JP2000517336A - Ｎｏシンターゼ抑制剤と反応性型酸素捕捉剤との組合せ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、活性成分として、少なくとも１種のNOシンターゼ抑制物質と、少なくとも１種の反応性の形の酸素を捕捉する物質とを含有し、場合により製剤学的に許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。本発明は、また、少なくとも１種のNOシンターゼ抑制物質と、少なくとも１種の反応性の形の酸素を捕捉する物質とを、別々の形で、これらの活性物質を組合として含有する製品に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 NOシンターゼ抑制剤と反応性型酸素捕捉剤との組合せ 本発明は、活性成分として、NOシンターゼ(NO synthase)を抑制する物質の少 なくとも１種と、反応性の形の(reactive form)酸素を捕捉する(trap)物質の少 なくとも１種とを含有し、場合により、製剤学的に許容される担体を含有してな る医薬組成物に関する。本発明は、また、NOシンターゼの抑制物質の少なくとも １種と、反応性の形の酸素の捕捉物質の少なくとも１種とからなる製品であって 、これらの活性成分が別個の形で（in separate form）組合されている製品に関 する。 本発明の医薬組成物及び製品は、一酸化窒素と反応性の形の酸素が関係する病 理学的状態、特に、下記の疾患の処置に有利である： −心臓血管及び脳血管障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、片頭痛、動脈性 高血圧症、敗血病性ショック、虚血又は出血に起因する心臓又は脳梗塞、虚血及 び血栓症； −中枢神経系又は末梢神経系疾患、例えば、特に、脳梗塞を包含する神経変性(n eurogenerative)疾患、アルツハイマー病を包含する老人性痴呆、ハンチントン 舞踏病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、即ち、プリオンに基づ く疾患、筋萎縮性側索硬化症及び疼痛、脳障害又は脊椎障害、アヘン、アルコー ル及び嗜好形成物質中毒、勃起機能障害及び生殖障害、認識障害、脳疾患(encep halophathy)、うつ病、不安症、精神分裂症、てんかん、睡眠障害(sleep disord er)、食障害(eating disorder)（無食欲、過食）；−増殖性(proliferative)及 び炎症性疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、肺動脈高血圧症、糸球体腎炎 、門脈高血圧症、乾癬、骨関節症及び慢性関節リウマチ、繊維症、アミロイド症 、胃腸系炎症（大腸炎、クローン病）又は肺動脈系炎症及び気道の炎症（喘息、 静脈洞炎）； −下痢、オータコイドに由来する嘔吐を包含する嘔吐、放射線照射、太陽光線照 射(UVA,UVB)； −臓器移植； −自己免疫及びウイルス性疾患、例えば、狼瘡(lupus)、AIDS、寄生虫及びウイ ルスの感染、糖尿病、多発性硬化症及びミオパシー； −癌；及び −一酸化窒素及び/又は反応性の形の酸素の生成又は機能障害を特徴とする全て の病理学的状態。 これらの病理学的状態の全てにおいて、一酸化窒素又は反応性の形の酸素が関 係していることを示す実験的根拠が存在する（Kerwin等、Nitric oxide:a new p aradigm for second messengers，J.Med.Chem.38 4343-4362,1995;Halliwell B. ,Gutteridge JMC.，Free radicals in biology and medicine，2nd ed.，Oxford ,Clalendon Press,1989）。このことは、特に、本発明を例示する実験的脳梗塞 について認められる（Buisson等、The neuroprotecti-ve effect of a niric ox ide inhibitor in a rat model of focal ischemia，Br J.Pharmacol.106,766-7 67,1992;Nowicki等，Nitric oxide mediates neuronal cell death after focal cerebral ischemia in the mouse，Eur.J.Phrmacol.204,339-340,1991;Zhao等 、Delayed treatment with the spin trap-phenyl-N-tert-butyl nitrone(PBN)r educes infarct size following transient middle cerebral artery occulusio n in rats，Acta.Physiol.Scand.,1994;Schulz等、Improved therapeutic windo w for treatment of histotoxic hypoxia with a free radical spin trap，J.C ereb.Blood Flow Metab.15,948-952(1995)）。従って、一酸化窒素又は反応性の 形の酸素の形成を抑制する医薬は有益な効果をもたらし得る。これらの２種の活 性成分、即ち、NOシンターゼ抑制剤及び反応性型の酸素の捕捉剤(trap)の組合せ は製造されていない。実験の部で述べるごとく、これらの２種の活性成分は相乗 効果的に作用する。実際に、準活性投与量(subactive dosage)（即ち、それ自体 では治療効果を示さない投与量）で投与されたこれらの２種の活性成分は、これ らを組合せた場合には、極めて大きな治療効果を示す。 この組合せの利点は、活性成分の各々の投与量を著しく減少させ、従って、 その望ましくない効果を相当、減少させ、しかも治療効果を得ることができるこ とである。本発明は神経変性(neurodegeneration)の実験的病理学的モデル：再 潅流を用いる脳虚血において特に十分に例示されている。 従って、本発明によれば、活性成分として、NOシンターゼを抑制する物質（NO シンターゼの抑制物質）の少なくとも１種と、反応性の形の酸素を捕捉する物質 （反応性型酸素の捕捉物質）の少なくとも１種とを含有し、場合により製剤学的 に許容される担体を含有してなる医薬組成物が提供される。 本発明によれば、特に、活性成分として、NOシンターゼを抑制する物質と反応 性の形の酸素の捕捉物質とを含有してなる医薬組成物が提供される。 NOシンターゼの抑制物質という用語は、構成的(constitutive)（神経性又は内 皮性）であるか又は誘導性(inducible)であるかに関係なく、そのイソ型(isofor ms)の一つの、任意の特異的又は非特異的抑制剤を意味すると理解すべきである( Kerwin等、Nitric oxide:a new paradigm for second messengers，J.Med.Chem. 38 4343-4362,1995)。 反応性型酸素の捕捉物質という用語は、O₂ ^・、OH^-、RO₂ ^・、RO^・、ONO₂ ^-、NO^・、N O₂ ^・又はH₂O₂のごとき反応性の形の酸素又はその一つに抵抗する(oppose)又はこ れを捕捉する(trap)ことのできる化学物質又は酵素的物質を意味すると理解すべ きである(Halliwell B.，Gutteridge JMC.,Free radicals in biology and medi cine,2nd ed.,Oxford,ClalendonPress,1989)。これらの物質は天然のものである か又は合成されたものであることができ、かつ、酸化防止性を有する(Santrucek 及びKrepelka，Antioxidants-Pot-ential chemotherapeutic agents Drugs Futu re 13,975-996,1986;Jackson等、Antioxidants:a biological defense mechanis im for the prevention of atherosclerosis，Med.Res．Reviews 13,161-182;Ar uoma，Characteri-zatioin of drugs as antioxidant prophylactis，Free Rad. Biol.Med.20,675-705(1996))。 本発明の医薬組成物においては、NOシンターゼ抑制剤と、反応性型酸素の捕捉 剤は、別個の形であるか又は塩を形成する組合せた形のものであり得る。好まし くは、塩は、少なくとも１個の塩基性基を含有する、NOシンターゼ抑 制剤の誘導体と、少なくとも１個の酸基を含有する、反応性型酸素の捕捉剤の誘 導体とから形成される。例えば、塩は当業者に既知の方法に従って、例えばアミ ジン、グアニジン、ピリジン又はピペリジンのごとき、以下に定義するNOシンタ ーゼ抑制剤と、例えば、フェノール酸、特に、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキ シ安息香酸、カフェ酸、シナピン酸(sinapic acid)又は没食子酸のごとき、以下 に定義する反応性型酸素の捕捉剤とから形成させ得る。 本発明によれば、更に、心臓血管及び脳血管障害、中枢神経及び末梢神経障害 、増殖性及び炎症性疾患、臓器移植、自己免疫性及びウイルス性疾患、癌及び一 酸化窒素及び/又は反応性型の酸素の生成又は機能障害を特徴とする全ての病理 学的状態のごとき、一酸化窒素及び反応性の形の酸素が関係する病理学的状態の 処置において同時的に又は逐次的に使用するための、別個の形で組合された製品 としての、NOシンターゼの抑制物質の少なくとも１種と、反応性型酸素の捕捉物 質の少なくとも１種とを含有する製品が提供される。 本発明の医薬組成物又は製品においては、NOシンターゼの抑制物質と反応性型 酸素の捕捉剤(trap)は、その投与量が同一であるか又は異なるものであり得る。 投与量は適当な稀釈剤又は賦形剤と組合された化合物によって選択される。 NOシンターゼ抑制剤と反応性型酸素の捕捉剤は、これらが別々の形であるか又 は結合された形であるかに応じて、同一の投与経路により又は異なる投与経路に より、同時に又は連続的に投与し得る。好ましくは、投与経路は経口、非経口又 は局所投与である。 NOシンターゼ抑制剤にはアミノ酸型及び非アミノ酸型の化合物が包含される。 アミノ酸型NOシンターゼ抑制剤は特許出願WO 95/00505、WO 94/12163、WO 96/06 076及びEP 230037（その内容は参照として本明細書に包含される）に記載の化合 物又は特許出願WO 93/24126、WO 95/01972、WO 95/24382、WO 95/09619及びWO 9 5/22968（その内容は参照として本明細書に包含される）に記載されるごときL- アルギニン、オルニチン又はリシンの誘導体であり得る。 非アミノ酸型NOシンターゼ抑制剤はグアニジン、イソチオ尿素、ニトロ又はシ アノアリール、アミノピリジン又はアミノピリミジン、アミジン、インダゾール 又はイミダゾールからなる群の化合物であり得る。 グアニジン系NOシンターゼ抑制剤は特許出願WO 95/28377、WO 91/04023、WO 9 4/21621、WO 96/18607及びWO 96/18608（その内容は参照として本明細書に包含 される）で定義されている化合物であり得る。 イソチオ尿素系NOシンターゼ抑制剤は特許出願WO 95/09619、WO 96/09286、.W O 94/12165、WO 96/14842、WO 96/18607、WO 96/18608、WO 96/09286、EP 71704 0及びEP 718924（その内容は参照として本明細書に包含される）で定義されてい る化合物であり得る。 ニトロ又はシアノアリール系NOシンターゼ抑制剤は特許出願WO 94/12163（そ の内容は参照として本明細書に包含される）で定義されている化合物であり得る 。 アミノピリジン又はアミノピリミジン系NOシンターゼ抑制剤は特許出願WO 96/ 14780、WO 96/18616及びWO 96/18617（その内容は参照として本明細書に包含さ れる）で定義されている化合物であり得る。 アミジン系NOシンターゼ抑制剤は特許出願WO 95/11014、WO 96/01817、WO 95/ 05363、WO 95/11231、WO 96/14844及びWO 96/19440（その内容は参照として本明 細書に包含される）で定義されている化合物又はN-フェニル-2-チオフェンカル ボキシイミドアミドのごとき化合物であり得る。 インダゾール系NOシンターゼ抑制剤は、一般式IA: （式中、Ｒ₁は水素原子、ニトロ、ハロ、低級アルキル又は低級アルコキシ基か ら選ばれた１個又はそれ以上の置換基である）で表される化合物であり得る。 イミダゾール系NOシンターゼ抑制剤は、一般式IIA: （式中、Ｒ₂及びＲ₃は、各々、水素原子、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル 又はアルコキシ基であるか、又は、Ｒ₂とＲ₃が、一緒に、イミダゾール環と縮合 したフェニル基を形成しており、このフェニル基は、場合により、ヒドロキシ、 トリフルオロメチル、ハロ、カルボキシ、低級アルキル、低級アルコキシ又は低 級アルケニル基から選ばれた１個又はそれ以上の置換基により置換されている； Ｒ₄は水素原子、低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ又はフェニル基を 表し、このフェニル基は、場合により、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、ハロ 、カルボキシ、低級アルキル、低級アルコキシ又は低級アルケニル基から選ばれ た１個又はそれ以上の置換基により置換されている；Ｒ₅は水素原子、低級アル キル、アミノ、低級アルキルアミノ基を表す）で表される化合物であり得る。 反応性型酸素の捕捉剤は、アスコルビン酸、N-アセチルシステイン、カロテン (Hao Chen等、Free Radical Biology and Medicine,18(5),949-953(1995))、補 酵素Q10(S.Tereao等、J.Org.Chem.,44,868(1979))又は捕獲性(captodative)化合 物(H.G.Viehe等、Acc.Res.18,148-154(1985)、その内容は参照として本明細書に 包含される)から選ばれ得る。反応性型酸素の捕捉剤はフェノール化合物、ニト ロン、インドール誘導体、イミダゾール又はカルバゾールからも選ばれることが でき、また、反応性型酸素の捕捉剤はスーパーオキシドジスムターゼ、カタラー ゼ又はグルタチオン ペルオキシダーゼ及びその疑似物(mimetics)のごとき、反 応性型の酸素を中和することのできる酵素であり得る。 フェノール化合物系の反応性型酸素の捕捉剤としては、プロブコール；ユビキ ノン；トコフェロール誘導体、即ち、α-,β-,γ-,ε-,τ-又はδ-トコフェロー ル又はフェノール性フラボノイド(R.A.等、Phytochemistry 27(4),969-978(1988 )、その内容は参照として本明細書に包含される)が挙げられ る。フェノール化合物系の反応性型酸素の捕捉剤は、一般式IB:又はIIB:（式中、Ｒ’₁は水素原子、ヒドロキシ、ハロ、カルボキシ、低級アルキル、低 級アルコキシ、低級アルケニル又はアルコキシカルボニル基から選ばれた置換基 の１種又はそれ以上を表し、これらのアルキル、アルコキシ及びアルケニル基は 、場合により、ヒドロキシ、ハロ、カルボキシ又はアミノ基により置換されてい る；Ｒ’₂は水素原子又は場合により置換されている低級アルキル基、低級アル コキシ、ヒドロキシ、ハロ、アミノ又はカルボキシ基から選ばれた置換基の１種 又はそれ以上を表す）で表される化合物からも選択し得る。 ニトロン系の反応性型酸素の捕捉剤は、特許出願WO 96/15110、WO 88/05044及 び米国特許5310916（その内容は参照として本明細書に包含される）で定義され ている化合物であり得る。 インドール誘導体系の反応性型酸素の捕捉剤は、一般式IIIB: （式中、Ｒ’₃は水素原子、ヒドロキシ、ハロ、低級アルキル又は低級アルコキ シ基から選ばれた置換基の１種又はそれ以上を表し、Ｒ’₄は水素原子、ハロ、 ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ又はアルキルカルボニルアミノアルキル基から 選ばれた置換基の１種又はそれ以上を表す）で表される化合物から選択し得る。 インドール誘導体系の反応性型酸素の捕捉剤も特許出願WO 96/26941で定義さ れている化合物であり得る。 イミダゾール系の反応性型酸素の捕捉剤としてはイミダゾールそれ自体又 はシメチジンが挙げられる。 カルバゾール系の反応性型酸素の捕捉剤としては4-ヒドロキシカルバゾール又 はカルベジオール(carvediol)が挙げられる。 本明細書において、アルキル及びアルコキシ基について低級という用語は、１ 〜６個の炭素原子を有する飽和、線状又は分岐鎖状脂肪族炭化水素基、例えば、 メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、メトキシ及びエ トキシを示す。アルケニル基については、低級という用語は、２〜６個の炭素原 子と１個又はそれ以上の二重又は三重結合を有する基、例えば、ビニル、アリル 、プロペニル、イソプロペニル、ペンテニル、ブテニル、ヘキサニル、プロピニ ル及びブタジエニル基を示す。ハロという用語はクロロ、ヨード、ブロモ又はフ ルオロをを示す。 本発明によれば、特に、 −NOシンターゼ抑制剤は、L-ニトロアルギニン(LNA)、L-ニトロアルギニンの メチルエステル(LNAME)、L-N-モノメチルアルギニン(LNMMA)、アミノグアニジン 、アグマチン、2-アミノ-1-(メチルアミノ)ベンゾイミダゾール、5-ニトロイン ダゾール、6-ニトロインダゾール、7-ニトロインダゾール、1,2-(トリフルオロ メチルフェニル)イミダゾール(TRIM)、2-アミノ-4-メチル-6-(2-アミノエチル) ピリジン、2-イミノピペリジン、2-イミノホモピペリジン、2-イミノ-5,6-ジヒ ドロ-1,3-チアジン、2-イミノ-5,6-ジヒドロ-1,3-オキサジン、N-フェニル-2-チ オフェンカルボキシイミドアミド、2-イミノテトラヒドロピリミジン、S-エチル イソーチオ尿素、S-メチル-L-チオシトルリン又はS-エチル-L-チオシトルリンか ら選ばれ、 −反応性型酸素の捕捉剤は、プロブコール、ユビキノン、α-,β-,γ-,ε-,τ -又はδ-トコフェロール、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸、2,3,6- トリメチル-2-ヘキシルオキシフェノール、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メトキシフェ ノール、オイゲノール、トロロックス(trolox)、没食子酸n-プロピル、テンポー ル、カフェ酸、シナピン酸、没食子酸、2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-オ キシル-3-カルボン酸、メラトニン、5-ヒドロキシインドール-2-カルボン酸、イ ミダゾール、シメチジン、アスコルビン酸、 N-アセチルシステイン、β-カロテン、補酵素Q10、捕獲性化合物、9-[2-(4-モル ホリニル)エチル]-2,4-ジ-1-ピロリジニル-9H-ピリミド[4,5-b]インドール、4- ヒドロキシカルバゾール又はカルベジロールから選ばれることを特徴とする、前 記したごとき組成物及び製品が提供される。 NOシンターゼ抑制剤及び反応性型酸素の捕捉剤である化合物は市販の製品であ るか又は当業者に既知の方法（又はこれに類似する方法）により調製し得る(P.H amley等、Bioorganic and medicinal chemistry letters．vol.5(15),1573-1576 (1995);W.M.Moore等、J.Med.Chem.,39,669-672(1996)；E.P.Gravey等、The Jour nal of Biological Chemistry，vol.269(43)，26669-16676(1994))。 以下の実施例は上記本発明を例示するものであるが、本発明を限定するもので はない。実験の部： 文字ＡはNOシンターゼ抑制剤であり、Ｂは反応性型酸素の捕捉剤である。実施例１ 化合物ＡＢ、ＡとＢが等モル量である、塩の形の活性成分ＡとＢの組合せ： 化合物Ａ：アミノグアニジン、誘導性(inducible)NOシンターゼの抑制剤、 化合物Ｂ：3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸、酸素を含有するフリー ラジカルの酸化防止性捕捉剤(antioxidant trap)実施例２ 化合物ＡＢ、別個の形の活性成分ＡとＢの組合せ： 化合物Ａ：7-ニトロインダゾール、神経型(neuronal type)の構成的NOシンター ゼの抑制剤、 化合物Ｂ：3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸、酸素を含有するフリー ラジカルの酸化防止性捕捉剤実施例３ 化合物ＡＢ、別々の形のかつ異なる経路で投与される活性成分ＡとＢの組合せ 、 化合物Ａ：NGニトロアルギニン、構成的及び誘導性NOンターゼの強力な 抑制剤； 化合物Ｂ：3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸、酸索を含有するフリー ラジカルの酸化防止性捕捉剤本発明の製品の薬理学的検討 本発明の化合物について幾つかの生体内及び生体外生物学的試験を行って、そ のNOシンターゼ（誘導性及び構成的）の抑制活性とフリーラジカルの捕捉活性を 調べた。これらの化合物の活性はラットにおける病巣的脳虚血(focalcerebral i schaemia)のモデルについて評価した。ヒトにおける臨床的状態(clinical situa ton)に近い重度の脳梗塞のモデルと見なされるこのモデルにおいては、NOシンタ ーゼ抑制剤と反応性型酸素の捕捉剤の保護効果が部分的であるとき、一酸化窒素 と反応性型酸素の過度の放出が認められた。活性成分の組合せの効果を、一酸化 窒素の抑制剤と反応性型酸素の捕捉剤とを単独で使用した処理で得られる効果と 比較した。NOシンターゼの抑制剤と反応性型酸素の捕捉剤との組合せは病巣的脳 虚血に対して極めて大きな保護効果を示し、これに対し、別個に採用されたかつ 使用された投与量でのNOシンターゼ抑制剤又は反応性型酸素の捕捉剤の効果は低 かった。このことはNOシンターゼ抑制剤と反応性型酸素の捕捉剤の間での相乗効 果を示している。 1)ラットの小脳に対する構成的NOシンターゼの、生体外での効果 この試験はNOシンターゼによる、L-アルギニンのL-シトルリンへの変換を測定 することからなる。スプレーグード-レイ(Sprague-Dawley)種ラット(300g-Charl es River)の小脳のサンプルを迅速に摘出し、４℃で切開し、ある量の抽出用緩 衝液(extraction buffer)(HEPES 50mM,EDTA 1mM，pH7.4，ペプスタチン A,10mg/ ml,ロイペプチン 10mg/ml)中でホモジナイズしついで４℃で15分間、21000gで遠 心分離した。検定は100mMのHEPES pH7.4、2mMのEDTA、2.5mMのCaCl₂、2mMのジ チオトレイトール、2mMの還元NADPH及び10g/mlのカルモジュリンを含有する100m lのインキュベーション用緩衝液(incubation buffer)を分配させたガラス製試験 管中で行った。100nMのトリチウム標識(tritiated)アルギニン（比活性:56.4Ci/ ミリモル、Amersham製）と40μＭの非放射性(non radioactive)アルギニンを含 有する溶液25 μｌを添加した。50μｌのホモジナイズされた生成物を添加することにより反応 を開始させた；最終容量は200μｌであった（25μｌの不足分は水又は試験した 生成物である）。15分後、2mlの停止用緩衝液(20mMのHEPES，pH5.5,2mlのEDTA) を使用して反応を停止させた。サンプルを１mlのDOWEX樹脂のカラムを通過させ た後、放射能を液体シンチレーション分光計により定量した。結果はIC₅₀により 表し、パラグラフ２の表に示した（第１欄の結果には、“構成的NOシンターゼ、 シトルリンの形成”という標題が付いている）。 2）ネズミマクロファージJ774A1の誘導性NOシンターゼに対する、生体外での 効果 ネズミマクロファージJ774A1はリポ多糖(LPS)とインターフェロン-γ(IFN-γ) により活性化されると大量の一酸化窒素を生成する。LPSとIFN-γで活性化した 後、10％ウシ胎児血清を富化したDMEM培地(Dulbecco's Modified Eeagle Medium )中で、CO₂5％の大気下、37℃で細胞を培養した。培養細胞を150cm²の容器中に5 000細胞/cm²の量で接種した。インキュベーションは10％ウシ胎児血清を富化し たDMEM中で、LPS(1g/ml)とネズミIFN-γ(50U/ml)の存在下で行った。抽出用緩衝 液(HEPES 50mM，pH7.4，ジチオトレイトール0.5mM,ペプスタチンA 1mg/ml,ロイ ペプチン1mg/ml,大豆トリプシン抑制剤1mg/ml,アンチペイン1mg/ml及びPMSF 10m g/ml)を使用してNOシンターゼを単離した。抽出用緩衝液中で、４℃で音波破砕 した後、ホモジナイズされた生成物を超遠心分離した（100,000g，3,5-tert-ブ チル-4-ヒドロキシ安息香酸を使用、４℃で１時間）。その後のプロトコールは インキュベーション用緩衝液の組成(100mMのHEPES,pH 7.4,1mMのジチオトレイト ール、2.5mMのCaCl₂、10Mのテトラヒドロビオプテリン、FAD10μＭ，BSA 1mg/ml ,2mMの還元NADPH)が異なる以外、小脳NOシンターゼの場合と同一であった。結果 はIC₅₀により表し、パラグラフ２の表に示した（第２欄の結果には“誘導性NOシ ンターゼ、シトルリンの形成”という標題が付いている）。 3）ネズミのマクロファージJ774A1による亜硝酸塩の生成に対する、生体 外での効果 この試験は培養細胞の誘導性NOシンターゼに対する、製品の抑制活性を測定す るのに使用される。10％ウシ胎児血清を富化したDMEM中で、CO₂５％の大気下、3 7℃で細胞を培養した。この実験のために、細胞を96個のウエル(well)を有する プレートに分布させ（50,000細胞/ウエル）ついで、試験すべき製品の存在下又 は不存在下、10％のウシ胎児血清とLPS(1μｇ/ml)及びネズミIFN-γ(50 U/ml)を 含有する、フェノールレッドを含まないDMEM中でインキュベートした。48時間後 、培地中の亜硝酸塩、即ち、一酸化窒素の分解生成物の濃度を、Green等の方法( Analytical Biochemistry,126,131-138(1982))に従って比色法により測定した。 結果はIC₅₀により表し、パラグラフ２の表に示した（第３欄の結果には“誘導性 NOシンターゼ、亜硝酸塩の形成”という標題が付いている）。 4）スーパーオキシドアニオンに対する、生体外での効果 マクロファージ細胞J774A1をフォルボル ミリステート アセテート(PMA)によ り活性化することにより、スーパーオキシドアニオンが数分間で生成する。スー パーオキシドアニオンは蛍光基質であるルミノールを酸化することができる。こ の反応により光量子(photon)が生成し、この光量子の生成はケミルミノメーター (chemiluminometer)により測定される。J774A1細胞をPMA、 試験すべき製品及びルミノールの存在下、37℃でインキュベートすることにより 、スーパーオキシドアニオンの生成に対する製品の効果を試験した。結果はIC₅₀ により示した。 実施例１ 製 品 IC₅₀（μＭ） Ａ 不活性 Ｂ 30 ＡＢ 30 5）再潅流を伴う巣状脳虚血に対する効果 体重330〜360gの雄スプレーグ-ドーレイ種ラット(Charles River)について実 験を行った。イソフルランで麻酔した後、ラットにMemezawa等(Exp．Brain.Res ．89,67-78,1992)により記載されている中央脳動脈の一過性閉塞(transient occ lusion)を生じさせた。前方脳動脈中にワイヤーを挿入して中央脳動脈の閉塞を 生じさせた。２時間後、ワイヤーを引抜いて、血液をウイリスポリゴン(Willis polygon)に再循環させた。ラットの体温を監視し、閉塞後、６時間制御した。閉 塞から48時間後、ラットをイソフルランで麻酔し、断頭した。脳のサンプルを迅 速に摘出し、イソペンタン中に２分間、-15℃で浸漬した。厚さ2mmの断片６個を 作成し、２％の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム クロライド(TTC)を含有する 溶液中に20分間浸漬しついでホルマリンで固定した。梗塞した帯域は白色に見え 、健常な帯域は赤く見えた。梗塞表面積をイメージアナライザーにより６個の断 片の部位で測定した。梗塞の容積は、これらが2mm離れているという知識に基づ いて、これらの種々の表面積を積分することにより算定した。製品は腹腔内投与 した。第１の処理は閉塞から４時間後、即ち、ワイアーを引抜いてから２時間後 に行い、ついで24時間後に行った。 実施例１の化合物:４群の動物を作成した： 群１：生理的血清で処理 群２：Ａで処理(30mg/kg) 群３：Ｂで処理(20mg/kg) 群４：ＡＢで処理(50mg/kg) 群番号 梗塞の容積 保護率％ １ 270.4±30.05 − ２ 233 ±30.15 NS 13.8 ３ 250.9±37.86 NS 7.1 ４ 89.6±22.42 ＊＊ 63.2 （NS:結果は重要性なし；＊＊：結果は非常に重要） 実施例２の化合物:４群の動物を作成した： 群１：生理的血清で処理 群２：Ａで処理(10mg/kg) 群３：Ｂで処理(20mg/kg) 群４：ＡＢで処理（Ａ 10mg/kg及びＢ 20mg/kg） 群番号 梗塞の容積 保護率％ １ 270.4±30.05 − ２ 238.9±27.08 NS 11.7 ３ 250.9±37.86 NS 7.1 ４ 69.6±37.86 ＊＊ 74.3 （NS:結果は重要性なし；＊＊:結果は非常に重要） 実施例３の化合物:４群の動物を作成した： 群１：生理的血清で処理 群２：Ａで処理(0.03mg/kg i.v) 群３：Ｂで処理(20mg/kg i.p) 群４：ＡＢで処理（Ａ 0.03mg/kg i.v．及びＢ 20mg/kg i.p） 群番号 梗塞の容積 保護率％ １ 237.68±31.51 − ２ 238.14±35.94 NS 0 ３ 222.9± 7.34 NS 6.2 ４ 136.5±33.02 ＊＊ 42.6 （NS:結果は重要性なし；＊＊:結果は非常に重要） これらの結果は反応性形酸素の捕捉剤として20mg/kgの投与量で使用した3,5- ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸は、ラットを虚血の発作から保護するの に不活性であること及びアミノグアニジン（NOシンターゼ抑制剤）は活性が低い ことを示している。一方、これらの化合物の組合せはラットを虚血から保護する のに高度の活性を示す。 同様に、構造型のNOシンターゼの抑制剤として使用される7-ニトロインダゾー ルは10mg/kgの投与量では高度の活性を示さない；一方、3,5-ジ-tert-ブチル-4- ヒドロキシ安息香酸と組合せた場合には、極めて大きな保護作用が得られる。こ の保護効果は２つの成分の間での相乗作用を示す。 同様に、NOシンターゼの抑制剤として使用されたかつ静脈内投与されたNGニト ロアルギニンは0.03mg/kgの投与量では活性を示さない；一方、これを腹腔内投 与する3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸と組合せた場合には、極めて 大きな保護作用が得られる。この保護効果は、活性成分を異なる経路で投与した 場合においても、２つの成分の間での相乗作用が観察されることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/355 Ａ６１Ｋ 31/355 31/381 31/381 31/40 31/40 31/403 31/403 31/404 31/404 31/416 31/416 31/4164 31/4164 31/4184 31/4184 31/44 31/44 31/4458 31/4458 31/505 31/505 31/535 31/535 31/5377 31/5377 31/541 31/541 31/55 31/55 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 25/00 25/00 29/00 29/00 31/04 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 39/00 39/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ビツグ，デニス フランス国 エフ―91190 ジフ シユル イベツト，リユ ヌーヴ，８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．活性成分として、NOシンターゼの抑制物質の少なくとも１種と、反応性型 酸素の捕捉物質の少なくとも１種とを含有し、場合により、製剤学的に許容され る担体を含有してなる医薬組成物。 ２．活性成分として、NOシンターゼの抑制物質と、反応性型酸素の捕捉物質と を含有する、請求項１に記載の医薬組成物。 ３．NOシンターゼの抑制物質と反応性型酸素の捕捉物質とが別個の形である、 請求項１又は２に記載の医薬組成物。 ４．NOシンターゼの抑制物質と反応性型酸素の捕捉物質とが塩の形である、請 求項１又は２に記載の医薬組成物。 ５．塩は、少なくとも１個の塩基性基を含有する、NOシンターゼの抑制物質の 誘導体と、少なくとも１個の酸性基を含有する、反応性型酸素の捕捉物質の誘導 体とからから形成される、請求項４に記載の医薬組成物。 ６．−NOシンターゼの抑制物質は、アミノ酸、特に、L-アルギニン、オルニチ ン又はリシンの誘導体、又は、グアニジン、イソチオ尿素、ニトロ又はシアノア リール、アミノピリジン又はアミノピリミジン、アミジン、インダゾール又はイ ミダゾールからなる群の化合物であり、 −反応性型酸素の捕捉剤は、アスコルビン酸、N-アセチルシステイン、β−カ ロテン、補酵素Q10、捕獲性化合物、又は、フェノール、ニトロン、インドール 誘導体、イミダゾール又はカルバゾールからなる群の化合物である、請求項１〜 ５のいずれかに記載の医薬組成物。 ７．−NOシンターゼの抑制物質は、L-ニトロアルギニン、L-ニトロアルギニン のメチルエステル、L-N-モノメチルアルギニン、アミノグアニジン、アグマチン 、2-アミノ-1-(メチルアミノ)ベンゾイミダゾール、5-ニトロインダゾール、6- ニトロインダゾール、7-ニトロインダゾール、1,2-(トリフルオロメチルフェニ ル)イミダゾール、2-アミノ-4-メチル-6-(2-アミノエチル)ピリジン、2-イミノ ピペリジン、2-イミノホモピペリジン、2-イミノ-5,6-ジヒドロ-1,3-チアジン、 2-イミノ-5,6-ジヒドロ-1,3-オキサジン、2-イミ ノテトラヒドロピリミジン、N-フェニル-2-チオフェンカルボキシイミドアミド 、S-エチルイソ-チオ尿素、S-メチル-L-チオシトルリン又はS-エチル-L-チオシ トルリンから選ばれ、 −反応性型酸素の捕捉剤は、プロブコール、ユビキノン、α-,β-,γ-,ε-,τ -又はδ-トコフェロール、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸、2,3,6- トリメチル-2-ヘキシルオキシフェノール、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メトキシフェ ノール、オイゲノール、トロロックス、没食子酸n-プロピル、テンポール、カフ ェ酸、シナピン酸、没食子酸、2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-オキシル-3 -カルボン酸、メラトニン、5-ヒドロキシインドール-2-カルボン酸、イミダゾー ル、シメチジン、アスコルビン酸、N-アセチルシステイン、β-カロテン、補酵 素Q10、捕獲性化合物、9-[2-(4-モルホリニル)エチル]-2,4-ジ-1-ピロリジニル- 9H-ピリミド[4,5-b]インドール、4-ヒドロキシカルバゾール又はカルベジロール から選ばれる、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。 ８．心臓血管系及び脳血管障害、中枢神経又は末梢神経障害、増殖性及び炎症 性疾患、下痢、嘔吐、放射線照射、太陽光線照射、臓器移植、自己免疫性及びウ イルス性疾患、癌及び一酸化窒素及び/又は反応性の形の酸素の生成又は機能障 害を特徴とする全ての病理学的状態のごとき、一酸化窒素及び反応性の形の酸素 が関係する病理学的状態の処置において同時に又は逐次、使用するための、別個 の形で組合された製品としての、NOシンターゼの抑制物質の少なくとも１種と、 反応性型酸素の捕捉物質の少なくとも１種とを含有する製品。 ９．アテローム性動脈硬化症、片頭痛、動脈性高血圧症、敗血病性ショック、 虚血又は出血に起因する心臓又は脳梗塞、虚血及び血栓症のごとき心臓血管及び 脳血管障害の処置に使用するための、請求項８に記載の製品。 10．神経変性障害、疼痛、脳障害又は脊椎障害、アヘン、アルコール及び嗜好 品形成物質中毒、勃起機能障害及び生殖障害、認識障害、脳疾患、うつ病、不安 症、精神分裂症、てんかん、睡眠障害、食障害のごとき、中枢神経又は末梢神経 障害の処置のための、請求項８に記載の製品。 11．アテローム性動脈硬化症、肺動脈高血圧症、糸球体腎炎、門脈高血圧症、 乾癬、骨関節症及び慢性関節リウマチ、繊維症、アミロイド症、胃腸系又は肺動 脈系の炎症及び気道の炎症のごとき増殖性及び炎症性疾患の処置のための、請求 項８に記載の製品。 12．狼瘡、AIDS、寄生虫及びウイルスの感染、糖尿病、多発性硬化症及びミオ パシーのごとき自己免疫性及びウイルス性疾患の処置のための、請求項８に記載 の製品。 13．NOシンターゼの抑制物質と、反応性型酸素の捕捉物質とからなるる、請求 項８〜12のいずれかに記載の製品。 14．NOシンターゼの抑制物質は、アミノ酸、特に、L-アルギニン、オルニチン 又はリシンの誘導体、又は、グアニジン、イソチオ尿素、ニトロ又はシアノアリ ール、アミノピリジン又はアミノピリミジン、アミジン、インダゾール又はイミ ダゾールであり、 −反応性型酸素の捕捉剤は、アスコルビン酸、N-アセチルシステイン、β−カ ロテン、補酵素Q10、捕獲性化合物、又は、フェノール、ニトロン、インドール 誘導体、イミダゾール、カルバゾール、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラ ーゼ又はグルタチオン ペルオキシダーゼである、請求項８〜13のいずれかに記 載の製品。 15．−NOシンターゼの抑制物質は、L-ニトロアルギニン、L-ニトロアルギニン のメチルエステル、L-N-モノメチルアルギニン、アミノグアニジン、アグマチン 、2-アミノ-1-(メチルアミノ)ベンゾイミダゾール、5-ニトロインダゾール、6- ニトロインダゾール、7-ニトロインダゾール、1,2-(トリフルオロメチルフェニ ル)イミダゾール、2-アミノ-4-メチル-6-(2-アミノエチル)ピリジン、2-イミノ ピペリジン、2-イミノホモピペリジン、2-イミノ-5,6-ジヒドロ-1,3-チアジン、 2-イミノ-5,6-ジヒドロ-1,3-オキサジン、2-イミノテトラヒドロピリミジン、N- フェニル-2-チオフェンカルボキシイミドアミド、S-エチルイソ-チオ尿素、S-メ チル-L-チオシトルリン又はS-エチル-L-チオシトルリンから選ばれ、 −反応性型酸素の捕捉剤は、プロブコール、ユビキノン、α-,β-,γ-, ε-,τ-又はδ-トコフェロール、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸、2 ,3,6-トリメチル-2-ヘキシルオキシフェノール、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メトキ シフェノール、オイゲノール、トロロックス、没食子酸n-プロピル、テンポール 、カフェ酸、シナピン酸、没食子酸、2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-オキ シル-3-カルボン酸、メラトニン、5-ヒドロキシインドール-2-カルボン酸、イミ ダゾール、シメチジン、アスコルビン酸、N-アセチルシステイン、β-カロテン 、補酵素Q10、捕獲性化合物、9-[2-(4-モルホリニル)エチル]-2,4-ジ-1-ピロリ ジニル-9H-ピリミド[4,5-b]インドール、4-ヒドロキシカルバゾール又はカルベ ジロールである、請求項８〜14のいずれかに記載の製品。