JP2000514434A

JP2000514434A - ヘモグロビン―ヒドロキシエチルスターチ結合体含有酸素運搬剤、その製造方法及びその血液代用剤等としての使用

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Publication number: JP2000514434A
Application number: JP10504767A
Authority: JP
Inventors: ゾンマーマイヤー、クラオス; アイヒナー、ヴォルフラム
Original assignee: フレゼニウスアーゲー
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1997-07-07
Publication date: 2000-10-31
Also published as: ATE209931T1; DK0912197T3; PT912197E; BR9710865A; ES2166551T3; DE59705678D1; WO1998001158A2; CA2258947A1; EP0912197B1; AU3541197A; WO1998001158A3; EP0912197A2; DE19628705A1; AU710879B2; US6083909A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する新規な酸素運搬剤、及びその製造方法に関する。本発明は、更に酸素運搬剤を、血液代用剤、血漿増量剤、血液灌流剤、血液希釈剤及び／又は心停止溶液として使用することに関する。本発明は、特にヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する酸素運搬剤であって、その結合体においてヘモグロビンとヒドロキシエチルスターチとが、ヘモグロビンの遊離アミノ基と酸化された状態で存在するヒドロキシエチルスターチの還元末端基との間でアミド結合を介して相互に選択的に結合しているヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する酸素運搬剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体含有酸素運搬剤、その製造方法及ひその血液代用剤等としての使用本発明は、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する新規酸素運搬剤及びその製造方法に関する。更に、本発明は血液代用剤、血漿増量剤、灌流剤、血液希釈剤及び／又は心停止溶液としての当該酸素運搬剤の使用に関する。血液代用剤として使用し得るストローマの無い(stroma-free)のヘモグロビン溶液、いわゆる「ヘモグロビン系酸素担体(haemoglobin-based oxygen carriers )」（ＨＢＯＣｓ）の開発が、これまで長い間医薬品の研究開発における緊急の課題とされてきた。例えば、事故又は手術の結果生じる血液の喪失は、多くの場合同種異系の供血によって処置される。これに関連した病原性の有機体、特にウイルス、例えばＨＩＶ若しくは肝炎誘起物質の無制御な取込みと、輸血に先立って血液型を識別する必要性等の問題が、当業者には以前から認識されており、文献に広く記述されている。標準の血液代用剤として使用可能なヘモグロビン系酸素担体（ＨＢＯＣ）生産物は、これらの問題を解決するだけでなく、血漿増量剤、血液灌流剤(perfusion agent)、血液希釈剤（haemodilution agent）及び／又は心停止溶液（cardiopl egic solution）として使用することができる。この種の生産物に対する需要は、相当に以前から認識されていた（例えば、Ra biner，Ｊ．Exp．Med．126，(1967)1127参照）にも拘わらず、既知のＨＢＯＣ生産物は、認可された医薬品としての地位を得るに至っていない。天然の酸素運搬剤（oxygen transfer agent）は、分子量（ＭＷ）が６４キロダルトン（ｋＤａ）の色素蛋白質である血色素（blood pigment）ヘモグロビンである。この蛋白質は、２種のα−及びβ−ペプチド鎖を含み、これらのペプチド鎖は、補形の基として結合されたヘム（haem）を有している。これは、中心に鉄原子を持ったポルフィリン環である。単離された（isolated）ヘモグロビン分子は、非常に不安定であり、急速に安定なα、β−二量体（ＭＷ：３２ｋＤａ）に解離する。血液の循環において、単離されヘモグロビンの生理的半減期は、約１時間である。これは、二量体が腎臓を通って速やかに排泄されるからである。その際に、二量体は、腎毒性の副作用を発現する（Bunn ＆ Jandl.，Ｊ．Exp．Med．129 ，(1967)925−934参照）。最初に開発されたＨＢＯＣ生産物は同様に、細胞の構成成分の混入による該生産物の汚染に起因する腎毒性の可能性を有していた（Relihan，Ann．Surg．176 ，(1972)700参照）。更に、単離されたヘモグロビン組成物には、天然に存在する酸素結合のアロステリック活性化剤（allosteric activator）である２，３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）が欠如している。そのため、単離されたヘモグロビンの酸素結合親和力が増大し、それに伴って当該組成物の酸素分離力の減少を来すことになる。従って、ヘモグロビン分子の誘導体の開発の努力は、第一に、酸素運搬（oxyg en transfer）能力の改善と、腎毒性の徴候の回避とに向けられていた。ここで、ヘモグロビンは、分子内で架橋化し、分子間で結合して重合体ＨＢＯＣ体を形成し、及び／又は重合体に結合して結合体のＨＢＯＣ体を与える。また、分子内及び分子間で架橋化されたヘモグロビン誘導体の混合体が製造され、予定された用途についての研究に付されてきた。二官能性若しくは多官能性の架橋剤によるヘモグロビンの架橋化は、選択的に又は非選択的に行うことができる。選択的架橋化の一つの形態においては、ヘモグロビンの二つの蛋白鎖が互に分子内結合されることにより、単離されたヘモグロビン分子の天然の四量体が安定化される。適当な架橋剤の選択により、ヘモグロビンの酸素親和力が更に調整されることができ、その結果架橋化ヘモグロビンが生理的な結合の下に酸素を可逆的に結合させ得るように設定される。そのような架橋剤の例として、ピリドキサールホスフェート及びジアスピリン（diaspiri n）並びにこれらの誘導体が挙げられる。ヘモグロビンを架橋化する方法は、例えば、Benesch（Meth．Enzymol.，Vol．231(1994)，267−274参照）、Keipe rt等（Transfusion，Vol．29(1989)，767−773参照）、Snyder等（Proc．Natl． Acad．Sci．ＵＳＡ，84(1987)，7280−7284参照）及びRogers等（Biochim．et B iophys．Acta 1248(1995)，135−142参照）に記載されている。非選択的架橋化においては、分子間で架橋化された重合体のＨＢＯＣ生産物が得られる。適当な架橋化剤及びその使用方法は、例えばＤＥ−26 07 706、ＥＰ −0 646 130並びにHai等（Art．Cells，Blood Subs．And Immob．Biotech，22(3 ) (1994)，923−931参照）に記載されている。種々のヘモグロビン誘導体並びにその臨床的な使用に関連した課題についての概要については、Gould等、Transfu s．Sci.，16(1995)5−17、並びに、Chang等、Biomat，Art．Cells and Immob．B iotech，20(1992)159−179による刊行物に示されている。既知のヘモグロビン結合体は、総括的に、Xue及びWong（Meth．in Enzymol，2 31 (1994)308−322頁参照）に、またＤＥ26 16 086及びDE26 46 854に記載されている。後者の文献に示された方法によれば、ヘモグロビンは、ヒドロキシエチルスターチを最初に過ヨウ素酸ナトリウム（sodium periodate）と反応することにより、ヒドロキシエチルスターチに結合される。その際に、ジアルデヒドが生成し、これらにヘモグロビンが結合される。それに対し、DE26 16 086には、架橋剤（例えば、ブロモシアン）が最初にヒドロキシエチルスターチに結合され、次にヘモグロビンが中間生成物に結合されることによる、ヒドロキシエチルスターチへのヘモグロビンの結合が記載されている。ヘモグロビン誘導体の酸素結合親和力は同様に、適切な架橋剤及び／又は重合化剤の選択だけでなく、架橋化及び／又は重合の際のヘム基の配位子にも依存する。オキシ−ヘモグロビンは、速やかに酸化されて、メト−ヘモグロビン（Ｆｅ −III）を生成する。このものは、酸素結合親和力が強過ぎるため、酸素運搬剤としては適切ではない。従って、ＨＢＯＣ誘導体を製造するための前記の方法は同様に、部分的若しくは完全に脱酸素化されたヘモグロビンについて行われる（前記Benesch，R．E.参照）。しかしながら、架橋体及び／又は結合体のＨＢＯＣ生産物を製造するための従来の方法は、特定の重合体へのヘモグロビンの選択的結合を可能としない。全ての方法において、その各成分がそれぞれ異なった生物学的活性を示す共重合体の混合物が生成される。反応生成物又はその混合物の組成は、従来は、粗い特徴化しかできなかった。高分子生成物（ＭＷ＞５００ｋＤａ）だけでなく、残留四量体も、毒性の副作用を示す。例えば、追加の濾過工程によってＨＢＯＣ生産物から特定の低分子及び／又は高分子量の成分を除去すると、相当大きな収率の減少が生じるため、製造方法の経済性が大きく損なわれる。これまでに追加的に試験されたＨＢＯＣ生産物は、最近の臨床研究によれば、低分子量の、即ち実質的な四量体のＨＢＯＣ体に帰せられる別の副作用を血管について生ずる（例えば、前記Gould等、及びAlayash及びCashon、Molecular Medi cine Today 1，(1995)，122−127参照）。これらの低分子のＨＢＯＣ体は、血液の循環から血管の内皮細胞層の中に侵入することができる。ヘモグロビンの酸化窒素に対する高い結合親和力（ＮＯ、内皮誘導緩和因子（endothelial derived relaxing factor）ＥＤＲＦとしても知られる）が、この組織中に自由に利用可能なＮＯの量をＨＢＯＣ誘導体の投与によって著しく減少せしめる。ＮＯ濃度の局所的な減少によって、高血圧を惹き起こす系統的な血管収縮を生ずる。 Jia等（Nature，380(1996)，221−226参照）は、ＮＯ循環の調整における中心的な役割をヘモグロビンに帰している。これによると、ヘモグロビンは、肺臓において協同的に酸素化されＳ−ニトロシル化される。ＮＯ基は、動脈−静脈の移動の間に、他の蛋白質に運搬され、これによって、ＮＯ−様の血管膨張活性を取得する。しかしながら、架橋されたＨＢＯＣ生産物は、通常は、協同性をもはや示さなくなる。これまでに試験されたＨＢＯＣ生産物の他の有毒活性は、特に、Alayash及びC ashomにより記述されている（Molec．Med．Today，(1995).前記文献参照）。これによると、ヘモグロビン分子は、赤血球の外部において、レドックス反応に関与し、この反応の過程において、高反応性のヘモグロビン種及び酸素種が生成し、これらの種は、特に脂質の過酸化の原因となるとされる。これまでに試験されたＨＢＯＣ生産物の毒性の副作用を抑制するために、ヘモグロビンをリポソームにパックする投与形体が開発され、合成された赤血球類似のヘモグロビンの搬送細胞小器官を生成させることによる適用形態が開発された（Rudolph等、Crit．Care Med．22(1994)142−150参照）。しかし、リン脂質が血液循環中に大量に入りこむことは、患者にとって更なるリスクに結び付く。以上を要約すると、これまでに試験されたＨＢＯＣ生産物は、酸素運搬剤としてのその臨床上の使用が信頼度の不十分なことによって阻害されていたため、医薬としての許可は得られていない。従って、本発明の目的は、血液代用剤として臨床的に使用可能な酸素運搬剤を提供することにある。本発明の別の目的は、本発明による酸素運搬剤の好適な製造方法を提供することにある。この目的は、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体（conjugate）を含有する酸素運搬剤（oxygen transfer agent）であって、この結合体中のヘモグロビンとヒドロキシエチルスターチとがヘモグロビンの遊離アミノ基と酸化された形態に存在するヒドロキシエチルスターチの還元末端基との間でアミド結合を介して、互に選択的に結合している当該結合体を含有する酸素運搬剤によって達成される。驚くべきことに、本発明によるヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体は、これらが特に優れた耐容性（tolerated）を示すため、酸素運搬剤として極めて好適であることが示された。この酸素運搬剤は、生理学的条件の下において可逆的な酸素結合を可能とする酸素結合親和力を示す(Ｐ₅₀は２０−８０mmHg 、好ましくは２０−５０mmHg；尚、Ｐ₅₀の測定は、純酸素の最大富化少くとも１５０mmHgにおいて行う。)。ヘモグロビンーヒドロキシエチルスターチ結合体は、血管の内皮細胞中に侵入するには大き過ぎるため、高血圧の副作用は惹き起こさない。また、酸素運搬剤は、抗原成分も発熱成分も含まないので、腎毒性の副作用も惹き起こさない。本発明において驚くべきことには、ヒドロキシエチルスターチを好ましい血液希釈剤及び循環血代用剤とする有利な流動性(Weidler等、Arzneim.-Forschung／ Drug．Res.，41,(1991)494−498参照)がこの結合体に保持されていることが見出された。即ち、酸素運搬剤の良好な耐容性は、ヘモグロビンの有利な酸素運搬特性と、ヒドロキシエチルスターチの血液希釈特性との驚くべき組合せにも基づいている。酸素運搬剤は長期の血管持続性を示し、ヘモグロビンの分子の表面は置換基によって遮蔽されている。驚くべきことに、本発明によるヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体においてヘモグロビンは、この遮蔽効果のために毒性のレドックス反応に関与できなくなる。本発明による酸素運搬剤の別の利点は、その結果コロイド浸透圧を高くすることなく、結合体としてヒドロキシエチルスターチとヘモグロビンとを、高濃度において同時に投与できることに存する。酸素運搬剤は、２−４０g／ｄｌ、好ましくは５−２０g／ｄｌ、特に好ましくは８−２０g／ｄｌの濃度において、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する。酸素運搬剤は、更に、既知の生理的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含有してもよい。本発明によれば、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を製造するために、好ましくはストローマを含有しない（stroma-free）、精製され、滅菌されたヘモグロビンが用いられる。このものは、先行技術において包括的に記載された種々の方法に従って取得できる。ヘモグロビンは、架橋化されていても、重合化されていても、その両方でもよい。ヘモグロビンは、ヒト、動物、動植、又は組換え体、何れの起源のものでもよい。また、驚くべきことに、動物由来のヘモグロビンを使用した場合に考えられるような免疫上の合併症が、ヒドロキシエチルスターチの遮蔽効果によって防止されることが、本発明によって示された。従って、本発明の好ましい実施態様は、ヘモグロビンが動物由来である場合の、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する酸素運搬剤に関する。ヘモグロビンは、例えばウシ、ブタ又はウマ由来でもよい。本発明の特に好ましい実施態様によれば、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体の製造のために、ウシ由来のヘモグロビンが使用される。このものは、架橋結合なしに、単離された形で、好ましい酸素結合親和力を示す。ヒトのヘモグロビンを使用する場合には、このものは、架橋化及び／又は重合化によって四量体として安定化させることができる。ヒトのヘモグロビンは、架橋化及び／又は重合化によって生理学的条件の下に、同時に可逆的な酸素結合を可能にする。架橋又は重合のために数多くの方法が当業者に知られている。本発明によれば、ヘモグロビンが安定化され、結果として所望の酸素親和力（Ｐ₅₀：２０−８０mmHg、好ましくはＰ₅₀：２０−５０mmHg、を示す限り、どのような所望の方法を用いてもよい。好ましい架橋方法は、ビス−ピリドキサール−四リン酸エステル（bis-pyridoxsal tetraphosphate）による分子内架橋（Keipert等、 Transfusion，Vol．29(1989)，767−773参照）、又はジアスピリン（diaspirin ）による分子内架橋（Snyder等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84（1987）,728 0−7284参照）又は酸化ラフィノース（raffinose）による架橋及び重合（ＥＰ− 0 646 130号公報参照）である。本発明の特に好ましい実施態様によれば、ヘモグロビンは、ヒドロキシエチルスターチとの結合の前においては、脱酸素化された形態若しくは部分的に脱酸素化された形態となっている。部分的に脱酸素化された状態においては、デオキシ −ヘモグロビン２０−８０％、他の誘導体の形態にあるヘモグロビン８０−２０％を含有する組成が好ましく、またデオキシ−ヘモグロビン５０−８０％、他の誘導体の形態にあるヘモグロビン５０−２０％の組成が特に好ましい。ここで、他の誘導体の形態にあるヘモグロビンには、詳しくは、ＣＯ−、オキシ−及び／又はメト−ヘモグロビンがある。結合体を製造するには、平均分子量が１−４０ｋＤａのヒドロキシエチルスターチが好適に使用される。平均分子量が好ましくは２−２０ｋＤａ、特に好ましくは５−２０ｋＤａのヒドロキシエチルスターチが使用される。更に好ましいヒドロキシエチルスターチは、モル置換度（a molar degree of substitution；グルコース単位当たりの置換分子数）が０．１−０．８によって、またＣ₂：Ｃ₆置換比（ratio of C₂:C₆ substitution；グルコース単位内の分配比）が２−２０の範囲にあることによって特徴付けられる。本発明による好ましいヒドロキシエチルスターチは、市販されている（シグマ社から）ような分子量の比較的高いヒドロキシエチルスターチから、例えばＨＣｌによる酸加水分解によって取得できる。ヒドロキシエチルスターチは、次に沈殿反応に付され、この際にアセトンを使用することができる。本発明によるヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体の分子量は、使用するヘモグロビンの分子量若しくは分子量分布、使用するヒドロキシエチルスターチの分子量分布、及び反応条件の選定に依存する。本発明によれば、分子量が１００−７００ｋＤａのヘモグロビンーヒドロキシエチルスターチ結合体が好ましく、この分子量は、２００−３００ｋＤａであることが特に好ましい。本発明によれば、ヘモグロビンに対する糖類の知られている安定化作用（Rudo lph，Cryobiology，25(1988)，1−8参照）も、短鎖のヒドロキシエチルスターチを使用した場合、結合体のヒドロキシエチルスターチに由来することが見出されている。本発明による酸素運搬剤は、非修飾（non-modified）ＨＢＯＣ生産物に比較して４℃及び室温で、改善された保存安定性を示す。従って、酸素運搬剤自体は、驚くべきことに、糖類の有利な安定化作用の担体となっている。本発明は、またヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する酸素運搬剤の製造方法に関する。この方法は、ヘモグロビンをヒドロキシエチルスターチに選択的に結合させることを可能とし、それにより酸素運搬剤を生成する。結合体は、多工程の方法によって製造され、その際ヒドロキシエチルスターチの還元末端基（reducing end groups）を最初に酸化した後、遊離アミノ基を経て、アミド結合を介してヘモグロビンをヒドロキシエチルスターチの酸化された末端基に結合させる。この方法の出発物質としては、平均分子量が１−４０ｋＤａのヒドロキシエチルスターチが好適に使用される。この場合、平均分子量が２−２０ｋＤａのヒドロキシエチルスターチが好ましく、平均分子量が５−２０ｋＤａのヒドロキシエチルスターチが特に好ましい。また、好ましいヒドロキシエチルスターチは、モル置換度０．１−０．８、Ｃ₂：Ｃ₆置換比２−２０の範囲によって特徴付けられる。本発明によれば、ストローマを含まず、精製され、滅菌された、架橋化及び／又は重合化されたヘモグロビンが、酸素運搬剤の製造のために好適に使用される。ここで、ヘモグロビンとしては、ヒト、動物、植物又は組換え体由来のものが使用できる。本発明によれば、単離された形体で生理学的条件の下において可逆的な酸素結合を可能とする酸素結合親和力を有するので、ウシのヘモグロビンが特に好ましい。本発明の好ましい製造方法によれば、ヒドロキシエチルスターチを最初に沃素含有溶液に混合し、次に水酸化カリウム溶液を添加することによって、ヒドロキシエチルスターチの還元末端基が酸化される。本発明の他の好ましい製造方法によれば、ヘモグロビンは、第二工程において、ヒドロキシエチルスターチの酸化された末端基に結合される。この反応は、例えば４０℃においてそれぞれの成分を混合することにより行われる。この際に、ヘモグロビンの遊離アミノ基とヒドロキシエチルスターチのラクトンとの間に求核性の置換反応が生じ、アミド結合が生成される。このアミド結合によって、ヘモグロビンが、ヒドロキシエチルスターチの酸化された還元末端基に結合される。驚くべきことに、多糖類とポリアミドとのブロック共重合体を製造するための Hashimoto等の方法(Kunststoffe，Kautschuk Fasern，9(1992)1271−1279参照) により、分子間及び／又は分子内で架橋可能な精製されたヘモグロビンを、特に耐容性のある酸素運搬剤が生成されるように、酸化されたヒドロキシエチルスターチに結合させ得ることが本発明によって示された。本発明の原理を使用することによつて初めて、不所望の高分子量のヘモグロビン形態の特記すべき量を生成することなく、四量体のヘモグロビンがヒドロキシエチルスターチに結合するようにヘモグロビン結合体の合成を制御することが可能となる。本発明の好ましい実施態様によれば、分子量が８０−８００ｋＤａ、好ましくは１００−５００ｋＤａ、特に好ましくは１５０−４００ｋＤａのヘモグロビン −ヒドロキシエチルスターチ結合体が生成されるように、反応条件を選定することができる。本発明の製造方法によれば、ヘモグロビンとヒドロキシエチルスターチとの反応は、ほぼ定量的に行うことができる。そのため、反応系中には低分子量のヘモグロビンは殆ど残存しない。非結合体のヘモグロビンの含量は５％よりも少いことが望ましい。そのため、本発明の好ましい実施態様によれば、ヘモグロビンとヒドロキシエチルスターチとの結合後において、所望の反応生成物を単離するために高価な精製工程は不要となる。本発明の別の好ましい実施態様によれば、ヒドロキシエチルスターチとの結合前に、ヘモグロビンは、完全に又は部分的に脱酸素化された形態になっている。部分的に脱酸素化された形態においては、２０−８０％のデオキシ−ヘモグロビンと８０−２０％の他の誘導体の形態にあるヘモグロビンとを含有する組成が好ましく、２０−８０％のデオキシ−ヘモグロビンと８０−２０％の他の誘導体の形態にあるヘモグロビンとから成る組成が特に好ましい。ヘモグロビンの脱酸素化は、所望の化学的方法又は物理的方法によって行うことができる。その場合、ヘモグロビンは、アスコルビン酸ナトリウム、グルタチオン、Ｎ−アセチル−システィン又はＮ−アセチル−メチオニン等の化学的還元剤で処理されるか、又は不活性ガス、例えばＮ₂、Ｈｅ又はＡｒに対してガス透過性の膜を介して循環される。本発明の特に好ましい実施態様によれば、システイン又はアセチル−システインが還元剤として使用される。オキシ−ヘモグロビンの含量が５％より少くなるまで、好ましくは１％より少くなるまで還元が行われる。メト−ヘモグロビンの含量は、５％よりも少く、好ましくは３％又は１％よりも少く、特に好ましくは０．５％よりも少くすべきである。本発明の別の特に好ましい実施態様によれば、ヘモグロビンが２０−８０％のデオキシ−ヘモグロビンと８０−２０％の他の誘導体の形態にあるヘモグロビンを含有するヘモグロビン溶液が、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を製造するために用いられる。そのようなヘモグロビン溶液を調製するために、オキシ−ヘモグロビンが部分的に脱酸素化され、或いはデオキシ−ヘモグロビンが部分的に酸素化されることができる。また、出発物質のヘモグロビン溶液の誘導体の形態や、本発明による所望の好適なヘモグロビン誘導体組成に従って、ヘモグロビン溶液は一酸化炭素によって安定なＣＯ形態に転換され、及び／又は酸素又はＯ₂含有ガスによって酸素化され、及び／又は窒素又は他の不活性ガスによって脱酸素化される。この場合、ガス交換は、先行文献に記載される任意の既知の方法に従って行うことができる。好ましい方法として、酸素又は酸素含有ガスによるデオキシ−ヘモグロビン溶液の気体処理（gassing）、還元剤、例えばジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム（Na bisulphite）によるオキシ−ヘモグロビンの化学的な部分還元がある。反応終了後に、例えば限外濾過によって還元剤を分離することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、所望の生成物を保留する膜を用いて限外濾過が行われる。本発明の特に好ましい方法によれば、ヘモグロビンは、次に、Ｎ₂気体処理によって凍結乾燥される。本発明の別の特に好ましい実施態様によれば、分画されたヒドロキシエチルスターチ（ＭＷ≦１０ｋＤａ）に最初に０．１Ｎの沃素溶液を添加して、還元末端基のところでヒドロキシエチルスターチが選択的に酸化される。次に、沃素由来の色が消失するまで、室温（ＲＴ）で、０．１ＮのＫＯＨ溶液を添加する。この工程を１回乃至数回繰り返した後、更に３０分間混合物を撹拌する。次に、溶液を透析に付す。この際透析膜は、残分中の所望の生成物（ここでは酸化されたヒドロキシエチルスターチ）を保留する除外体積（exclusion volume）を有する。カチオン交換塔を使用するクロマトグラフィーによる精製の後に、得られる溶液は凍結乾燥される。そのとき、カチオン交換クロマトグラフィーを、透析の前に行うことも可能である。本発明の別の特に好ましい実施態様によれば、選択的に酸化されたヒドロキシエチルスターチへのヘモグロビンの結合は、最初にヘモグロビンをＤＭＳＯ又は他の適当な非水溶媒中に溶解させ、これを３首の丸底フラスコ中に移すことによって行われる。このために、ＤＭＳＯ中得られた溶液を４０℃で徐々に、前記の方法によって酸化されたヒドロキシエチルスターチに添加する。しかし、これらの工程の順序は任意であり、ヘモグロビンをヒドロキシエチルスターチ溶液に添加してもよい。４０℃で２５時間撹拌した後、ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography：ＧＰＣ）、透析及び／又は限外濾過によって残渣を精製し、このようにして溶媒が除去される。ヘモグロビン調製物の分子量の増加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ゲル電気泳動（electrophoresis）又は超遠心分離（密度勾配又は沈降（sedimentation）平衡遠心分離）によって直接測定することができる。ＳＥＣ(size exclusion chromatography)又は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のような通常のクロマトグラフィー法が分子の大きさを測定するために更に適切である。分子の物理化学的特性における修飾−関連の変更を測定するためにＩＥＦ（isoelectronic focusing）と同様に、アフィニティクロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＲＰＣ）及びＩＥＣ（イオン交換クロマトグラフィー）を用いることができる。置換度は、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ、質量スペクトロメトリー又はキャピラリ電気泳動法（ＣＥ）により定量することができる。この目的のために、蛋白質試験（Bradford，Lowry，Biuret）又はKjeldahlによる窒素測定と組合せた、ＴＮＢＳ（Habeeb等、Anal．Biochem.，14，328［1966］参照）による蛋白質中の遊離アミノ基の定量のための比色法(colorimetric method)が、更に適切である。本発明は、ヒドロキシエチルスターチ−ヘモグロビン結合体及びアルブミンを含有する酸素運搬剤にも関する。ここでアルブミンは、ヒト、動物、植物又は組換え体、何れの起源のものでもよく、好ましくは水溶液として使用される。酸素運搬剤は２−２０g／ｄｌ、好ましくは５−１５g／ｄｌの濃度のアルブミンを含有していることが望ましい。本発明において好ましい酸素運搬剤中において、アルブミンに対するヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体の重量比は、１：１０からし４：１の範囲とすることができる。アルブミンは結合体よりもかなり廉価であり、酸素運搬剤中において所望の浸透圧を達成するために使用できるので、比較的高含量のアルブミンと、低含量のヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を持った酸素運搬剤が特に好ましい。本発明は、更にヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体及びアルブミンを含有し、特に良好な血管の認容性（good vascular tolerability）を有する酸素運搬剤に関する。本発明の特に好ましい実施態様によれば、このために前記結合体がアルブミン、特に予め一酸化窒素にて飽和されたヒトの血清アルブミンに混合される。ヘモグロビンとアルブミンは、Ｎ−ニトロソ体においてＮＯを錯化する（complexing）特性を備えている（Keaney等、J．Clin．Invest.，91，（ 1993），1582−1589参照）。架橋ＨＢＯＣ生産物は、通常は、もはや協同性を示さない。そのため、協同のＮＯ結合の能力は持たない。驚くべきことに、ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体のこの欠乏は、結合体に加えてＮＯを錯化したアルブミン溶液を含有する酸素運搬剤を使用することによって補い得ることが、本発明によって見出された。アルブミンのＮＯ飽和は、酸素排除下にアルブミン溶液をＮＯにて気体処理する（gassing）ことによって行われる。その結果、当該生産物の血管に対する認容性が改善される。本発明は、血液代用剤（blood substitute）、血漿増量剤（plasma expander ）、灌流剤（perfusion agent；心臓麻痺等で冠状動脈用等に使用）、血液希釈剤（haemodilution agent）及び／又は心停止溶液（cardioplegic solution；心臓麻痺性用）としての、本発明による酸素運搬分子並びにヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体及びアルブミン組成物の使用に関する。実施例ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体の製造Ａ．１ヒドロキシエチルスターチの還元末端基の酸化本発明の好ましい一方法においては、ヒドロキシエチルスターチの還元末端基が選択的に酸化される。３mlより少量の脱イオン水中に調製された分画ドロキシエチルスターチ（ＭＷ≦４ｋＤａ、秤量約０．５６mmol）の溶液に、最初に０．１Ｎ沃素溶液２ｍ１を滴下した。次に、沃素に由来する色が消失するまで、室温で０．１ＮのＫＯＨ溶液約３．３mlを添加した。上記の工程を繰り返して１４ml の沃素溶液及び２３mlのＫＯＨ溶液を反応系に添加し、得られた混合物を更に３０分間撹拌した。次に、得られた溶液を、カチオン交換塔（アンバーライトＩＲ１２０、Ｈ⁺ −型）を使用して、クロマトグラフィーにより精製した。除外限度１０００Ｄａの再生セルロース膜（Millipore ＰＬＡＣ 076 10）による透過濾過（ダイアフィルトレーション）後、一部濃縮された溶液は凍結乾燥された。しかし、カチオン交換クロマトグラフィーは同様に、透過濾過の後に行うこともできる。収率は、８０−９０％程度であった。Ａ．２ヒドロキシエチルスターチの還元末端基の酸化−別法３mlより少量の脱イオン水中に調製された分画ヒドロキシエチルスターチ（ＭＷ≦１０ｋＤａ、約５ｇ）の溶液に、０．１Ｎの沃素溶液２mlを最初に滴下した。次に、沃素に由来する色が消失するまで、室温（ＲＴ）で０．１ＮのＫＯＨ溶液を添加した。上記の工程の繰り返しによって、１４mlの沃素溶液及び２３mlのＫＯＨ溶液を、反応系に添加した。得られた混合物を更に３０分間撹拌した。次に、透析膜の除外容積約９ｋＤａで溶液の透析を行った。カチオン交換塔（アンバーライトＩＲ−１２０）によるクロマトグラフィーを行って精製した後、得られた溶液を凍結乾燥した。収率は８５％程度であった。Ｂ．１気体処理によるヘモグロビンの脱酸素化０．５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄及び０．０５ＭのＮａＨＣＯ₃ 中６g／ｄｌの濃度のウシのヘモグロビンを、気体処理（gassing）によって脱酸素化を行った。ヘモグロビンは、最初９４−９６％がＣＯ形態で存在していた。脱酸素化は密閉した容器中で行い、この容器中でヘモグロビン溶液をガス交換器を通して循環させ、このとき最初は部分酸素化のためにＯ₂で、次いでＮ₂で、１０psiの圧力下において絶えず膜を気体処理（gassed）した。７０％のデオキシ −ヘモグロビンの含量となったところで、脱酸素化を終了した。次に、ヘモグロビンをＮ₂気体処理（gassing）によって凍結乾燥した。Ｂ．２化学的還元剤によるヘモグロビンの脱酸素化０．５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄及び０．０５ＭのＮａＨＣＯ₃ 中６ｇ／ｄｌの濃度のウシのヘモグロビンを化学的に還元した。そのために、ヘモグロビン溶液に、１００ｍＭのナトリウムジサルファイト（Na disulphite ）が添加された。１時間後、得られた溶液は７５％のデオキシ−ヘモグロビンを含んでいた。ナトリウムジサルファイトは、膜の除外限界５０ｋＤａで、限外濾過によって分離した。次に、ヘモグロビンをＮ₂気体下に凍結乾燥した。Ｃ．ヒドロキシエチルスターチの酸化された還元末端基へのヘモグロビンの結合それぞれ、工程Ｂ．１、Ｂ．２によって調製されたヘモグロビン約１−１．５ gを、１５mlのＤＭＳＯに加えて、得られた混合物を１００mlの３首丸底フラスコに移した。０．５mlのＤＭＳＯ中に調製された、工程Ａ．により酸化されたヒドロキシエチルスターチ溶液を、４０℃で徐々に添加した。４０℃で１日乃至２日間撹拌した後、得られた混合物から透析により溶媒を除去し、透過濾過（diafil tration）を行い一部濃縮した。生成物の純度、特に出発物質の除去は、標準的なクロマトグラフィー工程と限外濾過とを含めることによって大きく改善することができる。結合反応の生成は、ゲル浸透（permeation）クロマトグラフィーにより確認された。

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する酸素運搬剤であって、当該結合体中のヘモグロビンとヒドロキシエチルスターチとが、ヘモグロビンの遊離アミノ基と酸化された状態で存在するヒドロキシエチルスターチの還元末端基との間でアミド結合を介して相互に選択的に結合することを特徴とする酸素運搬剤。２．ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体が２−２０g／ｄｌの濃度で酸素運搬剤中に存在する請求項１に記載の酸素運搬剤。３．ヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体が５−２０g／ｄｌの濃度で酸素運搬剤中に存在する請求項２に記載の酸素運搬剤。４．ヘモグロビンが、ヒト、動物、植物又は組換え体起源のものである請求項１〜３の何れかに記載の酸素運搬剤。５．ヘモグロビンがウシ起源のものである請求項１〜４の何れかに記載の酸素運搬剤。６．ヒドロキシエチルスターチとの結合前に、ヘモグロビンがデオキシ−ヘモグロビンとして又はデオキシ−ヘモグロビンとＣＯ−、Ｏ₂−又はメト−ヘモグロビンのような他の誘導体の形態にあるヘモグロビンとの混合物として存在する請求項１〜５の何れかに記載の酸素運搬剤。７．ヒドロキシエチルスターチとの結合前に、ヘモグロビンがデオキシ−ヘモグロビンとオキシ−ヘモグロビンとの混合物として存在し、ここでデオキシ− ヘモグロビンの含量が２０〜８０％であり、他の誘導体の形態にあるヘモグロビンの含量が８０〜２０％である請求項１〜６の何れかに記載の酸素運搬剤。８．ヘモグロビンが架橋化及び／又は重合化ヘモグロビンである請求項１〜７の何れかに記載の酸素運搬剤。９．ヒドロキシエチルスターチが１〜４０ｋＤａの平均分子量を有する請求項１〜８の何れかに記載の酸素運搬剤。１０．ヒドロキシエチルスターチが２〜２０ｋＤａの平均分子量を有する請求項１０に記載の酸素運搬剤。１１．ヒドロキシエチルスターチが、それぞれヒドロキシエチル基に基づいて０．１〜０．８のモル置換度、及び２〜２０の範囲にあるＣ₂：Ｃ₆置換比を有する請求項１〜１０の何れかに記載の酸素運搬剤。１２．アルブミンを更に含有する請求項１〜１１の何れかに記載の酸素運搬剤。１３．アルブミンが、ヒト、動物、植物又は組換え体起源のものの血清アルブミンである請求項１２に記載の酸素運搬剤。１４．アルブミンが２−２０g／ｄｌの濃度で存在する請求項１２又は１３に記載の酸素運搬剤。１５．アルブミンに対するヘモグロビン−ヒドロモシエチルスターチ結合体の重量比が１：１０から４：１の範囲にある請求項１２〜１４の何れかに記載の酸素運搬剤。１６．当該結合体への添加の前に、アルブミンが一酸化窒素（ＮＯ）で飽和された水溶液中に存在する請求項１２〜１５の何れかに記載の酸素運搬剤。１７．水溶液又は凍結乾燥体として存在する請求項１〜１６の何れかに記載の酸素運搬剤。１８．ヒドロキシエチルスターチの還元末端基を最初に酸化し、次いでヒドロキシエチルスターチの酸化された末端基に遊離アミノ基を介してアミド結合によりヘモグロビンを結合させることを特徴とするヘモグロビン−ヒドロキシエチルスターチ結合体を含有する酸素運搬剤の製造方法。１９．ヒドロキシエチルスターチの還元末端基の酸化が、ヒドロキシエチルスターチを最初に沃素含有溶液に混合し、次いで水酸化カリウム溶液を添加することにより行われる請求項１８に記載の製造方法。２０．ヘモグロビンの遊離アミノ基と、酸化された形態で存在するヒドロキシエチルスターチの還元末端基との結合が、各々の成分を４０℃で混合することにより行われる請求項１８又は１９に記載の製造方法。２１．ヘモグロビンが、ヒト、動物、植物又は組み換え体起源のものである請求項１８〜２０の何れかに記載の製造方法。２２．ヘモグロビンがウシ起源のものである請求項１８〜２１の何れかに記載の製造方法。２３．ヒドロキシエチルスターチとの結合の前に、ヘモグロビンがデオキシ −ヘモグロビンとして又はデオキシ−ヘモグロビンとＣＯ−、Ｏ₂−又はメト− ヘモグロビンのような他の誘導体の形態にあるヘモグロビンとの混合物として存在する請求項１８〜２２の何れかに記載の製造方法。２４．ヒドロキシエチルスターチとの結合の前に、ヘモグロビンがデオキシ −ヘモグロビンと他の誘導体の形態にあるヘモグロビンとの混合物として存在し、ここでデオキシ−ヘモグロビンの含量が２０〜８０％であり、他の誘導体の形態にあるヘモグロビンの含量が８０〜２０％である請求項１８〜２３の何れかに記載の製造方法。２５．ヘモグロビンが架橋化及び／又は重合化ヘモグロビンである請求項１８〜２４の何れかに記載の製造方法。２６．ヒドロキシエチルスターチが、５〜４０ｋＤａの平均分子量、それぞれヒドロキシエチル基に基づいて０．１〜０．８のモル置換度、及び２〜２０の範囲にあるＣ₂：Ｃ₆置換比を有する請求項１８〜２５の何れかに記載の製造方法。２７．請求項１〜１７に記載の酸素運搬剤又は請求項１８〜２５に記載の方法により製造された酸素運搬剤の、血液代用剤、血漿増量剤、灌流剤、血液希釈剤及び／又は心停止溶液としての使用。