JP2000516570A

JP2000516570A - アレルギー反応の標的治療のためのＦｃε―ＰＥキメラタンパク質、その製造方法、及びそれを含む薬剤組成物

Info

Publication number: JP2000516570A
Application number: JP09522641A
Authority: JP
Inventors: フィッシュマン，アラ; ヤルコーニ，サイ; ローバーブームガルスキー，ハヤ
Original assignee: イサムリサーチデベロプメントカンパニーオブザヘブライユニバーシティーオブエルサレム
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-18
Publication date: 2000-12-12
Also published as: AU1070797A; KR20000064465A; IL116436A0; US6919079B1; US7704506B2; KR100464699B1; ES2217331T3; AU718110B2; US7740853B2; CN1207686A; DE69631837D1; ATE261315T1; US20030158390A1; DE69631837T2; US20090082549A1; EP0868198B1; WO1997022364A1; IL116436A; EP0868198A1; JP2009106286A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般的にアレルギー性反応の治療のための新しいアプローチに関する。それは、キメラ細胞毒Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀によるＦｃεＲＩ受容体を発現する細胞の標的とされた削除を基礎とする。マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位のアミノ酸３０１−４３７をコードする配列はＰＥ₄₀に遺伝的に融合しており、細胞結合ドメインを欠くＰＥの切形である。Ｅ．コリで作られたキメラタンパク質は、ＦｃεＲＩ受容体を発現するマウスのマスト細胞ライン及び骨髄由来の一次マスト細胞を特異的かつ効果的に殺傷する。本発明は、ＦｃεＲＩ発現細胞の標的とされた削除によるアレルギー反応の治療に特に有用なキメラタンパク質を提供する。前記キメラタンパク質は、ＦＣεＲＩ発現細胞のための細胞標的部分及び細胞キラー部分を含む。好ましいキラー部分は、細菌毒素シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）である。このシュードモナスエキソトキシンはシュードモナスエラジノーザの産物である。また、本発明は、前記タンパク質の調製方法に関する。このキメラタンパク質は、マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位をＰＥ₄₀、細胞結合ドメインを欠くＰＥの切形に遺伝的に融合することによって調製する。また、本発明は、アレルギー性疾患の治療及び過形成及び悪性腫瘍の治療のための薬剤組成物であって、活性成分、前記キメラタンパク質及び一般的なアジュバント物を含む薬剤組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アレルギー反応の標的治療のためのＦｃε−ＰＥキメラタンパク質、その製造方法、及びそれを含む薬剤組成物発明の分野本発明は、一般的に、アレルギー反応の治療のための新しいアプローチに関する。より詳しくは、本発明は、ＦｃεＲＩ発現細胞の標的とされた削除のための、Ｆｃε−ＰＥキメラタンパク質、その製造方法及びそれを含む薬剤組成物に関する。このキメラタンパク質は、特異的な受容体を過剰発現する細胞を認識し、破壊するための細胞キラー部分と結合したＩｇＥ分子の一部である細胞標的部分を含む。本発明のキメラタンパク質に使用されるキラー部分は、細菌毒素シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）（シュードモナスエラジノーザ（Pseudomnas aeruginosa）の産物）である。発明の背景世界の人口の約２０％が、喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー等の様々なアレルギー性疾患に罹患している。過去10年間にアレルギー性疾患が危険なほどに増加したことにより、効果的な治療の必要性が明らかになってきた。ＩｇＥとマスト細胞もしくは好塩基球の相互作用は、アレルギー反応における第一経路のエフェクターである。ＩｇＥは、定常領域−たいていの場合、細胞の表面に限られることがわかっている−において高親和性の受容体（ＦｃεＲＩ）と結合する。低い分離率にもかかわらず、結合自身は細胞を刺激しない。しかし、多価抗原によって細胞表面結合したＩｇＥのクロスリンケージは、受容体の凝集の原因となり、爆発性の細胞脱顆粒反応を誘発し、それによってアレルギーのメディエイタ、例えば、ヒスタミンやセレトニンが放出する。ＦｃεＲＩ受容体の分布が、アレルギー反応を特徴づける細胞に限定されることから、それはキメラ細胞毒による標的免疫治療のための魅力的な候補物質となる。キメラ細胞毒は、遺伝子融合技術によって作られた新しいクラスの標的分子である。これらの分子は、細胞標的部分と細胞キラー部分を含む。そしてそれらは、特異的な受容体を過剰発現する細胞を認識し、破壊することができる。キメラタンパク質の作製に使用する細菌毒シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）は、シュードモナスエラジノーザの産物である。ＰＥは、細胞質に接近するとＡＤＰリボシル化活性によってタンパク質合成を阻害し、細胞死を引き起こす(Middlebrook，J.I.，Dorland R.B.、1984、Bacterial toxins:cellular mech anisms of action．ミクロバイオロジーレヴュー（Microbiol．Rev.）48、199) 。効果的なキメラ細胞毒は、様々な成長因子もしくは単一の鎖抗体をコードするｃＤＮＡと本質的な細胞結合能を欠くＰＥ誘導体との融合によって作られる。ＩＬ₂受容体を過剰発現する活性化されたＴ細胞を標的とし、選択的に削除するように作られたＩＬ₂−ＰＥ₄₀と呼ばれるこれらのキメラタンパク質の１つは、様々な型の自己免疫性障害、移植片拒絶反応、癌において効果的で選択的な免疫抑制を提供することが判明した(Lorberboum-Galski H、1994、Interleukin 2-Pseu domonas exotosin A(LI2-PE40)chimeric protein for targeted immunotherapy and the study of immune responses．ジャーナルオブトキシコロジー、トキシンレビュー（J．Toxicol．−Toxin Rewiewes）13(1)、105)。細菌に発現したＩｇＥの組換え定常領域全体（Ｆｃε）は、天然のＩｇＥに匹敵するＦｃεＲＩ受容体との親和性をもち、またヒスタミン放出を誘発する抗ＩｇＥのために好塩基球を感作する能力をもつ。細菌中に発現したヒトＦｃεの組換え分画を、受容体結合についてテストしたところ、定常領域のドメイン２及び３の結合部における残基３０１−３７６に対応するペプチドは、受容体との高親和性の結合にとって十分であることが判明した。また、受容体結合にε鎖ダイマー化が必要でないことも報告されている(Helm B.,Marsc R,VercelliD.,PadlanE.，Gould H.，Geha R．、 1998、"The mast cell biding site on human immunoglobulin."E．Nature，331 ,180)。本発明は、一般的に、アレルギー反応の治療のための新しいアプローチに関する。現時点で、喘息やアレルギー障害の治療に使用されている主な公知の薬剤群を下記に記す。１．β２刺激薬：アドレナリン性β２受容体の刺激により、気道を拡張させる。２．メチルキサンチン(methoxantines)：平滑筋弛緩剤、気管支を拡張させる。３．グルココルチコイド：炎症を抑える。４．クロモリンナトリウム：マスト細胞の脱顆粒反応を阻害する。５．抗ヒスタミン剤：標的細胞におけるヒスタミン活性を阻害する。広く使用されているにもかかわらず、これら全ての薬剤は、下記に関して顕著な欠点をもつ。１．特異性：これら全ての薬剤（クロモリンナトリウムを除く）の活性は、マスト細胞に特異的でない。従って、それらはアレルギーメディエイタの放出を阻止することができず、むしろ、それらの活性による作用を逆転もしくはブロックする。これらの薬剤による治療は、症候性であり、アレルギー反応が起こってからしか使い始めることができない。よって、予防的な使用はできない。２．毒性：これらの薬剤は、特異性がないため、様々な組識及び器官に作用する。そのため、重篤な副作用の原因となる。β２刺激薬の主な副作用はふるえであるが、心臓喘息を誘発することもある。メチルキサンチンは、中枢神経系を刺激し、神経質、吐き気、嘔吐、食欲不振、頭痛、心筋性頻脈を引き起こす。血漿中濃度が高くなると、心因発作や不整脈の危険がある。抗ヒスタミン剤は、中枢神経系を刺激して鎮静作用する。ステロイド剤は最も有害で、脳下垂体−副腎機能の抑制、体液及び電解質の障害、高血圧、高血糖、感染症罹患率の上昇、骨粗穀症、小児における成長阻止の原因となる。３．作用の持続性：βアドレナリン刺激薬やアミノキサンチン（aminoxantines ）や抗ヒスタミン剤は、ほとのど作用時間が短い薬剤であるため、頻繁に投与しなければならない。ステロイドは、作用時間が長い薬剤であるが、誘導時間も長いため、緊急時にはあまり価値がない。存在する唯一のマスト細胞特異性薬剤は、クロモリンナトリウムである。この薬剤は予防的に、本質的には副作用なく使用できる。しかし、それは半減期が非常に短く、誘導時間が非常に長いため、局所適用しかできず、また、一部の患者しかそれに反応しない。こうしたこと全てから、クロモリンナトリウムの使用は非常に限定される。ＩｇＥとその高親和性の受容体との相互作用を妨害するための試みが、抗アレルギー治療の基本として、近年多く報告されている。ＩｇＥからの構造的要素を含む組換えペプチド類(Helm B.,Kebo D.,Vercellic D.,Glovsky M.M.,Gould H., Ishizaka K.,Geha R.,Ishizaka T．、1989、"Blocking the passive sensatizat ion of human mast cells and basophil granolocytes with IgE antibodies by a recombinant human ε-chain fragment of 76 amino acids."プロシーディングスオブナチュラルアカデミーオブサイエンス(Proc．Natl.，Acad．Sci.,)、米国、86、9465)またはＦｃεＲＩ(Ra C.，Kuromitsu S.，Hirose T.,Yasuda S.， Furuichi K.，Okumura K．(1993),“Soluble human high affinity receptor fo r IgE abrogates the IgE-mediated allergicreaction.“J．Immunol．(インターナショナル、イミュノロジー)、5、47；Haak-Frendscho M.,Ridgway L.,Shiel ds R.,Robbins K.,Gorman C.,Jardieu P、1993、“Human IgE receptor a-chain IgG chimera blocks passive cutaneous anaphylaxis reaction in vivo.”ジャーナルオブイミュノロジー151，351)が、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用の競合的阻害物質として研究されてきた。マスト細胞の脱顆粒化反応を誘発せずに、ＩｇＥの受容体との結合をブロックし得る、ＩｇＥに対するモノクローナル抗体(B aniyash M.,Exhhar Z.,1984,“Inhibition of IgE binding to mast cells and bashopils by monoclonal antibodies tomurine IgE.”欧州ジャーナルオブイミュノロジー、14，799)、またはＦｃεＲ（Kitani S.，Kraft D.，Fischler C. ,Mergenhagen S．E.，Siraganian R.R,1988，“Inhibitaion of allergic react ions with nomoclonal antibody to the high affinity IgE receptor.”ジャーナルオブイミュノロジー、140、2585）も研究されてきた。しかし、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの親和性は非常に高い（Ｋ_M＝１０^-10Ｍ）ため、一旦受容体と結合すると、ＩｇＥ分子は細胞膜に数週間付着した状態を保つことができる。さらに、マスト細胞は低い受容体占有率で活性化し得る。マスト細胞の脱顆粒反応を引き起こすには、受容体の５％ほどの少ないクロスリンケージで十分である。この系のこれら２つの特徴は、競合的物質による阻害を妨げ、臨床的価値を限定している。我々の抗アレルギー分子は、はるかに少ない程度でＩｇＥと競合することができることに依存している。キメラタンパク質は、占有されていないＩｇＥ受容体を介して標的細胞に一旦入ると、標的細胞に影響を及ぼす。さらにマスト細胞の突然変異における受容体の早期の発現は、未成熟の標的細胞を、それがメディエイタを放出し得ないうちに、それらを削除することを可能とするだろう。受容体は幹細胞には発現しないので、骨髄へのダメージはおよそ考えられない。ＩｇＥシステムは、かなり複雑であり、多彩である。ＩｇＥとその結合構造の間の相互作用は、アレルギー反応の他に多くの機能をもち、そのいくつかは出現し始めたばかりである。ＩＬ−４に対するモノクローナル抗体、ＩＬ−４受容体もしくは低親和性のＩｇＥ受容体は、マウスにおいてＩｇＥの発現を削除したが、より一般的な免疫抑制効果をもつ。従って、高親和性でＩｇＥ受容体を標的とし、ＩｇＥシステム全体を標的としない本発明が有利であることは明白である。発明の要旨本発明は、一般的にアレルギー性反応の治療のための新しいアプローチに関する。それは、キメラ細胞毒Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀によるＦｃεＲＩ受容体を発現する細胞の標的とされた削除を基礎とする。マウスＩｇＥ分子のＦｃ郊位のアミノ酸３０１−４３７をコードする配列はＰＥ₄₀に遺伝的に融合しており、細胞結合ドメインを欠くＰＥの切形である。Ｅ．コリ（E.coli）に作られたこのキメラタンパク質は、Fc εＲＩ受容体を発現するマウスのマスト細胞ライン及び骨髄由来の一次マスト細胞を、特異的かつ効果的に殺傷する。本発明は、ＦｃεＲＩ発現細胞の標的とされた削除によるアレルギー反応の治療に特に有用なキメラタンパク質を提供する。前記キメラタンパク質は、ＦＣε ＲＩ発現細胞のための細胞標的部分及び細胞キラー部分を含む。好ましいキラー部分は、細菌毒シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）である。このシュードモナスエキソトキシンはシュードモナスエラジノーザの産物である。また、本発明は、前記タンパク質の調製方法に関する。このキメラタンパク質は、マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位をＰＥ₄₀に遺伝的に融合されることによって調製される細胞結合ドメインを欠くＰＥの切形である。また、本発明は、アレルギー性疾患の治療及び過形成及び悪性腫瘍の治療のための薬剤組成物であって、活性成分、前記キメラタンパク質および一般的なアジュバント物を含む薬剤組成物を提供する。さらに、本発明は、マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位のＰＥへの遺伝的な融合、必要であれば、一般的なアジュバント物の添加を含む薬剤組成物を調製するための方法に関する。本発明の薬剤組成物は、注射、局所適用または経口投与に好適ないずれの形態でもよい。発明の詳細な説明本発明のＦｃ−ＰＥキメラタンパク質は、存在する公知の薬剤と比べ、多くの利点を有する。１．特異性：Ｆｃ−ＰＥは特異性が高く、アレルギーメディエイタの放出の原因となる細胞（マスト細胞及び好塩基球）に影響を及ぼす。それはアレルギー性の発作を防ぐため、予防療法として高い価値をもち得る。２．毒性：Ｆｃ−ＰＥは、エフェクター細胞には作用するが、標的器官には作用しないため、たとえ認められたとしても、副作用は僅かである。さらに受容体は、幹細胞には発現しないため、骨髄や免疫抑制へのダメージは考えられない。この治療の終了後、数週間で正常な生理状態の再現が期待できる。３．作用の持続性：マスト細胞の成熟には数週間かかるので、Ｆｃ−ＰＥの効果は長期間持続する予測され、頻繁に投与する必要がない。さらに、生体外での研究によれば、細胞のタンパク質合成の８０％が４時間以内に減少することが観察されている。Ｆｃ−Ｐｅの誘導時間は比較的短いと考えられているため、アレルギー反応の急性期での使用が可能である。Ｆｃε−ＰＥはまた、全身性のマスト細胞症（良性及び悪性）及び好塩基球性白血病等のようなマスト細胞や好塩基球の過形成や悪性腫瘍の治療に効果的といえる。化学療法には重篤な副作用があるので、良性の肥満細胞症の患者には適さない。一方、悪性疾患の治療には良好な臨床プロトコールが存在しない。Ｆｃε −ＰＥキメラタンパク質は、高力価で選択的であるため、ＦｃεＲＩ受容体を発現する細胞に関与する良性の症状にも悪性の症状にも使用できる。下記実験結果は、本発明のＦｃ_2'-3−ＰＥ₄₀キメラタンパク質が、効果的で選択的なアレルギー治療の有望な候補であることを示している。本発明は、Ｆｃε−ＲＩ発現細胞の標的とされた削除による、特に喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー等のアレルギー性反応の治療に有用な、Ｆｃε−ＰＥキメラ細胞毒性タンパク質を提供する。下記の実験によって、前記発明をさらに説明する。これらの実験は、発明の範囲を限定することを意図するものでなく、それを実証し、明らかにすることを意図するものである。１．Ｆｃε−ＰＥ₄₀キメラタンパク質の作製キメラタンパク質の標的部分として、マウスＩｇＥの定常領域（Ｆｃε）の分画を使用する。それは、ヒトにおいてもマウスにおいても高親和性でＩｇＥ受容体と結合するからである(Conrad D.H.,Wingard,J.R.,Ishizaka,T.，1983，"The interaction of human and rodent IgE with the human basophil IgEreceptor. "ジャーナルオブイミュノロジー130、327)。ドメイン２のＣＯＯＨ末端及びドメイン３の全体（Ｃ₂’−Ｃ３）を含む、a.a ．301-437に対応する配列を使用した。また、Ｃ₂−Ｃ₄ドメインの全体を含む、a .a.225-552に対応する配列も使用した。これらの分画のｃＤＮＡを、ＩｇＥを分泌するためにクラス変換されたマウスＢ細胞から単離したＲＮＡ及び特異的な一組のプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって得た。週齢６週のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓から取ったＢ細胞を、抗Ｔｈｙ１．２及びウサギ補体を使用した陰性選択により分離した。細胞２×１０⁶cells／mlを、リポポリサッカライド（ＬＰＳ，１０μｇ/ｍｌ）及びＩＬ₄（５００ｕ／ｍｌ）の存在下で５日間インキュベートし、ＩｇＥ産生のためのクラス変換を誘発させた。５日後、全ての細胞ＲＮＡを単離した(ＲＮＡｚｏｌＴＭＢ分離キット。バイオテックラバラトリース（BIOTECK Laboratories)ヒューストン、米国)。次に、逆転写システム（プロメガ、米国）を製造者の推奨する条件の下で使用して、全てのＲＮＡ（２．５μ ｇ）を一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。そのｃＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（トリスＨＣＬ；１０ｍＭ、ｐＨ７．６、ＥＤＴＡ；１ｍＭ）で総体積が１ｍｌになるまで希釈した。使用するまで４℃で保存した。Ｆｃε分画を、ｃＤＮＡと一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲで得た。Ｆｃε_2'-3配列は、5'-GCG GAT CCC ATA TGG AGC AAT GGA TGT CGT-3’（センス、遺伝子銀行配列Ｊ００４７６のヌクレオチド４０６から開始）及び5'-GCG GAT CCC ATA TGT GGG GTC TTG GTG ATG GAA C-3'（アンチセンス、ヌクレオチド８１３から開始）を、そしてＦｃε_2-4配列は、5'-GCG GAT CCC ATA TGC GAC CTG TCA ACA TCA CTG-3'(センス、ヌクレオチド１７５から開始)及び5' -GCG GAT CCC ATA TGG GAG GGA CGG AGG GAG G-3'（アンチセンス、ヌクレオチド１１６７から開始）であった。合成オリゴヌクレオチドを、アプライドバイオシステム（Applied Biosystem ）ＤＮＡ合成機で合成し、オリゴヌクレオチド浄化カートリッジで浄化した。増幅にはベントポリメラーゼ酵素(vent polymerase enzyme)(バイオラボ(Biolabs) )を使用した。反応混合物をＤＮＡ熱サイクラー（ＭＪリサーチ社、米国）で３３サイクルインキュベートした。各サイクルは、９５℃で１分、アニーリング温度で１分、７２℃で１分とした。各プライマー対に使用したＭｇＳＯ₄濃度とアニーリング温度は、ＦＣ_2'-3'では２．５ｍＭ、６１℃、ＦＣ_2-4では２ｍＭ、５７℃であった。ＩＬ₂−ＰＥ₄₀をコードするｐＨＬ９０６プラスミッドについては前述した(Fi shman A.，Bar-Kana Y.，Steinberger I.，Lorberboum-Galski，H.,1994，"I ncreased cytotoxicity of IL2-PE chimeric proteins containing targeting s ignal for lysosomal membranes."バイオケミストリー(Biochem.)33，6235)。ｐＨＬ９０６プラスミッドをＮｄｅｌで切断し、3596bp.のより大きな分画を得た。上記Ｆｃε分画をｐＨＬ９０６のＮｄｅｌ部位に挿入した。得られたプラスミッド、それぞれ５’からＰＥ₄₀まで融合され、それぞれ、Ｃ₂’−Ｃ₃及びＣ₂− Ｃ₄をコードするｐＡＦ２３０２及びｐＡＦ２４１５は、制限及び配列分析により確認した(結果は示さない)。エシェリヒアコリ株ＨＢ１０１を形質転換とプラスミド調製に使用した。２．キメラタンパク質の発現と部分的精製新しく作られたキメラタンパク質である、プラスミッドｐＡＦ２３０２によってコードされたＦｃε−ＰＥ₄₀を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を溶原形態及び誘導可能形態でもつＥ．コリ（E.coli）株ＢＬ２１（ラムダＤＥ３）に発現させた。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ最終濃度）の存在下で、Ｏ．Ｄ．₆₀₀０．５で１８０分誘導した。細胞を発現するペレットを、リゾチーム（lysosyme）０．２ｍｇ/ｍｌを含むTE緩衝液（トリス；５０ｍＭ、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ；１ｍＭ）中で懸濁し、超音波処理し(３０ｓバースト３回)、30 000Ｘｇで３０分間遠心分離した。上澄み（可溶性画分）を取り除き、分析を続けた。ペレットを抽出緩衝液（塩酸グアニジン；６Ｍ、トリス；０．１Ｍ、ｐＨ８．６、ＥＤＴＡ；１ｍＭ、ＮａＣｌ；０．０５Ｍ、ＤＴＴ；１０ｍＭ）中で変性し、４℃で３０分間攪拌した。その懸濁物を30000Ｘｇで１５分間遠心分離することによって洗浄し、ペレットを捨てた。その後、上澄みを、トリス；０．１Ｍ(ｐＨ８．０)、ＥＤＴＡ；１ｍＭ、ＮａＣｌ；０．２５ｍＭ、Ｌ-アルギニン０．２５ｍＭで１６分間透析した。その透析物を15000Ｘｇで１５分間遠心分離した。そして得られた上澄み（可溶性画分、塩酸グアニジン処理）をキメラタンパク質源として使用した。タンパク質を、ゲル電気泳動法によって確認した(図２)。全細胞抽出物のタンパク質断面から、キメラタンパク質が高濃度で発現していることがわかった。タンパク質を、ＰＥ（図３Ａ）に対する抗体及びＩｇＥ(セロテック、英国)( 図３Ｂ)に対する抗体を使用したウエスタンブロット分析でさらに確認した。電気泳動にかけたサンプルをニトロセルロース上に移し、記載のように免疫ブロットした(Lorberboum-Galski，H．Fitzgerald，D.J.，Chaudhary V，Ashya S.，Pa stan I.,1988，"Cytotoxic activity of an interleukin 2−Pseudomonas exoto xin chimeric protein produced in Escherichia coli." Proc.Natl.Acad．Sci .USA，85，1992.)。ベクスタティンＡＢＣキット(Vectastain ＡＢＣ Kit)(ベクターラバラトリー、米国)を製造者の指示に従って使用した。キメラは、両抗体に反応した。こうしてインフレーム無削除キメラタンパク質のクローニングと産生を確認した。発現細胞の細胞下分画によれば、不溶性分画（本体を含む）は、特にキメラタンパク質が豊富であることが明らかになった(図２)。従って、この分画をキメラタンパク質源として使用した。テストしたサンプルのＡＤＰリボシル化活性を、前述のように、延長因子２が豊富な小麦遺伝子抽出物を基板として使用して測定した。それによって、新規なキメラタンパク質が、酵素的に活性であることが明らかになった（結果は示していない）。３．Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀キメラタンパク質のマウスマスト細胞ライン上へ及ぼす効果キメラタンパク質の細胞毒効果を、ＦｃεＲＩ受容体を発現することで知られている様々なマウスマスト細胞ラインでテストした。キメラタンパク質の細胞毒活性をタンパク質合成の阻害によって評価した。このとき、[³Ｈ]ロイシン組込みによって測定した。リン酸緩衝生理食塩水中のウシ血清アルブミン０．２５％で希釈した様々な濃度のキメラタンパク質を、２０時間、９６ウェルプレートにシードされた細胞２×１０⁴cells／０．２mlに添加し、続いて、２μＣｉの[³Ｈ ]ロイシンで８時間パルスした。その結果を、細胞をキメラタンパク質に曝さなかった対照実験に対するパーセンテージで表した。全てのアッセイは、３種の個別の実験で３回行った。ＦｃεＲＩ受容体を発現する３つの標的細胞ラインを使用した。その３つの細胞ラインは、マウス胎児の肝臓に由来し、その成長をＩＬ₃に依存しているマスト細胞であるＭＣ−９、マウスの骨髄に由来するＩＬ₃依存型マスト細胞であるＣ５７及びマウスの妊娠中期の未成熟胎盤に由来するアベルソン（Abelson）ウィルス形質転換マスト細胞ラインである。Ｆｃε−ＰＥ₄₀は、テストした全ての細胞ラインにおいて、用量依存的に細胞毒的であることがわかった(図４)。ＭＣ−９ラインとＣ５７ラインは、キメラ毒に極端に感受性があり、５０％感染量は、それぞれ５０−７５ｎｇ/ｍｌ、１００ −１２５ｎｇ/ｍｌであった。アベルソン細胞ラインは、感受性はそれほど強くなかった(５０％感染量は１２００−１５００ｎｇ/ｍｌであった)。４．Ｆｃε−ＰＥ₄₀反応の特異性Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀活性の特異性を証明するために、２つの対照タンパク質、ＰＥ₄₀及びＦｃ_2'-3−ＰＥ_40Mを作製し、標的細胞及び非標的細胞に対するそれらの効果を評価した。Ｆｃ_2'-3−ＰＥ_40Mを作製するために、ＰＥのＣ末端で１２２アミノ酸をコードする部位をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩとともに存在させて(exi sed)、アミノ酸５５３に欠失をもつ対応分画で置換した。予想していた通り、固有の標的能力を持たないＰＥ₄₀は、標的細胞ラインに何らの効果も及ぼさなかった(図４)。変化した、酵素的不活性形態のＰＥ₄₀に結合したＦｃ_2'-3部分を持つＦｃ_2'-3−ＰＥ_40Mも、標的細胞に対して細胞毒性を示さなかった(図４)。さらに、全マウスＩｇＥ（４０μｇ/ｍｌ、図５Ａ）もしくはαＰＥポリクローナル抗体（１０μｇ/ｍｌ、図５Ｂ）によって、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀の標的細胞に対する細胞毒効果をブロックすることができた。Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀の効果についても、様々なマウス非標的細胞ラインにおいてテストした(表１)。ヘモポエティックオリジン（hemopoetic origin）の全ての細胞ラインは、キメラタンパク質による影響を受けなかった。驚いたことに、線維芽細胞ライン及び血腫細胞ラインは、５０％感染量の値がＭＣ−９細胞に比べて２０倍も高かったにも関わらず、キメラ毒性に対してある程度の感受性を示した(表１)。上記データは、Ｆ_2'-3−ＰＥ₄₀のマスト細胞ラインに対する毒性効果が細胞中のキメラの細胞毒部分（ＰＥ₄₀）を標的とするＦｃ_2'-3部分によって仲介された特異的反応によるものであることを実証している。５．キメラタンパク質が一次マスト細胞に及ぼす効果新鮮なネズミのマスト細胞は、確立された細胞ラインとは異なる反応をする可能性があるので、我々は、正常なマウスからとった一次マスト細胞を用いて、Ｆｃ_2'-3− ＰＥ₄₀に対する感受性についてテストした。ＩＬ₃の存在下で２週間培養すると、マウスの骨髄は、未熟なマスト細胞のモルフォロジーをもつほぼ純粋な細胞集団に分化し、粒剤を含有し、ＦｃεＲＩ受容体を発現した。週齢４〜６週のＢＡＬＢ／Ｃマウスを屠殺し、それらの骨髄を、無菌で、大腿骨から冷たい０．９％ＮａＣｌに流し入れた。その細胞懸濁物を０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、３００Ｘｇで１０分間遠心分離し、最後に、ＲＰＭＩ１６４０培溶液中で再び懸濁した。その培溶液は、熱不活性化された胎児性子ウシ血清；１０％、Ｌ−グルタミン；４ｍＭ、ピルベートナトリウム(sodium piruvate)；１ｍＭ、非必須アミノ酸；０．１ｍＭ、βメルカプトエタノール；５×１０^-5Ｍ、ペニシリン；１００ｕ/ｍｌ、ストレプトマイシン；１００μｇ/ｍｌ並びに組換えマウスＩＬ₃；２０ｕ/ｍｌを含む。細胞は、組識培養フラスコ内で、１０⁶ 細胞／ｍｌの密度で、３７℃で、５％ＣＯ₂湿度雰囲気のもとで、２〜３週間で成長した。７日毎に培地を変えた。組換え型ＩＬ₄（１０ｕ/ｍｌ）は、開始７日目から培溶液中に添加した。突然変異の割合を追跡するために、細胞を、スライド上にのせ、酸性のトルイジンブルー（ｐＨ１．０）を染色し、オイルの存在下で顕微鏡で調べた。キメラタンパク質の効果を、培養１６日目にマスト細胞から誘導された骨髄（ＢＭＭＣ）についてテストした。図６に示すように、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀は、ＢＭＭＣに対し用量依存的に細胞毒性を示した。５０％感染量は１２５ｎｇ/ｍｌであった。キメラタンパク質の用量が多いときは、タンパク質合成はほぼ１００％阻害された。対照タンパク質Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀もしくはＰＥ₄₀で、ＢＭＭＣに対して細胞毒性を示したものはなかった(図６)。従って、一次マスト細胞は、キメラタンパク質に対して、確立されたマスト細胞ラインと同様の反応を示した(図４、６)。６．Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀の受容体特異性高親和性のＦｃεＲＩ受容体とは別に、他に３つの膜表面構造が、低い親和力でＩｇＥと結合していることが報告されている。それらは、低親和性のＦｃεＲＩＩ受容体、εＢＰガラクトシド結合タンパク質(ＭＡＣ−２またはＣＢＰ３５とも呼ばれる)及びＦｃｙＲＩＩ/ＩＩＩ受容体である。これらの構造は、種々の細胞、主にヘモポエティックオリジンの細胞に見られるが、線維芽細胞（εＢＰ）にも見られる。ＦｃγＲＩＩ/ＩＩＩとεＢＰは、ＦｃεＲＩに加えて、マスト細胞膜上に見られるようである。我々の目標は、マスト細胞だけを標的とすることであるので、キメラタンパク質がこれらの構造を認識せず、従って、それらによってインターナライズされないことを証明する必要がある。理論的には、我々のキメラタンパク質は、低親和性のＩｇＥ結合構造ＦｃεＲＩＩ，εＢＰ及びＦｃγＲＩＩ/ＩＩＩの結合要件を満たしていない。ＦｃεＲＩＩは、ε-鎖ダイマーと結合したジスルフィドとだけ結合し、一方、我々のタンパク質は、二量重合に必要なドメイン４を欠く。εＢＰは、グリコシル化されたＩｇＥとだけ結合する。細菌中で産生したＦｃ_2'-3−ＰＥ₄₀はグリコシル化されない。ＦｃγＲＩＩ /ＩＩＩは、ＩｇＥ免疫複合体（immunocomplexes）とは結合するが、遊離ＩｇＥとは結合しない。にもかかわらず、受容体結合についての実験は必要であった。 εＢＰ及びＦｃγＲＩＩ/ＩＩＩに関する実験を、ＦｃεＲＩに加えて、これらの受容体を発現することが知られているＣ５７マスト細胞で行った。これは、キメラタンパク質がＦｃγＲＩＩ/ＩＩＩ受容体によって細胞に入り得るかどうかをテストするために、キメラタンパク質の添加前に、細胞を２．４Ｇ２抗体( ファーミゲン(Pharmigen))（５０μｇ/ｍ）とともに、プレインキュベートした。ＦｃγＲＩＩ受容体及びＦｃγＲＩＩＩ受容体の両方の細胞外ドメインと結合している、このモノクローナル抗体は、ＩｇＥ結合の競合的阻害物質であることが判明した。図７Ａから明らかなように、対照細胞と抗体を用いてプレインキュベートした細胞との間には、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀に対する細胞の反応における違いはなかった。次に、我々は、εＢＰがＦｃ_2'-3−ＰＥ₄₀の細胞毒性に関与しているかどうかを調べた。εＢＰは、炭水化物決定部位の膜に付着するので、ラクトースを培地に添加すると細胞表面からの解離を引き起こす。Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀に対する細胞反応には、ラクトースの有無による違いがないことがわかった(２５ｍＭ、図７Ｂ)。２．４Ｇ２抗体及びラクトースの存在下で、キメラタンパク質に部分的に反応することが分かっている線維芽細胞ラインについて、追加実験を行った(表１)。また、処理した細胞と対照細胞とでは、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀細胞毒性の違いはなかった(結果は示していない)。ＦＣ_2'-3−ＰＥ₄₀がＦｃεＲＩＩをもつ細胞に対して効果を示すかどうかをテストするために、０．１２Ａ３細胞ライン、ＦｃεＲＩＩ受容体を発現するマウスＢ細胞ハイブリドーマを使用した。０．１２Ａ３細胞は、高用量のときでも、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀に全く反応しなかった(＞５０００ｎｇ/ｍｌ、図８Ａ)。このラインは、長時間培養において受容体を失うので、その後、受容体（Pharmigen ）に対するＢ３Ｂ４抗体を用いたＦＡＣＳ分析によるアッセイを行った。その結果、受容体が細胞の５４％において発現することがわかった(結果は示していない)。ＬＰＳ（５０μｇ/ｍｌ）とともに、１６時間、プレインキュベートして、ＦｃＥＲＩＩの発現を刺激した新しいマウスのＢ脾臓細胞（splenocytes）について追加実験を行った。ＦＡＣＳ分析によって定義されているように、細胞の６９％に受容体に発現したにもかかわらず、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀はこれらのＢ脾臓細胞に対して何の効果も示さなかった(図８Ｂ)。集合的に、これらの結果は、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀は、低親和性ＩｇＥ結合構造、即ち、ＦｃＥＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ並びにεＢＰとは結合しないことを示唆している。７．Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀が細胞脱顆粒反応に及ぼす効果ＦＣ_2'-3−ＰＥ₄₀が臨床適用される可能性があるために、ＦＣ_2'-3−ＰＥ₄₀を用いたマスト細胞の治療の結果、キメラタンパク質とＦｃεＲＩとの結合によるアレルギー性メディエータの放出が起こるかどうかをテストすることは重要である。 [³Ｈ]−ヒドロキシトリプタミン（１０μｃｉ/ｍｌ）で一晩前標識したＣ５７細胞を洗浄し、これを９６ウェル組識培養プレートの各ウェルの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に、細胞濃度２×１０⁵（cells／well）で入れた。そして、このプレートを、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀（１０μｇ/ｍｌ）とともに３７℃でインキュベートした。様々な時点で、上澄みを分離し、セレトニンの上澄み中への放出を測定した。非標識細胞もＦｃ_2'-3−ＰＥ₄₀とともに、インキュベートし、[³Ｈ]ロイシンとともに、同じ時間間隔で１時間パルスし、キメラ毒素によるタンパク質合成阻害を測定した。キメラタンパク質添加の３０分後、４時間後、８時間後において、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀で処理した細胞と、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀で処理していない細胞との間には、上澄み中の[³Ｈ]セレトニン含有量に違いはなかった(図９Ａ) 。タンパク質合成の阻害は４時間で８０％に達し、８時間で９０％の値を示した (図９Ｂ)。これらの結果は、受容体が結合する間もしくはタンパク質合成阻害時、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀がアレルギー性メディエイタを放出しないことを示唆する。８．Ｆｃε−ＰＥ₄₀の電気泳動による確認電気泳動されたサンプルのウェスタンブロット分析を非還元性条件下（サンプル緩衝液から２−メルカプトエタノールを除去）で行ったところ、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀キメラタンパク質は、専らモノマーとして存在することが明らかになった( 図１０ｂ)。天然のＰＡＧＥとして、２−メルカプトエタノールをサンプル緩衝液から除去し、そのサンプルは加熱しなかった。さらに、ＳＤＳを同体積のゲル状の水、サンプル緩衝液と電極移動緩衝液で置換した。変性しない条件の下で、キメラタンパク質は広帯域で移動した(図１０ｃ)。単一の天然システムでは、モル重量、電荷及びタンパク質電気泳動移動度の形態の効果を明らかにすることはできなかった。しかしながら、その帯域内の分子の近くでは、それらはこれらのパラメータについて大きな違いがないことを示している。９．インターナリゼーションアッセイキメラタンパク質の生体外活性は、インターナリゼーションのみにおいて達成された。キメラタンパク質がインターナライズするかどうかをテストするため、細胞５×１０⁵cells／３ｍｌを２０μｇのキメラタンパク質とともに、、３７℃ で１時間インキュベートした。冷たいＰＢＳで３回洗浄した後、ペレットを０．５ｍｌの酸溶液(ＮａＣｌ；０．１５Ｍ、酢酸；０．１５Ｍ、(ｐＨ３))で氷の上で３分間処理し、膜に結合したキメラタンパク質を取り除いた。その後、５０％ＦＣＳの添加によってｐＨを中和し、続けて、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで３回洗浄した。細胞ペレットを０．３ｍｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＮａＣｌ；１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ；１ｍＭ、トリスＨＣｌ；２０ｍＭ、ｐＨ７．４、フェニルメチルスルホニルフルオリド；１ｎＭ、１５％ＳＤＳ，１％デオキシクロリックアシド (deoxycholyc acid)、１％ノンイデット（nonidet）p-40）で溶解した。様々なサンプルについて、α―ＰＥ及びＦＣＬ検出システム（アメルシャム(Amersham) ）とともに、、電気泳動と免疫ブロットを行った。ウェスタンブロット分析によって、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀キメラタンパク質が標的細胞中にインターナライズすることが明らかになった(図１１)。１０．Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀が細胞脱顆粒反応に及ぼす効果Ｃ５７細胞を、[³Ｈ]用−ヒドロキシトリプタミン（１０μｃｉ/ｍｌ）とともに、、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を３回洗浄し、遊離[³Ｈ]−ヒドロキシトリプタミンを除去し、２４ウェル組識培養プレート中のチロードの緩衝液(Tyrod's buffer)（Ｈｅｐｅｓ；１０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ；１３０ｍＭ、ＫＣｌ；５ｍＭ、グルコース；５．６ｍＭ、０．５％ＢＳＡ）に、細胞濃度２．５×１０⁵cells／０．５ｍｌで入れた。そして、これを、ＩｇＥ（１０μｇ /ｍｌ）とともに、４℃で１時間インキュベートした。その後、ＭｇＣｌ₂とＣａＣｌ₂を添加し、最終濃度をそれぞれ１ｍＭ、１．６ｍＭとした。続いて、ジニトロフェニルヒト血清アルブミン（ＤＮＰ−ＨＳＡ，５０ｎｇ/ｍｌ）とともに、３０分、もしくは異なる濃度のキメラタンパク質とともに、３７℃で数回、インキュベートした。細胞のない上澄みを遠心分離によって採取し、放出された[³Ｈ]−ヒドロキシトリプタミンの量を測定した。テストしたどの濃度のキメラタンパク質においても脱顆粒反応は観察されなかった(図１２a)。対照実験として、ＩｇＥでプレインキュベートした細胞を、同条件下でＤＮＰに曝した。ＤＮＰによる脱顆粒反応を誘発する効果をはっきり視認した(図１２a)。Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀は、標的細胞との相互作用の晩期においても、いかなる脱顆粒反応もひき起こさず(図１２ｂ)、一方で、タンパク質の合成を約８０％以上阻害する(図１２ｃ)。我々の実験結果から、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀は、細胞との相互作用におけるどの段階においても、脱顆粒反応を誘発しなかったことが判明した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年７月２９日（１９９７．７．２９）【補正内容】７．Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀が細胞脱顆粒反応に及ぼす効果Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀が臨床適用される可能性があるために、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀を用いたマスト細胞の治療の結果、キメラタンパク質とＦｃεＲＩとの結合によるアレルギー性メディエータの放出が起こるかどうかをテストすることは重要である。Ｃ５７細胞を、[³H]−ヒドロキシトリプタミン（１０μｃｉ／ｍｌ）とともに、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を３回洗浄し、遊離[³Ｈ]−ヒドロキシトリプタミンを除去し、２４ウェル組識培養プレートのチロードの緩衝液(Tyr od's buffer)(Ｈｅｐｅｓ；１０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ；１３０ｍＭ、ＫＣｌ；５ｍＭ、グルコース：５．６ｍＭ、０．５％ＢＳＡ)に、細胞濃度２．５ ×１０⁵cells／０．５ｍｌで入れた。そして、これを、ＩｇＥ（１０μｇ/ml）を用いて４℃で１時間インキュベートした。その後、ＭｇＣｌ₂とＣａＣｌ₂を添加し、最終濃度をそれぞれ１ｍＭ、１．６ｍＭとした。続いて、ジニトロフェニルヒト血清アルブミン（ＤＮＰ−ＨＳＡ，５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３０分、もしくは異なる濃度のキメラタンパク質を用いて３７℃で数回、インキュベートした。細胞のない上澄みを遠心分離によって採取し、放出した[³Ｈ]−ヒドロキシトリプタミンの量を測定した。テストしたどの濃度のキメラタンパク質においても脱顆粒反応は観察されなかった(図９ａ)。対照実験として、ＩｇＥでプレインキュベートした細胞を同条件下でＤＮＰに曝した。ＤＮＰによる脱顆粒反応を誘発する効果をはっきり視認した(図９a)。Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀は、標的細胞との相互作用の晩期においても、脱顆粒反応を起こさず(図９ｂ)、一方で、タンパク質の合成を約８０％以上阻止した(図９ｃ)。我々の研究結果から、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀ が細胞との相互作用におけるどの段階においても、脱顆粒反応を誘発しなかったことが判明した。【図１】【図２】【図３】【図４】【図４】【図５】【図５】【図６】【図７】【図７】【図８】【図９】【図９】【図１０】【図１１】【図１２】【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１月７日（１９９８．１．７）【補正内容】下記実験結果は、本発明のＦｃ_2'-3−ＰＥ₄₀キメラタンパク質が、効果的で選択的なアレルギー治療の有望な候補であることを示している。本発明は、Ｆｃε−ＲＩ発現細胞の標的とされた削除による、特に喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー等のアレルギー性反応の治療に有用な、Ｆｃε−ＰＥキメラ細胞毒性タンパク質を提供する。下記の実験によって、前記発明をさらに説明する。これらの実験は、発明の範囲を限定することを意図するものでなく、それを実証し、明らかにすることを意図するものである。１．Ｆｃε−ＰＥ₄₀キメラタンパク質の作製キメラタンパク質の標的部分として、マウスＩｇＥの定常領域（Ｆｃε）の分画を使用する。それは、ヒトにおいてもマウスにおいても高親和性でＩｇＥ受容体と結合するからである(Conrad D.H.,Wingard,J.R.,Ishizaka,T.,1983，"The i nteraction of human and rodent IgE with the human basophil IgE receptor. "ジャーナルオブイミュノロジー130、327)。ドメイン２のＣＯＯＨ末端及びドメイン３の全体（Ｃ_2'−Ｃ３）を含む、a.a ．301-437に対応する配列を使用した。また、Ｃ₂−Ｃ₄ドメインの全体を含む、a .a.225-552に対応する配列も使用した。これらの分画のｃＤＮＡを、ＩｇＥを分泌するためにクラス変換されたマウスＢ細胞から単離したＲＮＡ及び特異的な一組のプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって得た。週齢６週のＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓から取ったＢ細胞を、抗Ｔｈｙ１．２及びウサギ補体を使用した陰性選択により分離した。細胞２×１０⁶cells／mlを、リポポリサッカライド（ＬＰＳ，１０μｇ/ｍｌ）及びＩＬ₄（５００Ｕ/ｍｌ）の存在下で５日間インキュベートし、ＩｇＥ産生のためのクラス変換を誘発させた。５日後、全ての細胞ＲＮＡを単離した(ＲＮＡｚｏｌＴＭＢ分離キット。バイオテックラバラトリース（BIOTECK Laboratories）ヒューストン、米国)。次に、逆転写システム（プロメガ、米国）を製造者の推奨する条件の下で使用して、全てのＲＮＡ（２．５μｇ）を一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。そのｃＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（トリスＨＣＬ；１０ｍＭ、ｐＨ７．６、ＥＤＴＡ；１ｍＭ）で総体積が１ｍｌになるまで希釈した。使用するまで４℃で保存した。Ｆｃε分画を、ｃＤＮＡと一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲで得た。Ｆｃε_2'-3配列は、5'-GCG GAT CCC ATA TGG AGC AAT GGA TGT CGT-3’（センス、遺伝子銀行配列Ｊ００４７６のヌクレオチド４０６から開始）及び5'-GCG GAT CCC ATA TGT GGG GTC TTG GTG ATG GAA C-3'（アンチセンス、ヌクレオチド８１３から開始）を、そしてＦｃε_2-4配列は、5'-GCG GAT CCC ATA TGC GAC CTG TCA ACA TCA CTG-3'(センス、ヌクレオチド１７５から開始)及び5'-GCG GAT CCC ATA TGG GAG GGA CGG AGG GAG G-3'（アンチセンス、ヌクレオチド１１６７から開始）であった。合成オリゴヌクレオチドを、アプライドバイオシステム（Applied Biosystem ）ＤＮＡ合成機で合成し、オリゴヌクレオチド浄化カートリッジで浄化した。増幅にはベントポリメラーゼ酵素（vent polymerase enzyme）(ＴＭ)（バイオラボ (Biolabs)）を使用した。反応混合物をＤＮＡ熱サイクラー（ＭＪリサーチ社、米国）で３３サイクルインキュベートした。各サイクルは、９５℃で１分、アニーリング温度で１分、７２℃で１分とした。各プライマー対に使用したＭｇＳＯ₄ 濃度とアニーリング温度は、ＦＣ_2'-3'では２．５ｍＭ、６１℃、ＦＣ_2-4では２ｍＭ、５７℃であった。ＩＬ₂−ＰＥ₄₀をコードするｐＨＬ９０６プラスミッドについては前述した（F ishman A.，Bar-Kana Y，Steinberger I.，Lorberboum-Galski，H.，1994，" Increased cytotoxicity of IL2-PE chimeric proteins containing targeting signal for lysosomal membranes."バイオケミストリー（Biochem.）33，6235) 。ｐＨＬ９０６プラスミッドをＮｄｅｌで切断し、3596ｂｐ.のより大きな分画を得た。上記Ｆｃε分画をｐＨＬ９０６のＮｄｅｌ部位に挿入した。得られたプラスミッド、それぞれ５’からＰＥ₄₀まで融合され、それぞれ、Ｃ_2'−Ｃ₃及びＣ₂−Ｃ₄をコードするｐＡＦ２３０びｐＡＦ２４１５は、制限及び配列分析により確認した（結果は示さない）。エシェリヒアコリ株ＨＢ１０１を形質転換とプラスミド調製に使用した。５．キメラタンパク質が一次マスト細胞に及ぼす効果新鮮なネズミのマスト細胞は、確立された細胞ラインとは異なる反応をする可能性があるので、我々は、正常なマウスからとった一次マスト細胞を用いて、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀に対する感受性についてテストした。ＩＬ₃の存在下で２週間培養すると、マウスの骨髄は、未熟なマスト細胞のモルフォロジーをもつほぼ純粋な細胞集団に分化し、粒剤を含有し、ＦｃεＲＩ受容体を発現した。週齢４〜６週のＢＡＬＢ／Ｃマウスを屠殺し、それらの骨髄を、無菌で、大腿骨から冷たい０．９％ＮａＣｌに流し入れた。その細胞懸濁物を０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、３００Ｘｇで１０分間遠心分離し、最後に、ＲＰＭＩ１６４０培溶液中で再び懸濁した。その培溶液は、熱不活性化された胎児性子ウシ血清；１０％、Ｌ-グルタミン；４ｍＭ、ピルベートナトリウム(sodium piruvate)；１ｍＭ、非必須アミノ酸；０．１ｍＭ、βメルカプトエタノール；５×１０^-5Ｍ、ペニシリン；１００ｕ/mＬストレプトマイシン；１００μｇ／ｍｌ並びに組換えマウスＩＬ₃；２０ｕ/ｍｌを含む。細胞は、組識培養フラスコ内で、１０⁶細胞／ｍｌの密度で、３７℃で、５％ＣＯ₂湿度雰囲気のもとで、２〜３週間で成長した。７日毎に培地を変えた。組換え型ＩＬ₄（１０Ｕ/ｍｌ）は、開始７日目から培溶液中に添加した。突然変異の割合を追跡するために、細胞を、スライド上にのせ、酸性のトルイジンブルー（ｐＨ１．０）を染色し、オイルの存在下で顕微鏡で調べた。キメラタンパク質の効果を、培養１６日目にマスト細胞から誘導された骨髄（ＢＭＭＣ）についてテストした。図６に示すように、ＦＣ_2'-3−ＰＥ₄₀は、ＢＭＭＣに対し用量依存的に細胞毒性を示した。５０％感染量は１２５ｎｇ/ｍｌであった。キメラタンパク質の用量が多いときは、タンパク質合成はほぼ１００％阻害された。対照タンパク質Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀もしくはＰＥ₄₀で、ＢＭＭＣに対して細胞毒性を示したものはなかつた(図６)。従って、一次マスト細胞は、キメラタンパク質に対して、確立されたマスト細胞ラインと同様の反応を示した(図４、６)。次に、我々は、εＢＰがＦｃ_2'-3−ＰＥ₄₀の細胞毒性に関与しているかどうかを調べた。εＢＰは、炭水化物決定部位の膜に付着するので、ラクトースを培地に添加すると細胞表面からの解離を引き起こす。Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀に対する細胞反応には、ラクトースの有無による違いがないことがわかった(２５ｍＭ、図７Ｂ)。２．４Ｇ２抗体及びラクトースの存在下で、キメラタンパク質に部分的に反応することが分かっている線維芽細胞ラインについて、追加実験を行った(表１)。また、処理した細胞と対照細胞とでは、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀細胞毒性の違いはなかった(結果は示していない)。ＦＣ_2'-3−ＰＥ₄₀がＦｃＥＲＩＩをもつ細胞に対して効果を示すかどうかをテストするために、０．１２Ａ３細胞ライン、ＦｃεＲＩＩ受容体を発現するマウスＢ細胞ハイブリドーマを使用した。０．１２Ａ３細胞は、高用量のときでも、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀に全く反応しなかった(＞５０００ｎｇ/ｍｌ、図８Ａ)。このラインは、長時間培養において受容体を失うので、その後、受容体（Pharmigen ）に対するＢ３Ｂ４抗体を用いたＦＡＣＳ分析によるアッセイを行った。その結果、受容体が細胞の５４％において発現することがわかった(結果は示していない)。ＬＰＳ（５０μｇ/ｍｌ）を用いて１６時間、プレインキュベートして、Ｆｃ εＲＩＩの発現を刺激した新しいマウスのＢ脾臓細胞（splenocytes）について追加実験を行った。ＦＡＣＳ分析によって定義されているように、細胞の６９％に受容体に発現したにもかかわらず、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀はこれらのＢ脾臓細胞に対して何の効果も示さなかった(結果は図示していない)。集合的に、これらの結果は、Ｆｃ_2'-3−ＰＥ₄₀は、低親和性ＩｇＥ結合構造、即ち、ＦｃεＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ並びにεＢＰとは結合しないことを示唆している。請求の範囲８．Ｆｃ６ＲＩ受容体を発現する細胞を生じるアレルギー性疾患の治療及び過形成及び悪性腫瘍の治療のための薬剤組成物であって、活性成分、請求項１から６に記載のキメラタンパク質および一般的なアジュバント物と含む薬剤組成物。９．アレルギー性疾患の治療及び過形成及び悪性腫瘍の治療のための請求項８に記載の薬剤組成物であって、前記組成物は、注射（静脈内、関節内、皮下、筋肉、腹腔内）、鼻内、硬膜内、皮内、経皮、吸入剤、局所投与、経口投与、持効性放出及び経腸ルートのために好適な形態である薬剤組成物。１０．請求項９に記載の好適な形態のいずれか１つの薬剤組成物を調製するための方法であって、マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位のＰＥへの遺伝的な融合及び、必要であれば、一般的なアジュバント物の添加を含む方法。１１．請求項１から５に定義したように、アレルギー反応の治療のため、ペプチドをコードするＤＮＡ分子に操作的に結合しているプロモータを含むプラスミド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヤルコーニ，サイイスラエル、91120 エルサレム、アインカレム、デパートメントオブセルラーバイオケミストリー、メディカルスクールオブハダサ (72)発明者ローバーブームガルスキー，ハヤイスラエル、91120 エルサレム、アインカレム、デパートメントオブセルラーバイオケミストリー、メディカルスクールオブハダサ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＦｃεＲＩ発現細胞の標的とされた削除によるアレルギー反応の治療のためのキメラタンパク質であって、前記キメラタンパク質は、ＦＣεＲＩ発現細胞のための細胞標的部分及び細胞キラー部分を含むキメラタンパク質。２．キラー部分が、細菌毒素シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）である請求項１に記載のキメラタンパク質。３．細胞標的部分が、マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位である請求項１に記載のキメラタンパク質。４．細胞標的部分及び細胞キラー部分が遺伝的に融合されている請求項１に記載のキメラタンパク質。５．マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位のアミノ酸２２５−５５２をコードする配列がＰＥ₄₀に遺伝的に融合しており、細胞結合ドメインを欠くＰＥの切形である請求項１に記載のキメラタンパク質。６．マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位のアミノ酸３０１−４３７をコードする配列がＰＥ₄₀に遺伝的に融合しており、細胞結合ドメインを欠くＰＥの切形である請求項１に記載のキメラタンパク質。７．喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎及びアナフィラキシーから選ばれるアレルギー性疾患に使用するための請求項１に記載のキメラタンパク質。８．ＦｃεＲＩ受容体を発現する細胞を生じるアレルギー性疾患の治療及び過形成及び悪性腫瘍の治療のための薬剤組成物であって、活性成分、請求項１から６に記載のキメラタンパク質および一般的なアジュバント物と含む薬剤組成物。９．アレルギー性疾患の治療及び過形成及び悪性腫瘍の治療のための請求項８に記載の薬剤組成物であって、前記組成物は、注射（静脈内、関節内、皮下、筋肉、腹腔内）、鼻内、硬膜内、皮内、経皮、吸入、局所投与、経口投与、持効性放出もしくは経腸ルートを含む他のルートにとって好適な形態である薬剤組成物。１０．請求項９に記載の薬剤組成物を調製するための方法であって、マウスＩｇＥ分子のＦｃ部位のＰＥへの遺伝的な融合及び、必要であれば、一般的なアジュバント物の添加を含む方法。１１．請求項１から５に定義するペプチドをコードするＤＮＡ分子に操作的に結合しているプロモータを含むプラスミド。