JP2000514440A - 遺伝子輸送システム - Google Patents

遺伝子輸送システム

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トーマス オーガスト
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Abstract

(57)【要約】 遺伝子輸送システムが、酵素によって分解可能なカチオンポリマーと、表面に付着した結合部分または標的リガンドを選択的に有する、核酸（DNAまたはRNA）のナノスフィアとによって作出される。この輸送システムは、コアセルベーションの簡便な方法によって作出することができる。標的リガンドは、ナノスフィアに直接付着させるか、結合部分によって付着させることができる。結合デザインによって、抗体、細胞接着分子、ホルモン、およびその他の細胞特異的なリガンドなど、どのような分子でも、ナノスフィアの表面に付着させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子輸送システム 本出願は、1994年6月7日に提出された米国特許出願第08/657,913号、および19 96年7月9日に提出された米国特許出願第60/021,408号の一部継続出願である。発明の背景 細胞中に外来遺伝子を導入するために、さまざまな技術が用いられている。物 理的な方法には、リン酸カルシウムいよる共沈殿、エレクトロポレーション、お よびパーティクルガンが含まれる。これらの直接的な導入法は、インビトロでは 適当であるが、インビボでは実用できない。インビボでの遺伝子治療法の有望性 は、ウイルスベクターまたはリポソームなどの輸送用の担体に依存している。ウ イルスベクターには、未だに、安全性に対する懸念が残っている。また、ウイル スに組み込むことのできるDNA配列のサイズは、普通7〜8kbに限定されるという 、もう一つの制限がある。一方、リポソームは、一般的に、負荷できるレベルが 低い。どちらの場合にも、これらの遺伝子輸送システムに対する、細胞または組 織の特異性の問題がある。 薬物輸送を制御することによって、多くの薬物療法の成功率が有意に向上して きた（ランガー（Langer）、R.，1990，新しい薬剤輸送方法（New methods of d rug delivery），Science，249：1527〜33；ポズナンスキー（Poznansky）ら，1 984，制御された薬物輸送方法のための生物学的方法：批判的概説（Biological approaches to the controlled delivery of drugs：critical revies），Pharm acol．Rev.，36:277〜336）。薬物輸送の主要な目的は、薬物を、標的部位に局 在させることである。これらの標的をもつ輸送システムは、しばしば、リポソー ムからなる注射可能な剤形（グレゴリアディス（Gregoriadis），G.，1988，薬 物輸送担体としてのリポソーム（Liposome as Drug Carriers）、ニューヨーク 、ワイリー社；リッチンガー（Litzinger）ら、1992、ホスファチジルエタノー ルアミン・リポソーム：薬物輸送、遺伝子導入、および免疫診断への応用（Phos phatidyletanolamine liposome:drug delivery，gene transfer and immunodiag nostic applications、Biochimica et Biophisica Acta，1113:201〜27）、なら びに蛋白質（カミングス（Cummings）ら、1991、蛋白質ミクロスフィア中でのド キソ ルビシンの共有結合は、腫瘍用薬物の沈着の主要な決定因子である（Covalent c oupling of doxorubicin in protein microsphere is a major determinant of tumor drug deposition）、Biochem．Pharm.，41:1849〜54；ベルリジック（Ver rijik）ら、1991、シスプラチンによる血管内の腫痘狙撃のための担体としての 、ポリマーコートしたアルブミンミクロスフィア（Polymer-coated albumin mic orsphere as carriers for intravasular tumor targeting of cisplatin）、Ca ncer Chemother．and Pharm.，29:117〜21；タバタ（Tabata）ら、1988、ゼラチ ンミクロスフィアに含まれている組換えインターフェロンアルフアA/Dによるマ クロファージの抗腫瘍活性の強化（Potentiation of antitumor activity of ma crophages by recombinant interferon alpha A/D contained in gelatin micro sphere）、Jpn．Cancer．Res.，79:636〜646）、多糖類（ロングブト（Rongeved ）ら、1991、常磁性共鳴イメージングの担体としての、クロスリンクした分解可 能なデンプンのミクロスフィア：合成、分解、および緩和特性（Cross-linked， degradable starch microspheres as carriers of paramagnetic resonance ima ging:sinthesis，degradation and relaxation properties）、Carbonhydrate R es.，145:83〜92；カーター（Carter）ら、1991、結腸直腸転移の動物モデルに おける薬剤輸送操作において、分解性デンプンミクロスフィアとアンギオテンシ ンIIを組み合わせること（The combination of degradable starch microsphere and angiotensin II in the manipulation of drug delivery in an animal mo del of colorectal metastasis）、British J．Cancer，65:37〜9）、および合 成ポリマー（デイビス（Davis）ら、1984、ミクロスフィアと薬剤治療（Microsp here and Drug Therapy）、アムステルダム；エルドリッジ（Eldridge）ら、199 1、ワクチン輸送システムとしての生物分解性ミクロスフィア（Biodegradable m icrosphere as a vaccine delivery system）、Molec．Immunology，28:287〜94 ；パッポ（Pappo）ら、1991、モノクローナル抗体によって誘発される、蛍光性 ポリスチレン製ミクロスフィアによるパイヤー斑M細胞の狙撃（Monoclonal anti body-directed targeting of fluorescent polystyrene microsp heres to Peye rユs patch Mcells）、Immunology，73:277〜80）でできたミクロスフィアの形 状をとる。ポリマーシステムは、薬物速度および生物分布の変化 など、リポソームシステムといくつかの利点が共通である。リポソームの方が、 生物親和性が高く、細胞と融合する可能性があると期待されかもしれないが、ポ リマーミクロスフィアの方が解離速度をより制御しやすく、保存中の安定性が高 く、また、化合物の種類によっては、薬物負荷レベルが高い。 当技術分野においては、解離を制御することができ、作製するのが簡単で、安 定しており、費用効果が高く、DNA負荷レベルが高く、比較的、非免疫原性であ るDNA輸送システムが必要とされている。発明の概要 本発明の目的は、細胞にDNAを輸送するためのポリマー粒子を提供することで ある。 本発明の目的は、細胞にDNAを輸送するためのポリマー粒子を製造する方法を 提供することである。 本発明のもう一つの目的は、ポリマーお粒子を用いて、細胞にDNAを輸送する 方法を提供することである。 本発明の上記および別の目的が、下記の態様の一つ以上によって提供されてい る。一つの態様において、遺伝子輸送のためのナノスフィアが提供されている。 ナノスフィアは、ポリマーカチオンとDNAとを含み、選択的には、結合分子また は標的リガンドが、該ナノスフィアの表面に付着している。 本発明の別の態様において、遺伝子輸送のためのナノスフィアを形成させる方 法が提供されている。この方法は、DNAとカチオンポリマーとのコアセルベーシ ョンによってナノスフィアを形成させる段階、および選択的に、ナノスフィアの 表面に結合分子または標的リガンドを付着させる段階を含む。 本発明のさらに別の態様において、遺伝子を細胞の中に導入するための方法が 提供されている。この方法は、カチオンポリマーとDNAとを含む固形ナノスフィ アによってトランスフェクションされるよう、細胞をインキュベートする段階を 含む。選択的には、標的リガンドがナノスフィアの表面に付着している。標的リ ガンドは、トランスフェクションのために細胞の表面に結合する。 このように、本発明は、簡単に調製でき、費用効率が高く、解離を制御するこ とができ、保存安定性が高く、かつ生物親和性が高い、魅力的なDNA輸送システ ム を含む技術を提供する。図面の簡単な説明 図１．ゼラチン-DNAコアセルベートの合成を示す概略図。 図２．cDNAの被包前後のゲル電気泳動。（std＝標準；Sup＝上清、Pellet＝遠 心分離によってペレット化されたナノスフィア）。 図３．本来のLAMP-1のcDNAの制御された解離を、インビトロで示した。さまざ まなグルタルアルデヒド濃度で、ナノスフィアにグルタルアルデヒドをクロスリ ンクしてから、トリプシンで分解した。図3Aは、さまざまなグルタルアルデヒド -クロスリンキングレベルにおける、DNA解離の時間的な推移を示す。図3Bは、さ まざまな時間とさまざまなグルタルアルデヒド-クロスリンキングレベルにおい て、ナノスフィアから解離したDNAを（ゲルとデンシトメータの記録で）示して いる。 図４．対照とLAMP-1cDNAを負荷したナノスフィアによってトランスフェクショ ンされたU937細胞（トランスフェクション後3日目）の蛍光画像。図4A：cDNAな しの抗-DC44ナノスフィア；図4B：リン酸カルシウム法によるトランスフェクシ ョン；図4C：抗休なしのLAMP-1ナノスフィア；図4D：抗-CD44-mABでコートされ たLAMP-1ナノスフィア。LAMP-1の発現は、細胞（リソソーム）の中の粒子となっ て現れる。 図５．抗リンパ球機能関連抗原1でコートしたナノスフィア、および対照によ るU937細胞のトランスフェクション効率のフローサイトメトリー解析。実際の平 均蛍光発光強度（MFI）を挿入図に示す。Msp＝ミクロスフィア、MRK＝ミスマッ チ抗-P糖蛋白質抗体、PLM＝抗LFA抗体。 図６．抗CD44でコートしたナノスフィアによってトランスフェクションされた 293s細胞における、LAMP-1の経時的発現。 図７．複合コアセルベーションによる、DNA-キトサンナノスフィアの調製。ナ ノスフィアは、Na2SO4によって誘導される高分子電解質複合体の溶媒不和化（de solvation）によって形成される。トランスフェクション効率を上げるのに役立 つが、トランスフェクションに必要ではない処理法または特徴には、複合体のコ アセルベーションの過程で、リソソーム分解剤または治療剤をナノスフィアの中 に 共に被包すること、ナノスフィアの安定性に影響するようクロスリンキングを変 化させること、レセプターが介在するエンドサイトーシスを促進させるためにナ ノスフィアの表面にリガンドを結合させることが含まれる。 図８．カルボジイミドを用いて、DNAナノスフィアの表面に、マンノース-6-リ ン酸を結合させる化学反応。 図９．カルボジイミドを用いて、DNAナノスフィアの表面に、葉酸を結合させ る化学反応。 図10．カルボジイミドを用いて、DNAナノスフィアの表面にトランスフェリン を結合させる化学反応。 図11．DNA-キトサンナノスフィアによってトランスフェクションした後のHEK2 93細胞におけるルシフェラーゼ発現の存続について示す。トランスフェクション の24時間前に、各ウェルプレートの中に8×104個のHEK293細胞を接種し、４時間 前に、1μｇのDNAを含むナノスフィアを各ウェルの細胞とインキュベートした。 さらに、この細胞を新鮮な培地でインキュベートした。5日後、3〜7日おきに（ 図中にアスタリスクで示す）、1:5の希釈率で細胞を継代した。さまざまな時点 でルシフェラーゼ活性を測定した。 図12．pDI-neoGFPプラスミドを含むキトサンナノスフィアによってトランスフ ェクションした後のHEK293細胞における緑色蛍光蛋白質の発現。トランスフェク ションの24時間前に、12ウェルプレートの各ウェルの中に8×104個のHEK293細胞 を接種し、4時間前に、１mgのDNAを含むナノスフィアを各ウェルの細胞と共にイ ンキュベートした。さらに、この細胞を新鮮な培地で3日間インキュベートし、 トリプシン処理し、ファクスキャン（FACScan）アナライザーで解析した。ナノ スフィアの量に対する陽性細胞の割合（トランスフェクション割合）が示されて いる。 図13．マンノース-6-リン酸または葉酸を結合させたナノスフィアによる、HEK 293細胞のトランスフェクション。トランスフェクションの24時間前に、12ウェ ルプレートの各ウェルの中に8×個の細胞を接種した。2μｇのDNAを含むナノス フィアを、各ウェルの細胞とともに4時間インキュベートした。新鮮な培地で、 さらに3日間細胞をインキュベートしてから、プロメガ（Promega）社製ルシフェ ラーゼ 測定システムを用いて、ルシフェラーゼの発現レベルを測定した。 図14．50mM Na2SO4、および55℃における、pRE-ルシフェラーゼpcDNA-キトサ ンのコアセルベーションに関する三相ダイアグラム。濃い色の領域が、ナノスフ ィア層が見られる濃度を示している。色の薄い領域の中では、沈殿、または集塊 化が起こり、白色の領域では、層の分離は見られない。ナノスフィアを調製する ために用いられた条件が矢印で示されている。ナノスフィアの最終組成物は、プ ラスミドDNAの重量で34.65±0.95%、キトサンの重量で65.35±0.95%であり、被 包効率は、それぞれ、98±2.0%、および92.7±3.7%である。 図15．動的光散乱光量子相関分光法（Dynamic Light Scattering and Photon Correlation Spectroscopy）によって測定される、キトサンに基づくナノスフィ アのサイズ分布を示す。ナノスフィアのサイズは、200nm〜300nmの間の狭い範囲 に集中している。 図16．ナノスフィアに処方すると、プラスミドDNAをDNase Iによる分解から保 護することができる。剥き出しのDNAおよびナノスフィアを、さまざまな濃度のD Nase Iとともに15分間、37℃でインキュベートした。DNase Iのインヒビターで あるヨード酢酸で反応を停止させた。そして、キトサナーゼとリゾチームとを用 いて2時間ナノスフィアを分解させた。全てのサンプルを0.08%ポリアクリルアミ ドゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。レーン1：分子量マーカー ；レーン2：プラスミド；レーン3：ナノスフィア；レーン4：分解されたナノス フィア；レーン5：プラスミド＋DNase（0.1μｇ）；レーン6：ナノスフィア＋DN ase（0.1μｇ）；レーン7：ナノスフィア＋DNase（0.1μｇ）＋分解；レーン8： ナノスフィア＋0.5μｇDNase；レーン9：ナノスフィア＋0.5μｇ DNase＋分解。 図17．ポリカチオン性の遺伝子担体の細胞毒性。HEK293細胞（4×104/ウェル ）を96穴プレートで培養した。24時間後に、さまざまな濃度のキトサン、ポリ-L -リシン、およびリポフェクタミンを加えた。48時間後に、標準的なプロトコー ルに従ったMTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾ リウムブロマイド;チアオリル(thiaolyl)ブルー）反応アッセイ法によって細胞 毒性を判定した。ひし形：キトサン；四角形：ポリ-L-リシン；三角形：リポフ ェクタミン。 図18．トランスフェクション後2日目のHEK293細胞における、緑色蛍光蛋白質 の発現。トランスフェクションは、異なる用量のナノスフィアを用いて、24穴プ レートの中で行った（5×104細胞/ウェル）。トランスフェクションされた細胞 は、2日後に、ファクスキャン（FACScan）を用いて選別した。Ncsp0.1＝0.1μｇ のDNAをもつナノスフィア、Ncsp0.5＝0.5μｇのDNAをもつナノスフィアなど。Sc sp＋Chlq 1＝クロロキンと1μｇのDNAをもつナノスフィア。 図19．HEK293細胞におけるナノスフィアの取り込み。ルシフェラーゼプラスミ ドでナノスフィアを製造し、細胞不浸透性のDNA結合染色液であるTO-PRO（モレ キュラープローブ社（Molecular Probe Inc.））で染色した。細胞を洗浄し、ト ランスフェクション後のさまざまな時点でトリプシン処理し、ファクスキャン（ FACScan）を用いて解析した。4℃でトランスフェクションされた細胞を、細胞表 面に結合した粒子を説明するための対照として用いた。 図20．DNA-キトサンナノスフィアおよび凍結乾燥ナノスフィアの保存安定性。 ナノスフィアは、下記の方法にしたがって作製した。PEG結合ナノスフィアは、 蔗糖勾配（50%）遠心で沈殿させた直後、凍結乾燥させた。HEK293細胞のトラン スフェクションを、前記と同じ方法にしたがって行った。 図21．DNAナノスフィアの表面にリガンドを付着させるための化学処理の概略 図。 図22．さまざまな形で輸送されたpcBLacZ遺伝子によってトランスフェクショ ンされたBALB/cマウスの筋肉におけるβ-galの発現。トランスフェクション後7 日目および21日目に発現レベルを判定し、内生的なバックグランドとなるガラク トシダーゼ活性を差し引いた。数値は平均値（n=6）+SD（標準偏差）である。好ましい態様の詳細な説明 本発明の知見は、さまざまな長さの鎖の核酸分子が、水溶液の状態で、カチオ ンポリマーと複合体を形成して、サイズがミクロン以下からミクロンという範囲 で固形のナノスフィアを形成することができるということである。これらの核酸 を負荷したナノスフィアは、効率的に細胞をトランスフェクションすることがで きる。 本発明にしたがって、ゼラチンと同程度の電荷密度をもつカチオンポリマーが 、核酸と複合体を作り、ナノスフィアを形成させるために用いられる。微小管、 アクチン、シトクロームC、ヒト血清アルブミン、およびヒストンなどの蛋白質 を、カチオンポリマーとして用いることもできる。ポリアルギニンおよびポリリ シンなどのアミノ酸のポリマーも用いることができるが、天然の蛋白質の方が好 ましい。または、キトサン、プロテオグリカン、メチルセルロース、アミロース 、およびデンプンなどの糖類をカチオンポリマーとして用いることもできる。典 型的には、カチオンポリマーの分子量は、5,000から1,000,000の間である。本発 明のカチオンポリマーとしては、キトサンが特に有用であると考えられる。望ま しくは、硫酸ナトリウムを用いて、カチオンポリマーと核酸とのコアセルベーシ ョンを誘導する。エタノールも、濃度約40から60％で、コアセルベーションを誘 導するために用いることができる。 必要に応じて、標的リガンドを、ナノスフィアの表面に直接結合させるか、ま たは、「架橋」もしくは「スペーサー」を用いて、間接的に付着させることがで きる。いくつかの多糖類および蛋白質にはアミノ酸基があるため（蛋白質のアル ギニン基とリシン基よって提供されるため）、標的部分を直接的に結合させるた めに、簡単に、ナノスフィアの表面の誘導化を行うことができる。例えば、誘導 化剤としてカルボジイミドを用いることができる。または、アビジン-ビオチン などのスペーサー（標的リガンド上の結合分子と誘導化部分）を用いて、標的リ ガンドをナノスフィアに間接的に結合させることができる。ビオチンはアビジン に対して高親和性（ka＝1015M-1）であるため（ハズダら（Hazuda）、1990、イ ンターロイキン1ベータの前駆体のプロセッシングと炎症疾患（Processing of p recursor interleukin 1 beta and inflammatory disease）、J．Biol．Chem.， 265:6318〜22；ウィルチェック（Wilchek）ら、1990、アビジン-ビオチン技術入 門（Introduction to avidin-biotin technology）、Method In Enzymology，18 4:5〜13）、ビオチニル化抗体および/またはその他のビオチニル化リガンドを、 アビジンコートしたナノスフィアの表面に、効率的に結合させることができる。 IgGの方向選択的な付着は、抗体のFc部位に存在するオリゴ糖類の基のビオチニ ル化によって行うことができる（オシャネシー（O'Shannessy）ら、1984、オリ ゴ糖部4分を接合させて免疫グロブリンを標識するための新しい方法（A novel p rocedur e for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharides moieti es）、Immunol．Lett.，8:273〜277）。この設計は、結合可能な部位の数を保存 したり、マクロファージなどのFoレセプターをもつ細胞に対する、付着した抗体 の免疫原性を低くするのに役立つ。当技術分野において知られているように、ア ビジン-ビオチン架橋以外のスペーサーを用いることもできる。例えば、免疫グ ロブリン分子のFc部位をナノスフィアに結合させるために、ブドウ球菌のプロテ インAでナノスフィアをコートすることができる。 ナノスフィアを安定化させるために、クロスリンキングを用いることができる 。これは、ゼラチンで作られたナノスフィアのように、蛋白質を基にするナノス フィアにとって、特に有効である。クロスリンキングの程度を変化させて、アプ リオリ（a priori）にナノスフィアの分解する速度と核酸が遊離する速度とを設 定することができる。クロスリンクが増加すれば、ナノスフィアの安定性が増加 する。核酸の負荷レベルは、>95％の被包効率で、30％（w/w）まで高めることが できる。 結合分子、または標的リガンドの、ナノスフィアへのクロスリンキングを用い て、ナノスフィアの安定性を向上させるとともに、ナノスフィアへの結合分子、 または標的リガンドの結合を共有的に付加することができる。クロスリンキング の程度は、ミクロスフィアからの核酸の解離速度に直接的に影響する。グルタル アルデヒド、EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド） などのカルボジイミド、DCC（N,N'-ジクロロヘキシルカルボジイミド）、カルボ キシル（ペプチド結合）結合、ビス（スルホサクシンイミジル）スベリン酸、ジ メチルスベルイミデート（dimethylsuberimidate）などを用いて、クロスリンキ ングを行うことができる。 本発明に記載された標的リガンドは、身体の特異的な型の細胞に結合する分子 であればよい。これらは、それらに対する細胞内レセプターが存在するものであ れば、いかなるタイプの分子であってもよい。好ましくは、この細胞内レセプタ ーは、特異的な細胞型でのみ発現される。用いることのできる標的リガンドの例 には、ホルモン、抗体、細胞接着分子、糖類、薬物、および神経伝達物質がある 。 本発明に係るナノスフィアには、優れた負荷特性がある。典型的には、本発明 の方法にしたがって、少なくとも5％（w/w）の核酸をもつナノスフィアを作製す ることができる。好ましくは、負荷するのは、10または15％よりも多い核酸であ る。しばしば、20または30％よりも多いが、40または50％よりは少ない核酸を有 するナノスフィアを作製することができる。典型的には、95％よりも高い、ナノ スフィアへの核酸の負荷効率を実現することができる。 本発明に係る方法には、カチオンポリマーと核酸とのコアセルベーションが含 まれる。このプロセスは、正に荷電したカチオンポリマーと、負に荷電した核酸 との相互作用に依存するため、複合的なコアセルベーションプロセスと考えるこ とができる。しかし、硫酸ナトリウム（またはエタノール）は、相転移を誘導す ることによって、コアセルベーション反応を誘導するため、簡単なコアセルベー ション反応と考えることもできるかもしれない。核酸は、コアセルベーション混 合液の中に、1ng/mlから500μｇ/mlの間の濃度で存在する。望ましくは、この核 酸は、少なくとも約2〜3kbの長さであるが、10、20、または50kbにまで及んでも よい。硫酸ナトリウムは、5mM〜100mMの間で存在する。ゼラチンまたはその他の カチオンポリマーは、コアセルベーション混合液の中に、約.01％〜7％の間で存 在し、好ましくは2％〜5％（w/v）の間で存在する。典型的には、糖に基づくポ リマーよりも、アミノ酸に基づくポリマーでは、約10倍量のポリマーが必要とな る。したがって、一般的に、ゼラチンは1〜5％で用いられるが、キトサンは、一 般的に、0.01〜0.05％で用いられる。キトサンを用いたとき、核酸の適当な濃度 は、0.002％〜0.008％の間にある。 魅力のあるナノスフィア輸送システムには、調製の簡易さ、費用効果性、核酸 負荷レベル、制御された解離能力、保存安定性、および成分の免疫原性が必要と される。本明細書で説明されている遺伝子輸送システムは、リポソームシステム を含む、他の微粒子輸送システムに比べて利点を提供することができる。不安定 性、低い負荷レベル、および制御された解離能力という問題は、ナノスフィアポ リマーシステムによって、より良い状態へと解決される。ゼラチンは、生物親和 性があり、インビボで酵素的に分解することができるため、手術用組織接着剤（ バインシェルバウム（Weinschelbaum）ら、1992、生来の大動脈弁を保存しなが ら の急性A型解離性動脈瘤の外科的処置、および生物学的接着剤の使用。6年間の追 跡調査（Surgical treatment of acute type A dissecting aneurysm with pres ervation of the native aortic valve and use of biologic glue．Follow-up to 6 years）、J．Thorac．Cardiovasc．Surg.，130:369〜74）から、定量的な 免疫組織学的アッセイ法（イズミ（Izumi）ら、1990、現地でのハンセン病の血 清診断のための、新しいゼラチン粒子凝集テスト法（Novel gelatin particule agglutination test for serodiagnosis of leprosy in the field）、J．Clini cal Microbiol.，28:525〜9）までの広い範囲で、また、薬物輸送媒体（タバタ （Tabata）ら、1991、マウスの腫瘍細胞増殖に対する、インビボでの組換えアル ファ-インターフェロン-ゼラチンの効果（Effects of recombinant alpha-inter feron-gelatin conjugate on in vivo murine tumor cell growth）、Cancer．R es.,51:5532〜8）として生物学的に使用されることが増えてきた。広範に研究さ れたポリ乳酸/ポリグリコール酸のコポリマーのような他の合成ポリマーシステ ムに較べると、ナノスフィア処方剤の緩和な条件は魅力的である。合成ナノスフ ィアポリマーを処方するために用いられる溶媒蒸発とホットメルト技術とは異な り、複合的コアセルベーションには、これは、有機溶媒や熱を用いる必要がない 。受動的溶媒捕獲によるだけでなく、直接的な電荷-電荷相互作用によっても核 酸などの生体高分子を被包するのに特に適している。 10kbよりも大きい遺伝子を輸送することができないウイルスベクターとは異な って、本発明に係るナノスフィア輸送システムには、サイズによる制約がない。 約2kbよりも大きい核酸分子を用いることができ、10から50kbの核酸分子でさえ も用いることができる。 一般的に、可能な標的の範囲は、例えば、静脈内、または動脈内、皮下、腹膜 内、鞘内などの注射経路に依存する。全身注射では、この輸送システム特異性は 、血液に運ばれているナノスフィアへの標的の接触可能性によって影響を受け、 また、粒子の大きさによっても影響を受ける。粒子のサイズは、コアセルベーシ ョン混合液の温度、成分濃度、およびpHによって影響を受ける。また、この粒子 は、例えば、ショ糖勾配超遠心分離によってサイズ分画することもできる。150 ナノメートルよりも小さいサイズをもつ粒子は、ほとんどの血管壁の内側にある 開 口部を通って、間隙部に入ることができる。このような環境の下では、標的とす ることのできる細胞の範囲は大きい。標的とすることのできる細胞の略表には、 肝臓の洞様毛細血管の実質細胞、結合組織の線維芽細胞、膵臓のランゲルハンス 島の細胞、心筋細胞、腸管の主細胞と壁細胞、骨の骨細胞と軟骨細胞、ケラチノ サイト、末梢神経系の神経細胞、腎臓と肺の上皮細胞、精巣のセルトーリ細胞な どが含まれる。0.2ミクロンよりも大きいサイズをもつ粒子の標的となるのは、 ほとんど脈管部分に限定されるはずである。ここで、標的となりうる細胞型には 、赤血球、白血球（すなわち、単球、マクロファージ、B型リンパ球、T型リンパ 球、好中球、ナチュラルキラー細胞、前駆細胞、肥満細胞、好酸球）、血小板、 および内皮細胞が含まれる。 皮下注射では、標的となりうる細胞には、結合組織に存在する全ての細胞（例 えば、線維芽細胞、肥満細胞など）、ランゲルハンス細胞、およびケラチノサイ ト、筋細胞が含まれる。鞘内注射では、標的となりうる細胞には、ニューロン、 グリア細胞、星状細胞、および血液脳関門の内皮細胞が含まれる。腹腔内注射で は、標的となりうる細胞には、マクロファージおよび好中球が含まれる。 キトサンを用いて作出されたナノスフィアのような、糖に基づくナノスフィア は、多くの利点を備えている。クロスリンキングは必要ではない。さらに、標的 リガンドを用いることはできるが、必要でない。本出願人らは、いかなる特殊な 理論にも束縛されたくはないが、細胞には、キトサンが結合するレセプターがあ ると考える。キトサンを用いるコアセルベーション混合において必要とされるDN A濃度は、ゼラチンを用いるときに必要とされる濃度の約半分である。さらに、 必要とされるキトサンの濃度は、ゼラチンナノスフィアを作製するのに必要とさ れる濃度の10分の1である。キトサンに基づくナノスフィアは、凍結乾燥させる ことができるため、保存安定性がある。 キトサンに基づくナノスフィアは、クロスリンクさせたり、標的リガンドと反 応させる必要がないため、形成させた後、合成後の精製を行う必要なしに、すぐ に用いることができる。この合成後の処理をなくすことによって、作成したばか りのコアセルベートを、細胞にトランスフェクションするために直接用いること が可能になる。キトサンに基づくナノスフィアと、ゼラチンに基づくナノスフィ アとの間でさらに対照的なのは、トランスフェクション効率に及ぼすクロロキン の効果である。ゼラチンのシステムでは、クロロキンは、トランスフェクション 効率を向上させる。しかし、キトサンのシステムでは、クロロキンは、トランス フェクション効率を向上させない。効率的な細胞内輸送にとっては、ナノスフィ アのサイズが重要だと考えられている。典型的に、ナノスフィアは、4、3、2μ ｍ、さらには1μｍよりも小さい。最も好ましくは、固形粒子は、200nm〜300nm の間である。 実施例： 実施例１ 基質材料：ゼラチン（60ブルーム、ブタの皮膚から採取したA型）、コンドロ イチン4-硫酸、グルタルアルデヒド（25％、1級）、1-エチル-3-(-3ジメチルア ミノプロピル)-カルボジイミド塩酸（EDC塩酸）、および超高純度ショ糖をシグ マ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）（ミズーリ州セントルイス）から購入し た。ビオチンLCヒドラジド、およびニュートラビジン（NeutrAvidin）、および クーマシー蛋白質測定試薬は、ピアス社（Pierce）（イリノイ州、ロックフォー ド）から購入した。セントリコン（Centricon）微量濃縮装置は、アミコン社（A micon）（マサチューセッツ州ビバリー）から購入した。 モノクローナル抗体：マウスのLFA-1とも交差反応するBALB/cマウス抗-ブタLF A-1（IgG1b）であるmAb PLM-2を、以前に説明されたとおりにして、単離精製し た（ヒルドレス（Hildreth）ら、1989、ブタLFA-1に対するモノクローナル抗体 ：生物種間での交差反応性と、ｂ-サブユニット特異的な抗体の機能的効果（Mon oclonal antibodies against porcine LFA-1:specie scross-reactivity and fu nctional effects of b-subunit-specific antibodies）、Molec．Immunol.，26 :883〜895）。ラット抗-マウスLAMP-1腹水であるIB-4B、およびマウス抗-ヒトCD 44mAbを、以前に説明されたとおりに、単離した（デウェット（de Wet）ら、198 7、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子：哺乳動物細胞における構造と発現（Firefly luciferase gene:structure and expression in mammalian cells）、Mol．& C ell．Biol.，7:725〜37）。CHAは、インビボで、既知のマウスエピトープのいず れをも認識しないIgG1である（ハイブリテック社（Hybritech Inc.）、カリフォ ル ニア州サンディエゴ）。アフィニティー精製したFITCとテキサスレッド標識され たポリクローナル抗-ラットIgGは、シグマ社（Sigma）から入手した。 遺伝子：2つの遺伝子を用いて、この輸送システムの実用可能性を明らかにし た。LAMP-aのcDNAは、CMVプロモーターをもつインビトロジェン社（Invitrogen) のプラスミドcDNAの中に挿入されたマウスLAMP-1遺伝子（2.4kb）をもつ、6.4kb の環状スーパーコイルプラスミドcDNAである（グアルニエリ（Guaarnieri）ら、 1993、J．Biol．Chem.，268:1941）。LAMP-1発現の検出は、抗-LAMP-1mAbと、テ キサスレッドを結合した抗IgG mAb二次抗体とによって細胞を染色して行われた 。アッセイの感度が高く、簡便で、費用がかからないため、遺伝子発現を研究す るために、細胞生物学では、ルシフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が広く用い られる。さらに、この酵素は、酵素活性を生じる為の翻訳後プロセッシングを必 要としない細胞質蛋白質であるため、優れた遺伝子発現レポーターとなる（デウ ェット（de Wet）ら、1987、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子：哺乳動物細胞にお ける構造と発現（Firefly luciferase gene:structure and expression in mamm alian cells、Mol．& Cell．Biol.，7:725〜37；ウッド（Wood）ら、1989、甲虫 のルシフェラーゼとその応用への手引き（Introduction to beetle luciferase and their applications）、J．of Biolumin．& Chemilum.，4:289〜301）。光 子の発生（化学発光という形で）を同時に伴う甲虫ルシフェリンの酸化を含む酵 素反応によって、ルシフェラーゼの存在を容易に検出することができる。このア ッセイ法は、プロメガ社（Promega Corp.）（ウィスコンシン州マディソン）か ら購入した解析キットを用いて行った。 ミクロスフィアの合成：ゼラチン-DNAコアセルベートを合成するための詳細な 概略図が図1に示されている。別段の記載がない限り、記載されている濃度はす べて、67℃に設定された反応混合液中の最終濃度である。まず、リソソームに結 合した膜蛋白質-1（LAMP-1）をコードするプラスミドDNA（6.7kb、環状スーパー コイル）の3.5mg/ml溶液を42mMの硫酸ナトリウム（Na2SO4）で調製することによ って、アビジンでコートされたゼラチン/プラスミドDNAのナノスフィアを合成し た。DNA/Na2SO4溶液に、等量のゼラチン（5％）を加えて、高速で1分間ボルテッ クスにかけながら、コアセルベーションを開始した。ゼラチンを用いたコアセル ベーションを開始する前に、DNA/Na2SO4溶液に直接加えることによって、薬物と その他の因子の同時被包を行うことができる。最終濃度が75μｇアビジン/mlミ クロスフィア溶液となるように、ミクロスフィア懸濁液に、アビジン（5mg/ml） を加えた。ミクロスフィア混合液を70％ショ糖（w/v）層の上に載せて、6,000× gで4分間遠心分離した（ブリンクマン・インストルメント社（Brinkman Instrum ents Inc.）、ニューヨーク州ウエストベリー、モデルL8-75）。ショ糖層から回 収されたミクロスフィア画分を水で5倍に希釈してから、グルタルアルデヒド（ 最終濃度12.5mM）を用いて、室温で10分間クロスリンクさせた。エタノールアミ ン（1M）を10分間加えて、反応しなかったグルタルアルデヒドを除いた。上記の ようにして、ショ糖遠心分離によって、ミクロスフィアを透析させた。 アビジンコートしたミクロスフィアへのビオチニル化したmAbの接着：30μｇ の抗体（確立した方法（オシャネシー（O'Shannessy）ら、1984、オリゴ糖部分 を接合させて免疫グロブリンを標識するための新しい方法（A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharides moieties ）、Immunol．Lett.，8:273〜277）によってビオチニル化されている）を、アビ ジンコートしたミクロスフィア懸濁液（11mg/ml）1mlの中に加えて、1時間ゆっ くりと攪拌した。透析して、結合しなかったmAbをミクロスフィアから取り除い た。 ミクロスフィアの特徴分析および結合の実施:DNAを負荷したミクロスフィアは 、光学顕微鏡で判定したところ、3ミクロンよりも小さいサイズの粒子が多分散 した、多様なコロイド形状を示した。精製されたミクロスフィアは、少なくとも 1ヶ月は、分解が認められず、安定していた。LAMP-1プラスミドDNAに関する負荷 レベルは、20％（w/w）であった。被包効率は、典型的には、>95％であった。遊 離したLAMP-1DNAと（ミクロスフィアから）解離したDNAの、1％アガロースゲル 電気泳動での移動度は一致していたが（図2）、このことは、被包されたDNAが、 本来の形状で解離されることを示唆している。ミクロスフィアからのcDNAの解離 速度は、クロスリンキング密度と酵素レベルに依存していた（図4）。数週間に わたる解離の持続が容易に得られた。 本発明者らは、組織培養において、LAMP-1DNAを負荷したミクロスフィアが、 ヒトの組織球リンパ腫細胞系（U937）に結合した後、トランスフェクションする こ とができるかをテストした。抗-LFAまたは抗-CD44モノクローナル抗体（どちら の標的蛋白質も、U937細胞の表面で大量に発現していた）でコートされている場 合、LAMP-1を認識する抗体で染色すると、LAMP-1蛋白質の発現が、3日目までに 検出された（図4A、蛍光発光している粒子）。LAMP-1ミクロスフィアとインキュ ベートしたU937細胞の染色パターンは、トランスフェクションのリン酸カルシウ ム法と同じであった（図4B）。アビジンまたは非特異的なCHA mAbでコートされ たミクロスフィアは、粒子状の染色パターンを示さず、非処理の細胞と同じであ った（図4C）。 本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、培養中のU937細胞の5％に至 るまでの細胞でLAMP-1の発現が検出されることを示した（図5）。いずれの対照 −ミクロスフィアのみ、cDNAをもつが、抗体をもたないミクロスフィア、cDNAを もち不適合な抗-P-糖蛋白質抗体（MRK-Msp.）でコートされたミクロスフィア、 およびミクロスフィアの中に捕捉されているよりも6倍高い濃度の遊離cDNA−に おいてもトランスフェクションしたという証拠は示されなかった。トランスフェ クション効率は、用量応答的であると思われる。一般的に、この特定の遺伝子と 細胞型のトランスフェクション効率は、提案されたミクロスフィア輸送システム （1〜10％）とリン酸カルシウム沈殿法（2〜15％）との間で同等であった。図6 は、異なるモノクローナル抗体を用いた、異なる細胞型における概念を示してい る。ここでも、遊離のcDNAは、細胞をトランスフェクションすることができなか った。何度か継代した後、LAMP-1の発現は最後には見られなくなった。また、ル シフェラーゼレポーター遺伝子システムに関しても、肯定的な結果が得られた。 ルシフェラーゼ遺伝子を負荷したミクロスフィアとともにインキュベートした29 3s細胞においてルシフェラーゼの酵素活性を測定することにより、トランスフェ クションが明らかに検出された。 実施例２ DNAナノスフィアを合成する一般的概念が図7に示されている。 ゼラチン（蒸留水中5％w/v）と4mMのクロロキンとを含む100mlの溶液、および 0.2mg/mlのプラスミドDNAと4.3mMの硫酸ナトリウム（Na2SO4）とを含む100mlの 溶液を、55℃で1分間ボルテックスして、DNA-ゼラチンナノスフィアを合成し た。より高いNa2SO4濃度（45mM）を用いたこと以外は同様にして、クロロキンを 含まないナノスフィアを合成した。混合液を100mlのショ糖層（55％w/w）の中で 、40,000×gで7分間遠心分離して、反応しなかった成分を除去した。ナノスフィ アを含むショ糖画分を、水で200mlまで希釈してから、ナノスフィアとトランス フェリン溶液（20mg）を、0.1mg/mlの（1-エチル-3-[-3ジメチルアミノプロピル ]-カルボジイミド塩酸）（EDC）を含む22mlの0.2M MES緩衝液、pH4.5に加えるこ とによって、トランスフェリンとクロスリンクさせ結合させた。この反応を室温 で30分間行い、その後、グリシンを最終濃度が0.2Mになるまで加えて停止させた 。また、さまざまな濃度のグルタルアルデヒドと10分間反応させることにより、 クロスリンクも行った。キトサン溶液を0.02％（w/v、5mM NaAc-H0Ac中、pH5.5 ）に希釈した以外は同様にして、DNA-キトサンナノスフィアを調製した。 実施例３ DNAナノスフィアを合成する一般的概念が図7に示されている。キトサンまたは ゼラチン-DNA複合体のミクロ粒子状コアセルベートが、高分子電解質の部分的な 水環境の、Na2SO4によって誘導される溶媒不和化（desolvation）の結果として 形成された。ナノスフィアの合成は、図14の三相のダイアグラムに示されている ように、塩濃度、pH、温度、および反応物の濃度に関しては最適化された。55℃ で、pH5.5、および硫酸ナトリウム濃度が50mMで、キトサンについては、0.005か ら0.02％（w/v）、DNAについては0.004から0.008％の濃度範囲において、粒子状 のキトサン-DNA複合体の相分離が起こる。図15のTEMおよびSEMで示されているよ うに、200〜320nmの範囲のナノスフィアが形成された。 固形のナノスフィアは、DNAを酵素による分解から保護する（図16）。ヌクレ アーゼがDNAを分解する10％ウシ胎児血清（FBS）の中で、DNA-キトサンナノスフ ィアの安定性実験を行った。ゲル電気泳動による移動度解析によって、血清中で 15分間インキュベートされた剥き出しのDNAは、明らかな徴候を示した（レーン5 ）が、ナノスフィア中のDNAは無傷のままであった（レーン6および7）。5倍高い ヌクレアーゼ濃度の0.5μｇ/mlでもなお、分解を示す徴候は見られなかった（レ ーン8および9）。 キトサンの細胞毒性を、他のポリカチオン遺伝子担体と比較した（図17）。キ トサンは、少なくとも200μｇ/mlの濃度までは毒性がなかった。GFP DNAを含むD NA-キトサンナノスフィアは、用量応答的な様式で、293細胞をトランスフェクシ ョンした（図18）。ファクスキャン（FACScan）解析で示されたように、DNA-キ トサンナノスフィアの取り込みは急速であった（図19）。２時間のインキュベー ションで、ほぼ100％の細胞が、飽和しうるような動態を示しながら、ナノスフ ィアを取り込んだ。 集塊を作ることなく凍結乾燥させるために、図21に示した化学処理のスキーム にしたがって、ナノスフィアを誘導体化した。50mgのpcDNAを含むDNA-キトサン ナノスフィア懸濁液の1mLを、５mLのDSS溶液（10mM）、10mLのa-マレミジル-w-N −ヒドロキシサクシンイミジルポリ(エチレングリコール)溶液(NHS-PEG-MAL、分 子量2000、5mM)、20mLのメトキシポリ(エチレングルコール)のサクシンイミジル サクシンアミド溶液（SSA-PEG、分子量5000、10mM）、および100mLのPBS緩衝液 と共にボルテックスにかけて混合した。この混合液を、50mLの1Mグリシンを加え て反応を終結させる前に、室温で30分間撹拌して、その後、スルフヒドリル基で 修飾された250mgのトランスフェリン（2-イミノチオレイン反応によって、遊離 のスルフヒドリル基をトランスフェリンに導入し、修飾の程度は、トランスフェ リンあたり3〜6であった）を加えた。室温で2時間反応させた後、混合液を55％ ショ糖勾配中、50,000gで20分間超遠心した。単離されたナノスフィアを直接凍 結乾燥させた。ナノスフィアの表面へのPEG5000の結合により、溶液中のあらゆ る凝集が最小化された。これらのナノスフィアは、抗粘結剤なしに凍結乾燥させ ることもでき、簡単に再懸濁することができた。ナノスフィアのトランスフェク ション効率は、このPEG誘導体化による影響を受けなかった（図20）。また、シ ョ糖溶液または凍結乾燥状態にて保存することによっても影響を受けなかった。 LacZプラスミド（1mgの全DNA）、DNA-リポフェクタミン複合体（1mgの全DNA） 、剥き出しのプラスミドDNA（1mg）、またはAAV-LacZの５×1010のウイルス粒子 を含むゼラチンナノスフィアを20mlに懸濁して、６週齢のBALB/cマウスの脛の前 面の筋束に注射して、インビボでのトランスフェクション効率の比較を行った。 １週間後および３週間後に、筋肉を分離して、破砕し、トロピックス社（Tropix ）（マサチューセッツ州ベドフォード）によって供給された解析キット（「ガラ クトライト（Galacto-Light)」）によって、レポーター遺伝子の発現を判定した 。1mgのLacZ遺伝子を含むゼラチンナノスフィアを、マウスの脛の筋束に注射し たところ、少なくとも21日間はβ-galを発現していた（図22）。同量の剥き出し のDNAに関するレベルは、7日目で10〜30倍低く、21日目までには、バックグラウ ンドのレベルにまで落ちた。これらに対応してインビトロで行った実験とは対照 的に、リポフェクタミン複合体は、ナノスフィアほど効率的ではなかった。7日 目の発現レベルは、剥き出しのDNAの発現よりも低いほどであった。全体的に観 察してみたところ、リポフェクタミン複合体によって処理された筋肉組織では、 急性の炎症反応が起きていて、そのために、思わしくない結果になったとも考え られる。７日目のナノスフィアの発現よりも50〜100倍高いβ-gal発現を誘導し 、また、恐らくウイルスが複製したために、21日目には、このレベルが、さらに 6〜12倍上昇したため、AAVベクターが最も効率的であった。 cDNAと、ゼラチンおよびキトサンなどのポリカチオンとの、塩に誘導された複 合体のコアセルベーションによって合成されたナノスフィアは、効率的な遺伝子 輸送媒体である。サイズの範囲が200〜750nmのDNA-ナノスフィアは、さまざまな 細胞系をトランスフェクションすることができた。ナノスフィアのトランスフェ クション効率は、細胞培養物においては、一般的に、リポフェクタミンおよびリ ン酸カルシウムの対照の効率よりも低いが、BALB/cマウスの筋肉におけるβ-gal の発現は、剥き出しのDNAおよびリポフェクタミン複合体によって行われた場合 よりも高く、また持続性があった。この遺伝子輸送システムには、いくつかの魅 力的な特徴がある。すなわち、1）リガンドがナノスフィアに結合すると、レセ プターによって媒介されるエンドサイトーシスを促進することができ、2）リソ ソーム分解因子が取り込まれて、エンドソームとリソソーム分画におけるDNA分 解を抑制することができ、3）その他の生物活性因子または複数のプラスミドを 同時に被包させることができ、4）基質によって血清中のヌクレアーゼによる分 解から保護されるため、DNAの生物学的利用の可能性を向上させることができ、5 ）ナノスフィアは、血漿電解質中で安定しており、生物活性を失わせることなく 、保存のために凍結乾燥できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 トロング トーマス アメリカ合衆国 メリーランド州 バルチ モア マクエルデリー ストリート 2008 (72)発明者 オーガスト トーマス アメリカ合衆国 メリーランド州 バルチ モア ポピラー ヒル ロード 905 (72)発明者 レオング カム ダブリュ. アメリカ合衆国 メリーランド州 エリコ ット シティー ブリコンシャイアー ロ ード 10242

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1．カチオンポリマーおよびポリアニオンを含む、細胞に遺伝子を輸送するた めの3μｍよりも小さい固形のナノスフィアであって、ポリアニオンが核酸を含 み、カチオンポリマーがポリリシンではないナノスフィア。 2．カチオンポリマーが糖類である、請求項1記載のナノスフィア。 3．カチオンポリマーがキトサンである、請求項2記載の固形のナノスフィア。 4．ナノスフィアが、5％（w/w）よりも多量の核酸を含む、請求項1記載のナノ スフィア。 5．ナノスフィアが、20％（w/w）よりも多量の核酸を含む、請求項1記載のナ ノスフィア。 6．核酸が2〜20kbの遺伝子を含む、請求項1記載のナノスフィア。 7．特異的な標的細胞に遺伝子を輸送するために、固形のナノスフィアを形成 する方法であって、核酸とポリリシンではないカチオンポリマーとのコアセルベ ーションによって3μｍよりも小さいナノスフィアを形成する段階を含む方法。 8．カチオンポリマーが糖類である、請求項7記載の方法。 9．硫酸ナトリウム存在下でコアセルベーションを行う、請求項8記載の方法。 10．カチオンポリマーがキトサンである、請求項8記載の方法。 11．コアセルベーションの段階において、約0.01〜7％の濃度でカチオンポリ マーが存在する、請求項8記載の方法。 12．コアセルベーションの段階において、核酸が１ng/mlから500μｇ/mlの濃 度で存在する、請求項8記載の方法。 13．コアセルベーションの段階において、硫酸ナトリウムの濃度が、約5〜100 mMの間である、請求項8記載の方法。 14．下記の段階を含む、遺伝子を細胞へ導入するための方法： (a)トランスフェクトする細胞を(b)カチオンポリマー分子と核酸分子とを含む 3μｍよりも小さい固形ナノスフィアと共にインキュベートする段階であって、 それにより該細胞が該核酸分子によりトランスフェクトされ、カチオンポリマー 分子がポリリシンではない段階。 15．カチオンポリマー分子が糖類である、請求項14記載の方法。 16．カチオンポリマー分子がキトサンである、請求項15記載の方法。 17．核酸がDNAである、請求項15記載の方法。 18．核酸がRNAである、請求項15記載の方法。 19．細胞が培養されている、請求項14記載の方法。 20．細胞が動物の体内にある、請求項14記載の方法。
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