JP2000516095A - ウィルス増殖のための不死化細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は一次ニワトリ胚繊維芽細胞からの不死化細胞系の製造及び利用に関する。これらの細胞はウィルス繁殖、組換タンパク質発現及び組換ウィルス製造のための基材として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス増殖のための不死化細胞系 発明の分野 本発明は細胞生物学及びウィルス学の分野に関する。詳しくは、本発明はウィ ルス繁殖のための不死化細胞の利用に関する。 発明の背景 1931年において、Alice Miles Woodruff及びErnest Goodpastureはウィルスを 培養するための新しい方法を紹介した。彼らはフォウル・ポックスのウィルスが 発達中のヒヨコの胚の漿尿膜上で増殖できうることを報告した。ウィルスを含む 損傷がウィルス接種を経た膜上に認められた。卵は、初期のウィルス研究のため の基材であった動物と比べ、比較的安価であり、且つ入手し易い。卵は様々なウ ィルスによる感染に対して感受性であり、且つ管理された安定な環境の中に保つ ことができる様々な細胞及び膜を有する。ヒヨコの胚は幾多のウィルスに対して 感受性である様々な細胞を簡単に供与することでウィルス学の発達に対する重要 な途を寄与する。 卵は様々なウィルス株の複製を支持するが、卵を感染させる及びウィルス増殖 を維持するための方法は時間がかかり、且つめんどうである。例えば、漿尿膜接 種のためには、まず卵の殻及び殻膜に穴を開ける。殻に気嚢の上で穴を設け、空 気が殻膜と漿尿膜との間に入り込むようにし、サンプルを載せる人工的な気嚢を 設ける。サンプルは絨毛性上皮と接触し、そしてウィルスはこの膜の上で損傷と して増殖する。驚くべきことでなく、ウィルス複製のための卵の利用は細胞培養 技術の到来と共に消えた。 様々な細胞をin vitroで増殖させることができる。細胞培養物は卵と比べて維 持し易く、そして高度に管理された環境の中に保つことができる。しかしながら 、培養細胞の中でよりも胚入り卵細胞の中での方が良く増殖すると認められるウ ィルス株がまだある。更に、多くの培養細胞系は感染性因子、例えばマイクロプ ラズマ、低レベルの細菌夾雑物、内因性ウィルス等を担持する。ウィルス複製を 支持するのに最も効率的であるいくつかの細胞タイプは、その細胞が内因性ウィ ルスを含む点でウィルスストック製造に関する問題を抱えている。内因性ウィル スは低レベルで複製するか、又は細胞が第二ウィルス株で感染されたときに活性 化されうる。例えば、げっ歯類細胞は内因性ウィルスを担持することで知られ、 そして培養物中のげっ歯類細胞の電子顕微鏡観察は往々にして細胞内での同定可 能なウィルス粒子の存在を示している。汚染された細胞系は商業的な生きた又は 不活性ワクチンのための基材として利用することができない。 いくつかのウィルスにとって、ウィルス複製のための選定の手段は胚ニワトリ (embryonated chicken)である。例えば、ヒトインフレンザウィルス、ラビエス 、犬のジステンパーウィルス、Marek病ウィルス、レオウィルス及びフォウル・ ポックス・ウィルスが、卵が高力価ウィルスストック増殖を支持することを理由 に胚入り卵又は胚入り卵から誘導された一次細胞の中で優先的に増殖するウィル スである。その他のケースでも、ウィルスは卵の中で増殖されており、なぜなら 承認可能な無ウィルス細胞基材のニーズがあるからである。 一次細胞培養物は完全組織から単離されたばかりの細胞の培養物である。これ らの細胞は往々にして良好な無ウィルス材料の起源であり、そしてウィルス複製 のための宿主細胞として良く適する。一 次細胞はウィルスの複製において常に効率的であるものではなく、そして一次動 物細胞は限られた培養寿命を示し、事実上老衰する。老衰では、細胞は分裂する のを止め、やがて死ぬ。培養において細胞が経時的に分裂する能力はいくつかの パラメーター、例えば細胞の起源の種及び細胞を培養する時の組織の年令に依存 する。老衰にかかっている細胞は培養物の中に長時間維持されることができず、 それ故ウィルスストックの増殖のための再現性ある宿主とはならない。 いくつかの一次細胞は老衰を逃避し、そして不死となる能力を獲得する。げっ 歯類細胞はかなり簡単に自発性不死化するが(Curatoloら、in vitro 20：597-60 1，1984)、正常ヒト及び鳥類細胞が自発性不死化できることはめったにない(Har veyら、Genes and Development ５：2375-2385，1991；Pereira-Smith，J．Cell Physiol 144：546-9，1990；SmithらScience 273：63-67，1996)。なぜ特定の 細胞集団が不死化を受けるかについて様々な理由がある。細胞は遺伝子突然変異 を誘導することで知られる因子に対する曝露を経て不死化されるように誘導され うる。ある者は老衰に関係する増殖の停止が不死化に優先し、そして増殖抑制遺 伝子を不活性化する現象が不死化をもたらしうるものと推定している(Pereira-S mithら、Proc．Natl．Acad．Sci.(USA)85：6042-6046，1988)。 不死化無ウィルス細胞の入手は一次動物組織培養物の利用を排除又は抑制でき うる。一次培養物は一般に細胞集団に適せず、そして往々にして汚染されている 。これらの培養物は往々にして商業用ワクチン製造のための規則要件に合致しな い。細胞の一次培養物はシルコドナビリデ(Circodnavirideae)(例えば、ニワト リ貧血ウィルス)又はエッグ・ドロップ・シンドローム・ウィルスで汚染されて いることがある。例えば、Marek病ワクチン（生きたウィルスワク チン）は家禽ワクチン化のためにアヒルの卵の中のウィルスストックとして増殖 できる。1976年において、ワクチンを受けたニワトリ群は、ワクチンストックを 汚染したものと信じられ、且つニワトリの中での増殖に適応したアヒルアデノウ ィルスにより引き起こされるエッグ・ドロップ・シンドロームの徴候を示した。 ワクチン産業において、製品の安定性、一貫性及び効能についての規定要件は 、卵を基礎とする一次細胞ワクチン基材を利用する現状の最良の代替として、業 者が細胞系を購入することへと導いている。安全性及び一貫性に対する関心は、 米国及びヨーロッパの双方におけるワクチン基材に関する基準環境の厳しさの高 まりに基づき、ヒト及び動物ワクチン製品の双方の製造業者にももたれている。 胚入り卵を代替するウィルス増殖のための適当な細胞の同定は、USGoverment Pr inciples for the Utilization and Care of Vertebrate Animals in Testing， Research，and Training and the Animal Welfare Act(7 U.S.C.§2131)の観点 でも好ましい。それはどのような状況においてもin vitro生物システムの如き方 法をin vivo動物モデルシステムの代わりに考慮すべきであると一部に記述して いる。動物ワクチン製品を作るためにウィルスを含まず、且つ外性ウィルス増殖 を支持する細胞のニーズがある。 発明の概要 本発明は自発性不死化ニワトリ繊維芽細胞の同定及び当該細胞系を得るための 方法に関する。詳しくは、本発明はブダペスト条約の規則及び条件下でATCCに寄 託した自発性不死化細胞系UMNSAH−DF１の特徴を有する一次ニワトリ胚繊維芽細 胞に由来する自発性不死化細胞に関する。更に、本発明はこのような細胞の培養 物及びウィルス複製を支持する不死化細胞系の不死化サブクローンに関する。 本発明の一の観点において、本発明の不死化細胞はウィルスを含み、そして別 の観点において、本発明の不死化細胞は細胞の中での組換タンパク質の発現を指 令することのできる少なくとも一つのベクターを含む。一の態様において、本発 明の細胞は組換タンパク質を発現し、そして本発明の別の観点において、本発明 の細胞の中に含まれている当該ベクターは組換ウィルスの少なくとも一部をコー ドする。別の態様において、当該ベクターはレトロウィルスベクターである。 本発明の別の観点において、下記の工程を含んで成るニワトリ胚繊維芽細胞か ら不死化細胞系を製造するための方法を開示する：培養物の中で一次ニワトリ胚 繊維芽細胞を増殖させる；この繊維芽細胞をそれらが細胞老衰するまで培養物の 中で継代する；当該細胞を細胞老衰中に約30％〜約60％の培養物集密度となるま で濃縮する；非老衰細胞のフォーカスを同定する；そして非老衰細胞を30継代よ り多くにわたり増殖させる。 本発明の別の観点において、下記の工程を含んで成る細胞の中でウィルスを増 殖させるための方法を開示する：培養物の中で一次ニワトリ胚繊維芽細胞に由来 する自発性不死化細胞系を増殖させる；このウィルスを細胞の中で複製させる； そしてこの細胞の中で複製したウィルスを回収する。 好適な態様の詳細な説明 現在、本質的に非ウィルス、非ウィルスタンパク質、又は非化学変換鳥類細胞 系は入手できない。一次細胞系はウィルスストック製品を連続生産するにはめん どうであり、そしてウィルス増殖のための非汚染リザーバーとして個別に確認さ れなければならない。本発明はイースト・ランシング・ライン(East Lansing Li ne)(ELL−Ｏ ）ニワトリ胚に由来する細胞を含むニワトリ胚繊維芽(CEF)細胞の不死化を開示 する。 本明細書の中で用いる語「不死化」とは、30継代よりも多く培養物の中で増殖 することができ、培養物中で約１〜約２日の倍化時間を維持し、そして約６ケ月 以上連続培養される非げっ歯類細胞をいう。鳥類細胞は一般に培養物の中で約20 〜約25回継代されたら不死化と考える。不死化細胞は形質転換細胞とは異なり、 それが密度依存性及び／又は増殖阻止（例えば接触阻害）される点で形質転換細 胞と区別される。形質転換細胞はソフトアガーの中で増殖でき、そして通常は実 験動物に注射されたときに腫瘍を形成できる。本発明の細胞はウィルス増殖又は 組換タンパク質もしくはウィルス発現のためのリザーバーとして、特に細胞が夾 雑ウィルス又はウィルスタンパク質を有しないことが重要な場合、有用である。 これらの細胞は細胞の老衰及び不死化の基本メカニズムを研究するためにも有用 である。 10日目のELL−Ｏ卵由来のニワトリ胚繊維芽(CEF)一次細胞は、10日目の胚の胚 トルソを採取し、その組織をミンチにかけ、そしてその細胞を培地の中に入れる ことにより得られる。受精卵は入手できるHy−Vac(Adel，Iowa)である。卵及び その産卵鳥はその供給者により鳥類インフレンザ（Ａ型）、鳥類レオウィルス、 鳥類アデノウィルス（Ｉ−III族）、鳥類脳脊髄炎ウィルス、フォウル・ポック ス・ウィルス、ニューキャッスルウィルス、パラミキソウィルス（２型）、マイ クロプラズマ、サルモネラ及びその他の家禽ストックに感染することで知られる 感染因子について陰性であることが承認されている。一次細胞の単離及び不死化 細胞の同定は実施例１に示す。 これらの細胞は、不死化系の発見時に特定されるものであり、な ぜなら、細胞老衰の効果を研究するために細胞集団を選定するからである。ヒト 及び鳥類細胞は組織培養条件下で最も不死化しにくい細胞の一部として知られる 。げっ歯類細胞とは異なり、正常ドナーからヒト又はヒヨコ繊維芽細胞を不死化 するための明確な報告はない(Smithら、Science 273：63-67，1996)。鳥類繊維 芽細胞において、未処理細胞は典型的には20〜25継代しか続かない。即ち、30回 の継代により、これらの鳥類細胞の一次培養物は死んでいる又は死ぬ。本発明に おいて開示のように、20継代に達するには、細胞を継代し、そして約12継代目〜 約20継代目で小さめのプレートに必要なだけ濃縮させる（実施例１参照）。より 急速に増殖する細胞のフォーカスが観察され、そしてこれらのフォーカスをクロ ーニングリング（Bellco Glass，Inc．Vineland，N．J.）を用いて単離し、そし て培地の中で増殖させる。 老衰は本明細書において、１日当り約0.5以下の集団倍化を有する細胞と定義 する。本発明にとって、不死化細胞は培養物の中で30回より多く継代され、１日 当り約0.6〜約1.2の集団倍化、そして好ましくは１日当り約0.7〜約1.0の集団倍 化の集団倍化速度（トリパンブルー排除を利用し、１日当りの総細胞計測数及び 生存細胞計測数により決定）で増殖し、しかも接触阻害、密度依存性及び正常細 胞形態学を示す細胞である。 実施例１に記載の通りにして最初に同定されたフォーカスから得た細胞は400 超の集団倍化及び160超の継代がされた。本明細書において用いる語フォーカス とは、その周囲の細胞の形態から区別できる形態学的に均質な細胞のクラスター を意味する。このような細胞のフォーカスは簡単に除去でき、そして更なる研究 のためにサブクローニングできる。本発明の細胞は22〜24hr毎に倍化し続ける。 これらの細胞の接触阻害され、逆転写酵素陰性であり（実施例２参 照）、密度依存式に休止し、異数性であり（油浸漬顕微鏡での染色体拡布分析に より観察すると、カリオタイプはジプロイド／テトラプロイドの混合物であり、 一部の細胞は染色体１の見かけ上の転移を示した）、そして1.1〜1.9×10⁵細胞 ／cm²の高プレーティング密度にまで増殖した。多核巨大細胞は観察されなかっ た。これらの細胞は均一な表現型を有した。これらの細胞はウィルス繁殖のため に重要である急速増殖の特徴的なパターンを維持した。 これらの細胞はソフトアガーアッセイにおけるその増殖能力の欠如により証明 される（実施例３参照）。更に、これらの細胞はニワトリの翼に注射したときに 腫瘍を生成しなかった（実施例４参照）。本発明の典型的な細胞をUMNSAH−DF１ 細胞であり、そしてブダペスト条約の規則及び条件下で1996年10月11日にアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）、12301 Parklawn Drive，Ro ckville Maryland，20852，受託番号CRL−12203で寄託されている。 本発明は培養物中の本発明の不死化ニワトリ胚繊維芽細胞及び本発明の不死化 細胞のサブクローンに関する。例えば、本発明の細胞は自発性不死化細胞と特定 される。これらの細胞は既知の無ウィルス、既知の化学夾雑物非含有産卵鳥（本 発明の起源である胚組織を産生するメンドリ）から得られ、そして本発明の細胞 を製造するのに用いた胚組織も化学夾雑物を含まず（即ち、既知の発癌物質又は げっ歯類細胞を形質転換することで知られるその他の因子）且つ既知のウィルス を含まない。本発明の不死化細胞を培養すると、細胞集団において変動し得るそ の他の生理学的パラメーターを選定するために細胞を更にサブクロ−ニングし、 しかも接触阻害及びウィルス感染症に対する感受性を維持することができる。 細胞をHV7（七面鳥ヘルペスウィルス）、鳥類ヘルペスウィルス （血清型III）、フォウル・ポックス・ウィルス及びレオウィルスを複製する能 力について試験した。細胞はシルコドナビリデ、ニワトリHSV血清型II又はその 他の様々なウィルスを複製する能力について試験でき、そしてトランスフェクシ ョンの基材として試験されうる。これらの細胞は鳥類及び非鳥類ウィルスの双方 を繁殖するために有用である。実施例５はHVT、フォウル・ポックス・ウィルス 及びレオウィルスについての方法を詳細する。これらの細胞はウィルス製造のた めの基材として有用であり、そして特にこれらの細胞はレトロウィルス製造のた めに有用であり、なぜならその細胞及びその産卵鳥（即ち、その母親）は検出可 能なレトロウィルス感染をもたないからである。これらの細胞は鳥類肉腫白血病 ウィルス及びラウス肉腫ウィルスの複製を支持できる。 ウィルスストックを製造するため、本発明の細胞を組織培養フラスコ、ローラ ーボトル、スピンカルチャー又は中空ファイバー反応器の中に播種することがで きる。ローラーボトルウィルス繁殖のためには、これらの細胞は約２〜５×10⁴ 個の細胞／cm²表面積で播種する。ウィルスストック増殖を開始させるための感 染多重度（感染性ウィルス粒子、対、細胞の比）はウィルス株に依存して変わる であろう。ウィルス学の当業者並びに特定のウィルス及びウィルス株の増殖にお ける当業者は感染多重度、温度、培地バリエーション等の標準的な操作を介し、 めんどうな実験をすることなくウィルスストック収量を最大にすることができる であろう。 感染性ウィルスストックを得るために感染後にウィルスを収穫するための方法 もウィルス株で変動する。エンベロープ付ウィルスはエンベロープのないウィル スよりもゆっくりと培養培地の外へと出ていく。ウィルスのストックは培養培地 のみから、又はコンディショニングした培地と共にプールした細胞リゼートから 得られうる。 溶解ウィルス（ウィルスが出ていく際に効率的に細胞も溶解するもの）に関し、 細胞塊を除去するには、軽い遠心段階後のコンディショニング培養培地（例えば 、ウィルスを含む消費培地）の回収で十分である。ここでも、多種多様なウィル ス株からのウィルスの回収及び保存のための方法は当業界において周知である。 当業界において公知の通り、細胞の培養物からウィルス増殖を定量するための 様々な方法がある。例えば、ヘルペスウィルス科の構成員及び細胞単層表層上に 細胞病理学フォーカスを生み出す様々なウィルスのウィルスストックカ価はプラ ークアッセイにより（プラーク形成単位／ml培養流体として又はプラーク形成単 位／ワクチン接種物のウィルス量の用量）又は組織培養感染用量−50（TCID₅₀） として容易に定量される。迅速溶解ウィルスは規定時間において培養物の50％に 感染することがでるウィルスストックの用量又は希釈率としてTCID₅₀により一層 良く定量される。ウィルスを増殖及び定量するための方法は当業界において公知 であり、そしてウィルス定量方法を教示するソースはFieldら（編）Fundamental Virology 1991，Raven Press，New York又はMandellら（編）Principles andPr actice of Infections Diseases，1985，John Wiley & Sons，New Yorkに見い出 せる。 ウィルス増殖を支持する他に、本発明の細胞は組換ウィルス、例えばレトロウ ィルス等を製造するためにも有用である。これらの細胞は組換タンパク質、例え ばウィルスタンパク質を製造するためも利用されうる。組換タンパク質をコード する核酸を真核細胞、例えば本発明の不死化細胞においてタンパク質の発現を指 令することのできる調節要素のコントロール下で核酸ベクターの中に組込むため の方法は当業界において周知である。発現ベクターは組換タンパク質の発現を指 令することのできる複製可能な核酸フラグメントであ る。レトロウィルスベクターを含む多くの発現ベクターが学会誌及び商業供給者 を介して当業界において入手できる。複製可能な発現ベクター成分には一般に、 限定することなく、下記の１又は複数のものが挙げられる：複製起点、１又は複 数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター要素、任意的なシグナル 配列及び転写終止配列。選択又はマーカー遺伝子は形質転換又はトランスフェク ション細胞の集団の同定を担うタンパク質をコードする。典型的な選択遺伝子は 抗生物質もしくはその他の要素に対する耐性を供する、栄養要求性欠陥を相補す る又は複合培地からは得られない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする 。 組換タンパク質をコードする核酸を有する発現ベクターを細胞の中にトランス フェクションし、そして本発明の不死化細胞における組換タンパク質の発現を指 令するのに利用される。このベクターは好ましくは鶏胚繊維芽細胞の中で発現で きる任意の組換タンパク質、例えば限定することなく、ウィルスタンパク質、例 えば逆転写酵素及び／又はウィルス構造タンパク質をコードしうる。細胞の中で 組換タンパク質を製造するためのベクターの例には腫瘍抑制タンパク質、又はウ ィルス構造タンパク質、例えばGivolらOncogene 11（12）：2609-2618，1995，G ivolらCell Growth & Differentiatioｎ 5（4）：419-429，1994，AkiyamaらVir ology 203 （2）：211-220，1994及びBoyerらOncogene 20：457-66，1993により 開示のものが挙げられる。 本発明の細胞は組換ウィルス、例えば限定することなく組換レトロウィルスを 発現する基材を担いうる。本発明の細胞は遺伝子治療等のために有用な遺伝子的 に操作されたウィルスのためのパッケージング細胞系を担いうるのに適する。パ ッケージング細胞系として特定の細胞系を利用するための構築体及び方法は当業 界において公 知である。例えば、Boerkoelら（Virology 195（2）：669-79,1993）はパッケー ジング細胞系として一次鶏胚繊維芽細胞を利用してウィルスをパッケージングす るための方法を開示する。これらと同じ方法を本発明の不死化細胞の中でウィル スをパッケージングするのに利用できうる。 ほとんどの鳥類細胞系及び全ての形質転換鳥類細胞、並びに事実上全てのマウ ス形質転換細胞系はウィルス夾雑物、例えば内因性ウィルスを含むか又はウィル スタンパク質を産生するため、それらはヒト又は動物ワクチンの製造に適さない 。これらの細胞は組換タンパク質を製造するために利用することはできず、なぜ なら内因性夾雑物は精製組換タンパク質調製品を汚染しうるからである。好都合 には、本発明の細胞はこのような問題の適当な代替物を供する。 本発明の細胞はその他の細胞からのウィルス増殖を支持する基材をも担うこと ができる。このようなその他の細胞には一次細胞又は培養細胞であって、他の細 胞の存在下、又は細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン 等の存在下で培養物の中で向上した増殖又は寿命を示すものが挙げられる。一の 態様において、細胞をウィルスと混合し、次いで本発明の細胞と好ましくは細胞 ：本発明の細胞の比において１：５の細胞〜約１：20の細胞、そしてより好まし くは約１：10（１個の細胞、対、10個の本発明の細胞）の比で混合する。この混 合細胞を培養物の中に入れる。第二の態様において、これらの細胞をウィルスと 混合し、そして組織培養表層に既に付着している本発明の不死化細胞の表層上に プレーティングする。本発明の細胞はその他の細胞のための支持体を担い、そし て本発明の範囲を限定することなく、本発明の細胞は増殖因子等、並びに細胞外 マトリックス成分等を、他の細胞を支持しながらそれらがウィルスを産生するよ うに供給することができる。実施例６は 細胞基材としての本発明の細胞の利用例を供する。 本明細書において引用する文献は全て本明細書に組入れている。本発明の特定 の態様を詳細に論じてきたが、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更、改 良等を本発明に施すことができる。 実施例１ 自発性ニワトリ繊維芽細胞系の樹立 ２ダースのELL−Ｏ卵をイースト・ランシングUSDA家禽ストックから注文した 。卵を無菌隔離インキュベーターの中で10日間インキュベーションし、そして一 次培養のために処理した。胚組織をトリプシン／EDTA溶液を用いて解離し、そし て10％の胎児牛血清(Gibco)、１％の抗生物質／抗真菌物質(Gibco)及び２mMのＬ −グルタミン(Gibco)を含むDMEM培地(GIBCO)の中にプレーティングした。この解 離細胞懸濁物を10％の胎児牛血清を含む50mLの遠沈管に集め、トリプシンを不活 性させ、そして700×ｇで10分遠心分離した。 細胞を36μｇ／mlのインスリン(Sigma)、1.6μｇ／mlのトランスフェリン（Si gma，St．Louis，MO）、２mMのＬ−グルタミン、10％の胎児牛血清、１％の抗生 物質／抗真菌物質溶液の入った10mlのダルベッコ改良イーグル培地の中に再懸濁 し、そして25cm²コーニング組織培養フラスコに分注し、そして５％のCO₂、95％ の大気の中で40.5℃でインキュベーションした。24時間のインキュベーション後 、培地を交換した。この一次培養物は上皮様細胞の中心及び放射状の繊維芽細胞 を有する莫大な外植片を含んだ。 培養物を集密となるまで増殖させ（５日）、そしてプレートからトリプシン／ EDTA溶液(PBS中の0.05％のトリプシン及び0.02％のエチレンジアミン四酢酸(EDT A))を用いて除去し、そして２回目の継代のために再プレーティングした。第二 継代目において、一部の細胞を50％のDMEM培地、12％のDMSO及び38％の胎児牛血 清を含むコン ディショニング培地の中で凍結した。これらの細胞を気相液体窒素の中で24hr凍 結し、次いで水性液体窒素に長期保存のため移し入れた。 第２継代（Ｐ２）の細胞を2.7×10⁴細胞／mlの播種密度で再プレーティングし た。これらの細胞を数ケ月継代培養した。培養した繊維芽細胞は８〜９継代にわ たり急速増殖し、次いで多量の細胞死を伴って遅くなり始めた。クリーゼ（cris es）の際、細胞をATV溶液（1000ml中、８ｇ／ｌのNaCl、0.4ｇのKC1、１ｇのデ キストロース、0.58ｇのNaHCO₃、0.5ｇのトリプシン(Difco １：250)、０.２ｇ のベルセン(ニナトリウム塩))を用いて継代した。細胞を36μｇ／mlのインスリ ン(Sigma)、1.6μｇ／mlのトランスフェリン(Sigma)、２mMのＬ−グルタミン、1 0％の胎児牛血清及び１％の抗生物質／抗真菌物質溶液の入ったダルベッコ改良 イーグル培地の中で増殖させた。大半の細胞が継代11（Ｐ11）で死んでいる又は 死ぬことに注目すべきである；しかしながら、わずかな細胞は健康な繊維芽細胞 であった。P11細胞を皿の上に４週間、３日毎に新鮮な培地を再供給しながら維 持した。一部の細胞を凍結し、そして残りの細胞は小面積にまで濃縮し、そして ２回目の継代培養のために十分に集密となるまで更に２週間増殖させた。P15で は、細胞は細胞形態学において一層均一なようであり、そして１日当り0.32集団 倍化速度で増殖した。Ｐ20では、集団倍化は１日当り約0.7〜約0.8集団倍化にま で増大した。この時点で細胞は非常に均一な形態を有すようである。細胞をUMNS AH／DF＃１とし、そして19ケ月にわたり連続培養されたものである。これらの細 胞は現在継代160である。Ｐ５由来の細胞を凍結し（上記の通り）、そして融解 した。サブクローニングした細胞を増殖させ、そしてこの方法の再現性を他のク ローンの同定を介して確認した。いくつかの更なるクローンがＰ11より 得られた。 実施例２ ウィルス夾雑物についての細胞試験 本発明の細胞を夾雑核酸フラグメントを同定するためにPCRを利用してウィル ス夾雑物について試験した。本発明の細胞が夾雑ウィルスを含むかどうかを決定 するために様々なウィルスに対する多種多様な市販検査キットがある。同様に、 ウィルス抗原を検査するための商業的に有用な検査法がある（例えば、商業的に 有用なELISAアッセイ等）。抗原は様々なウィルスに由来する。これらの検査は 当該培養物が夾雑ウィルスを含まないことを実証する日常の実験技術を利用する 。 一連の検査において、これらの細胞を逆転写酵素活性について検査した。急速 増殖培養物由来の１×10⁶個の細胞を４mlの培地において単離した。この培地を −80℃での数回の凍結融解にかけ、細胞を溶解させた。溶解細胞を有する培地を 10％のグリセロール勾配の上に積層した。この勾配物をSW40ローター（Beckman Instruments,Pal Alto，CA）を用い40,000rpmで60分遠心した。存在するなら、 ウィルス粒子はペレット化した。培地を捨て、そしてペレットを20μｌのNonide t P-40(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)の中に再懸濁させた。 エッペンドルフチューブを41℃に加熱した。５μｌのサンプルを45mMのトリス 、pH 7.8、２mMの２−βメルカプトエタノール、２mMの酢酸（第一）マンガン、 0.1％のTriton X−100、10μＭづつのdATP，dCTP，dGTP(Boehringer Mannheim B iochemical，Indianapolis，IN)、2.4μｇのポリＡ(Sigma)、60ngのプライマーd T 12−19(Pharmacia)、0.4μCi／反応の³Ｈチミジン三リン酸（15,000〜28,000 cpm/pmole活性、Amersham）を含む45μｌの逆転写酵素 カクテルに加えた。 この反応体を41℃で１時間インキュベーションした。陰性コントロールは５μ ｌのddH₂O及び45μｌのカクテルを使用した。２つの既知の陽性コントロールを このアッセイに含ませた。アッセイは１mlの10％のトリクロロ酢酸(TCA，Columb us Chemical Industries,Inc.，Columbus，WI)の添加により停止させた。この混 合物をWhatman GF／Ｃガラス0.45ミクロンプレフィルターで濾過した。５％のTC Aを用いて数回の洗浄を実施した。フィルターを５mlのシンチレーション計測液 を含むシンチレーションバイアルを利用するBeckman Instruments Scintillatio nカウンターに移した。サンプルを050〜600ウィンドー設定値を用いて計測した 。カクテルバックグランド（陰性コントロール）よりも３倍の計測値の上昇を陽 性と考えた。 一次培養物は本発明において用いた他の細胞と同じように陰性と検査された。 逆転写酵素アッセイについての更なる情報はCrittendenら、Virology 57：128-1 38，1974を参照のこと。 実施例３ 細胞の腫瘍原潜在性を評価するためのソフトアガロースコロニー形成アッセイ 腫瘍原潜在性について検査するため、細胞をソフトアガーの中での増殖につい て検査した。ソフトアガロースベースを、21.6mlの濃厚McCoy's５Ａ培地〔Gibco ；120mlの胎児牛血清（熱不活性化）、５mlのNaピルベート（2.2％ストック）、 １mlのＬ−セリン（21mg／mlストック）、５mlのＬ−グルタミン(200mMストック )、12.5mlのHepes(１Ｍストック)〕、5.9m1のアスパラギン(4.4mg／mlの無菌濾 過ストック）の中で12mlの２％のアガロース溶液（オートクレーブにかけ、56℃ に冷やしたもの）を混合することにより作った。 ７mlの温暖培地／アガロースを100mm²の組織培養皿に注ぎ、そして組織培養フッ ドの中で１hrかけて室温で固化させた。 活発に増殖する（約40〜約70％の集密度の）培養物から細胞をトリプシン処理 により除去し、10％の胎児牛血清（Ｌ−グルタミン及び抗生物質−抗真菌物質入 り）を含む新鮮DMEM培地中の単一細胞懸濁物を得た。約１×10⁶個の細胞を10％ の胎児牛血清、0.75mlの１％のアガロース及び50μ１の２β−メルカプトエタノ ールを含む4.2mlのDMEM培地に加えた。温暖培地／アガロースは細胞に添加され る前に確実に42℃である注意が要される。すばやく、５mlの上記細胞懸濁物をア ガロースプレートの上に積層した。 細胞を５％のCO₂及び95％の大気インキュベーターの中で37℃で増殖させ、そ して35日間観察した。プレートを２重で３ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテ トラゾリウムクロリド(INT染料)で染色し、そしてコロニー形成及び増殖につい て０，５，10，15，20，30及び35日目に検査した。60μｍより大きい染色された コロニーを全て陽性と考えた。 全ての細胞が陰性と検査された。ソフトアガーアッセイについての更なる情報 はHamburgerら、Prog．Clin．Biol．Res．48：ｐ43，135，179，1980から得られ る。 実施例４ 不死化細胞の腫瘍原性 ミネソタ大学の動物使用プロトコール（プロトコール＃95 0300−１、1995年 ３月〜1996年12月）に概略してある指針に従い、細胞を試験動物に注射し、細胞 が腫瘍原性であるか否かを調べた。 活発に増殖する細胞を細胞培養プレートから除去し、そして６羽のSPAFAS系成 鶏(Hy−Vac，Adel，Iowa)に注射した。４×10⁶個の毎週検査した。今日までに作製したどのトランスフェクション細胞（皮膚、心臓 及び筋肉）についても注射箇所において腫瘍は観察されず、そして動物は全て健 康を維持した。この実験は不死化細胞が腫瘍原性でないことを証明した。 実施例５ ウィルス増殖を支持する細胞の能力 細胞をローラーボトルの中に5.0×10⁵細胞／cm²で播種した。細胞を24時間か けて付着させ、そして細胞計測のためにコントロールを回収した。細胞をDMEM(4 .５ｇ／ｌのグルコース）、４％の胎児牛血清、２mMのＬ−グルタミン、50mg／ ｌのゲンタマイシンの中にウィルス感染のために増殖させた。細胞は細胞当り0. 0006 HVTウィルス粒子の感染多重度で感染させた。ローラーボトルをCPEの進行 について毎日検視した。ボトルを感染46hr後に回収し、そのときは約50％のCPE であった。HVT感染細胞を10％のDMSO入りの増殖培地の中で2.0×10⁷細胞／mlの 濃度で凍結した。HVTの力価はプラークアッセイにより定量した。ウィルスを増 殖培地の中で系列希釈し、そして許容細胞集密の単層の上に載せた。培養物を表 示時間インキュベーションし、そして細胞を固定し、そして染色した。単層上の プラークを計測し、そしてウィルスカ価を用量当りのプラーク形成単位として示 した。 これらの細胞をレオウィルス生産を支持するその能力について検査した。2.5 ×10⁸個の細胞を8.2TCID₅₀／mlの力価を有するレオウィルスのWSS−Reo 1733株 で感染させた。細胞は0.005，0.001又は0.0005感染性ウィルス粒子／細胞の感染 多重度で感染された。感染細胞をローラーボトルの中で増殖させ、そして注射の 48，64及び72時間後に検査し、そして多量のウィルス増殖が示された。 実施例６ 細胞基材としてのトランスフェクション皮膚細胞の利用 本発明の細胞は一次細胞のウィルス複製を支持するための基材として有用であ る。これらの実験において、不死化細胞を一次細胞と混合した。一の研究におい て、一次細胞を感染させ、そして当該不死化細胞と混合し、そして培養物の中に 入れる。別の研究においては、一次細胞を感染させ、そして不死化細胞の上に載 せる。この場合、不死化細胞は組織培養フラスコの中に菌叢として既に配置され ている。一の例において、ウィルスはエッグ・ドロップ・シンドローム・ウィル スであり、そして一次細胞は一次鶏胚肝細胞である。第二の例においては、一次 細胞が内皮細胞、好ましくは腎内皮細胞であり、そしてウィルスは感染性気管支 炎ウィルスである。一次細胞、対、不死化細胞の好適な比は約１：５〜約１：20 であり、そしてより好ましくは約１：10である。混合細胞集団の中で増殖する一 次細胞のウィルス力価は培養物中の単独の一次細胞の力価より高い。不死化細胞 は一次細胞が商業的条件下でのウィルス繁殖に利用されることを可能にする。 本発明は特定の態様に限定されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一次ニワトリ胚繊維芽細胞に由来する自発性不死化細胞系であって、UMNS AH−DF１細胞系の特徴を有し、且つアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョンに受託番号CRL−12203として寄託されている、細胞系。 ２．ウィルス複製を支持する、請求項１記載の不死化細胞系の培養物又は不死 化サブクローン。 ３．ウィルスを含む請求項１又は２記載の細胞。 ４．前記細胞の中での組換タンパク質の発現を指令することのできる少なくと も一つのベクターを含む、請求項１又は２記載の細胞。 ５．組換タンパク質を発現する、請求項４記載の細胞。 ６．前記ベクターが組換ウィルスの少なくとも一部をコードする、請求項４記 載の細胞。 ７．前記ベクターがレトロウィルスベクターである、請求項４記載の細胞。 ８．ニワトリ胚繊維芽細胞から不死化細胞系を製造するための方法であって、 下記の工程： 一次ニワトリ胚繊維芽細胞を培養物の中で増殖させる； この培養物中の繊維芽細胞をそれらが細胞老衰を開始するまで継代する； 細胞老衰中の細胞を約30％〜約60％の培養集密度が維持されるまで濃縮する； この培養物中の非老衰細胞のフォーカスを同定する； この非老衰細胞を単離する；そして この非老衰細胞を30回超の継代にわたり増殖させる； を含んで成る方法。 ９．ウィルスを増殖させるための方法であって、下記の工程： 請求項１記載の細胞を培養物の中で増殖させる； この細胞をウィルスで感染させる； このウィルスをこの細胞の中で複製させる；そして この細胞の中で複製したウィルスを回収する； を含んで成る方法。