KR20220115569A - 돌연변이 calr 및 jak2에 기반한 백신 및 이의 용도 - Google Patents

돌연변이 calr 및 jak2에 기반한 백신 및 이의 용도 Download PDF

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리카르도 아타르
제이슨 디하트
샐리나 칸
비노드 크리쉬나
제니퍼 럼
크리스티안 메인
바바라 샌더스
마누엘 알레한드로 세풀베다
패트릭 윌킨슨
롤랜드 잔
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

돌연변이체 CALR 및 JAK2 서열을 기반으로 하는 백신, 폴리펩티드, 및 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 바이러스, 및 이들의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 본 개시내용은 또한 면역 반응을 유도하는 방법 및 JAK2V617F 또는 CALR 엑손 9 돌연변이체, 또는 JAK2V617F 및 CALR 엑손 9 돌연변이체 둘 모두의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 벡터를 포함하는 조성물 중 임의의 것의 복수의 투여를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

돌연변이체 CALR 및 JAK2를 기반으로 하는 백신 및 이의 용도
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 18일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/936,841호 및 2019년 11월 18일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/936,846호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2020년 11월 6일자로 생성된 ASCII 카피는 파일명이 JBI6177USNP1_SL.txt이며, 크기가 65,758 바이트이다.
기술분야
돌연변이체 칼레티쿨린(CALR) 및 Janus 키나제 2(JAK2) 서열을 기반으로 하는 백신, 폴리펩티드, 및 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 바이러스, 및 이들의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
BCR-ABL-MPN이라고도 불리는 고전적인 골수증식성 신생물(MPN)은 골수증식성 장애 중에서 가장 빈번한 질환이다. MPN은 완전히 기능적인 최종 분화된 혈구의 과도한 생성을 특징으로 한다. 고전적인 MPN은 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판혈증(ET), 및 원발성 골수섬유증(PMF)의 3개의 실체로 분류되었으며, 이는 빈번한 질환-관련 합병증, 예컨대 정맥 및 동맥 혈전증, 출혈, 및 급성 골수성 백혈병(AML) 으로의 전환을 갖는다. 모든 MPN 실체는 클론적으로 팽창하고 사실상 모든 골수 세포, 및 B 및 NK 세포를 발생시키는 단일 체세포 돌연변이된 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 발생한다. MPN HSC의 클론 확장은 단일- 또는 다중-계통 과형성을 수반한다.
PV는 과량의 적혈구 및 우세한 적혈구 계통 관여를 특징으로 할 뿐만 아니라, 거핵구/과립구 계통의 가변적 과형성과도 연관된다. ET는 거핵구 과형성을 갖는 증가된 혈소판 계수를 특징으로 하는 반면에, PMF는 골수 섬유증(특히, 과량의 콜라겐 섬유) 및 거핵구 과형성의 존재에 의해 정의된 더 불균질한 장애이다. PMF에서의 골수증식은 초기에는 골수에서 우세하고 후기에는 비장과 같은 골수외 부위로 확장된다. 질환 발병에서의 진단은 종종 난제이지만, MPN에 대한 세계 보건 기구(WHO) 진단 기준의 2016 개정은 MPN의 분자적, 임상적, 및 증상적 제시 모두를 정의하는 데 도움이 된다. 그러나, 많은 환자에서, ET 및 PV의 속발성 골수섬유증(MF)으로의 진행이 관찰된다. 추가로, 이들 3개의 장애 사이의 경계는, 특히 ET와 PMF 사이에서, 잘 확립될 수 없다. 따라서, 전형적인 골수 조직학으로 진단시에 ET 표현형을 나타내는 전섬유화 PMF(또는 초기 PMF)와 같은 질환 상태를 설명하는 이행 실체가 부각될 수 있지만, 진성 ET보다 MF로 진행할 확률이 높고 예후가 더 불량하다.
MPN을 갖는 환자의 50% 초과는 JAK2V617F 돌연변이를 보유한다. 또한, JAK2 야생형 본태성 혈소판혈증(ET) 또는 원발성 골수섬유증(PMF)을 갖는 환자의 대략 60%에서 칼레티쿨린(CALR) 유전자의 엑손 9에서의 돌연변이가 발견된다.
2005년에, JAK2의 엑손 14에서 뉴클레오티드 1849에서의 G로부터 T로의 체세포 돌연변이가 발견되었다. 이러한 돌연변이는 JAK2의 슈도키나제 도메인 내의 코돈 617(V617F)에서 발린의 페닐알라닌으로의 치환을 유발한다. 이러한 돌연변이는 골수증식성 신생물(MPN)의 약 70%에서 발견될 수 있다: 진성 적혈구증가증(PV)의 95% 및 ET 및 PMF의 50% 내지 60%. JAK2V617F는 종종 유사분열 재조합의 발생으로 인해 이형접합성으로부터 동형접합성으로 이행하여, 염색체 9의 짧은 아암(9pLOH) 상의 가변 크기 영역을 따라 이형접합성의 카피-중성 상실(copy-neutral loss)을 유발한다. JAK2V617F는 다능성 조혈 전구체에서 발생하고, 모든 골수 계통에 존재하며, 또한 림프구 세포, 주로 B 및 자연 살해(NK) 세포에서, 그리고 더 희귀하게 질환의 후기에 T 세포에서 검출될 수 있다. 환상 철적모구 및 혈소판증가증(RARS T)을 동반하는 불응성 빈혈을 제외하고는, JAK2V617F는 주로 고전적 MPN으로 제한된다. 그러나, 신생아를 포함하는 정상 집단에서 JAK2V617F는 매우 낮은 수준(1% 미만)으로 검출되었다. 그것은 노화와 연관된 클론성 조혈증(잠재성 불명의 클론성 조혈증(clonal hematopoiesis of indeterminate potential))에서 발견되는 가장 빈번한 돌연변이 중 하나이다. JAK2V71F 돌연변이의 존재는 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 신호전달의 구성적 활성화를 유발하여 증가된 세포 증식, 활성화, 및 자가분비/측분비 방출을 유발한다. JAK2V617F 돌연변이는 또한 심혈관 적응증을 갖는 환자에서 확인되었다.
2013년에, JAK2 유전자 내의 V617F 돌연변이(JAK2V617F) 및 트롬보포이에틴 수용체(MPL) 유전자 내의 돌연변이에 대해 음성인 본태성 혈소판혈증(ET) 및 원발성 골수섬유증(PMF) 환자에서 CALR 유전자의 엑손 9에서의 프레임시프트 돌연변이가 확인되었다. 50개 초과의 프레임시프트 돌연변이가 확인되었으며, 85% 초과가 동일한 44-아미노산-돌연변이체 C 말단 테일을 유발하였다. C 말단 테일의 돌연변이는 KDEL 모티프를 제거하여 소포체(ER) 체류 및 세포 표면 막으로의 전좌의 상실을 유발한다. 또한, CALR의 돌연변이체 버전은 양성 하전된 C 말단 테일을 가지며, 이는 Ca2+ 결합을 방해하고 표준 기능을 제한한다. 2개의 가장 빈번한 CALR 돌연변이는 유형 1로도 불리는 52 bp 결실(p.L367fs*46), 및 유형 2라고도 불리는 5 bp 삽입(p.K385fs*47)에 상응한다. ET와 PMF에서의 유형 1 및 유형 2 돌연변이 사이에는 빈도의 큰 차이가 존재한다: ET에서는 유형 1 및 유형 2 돌연변이가 근접하여 분포되는 반면에(55% 대 35%), PMF에서는 유형 1이 크게 우세하다(75% 대 15%). 종합하면, 이들 결과는 돌연변이체 CALR이 발암 요인(oncogenic driver)이며 CALRmut는 MPL-JAK2-STAT 신호전달 경로를 통해 전환을 유도함을 나타낸다.
MPN 환자는, 또한 제한된 치료 옵션을 가지면서, 높은 증상 부담, 생명-위협적 합병증, 및 급성 백혈병으로 진행할 위험을 갖는다. MPN 환자 치료는 관찰, 의학적 요법, 및 동종이계 줄기 세포 이식(allo-SCT)의 카테고리로 가장 잘 분할된다. 의학적 요법 자체는 세포감소제(cytoreductive agent), 단일-제제 JAK 억제제, 및 면역조절제 인터페론(IFN)-α의 카테고리에 속한다. 특이적으로 MPN을 갖는 환자에 대해, 현재 표준 치료이며, 유일한 승인된 치료제는 소분자 JAK1/2 억제제 JAKAFI®(룩솔리티닙)이다. JAKAFI®(룩솔리티닙)는 중간 내지 고위험 PMF 및 진성 적혈구증가증-후 골수섬유증(PPV-MF) 및 본태성 혈소판혈증-후 골수섬유증(PET-MF)에 대한 최초의 표적화된 미국 식품의약국(FDA)-승인 의약품이었지만, 더욱 최근에는 PV 및 이식편-대-숙주 질환(GVHD) 환자 집단 둘 모두에서 또한 승인을 얻었다. COMFORT-I 및 COMFORT-II 연구에서 효능이 확립되었으며, 1차 종점으로서 비장 크기의 유의한 감소를 나타냈다. 그러나, 반응의 상실, 질환 진행, 및 치료-관련 유해 사건으로 인한 중단은 3 년에 환자의 약 50% 및 5 년에 75%를 포함하였다. JAKAFI®(룩솔리티닙) 요법은 또한 MF 환자에서 공격적 B-세포 림프종에 대한 증가된 위험과 연관되었다. 실제로 JAKAFI®(룩솔리티닙) 치료를 중단한 107명의 MF 환자의 연구에서, 중간 전체 생존은 단지 14 개월이었다. JAKAFI®(룩솔리티닙) 사용으로 생존 이익을 도출할 수 있는 환자의 서브세트가 존재하지만, 대부분의 MPN 환자는 이들의 질환이 계속 진행한다.
본 개시내용은 적어도 2개 이상의 하기 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다: 서열 번호 6(FCGDENILV)의 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프, 서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프, 서열 번호 4(KLSHKH LVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)의 JAK2 에피토프, 서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 및 서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프.
본 개시내용은 또한 2개 이상의 서열 번호 6의 반복을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 AAY, RR 또는 DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR과 같은 링커 서열에 의해 분리된 2, 3, 4, 5개, 또는 5개 초과의 서열 번호 6의 반복을 포함한다.
본 개시내용은 또한 비-천연 링커 서열 AAY에 의해 연결된 2개의 서열 번호 6의 폴리펩티드를 포함하는 서열 번호 28(FCGDENILVAA YFCGDENILV)의 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 면역 반응을 유도하는 방법 및 JAK2V617F 또는 CALR 엑손 9 돌연변이체, 또는 JAK2V617F 및 CALR 엑손 9 돌연변이체 둘 모두의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 벡터 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 면역 반응을 유도하는 방법 및 JAK2V617F 또는 CALR 엑손 9 돌연변이체, 또는 JAK2V617F 및 CALR 엑손 9 돌연변이체 둘 모두의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 벡터를 포함하는 조성물 중 임의의 것의 복수의 투여를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 벡터를 포함하는 조성물 중 임의의 것과 조합하여 투여하는 단계를 제공한다.
본 개시내용은 또한 면역 반응을 유도하는 방법 및 JAK2V617F 또는 CALR 엑손 9 돌연변이체, 또는 JAK2V617F 및 CALR 엑손 9 돌연변이체 둘 모두의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 서열 번호 6(FCGDENILV)의 JAK2 에피토프, 서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프, 서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCRE ACLQGWTE)의 CALR 에피토프, 및 서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 2회 이상 투여하는 단계를 포함하며; 여기서 벡터는 Ad26, GAd20, MVA, 또는 자가-복제 RNA인 방법을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 및 JAK2V617F 또는 CALR 엑손 9 돌연변이체, 또는 JAK2V617F 및 CALR 엑손 9 돌연변이체 둘 모두의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은, 이를 필요로 하는 대상체에게 2개 이상의 서열 번호 6의 반복을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 2회 이상 투여하는 단계를 포함하며; 여기서 벡터는 Ad26, GAd20, MVA, 또는 자가-복제 RNA이다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 골수증식성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 서열 번호 6(FCGDENILV)의 JAK2 에피토프, 서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프, 서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREAC LQGWTE)의 CALR 에피토프, 및 서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 2회 이상 투여하는 단계를 포함하며; 여기서 벡터는 Ad26, GAd20, MVA, 또는 자가-복제 RNA인 방법을 제공한다.
도 1은 mutJAK2 클래스 I 에피토프 1 및 2에 대한 JAK2 V617F+ HLA A02:01+ MPN 공여자 T-세포 반응을 나타낸다.
도 2는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두로부터의 IFN-γ/TNF-α 반응에 대한 유세포 분석 세포내 사이토카인 염색을 나타낸다. 정상 공여체 수지상 세포를 빈 벡터 또는 서열 번호 10의 LS_CALR.JAK2 2X9mer를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 아데노바이러스 26 벡터로 감염시켰다. 감염 후 24 시간에 자가유래 CD4/CD8 T 세포를 수지상 세포에 첨가하였다. 수지상 및 T 세포를 11 일 동안 공동-배양하고 펩티드 특이적 mutCALR의 풀로 재자극하였다.
도 3은 CD8+ T 세포로부터의 IFN-γ/TNF-α 반응에 대한 유세포 분석 세포내 사이토카인 염색을 나타낸다. 정상 공여체 수지상 세포를 빈 벡터 또는 서열 번호 10의 LS_CALR/JAK2 2X9mer를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 아데노바이러스 5 벡터로 감염시켰다. 감염 후 24 시간에 자가유래 CD8 T 세포를 수지상 세포에 첨가하였다. 수지상 및 T 세포를 11일 동안 공동-배양하고, muJAK2 에피토프 1(서열번호 5) 또는 에피토프 2(서열번호 6)에 특이적인 9mer 펩티드로 재자극하였다.
도 4는 CD8+ T 세포로부터의 IFN-γ/TNF-α 반응에 대한 유세포 분석 세포내 사이토카인 염색을 나타낸다. 정상 공여체 수지상 세포를 빈 벡터 또는 LS_CALR.JAK2-30mer(서열 번호 11)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 아데노바이러스 5 벡터로 감염시켰다. 감염 후 24 시간에 자가유래 CD8 T 세포를 수지상 세포에 첨가하였다. 수지상 및 T 세포를 11일 동안 공동-배양하고, mutJAK2 에피토프 1(서열번호 5) 또는 에피토프 2(서열번호 6)에 특이적인 9mer 펩티드로 재자극하였다.
도 5는 면역화 후 2 주에 1010개의 VP의 용량으로 Ad26HEME001(LS_CALR_JAK2-30mer, 서열 번호 11)(n=8/군) 또는 Ad26.Empty(n=4)로 IM 면역화된 C57BL/6 또는 Balb/c 마우스로부터의 비장세포에서의 IFN-γ ELISpot 반응을 나타낸다. 비장세포를 HEME001 서열에 걸쳐 있는 15-량체 펩티드 풀로 하룻밤 자극하였다. 106개의 비장세포당 IFN-γ SFU의 수를 ELISpot에 의해 결정하였다. 군당 평균 반응은 수평선으로 나타낸다. 점선은 비-자극된 비장세포에서 관찰된 SFU(43 SFU/106개의 세포)의 95% 백분위수로서 정의된 검정의 배경을 나타낸다. 윌콕슨 순위합 검정을 사용하여 통계적 분석을 실행하였으며, 43 SFU/106개의 세포 미만의 값을 이러한 컷-오프로 설정하였다. VP, 바이러스 입자; LOD, 검출 한계.
도 6은 면역화 후 2 주에 1010개의 VP의 용량으로 Ad26HEME002(LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10)(n=8/군) 또는 Ad26.Empty(n=4)로 IM 면역화된 C57BL/6 또는 Balb/c 마우스로부터의 비장세포에서의 IFN-γ ELISpot 반응을 나타낸다. 비장세포를 HEME002 서열에 걸쳐 있는 15-량체 펩티드 풀로 하룻밤 자극하였다. 106개의 비장세포당 IFN-γ SFU의 수를 ELISpot에 의해 결정하였다. 군당 평균 반응은 수평선으로 나타낸다. 점선은 비-자극된 비장세포에서 관찰된 SFU(43 SFU/106개의 세포)의 95% 백분위수로서 정의된 검정의 배경을 나타낸다. 윌콕슨 순위합 검정을 사용하여 통계적 분석을 실행하였으며, 43 SFU/106개의 세포 미만의 값을 이러한 컷-오프로 설정하였다. VP, 바이러스 입자; LOD, 검출 한계.
도 7은 Ad26HEME002(LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10), MVA-HCalJ-9.9(TCE_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 26), 또는 Ad26.Empty로 IM 면역화된 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포에서의 IFN-γ ELISpot 반응을 나타낸다(5마리의 동물을 가진 군 1[MVA-HCalJ-9.9] 및 3마리의 동물을 가진 군 10[Ad26.Empty]을 제외하고는, n=10/군). 제4주에, Ad26HEME002의 서열에 걸쳐 있는 펩티드 풀로 비장세포를 하룻밤 자극하였다. 106개의 비장세포당 IFN-γ SFU의 수를 ELISpot에 의해 결정하였다. 군당 기하 평균 반응은 수평선으로 나타낸다. 그래프에서 점선은 비-자극된 비장세포에서 관찰된 SFU의 95% 백분위수로서 정의된 검정의 배경을 나타낸다. Ad26HEME002 프라임-단독을 Ad26HEME002 프라임 면역화 및 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 부스트와 비교하는 차이 시험을 위해, log10-전환된 ELISpot 데이터에 대해 ANOVA를 수행하였다. 52 SFU/106개의 세포 미만의 값을 컷-오프로 설정하였다. 수평 막대는 각각의 군의 평균에 상응한다. Gr: 군.
도 8은 Ad26HEME002(LS_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 10), MVA-HCalJ-9.9(TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26), 또는 Ad26.Empty로 IM 면역화된 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포에서의 IFN-γ ELISpot 반응을 나타낸다(5마리의 동물을 가진 군 1[MVA-HCalJ-9.9] 및 3마리의 동물을 가진 군 4[Ad26.Empty]를 제외하고는, n=10/군). 제4주에, CALRmut 서열에 걸쳐 있는 펩티드 풀로 비장세포를 하룻밤 자극하였다. 106개의 비장세포당 IFN-γ SFU의 수를 ELISpot에 의해 결정하였다. 군당 기하 평균 반응은 수평선으로 나타낸다. 그래프에서 점선은 비-자극된 비장세포에서 관찰된 SFU의 95% 백분위수로서 정의된 검정의 배경을 나타낸다. Ad26HEME002 프라임-단독을 Ad26HEME002 프라임 면역화 및 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 부스트와 비교하는 차이 시험을 위해, log10-전환된 ELISpot 데이터에 대해 ANOVA를 수행하였다. 52 SFU/106개의 세포 미만의 값을 컷-오프로 설정하였다. 수평 막대는 각각의 군의 평균에 상응한다. Gr: 군.
도 9는 Ad26HEME002(LS_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 10), MVA-HCalJ-9.9(TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26), 또는 Ad26.Empty로 IM 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 비장세포에서의 IFN-γ ELISpot 반응을 나타낸다(n=8/군). 제4주에, 비장세포를 단리하고 HEME002의 서열에 걸쳐 있는 펩티드 풀로 하룻밤 자극하였다. 106개의 비장세포당 IFN-γ SFU의 수를 ELISpot에 의해 결정하였다. 군당 평균 반응은 수평선으로 나타낸다. 펩티드로 하룻밤 자극되지 않은 비장세포를 사용하여 각각의 개별 데이터 포인트를 배경 감산하여 배경 SFU/106개의 비장세포를 평가한다. Ad26HEME002 프라임-단독을 Ad26HEME002 프라임 면역화 및 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 부스트와 비교하는 차이 시험을 위해, 웰치 보정(Welches correct)(불균등(unequal) SD)을 이용한 독립표본 t-검정을 실행하여 통계적 유의성을 평가하였다. SFU: 스팟-형성 단위; Ad empty: Ad26.Empty; MVA 단독: MVA-HCalJ-9.9(TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26); Ad: Ad26HEME002(LS_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 10).
도 10은 Ad26HEME002,LS_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 10(Ad) 및/또는 MVA-HCalJ-9.9 TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26(MVA) 단독 또는 YERVOY®(이필리무맙)(Ipi)와의 조합으로 면역화된 비-인간 영장류에서 시간 경과에 따라 ELISpot에 의해 측정된 IFN-γ-생성 인간 HEME002-특이적 T-세포의 유도의 동역학을 나타낸다. 106개의 PBMC당 인간 HEME002-특이적 T-세포 반응을 시간 경과에 따라 측정하였다. 검정 양성은 50 SFU/106개의 세포 초과의 배경 감산된 반응의 SFU/106개의 세포 및 2× 중간 반응 초과의 배경 감산된 반응의 SFU/106개의 세포로서 정의된다. 검정 양성 기준에 실패한 값은 50 SFU/106개의 세포로 조정하였다. log10-전환된 데이터를 나타낸다. 하부 점선은 50 SFU/106개의 세포로 설정되었고 LOD에 상응하는 반면에, 상부 점선은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고 ULOQ에 상응한다. 화살표 포인트는 군당 면역화의 시점을 지칭한다. 화살표 막대는 표준 편차이다. LOD: 검출 하한; ULOQ: 정량 상한. Gr: 군. 그래프 상단으로부터의 군: 상단 라인: Gr4; 상단으로부터의 제2 라인: Gr3, 상단으로부터의 제3 라인: Gr2, 상단으로부터의 제4 라인: Gr1.
도 11은 Ad26HEME002, LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10(Ad) 및/또는 MVA-HCalJ-9.9, TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26(MVA) 단독 또는 YERVOY®(이필리무맙)(Ipi)와의 조합으로 면역화된 비-인간 영장류에서 연구의 제-2주에 군당 IFN-γ 생성 HEME002-특이적 T-세포의 유도를 나타낸다. IFN-γ 생성은 ELISpot에 의해 평가되었다. 나타낸 값을 배경 감산하고, 50 SFU/106개의 세포 미만의 값을 그 값으로 설정하였다(개방 흑색 기호로 나타냄). 150 SFU/106개의 세포 초과의 높은 배경 반응을 갖는 동물은 회색 기호로 나타낸다. 막대는 군 평균을 나타낸다. 우도비 검정(Likelihood ratio test)을 이용한 토빗 모델을 사용하고 본페로니 조정을 적용하여 완전한 데이터 세트에 대해 통계적 분석을 수행하였으며, 유의한 반응은 p<0.05를 갖는다. 하부 점선은 50 SFU/106개의 세포로 설정되었고 LOD에 상응한 반면에, 상부 점선은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고 ULOQ에 상응하였다. log10-전환된 데이터를 나타낸다.
도 12는 Ad26HEME002, LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10(Ad) 및/또는 MVA-HCalJ-9.9, TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26(MVA) 단독 또는 YERVOY®(이필리무맙)(Ipi)와의 조합으로 면역화된 비-인간 영장류에서 연구의 제2주에 군당 IFN-γ 생성 HEME002-특이적 T-세포의 유도를 나타낸다. IFN-γ 생성은 ELISpot에 의해 평가되었다. 나타낸 값을 배경 감산하고, 50 SFU/106개의 세포 미만의 값을 그 값으로 설정하였다(개방 흑색 기호로 나타냄). 150 SFU/106개의 세포 초과의 높은 배경 반응을 갖는 동물은 회색 기호로 나타낸다. 막대는 군 평균을 나타낸다. 우도비 검정을 이용한 토빗 모델을 사용하고 본페로니 조정을 적용하여 완전한 데이터 세트에 대해 통계적 분석을 수행하였으며, 유의한 반응은 p<0.05를 갖는다. 하부 점선은 50 SFU/106개의 세포로 설정되었고 LOD에 상응한 반면에, 상부 점선은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고 ULOQ에 상응하였다. log10-전환된 데이터를 나타낸다.
도 13은 Ad26HEME002, LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10(Ad) 및/또는 MVA-HCalJ-9.9, TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26(MVA) 단독 또는 YERVOY®(이필리무맙)(Ipi)와의 조합으로 면역화된 비-인간 영장류에서 연구의 제6주에 군당 IFN-γ 생성 HEME002-특이적 T-세포의 유도를 나타낸다. IFN-γ 생성은 ELISpot에 의해 평가되었다. 나타낸 값을 배경 감산하고, 50 SFU/106개의 세포 미만의 값을 그 값으로 설정하였다(개방 흑색 기호로 나타냄). 150 SFU/106개의 세포 초과의 높은 배경 반응을 갖는 동물은 회색 기호로 나타낸다. 막대는 군 평균을 나타낸다. 우도비 검정을 이용한 토빗 모델을 사용하고 본페로니 조정을 적용하여 완전한 데이터 세트에 대해 통계적 분석을 수행하였으며, 유의한 반응은 p<0.05를 갖는다. 하부 점선은 50 SFU/106개의 세포로 설정되었고 LOD에 상응한 반면에, 상부 점선은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고 ULOQ에 상응하였다. log10-전환된 데이터를 나타낸다.
도 14는 Ad26HEME002, LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10(Ad) 및/또는 MVA-HCalJ-9.9, TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26(MVA) 단독 또는 YERVOY®(이필리무맙)(Ipi)와의 조합으로 면역화된 비-인간 영장류에서 연구의 제10주에 군당 IFN-γ 생성 HEME002-특이적 T-세포의 유도를 나타낸다. IFN-γ 생성은 ELISpot에 의해 평가되었다. 나타낸 값을 배경 감산하고, 50 SFU/106개의 세포 미만의 값을 그 값으로 설정하였다(개방 흑색 기호로 나타냄). 150 SFU/106개의 세포 초과의 높은 배경 반응을 갖는 동물은 회색 기호로 나타낸다. 막대는 군 평균을 나타낸다. 우도비 검정을 이용한 토빗 모델을 사용하고 본페로니 조정을 적용하여 완전한 데이터 세트에 대해 통계적 분석을 수행하였으며, 유의한 반응은 p<0.05를 갖는다. 하부 점선은 50 SFU/106개의 세포로 설정되었고 LOD에 상응한 반면에, 상부 점선은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고 ULOQ에 상응하였다. log10-전환된 데이터를 나타낸다.
도 15는 Ad26HEME002, LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10(Ad) 및/또는 MVA-HCalJ-9.9, TCE_CALR_JAK2-2x9mer; 서열 번호 26(MVA) 단독 또는 YERVOY®(이필리무맙)(Ipi)와의 조합으로 면역화된 비-인간 영장류에서 연구의 제16주에 군당 IFN-γ 생성 HEME002-특이적 T-세포의 유도를 나타낸다. IFN-γ 생성은 ELISpot에 의해 평가되었다. 나타낸 값을 배경 감산하고, 50 SFU/106개의 세포 미만의 값을 그 값으로 설정하였다(개방 흑색 기호로 나타냄). 150 SFU/106개의 세포 초과의 높은 배경 반응을 갖는 동물은 회색 기호로 나타낸다. 막대는 군 평균을 나타낸다. 우도비 검정을 이용한 토빗 모델을 사용하고 본페로니 조정을 적용하여 완전한 데이터 세트에 대해 통계적 분석을 수행하였으며, 유의한 반응은 p<0.05를 갖는다. 하부 점선은 50 SFU/106개의 세포로 설정되었고 LOD에 상응한 반면에, 상부 점선은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고 ULOQ에 상응하였다. log10-전환된 데이터를 나타낸다.
도 16은 SC 투여된 항-CTLA4 항체 이필리무맙이 NHP에서 항원 특이적 T 세포 반응을 프라이밍함에 있어서 IV와 동일함을 보여준다. 이필리무맙은 벡터 면역화의 시점에 3 mg/㎏으로 IV 또는 SC 투여된다. 250K 사이노몰구스 PBMC로부터의 IFNγ 생산 세포를 mutCALR 특이적 펩티드로 하룻밤 자극하고 Elipot에 의해 분석하였다. mutCALR 특이적 반응 - 배경기술을 기반으로 하여 mutCALR 펩티드 반응을 계산하였다. 막대는 군 평균을 나타낸다. 우도비 검정을 이용한 토빗 모델을 사용하고 본페로니 조정을 적용하여 완전한 데이터 세트에 대해 통계적 분석을 수행하였으며, 유의한 반응은 p<0.05를 갖는다.
도 17은 제4주에 시작하여 Ad/Ad/MVA + 1회 용량(군 6) 또는 2회 용량(군 5)의 이필리무맙(SC)에 항-PD-1 항체(니볼루맙 10 mg/㎏ IV)를 포함시키는 것은 Ad/Ad/MVA + 이필리무맙(SC) 단독으로 투여된 동물에 비교하여 mutCALR 특이적 T 세포 반응의 크기를 개선함을 나타낸다. Ad26: Ad26HEME002, LS_CALR_JAK2-2x9mer, 서열 번호 10; Ipi; 이필리무맙; aPD1: 니볼루맙.
도 18a는 5'-단부에서 비-구조 다단백질(nsP1-nsP4; 복제효소)을 인코딩하고 3'-단부에서 구조 유전자(캡시드 및 당단백질)를 인코딩하는 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus)의 알파바이러스 게놈, 양성-센스, 단일-가닥 RNA의 개략도를 나타낸다.
도 18b는 서브게놈 프로모터(SGP)의 전사 제어 하에 바이러스 구조 유전자가 관심 유전자로 대체된, 알파바이러스 레플리콘으로부터 유래된 예시적인 자가-복제 RNA 분자(레플리콘)의 개략도를 나타낸다. 5' 및 3'-단부에서 보존된 서열 요소(CSE)는 마이너스-가닥 및 양성-가닥 RNA 전사를 위한 프로모터로서 작용한다. 레플리콘이 세포 내로 전달된 후에, 비-구조 다단백질 전구체(nsP1234)가 시험관내 전사된 레플리콘으로부터 번역된다. nsP1234는 초기 단계에서 자가-단백질분해에 의해(auto-proteolytically) 단편 nsP123 및 nsP4로 가공되며, 이는 레플리콘의 음성-가닥 카피를 전사한다. 이후에, nsP123은 단일 단백질로 완전히 가공되며, 이는 새로운 양성-가닥 게놈 카피를 전사하기 위해 (+) 가닥 복제효소뿐만 아니라 관심 유전자를 코딩하는 (+) 가닥 서브게놈 전사체에 조립된다. 서브게놈 RNA뿐만 아니라 새로운 게놈 RNA가 캡핑되고 폴리-아데닐화된다. 비활성 프로모터는 점선 화살표이고; 활성 프로모터는 실선 화살표이다.
도 19는 5'-캡, 비구조 유전자(NSP1-4), 26S 서브게놈 프로모터(회색 화살표), 관심 유전자(GOI), 및 3'-폴리아데닐화 테일을 함유하는 알파바이러스로부터 유래된 예시적인 자가-증폭 RNA의 개략적 예시이다. 예시는 또한, 시작 코돈을 제외하고 2A 리보솜 스킵핑 요소(P2A) 및 5'-UTR의 하류 및 DLP의 상류에 있는 nsP1의 복제된 최초 193개의 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 20은 나타낸 바와 같은 지질 성분의 퍼센트 몰비를 갖는, 자가-증폭 RNA를 캡슐화하는 예시적인 지질 나노입자(LNP)의 개략적 예시이다(문헌[Geall et al., PNAS, 2012, 109:14604-14609]).
도 21a는 자가-복제 RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer가 항-CALR CD4 T 세포 반응을 프라이밍함을 나타낸다. 데이터는 ELISpot에 의해 측정되는 바와 같이 중복 CALR 펩티드 라이브러리(개방 막대) 또는 DMSO(회색 막대)로 재자극된 비장세포에 의한 IFN 생성을 나타낸다.
도 21b는 자가-복제 RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer가 항-CALR CD4 T 세포 반응을 프라이밍함을 나타낸다. 데이터는 유세포 분석에 의해 측정된 중복 CALR 펩티드로 재자극된 비장세포의 IFN, TNFα, 및 IL-2 생성을 나타낸다. 기호는 개별 마우스를 나타내고(n=5), 막대는 SD를 갖는 평균을 나타낸다. **p<0.01, 만-휘트니 검정.
도 22a는 항-CALR CD4 T 세포 반응을 프라이밍하는 지질 나노입자 제형화된 자가-복제 RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer를 나타낸다. 나타낸 용량의 LNP 제형화된 자가-복제 RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer뿐만 아니라 20 ㎍의 제형화되지 않은 버전으로 Balb/c 마우스를 면역화하고, 14일 후에 비장을 분석하였다. 도면은 ELISpot에 의해 측정되는 바와 같이 중복 CALR 펩티드 라이브러리(DMSLO 배경 감산됨)로 재자극된 비장세포에 의한 IFN 생성을 나타낸다.
도 22b는 항-CALR CD4 T 세포 반응을 프라이밍하는 지질 나노입자 제형화된 자가-복제 RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer를 나타낸다. 데이터는 유세포 분석에 의해 측정된 중복 CALR 펩티드로 재자극된 비장세포의 IFN, TNFα, 및 IL-2 생성을 나타낸다. 기호는 개별 마우스를 나타내고(n=5), 막대는 SD를 갖는 평균을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, 만-휘트니 검정.
도 23a는 항-CALR CD4 T 세포 반응을 부스팅하는 백신 계획을 나타낸다. Balb/c 마우스를 프라이밍한 후에 도면에 나타낸 바와 같이 Ad26, 자가-복제 RNA 분자(레플리콘), 또는 MVA의 다양한 조합으로 부스팅하고, 이어서 비장을 분석하였다. 도면은 ELISpot에 의해 측정되는 바와 같이 중복 CALR 펩티드 라이브러리(DMSO 배경 감산됨)로 재자극된 비장세포에 의한 IFN 생성을 나타낸다.
도 23b는 항-CALR CD4 T 세포 반응을 부스팅하는 백신 계획을 나타낸다. 데이터는 유세포 분석에 의해 측정된 중복 CALR 펩티드로 재자극된 비장세포의 IFN, TNFα, 및 IL-2 생성을 나타낸다. 기호는 개별 마우스를 나타내고, 막대는 SD를 갖는 평균을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 만-휘트니 검정.
정의
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
"약"은, 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 특정 검정, 결과 또는 구현예의 맥락에서, 실시예 또는 본 명세서 내 다른 곳에서 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 표준편차 이내 또는 5% 이하의 범위 이내(둘 중 더 큰 것)를 의미한다.
"애주번트" 및 "면역 자극제"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이와 관련하여, 애주번트는 본 개시내용의 백신에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해 사용된다.
"대안적인 스캐폴드"는 높은 입체형태 공차(conformational tolerance)의 가변 도메인과 연관된 구조화된 코어를 함유하는 단일쇄 단백질 프레임워크를 지칭한다. 가변 도메인은 스캐폴드 완전성(integrity)을 손상시키지 않고서 도입되는 변이에 견디므로, 가변 도메인은 특이적 항원에 결합하도록 조작 및 선택될 수 있다.
"항원 제시 세포(APC)"는 주조직적합성 복합체 분자(MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자 또는 둘 모두)와 관련하여 그의 표면 상에 항원을 제시하는 임의의 세포를 지칭한다.
"항체"는 뮤린, 인간, 인간화, 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체, 항원-결합 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형태의 면역글로불린 분자를 지칭한다.
"항원-결합 단편"은 모(parental) 전장 항체의 항원 결합 특성을 보유하는 면역글로불린 분자의 일부분을 지칭한다. 예시적인 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2, 및/또는 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2, 및/또는 3, VH, VL, VH 및 VL, Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편뿐만 아니라 하나의 VH 도메인 또는 하나의 VL 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb)이다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 결합되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 디자인을 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별개의 쇄에 의해 발현되는 경우에 분자내에서 또는 분자간에 쌍을 이루어서, 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 디아바디(diabody)를 형성하며, 이는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제WO1998/44001호, 국제 특허 출원 공개 제WO1988/01649호, 국제 특허 출원 공개 제WO1994/13804호, 또는 국제 특허 출원 공개 제WO1992/01047호에 기재되어 있다.
이행 용어 "포함하는", "~로 본질적으로 이루어진", 및 "~로 이루어진"은 특허 용어에서 그들의 일반적으로 허용되는 의미를 함축하는 것으로 의도되며; 즉, (i) "구비하는", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어인 "포함하는"은 포괄적 또는 개방형(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않으며; (ii) "~로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제하고; (iii) "~로 본질적으로 이루어진"은 명시된 재료 또는 단계, 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들"로 청구범위의 범주를 제한한다. 어구 "포함하는"(또는 이의 등가적 표현)의 관점에서 기재된 실시 형태는 또한 "~로 이루어진" 및 "~로 본질적으로 이루어진"의 관점에서 독립적으로 기재된 것들을 실시 형태로서 제공한다.
"CALR"은 인간 칼레티쿨린을 지칭한다. 인간 CALR 단백질은, 예를 들어, UniProt 수탁 번호 P27797에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
"하류 루프" 또는 "DLP 모티프"는, 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)의 시작 코돈의 하류에 배치되는 경우에 DLP 모티프가 없는 그 밖에 동일한 작제물에 비교하여 ORF의 증가된 번역을 제공하는, 하나 이상의 RNA 줄기-루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
면역 반응과 관련하여 "향상시키다" 또는 "유도하다"는 면역 반응의 스케일 및/또는 효율을 증가시키거나 면역 반응의 지속기간을 연장시키는 것을 지칭한다. 이 용어들은 "증강시키다"와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "에피토프 서열"은 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 일부, 예를 들어, 면역계, 예를 들어, 항체, B 세포(예를 들어, B 림프구), 및/또는 T 세포에 의해 인식되는, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 1차, 2차, 3차, 또는 4차 구조의 일부를 지칭한다.
"발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"촉진자 요소(facilitator element)"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 요소를 지칭하며, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 정지 코돈, 단백질 태그, 예컨대 히스티딘 태그 등을 포함한다.
"이종성"은 자연계에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드를 지칭한다.
"면역원성 단편"은 단편이 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자와 복합체를 형성할 경우에 세포독성 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 또는 B 세포에 의해 인식되는 폴리펩티드를 지칭한다.
"인-프레임(in-frame)"은 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 함께 결합되는 제2 폴리뉴클레오티드의 코돈의 리딩 프레임과 동일한 제1 폴리뉴클레오티드에서의 코돈의 리딩 프레임을 지칭한다. 인-프레임 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 둘 모두에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 인코딩한다.
"면역원성"은 하나 이상의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
"면역 반응"은 척추동물 대상체의 면역계에 의한 면역원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 단편에 대한 임의의 반응을 지칭한다. 예시적인 면역 반응은 국소 및 전신 세포 면역뿐만 아니라 체액성 면역, 예컨대 CD8+ CTL의 항원-특이적 유도를 포함하는 세포독성 T 림프구(CTL) 반응, T-세포 증식 반응 및 사이토카인 방출을 포함하는 헬퍼 T-세포 반응, 및 항체 반응을 포함하는 B-세포 반응을 포함한다.
"~와 조합하여"는 2개 이상의 치료제가 대상체에게 혼합물로 함께 투여되거나, 단제(single agent)로서 동시에 투여되거나, 단제로서 임의의 순서로 순차적으로 투여됨을 의미한다.
"단리된"은 분자가 생성되는 시스템, 예컨대 재조합 세포의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리되고/되거나 정제된 분자(예컨대 합성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)의 상동 집단뿐만 아니라, 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 단백질을 지칭한다. "단리된"은 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 분자를 지칭하며, 더 높은 순도로, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도로 단리된 분자를 포함한다.
"JAK2"는 인간 Janus 키나제 2를 지칭한다. 인간 JAK2 단백질은, 예를 들어, UniPort 수탁 번호 O060674에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
"돌연변이체 CALR"은 하나 이상의 엑손 9 돌연변이를 보유하는 CALR을 지칭한다.
"돌연변이체 JAK2"는 V617F 돌연변이를 보유하는 JAK2를 지칭한다.
"비-자연 발생"은 자연계에 존재하지 않는 분자를 지칭한다.
"작동가능하게 연결된" 서열은 이들이 조절하는 핵산 서열과 인접한 발현 제어 서열 및 조절되는 핵산 서열을 제어하기 위해 트랜스로(in trans), 또는 원격으로 작용하는 조절 서열 둘 모두를 지칭한다.
"필라델피아 염색체" 또는 "Ph"는 염색체 9와 22 사이의 잘 알려진 염색체 전좌를 지칭하며, 이는 구성적으로 활성인 티로신 키나제 활성을 갖는 발암성 BCR-ABL 유전자 융합을 유발한다. 전좌는 염색체 22q11로부터의 BCR 유전자의 일부가 염색체 9q34로부터의 ABL 유전자의 일부와 융합되는 것을 유발하며, 이는 인간 세포유전학적 명명법에 관한 국제 규약(ISCN: International System for Human Cytogenetic Nomenclature) 하에 t(9;22)(q34;q11)로서 지정된다. 융합의 정확한 위치에 따라, 생성된 융합 단백질의 분자량은 185 내지 210 kDa의 범위일 수 있다. "필라델피아 염색체"는 (9;22)(q34;q11) 전좌로 인해 형성된 모든 BCR-ABL 융합 단백질을 지칭한다.
"폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 다른 등가의 공유결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 예는 RNA 및 DNA를 포함한다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합으로 결합된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다.
질환 또는 장애와 관련하여 "예방하다", "예방하는", "예방", 또는 "예방법"은 장애가 대상체에서 발생하는 것을 예방하는 것을 의미한다.
"프라임-부스트" 또는 "프라임-부스트 계획"은 제1 백신으로 T-세포 반응을 프라이밍하는 단계 후에 제2 백신으로 면역 반응을 부스팅하는 단계를 수반하는 대상체를 치료하는 방법을 지칭한다. 제1 백신과 제2 백신은 전형적으로 구별된다. 이러한 프라임-부스트 면역화는 동일한 백신으로 프라이밍 및 부스팅에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 큰 높이와 폭의 면역반응을 유도한다. 프라이밍 단계는 기억 세포를 개시하고, 부스트 단계는 기억 반응을 확장시킨다. 부스팅은 1회 또는 다수회 일어날 수 있다.
"재조합"은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 바이러스, 및 다른 거대분자를 지칭한다.
"불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환을 지칭한다. 불응성 질병은 치료 전 또는 치료 시작 시점에서 치료에 대해 저항성일 수 있거나, 또는 불응성 질병은 치료 동안 저항성이 될 수 있다.
"재발성"은 치료제에 의한 이전 치료 후의 개선 기간 후에 질환 또는 질환의 징후 및 증상의 복귀를 지칭한다.
"레플리콘"은 그 자체의 카피의 생성을 유도할 수 있고 RNA뿐만 아니라 DNA를 포함하는 바이러스 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 아테리바이러스(arterivirus) 게놈의 이중 가닥 DNA 버전은 아테리바이러스 레플리콘을 구성하는 단일 가닥 RNA 전사체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 바이러스 레플리콘은 바이러스의 완전 게놈을 포함한다.
"RNA 레플리콘"(또는 "자가-복제 RNA", 또는 "자가-복제 RNA 분자" 또는 "srRNA")은 허용 세포 내에서 그 자체의 증폭 또는 자가-복제를 유도하기 위해 필요한 모든 유전 정보를 함유하는 RNA 분자를 지칭한다. 그 자체의 복제를 유도하기 위해, RNA 분자는 1) RNA 증폭 과정을 촉매하기 위해 바이러스 또는 숙주 세포 유래 단백질, 핵산, 또는 리보핵단백질과 상호작용할 수 있는 중합효소, 복제효소, 또는 다른 단백질을 인코딩하고; 2) 레플리콘-인코딩된 RNA의 복제 및 전사에 필요한 시스-작용성 RNA 서열을 함유한다. 자가-복제 RNA 분자는 전형적으로 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈으로부터 유래되며, 구조 또는 비-구조 유전자를 인코딩하는 바이러스 서열을 대체하거나 구조 또는 비-구조 유전자를 인코딩하는 서열의 5' 또는 3'에 외래 서열을 삽입함으로써 숙주 세포에 외래 서열을 도입하는 기반으로 사용될 수 있다. 외래 서열은 알파바이러스의 서브게놈 영역 내로 도입될 수 있다. 자가-복제 RNA 분자는 재조합 바이러스 입자, 예컨대 재조합 알파바이러스 입자 내로 패키징되거나, 대안적으로 지질 나노입자(LNP)를 사용하여 숙주에 전달될 수 있다. 자기 복제 RNA는 크기가 적어도 1 kb 또는 적어도 2 kb 또는 적어도 3 kb 또는 적어도 4 kb 또는 적어도 5 kb 또는 적어도 6 kb 또는 적어도 7 kb 또는 적어도 8 kb 또는 적어도 10 kb 또는 적어도 12 kb 또는 적어도 15 kb 또는 적어도 17 kb 또는 적어도 19 kb 또는 적어도 20 kb일 수 있거나, 100 bp 내지 8 kb 또는 500 bp 내지 8 kb 또는 500 bp 내지 7 kb 또는 1 내지 7 kb 또는 1 내지 8 kb 또는 2 내지 15 kb 또는 2 내지 20 kb 또는 5 내지 15 kb 또는 5 내지 20 kb 또는 7 내지 15 kb 또는 7 내지 18 kb 또는 7 내지 20 kb일 수 있다. 자가-복제 RNA는, 예를 들어, 제WO2017/180770호, 제WO2018/075235호, 및 제WO2019143949A2호에 기재되어 있다.
"특이적으로 결합한다", "특이적 결합", "특이적으로 결합하는", 또는 "결합한다"는 단백질성 분자가 다른 항원들에 대한 친화도보다 더 큰 친화도로 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 단백질성 분자는 약 1x10-7 M 이하, 예를 들어 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하며, 전형적으로 KD는 비-특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합에 대한 그의 KD보다 100배 이상 더 적다. 본 명세서에 기재된 분자의 맥락에서, "특이적 결합"은, 야생형 CALR 또는 JAK2 단독 또는 HLA와의 복합체에 대한 검출가능한 결합 없이 CALR/JAK2 돌연변이체 폴리펩티드, CALR 돌연변이체 폴리펩티드, 또는 JAK2 돌연변이체 폴리펩티드 단독 또는 HLA와의 복합체에 대한 단백질성 분자의 결합을 지칭한다.
"서브게놈 RNA"는 그것이 유래된 게놈 RNA보다 더 작은 길이 또는 크기의 RNA 분자를 지칭한다. 바이러스 서브게놈 RNA는 내부 프로모터로부터 전사될 수 있으며, 그의 서열은 게놈 RNA 또는 그의 보체 내부에 존재한다. 서브게놈 RNA의 전사는 숙주 세포-인코딩된 단백질, 리보핵단백질(들), 또는 이들의 조합과 연관된 바이러스-인코딩된 중합효소(들)에 의해 매개될 수 있다. 다수의 RNA 바이러스는 이들의 3'-근위 유전자의 발현을 위한 서브게놈 mRNA(sgRNA)를 생성한다. 바이러스 서브게놈 RNA는 내부 프로모터로부터 전사될 수 있으며, 그의 서열은 게놈 RNA 또는 그의 보체 내부에 존재한다. 서브게놈 RNA의 전사는 숙주 세포-인코딩된 단백질, 리보핵단백질(들), 또는 이들의 조합과 연관된 바이러스-인코딩된 중합효소(들)에 의해 매개될 수 있다.
"서브게놈 레플리콘"은 유전자의 완전 보체(full complement) 및 바이러스 게놈의 다른 특징부보다는 덜하지만 여전히 그 자체의 카피의 생성을 유도할 수 있는 것을 함유하는 바이러스 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 아테리바이러스의 서브게놈 레플리콘은 바이러스의 비구조적 단백질에 대한 대부분의 유전자를 포함할 수 있지만, 구조적 단백질을 코딩하는 유전자의 대부분은 결손되어 있다. 서브게놈 레플리콘은 바이러스 서브게놈의 복제(서브게놈 레플리콘의 복제)에 필요한 모든 바이러스 유전자의 발현을 바이러스 입자의 생성 없이 유도할 수 있다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "인간외 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 인간외 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 용어 "대상" 또는 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
암과 같은 질환 또는 장애와 관련하여 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 하기 중 하나 이상을 달성하는 것을 지칭한다: 장애의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시킴, 치료되는 장애의 특징적인 증상의 악화를 억제함, 이전에 장애를 가졌던 대상체에서 장애의 재발을 제한하거나 예방함, 또는 장애에 대해 이전에 증상을 나타낸 대상체에서 증상의 재발을 제한하거나 예방함.
"치료적 유효량"은 필요한 용량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 치료제 또는 치료제들의 병용물이 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 효과적인 치료제 또는 치료제의 조합의 예시적인 지표는, 예를 들어, 대상체의 개선된 웰빙(well-being)을 포함한다.
"백신"은 수용자(예를 들어, 대상체)에서 획득 면역을 유도하기 위해 의도적으로 투여되는 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드, 면역원성 폴리펩티드 또는 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물을 지칭한다.
"벡터"는 생물 시스템 내에서 복제가 가능하거나, 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 생물계에서 이러한 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소를 포함한다. 그러한 생물계의 예에는 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 요소를 이용하는 세포계, 바이러스 시스템, 동물계, 식물계 및 재구성된 생물계가 포함될 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.
"바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내로 패키징되는 역량을 갖는 벡터 작제물을 지칭한다.
"변이체", "돌연변이체", 또는 "변경된"은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 참조 폴리펩티드 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
폴리펩티드
본 명세서에는 돌연변이체 CALR 및 돌연변이체 JAK2의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드가 개시되며, 이는 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00001
서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00002
서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00003
서열 번호 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00004
서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00005
서열 번호 6(FCGDENILV)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프; 서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프; 및 서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 서열 번호 1, 2, 및 4의 에피토프 서열은 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 링커에 의해 분리될 수 있다. 예시적인 링커 서열은 AAY, RR, DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 6의 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프, 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 및 서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 서열 번호 6, 1, 및 2의 에피토프 서열은 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 링커에 의해 분리될 수 있다. 예시적인 링커 서열은 AAY, RR, DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 또한 서열 번호 6의 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프, 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 및 서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 서열 번호 6, 5, 1, 및 2의 에피토프 서열은 임의의 순서로 존재할 수 있으며, AAY, RR, DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR과 같은 링커에 의해 분리될 수 있다.
본 개시내용은 또한 하기 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다: 서열 번호 12, 서열 번호 10, 서열 번호 13, 서열 번호 11, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 28, 서열 번호 31, 또는 이들의 면역원성 단편.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 서열 번호 28과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시내용은 또한 서열 번호 6의 2개 이상의 반복을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5개, 또는 5개 초과의 서열 번호 6의 반복을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 서열 번호 6의 반복은 링커에 의해 분리될 수 있다. 예시적인 링커 서열은 AAY, RR 또는 DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR을 포함한다.
일부 실시 형태에서는, 대상체에서 폴리펩티드가 에피토프 서열을 포함하는 펩티드 단편으로 생체내 절단되어 개선된 면역 반응을 유발하도록, 본 명세서에 개시된 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 N-말단에 리더 서열 또는 T-세포 인핸서 서열(TCE)을 추가로 포함할 수 있다. 리더 서열은 발현을 증가시키고/시키거나 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다. 예시적인 리더 서열은 T2 림프구(HAVT20)의 TCR 수용체의 α 사슬(MACPGFLWALVISTC LEFSMA; 서열 번호 8), 유비퀴틴 신호 서열(Ubiq)(MQIFVKTLTGKTITLEVEP SDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVR; 서열 번호 54), 또는 T 세포 인핸서(TCE) 서열, 예컨대 쏘가리 불변 사슬(mandarin fish invariant chain)로부터의 28 aa 길이의 펩티드 단편(MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV; 서열 번호 29)을 포함한다. 리더 서열은 본 명세서에 개시된 에피토프에 대한 면역 반응을 증가시키는 데 도움이 될 수 있는 것으로 여겨진다.
폴리뉴클레오티드
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다:
Figure pct00006
서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00007
서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00008
서열 번호 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00009
서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00010
서열 번호 6(FCGDENILV)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프; 서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프; 및 서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 서열 번호 1, 2, 및 4의 에피토프 서열은 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 링커에 의해 분리될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 6(FCGDENILV)의 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프, 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 및 서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 서열 번호 6, 1, 및 2의 에피토프 서열은 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 링커에 의해 분리될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 서열 번호 6의 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프, 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 및 서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 서열 번호 6, 5, 1, 및 2의 에피토프 서열은 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 링커에 의해 분리될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 개시내용은 또한 서열 번호 6의 2개 이상의 반복을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5개, 또는 5개 초과의 서열 번호 6의 반복을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 서열 번호 6의 반복은 링커에 의해 분리될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
서열 번호 16의 핵산 서열 또는 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 17의 핵산 서열 또는 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 18의 핵산 서열 또는 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 19의 핵산 서열 또는 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 20의 핵산 서열 또는 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 21의 핵산 서열 또는 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 22의 핵산 서열 또는 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 26의 핵산 서열 또는 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및
서열 번호 27의 핵산 서열 또는 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함한다.
일부 실시 형태에서, RNA는 mRNA 또는 자가-복제 RNA이다.
일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 부위, 코작 서열(Kozak sequence), 정지 코돈, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 화학적 합성, 효소적 합성(예를 들어, 시험관내 전사), 더 긴 전구체의 효소적 또는 화학적 절단, 폴리뉴클레오티드의 더 작은 단편의 화학적 합성 후의 단편의 라이게이션, 또는 알려진 PCR 방법을 포함한다. 합성될 폴리뉴클레오티드 서열은 원하는 아미노산 서열에 대해 적절한 코돈으로 설계될 수 있다. 일반적으로, 서열이 발현에 사용될 의도된 숙주에 대해 바람직한 코돈이 선택될 수 있다.
벡터
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
Figure pct00011
서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00012
서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00013
서열 번호 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00014
서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00015
서열 번호 6(FCGDENILV)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
벡터는 임의의 숙주, 예컨대 박테리아, 효모, 또는 포유동물에서의 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 의도된 벡터일 수 있다. 적절한 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 일반적으로, 원하는 DNA 서열로 유전자도입되거나 형질도입된 세포의 검출을 가능하게 하기 위해, 발현 벡터는 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성, 또는 네오마이신 내성과 같은 선택 마커를 함유한다. 예시적인 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 벡터, 또는 인공 염색체이다.
사용될 수 있는 적합한 벡터는 - 박테리아 벡터: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a(미국 캘리포니아주 라호이아 소재의 Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5(스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia). 진핵세포 벡터: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL(Pharmacia)이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리펩티드 중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
바이러스 벡터는 전형적으로 복제능력이 없도록, 예를 들어 복제하지 않도록 변형된 자연 발생 바이러스 게놈으로부터 유래된다. 복제하지 않는 바이러스는 복제를 위해 트랜스형 단백질을 제공해야 한다. 전형적으로, 이러한 단백질은 바이러스 생산 세포주에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현되어, 바이러스 복제가 가능하다. 따라서 바이러스 벡터는 전형적으로 감염성이고 복제하지 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, AAV 타입 5 및 타입 2), 대형 유인원 아데노바이러스 벡터(GAd), 알파바이러스 벡터(예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE: Venezuelan equine encephalitis virus), 신드비스 바이러스(SIN: Sindbis virus), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 및 VEE-SIN 키메라), 헤르페스 바이러스 벡터(예를 들어, 레서스 사이토메갈로바이러스(RhCMV: rhesus cytomegalovirus)와 같은 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 벡터), 아레나 바이러스 벡터(예를 들어, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 벡터), 홍역 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA), NYVAC(코펜하겐 백시니아 균주로부터 유래됨), 및 아비폭스 벡터: 카나리폭스(ALVAC) 및 계두(FPV) 벡터), 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바이러스 유사 입자, 및 박테리아 포자일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 유래된다.
아데노바이러스 벡터
일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스로부터 유래된다.
아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스(Ad)로부터 유래될 수 있지만, 또한 소 아데노바이러스(예를 들어, 소 아데노바이러스 3, BAdV3), 개 아데노바이러스(예를 들어, CAdV2), 돼지 아데노바이러스(예를 들어, PAdV3 또는 5), 또는 대형 유인원, 예컨대 침팬지(Pan), 고릴라(Gorilla), 오랑우탄(Pongo), 보노보(Bonobo)(Pan paniscus) 및 일반 침팬지(Pan troglodytes)와 같은 다른 종을 감염시키는 아데노바이러스로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 자연 발생 유인원 아데노바이러스는 각각의 유인원의 대변 샘플로부터 분리된다.
인간 아데노바이러스 벡터는 다양한 아데노바이러스 혈청형, 예를 들어 인간 아데노바이러스 혈청형 hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd34, hAd35, hAd48, hAd49 또는 hAd50(혈청형은 Ad5, Ad7, Ad11, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 또는 Ad50로도 지칭됨)로부터 유래될 수 있다.
대형 유인원 아데노바이러스(GAd) 벡터는 다양한 아데노바이러스 혈청형으로부터, 예를 들어, 대형 유인원 아데노바이러스 혈청형 GAd20, Gad19, GAd21, GAd25, GAd26, GAd27, GAd28, GAd29, GAd30, GAd31, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAdI7, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 또는 PanAd3으로부터 유래될 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 대부분의 인간 및 비-인간 아데노바이러스의 서열은 알려져 있으며, 다른 것들은 일상적인 절차를 사용하여 얻을 수 있다. Ad26의 예시적인 게놈 서열은 젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 EF153474 및 국제 특허 공개 제WO2007/104792호의 서열 번호 1에서 발견된다. Ad35의 예시적인 게놈 서열은 국제 특허 공개 제WO2000/70071호의 도 6에서 발견된다. Ad26를 기반으로 한 벡터는 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO2007/104792호에 기재되어 있다. Ad35를 기반으로 한 벡터는 예를 들어, 미국 특허 제7,270,811호 및 국제 특허 공개 제WO2000/70071호에 기재되어 있다. ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 및 ChAd82에 기초한 벡터는 국제 특허 공개 제WO2005/071093호에 기재되어 있다. PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, 및 ChAd147을 기반으로 하는 벡터는 국제 특허 출원 공개 제WO2010/086189호에 기재되어 있다.
아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 영역 E1, E2 및 E4 중 하나 이상과 같은, 바이러스 복제에 필수적인 유전자 산물의 하나 이상의 기능적 결실 또는 완전한 제거를 포함하도록 조작되어, 아데노바이러스가 복제할 수 없도록 만든다. E1 영역의 결실은 EIA, EIB 55K 또는 EIB 21K, 또는 이들의 임의의 조합의 결실을 포함할 수 있다. 복제 결손성 아데노바이러스는 헬퍼 플라스미드를 이용하여 생산 세포에 의해 트랜스형으로 결실 영역(들)에 의해 인코딩된 단백질을 제공하거나, 필요한 단백질을 발현하도록 생산 세포를 조작함으로써 증식된다. 아데노바이러스 벡터는 또한 복제에 불필요한 E3 영역에 결실이 있을 수 있으므로, 이러한 결실은 보완될 필요는 없다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 E1 영역 및 E3 영역의 적어도 일부의 기능적 결실 또는 완전한 제거를 포함할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 E4 영역 및/또는 E2 영역의 기능적 결실 또는 완전한 제거를 추가로 포함할 수 있다. 이용될 수 있는 적절한 생산 세포는 El, 예를 들어 911 또는 PER.C6 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,994,128호 참조), E1 형질전환된 양수 세포(예를 들어, EP 1230354 참조), E1 형질전환된 A549 세포(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO1998/39411호, 미국 특허 제5,891,690호 참조)에 의해 불멸화된 인간 망막 세포이다. 사용될 수 있는 예시적인 벡터는 바이러스 복제에 충분한 기능적 E1 코딩 영역, E3 코딩 영역 내의 결실 및 E4 코딩 영역 내의 결실을 포함하되, 단, E4 오픈 리딩 프레임 6/7이 결실되지 않는 Ad26이다(예를 들어, 미국 특허 제9,750,801호 참조).
일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스(Ad) 벡터이다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad5로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad11로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad7로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad26로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad34로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad35로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad48로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad49로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Ad 벡터는 Ad50로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터는 유인원 아데노바이러스(GAd) 벡터이다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd20로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd19로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd21로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd25로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd26로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd27로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd28로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd29로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd30로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 GAd31로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd3로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd4로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd5로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd6로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd7로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd8로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd9로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd9로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd10로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd11로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd16로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd17로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd19로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd20로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd22로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd24로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd26로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd30로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd31로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd32로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd31로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd33로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd37로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd38로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd44로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd55로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd63로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd68로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd73로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd82로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GAd 벡터는 ChAd83로부터 유래된다. GAd19-21 및 GAd25-31은 국제 특허 출원 공개 제WO2019/008111호에 기재되어 있으며, 일반 인간 집단에서 면역원성이 높고 기존의 면역이 없는 균주를 나타낸다. GAd20 게놈의 폴리뉴클레오티드 서열은 국제 특허 출원 공개 제WO 2019/008111호에 개시되어 있다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 생성된 재조합 바이러스의 바이러스 생존력에 영향을 미치지 않는 벡터의 부위 또는 영역(삽입 영역) 내로 삽입될 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 평행(5'으로부터 3'으로 전사됨) 또는 역평행(벡터 골격에 대해 3'으로부터 5' 방향으로 전사됨) 배향으로 결실 E1 영역 내로 삽입될 수 있다. 또한, 벡터가 사용을 위해 제조되고 있는 포유동물 숙주 세포에서 폴리펩티드 또는 본 개시내용의 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있는 적절한 전사 조절 요소가 폴리펩티드 또는 본 개시내용의 폴리펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.
재조합 아데노바이러스 입자는 바이러스 복제에 필요한 결손 바이러스 유전자를 트랜스형으로 공급하는 상보성 세포주 또는 헬퍼 바이러스를 사용하여 당해 기술 분야의 임의의 통상적인 기술(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO1996/17070호)에 따라 제조 및 증식될 수 있다. 세포주 293, PER.C6, E1 A549, 및 911은 El 결실을 보완하기 위해 일반적으로 사용된다. 결함이 있는 벡터를 보완하도록 다른 세포주가 조작되었다(문헌[Yeh, et al., 1996, J. Virol. 70: 559-565]; 문헌[Kroughak and Graham, 1995, Human Gene Ther. 6: 1575-1586]; 문헌[Wang, et al., 1995, Gene Ther. 2: 775-783]; 문헌[Lusky, et al., 1998, J. Virol. 72: 2022-203]; 제EP 919627호 및 국제 특허 출원 공개 제WO1997/04119호). 아데노바이러스 입자는 배양 상청액으로부터 회수될 수 있지만, 용해 후 세포로부터도 회수될 수 있고, 임의로 표준 기술(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO1996/27677호, 국제 특허 공개 제WO1998/00524호, 국제 특허 공개 제WO1998/26048호 및 국제 특허 공개 제WO2000/50573호에 기재된 크로마토그래피, 초원심분리법)에 따라 추가로 정제될 수 있다. 아데노바이러스 벡터를 증식시키기 위한 구성 및 방법은 또한, 예를 들어 미국 특허 제5,559,099호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,994,106호, 제5,994,128호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제6,040,174호, 제6,020,191호 및 제6,113,913호에 기재되어 있다.
본 명세서에는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되며, 여기서 벡터는 hAd26(Ad26으로도 지칭됨)으로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 16의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 18의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 19의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 20의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 21의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 22의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 23의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 23과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 24의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 24와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 25의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 25와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 26의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 27의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터는 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되며, 여기서 벡터는 GAd20으로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 16의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 18의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 19의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 20의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 21의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 22의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 23의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 23과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 24의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 24와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 25의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 25와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 26의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 27의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터는 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폭스바이러스 벡터
폭스바이러스(폭스바이러스과(Poxviridae)) 벡터는 천연두 바이러스(variola), 백시니아 바이러스, 우두 바이러스 또는 원숭이 폭스바이러스로부터 유래될 수 있다. 예시적인 백시니아 바이러스는 코펜하겐 백시니아 바이러스(W), 뉴욕 약독화 백시니아 바이러스(NYVAC: New York Attenuated Vaccinia Virus), ALVAC, TROVAC, 또는 변형된 백시니아 앙카라(MVA)이다.
MVA는 터키 앙카라의 백신 연구소(Vaccination Institute)에서 수년 동안 유지되어 인간 백신 접종의 기초로 사용된 진피 백시니아 균주 앙카라(CVA(Chorioallantois vaccinia Ankara) 바이러스)에서 유래한다. 그러나, 백시니아 바이러스(VACV)와 관련된 종종 중증의 백신 접종 후 합병증으로 인해, 더욱 약독화되고 더욱 안전한 천연두 백신을 생성하려는 여러 시도가 있었다.
MVA는 CVA 바이러스의 닭 배아 섬유아세포에 대한 516회의 연속 계대에 의해 생성되었다(문헌[Meyer et al., J. Gen. Virol., 72: 1031-1038 (1991)] 및 미국 특허 제10,035,832호). 이러한 장기 계대의 결과로서 생성되는 MVA 바이러스는 그의 게놈 서열의 약 31 킬로베이스가 결실되었고, 따라서 조류 세포에 대해 고도로 숙주 세포 제한적인 것으로 기재되었다(문헌[Meyer, H. et al., Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991]; 문헌[Meisinger-Henschel et al., Genomic sequence of chorioallantois vaccinia virus Ankara, the ancestor of modified vaccinia virus Ankara, J. Gen. Virol. 88, 3249-3259, 2007]). MVA 게놈을 그의 모체인 CVA에 비교하여, 게놈 DNA의 6개의 주요 결실(결실 I, II, III, IV, V, 및 VI)을 규명하였으며, 총 31,000개의 염기쌍이 되었다. (문헌[Meyer et al., J. Gen. Virol. 72:1031-8 (1991)]). 생성되는 MVA는 유의하게 비병원성임이 다양한 동물 모델에서 나타났다(문헌[Mayr, A. & Danner, K. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions, Dev. Biol. Stand. 41: 225-34, 1978]). MVA를 약독화시키기 위해 많은 계대가 사용되었기 때문에, CEF 세포의 계대 수에 따라 MVA 476 MG/14/78, MVA-571, MVA-572, MVA-574, MVA-575 및 MVA-BN과 같은 다양한 균주 또는 분리주가 존재한다. MVA 476 MG/14/78은 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO2019/115816A1호에 기재되어 있다. MVA-572 균주는 1994년 1월 27일자로 기탁 번호 ECACC 94012707 하에, European Collection of Animal Cell Cultures ("ECACC"), Health Protection Agency, Microbiology Services(영국("UK") SP4 0JG 솔즈베리 포튼 다운 소재)에 기탁되었다. MVA-575 균주는 2000년 12월 7일자로 기탁 번호 ECACC 00120707 하에 ECACC에 기탁되고; MVA-바바리안 노르딕(Bavarian Nordic)("MVA-BN") 균주는 2000년 8월 30일자로 기탁 번호 V00080038 하에 ECACC에 기탁되었다. MVA-BN 및 MVA-572의 게놈 서열은 젠뱅크(각각, 수탁 번호 DQ983238 및 DQ983237)에서 입수할 수 있다. 다른 MVA 균주의 게놈 서열은 표준 시퀀싱 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 벡터 및 바이러스는 임의의 MVA 균주 또는 추가로 MVA 균주의 유도체로부터 유래될 수 있다. 추가의 예시적인 MVA 균주는 미국 20108 버지니아주 머내서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture collection, ATCC)에 기탁된 기탁물 VR-1508이다.
MVA의 유도체는 모 MVA와 본질적으로 동일한 특징을 나타내지만 이들의 게놈의 하나 이상의 부분에서 차이를 나타내는 바이러스를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 MVA 476 MG/14/78로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 MVA-571로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 MVA-572로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 MVA-574로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 MVA-575로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 MVA-BN으로부터 유래된다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 생성된 재조합 바이러스의 바이러스 생존력에 영향을 미치지 않는 MVA 벡터의 부위 또는 영역(삽입 영역) 내로 삽입될 수 있다. 이러한 영역은 재조합 바이러스의 바이러스 생존력에 심각한 영향을 미치지 않으면서 재조합 형성을 가능하게 하는 영역에 대해 바이러스 DNA 단편을 테스트함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 티미딘 키나제(TK) 유전자는 사용될 수 있는 삽입 영역이며, 모든 조사된 폭스바이러스 게놈과 같은 많은 바이러스에 존재한다. 또한, MVA는 6개의 자연 결실 부위를 포함하며, 각각은 삽입 부위로 사용될 수 있다(예를 들어, 결실 I, II, III, IV, V 및 VI; 예를 들어, 미국 특허 제5,185,146호 및 미국 특허 제6.440,442호 참조). MVA의 하나 이상의 유전자간 영역(IGR)은 또한 IGR IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 및 IGR 148/149과 같은 삽입 부위로 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2018/0064803호 참조). 추가의 적절한 삽입 부위가 국제 특허 공개 제WO2005/048957호에 기재되어 있다.
rMVA와 같은 재조합 폭스바이러스 입자는 당해 기술분야에 기재된 바와 같이 제조된다(문헌[Piccini, et al., 1987, Methods of Enzymology 153: 545-563]; 미국 특허 제4,769,330호; 미국 특허 제4,772,848호; 미국 특허 제4,603,112호; 미국 특허 제5,100,587호 및 미국 특허 제5,179,993호). 예시적인 방법에서, 바이러스에 삽입될 DNA 서열은 MVA의 DNA 섹션에 상동성인 DNA가 삽입된 대장균(E. coli) 플라스미드 작제물에 배치될 수 있다. 별도로, 삽입되는 DNA 서열은 프로모터에 라이게이션될 수 있다. 프로모터-유전자 결합은 프로모터-유전자 결합이 비필수 유전자좌를 포함하는 MVA DNA의 영역에 플랭킹(flanking)하는 DNA 서열에 상동성인 DNA에 의해 양 말단에 플랭킹되도록 플라스미드 작제물에 위치될 수 있다. 얻어진 플라스미드 작제물은 대장균 내에서 증식에 의해 증폭되고 분리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 포함하는 분리된 플라스미드는 예를 들어, 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 세포 배양물에 트랜스펙션될 수 있으며, 동시에 상기 배양물은 MVA로 감염된다. 플라스미드의 상동성 MVA DNA와 바이러스 게놈 사이의 재조합은 각각, 외래 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 MVA를 생성할 수 있다. rMVA 입자는 용해 단계(예를 들어, 화학적 용해, 동결/해동, 삼투압 충격, 초음파 처리 등) 후에 배양 상청액으로부터 또는 배양된 세포로부터 회수될 수 있다. 플라크 정제의 연속 라운드를 사용하여 오염 야생형 바이러스를 제거할 수 있다. 그 다음에, 바이러스 입자는 당업계에 공지된 기술(예를 들어, 크로마토그래프법 또는 염화세슘 또는 수크로스 구배 초원심분리법)을 사용하여 정제될 수 있다.
본 명세서에는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되며, 여기서 벡터는 MVA로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 16의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 18의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 19의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 20의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 21의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 22의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 23의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 23과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 24의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 24와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 25의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 25와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 26의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 27의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터는 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
자가-복제 RNA 분자
자가-복제 RNA는 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 알파바이러스는 VEEV/EEEV 군, 또는 SF 군, 또는 SIN 군에 속할 수 있다. SF 군 알파바이러스의 비제한적인 예는 셈리키 포레스트 바이러스, 오니옹니옹 바이러스(O'Nyong-Nyong virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 미델버그 바이러스(Middelburg virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 바마 포레스트 바이러스(Barmah Forest virus), 게타 바이러스(Getah virus), 마야로 바이러스(Mayaro virus), 사기야마 바이러스(Sagiyama virus), 베바루 바이러스(Bebaru virus), 및 우나 바이러스(Una virus)를 포함한다. SIN 군 알파바이러스의 비제한적인 예는 신드비스 바이러스, 거드우드 S. A. 바이러스(Girdwood S. A. virus), 남아프리카 아르보바이러스(South African Arbovirus) 제86, 옥켈보 바이러스(Ockelbo virus), 아우라 바이러스(Aura virus), 바반키 바이러스(Babanki virus), 와타로아 바이러스(Whataroa virus), 및 키질라가크 바이러스(Kyzylagach virus)를 포함한다. VEEV/EEEV 군 알파바이러스의 비제한적인 예는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV: Eastern equine encephalitis virus), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 에버글레이즈 바이러스(EVEV: Everglades virus), 무캄보 바이러스(MUCV: Mucambo virus), 픽수나 바이러스(PIXV: Pixuna virus), 미들버그 바이러스(MIDV: Middleburg virus), 치쿤구니아 바이러스(CHIKV), 오니옹니옹 바이러스(ONNV), 로스 리버 바이러스(RRV), 바마 포레스트 바이러스(BF), 게타 바이러스(GET), 사기야마 바이러스(SAGV), 베바루 바이러스(BEBV), 마야로 바이러스(MAYV), 및 우나 바이러스(UNAV)를 포함한다.
자가-복제 RNA 분자는 알파바이러스 게놈으로부터 유래될 수 있으며, 이는 이들이 알파바이러스 게놈의 구조적 특징 중 일부를 갖거나 이들과 유사하다는 것을 의미한다. 자가-복제 RNA 분자는 변형된 알파바이러스 게놈으로부터 유래될 수 있다.
자가-복제 RNA 분자는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 에버글레이즈 바이러스(EVEV), 무캄보 바이러스(MUCV), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 픽수나 바이러스(PIXV), 미들버그 바이러스(MIDV), 치쿤구니아 바이러스(CHIKV), 오니옹니옹 바이러스(ONNV), 로스 리버 바이러스(RRV), 바마 포레스트 바이러스(BF), 게타 바이러스(GET), 사기야마 바이러스(SAGV), 베바루 바이러스(BEBV), 마야로 바이러스(MAYV), 우나 바이러스(UNAV), 신드비스 바이러스(SINV), 아우라 바이러스(AURAV), 와타로아 바이러스(WHAV), 바반키 바이러스(BABV), 키질라가크 바이러스(KYZV), 서부 말 뇌염 바이러스(WEEV: Western equine encephalitis virus), 하이랜드 J 바이러스(HJV: Highland J virus), 포트 모건 바이러스(FMV: Fort Morgan virus), 엔두무(NDUV: Ndumu), 및 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus)로부터 유래될 수 있다. 병원성 및 비병원성 알파바이러스 균주는 둘 모두 적합하다. 일부 실시 형태에서, 알파바이러스 RNA 레플리콘은 신드비스 바이러스(SIN), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 로스 리버 바이러스(RRV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 또는 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV)의 것이다.
일부 실시 형태에서, 알파바이러스-유래 자가-복제 RNA 분자는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)이다.
자가-복제 RNA 분자는 야생형 신세계 또는 구세계 알파바이러스 게놈으로부터의 RNA 서열(또는 이에 의해 인코딩되는 아미노산 서열)을 함유할 수 있다. 본 명세서에 개시된 자가-복제 RNA 분자 중 임의의 것은 야생형 알파바이러스 게놈 서열 "로부터 유래"되거나 이를 "기반으로 하는" RNA 서열을 함유할 수 있으며, 이는 이들이 신세계 또는 구세계 알파바이러스 게놈일 수 있는 야생형 RNA 알파바이러스 게놈으로부터의 RNA 서열(이는 상응하는 RNA 서열일 수 있음)과 60% 이상 또는 65% 이상 또는 68% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 97% 이상 또는 98% 이상 또는 99% 이상 또는 100% 또는 80 내지 99% 또는 90 내지 100% 또는 95 내지 99% 또는 95 내지 100% 또는 97 내지 99% 또는 98 내지 99%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다.
자가-복제 RNA 분자는 허용 세포 내에서 이들 자체의 증폭 또는 자가-복제를 유도하기 위해 필요한 모든 유전 정보를 함유한다. 이들 자체의 복제를 유도하기 위해, 자가-복제 RNA 분자는 RNA 증폭 과정을 촉매하기 위해 바이러스 또는 숙주 세포-유래 단백질, 핵산, 또는 리보핵단백질과 상호작용할 수 있는 중합효소, 복제효소, 또는 다른 단백질을 인코딩하고; 레플리콘-인코딩된 RNA의 복제 및 전사에 필요한 시스-작용성 RNA 서열을 함유한다. 따라서, RNA 복제는 다중의 딸 RNA의 생성을 유발한다. 이들 딸 RNA뿐만 아니라 공선적 서브게놈 전사체는, 관심 유전자의 원위치 발현을 제공하기 위해 번역될 수 있거나, 관심 유전자의 원위치 발현을 제공하기 위해 번역되는 전달된 RNA와 동일한 센스를 갖는 추가의 전사체를 제공하기 위해 전사될 수 있다. 이러한 전사 순서의 전체적인 결과는 도입된 레플리콘 RNA의 수의 막대한 증폭이며, 따라서 인코딩된 관심 유전자는 세포의 주요 폴리펩티드 생성물이 된다.
알파바이러스의 게놈 내에는 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF), 비-구조(ns) 및 구조 유전자가 있다. ns ORF는 바이러스 RNA의 전사 및 복제에 필요하고 다단백질로서 생성되며 바이러스 복제 기구인 단백질(nsP1 내지 nsP4)을 인코딩한다. 구조 ORF는 3개의 구조 단백질을 인코딩한다: 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 이종이량체로서 회합하는 엔벨로프 단백질 P62 및 El. 바이러스 막-고정된 표면 당단백질은 수용체 인식 및 막 융합을 통한 표적 세포 내로의 진입을 담당한다. 4개의 ns 단백질 유전자는 게놈의 5' 2/3의 유전자에 의해 인코딩되는 반면에, 3개의 구조 단백질은 게놈의 3' 1/3과 공선적인 서브게놈 mRNA로부터 번역된다. 알파바이러스 게놈의 예시적인 도시를 도 18a에 나타낸다.
자가-복제 RNA 분자는 구조 유전자를 인코딩하는 바이러스 서열을 대체하거나 구조 유전자를 인코딩하는 서열의 5' 또는 3'에 외래 서열을 삽입함으로써 숙주 세포에 외래 서열을 도입하는 단계의 기반으로 사용될 수 있다. 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있는, 복제효소의 하류의 바이러스 구조 유전자를, 관심 유전자(GOI), 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 대체하도록 이들을 조작할 수 있다. 형질감염 시에, 즉시 번역되는 복제효소는 게놈 RNA의 5' 및 3' 말단과 상호작용하고, 상보적 게놈 RNA 카피를 합성한다. 이들은 신규한 양성-가닥의 캡핑되고 폴리-아데닐화된 게놈 카피, 및 서브게놈 전사체의 합성을 위한 주형으로서 작용한다(도 18b). 궁극적으로 증폭은 세포당 최대 2 × 105개의 카피의 매우 높은 RNA 카피 수를 유발한다. 결과는 백신 효능 또는 치료의 치료적 영향에 영향을 줄 수 있는 GOI(예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 균일하고/하거나 향상된 발현이다. 따라서, 자가-복제 RNA 분자를 기반으로 하는 백신은 통상적인 바이러스 벡터에 비교하여 매우 높은 카피의 생성된 RNA로 인해 매우 낮은 수준으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 유의한 가치 중 하나는, 만성 또는 급성 면역 활성화 상태에 있는 개체에서 백신 효능이 증가될 수 있다는 것이다.
본 개시내용의 CALR/JAK2 또는 JAK2 에피토프 2 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 포함하는 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 본 명세서에 또한 기재된 바와 같은 다른 전달 기술을 포함하는 다양한 기술을 사용하여, 골수증식성 신생물을 갖는 대상체에게 이들을 전달함으로써 치료제로서 이용될 수 있다.
본 개시내용은 허용 세포 내에서 그 자체의 증폭 또는 자가-복제를 유도하기 위해 필요한 모든 유전 정보를 함유하는 자가-복제 RNA 분자를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 구조 유전자를 인코딩하는 바이러스 서열을 대체함으로써 숙주 세포(예를 들어, 본 개시내용의 CALR/JAK2 또는 JAK2 에피토프 2 폴리펩티드)에 외래 서열을 도입하는 단계의 기반으로서 사용될 수 있는 자가-복제 RNA 분자를 제공한다.
본 명세서에는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자이다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 16의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 18의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 19의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 20의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 21의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 22의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 23의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 23과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 24의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 24와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 25의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 25와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 26의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 27의 폴리뉴클레오티드로부터 유래되거나 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성, 또는 95% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
상기 자가-복제 RNA 분자 중 임의의 것은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다:
Figure pct00016
하나 이상의 비구조 유전자 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4;
Figure pct00017
DLP 모티프, 5' UTR, 3'UTR, 및 폴리 A 중 하나 이상; 및
Figure pct00018
서브게놈 프로모터.
일부 실시 형태에서, 예를 들어, 자가-복제 RNA 분자는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
Figure pct00019
하나 이상의 비구조 유전자 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4;
Figure pct00020
DLP 모티프, 5' UTR, 3'UTR, 및 폴리 A 중 하나 이상; 및
Figure pct00021
서브게놈 프로모터; 및
Figure pct00022
서열 번호 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 31의 아미노산을 인코딩하며, 서브게놈 프로모터에 작동가능하게 연결된 RNA.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 RNA 서열; 5' 및 3' 알파바이러스 비번역 영역; 신세계 알파바이러스 VEEV 비구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열; 단백질을 인코딩하는 RNA 서열에 작동가능하게 연결되고 그의 번역을 조절하는 서브-게놈 프로모터; 5' 캡 및 3' 폴리-A 테일; 양성 센스, 단일-가닥 RNA; 비-구조 단백질 1(nsP1)의 상류에 있는 신드비스 바이러스로부터의 DLP; 2A 리보솜 스킵핑 요소; 및 5'-UTR의 하류 및 DLP의 상류에 있는 nsp1 뉴클레오티드 반복을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 크기가 1 kb 이상 또는 2 kb 이상 또는 3 kb 이상 또는 4 kb 이상 또는 5 kb 이상 또는 6 kb 이상 또는 7 kb 이상 또는 8 kb 이상 또는 10 kb 이상 또는 12 kb 이상 또는 15 kb 이상 또는 17 kb 이상 또는 19 kb 이상 또는 20 kb 이상일 수 있거나, 크기가 100 bp 내지 8 kb 또는 500 bp 내지 8 kb 또는 500 bp 내지 7 kb 또는 1 내지 7 kb 또는 1 내지 8 kb 또는 2 내지 15 kb 또는 2 내지 20 kb 또는 5 내지 15 kb 또는 5 내지 20 kb 또는 7 내지 15 kb 또는 7 내지 18 kb 또는 7 내지 20 kb일 수 있다.
상기-개시된 자가-복제 RNA 분자 중 임의의 것은 자가프로테아제 펩티드(예를 들어, 자가촉매성 자가-절단 펩티드)에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 자가프로테아제에 대한 코딩 서열은 임의로 제2 핵산 서열에 대해 상류에 작동가능하게 연결된다.
일반적으로, 당업계에 알려진 임의의 단백질분해 절단 부위는 본 개시내용의 핵산 분자 내로 혼입될 수 있으며, 예를 들어, 프로테아제에 의해 생성-후 절단되는 단백질 분해 절단 서열일 수 있다. 추가의 적합한 단백질분해 절단 부위는 또한 외부 프로테아제의 첨가 후에 절단될 수 있는 단백질분해 절단 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "자가프로테아제"는 자가단백질분해 활성을 보유하고 더 큰 폴리펩티드 모이어티로부터 자신을 절단할 수 있는 "자가-절단" 펩티드를 지칭한다. 피코르나바이러스 군의 구성원인 수족구병 바이러스(FMDV: foot-and-mouth disease virus)에서 최초로 확인되고, 예를 들어, 말 비염 A 바이러스(E2A: equine rhinitis A virus), 돼지 테스코바이러스-1(P2A: porcine teschovirus-1), 및 토세아 아시그나 바이러스(T2A: Thosea asigna virus)로부터의 "2A 유사" 펩티드와 같은 몇몇 자가프로테아제가 후속하여 확인되었으며, 단백질분해 절단에서의 이들의 활성은 다양한 시험관외(ex vitro) 및 생체내 진핵생물 시스템에서 나타났다. 이와 같이, 다수의 자연 발생 자가프로테아제 시스템이 확인되었으므로 자가프로테아제의 개념은 당업자에게 이용가능하다. 잘 연구된 자가프로테아제 시스템은, 예를 들어, 바이러스 프로테아제, 발달 단백질(developmental protein)(예를 들어, HetR, 헤지호그 단백질), RumA 자가프로테아제 도메인, UmuD 등이다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 자가프로테아제 펩티드의 비제한적인 예는 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 수족구병 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나 바이러스 2A(T2A), 세포질 다각체 바이러스 2A(cytoplasmic polyhedrosis virus 2A)(BmCPV2A), 연화병 바이러스 2A(Flacherie Virus 2A)(BmIFV2A), 또는 이들의 조합으로부터의 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가프로테아제 펩티드에 대한 코딩 서열은 DLP 모티프의 하류 및 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 대해 상류에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시 형태에서, 자가프로테아제 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 수족구병 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나 바이러스 2A(T2A), 세포질 다각체 바이러스 2A(BmCPV2A), 연화병 바이러스 2A(BmIFV2A), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 자가프로테아제 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A)의 펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가프로테아제 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 수족구병 바이러스(FMDV) 2A(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A), 토세아 아시그나 바이러스 2A(T2A), 세포질 다각체 바이러스 2A(BmCPV2A), 연화병 바이러스 2A(BmIFV2A), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 자가프로테아제 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A)이다.
본 개시내용의 변형된 바이러스 RNA 레플리콘 내의 P2A 펩티드의 혼입은 캡시드-GOI 융합으로부터 GOI(예를 들어, 본 개시내용의 CALR-JAK2 또는 JAK2 에피토프 2 폴리펩티드)에 의해 인코딩된 단백질의 방출을 가능하게 한다.
본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A) 펩티드 서열은 DLP 서열 바로 뒤에 인-프레임 조작되고 모든 GOI의 바로 상류에서 인-프레임 조작된다.
상기-개시된 자가-복제 RNA 분자 중 임의의 것은 코딩 서열 하류 루프(DLP) 모티프를 추가로 포함할 수 있다.
일부 바이러스는 캡시드 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 증가시키는, 하나 이상의 줄기-루프 구조를 형성할 수 있는 서열을 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 바이러스 캡시드 인핸서는 그러한 줄기-루프 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 조절 요소를 지칭한다. 일부 예에서, 줄기-루프 구조는 캡시드 단백질의 코딩 서열 내부의 서열에 의해 형성되며, 하류 루프(DLP) 서열로 명명된다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 이들 줄기-루프 구조 또는 이의 변이체는 관심 유전자의 발현 수준을 조절하기 위해, 예를 들어 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 줄기-루프 구조 또는 이의 변이체는 이에 대해 하류에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및/또는 번역을 향상시키기 위해 재조합 벡터(예를 들어, 이종성 바이러스 게놈에서)에 사용될 수 있다.
숙주 세포에서의 알파바이러스 복제는 이중가닥 RNA-의존적 단백질 키나제(PKR)를 유도하는 것으로 알려져 있다. PKR은 진핵 번역 개시 인자 2α(eIF2α)를 인산화한다. eIF2α의 인산화는 mRNA의 번역 개시를 차단하고, 그렇게 하는 중에 바이러스가 생산적 복제 사이클을 완료하는 것을 방지한다. 신드비스 바이러스에 의한 세포의 감염은 eIF2α의 인산화를 유발하는 PKR을 유도하지만, 바이러스 서브게놈 mRNA는 효율적으로 번역되는 반면에 다른 모든 세포 mRNA의 번역은 제한된다. 신드비스 바이러스에서 바이러스 서브게놈 mRNA의 효율적인 번역은 바이러스 캡시드 단백질(예를 들어, 캡시드 인핸서)에 대한 야생형 AUG 개시자 코돈의 하류에 위치하는 안정한 RNA 헤어핀 루프(또는 DLP 모티프)의 존재에 의해 가능하게 된다. DLP 구조는 야생형 AUG 상에 리보솜을 지체시킬 수 있고, 이는 기능적 eIF2α에 대한 요구 없이 서브게놈 mRNA의 번역을 지원한다는 것이 보고되어 있다. 따라서, 신드비스 바이러스(SINV)뿐만 아니라 다른 알파바이러스의 서브게놈 mRNA는 고도로 활성인 PKR을 갖는 세포에서도 효율적으로 번역되어 eIF2α의 완전한 인산화를 유발한다.
DLP 구조는 신드비스 바이러스(SINV) 26S mRNA에서 최초로 특성화되었고, 셈리키 포레스트 바이러스(SFV)에서도 검출되었다. 신세계(예를 들어, MAYV, UNAV, EEEV(NA), EEEV(SA), AURAV) 및 구세계(SV, SFV, BEBV, RRV, SAG, GETV, MIDV, CHIKV, 및 ONNV) 구성원을 포함하는 알파바이러스 속의 14개 이상의 다른 구성원에 유사한 DLP 구조가 존재하는 것으로 보고되었다. 이들 알파바이러스 26S mRNA의 예측 구조는 SHAPE(선택적 2′-하이드록실 아실화 및 프라이머 연장) 데이터를 기반으로 작제되었으며(문헌[Toribio et al., Nucleic Acids Res. May 19; 44(9):4368-80, 2016]), 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. CHIKV 및 ONNV를 제외한 모든 경우에 안정적인 줄기-루프 구조가 검출된 반면에, MAYV 및 EEEV는 더 낮은 안정성의 DLP를 나타냈다(문헌[Toribio et al., 2016 상기 문헌]). 가장 높은 DLP 활성은 가장 안정한 DLP 구조를 함유하는 알파바이러스에 대해 보고되었다.
예로서, 알파바이러스 속의 구성원은 바이러스 26S 전사체 내부에 존재하는 하류 루프(DLP)에 의한 항바이러스 RNA-활성화 단백질 키나제(PKR)의 활성화에 저항할 수 있으며, 이는 이들 mRNA의 eIF2-독립적 번역 개시를 가능하게 한다. 하류 루프(DLP)는 SINV 26S mRNA에서, 그리고 알파바이러스 속의 다른 구성원에서 AUG로부터 하류에 위치한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 DLP 모티프(들)에 작동가능하게 연결된 관심 유전자(GOI)에 대한 코딩 서열 및/또는 DLP 모티프에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자는 하류 루프(DLP)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 하류 루프(DLP)는 하나 이상의 RNA-줄기-루프를 포함한다.
일부 경우에, DLP 활성은 DLP 모티프와 개시 코돈 AUG(AUGi) 사이의 거리에 따라 달라진다. 알파바이러스 26S mRNA에서의 AUG-DLP 간격은 DLP에 의해 지체된 40S 서브유닛의 P 부위에서 AUGi가 배치되도록 하는 방식으로 리보솜 18S rRNA의 ES6S 영역의 토폴로지에 조정되어, eIF2의 참여 없이 Met-tRNA의 혼입을 가능하게 한다. 신드비스 바이러스의 경우, DLP 모티프는 신드비스 서브게놈 RNA의 최초 약 150 nt에서 발견된다. 신드비스 캡시드 AUG 개시 코돈(신드비스 서브게놈 RNA의 nt 50의 AUG)의 하류에 헤어핀이 위치하며, 이는 정확한 캡시드 유전자 AUG를 사용하여 번역이 개시되도록 리보솜의 지체를 유발한다. 서열 비교 및 구조 RNA 분석의 이전의 연구는 SINV에서 DLP의 진화적 보존을 규명하였고, 알파바이러스 속의 다수의 구성원에서 등가의 DLP 구조의 존재를 예측하였다(예를 들어, 문헌[Ventoso, J. Virol. 9484-9494, Vol. 86, September 2012] 참조).
임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 임의의 GOI에 대한 코딩 서열의 상류에 DLP 모티프를 배치하는 것은 전형적으로, GOI AUG가 아닌 캡시드 AUG 상에서 개시가 일어나기 때문에, 헤어핀 영역 내에 인코딩된 N-말단 캡시드 아미노산의 GOI 인코딩된 단백질에 대한 융합-단백질을 유발하는 것으로 여겨진다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 비-구조 단백질 1(nsP1)의 상류에 배치된 하류 루프를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 하류 루프는 비-구조 단백질 1(nsP1)의 상류에 배치되고, 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A) 리보솜 스킵핑 요소에 의해 nsP1에 결합된다.
본 개시내용의 DLP-함유 자가-복제 RNA는 대상체에서 선천성 면역계에 대한 내성을 부여하는 데 유용할 수 있다. 비변형된 RNA 레플리콘은 이들이 도입되는 세포의 초기 선천성 면역계 상태에 민감하다. 세포/개체가 고도로 활성인 선천성 면역계 상태에 있는 경우, RNA 레플리콘 성능(예를 들어, GOI의 복제 및 발현)은 부정적인 영향을 받을 수 있다. 특히 비-구조 단백질의 단백질 번역의 개시를 제어하기 위해 DLP를 조작함으로써, 효율적인 RNA 레플리콘 복제에 영향을 미치는 선천성 면역계의 기존 활성화 상태의 영향이 제거되거나 경감된다. 결과는 치료의 백신 효능 또는 치료 영향에 영향을 줄 수 있는 GOI의 더 균일하고/하거나 향상된 발현이다.
본 개시내용의 자가-복제 RNA의 DLP 모티프는 세포 mRNA 번역이 억제되는 세포 환경에서 효율적인 mRNA 번역을 부여할 수 있다. DLP가 레플리콘 벡터의 비-구조 단백질 유전자의 번역과 연결되는 경우, 복제효소 및 전사효소 단백질은 PKR 활성화된 세포 환경에서 기능적 복제를 개시할 수 있다. DLP가 서브게놈 mRNA의 번역과 연결되는 경우에는, 세포 mRNA가 선천성 면역 활성화로 인해 제한될 경우에도, 강력한 GOI 발현이 가능하다. 따라서, 비-구조 단백질 유전자 및 서브게놈 mRNA 둘 모두의 번역을 구동하는 것을 돕기 위해 DLP 구조를 함유하는 자가-복제 RNA를 조작하는 것은 선천성 면역 활성화를 극복하는 강력한 방식을 제공한다.
DLP 모티프를 포함하는 자가-복제 RNA 벡터의 예는 미국 특허 출원 공개 제US2018/0171340호 및 국제 특허 출원 공개 제WO2018106615호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
상기-개시된 자가-복제 RNA 분자 중 임의의 것은 비구조 유전자 nsP1, nsP2, nsP3, 및/또는 nsP4를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 기능적 바이러스 구조 단백질을 인코딩하지 않는다.
알파바이러스 게놈은 비-구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4를 인코딩하며, 이는 간혹 P1234(또는 nsP1-4 또는 nsP1234)로 지칭되는 단일 다단백질 전구체로서 생성되고, 이는 단백질분해 가공을 통해 성숙 단백질로 절단된다(도 18b). nsP1은 크기가 약 60 kDa일 수 있고 메틸트랜스퍼라제 활성을 가질 수 있으며 바이러스 캡핑 반응에 관여할 수 있다. nsP2는 크기가 약 90 kDa이고 헬리카제 및 프로테아제 활성을 가질 수 있는 반면에 nsP3은 약 60 kDa이고 3개의 도메인을 함유한다: 마크로도메인, 중심(또는 알파바이러스 고유) 도메인, 및 초가변 도메인(HVD). nsP4는 크기가 약 70 kDa이고 코어 RNA-의존적 RNA 중합효소(RdRp) 촉매 도메인을 함유한다. 감염 후에 알파바이러스 게놈 RNA는 개별 단백질로 절단되는 P1234 다단백질을 생성하도록 번역된다.
알파바이러스 게놈은 또한 3개의 구조 단백질을 인코딩한다: 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 이종이량체로서 회합하는 엔벨로프 단백질 P62 및 E1. 구조 단백질은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있고, 관심 유전자(GIO)에 의해 대체될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA에는 구조 바이러스 단백질(예를 들어, 뉴클레오캡시드 단백질 C 및 엔벨로프 단백질 P62, 6K, 및 E1) 중 하나 이상(또는 전부)의 서열(들)이 결여될 수 있다(또는 함유하지 않음). 이들 실시 형태에서, 하나 이상의 구조 유전자를 인코딩하는 서열은, 예를 들어, 하나 이상의 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 본 개시내용의 CALR/JAK2 폴리펩티드 또는 JAK2 에피토프 2 폴리펩티드에 대한 코딩 서열(또는 다른 관심 유전자(GOI))과 같은 하나 이상의 서열로 치환될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA에는 알파바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 서열이 결여되거나; 알파바이러스(또는 임의로, 다른 임의의) 구조 단백질을 인코딩하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자에는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질에 대한 부분 또는 전체 코딩 영역이 추가로 결여된다. 예를 들어, 알파바이러스 발현 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 C, E1 당단백질, E2 당단백질, E3 단백질 및 6K 단백질 중 하나 이상에 대한 일부 또는 전체 코딩 서열이 결여될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 구조 바이러스 단백질 중 하나 이상에 대한 코딩 서열을 함유하지 않는다. 이러한 경우에, 구조 유전자를 인코딩하는 서열은, 예를 들어, GOI에 대한 코딩 서열, 예를 들어, 본 개시내용 도 18의 CALR/JAK2 또는 JAK2 에피토프 2 폴리뉴클레오티드와 같은 하나 이상의 서열로 치환될 수 있다.
본 개시내용은 또한 비구조 유전자 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4를 포함하는 자가-복제 RNA 분자를 제공하며, 여기서 자가-복제 RNA 분자는 기능적 바이러스 구조 단백질을 인코딩하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 비구조 바이러스 단백질(예를 들어, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4)에 대한 코딩 서열을 포함하는 자가-복제 RNA 분자를 제공한다. 레플리콘에 의해 인코딩된 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 단백질은 기능적 또는 생물학적 활성 단백질이다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 하나 이상의 비구조 바이러스 단백질의 일부에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA 분자는 하나 이상의 비구조 바이러스 단백질에 대한 인코딩 서열의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 범위를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 하나 이상의 비구조 바이러스 단백질의 실질적인 일부에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 비구조 바이러스 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 "실질적인 일부"는 비구조 바이러스 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 충분히 포함하여, 당업자에 의한 서열의 수동 평가, 또는 BLAST(예를 들어, 문헌["Basic Local Alignment Search Tool"] 내의; 문헌[Altschul S F et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993] 참조)와 같은 알고리즘을 사용하는 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 확인에 의해, 그 단백질의 추정상의 확인을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 하나 이상의 비구조 단백질에 대한 전체 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 천연 바이러스 비구조 단백질에 대한 실질적으로 모든 코딩 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 하나 이상의 비구조 바이러스 단백질은 동일한 바이러스로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 비-구조 단백질 1(nsP1)의 상류에 배치된 자가-복제 RNA 분자의 하류 루프 DLP는 신드비스 바이러스로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)로부터 유래된 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 서열, 및 신드비스 바이러스(SIN)로부터 유래된 DLP 모티프를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 또한 알파바이러스 nsP3 마크로 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서브-서열, 및 알파바이러스 nsP3 중심 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서브-서열을 갖는다. 자가-복제 RNA 분자는 또한 구세계 알파바이러스 nsP3 초가변 도메인으로부터 전체적으로 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서브-서열을 가질 수 있거나; 신세계 알파바이러스 nsP3 초가변 도메인으로부터 유래된 일부, 및 구세계 알파바이러스 nsP3 초가변 도메인으로부터 유래된 일부를 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있으며 즉, 초가변 도메인(HVD)은 혼성 또는 키메라 신세계/구세계 서열일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 야생형 신세계 알파바이러스 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4 단백질 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA 서열을 가질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 비구조 단백질은 상이한 바이러스로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 야생형 알파바이러스 nsP3으로부터 유래된 nsP3 마크로 도메인, 및 야생형 알파바이러스 nsP3으로부터 유래된 nsP3 중심 도메인을 인코딩하는 RNA 서열을 가질 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 마크로 및 중심 도메인(들)은 둘 모두 신세계 야생형 알파바이러스 nsP3으로부터 유래될 수 있거나, 둘 모두 구세계 야생형 알파바이러스 nsP3 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 마크로 도메인은 신세계 야생형 알파바이러스 마크로 도메인으로부터 유래될 수 있고 중심 도메인은 구세계 야생형 알파바이러스 중심 도메인으로부터 유래될 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 다양한 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 서열의 것일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 비 VEEV 비구조 단백질 nsP1, nsP2, nsP3, 및 nsP4를 함유한다.
축적된 실험 증거는 VEEV 및 다른 알파바이러스 게놈 및 이들의 결함이 있는 간섭(DI) RNA의 복제/증폭이 하기 3개의 프로모터 요소에 의해 결정된다는 것을 입증하였다: (i) 보존된 3'-말단 서열 요소(3' CSE) 및 그 뒤의 폴리(A) 테일; (ii) 음성-가닥 RNA 및 양성-가닥 RNA 합성 둘 모두에 대한 핵심 프로모터 요소로서 기능하는 5' UTR; 및 (iii) nsP1-코딩 서열 내에 위치하고 알파바이러스 게놈 복제의 인핸서로서 기능하는 51-nt 보존된 서열 요소(51-nt CSE)(문헌[Kim et al., PNAS, 2014, 111: 10708-10713] 및 그 안의 참고문헌).
상기-개시된 자가-복제 RNA 분자 중 임의의 것은 비변형된 5' 비번역 영역(5'UTR)을 추가로 포함할 수 있다.
이전의 연구는 VEEV 및 신드비스 바이러스 감염 중에 바이러스 비구조 단백질(nsP) 중 작은 일부만이 dsRNA 복제 중간체와 공동국소화된다는 것을 입증하였다. 따라서, 큰 분획의 nsP는 RNA 복제에 관여하지 않는 것으로 보인다(문헌 [Gorchakov R, et al. (2008) A new role for ns polyprotein cleavage in Sindbis virus replication. J Virol 82(13):6218-6231]). 이는 서브게놈 프로모터로부터 정상적으로 전사되고 추가로 증폭되지 않는 관심 단백질을 인코딩하는 서브게놈 RNA의 증폭을 위해 유휴 ns 단백질을 이용할 기회를 제공하였다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자의 nsP1의 단편은 5'-UTR의 하류 및 DLP의 상류에 복제된다.
일부 실시 형태에서, nsP1의 최초 193개 뉴클레오티드는 5' UTR의 하류 및 DLP의 상류에 복제된다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 변형된 5' 비번역 영역(5'-UTR)을 포함한다. 예를 들어, 변형된 5'-UTR은 위치 1, 2, 4, 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형된 5'-UTR은 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환을 포함하며, 더욱 바람직하게는, 변형된 5'-UTR은 위치 2에서 U->G 치환을 갖는다. 그러한 자가-복제 RNA 분자의 예는 미국 특허 출원 공개 제US2018/0104359호 및 국제 특허 출원 공개 제WO2018075235호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시 형태에서, UTR은 야생형 신세계 또는 구세계 알파바이러스 UTR 서열, 또는 이들 중 임의의 것으로부터 유래된 서열일 수 있다. 5' UTR은 임의의 적합한 길이, 예컨대 약 60 nt 또는 50 내지 70 nt 또는 40 내지 80 nt의 것일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 5' UTR은 또한 보존된 1차 또는 2차 구조(예를 들어, 하나 이상의 줄기-루프(들))를 가질 수 있고, 알파바이러스 또는 레플리콘 RNA의 복제에 참여할 수 있다. 3' UTR은 최대 수백 뉴클레오티드일 수 있으며, 예를 들어, 이는 50 내지 900 또는 100 내지 900 또는 50 내지 800 또는 100 내지 700 또는 200 nt 내지 700 nt일 수 있다. 3' UTR은 또한 2차 구조, 예를 들어, 단계 루프를 가질 수 있고, 폴리아데닐레이트 트랙 또는 폴리-A 테일이 이어질 수 있다.
5' 및 3' 비번역 영역은 레플리콘에 의해 인코딩된 다른 서열 중 임의의 것에 작동가능하게 연결될 수 있다. UTR은 다른 인코딩된 서열의 인식 및 전사에 필요한 서열 및 간격을 제공함으로써 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 프로모터 및/또는 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 개시내용의 GOI, 예를 들어, CALR/JAK2 또는 JAK2 에피토프 2 폴리뉴클레오티드는 서브게놈 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 천연 서브게놈 프로모터 대신에, 서브게놈 RNA는 뇌심근염 바이러스(EMCV: encephalomyocarditis virus), 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV: Bovine Viral Diarrhea Virus), 폴리오바이러스, 수족구병 바이러스(FMD), 엔테로바이러스 71, 또는 C형 간염 바이러스로부터 유래된 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 제어 하에 배치될 수 있다. 서브게놈 프로모터는 24개의 뉴클레오티드(신드비스 바이러스) 내지 100개 초과의 뉴클레오티드(비트 괴사성 황색 정맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus))의 범위이고, 일반적으로 전사 시작의 상류에서 발견된다.
자가-복제 RNA 분자는 3' 폴리-A 테일을 가질 수 있다. 그것은 또한 그의 3' 단부 부근에 폴리-A 중합효소 인식 서열(예를 들어, AAUAAA)을 포함할 수 있다.
자가-복제 RNA 분자가 재조합 알파바이러스 입자 내로 패키징되는 경우, 그것은 입자 형성을 유발하는 알파바이러스 구조 단백질과의 상호작용을 개시하는 역할을 하는 하나 이상의 서열, 소위 패키징 신호를 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 알파바이러스 입자는 하나 이상의 알파바이러스로부터 유래된 RNA; 및 구조 단백질을 포함하며, 여기서 상기 구조 단백질 중 하나 이상은 2개 이상의 알파바이러스로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 구조 바이러스 단백질(예를 들어, 뉴클레오캡시드 단백질 C 및 엔벨로프 단백질 P62, 6K, 및 E1)이 제거되고 본 개시내용의 CARL.JAK2 또는 JAK2 에피토프 2 폴리펩티드의 코딩 서열에 의해 대체된 VEEV 유래 벡터를 포함한다.
다른 바이러스 벡터 및 재조합 바이러스
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 인간 아데노-관련 바이러스, 예컨대 AAV-2(아데노-관련 바이러스 유형 2)로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터의 매력적인 특징은 이들이 어떠한 바이러스 유전자도 발현하지 않는다는 것이다. AAV 벡터에 포함된 유일한 바이러스 DNA 서열은 145 bp 역방향 말단 반복체(ITR)이다. 따라서, 벌거벗은(naked) DNA로 면역화할 때와 같이, 발현되는 유일한 유전자는 항원 또는 항원 키메라의 유전자이다. 추가로, AAV 벡터는 인간 말초혈액 단핵구 유래 수지상 세포와 같은 분열 및 비분열 세포 둘 다를 지속적인 도입 유전자 발현과 점막 면역 생성을 위한 경구 및 비강내 전달 가능성으로 형질도입하는 것으로 알려져 있다. 또한, 필요한 DNA의 양은 50 ㎍ 또는 약 1015개의 카피의 비결합 DNA 용량과는 대조적으로 1010 내지 10n개의 입자 또는 DNA 카피의 용량에서의 최대 반응으로, 몇 자릿수만큼 훨씬 더 적은 것으로 보인다. AAV 벡터는 AAV ITR 키메라 단백질 인코딩 작제물 및 ITR이 없는 AAV 코딩 영역(AAV rep 및 cap 유전자)을 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드 ACG2에 함유된 DNA로 적절한 세포주(예를 들어, 인간 293 세포)의 공트랜스펙션에 의해 패키징된다. 세포는 이후에 아데노바이러스 Ad5로 감염된다. 벡터는 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 염화세슘 밀도 구배 초원심분리법)을 사용하여 세포 용해물로부터 정제될 수 있으며, 검출 가능한 복제 가능 AAV 또는 아데노바이러스가 없는지 확인하기 위해 검증된다(예를 들어, 세포변성 효과 생물학적 검정에 의해).
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 또한 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스는 바이러스에 인코딩된 역전사효소를 사용하여 복제하는 통합 바이러스 부류로, 바이러스 RNA 게놈을 감염 세포(예를 들어, 표적 세포)의 염색체 DNA에 통합되는 이중 가닥 DNA로 복제한다. 그러한 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스, 특히 몰로니(문헌[Gilboa, et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 29]) 또는 프렌드 FB29 균주(국제 특허 출원 공개 제WO1995/01447호)로부터 유래된 것들을 포함한다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자 gag, pol 및 env의 전부 또는 일부가 결실되고, 5' 및 3' LTR 및 캡슐화 서열을 보유한다. 이들 요소는 레트로바이러스 벡터의 발현 레벨 또는 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형에는 레트로바이러스 캡슐화 서열을 VL30과 같은 레트로트랜스포존 중 하나로 치환하는 것이 포함된다(예를 들어, 미국 특허 제5,747,323호 참조).
본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 레트로바이러스 게놈에 대해 반대 방향으로, 캡시드화 서열의 하류에 삽입될 수 있다. 레트로바이러스 입자는 헬퍼 바이러스의 존재 하에 또는 레트로바이러스 벡터가 결함이 있는 레트로바이러스 유전자(예를 들어, gag/pol 및 env)를 게놈에 통합시켜 포함하는 적절한 상보성(패키징) 세포주에서 제조된다. 그러한 세포주는 선행 기술(문헌[Miller and Rosman, 1989, BioTechniques 7: 980]; 문헌[Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460]; 문헌[Markowitz, et al., 1988, Virol. 167: 400])에 기재되어 있다. env 유전자의 산물은 표적 세포의 표면에 존재하는 바이러스 수용체에 대한 바이러스 입자의 결합에 관여하므로, 레트로바이러스 입자의 숙주 범위를 결정한다. 따라서, 양종성 엔벨로프(amphotropic envelope) 단백질을 함유하는 PA317 세포(ATCC CRL 9078) 또는 293EI6(WO97/35996)와 같은 패키징 세포주는 인간 및 다른 종의 표적 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 입자는 배양 상청액으로부터 회수되고, 임의로 표준 기술(예를 들어, 크로마토그래피, 초원심분리)에 따라 추가로 정제될 수 있다.
조절 요소
본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내의 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 리프레서 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 그의 가장 넓은 합리적인 맥락으로 이해되어야 하며, 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 그것이 다른 폴리뉴클레오티드와 기능적 관계로 배치될 경우에 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터는 그것이 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
발현 벡터 및 바이러스 벡터에서 통상적으로 사용되는 인핸서 및 프로모터 서열 중 일부는 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV), 백시니아 P7.5 초기/후기 프로모터, CAG, SV40, 마우스 CMV(mCMV), EF-1 및 hPGK 프로모터이다. 강력하고 약 0.8 kB의 적당한 크기로 인해, hCMV 프로모터는 이들 프로모터 중 가장 일반적으로 사용되는 것 중 하나이다. hPGK 프로모터는 작은 크기(약 0.4kB)가 특징이지만, hCMV 프로모터보다 덜 강력하다. 한편, 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소, 프로모터, 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 인트론, 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체로 이루어진 CAG 프로모터는 hCMV 프로모터에 필적하는 매우 강력한 유전자 발현을 유도할 수 있지만, 이의 큰 크기로 공간 제약이 중요한 문제가 될 수 있는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터(AdV), 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV) 또는 렌티바이러스 벡터(LV))에서 덜 적합하게 된다.
사용될 수 있는 추가의 프로모터는 국제 특허 공개 제WO2018/146205호에 기재된 아오틴(Aotine) 헤르페스바이러스 1 주요 전초기(immediate early) 프로모터(AoHV-1 프로모터)이다. 프로모터는 리프레서 단백질의 존재 하에서 프로모터의 발현을 억제하기 위해 리프레서 단백질이 결합할 수 있는 리프레서 오퍼레이터 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 리프레서 오퍼레이터 서열은 TetO 서열 또는 CuO 서열이다(예를 들어, US9790256 참조).
특정 경우에, 동일한 벡터로부터 적어도 2개의 별개의 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 프로모터 및/또는 인핸서 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 예를 들어 뇌심근염 바이러스로부터의 내부 리보솜 침입 부위(IRES)를 이용함으로써 잘 알려진 2시스트론성 발현계가 사용될 수 있다. 대안적으로, hCMV-rhCMV 프로모터 및 국제 특허 공개 제WO2017/220499호에 기재된 다른 프로모터와 같은 양방향 합성 프로모터를 사용할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 또는 소 성장 호르몬(BGH)으로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 벡터는, 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 본 개시내용의 폴리펩티드의 복제 및 발현을 포함하지만 이로 제한되지 않는 벡터의 통상적인 기능(들)을 확립하기 위한 임의의 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 번역 정지 코돈, 리보솜 결합 요소, 전사 종결자, 선택 마커, 복제 기점 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. "발현 카세트"는 RNA 및 단백질을 제조하도록 세포 기구를 유도하는 벡터의 부분이다. 발현 카세트는 전형적으로 3개의 성분을 포함한다: 프로모터 서열, 오픈 리딩 프레임, 및 폴리아데닐화 신호를 임의로 포함하는 3'-비번역 영역(UTR). 오픈 리딩 프레임(ORF)은 시작 코돈으로부터 정지 코돈까지 관심 단백질(예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드)의 코딩 서열을 함유하는 리딩 프레임이다. 발현 카세트의 조절 요소는 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 기재된 발현 카세트에 사용하기에 적합한 임의의 성분은 본 출원의 벡터를 제조하기 위해 임의의 조합 및 임의의 순서로 사용될 수 있다.
벡터는 본 개시내용의 폴리펩티드의 발현을 제어하기 위해, 바람직하게는 발현 카세트 내부에 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 용어 "프로모터"는 그의 통상적인 의미로 사용되며 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 그것이 전사하는 뉴클레오티드 서열 부근의 동일한 가닥 상에 위치한다. 프로모터는 구성적, 유도성, 또는 억제성일 수 있다. 프로모터는 자연 발생 또는 합성일 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 상동성 프로모터(즉, 벡터와 동일한 유전자 공급원으로부터 유래됨) 또는 이종성 프로모터(즉, 상이한 벡터 또는 유전자 공급원으로부터 유래됨)일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 발현 카세트 내부에서 본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA에서, 프로모터는 알파바이러스에 대한 서브게놈 프로모터일 수 있다.
자가-복제 RNA에서, 벡터는 발현된 전사체를 안정화시키고/시키거나, RNA 전사체의 핵 방출을 향상시키고/시키거나, 전사-번역 커플링을 개선하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 서열의 예는 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 전형적으로 벡터의 발현 카세트 내부의 관심 단백질(예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 하류에 위치한다. 인핸서 서열은, 전사 인자에 의해 결합될 경우에 연관된 유전자의 전사를 향상시키는 조절 DNA 서열이다. 인핸서 서열은 바람직하게는 본 개시내용의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상류에, 그러나 벡터의 발현 카세트 내부의 프로모터 서열의 하류에 위치한다.
본 개시 내용의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 인핸서 서열이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 자가-복제 RNA 벡터의 성분 또는 서열 중 임의의 것은 성분 또는 서열 중 다른 임의의 것에 기능적으로 또는 작동가능하게 연결될 수 있다. 자가-복제 RNA 분자의 성분 또는 서열은 숙주 세포 또는 치료되는 유기체에서 하나 이상의 단백질 또는 펩티드(또는 생물의약품)의 발현을 위해 및/또는 레플리콘이 자가-복제하는 능력을 위해 작동가능하게 연결될 수 있다.
코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 UTR은 적절한 효소가 존재하는 경우에 코딩 서열의 전사 및 발현을 수행할 수 있다. 프로모터는 그것이 코딩 서열의 발현을 유도하는 기능을 하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 RNA 서열과 조절 서열(예를 들어, 프로모터 또는 UTR) 사이의 작동가능한 연결은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. "작동가능하게 연결된"은 또한 RdRp(예를 들어 nsP4), nsP1-4를 인코딩하는 서열, UTR, 프로모터, 및 RNA 레플리콘 내에서 인코딩하는 다른 서열과 같은 서열을 지칭할 수 있으며, 이는 이들이 생물의약품 분자의 전사 및 번역 및/또는 레플리콘의 복제를 가능하게 하도록 연결된다. UTR은 다른 인코딩된 서열의 리보솜에 의한 인식 및 번역에 필요한 서열 및 간격을 제공함으로써 작동가능하게 연결될 수 있다.
분자는 그의 자연적인(또는 야생형) 상응하는 분자와 동일한 활성의 50% 이상을 그것이 수행하는 경우에 기능적으로 또는 생물학적으로 활성이지만, 기능적 분자는 또한 그의 자연적인(또는 야생형) 상응하는 분자와 동일한 활성의 60% 이상 또는 70% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 100%를 수행할 수 있다. 자가-복제 RNA 분자는 또한 야생형 알파바이러스 아미노산 서열을 기반으로 하거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩할 수 있으며, 이는 이들이 신세계 또는 구세계 알파바이러스 게놈일 수 있는 야생형 RNA 알파바이러스 게놈에 의해 인코딩되는 아미노산 서열(이는 상응하는 서열일 수 있음)과 60% 이상 또는 65% 이상 또는 68% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 97% 이상 또는 98% 이상 또는 99% 이상 또는 100% 또는 80 내지 99% 또는 90 내지 100% 또는 95 내지 99% 또는 95 내지 100% 또는 97 내지 99% 또는 98 내지 99%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 다른 서열로부터 유래된 서열은 원래의 서열보다 최대 5% 또는 최대 10% 또는 최대 20% 또는 최대 30% 더 길거나 더 짧을 수 있다. 실시 형태 중 임의의 것에서, 서열 동일성은 G3BP 또는 FXR 결합 부위를 그 위에 인코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열(또는 이를 갖는 아미노산 서열)에 대해 95% 이상 또는 97% 이상 또는 98% 이상 또는 99% 이상 또는 100%일 수 있다. 이들 서열은 또한 원래의 서열보다 최대 5% 또는 최대 10% 또는 최대 20% 또는 최대 30% 더 길거나 더 짧을 수 있다.
숙주 세포
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 상기 벡터 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 PER.C6, PER.C6 TetO, 닭 배아 섬유아세포(CEF), CHO, HEK293, HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 또는 Age1 세포주이다.
조성물
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것, 폴리펩티드 중 임의의 것, 및 벡터 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 포함할 수 있으며, 여기서 벡터는 Ad26, GAd20, MVA, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된다.
상기 기재된 조성물 중 임의의 것은 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있거나 이로 제형화될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한"은 사용되는 투여량 및 농도에서 이들이 투여되는 대상체에게 원치 않거나 유해한 효과를 야기하지 않을 부형제를 지칭하며, 담체, 완충제, 안정화제, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 재료를 포함한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어 근육내, 피하, 경구, 정맥내, 피부, 점막내(예를 들어, 장), 비강내 또는 복막내 경로에 좌우될 수 있다. 물, 석유, 동물유 또는 식물유, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체가 포함될 수 있다. 생리식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 예시적인 제형은 아데노바이러스 세계 표준(Adenovirus World Standard)(문헌[Hoganson et al, 2002])이다: 20 mM 트리스 pH 8, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤; 또는 20 mM 트리스, 2 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 수크로스 10% w/v, 폴리소르베이트-80 0.02% w/v; 또는 10-25 mM 시트레이트 완충제 pH 5.9-6.2, 4-6% (w/w) 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HBCD), 70-100 mM NaCl, 0.018-0.035% (w/w) 폴리소르베이트-80, 및 임의로 0.3-0.45% (w/w) 에탄올. 많은 다른 완충제가 사용될 수 있으며, 정제된 약제학적 제제의 보관 및 약제학적 투여에 적합한 제형의 예가 알려져 있다.
조성물은 하나 이상의 애주번트를 포함할 수 있다. 그러한 애주번트의 예는 무기 애주번트(예를 들어, 무기 금속 염, 예컨대 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드), 유기 애주번트(예를 들어, 사포닌 또는 스쿠알렌), 오일-기반 애주번트(예를 들어, 프로인트 완전 애주번트 및 프로인트 불완전 애주번트), 리포솜, 또는 생분해성 미소구체), 바이로솜, 박테리아 애주번트(예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 또는 뮤라밀 펩티드), 합성 애주번트(예를 들어, 비-이온성 블록 공중합체, 뮤라밀 펩티드 유사체, 또는 합성 지질 A), 또는 합성 폴리뉴클레오티드 애주번트(예를 들어, 폴리아르기닌 또는 폴리라이신)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 애주번트의 다른 비제한적인 예는 QS-21, Detox-PC, MPL- SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-알레틴, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, 알룸, 및 MF59를 포함한다.
사용될 수 있는 다른 애주번트는 렉틴, 성장 인자, 사이토카인, 및 림포카인, 예컨대 알파-인터페론, 감마 인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF), 종양 괴사 인자(TNF), 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, 또는 TLR 작용제, 및 미립자 애주번트(예를 들어, 면역-자극 복합체(ISCOMS))를 포함한다.
나노입자
일부 실시 형태에서, 조성물은 나노입자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 대상체로의 전달을 위해 나노입자에 부착되거나 이와 접촉될 수 있다. 나노입자를 사용하는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 임의의 것의 전달은 백신 조성물에 바이러스 또는 애주번트를 포함할 필요성을 제거할 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 나노입자는 펩티드에 대한 면역반응을 효과적으로 유도하는 데 도움이 되는 면역 위험 신호를 포함할 수 있다. 나노입자는 강력한 면역반응에 필요한 수지상 세포(DC) 활성화 및 성숙을 유도할 수 있다. 나노입자는 항원 제시 세포와 같은 세포에 의한 나노입자 및 따라서 펩티드의 흡수를 개선하는 비자기 성분을 함유할 수 있다.
나노입자는 전형적으로 직경이 약 1 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어 약 20 nm 내지 약 40 nm이다. 평균 직경이 20 내지 40 nm인 나노입자는 사이토졸에 대한 나노입자의 흡수를 촉진시킬 수 있다(예를 들어, WO2019/135086 참조). 예시적인 나노입자는 폴리머 나노입자, 무기 나노입자, 리포좀, 지질 나노입자(LNP), 면역 자극 복합체(ISCOM), 바이러스 유사 입자(VLP) 또는 자기 조립 단백질이다. 나노입자는 인산칼슘 나노입자, 실리콘 나노입자 또는 금 나노입자일 수 있다. 폴리머 나노입자는 하나 이상의 합성 폴리머, 예컨대 폴리(d,l-락티드-코-글리콜라이드)(PLG), 폴리(d,l-락트산-코글리콜산)(PLGA), 폴리(g-글루탐산)(g-PGA)m 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 또는 폴리스티렌 또는 하나 이상의 천연 폴리머, 예컨대 다당류, 예를 들어 풀루란, 알기네이트, 이눌린 및 키토산을 포함할 수 있다. 폴리머 나노입자의 사용은 나노입자에 포함될 수 있는 폴리머의 특성으로 인해 유리할 수 있다. 예를 들어, 상기에 언급된 천연 및 합성 폴리머는 양호한 생체적합성 및 생분해성, 비독성 특성 및/또는 원하는 형상 및 크기로 조작되는 능력을 가질 수 있다. 폴리머 나노입자는 하이드로젤 나노입자, 즉, 유연한 메시 크기, 다가 접합을 위한 큰 표면적, 높은 수분 함량 및 항원에 대한 높은 로딩 용량을 포함하는 유리한 특성을 갖는 친수성 3차원 폴리머 네트워크를 형성할 수 있다. 폴리(L-락트산)(PLA), PLGA, PEG, 및 다당류와 같은 중합체가 하이드로젤 나노입자를 형성하기에 적합하다. 무기 나노입자는 전형적으로 강성 구조를 가지며, 항원이 캡슐화된 셸 또는 항원이 공유결합될 수 있는 코어를 포함한다. 코어는 하나 이상의 원자, 예컨대 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu) 원자, Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd 또는 Au/Ag/Cu/Pd 또는 인산칼슘(CaP)을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 나노입자는 리포솜일 수 있다. 리포솜은 전형적으로 생분해성 비독성 인지질로 형성되며, 수성 코어를 갖는 자기 조립 인지질 이중층 셸을 포함한다. 리포솜은 단일 인지질 이중층을 포함하는 단층 소포이거나, 수층에 의해 분리된 여러 동심 인지질 셸을 포함하는 다중층 소포일 수 있다. 결과적으로, 리포솜은 친수성 분자를 수성 코어에 통합하거나, 소수성 분자를 인지질 이중층 내에 통합하도록 맞춰질 수 있다. 리포솜은 전달을 위해 코어 내부에 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 캡슐화할 수 있다. 리포솜 및 리포솜 제형은 표준 방법에 따라 제조될 수 있고, 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington's]; 문헌[Akimaru, 1995, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-210]; 문헌[Alving, 1995, Immunol. Rev. 145: 5-31]; 문헌[Szoka, 1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467]; 미국 특허 제4,235,871호; 미국 특허 제4,501,728호; 및 미국 특허 제4,837,028호를 참조한다. 리포솜은 특정 세포형에 리포솜 복합체를 표적화하기 위한 표적화 분자를 포함할 수 있다. 표적화 분자는 표적 조직에서 발견되는 혈관 또는 세포의 표면 상의 생체분자(예를 들어, 수용체 또는 리간드)에 대한 결합 파트너(예를 들어, 리간드 또는 수용체)를 포함할 수 있다. 리포솜 전하는 혈액으로부터의 리포솜 제거에 중요한 결정 인자이며, 음성 하전된 리포솜은 세망내피계에 의해 더 빠르게 흡수되므로(문헌[Juliano, 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63: 651]), 혈류에서 더 짧은 반감기를 갖는다. 포스파티딜에탄올아민 유도체의 혼입은 리포솜 응집을 방지하여 순환 시간을 향상시킨다. 예를 들어, N-(오메가-카르복시)아실아미도포스파티딜에탄올아민을 L-알파-다이스테아로일포스파티딜콜린의 대형 단층 소포 내로 혼입시키는 것은, 생체내 리포솜 순환 수명을 극적으로 증가시킨다(예를 들어, 문헌[Ahl, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1329: 370-382] 참조). 전형적으로, 리포솜은 약 5 내지 15 몰%의 음으로 하전된 인지질, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린 또는 포스파티딜-이노시톨로 제조된다. 또한 포스파티딜글리세롤과 같은 음으로 하전된 인지질을 첨가하면, 자발적 리포솜 응집을 방지하여, 크기가 작은 리포솜 응집 형성의 위험을 최소화시킨다. 적어도 약 50몰% 농도의 막강성화제, 예컨대 스핑고미엘린 또는 포화 중성 인지질 및 5 내지 15 몰%의 모노시알릴강글리오시드(monosialylganglioside)는 또한 바람직하게는 강성과 같은 리포솜 특성을 부여할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,837,028호 참조). 게다가, 리포솜 현탁액은 저장 시의 자유 라디칼 및 지질 과산화 손상으로부터 지질을 보호하는 지질 보호제를 포함할 수 있다. 알파-토코페롤과 같은 친유성 자유-라디칼 소광제 및 페리옥사민과 같은 수용성 철-특이적 킬레이트제가 바람직하다.
자가-복제 RNA 분자 및/또는 이를 포함하는 조성물은 또한 중합체, 지질, 및/또는 다른 생분해성 제제, 예컨대 비제한적으로 칼슘 포스페이트, 중합체의 조합을 사용하여 나노입자로서 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 분자 및/또는 조성물의 전달이 향상될 수 있도록 나노입자의 미세 조정을 가능하게 하기 위해 코어-쉘, 혼성체, 및/또는 층상 구조체 내에 성분이 조합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 나노입자는 불균질한 크기의 다중층 소포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소포 형성 지질은 적절한 유기 용매 또는 용매계에 용해되고 진공 또는 불활성 가스 하에서 건조되어 얇은 지질 박막을 형성할 수 있다. 필요에 따라, 지질 박막은 삼차 부탄올과 같은 적절한 용매 중에 재용해된 다음에, 동결건조되어 더욱 용이하게 수화된 분말 유사 형태인 더욱 균질한 지질 혼합물을 형성할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 수용액으로 이러한 박막을 덮고, 교반하면서 전형적으로 15 내지 60 분의 기간에 걸쳐 수화되도록 하였다. 얻어진 다중층 소포의 크기 분포는 더욱 격렬한 교반 조건에서 지질을 수화하거나 데옥시콜레이트와 같은 가용화 세정제를 첨가하여 더욱 작은 크기로 전환될 수 있다. 수화 매질은 최종 리포솜 현탁액에서 리포솜의 내부 용적에 요구되는 농도로 핵산을 포함할 수 있다. 다중층 소포를 형성하기 위해 사용될 수 있는 적합한 지질은 DOTMA(문헌[Feigner, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417]), DOGS 또는 Transfectain™(문헌[Behr, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982- 6986]), DNERIE 또는 DORIE(문헌[Feigner, et al., Methods 5: 67-75]), DC-CHOL(문헌[Gao and Huang, 1991, BBRC 179: 280-285]), DOTAP™(문헌[McLachlan, et al., 1995, Gene Therapy 2: 674-622]), Lipofectamine™, 및 글리세롤지질 화합물(예를 들어, 제EP901463호 및 제W098/37916호 참조)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 나노입자는 면역-자극 복합체(ISCOM)일 수 있다. ISCOM은 전형적으로 콜로이드상 사포닌 함유 미셸로 형성되는 케이지 유사 입자이다. ISCOM은 콜레스테롤, 인지질(예를 들어, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린) 및 사포닌(예를 들어, 퀼라야 사포나리아(Quillaia saponaria) 나무의 퀼(Quil) A)을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 나노입자는 바이러스-유사 입자(VLP)일 수 있다. VLP는 생체적합성 캡시드 단백질의 자기 조립에 의해 형성되는, 감염성 핵산이 결여된 자기 조립 나노입자이다. VLP는 전형적으로 직경이 약 20 내지 약 150 nm, 예컨대 약 20 내지 약 40 nm, 약 30 내지 약 140 nm, 약 40 내지 약 130 nm, 약 50 내지 약 120 nm, 약 60 내지 약 110 nm, 약 70 내지 약 100 nm, 또는 약 80 내지 약 90 nm이다. VLP는 유리하게는, 면역계와의 상호작용에 자연적으로 최적화된 진화된 바이러스 구조의 파워를 이용한다. 자연적으로 최적화된 나노입자 크기와 반복적인 구조적 순서는 애주번트가 없는 경우에도 VLP가 강력한 면역반응을 유도한다는 것을 의미한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드와 복합체를 형성하기에 적합한 다른 분자는 양이온성 분자, 예컨대 폴리아미도아민(문헌[Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem. 4: 372-379]), 수지상 폴리라이신(국제 특허 출원 공개 제WO1995/24221호), 폴리에틸렌 이민 또는 폴리프로필렌 이민(국제 특허 출원 공개 제WO1996/02655), 폴리라이신(미국 특허 제5,595,897호), 키토산(미국 특허 제5,744,166호), DNA-젤라틴 코아세르베이트(예를 들어, 미국 특허 제6,207,195호; 미국 특허 제6,025,337호; 미국 특허 제5,972,707호 참조), 또는 DEAE 덱스트란(문헌[Lopata, et al., 1984, Nucleic Acid Res. 12: 5707-5717])을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 양이온성 분자, 예컨대 폴리아미도아민(문헌[Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem. 4: 372-379]), 수지상 폴리라이신(국제 특허 출원 공개 제WO1995/24221호), 폴리에틸렌 이민 또는 폴리프로필렌 이민(국제 특허 출원 공개 제WO1996/02655), 폴리라이신(미국 특허 제5,595,897호), 키토산(미국 특허 제5,744,166호), DNA-젤라틴 코아세르베이트(예를 들어, 미국 특허 제6,207,195호; 미국 특허 제6,025,337호; 미국 특허 제5,972,707호 참조), 또는 DEAE 덱스트란(문헌[Lopata, et al., 1984, Nucleic Acid Res. 12: 5707-5717]), 덴드리머(예를 들어, 제WO1996/19240호 참조), 또는 폴리에틸렌이민(PEI)(예를 들어, 문헌[Sun et al., 2014, Mol Med Rep. 10(5):2657-2662] 참조) 내에 패키징되거나 캡슐화될 수 있다.
개시된 자가-복제 RNA 분자 및/또는 본 개시내용의 폴리펩티드 중 임의의 것을 인코딩하는 자가-복제 RNA 분자를 포함하는 조성물은 하나 이상의 리포솜, 리포플렉스, 및/또는 지질 나노입자를 사용하여 캡슐화될 수 있다. 리포솜은 주로 지질 이중층으로 구성될 수 있고 폴리뉴클레오티드 및 자가-복제 RNA 분자의 투여를 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있는 인공적으로 제조된 소포이다. 리포솜은 비제한적으로 직경이 수백 나노미터일 수 있고 좁은 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심 이중층을 함유할 수 있는 다중층 소포(MLV), 직경이 50 nm보다 작을 수 있는 소형 단세포 소포(SUV), 및 직경이 50 내지 500 nm일 수 있는 대형 단층 소포(LUV)와 같은 상이한 크기의 것일 수 있다. 리포솜 설계는, 건강하지 않은 조직에 대한 리포솜의 부착을 개선하거나 비제한적으로 세포내이입과 같은 사건을 활성화하기 위해, 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 리포솜은 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 자가-복제 RNA 분자의 전달을 개선하기 위해 낮거나 높은 pH를 함유할 수 있다.
리포솜의 형성은 비제한적으로 포획된 약제학적 제형 및 리포솜 성분, 지질 소포가 분산되는 매질의 성질, 포획된 물질의 유효 농도 및 그의 잠재적 독성, 소포의 적용 및/또는 전달 중에 관여하는 임의의 추가의 공정, 의도된 적용을 위한 소포의 최적화 크기, 다분산성, 및 저장 수명, 및 배치-대-배치 재현성 및 안전하고 효율적인 리포솜 생성물의 대규모 생성의 가능성과 같은 물리화학적 특징에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자는 리포솜, 리포플렉스, 지질 나노입자, 또는 이들의 조합 내에 캡슐화되거나, 이들에 결합되거나, 이들 상에 흡착되며, 바람직하게는 자가-복제 RNA 분자는 지질 나노입자에 캡슐화된다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 중 임의의 것을 인코딩하는 자가-복제 RNA 분자는 입자의 지질 부분 내부에 완전히 캡슐화될 수 있으며, 이에 의해 뉴클레아제 분해로부터 RNA를 보호한다. "완전히 캡슐화된"은 유리 RNA를 유의하게 분해하는 혈청에 대한 노출 또는 뉴클레아제 검정 후에 RNA가 유의하게 분해되지 않음을 의미한다. 완전히 캡슐화될 경우에, 정상적으로 유리 핵산의 100%를 분해할 처리에서 바람직하게는 입자 내의 핵산의 25% 미만이 분해되고, 더욱 바람직하게는 입자 내의 핵산의 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만이 분해된다. "완전히 캡슐화된"은 또한, 핵산-지질 입자가 생체내 투여 시에 이들의 성분 부분으로 신속하게 분해되지 않음을 의미한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자 및/또는 이를 포함하는 조성물은 기능화된 지질 이중층 사이에 가교를 가질 수 있는 지질 소포 내에 제형화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자 및/또는 조성물은 지질-폴리양이온 복합체 내에 제형화될 수 있다. 지질-폴리양이온 복합체의 형성은 당업계에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예로서, 폴리양이온은 양이온성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대, 비제한적으로, 폴리라이신, 폴리오르니틴, 및/또는 폴리아르기닌 및 양이온성 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 자가-복제 RNA 분자 및/또는 조성물은 지질-폴리양이온 복합체 내에 제형화될 수 있으며, 이는 비제한적으로 콜레스테롤 또는 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같은 중성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 지질 나노입자 제형은 양이온성 지질 성분의 선택, 양이온성 지질 포화도, PEG화의 성질, 모든 성분의 비, 및 크기와 같은 생물리학적 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 자가-복제 RNA 분자는 도 20에 나타낸 바와 같이 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화된다. 지질 나노입자는 전형적으로 4개의 상이한 지질-이온화가능한 지질, 중성 헬퍼 지질, 콜레스테롤, 및 확산성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지질을 포함한다. LNP는 리포솜과 유사하지만, 기능과 조성이 약간 다르다. LNP는 DNA, mRNA, siRNA 및 sRNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 캡슐화하기 위해 설계된다. 전통적인 리포솜은 하나 이상의 지질 이중층으로 둘러싸인 수성 코어를 포함한다. LNP는 비-수성 코어 내에 폴리뉴클레오티드를 캡슐화하는 미셀-유사 구조를 취할 수 있다. LNP는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)을 포함한다. LNP는 정맥내(i.e.) 주사(즉) 후 연장된 순환 수명을 나타내며, 원위 부위(예를 들어, 투여 부위로부터 물리적으로 떨어져 있는 부위)에 축적되기 때문에, 전신 적용에 유용하다. LNP는 평균 직경이 약 50 nm 내지 약 150 nm, 예컨대 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm 일 수 있으며, 실질적으로 비독성이다. 폴리뉴클레오티드 로딩된 LNP의 제조는, 예를 들어, 미국 특허 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 및 PCT 출원 공개 제WO 96/40964호에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드 함유 LNP는 예를 들어, WO2019/191780호에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 양이온성 지질 또는 이의 염), 인지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질(예를 들어, 하나 이상의 PEG-지질 접합체)을 포함한다. 지질 입자는 또한 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 지질 입자는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 자가-복제 RNA 분자를 캡슐화할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리양이온성 조성물을 포함하는 LNP 제형은 생체내 및/또는 시험관외에서 본 명세서에 기재된 자가-복제 RNA 분자의 전달에 사용될 수 있다. 본 개시내용은 양이온성 지질을 포함하는 LNP 제형을 추가로 제공한다.
용어 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"은 1, 2, 3개 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정가능한 아미노 헤드 기(예를 들어, 알킬아미노 또는 다이알킬아미노 헤드 기)를 갖는 지질 및 이의 염을 포함하도록 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화되며(즉, 양성 하전됨), pKa 초과의 pH에서 실질적으로 중성이다. 양이온성 지질은 또한 적정가능한 양이온성 지질로 명명될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 지질은 양성자화가능한 3차 아민(예를 들어, pH-적정가능함) 헤드 기; 각각의 알킬 사슬이 독립적으로 0 내지 3개(예를 들어, 0, 1, 2, 또는 3개)의 이중 결합을 갖는 C18 알킬 사슬; 및 헤드 기와 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르, 또는 케탈 연결을 포함한다. 그러한 양이온성 지질은 DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, γ-DLenDMA, DLin-K- DMA, DLin-K-C2-DMA(DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K로도 알려짐), DLin-K-C3-DM A, DLin-K-C4-DMA, DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA, DLin-M-C2-DMA(MC2로도 알려짐), DLin-M-C3-DMA(MC3으로도 알려짐), 및 (DLin-MP-DMA)(1-B1 1로도 알려짐)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 개시내용은 또한 캡슐화된 자가-복제 RNA 분자를 제공하며, 여기서 양이온성 지질은 양성자화가능한 3차 아민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 지질은 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 8,8'-((((2-(다이메틸아미노)에틸)티오)카르보닐)아잔다이일) 다이옥타노에이트이다.
일부 실시 형태에서, 양이온성 지질 화합물은 비교적 비-세포독성이다. 양이온성 지질 화합물은 생체적합성이고 생분해성일 수 있다. 양이온성 지질은 pKa가 대략 5.5 내지 대략 7.5, 더욱 바람직하게는 대략 6.0 내지 대략 7.0의 범위일 수 있다.
본 명세서에 기재된 양이온성 지질 화합물은 몇몇 이유로 약물 전달에 특히 매력적이다: 이들은 DNA, RNA, 다른 폴리뉴클레오티드, 및 다른 음성 하전된 제제와 상호작용하기 위해, pH를 완충하기 위해, 엔도-삼투파괴(endo-osmolysis)를 야기하기 위해, 전달될 자가-복제 RNA 분자를 보호하기 위해 아미노기를 함유하며, 이들은 상업적으로 입수가능한 시재료로부터 합성될 수 있고/있거나; 이들은 pH 반응성이고 원하는 pKa로 조작될 수 있다.
지질 나노입자 제형은 신속하게 제거되는 지질 나노입자(reLNP)로 알려진 생분해성 양이온성 지질로 양이온성 지질을 대체함으로써 개선될 수 있다. 비제한적으로 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, 및 DLin-MC3-DMA와 같은 이온화가능한 양이온성 지질은 시간 경과에 따라 혈장 및 조직에 축적되며 잠재적인 독성 공급원일 수 있는 것으로 나타났다. 신속하게 제거되는 지질의 신속한 대사는 래트에서 지질 나노입자의 용인성 및 치료 지수를 1 mg/㎏ 용량으로부터 10 mg/㎏ 용량으로 한 자릿수만큼 개선할 수 있다. 효소적으로 분해된 에스테르 연결을 포함하는 것은, reLNP 제형의 활성을 여전히 유지하면서, 양이온성 성분의 분해 및 대사 프로파일을 개선할 수 있다. 에스테르 연결은 지질 사슬 내부에 내부적으로 위치될 수 있거나, 그것은 지질 사슬의 말단 단부에 말단 위치될 수 있다. 내부 에스테르 연결은 지질 사슬 내의 임의의 탄소를 대체할 수 있다. 지질 입자는 지질 접합체를 포함할 수 있다. 접합된 지질은 입자의 응집을 방지한다는 점에서 유용하다. 적합한 접합된 지질은 PEG-지질 접합체, 양이온성-중합체-지질 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
PEG는 2개의 말단 하이드록실기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형, 수용성 중합체이다. PEG는 이들의 분자량에 의해 분류되며; 하기를 포함한다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM)뿐만 아니라, 말단 메톡시기 대신에 말단 하이드록실기를 함유하는 그러한 화합물(예를 들어, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH2).
본 명세서에 기재된 PEG-지질 접합체의 PEG 모이어티는 550 달톤 내지 10,000 달톤 범위의 평균 분자량을 포함할 수 있다. PEG-지질의 예는 다이알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(PEG-DAA), 다이아실글리세롤에 커플링된 PEG(PEG-DAG), 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에 커플링된 PEG(PEG-PE), 세라미드에 접합된 PEG, 콜레스테롤 또는 이의 유도체에 접합된 PEG, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, PEG 접합된 지질은 DMG-PEG-2000이다.
자가-복제 RNA 분자는 또한 비-양이온성 지질을 포함하는 입자 내에 제형화될 수 있다. 적합한 비-양이온성 지질은, 예를 들어, 안정한 복합체를 생성할 수 있는 중성의 하전되지 않거나, 쯔비터이온성이거나, 음이온성인 지질을 포함한다. 비-양이온성 지질의 비제한적인 예는 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고마이엘린, 계란 스핑고마이엘린(ESM), 세팔린, 카르디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일- 포스파티딜글리세롤(POPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 포스파티딜에탄올아민 포스파티딜에탄올아민 포스파티딜에탄올아민 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민다이팔미토일- 다이미리스토일- 다이스테아로일- 모노메틸- 다이메틸- 다이엘라이도일- 스테아로일올레오일- 포스파티딜에탄올아민(SOPE), 라이소포스파티딜콜린, 다이리놀레오일포스파티딜콜린과 같은 인지질, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 다이아실포스파티딜콜린 및 다이아실포스파티딜에탄올아민 인지질이 또한 사용될 수 있다. 이들 지질 내의 아실기는 바람직하게는 C10 내지 C24 탄소 사슬을 갖는 지방산, 예를 들어, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 또는 올레오일로부터 유래된 아실기이다.
비-양이온성 지질의 추가의 예는 콜레스테롤과 같은 스테롤 및 이의 유도체를 포함한다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예는 5a-콜레스타놀, 5a-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르, 및 6-케토콜레스타놀과 같은 극성 유사체; 5a-콜레스탄, 콜레스테논, 5a-콜레스타논, 5a-콜레스타논, 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비-극성 유사체; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르와 같은 극성 유사체이다. 일부 실시 형태에서, 인지질은 DSPC이다. 일부 실시 형태에서, 지질 입자 내에 존재하는 비-양이온성 지질은 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하거나 이로 이루어진다. 지질 입자가 인지질 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물을 함유하는 일부 실시 형태에서, 혼합물은 입자 내에 존재하는 총 지질의 최대 40 몰%, 45 몰%, 50 몰%, 55 몰%, 또는 60 몰%를 차지할 수 있다.
일부 실시 형태에서, LNP는 30 내지 70%의 양이온성 지질 화합물, 0 내지 60%의 콜레스테롤, 0 내지 30%의 인지질, 및 1 내지 10%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 양이온성 지질, 쯔비터이온 지질, 콜레스테롤, 및 접합된 지질은 지질 나노입자 내에 각각 50:7:40:3의 몰비로 조합된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 LNP 제형은 투과성 인핸서 분자를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 나노입자 제형은 탄수화물 담체 및 자가-복제 RNA 분자를 포함하는 탄수화물 나노입자일 수 있다. 비제한적인 예로서, 탄수화물 담체는 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 재료, 피토글리코겐 옥테닐 석시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 및 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
키트
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 하나 이상의 조성물, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 재조합 바이러스를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하는 것을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 발명의 백신의 세포 내로의 진입을 용이하게 하기 위한 시약, 예컨대 지질 기반 제제 또는 바이러스 패키징 물질을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 Ad26 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 MVA 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 GAd20 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 자가-복제 RNA 분자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 Ad26 벡터 및 본 개시내용의 MVA 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 GAd20 벡터 및 본 개시내용의 MVA 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 Ad26 벡터 및 본 개시내용의 Gad20 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자 및 본 개시내용의 Gad20 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자 및 본 개시내용의 MVA 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 본 개시내용의 자가-복제 RNA 분자 및 본 개시내용의 Ad26 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 본 발명의 세포를 포함한다.
다른 분자
펩티드-HLA 복합체
본 개시내용은 또한 인간 백혈구 항원(HLA) 및 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 28, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편을 포함하는 단백질 복합체를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단편은 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 중 임의의 것의 면역원성 단편이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 6 내지 25개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 6개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 7개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 8개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 9개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 10개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 11개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 12개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 13개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 14개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 15개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 16개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 17개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 18개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 19개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 20개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 21개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 22개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 23개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 24개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 단편은 약 25개 아미노산의 길이이다.
일부 실시 형태에서, HLA는 클래스 I HLA 또는 클래스 II HLA이다.
일부 실시 형태에서, HLA는 HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02, 및 HLA-C*07:02, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시 형태에서, 단백질 복합체는 검출제 또는 세포독성제에 접합된다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 HLA와 폴리펩티드의 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 단백질성 분자를 제공한다.
단백질성 분자
일부 실시 형태에서, 단백질성 분자는 항체, 대안적인 스캐폴드, 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 T 세포 수용체(TCR)이다.
일부 실시 형태에서, 단백질성 분자는 항체이다.
일부 실시 형태에서, 단백질성 분자는 대안적인 스캐폴드이다.
일부 실시 형태에서, 단백질성 분자는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 실시 형태에서, 단백질성 분자는 T 세포 수용체(TCR)이다.
본 개시내용의 폴리펩티드 또는 펩티드-HLA 복합체에 대한 단백질성 분자의 결합은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 알려진 프로테온(ProteOn) XPR36, 비아코어(Biacore) 3000 또는 KinExA 기기, ELISA 또는 경쟁적 결합 분석을 사용할 수 있다. 측정된 결합은 상이한 조건(예를 들어, 오스몰 농도(osmolarity), pH) 하에 측정되는 경우에 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 전형적으로 표준화된 조건, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다. 예를 들어, 비아코어 3000 또는 프로테온을 사용하는 친화도 측정에 대한 내부 오차(표준 편차, SD로서 측정됨)는 전형적인 검출 한계 내에서의 측정에 대해 전형적으로 5 내지 33% 이내일 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. "실질적이지 않은"은 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 HLA/펩티드에 대한 단백질성 분자의 측정된 결합에 비교할 경우에 100-배 미만인 결합을 지칭한다.
항체
폴리펩티드 또는 HLA/펩티드 복합체에 결합하는 항체는 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]의 하이브리도마 방법이 단일클론 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터, 래트, 또는 원숭이를 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이의 단편으로 면역화한 후에, 표준 방법을 사용하여 면역화된 동물로부터의 비장세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 단일 불멸화(immortalized) 하이브리도마 세포로부터 발생하는 콜로니를 원하는 특성, 예컨대 결합 특이성 및 친화도를 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝한다.
다양한 숙주 동물을 사용하여 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 표준 면역화 프로토콜을 사용하여, Balb/c 마우스, 래트, 또는 닭을 사용하여 VH/VL 쌍을 함유하는 항체를 생성할 수 있고, 라마 및 알파카를 사용하여 중쇄 단독(VHH) 항체를 생성할 수 있다. 비인간 동물에서 제조된 항체는 더욱 인간과 유사한 서열을 생성하기 위해 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
인간 수용자 프레임워크의 선택을 포함하는 예시적인 인간화 기술이 공지되어 있으며, CDR 이식(미국 특허 제5,225,539호), SDR 이식(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(resurfacing)(문헌[Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499]), 특이성 결정 잔기 재표면화(미국 특허 공개 제2010/0261620호), 인간 프레임워크 적응화(미국 특허 제8,748,356호), alc 초인간화(미국 특허 제7,709,226호)를 포함한다. 이들 방법에서는, 모 항체의 CDR을 인간 프레임워크 상에 전달하는데, 이러한 인간 프레임워크는 모 프레임워크에 대한 그의 전체 상동성에 기초하여, CDR 길이의 유사성에 기초하여, 또는 표준 구조 동일성에 기초하여, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하여 선택될 수 있다.
인간화 항체는, 국제 특허 공개 WO1990/007861호 및 WO1992/22653호에 기재된 것들과 같은 기법들에 의해, 변경된 프레임워크 지지 잔기를 도입시켜 결합 친화도를 보존함으로써(복귀 돌연변이(backmutation)), 또는 CDR들 중 임의의 것에서 변이를 도입하여, 예를 들어 항체 친화성을 개선함으로써 원하는 항원에 대한 그의 선택성 또는 친화성을 개선하도록 추가로 최적화될 수 있다.
인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 그의 게놈 내에 보유하는 마우스 또는 래트와 같은 유전자도입 동물을 사용하여 표적 단백질에 대한 인간 항체를 생성할 수 있으며, 이는 예를 들어 미국 특허 제6,150,584호, 국제 특허 출원 공개 제WO99/45962호, 국제 특허 출원 공개 제WO2002/066630호, 제WO2002/43478호, 제WO2002/043478호, 및 제WO1990/04036호에 기재되어 있다. 이러한 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실될 수 있고, 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 도입염색체(transchromosome)를 사용하거나, 미니유전자(minigene)를 사용하여, 하나 이상의 완전하거나 부분적인 인간 면역글로불린 유전자좌를 동물의 게놈에 삽입할 수 있다. 레제네론(Regeneron) (http://_www_regeneron_com), 하버 안티바디스(Harbour Antibodies) (http://_www_harbourantibodies_com), 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드(Open Monoclonal Technology, Inc.) (OMT) (http://_www_omtinc_net), 키맙(KyMab) (http://_www_kymab_com), 트리아니(Trianni) (http://_www.trianni_com) 및 아블렉시스(Ablexis) (http://_www_ablexis_com)와 같은 회사들이 상술한 바와 같은 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는 데에 관여할 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 일부, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 이루지 않거나 쌍을 이루는 항체 가변 영역을 발현하도록 조작된다. 본 개시내용의 항체는, 예를 들어, 박테리오파지 pIX 코트 단백질을 갖는 폴리펩티드로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 라이브러리는 원하는 항원에 결합하는 파지에 대해 스크리닝될 수 있고, 얻어진 양성 클론은 추가로 특성화될 수 있으며, Fab는 클론 용해물로부터 단리되고, 전장 IgG로서 발현된다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,580,717호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호에 기재되어 있다.
면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생산은 재조합 단백질 생산 또는 펩티드의 화학적 합성과 같은 임의의 적절한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 면역원성 항원을 정제된 단백질, 또는 전세포, 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여할 수 있거나, 항원은 상기 항원 또는 이의 부분을 인코딩하는 핵산으로부터 동물의 체내에 새로(de novo) 형성될 수 있다.
대안적인 스캐폴드
폴리펩티드 또는 HLA/펩티드 복합체에 결합하는 대안적인 스캐폴드(항체 모방체로도 지칭됨)는 당업계에 알려지고 본 명세서에 기재된 다양한 스캐폴드를 사용하여 생성될 수 있다. 대안적인 스캐폴드는 피브로넥틴 또는 테나신의 피브로넥틴 유형 III 도메인(Fn3)을 단백질 스캐폴드로서 혼입시키도록 설계된 모노바디(미국 특허 제6,673,901호; 미국 특허 제6,348,584호) 또는 미국 특허 출원 공개 제2010/0216708호 및 미국 특허 출원 공개 제2010/0255056호에 기재된 바와 같은 텐콘과 같은 합성 FN3 도메인일 수 있다. 추가의 대안적인 스캐폴드는 아드넥틴(Adnectin)™, iMab, 안티칼린(Anticalin)®, EETI-II/AGRP, 쿠니츠(Kunitz) 도메인, 티오레독신 펩티드 앱타머, 애피바디(Affibody)®, DARPin, 아필린(Affilin), 테트라넥틴(Tetranectin), 파이노머(Fynomer) 및 아비머(Avimer)를 포함한다. 대안적인 스캐폴드는 가변 도메인 내에 삽입, 결실 또는 다른 치환을 허용하는 높은 입체형태 공차의 가변 도메인과 관련된 고도로 구조화된 코어를 포함하는 단일쇄 폴리펩티드 프레임워크이다. 다양성을 하나 이상의 가변 도메인에, 경우에 따라서는 구조화된 코어에 도입하는 라이브러리는 공지된 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있고, 얻어진 라이브러리는 본 발명의 신생항원에 결합하기 위해 스크리닝될 수 있으며, 확인된 결합제는 공지된 방법을 사용하여 이의 특이성에 대해 추가로 특성화될 수 있다. 대안적인 스캐폴드는 단백질 A, 특히 이의 Z-도메인(아피바디), ImmE7(면역 단백질), BPTI/APPI(쿠니츠 도메인), Ras-결합 단백질 AF-6 (PDZ-도메인), 카리브도톡신(전갈 독소), CTLA-4, Min-23(노틴), 리포칼린(안티칼린), 네오카르지노스타틴, 피브로넥틴 도메인, 안키린 공통 반복 도메인, 또는 티오레독신으로부터 유래될 수 있다(문헌[Skerra, A., "Alternative Non-Antibody Scaffolds for Molecular Recognition," Curr. Opin. Biotechnol. 18:295-304 (2005)]; 문헌[Hosse et al., "A New Generation of Protein Display Scaffolds for Molecular Recognition," Protein Sci. 15:14-27 (2006)]; 문헌[Nicaise et al., "Affinity Transfer by CDR Grafting on a Nonimmunoglobulin Scaffold," Protein Sci. 13:1882-1891 (2004)]; 문헌[Nygren and Uhlen, "Scaffolds for Engineering Novel Binding Sites in Proteins," Curr. Opin. Struc. Biol. 7:463-469 (1997)].
키메라 항원 수용체(CAR)
폴리펩티드 또는 HLA/펩티드 복합체에 결합하는 CAR이 생성될 수 있다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 유전자 조작된 수용체이다. 이들 유전자 조작된 수용체는 당업계에 알려진 기법에 따라 T 세포를 포함한 면역 세포에 용이하게 삽입되고 이에 의해 발현될 수 있다. CAR의 경우, 단일 수용체는 특정 항원을 인식하도록, 그리고 또한, 그 항원에 결합될 때 면역 세포를 활성화하여 그 항원을 보유하는 세포를 공격하고 파괴하도록 프로그래밍될 수 있다. 이들 항원이 종양 세포 상에 존재할 때, CAR을 발현하는 면역 세포는 종양 세포를 표적화하고 사멸시킬 수 있다.
CAR은 전형적으로 항원에 결합하는 세포외 도메인, 임의의 링커, 막관통 도메인, 및 공자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 사이토졸 도메인을 포함한다.
CAR의 세포외 도메인은 원하는 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 세포외 도메인은 scFv, 항체의 일부 또는 대안적인 스캐폴드를 포함할 수 있다. CAR은 또한 직렬로 배열되고 링커 서열에 의해 분리될 수 있는 2개 이상의 원하는 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도메인 항체, scFv, 라마 VHH 항체 또는 다른 VH 전용 항체 단편은 링커를 통해 직렬로 구성되어, CAR에 이중특이성 또는 다중특이성을 제공할 수 있다.
CAR의 막관통 도메인은 CD8, T-세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDI la, CD18), ICOS(CD278), 4-1 BB(CD137), 4-1 BBL, GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFI), CD160, CD1 9, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDI Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CDI la, LFA-1, ITGAM, CDI lb, ITGAX, CDI lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD1 8, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각(Tactile)), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 막관통 도메인으로부터 유래될 수 있다.
CAR의 세포내 공자극 도메인은 하나 이상의 공자극 분자의 세포내 도메인으로부터 유래될 수 있다. 공자극 분자는 항원에 결합 시에 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 제2 신호를 제공하는, 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 잘 알려진 세포 표면 분자이다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 공동자극성 도메인은 4-1BB, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70의 세포내 도메인이다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어, CD3ζ, CD3ε, CD22, CD79a, CD66d, 또는 CD39의 신호전달 도메인으로부터 유래될 수 있다. "세포내 신호전달 도메인"은 표적 항원에 대한 효과적인 CAR 결합의 메시지를 면역 이펙터 세포의 내부로 전달하여 이펙터 세포 기능, 예를 들어 활성화, 사이토카인 생성, 증식, 및 세포독성 활성(CAR-결합된 표적 세포로의 세포독성 인자의 방출을 포함함), 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합 후에 유도되는 다른 세포 반응을 유도하는 데 참여하는 CAR 폴리펩티드의 부분을 지칭한다.
세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치된 CAR의 선택적인 링커는 약 2 내지 100개의 아미노산 길이의 폴리펩티드일 수 있다. 링커는 인접한 단백질 도메인들이 서로에 대해 자유롭게 이동하도록 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 방해하지 않음을 보장하는 것이 바람직할 때에는 더 긴 링커가 사용될 수 있다. 링커는 절단성 또는 비절단성일 수 있다. 절단성 링커의 예에는 2A 링커(예를 들어, T2A), 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 및 이들의 조합이 포함된다. 링커는 또한 임의의 면역글로불린의 힌지 영역 또는 상기 힌지 영역의 일부분으로부터 유래될 수 있다.
사용될 수 있는 예시적인 CAR은, 예를 들어, 본 개시내용의 CALR/JAK2 폴리펩티드의 단편과의 복합체 내의 HLA에 결합하는 세포외 도메인, CD8 막관통 도메인, 및 CD3
Figure pct00023
신호전달 도메인을 함유하는 CAR이다. 다른 예시적인 CAR은 CD8 또는 CD28 막관통 도메인, CD28, 41BB, 또는 OX40 공자극 도메인 및 CD3
Figure pct00024
신호전달 도메인을 함유한다.
CAR은 표준 분자 생물학 기법에 의해 생성된다. 원하는 항원에 결합하는 세포외 도메인은 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래될 수 있다.
T-세포 수용체(TCR)
본 개시내용의 HLA/펩티드 복합체에 결합하는 TCR이 생성될 수 있다. TCR은 HLA/펩티드 복합체에 대한 T-세포 결합에 이어서 TCR의 서열분석을 기반으로 확인될 수 있다. 확인된 TCR은
αβ T 세포로부터 확인될 수 있다. 확인된 TCR은 친화성, 안정성, 용해도 등을 개선하기 위해 추가로 조작될 수 있다. 예를 들어, TCR은 시스테인 안정화되고, 가용성 TCR로서, 단일쇄 TCR로서, N-말단 또는 C-말단 에피토프 태그와의 융합으로서 발현되고, 안정성을 개선하기 위해 α 사슬의 위치 11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 또는 94와 같은 소수성 코어 내의 돌연변이로 조작되고, 제US7329731호, 제US7569664호, 제US9133264호, 제US9624292호, 제US2016/0130319호, 및 제US9884075호에 기재된 바와 같이 스와핑되는 α 및 β 사슬 가변 및/또는 불변 도메인으로 도메인 스와핑될 수 있다.
본 명세서의 조성물 중 임의의 것의 사용 방법
본 명세서에 개시된 조성물로 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 제공된 방법은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 및 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 조성물, 및 투여 계획은 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 그의 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 임상적 병태는 암, 골수증식성 질환, 또는 심혈관 질환이다.
일부 실시 형태에서, 임상적 병태는 폐암, 림프암, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 형질 세포 골수종, 담도암, 방광암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 갑상선암, 위암, 대장암, 결장암, 요도암, 중추 신경계암, 신경아세포종, 신장암, 유방암, 자궁경부암, 고환암, 및 연조직암으로부터 선택된 암이다.
일부 실시 형태에서, 임상적 병태는 원발성 골수섬유증(MPN), 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판혈증(ET), 원발성 골수섬유증(PFM), 속발성 골수섬유증, 급성 골수성 백혈병(AML), 속발성 AML, 만성 골수원성 백혈병(CML), 잠재성 불명의 클론성 조혈증(CHIP), 및 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)으로부터 선택된 골수증식성 질환이다.
일부 실시 형태에서, 심혈관 질환은 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 뇌혈관 질환, 허혈성 심장 질환, 혈전증, 정맥 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 파국적 복강내 혈전증, 말초 동맥 질환, 고혈압, 심부전, 심방 세동, 관상동맥 심장 질환, 죽상동맥경화증, 또는 클론성 조혈증으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 필라델피아 염색체 음성이다. 일부 실시 형태에서, 대상은 치료 경험이 없다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 하나 이상의 항암 치료제에 대해 내성 또는 불응성이 되었거나 내성 또는 불응성이 된 것으로 의심된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 줄기 세포 이식에 적격성이 아니다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 줄기 세포 이식으로 치료받은 적이 있다.
일부 실시 형태에서, 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 임상적 병태는 암, 골수증식성 질환, 또는 심혈관 질환이다.
일부 실시 형태에서, JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이를 보유하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 대상체에서 골수증식성 질환을 치료하거나 예방하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 골수증식성 질환은 원발성 골수섬유증(MPN), 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판혈증(ET), 원발성 골수섬유증(PFM), 속발성 골수섬유증, 급성 골수성 백혈병(AML), 속발성 AML, 만성 골수원성 백혈병(CML), 잠재성 불명의 클론성 조혈증(CHIP), 및 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 폐암, 림프암, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 형질 세포 골수종, 담도암, 방광암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 갑상선암, 위암, 대장암, 결장암, 요도암, 중추 신경계암, 신경아세포종, 신장암, 유방암, 자궁경부암, 고환암, 및 연조직암으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 대상체에서 심혈관 질환을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 심혈관 질환은 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 뇌혈관 질환, 허혈성 심장 질환, 혈전증, 정맥 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 파국적 복강내 혈전증, 말초 동맥 질환, 고혈압, 심부전, 심방 세동, 관상동맥 심장 질환, 죽상동맥경화증, 및 클론성 조혈증으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 에피토프 서열은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00025
서열 번호 1(MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00026
서열 번호 2(EEAEDNCRRMMRTK)의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00027
서열 번호 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00028
서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00029
서열 번호 6(FCGDENILV)의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것에서, 대상체에게 투여되는 조성물은 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택된 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 본 개시내용에 제공된 조성물의 1회 이상의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 방법은 2회의 투여 사이에 기간을 두고 제1 투여에 이어서 제2 투여를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여 및 제2 투여는 동일하거나 상이한 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 투여는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6에 의해 나타내어지는 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 투여는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6에 의해 나타내어지는 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여 및 제2 투여는 대상체의 생애에 1회 투여된다. 일부 실시 형태에서, 제1 투여 및 제2 투여는 대상체의 생애에 2회 이상 투여된다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여와 제2 투여 사이의 기간은 약 1 주 내지 약 2 주, 약 1 주 내지 약 4 주, 약 1 주 내지 약 6 주, 약 1 주 내지 약 8 주, 약 1 주 내지 약 12 주, 약 1 주 내지 약 20 주, 약 1 주 내지 약 24 주, 또는 약 1 주 내지 약 52 주이다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여와 제2 투여 사이의 기간은 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 또는 약 52 주이다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여와 제2 투여 사이의 기간은 약 2 주이다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여와 제2 투여 사이의 기간은 약 4 주이다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여 및 제2 투여는 사이클을 구성하며, 치료 계획은 2회 이상의 사이클을 포함할 수 있고, 각각의 사이클은 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 약 6 개월, 약 7 개월, 약 8 개월, 약 9 개월, 약 10 개월, 약 11 개월, 또는 약 12 개월만큼 이격된다.
하기 실시예는 본 명세서에 개시된 실시 형태들 중 일부를 추가로 설명하기 위해 제공된다. 실시예는 개시된 실시 형태를 예시하고자 하는 것으로서, 이를 한정하고자 하는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 제1 투여 및 제2 투여는 표 1에 제공된 벡터의 임의의 조합 또는 하기 표 2에 제공된 에피토프의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[표 1]
Figure pct00030
[표 2]
Figure pct00031
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터인, 제2 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제2 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제2 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여;
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여.
제3 투여
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것은 제3 투여를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 각각의 투여 사이에 기간을 두고 제1 투여, 제2 투여에 이어서 제3 투여를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여, 제2 투여, 및 제3 투여는 동일하거나 상이한 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 투여는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6에 의해 나타내어지는 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 투여는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6에 의해 나타내어지는 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제3 투여는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6에 의해 나타내어지는 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여, 제2 투여, 및 제3 투여는 대상체의 생애에 1회 투여된다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 투여는 대상체의 생애에 2회 이상 투여된다.
일부 실시 형태에서, 제2 투여와 제3 투여 사이의 기간은 약 1 주 내지 약 2 주, 약 1 주 내지 약 4 주, 약 1 주 내지 약 6 주, 약 1 주 내지 약 8 주, 약 1 주 내지 약 12 주, 약 1 주 내지 약 20 주, 약 1 주 내지 약 24 주, 또는 약 1 주 내지 약 52 주이다.
일부 실시 형태에서, 제2 투여와 제3 투여 사이의 기간은 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 또는 약 52 주이다.
일부 실시 형태에서, 제2 투여와 제3 투여 사이의 기간은 약 6 주이다.
일부 실시 형태에서, 제2 투여와 제3 투여 사이의 기간은 약 8 주이다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여, 제2 투여, 및 제3 투여는 함께 사이클을 구성하며, 치료 계획은 2회 이상의 사이클을 포함할 수 있고, 각각의 사이클은 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 약 6 개월, 약 7 개월, 약 8 개월, 약 9 개월, 약 10 개월, 약 11 개월, 또는 약 12 개월만큼 이격된다.
하기 실시예는 본 명세서에 개시된 실시 형태들 중 일부를 추가로 설명하기 위해 제공된다. 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 제1, 제2, 및 제3 투여는 하기 표 3 및 표 4에 제공된 에피토프 및 조성물의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[표 3]
Figure pct00032
[표 4]
Figure pct00033
Figure pct00034
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제3 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA인, 제3 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA인, 제3 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA인, 제3 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA인, 제3 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여;
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여; 및
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제3 투여.
제4 투여
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것은 제4 투여를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 각각의 투여 사이에 기간을 두고 제1 투여, 제2 투여, 제3 투여, 및 제4 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 투여, 제2 투여, 제3 투여, 및 제4 투여는 동일하거나 상이한 조성물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 제4 투여는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6에 의해 나타내어지는 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여, 제2 투여, 제3 투여, 및 제4 투여는 대상체의 생애에 1회 투여된다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 투여는 대상체의 생애에 2회 이상 투여된다.
일부 실시 형태에서, 제3 투여와 제4 투여 사이의 기간은 약 1 주 내지 약 2 주, 약 1 주 내지 약 4 주, 약 1 주 내지 약 6 주, 약 1 주 내지 약 8 주, 약 1 주 내지 약 12 주, 약 1 주 내지 약 20 주, 약 1 주 내지 약 24 주, 또는 약 1 주 내지 약 52 주이다.
일부 실시 형태에서, 제3 투여와 제4 투여 사이의 기간은 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 또는 약 52 주이다.
일부 실시 형태에서, 제3 투여와 제4 투여 사이의 기간은 약 4 주이다.
일부 실시 형태에서, 제3 투여와 제4 투여 사이의 기간은 약 8 주이다.
일부 실시 형태에서, 제1 투여, 제2 투여, 제3 투여, 및 제4 투여는 함께 사이클을 구성하며, 치료 계획은 2회 이상의 사이클을 포함할 수 있고, 각각의 사이클은 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 약 6 개월, 약 7 개월, 약 8 개월, 약 9 개월, 약 10 개월, 약 11 개월, 또는 약 12 개월만큼 이격된다.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제3 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제4 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여.
일부 실시 형태에서, 면역 반응을 유도하는 방법 또는 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법은 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함한다:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제3 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여.
유지 투여
일부 실시 형태에서, 본 방법은 치료 사이클 중에 규칙적인 간격으로 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 치료 사이클이 종료된 후에도 계속될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 치료 계획 중에 매달 대상체에게 투여될 수 있으며, 추가의 6 개월 동안 계속될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 2개의 치료 사이클 사이에 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것, 예컨대 에피토프 서열을 인코딩하는 Ad26 벡터, GAd20 벡터, MVA 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택된 벡터를 포함하는 조성물일 수 있다
투여의 용량 및 경로
일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x104 IFU(감염 단위) 내지 약 1x1012 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x1011 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x1010 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x109 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x108 IFU, 또는 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x106 IFU의 용량으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x106 VP(바이러스 입자) 내지 약 1x1014 VP, 용량당 약 1x106 VP 내지 약 1x1012 VP, 용량당 약 1x106 VP 내지 약 1x1010 VP, 용량당 약 1x106 VP 내지 약 1x108 VP, 또는 용량당 약 1x106 VP 내지 약 1x107 VP의 용량으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, Ad26 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1010 IFU로 투여된다. 일부 실시 형태에서, Ad26 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1011 IFU로 투여된다. 일부 실시 형태에서, Ad26 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1010 VP로 투여된다. 일부 실시 형태에서, Ad26 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1011 VP로 투여된다.
일부 실시 형태에서, GAd20 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x108 IFU로 투여된다. 일부 실시 형태에서, GAd20 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1010 IFU로 투여된다. 일부 실시 형태에서, GAd20 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1010 VP로 투여된다. 일부 실시 형태에서, GAd20 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1011 VP로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 폭스바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x104 IFU(감염 단위) 내지 약 1x1012 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x1011 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x1010 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x109 IFU, 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x108 IFU, 또는 용량당 약 1x104 IFU 내지 약 1x106 IFU의 용량으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, MVA 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x108 IFU로 투여된다. 일부 실시 형태에서, MVA 벡터를 포함하는 조성물은 용량당 약 1x1010 IFU로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 자가-복제 RNA 분자를 포함하는 조성물은 약 1 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 90 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 80 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 70 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 60 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 50 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 40 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 30 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 20 마이크로그램, 약 1 마이크로그램 내지 약 10 마이크로그램, 또는 약 1 마이크로그램 내지 약 5 마이크로그램의 자가-복제 RNA 분자의 용량으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 피하, 국소, 경구, 및 근육내와 같은 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물의 투여는 경구 또는 비경구로 달성될 수 있다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내(조직에 직접), 근육내, 피하, 골수내, 척수강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 또는 비강내 투여를 포함한다. 본 개시내용은 또한 예방 및 치료 방법에 사용하기에 적합한 국소, 경구, 전신, 및 비경구 제형을 제공하는 목적을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 백신 조성물의 근육내 투여는 바늘을 사용함으로써 달성할 수 있다. 대안은 조성물(예를 들어, Biojector(TM)를 사용함) 또는 백신 조성물을 함유하는 동결-건조 분말을 투여하기 위한 무침 주사 장치의 사용이다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 환부에서의 주사의 경우, 조성물은 발열성 물질이 없고 적합한 pH, 등장성, 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락트산 첨가 링거 주사액(Lactated Ringer's Injection)과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 충분히 제조할 수 있다. 방부제, 안정제, 완충제, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 서방성 제제도 사용될 수 있다.
전형적으로, 투여는 임상적 증상의 발생 전에 돌연변이체 CALR 및/또는 돌연변이체 JAK2에 대한 면역 반응을 생성하기 위한 예방적 목적을 가질 것이다. 본 개시내용의 조성물은 대상체에게 투여되어, 대상체에서 면역 반응을 일으킨다. 검출가능한 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물의 양은 "면역학적 유효 용량"인 것으로 정의된다. 본 개시내용의 조성물은 세포-매개 면역 반응뿐만 아니라, 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 전형적인 실시 형태에서, 면역 반응은 보호 면역 반응이다.
투여된 실제량, 및 투여 속도 및 투여의 경시 변화는 치료 대상의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 용량 결정 등은 일반 개업의 및 다른 의사의 책임에 포함되며, 일반적으로 치료할 질환, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 인자를 고려한다.
예시적인 일 계획에서, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 약 104 내지 1012개의 바이러스 입자/ml의 농도를 함유하는 약 100 μL 내지 약 10 ml 범위의 부피로 투여된다(예를 들어, 근육내). 아데노바이러스 벡터 조성물은 0.25 내지 1.0 ml 범위의 부피로, 예컨대 0.5 ml의 부피로 투여될 수 있다.
예시적인 일 계획에서, MVA 벡터를 포함하는 조성물은 약 1xl07 TCID50 내지 1x109 TCID50(50% 조직 배양 감염 용량(Tissue Culture Infective Dose)) 또는 Inf.U(감염 단위)의 용량을 함유하는 생리식염수 약 100 μl 내지 약 10 ml 범위의 부피로 투여된다(예를 들어, 근육내). MVA 벡터 조성물은 0.25 내지 1.0 ml 범위의 부피로 투여될 수 있다.
제2 치료제
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 면역자극제, 화학치료제, 항생제, 체크포인트 억제제, 또는 세포 요법이다.
일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 CTLA-4 항체, CTLA4 리간드, PD-1 축 억제제, PD-L1 축 억제제, TLR 작용제, CD40 작용제, OX40 작용제, 하이드록시우레아, 룩솔리티닙, 페드라티닙, 41BB 작용제, CD28 작용제, STING 길항제, RIG-1 길항제, TCR-T 요법, CAR-T 요법, FLT3 리간드, 알루미늄 설페이트, BTK 억제제, JAK 억제제, CD38 항체, CDK 억제제, CD33 항체, CD37 항체, CD25 항체, GM-CSF 억제제, IL-2, IL-15, IL-7, CD3 방향전환 분자(CD3 redirection molecule), 포말리밉, IFNγ, IFNα, TNFα, VEGF 항체, CD70 항체, CD27 항체, BCMA 항체, 또는 GPRC5D 항체, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 필리무맙, 세트렐리맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 신틸리맙, 세미플리맙, 토리팔리맙, 캄렐리주맙, 티슬렐리주맙, 도스트랄리맙, 스파르탈리주맙, 프롤골리맙, 발스틸리맙, 부디갈리맙, 사산리맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 두르발루맙, 엔바폴리맙 또는 아이오다폴리맙, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 체크포인트 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 JAK 억제제이다.
일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 제1 투여의 제1 조성물 또는 제2 투여의 제2 조성물 또는 제3 투여의 제3 조성물, 또는 제4 투여의 제4 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-CTLA-4 항체는 본 개시내용의 조성물의 제1, 또는 제2, 또는 제3, 또는 제4 투여 중 임의의 것과 조합된다.
일부 실시 형태에서, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체는 본 개시내용의 조성물의 제1, 또는 제2, 또는 제3, 또는 제4 투여 중 임의의 것과 조합된다.
일부 실시 형태에서, 체크포인트 억제제는 약 0.5 내지 약 5 mg/㎏, 약 5 내지 약 10 mg/㎏, 약 10 내지 약 15 mg/㎏, 약 15 내지 약 20 mg/㎏, 약 20 내지 약 25 mg/㎏, 약 20 내지 약 50 mg/㎏, 약 25 내지 약 50 mg/㎏, 약 50 내지 약 75 mg/㎏, 약 50 내지 약 100 mg/㎏, 약 75 내지 약 100 mg/㎏, 약 100 내지 약 125 mg/㎏, 약 125 내지 약 150 mg/㎏, 약 150 내지 약 175 mg/㎏, 약 175 내지 약 200 mg/㎏, 약 200 내지 약 225 mg/㎏, 약 225 내지 약 250 mg/㎏, 또는 약 250 내지 약 300 mg/㎏의 용량으로 투여된다.
실시예
실시예 1: JAK2 V617F 에피토프 2의 확인 및 JAK2 V617F 에피토프의 컴퓨터내(in-silico) 면역원성 평가
중심 잔기로서 V617F 돌연변이를 갖는 JAK2 단백질의 17-량체 서열, 및 이러한 17-량체 서열에 함유된 인접한 아미노산의 모든 9-량체를 생성하였다. 공통 HLA-A 및 HLA-B 대립유전자에 대한 이들 9-량체의 결합 친화도의 컴퓨터내 예측은 netMHCpan4.0을 사용하여 예측되었다. 결합 예측은 일반적으로 발생하는 HLA-A 대립유전자에 대한 약한 결합(500 nM 초과의 예측 친화도); 중간 결합(50 nM 내지 500 nM의 예측 친화도), 및 강한 결합(50 nM 미만의 예측 친화도)의 3개의 카테고리로 분류되었다. 추가의 실험적 추적조사를 위해 이러한 분석으로부터 서열 번호 5(VLNYGVCFC)의 9-량체 JAK2 에피토프 1 및 서열 번호 6(FCGDENILV)의 신규한 9-량체 JAK2 에피토프 2를 선택하였다. 서열 번호 6의 펩티드는 면역원성 JAK2 단편인 것으로 이전에 기재되지 않았다. 표 5에 나타낸 JAK2 에피토프 2의 예측 결합 친화도는 JAK2 에피토프 1의 결합보다 더 낮다.
[표 5]
Figure pct00035
실시예 2: 질환 환자 샘플에서의 돌연변이체 JAK2 대 야생형 JAK2 에피토프 면역원성
확인된 JAK617F 돌연변이를 갖는 본태성 혈소판혈증(ET) 또는 원발성 골수섬유증(PMF) 환자로부터 PBMC가 단리되었다. 제0일에 250,000개의 PBMC에 개별 클래스-I-관련 mutJAK2 또는 야생형 JAK2 펩티드를 5 ㎍/ml 농도로 외인성으로 투여하였다. 10 IU/ml의 인간 IL-2 및 10 ng/ml의 인간 IL-15의 존재 하에 10일 동안 세포를 배양하고, 이어서 IFNγ 및 TNFα 생산 CD8+ T 세포에 대한 세포내 염색 유세포 분석 및 펩티드-펄스 호출에 의해 돌연변이체 또는 야생형 JAK2 항원-특이적 T 세포의 빈도에 대해 평가하였다. IFNγ/TNFα + CD8+ T 세포의 빈도가 제0일에 DMSO 단독으로 처리된 세포에 비교하여 3-배 더 크고 0.1% 초과인 경우에 항원 특이적 반응은 양성으로 간주되었다. 결과는 표 6에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure pct00036
도 1은 동일한 에피토프 영역의 야생형 서열에 비교하여 질환 환자 샘플에서의 JAK2 에피토프 1 및 JAK2 에피토프 2의 면역원성을 나타낸다. mutJAK2 에피토프 I 및 II에 대한 상응하는 야생형 펩티드 서열을 또한 평가하였으며 DMSO 대조군과 유사한 반응을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 3: Ad26 및 MVA 발현에 대한 CALR.JAK2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 설계 및 생성
양호한 항원 발현 및 T-세포 활성화를 유발한 백신 조성물을 선택하기 위해, 일련의 CALR.JAK2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 설계하고 시험하였다.
CALR 유형 1 및 유형 2 돌연변이를 폴리뉴클레오티드 내로 포함시켰다. 컴퓨터내 T 세포 에피토프 예측 및 HLA 결합 연구를 기반으로 하여, CALR 돌연변이체 유형 1의 54-량체 펩티드(서열 번호 1) 및 CALR 돌연변이체 유형 2 단백질의 절단된 14-량체 펩티드(서열 번호 2)를 폴리뉴클레오티드 내로 포함시켰다. 폴리뉴클레오티드의 CARL 부분은 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 인코딩한다. 모든 단백질의 양호한 세포내 가공을 보장하기 위해, 개별 펩티드는 프로테아좀 절단을 촉진하는 AAY(ala-ala-tyr) 링커에 의해 연결되었다.
또한 컴퓨터내 T 세포 에피토프 예측 및 HLA 결합 연구를 기반으로 하여, 2개의 별개의 JAK2 펩티드, 30-량체 펩티드(서열번호 4) 또는 2개의 9-량체 펩티드(서열번호 5 또는 서열번호 6)가 포함되었으며, 이들 각각은 V617F 돌연변이를 함유하였다. 서열 번호 6의 펩티드는 면역원성 JAK2 단편인 것으로 이전에 기재되지 않았다.
모든 단백질의 양호한 세포내 가공을 보장하기 위해, 개별 펩티드는 또한 프로테아좀 절단을 촉진하는 AAY(ala-ala-tyr) 링커에 의해 연결되었다. 서열 번호 7은 AAY 링커에 의해 분리된 JAK2 2개의 9-량체의 아미노산 서열을 나타낸다.
CALR 부분이 동일하지만 JAK2 부분은 30-량체 펩티드 또는 2개의 9-량체 펩티드인 2개의 상이한 작제물이 설계되었다. 이들 2개의 상이한 도입유전자는 N-말단에 리더 서열 (LS), HAVT20 LS(MACPGFLWALVISTCLEFSMA; 서열 번호 8), 또는 유비퀴틴 신호(Ubiq)(MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVR; 서열 번호 54)가 없이 설계되었다. 작제물은 표 3에 열거되어 있다. HAVT20 LS는 도입유전자를 ER 내로 유도해야 하는 반면에, 유비퀴틴 서열은 프로테아좀을 표적화한다. 이는 작제물 사이의 TG의 상이한 발현 수준을 유발할 수 있다. 또한, 2개의 돌연변이체 CALR 단백질로부터의 서열만을 인코딩하는 작제물이 생성되었으며, 이는 CALR 단백질의 발현에 대한 대조군으로서 사용되었다. 도입유전자의 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열을 표 7에 나타낸다. 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열은 아데노바이러스 발현에 대해 최적화되었다.
[표 7]
Figure pct00037
[표 8]
Figure pct00038
아데노바이러스 발현을 위한 표준 방법을 사용하여 CALR.JAK2 작제물을 pUC57 셔틀 플라스미드 내로 클로닝하였다. 발현 카세트는 PER.C6 TetR 세포주와 조합하여 사용하는 것을 가능하게 하기 위한 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)-함유 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 코작 서열, CALR.JAK2 폴리뉴클레오티드, 및 발현 카세트 외부의 Ad26-특이적 서열에 의해 플랭킹된 시미안 바이러스 40(SV40) 폴리아데닐화 신호로 이루어졌다. 이러한 플랭킹하는 Ad26-특이적 서열은 상동성 재조합에 의한 플라스미드 생성을 보장하기 위해 Ad26 골격 플라스미드 서열과 상동성이었다. 서열은 향상된 도입유전자 발현에 대해 최적화된 인간-유전자였다.
이들 상이한 작제물에 의한 CALR.JAK2 발현을 시험하기 위해, HEK293 세포를 각각의 DNA 플라스미드로 형질감염시키고, 형질감염 72시간 후 웨스턴 블롯에 의해 세포 용해물에서의 발현을 조사하였다. 또한, 샘플을 수집하기 4 시간 전에 프로테아좀 억제제 MG132를 첨가함으로써 프로테아좀 활성을 억제하여 도입유전자 발현에 대한 효과를 조사하였다. 모든 작제물은 CALR.JAK2 에피토프를 발현하였고, HAVT20 LS를 갖는 작제물의 경우에 최고 발현이 관찰되었다. 프로테아좀 억제는 유비퀴틴 신호를 갖는 작제물에 의한 도입유전자 발현을 약간 향상시켰지만, 이러한 차이는 웨스턴 블롯에 의해 정량화될 수 없었다. CALR.JAK2 발현 데이터를 기반으로 하여, 아데노바이러스의 생성을 위해 HATV20 리더 서열(LS)을 갖는 2개의 작제물, 즉, Ad26.LS_CALR_JAK2-30mer(Ad26HEME001) 및 Ad26.LS_CALR_JAK2-2x9mer(Ad26HEME002)를 선택하였다. 또한, 가능한 대조군으로서의 역할을 하도록 Ad26-LS-CALR(AD26HEME003)이 생성되었다. 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)-함유 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 코작 서열, CALR,JAK2 및 시미안 바이러스 40(SV40) 폴리아데닐화 신호를 함유하는 Ad26HEME001의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 번호 23에 나타낸다. 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)-함유 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 코작 서열, CALR.JAK2 및 시미안 바이러스 40(SV40) 폴리아데닐화 신호를 함유하는 Ad26HEME002의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 번호 24에 나타낸다.
Ad26HEME001 및 Ad26HEME002 생성을 위한 세포주를 선택하기 위해, PER.C6 TetR 세포에 비교하여 PER.C6®에서 바이러스 게놈 DNA의 형질감염에 의해 바이러스 구조-능력을 측정하였다. 세포변성 효과(CPE) 및 플라크 형성(구조-능력을 함께 나타냄)은 Ad26HEME001과 Ad26HEME002 작제물 사이에서 유사하였다(표 9). 요약하면, 둘 모두의 작제물은 PER.C6® 세포가 아니라 PER.C6 TetR 상에서 8 일 이내에 완전한 CPE를 나타냈다. Ad26HEME001 및 Ad26HEME002는 제8일에 공동-용이(co-easy) 형질감염에 대해 PER.C6® 세포 상에서 각각 약 13개 및 약 11개의 플라크 및 PER.C6 TetR 세포 상에서 100개 초과의 플라크를 나타냈다. 이는 PER.C6® 세포 상에서 구조-능력이 억제되었음을 나타냈다. 구조가 어려운 아데노바이러스 벡터는 생산성 특징이 제한적이며 도입유전자 발현 카세트 내의 결실 및 돌연변이 위험이 높다. 이러한 결과를 기반으로 하여, Ad26HEME001 및 Ad26HEME002의 바이러스 생성을 위한 세포주로서 PER.C6 TetR이 선택되었다. Ad26HEME003이 또한 PER.C6 TetR 세포 상에서 생성되었다.
[표 9]
Figure pct00039
실시예 4: Ad26HEME001 및 Ad26HEME002의 생성
연구 배치는 단일-게놈 pAd26HEME001(pAd26.LS_CALR_JAK2-30mer), pAd26HEME002(pAd26.LS_CALR_JAK2-2x9mer), 및 pAd26HEME003(pAd26.LS_CALR) 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 생성되었다.
pUC57 플라스미드 DNA를 사용하여 Ad26 초기 영역 1(E1) TG 발현 카세트를 pAd26 골격 내로 클로닝하여 pAd26HEME001, pAd26HEME002, 및 pAd26HEME003 플라스미드를 생성하였다. 인간 세포와 같은 비-보완 세포에서 벡터가 복제-부적격이 되도록 하기 위해 pAd26 골격 내의 E1 영역을 결실시켰다. 또한, 외래 항원의 삽입을 위해 바이러스 게놈 내에 충분한 공간이 생성되도록 Ad26 초기 영역 3(E3) 영역의 일부를 제거하고(ΔE3), Ad26 초기 영역 4(E4) 오픈 리딩 프레임(orf) 6을 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 상동체로 교체하여, HEK293, PER.C6®, 및 HER96 세포와 같은 Ad5-E1-보완 세포주에서 복제-부적격 Ad26 벡터의 생성을 가능하게 하였다. 이후에 TG 카세트가 도입된 영역 내에 고유한 제한 부위(AsiSI)를 사용하여 pAd26 골격을 선형화하였다. 이러한 선형화된 플라스미드의 양쪽 단부는 E1 도입유전자 발현 카세트의 외부에 존재하는 Ad26-특이적 서열과 상동성인 중복 서열을 함유하였다. 이는 상동성 재조합 기술을 사용하여 도입유전자 카세트를 pAd26 골격 내로 클로닝함으로써 플라스미드 생성을 가능하게 하였다. 완전한 플라스미드 서열을 검증하였다.
Ad26HEME001, Ad26HEME002, 및 Ad26HEME003 벡터를 생성하기 위해, PER.C6 TetR 세포 내로 플라스미드를 형질감염시켰다. 바이러스를 PER.C6 TetR 세포 상에서 증폭시키고, 정제하고, 아데노바이러스 게놈의 완전성 및 동일성 및 TG의 정확한 발현에 대해 시험하였다.
배치 생성 및 특성화
1개의 Ad26HEME001, 2개의 Ad26HEME002, 및 1개의 Ad26HEME003 연구 배치를 생성하고, 감염성, 도입유전자 발현, 배치 유전자 안정성, 및 현탁 PER.C6(sPER.C6) TetR 세포에서의 상대 생산성의 평가에 대해 특성화하였다. 모든 연구 배치는 부착성 PER.C6 TetR 세포 상에서 생성되었다. 비-복제 조건 하의 인코딩된 항원의 발현, 바이러스 입자(VP)의 수, 및 감염 단위(IU)에 의해 배치 품질을 특성화하였다.
모든 생성된 연구 배치는 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같이 인코딩된 항원의 발현을 나타냈고, 모든 배치는 낮은 VP/IU 비를 가졌다. Ad26HEME001의 연구 배치는 29의 VP/IU 비를 나타냈다. Ad26HEME002의 2개의 연구 배치는 5의 VP/IU 비를 나타냈고, Ad26HEME003은 8의 VP/IU 비를 나타냈다. 유전적 안정성 및 생산성 둘 모두는 임상 시험 재료(CTM) 또는 상업적 규모로 아데노바이러스 벡터의 생성을 규모확대하는 타당성에 있어서 중요하다. 생산 세포주에서의 증식 중에 벡터 게놈의 변화 및 원치 않는 특성을 갖는 집단의 증식에 의해 정의된 바와 같은 유전자 불안정성에 대한 위험은 소규모에서 몇몇 바이러스 집단의 증식에 의해 평가될 수 있다. 모든 연구 배치에 대해, 도입유전자 영역, E3 유전자 영역, 및 E4 유전자 영역에 대한 동일성 중합효소 연쇄 반응(ID PCR)에 의해, 최종 배치 재료에 대해 유전자 안정성을 평가하였다. 또한, 도입유전자 영역의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 생성물을 서열분석하였다. 모든 연구 배치는 유전적으로 안정한 것으로 확인되었다.
백신 후보 벡터를 각각의 벤치마크 대조군에 비교함으로써 생산성(VP/mL의 역가에 의해 정의된 바와 같음)을 소규모 실험에서 평가하였으며, 10 L 공정 강화(PIN: process intensified)-생물반응기에서의 이의 성능이 알려져 있다. 약술하면, 70, 300, 및 900 VP/세포의 정제된 연구 배치 재료 및 2개의 Ad26 벤치마크 대조군으로 sPER.C6 TetR 세포를 형질도입시켰다. Ad26HEME001, Ad26HEME002, 및 Ad26HEME003은 70, 300, 및 900 VP/세포에서 표준 대조군과 유사한 생산성을 나타냈으며, 이는 3개의 벡터 모두가 양호한 생산자(대조군은 예상되는 결과를 나타냈음)이고, 배양 중에 2 내지 3 일 후에 약 1011 VP/ml가 생성됨을 나타낸다.
다양한 요소를 포함하는 Ad26HEME002 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 번호 24에 나타내며, 이들에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 10에 나타낸다.
실시예 5: MVA.CALR.JAK2 및 GAd20.CALR.JAK2 작제물의 생성
인간 코돈 사용을 기반으로 하여 CALR.JAK2 도입유전자에 대한 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열로 전환하였다. MVA 벡터에 대한 종결 모티프(TTTTTnT)는 회피하였다. 이어서, BamH1 제한 부위 및 코작 서열을 뉴클레오티드 서열의 상류에 첨가하였다. 2개의 정지 코돈에 이어서 Asc1 제한 부위를 뉴클레오티드 서열의 하류에 첨가하였다. 쏘가리 불변 사슬로부터의 28 aa의 길이를 갖는 작은 펩티드 단편(; 서열 번호 29)을 인코딩하는 T 세포 인핸서(TCE) 폴리뉴클레오티드 를 도입유전자의 N-말단에 배치하였다. 전임상 데이터는 이 서열이 바이러스 벡터의 면역학적 반응을 증가시키는 것으로 나타났다. 도입유전자의 합성은 알려진 방법을 사용하여 수행하였다.
백시니아 P7.5 초기/후기 프로모터(서열 번호 32)의 제어 하에 클로닝된 MVA 도입유전자를 상동성 재조합에 의해 MVA(III-1 및 -2 영역에 플랭킹됨)의 결실 III 유전자좌 내로 삽입하고, 알려진 방법을 사용하여 재조합 바이러스 입자를 생성하였다.
GAd20 도입유전자를 EcoRI-Not1 제한 부위를 통해 2개의 TetO 반복체를 갖는 CMV 프로모터와 BGH 폴리A 사이의 셔틀 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 얻어진 발현 카세트를 적절한 대장균의 균주에서의 상동성 재조합에 의해 GAd20 게놈에 옮기고, CMV-도입유전자-BGH DNA 단편으로 형질전환시키고, GAd20 게놈을 지닌 작제물로 형질전환시켰다. 재조합은 E1 결실(도입유전자의 삽입 부위) 대신에 GAd20 작제물에 이미 존재하는 상동성 암으로서 CMV 및 BGH를 포함하였다. 이어서, 재조합 GAd20 벡터를 E1 상보적, TetR 발현 M9 세포의 트랜스펙션에 의해 구제하고, 새로운 M9 세포의 후속 재감염에 의해 증폭시켰다.
폴리펩티드 TCE_CALR_JAK2-2x9mer(서열 번호 31)(HCalJ-9.9)를 발현하는 MVA 및 GAd20 벡터는 알려진 방법을 사용하여 생성되었다.
실시예 6: Ad26.CALR.JAK2 벡터는 항원을 발현하고, 가공하고, 자가유래 T 세포에 제시한다
본 연구의 목적은 백신의 신생항원을 가공하고 제시하고 T-세포 반응을 마운팅하는 인간 항원-제시 세포(APC) 역량을 시험하는 것이었다.
자가유래 CD1c+ DC 및 자가유래 CD4+/CD8+ T 세포의 냉동 바이알을 자기 비드 음성 선택을 통해 단리하였다. 50,000 VP의 감염 다중도(MOI)에서 Ad26HEME002 또는 Ad5HEME002(LS_CALR_JAK2-2x9mer 도입유전자를 발현하도록 조작된 Ad5 벡터)로 CD1c+ DC를 하룻밤 감염시켰다. 감염 후 18 내지 24 시간에, 동일한 공여자 자가유래 T 세포를 10:1 비로 CD1c+ DC와 혼합하였다. 10 ng/mL의 인간 IL-15를 제0일에 배양물에 첨가하고, 제11일까지 2 내지 3 일마다 2×IL-15 및 IL-2(10 IU/mL)를 갖는 절반 배지 교환을 수행하였다. 제11일에, CALRmut, JAK2V617F, 또는 아데노 헥손 단백질(양성 대조군)에 상응하는 펩티드를 단백질 수송 억제제와 함께 DC / T-세포 배양물에 하룻밤 첨가하였다. 생성되는 배양물을 T-세포 마커(CD4, CD8, CD3) 및 활성화된 T 세포의 마커(IFN-γ, TNF-α)에 대해 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 제11일에 펩티드의 하룻밤 자극 후 증가된 IFN-γ 및 TNF-α 염색은 특이적으로 Ad26/Ad5-HEME002-구동 도입유전자 발현으로 인한 CALR돌연변이체 및/또는 JAK2V617F 항원 특이적 T 세포의 증식을 나타냈다. Ad26/Ad5 빈 벡터에 비해 IFN-γ 및 TNF-α 이중-양성 CD8 T 세포의 3-배 증가는 양성 반응으로 간주되었다. 배제 기준은 (i) 0.5% 미만의 IFN-γ 및 TNF-α 이중-양성 T 세포의 아데노 헥손 반응, 또는 (ii) 1% 미만의 바이러스 항원(아데노 CEF 작제물) IFN-γ 및 TNF-α 이중-양성 T 세포였으며; 이 경우에 실험은 최적이 아닌 것으로 간주되었고, 음성 반응은 공여자 또는 실험 환경(experimental set up)의 기술적 실패일 가능성이 있었다.
총 24개의 고유한 건강한 공여자 세포를 스크리닝하였다. 도 2는 CALR돌연변이체 특이적 T 세포 반응에 대한 1명의 공여자에서의 스크리닝의 대표적인 결과를 나타낸다. 실험에서, 세포를 생존/CD3+/CD8+ 세포에 대해 게이팅하고 IFN-γ 및 TNF-α 염색을 평가하였다. 감염 후에 CD8(클래스 I) 및 CD4(클래스 II) 반응 둘 모두가 관찰되었다. 실험은 3개의 독립적인 분석에 걸쳐 수행되었고, 반응의 빈도는 실험에 걸쳐 유사하였으며, 약 35%는 Ad26이 사용되든 Ad5가 사용되든 무관하였다. 도 3은 백신 내로 포함된 JAK2 에피토프 둘 모두(서열 번호 5(VLNYGVCFC); 도 3의 에피토프 1 및 서열 번호 6; 도 3의 FCGDENILV 에피토프 2)가 면역원성임을 나타낸다. 도 4는 JAK2 돌연변이체 특이적 T 세포 반응에 대한 1명의 공여자에서의 스크리닝의 대표적인 결과를 나타낸다. 데이터는, JAK2 돌연변이체 신생에피토프 둘 모두가 백신 도입유전자 서열로부터 가공되었음을 입증하였으며, 이는 이들 에피토프가 암 세포에 의해 제시될 수 있음을 나타낸다. 모든 시험된 공여자의 HLA 유형을 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00040
실시예 7: Ad26.CALR.JAK2 벡터는 마우스에서 유도된 세포 반응을 발현한다
본 연구의 목적은 IFN-γ 효소-결합 면역스폿 검정(ELISpot: enzyme-linked immunospot assay)을 사용하여 Ad26-함유 Ad26HEME001 또는 A26HEME002에 의해 유도된 T-세포 반응이 빈 Ad26 벡터에 의해 유도된 것보다 더 높았는지를 시험하고, 추가의 면역원성 연구에 대한 최적의 마우스 품종을 선택하는 것이었다.
에피토프 예측 분석은 잠재적 CD8 T-세포 에피토프가 이들 마우스 품종에 존재하였음을 나타냈으므로, C57BL/6 및 Balb/c 마우스 품종을 이러한 면역원성 연구에 대해 시험하였다. 1010 VP/마우스의 용량의 Ad26HEME001 또는 Ad26HEME002, 또는 도입유전자를 인코딩하지 않는 Ad26(Ad26.Empty)을 마우스에 주사하였다. Ad26HEME001 또는 Ad26HEME002 삽입물에 걸쳐 있는 15-량체 중복 펩티드 풀을 사용하여 프라임 백신접종 14 일 후의 세포 면역 반응을 평가하였다(IFN-γ ELISpot). 실험군은 표 11에 나타낸다.
[표 11]
Figure pct00041
IFN-γ ELISpot에 의해 측정된 바와 같이 C57BL/6 및 Balb/c 마우스에서 프라임 14 일 후에 삽입-특이적 T-세포 반응이 유도되었고, Ad26.Empty-면역화 동물에 의해 유도된 것에 비해 Ad26HEME001(도 5) 또는 Ad26HEME002(도 6)로 면역화된 동물에서 유의하게 더 높은 면역-반응이 유도되었다. LS 펩티드에 대해서는 세포 면역 반응이 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 마우스 품종에 걸쳐 고찰할 경우에 2개의 벡터에 의해 유도된 면역 반응 사이에 유의한 차이는 없었다. 마찬가지로, 백신 후보에 걸쳐 고찰할 경우에 Balb/c 및 C57BL/6에 의해 유도된 HEME001 펩티드 풀에 대한 면역 반응 사이에 유의한 차이는 없었다. 백신 후보에 걸쳐 고찰할 경우에 Balb/c 및 C57BL/6에 의해 유도된 HEME002 펩티드 풀에 대한 면역 반응 사이에는 유의한 차이가 있었다.
실시예 8: Ad26.CALR.JAK2 및 MVA.CALR.JAK2 벡터는 마우스에서 세포 반응을 유도한다
이들 연구의 목적은 HCalJ-9.9를 인코딩하는 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터(즉, MVA-HCalJ-9.9, MVAHEME002)가 Balb/c 마우스에서 Ad26HEME002를 이용한 프라임 면역화에 의해 유도된 면역 반응을 부스팅할 수 있는지를 결정하는 것이었다. C57BL/6 마우스 품종에 비교하여 Balb/c 마우스 품종에서 더 적은 변이가 관찰된 실시예 7에 기재된 데이터를 기반으로 하여 Balb/c 마우스 품종이 선택되었다.
제1 연구에서, Ad26HEME002는 1010 VP로 투여되었고 MVA-HCalJ-9.9는 107 IU로 투여되었다. 제0주에, Ad26HEME002를 이용한 IM 주사에 의해 마우스를 면역화하였으며; 동물의 절반은 부스트 면역화를 받지 않았고(군 2), 동물의 절반은 제3주에 MVA-HCalJ-9.9로 부스팅하였다(군 3). 제3주에 MVA-HCalJ-9.9로 다른 군의 마우스를 면역화(프라임)하였다(군 1). 제0주에 대조군 마우스를 Ad26.Empty로 프라이밍하였다(군 4). 제4주에, 모든 동물을 희생시키고, Ad26HEME002 삽입물에 걸쳐 있는 15-량체 중복 펩티드 풀, 또는 삽입물 내의 CALR 서열을 덮는 펩티드 풀, 또는 2개의 JAK2 9-량체 서열을 덮는 9-량체로 비장세포를 자극하였다. IFN-γ-생산 세포의 유도를 IFN-γ ELISpot에 의해 측정하였다. 표 12는 다양한 실험군을 나타낸다.
[표 12]
Figure pct00042
Ad26HEME002 단독 또는 MVA-HCalJ-9.9 부스트와의 조합으로 면역화된 모든 동물은 11개의 아미노산에 의해 중복되는 15-량체 펩티드로 구성되고 전체 HEME002(LS_CALR.JAK2.2x9mer)를 덮는 펩티드 풀(도 7) 또는 11개의 아미노산에 의해 중복되는 15-량체 펩티드로 이루어지고 HEME002의 mutCALR 부분만을 덮는 mutCALR 펩티드 풀(도 8)로 자극 시에 IFN-γ-생산 세포가 발생하였다. 대조적으로, 2개의 9-량체 JAK2 펩티드로 자극 시에 사이토카인-생산 세포의 유도가 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 중요하게는, Ad26HEME002를 이용한 프라임 면역화 후의 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 부스트(군 3)는 제0주에 Ad26HEME002 단독으로 프라이밍된 동물(군 2)보다 유의하게 더 높은 반응을 유도하였다(HEME002 펩티드 풀: p=0.038; CALRmut 펩티드 풀: p=0.00025; ANOVA). 결론적으로, ELISpot 데이터는 MVA가 Ad26HEME002를 이용한 프라임 면역화에 의해 유도된 삽입-특이적 세포 면역 반응을 부스팅할 수 있었음을 나타냈다.
제2 연구에서, Ad26HEME002는 109 VP 또는 1010 VP로 투여되었고 MVA-HCalJ-9.9는 107 IU로 투여되었다. 제0주에, Ad26HEME002를 이용한 IM 주사에 의해 마우스를 면역화한 후, 제3주에 MVA-HCalJ-9.9로 부스팅하였다. 제4주에, 모든 동물을 희생시키고, Ad26HEME002 삽입물에 걸쳐 있는 15-량체 중복 펩티드 풀, 또는 삽입물 내의 CALR 서열을 덮는 펩티드 풀, 또는 2개의 JAK2 9-량체 서열을 덮는 9-량체로 비장세포를 자극하였다. IFN-γ-생산 세포의 유도를 IFN-γ ELISpot에 의해 측정하였다. 1×1010 VP에서의 Ad26HEME002 프라임에 이어서 1×107 플라크-형성 단위(pfu)에서의 MVA-HCalJ-9.9 부스트는 1×1010 VP에서의 Ad26.Empty 벡터 단독에 비교할 경우에 통계적으로 유의한 IFN-γ의 증가를 유발했다(3.2-배 증가, p=0.0042). 대조적으로, 1×109 VP에서의 더 낮은 용량의 Ad26HEME002 프라임에 이어서 1×107 pfu에서의 MVA-HCalJ-9.9 부스트에서는 IFN-γ의 유의한 변화가 관찰되지 않았다(p=0.090). 1x109 VP 투여에 비교하여 1x1010 VP Ad26HEME002에 의해 증가된 IFN-γ-생산 비장세포가 관찰되었다. 도 9는 실험의 결과를 나타낸다.
실시예 9: 비-인간 영장류(NHP)에서의 Ad26HEME002 및 MVA-HCalJ 9.9의 면역원성
본 연구의 1차 목적은 NHP에서 Ad26HEME002 및 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 백신접종이 Ad26HEME002 단독을 이용한 백신접종보다 크기 및 지속기간이 더 높은 CALR- 및/또는 JAK2-특이적 T-세포 반응을 유도하는지 여부를 결정하는 것이었다. 2차 목적은 Ad26HEME002 및 MVA-HCalJ-9.9와 조합된 항-CTLA-4 단일클론 항체, 즉, YERVOY®(이필리무맙)([Ipi])가 면역 반응을 향상시킬 수 있는지를 평가하는 것이었다. 또한, 탐색적 목적은 Ad26HEME002의 상동체 2-계획 투여와 조합된 항-CTLA-4 항체가 Ad26HEME002 1-계획 투여에 비교하여 삽입-특이적 T-세포 반응을 향상시킬 수 있는지를 평가하는 것이었다.
표 13에 나타낸 스케줄에 따라 Ad26HEME002 및/또는 MVA-HCalJ-9.9 단독 또는 Ipi(10 mg/㎏ 정맥내 [IV])와의 조합으로 사이노몰구스 마카크를 IM 면역화하였다. 간략하게는, Ad26HEME002(5x1010 VP, IM) 단독(군 1 및 군 2) 또는 Ipi 10 mg/㎏ IV(군 3 및 군 4)와의 조합으로 NHP를 면역화하였다. 제4주 및 제8주에 MVA-HCalJ-9.9 단독(108 IU, IM, 군 2) 또는 Ipi 10 mg/㎏ IV와 조합된 MVA-HCalJ-9.9(군 3)로 동물을 부스팅하거나, 제4주에 Ipi와 조합된 Ad26HEME002에 이어서 제14주에 Ipi 10 mg/㎏ IV와 조합된 MVA-HCalJ-9.9의 투여로 동물을 부스팅하거나(군 4), 동물이 어떠한 부스트도 받지 않았다(군 1). 다양한 시점에 동물을 채혈하고, 면역학적 검정을 위해 PBMC 및 혈청을 단리하였다. CALRmut 또는 JAK2 2×9-량체 삽입 서열, 리더 서열, 또는 전체 삽입물(HEME002; CALR_JAK2-2x9mer)에 걸쳐 있는 펩티드 풀을 사용하는 IFN-γ ELISpot에 의해 연구 중에 다양한 시점에 PBMC에서 CALRmut 또는 JAK2에 대한 면역 반응의 유도를 평가하였다.
[표 13]
Figure pct00043
연구에 걸쳐 다양한 시점에 몇몇 동물에서 높은 비-특이적 배경 반응이 관찰되었으며, 이는 특히 낮은 반응의 해석을 모호하게 할 수 있다. 모든 동물은 데이터 세트에 포함되었다.
측정된 시점 중 임의의 것에 JAK2 또는 리더 서열 펩티드 풀에 대한 검출가능한 면역 반응은 없었다(데이터는 나타내지 않음). CALR 및 CALR_JAK2-2x9mer(HEME002) 펩티드 풀에 대해 측정된 크기 및 반응률이 매우 유사하였으므로 CALR_JAK2-2x9mer(HEME002) 데이터 세트만 나타낸다. 도 10은 4개의 군에 걸쳐 IFN-γ-생산 인간 HEME002-특이적 T-세포의 유도의 동역학을 나타낸다. 단일 Ad26HEME002 면역화는 동물 중 임의의 것에서 검출가능한 IFN-γ-생산 세포를 HEME002 펩티드 풀에 대해 유도하지 않았다(도 10). 대조적으로, 제2주(도 12) 및 제4주(데이터는 나타내지 않음)에 Ipi와 조합된 Ad26HEME002로 면역화된 12마리의 동물(군 3 및 군 4가 조합됨) 중 5마리에서 낮지만 검출가능한 HEME002-특이적 IFN-γ-생산 세포가 검출되었으며, 이러한 면역 반응은 Ad26HEME002 단독으로 투여된 동물에서 검출된 것보다 유의하게 더 높았다(p<0.001).
Ad26HEME002 및 MVA-HCalJ-9.9로 투여된 동물에서 CALR_JAK2-2x9mer(HEME002)에 대한 면역 반응이 제6주부터 계속 관찰되었다. 동물이 MVA-HCalJ-9.9의 1회 용량을 받았든(도 13) 2회 용량을 받았든(도 14) 반응률(7마리의 동물 중 3 내지 4마리)에는 단지 작은 변화가 있을 뿐이었다. 반응 동물 중에서, HEME002 면역 반응의 평균 크기는 129 내지 453 SFU/106개의 세포의 범위였다(도 13 내지 도15). 도 11은 연구의 -2 주(즉, 제1 용량 전 2 주)에서의 면역 반응을 나타낸다. 도 12는 2 주에서의 면역 반응을 나타낸다. 도 13은 제6주에서의 면역 반응을 나타낸다. 도 14는 제10주에서의 면역 반응을 나타낸다. 도 15는 제16주에서의 면역 반응을 나타낸다. 제4주 및 제8주에 Ipi와 조합된 MVA-HCalJ-9.9로 투여된 동물(군 3)은 Ad26HEME002 면역화 후에 비교하여 HEME002-특이적 면역 반응의 크기의 증가(반응 동물의 평균 반응: 제2주에 93 SFU/106개의 세포, 제6주에 1,945 SFU/106개의 세포, 및 제10주에 983 SFU/106개의 세포)를 가진 반면에, MVA 투여 전 및 후를 비교하면 전체 반응률의 증가가 없었다.
Ipi와 조합된 Ad26HEME002를 이용한 단일 투여에 비교하여 Ipi와 조합된 Ad26HEME002를 이용한 2회의 용량 후에 IFN-γ-생산 세포의 크기의 증가가 있었다(군 4): 제2주에(제1 투여 후) 93 SFU/106개의 세포 및 제6주에(제2 투여 후) 580 SFU/106개의 세포의 반응 동물의 평균 HEME002 반응. 제14주에, 군 4는 Ipi와 조합된 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 투여를 받았으며, 이는 반응 동물의 평균 반응의 4.6-배 증가를 유발한 반면에(제12주에 400 SFU/106개의 세포 및 제16주에 1,827 SFU/106개의 세포; 변화 점수에 대한 토빗 p<0.001), 반응률의 변화는 관찰되지 않았다. 반응 동물 중에서, 면역 반응의 단지 작은 수축이 관찰되었을 뿐이며, 평균 반응은 제20주에 HEME002에 대해 1,698 SFU/106개의 세포였다(MVA-HCalJ-9.9 + Ipi를 이용한 투여 후 6 주)(군 4).
HEME002 면역 반응에 대한 곡선하 면적(AUC; 본페로니 보정을 이용한 토빗)의 분석을 하기 시간 윈도우에 대해 실행하였다: (i) 제2주 내지 제20주, (ii) 제2주 내지 제12주, 및 (iii) 제16주 내지 제20주. 높은 변동 및 많은 양의 중도절단된(censored) 값으로 인해, 군 1 및 군 2에 대한 AUC, 또는 군 2 및 군 3에 대한 AUC를 비교하는 경우에 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다(도 10). 대조적으로, 시간 윈도우 제16주 내지 제20주에 대해 군 3 및 군 4를 비교하는 경우에 HEME002 반응에 대한 AUC에 유의한 차이가 있었다(p=0.029). 동물 #3002(샘플#14)는 제43일에 안락사시켰다. 동물 #4003(샘플#22) 제16주는 계수하기에는 너무 많은 웰들을 나타냈으며, 이러한 샘플은 2,000 SFU/106개의 세포로 설정되었고, 또한 통계 분석에 사용되었다.
비임상 연구는 CALRmut 및 JAK2 2x9-mer 융합 단백질을 발현하는 생성된 Ad26 및 MVA 벡터가 시험관내에서 T-세포 활성화를 유발하고 마우스 및 NHP에서 세포 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 10: MutCALR/MutJAK2 작제물 연구, 투여, 및 스케줄링
본 연구의 1차 목적은 Ad/Ad/MVA 백신과 조합된 항CTLA4 항체의 피하(SC) 대 IV 투여를 비교하는 것이었다. 목적은 또한 Ad/Ad/MVA 백신과 조합된 항-CTLA4 항체의 다중 투여 대 단일 용량을 평가하는 것이었다. 2차 목적은 항-CTLA-4 단일클론 항체, 즉, YERVOY®(이필리무맙)([Ipi])와 항 PD-1 항체(니볼루맙)의 조합이 특이적 T 세포 반응을 추가로 향상시킬 수 있는지를 평가하는 것이었다.
항-CLTA4 항체는 Ad26 주사에 국소화된 Ad26 백신접종과 동시에 SC 투여되었다. 대안적으로, 항-CTLA4 항체는 Ad26 투여 직후에 시간 경과에 따라 IV 주입되었다. 항-CTLA4 항체의 SC 투여를 동물당 3 mg/㎏에서의 IV 투여에 비교하였다. 제2주 분석에서 16마리의 동물은 항 CTLA4 IV(3mg/㎏)를 받았고 31마리의 동물은 SC 투여를 통해 항 CTLA4(3 mg/㎏)를 받았다. IV 및 SC 투여된 항 CTLA4 투여 코호트에서 각각 유사한 수의 반응 동물 7/16(44%) 및 13/31(42%)이 관찰되었다. 또한, 본페로니 보정을 이용한 토빗 LRT 분석에 의해 결정된 바와 같이(p<0.05), 반응의 평균 크기는 유의하게 상이하지 않았다(도 16. 표 14).
[표 14]
Figure pct00044
제4주에 시작하여 Ad/Ad/MVA + 이필리무맙에 항 αPD-1 항체(니볼루맙 10 mg/㎏ IV)를 포함시키는 것은 mutCALR 특이적 T 세포 반응의 크기를 개선한다(도 17). mutCALR 펩티드 반응은 mutCALR 특이적 반응-배경을 기반으로 하여 계산하였다. 제6주 예비 ELISpot 분석은 또한 항 αCTLA4 항체 및 Ad/Ad/MVA 투여 계획을 이용한 다중 용량이 단일 용량보다 우월함을 나타낸다(도 17).
실시예 11: 자가-복제 RNA CALR_JAK2-2x9 작제물의 생성
LS_CALR.JAK2-2x9mer 폴리뉴클레오티드를 자가-복제 RNA 내로 클로닝하였다.
베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 게놈 서열의 TC-83 균주는 본 발명의 레플리콘을 작제하기 위해 사용되는 염기 서열로서의 역할을 하였다. 이러한 서열은 신드비스 바이러스로부터의 하류 루프(DLP)를 비-구조 단백질 1(nsP1)의 상류에 배치함으로써 변형되며, 이들 2개는 돼지 테스코바이러스-1로부터의 2A 리보솜 스킵핑 요소에 의해 결합된다. nsP1의 최초 193개의 뉴클레오티드는 TAG로 돌연변이된 시작 코돈을 제외하고 5'UTR의 하류 및 DLP의 상류에 중복되었다. 이는 복제에 필요한 모든 조절 구조 및 2차 구조가 유지되는 것을 보장하였지만, 이러한 부분 nsp1 서열의 번역은 방지하였다. 구조 유전자를 제거하고, EcoR V 및 Asc I 제한 부위를 서브게놈 프로모터의 하류에 다중 클로닝 부위(MCS)로서 배치하여 임의의 관심 유전자의 삽입을 용이하게 하였다(도 19). LS_CALR_JAK2-2x9mer를 클로닝 부위에 삽입하였다. 도입유전자를 이들의 5' 및 3' 단부에서 MCS에 대해 40 bp의 상동성을 갖는 IDT에 의해 dsDNA 단편으로서 합성하고 NEB HiFi DNA 조립체 마스터 믹스(카탈로그 번호 E2621S)를 사용하여 EcoRV 및 AscI로 분해된 VEEV 유래 자가-복제 RNA 벡터 내로 클로닝하였다.
전체 자가-복제 RNA 플라스미드의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33에 나타낸다. T7 종결자의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 34에 나타낸다. AmpR 프로모터의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 35에 나타낸다. 최소 26S 프로모터의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 36에 나타낸다. T7 프로모터의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 37에 나타낸다. 폴리 A 부위의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 38에 나타낸다. nsP1로부터의 알파 5' 복제 서열의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 39에 나타낸다. DLP의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 40에 나타낸다. P2A의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 41에 나타낸다. Bom의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호42에 나타낸다. DLP nsp ORF의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 43에 나타낸다. nsP2의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 44에 나타낸다. nsP4의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 45에 나타낸다. nsP3의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 46에 나타낸다. nsP1의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 47에 나타낸다. KanR의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 48에 나타낸다. Rop의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 49에 나타낸다. 5'UTR의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 50에 나타낸다. 3'UTR의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 51에 나타낸다.
실시예 12: srRNA.CALR/JAK2 레플리콘 RNA 플랫폼은 마우스에서 세포 반응을 유도한다
이들 연구의 목적은 CALR_JAK2-2x9mer를 인코딩하는 자가-복제 RNA 분자가 Balb/c 마우스에서 면역 반응을 프라이밍할 수 있는지를 결정하는 것이었다. C57BL/6 마우스 품종에 비교하여 Balb/c 마우스 품종에서 더 적은 변이가 관찰된 실시예 7에 기재된 데이터를 기반으로 하여 Balb/c 마우스 품종이 선택되었다.
제1 연구에서, LS_CALR_JAK2-2x9mer를 인코딩하는 자가-복제 RNA(srRNA.CALR/JAK2)를 3, 10, 및 30 ㎍으로 투여하였다. 제0주에, 나타낸 용량(3, 10, 및 30 ㎍)으로 srRNA.CALR/JAK2를 이용한 IM 주사에 의해 Balb/c 마우스를 면역화하였고, 대조군에는 식염수를 주사하였다 제2주에, 모든 동물을 희생시키고, 삽입물 내의 CALR 서열을 덮는 15-량체 중복 펩티드(서열 번호 3) 풀, 또는 2개의 JAK2 9-량체 서열을 덮는 9-량체(서열 번호 7)로 비장세포를 자극하였다. IFN-γ-생산 세포의 유도를 IFN-γ ELISpot에 의해 측정하였다. IFN-γ, TNFα, 및 IL-2의 생성을 유세포 분석에 의해 측정함으로써 CD8 및 CD4 다기능성 T 세포 반응을 결정하였다. 표 15는 다양한 실험군을 나타낸다.
[표 15]
Figure pct00045
srRNA.CALR/JAK2로 면역화된 모든 동물은 CALRmut 서열을 덮는 펩티드로 자극 시에 IFNγ-생산 세포가 발생하였으며(도 21a), 대조적으로 2개의 9-량체 JAK2 펩티드(서열 번호 5 및 6)로 자극 시에는 사이토카인-생산 세포의 유도가 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 세포내 유세포 분석은 시험된 모든 용량에서 항-CALR 반응이 CD4 구동되고 다기능성임을 나타냈다(도 21b).
제1 연구에서 자가-복제 RNA 분자는 비결합 상태로 동물에게 주입되었다. 제2 연구의 경우, 본 발명자들은 자가-복제 RNA 분자를 지질 나노입자(LNP) 내에 제형화하고, 표 16에 개략된 유사한 연구를 수행하였다. 제1 연구와 유사하게, srRNA.CALR/JAK2로 면역화된 모든 동물은 CALRmut 서열을 덮는 펩티드로 자극 시에 IFNγ-생산 세포가 발생하였으며(도 22a), 대조적으로 2개의 9-량체 JAK2 펩티드(서열 번호 5 및 6)로 자극 시에는 사이토카인-생산 세포의 유도가 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 세포내 유세포 분석은 제형화되지 않은 버전 및 LNP-제형화된 버전 둘 모두에서 시험된 모든 용량에서 항-CALR 반응이 CD4 구동되고 다기능성임을 나타냈다(도 22b).
[표 16]
Figure pct00046
제3 연구에서, 본 발명자들은 이종성 프라임/부스트 계획이 항-CALR T 세포 기능을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해 2개의 다른 백신 플랫폼, Ad26 및 MVA와 조합된 srRNA.CALR/JAK2를 시험하였다. 모든 플랫폼은 CALR_JAK2-2x9mer 작제물을 인코딩하였다. 제0주에, 식염수, Ad26HEME002(1010 PFU), 또는 srRNA/CALR.JAK2(20 ㎍)를 Balb/c 마우스에 주사하였다. 제4주에 Ad26HEME002, MVA-HCalJ-9.9(107 PFU), 또는 srRNA.CALR/JAK2를 마우스에 주사하고, 부스트 후 1 주에 비장을 분석하였다(하기 실험 설계 참조, 표 17). 3 주 프라임/부스트 간격 및 부스트 후 2 주 비장 분석으로 Ad26/MVA를 사용하는 이력 데이터에 연계하기 위해 대조군을 첨가하였다. 중복 CALR 펩티드를 사용하여 상기 기재된 바와 같은 ELISpot 및 ICS에 의해 비장을 분석하였다.
[표 17]
Figure pct00047
자가-복제 RNA 프라임에 Ad26 또는 MVA 부스트를 첨가하는 것은 IFNγ ELISpot에 따라 통계적으로 유의한 부스트를 유발하였다(p<0.001, 각각 5.1, 및 6.5배 증가). Ad26 프라임 후에 부스팅제로서 자가-복제 RNA를 첨가하는 것은 Ad26 프라임 단독에 비해 1.7배 증가를 유발하였다(통계적으로 유의하지 않음)(도 23a). 세포내 사이토카인 염색은, 자가-복제 RNA 프라임 후에 Ad26 및/또는 MVA를 부스트로서 첨가하는 것은 다기능성 IFNγ+ TNFα+ IL-2+ CD4 T 세포의 통계적으로 유의한 증가를 유발한다는 것을 나타낸다(p<0.001, 각각 4.9, 및 3.6배 증가). Ad26 프라임 후에 자가-복제 RNA를 이용한 부스팅은 Ad26 프라임 단독에 비해 다기능성 삼중 사이토카인 양성 T 세포의 2-배 증가를 유발한다(통계적으로 유의하지 않음)(도 23b).
실시예 13. 비-인간 영장류(NHP)에서의 srRNA.CALR/JAK2 및 MVA-HCalJ-9.9의 면역원성
본 연구의 1차 목적은 NHP에서 srRNA.CALR/JAK2 및 MVA-HCalJ-9.9를 이용한 백신접종이 srRNA.CALR/JAK2 단독을 이용한 백신접종보다 크기 및 지속기간이 더 높은 항원 특이적 T-세포 반응을 유도하는지 여부를 결정하는 것이다. 2차 목적은 srRNA.CALR/JAK2 및 MVA-HCalJ-9.9와 조합된 항-CTLA-4 단일클론 항체, 즉, YERVOY®(이필리무맙)([Ipi])가 백신 유도 면역 반응을 향상시킬 수 있는지를 평가하는 것이다. 또한, 탐색적 목적은 백신 계획 및 항-CTLA-4 항체와 조합된 항-PD-1 단일클론 항체 OPDIVO®(니볼루맙)가 항-PD-1 없이 투여된 동물에 비교하여 유사하거나 삽입-특이적 T-세포 반응을 증가시키는지를 평가하는 것이다. 표 18에 나타낸 스케줄에 따라 srRNA.CALR/JAK2, 및/또는 MVA-HCalJ-9.9 단독 또는 Ipi(3 mg/㎏ 피하[SC])와의 조합 또는 니볼루맙(10 mg/㎏ 정맥내[IV])과의 조합으로 사이노몰구스 마카크를 IM 면역화하였다. 간략하게는, Ipi 3 mg/㎏ SC와 조합되거나(군 2) Ipi 3 mg/㎏ SC 및 니볼루맙 IV 10 mg/㎏ IV와 조합된(군 4) srRNA.CALR/JAK2 및 MVA-HCalJ-9.9로 NHP를 면역화할 것이다. 다양한 시점에 동물을 채혈하고, 면역학적 검정을 위해 PBMC 및 혈청을 단리한다. 전체 CALR 삽입 서열에 상응하는 15-량체 중복 펩티드로 구성된 펩티드 풀을 사용하여 IFNγ ELISpot에 의해 연구 중의 다양한 시점에 PBMC에서 CALR 항원에 특이적인 면역 반응의 유도를 평가한다.
srRNA.CALR/JAK2 백신은 MVA-HCalJ-9.9와 조합된 계획으로서 투여될 경우에 추가로 증가될 수 있는 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 것으로 예상된다. srRNA.CALR/JAK2 및 MVA-HCalJ-9.9와 조합된 면역 체크포인트 차단 단일클론 항체 항-CTLA-4 및/또는 항 PD-1 항체의 사용은 더 높은 크기, 품질, 및 더 지속적인 항원 특이적 T 세포 반응을 유발할 것이다.
[표 18]
Figure pct00048
실시예 14. 비-인간 영장류(NHP)에서의 GAd.CALR.JAK2의 면역원성 및 srRNA.CALR/JAK2의 지속적인 제시
본 연구의 1차 목표는 GAd20.CALR.JAK2를 이용한 백신 접종이 항-CTL-4 항체 및 MVA 또는 sRNA와 조합되어 항원 특이적 T-세포 반응을 유도한다는 것을 확인하는 것이다. 본 연구는 또한 srRNA.CALR/JAK2를 이용한 백신접종이 GAd20 또는 GAD20/MVA와 조합될 때 T-세포를 증가시키는지 여부를 결정하고, srRNA가 MVA 대신에 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 설계된다. 본 연구의 목적은 또한, 항CTLA4 항체와 조합된 GAD20/MVA/srRNA가 GAD20/MVA/srRNA 단독보다 더 큰 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 평가하는 것이다. 삼중 조합으로서 srRNA.CALR/JAK2 벡터를 GAd20/MVA 백신에 첨가하는 것은 암 환자에서 더 크고 더 지속적인 항원 특이적 T 세포 반응을 구동할 것으로 예상된다.
본 연구의 제2 목적은 항 CTL-4 항체의 필요성을 완전히 또는 MVA의 투여 후에 제거하는 srRNA.CALR.JAK2 다중-용량 계획 역량을 평가하는 것이다. 또한, 본 연구는 항원 특이적 T 세포 반응을 지속적으로 증가시키거나 유지하기 위해 srRNA가 다중 횟수로(매월) 투여될 수 있는지를 결정하기 위해 작제된다. 생성된 항-mutCALR/mutJAK2 표적화 T 세포의 가장 높고 가장 지속적인 수준은 Ab-매개 중화에 민감하지 않은 벡터에 의한 지속적인 신생-항원 제시를 필요로 할 것이며, 이는 MPN 환자에 대한 악성 클론 제거 및 임상적 이익을 유발한다. 자가-복제 RNA 기반 백신의 잠재적인 일 이점은 벡터 특이적 면역이 발생하지 않는다는 것이다. 자가-복제 RNA 기반 백신은 벡터에 특이적인 중화 항체를 생성하지 못하므로, 벡터 특이적 면역 반응의 부재는 항원 제시의 감소 없이 자가-복제 RNA의 반복된 투여를 가능하게 할 수 있다. srRNA.CALR/JAK2가 매월 근육내 투여 스케줄 상의 투여에 의해 항원 특이적 T 세포 반응을 유지할 수 있는지를 평가하기 위해 다중-용량 계획을 시험한다.
본 연구를 위해, 표 19에 나타낸 스케줄에 따라 사이노몰구스 마카크를 면역화한다. 다양한 시점에 동물을 채혈하고, 면역학적 검정을 위해 PBMC 및 혈청을 단리한다. 전체 CALR 삽입 서열에 상응하는 15-량체 중복 펩티드로 구성된 펩티드 풀을 사용하여 IFNγ ELISpot에 의해 연구 중의 다양한 시점에 PBMC에서 CALR 항원에 특이적인 면역 반응의 유도를 평가한다.
GAd20/MVA 면역화 후에 srRNA.CALR/JAK2를 투여하는 것은 지속적인 부스팅을 가능하게 하여, 독립적으로 또는 CPI 투여와 조합하여 항원 특이적 T 세포 반응을 연장할 것이다. 다중 용량 srRNA.CALR/JAK2 자가-복제 RNA 기반 계획은 더 긴 지속기간을 갖는 T 세포 반응의 더 높은 크기를 유도할 것으로 예상된다.
[표 19]
Figure pct00049
실시 형태
하기 목록의 실시 형태는 이전의 설명을 대신하거나 교체하기 보다는 보완하도록 의도된다.
실시 형태 1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드:
MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG(서열 번호 4) 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
VLNYGVCFC(서열 번호 5) 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
FCGDENILV(서열 번호 6) 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 이들의 조합.
실시 형태 2. 실시 형태 1에 있어서, 하기 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드:
MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
VLNYGVCFC(서열 번호 5) 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
FCGDENILV(서열 번호 6) 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열.
실시 형태 3. 실시 형태 1에 있어서, 하기 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드:
MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG(서열 번호 4) 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열.
실시 형태 4. 실시 형태 1에 있어서, 하기 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드:
MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열.
실시 형태 5. 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하기로부터 선택된 리더 서열을 N 말단에 추가로 포함하는 폴리펩티드:
MACPGFLWALVISTCLEFSMA(서열 번호 8);
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGV(서열 번호 54); 및
MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV(서열 번호 29).
실시 형태 6. 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 에피토프 서열이 링커 서열에 의해 서로에게 연결되는 폴리펩티드.
실시 형태 7. 실시 형태 6에 있어서, 링커 서열이 AAY, RR, DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR로부터 선택되는 폴리펩티드.
실시 형태 8. 실시 형태 6에 있어서, 링커 서열이 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드.
실시 형태 9. 실시 형태 1에 있어서, 하기로부터 선택되는 폴리펩티드:
서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
실시 형태 10. 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 한 실시 형태의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
실시 형태 11. 실시 형태 10에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:
서열 번호 16의 핵산 서열 또는 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 17의 핵산 서열 또는 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 18의 핵산 서열 또는 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 19의 핵산 서열 또는 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 20의 핵산 서열 또는 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 21의 핵산 서열 또는 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 22의 핵산 서열 또는 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
서열 번호 26의 핵산 서열 또는 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및
서열 번호 27의 핵산 서열 또는 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
실시 형태 12. 실시 형태 10 또는 실시 형태 11의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시 형태 13. 실시 형태 12에 있어서, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 벡터.
실시 형태 14. 실시 형태 13에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd34, hAd35, hAd48, hAd49, hAd50, GAd20, Gad19, GAd21, GAd25, GAd26, GAd27, GAd28, GAd29, GAd30, GAd31, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAdI7, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3으로부터 선택되는 벡터.
실시 형태 15. 실시 형태 13에 있어서, 폭스바이러스 벡터가 천연두 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 원숭이두창 바이러스 벡터, 코펜하겐 백시니아 바이러스(W) 벡터, 뉴욕 약독화 백시니아 바이러스(NYVAC) 벡터, 및 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터로부터 선택되는 벡터.
실시 형태 16. 실시 형태 12에 있어서, 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 한 실시 형태의 폴리펩티드 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터인 벡터.
실시 형태 17. 실시 형태 12에 있어서, 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 한 실시 형태의 폴리펩티드 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 분자인 벡터.
실시 형태 18. 실시 형태 12에 있어서, 서열 번호 10의 폴리펩티드 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26인 벡터.
실시 형태 19. 실시 형태 12에 있어서, 서열 번호 31의 폴리펩티드 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MVA 벡터인 벡터.
실시 형태 20. 실시 형태 12에 있어서, 서열 번호 31의 폴리펩티드 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 GAd20인 벡터.
실시 형태 21. 실시 형태 12에 있어서, 서열 번호 12의 폴리펩티드 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 분자인 벡터.
실시 형태 22. 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 한 실시 형태의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물.
실시 형태 23. 실시 형태 10 또는 실시 형태 11의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물.
실시 형태 24. 실시 형태 12 내지 실시 형태 21 중 어느 한 실시 형태의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
실시 형태 25. 실시 형태 24에 있어서, 벡터가 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
실시 형태 26. 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 실시 형태 22 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시 형태 27. JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이를 보유하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 실시 형태 22 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시 형태 28. 대상체에서 골수증식성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 실시 형태 22 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시 형태 29. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 실시 형태 22 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시 형태 30. 대상체에서 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 실시 형태 22 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시 형태 31. 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법:
Figure pct00050
서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00051
서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00052
서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00053
서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00054
서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
실시 형태 32. JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이를 보유하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법:
Figure pct00055
서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00056
서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00057
서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00058
서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00059
서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
실시 형태 33. 대상체에서 골수증식성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법:
Figure pct00060
서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00061
서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00062
서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00063
서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00064
서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
실시 형태 34. 실시 형태 33에 있어서, 골수증식성 질환이 원발성 골수섬유증(MPN), 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판혈증(ET), 원발성 골수섬유증(PFM), 속발성 골수섬유증, 급성 골수성 백혈병(AML), 속발성 AML, 만성 골수원성 백혈병(CML), 잠재성 불명의 클론성 조혈증(CHIP), 및 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)으로부터 선택되는 방법.
실시 형태 35. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법:
Figure pct00065
서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00066
서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00067
서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00068
서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00069
서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
실시 형태 36. 실시 형태 35에 있어서, 암이 폐암, 림프암, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 형질 세포 골수종, 담도암, 방광암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 갑상선암, 위암, 대장암, 결장암, 요도암, 중추 신경계암, 신경아세포종, 신장암, 유방암, 자궁경부암, 고환암, 및 연조직암으로부터 선택되는 방법.
실시 형태 37. 대상체에서 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법:
Figure pct00070
서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00071
서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
Figure pct00072
서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
Figure pct00073
서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
Figure pct00074
서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
실시 형태 38. 실시 형태 37에 있어서, 심혈관 질환이 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 뇌혈관 질환, 허혈성 심장 질환, 혈전증, 정맥 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 파국적 복강내 혈전증, 말초 동맥 질환, 고혈압, 심부전, 심방 세동, 관상동맥 심장 질환, 죽상동맥경화증, 및 클론성 조혈증으로부터 선택되는 방법.
실시 형태 39. 실시 형태 31 내지 실시 형태 38 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.
실시 형태 40. 실시 형태 31 내지 실시 형태 39 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 벡터가 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.
실시 형태 41. 실시 형태 31 내지 실시 형태 39 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26 벡터인 방법.
실시 형태 42. 실시 형태 31 내지 실시 형태 39 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 GAd20 벡터인 방법.
실시 형태 43. 실시 형태 31 내지 실시 형태 39 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MVA 벡터인 방법.
실시 형태 44. 실시 형태 31 내지 실시 형태 39 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 Janus 키나제 2(JAK2) 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 분자인 방법.
실시 형태 45. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여.
실시 형태 46. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제3 투여.
실시 형태 47. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여.
실시 형태 48. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여.
실시 형태 49. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여.
실시 형태 50. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제3 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여.
실시 형태 51. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제3 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여.
실시 형태 52. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제3 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제5 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제5 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제6 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제6 투여.
실시 형태 53. 실시 형태 31 내지 실시 형태 52 중 어느 한 실시 형태에 있어서, CTLA-4 항체, PD-1 항체, PD-L1 항체, TLR 작용제, CD40 작용제, OX40 작용제, 하이드록시우레아, 룩솔리티닙, 페드라티닙, 41BB 작용제, CD28 작용제, FLT3 리간드, 알루미늄 설페이트, BTK 억제제, JAK 억제제, CD38 항체, CDK 억제제, CD33 항체, CD37 항체, CD25 항체, GM-CSF 억제제, IL-2, IL-15, IL-7, IFNγ, IFNα, TNFα, VEGF 항체, CD70 항체, CD27 항체, BCMA 항체, GPRC5D 항체, 및 이들의 조합으로부터 선택된 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시 형태 54. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하고, 여기서 치료 사이클은 제1, 제2, 및/또는 제3 조성물과 조합하여 항 CTLA-4 항체, PD-1 항체, 및 PD-L1 항체로부터 선택된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여.
실시 형태 55. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하고, 여기서 치료 사이클은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및/또는 제6 조성물과 조합하여 항 CTLA-4 항체, PD-1 항체, 및 PD-L1 항체로부터 선택된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제5 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제5 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제6 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제6 투여.
실시 형태 56. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하고, 여기서 치료 사이클은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및/또는 제6 조성물과 조합하여 항 CTLA-4 항체, PD-1 항체, 및 PD-L1 항체로부터 선택된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제인, 제3 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제5 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제5 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제6 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제6 투여.
실시 형태 57. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하고, 여기서 치료 사이클은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및/또는 제6 조성물과 조합하여 항 CTLA-4 항체, PD-1 항체, 및 PD-L1 항체로부터 선택된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 MVA 벡터인, 제3 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제5 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제5 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제6 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제6 투여.
실시 형태 58. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하고, 여기서 치료 사이클은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및/또는 제6 조성물과 조합하여 항 CTLA-4 항체, PD-1 항체, 및 PD-L1 항체로부터 선택된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제1 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 GAd20 벡터인, 제2 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제인, 제3 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제4 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제4 투여;
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제5 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제5 투여; 및
서열 번호 1의 CALR 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제6 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 자가-복제 RNA 분자인, 제6 투여.
실시 형태 58. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하는 방법:
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여;
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여.
실시 형태 59. 실시 형태 31 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 하나 이상의 치료 사이클을 포함하며, 여기서 각각의 사이클은 하기를 포함하고, 여기서 치료 사이클은 제1, 제2, 및/또는 제3 조성물과 조합하여 항 CTLA-4 항체, PD-1 항체, 및 PD-L1 항체로부터 선택된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제1 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제1 투여;
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제2 투여;
서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 2개 이상의 직렬 반복을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 제3 조성물을 포함하며, 여기서 벡터는 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 또는 자가-복제 RNA 분자로부터 선택되는, 제3 투여.
서열 목록
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
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Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. <120> VACCINES BASED ON MUTANT CALR AND JAK2 AND THEIR USES <130> JBI6177WOPCT1 <140> <141> <150> 62/936,841 <151> 2019-11-18 <150> 62/936,846 <151> 2019-11-18 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Thr Arg Arg Met Met Arg 1 5 10 15 Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met Arg Arg Thr Arg Arg Lys Met Arg 20 25 30 Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro Arg Thr Ser Cys Arg Glu Ala Cys 35 40 45 Leu Gln Gly Trp Thr Glu 50 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Glu Glu Ala Glu Asp Asn Cys Arg Arg Met Met Arg Thr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Thr Arg Arg Met Met 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tgattacaat 180 atccagaagg agagcacact gcacctggtg ctgcggctga gaggcgtgag gaaggacaag 240 caggatgagg agcagcgcac ccggagaatg atgcggacaa agatgagaat gaggcgcatg 300 cggagaacca ggcgcaagat gcggagaaag atgagcccag caaggccacg cacctcctgc 360 agggaggcat gtctgcaggg atggacagag gcagcctatg aggaggccga ggacaactgc 420 aggcgcatga tgcggacaaa ggccgcctac aagctgtctc acaagcacct ggtgctgaac 480 tatggcgtgt gcttctgtgg cgatgagaat atcctggtgc aggagttcgt gaagtttggc 540 tgataa 546 <210> 23 <211> 1417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tctccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gatcgtcgac gagctcgttt 780 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 840 ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggatctagag ccaccatggc 900 atgcccaggc ttcctgtggg ccctggtcat cagcacctgt ctggagtttt ccatggccat 960 gaaggacaag caggatgagg agcagcggac ccggagaatg atgaggacaa agatgcgcat 1020 gaggcgcatg cggagaacaa ggcgcaagat gcggagaaag atgtctccag caaggcctag 1080 aaccagctgc agggaggcat gtctgcaggg atggacagag gcagcatacg aggaggcaga 1140 ggacaactgc aggcgcatga tgaggaccaa ggccgcctac aagctgagcc acaagcacct 1200 ggtgctgaac 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ggcagtacat 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tctccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gatcgtcgac gagctcgttt 780 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 840 ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggatctagag ccaccatggc 900 atgcccaggc ttcctgtggg ccctggtcat cagcacctgt ctggagtttt ccatggccat 960 gaaggacaag caggatgagg agcagcggac ccggagaatg atgaggacaa agatgcgcat 1020 gaggcgcatg cggagaacaa ggcgcaagat gcggagaaag atgtctccag caaggcctag 1080 aaccagctgc agggaggcat gtctgcaggg atggacagag gcagcatacg aggaggcaga 1140 ggacaactgc aggcgcatga tgaggaccaa ggccgcctac gtgctgaatt atggcgtgtg 1200 cttctgtgcc gcctattttt gtggcgatga gaacatcctg gtgtgataag gtaccatccg 1260 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 1320 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 1380 tatcatgtct 1390 <210> 25 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 gatcactaat tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa 60 tacaataatt aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acggtaagga 120 agtagaatca taaagaacag tgacggatcc cgcgacttcg ccgccatggg ccagaaggaa 180 cagattcata cgcttcagaa aaattctgaa cgaatgtcaa agcaattgac acgaagttct 240 caggcagtaa tgaaggacaa acaagacgaa gaacaacgaa ctaggcggat gatgaggact 300 aagatgagga tgcggaggat gagacggacg cgacgcaaga tgcgccggaa aatgtctccc 360 gcccggccaa ggacgtcttg tcgggaagcc tgtttgcagg gctggaccga agcagcttac 420 gaagaagcag aagacaattg tcggcgaatg atgagaacga aggctgctta cgtgcttaac 480 tatggagtgt gcttctgcgc tgcctatttc tgcggagatg agaacattct ggtgtagtaa 540 aggcgcgcc 549 <210> 26 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 atgggccaga aggaacagat tcatacgctt cagaaaaatt ctgaacgaat 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Ile Leu Val Ala Ala Tyr Phe Cys Gly Asp 1 5 10 15 Glu Asn Ile Leu Val 20 <210> 29 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Met Gly Gln Lys Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg 1 5 10 15 Met Ser Lys Gln Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val 20 25 <210> 30 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 atgggccaga aggaacagat tcatacgctt cagaaaaatt ctgaacgaat gtcaaagcaa 60 ttgacacgaa gttctcaggc agta 84 <210> 31 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Met Gly Gln Lys Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg 1 5 10 15 Met Ser Lys Gln Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val Met Lys Asp Lys 20 25 30 Gln Asp Glu Glu Gln Arg Thr Arg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg 35 40 45 Met Arg Arg Met Arg Arg Thr Arg Arg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser 50 55 60 Pro Ala 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cgatccttga cattggaata gtcagcatag tacatttcat ctgactaata ctacaacacc 300 accaccatga atagaggatt ctttaacatg ctcggccgcc gccccttccc ggcccccact 360 gccatgtgga ggccgcggag aaggaggcag gcggccccgg gaagcggagc tactaacttc 420 agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg gacctgagaa agttcacgtt 480 gacatcgagg aagacagccc attcctcaga gctttgcagc ggagcttccc gcagtttgag 540 gtagaagcca agcaggtcac tgataatgac catgctaatg ccagagcgtt ttcgcatctg 600 gcttcaaaac tgatcgaaac ggaggtggac ccatccgaca cgatccttga cattggaagt 660 gcgcccgccc gcagaatgta ttctaagcac aagtatcatt gtatctgtcc gatgagatgt 720 gcggaagatc cggacagatt gtataagtat gcaactaagc tgaagaaaaa ctgtaaggaa 780 ataactgata aggaattgga caagaaaatg aaggagctcg ccgccgtcat gagcgaccct 840 gacctggaaa ctgagactat gtgcctccac gacgacgagt cgtgtcgcta cgaagggcaa 900 gtcgctgttt accaggatgt atacgcggtt gacggaccga caagtctcta tcaccaagcc 960 aataagggag ttagagtcgc ctactggata ggctttgaca ccaccccttt tatgtttaag 1020 aacttggctg gagcatatcc atcatactct accaactggg ccgacgaaac cgtgttaacg 1080 gctcgtaaca 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caccctcata tcatgtggtg cgaggggata ttgccacggc caccgaagga 4500 gtgattataa atgctgctaa cagcaaagga caacctggcg gaggggtgtg cggagcgctg 4560 tataagaaat tcccggaaag cttcgattta cagccgatcg aagtaggaaa agcgcgactg 4620 gtcaaaggtg cagctaaaca tatcattcat gccgtaggac caaacttcaa caaagtttcg 4680 gaggttgaag gtgacaaaca gttggcagag gcttatgagt ccatcgctaa gattgtcaac 4740 gataacaatt acaagtcagt agcgattcca ctgttgtcca ccggcatctt ttccgggaac 4800 aaagatcgac taacccaatc attgaaccat ttgctgacag ctttagacac cactgatgca 4860 gatgtagcca tatactgcag ggacaagaaa tgggaaatga ctctcaagga agcagtggct 4920 aggagagaag cagtggagga gatatgcata tccgacgact cttcagtgac agaacctgat 4980 gcagagctgg tgagggtgca tccgaagagt tctttggctg gaaggaaggg ctacagcaca 5040 agcgatggca aaactttctc atatttggaa gggaccaagt ttcaccaggc ggccaaggat 5100 atagcagaaa ttaatgccat gtggcccgtt gcaacggagg ccaatgagca ggtatgcatg 5160 tatatcctcg gagaaagcat gagcagtatt aggtcgaaat gccccgtcga agagtcggaa 5220 gcctccacac cacctagcac gctgccttgc ttgtgcatcc atgccatgac tccagaaaga 5280 gtacagcgcc 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cctccgacac cggtcaaggg catttacaac aaaaatcagt aaggcaaacg 6180 gtgctatccg aagtggtgtt ggagaggacc gaattggaga tttcgtatgc cccgcgcctc 6240 gaccaagaaa aagaagaatt actacgcaag aaattacagt taaatcccac acctgctaac 6300 agaagcagat accagtccag gaaggtggag aacatgaaag ccataacagc tagacgtatt 6360 ctgcaaggcc tagggcatta tttgaaggca gaaggaaaag tggagtgcta ccgaaccctg 6420 catcctgttc ctttgtattc atctagtgtg aaccgtgcct tttcaagccc caaggtcgca 6480 gtggaagcct gtaacgccat gttgaaagag aactttccga ctgtggcttc ttactgtatt 6540 attccagagt acgatgccta tttggacatg gttgacggag cttcatgctg cttagacact 6600 gccagttttt gccctgcaaa gctgcgcagc tttccaaaga aacactccta tttggaaccc 6660 acaatacgat cggcagtgcc ttcagcgatc cagaacacgc tccagaacgt cctggcagct 6720 gccacaaaaa gaaattgcaa tgtcacgcaa atgagagaat tgcccgtatt ggattcggcg 6780 gcctttaatg tggaatgctt caagaaatat gcgtgtaata atgaatattg ggaaacgttt 6840 aaagaaaacc ccatcaggct tactgaagaa aacgtggtaa attacattac caaattaaaa 6900 ggaccaaaag ctgctgctct ttttgcgaag acacataatt tgaatatgtt gcaggacata 6960 ccaatggaca 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Synthetic oligonucleotide <400> 36 ctctctacgg ctaacctgaa tgga 24 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 taatacgact cactatag 18 <210> 38 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 39 <210> 39 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 taggagaaag ttcacgttga catcgaggaa gacagcccat tcctcagagc tttgcagcgg 60 agcttcccgc agtttgaggt agaagccaag caggtcactg ataatgacca tgctaatgcc 120 agagcgtttt cgcatctggc ttcaaaactg atcgaaacgg aggtggaccc atccgacacg 180 atccttgaca ttgga 195 <210> 40 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 atagtcagca tagtacattt catctgacta atactacaac accaccacca tgaatagagg 60 attctttaac 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240 ctgcaaggcc tagggcatta tttgaaggca gaaggaaaag tggagtgcta ccgaaccctg 300 catcctgttc ctttgtattc atctagtgtg aaccgtgcct tttcaagccc caaggtcgca 360 gtggaagcct gtaacgccat gttgaaagag aactttccga ctgtggcttc ttactgtatt 420 attccagagt acgatgccta tttggacatg gttgacggag cttcatgctg cttagacact 480 gccagttttt gccctgcaaa gctgcgcagc tttccaaaga aacactccta tttggaaccc 540 acaatacgat cggcagtgcc ttcagcgatc cagaacacgc tccagaacgt cctggcagct 600 gccacaaaaa gaaattgcaa tgtcacgcaa atgagagaat tgcccgtatt ggattcggcg 660 gcctttaatg tggaatgctt caagaaatat gcgtgtaata atgaatattg ggaaacgttt 720 aaagaaaacc ccatcaggct tactgaagaa aacgtggtaa attacattac caaattaaaa 780 ggaccaaaag ctgctgctct ttttgcgaag acacataatt tgaatatgtt gcaggacata 840 ccaatggaca ggtttgtaat ggacttaaag agagacgtga aagtgactcc aggaacaaaa 900 catactgaag aacggcccaa ggtacaggtg atccaggctg ccgatccgct agcaacagcg 960 tatctgtgcg gaatccaccg agagctggtt aggagattaa atgcggtcct gcttccgaac 1020 attcatacac tgtttgatat gtcggctgaa gactttgacg ctattatagc cgagcacttc 1080 cagcctgggg attgtgttct ggaaactgac atcgcgtcgt ttgataaaag tgaggacgac 1140 gccatggctc tgaccgcgtt aatgattctg gaagacttag gtgtggacgc agagctgttg 1200 acgctgattg aggcggcttt cggcgaaatt tcatcaatac atttgcccac taaaactaaa 1260 tttaaattcg gagccatgat gaaatctgga atgttcctca cactgtttgt gaacacagtc 1320 attaacattg taatcgcaag cagagtgttg agagaacggc taaccggatc accatgtgca 1380 gcattcattg gagatgacaa tatcgtgaaa ggagtcaaat cggacaaatt aatggcagac 1440 aggtgcgcca cctggttgaa tatggaagtc aagattatag atgctgtggt gggcgagaaa 1500 gcgccttatt tctgtggagg gtttattttg tgtgactccg tgaccggcac agcgtgccgt 1560 gtggcagacc ccctaaaaag gctgtttaag cttggcaaac ctctggcagc agacgatgaa 1620 catgatgatg acaggagaag ggcattgcat gaagagtcaa cacgctggaa ccgagtgggt 1680 attctttcag agctgtgcaa ggcagtagaa tcaaggtatg aaaccgtagg aacttccatc 1740 atagttatgg ccatgactac tctagctagc agtgttaaat cattcagcta cctgagaggg 1800 gcccctataa ctctctacgg c 1821 <210> 46 <211> 1671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 gcaccctcat atcatgtggt gcgaggggat attgccacgg ccaccgaagg agtgattata 60 aatgctgcta acagcaaagg acaacctggc ggaggggtgt gcggagcgct gtataagaaa 120 ttcccggaaa gcttcgattt acagccgatc gaagtaggaa aagcgcgact ggtcaaaggt 180 gcagctaaac atatcattca tgccgtagga ccaaacttca acaaagtttc ggaggttgaa 240 ggtgacaaac agttggcaga ggcttatgag tccatcgcta agattgtcaa cgataacaat 300 tacaagtcag tagcgattcc actgttgtcc accggcatct tttccgggaa caaagatcga 360 ctaacccaat cattgaacca tttgctgaca gctttagaca ccactgatgc agatgtagcc 420 atatactgca gggacaagaa atgggaaatg actctcaagg aagcagtggc taggagagaa 480 gcagtggagg agatatgcat atccgacgac tcttcagtga cagaacctga tgcagagctg 540 gtgagggtgc atccgaagag ttctttggct ggaaggaagg gctacagcac aagcgatggc 600 aaaactttct catatttgga agggaccaag tttcaccagg cggccaagga tatagcagaa 660 attaatgcca tgtggcccgt tgcaacggag gccaatgagc aggtatgcat gtatatcctc 720 ggagaaagca tgagcagtat taggtcgaaa tgccccgtcg aagagtcgga agcctccaca 780 ccacctagca cgctgccttg cttgtgcatc catgccatga ctccagaaag agtacagcgc 840 ctaaaagcct cacgtccaga acaaattact gtgtgctcat cctttccatt gccgaagtat 900 agaatcactg gtgtgcagaa gatccaatgc tcccagccta tattgttctc accgaaagtg 960 cctgcgtata ttcatccaag gaagtatctc gtggaaacac caccggtaga cgagactccg 1020 gagccatcgg cagagaacca atccacagag gggacacctg aacaaccacc acttataacc 1080 gaggatgaga ccaggactag aacgcctgag ccgatcatca tcgaagagga agaagaggat 1140 agcataagtt tgctgtcaga tggcccgacc caccaggtgc tgcaagtcga ggcagacatt 1200 cacgggccgc cctctgtatc tagctcatcc tggtccattc ctcatgcatc cgactttgat 1260 gtggacagtt tatccatact tgacaccctg gagggagcta gcgtgaccag cggggcaacg 1320 tcagccgaga ctaactctta cttcgcaaag agtatggagt ttctggcgcg accggtgcct 1380 gcgcctcgaa cagtattcag gaaccctcca catcccgctc cgcgcacaag aacaccgtca 1440 cttgcaccca gcagggcctg ctcgagaacc agcctagttt ccaccccgcc aggcgtgaat 1500 agggtgatca ctagagagga gctcgaggcg cttaccccgt cacgcactcc tagcaggtcg 1560 gtctcgagaa ccagcctggt ctccaacccg ccaggcgtaa atagggtgat tacaagagag 1620 gagtttgagg cgttcgtagc acaacaacaa tgacggtttg atgcgggtgc a 1671 <210> 47 <211> 1602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 gagaaagttc acgttgacat cgaggaagac agcccattcc tcagagcttt gcagcggagc 60 ttcccgcagt ttgaggtaga agccaagcag gtcactgata atgaccatgc taatgccaga 120 gcgttttcgc atctggcttc aaaactgatc gaaacggagg tggacccatc cgacacgatc 180 cttgacattg gaagtgcgcc cgcccgcaga atgtattcta agcacaagta tcattgtatc 240 tgtccgatga gatgtgcgga agatccggac agattgtata agtatgcaac taagctgaag 300 aaaaactgta aggaaataac tgataaggaa ttggacaaga aaatgaagga gctcgccgcc 360 gtcatgagcg accctgacct ggaaactgag actatgtgcc tccacgacga cgagtcgtgt 420 cgctacgaag ggcaagtcgc tgtttaccag gatgtatacg cggttgacgg accgacaagt 480 ctctatcacc aagccaataa gggagttaga gtcgcctact ggataggctt tgacaccacc 540 ccttttatgt ttaagaactt ggctggagca tatccatcat actctaccaa ctgggccgac 600 gaaaccgtgt taacggctcg taacataggc ctatgcagct ctgacgttat ggagcggtca 660 cgtagaggga tgtccattct tagaaagaag tatttgaaac catccaacaa tgttctattc 720 tctgttggct cgaccatcta ccacgagaag agggacttac tgaggagctg gcacctgccg 780 tctgtatttc acttacgtgg caagcaaaat tacacatgtc ggtgtgagac tatagttagt 840 tgcgacgggt acgtcgttaa aagaatagct atcagtccag gcctgtatgg gaagccttca 900 ggctatgctg ctacgatgca ccgcgaggga ttcttgtgct gcaaagtgac agacacattg 960 aacggggaga gggtctcttt tcccgtgtgc acgtatgtgc cagctacatt gtgtgaccaa 1020 atgactggca tactggcaac agatgtcagt gcggacgacg cgcaaaaact gctggttggg 1080 ctcaaccagc gtatagtcgt caacggtcgc acccagagaa acaccaatac catgaaaaat 1140 taccttttgc ccgtagtggc ccaggcattt gctaggtggg caaaggaata taaggaagat 1200 caagaagatg aaaggccact aggactacga gatagacagt tagtcatggg gtgttgttgg 1260 gcttttagaa ggcacaagat aacatctatt tataagcgcc cggataccca aaccatcatc 1320 aaagtgaaca gcgatttcca ctcattcgtg ctgcccagga taggcagtaa cacattggag 1380 atcgggctga gaacaagaat caggaaaatg ttagaggagc acaaggagcc gtcacctctc 1440 attaccgccg aggacgtaca agaagctaag tgcgcagccg atgaggctaa ggaggtgcgt 1500 gaagccgagg agttgcgcgc agctctacca cctttggcag ctgatgttga ggagcccact 1560 ctggaagccg atgtcgactt gatgttacaa gaggctgggg cc 1602 <210> 48 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 atgattgaac aggatggcct gcatgcgggt agcccggcag cgtgggtgga acgtctgttt 60 ggctatgatt gggcgcagca gaccattggc tgctctgatg cggcggtgtt tcgtctgagc 120 gcgcagggtc gtccggtgct gtttgtgaaa accgatctga gcggtgcgct gaacgagctg 180 caggatgaag cggcgcgtct gagctggctg gccaccaccg gtgttccgtg tgcggcggtg 240 ctggatgtgg tgaccgaagc gggccgtgat tggctgctgc tgggcgaagt gccgggtcag 300 gatctgctgt ctagccatct ggcgccggca gaaaaagtga gcattatggc ggatgccatg 360 cgtcgtctgc ataccctgga cccggcgacc tgtccgtttg atcatcaggc gaaacatcgt 420 attgaacgtg cgcgtacccg tatggaagcg ggcctggtgg atcaggatga tctggatgaa 480 gaacatcagg gcctggcacc ggcagagctg tttgcgcgtc tgaaagcgag catgccggat 540 ggcgaagatc tggtggtgac ccatggtgat gcgtgcctgc cgaacattat ggtggaaaat 600 ggccgtttta gcggctttat tgattgcggc cgtctgggcg tggcggatcg ttatcaggat 660 attgcgctgg ccacccgtga tattgcggaa gaactgggcg gcgaatgggc ggatcgtttt 720 ctggtgctgt atggcattgc ggcaccggat agccagcgta ttgcgtttta tcgtctgctg 780 gatgaatttt tctaataa 798 <210> 49 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta 60 acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg 120 cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt 180 gaaaacctct ga 192 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ataggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaa 44 <210> 51 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 51 atacagcagc aattggcaag ctgcttacat agaactcgcg gcgattggca tgccgcttta 60 aaatttttat tttatttttc ttttcttttc cgaatcggat tttgttttta atatttc 117 <210> 52 <211> 845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca 60 ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 120 ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 180 ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 240 acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 300 ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 360 aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 420 tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 480 gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 540 gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 600 ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc 660 cctatcagtg atagagatct ccctatcagt gatagagatc gtcgacgagc tcgtttagtg 720 aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 780 gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag 840 agtga 845 <210> 53 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcc 227 <210> 54 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Val Arg 65 70 75

Claims (45)

  1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
    MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG(서열 번호 4) 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    VLNYGVCFC(서열 번호 5) 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    FCGDENILV(서열 번호 6) 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 이들의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 하기 에피토프 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
    MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    VLNYGVCFC(서열 번호 5) 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
    FCGDENILV(서열 번호 6) 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열.
  3. 제1항에 있어서, 하기 에피토프 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
    MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열;
    EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
    KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG(서열 번호 4) 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열.
  4. 제1항에 있어서, 하기 에피토프 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
    MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE(서열 번호 1) 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
    EEAEDNCRRMMRTK(서열 번호 2) 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 리더 서열을 N 말단에 추가로 포함하는, 폴리펩티드:
    MACPGFLWALVISTCLEFSMA(서열 번호 8);
    MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGV(서열 번호 54); 및
    MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV(서열 번호 29).
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 서열이 링커 서열에 의해 서로에게 연결되는, 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 링커 서열이 AAY, RR, DPP, HHAA, HHA, HHL, RKSYL, RKSY, SSL, 또는 REKR로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  8. 제6항에 있어서, 링커 서열이 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 하기로부터 선택되는, 폴리펩티드:
    서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 서열 번호 15와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
    서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드:
    서열 번호 16의 핵산 서열 또는 서열 번호 16과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 17의 핵산 서열 또는 서열 번호 17과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 18의 핵산 서열 또는 서열 번호 18과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 19의 핵산 서열 또는 서열 번호 19와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 20의 핵산 서열 또는 서열 번호 20과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 21의 핵산 서열 또는 서열 번호 21과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 22의 핵산 서열 또는 서열 번호 22와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열;
    서열 번호 26의 핵산 서열 또는 서열 번호 26과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및
    서열 번호 27의 핵산 서열 또는 서열 번호 27과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
  12. 제10항 또는 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd34, hAd35, hAd48, hAd49, hAd50, GAd20, Gad19, GAd21, GAd25, GAd26, GAd27, GAd28, GAd29, GAd30, GAd31, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAdI7, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3으로부터 선택되는, 벡터.
  15. 제13항에 있어서, 폭스바이러스 벡터가 천연두 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 원숭이두창 바이러스 벡터, 코펜하겐 백시니아 바이러스(W) 벡터, 뉴욕 약독화 백시니아 바이러스(NYVAC: New York Attenuated Vaccinia Virus) 벡터, 및 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터로부터 선택되는, 벡터.
  16. 제12항에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터인, 벡터.
  17. 제12항에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 분자인, 벡터.
  18. 제12항에 있어서, 서열 번호 10의 폴리펩티드 또는 서열 번호 10과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26인, 벡터.
  19. 제12항에 있어서, 서열 번호 31의 폴리펩티드 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MVA 벡터인, 벡터.
  20. 제12항에 있어서, 서열 번호 31의 폴리펩티드 또는 서열 번호 31과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 GAd20인, 벡터.
  21. 제12항에 있어서, 서열 번호 12의 폴리펩티드 또는 서열 번호 12와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 분자인, 벡터.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제10항 또는 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 벡터가 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  26. 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이를 보유하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 대상체에서 골수증식성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 대상체에서 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 대상체에서 JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이체의 발현을 특징으로 하는 임상적 병태를 치료하거나, 예방하거나, 발병 위험을 감소시키거나, 발병을 지연시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는, 방법:
    Figure pct00086
    서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00087
    서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00088
    서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
    Figure pct00089
    서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
    Figure pct00090
    서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
  32. JAK2V617F 및/또는 CALR 엑손 9 돌연변이를 보유하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는, 방법:
    Figure pct00091
    서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00092
    서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00093
    서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
    Figure pct00094
    서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
    Figure pct00095
    서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
  33. 대상체에서 골수증식성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는, 방법:
    Figure pct00096
    서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00097
    서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00098
    서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
    Figure pct00099
    서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
    Figure pct00100
    서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
  34. 제33항에 있어서, 골수증식성 질환이 원발성 골수섬유증(MPN), 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판혈증(ET), 원발성 골수섬유증(PFM), 속발성 골수섬유증, 급성 골수성 백혈병(AML), 속발성 AML, 만성 골수원성 백혈병(CML), 잠재성 불명의 클론성 조혈증(CHIP: clonal hematopoiesis of indeterminate potential), 및 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)으로부터 선택되는, 방법.
  35. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는, 방법:
    Figure pct00101
    서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00102
    서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00103
    서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
    Figure pct00104
    서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
    Figure pct00105
    서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
  36. 제35항에 있어서, 암이 폐암, 림프암, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 형질 세포 골수종, 담도암, 방광암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 갑상선암, 위암, 대장암, 결장암, 요도암, 중추 신경계암, 신경아세포종, 신장암, 유방암, 자궁경부암, 고환암, 및 연조직암으로부터 선택되는, 방법.
  37. 대상체에서 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개 이상의 에피토프 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는, 방법:
    Figure pct00106
    서열 번호 1의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00107
    서열 번호 2의 CALR 에피토프 또는 서열 번호 2와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 CALR 에피토프;
    Figure pct00108
    서열 번호 4의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 4와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프;
    Figure pct00109
    서열 번호 5의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 5와 90% 이상의 서열 동일성의 JAK2 에피토프;
    Figure pct00110
    서열 번호 6의 JAK2 에피토프 또는 서열 번호 6과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 JAK2 에피토프; 및 이들의 조합.
  38. 제37항에 있어서, 심혈관 질환이 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 뇌혈관 질환, 허혈성 심장 질환, 혈전증, 정맥 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 파국적 복강내 혈전증, 말초 동맥 질환, 고혈압, 심부전, 심방 세동, 관상동맥 심장 질환, 죽상동맥경화증, 및 클론성 조혈증으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 Ad26 벡터, MVA 벡터, GAd20 벡터, 자가-복제 RNA 분자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Ad26 벡터인, 방법.
  42. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 GAd20 벡터인, 방법.
  43. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MVA 벡터인, 방법.
  44. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 서열 번호 1의 칼레티쿨린(CALR) 에피토프, 서열 번호 2의 CALR 에피토프, 서열 번호 5의 JAK2 에피토프, 및 서열 번호 6의 JAK2 에피토프의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-복제 RNA 분자인, 방법.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA-4 항체, PD-1 항체, PD-L1 항체, TLR 작용제, CD40 작용제, OX40 작용제, 하이드록시우레아, 룩솔리티닙, 페드라티닙, 41BB 작용제, CD28 작용제, FLT3 리간드, 알루미늄 설페이트, BTK 억제제, JAK 억제제, CD38 항체, CDK 억제제, CD33 항체, CD37 항체, CD25 항체, GM-CSF 억제제, IL-2, IL-15, IL-7, IFNγ, IFNα, TNFα, VEGF 항체, CD70 항체, CD27 항체, BCMA 항체, GPRC5D 항체, 및 이들의 조합으로부터 선택된 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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