JP2000515522A - 経皮内用のウシポリヌクレオチドワクチン製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウシの病原物質の免疫源をコードするＤＮＡ配列と、皮膚の細胞中でインビボでこの免疫源を発現させるプロモータとを組み合わせた、皮内経路で有効な量のプラスミドを含む、液体ジェット投与装置を用いた皮内投与用の、ウシ用のポリヌクレオチドワクチン製剤。ワクチン製剤の投与量を皮内経路で伝達する液体噴射投与器具と、上記ワクチン製剤を数回分の投与量で含む適当なバイアルとで構成される携帯型ウシワクチンユニット。

Description

【発明の詳細な説明】 経皮内用のウシポリヌクレオチドワクチン製剤 本発明はウシの予防接種の改良に関するものである。 国際特許第ＷＯ−Ａ−９０１１０９２には免疫原性タンパク質をコードするヌ クレオチド配列を直接投与する免疫化および予防接種（いわゆるＤＮＡまたはポ リヌクレオチド予防接種）が記載されている。挿入されたヌクレオチド配列にコ ードされたタンパク質は細胞内で発現し、免疫応答する。この特許では裸のＤＮ Ａと同様リポゾームに含まれるＤＮＡの使用を試みている。ＤＮＡは筋肉中に導 入するのが好ましい。ＤＮＡはまた皮膚や特定の器官または血液中に導入でき、 皮内経路、経皮経路、静脈経路等による異なる方法で導入できる。 この方法の研究によって、ＤＮＡ注射のために筋肉内経路を用いるか、ＤＮＡ で被覆した金の微粒子のような金属の微粒子を皮膚の表面細胞層に直接推進させ る、いわゆる"ジーンガン"（gene gun）法を用いることのどちらが有益であるか が示された。 J．B．ULMER他（Science，Volume 259，19 March 1993，1745-1749）やG．J． M．COX他（Virology，Volume 67，No．9，September 1993，5664-5667）やZ．Q ．XIANG，（Virology 199，132-140(1994)）は筋肉内経路を用いたＤＮＡ予防接 種試験を記載している。 筋肉内経路は皮内経路よりも優れた結果をもたらすことは広く示されていた。 最終の分析では最も有望な方法は"ジーンガン"の使用であり、この技術により投 与量は筋肉内経路で必要とされる量よりもかなり少なくなる。Ｆ．フィナン他の P．N．A．S．USA Volume 90，11478-11482，December，1993，WO-A-95/20660を 参照。 同様に、Ｄ．タン達（Nature 356，152-154，12 March 1992）は、皮下針を用 いて皮内経路でヒト成長ホルモンを投与した後、免疫反応が無いことを示した。 一方、発明者達は"ジーンガン"を用いて免疫反応を獲得したことを示した。 Ｅ．ラズ達（P．N．A．S．USA，Vol．91，9519-9523，September 1994）のみ が皮内投与によって高い抗体価を誘導することができると報告している。 しかし、"ジーンガン"法はＤＮＡで被覆した金の微粒子を生成、使用し、特別 な推進剤を用いて投与する必要があるため、使用が難しく高価である。 そこで、液体噴射投与器具の使用を試みる別の技術を開発した発明者達もいる 。ＤＮＡワクチンの投与のためヒトワクチンを筋肉組織内に届けるために用いる 注射器であるPed-o-jetと称する器具の使用を説明したP．A．FURTH達（Analytic al Biochemistry 205，365-368，1992）が挙げられる。発明者達はこの注射器に より、ＤＮＡが生きている動物の皮膚を通過し筋肉や脂肪組織や乳腺組織に到達 することができると報告している。 H．L．VAHLSING達はJournal of Immunolog Methods 75（1994）11-22で経皮や 筋肉内投与のためのMed-E-Jetと称する器具の使用を説明している。 筋肉内へのジェット予防接種の使用を説明したＭ．ジェンキンス達（Vaccine 1995，Volume 13，No．17，1658-1664）を挙げることもできる。 ウシの呼吸器合胞体ウイルス（bovine respiratory syncytial virus）ＢＲＳ Ｖは世界中に存在し、ウシの気道低部に重い疾患を引き起こすことがあるが、こ の病気はヒトの子供の呼吸器合胞体ウイルスＨＲＳＶＮが引き起こす病気に類似 している。ある研究では９５％以上の２才の子ウシがＢＲＳＶウイルスに感染し ている（Van der Poel et al.，Archives of Virology 1993，133，309-321）。 ＢＲＳＶウイルスに対するワクチンの必要はあったが有効なワクチンの開発は なされていなかった。子供に対する予防接種の最初の試みから、自然感染後の病 気の促進が見られ、予防接種は危険であるかもしれないことを示唆した（アンダ ーソン他.，Journal of Infectious Diseases，1995，171:1-7）。しかし、２つ の主たる表面糖タンパクであるＦ（融合タンパク質）とＧ（接着タンパク質）に 対する抗体が防御の働きをすることができることは周知である（KimmanとWesten brink，Archives of Virology，1990，112：1-25）。ネズミ、イヌ、フェレット タイプの動物モデルに対しても多くの研究がなされてきた。一方、精製Ｆタンパ ク質を用いたウシに対する予防接種の試験は、ＨＲＳＶを接種した子供のように 、子ウシも後に続くウイルス感染中の免疫反応を妨害する中和抗体と非中和抗体 を発生させた（Ｌ．Ｄ．ネルソン他、Am．j．Vet．Res.，Vol．3，No． 8，August 1992，p．1315-1321） 本発明の目的は、筋肉内経路または"ジーンガン"法と少なくとも同等の効果が あり、しかも、より使い易く、費用の安い予防接種が可能な、ＤＮＡを用いたウ シに対する予防接種の改良法を提供することにある。 本発明の他の目的は組織内のワクチン残留物に関する安全性を必然的に高める ような改良法を提供することにある。 本発明の他の目的はまた、食肉用の動物に対する予防接種に関して予防接種が 肉の外見に好ましくない影響を与えないような安全性の確保にある。 本発明の他の目的は集団予防接種のための手段を提供することにある。 本発明の特別な目的はＢＲＳＶウイルス、ＩＢＲウイルス、ＢＶＤウイルスま たはＰＩ‐３ウイルスに対してウシを防御するワクチンを提供することにある。 本出願人は表皮、真皮、皮下組織内に必ずワクチンが分布されるよう少なくと も５点に針無し液体注射器を用いた皮内経路のワクチン投与することでこれらの 目的を達成できることを発見した。本出願人が実施したウシ呼吸器合胞体ウイル ス（Bovine Respiratory Syncytial Virus，BRSV）に対するウシの予防接種試験 により、この経路で筋肉内経路によるものよりも優れた結果を獲得することがで きた。 本発明は針無し液体噴射注射器を用いて皮内経路用に構成し、投与するポリヌ クレオチドワクチン（またはＤＮＡワクチンまたはプラスミドワクチン）のウシ への接種を初めて提供する。 本発明の対象は、免疫源をコードするＤＮＡ配列と皮膚の細胞中の生体内免疫 源を発現させるプロモータを組み合わせた、皮内経路で有効な量のプラスミドを 含むポリヌクレオチドワクチン製剤であって、このワクチン製剤は、皮内投与用 液体噴射器、特にPigjet（製造販売：Endorscoptic社、Laons，France）とよば ｚれる器具か、ワクチンをPigjetと同等の条件下で５つのノズルを通して伝達す る同等な器具を用いた皮内投与に適している（表皮、真皮、皮下組織の細胞が特 に目標にされ、投与は特に発現された抗体源を主に表皮に位置する皮膚の樹状ラ ンゲルハンス細胞に表す）。一般に、本発明のワクチン製剤は５から１０、好ま しくは４から６、さらに好ましくは５から６のノズルを有する液体噴射器具を用 いた投与に適している。 これは皮内経路に適した、水、バッファー、生理食塩水、リポゾーム、カチオ ンリピッドや、一般に水と同等かそれに近い、低い粘度の溶媒と、この経路に有 用で効果のある投与量を必要とする。 特に、５または６個のノズルを有する器具すなわち５または６個の開口部を通 して、５または６回の同用量の噴射の形で製剤を投与する場合には、投与量は０ ．１から０．９ｍｌ、好ましくは０．２から０．６ｍｌ、好ましくは０．４から ０．５ｍｌであるのが有利であるが、必ずしもそうでなくてもよい。 ワクチン製剤は皮内で有効な量のプラスミド、一般に１０ｎｇから１ｍｇ、好 ましくは１００ｎｇから５００μｇ、好ましくは０．５μｇから５０μｇのプラ スミドを含む。 一般に、本発明はプラスミドに細胞を最適な形で形質移入させるため、数箇所 にワクチン製剤を投与する。このため、数箇所の孔の開いた注射ヘッドを用いる のが好ましい。これはまた、装置の多重使用、つまり異なる部位で装置を１回以 上用いたワクチン製剤の拡散と組み合わせることもできる。特に好ましい方法で は５または６個の孔の装置を１回または複数回、好ましくは２回の使用に用いる ことができる。 本発明の典型的なケースはＢＲＳＶウイルスの免疫源と、このウイルスのＧお よび／またはＦ遺伝子をコードするＤＮＡ配列である（例えば３９１ ２菌株： R．Lerch他、Virology，1991，181，118-131） 本発明の他の典型的なケースは、ウシの感染性鼻気管炎（infectious bovine rhinotracheitis:IBR）またはウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、特にｇＢ遺伝 子および／またはｇＤ遺伝子をコードするＤＮＡ配列である（例えばＳＴ菌株:L eung-Tack P.他、Virology，1994，199，409-421） 本発明の他の典型的なケースは、粘膜疾病ウイルス特にＥ２遺伝子および／ま たはＥ１遺伝子をコードするＤＮＡ配列である（例えばOsloss菌株:L．DeMoerlo ose他、J．Gen．Virol.，1993，74，1433-1438）ＢＶＤの異なるサブタイ プ、例えば北アメリカやヨーロッパからの遺伝子を組み合わせることもできる。 （A．Dekker他、Veterinary Microbiol.，1995，47，317-329） 本発明の他の典型的なケースは、タイプ３パラインフルエンザウイルスの免疫 源（PI-3）、特にＨＮ遺伝子または／およびＦ遺伝子、好ましくはＨＮ遺伝子を コードするＤＮＡ配列である（１９８７年にＨ．シブタが析出したＦおよびＨＮ 遺伝子の配列、遺伝子バンク配列目録番号Ｙ００１１５） ２つの遺伝子の組み合わせ、例えばＢＲＳＶのＦおよびＧ、ＰＩ‐３のＨＮと ＦまたはＩＢＲのｇＤとｇＢの場合、対応する配列は同じプラスミドまたは異な るプラスミドに挿入することができる。 病原体遺伝子は完全な遺伝子だけでなく保護応答を誘導する能力を保持してい る断片を含む多様なヌクレオチド配列を意味する。遺伝子の概念は実施例に正確 に説明したものと同じヌクレオチド配列、つまり異なる配列で同じタンパク質を コードするものを含む。交差防御または菌株や菌株群に特有の防御を提供する病 原体の他の菌株のヌクレオチド配列も含む。また、宿主の動物による生体内発現 を実施するため修正したヌクレオチド配列で、同じタンパク質をコードするもの でもよい。 本発明は公知のＤＮＡワクチンを液体噴射投与装置で皮内投与することに適用 したものである。ワクチン製剤、特にその粘度およびＤＮＡ質量、投与量を変え ることによって、本発明は先行技術に記載の任意のＤＮＡワクチン構造に適合で きることは言うまでもない。当技術分野の専門家はＤＮＡ接種分野の現状、特に 前記に述べた資料を参照することができる。 特に、本発明のワクチン製剤に用いられる転写ユニットはｈＣＭＶ ＩＥ プ ロモーターのような強力な真核生物プロモーターを含む。 本発明のワクチン製剤は皮内液体噴射投与器具、好ましくはPigjetに合った複 数投与バイアルに例えば１０から１００投与量を入れることができる。 本発明の対象はまた、液体噴射投与器具と上記の数回分の投与量のワクチン製 剤を含む、ワクチン製剤の投与量を皮内経路で伝達するように構成された携帯型 ウシワクチンユニットにある。 投与器具は１から１０個、特に４から６個、好ましくは５または６個のノズル を有する注射ヘッドを含むのが好ましい。 投与器具は詳細な説明に記載の異なる特性を有してもよい。好ましい型の投与 器具はPigjet器具を用いて得られた投与条件を再現するものである。 本発明の他の対象は、皮内投与に適した上記の異なる方法による液体噴射投与 器具を用いたポリヌクレオチドワクチン生成のためのウシ病原体の免疫源をコー ドするＤＮＡ配列とこの型の免疫源を発現させるプロモーターとを組み合わせた プラスミドの使用にある。 本発明の他の対象は、上記ポリヌクレオチドワクチン製剤を皮内経路で液体噴 射投与器具を用いて投与する予防接種方法にある。ワクチンの投与は一定量の製 剤を１回または複数回の伝達により行われる。同様に１回または複数回の予防接 種を時間を分散して試みることもできる。 本発明の予防接種方法では投与器具に関する上記データが考慮できる。 以下、添付図面を参照して、発明の実施例を詳細に説明するが、本発明が下記 実施例に限定されるものではない。 図１はｈＣＭＶプロモーターの制御下でＢＲＳＶウイルスＧ遺伝子を含む、こ のウイルスに対するウシの予防接種のためのプラスミドを示す図。 図２は日数をｘ軸に、感染価をｙ軸にした、筋肉内ＩＭ経路（ウシ１３４９） および皮内ＩＤ経路（ウシ１３５２と１３５３）でのＢＲＳＶウイルスに対する 予防接種の効果を比較したグラフ。 ＢＲＳＶの合成Ｇ遺伝子の生成 ウシの呼吸器合胞体ウイルスはパラミキソウイルス科のニューモウイルスであ り、細胞質中で複製し、負の方向の単鎖のゲノムＲＮＡを有する被覆されたウイ ルスである。ＢＲＳＶゲノムは２つの主要な膜貫通糖タンパク質、融合タンパク 質Ｆと接着タンパク質Ｇをコードする。 Ｇ遺伝子の合成変換はこの遺伝子または潜在的なスプライシングシグナルを除 去することで生成した（G．Keil，Federal Research Center for Virus Germany） Ｇ遺伝子をコードする領域はLerch達によって決定されている（Journal of Vi rology，1990，64，5559-5569）。 コード領域は２５７アミノ酸と１１型膜貫通糖タンパク質に対応し、２５アミ ノ酸の膜貫通ドメインに続く４０アミノ酸のＮ‐末端細胞質ドメインを有する。 残り、すなわち１９２のＣ‐末端のアミノ酸はＧタンパク質の細胞外領域を形成 する。Lerch達が発見した全く同様の、ただし潜在的スプライシングシグナルの 無い２５７のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮ Ａ配列を合成した。２５７のアミノ酸の配列をこのようなアミノ酸配列をコード する可能性のある全てのＤＮＡに逆翻訳する。これは、スイス、ジュネーブ大学 のA．BairochによるＰＣＧｅｎｅのタンパク質配列ＲＴＲＡＮＳの逆翻訳プログ ラム（IntelliGenetics Inc.）を用いて実施する。潜在的スプライシング部位は "信号"核酸分析プログラムを用いて定める。このプログラムはStaden重み付けマ トリクス法（Staden weighted matrix method）（1984，Nucleic Acids Researc h 12，505-519）に基づく。このプログラムは潜在的ドナースプライシング部位 （イントロン／エクソン境界）と潜在的アクセプタースプライシング部位（エク ソン／イントロン境界）を認識する。こうした配列データを用いて、タンパク質 の容量を変えずに全ての潜在的な強力スプライシングシグナルを変異させること ができる。特にイントロンの５'末端を形成することができるＧＴジヌクレオチ ドとイントロンの３'末端を形成することができるＡＧジヌクレオチドは可能な ときに除去する。 Ｇをコードする適切なヌクレオチド配列を合成するため、完全配列の２つのス トランドを被覆する約１００の残留物のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機（例 えばPerkin Elmer/Applied Biosystems 381A DNA合成機；市販のオリゴヌクレオ チドを用いることもできる）を用いて合成した。相補的オリゴヌクレオチドは２ 重ストランドの断片を形成するためハイブリッド合成し、ｐＵＣ１８またはｐＵ Ｃ１９のような原核ベクターにクローン化する。適切な酵素制限部位を用いて、 クローン化したＤＮＡ断片を標準クローニング法を用いた正しい順序に連結させ る。（サンブルック他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd edition ，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York 1989）配列 が正しいことを確認するため標準配列法（サンブルック他）を用いて、そこから 生じるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を定める。 ｈＣＭＶプロモーターの後ろのＧ遺伝子を含む真核生物の発現ベクターの製造 発現を確かにするため、合成Ｇ遺伝子をベクターにクローン化した。この予備 試験では、実験室ですぐに使用できるベクター、すなわち真核生物発現ベクター １７５ｈＣＭＶを用いた。このプラスミドベクターはＬａｍと称されるオランダ ＢＨＶ１菌株からのＥ糖タンパク質と起点において隣接するＢＨＶＩウイルスに 由来する２つの断片を含む（ハVan Engelenburg他、1994，Journal of General V irology 75，2311-2318）。左側に隣接する断片（Cterm gI）はgI糖タンパク質 のオープンリーディングフレームに位置するPstI部位から始まり、ｇＥ遺伝子の オープンリーディングフレームの開始点から１７ヌクレオチド分上流のBstBi（ またはAsuII）部位で終わる。右側に隣接する断片はｇＥオープンリーデイング フレームの停止コドンのレベルに位置するEcoNI部位から始まり、末端反復（Ｔ ｒ）断片の第一SmaI部位上流のレベルで終わる。この断片はＵＳ９遺伝子をコー ドする。この断片は:ＵＳ９とＴＲで表す。これら２つの断片はｐＵＣ１８のPst I部位とEcoRI部位（平滑末端）にクローン化した。BstBI部位とEcoNI部位の間で 、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーター（ｈＣＭＶ‐Ｐ）の最大部分を含 む７２０ｂｐのAseI断片（平滑末端）をポリリンカー領域でクローン化し、ポリ アデニレーション信号（Poly A）で終了した。合成Ｇ遺伝子はこのポリリンカー 領域のSmaI部位内部を示す方向にクローン化する。獲得したプラスミドをＰＲ６ ０８とする（図１参照）。 プラスミドＰＲ６０８からのＧのインビトロ発現の制御 プラスミドＰＲ６０８がＧタンパク質を発現できるかどうかを試験するため、 過渡発現試験を実施した。この試験のため、プラスミドＰＲ６０８からの精製し たＤＮＡ１．５μｇを培地中のウシ胎児の気管細胞（ＥＢＴｒ）の単層に形質移 入した。これらのＥＢＴｒ細胞はイーグルの最少必須培地中で１０％のウシ胎児 血清（Integro）と抗生物質［１ｍｌにつき、１２５ＩＵのペニシリン（Gist-Br ocades）と１２５μｇのストレプトマイシン（Biochemie）と３７．５ＩＵのニ スタチン（Sigma）と３７．５μｇのカナマイシン（Sigma）］を培養した。形質 移入は、F．L．グラハムとA．J．van der Eb（1973，Virology 52，456-467）に よる標準リン酸カルシウム沈殿法に従って実施した。形質移入後、プラスミドＤ ＮＡを形質移入した細胞の核に輸送し、コード化したタンパク質を宿主細胞の機 構を用いて発現させる。通常、形質移入した単層の細胞の０．０１％ ０．１％ のみがＤＮＡを内部移行させコード化した遺伝子を発現する。 ポリヌクレオチド予防接種のためのＤＮＡの生成 プラスミドＰＲ６０８のＤＮＡは、グリセロール、プラスミドＰＲ６０８を含 むＤＨ５アルファＦ細胞中の大腸菌K12のストック１００μｌをバクテリアの成 長のための標準培地であるＬＢ溶媒２リットルに添加して生成した。この２リッ トルの培地は３７℃で２０時間保温し、増幅した細胞は２５０ｍｌフラスコと最 高速度のＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ‐８Ｒ遠心機を用いて培養した。プラスミドＰＲ ６０８のＤＮＡは、サンブルック達が記載したようにBirnboinとDolyの標準アル カリ法に従ってペレットの細胞から単離した（1989，Molecular Cloning，a Pre ss Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press）。単 離したプラスミドＤＮＡは次にTE（１０ｍＭのトリスと１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐｈ ７．４）２０ｍｌ中で溶解し、電気泳動法を受けてＤＮＡ濃度を決定し、ＤＮＡ の質を査定した。２リットルの通常培地からはプラスミドを４０ｍｇ単離するこ とができる；プラスミドＰＲ６０８の約６０％がスーパーコイルの状態で、約３ ０％が緩やかな循環の状態で見られる。 プラスミド生成物は‐２０℃で保存する。プラスミドＤＮＡＰＲ６０８の塗布 前にＤＮＡ溶液は１×ＰＢＳおよびＴＥ中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈する。この バッファーＤＮＡ溶液はPigjet器具を設置した１０ｍｌフラスコにピペットで移 し、１から２時間以内に使用するように４℃で保存する。 ピジェ（Pigjet）投与器具 Pigjet型の携帯型投与器具はハンドルを備えるケーシングと、０．２ｍｌの目 盛の付いた容器と、通常はバネによって容器内の正常位置に維持されたピストン とを含む。 この器具はさらに、較正済みの５つのノズルを有する１つのヘッドと、不純物 の注射を防ぐためのろ過装置とを含む。ノズルは互いに少し離れている。ノズル の吐出部における噴射圧は１つのノズルのPigjetに対して１００バールに設定す ることができる。 適切な手段でバネを圧縮してピストンを動かし、ケーシングに設けた適切な貯 蔵器またはバイアルからワクチン製剤を吸引する。バネを放すと、ピストンが戻 り、ノズルを通して製剤が放出される。 予防接種と負荷試験 特定の病原性生物のない４匹の子ウシを帝王切開で得て、初乳を与えず、単独 で育成した。子ウシは生後６週間から１週間に６回ワクチンを接種した。２匹は ノズルが１つのPigjet（Endoscoptic，Laons，France）を用いて皮内経路で、も う２匹は２５ゲージ針を用いて筋肉内経路で予防接種をした。Pigjetはヘッドが 皮膚に接触し、垂直になるように利用し、ワクチンの噴射が皮膚に直角方向にな るようにした。各予防接種液はＰＢＳリン酸緩衝液１ml中に５００μｇのプラス ミドＤＮＡからなる。皮内経路の予防接種液は０．２ｍｌを後肢の皮膚に５回注 射し、筋肉内経路では臀部の筋肉に１回注射した。皮膚は予防接種前に剃った。 下記表１に見られる抗体価が得られた: １）０、１、２、３、４、５週に予防接種 ２）６週に負荷 ３）０から８週に抗体価を測定 （注）ａ:このウシは予防接種とは無関係な健康障害が現れたため犠牲にした 。 ＤＮＡ注射後３週間の終わりにＩＤ経路で予防接種した動物に抗体の出現が見 られ、４週目からは高い抗体価が見られ、プラトーになった。 子ウシは次いで感染性ＢＲＳＶウイルスで負荷を与えた。ウイルスの接種は、 １回目の予防接種から６週間後に、Odijkウイルス菌株を各鼻孔に１ｍｌ（10^3.8 ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ）ずつ鼻孔内に滴下注入して実施した。 予防接種の効果を推定するため、鼻咽頭スワブ（ｓｗ）上や肺洗浄液（Ｌａｖ ）中の感染価ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌで、感染後１２日までウイルスの排出を測定した 。（図２） 皮内経路で液体噴射により投与したＢＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするプラ スミドがこのウイルスの病原性の負荷に対して防御することを立証することがで きた。１つ孔の放出ヘッドを有する投与器具を用いて皮内予防接種をすることに より、Ｇタンパク質に対する高い抗体価を素早く誘導する。これは筋肉内予防接 種では見られなかった。さらに肺洗浄液中や鼻咽頭スワブ中の感染性ＢＲＳＶウ イルス価は、筋肉内経路で予防接種した子ウシでは高く、皮内経路で予防接種し た子ウシでは実質的に無かった。医学的兆候は弱く、動物間で懸著な違いも無か った。 Pigjetを用いた時には、金微粒子の場合に引き起こされる組織の予備炎症が実 際に必要ないため、非常に高い安全性も見られた。 さらに注目すべきころは、普通はあまり免疫源性でないＧタンパク質の防御を 獲得したこと（P．L．コリンズ:The Paramyxoviruses，1991，Ed．D．W．Kingsb ury，New York，Plenum Press）と、皮内予防接種後に得られた高い抗体価が自 然感染またはテストした生ワクチンの予防接種後に得たものに匹敵することであ る。 本発明はさらに、上記ワクチン製剤の製造方法にも関するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/265 Ａ６１Ｋ 39/265 Ａ６１Ｐ 31/14 Ａ６１Ｐ 31/14 31/22 31/22 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，Ｋ Ｚ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ， ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シュリヴェル，レムコ，シーベルン オランダ国 3722 ヤー ハー ビルトフ ェン パルツェルベグ 54 (72)発明者 バン オイショ，ヨハンナ，テオドラス オランダ国 8212 アー エヌ ルリスタ ッド オストランドパルク 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １. ウシの病原物質の免疫源をコードするＤＮＡ配列と、皮膚の細胞中でイン ビボでこの免疫源を発現させるプロモータとを組み合わせた、皮内経路で有効な 量のプラスミドを含む、液体ジェット投与装置を用いた皮内投与用の、ウシ用の ポリヌクレオチドワクチン製剤。 ２. プラスミドが皮内経路に適した媒体中に0.1から0.9ｍｌ、好ましくは0.2か ら0.6ｍｌ、さらに好ましくは0.4から0.5ｍｌの投与量で存在し、液体ジェット により皮内経路で投与される、請求項１に記載のワクチン製剤。 ３. プラスミドがワクチン製剤中に10ｎｇから１ｍｇ、好ましくは100ｎｇから 500μｇ、さらに好ましくは0.5μから50μｇの皮内で有効な量で存在する請求項 １または２に記載のワクチン製剤。 ４. ＤＮＡ配列がＢＲＳＶウイルス、ＩＢＲウイルス、ＢＶＤウイルスおよび ＰＩ３ウイルスよりなる群の中から選択される病原物質の免疫源をコードする請 求項３に記載のワクチン製剤。 ５. ＤＮＡ配列がＩＢＲウイルスのｇＢ遺伝子および／またはｇＤ遺伝子をコ ードする請求項４に記載のワクチン製剤。 ６. ＤＮＡ配列がＢＲＳＶウイルスのＧ遺伝子および／またはＦ遺伝子をコー ドする請求項４に記載のワクチン製剤。 ７. ＤＮＡ配列がＢＶＤウイルスのＥ２遺伝子および／またはＥ１遺伝子をコ ードする請求項４に記載のワクチン製剤。 ８. ＤＮＡ配列がＰＩ３ウイルスのＨＮ遺伝子および／またはＦ遺伝子をコー ドする請求項４に記載のワクチン製剤。 ９. プロモータがｈＣＭＶＩＥプロモータのような強力な真核生物プロモータ である請求項１から８のいずれか一項に記載のワクチン製剤。 10. 皮内液体噴射投与器具、好ましくはPigjetの器具に合った複数の投与バイ アル内に収容された請求項１から９のいずれか一項に記載のワクチン製剤。 11. ワクチン製剤の投与量を皮内経路で伝達する液体噴射投与器具と、請求項 １から１０のいずれか一項に記載のワクチン製剤を数回分の投与量で含む適当な バイアルとで構成される携帯型ウシワクチンユニット。 12. 液体噴射投与器具が１から１０個、特に４から６個、好ましくは５または ６個のノズルを有する注射ヘッドを含む請求項１１に記載の装置。 13. ウシの免疫源をコードするＤＮＡ配列とこの型の免疫源を発現させるプロ モータを組み合わせるプラスミドの、液体噴射投与器具を用いた皮内投与に適し たポリヌクレオチドワクチン製剤の製造での使用。 14. 10ｎｇから１ｍｇ、好ましくは100ｎｇから500μｇ、さらに好ましくは0.5 μから50μｇのＤＮＡを、投与量0.1から0.9ｍｌ、好ましくは0.2から0.6ｍｌ、 さらに好ましくは0.4から0.5ｍｌで含む請求項１３に記載の使用。 15. ＤＮＡ配列がＢＲＳＶウイルス、ＩＢＲウイルス、ＢＶＤウイルスおよび ＰＩ３ウイルスよりなる群の中から選択される病原物質の免疫源をコードする請 求項１２に記載の使用。