UA70914C2 - Вакцина для великої рогатої худоби проти респіраторних патологій, спосіб вакцинації та набір для вакцинації великої рогатої худоби - Google Patents

Abstract

Винахід стосується вакцини для великої рогатої худоби проти респіраторних патологій великої рогатої худоби, вказана вакцина включає плазміду, що містить одну або більше нуклеїнових кислот, що кодує F та/або G білок респіраторного синцитіального вірусу великої рогатої худоби, або вакцини, що додатково включає плазміду, що містить принаймні один ген іншого патогену великої рогатої худоби. Також винахід стосується способу та набору для вакцинації великої рогатої худоби.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується формули вакцини, яка дозволяє провести вакцинацію великої рогатої худоби, 2 зокрема, проти респіраторних патологій. Він також стосується відповідної методики вакцинації.

Велика рогата худоба є носієм потенційно патогенних вірусів і бактерій із різним ступенем патогенності.

Віруси можуть розмножуватися у випадку ослаблення специфічного імунітету і у випадку ушкоджень дихальних шляхів. Далі вони виділяються тваринами і можуть заражувати інших тварин.

Серед вірусів, які зустрічаються, можна, зокрема, назвати вірус парагрипу типу З (РІ-3), помірної власної 70 патогенності, респіраторний вірус сінцітія великої рогатої худоби (КМ) і бичачий вірус герпесу (ВНУ), називаний також вірусом інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (ІВК), високої власної патогенності.

Іншим вірусом, що заслуговує особливої уваги через свою роль імунодепресанта і несприятливого впливу на репродукцію, є вірус захворювання слизових оболонок, або пестивірус великої рогатої худоби (ВМОМ).

Ці віруси виявляються в цілому у первинній фазі підвищення температур, грипозного синдрому і дихательних 12 порушень, з порушеннями травлення (діареями) у випадку ВМО. Ця фаза може супроводжуватися вторинною фазою з виникненням бронхопневмоній, зв'язаних із бактеріальними інфекціями, зокрема, з такими як

РазіеигеїІа, які можуть призвести до смерті. Цей феномен особливо підсилюється придушенням імунної системи інфекцією ВМО або зараженням макрофагів вірусом РІ-3. Можуть проявитися і інші симптоми, такі як викидень плоду при ВМО і ВНУ.

Необхідно, отже, постаратися налагодити ефективний спосіб попередження респіраторних патологій великої рогатої худоби, які викликаються основними вірусами.

В минулому вже пропонувалися сполучення вакцин проти деяких вірусів, які викликають респіраторні патології великої рогатої худоби.

Такі сполучення, розроблені дотепер, були створені на основі інактивованих вакцин або живих вакцин, а с також на основі сумішей таких вакцин. Їх створення ставить проблеми сумісності валентності і стабільності. Ге)

Дійсно, необхідно забезпечити одночасно сумісність різних валентностей вакцин як у плані відмінності використовуваних антигенів, так і в плані самих таких складів, зокрема, при сполученні інактивованих вакцин і живих вакцин. Також виникають проблеми збереження таких комбінованих вакцин і їхньої нешкідливості, зокрема, у присутності добавок. Такі вакцини в цілому досить дорогі. З

У заявках УМО-А-90 11092, УУО-А-93 19183, М/О-А-94 21797 і МУО-А-95 20660 відображене використання «- недавно розробленої технології полінуклеотидних вакцин. Відомо, що в цих вакцинах використовують плазміду, здатну здійснювати в клітинах хазяїна експресію антигену, вмонтованого в цю плазміду. Були запропоновані всі о шляхи уведення (внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, черезшкірний, Га») внутрішньошкірний, крізь слизову і т.п.-). Також можуть бути використані різні засоби вакцинації, такі як ДНК, розміщена на поверхні частинок золота і яка наноситься таким чином, і щоб вона проникала в шкіру тварини - (Тапо та ін., Майте 356, 152-154, 1992) і рідкоструменний впорскувач, які дозволяють здійснити трасфекцію одночасно в шкіру, м'язи, жирову тканину і у тканини молочних залоз (ЕРигій та ін., Апаїуїса! Віоспетівігу, 205, 365-368, 1992). «

У полінуклеотидних вакцинах можуть використовуватися як неодягнуті ДНК, так і ДНК усередині ліпосом або З катіонних ліпідів. с О0.).М.СОХ вже пропонував полінуклеотидну вакцинацію проти бичачого вірусу герпесу типу 1 у У. ої

Із» Мігоіоду, том 67, Мо9, вересень 1993, 5664-5667. Авторами були описані, зокрема, плазміди, що несуть гени а (98), 9 (92) і Сім (95).

У "Массіпе", том 13 Мо4 415-421, 1995, У.Е. СКОМУЕ подає загальний огляд різних методик вакцинації проти респіраторного вірусу сінцітія і проти вірусу парагрипу типу 3. Цей огляд відображає усі можливості, які і надаються сучасною технікою вакцинації, і у ньому уточнюється тільки те, що технологія полінуклеотидної ав | імунізації може бути корисна в стратегії імунізації проти КМ і РІ-3. Ні плазмідні конструкції, ні результати вакцинації великої рогатої худоби проти цих вірусів у даному документі не описані. іш Задачею винаходу є, таким чином, створення формули полівалентної вакцини, яка дозволяє здійснити -к 70 вакцинацію проти деякого числа патогенних вірусів, які викликають, зокрема, респіраторні патології у великої рогатої худоби, і забезпечити, таким чином, ефективну вакцинацію проти цих патологій.

Т» Іншою метою винаходу є створення такої формули вакцини, що поєднує у собі різні валентності при збереженні всіх необхідних критеріїв взаємної сумісності і стабільності валентностей.

Іншою метою винаходу є створення такої формули вакцини, яка дозволяє сполучити різні валентності в 29 одному і тому ж носії.

ГФ) Іншою метою винаходу є створення такої вакцини, яка була б проста в застосуванні і була б недорогою.

Ще однією метою винаходу є створення такої формули вакцини і методики вакцинації великої рогатої худоби, о які дозволяють домогтися високоефективного і довгострокового полівалентного захисту, а також нешкідливості препарату і відсутність відходів. 60 Таким чином, об'єктом даного винаходу є формула вакцини, зокрема, проти респіраторних патології великої рогатої худоби, що включає, щонайменше, три валентності полінуклеотидних вакцин, кожна з яких включає плазміду, що містить (і яка забезпечує його експресію іп мімо в клітинах хазяїна) ген однієї валентності респіраторного патогену великої рогатої худоби, причому ці валентності вибирають з групи, яка подана бичачим вірусом герпесу, респіраторним вірусом сінцітія великої рогатої худоби, вірусом захворювання слизових бо оболонок і вірусом парагрипу типу 3, при цьому плазміди містять в собі, для кожної валентності, один або декілька генів, вибраних із групи, представленої ЗВ і 90 для бичачого вірусу герпесу, БЕ і б для респіраторного вірусу сінцітія великої рогатої худоби, Е2, СЯЕ1Е2 і Е14Е2 для вірусу захворювання слизових оболонок, НМ і Е для вірусу парагрипу типу 3. Під валентністю в даному винаході розуміють, щонайменше, один антиген, який забезпечує захист проти патогенного вірусу, причому валентність може містити в собі в якості підвалентності один або декілька природних або змінених генів одного або декількох штамів даного патогену.

Під геном патогенного агента розуміють не тільки повний ген, але і різні нуклеотидні послідовності, включаючи фрагменти, які зберігають здатність індукувати захисну відповідь. Поняття гена поширюється на нуклеотидні послідовності, еквівалентні в точності наведеним у прикладах, тобто на різні, але кодуючі один і 70 той же протеїн. Воно також поширюється на нуклеотидні послідовності інших штамів розглянутого патогену, що забезпечують перехресний захист або захист, специфічний для штаму або групи штамів. Воно також поширюється на нуклеотидні послідовності, змінені з метою полегшення експресії іп мімо в організмі тварина-хазяїна, але кодуючі той же протеїн.

Переважно, формула вакцини згідно з винаходом включає усі чотири валентності.

Щодо валентності ВНУ, краще використовувати обидва гени, які кодують ОВ і 90, у різних плазмідах або в одній плазміді. Можна також використовувати, що є менш бажаним, один або інший із цих генів.

Для валентності КЗМ переважно використовують, обидва гени с і Е, які вмонтовані у дві різні плазміду або в одну плазміди. Можна використовувати, що є менш бажаним, тільки ген Е.

Для валентності ВМО переважно використовують плазміду, яка включає ген Е2. Можна використовувати, що го є менш бажаним, плазміду, яка кодує ЕТі Е?2 або С, Е1 і Е2.

Для валентності РІ-3 переважно використовують обидва гени НМ і Е у двох різних плазмідах або в одній плазміде. Також можна використовувати тільки ген НМ.

Формула вакцини згідно з винаходом в її кращому варіанті забезпечує експресію вмонтованих у неї генів В і 90 (ВНУ), С і Е (БМ), Е2 (ВМО) і НМ ї К(РІ-3). с

Об'єм дози формули вакцини згідно з винаходом може складати від 0,1 до 1Омл, зокрема, від 1 до 5мл.

Доза складає, в цілому, від 1ТОнг до 1мг, переважно, від їООнг до 500мкг, ще краще від мкг до 25Омкг на (8) кожен тип плазміди.

Використовують, переважно, неодягнені плазміди, вміщені в носій, який вакцинує, такий як фізіологічний розчин (Масі 0,995), ультрачиста вода, буфер ТЕ і т.п. Можна, зрозуміло, використовувати будь-які форми «г зо полінуклеотидних вакцин, які описані в практиці минулого.

Кожна плазміда містить у собі промотор, який забезпечує експресію підпорядкованого йому гена в -- клітинах-хазяїв. Це може бути сильний еукаріотичний промотор і, зокрема, ранній промотор цитомегаловірусу Ге!

СМУ-РЕ, узятий від людини або від миші, або, можливо, від інших тварин, таких як пацюк, свиня, морська свинка.

У цілому промотор може мати як вірусне, так і клітинне походження. В якості вірусного промотору, крім о

СМУ-РЕ, можна назвати ранній або пізній промотор вірусу 5М40 або промотор ІТК вірусу саркоми Рауса. Це ї- може бути також промотор, який походить від того ж вірусу, від якого походить ген, наприклад, власний промотор даного гену.

В якості клітинного промотора можна назвати промотор гену цитоскелета, наприклад, промотор десміну (ВоІтопі і ін., доигпа! ої З!иртісгозсоріс Суїсіоду апа РаїйюіІоду, 1990, 22,117-122; ії ЯНЕМИІМ ї ін., Сепе, « 1989, 78, 243-254) або промотор актину. з с Якщо одна плазміда містить декілька генів, вони можуть знаходитися в одній одиниці транскрипції або в двох різних одиницях. ;» Комбінація різних валентностей вакцини згідно з винаходом може бути отримана, переважно, змішуванням полінуклеотидних плазмід, що забезпечують експресію одного або декількох антигенів кожної валентності, але

Можна також здійснити експресію антигенів декількох валентностей за допомогою однієї і тієї ж плазміди. -І Також об'єктом винаходу є формули одновалентної вакцини, які включають одну або декілька плазмід, кодуючих один або декілька генів одного з вірусів, вибраних з групи, представленої ВКМ, ВМО і РІ-3, при о цьому гени відповідають описаним вище. Не вважаючи їхнього одновалентного характеру, ці формули можуть

Ге) мати вищенаведені характеристики в плані вибору генів, їх комбінацій, композиції плазмід, об'ємів доз, доз і т.д.

Формули одновалентної вакцини можуть бути використані. - (І) для одержання формули полівалентної вакцини як вона описана вище, ї» (ІЇ) в індивідуальному порядку проти певної патології, (ПП) у сполученні з вакциною іншого типу (суцільною живою або інактивованою, рекомбінантною, субодиниці) проти іншої патології або (ІМ) як вакцини для повторного уведення після вакцини, описаної нижче.

Дійсно, ще одним об'єктом винаходу є застосування однієї або декількох плазмід згідно з винаходом для

Ф) одержання вакцини, яка призначена для вакцинації великої рогатої худоби, первинно вакцинованої першою, ка звичайною вакциною відомого типу, вибраною, зокрема, з групи, представленою суцільною живою вакциною, суцільною інактивованою вакциною, субодиничною вакциною, рекомбінантною вакциною, причому ця перша бо вакцина містить (або здійснює їх експресію) один або декілька антигенів, кодуємих однією або декількома використовуваними плазмідами, або антигенів, які забезпечують перехресний захист.

Заслуговує на увагу той факт, що полінуклеотидна вакцина справляє сильну дію в якості другої вакцини, яка проявляється в посиленні імунної відповіді і у встановленні довгострокового імунітету.

У цілому вакцини для первинної вакцинації можуть бути вибрані з вакцин, які випускаються для продажу 65 різними виробниками ветеринарних вакцин.

Також об'єктом винаходу є набір для вакцинації, у який входять вакцина для первинної вакцинації, як вона описана вище, і формула вакцини згідно з винаходом для вторинної вакцинації. Він (винахід) також відноситься до формули вакцини згідно з винаходом з прикладеною до неї інструкцією по застосуванню цієї формули при вторинній вакцинації після первинної вакцинації як вона описана вище.

Також об'єктом винаходу є методика вакцинації великої рогатої худоби проти респіраторних патологій, включаючи уведення формули ефективної вакцини, як вона описана вище. Ця методика вакцинації включає уведення однієї або декількох доз формули вакцини, причому ці дози можуть бути уведені послідовно за короткий проміжок часу та/або послідовно через тривалий проміжок часу.

Формули вакцини згідно з винаходом можуть бути уведені, у рамках даної методики вакцинації, різними 7/0 шляхами уведення, передбаченими для полінуклеотидної вакцинації, і за допомогою будь-якої відомої техніки уведення.

Також об'єктом винаходу є методика вакцинації, яка полягає в тому, що проводять первинну вакцинацію, як описано вище, і вторинну вакцинацію формулою вакцини згідно з винаходом.

Відповідно до кращої форми здійснення способу згідно з винаходом, спочатку тварині уводять ефективну /5 дозу вакцини класичного типу, зокрема, інактивованої, живої, ослабленої або рекомбінантної, або субодиничну вакцину, таким чином, щоб забезпечити первинну вакцинацію, і, переважно через 2-6 неділь, уводять полівалентну або одновалентну вакцину згідно з винаходом.

Винахід також стосується методики приготування формул вакцини, а саме одержання валентностей і їхніх сумішей, як випливає з даного опису.

Далі випливає більш детальний опис у способах здійснення винаходу, що обпирається на малюнки додатка.

Список Фігур

Фігура 1 Плазміда рмК 1012

Фігура 2 Послідовність гену ВНУ-Ї 57 98

Фігура З Конструкція плазміди рРРВ 156 сч

Фігура 4 Плазм іда рАВ 087

Фігура 5 Плазміда рАВ 011 і)

Фігура 6 Плазміда рАВ 012

Фігура 7 Плазміда рАВ 058

Фігура 8 Плазміда рАВ 059 «г зо Фігура 9 Плазміда рАВ 060

Фігура 10 Плазміда рАВ 071 --

Фігура 11 Плазміда рАВ 072 Ге!

Список послідовностей ЗЕО ІЮ Мо

ЗЕО ІЮ Мо1: Послідовність гену ВНУ-Ї 98 (штам 51) о

ЗЕО ІЮ Мо2: Олігонуклеотид РВ234 М

ЗЕО ІЮ Мо3: Олігонуклеотид РВ235

ЗЕО ІЮ Мо4: Олігонуклеотид АВ162

ЗЕО ІЮ Моб: Олігонуклеотид АВ163

ЗЕО ІЮ Моб: Олігонуклеотид АВО2б «

ЗЕО ІЮ Мо7: Олігонуклеотид АВО27 шщ с ЗЕО ІЮ Мо8: Олігонуклеотид АВО28 . ЗЕО ІЮ Мо9: Олігонуклеотид АВО29 и? ЗЕО ІЮ Мо10: Олігонуклеотид АВ11О

ЗЕО ІЮ Мо11: Олігонуклеотид АВ111

ЗЕО ІЮ Мо12: Олігонуклеотид АВ114 -І ЗЕО ІЮ Мо13: Олігонуклеотид АВ115

ЗЕО ІЮ Мо14: Олігонуклеотид АВ116б о ЗЕО ІЮ Мо15: Олігонуклеотид АВ117

Ге) ЗЕО ІЮ Мо16: Олігонуклеотид АВ130

ЗЕО ІЮ Мо17: Олігонуклеотид АВ131 - ЗЕО ІЮ Мо18: Олігонуклеотид АВ132 ї» ЗЕО ІЮ Мо19 Олігонуклеотид АВ13З3

ПРИКЛАДИ

ПРИКЛАД 1

Культура вирусів

Віруси культивують на відповідній системі клітин до проявлення цитопатичного ефекту. Системи клітин, які

Ф) використовуються для кожного вірусу, добре відомі фахівцям. Коротко кажучи, клітини, чутливі до ка використовуваного вірусу, які культивуються в мінімальному необхідному середовищі Ігла (середовище "МЕМ") або в іншому відповідному середовищі, заражають досліджуваним вірусним штамом, використовуючи бо Множинність зараження 1. Інфіковані клітини інкубують при 37"С протягом часу, необхідного для проявів повного цитопатичного ефекту (у середньому З6 годин).

ПРИКЛАД 2

Екстракція геномних вірусних ДНК

Після культивації збирають зруйновані клітини і їх уламки, що плавають на поверхні, і центрифугують 65 вірусну суспензію при 1.000д і 47"С на протязі 10 хвилин для видалення уламків клітин. Потім осаджують вірусні частинки за допомогою ультрацентрифугування при 400.0009 і 4? на протязі 1 години. Осад збирають у мінімальному об'ємі буфера (Тіз 10мММ, ЕОТА 1ї1мМ). Цю концентровану вірусну суспензію обробляють протеїназою К (в кінцевій концентрації 10Омкг/мл) у присутності додецилсульфату натрію (505) (кінц. конц. 0,596) протягом 2 годин при 37"С. Потім екстрагують вірусну ДНК за допомогою суміші фенол/хлороформ, потім осаджують 2 об'ємами абсолютного етанолу. Залишають на ніч при -207С, потім центрифугують ДНК при 10.0009 і ї47С на протязі 15 хвилин. Висушують осаджену ДНК, потім збирають у мінімальному об'ємі стерильної ультрачистої води. Тепер вона може піддаватися дії ферментів рестрикції.

ПРИКЛАД З

Виділення геномних вірусних РНК 70 РНК - які містять віруси очищають відповідно до добре відомих фахівцям технологіям. Потім виділяють геномну вірусну РНК кожного вірусу, використовуючи техніку екстракції "тіоціанат гуанідію/фенолхлороформ", описану Р. Спотсгупвекі, М.Засснпі (Апаї! Віоспет. 1987, 162, 156-159).

ПРИКЛАД 4

Технології молекулярної біології

Усі плазмідні конструкції були отримані при використанні стандартних технологій молекулярної біології, описаних .). ЗатбгооК; і ін. (МоІесцшіаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиа! 2-е вид. СоЇй Зргіпд Нагбог І арогайогу.

Соїй бргіпд Нагрог. Мем Могк. 1989). Усі рестрикційні фрагменти, використовувані уданому винаході були ізольовані за допомогою набору "Сепесіеап" (ВІО 101 Іпс. І а доїа, СА).

ПРИКЛАД 5

Технологія полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскриптазою (КТ-РСК.)

Специфічні олігонуклеотиди (несучі на 5'-кінцях сайти рестрикції для полегшення клонування ампліфікованих фрагментів) синтезують таким чином, що вони повністю охоплюють кодуючі ділянки генів, які повинні бути ампліфіковані (див. специфічні приклади). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) із зворотною транскриптазою (КТ) здійснюють по стандартним технологіях (). Затбргоок і ін. МоіІесціаг СіІопіпд: А І арогаїогу Мапиаї. 2-е сч ов видання. Соїд Зргіпу Нагброг Іарогаюгу. Соїа Зргіпд Нагрог. Мем Могк. 1989). Кожну реакцію КТ-ПЛР проводять із парою специфічних амплімерів, використовуючи в якості матриці екстраговану вірусну геномну РНК. і)

Комплементарну ампліфіковану ДНК екстрагували фенолом/хлороформом/ізоаміловим спиртом (25:24:71) перед розщепленням рестрикційними ферментами.

ПРИКЛАД 6 «Е зо Плазміда рум 1012

Плазміда рум 1012 (фігура 1) була отримана при Міса! Іпс. Зап Оіедо, СА, ОА. Її конструювання було -- описано у .). НапііККа і ін. (Нитап Сепе ТПегару. 1996. 7. 1205-1217). Ге!

ПРИКЛАД 7

Конструювання плазміди рРВ 156 (ген ВНУ-1 98) о

ДНК генома бичачого вірусу герпесу ВНМ-І (Штам 5Т) (Гешпо-Таск Р. і ін. Мігоїюсду. 1994. 199. 409-421) ї- була отримана за технологією, описаною в прикладі 2, і розщеплена Ватні. Після очищення фрагмент

Ватні-Ватні з 18 т.п.н. був клонований у векторі рВК 322, попередньо розщепленим за допомогою Ватні, для одержання плазміди ріВК-4-Ватні (22 т.п.н.).

Потім плазміду рІВК-4-ВатНі розщепили за допомогою ЗаїЇ, щоб вивільнити фрагмент ЗаїІ-Заї! 6,6 т.п.н. « який містить ген, що кодує глікопротеїн ОВ вірусу ВНМ-1 (фігура 2 і 5ЕО ІО Мо1). Цей фрагмент клонували у шву) с векторі рВК 322, попередньо розщепленому за допомогою заї|, і одержали плазміду рівК-6, 6-заї! (10,9 т.п.н.). . Плазміду рівВкК-б, 6-ЗаіЇ розщепили за допомогою Ме! і ВаїїЇ, щоб визволити фрагмент МНеїі-Воа (2676 и?» п.н.), який містить ген, що кодує глікопротеїн 98 бичачого вірусу герпесу (ВНМУ-1) (фрагмент А).

Провели реакцію ПЛР із геномною ДНК бичачого вірусу герпесу (ВНМ-1) (Штам 5Т) і з наступними Оолігонуклеотидами: -І

Рв 234 (30 мер) (5ЕО 19 М 2) («в) со ЗТТГТЦГАЧЛАТІГЦЦГИТИГИГГОгттрОтгО З -л 20 РВ 235 (21 мер) (5ХО ІРО Ю 3)

Та» У ГПАГГЕМПАГІТТИТАГОИГНЕГО ЗУ щоб виділити частину 5-гену, що кодує глікопротеїн 9В (ВНМ-1).

Після очищення продукт ПЛР (153 п.н.) розщепили за допомогою заїЇ і МНеії, щоб ізолювати фрагмент заїі-МНеї 145 п.н. (фрагмент В). (Ф, Фрагменти А і В зшили разом із вектором рук 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим за допомогою заї! і ка Ватні, і одержали плазміду ррВ 156 (7691 п.н.) (Фігура 3).

ПРИКЛАД 8 во Конструювання плазміди рАВОв87 (ген ВНМУ-1 90)

Провели реакцію ПЛР із геномною ДНК бичачого вірусу герпесу (ВНМ-1) (Штам 5Т) (Р.І енпо-ТаскК і ін.

Мігоіоду. 1994. 199. 409-421), отриманою за технологією, описаною у прикладі 2 і з наступними олігонуклеотидами: б5

АВ 162 (31 мер) (5ЕО І М 4)

З'АААЦІГЦАГАТГЦААГГГЦЦГАЦАТТГОЦЦІ 3 й

АВ 163 (27 мер) (5ЕО Ір Ж 5)

ЗАТЦТТГТАЦЦАТАТГАЦИТТГГЦгГТТе 3 щоб ампліфікувати частину 5'-гену, що кодує глікопротеїн 90 бичачого вірусу герпесу (ВНМ-1) (Мо доступу то послідовности в Сеп ВапКе - | 26360) у вигляді фрагмента ПЛР 338 п.н. Після очищення цей фрагмент розщепили за допомогою Рзії і Маеї, щоб ізолювати фрагмент Рзі-Мае!317 п.н. (фрагмент А).

Плазміду РВНМ 001 (Р. емипо-ТаскК і ін. Мігоїсду. 1994. 199. 409-421) розщепили за допомогою Маеї і ЗМІ, щоб визволити фрагмент 942 п.н., який містить частину 3-гену, що кодує глікопротеїн 90 вірусу ВНМУ-1 (фрагмент В). т Фрагменти А і В зшили разом із вектором рук 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим Рвзії і хХваї, і одержали плазміду рАВ 087 (6134 п.н.) (фігура 4).

ПРИКЛАД 9

Конструювання плазміди рАВ 011 (ген ВК5М РЕ)

За технологією, описаною у прикладі 5, провели реакцію КТ-ПЛР із геномною РНК респіраторного вірусу сінцітія великої рогатої худоби (ВКМ) (Штам 391-2) (К.Гегсп і ін. Мігоїюсду. 1991. 181. 118-131), отриманої, як зазначено в прикладі 3, і з наступними олігонуклеотидами:

АВ 026 (33 мер) (5ЕО 10 М б) с 5'ААААЦТГЦАГГГАТГГЦІТЦААНЦАГЦЦАТГАГТІ 3" о

АВ 027 (31 мер) (5ЕО ІВ Ж 7) 5" ЦГЦГГАТЦЦТПАТТТАЦТАААГГАААГАТТГ 3 - щоб виділити ген, що кодує глікопротеїн злиття Е (ВКМ ЕР) у формі фрагмента ПЛР 1734 п.н. Після очищення - де цей фрагмент розщепили Рзії і Ватні, щоб ізолювати фрагмент РзїЇ -Ватні 1717 п.н. Цей фрагмент зшили з вектором рук 1012 (приклад б), попередньо розщепленим Рзії і ВатнНі, і одержали плазміду рАВ 011 (6587 п.н.) ме) (фігура 5). о

ПРИКЛАД 10

Зо Конструювання плазміди рАВ 012 (ген ВА5М 05) ї-

За технологією, описаною в прикладі 5, провели реакцію КТ-ПЛР із геномною РНК респіраторного вірусу сінцітія великої рогатої худоби (ВКМ) (Штам 391-2) (К.егсп і ін. 9.Мігоїюду. 1990. 64. 5559-5569) і з наступними олігонуклеотидами: «

АВ 028 (32 мер) (520 І Мб 8) -в с 9ААААЦТГЦАГАТГТЦЦААЦЦАТАЦЦЦАТЦАТЦ 3" . » " АВ 029 (35 мер) (5ЕО І0 М 9) 5'ЄГЦГГАТЦИЦТАГАТЦІГТГТАГТІГАТІГАТТТЕ 3 -І щоб виділити ген, що кодує протеїн їз (ВКМ б) у формі фрагмента ПЛР 780 п.н. Після очищення цей о фрагмент розщепили за допомогою Рзії! і ВатНі, щоб ізолювати фрагмент Рвїї -Ватні 763 п.н. Цей фрагмент

Ге) зшили з вектором рук 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим Рзії і Ватні, і одержали плазміду рАВО12 5о (5634 п.н.) (фігура 6). - ПРИКЛАД 11 ї» Конструювання плазміди рАВО58 (ген ВМОМ С)

За технологією, описаною в прикладі 5, провели реакцію КТ-ПЛР із геномною РНК вірусу вірусної діареї великої рогатої худоби (ВМОМ) (Штам Озвіовзв) (І.Ое Моегпооле і ін. уУ.Сеп.МігоЇї. 1993. 74. 1433-1438), в отриманою за технологією, описаною в прикладі 3, і з наступними олігонуклеотидами:

ГФ) АВ 110 (35 мер) (5ЕО ІО Ж 10) іме) УААААЦТГПАГАТГІЦЦГАНАЦААЛАГЦАГААГГГІ 3" во АВ 111 (47 мер) (5Е0О І юж 11)

ЗУЧЦІГЦГГАТИИТПААТАААААТЦАТТИЦНАПТОСИГАЦТТГАААПААААЦ У щоб ампліфікувати фрагмент у 342 п.н., який містить ген, що кодує протеїн капсиду С вірусу ВМОМ. Після очищення продукт реакції КТ-ПЛР розщепили за допомогою Рвії і Ватні і одержали фрагмент Рай-Ватні 324 п.н. 65 Цей фрагмент зшили з вектором рмЕ 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим за допомогою Рзі! і Ватні, і одержали плазміду рАВ 058 (5183 п.н.) (фігура 7).

ПРИКЛАД 12

Конструювання плазміди рАВ 059 (ген ВМОМ ЕТ)

За технологією, описаною в прикладі 5, провели реакцію КТ-ПЛР із РНК геному вірусу вірусної діареї великої рогатої худоби (ВМОМ) (Штам Озіозв) (І.Ое Моегпооге і ін. 9У.Сеп. МігоЇї. 1993. 74. 1433-1438) і з наступними олігонуклеотидами:

АВ 114 (32 мер) (5ЕО ІД М 12) 5 АЦГЦГТЦГАПАТГААГАААЦТАГАГАЛАГЦІ З

АВ 115 (33 мер) (5ЕО Ір М 13) 5 ЦГЦГГАТЦЦІЦАРЦІТТІТТГЦАААЦТІТТАГОУ щоб виділити послідовність, яка кодує протеїн Е1 вірусу ВМОМ, у формі фрагмента ПЛР 1381 п.н. Після 72 очищення цей фрагмент розщепили за допомогою 5аї! і ВатНі і одержали фрагмент ЗаїІ-Ватні 1367 п.н.

Цей фрагмент зшили з вектором рук 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим за допомогою заї! і Ватні, і одержали плазміду рАВ 059 (6236 п.н.) (Фігура 8).

ПРИКЛАД 13

Конструювання плазміди рАВ 060 (ген ВМОМ Е2)

За технологією, описаною в прикладі 5, провели реакцію КТ-ПЛР із геномною РНК вірусу вірусної діареї великої рогатої худоби (ВМОМ) (Штам Озіозв) (І.Ое Моегпооге і ін. 9У.Сеп. МігоЇї. 1993. 74. 1433-1438) і з наступними олігонуклеотидами: 5 5ЕО І т 14

АВ 116 (36 мер) (5ЕО | с 75 ВАЦГЦГТЦГАЦАТГАЦГАЦТАЦТГЦАТТЦЦІГГТАТГ З' о

АВ 117 (35 мер) (5ЕО ІО її 15)

УЦГЦГГАТЦЦТПАТІГАЦГТЦЦЦГАТГГТЦАТІТГ 3 «І щоб ізолювати послідовність, яка кодує протеїн Е2 вірусу ВМОМ, у формі фрагмента ПЛР 1252 п.н. Після «- очищення цей фрагмент розщепили заї| і Ватні і одержали фрагмент ЗаїІ-ВатН111238 п.н.

Цей фрагмент зшили з вектором рмЕ 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим за допомогою заї| і Ватні, і ме) одержали плазміду рАВ (6107 п.н.) (Фігура 9). о

ПРИКЛАД 14

Зо Конструювання плазміди рАВ 071 (ген ВРІМ НМ) ї-

За технологією, описаною в прикладі 5, проводять реакцію КТ-ПЛР з геномною РНК вірусу парагрипу великої рогатої худоби типу З (РІЗ-ВРІМ) і з наступними олігонуклеотидами:

АВ 130 (33 мер) (5ЕО Ір М 165) « с 40 Б'ТТТГТЦГАЦАТГГААТАТТГГАААЦАЦАНАВАН 3 З "» АВ 131 (33 мер) (5ЕО ІО Ж 17) п

ЗТТІГГАТИЦТТАГЦІГЦАГТТТІТЦІГААЦІТЦ З

-І щоб виділити ген, який кодує глікопротеїн НМ ВРІМ (послідовність гену НМ, заявлена Н.Зпірша у 1987 Мо доступу послідовності в Сеп ВапКе - 00115) у формі фрагмента ПЛР 1737 п.н. Після очищення цей фрагмент о розщепили за допомогою заї| і ВатНі, щоб ізолювати фрагмент заї! і ВатНі 1725 п.н. Цей фрагмент зшили з

Ге) вектором рук 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим за допомогою заї і ВатнНі, і одержали плазміду рАВ 071 (6593 п.н.) (фігура 10). -

ПРИКЛАД 15 ї» Конструювання плазміди рАВО?72 (ген ВРІМ Б)

За технологією, описаною в прикладі 5, провели реакцію КТ-ПЛР із геномною РНК вірусу парагрипу великої рогатої худоби типу З (РІЗ-ВРІМ) і з наступними олігонуклеотидами:

АВ 132 (30 мер) І5ЕО І БЖ 18) (ФІ З'РТТГТЦГАПАТГАТЦАТЦАПАААЦАЦААТЦО З"

ГІ АВ 133 (30 мер) (5ЕО ІО М 19) 5" ТТТГГАТЦЦТЦАТТГТЦТАЦТТГТТАГТАЦ З 6о щоб виділити ген, який кодує протеїн Е вірусу ВРІМ (послідовність гену Е, заявлена Н.ЗНПіршіа у 1987. Мо. доступу послідовності в Сеп ВапКе - 00115) у формі фрагмента ПЛР 1641 п.н. Після очищення цей фрагмент розщепили за допомогою заї і ВатнНі, щоб ізолювати фрагмент ЗаїІ-ВатнНі 1629 п.н. Цей фрагмент зшили з вектором рук 1012 (приклад 6), попередньо розщепленим за допомогою заї| і Ватні, і одержали плазміду рАВ 072 (6497 п.н.) (фігура 11). б5 ПРИКЛАД 16

Одержання і очищення плазмід

Для одержання плазмід, призначених для вакцинації тварин, можна використовувати будь-яку технологію, яка дозволяє одержати суспензію очищених плазмід, здебільшого у зверхскрученій формі. Такі технології добре відомі фахівцям. Можна назвати, зокрема, техніку лужного лізису з наступним дворазовим центрифугуванням у градієнті хлориду цезію в присутності броміду етідія, як вона описана .).ЗатьгоокК і ін. (МоїІесшаг Сіопіпа: А

І арогаюгу Мапиа! 2-е вид. Соїа Зргіпд Нагрог І арогаїогу. Соїд Зргіпд Нагрог. Мем Могк. 1989). Також можна звернутися до матеріалів заявок РСТ УМО 95/21250 і РСТ УМО 96/02658, де описані методики одержання у промисловому масштабі плазмід для вакцинації. Для одержання вакцин (див. приклад 17) очищені плазміди 7/0 поміщають у суспензію таким чином, щоб одержати розчини високої концентрації (»2мг/мл), придатні для збереження. Для цього готують суспензію плазмід в ультрачистій воді або в буфері ТЕ (Тгіз-НСІ 10мММ; ЕОТА 1мм, рН 8,0).

ПРИКЛАД 17

Одержання асоційованих вакцин

Різні плазміди, необхідні для одержання асоційованої вакцини, змішують у їхніх концентрованих розчинах (приклад 16). Суміші готують таким чином, що кінцева концентрація кожної плазміди відповідає ефективній дозі кожної плазміди. Для точного доведення кінцевої концентрації вакцини використовують розчин 0,995 Масі або буфер РВ5.

Такі особливі компоненти як ліпосоми, катіонні ліпіди можуть також бути використані для одержання вакцин.

ПРИКЛАД 18

Вакцинація великої рогатої худоби

Велику рогату худобу вакцинують дозами 1О0Омкг, 250мкг або 50Омкг на плазміду. Ін'єкцію проводять за допомогою голки внутрішньом'язово в м'яз дішеийвз або в м'язи шиї. Дози вакцинації вводять в об'ємах від 1 до

Ббмл. | сч 4721 217 р й СМУЕ о я, то Промотор/Активатор над у чу г Чу

Д Стійкість до ЧИ «І

А канаміцину 3798 І, | міт «- г рУКІ1012 т (41915685) ! Ге») 3а97 Я | 1853 / Ван ав) о

Лу, Заї - рт ч- ри 2 я Як зай: ЗОН Теля 1335 ха

Ваш Ватні « - с и ФІГ.1 и? -І («в) се) - 50 «з»

Ф) іме) 60 б5

1 АТООССОСТООСООСОоТоСТОААСОСОССоСоСОСоССОСАСАСССТСОБССАССАСЬОСОТ 1» некліалізАгУЄьуєТу МасіпАгов1алтайтуйасіуАзрО1уАЕЧАхоО1ус1іпАєт 64 ССТСАТСТАССАССОССАССТОТТСТООСТОоСтТотТАСОСООСТОСТОСАОоСОССТОЮСОоСосоС 22» АкунівІецАгурРТОВ1іуАкууаігттА1аА1атенАтустуРІОА1Талтаргосіу масу 127 бОоСоСоСОСоССОСССтТАСССССТОСССТОСТАТОССоСАССТОСОСОСТОСТОСТосСсоссо 4укс1уліальцліаАзатезАтаатайтатец еотгра1атріттразатецт ее еоміаліа 190 сссбссособсоСссАСССОССАСААСОССССССОСОСССССОСССОААСАСОССоССАССССо 64 РгсліалтасіуАксттоМ1атьетрирРторгоаргоргорто ПсішА1аЛіалеврго 253 сСОСССССССССАСССССАССССССИССОСССССАССОССАССАСОССОССАСССССВАСЛАС 85» АзіартортолізсехркобехртортосіуєколрОТуАврАврА1алізбетртодерАєт 3165 АССАСАСАССТОСССОССССОСТОССОСТОССОСАССССОССССССААААСТОССССТТСТТ 106» ЗестігАЗрчаївтоміавіві соку еоміастраталіаот у ічАзовегатуврарра 379 стотосесоссоссстоосососсАсостостосоостоососссососооссотоссстоАс 127» ЧаїСузфЕсргортовена УА атвсуатуз 1 Ат АЧАТарьОДізАЕЧЕВОСуарЕоЯІ 442 ТАСОСОСТОССССООЛАСТАСАСОО ОСА СТСАТТТАСЛАССАСААСАТССССССС 1485 Тухо1утеи1уАгОАсптТут па илпутесвіучаттіатуєтувашАЗВІталзарто 505 ТАСАСОТТСААССССТАСАТТТАСАААААССТОАТССТОАССАССАССТОСОСОСОСАСССЯ і69ктустяховетухАіатукІзетусуАВеМалтІ1вчуаєтьствс та: ттуАізо1уЗехтх 55689 ТАСОССОССАТТАСАААССАСТАСАСОСАС СЕССТСССТО ТО САТОСОССАСАТСАСоСАС 190» ТугА1зА1ТаттетвсАєПО ПтухтнеАСракоуатреочуа101умаєтусіатіетьслву 631 СТОСТОСАСААСААСТООСОСТОССТТТОСААЛОССОАСТАССТОСОСАО СОС АССТО 21,7МтесМа1АсрьувцузТтрлиусувеветіу МАС укістАкоВехо1уАкоузчаї 694 стТосестТТСАСеоосАСсАСоЛеССстосоАСИСОССССТОААСССТОСоСоСсстоЛоСосо 232» чуаїмізрвалврактАврАЗрАррЕстх р АтарисІ уві еюбелаїа 757 СОС ОСС СА САССАСОСАССАТСТОТАСАСОССССТОСоСстосососсост 253» РкосіучаїлІітуттрнізтастикАЗрАсруаттуттгА зле іуєетАтастутті 4 І 820 ТАССССАСССССАССТОТСТСЛАСТОСХТССТОСААСААСТОСАСССоСОСтТООСтТоТАСоСО 274» Тухлгото ка у тв кЗек иа АзпСувІ1теча1с1 оо сі АсоЗегуаІ тує то о 883 тассАСтТОотТТСоСОоСТСтТоОАССОСОСАСАТТАТСТАСАТОТООСССТТТТАСОСоСТОСОС 2955 ТусАзраехрваліатеалестнисіуАоріїетістутлесзецкрРторБатукОїу епасут 946 сАОобСОСОСАССОСОАССАСАССАСОСТАСТОССООАОСОСТТССАОСАСАТОСАСООСТА 3169 с10б1уАзанісАь іні твЕАсст ел с1у Аза еаркалі алергії а «І 1909 СТАСАДССССОАСАТОСССАССОСССООСОССТОААССАСССОСТСТОССООДЛАСТТТТТОСо

З)7ІлОиСсІЗА1аАЕЧНІвсТуніссіуртоліартосіпсіулі сту я Атастшеаоведіа 1272 ТАСАСЛОСАССТОАСОСТАСССТООСАСТОСОТОСССААССОСАЛАЛАССТОТОСТООСТОСС (є) 358» туптогА1аАгуАЗро1уегі лу тео1уАтасіпА1аєіпьузАгуазлтеАтасту в. - . и? з 50 «з» 60 б5

11:23 СААСТОСССССАСССОСАССАААТССТОССАСАССАСАССССССОСААСТТССОСТТСАССОС 179 с1і5уа1М1алиусіутухкцАхоАТа алко сіро Ако ри еобсогезнівсїу 1197 сООСТСоСТСТеОСССАССТТТСТОАСССАСАСССАСАССТТССССТТОСАСААТСТОССССТ 400» РготечА1агеооіуАзрігисувоїпліусіпРЕОНівгеоАгочаїдізстосСувАїакіа 1261 САСССАСТОССТОСАТСОААСАСССССАООССССССТОСАССОСОТСТАСССССАССОСТАСАА 4219 СіпАкЧілодхЧАрАХОАтОСТулицо1уАт у у виФАз Ак и РОТОМ ат Аа 1324 СОБСАСОСАССТОСТОТОССОСАССТТОСАСАСОТАССТООСОСОСООСОССТТТОТОСТООС 4142» АкЧНівА1алтойтачуа сіус ів ютуаєруві»кос1іуалечаті осузахоєіу 1387 СТТОСООССАТОСТСАССААССАССТООССААССТОТАССТОСАССАССТОССОСОСТСОААС 463» ІеПРЕОАТаМастеизетАєт неза ат уві етуті теза 1ізАговетачт 70 1450 ССсАСОСТСОАСОСОСТОТТООсСОССоССОСоСССААСССоСОСССсоСоССососососсос 484» сіутвпеоіобіу г епрБеАіалізаталіаргобуз хо 1ургоАгЧАсТЛіЗАсоАту 1513 сссососсстотососссооссосссооососооссААСООВСССоССооСбАСОССОХСССС 5059 А1аА1аргосага1артостіустуртосіувіалізаєтилурголізатуатро1уАерАїа, 1576 соСоООСооОТОАСТАСССТОАССТООССССАСТТТОССОСОСТОСАСТТСАССТАССАССАС 526» с1ус1уАгууаітвствсуаїбегтегА1іасішррелілАтатетіпрнатьстуєаерніє 15 . 1539 АТССАССАССАССТОААСАССАТСТТСАССССССТОСССАСОТОСТОСТОССТосТесАсААС 547» І1есідАзрнізуаї вка тиме стребесАку і єпАізтсастгрсув ет есізава 1702 ААОСАССОСОСОСТОТОСОСССАСОСООСТААССТОААССССАССОСОССООССАССОСТОСЬ «58» цузс1пАгулЛІізі АмттрА1асіоА1алтат уві тАєпогОосетліаліанізсататані я 1765 СТОСАССОССОСОССОССОСОСОСАТСТТО ОО САСОССАТООССОТОАСОТАСТОССАССА

ЗВО» ІецАнрАПОвсоАЇЗАТаА1ВАго уп УАРАї Маса тн: тукСу Ні 1828 стососсАССООССССТОТТСАТСОАОЛАСТООАТОСОСССОССССосОССоТТОСтАСАс 8105 Гезбіузіооїувивча1 релі Авобесмаєксвліарсо уві учаїсувтуювах 1991 СОСССОССССТСТОСТТТОССТТОСОСААССАСАССОАСССОСТОСАСООССАССТОСоССАЮ 511» АкуркоркомаїбекрвалтАрНоВіуА Ліса еко а 11 пе 1уЧи 1954 САСААССАОСТОСТОССОСОССОССАССТОТОСАССССТОСАССОССААССАСААССОСТАС см 8529 АерАБВЗ І еогепрЕОС1уАхО В еиуа1с1пртосСувтвев1зАєоні в увАЄЕ о 2917 тТтТОСоСТТТООСОоСОСАСТАССТОТАСТАССАСААСТАСССОТАССТОССОССОСТОССОСТО 573» РіеледРНесіуАТіалсртукчаттуєтувсізАєптувліатуєататоатуа рт г 2080 ОСООАССТОСАСОТОАТСАССАССТТТОТаСАССТАААССТОАСО ОТТО САС СсА 694» А1ас1агесіпчуа1їт1езествт Вега Ар емАЗЦІ вит Таттет пара ВИ « зо 2143 ТТСТТОССОСТАСААСТОТАСАСОСОСОССОАС То АСЛосоСтТоТоСтТо АСТМІ 11535 врегецегогеоисічаітуєтьтАкЧ ас ета 1у ес ечАзотуттехг ч- 2205 САСАТАСАССОССОСААССАССТОСАССАССТОСОСТТОТАССАСАТТСАСССССТОСсТоАА ть» сі т1еб1вАхсАгсоллосіві еоНі збіг езАЕЧРнетухАзрІ1еАзраікЧ а1уз1цуз (о)

ФІГ .2 (продовження) - 2133 СОСАСООСААТАТОСССАТСАТОССАСОСОСТООССАСТТСТТТСКОООССТОСОСосСоТе 737» ТепАВрО1уАБОоМеєліатівмесАто ут ецА1алаврРоавресіроту ецоіумачаї 2132 ооосАОбССоТООоСАСОСТОСТОСТОСоСоСсосооосТоСооСОСтСТоАССотоТоооос

ТВ о1усівАзауа1о1утвимаїУуа1їтезсіултахасіу талі еивектвх абетку « 2395 АТСсССТОСТТТАТТОСОААСССсТтоСосСосостооссАСОССОСТОоСсТОсТосТооссооо 799 Т1еАіабегтнетіеА1аляпрторвесіуАіатеаліатькот ут еотецмаатеасту - с 2458 СТОСТОСССОСТТТОСТООССТАСССОТАСАТТТСССОССТОСОСАССААССССАТОМАСОСО 820»ІеиуаїАтТаліавретецА1атухтаттутукІ1едзепли т еойгуветАзпрЕсМеєтуваіа . и 2 2521 СТОТАССССАТСАССАСОСОСОСОСТСААССАСОАСОССССООССОСААССОССССООСОСА 821»1есптуктРКоОЇ1іеТВсТехАтуАТа у ВАВрАЗрАЇалко ту АВТ АТартоуи 2334 САЛОАСОАСОАСТТТОАСОСоОССАААСТООАОСАСОССООССАСАТОСАТСЛАСТАТАТОТОС 862» со 1ос1пРБеАсрАзаАТагуві 112 Аз ЗАСТ МевІт18тувТутчарсвг - і 2647 сСтТостТотТСАССОСТОСАОСООСААСАССАСЛАСОССАААААСАССААСААССоСОоСсссостО 383» тецмаібетА1ауаїсталЕссіго мні срузАІацузіузбекаєціувстіутуРТОГех о 2710 стоосоАССсоостОАСОСЛОСТООСО СТО ОС ОССАСОССОССОСАОТА САС

З04»теза1атигАтИествхсіп епА1агт оди АттАхА1артОортовітуюа сірі 2773 СССАТООСССАСОТСЗОСОПОСОСАТСА з 50 925» РеомекАтіалзруаїс1уєіуліанн»

ЧТ»

ФІГ .2 (продовження) 60 б5

7 ватні «Фрагмент Ватні де 18 Ко вну-1 57 г вих геномна ДНК рівн4- ва ватні М вай ват вані ува то як Ммпеї зап! а! за ше

Ї рРсв

Мпні-ВУШ Ь/ - зап-Ватні вай-нявї 7497. 237

Ніпфи Промотор/Активатор в574 й з

Я Стійкість до у см Е ват, канаміцину у яхт 1883 рРРВІ56 | а (769105) Две!

Я ФІГ

' і сч згвв У вич Дови всн З й чі тет Ж ЕВ а нем Ге) 37 Зевн НИ

Ва 5940 237 « | СМ ТЕ

Ніла дя чвуу,Промотор/Активатор - 4 Чер, й ту зго о 4 Стійкість до Чу вот, г канаміцину у щ

Ї, у 4716 Й | моди м рАВО87 І (6134ре)

ЛИ лвєз ї Вей « вну-і Й Зан 79 щі і мае шщ с зга й: а о і ВСН Тепа чаї " » Ватні 3154

Ва! -

ФІГ4 («в) се) пу 237 «дж йо СМУ - 20 шк р г Промотор/Активатор ай ї

Й ть 920 й (Ь ї» 5470 Й / Стійкість до і хі канаміцину у // у

Ше | МУ шт рРАВО11 (Ф; (6557рЬь) / і ко ЩХ тввз й ви

ВЕ5У бо й Е «154 У

Вон тел рр 3во7 Во Ватні б5

ФІГ.5

5440 237 нів - я Ме СМУЕ

А, М Промотор/Активатор є, ЦО ого

Й стійкі у

Ї, тійкість до і 4517. Її, канаміцину

СММ ЦЕ

«216-йй рАВО12 . Іти (з634рЬ) вА5У й ввз б. Й ва оуругВ м Вані 320! ВСН Те "Ватні! 2555 Во

ФІГ.6 4989 237 свй (в СМ Е й т та Промотор/Активатор

Ніпан? уз р уд з, у: й Стійкість до у 920 у канаміцину зобв-. В | с

К

! ї СМУ рАВОБВ су і9) зтве В (51836р5) ! /

ВУ0У и Я чІ с ф-ввз

Ран - коду ах й ві сто Воно 2283 Ге) «в) в.

ФІГ.7 5042 237

СМ Е нія од вела цу ромотор/Активатор « 4 Ч

У Ч) 920 й У зиз Й // Стійкість до х З с 4 канаміцину її

І у СМУ ТЕ

Ку Ти ; 2 4818 Й рА 8059 (6236рЬ)

Ілаєз

Кві - й Зак

ВУВУ о ЕІ 4 Рг (Се) зво3 ву і Хв гуми а

Вон. Тела Ве - 3255) Ватні'яа вон

ЧТ»

ФІГ.8 іме) бо б5

913 237

СМУ ТЕ нів й оо Промотор/Активатор й її ий Тв 920

АЙ и стійкі Чу «990 д ТІяКіІСсть до й

Я канаміцину і

Й | СМУ

Ї, | ДЯ ше рАВОбО (6107рЬ) Й її тери

Й Бай

ВУВУ /

ЕЗ Й зв 3674 ру, ? 75 се

ВОН Те Затні 3127 Во

ФІГ.9 6195 237 й

Ніпа я СМУЕ

Ду дян : у Промото р/Активатор

Уа в 320 у:й У ват Ду Стійкість до ч,

У канаміцину у ге, |) СМУ 5175. В | 5 с рАВОгІ1 | (о) (6593р5) М хввз

ЕІ

Зай

ВРІУ Я

», ни Й вош Й мі і

ВСН тео дв дон - зві ддуРен ВШ хваі Ге»)

Ватні «в)

ФІГ.10 і - 6303 217

Ніпані і ТЕ т ЕЕ пору, Промотор/Активатор я, руовго 5 зу « 5389 Стійкість до Ме канаміцину о см шщ с зот5. Би - равО72 :з» ! (5497рв5) тез се з у зай

ВРХ ду

Е ГЕ

-і з й зова ва с о Вон тесв Ж -

Н 3517 Затні Бе

І«е) т - вд - 70

ФІГ.11 «з»

Claims (12)

1. Формула винаходу о 1. Вакцина для великої рогатої худоби, яка включає плазміду, що містить одну або більше нуклеїнових ко кислот, що кодує Е та/або С білок респіраторного синцитіального вірусу великої рогатої худоби.
2. 2. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана плазміда містить нуклеїнову кислоту, яка кодує обидва 60р гени Ета б.
3. З. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана плазміда містить нуклеїнову кислоту, яка кодує Е ген, і при цьому вакцина містить другу плазміду, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує о ген.
4. 4. Вакцина за будь-яким з пунктів 1-3, яка відрізняється тим, що плазміда включає ранній промотор СММ-ІЕ цитомегаловірусу. 65
5. 5. Вакцина за будь-яким з пунктів 1-3, яка відрізняється тим, що плазміда включає промотор, вибраний з раннього промотору 5М40, пізнього промотору ЗМ40, промотору ТК вірусу саркоми Рауса та промотору цитоскелета.
6. 6. Вакцина за п. 5, яка відрізняється тим, що промотор цитоскелета являє собою промотор десміну або промотор актину.
7. 7. Вакцина за будь-яким з пунктів 1-6, яка відрізняється тим, що її поєднують з живою цільною вакциною, інактивованою цільною вакциною, рекомбінантною вакциною або субодиницею вакцини.
8. 8. Вакцина за будь-яким з пунктів 1-7, яка відрізняється тим, що додатково включає плазміду, що містить, принаймні, один ген іншого патогену великої рогатої худоби.
9. 9. Вакцина за п. 8, яка відрізняється тим, що ген вибирають з ОВ та 90 вірусу герпесу великої рогатої 70 худоби, Е2, СЕ1-Е2 та Е1-4Е2 вірусу захворювання слизової оболонки, НМ та Е вірусу парагрипу типу 3.
10. 10. Спосіб вакцинації великої рогатої худоби, який полягає у введенні великій рогатій худобі однієї або більше плазмід, описаних у будь-якому з пунктів 1-9, у поєднанні з інактивованою цільною вакциною, рекомбінантною вакциною або субодиничною вакциною.
11. 11. Спосіб вакцинації великої рогатої худоби, який полягає у введенні однієї або більше плазмід, описаних 75 У будь-якому з пунктів 1-9, великій рогатій худобі, яку спочатку вакцинують першою вакциною, вибраною з групи, яка складається з живої цільної вакцини, інактивованої цільної вакцини, субодиничної вакцини, рекомбінантної вакцини, при цьому вказана перша вакцина містить один або більше антигенів, що кодуються плазмідою, або один або більше антигенів, які забезпечують перехресний імунітет.
12. 12. Набір для вакцинації великої рогатої худоби, що містить вакцину за будь-яким з пунктів 1-9, та іншу 2о вакцину, вибрану з групи, яка складається з живої цільної вакцини, інактивованої цільної вакцини, субодиничної вакцини, рекомбінантної вакцини, при цьому перша вакцина містить антиген, що кодується плазмідою, або антиген, що забезпечує перехресний імунітет, для введення спочатку вказаної другої вакцини та введення вакцини за будь-яким з пунктів 1-9 як допоміжного засобу. тріїгя я " : " " : : пов с Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 11, 15.11.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і і) науки України. « «- (о) «в) і -

    - . и? -і («в) се) - 70 с» іме) 60 б5