JP2000516200A - ウシの呼吸病に対するポリヌクレオチドワクチン処方 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウシ呼吸病を予防するためのウシワクチン処方。この処方は少なくとも三つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含み、各ポリヌクレオチドワクチン結合価は、宿主細胞でインビボで発現が可能な一つのウシ呼吸病原体結合価の遺伝子を組込んたプラスミドを含む。各結合価はウシヘルペスウイルス、ウシ呼吸合胞体層ウイルス、粘膜病ウイルスおよび３型パラインフルエンザウイルスから成る群より選択され、上記プラスミドは、各結合価につき、ウシヘルペスウイルスについてはgBおよびgD、ウシ呼吸合胞体層ウイルスについてはＦおよびＧ、粘膜病ウイルスについてはE2、Ｃ＋E1＋E2およびE1＋E2、ならびに３型パラインフルエンザウイルスについては開およびHNから構成される群より選択される一つ以上の遺伝子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ウシの呼吸病に対するポリヌクレオチドワクチン処方 本発明は、ウシの呼吸病に対する予防接種用ワクチン処方と、それに対応する 予防接種方法に関するものである。 全てのウシは潜在的な病原体であるウイルスやバクテリアの保有者であり、そ の程度は広範である。 ウイルスは、特定の免疫が弱まり気道病変が起こると繁殖する。その後、これ らウイルスは、動物から排泄され、他の動物に伝染する。 関連するウイルスとしては、特に、中程度の固有病原性を持つ３型パラインフ ルエンザウイルス(PI-3)、高度の固有病原性を持つウシ呼吸合胞体層ウイルス(R SV)、ならびに、ウシの伝染性鼻気管炎（IBR）ウイルスとも呼ばれるウシヘルペ スウイルス（BHV）を挙げることができる。 それ以外に、特に、免疫抑制作用、ならびに生殖への有害作用が大きいウイル スが、粘膜病ウイルス、すなわちペスチウイルス（BVDV）である。 これらのウイルスは、一般に、第１段階の過温症、インフルエンザ症候群、な らびに呼吸障害を発症し、BVDの場合には、消化障害（下痢）を伴う。この段階 には、死に到る可能性のあるバクテリア（特にパスツレラ属）感染を引き起こす 気管支肺炎の兆候が現れる第２段階を伴う場合もある。この現象は、特に、VR2 感染もしくはPI-3によるマクロファージ感染によって起こる免疫抑制により悪化 する。また、BVDやBHVによる流産等、その他の症状が発現する場合もある。 従って、ウシの呼吸病に関する主な病原体に対する有効な予防対策を開発する 必要が生じてくる。 ウシの呼吸病の原因となるウイルスに対するワクチン処方については、すでに 提案されてきている。 これまでに開発された処方は、不活性化ワクチン、もしくは生ワクチン、なら びに場合に応じて、これらワクチンの混合物である。これらの開発には、結合価 間の適合性および安定性の問題がある。実際、特に、不活性化ワクチンおよび生 ワクチンを組み合わせて用いる場合に、使用した各種抗原と処方自体の二つの見 地から、異なる結合価間の適合性を達成することが必要である。また、組み合わ せたワクチンの保存、特に、補助薬の存在下での安全性の問題もある。これらワ クチンは一般にかなり高価である。 国際特許第WO-A-90,11092号、WO-A-93,19183号、WO-A-94,21797号、ならびにW O-A-95,20660号は、近年開発されたポリヌクレオチドワクチンの技術を利用して いる。これらワクチンが、宿主細胞において、プラスミドに挿入された抗原を発 現することができるプラスミドを使用することは周知である。また、あらゆる投 与経路が提案されている(腹腔内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、粘膜等)。また 、様々なワクチン接種手段を使用することができる。例えば、金の粒子表面にDN Aを付着させて放出し、動物の皮膚を通過させるもの（Tangら、ネイチャー、第3 56号、第152〜154頁、1992年）や、皮膚、筋肉、脂肪組織ならびに乳房組織に同 時にトランスフェクションすることを可能にする液体噴射式注射器（Furthら、 分析生化学、第205号、第365〜368頁、1992年）がある。 ポリヌクレオチドワクチンは、裸DNAと、例えば陽イオン脂質リポソーム内部 に配合されるDNAの両方を使用することができる。 G.J.M.コックスは、ウイルス学誌、第67巻、第９号、1993年９月、第5664〜56 67頁に１型ウシヘルペスに対するポリヌクレオチドワクチンの接種をすでに提案 している。また、著者らは、gI(gB)、gIII（gC）およびgIV（gD）遺伝子を組込 んだプラスミドを記載している。 「ワクチン」（第13巻、第４号、第415〜421頁、1995年）では、J.E.クロウエ が、呼吸合胞体層ウイルスおよび３型パラインフルエンザウイルスに対する各種 予防接種方法をおおまかに検証している。この検証では、現行の予防接種方法に より提供されるあらゆる可能性を再検討し、ポリヌクレオチド免疫処置法が、RS VおよびPI-3に対する免疫処置において、有益であり得るとの見解を示したにす ぎない。この文献では、プラスミド形成、ならびに、これらウイルスに対するウ シの予防接種の成果のいずれについても全く触れられていない。 本発明は、特に、ウシの呼吸病に関与する多数の病原ウイルスに対する予防接 種の達成を可能にする多価性ワクチンの処方を提供する。 本発明の別の目的は、異なる結合価を組み合わせるとともに、結合価同士の相 互適合性ならびに安定性に関して要求されるすべての基準を満たすワクチン処方 を提供することである。 本発明の別の目的は、同じ賦形剤において異なる結合価を組み合わせることが できるワクチン処方を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、使用が容易、かつ安価なワクチン使用を提供する ことである。 本発明のさらにまた別の目的は、高レベルの効力および長い持続期間を実現す ると共に、安全性に優れ、残留物のない多価性保護の獲得を可能にするワクチン 処方ならびにウシの予防接種方法を提供することである。 本発明は、少なくとも三つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含む特にウシ の呼吸病に対するワクチン処方であって、各ポリヌクレオチドワクチン結合価が 、一つのウシ病原体結合価の遺伝子を組込んだ、宿主細胞にインビボでそれを発 現するプラスミドを含み、これら結合価がウシヘルペスウイルス、ウシ呼吸合胞 体層ウイルス、粘膜病ウイルスおよび３型パラインフルエンザウイルスから成る 群から選択され、上記プラスミドが、各結合価につき、ウシヘルペスウイルスに ついてはgBおよびgD、ウシ呼吸合胞体層ウイルスについてはＦおよびＧ、粘膜病 ウイルスについてはＣ＋E1＋E2およびE1＋E2、ならびに３型パラインフルエンザ ウイルスについてはHNおよびＦから構成される群より選択される一つ以上の遺伝 子を含むことを特徴とするワクチン処方を提供する。 本発明における「結合価(valency)」とは、対象とする病原体のウイルスに対 する保護を達成する少なくとも一つの抗原を意味し、結合価は、準結合価として 、対象病原体の一つ以上の菌株からの一つ以上の改質または天然遺伝子を含んで いてもよい。 病原体遺伝子とは、完全な遺伝子だけではなく、保護反応を誘導する能力を維 持するフラグメントを含む様々なヌクレオチド配列を意味する。遺伝子の概念に は、実施例で詳細に記載した配列と均等なもの、すなわち、それぞれ違っていは いるが、同じタンパク質をコードする配列に相当するヌクレオチド配列が含まれ る。遺伝子の概念はまた、対象とする病原体の他の菌株のヌクレオチド配列を含 み、これは、一つの菌株または菌株群に特有の交差保護または保護をもたらす。 さらに、この概念は、宿主動物による生体内発現を容易にするために改質されて いるが、同じタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含んでいる。 好ましくは、本発明に従うワクチン処方は、四つの結合価を含む。 BHV結合価に関しては、異なるプラスミド、あるいは同一のプラスミドにおい て、gBおよびgDをコードする二つの遺伝子を使用するのが好ましい。あまり好ま しくはないが、場合によっては、これら遺伝子のいずれかを用いることも可能で ある。 RSV結合価に関しては、二つの異なるプラスミド、あるいは同一のプラスミド に組込まれる二つのＧおよびＦ遺伝子を使用するのが好ましい。あまり好ましく はないが、場合によっては、Ｆ遺伝子を単独で使用することもできる。 BHV結合価に関しては、E2遺伝子を組込んだプラスミドを使用するのが好まし い。あまり好ましくはないが、場合によっては、E1およびE2を共に、あるいは、 Ｃ、E1およびE2から成る組合せをコードするプラスミドを用いることもできる。 PI-3結合価に関しては、二つの異なるプラスミド、もしくは同一のプラスミド 中に、二つのHNおよびＦ遺伝子の組合せを使用するのが好ましい。HN遺伝子だけ を使用することも可能である。 本発明の好ましいワクチン処方は、BHVgBおよびgD遺伝子、RSVGおよびＦ遺伝 子、BHVE2遺伝子およびPI-3HNおよびＦ遺伝子の発現を含み、かつこれを達成す る。 本発明のワクチン処方は、0.1〜10ml、特に、１〜５mlの投与量として提供す ることができる。 この投与量は、各型のプラスミドにつき、一般に10ng〜1mg、好ましくは、100 ng〜50μｇ、さらに好ましくは、１μｇ〜250μｇとする。 好ましくは、一般に、生理的食塩水(0.9％NaCl)、超純水、TE緩衝剤等である ワクチン接種賦形剤に単純に装入された裸プラスミドを使用する。もちろん、従 来の技術に記載されているポリヌクレオチドワクチンの形態すべてを使用するこ とができる。 各プラスミドは、宿主細胞に、制御下で挿入された遺伝子の発現を達成するこ とができるプロモータを含む。これは、一般に、強力な真核プロモータ、特に、 ヒトまたはネズミ、あるいは場合に応じて、ラット、ブタおよびモルモットから 得られたサイトメガロウイルス早期CMV-IEプロモータである。 一般的に、プロモータはウイルスあるいは細胞のいずれかから得たものでよい 。CMV-IE以外のウイルス性プロモータとしては、SV40ウイルス早期または遅発性 プロモータ、あるいはラウスニワトリ肉腫ウイルスLTRプロモータを挙げること ができる。また、例えば遺伝子自体のプロモータ等、遺伝子の抽出源であるウイ ルスから得たプロモータでもよい。 細胞性プロモータとしては、細胞骨格遺伝子のプロモータ、例えば、デスミン プロモータ(ボルモントら、超顕微鏡的細胞学および病理学、1990年、第22号、 第117〜122頁;Zhenlinら、遺伝子、1989年、第78号、第243〜254頁)、あるいは 代替的に、アクチンプロモータを挙げることができる。 同じプラスミド中に数種の遺伝子が存在する場合には、これらは、同じ転写単 位、あるいは二つの異なる単位に提示することができる。 本発明による異なるワクチン結合価の組合せは、好ましくは、各結合価の抗原 を発現するポリヌクレオチドプラスミドを混合することによって達成することが できるが、数種の結合価の抗原が、同じプラスミドにより発現されるようにする ことも可能である。 本発明はまた、BRSV、BVDおよびPI-3から構成される群より選択されるウイル スの一つからの一つ以上の遺伝子をコードする一つ以上のプラスミドを含む一価 ワクチン処方を提供する。尚、これら遺伝子は、すでに記載されたものである。 一価性以外に、これら処方は、遺伝子の選択、遺伝子の組合せ、プラスミドの組 成、投与量等に関して上記の特徴を有していてもよい。 一価ワクチン処方は、(i)すでに述べた多価ワクチン処方の製造のために、(ii )それぞれ実際病状に対して、(iii)別の病気に対する別の種類のワクチン（生ま たは不活性化全、組換え、サブユニット）と組み合わせて、あるいは(iv)以下に 述べるワクチン用の追加免疫として、使用することができる。 また、本発明では、従来タイプの初期ワクチンすなわち生全ワクチン、不活性 化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択され た初期ワクチンを接種したウシに予防接種するためのワクチンを製造することを 目的として、本発明による一つ以上のプラスミドを使用する。この初期ワクチン は、プラスミドによってコードされた抗原、または、交差保護をもたらす抗原を 有する(すなわち、含む、あるいは、発現することができる)。 驚くべきことに、本発明のポリヌクレオチドワクチンには強力な追加免疫（ブ ースター）効果があり、これによって、免疫反応が増幅すると同時に、長期間持 続する免疫を獲得することができる。 一般に、初期接種ワクチンは、様々な動物用ワクチン製造者が市販しているワ クチンから選択することができる。 また、本発明は、前述の初期接種ワクチンと、追加免疫用の本発明によるワク チン処方とを一つにした予防接種キットを提供する。これはまた、前述の初期接 種用の追加免疫として本発明の処方の使用を指示する小冊子を含む本発明のワク チン処方に関する。 さらに、本発明は、前述のワクチン処方の有効投与量の投与を含む呼吸病に対 するウシの予防接種方法を提供する。この予防接種方法は、ワクチン処方の一回 分以上の投与量の投与を含み、これらの投与量を短い間隔で連続して、および／ または長い間隔を置いて連続して投与することが可能である。 本発明のワクチン処方は、この予防接種方法においては、ポリヌクレオチドワ クチン接種のための従来の技術で提案された様々な投与経路により、周知の投与 技術を用いて、投与することができる。 さらに、本発明は、前述の初期ワクチン接種と、本発明に従うワクチン処方に よる追加免疫を行うことから成る予防接種方法を提供する。 本発明による方法の好ましい態様では、第一に、動物に、従来の、特に不活性 化、生、弱毒化もしくは組換えタイプのワクチン、あるいは代替的に、サブユニ ットワクチンの有効量を投与して、第１回のワクチン接種を実施し、次に、好ま しくは２〜６週間後に、本発明に従う多価または一価ワクチンを投与する。 本発明はまた、ワクチン処方の製造、すなわち、本文の説明から明らかなよう に、異なる結合価およびこれらの混合物の製造方法に関する。 以下に、本発明の実施例、ならびに添付の図面を参照にしながら、本発明をさ らに詳しく説明することにする。 図面リスト 図１： プラスミドpVR1012 図２： BHV-1STgB遺伝子の配列 図３： プラスミドpPB156の構造 図４： プラスミドpAB087 図５： プラスミドpAB011 図６： プラスミドpAB012 図７： プラスミドpAB058 図８： プラスミドpAB059 図９： プラスミドpAB060 図10： プラスミドpAB071 図11： プラスミドpAB072 配列ID番号一覧 配列ID番号１：BHV-1gB遺伝子（ST株）の配列 配列ID番号２：オリゴヌクレオチドPB234 配列ID番号３：オリゴヌクレオチドPB235 配列ID番号４：オリゴヌクレオチドAB162 配列ID番号５：オリゴヌクレオチドAB163 配列ID番号６：オリゴヌクレオチドAB026 配列ID番号７：オリゴヌクレオチドAB027 配列ID番号８：オリゴヌクレオチドAB028 配列ID番号９：オリゴヌクレオチドAB029 配列ID番号10：オリゴヌクレオチドAB110 配列ID番号11：オリゴヌクレオチドAB111 配列ID番号12：オリゴヌクレオチドAB114 配列ID番号13：オリゴヌクレオチドAB115 配列ID番号14：オリゴヌクレオチドAB116 配列ID番号15：オリゴヌクレオチドAB117 配列ID番号16：オリゴヌクレオチドAB130 配列ID番号17：オリゴヌクレオチドAB131 配列ID番号18：オリゴヌクレオチドAB132 配列ID番号19：オリゴヌクレオチドAB133実施例１ ウイルスの培養 ウイルスを細胞変性効果が得られるまでウイルスに適した細胞系で培養する。 各ウイルスについて使用する細胞系は、当業者には公知のものである。簡単に言 えば、ウイルスをイーグルの最少必須培地（MEM培地）もしくは別の適した培地 で培養し、この使用したウイルスに感応する細胞に、感染多重度１を用いて、実 験対象のウイルス株を接種する。次に、感染した細胞を37℃で培養する。尚、培 養する時間は、細胞変性効果が現れるのに必要な時間（平均36時間）とする。実施例２ ウイルス遺伝子DNAの抽出 培養後、上澄みおよび分離した細胞を回収し、ウイルス懸濁液全体を＋４℃、 1000ｇで、10分間遠心分離にかけ、細胞の残屑を除去する。次に、＋４℃、400, 000ｇで１時間、超遠心分離にかけることにより、ウイルス粒子を回収し、ペレ ットを最小容量の緩衝剤（10mMトリス、1mMEDTA）に溶解させる。この濃縮ウイ ルス懸濁液を、硫酸ナトリウムドデシル（SDS)(0.5％最終）の存在下で、プロテ イナーゼＫ（100μｇ／ml最終）で処理する。次に、フェノール／クロロホルム 混合物を用いてウイルスDNAを抽出した後、２容量の無水エタノールで沈殿させ る。−20℃で一晩放置した後、DNAを＋４℃、10,000ｇで、15分間遠心分離にか ける。DNAペレットを乾燥し、最小容量の無菌超純水中に溶解させる。その後、 制限酵素を用いてこのDNAを消化することができる。実施例３ ウイルス遺伝子RNAの分離 当業者には公知の方法に従い、RNAウイルスを精製した。次に、P.Chromczynsk iおよびN.Sacchiにより記載された「チオシアン酸グアニジウム／フェノール− ク ロロホルム」抽出方法（分析生化学、1987年、第162号、第156〜159頁）を用い て、各ウイルスの遺伝子ウイルスRNAを分離した。実施例４ 分子生物学方法 J.サンブルックらにより記載された標準的分子生物学方法（分子クローニン グ：研究所便覧、第２版、ColdSpringHarbor研究所、ColdSpringHarbor、ニュー ヨーク、1989年）を用いて、すべてのプラスミド製造を実施した。「ジーンクリ ーン」キット(BIO101社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）を用いて、本発明に 使用したすべての制限フラグメントを分離した。実施例５ RT-PCR 法 特定のオリゴヌクレオチド（増幅したフラグメントのクローニングを容易にす るために５'末端に制限部位を含む）を合成して、これらオリゴヌクレオチドが 、増幅すべき遺伝子のコード領域を完全に覆うようにする(具体的な例を参照)。 標準的方法（J.サンブルックら、分子クローニング：研究所便覧、第２版、Cold SpringHarbor研究所、ColdSpringHarbor、ニューヨーク州、1989年）に従い、逆 転写（RT）反応およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施した。各RT-PCR反応 は、一対の特定アンプリマー（amplimer）を用いて、またテンプレートとして、 抽出したウイルス遺伝子RNAを採用して、実施した。増幅した補足DNAをフェノー ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出した後、制限酵 素で消化した。実施例６ プラスミドDVR1012 プラスミドpVR1012（図１）は、米国カリフォルニア州サンジエゴのバイカル 社から入手した。その製造については、J.Hartikkaらが記載している(ヒトの遺 伝子治療、1996年、第７号、第1205〜1217頁)。実施例７ プラスミドpPB156（BHV-1gB遺伝子）の製造 実施例２に記載した方法に従い、BHV-1ウシヘルペスウイルス（ST株）遺伝子D NA（Leung-TackP．ら、ウイルス学、1994年、第199号、第409〜421頁）を製造し 、BamHIを用いて消化する。精製後、予めBamHIで消化したベクターpBR322中で、 18kbpBamHI-BamHIフラグメントのクローニングを行って、プラスミドpIBR-4-Bam HI(22kbp)を得た。 次に、プラスミドpIBR-4-BamHIをSalIで消化し、BHV-1gBグリコタンパク質を コードする遺伝子（図２および配列ID番号１参照）を遊離する。このフラグメン トを、予めSalIで消化したベクターpBR322中でクローニングすることにより、プ ラスミドpIBR-6,6-SalI(10.9kbp)を得た。 プラスミドpIBR-6,6-SalIをNheIおよびBglIIで消化することにより、ウシヘル ペスウイルス（BHV-1）gBグリコタンパク質をコードする遺伝子を含む2676bpNhe I-BglIIフラグメント（フラグメントＡ）を遊離した。 ウシヘルペスウイルス（BHV-1）（ST株）からの遺伝子DNAと、下記オリゴヌク レオチド： を用いて、RT-PCR反応を実施することにより、BHV-1gBグリコタンパク質をコー ドする遺伝子の５'部分を分離した。精製後、153bpPCR生成物をSalIびNheIで消 化することにより、145bpSalI-NheIフラグメント（フラグメントＢ）を分離した 。 これらフラグメントＡおよびＢを共に、予めSalIおよびBamHIで消化したベク ターpVR1012（実施例６）で結紮することによって、プラスミドpPB156（7691bp ）を得た(図３)。実施例８ プラスミドpAB087（BHV-1gB遺伝子）の製造 実施例２に記載した方法で製造したウシヘルペスウイルス（BHV-1）(ST株)か らの遺伝子DNA（Leung-TackP.ら、ウイルス学、1994年、第199号、第409〜421頁 ）と、下記オリゴヌクレオチド： を用いて、PCR反応を実施することにより、ウシヘルペスウイルス（BHV-1）gDグ リコタンパク質をコードする遺伝子（遺伝子バンク受入れ番号:L26360）の５’ 部分を338bpPCRフラグメントとして増幅した。精製後、このフラグメントをPstI およびNheIで消化することにより、317bpPstI-NheIフラグメント（フラグメント Ａ）を分離した。 プラスミドpBHV001（P.Leung-Tackら、ウイルス学、1994年、第199号、第409 〜421頁）をNhelおよびStyIで消化することにより、BHV-1gDグリコタンパク質（ フラグメントＢ）をコードする遺伝子の３'部分を含む942bpフラグメントを遊離 する。 これらフラグメントＡおよびＢを共に、予めPstIおよびXbaIで消化したベクタ ーpVR1012（実施例６）と結紮することによって、プラスミドpAB087（6134bp） を得た(図４)。実施例９ プラスミドpAB011（BRSVF遺伝子）の製造 実施例３に記載した方法で製造したウシ呼吸合胞体層ウイルス（BRSV）(391-2 菌株)（R.ラーチら、ウイルス学誌、1991年、第181号、第118〜131頁）からの遺 伝子RNAと、下記オリゴヌクレオチド： とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 Ｆ融合グリコタンパク質（BRSVF）をコードする遺伝子を1734bpPCRフラグメント として分離した。精製後、このフラグメントをPstIおよびBamHIで消化すること により、1715bpPstI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予め PstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例６）と結紮して、プラスミ ドpAB011（6587bp）を得た(図５)。実施例10 プラスミドpAB012（BRSVG遺伝子）の製造 ウシ呼吸合胞体層ウイルス（BRSV）(391-2菌株)（R.ラーチら、ウイルス学誌 、1991年、第64号、第5559〜5569頁）からの遺伝子RNAと、下記オリゴヌクレオ チド： とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 Ｇタンパク質（BRSVG）をコードする遺伝子を780bpPCRフラグメントとして分離 した。精製後、このフラグメントをPstIおよびBamHIで消化することにより、763 bpPstI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予めPstIおよびBa mHIで消化したベクターpVR1012（実施例６）と結紮して、プラスミドpAB012（56 34bp）を得た(図６)。実施例11 プラスミドpAB058（BRSVC遺伝子）の製造 実施例３に記載した方法で製造したウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）(オ スロス株)(L．ド・ムールーズら、遺伝子ウイルス学誌、1993年、第74号、第1433 〜1438頁）からの遺伝子RNAと、下記オリゴヌクレオチド： とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 BVDVウイルスから、Ｃカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含む342bpフラ グメントを増幅した。精製後、このRT-PCR生成物をPstIおよびBamHIで消化する ことにより、324bpPstI-BamHIフラグメントを得た。 このフラグメントを、予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施 例６）と結紮して、プラスミドpAB058（5183bp）を得た(図７)。実施例12 プラスミドpAB059（BRSVE1遺伝子）の製造 ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）(オスロス株)（L．ド・ムールーズら、 遺伝子ウイルス学誌、1993年、第74号、第1433〜1438頁）からの遺伝子RNAと、 下記オリゴヌクレオチド： とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 BVDVウイルスE1タンパク質をコードする配列を1381bpPCRフラグメントとして分 離した。精製後、このフラグメントをSalIおよびBamHIで消化することにより、1 367bpSalI-BamHIフラグメントを得た。 このフラグメントを、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施 例６）と結紮して、プラスミドpAB059（6236bp）を得た(図８)。実施例13 プラスミドpAB060（BRSVE2遺伝子）の製造 ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）（オスロス株）（L.ド・ムールーズら、 遺伝子ウイルス学誌、1993年、第74号、第1433〜1438頁）からの遺伝子RNAと、 下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 BVDVウイルスE2タンパク質をコードする配列を1252bpPCRフラグメントとして分 離した。精製後、このフラグメントをSalIおよびBamHIで消化することにより、1 238bpSalI-BamHIフラグメントを得た。 このフラグメントを、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施 例６）と結紮して、プラスミドpAB060（6107bp）を得た(図９)。実施例14 プラスミドpAB071（BPIVHN遺伝子）の製造 ３型ウシパラインフルエンザウイルス（PI3=BPIV）からの遺伝子RNAと、下記 オリゴヌクレオチド： とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 BPIVHNグリコタンパク質をコードする遺伝子（1987年にH.シブタにより預けられ たHN遺伝子配列、遺伝子バンク配列受入れ番号:Y00115）を1737bpPCRフラグメン トとして分離した。精製後、このフラグメントをSalIおよびBamHIで消化するこ とにより、1725bpSalI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予 めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例６）と結紮して、プラス ミドpAB071（6593bp）を得た(図10)。実施例15 プラスミドpAB072（BPIVF遺伝子）の製造 ３型ウシパラインフルエンザウイルス（PI3=BPIV）からの遺伝子RNAと、下記 オリゴヌクレオチド： とを用いて、実施例５に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 BPIVFグリコタンパク質をコードする遺伝子（1987年にH.シブタにより預けられ たＦ遺伝子配列、遺伝子バンク配列受入れ番号:YOO115）を1641bpPCRフラグメン トとして分離した。精製後、このフラグメントをSalIおよびBamHIで消化するこ とにより、1629bpSalI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予 めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例６）と結紮して、プラス ミドpAB072（6497bp）を得た(図11)。実施例16 プラスミドの製造および精製 動物の予防接種を目的とするプラスミドを製造するためには、主にスーパーコ イル状をした精製プラスミドの懸濁液が得られる方法であれば、どんな方法を用 いてもよい。これらの方法は、当業者には公知である。特に、J.サンブルックら （分子クローニング：研究所便覧、第２版、ColdSpringHarbor研究所、ColdSpri ngHarbor、ニューヨーク州、1989年）により記載されたアルカリ溶解方法を挙げ ることができる。この方法では、臭化エチジウムの存在下で、所定の塩化セシウ ム勾配での超遠心分離を２回連続して行う。また、予防接種に使用することがで きるプラスミドを工業レベルで生産する方法を記載した特許出願PCTWO95/21250 号およびPCTW096/02658号を参照してもよい。ワクチン（実施例17参照）を製造 するためには、精製されたプラスミドを再懸濁し、保存に適した 高い濃度（＞2mg/ml)の溶液を得る。これを実施するために、超純水もしくはTE 緩衝剤（10mMトリス-HCl；1mMEDTA、pH8.0）のいずれかにおいて、プラスミドを 再懸濁する。実施例17 関連ワクチンの製造 関連ワクチンの製造に必要な各種プラスミドをまずそれらの濃縮溶液と混合す る(実施例16)。混合物は、各プラスミドの最終濃度が、各プラスミドの有効投与 量に相当するように製造する。ワクチンの最終濃度を調整するのに使用できる溶 液は、0.9％NaCl溶液、あるいはPBS緩衝剤のいずれでもよい。 また、リポソーム、陰イオン脂質のような特定の配合物をワクチン製造のため に使用することも可能である。実施例18 ウシの予防接種 各型のプラスミドにつき、100μｇ、250μｇもしくは500μｇの投与量のワク チンをウシに接種する。注射は、注射針を用いて、臀筋もしくは頚筋いずれかの 箇所において、筋肉内経路で行うことができる。この場合、投与するワクチン量 は、１〜５mlとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/22 Ａ６１Ｐ 31/22 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，Ｋ Ｚ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ， ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リヴィエール，ミシェル フランス国 69130 エキュリ シュマン デュ シャンスリエ 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも三つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含むウシ呼吸病に対 するウシのワクチン処方であって、各ポリヌクレオチドワクチン結合価が、一つ のウシ呼吸病原体結合価の遺伝子を組込んでそれを宿主細胞でインビボで内発現 するプラスミドを含み、各結合価がウシヘルペスウイルス、ウシ呼吸合胞体層ウ イルス、粘膜病ウイルスおよび３型パラインフルエンザウイルスから成る群より 選択され、上記プラスミドが、各結合価につき、ウシヘルペスウイルスについて はgBおよびgD、ウシ呼吸合胞体層ウイルスについてはＦおよびＧ、粘膜病ウイル スについてはE2、Ｃ＋E1＋E2およびE1＋E2、ならびに３型パラインフルエンザウ イルスについてはHNおよびＦから構成される群より選択される一つ以上の遺伝子 を含むことを特徴とするワクチン処方。 ２． 四つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含む請求項１に記載のワクチン 処方。 ３． 同じプラスミドまたは異なるプラスミドにおいてウシヘルペスウイルスgB およびgD遺伝子を含む請求項１または２に記載のワクチン処方。 ４． 同じプラスミド、あるいは異なるプラスミドにおいてウシ呼吸合胞体層ウ イルスＦおよびＧ遺伝子を含む請求項１または２に記載のワクチン処方。 ５．粘膜病ウイルスがE2遺伝子を含む請求項１または２に記載のワクチン処方。 ６． ３型パラインフルエンザウイルス結合価について、一つのプラスミドがHN 遺伝子を含むか、HNおよびＦをコードする全ての遺伝子を同じプラスミドまたは 異なるプラスミドに含む請求項１または２に記載のワクチン処方。 ７． 請求項１〜６のすべてに記載のワクチン処方。 ８． 10ng〜1mg、好ましくは100ng〜500μｇ、さらに好ましくは、１μｇ〜500 μｇの各プラスミドを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン処方。 ９． 生全ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワク チンから成る群より選択されたプラスミドによってコードされた抗原、または交 差保護をもたらす抗原を有する初期ワクチンを接種したウシに予防接種するため のワクチン製造を目的とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の一つ以上のプ ラスミドの使用。 10． 請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン処方と、生全ワクチン、不 活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択 されたワクチンとを一つにする予防接種キットであって、初期ワクチンがポリヌ クレオチドワクチンによってコードされた抗原または交差保護をもたらす抗原を 有し、初期ワクチンを初期予防接種として投与し、前記ワクチン処方を追加免疫 として投与することを特徴とするキット。 11． 初期ワクチンがポリヌクレオチドワクチンによってコードされた抗原、ま たは交差保護をもたらす抗原を有する、生全ワクチン、不活性化全ワクチン、サ ブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択された初期ワクチンの 追加免疫として請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン処方が使用可能で あることを記載した指示書を含むワクチン処方。