JP2000516574A

JP2000516574A - Ｉｌ―６アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するｉｌ―６およびｉｌ―６レセプター誘導ペプチド

Info

Publication number: JP2000516574A
Application number: JP10502722A
Authority: JP
Inventors: レーンフート，レオナルデュスアドリアニュスマリアホファルデュスファン; ヒューベルテュスニコラースフーベ，カスペル; ハンスメルーン，ロベルト
Original assignee: コステル，ヘンクウィルヘルムス
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2000-12-12
Also published as: WO1997048728A1; EP0928293A1; AU3193097A

Abstract

(57)【要約】本発明はＩＬ−６アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するＩＬ−６およびＩＬ−６レセプター誘導ペプチドに関する。該ペプチドは少なくとも５個のアミノ酸長を有し、以下のアミノ酸配列の一つから選択される。

Description

【発明の詳細な説明】ＩＬ−６アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するＩＬ−６およびＩＬ−６レセプター誘導ペプチド本発明はサイトカインの分野に関係する。サイトカインは免疫系細胞により産生され、体液性および細胞性免疫反応並びに炎症応答に関与する物質である。多くのサイトカインが知られているが、そのすべてが複雑な様式で生体中の種々の反応に影響を与えている。その相互依存性およびサイトカイン間に存在する相互関係の入り組んだ網目を説明するために、しばしば「サイトカイン・ネットワーク」について語られる。インターロイキン６（ＩＬ−６）は哺乳動物細胞に多くの効果を示すサイトカインである。それらの効果は特異細胞表面レセプターへの結合を通して発揮されるものであり、約８０ｋＤの分子量をもつ特異α−サブユニットおよびｇｐ１３０とも称される約１３０ｋＤの共通β−サブユニットから成る。ｇｐ１３０β鎖はまた、インタ一ロイキン−１１ (ＩＬ−１１)，白血病阻害因子(ＬＩＦ)，オンコスタチンＭ(ＯＭ)、毛様体好中球因子（ＣＮＴＦ）およびカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）のシグナル伝達に関与している(P.B.Sehgal,Llng Wang,Ravi Rayanade et al.，pp 1-14;volume 762，Annals of the New York Academy of Sciences;1995)。 IL-6は非常に多形質発現性であり、その活性は以下のとおりである。Ｂ細胞によるＩｇ産生誘発、ＢおよびＴ細胞生育剌激、Ｔ細胞およびマクロファージの分化、肝細胞による急性期タンパク産生誘発、多正統造血(multilineage hematopo esis)、破骨細胞形成、巨核球成熟、および血小板産生。ＩＬ−６はまた中枢神経系に影響する。ＩＬ−６は内因性発熱物質であり、下垂体によるＡＣＴＨ産生を誘発し、最終的には循環系での糖質コルチコイドレベル増大に至る。ＩＬ−６はすべての標的細胞に存在するトランスメンブラン・レセプターの引き金を引くことによりその活性を発現する。ＩＬ−６シグナル・カスケード中の特別の工程は親和性の低いα−鎖（ＣＤ１２６）への結合である。ＩＬ−６とα− 鎖との複合体は親和性の高いシグナル伝達β−鎖（ＧＰ１３０，ＣＤ１３０）と結合する。健常人ではその循環系中にまったくあるいはほんの僅かのレベルでしかＩＬ− ６が検出できない(＜１０ｐｇ／ｍｌ)。ＩＬ−６レベルは多くの疾患において増大し、これらのレベルの増大がこれらの疾患の発症機作において原因としての役割を演じていると仮定されている。ＩＬ−６レベルの増大しているのが見出されている疾患の例は、とりわけ、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳリンパ腫、ＡＩＤＳにおいて観察されるポリクローナルＢ細胞活性化、リウマチ様関節炎、心臓粘液腫とカッスルマン（Castleman）病、糸球体間質増殖糸球体腎炎、乾癬、がん関連悪液質、閉経後骨粗しょう症、敗血症、多発性全身性器官不全、アルコール肝硬変、およびアルツハイマー様中枢神経系疾患などである。上述疾患のいくつかについて、その病因におけるＩＬ−６の原因論的役割は、ＩＬ−６中和性モノクローナル抗体による第Ｉ相および第II相臨床試験から結論づけたものである。抗ＩＬ −６モノクローナル抗体で治療すると、発熱、急性期タンパク、夜間発汗、骨破壊、および悪液質を逆行させた。カッスルマン（Castleman）病の患者を抗ＩＬ −６モノクローナル抗体で治療すると、急性期タンパクレベル、発熱、貧血、血小板増加、および過ガンマグロブリン血症を低下させた。患者の改善もリウマチ様関節炎の患者で観察された。明らかに、これらの患者のＩＬ−６活性を減弱させるとその疾患の臨床症状が改善された。ＩＬ−６活性に拮抗させるこの種疾患の治療法は、ＩＬ−６に向けたモノクローナル抗体を使用することによる。しかし、モノクローナル抗体は通常ヒト由来のものではなく、非ヒトモノクローナル抗体を繰り返し投与すると、抗体が患者の身体に対して異物であるために、一般に抗体の一定部分に対して免疫応答が起こる。この治療に用いたモノクローナル抗体に対する免疫反応が、結局、それ自身治療処置に対して逆効果を招くことになる。用いたモノクローナル抗体は免疫系により産生された抗体により無効なものとなってしまう。第二に、非ヒトモノクローナル抗体を繰り返し投与することは、患者に有害な激しい免疫反応を誘発する可能性がある。抗原性の少ない抗体フラグメントを産生する方法とか、抗体をヒト化する方法が提案されているが、少しは可能性があるとしても、これらの方法はまったく経済的ではなく、その半減期および生物利用性においてもそれ自身問題を生じるだろう。従って、ＩＬ−６関連疾患の治療においてＩＬ−６モノクローナル抗体を使用することは、実現可能とは考えられない。ＩＬ−６の変異誘発に基づくインヒビターまたはアンタゴニストも提案されているが、例えば、ＩＬ−６，Ｑ１６０Ｅ／Ｔ１６３Ｐ（Brakenhoff，J.,deHon,F .，Fontaine，V.，et al;J．Biol．Chem.；269:86-93(1994))およびＩＬ−６，Ｑ１５９Ｅ／Ｔ１６２Ｐ（Ehlers，M.，de Hon，D.，KlaasseBos，H，et al.，J ．Biol．Chem.;270:8158−8163(1995)）などである。これらの変異タンパクについては、ＩＬ−６のレセプター結合およびＩＬ−６のシグナル伝達がインビトロで分割できることが示されている。しかし、このような変異タンパクはまた治療すべき患者の身体にとって異物でもあり、一般に治療に有害な起こって欲しくない好ましからざる免疫応答を誘発することになる。さらにそのような変異タンパクは、特異的なＩＬ−６活性を効果的にブロックあるいは阻害するが、同時にこれらのタンパクに存在する付加的になお残存する反応部位をもつサイトカインネットワークに他の影響を及ぼす可能性があるという理由で、部分的にのみ有効であるのかも知れない。そのような試薬での治療的処置は、他の未だ予測不可能な副作用を示すことになろう。以前に報告された変異ＩＬ−６およびＩＬ−６レセプターアンタゴニストの大きな不利益は、これらの分子がインビボでＩＬ−６に結合する代りに、担体として作用し、半減時間を延長し、結果としてインビボでのＩＬ−６活性を増大させることである。更に、これらの変異ＩＬ−６およびＩＬ−６レセプターアンタゴニストはその標的分子に対して低い親和性を有し、恐らく免疫原として作用する。更に、ＩＬ−６に対して樹立した抗体はＩＬ−６を安定化し、ＩＬ−６の産生を増大させることになる。これらのＩＬ−６に対する抗体での治療の結果、腎臓での濾過不能が予測されるので、安定なＩＬ−６−抗ＩＬ−６複合体として循環ＩＬ−６の蓄積が起こるだろう。非ヒト化ＩＬ−６抗体をヒト患者に繰り返し使用すると多分これらの抗体に対する抗体の産生を誘発し、免疫複合体の形成に至る(Heremans，H.，Dillen，C.，et al， J．Immuno．22，2395−2401)。本発明はＩＬ−６関連疾患の治療処置の可能性を妨害することなく上述の問題の解決法を提供するものである。抗体または変異体によりＩＬ−６活性を阻害する上記方法はここに記載した発明、すなわち、レセプターに対する結合部位において３つの様式で、すなわち、ＩＬ−６の部分で、α−レセプターの部分で、またはｇｐ１３０−レセプターの部分でＩＬ−６と拮抗する、あるいはＩＬ−６を活性化するペプチドとは大きく異なるものである。これらのアンタゴニストおよびアゴニスト、および確定した薬物動態学的特性を有する多量体ペプチドとして、もしくは単一ペプチドとしてのこれらアンタゴニストおよび／またはアゴニストの組合わせは、ＩＬ−６の生物活性を制御する強力な手段を提供する。本発明により提供される解決法をもってすれば、治療に対する免疫応答は起こらない。更に、予測不能な副作用発現が大幅に削減される。本発明はＩＬ−６のレセプター部位または標的細胞に存在するＩＬ−６レセプター（αおよびβ）と相互作用する合成ペプチドを提供する。更に本発明は、組み合せた場合に、ＩＬ−６のレセプター部位並びに標的細胞に存在するＩＬ−６レセプター（αおよびβ）と相互作用する合成ペプチドを提供する。これらペプチドの混合物は、当該ペプチドの薬理学的性質が最大の所望効果を得るために調整し得るので特に有用である。更に、半減時間が合成ペプチドに非天然アミノ酸を挿入することにより引き伸ばすことができる。当該ペプチドのアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性は、一つ以上のレセプター部位に対する二量体もしくは多量体ペプチドを製造することにより増大させることができる。そのような二量体もしくは多量体ペプチドは、例えば、１個またはそれ以上のリジンなどのアミノ酸を介してペプチドを結合することにより製造し得る(T am，PNAS 1988，85:5409−5413)。該ペプチドを標的臓器へ分布させるには、ペプチドの親水性または親油性を調整することにより、あるいは臓器マーカーと特異的に相互作用するペプチドにこれらのペプチドを結合させることにより最適化することができる。最後に、調製したペプチドは患者の体外血液循環回路に接続した膜またはフィルターの固相に結合させることができる。ＩＬ−６および／または可溶ＩＬ−６レセプターのより効率的な浄化をその方法により達成し得る。そのよな合成ペプチドは（Ａ）ＩＬ−６から誘導され得るか、または（Ｂ）ＩＬ−６のレセプターα鎖（ＩＬ−６Ｒα、ＣＤ１２６）あるいは（Ｃ）ＩＬ−６のレセプターβ鎖（ＩＬ−６Ｒβ、ＧＰ１３０，ＣＤ１３０）から誘導され、ＩＬ−６シグナル伝達カスケードの種々の組成および段階に対し、アンタゴニストおよびアゴニスト活性を示す。該ペプチドは公刊されたヒトＩＬ−６(Hirano,T. Yasukawa，I.，Harada，H，et al.，Nature 324，73-76(1986);Yasukawa，R.，H lrano，T.，Watanabe，Y．et al.，EMBO J．6:2939-2945(1987))、ＩＬ−６Ｒa （Yamasakl，K.，Taga，T.，Hirata，Y.，et al．;Science241:825-828(1988)) およびＩＬ−６β（Hibi，M.，Murakami，M.，Saito，M.;Cell 63:1149-1157(19 90)）からの重なり合ったアミノ酸配列の一組をテストすることにより見出された。これらの重なり合ったペプチドの各１２アミノ酸の長さを、アンタゴニストおよびアゴニストＩＬ−６活性用のアッセイによりテストした。本発明により提供されるペプチドはすべてＩＬ−６アッセイにおいて測定したとおり、ＩＬ−６シグナル伝達カスケードに対してアンタゴニストおよびアゴニストＩＬ−６活性を示す。本発明のペプチドは免疫応答を発現するには小さすぎる。更に、これらのものがさらなる反応性部位を含むには余りに短かすぎるので、このアンタゴニストおよび更にアゴニストであるペプチドは、上昇したＩＬ−６レベルを抑え、調整するために患者を処理するのに有利に用いることができる。以下に記載するすべてのアンタゴニストまたはアゴニストのアミノ酸は１文字コードで示してあり、Ｎ−末端（頭部）アミノ酸を最初（左端）に掲げ、Ｃ−末端（尾部）アミノ酸を末尾（右端）に掲げてある。Ａ．ＩＬ−６から誘導されるアンタゴニストペプチドは、好ましくは、以下の３領域から選ばれた少なくとも５個の連続したアミノ酸から成り、その配列は RYILDGISALRK、 STKVLIQFLQKKAKNLおよび ILRSFKEFLQSSLRALRQMである。Ｂ．ＩＬ−６のレセプターα鎖から誘導されるアンタゴニストペプチドは、好ましくは、以下の３領域から選ばれた少なくとも５個の連続したアミノ酸から成り、その配列は QLSCFRKSPLSNVVC PRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSおよび MCVASSVGSKFSKTQTFQGCである。ＩＬ−６のレセプターα鎖から誘導されるアゴニストペプチドは、好ましくは、以下の領域から選ばれた少なくとも５個の連続したアミノ酸から成り、その配列は EWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDである。Ｃ．ＩＬ−６のレセプターβ鎖から誘導されるアンタゴニストペプチドは、好ましくは、以下の４領域から選ばれた少なくとも５個の連続したアミノ酸から成り、その配列は PEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGR NFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTS WVEAENALGKVTSDHおよび PVYKVKPNPPHNLSVINである。上記ペプチドのいずれかから選択される比較的短いペプチド（短いもので一連の５個のアミノ酸）あるいは３０個のアミノ酸長を超えないペプチドは、ＩＬ− ６アッセイにより測定したときアンタゴニストまたはアゴニスト活性を示し、Ａ群、Ｂ群またはＣ群からのペプチドと共通の少なくとも一連の少なくとも５個のアミノ酸を有し、これらもまた本発明のペプチドである。本発明によるペプチドはその長さを変えることができる。また、Ａ群、Ｂ群またはＣ群からのペプチドと共通の一連の少なくとも５個のアミノ酸から成るペプチドは、該連鎖中の１個もしくは２〜３個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換えることにより改変することができる。そのようなアミノ酸は天然のアミノ酸のいずれから選択してもよいが、また、通常天然には存在しないアミノ酸を置換アミノ酸として用いることもできる。置換アミノ酸の選択は、例えば、ヒト以外の種からのＩＬ−６もしくはＩＬ −６レセプター配列と比較することにより、あるいは選択したペプチドに極端な機能的もしくはコンホメーションの変化を持ち込まないアミノ酸を選択することにより進めることができるが、他の選択法も用いることができる。更に特定すると、本発明は第一の観点で、少なくとも５個のアミノ酸、多くとも３０個のアミノ酸を含むペプチドであって、ＩＬ−６に対して、および／またはＩＬ−６レセプターのα鎖に対して、および／またはＩＬ−６レセプターのβ鎖に対してアンタゴニスト活性を示すペプチドに関する。また、本発明のもう一つの観点では、少なくとも５個のアミノ酸、多くとも３０個のアミノ酸を含むペプチドであって、それを使用する濃度に依存してアンタゴニストまたはアゴニストＩＬ−６活性を示すペプチドに関する。そのようなペプチドの一例は、ＩＬ−６レセプターのα鎖に見出されるアミノ酸配列 EWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAED を有するものを基本として選択したペプチドである。驚くべきことに、上述配列を基にして選択したペプチドは、高濃度でアンタゴニストＩＬ−６活性を示し、一方で、低濃度では明らかなアゴニスト活性を示した。アゴニスト活性はインビトロ・バイオアッセイにおいて７．５ないし120μｇ／ｍｌペプチドの濃度範ｍｌの濃度でＩＬ−６の生物活性にアンタゴニスト効果を及ぼした。このアゴニストペプチドは、インビトロで用いた場合と比較的等量ではあるが必ずしも同一ではない濃度で使用することができる。更に、本発明はペプチドの組合わせを提供するものであり、その組み合せは、Ａ群、Ｂ群またはＣ群から選択した数種の、場合により改変したペプチドの単純な混合物であるか、あるいはＡ群、Ｂ群またはＣ群から選択し、ペプチドを直接の化学結合によりまたはスペーサー分子を用いて、頭部と尾部、もしくは頭部と頭部、もしくは尾部と尾部で連結するか、または選択したペプチドに存在するアミノ酸の側鎖を介して連結し、場合により改変したペプチドである。そのようなペプチドの組合わせ例は、例えば、ペプチドSLTTKAVおよびILRSFKEFLQSS、またはWVEAENALGKVTSDHおよびRYILD、またはKAVLLVRKおよびKAVLLVRKを用いるものであるが、２もしくはそれ以上のペプチドから成る他の多くの組合わせも、Ａ群、Ｂ群またはＣ群に掲載されたペプチド類から選択することができる。そのようなペプチドの組合わせは、単純な混合物であるか、結合したペプチドであるが、ＩＬ−６シグナル伝達カスケードに起こる事象を抑止するために有利に用いることができる。その抑止は、例えば、ＩＬ−６とα鎖結合部位の双方で同時競合させることによりＩＬ−６がα鎖に結合するのを妨げること、あるいはＩＬ−６／α鎖複合体とβ鎖の結合部位で同時競合させることによる。本発明のペプチドは治療的または予防的目的の医薬的または薬学的製剤として好適に用い得る。更に、該ペプチドは、これらを固相に結合する透析法により罹患患者の血液から循環ＩＬ−６を除去するためのプロトコールに使用することができる。血液または血液濾過物をこのように結合したペプチドに通過させると、ＩＬ−６が固相上のペプチドに結合し、浄化するに至る。また、本発明によるペプチドを血液または血液濾過物に加え、（不）可逆的にＩＬ−６またはＩＬ−６レセプター分子に結合させ、体内に再投入する前にこれらを不活性化させてもよい。また、該ペプチドを診断テストに用いることもできる。例えば、ＩＬ−６レベルを測定するための直接結合または競合ベースの酵素結合免疫吸着アッセイ法に用いることができる。ＩＬ−６アゴニスト・ペプチドは、細胞培養物に加えるＩＬ−６に完全にまたは部分的に置き換えることができる。例えば、ＩＬ−６は、ＩＬ−６を成長因子として加えたＢ細胞ハイブリドーマのようなＩＬ−６依存性細胞を生育させるか、または培養するのに用いるが、細胞培養物も一般にはアゴニストＩＬ−６ペプチドを添加することから利益を得る。ヒトまたは動物に投与されたＩＬ−６アゴニストペプチドは、特異免疫原性物質に曝された宿主の免疫応答を増大させるのに用いることができる。ＩＬ−６アゴニストペプチドはヒトまたは動物に対して宿主の免疫系の応答性を高めるために投与することができる。具体的な用途は局所または乳腺内投与のための製剤にある。これらのアゴニストペプチドを記載のようにＩＬ−６アンタゴニストと組み合せる場合、過剰のＩＬ−６は基本的なシグナル伝達を失わずに阻害することができる。該ペプチドに対し特異的な抗体、およびその対応する抗イディオタイプ抗体も本発明の一部である。そのような抗体は、例えば、該ペプチドで初期に治療した患者に投与し、患者に対するペプチドの影響を和らげることができる。そのような抗体は上記の透析プロトコールおよび診断テストに用いることができる。該ペプチドの合成は技術上利用可能な方法に従って遂行できる。例示したペプチドの合成はバレリオ（Valerlo）ら（Int．J．Peptide Res.，42:1 9(1993)および／またはバレリオら（Int．J．Peptide Res.，44:148 165(1994)）の方法に従って実施した。合成ペプチドの大量製造法およびその精製は周知の技術である。本発明を以下の実施例に従って説明する。実験の部１．ペプチドの合成ＩＬ−６およびＩＬ−６レセプター分子内の活性中心を同定するための、実施例のペプチドは、バレリオ（Valerio）ら（Int．J．Peptide Res.,42:1-9(1993) ）および／またはバレリオら（Int．J．Peptide Res.，44:148-165(1994)）による方法を用いて合成した。多量体ペプチド（４分枝）は、合成されたアンタゴニストペプチド取込みのための足場物質として分枝オリゴリシンを分散させた系を用いて、固相法によって合成した(Tam，J.P.;Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85: 5409-5413(1998))。２．アンタゴニストＩＬ−６活性を測定するための増殖アッセイヒトＩＬ−６配列(Hirano,T.,Yasukawa,K.,Harada,H.,et al.;Nature324,73-7 6(1986);Yasukawa，R.，Hirano，T.，Watanabe Y.，et al;EMBO J.6:2939-2945( 1987))に由来する、それぞれ１２アミノ酸長を有する一組の重複ペプチド（それぞれのペプチドは、１１の共通アミノ酸を有するように１アミノ酸ずれている）を、細胞（Ｂ９）と共に３７℃でインキュベートした。１時間後、組換え型ヒトＩＬ−６（CLB，Amsterdam，The Netherlands）を３つの異なる濃度（２．５Ｕ／ｍｌ，５Ｕ／ｍｌ，１０Ｕ／ｍｌ）で添加した。ヒトＩＬ６Ｒａ(Yamasaki，K.，Taga，T.，Hirata，Y.，et al.;Science 241:825-828(1998))またはｇｐ１３０(Hibi,M.,Murakami,M.,Saito,M.;Cell63:1 149-1157(1990))に由来する、それぞれ１２アミノ酸長を有する一組の重複ペプチド（それぞれのペプチドは、１１の共通アミノ酸を有するように１アミノ酸ずれている）を、ＤＭＥＭで希釈しＨＴを添加した３つの異なる濃度のＩＬ−６（２．５Ｕ／ｍｌ，５Ｕ／ｍｌ，１０Ｕ／ｍｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、残存ＩＬ−６活性は、バイオアッセイで、Ｂ９マウスハイブリドーマ細胞のＩＬ−６依存性増殖を測定することにより測定した(Helle，M.，Boeije，L.，Aarden，L.A.; Eur．J．Ｉmmunol.18:1535-1540(19 88))。すなわち、ＩＬ−６を含まない培地内で対数増殖期にあるＢ９マウスハイブリドーマ細胞を回収し、５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ＋ＨＴ培地に、１×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。各５０μｌのＩＬ−６希釈液を、ＩＬ−６配列を表すそれぞれの合成されたペプチドと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。この混合物を平底型９６ウェル組織培養プレート（Greiner）内のＢ９細胞懸濁液５０μｌに加えたものを２つ用意し、３７℃，５％のＣＯ₂存在下に、７２時間インキュベートした。ＩＬ−６活性は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ， Sigma）を用いて評定した。各ウェルに２５μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解）を添加し、さらに３７℃で４時間インキュベートした後、１００ｕｌの溶解緩衝液（２０％ｗ／ｖＳＤＳ−５０％ジメチルホルムアミド）を加えた。その後、３７℃で一晩インキュベートを続け、翌朝、５７８ｎｍにおける吸光度を測定した。ＩＬ−６レセプターａまたはｂの配列から合成されたペプチドの、ＩＬ−６に対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を測定するために、これらのペプチドを種々の濃度で５０μｌのＢ９細胞懸濁液（５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ＋ＨＴ培地中に１×１０⁵細胞／ｍｌ）と混合した。この懸濁液を３７℃で１時間インキュベートし、それぞれＩＬ−６の希釈液と混合し、平底型９６ウェル組織培養プレート（Greiner）に入れた。プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。ＩＬ−６活性は上述のようにして評定した。合成ペプチドを含まないか偽ペプチドを含み、かつＩＬ−６を含む試料をポジティブコントロールとし、ＩＬ−６も合成ペプチドも含まない試料をネガティブコントロールとして用いた。ＩＬ−６活性の阻害または増大は、いずれもネガティブコントロールの吸光度によって補正した、試験試料の吸光度と、ポジティブコントロールの吸光度との比を計算することによって決定した。３．ペプチドの毒性試験合成ペプチドがインビトロにおいて、赤血球(Ａ)、多形核細胞(Ｂ)、または肝細胞(Ｃ)に対して毒性を示さないかどうかを調べるために、３つの別個の試験を行った。Ａ．ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）をＰＢＳ中で５回洗浄した。ゼラチンを含むベロナール緩衝生理的食塩水に赤血球を懸濁して、１％（ｖ／ｖ）の赤血球懸濁液を調整した(ＧＶＳ：３．９ｍＭバルビタールナトリウム，１ｍＭ硫酸マグネシウム，０．３８ｍＭ塩化カルシウム，および１４５．６ｍＭ塩化ナトリウムの中に０．０３２％ゼラチン)。Ｕ字型ミクロタイタープレート（Greiner Lab ortechnik）内で合成ペプチドの２倍希釈液（５０μｌ）を調整し、５０μｌのＳＲＢＣ懸濁液を各ウェルに添加した。プレートを密閉し、混合し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、各プレートについて溶血を調べた。どの合成ペプチドにも溶血は認められなかった。Ｂ.ブタ多形核細胞(ＰＭＮ)は、ブタ血液から単離した(Cruijsen，T.L. M.,Van Leengoed，L.A.M.G．et al.；Infect．Immun．60:4867-4871(1992))。Ｕ字型ミクロタイタープレート（Greiner Labortechnik）内で合成ペプチドの２倍希釈液（５０μｌ）を調整し、５０μｌのＰＭＮ懸濁液（２×１０⁶細胞／ｍｌ）を各ウェルに添加した。プレートを密封し、穏やかに混合し、５％のＣＯ₂存在下に、３７℃で６時間インキュベートした。その後、ニグロシン染料の排除により、各プレートの細胞毒性を調べた。どの合成ペプチドについても、ＰＭＮに対する毒性は認められなかった。Ｃ．ブタ肝細胞はセグレン（Seglen）の方法(Seglen，P.O.;Methods Ce llBlol 13:29-83(1976))に基づき、ブタの肝臓から単離し、モンショウベル．Ｍ（Monshouwer M.）ら（Toxicol．Applied Pharmacol．in press)に従って適応させた。肝細胞はウィリアムズ（William）の培地Ｅに、１０⁶細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。この懸濁液を、１２ウェル組織培養プレート（Costar）の各ウェルに１．５ｍｌずつ移し、３７℃で１２時間インキュベートした。付着肝細胞に対して生死判別を行い、非付着肝細胞は除去した。それぞれの合成ペプチドをウィリアムズの培地Ｅと混合し(希釈比１：５０および１：１００)、付着肝細胞とともにウェルに加えた。さらに３７℃で２４時間インキュベートした後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ，Sigma）を用いて、生死判別を行った。１．５のＭＴＴ（ウィリアムズの培地Ｅに１ｍｇ／ｍｌで溶解）を各ウェルに添加し、さらに３７℃で３０分インキュベートした後、１ｍｌの溶解緩衝液（０．８ＭＨＣｌ−イソプロパノール）を添加した。その後、プレートを１０分間混合し、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。どの合成ペプチドも肝細胞の生存に影響を及ぼさないことが判明した。４．IL-6 誘発急性期反応および肝臓の生体内変化活性のダウンレギュレーションに対するIL-6アンタゴニストペプチドの影響セグレンス（Seglens）の方法（Seglen，P．0．;Method Cell Biol１３：２９−８３(１９７６)）に基づいて、ブタの肝細胞をブタの肝臓から単離し、モンシャウアー(Monshouwer M.)らに従って（Toxicol．App l ied Pharmacol.in p ress）適応させた。肝細胞を１０６細胞/ｍｌの濃度までウイリアムズ（William s）の培地Ｅで懸濁した。この懸濁液から、１ｍｌを１２−ウェルの組織培養プレート（Costar）の各ウェルに載せ、３７℃で１２時間インキュベートした。付着肝細胞をその生存能力について試験し、非付着肝細胞を除去した。合成された各ペプチドをIL-6（１０００Ｕ／ｍｌ）を含むウイリアムズ（Williams）の培地Ｅで（１：５０および１：１００の希釈度で）混合し、付着肝細胞を有するウェルに添加した。（ＩＬ−６を含まない、および培地中に合成ペプチドを含まない）ネガティブコントロールと、（１０００Ｕ／ｍｌＩＬ−６を培地中に含む）ポジティブコントロールを調製しテストした。２４時間インキュベートした後、培地を除去し、各ウェルについて、肝細胞の損傷のない単層のＣＹＰ４５０依存酵素活性を測定した。ＣＹＰ４５０酵素アッセイ。基質としてテストステロン（２５０μＭ）を用いて、ＣＹＰ４５０依存酵素活性を、ヴァントクルースターら(Van't Klooster etal.)によって記載されているように(Bloch．Pharmacol,46;1781-1790(1993)) 測定した。簡単に述べるならば、テストステロンを胎児のウシの血清のない、ウイリアムズ（Williams）の培地Ｅと混合し、肝細胞を含むウエルに添加した。３７℃、５％CO₂にて３０分インキュベートした後、培地中の水酸化テストステロン代謝産物をＨＰＬＣによって定量した。ＨＰＬＣ分析。培地１ｍｌの一部を内部標準としてのメタノール中１１β-テストステロン溶液１００μｌと混合し、５ｍｌのジクロルメタンで抽出した。有機物相を清浄な管に移し、窒素流下にて室温で蒸発乾燥させた。残さを１３０μ ｌの５０％メタノールで溶解し、この溶液を各２０μｌＨＰＬＣ分析のために注入した。固定相は、Ｃ１８ガラスカラム（２０ｃｍ、３μｍ粒子サイズ、Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ，Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、オランダ）からなる。移動相は緩衝液Ａ（１２％メタノール、７５％ミリＱ水）と緩衝液Ｂ（６４％メタノール、６％アセトニトリル、３０％ミリＱ水）とからなる。これらの緩衝液で以下の溶離の勾配を発生させた：０〜４５分で１０〜５８％Ｂ；４５〜５０分で５８〜５９％；５０〜５３分で５９〜１０％；流速０．８ｍｌ/分。代謝産物をスペクトル光度測定によって２５４ｎｍにて検出した。シトクロムＰ４５０のＩＬ−６依存ダウンレギュレーションの阻害を、合成ペプチドとＩＬ−６でインキュベートされた付着肝細胞からの培地中の水酸化テストステロン代謝産物の相対濃度と、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの肝細胞単層からの培地中の水酸化テストステロン代謝産物の相対濃度とを比較することによって、決定した。５．結果ｈＩＬ、ｈｇｐ１３０（ＩＬ−６レセプターβ鎖）およびｈＩＬ６Ｒａ（ＩＬ −６レセプターα鎖）から誘導されたペプチドを、アンタゴニストＩＬ−６活性について分析した。ｈＩＬ−６ペプチドについては、ＩＬ−６アッセイにおけるＩＬ−６活性を阻害した３つの領域が同定された(図２)。ペプチド３１、１１９〜１２３および１６７〜１７４は同定された領域（ＲＹＩＬＤＧＩＳＡＬＲＫ，ｒｅｓｐ．ＳＴＫＶＬＩＱＦＬＱＫＫＡＫＮＬ，ｒｅｓｐ．ＩＬＲＳＦＫＥＦＬＱＳＳＬＲＡＬＲＱＭ）を示している。ｈＩＬ６Ｒａについても、ＩＬ−６アッセイにおけるＩＬ−６活性を阻害した３つの領域が同定された(図３)。ペプチド６〜９、２４〜３３、および８０〜８９は同定された領域（ＱＬＳＣＦＲＫＳＰＬＳＮＶＶＣ，ｒｅｓｐ．ＰＲＳＴＰＳＬＴＴＫＡＶＬＬＶＲＫＦＱＮＳ，ｒｅｓｐ．ＭＣＶＡＳＳＶＧＳＫＦＳＫＴＱＴＦＱＧＣ）を示している。ｈｇｐ１３０については、ＩＬ−６アッセイにおいてＩＬ−６活性を阻害した４つの領域が同定された(図４)。ペプチド２〜１５、３３〜４６、７３〜７６および９２〜９７は同定された領域（ＰＥＫＰＫＮＬＳＣＩＶＮＥＧＫＫＭＲＣＥＷＤＧＧＲ，ｒｅｓｐ．ＮＦＴＬＫＳＥＷＡＴＨＫＦＡＤＣＫＡＫＲＤＴＰＴＳ，ｒｅｓｐ．ＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＶＴＳＤＨ，ｒｅｓｐ．ＰＶＹＫＶＫＰＮＰＰＨＮＬＳＶＩＮ）を示している。抗ＩＬ−６活性を有する同定されたペプチドは、赤血球については溶解性がなく、多形核細胞については毒性がなく、一次肝細胞培養細胞については毒性がなかった。ｈＩＬ６Ｒａ（ＩＬ−６レセプターのα鎖）から誘導されたペプチドをアゴニストＩＬ−６活性について分析し、培地にＩＬ−６を添加しなくてもＢ９細胞の増殖を刺激し、Ｂ９バイオアッセイにおいてＩＬ−６活性を高めた１つの領域が同定された(図５)。ペプチド２１〜３７がＩＬ−６Ｒａ配列の領域ＥＷＧＰＲＳＴＰＳＬＴＴＫＡＶＬＬＶＲＫＦＱＮＳＰＡＥＤを示している。アゴニスト活性が７．５〜１２０μｇ／ｍｌペプチドの濃度範囲において観測された。これらのペプチドはＩＬ−６依存細胞系Ｂ９の増殖の増大を誘発し、ＩＬ−６と結合させたとき、Ｂ９細胞系の増大した増殖が試験され、したがってＩＬ−６の生物活性が高められた。≧１２０μｇ／ｍｌの濃度においては、これらのアゴニストペプチドはＩＬ−６の生物活性に拮抗作用を有していた。アゴニストＩＬ−６活性を有する同定されたペプチドは赤血球については溶解性がなく、多形核細胞については毒性がなく、一次肝細胞培養細胞については毒性がなかった。領域ＰＶＹＫＶＫＰＮＰＰＨＮＬＳＶＩＮ、ＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＶＴＳＤＨ、およびＭＣＶＡＳＳＶＧＳＫＦＳＫＴＱＴＦＱＧＣからの合成ペプチドは肝細胞のシトクロムｐ−４５０のＩＬ−６調節ダウンレギュレーションを阻害する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月１８日（１９９８．６．１８）【補正内容】請求の範囲１．ＩＬ−６に対しアンタゴニスト活性を有するアミノ酸５〜３０個を含むことを特徴とするペプチド。２．ＩＬ−６レセプターのαまたはβ−鎖に対しアンタゴニスト活性を有するアミノ酸５〜３０個を含むことを特徴とするペプチド。３．アンタゴニストおよび／またはアゴニストＩＬ−６活性を有するアミノ酸５〜３０個から成ることを特徴とするペプチド。４．アミノ酸５〜２０個から成ることを特徴とする請求項１，２または３記載のペプチド。５．アミノ酸５〜１２個から成ることを特徴とする請求項４記載のペプチド。６．下記のアミノ酸配列の１つを共通にする少なくとも一連の５個の連続アミノ酸長を有することを特徴とする請求項１，２、３、４または５記載のペプチド。 STKVLIQFLQKKAKNL ILRSFKEFLQSSLRALRQM QLSCFRKSPLSNVVC PRSTPSLTTKAVLLVRKFQNS MCVASSVGSKFSKTQTFQGC PEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGR NFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTS WVEAENALGKVTSDHまたは PVYKVKPNPPHNLSVIN ７．下記のアミノ酸配列を共通にする少なくとも一連の５個の連続アミノ酸長を有することを特徴とする請求項３、４または５記載のペプチド。 EWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAED ８．請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも２個のぺプチドが直接またはスペーサー分子を介して結合していることを特徴とするペプチド組成物。９．少なくとも２個のペプチドがリジンと結合していることを特徴とする請求項８記載のペプチド組成物。 10．アミノ酸配列RYILDGISALRKを共通にする少なくとも一連の５個の連続アミノ酸長を有する請求項１，２、３、４または５記載の少なくとも２個のペプチドがリジンと結合していることを特徴とするペプチド組成物。 11．少なくとも４個のペプチドが分枝オリゴリジンと結合していることを特徴とする請求項８、９または１０記載のペプチド組成物。 12．請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドおよび／またはペプチド組成物から成ることを特徴とする混合物。 13．請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物に対し特異的であることを特徴とする抗体。 14．請求項１３に記載の抗体に対し樹立したことを特徴とする抗イディオタイプ抗体。 15．上記請求項のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物または抗体と少なくとも１種の好適な投与用成分とから成ることを特徴とする製剤。 16．ＩＬ−６関連疾患の治療または予防における請求項１５に記載の製剤の使用。 17．ＩＬ−６またはＩＬ−６レセプター分子からの体外血液または血液製品を浄化するための、請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物または抗体の使用。 18．請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物または抗体から成ることを特徴とする診断アッセイ法。 19．ヒトまたは動物のＩＬ−６関連疾患を検出または診断することを特徴とする請求項１８記載の診断アッセイ法の使用。 20．９細胞バイオアッセイでのインビトロ試験において、７．５ないし１２０ μｇ／ｍｌ相対量濃度でアゴニストＩＬ−６活性を示すことを特徴とする請求項７記載のペプチドの使用。 21．細胞培養における請求項２０に記載のペプチドの使用。 22．請求項７に記載のペプチドと少なくとも１種の好適な投与用成分とから成ることを特徴とする製剤。 23．局所または乳腺内投与用の請求項２２に記載の製剤の使用。 24．局所または乳腺内投与用薬物製造のための請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ 38/00 39/395 Ｕ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/00 16/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フーベ，カスペルヒューベルテュスニコラースオランダ国エヌエル―3523 アーエンユトレヒトトルステーフプラントスーン 46 (72)発明者メルーン，ロベルトハンスオランダ国エヌエル―8231 アーペーレーリスタットカルフェール 10―04

Claims

【特許請求の範囲】１．ＩＬ−６に対しアンタゴニスト活性を有するアミノ酸５〜３０個を含むことを特徴とするペプチド。２．ＩＬ−６レセプターのαおよび／またはβ−鎖に対しアンタゴニスト活性を有するアミノ酸５〜３０個を含むことを特徴とするペプチド。３．アンタゴニストおよび／またはアゴニストＩＬ−６活性を有するアミノ酸５〜３０個を含むことを特徴とするペプチド。４．アミノ酸５〜２０個を含むことを特徴とする請求項１，２または３記載のペプチド。５．アミノ酸５〜１２個を含むことを特徴とする請求項４記載のペプチド。６．下記のアミノ酸配列の１つを共通にする少なくとも一連の５個の連続アミノ酸長を有することを特徴とする請求項１，２、３、４または５記載のペプチド。 RYILDGISALRK STKVLIQFLQKKAKNL ILRSFKEFLQSSLRALRQM QLSCFRKSPLSNVVC PRSTPSLTTKAVLLVRKFQNS MCVASSVGSKFSKTQTFQGC PEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGR NFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTS WVEAENALGKVTSDHまたは PVYKVKPNPPHNLSVIN ７．下記のアミノ酸配列を共通にする少なくとも一連の５個の連続アミノ酸長を有することを特徴とする請求項３、４または５記載のペプチド。 EWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAED ８．請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも２個のペプチドが直接またはスペーサー分子を介して結合していることを特徴とするペプチド組成物。９．少なくとも２個のペプチドがリジンと結合していることを特徴とする請求項８記載のペプチド組成物。 10．少なくとも４個のペプチドが分枝オリゴリジンと結合していることを特徴とする請求項８記載のペプチド組成物。 11.請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドおよび／またはペプチド組成物から成ることを特徴とする混合物。 12．請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物に対し特異的であることを特徴とする抗体。 13．請求項１２に記載の抗体に対し樹立したことを特徴とする抗イディオタイプ抗体。 14．上記請求項のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物または抗体と少なくとも１種の好適な投与用成分とから成ることを特徴とする製剤。 15．ＩＬ−６関連疾患の治療または予防における請求項１４に記載の製剤の使用。 16．ＩＬ−６またはＩＬ−６レセプター分子からの体外血液または血液製品を浄化するための、請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物または抗体の使用。 17．請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物または抗体から成ることを特徴とする診断アッセイ法。 18．ヒトまたは動物のＩＬ−６関連疾患を検出または診断することを特徴とする請求項１７記載の診断アッセイ法の使用。 19．７．５ないし１２０μｇ／ｍｌ相対量濃度でアゴニストＩＬ−６活性を示すことを特徴とする請求項７記載のペプチドの使用。 20．細胞培養における請求項１９に記載のペプチドの使用。 21．請求項７または１９に記載のペプチドと少なくとも１種の好適な投与用成分とから成ることを特徴とする製剤。 22．局所または乳腺内投与用の請求項２１に記載の製剤の使用。 23．局所または乳腺内投与用薬物製造のための請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド組成物の使用。