JP2002155100A - 幹細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 造血幹細胞を含む種々の幹細胞集団の成長を
刺激する因子を提供すること。 【解決手段】 ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１４５１を有
する細胞株ＭＬ−１から得られる幹細胞増殖因子であっ
て、以下の特性を有するポリペプチドを含む、幹細胞増
殖因子：ａ）ヒトＣＤ３４⁺骨髄幹細胞の増殖を刺激す
る；ｂ）尿素の存在下での２次元ゲル電気泳動によって
決定された、２３ｋＤａの分子量を有する；ｃ）ドデシ
ル硫酸ナトリウムの存在下での１次元ゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定された、２７ｋＤａの分
子量を有する；ｄ）尿素の存在下での２次元ゲル電気泳
動によって決定された、約７．７の等電点を有する；
ｅ）尿素の存在下でのフラットベッドゲル電気泳動によ
って決定された、約９の等電点を有する；ｆ）ＣＦＵ−
ＧＥＭＭ由来の多系統細胞の増殖を刺激する；および
ｇ）ＭｏｎｏＳに結合するが、ＤＥＡＥセルロースにも
ＣＭセルロースにも結合しない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】（１．導入）本発明は、胚細
胞腫瘍株およびヒトＣＤ３４＋細胞株から単離された自
己分泌成長因子に指向される。特に、幹細胞増殖因子
（ＳＣＰＦ）の生産、精製、および使用に関する。種々
の細胞株において、本発明のタンパク質は、２つの形
態、可溶性形態および膜結合形態で存在し、膜結合形態
は、少ないパーセンテージのヒト骨髄細胞の表面で検出
され、これらの細胞の増殖を刺激する。従って、ＳＣＰ
Ｆは、造血性幹細胞の成長を増加することを含むがこれ
に限定されない広域な適用を有する。さらに、抗体によ
るそのタンパク質の除去は、腫瘍細胞成長の制御に有用
である。

【０００２】

【従来の技術】（２．発明の背景）自己分泌様式でその
成長因子を生産する細胞にその刺激効果を作用させる成
長因子が記載されている。同じ因子が、他の標的細胞に
同様の活性を示し得る。しかし、神経系から得られる腫
瘍細胞が、造血系の細胞の成長を調節する因子を生産す
ることは、文献に記載されていなかった。

【０００３】（２．１．胚細胞腫瘍）中枢神経系の胚細
胞腫瘍は希少であり、小児固形腫瘍の３％未満である。
これらの腫瘍は、最も一般的には松果体および視床下部
に生じるが、それらは視床および脳幹神経節においても
記載されている。組織学的には、これらの腫瘍は、最も
一般的には胚細胞腫であることが見い出されている。よ
り少数のサブタイプは、絨毛癌、胚細胞腫瘍（ｅｍｂｒ
ｙｏｎａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、およ
び混合胚細胞腫瘍を含む。一般に、これらのタイプの腫
瘍は、いっそう悪い予後を有する。

【０００４】これらの腫瘍の治療は多様であり、胚細胞
腫の手術および放射線治療、非胚細胞腫性胚細胞腫瘍、
転移性疾病、または再発性疾病の患者にとって重要な役
割を果たす集中的なプラチナベース化学療法プロトコー
ルおよび自己骨髄移植がある。心室（脳室）シャントを
介して広がった転移が報告されており、そしてシャント
の路に沿って何処でも生じ得る。頚部および肺の転移性
沈積物が報告されているが、最も一般的には、これらの
沈積物は、心室腹膜シャントおよび大きな腹膜移植片と
関連する。頭蓋内胚細胞株腫瘍から培養された細胞株が
まれに報告されているが、いくつかの細胞株は、神経外
起源の胚細胞腫瘍に由来した。インビトロで継代された
細胞株は、ラット癌に由来した。これらの細胞株は、初
期多能性細胞の分化の研究で非常に価値があることが分
かった。

【０００５】（２．２．造血細胞および成長因子）ヒト
の薬において、造血を開始し調節する能力は、非常に重
要である（ＭｃＣｕｎｅら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１：１６３２）。悪性疾患を含む種々の疾病お
よび免疫疾患は、リンパ−造血系内の破裂に関するよう
に考えられる。多くのこれらの疾患は、前駆細胞を造血
系に再居住させることにより緩和されそして／または治
療され得、前駆細胞が分化するように誘起された場合、
患者の欠乏症は克服される。ヒトにおいては、現在の補
充療法は骨髄移植である。白血病の治療での骨髄移植の
使用は別として、現在では、それは他の新形成で頻繁に
用いられる（ＥｐｓｔｅｉｎおよびＳｌｅａｓｅ， １
９８５， Ｓｕｒｇ．Ａｎｎ． １７：１２５）。しか
し、このタイプの治療は、侵入性手順を含んでいるた
め、（ドナーとレシピエントの）両方にとって痛みが伴
われ、そしてレシピエントに重篤な合併症を与え、特
に、移植片は同種異型である場合、移植片対宿主疾病
（Ｇｒａｆｔ Ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ）（ＧＶＨＤ）を生じる。従って、ＧＶＨＤの危険性
は、他の致命的な疾病の患者への骨髄移植の使用を制限
する。造血疾患に対し潜在的にさらに刺激的な他の治療
は、コロニー刺激因子を１つまたは組合せによる患者の
治療である（Ｄｅｘｔｅｒ，１９８７， Ｊ． Ｃｅｌ
ｌ Ｓｃｉ． ８８：１）。

【０００６】少数の自己修復性幹細胞が系統特異的な前
駆細胞を生じさせることによる血液細胞形成のプロセス
は、特異的ホルモンの制御下にあり、系統特異的な前駆
細胞は、続いて増殖し、分化し、成熟循環血液細胞を生
産する。これらのホルモンは、コロニー刺激因子（ＣＳ
Ｆ）として集合的に知られている（Ｍｅｔｃａｌｆ，１
９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１６； Ｄｅｘｔ
ｅｒ， １９８７，Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ８８：
１； ＧｏｌｄｅおよびＧａｓｓｏｎ，１９８８， Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， ７月：６
２； ＴａｂｂａｒａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ， １９
９１， Ａｎｔｉ−Ｃａｃｅｒ Ｒｅｓ． １１：８
１； Ｏｇａｗａ， １９８９， Ｅｎｖｉｒｏｎ．
Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｅｓｐ． ８０：１９９； Ｄｅｘ
ｔｅｒ， １９８９， Ｂｒ．Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．
４５：３３７）。組換えＤＮＡ技術の出現により、多数
のこれらのＣＳＦは、今やクローン化され、そして発現
されている（Ｓｏｕｚａら、１９８６， Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３２：６１； Ｇｏｕｇｈら、１９８４， Ｎａ
ｔｕｒｅ ３０９：７６３； Ｙｏｋｏｔａら、１９８
４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：１０７０； Ｋａｗａｓａｋｉ
ら、１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：２９１）。
これらの組換えＣＳＦは今では入手可能であり、そして
それらの治療の潜在能力への広範囲な研究が始まった。
薬におけるそれらの潜在性使用は広くまで及び、輸血、
骨髄移植、免疫抑制疾患の矯正、癌治療、創傷治癒、お
よび免疫応答の活性化のような領域を含む。（Ｇｏｌｄ
ｅおよびＧａｓｓｏｎ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， ７月：６２）。造血性前
駆細胞の増殖および分化の誘導とは別に、ＣＳＦはま
た、成熟血液細胞の多数の機能の活性化を示し（Ｓｔａ
ｎｌｅｙら、１９７６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．
１４３：６３１； Ｓｃｈｒａｄｅｒら、１９８１，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．
Ｓ．Ａ． ７８：３２３； Ｍｏｏｒｅら、１９８０，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５：１３０２； Ｋｕｒ
ｌａｎｄら、１９７９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６：２３２６；
ＨａｎｄｍａｎおよびＢｕｒｇｅｓｓ， １９７９，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２２：１１３４； Ｖａｄ
ａｓら、１９８３， Ｂｌｏｏｄ ６１：１２３２；
Ｖａｄａｓら、１９８３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３０：７９５）、成熟造血細胞の移動に影響すること
を含む（Ｗｅｉｂａｒｔら、１９８６，Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １３７：３５８４）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】造血幹細胞を含む種々
の幹細胞集団の成長を刺激する因子を提供すること。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規な自己分
泌成長因子のファミリーである幹細胞増殖因子（ＳＣＰ
Ｆ）を提供する。

【０００９】（３．発明の要旨）本発明は、以下の項目
１〜５７に記載の発明を提供する。 １．以下の特性を有するポリペプチドを含む幹細胞増殖
因子（SCPF）： （ａ）ヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激する；および（ｂ）
（ａ）の幹細胞増殖効果を阻害するSAM.1抗体を結合さ
せる。 ２．IL-3、GM-CSF、G-CSF、またはM-CSFを結合および中
和する抗体の存在下でヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激する
さらなる特性を有する、項目１に記載のSCPF。 ３．前記ポリペプチドが、SDS-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により決定された32キロダルトンの分子量を有
する可溶性ポリペプチドである、項目１に記載のSCPF。 ４．前記ポリペプチドが、SDS-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により決定された23キロダルトンの分子量を有
する、項目１に記載のSCPF。 ５．前記ポリペプチドが、トランスメンブランドメイン
を含み、そしてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より決定された37キロダルトンの分子量を有する、項目
１に記載のSCPF。 ６．前記ヒト骨髄幹細胞がCD34を発現する、項目１に記
載のSCPF。 ７．胚細胞腫瘍株により生産される、項目１に記載のSC
PF。 ８．前記胚細胞腫瘍株が神経外胚葉起源である、項目７
に記載のSCPF。 ９．骨髄細胞株により生産される、項目１に記載のSCP
F。 １０．ATCCに寄託されて受諾番号CRL 10992を有する細
胞株751-NA-15により生産される、項目１に記載のSCP
F。 １１．ATCCに寄託されて受諾番号CRL 11451を有する細
胞株ML-1により生産される、項目１に記載のSCPF。 １２．項目１に記載のSCPFに免疫特異的に結合する抗
体。 １３．モノクローナル抗体である、項目１２に記載の抗
体。 １４．SCPFの生物学的活性を中和する、項目１２に記載
の抗体。 １５．モノクローナル抗体である、項目１４に記載の抗
体。 １６．以下の工程を包含する、項目１に記載の幹細胞増
殖因子（SCPF）を生産する方法： （ａ）遺伝子発現を指向する調節ヌクレオチド配列の作
動可能な制御下で項目１に記載のSCPFをコードするヌク
レオチド配列を含む細胞を培養する工程であって、それ
により生物学的に活性なSCPFが該培養細胞により発現さ
れる、工程；および（ｂ）該培養から生物学的に活性な
SCPFを回収する工程。 １７．前記培養細胞が胚細胞腫瘍株である、項目１６に
記載の方法。 １８．前記胚細胞腫瘍株が神経外胚葉起源である、項目
１７に記載の方法。 １９．前記培養細胞が骨髄細胞株である、項目１７に記
載の方法。 ２０．前記細胞株が、ATCCに寄託されて受諾番号CRL 10
992を有する細胞株751-NA-15である、項目１６に記載の
方法。 ２１．前記細胞株が、ATCCに寄託されて受諾番号CRL 11
451を有する細胞株ML-1である、項目１６に記載の方
法。 ２２．前記培養細胞が、前記調節ヌクレオチド配列の作
動可能な制御下で前記SCPFをコードする組換えDNAベク
ターで形質転換された遺伝子工学的に処理された宿主細
胞である、項目１６に記載の方法。 ２３．前記宿主細胞が原核生物細胞である、項目２２に
記載の方法。 ２４．前記宿主細胞が真核生物細胞である、項目２２に
記載の方法。 ２５．前記組換えベクターが、さらに選択マーカーをコ
ードするヌクレオチド配列を含む、項目２２に記載の方
法。 ２６．前記SCPFが前記培養培地から回収される、項目２
２に記載の方法。 ２７．ヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激する方法であって、
該骨髄細胞を項目１に記載の幹細胞増殖因子（SCPF）と
接触させる工程を包含する、方法。 ２８．前記骨髄幹細胞がCD34⁺である、項目２７に記載
の方法。 ２９．培養において実施される、項目２７に記載の方
法。 ３０．インビボで実施される、項目２７に記載の方法。 ３１．項目１に記載の幹細胞増殖因子（SCPF）により刺
激される腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該腫
瘍細胞を該SCPFに結合しそしてこれを中和する抗体また
は抗体フラグメントと接触させる工程を包含する、方
法。 ３２．培養において実施される、項目３１に記載の方
法。 ３３．インビボで実施される、項目３１に記載の方法。 ３４．胚細胞腫瘍株由来サイトカインを生産する方法で
あって、該サイトカインがヒト幹細胞の増殖を刺激し、
該方法が以下の工程を包含する、方法： （ａ）遺伝子発現を指向する調節ヌクレオチド配列の作
動可能な制御下でサイトカインをコードするヌクレオチ
ド配列を含む細胞を培養する工程であって、それにより
生物学的に活性なサイトカインが該培養細胞により発現
される、工程；および（ｂ）該培養から生物学的に活性
なサイトカインを回収する工程。 ３５．前記培養細胞が胚細胞腫瘍株である、項目３４に
記載の方法。 ３６．前記培養細胞が、前記調節ヌクレオチド配列の作
動可能な制御下で前記サイトカインをコードする組換え
DNAベクターで形質転換された遺伝子工学的に処理され
た宿主細胞である、項目３４に記載の方法。３７．以下
の特性を有するポリペプチドを含む幹細胞増殖因子（SC
PF）： （ａ）ヒト幹細胞の増殖を刺激する；および（ｂ）項目
１に記載の幹細胞増殖因子、IL-3、GM-CSF、G-CSF、ま
たはM-CSFの活性を結合および中和する抗体の存在下で
該ヒト幹細胞の増殖を刺激する。 ３８．項目１に記載の幹細胞増殖因子（SCPF）をコード
する単離されたポリヌクレオチド配列。 ３９．前記ポリヌクレオチドがDNA、cDNA、またはRNAで
ある、項目３８に記載のポリヌクレオチド。 ４０．項目３８に記載のポリヌクレオチド配列を含む生
物学的に機能性の発現ベクター。 ４１．前記ベクターがプラスミドである、項目４０に記
載のベクター。 ４２．前記ベクターがウイルスである、項目４０に記載
のベクター。 ４３．前記ウイルスがRNAウイルスである、項目４２に
記載のベクター。 ４４．前記ウイルスがレトロウイルスである、項目４３
に記載のベクター。 ４５．項目４０に記載のベクターで安定に形質転換され
た宿主細胞。 ４６．前記宿主が原核生物である、項目４５に記載の宿
主細胞。 ４７．前記宿主が真核生物である、項目４５に記載の宿
主細胞。 ４８．被験体における幹細胞増殖因子（SCPF）に関連し
た疾患を検出する方法であって、項目１２に記載の抗体
を、SCPF関連疾患を有すると推測される該被験体の標本
と接触させる工程、および該抗体の結合を検出する工程
を包含する、方法。 ４９．前記疾患が、白血病、再生不良性貧血、神経性疾
患、重度の混合免疫不全、および脾機能亢進からなる群
から選択される、項目４８に記載の方法。 ５０．前記検出がインビボである、項目４８に記載の方
法。 ５１．前記検出がインビトロである、項目４８に記載の
方法。 ５２．前記抗体が検出可能に標識されている、項目４８
に記載の方法。 ５３．前記検出可能な標識が、ラジオアイソトープ、蛍
光性化合物、生物発光性化合物、化学発光性化合物、お
よび酵素からなる群から選択される、項目５２に記載の
方法。 ５４．前記骨髄細胞がさらにサイトカインと接触され
る、項目２７に記載の方法。 ５５．前記サイトカインがIL-3、IL-6、およびSCFから
なる群から選択される、項目２７に記載の方法。 ５６．ATCC受諾番号CRL 10992を有する細胞株。 ５７．ATCC受諾番号CRL 11451を有する細胞株。

【００１０】本発明は、幹細胞増殖因子（ＳＣＰＦ）、
造血幹細胞を含む種々の幹細胞集団の成長を刺激するこ
とにおけるその使用、および胚細胞腫瘍または他の細胞
株により生産される他の成長因子またはサイトカインを
同定する方法に関する。ＳＣＰＦは、ヒト骨髄幹細胞の
増殖を刺激する新規な自己分泌成長因子のファミリーで
ある。ＳＣＰＦはまた、３２，０００ダルトンの分泌形
態および３７，０００ダルトンの分子量の膜結合形態と
して７５１と称せられるネズミ細胞株により発現され
る。ＳＣＰＦはまた、分子量２３，０００ダルトンのＭ
Ｌ−１と称される細胞株により発見される。ＳＣＰＦ
は、ＣＤ３４⁺ヒト骨髄幹細胞と同様にそれを生産する
細胞株の増殖および成長を刺激する。

【００１１】本発明は、一部、ネズミ７５１細胞株が自
己分泌成長因子を培養培地に放出するという本出願者の
発見に基づく。精製３２ｋＤａタンパク質に対して生成
するポリクローナルウサギ抗体（ＳＡＭ．１）は、７５
１細胞により生産された３２ｋＤａの分泌産物および３
７ｋＤａの細胞結合タンパク質ならびにＭＬ−１細胞に
より生産された２３ｋＤａのタンパク質の両方を認識す
る。この抗体はまた、ヒト骨髄における細胞集団を同定
し得、正常（粘着涸渇した）骨髄細胞の２．６％未満と
反応する。このＳＣＰＦ⁺骨髄細胞集団は、幹細胞マー
カーＣＤ３４を同時発現する。本明細書に記載の実施例
に示すように、ＳＣＰＦの生物学的活性は、任意の公知
の骨髄コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ
−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−３を含む）とは区
別される。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−Ｃ
ＳＦ、およびＩＬ−３に特異的な抗体は、ＳＣＰＦの生
物学的活性を阻害しない。さらに、抗ＳＣＰＦ抗体はＳ
ＣＦ機能を中和しないので、ＳＣＰＦはまた、ｃ−ｋｉ
ｔオンコジーン産物（ＳＣＦ）に対するリガンドとも区
別される。

【００１２】本発明は、実施例の様式により記載されて
おり、実施例では、ＳＣＰＦは、特定の細胞株、例え
ば、本明細書中に記載される細胞株により生産された自
己分泌成長因子として同定され、この因子の生化学的な
および生物学的な特性を特徴づける。これらの新規なタ
ンパク質の広範囲な種類の使用は、本明細書に記載の発
明により包含される。

【００１３】（５．発明の詳細な説明）本発明は、幹細
胞増殖因子（ＳＣＰＦ）、従来技術または組換えＤＮＡ
技術によるＳＣＰＦの生産方法、ＳＣＰＦの使用方法、
および細胞株に同様に由来するＳＣＰＦファミリーの他
のメンバーを同定および単離する方法に関する。

【００１４】ＳＣＰＦは新規な自己分泌成長因子であ
り、膜結合形態および分泌形態の両方でネズミ７５１細
胞株により発現される。ＳＣＰＦの膜形態はまた、ＣＤ
３４⁺ヒト骨髄細胞の小画分の細胞表面上で発現され
る。ＳＣＰＦは、ＣＤ３４⁺ヒトＭＬ−１細胞株により
発現され、そして細胞ライゼートから単離されると２３
ｋＤａの分子量および約７．７のｐＩを有する。さら
に、ＳＣＰＦはＣＤ３４⁺骨髄幹細胞の増殖を刺激し、
それは造血細胞成長の促進を必要とする条件下、すなわ
ち、骨髄移植における使用のための幹細胞の培養、また
は造血を調節するためのインビボにおける処置において
有用であり得ることを示している。７５１細胞培養物中
の抗体によるＳＣＰＦの除去は、腫瘍細胞コロニー形成
の減少をもたらし、ＳＣＰＦが腫瘍細胞増殖の支持に関
与しており、従ってＳＣＰＦ活性の阻害が、特定の腫瘍
の治療に有用であり得ることを示唆する。これは、抗Ｓ
ＣＰＦ抗体および７５１細胞の同時注入により細胞株の
腫瘍形成の減少が生じるインビボ実験によりさらに支持
される。さらに、膜形態のＳＣＰＦはまた、抗ＳＣＰＦ
抗体の使用による多能性骨髄幹細胞の小集団の同定およ
び単離のための細胞表面マーカーとして有用であり得
る。

【００１５】ＳＣＰＦ、またはそのフラグメントおよび
誘導体は、造血の調節および特定の胚細胞の処置におい
て広域な潜在的適用を有し得る。

【００１６】本発明のもう一つの実施態様では、胚細胞
腫瘍株は培養で生じ得る。このような腫瘍細胞は、特に
造血系の細胞、一般に種々の組織型の胚／幹細胞の成長
増大活性を有するサイトカインの供給源であり得る。

【００１７】本発明は、以下のサブセクションでさらに
詳細に説明されるが、単に記載を目的とするだけであ
り、限定されない。議論を明解にするために、本発明
は、特定のＳＣＰＦおよび細胞株によって記載される。
しかし、この原理は、他の細胞株由来の他の自己分泌因
子に同様に適用され得る。

【００１８】（５．１．ＳＣＰＦを生産する細胞株）中
枢神経系の胚細胞腫瘍は、胚発生で他の組織部位にそれ
らが移動する間、神経クレストに留まった原始細胞の産
物であると考えられている。このような腫瘍細胞が、神
経系外の組織に作用する種々のサイトカインを生産し得
る（Ｂｈａｎｄａｒ， １９８８， Ｍｅｄ． Ｈｙｐ
ｏｔｈ， ２７：２９１）。従って、胚細胞腫瘍から生
じる細胞株は、造血系の細胞を含む種々の細胞タイプの
増殖に影響する初期作用性成長因子の供給源であり得
る。

【００１９】ネズミ７５１細胞株は、手術により除去し
た胚細胞腫瘍から細胞株を樹立する過程で発見された。
胚細胞腫瘍は、腹膜腔（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｐｅｒｉ
ｔｏｎｅａｌ）シャントに沿って複数の皮下塊を有する
と診断された患者から得られた。培養７５１細胞は、非
粘着性であり、そしてインビトロで７〜８時間の極度に
短い倍加時間を示す。この迅速な成長速度（ｋｉｎｅｔ
ｉｃ）はまた、ＢＮＸマウスへの培養細胞の移入の際、
インビボにおいても確認された。培養細胞の移入は、ネ
ズミモデルでの外因性腫瘍の大部分に関する２〜３カ月
とは対照的に、７日で１０³細胞の接種物から目視可能
な皮下腫瘍を発達させた。

【００２０】特異的細胞決定因子を指向する抗体を用い
るフローサイトメトリー分析は、７５１細胞が、適切な
刺激の際に、ニューロン細胞系統またはグリア細胞系統
へとさらに分化し得る原始脳神経外胚葉細胞株を表すこ
とを示した。従って、これは、成長および分化能力の両
方を有する原始多能性細胞株である。さらに、オンコジ
ーンｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｍｓのｍＲＮＡは、オンコ
ジーン配列のパネルに特異的な分子プローブを用いて検
出された。ｃ−ｆｍｓは、マクロファージコロニー刺激
因子に対するレセプターであることが示されたので、７
５１細胞は同じ様式で骨髄の前駆細胞と関係があり得
る。

【００２１】ＭＬ−１細胞株は、以下に記載するよう
に、ＣＤ３４⁺ヒト骨髄細胞の異種集団を７５１細胞か
ら得た部分的に精製したＳＣＰＦ画分で処理することに
より樹立させた。細胞を、以下に記載するように、７５
１ ＳＣＰＦ調製物の存在下で継代培養し、そして外因
性ＳＣＰＦの非存在下で継続成長し得るＭＬ−１細胞株
を単離した。この細胞株は、ＣＤ３４⁺、ＣＤ３８^-、Ｈ
ＬＡＤＲ⁺であるが、ＣＤ３^-、ＣＤＲ^-、およびＣＤ８^-
でないことが示される。

【００２２】（５．２．幹細胞増殖因子）本明細書の実
施例に記載されるとおり７５１細胞株により生産される
幹細胞増殖因子は、２つの形態、約３２ｋＤａの分子量
を有する分泌形態および３７ｋＤａの分子量の膜結合形
態で存在する。約７．０〜８．０範囲のＰ．Ｉを有する
複数のＳＣＰＦイソ型が同定される。

【００２３】３２ｋＤａ ＳＣＰＦを用いて、ウサギに
おいてポリクローナル抗血清を生成させた。ＳＡＭ．１
と名付けられた特異的ポリクローナル抗体を用いて、７
５１細胞による主要分泌タンパク質のさらなる生化学的
特徴付けを容易にした。抗体は、ウエスタン免疫ブロッ
ティング実験において７５１全細胞ライゼートで３７ｋ
Ｄａのタンパク質種と反応したので、この抗体がＳＣＰ
Ｆタンパク質に特異的であることが最初に示された。こ
の所見は、目的のタンパク質が３２ｋＤａの分泌形態お
よび固定（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）のためのトランスメン
ブラン成分を含み得る３７ｋＤａ分子量の膜形態で存在
し得ることを示す。従って、同じタンパク質が、可溶性
分子および相互作用する細胞間の細胞表面タンパク質の
両方として機能し得る。

【００２４】このタンパク質（以降、幹細胞増殖因子、
ＳＣＰＦと称する）の生物学的活性を示すために、コロ
ニー阻害アッセイを行い、このアッセイでは７５１細胞
コロニー形成が種々の濃度のウサギ抗血清の存在下で評
価された。この結果は、この抗体が腫瘍細胞コロニー形
成を阻害することを明確に示し、分泌されたタンパク質
が７５１細胞の成長を促進する自己分泌成長因子である
ことを示した。さらに、抗体の増殖阻害効果は、神経芽
腫細胞株の成長が阻害されない胚または幹細胞株に特異
的である。

【００２５】ＳＣＰＦは、ネズミ７５１細胞株から精製
され、そしてヒト骨髄細胞の増殖を刺激するその能力に
ついてテストした。ＳＣＰＦはクロノジェニックアッセ
イで芽細胞の成長を誘導した。これは、続いてフローサ
イトメトリー分析によりＣＤ３４マーカーおよびＨＬＡ
クラスＩ抗原を発現することが示された。同じ細胞が長
期Ｇｏｒｄｏｎ培養においてＳＣＰＦの非存在下で成長
し、そして組換えＧＭ−ＣＳＦの存在下で再プレーティ
ング（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）効率について試験する場
合、細胞は応答して、顆粒球、単球、および混合表現型
のコロニーを生じさせた。従って、ＳＣＰＦは、続くコ
ロニー刺激因子での刺激に応答して、分化能力を保持す
るＣＤ３４⁺骨髄細胞集団の複製を誘導し得る。

【００２６】抗ＳＣＰＦ抗体がヒト骨髄細胞と反応した
場合、小さいが検出可能な細胞画分がポジティブに染色
されることが示された。同じ細胞はまた、造血幹細胞に
より発現されたマーカーであると報告されたＣＤ３４タ
ンパク質を発現する。しかし、ＳＣＰＦ産生７５１胚細
胞腫瘍がＣＤ３４発現についてネガティブであること、
および抗ＳＣＰＦおよび抗ＣＤ３４抗体が精製ＣＤ３４
⁺細胞への結合において互いに拮抗的に阻害しないとい
う所見は、ＳＡＭ．１抗体はＣＤ３４マーカーを指向し
ないが、ＳＣＰＦの膜形態を指向することを示す。ＳＡ
Ｍ．１抗体はネズミ、ウシ、およびヒツジ骨髄から得ら
れる細胞と反応しなかったので、ＳＡＭ．１抗体は、異
なる非ヒト動物種の任意のタンパク質と交差反応しな
い。

【００２７】ＳＣＰＦの生物学的特性をさらに特徴づけ
るために、ＣＤ３４⁺細胞の長期培養を、７５１細胞株
から精製された外因性ＳＣＰＦの存在下で開始した。組
換えＩＬ−３またはＩＬ−６に応答して迅速に増大した
培養物とは異なって、ＳＣＰＦを与えた培養物は、次い
でＳＣＰＦに応答して増殖し得るＣＤ３４⁺細胞の残余
集団を初期のうちに細胞死に至らせた。ＳＣＰＦ処理細
胞は、ＩＬ−３またはＩＬ−６で成長した培養物と対比
して、形態学においてより均質である。しかし、ＳＣＰ
Ｆ処理した培養物は、細胞表面マーカー発現に基づいて
２つの細胞集団を生じた。両方の集団がＣＤ３４を発現
するが、１つの集団はＣＤ３８およびＨＬＡ−ＤＲ発現
についてネガティブであり、そしてもう一方は低レベル
で両方のマーカーを発現した。従って、まとめると、細
胞は、他の分化シグナルに応答するそれらの能力を保持
するが、ＳＣＰＦは分化を起こさずにＣＤ３４⁺骨髄細
胞の増殖を誘導する自己分泌成長因子である。この因子
は培養細胞の悪性トランスフォーメーションを誘導しな
い。なぜならば、ＳＣＰＦを除去すると、ＣＤ３４ ⁺細
胞の生存力が急速に低下したからである。

【００２８】さらに、ＳＣＰＦは、他のコロニー刺激因
子と組合せて使用する場合、骨髄細胞における刺激効果
を増加し得る。しかし、ＳＣＰＦ生物学的活性は、ＧＭ
−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−３を
含む公知の造血成長因子と同様ではない。さらに、ヒト
ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−
３に特異的な抗体は、ＳＣＰＦの生物学的活性を中和し
ない。さらに、抗ＳＣＰＦ抗体は、最近同定された幹細
胞因子（ＳＣＦ）の機能を阻害しない。このＳＣＦは、
ｃ−ｋｉｔオンコジーンによりコードされたレセプター
に対するリガンドであることが示されている（Ｙｏｋｏ
ｔａら、１９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：１０７０； Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓら、１９９０， Ｃｅｌｌ ６３：１６
７； Ｚｓｅｂｏら、１９９０，Ｃｅｌｌ ６３：１９
５）。

【００２９】ネズミ７５１細胞により生成したＳＣＰＦ
を、以下の実施例に記載のとおり、ＭＬ−１細胞株の単
離を促進するために用いた。ＭＬ−１細胞株は、ＳＣＰ
Ｆ活性に対する標的細胞およびヒトＳＣＰＦの供給源の
両方である。ＭＬ−１細胞ライゼートから得られるＳＣ
ＰＦは、以下に記載した尿素の存在下での２次元ゲル電
気泳動により決定されるように２３ｋＤａの分子量およ
び約７．７のｐＩを示す。ＭＬ−１により生成されたＳ
ＣＰＦは、ＳＡＭ．１抗体（７５１細胞由来のＳＣＰＦ
に対して生じた）と反応し、以下に記載のとおりヒト標
的細胞でアッセイした場合の生物学的活性を示す。

【００３０】（５．３．ＳＣＰＦコード化配列の単離）
ｃＤＮＡの調製のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）は、ＳＣＰＦを生成する細胞供給源から得られ得る
が、ＳＣＰＦについてのゲノム配列は任意の細胞供給源
から得られ得る。例えば、ＭＬ−１、７５１−ＮＡ、７
５１−ＬＩＶ、または７５１−ＬＮ細胞は、ＳＣＰＦに
ついてのコード化配列の供給源としておよび／もしくは
ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの調製のために用い
られ得る。ＳＣＰＦコード化配列を含む遺伝学的に設計
された微生物または細胞株は、この目的のためにＤＮＡ
の便利な供給源として使用され得る。

【００３１】ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのいず
れかが、当該分野で周知の技術を用いて生成されるＤＮ
Ａフラグメントから調製され得る。ＳＣＰＦをコードす
るフラグメントは、精製タンパク質から得られるアミノ
酸配列情報に基づくＳＣＰＦ配列の一部分と相同なヌク
レオチドプローブを用いてこのようなライブラリーをス
クリーニングすることにより同定され得る。あるいは、
抗体プローブは、λｇｔ１１のような発現クローニング
方法により生成されるライブラリーをスクリーニングす
るために使用され得る（ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．
Ｓ．Ａ． ８０：１１９４−１１９８）。コード化配列
の部分は、クローニングおよび発現に用いられ得るが、
完全長のクローン、すなわち、ＳＣＰＦの全コード化領
域を含むクローンが発現のために好ましいとされ得る。
これらの目的に対し、ＤＮＡの単離、適切な制限フラグ
メントの生成、クローンおよびライブラリーの構築、お
よび組換え体のスクリーニングのための当業者に周知の
技術が用いられ得る。オリゴヌクレオチド配列を用い
て、ポリメラーゼ連鎖反応により、独特な遺伝子配列の
コピー数を増加させ得る。このアプローチは、縮重オリ
ゴヌクレオチドを用いて得られるより特異的なプローブ
を提供し得る。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．
Ｙ．に記載の技術を参照。

【００３２】ＳＣＰＦコード化配列を同定およびクロー
ン化するために選択される方法にかかわらず、発現クロ
ーニング方法は、スクリーニングする労力を十分に減少
させるために用いられ得る。最近、抗体遺伝子をクロー
ニングおよび発現するための１工程手順が報告された
（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０， Ｎａｔｕｒｅ
３４８：５５２−５５４； ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２
９３−２９９）。この技術に基づき、ＳＣＰＦ遺伝子
は、同様に、λまたはｆｄのようなバクテリオファージ
のコートタンパク質遺伝子に近接する部位でベクターに
直接クローン化され得る。ＳＣＰＦ遺伝子を有するファ
ージは、その表面で融合タンパク質を発現するので、Ｓ
ＣＰＦ特異的抗体を含むカラムが、結合活性でファージ
粒子を選択および単離するために使用され得る。Ｌａｍ
ｂｄａ−Ｚａｐ−ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いる市販
の発現クローニング系はまた、ＳＣＰＦ ｃＤＮＡライ
ブラリーのクローニングおよび抗体スクリーニングのた
めに使用され得る。過渡的な遺伝子発現系は、正確なＳ
ＣＰＦ遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、
ＣＯＳ細胞系（例えば、ＧｅｒａｒｄおよびＧｌｕｚｍ
ａｎ， １９８６， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ
ｌ． ６（１２）４５７０−４５７７）が使用され得
る。

【００３３】ヌクレオチドコード化配列の縮重のため
に、任意のＳＣＰＦ遺伝子産物のアミノ酸配列をコード
する他のＤＮＡ配列は、ＳＣＰＦのクローニングおよび
発現のために本発明の実施において用いられ得る。例え
ば、ＳＣＰＥアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列、もしくはＳＣＰＦ遺伝子またはそのｃＤＮＡに選択
的にハイブリダイズするヌクレオチド配列が、ＳＣＰＦ
のクローニングおよび発現のために用いられ得る。この
ような配列の改変は、同じまたは機能的に等価な遺伝子
産物をコードする配列を生じる異なるヌクレオチド残基
の欠失、付加、または置換を含む。遺伝子産物は、配列
内にアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含み得、
サイレント変化を生じ、生物活性産物を生産する。この
ようなアミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、可
溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質
の類似性に基づき行われ得る。例えば、負に荷電したア
ミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；
正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含
む；類似の親水性値を有する荷電していない極性頭基を
有するアミノ酸は以下を含む：ロイシン、イソロイシ
ン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グル
タミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロ
シン。

【００３４】さらに、コード化ＳＣＰＦタンパク質の生
物学的活性を実質的に変化しない構造的な改変を含む他
のＤＮＡ配列もまた、本発明の実施において用いられ得
る。このような改変は、プロセッシング部位の付加およ
び／またはグリコシル化部位の除去を作製するような、
ＳＣＰＦにおけるアミノ酸残基の付加、欠失、または置
換を含むが、これらに限定されない。例えば、特定のタ
ンパク質のＮ結合グリコシル化部位の除去により、酵母
発現系で特に有用である発現産物のグリコシル化が減少
する。

【００３５】（５．４．組換えＤＮＡ技術によるＳＣＰ
Ｆの発現）生物学的に活性なＳＣＰＦを発現させるため
に、ＳＣＰＦをコードしているヌクレオチド配列、また
は機能的に等価のヌクレオチド配列が、適切な発現ベク
ター、すなわち、挿入コード化配列の転写および翻訳の
必須要素を含むベクターに挿入される。ＳＣＰＦコード
化配列の改変型が、発現産物の安定性、生産、精製、ま
たは収量を増大させるように設計され得た。例えば、Ｓ
ＣＰＦおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質また
は開裂可能な融合タンパク質の発現が設計され得る。こ
のような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグ
ラフィーにより容易に単離され得る；例えば、異種タン
パク質に特異的なカラム上での固定による。開裂部位
が、ＳＣＰＦ部分と異種タンパク質との間に作られる場
合、ＳＣＰＦタンパク質は、開裂部位を分断する適切な
酵素または薬剤での処理によりクロマトグラフィーカラ
ムから放出され得る（例えば、Ｂｏｏｔｈら、１９８
８，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９：６５−７
０；およびＧａｒｄｅｌｌａら、１９９０， Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１５８５４−１５８５
９を参照）。

【００３６】当業者に周知である方法が、ＳＣＰＦコー
ド化配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発
現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方
法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、お
よびインビボでの組換え／遺伝子技術を含む。例えば、
Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．に記載の技術を参照。

【００３７】種々の宿主発現ベクター系が、ＳＣＰＦコ
ード化配列を発現するために用いられ得る。これらは、
以下のような微生物を含むがこれらに限定されない；
ＳＣＰＦコード化配列を含む組換えバクテリオファージ
ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現
ベクターを用いて形質転換した細菌；ＳＣＰＦコード化
配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換し
た酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフ
ラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）を感染させたまたはＳＣＰＦコード化
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔ
ｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系； Ｓ
ＣＰＦコード化配列を含む組換えウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系；もしくはＳＣＰＦコード化配列を含む組換えウイル
ス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイ
ルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、
または安定な発現のために設計された形質転換動物細胞
系。ＳＣＰＦは、炭水化物を含むことが確認されないの
で、細菌発現系ならびに翻訳時および翻訳後の改変を提
供する細菌発現系の両方が用いられ得る；例えば、哺乳
動物、昆虫、酵母、または植物の発現系。

【００３８】用いる宿主／ベクター系に依存して、多数
の適切な転写および翻訳要素は、構成性プロモーターお
よび誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写
ターミネーターなどを含み、発現ベクターで用いられ得
る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、１９８７， Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−
５４４参照）。例えば、細菌系でクローニングする場
合、誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージ
γのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−
ｌａｃハイブリッドプロモーター）などが用いられ得
る。哺乳動物細胞系にクローニングする場合、哺乳動物
細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオ
ネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプ
ロモーター（例えば、レトロウイルス長末端反復；アデ
ノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．
５Ｋプロモーター）が用いられ得る。組換えＤＮＡまた
は合成技術により生成されるプロモーターもまた、挿入
ＳＣＰＦコード化配列の転写を提供するために用いられ
得る。

【００３９】細菌系において、多数の発現ベクターが、
発現されるＳＣＰＦの意図される使用に依存して有利に
選択され得る。例えば、大量のＳＣＰＦを生成する場
合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の
発現を指向するベクターが所望され得る。ＳＣＰＦの回
収を助ける開裂部位を含むように設計されるベクターが
好ましい。このようなベクターは、Ｅ． ｃｏｌｉ発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、 １９８３，
ＥＭＢＯ Ｊ． ２：１７９１）、Ｅ． ｃｏｌｉ発
現ベクターｐＵＲ２７８では、ＳＣＰＦコード化配列が
ｌａｃ Ｚ コード化領域とインフレームでベクターに
連結され得、そのため、ハイブリッドＳＣＰＦ−ｌａｃ
Ｚタンパク質が生成される； ｐＩＮベクター（Ｉｎ
ｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ， １９８５， Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：３１０１−３１０
９； Ｖａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，
１９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：
５５０３−５５０９）；などを含むがこれに限定されな
い。。

【００４０】酵母では、構成性または誘導性プロモータ
ーを含む多数のベクターが用いられ得る。概説について
は以下を参照のこと、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖ
ｏｌ． ２， １９８８，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅ
ｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆Ｗｉｌｅ
ｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃｈ． １３； Ｇ
ｒａｎｔら、１９８７， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙ
ｅａｓｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、３１９８７，
Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ． １
５３， ｐｐ．５１６−５４４； Ｇｌｏｖｅｒ， １
９８６， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌ． Ｉ
Ｉ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈ．， Ｄ．
Ｃ．， Ｃｈ． ３； およびＢｉｔｔｅｒ， １９８
７， Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ＢｅｒｇｅｒおよびＫ
ｉｍｍｅｌ編、Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．，
Ｖｏｌ． １５２， ｐｐ． ６７３−６８４； お
よびＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ， １９８２， Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｖｏ
ｌ． ＩおよびＩＩ。構成性酵母プロモーター（例えば
ＡＤＨまたはＬＥＵ２）、もしくは誘導性プロモーター
（例えばＧＡＬ）が、用いられ得る（Ｃｌｏｎｉｎｇ
ｉｎ Ｙｅａｓｔ， Ｃｈ． ３， Ｒ． Ｒｏｔｈｓ
ｔｅｉｎ， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．１１，
Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ， ＤＭ
Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８６， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，
Ｗａｓｈ．， Ｄ．Ｃ．）。あるいは、ベクターは酵母
染色体に外来性ＤＮＡ配列の組み込みを促進するために
用いられ得る。

【００４１】植物発現ベクターを用いる場合、ＳＣＰＦ
コード化配列の発現は、任意の多数のプロモーターによ
り操作され得る。例えば、ウイルスプロモーター、例え
ば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプ
ロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら、１９８４， Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１０：５１１−５１４）、またはＴＭＶのコー
トタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、１
９８７， ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１）が用い
られ得る；あるいは、植物プロモーター、例えば、ＲＵ
ＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９
８４， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０；
Ｂｒｏｇｌｉｅら、１９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
４：８３８−８４３）；または熱ショックプロモータ
ー、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１
７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら、１９８６， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：５５９−５６５）が用い
られ得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプ
ラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転
換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーショ
ンなどを用いて、植物細胞に導入され得る。このような
技術の概説については以下を参照のこと、例えば、Ｗｅ
ｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ， ＮＹ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ， ｐｐ．
４２１−４６３；および ＧｒｉｅｒｓｏｎおよびＣ
ｏｒｅｙ， １９８８， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｂｌａｃｋｉｅ，
Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈ． ７−９。

【００４２】ＳＣＰＦを発現するために用いられ得る別
の発現系は昆虫系である。１つのこのような系では、Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するベ
クターとして用いられる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で成長する。Ｓ
ＣＰＦコード化配列は、ウイルスの非必須領域（例え
ば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化され得、そして
ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモ
ーター）の制御下に置かれ得る。ＳＣＰＦコード化配列
の挿入の成功により、ポリヘドリン遺伝子の不活化およ
び非閉塞性組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺
伝子によりコードされたタンパク質性コートを欠くウイ
ルス）の生産を生じ得る。次いで、これらの組換えウイ
ルスを用いて、挿入遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染させる。（例
えば、Ｓｍｉｔｈら、１９８３， Ｊ． Ｖｉｏｌ．
４６：５８４； Ｓｍｉｔｈ， 米国特許第４，２１
５，０５１号参照）。

【００４３】真核生物系、および好ましくは哺乳動物発
現系は、発現した哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後改
変を生じさせ得る。一次転写物の適切なプロセッシン
グ、グリコシル化、リン酸化、および有利には遺伝子産
物の分泌の細胞機構を有する真核生物細胞は、ＳＣＰＦ
の発現のための宿主細胞として用いられ得る。宿主細胞
株は好ましいとされ得る。このような宿主細胞株は、Ｃ
ＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣ
Ｋ、−２９３、およびＷＩ３８を含むがこれらに限定さ
れない。

【００４４】発現を指向するために組換えウイルスまた
はウイルス要素を用いる哺乳動物細胞系が設計され得
る。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場
合、ＳＣＰＦコード化配列はアデノウイルス転写／翻訳
制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部分リ
ーダー配列に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子
は、アデノウイルスゲノムにインビトロまたはインビボ
での組換えにより挿入され得る。ウイルスゲノムの非必
須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入に
より、生存し得そして感染宿主でＳＣＰＦタンパク質を
発現し得る組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａ
ｎおよびＳｈｅｎｋ， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３６
５５−３６５９参照）。あるいは、ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーターが用いられ得る。（例えば、Ｍａ
ｃｋｅｔｔら、１９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ７４１５−７
４１９； Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８４， Ｊ． Ｖｉ
ｒｏｌ． ４９： ８５７−８６４； Ｐａｎｉｃａｌ
ｉら、１９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ７９： ４９２７−４９３１参
照）。染色体外要素として複製する能力を有するウシパ
ピローマウイルスに基づくベクターが特に興味深い（Ｓ
ａｒｖｅｒら、１９８１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂ
ｉｏｌ． １： ４８６）。このＤＮＡがマウス細胞に
侵入した後しばらくして、プラスミドは約１００〜２０
０コピー／細胞まで複製する。挿入ｃＤＮＡの転写は、
宿主染色体へのプラスミドの組み込みを必要としない。
従って、高レベルの発現を生じる。これらのベクター
は、選択マーカー、例えば、ｎｅｏ遺伝子をプラスミド
に含むことにより、安定な発現のために用いられ得る。
あるいは、レトロウイルスゲノムは、宿主細胞にＳＣＰ
Ｆ遺伝子の発現を導入および指向し得るベクターとして
用いるために改変され得る（ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉ
ｇａｎ， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６３４９−６３５
３）。高レベルの発現はまた、メタロチオニンＩＩＡプ
ロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むがこれ
らに限定されない誘導性プロモーターを用いて達成され
得る。

【００４５】組換えタンパク質の長期の高収量生産のた
めに、安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む
発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞は適切な発
現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配
列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）お
よび選択マーカーにより制御されるＳＣＰＦ ｃＤＮＡ
を用いて形質転換され得る。組換えプラスミドの選択マ
ーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞に対
し、細胞の染色体にプラスミドを安定に組み込ませ成長
させて、順番にクローン化され得そして細胞株に広がり
得る病巣を形成させる。例えば、外来ＤＮＡ導入後、作
製された細胞は、栄養豊富な培地で１〜２日間培養され
得、次いで選択培地に切り換えられる。以下を含むがこ
れらに限定されない多数の選択系が用いられ得る：単純
ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、
１９７７， Ｃｅｌｌ １１： ２２３）、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６
２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ４８： ２０２６）、およびアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０，
Ｃｅｌｌ ２２： ８１７）遺伝子は、それぞれｔ
ｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-、またはａｐｒｔ^-細胞で使用され得
る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子に関する
選択性の基準として用いられ得る： ｄｈｆｒ遺伝子は
メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ
ら、１９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７７： ３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８
１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８： １５２７）； ｇｐｔ遺伝子はマイ
コフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎおよびＢｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ２０７
２； ｎｅｏ遺伝子はアミノグリコシドＧ−４１８に対
する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ
ら、１９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５
０： １）； およびｈｙｇｒｏ遺伝子はヒグロマイシ
ンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８
４， Ｇｅｎｅ ３０： １４７）。最近さらに別の選
択遺伝子が記載された：すなわちｔｒｐＢは、細胞にト
リプトファンの代わりにインドールを利用させる； ｈ
ｉｓＤは、細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを
利用させる（ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，
１９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０４７）； およびＯＤＣ
（オルニチンデカルボキシラーゼ）は、オルニチンデカ
ルボキシラーゼインヒビター、２−（ジフルオロメチ
ル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与え
る（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．， １９８７， Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編）。

【００４６】（５．５．ＳＣＰＦの生成）本発明は、膜
結合形態および分泌形態の両方のＳＣＰＦに関する。Ｓ
ＣＰＦは７５１およびＭＬ１細胞株により天然に分泌さ
れる。ＳＣＰＦは、継続的な細胞株の馴化培地から単離
され得、そして種々のタンパク質精製手順を用いて均質
になるまで精製され得る。あるいは、ＳＣＰＦは、組換
えＤＮＡ技術により、または化学合成方法により生成さ
れ得る。

【００４７】（５．５．１．ＳＣＰＦの精製）ＳＣＰＦ
は、ＳＣＰＦを分泌する細胞、すなわち、細胞株または
遺伝的に設計した組換え宿主細胞発現系のいずれかの培
養上清から精製され得る。特定の実施態様では、以下の
実施例のように、７５１細胞株の馴化培地が回収され、
ＳＣＰＦはＳＤＳ調製ゲル電気泳動により精製される。
あるいは、７５ｌまたはＭＬ−１細胞ライゼートが、Ｓ
ＣＰＦについての供給源として用いられ得る。ＳＣＰＦ
はまた、抗ＳＣＰＦ抗体を用いて免疫アフィニティー法
により精製され得る。さらに、ＳＣＰＦは等電点電気泳
動法を用いて精製され得る。

【００４８】細胞の粗培養培地からＳＣＰＦを精製する
方法は、クローン化した発現産物の精製のために適合さ
せ得る。さらに、ＳＣＰＦコード化配列が開裂可能な融
合タンパク質をコードするように設計される場合、ＳＣ
ＰＦの精製はアフィニティー精製技術を用いて容易に達
成され得る。例えば、プロテアーゼ因子Ｘａ開裂認識配
列は、ＳＣＰＦのカルボキシル末端とマルトース結合タ
ンパク質との間に設計され得る。得られた融合タンパク
質は、マルトース結合タンパク質が結合するアミロース
を結合させたカラムを用いて容易に精製され得る。次い
で、ＳＣＰＦ融合タンパク質は、マルトース含有緩衝液
を用いてカラムから溶出され、続いて因子Ｘａで処理さ
れる。開裂されたＳＣＰＦは、マルトース結合タンパク
質を除去するために第二のアミロースカラム（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）を通過させることによりさらに精製される。本
発明のこの局面を用いて、任意の開裂部位または酵素開
裂基質は、ＳＣＰＦ配列と精製のために用いられ得た結
合パートナーを有する第二ペプチドまたはタンパク質と
の間に設計され得る。例えば、免疫アフィニティーカラ
ムを調製し得るための任意の抗原。

【００４９】本発明のＳＣＰＦを単離するために用いら
れ得る手順は、タンパク質物質の分離のために一般に用
いられる手順を含み、例えば、タンパク質用の一般的な
沈澱剤を用いるＳＣＰＦ含有サンプルの処理、続いて、
分画技術（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、限外濾過、およびそれ
らの種々の組合せ）を含む。ＳＣＰＦは、例えば、米国
特許第４，８８５，２３６号および第４，８８２，２６
８号に記載の方法により細胞懸濁液から精製され得る。
本発明のポリペプチドの精製の他の方法は、当業者に公
知であり得る（例えば、本明細書に参考として援用され
るＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９２参
照）。

【００５０】ＳＣＰＦ含有画分は、適切な条件下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥに供せられ得、そしてＳＣＰＦ活性を含む
ゲルスライスまたはＳＣＰＦの分子量に相当するゲルス
ライスが回収される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍ
ｌｉら、（Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０， １９７
０）の方法に従って行われる。適切な範囲内の条件の変
化は、精製手順内に含まれると理解されている。

【００５１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのＳＣＰＦ含有画分
は単離され得、そしてさらにＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ
（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５０：４００７，
１９７５）の方法により２次元ゲル電気泳動に供され
得る。第一次元等電点ゲルは、約３．８〜約８．０の間
のｐＩ値を有するタンパク質を分析するために、広範囲
な両性電解質を用いる標準方法により実行される。ｐＨ
２〜１１の両性電解質溶液は、目的のタンパク質のｐ
Ｉに依存して、種々の量で添加される。狭いｐＨでの広
い増大した分析が所望される場合、狭い範囲の両性電解
質は２：１の割合で広範囲な両性電解質に添加され得
る。好ましくは、ＳＣＰＦおよびその対応するイソ型
は、約５〜約９のｐＩ、さらに特には約７〜約８のｐＩ
を有するタンパク質を分離する両性電解質を用いて分析
される。第二次元ゲルは、１０〜２０％アクリルアミド
ゲルとして流すが、しかし、任意の従来のスラブゲルが
用いられ得る。

【００５２】２次元ゲル電気泳動により分解したタンパ
ク質は、クマシーブルー染色および銀染色のような標準
方法により検出され得る。あるいは、ゲル中のタンパク
質は、ブロットトランスファーメンブランに電気泳動的
に移し得、Ｉｎｄｉａインクまたはコロイド状ゴールド
を用いる染色、またはウエスタンブロッティングにより
検出され得る。好ましくは、本発明のＳＣＰＦは、本発
明の抗体を用いてウエスタンブロッティングにより検出
される。

【００５３】ＳＣＰＦ含有画分はまた、逆相ＨＰＬＣに
供され得、そして例えば、アセトニトリルを用いて溶出
され得る。得られたＳＣＰＦは、Ｎ末端アミノ酸配列を
決定するに十分に純粋である。この溶液は、真空下で乾
燥され、少量のアセトニトリル９５％＋ＴＦＡ（０．０
８％）に再度溶解される。次いで、濃縮したサンプル
は、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）分析器に連結
するシークエンサーに導入される。

【００５４】ゲル精製したサイトカイン（例えば、本発
明のＳＣＰＦ）の生物学的活性は、指標細胞株の増殖の
刺激（および／または阻害）についてのバイオアッセイ
でテストされ得る。例えば、ＳＣＰＦ活性は、ＭＬ１、
ＫＧ−１ａ、または部分精製ＣＤ３４⁺骨髄細胞でアッ
セイされ得る。

【００５５】５．５．２ 化学的合成方法 ＳＣＰＦ分子はまた、そのアミノ酸配列を基にして、固
相化学的合成技術により全体的にまたは部分的に生成さ
れ得る。（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３，Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ． ｐｐ．５０−
６０；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ， １９８４，
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第２版，Ｐ
ｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏ．を参照）。このア
プローチは、ＳＣＰＦの１以上の生物学的に活性な領域
に対応するそのセグメントを生成するのに特に有用であ
る。

【００５６】（５．６． 抗ＳＣＰＦ抗体産生）本発明
の範囲の中には、ＳＣＰＦまたはその関連タンパク質を
認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
の産生がある。

【００５７】当該分野で公知の種々の手法が、ＳＣＰＦ
のエピトープに対するポリクローナル抗体の産生に用い
られ得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物がＳＣ
ＰＦタンパク質またはＳＣＰＦペプチドの注射により免
疫化され得、それらにはウサギ、ハムスター、マウス、
ラットなどが含まれるが、これらに限定されない。宿主
の種類に応じて種々のアジュバントを用い、免疫応答を
高め得、それらには、フロイント（完全および不完
全）、鉱物性（ｍｉｎｅｒａｌ）ゲル（例えば水酸化ア
ルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチ
ン）、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐ
ｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油型乳剤、キ
ーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノー
ル、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、
ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒ
ｉｎ））およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａ
ｒｖｕｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【００５８】本発明の特定の実施態様において、ＳＣＰ
Ｆ特異的抗体の生成のため、ゲル精製されたＳＣＰＦを
用いてウサギを免疫化した。そのような抗血清の１つ
（ＳＡＭ．１）には、ＳＣＰＦと特異的に反応し、それ
による自己分泌様式での７５１細胞増殖の刺激の際にそ
の活性が阻害される抗体が含まれることが示された。セ
クション７．２．２（後出）を参照されたい。

【００５９】ＳＣＰＦのエピトープに対するモノクロー
ナル抗体は、培養物中での継続的な細胞株による抗体分
子の産生を提供する任意の技術を用いることにより調製
され得る。これらにはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９
７）により初めて記載されたハイブリドーマ技術、およ
びより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂ
ｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４：７２；Ｃｏｔｅら、１９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０
３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ
ら、１９８５， ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａ
ｌａｎＲ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９
６）が挙げられるが、これらに限定されない。適当な抗
原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子とともにヒト抗
体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる
「キメラ抗体」の産生に開発された技術を用い得る（例
えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，８１：６８５１−
６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４， Ｎａｔ
ｕｒｅ， ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、
１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５
４）。さらに、一本鎖抗体の産生について記載された技
術（米国特許第４，９４６，７７８号）が一本鎖抗体を
産生するために適応される。

【００６０】分子の結合部位を含む抗体フラグメント
は、既知の方法により生成され得る。例えばそのような
フラグメントにはＦ（ａｂ’）₂フラグメント（抗体分
子のペプシン消化により生成され得る）およびＦａｂフ
ラグメント（Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィ
ド架橋を還元することにより生成され得る）が挙げられ
るが、これらに限定されない。

【００６１】ＳＣＰＦに対する抗体は、成熟形態、前駆
体形態、およびサブ成分形態で、膜に結合したＳＣＰＦ
または分泌されたＳＣＰＦの、質的な検出および量的な
検出において、ＳＣＰＦタンパク質のアフィニティー精
製において、ＳＣＰＦ生合成、代謝、および機能の解明
において、ならびに免疫原性エピトープをコードする遺
伝子配列のＳＣＰＦ発現ライブラリーのスクリーニング
において、その使用が見出され得る。ＳＣＰＦに対する
抗体はまた、胚細胞または他の腫瘍の診断および治療剤
としても有用であり得る。

【００６２】（５．７． ＳＣＰＦの使用）ＳＣＰＦの
機能的活性および標的細胞特異性は、インビトロおよび
インビボでの幅広い使用を提供する。成長刺激活性を示
すＳＣＰＦ、またはそのフラグメントおよび誘導体を含
む任意の化合物を、単独で、あるいは他の生物学的に活
性な成長因子、インヒビター、もしくは免疫調整剤とと
もに、本発明の実施および方法において用い得る。ＳＣ
ＰＦ、ＳＣＰＦ関連分子、およびその組成物は、造血幹
細胞を含むがそれに限定されない胚／幹細胞の増殖を増
大させることにおいて特に有用であり得る。

【００６３】造血幹細胞に外因性遺伝子を安定に組み込
むことを達成しようとする最近の試みにおける主な障害
は、既知のサイトカインには、そのような細胞を分化す
ることなく増殖する刺激能力がないということである。
ＳＣＰＦは、精製ＣＤ３４⁺細胞を細胞周期に入るよう
に誘導して、長期培養において増殖させ得ることが示さ
れた（セクション７．２．５．、後出）。鎌状細胞貧血
を含むがそれに限定されない造血疾患の遺伝子治療にお
ける使用のために、ＳＣＰＦを用いて幹細胞の遺伝子操
作を容易にし得る。

【００６４】ＳＣＰＦが自己分泌成長因子であり、また
造血系統の細胞上で働くという発見は、ＳＣＰＦが異な
る組織起源の原始胚／幹細胞に特異的なサイトカインで
あり得るということを意味する。幹細胞集団は脳、肝
臓、および皮膚を含む種々の器官および組織に存在する
ということが示された。さらに、脱毛もまた、毛包を取
り巻く幹細胞の増殖の欠陥に関係する。従って、ＳＣＰ
Ｆは、脱毛を含むがそれに限定されない、幹細胞集団
（その起源組織に関係なく）の成長を必要とする状態を
処置するために有用な物質であり得る。

【００６５】さらに、ＳＣＰＦレセプターを発現する細
胞が、標識したＳＣＰＦまたはＳＣＰＦ関連分子をレセ
プター結合アッセイにおいて用いることにより、あるい
はＳＣＰＦレセプター自体を指向する抗体を用いること
により検出され得る。細胞は、ＳＣＰＦに対するレセプ
ターの存在および密度によって区別され得、それにより
そのような細胞のＳＣＰＦの生物学的活性に対する応答
性を予測し得る。

【００６６】（５．８． 胚細胞由来のサイトカインを
同定する方法）本発明は、種々の胚／幹細胞に関する生
物学的活性を有する成長因子もしくはサイトカインの同
定および単離の新規なアプローチを示す。任意の胚細胞
腫瘍は、手術用材料から入手し得、本発明の実施のため
のインビトロ培養用に調製され得る。この細胞株は、特
定のマーカーの発現もしくは特定の成長因子に対する応
答を基にして選択され得、そして粘着性および非粘着性
の両方の細胞集団が維持され得る。確立された細胞株の
組織系統の特徴付けは、白血球抗原および中間フィラメ
ントを含む種々の細胞表面要素および内部の細胞骨格要
素（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｙｔｏｓｋｅｌｔａｌ ｅｌ
ｅｍｅｎｔ）に対する抗体を用いるフローサイトメトリ
ー分析により決定され得る。さらに、オンコジーン（ｃ
−ｍｙｃ、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−
ｆｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ｅｒｂ、ｃ−ｎｅｕ、ｃ−ｒ
ｏｓ、およびｃ−ｓｉｓを含む）は、分子プローブの使
用により試験され得る。

【００６７】確立された細胞株により産生される新規な
サイトカインを同定するために、細胞は代謝的に標識さ
れそして分泌されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析され得る。あるいは、培養上清は、生物学的アッ
セイにおいて特定のサイトカインに応答することが公知
であるインジケーターとして用いられる種々の細胞タイ
プに作用させる（ａｐｐｌｙ）ことにより直接分析され
得る。主要なタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりおよ
び／または生物学的活性により同定したら、そのタンパ
ク質は、ＳＤＳ−分離用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ゲ
ル、イオン交換クロマトグラフィー、および等電点ゲル
により精製され得る（セクション５．５．１、後出参
照）。タンパク質の純度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認さ
れ、タンパク質アッセイにより定量化され、それらの活
性はバイオアッセイにおいて確認され、そしてポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体の産生のための免
疫原として用いられ得る。

【００６８】精製されたタンパク質はさらに、異なる組
織タイプの種々のインジケーター細胞株の増殖の刺激お
よび／または阻害をバイオアッセイにおいてテストされ
得る。放射性標識されたタンパク質もまた用いられ、ア
フィニティー標識のような方法により、それらの細胞表
面レセプターが同定され得る。サイトカインの生合成経
路の研究、そのタンパク質のアフィニティー精製、およ
びコード化配列の分子クローニングに対する発現ライブ
ラリーの免疫スクリーニングのために、サイトカインに
対する特定の抗体が用いられ、膜形態および分泌形態の
サイトカインが、例えば先に記載したアプローチおよび
技術を用いて、同定および定量され得る。

【００６９】（６．実施例：ＳＣＰＦを産生する７５１
細胞株の生成）以下のセクションは、胚細胞腫瘍株の確
立途上で発見された７５１細胞株を記載する。７５１細
胞株の成長はこれまで記載されなかった１以上の成長因
子によって調節される。

【００７０】（６．１． 材料および方法） （６．１．１． 細胞培養）７５１細胞株を、１０％ウ
シ胎児血清、Ｌ−グルタミン、および抗生物質（ペニシ
リン／ストレプトマイシン）を補充したＲＰＭＩ１６４
０中で維持した。生存率および細胞濃度をトリパンブル
ー排除を用いて評価した。細胞濃度を１×１０⁵細胞／
ｍｌとなるように調整して７５ｃｍの細胞培養フラスコ
に播き、次いで、空気中５％ＣＯ₂の雰囲気下で３７℃
でインキュベートした。

【００７１】（６．１．２． 動物）３重免疫不全（ｔ
ｒｉｐｌｅ−ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）ｂｙ
／ｍｕ／ｘｉｄの雌のマウス（ＢＮＸマウス）をＨａｒ
ｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｉｎｃ．，Ｉ
Ｎより入手し、無菌動物コロニー中に維持した。マウス
には滅菌Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｌｏｘおよび酸性化した水を
無制限に与え、７〜９週齢で実験に用いた。

【００７２】（６．１．３． インビトロ細胞増殖速度
実験（ｋｉｎｅｔｉｃｓ））７５１細胞株のインビトロ
増殖速度実験を以下のように行った。初期の増殖曲線の
研究を行って、開始時の最適な細胞濃度を得た。従っ
て、初期の増殖曲線は、５×１０³、５×１０⁴、および
１×１０⁵細胞／ウェルで行った（ｒｕｎ）。細胞計測
は、１２時間の間隔で７日間行った。全ての細胞数／サ
ンプルは、３組で行った。これらの予備研究は、続く全
ての増殖曲線の最適な細胞数が５×１０ ⁴であることを
明らかにした。次いで、最終濃度（容量２ｍｌ中の）が
５×１０⁴／ウェルとなるように７５１細胞を１２ウェ
ルのプレートに播いた。全ての計測は１２時間の間隔で
７日間行い、そして生存率％も記録した。全ての細胞数
／サンプルを３組で行った。

【００７３】（６．１．４． インビボ細胞増殖速度実
験（ｋｉｎｅｔｉｃｓ））７５１細胞株がＢＮＸマウス
に移植され得る能力をテストした。腫瘍成長の速度を測
定するために、７５１−ＮＡ細胞株のＬｏｇ₁₀連続希釈
物をＢＮＸマウスの後躯の皮下に接種した（．１ｍ
ｌ）。希釈物当たり８匹のマウスを用いた。接種したマ
ウスの腫瘍の出現を１週間に２回検査した。一旦腫瘍が
顕性になると、腫瘍のサイズをカリパスを用いて２日毎
に測定した。腫瘍の測定は、２つの直交する直径を測定
することによって行い、腫瘍の面積はその２つの値を一
緒に乗じることにより推定した。

【００７４】（６．１．５． フローサイトメトリー分
析）７５１細胞もしくはＭＬ−１細胞を、以下の白血球
細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体を用い
てスクリーニングした：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ
５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１９、
ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、
ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ。これらの抗体は、Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， ＣＡにより入手可
能であった。フローサイトメトリー分析を以下のように
行った（Ｇｒｉｅｂｅｌら、１９８８）。７５１腫瘍細
胞を遠心分離し（１，０００ｒｐｍ、１０分間）、そし
て０．２％ゼラチン、１ｍＭアジ化ナトリウム、および
２％正常ウサギ血清を含む０．１Ｍ ＰＢＳ中に２×１
０⁷の濃度で再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液を、９
６ウェル平底マイクロタイタープレート中の５０μｌの
適切なモノクローナル抗体に添加し、４℃で３０分間イ
ンキュベートした。次いで、この細胞を氷冷ＰＢＳ−ゼ
ラチンで３回洗浄し、そしてＦＩＴＣで標識したＦ（ａ
ｂ）’２ヤギ抗マウス免疫グロブリン（重鎖および軽鎖
特異的）（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ， Ｍ
ａｌｖｅｒｎ， ＰＡ）１００μｌ（ＰＢＳ−ゼラチン
で１／７５に希釈されている）と一緒にさらに３０分間
４℃でインキュベートした。全てのサンプルから、２ミ
リミクロンを通す前濾過により細胞凝集体を除去した。
ＦＡＣＳ分析の直前にナイロンモノフィラメントメッシ
ュにかけた（Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｔｓ Ｉｎｃ．， Ｍ
ｉａｍｉ， ＦＬ）。非特異的標識を検出するために、
適切なコントロールを含んだ。これらのコントロールに
おいて、骨髄は、ＦＩＴＣで標識したＦ（ａｂ）’２単
独または無関係な抗原に特異的なモノクローナル抗体と
マッチしたイソタイプとのいずれかと反応した。ＦＩＴ
Ｃで標識した７５１腫瘍細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ Ｆａｃ−Ｓｃａｎフローサイトメーター
を用いて分析した。２０，０００細胞からのデータを集
めてモノクローナル抗体の反応性のパターンを分析し
た。フォワードアングル光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ａｎ
ｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ）（ＦＡＬＳ）対
９０％光散乱（ＬＩ９０）の２パラメーター分析を用い
てＦＡＬＳ対蛍光のブロットを排除し、蛍光対細胞数の
ヒストグラムとした。データはまた、所定の表現型マー
カーに対してポジティブであった細胞の％として得た。

【００７５】種々の抗原に対する抗体は、販売元から購
入した：抗サイトケラチン、抗ＮＦ２００、抗ＮＦ１６
０、抗ＮＦ６８（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）；抗ビメンチン（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）；抗ＧＦＡＰおよび抗ＮＳＥ（Ｄａｋｏｐａ
ｔｔｓ， Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）。Ｆ
ＩＴＣ結合二次抗体試薬は、Ｓｉｇｍａから購入した。

【００７６】（６．２ 結果） （６．２．１． 病歴）１９８９年に、１９才の白人女
性が彼女のかかりつけの医師に頭痛および複視を訴え
た。彼女はＣＴスキャンにより大きな鞍上塊を有してい
ると診断された。この塊を外科的に小さくして腹膜腔脳
室内（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ（Ｖ
Ｐ））シャントをその場所に入れた。術後の局所的放射
線照射により総用量５０００ｃＧｙが投与された。彼女
が１年後に再び頭痛を訴えるまで、残った腫瘍をコント
ロールしながら見かけ上健康であった。彼女はまたＶＰ
シャントに沿って多数の皮下の塊を見出された。身体検
査は彼女の頭蓋骨の右側のＶＰシャントの近くに１つ、
およびシャントのチューブに沿って胸郭（ｃｈｅｓｔｗ
ａｌｌ）上に２つの塊があることを明らかにした。彼女
の頭部のＣＴスキャンは、シャントの近くに局所的な再
発および軟組織塊があることを明らかにした。さらに、
彼女の腹部には転移した沈着物が見出された。この頭蓋
骨上の病巣を吸引した；この領域からの細胞の細胞の性
質（ｃｙｔｏｌｏｇｙ）は、胚細胞腫瘍と一致してい
た。１９９０年２月、さらに組織の性質（ｈｉｓｔｏｌ
ｏｇｙ）を定義するために、胸郭の塊の１つを切除し
た。腫瘍の組織学的検査は、非胚細胞腫（ｎｏｎ−ｇｅ
ｒｍｉｎｏｍａｔｏｕｓ）混合胚細胞腫瘍が小さな原始
細胞の顕著な集団を有し、１９８９年に行われた始めの
バイオプシーと類似していることを明らかにした。

【００７７】（６．２．２． ７５１細胞株の起源）１
９９０年２月の手術の時に、小部分の胸郭の腫瘍を、細
胞単離および細胞培養中でのインビトロ増殖のために、
研究所へ送付した。腫瘍は約３ｍｍの部分に分かれてい
た。細切した腫瘍をベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）−トリ
プシンを用いて３７℃で１０分間制限消化した。酵素処
理の後、未消化の組織を沈降によって除去し、上清の流
体を集め、遠心分離し、そして細胞ペレットを回収し
た。細胞ペレットを再懸濁し成長培地で培養した。

【００７８】一次培養物を毎日試験し、培地を週毎に交
換した。元の細胞培養物は、プラスチック皿に粘着細胞
および非粘着細胞のどちらも含んでいた。次の２カ月間
にわたり、形態的に異なる細胞タイプの数は、共培養物
として複製している２つの明確な集団のみが現れる時点
まで減衰した。一つは粘着細胞として成長し、もう一つ
は非粘着細胞として成長していた。この胚細胞株を培養
して約１６週経ったとき、非粘着細胞は粘着集団より成
長しており、限界希釈によってクローン化されて主な細
胞タイプとなり、７５１−ＮＡと名付けられた。驚くべ
きことに、７５１−ＮＡは、核型分析および種々の細胞
酵素のネズミイソ型の発現により決定されたとおりネズ
ミ細胞株であることが見出された。７５１−ＮＡは、前
述の成長培地を用いて多重細胞集団継代（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ−ｃｅｌｌ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐａｓｓａｇ
ｅ）によりインビトロ培養で、安定な形態で維持され
た。７５１−ＮＡ細胞株からネズミ腫瘍モデルを発生さ
せるために、細胞をベージュ色でヌードなｘ−染色体性
免疫不全（ＢＮＸ）マウスの皮下組織に注入し、（組織
学的外見は元の患者の腫瘍と類似している）胚細胞腫瘍
を発生させた。ＢＮＸマウス由来の皮下部位の腫瘍は無
菌的に除去され、ベルゼントリプシン処理されて（前
出）、新規な非粘着細胞株がインビトロ培養において再
確立された；７５１−ＭＵと名付けられた。肝臓および
リンパ節ドレナージ中の転移した沈着物からさらに２つ
の細胞株を確立し、それぞれ７５１−ＬＩＶおよび７５
１−ＬＮと名付けた。

【００７９】（６．２．３． ７５１細胞株の特徴付
け）確立された７５１細胞株の特徴付けは、増殖速度お
よび表現型の両方を試験した。インビトロでの増殖は、
増殖曲線分析を用いて試験し、遅滞期をほとんど有さな
いか全く有さないユニークな増殖パターンを示したが、
生存率は始めに対数増殖し、短い定常期に続いて劇的に
減少した。成長の速さは７〜８時間の対数期の間の倍加
時間を計算することにより示す。

【００８０】インビボの細胞株の増殖を、ＢＮＸネズミ
モデルを用いて評価した。マウスに注入された場合の細
胞の増殖速度を測定するために、種々の７５１細胞株の
連続的な対数希釈物を、後躯の皮下組織に接種した。マ
ウスを１週間に２回検査し、そして腫瘍の２つの直交す
る直径を測定した。接種物からは、接種後２０日で顕性
の１００細胞くらいの腫瘍が生じたことが見出された。
報告されたほとんどのネズミの腫瘍モデルで見出された
ように、１×１０³細胞の接種により、２〜３ヶ月では
なくむしろたった７日間で腫瘍が生じた。さらに、報告
されたほとんどの腫瘍は５×１０⁵細胞より少ない接種
物では成長しない。

【００８１】この細胞集団（７５１−ＮＡ、７５１−Ｌ
ＩＶ、７５１−ＬＮ）の起源を決定するために、神経外
胚葉胚細胞、ニューロン系統、およびグリア細胞系統に
特異な細胞決定基に対するポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体の両方を用いて、細胞をフローサイト
メトリーにより分析した。以下の抗体を用いて、この研
究を完遂した：胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＰ）
およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＸＣＧ）をマーカー
として用いて、非ニューロン細胞の胚細胞を検出した；
サイトケラチン（抗ヒトまたは抗ラット）およびビメン
チン（抗ヒト）を神経外胚葉起源の胚細胞のマーカーと
して用いた；グリア線維酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ
Ｆｉｂｒａｌｌｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｇ
ＦＡＰ）をグリア系統のマーカーとした；および神経特
異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ならびに神経フィラメント
タンパク質（ＮＦＰ）−６８，１５０および２００をニ
ューロン系統の細胞のマーカーとした。結果は、細胞集
団（７５１−ＮＡ、７５１−ＭＵ、７５１−ＬＮ）が、
適切な条件下で、ニューロン系統またはグリア系統のい
ずれかの細胞を形成し得る原始脳胚細胞であることを示
した（図１参照）。

【００８２】７５１細胞のさらなるフローサイトメトリ
ー表現型決定は、以下に対応する抗体によるポジティブ
な蛍光細胞の以下の平均％（括弧内）を示した：抗ラッ
トサイトケラチン８（０．８６）；抗ラットサイトケラ
チン１９（０．４０）；抗ヒトビメンチン（１．２
９）；マウス抗ヒトモノクローナルＮＦ−６８（３３．
１６）；ウサギ抗ヒトポリクローナルＮＦ−１５０（６
４．５４）；マウス抗ヒトモノクローナルＮＦ１６０
（８．５０）；マウス抗ヒトモノクローナルＮＦ−２０
０（６１．１３）；ＨＰＡＰ（５６．２８）；ウサギ抗
ヒトポリクローナルＧＦＡＰ（６７．６９）；ウサギ抗
ヒトポリクローナルＮＳＥ（７８．３４）；およびヤギ
抗ヒトＨＣＧ（５０．０４）。

【００８３】最初の研究は、７５１細胞株がＨＰＣＡ−
１（ＣＤ−３４）を含む任意の公知のヒト白血球マーカ
ーを発現するかどうかを確かめるために設計された。Ｃ
Ｄ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ
８、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、Ｃ
Ｄ７１、およびＣＤ３４の発現に関する７５１細胞株の
ＦＡＣＳ分析は、この原始細胞株がＣＤ３４マーカーを
含む全ての白血球マーカーが全くないことを示した。し
かし、続く核型分析は、７５１細胞がネズミであること
を明らかにした。従って、７５１細胞によって産生され
るＳＣＰＦは、起源がネズミであることが予想される。
驚くべきことに、「ネズミ」ＳＣＰＦは、ヒト標的細胞
に対して生物学的活性を有する。

【００８４】（６．２．４． ７５１細胞株によるオン
コジーン発現）細胞の悪性の表現型の発現におけるプロ
トオンコジーンの役割（インビトロおよびインビボの両
方）を、多くの細胞培養系において調査した。多くの異
なるオンコジーンに対するＤＮＡプローブを用いて、ノ
ーザン分析を行った。これらの分析は、７５１細胞がオ
ンコジーンｃ−ｍｙｃならびにオンコジーンレセプター
ｃ−ｆｍｓのｍＲＮＡを十分に含んでいることを示し
た。これは、特に重要である。なぜなら、ｃ−ｆｍｓオ
ンコジーンはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−
ＣＳＦ）のレセプターとして供されるからである。Ｍ−
ＣＳＦレセプターは、脳内の小グリア細胞（ｍｉｃｒｏ
ｇｌｉａ）に関しては記載されているが、神経起源の原
始細胞におけるその存在は未だに報告されていない。し
かし、Ｍ−ＣＳＦレセプターは、骨髄内の前駆細胞上に
見出され、そして単球／マクロファージ細胞の系統特異
的分化に関与する成長因子の一つである。このレセプタ
ーの発現は、原始胚細胞の増殖および分化におけるＭ−
ＣＳＦの役割を示す。

【００８５】（７．実施例：７５１細胞株に由来する幹
細胞増殖因子）以下に記載する実験は、ＳＣＰＦが分泌
される場合には３２ｋＤａであり、そして細胞に結合す
る場合には３７ｋＤａであることを示す。精製したタン
パク質の２次元ゲル電気泳動は、ＰＩが約７．０〜８．
０の範囲のタンパク質の複数のイソ型の存在を示す。

【００８６】（７．１． 材料および方法） （７．１．１． 放射性標識およびポリアクリルアミド
ゲル電気泳動）７５１細胞株を、３０ｍｌの培養フラス
コ中で、１０⁶細胞／ｍ．の密度になるまで、１０％ウ
シ胎児血清および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマ
イシン）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地
（ＤＭＥＭ）中で成長させた。一旦必要な密度が達成さ
れたら、細胞を成長培地がなくなるように洗浄し、そし
てメチオニンを含まない７５％ＤＭＥＭにメチオニンお
よび２％の［³⁵Ｓ］−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，
ＩＬ）を含む２５％ＤＭＥＭを補充して再培養し、そ
して再インキュベートした。２４時間間隔で、上清を採
取し、非粘着細胞を除くように成形し、そして−２０℃
で保存した。次いで、この³⁵Ｓで標識された上清をサン
プル緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２−メルカプトエタノ
ール、１０％グリセロール、２％ ＳＤＳ、および０．
００１％ブロモフェノールブルー）に添加し、そして１
００℃で５分間加熱した。次いで、このサンプルをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥに適用して先に記載したように電気泳動し
た。電気泳動後、ゲルをＴＣＡ（１０％、ｗ／ｖ）；氷
酢酸（１０％、ｖ／ｖ）およびメタノール（３０％、ｖ
／ｖ）中で固定した。固定後、ゲルをＦｌｕｏｒｏ−ｈ
ａｎｃｅ^TM（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉ
ｎｃ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔ ＩＬ）にさらに３０分間浸
漬した。ゲルを取り出して、ファイバー紙（予め湿潤さ
せた）上に置き、そして真空下で加熱しながら（６０
℃）乾燥させた。乾燥後、このゲルを高速Ｘ線フィール
ド（ｆｉｅｌｄ）（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ｏｍａｔ ＡＲ）
に曝し、−７０℃で２４〜４８時間保持し、その後オー
トラジオグラフを現像して分析した。

【００８７】７５１細胞株の細胞ライゼート、精製タン
パク質、および上清を、電気泳動用緩衝液で溶解し、Ｌ
ａｅｍｍｅｌｉ（１９７０）の不連続緩衝液システムを
用いて１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。他に言及しない限り、電気泳動は変性条件下で行っ
た。各実験において、分子量マーカー（Ｂｉｏ Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を同時に泳動し、そして
クマシーブルーで染色することにより可視化した。

【００８８】（７．１．２． ＳＣＰＦのゲル精製）無
血清上清を、培養４８時間後の７５１−ＮＡ細胞から採
取した。上清をＳａｖａｎｔ濃縮を用いて２０倍に濃縮
し、次いで透析した。次いで、濃縮されたサンプルを１
２％の分離ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳゲル電気
泳動の後、このゲルを０．３Ｍ ＣｕＣＩ₂によるネガ
ティブ染色を行った。目的のタンパク質のバンドをゲル
から取り出し、小断片に切って２００μｌの溶出緩衝液
（ｇ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−グリシン、ｐＨ８．３）と一
緒に透析バッグ（１２−１４，０００分子量区分）に入
れた。次いで、このサンプルを１００Ｖ、４℃で１８時
間電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅｄ）した。電
気溶出後、電流を３０〜４０秒間逆流させて透析バッグ
を取り出し、サンプルを採取して一晩透析した。全ての
水簸（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）調製物を、免疫原とし
て用いる前にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度に関して検査
するか、または細胞増殖アッセイにおける使用に関して
検査した。

【００８９】（７．１．３． 抗ＳＣＰＦ抗体の調製
物）ニュージーランドシロウサギを免疫前に採血し、そ
して免疫前血清を用いて基線を確立した。ウサギをＲｉ
ｂｉアジュバントを含む７５１細胞株由来の７μｇの精
製ＳＣＰＦポリペプチドで皮下に免疫化した。最初の注
射の２週間後に、ウサギにポリペプチドおよびＲｉｂｉ
アジュバントを含む第２回目の注射を行った。ウサギは
免疫原およびＲｉｂｉアジュバントにより最低５回の皮
下接種を受けた。ウサギを各接種時点で採血し、そして
その血清を、３２ｋＤａのタンパク質に反応性である抗
体の存在についてウエスタンブロットにより試験した。
３２ｋＤａのタンパク質に特異的な抗体を高濃度に含む
全血清をアリコートし、そして−７０℃で保存した。

【００９０】（７．１．４． ウエスタン免疫ブロッテ
ィング）７５１−ＮＡ腫瘍細胞株の細胞ライゼートを電
気泳動緩衝液中に調製し、そしてタンパク質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｌａｅｍｍｅｌｉ，
１９７０）を用いて分離した。ゲル中に存在するタンパ
ク質を、Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９によって記載された
技術に基づいて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ
Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ａｐｐａｒａｔｕｓを用いて、ニ
トロセルロースに移した。このゲルをエレクトロブロッ
ト緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシ
ン、および５％ｖ／ｖメタノール、ｐＨ８．３）で平衡
化した。ニトロセルロールメンブランもまたこの緩衝液
で平衡化した。平衡化した後、ニトロセルロースメンブ
ランをプラチナ陽極上の濾紙の上に置き、次いでゲルを
一番上に置いて次に予め浸漬した濾紙を置いた。陰極を
配置した後、サンプルを２５ボルトで３５〜４０分間ブ
ロット／電気泳動した。移動後、メンブラン／ブロット
を、ゼラチンおよびＴｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝
化生理食塩水（ＰＢＳ−ｇｅｌ−ｔｗｅｅｎ）で４回洗
浄した。このブロットを、予めＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希
釈したウサギポリクローナル抗体と共に一晩インキュベ
ートした。インキュベーションの後、このブロットをＰ
ＢＳ−Ｇｅｌ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いでペルオ
キシダーゼで標識したヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と一緒に１時間インキュ
ベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、
その後ＰＢＳのみで２回洗浄した。基質（０．０５％
（ｗ／ｖ）４−クロロ−１−ナフトールおよび３０％Ｈ
₂Ｏ₂）を添加しそしてブロットを暗所で室温で６０分間
インキュベートした。ポジティブな反応は暗青色のバン
ドの出現により示された。

【００９１】（７．１．５． クロノジェニックアッセ
イ）７５１腫瘍株は、１０％ＦＢＳを補充したメチルセ
ルロース含有ＤＭＥＭ中でコロニー（１２８細胞／コロ
ニーより多い）を形成し得る。１０³細胞を１．０ｍｌ
のメチルセルロースに添加し、これにさらに３２ｋＤａ
タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体の種々の
希釈物を１００μｌの容量で添加した。このサンプルを
十分混合して、２０ｍｍペトリ皿に播き、そして空気中
５％ＣＯ₂雰囲気下で３７℃でインキュベート（ｉｎｏ
ｃｕｌａｔｅｄ）した。培養４８時間後に、倒立光学顕
微鏡でコロニーの数を計数した。

【００９２】種々のコロニー刺激因子に特異的な抗体を
Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。

【００９３】（７．１．６． 長期培養物（Ｇｏｒｄｏ
ｎ型培養物））ヒト造血幹細胞を長期インビトロ培養で
増殖させるために、可溶性因子および細胞接触依存性因
子を提供するために粘着細胞集団が必要とされる。ヒト
骨髄吸引物（ｍａｒｒｏｗ ａｓｐｉｒａｔｅ）を保存
料を含まないヘパリンを含む培地中に回収し、そして２
５ｃｍ²組織培養フラスコ中の長期培養培地に希釈して
最終容量８ｍｌ（２×１０⁷の有核細胞を含む）となる
ようにした（Ｇｏｒｄｏｎら、１９８７、Ｅｘｐ．Ｈｅ
ｍａｔｏｌ． １５：７７２）。成長培地は、イノシト
ール（４０ｍｇ／ｍｌ）、葉酸（１０ｍｇ／ｍｌ）、ヒ
ドロコルチゾン（１０^-6Ｍ）、２−メルカプトエタノー
ル（２×１０^-4Ｍ）、およびウマ血清とＦＢＳとを１：
１で混合して最終血清濃度が２５％となるようにしたも
のを補充したα−ＭＥＭから構成されている。付着を容
易にするために、培養物を３７℃で置いた。４日後、こ
の培地および非粘着細胞を回収し、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙ
ｐａｑｕｅで遠心分離して顆粒球および赤血球を除き、
そして低い密度の画分を培養フラスコに戻した。その
後、集密的粘着細胞単層が形成されるまで、成長培地の
半分および非粘着細胞を１週間毎に新鮮な培地と交換し
た。

【００９４】培地および非粘着細胞を長期培養物から取
り出し、そして２ｍｌの新鮮な培地を添加した。次い
で、このフラスコに２０００ラドで放射線照射して粘着
層内に存在する造血細胞を除去した。放射線照射後、こ
の培地を取り出し、精製した細胞集団を含む８ｍｌの新
鮮な培地と交換して、それらが培養物中で骨髄造血を再
構成して開始するかどうかを決定した。コントロールと
して、いくつかの長期培養物を培地のみで再構成し、放
射線照射が全ての造血前駆体を排除するのに十分である
ことを示した（ネガティブコントロール）。さらに、い
くつかの長期培養物を正常骨髄細胞で再構成した（ポジ
ティブコントロール）。再構成に続いて、培地の半分お
よび非粘着細胞を毎週採取し、計数して、成長因子を含
むメチルセルロース培養物中に播いた。さらに、特定の
時点で、培養フラスコを犠牲にして、粘着細胞をトリプ
シン処理し、造血コロニーアッセイのために単一細胞懸
濁物を得た。

【００９５】（７．１．７． インビトロ前駆細胞アッ
セイ）以下のアッセイは、細胞のＣＦＵ活性の測定に用
いた標準プロトコルであった。

【００９６】コロニー形成前単位（Ｐｒｅ−ＣＦＵ）ア
ッセイを設計してヒト骨髄の初期造血前駆体を検出した
（Ｓｍｉｔｈら、１９９１、Ｂｌｏｏｄ、７７：２１２
２）。単離された細胞をｒＩＬ−１α（１００Ｕ／ｍ
ｌ）およびｒＩＬ−３（５０ｎｇ／ＭＬ）と一緒にイン
キュベートし、培養７日後に採取し計数した。１×１０
⁵細胞は、０．３６％アガロース中の１０００Ｕ／ｍｌ
の組換えＧＭ−ＣＳＦとともに播かれ、コロニー（＞５
０細胞）を、インキュベーション後１４日間計数した。

【００９７】骨髄単球／赤血球前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＥ
ＭＭ）および赤血球系の前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）を検出
するために、組み合わせたＣＦＵ−ＧＥＭＭ／ＢＦＵ−
Ｅアッセイを用いた（Ａｓｈら、１９８１、Ｂｌｏｏｄ
５８：３０９）。簡潔に述べると、１×１０⁵の精製
幹細胞を、直径３５ｍｍのプレートに、５×１０⁵ Ｍ２
−メルカプトエタノール、３０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／
ｍｌのヒトｒＩＬ−３および１．０Ｕ／ｍｌのＥｐｏお
よび０．９％メチルセルロースを補充した総容量１．０
ｍｌのＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中に播い
た。培養物を、空気中に５％ＣＯ₂および１０％Ｏ₂を含
む湿潤雰囲気下で１４日間３７℃でインキュベートし
た。コロニー（＞５０細胞）を倒立顕微鏡を用いて計数
した。

【００９８】ＣＦＵ−ＧＭの代表である初期造血前駆体
もまた検出された（Ｉｓｃｏｖｅら、１９７１、Ｂｌｏ
ｏｄ ３７：１）。簡潔に述べると、１×１０⁵精製幹
細胞を、２％ ＦＢＳ、０．６％Ｌ−グルタミン、０．
９％メチルセルロース、および１００Ｕ／ｍｌのヒト組
換えｒＩＬ−３を補充したα−ＭＥＭ総容量１．０ｍｌ
で直径３５ｍｍのペトリ皿に播いた。培養物をＣＦＵ−
ＧＥＭＭアッセイに関して記載したようにインキュベー
トし、そして倒立顕微鏡を用いてコロニーを計数した。

【００９９】（７．２． 結果） （７．２．１． ＳＣＰＦの生物化学的同定）７５１細
胞株によって分泌されるタンパク質を可視化するため
に、パルスチェイス実験を［³⁵Ｓ］−メチオニンを用い
て行った。細胞をメチオニンを含まない培地中で１２時
間標識し、その後細胞をメチオニンを含む非放射性の成
長培地に置いた。次いで、³⁵Ｓで標識した上清をＳＤＳ
−ＰＡＧＥにかけた。１つの主要なタンパク質は７５１
腫瘍細胞から分泌されることが見出され、計算された見
かけの分子量（回帰分析による）は３２ｋＤａであるこ
とを示した。さらに、このタンパク質の最大分泌は培養
後２４〜３６時間で起こることが見出された（図２）。

【０１００】このタンパク質の単離は、分泌されたポリ
ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、分子量マ
ーカーと比較した移動度によって３２ｋＤａのポリペプ
チドを同定することにより達成した。一旦同定すると、
タンパク質をエレクトロブロットによりニトロセルロー
スに移し、そして３２ｋＤａタンパク質に相当する領域
を切り出してジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で溶
解した。これを生成されるポリクローナル抗体の生成の
ためにウサギに接種した。

【０１０１】抗体の特異性は、ウエスタン免疫ブロット
技術を用いて、７５１−ＬＮの全細胞ライゼートに対し
てテストした。この系では、タンパク質をＢｉｏ−Ｒａ
ｄｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｐｐａｒａ
ｔｕｓを用いてニトロセルロースに移し、次いで、改変
した比色定量ＥＬＩＳＡに供した。ポジティブバンド反
応は、暗青色バンドの出現により示された。これらのア
ッセイは、見かけの分子量が３７ｋＤａ（回帰分析によ
り計測）の単一のタンパク質と特異的に反応するポリク
ローナル抗体を示した（図３）。このことは、分泌され
たタンパク質の分子量（３２ｋＤａ）に関連して次のこ
とを示唆する：（１）シグナル配列は分泌されたタンパ
ク質を細胞表面に輸送するために存在する；（２）分子
に対するトランスメンブラン成分は、タンパク質を膜に
固定（ａｎｃｈｏｒ）する；および（３）このタンパク
質には２つの形態が存在し、１つは膜結合種（３７ｋＤ
ａ）であり、他方は分子量が３２ｋＤａの可溶性細胞外
種である。両形態は、正常な胚細胞発生の間に、細胞−
細胞相互作用に追加的に関与する膜結合形態をとりなが
ら「成長因子」として作用し得る。

【０１０２】（７．２．２． ＳＣＰＦによる胚細胞腫
瘍株の自己分泌成長調節）細胞株７５１によって産生さ
れた３２ｋＤａタンパク質に対して誘導されたポリクロ
ーナル抗体を用いて、メチルセルロース中でコロニー阻
害アッセイを行った。先の実験で、７５１細胞がメチル
セルロース中で４８時間以内に５０細胞より多いコロニ
ーを形成することを示した。もし３２ｋＤａのタンパク
質が、腫瘍細胞の成長を調節する自己分泌因子なら、タ
ンパク質がその細胞レセプターに結合することをブロッ
クすることにより細胞の複製およびコロニーの成長が減
少するはずである。ウサギポリクローナル抗３２ｋＤａ
抗体の連続希釈を用いて、７５１−ＮＡ、７５１−Ｍ
Ｕ、および７５１−ＬＮ腫瘍細胞を種々の血清希釈物を
含むメチルセルロース中に混合して、３７℃で４８時間
インキュベートし、次いで新しく形成されたコロニーを
計数した。１／２０の逆希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ
ｄｉｌｕｔｉｏｎ）のとき、抗体はコロニー形成を９８
％阻害した。この阻害は、抗体濃度依存性を示し、著し
い阻害（＞２５％）は１／１２０の血清希釈で生じた。
１／２０希釈の正常ウサギ血清は、コロニー形成をブロ
ックしなかった（図４）。さらに、抗３７ｋＤａ抗体が
細胞増殖をブロックする能力を³Ｈチミジン取り込みア
ッセイにおいてテストした（図５）。この図は、抗体が
実際に細胞増殖を阻害すること、ならびに７５１−Ｍｕ
ＭｅｔおよびＢｏ Ｂｍ．１細胞のみが阻害されたの
で、この阻害が胚／幹細胞に対して特異的であることを
示す。Ａ２５１神経芽細胞腫細胞株は阻害されなかっ
た。

【０１０３】（７．２．３． ＳＣＰＦとヒト骨髄細胞
集団との相互作用）以下に記載した実験結果は、抗ＳＣ
ＰＦ抗体（ＳＡＭ．１）が骨髄細胞の小集団と特異的に
相互作用していること、さらに、この集団がＣＤ３４⁺
の区分に入るようであることを示す。最終的には、抗Ｓ
ＣＰＦはＣＤ３４タンパク質とは異なるマーカーを認識
し、そして幹細胞集団の概要説明に重要であり得る。

【０１０４】７５１細胞の原始的性質により、およびそ
れが自己分泌成長因子（ＳＣＰＦ）により調節されるよ
うなので、以下の実験は、精製された天然のタンパク質
が骨髄細胞と相互作用するかどうかを決定するために設
計された。この相互作用は（１）骨髄−メチルセルロー
スクロノジェニックアッセイ；（２）³Ｈ−チミジン取
り込みアッセイ；および（３）フローサイトメトリーを
用いて分析した。図３は、クマシーブルーで染色したＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびこれらのアッセイに用いた精
製された天然の３７ｋＤａタンパク質のＳＡＭ．１ポリ
クローナル抗体を用いたウエスタンブロットを示す。３
７ｋＤａに移動した単一のバンドがゲル上に存在した
（図３Ａ）。ＳＡＭ．１抗体と反応させた場合のこのゲ
ルのニトロセルロースブロットは、同じ位置のバンドを
明らかにした（図３Ｂ）。精製したＳＣＰＦを種々の濃
度でクロノジェニックアッセイに用いた場合（表１）、
はっきりとした形態のコロニーは観察されなかった。

【０１０５】

【表１】 しかし、これらのアッセイにおいて、非常に散開したク
ラスター内の芽様細胞（ｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌ
ｌ）が観察された。これらの芽様細胞をクロノジェニッ
クアッセイから取り出し、間質供給層（ｓｔｒｏｍａｌ
ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒ）ありまたはなしで懸濁培養
内に入れ、ＳＣＰＦを用いて増殖させた。間質供給層な
しの懸濁物を、培養後９６時間で採取し、モノクローナ
ル抗体ＨＰＣＡ−１（抗ＣＤ３４）を用いるフローサイ
トメトリー分析を行った。イソ型のコントロールをネガ
ティブコントロールとして用い、Ｗ６／３２（抗ヒトＨ
ＬＡクラス１）モノクローナルをポジティブコントロー
ルとした。図６は、これらの細胞のフローサイトメトリ
ー分析である。全ての細胞は、Ｗ６／３２抗ＨＬＡクラ
スＩで染色され、さらに、高い％の細胞が抗ＣＤ３４と
も反応した。そのことは、必ずしも全ての細胞がＣＤ３
４⁺ではないことを明らかにした。これは、（１）懸濁
培養での増殖の前に、クロノジェニックアッセイから非
ＣＤ３４⁺細胞が除去されること、または（２）懸濁培
養中に細胞が分化することに起因し得る。しかし、これ
は、ＳＣＰＦタンパク質がＣＤ３４⁺表現型の細胞と相
互作用することを示す。間質供給層を有する長期培養に
入れた細胞（図７）を、Ｇｏｒｄｏｎ培養条件下での継
続的な増殖について分析した。

【０１０６】図７は、これらの細胞がＳＣＰＦ非存在下
で長期Ｇｏｒｄｏｎ培養中で増殖したことを示す。間質
細胞は、良好な増殖および生存を維持するために、可溶
性因子にも細胞−細胞接触にも重要であるようである。
間質馴化培地に与えられた細胞は増殖も生存もしなかっ
た。細胞を７２時間目にＧｏｒｄｏｎ培養から取り出
し、そして組換えＧＭ−ＣＳＦ存在下での複製効率をテ
ストした（表２）。

【０１０７】

【表２】 コロニーアッセイにおいて誘導させ、次いで、Ｇｏｒｄ
ｏｎ培養中で増殖させた細胞は、ＧＭ−ＣＳＦに応答し
得、そして顆粒球（Ｇ）、単球（Ｍ）、および混合ＧＭ
細胞のコロニーを形成し得た。従って、そのことは、そ
れらが系統分化を受けて骨髄細胞になる能力を示す。³
Ｈチミジン取り込みによって測定されたように、骨髄細
胞の増殖もまたＳＣＰＦが骨髄起源の細胞を増殖へ誘導
することを示した（図８）。

【０１０８】先の実験から、ＳＣＰＦが骨髄細胞集団と
相互作用することは明らかである。ポリクローナルウサ
ギ抗体（ＳＡＭ．１）が、細胞株７５１由来のＳＣＰＦ
に対して産生され、そしてそのＳＣＰＦが細胞に結合し
たので、骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を行っ
て、ＳＣＰＦと相互作用する骨髄中の細胞の表現型の性
質を確かめた。ＳＡＭ．１がヒト骨髄細胞を認識する能
力を、粘着力が涸渇したヒト骨髄細胞およびヒトの臍帯
血の両方を新規な造血幹細胞の供給源として用いてテス
トした。図９は、ＳＡＭ．１が骨髄中の細胞の非常に少
ない集団（２．５％）および臍帯血中の非常に少ない細
胞集団（１．９６％）に結合することを示す。この集団
を明確にする試みにおいて、二色ＦＡＣＳ分析を、抗Ｃ
Ｄ３４フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体およびＳＡ
Ｍ．１蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）システムを
用いて行った（図１０）。これらの実験および７５１細
胞がＣＤ３４を発現せず、その結果、ＳＡＭ．１がＣＤ
３４マーカー自身を指向しないという先の所見から、Ｓ
ＡＭ．１は、ＣＤ３４マーカーおよびＳＣＰＦの両方を
同時に発現する細胞集団を認識することが明らかであ
る。

【０１０９】ＣＤ３４⁺およびＳＣＰＦ⁺である細胞集団
は、試験した全細胞集団の１．６５％を示す（図１
０）。ＳＡＭ．１がネズミ、ウシ、およびヒツジの骨髄
中の細胞集団を認識する能力もまたフローサイトメトリ
ーにより試験した。全ての場合において、ＳＡＭ．１
は、これらの非ヒト種の骨髄由来の任意の有意な細胞集
団を認識しなかった。

【０１１０】フローサイトメトリー研究を、抗ＳＣＰＦ
抗体を用いて精製ＣＤ３４⁺細胞に関して行った。ＣＤ
３４⁺集団を、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体とカップ
リングさせた免疫磁気ビーズを用いて正常ヒト骨髄から
分離し、フローサイトメトリーに用いるまで液体窒素で
保存した（Ｋｅｓｓｌｅｒら、１９８７、Ｂｌｏｏｄ７
０：３２１）。単色分析および二色分析のどちらに関し
ても、ＳＡＭ．１はＣＤ３４選択集団を認識した（図１
１）。さらに、ＳＡＭ．１と抗ＣＤ３４との間には競合
はない（図１２）。これらの実験において、ＣＤ３４⁺
細胞はＳＡＭ．１のみまたはＳＡＭ．１／抗ＣＤ３４の
混合物とともにインキュベートした。図１２から観察し
得るように、抗ＣＤ３４は、ＳＡＭ．１がこれらの細胞
に結合する能力に干渉しなかった。これらの実験を、Ｃ
Ｄ３４⁺細胞を抗ＣＤ３４単独またはＳＡＭ．１／抗Ｃ
Ｄ３４の混合物とともにインキュベートすること以外は
反復した。図１２Ａに示すように、ＳＡＭ．１は、抗Ｃ
Ｄ３４抗体の結合に干渉しなかった。このことは、ＳＡ
Ｍ．１抗体が異なる細胞表面抗原を認識することをさら
に示す。

【０１１１】（７．２．４． ７５１細胞由来のＳＣＰ
Ｆを用いるＣＤ３４⁺細胞の長期培養）ＣＤ３４⁺細胞の
長期培養は、外因的に添加した精製天然ＳＣＰＦの存在
下で開始した。外因的に添加した成長因子がないコント
ロール培養、ならびに１００Ｕ／ｍｌのインターロイキ
ン３（ＩＬ−３）および１００Ｕ／ｍｌのインターロイ
キン６（ＩＬ−６）を有する培養を含んだ。精製ＣＤ３
４⁺細胞を２００，０００細胞／ｍｌで２４ウェルプレ
ートのウェルに播き、適切な成長因子を添加した。種々
の濃度の精製ＳＣＰＦ（１μｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍ
ｌ）を添加した。３日毎に、培養培地を交換し、外因性
の成長因子を添加した。全ての培養を毎日試験して細胞
の生存および状態を評価した。

【０１１２】これらの研究の結果を図１３にまとめた。
ＩＬ−３またはＩＬ−６を与えた培養物は、非生存細胞
がほとんど存在せずに急速に増殖した。７日目までに培
養物は継代を必要とした。一方、ＳＣＰＦ処理した培養
物は、急速に細胞生存率が減少し、その結果、７日目ま
でにわずか１０〜１５％の細胞が生存するのみであっ
た。しかし、この残ったＣＤ３４⁺細胞集団は今やＳＣ
ＰＦ応答性であり、１２週間にわたって培養物中で増殖
した。コントロール培養（成長因子なし）は、それらが
最終的に死滅するまで３週間維持した。ＩＬ−３もしく
はＩＬ−６を与えた細胞は混合した形態であり、粘着細
胞および非粘着細胞の両方を含んでいた。細胞遠心分離
（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ）調製物は、培養物
が多くの成熟顆粒球細胞ならびに成熟芽様細胞を含むこ
とを示す。これらのＩＬ−３およびＩＬ−６処理細胞を
１６週間まで継続的に維持した。ＳＣＰＦ処理した細胞
はサイズがより均一であり、全て単核で外見は芽様であ
り、そして非粘着性である。用量応答実験から、ＳＣＰ
Ｆの最適濃度は５０ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌとの間
にあるようである。

【０１１３】培養１２週間後、ＳＣＰＦ処理したＣＤ３
４⁺細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＤＲ／ＨＬＡ
クラスＩＩ発現の有無に関してフローサイトメトリーに
よって試験した。図１４および１５に示したデータは、
ＳＣＰＦで増殖したＣＤ３４ ⁺細胞が、サイズに基づく
と２つの形態の集団からなることを示す。図１４（ゲー
ト領域Ｃ）は、表現型がＣＤ３４⁺、ＣＤ３８^-、および
ＤＲ^-である小さな細胞を示す。大きな集団（図１５−
ゲート領域Ｂ）は、ＣＤ３４⁺、ＣＤ３８^low、およびＤ
Ｒ^lowである。従って、ＳＣＰＦは、インビトロ培養物
中のＣＤ３４⁺細胞がＣＤ３４⁺の表現型を維持している
間は、その増殖を誘導し得る−−すなわち、ＣＤ３４⁺
細胞は分化せずに増殖する。ＳＣＰＦで増殖したＣＤ３
４⁺細胞およびＩＬ−３で増殖したＣＤ３４⁺細胞の両方
の複製効率を培養８週間後にテストした（表３）。

【０１１４】

【表３】 データは、ＩＬ−３存在下で増殖した細胞の複製が乏し
い（組換えＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを用いる）こと
をさらに示唆する。一方、ＳＣＰＦで処理したＣＤ３４
⁺細胞は、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で良好な
複製効率であり、そのことは、ＳＣＰＦで増殖させた細
胞の原始的性質をさらに示す。ＳＣＰＦは、ＣＤ３４⁺
細胞にいかなる悪性の表現型も与えない。なぜなら、Ｃ
Ｄ３４⁺細胞は、ＳＣＰＦがなくなると４〜５日後に死
滅するからである。

【０１１５】主なシグナルとして、この成長因子が骨髄
幹細胞と相互作用する能力に関して行った研究は、ＳＣ
ＰＦがＢＦＵコロニーおよびＣＦＵ−ＧＭコロニーのど
ちらも誘導し得ることを示す（図１６および１７）。Ｓ
ＣＰＦは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭを誘導し得るようではな
い。しかし、この因子は、コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、ＩＬ−３およびＥＰＯ）の混合物の活性を促進し
得、それによりＢＦＵコロニー（図１６ＡおよびＣ）、
ＣＦＵ−ＧＭコロニー（図１７ＡおよびＣ）、ならびに
ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー（図１８ＡおよびＣ）に対す
るＣＳＦ活性を著しく増加させる。

【０１１６】（７．２．５． ＳＣＰＦによるＣＤ３４
⁺細胞の細胞周期への誘導）以下の実験により、ＳＣＰ
ＦおよびＩＬ−３が精製ＣＤ３４⁺骨髄細胞を複製に誘
導する能力を分析した。結果は、ＳＣＰＦおよびＩＬ−
３はどちらも、単独で与えられた場合に、細胞周期に入
るために細胞を刺激し得たことを示す。これらの２つの
サイトカインを組み合わせて培養細胞に添加する場合、
Ｇ２期にある細胞の％の増加にさらなる効果がある（表
４）。

【０１１７】

【表４】 （７．２．６． 抗体阻害研究）以下の研究は、ＳＣＰ
Ｆにより誘導された芽細胞コロニーの形成を中和するた
めにヒトＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およ
びＩＬ−３に特異的なポリクローナル抗体のメチルセル
ロース骨髄コロニーアッセイにおける使用を試験した
（表５）。

【０１１８】

【表５】 データは、これらのポリクローナル抗体がＳＣＰＦによ
る芽細胞コロニーの誘導を中和し得なかったが、ＳＡ
Ｍ．１はそれらの誘導を中和し得たことを示す。しか
し、ＳＡＭ．１抗体は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の
ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）促進を阻害し得なかった。こ
のことは、ＳＣＰＦが公知のＣＳＦと同一ではないこ
と、およびＳＡＭ．１抗体がＳＣＦの機能を阻害しない
ので、ＳＣＰＦはＳＣＦとは機能的に異なるようである
ことを示す。

【０１１９】（７．２．７． 二次元ゲル電気泳動）化
学物質。アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミド、尿素、過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ，
Ｎ，−テトラメチルエチレンジアミン、およびＡＧ ５
０１−Ｘ８分析用混合床樹脂をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅＣｅｎｔｒｅ， ＮＹ）から購入した。Ｐ
ｈａｒｍａｌｙｔｅ ｐＨ ３−１０およびＢｉｏｌｙ
ｔｅ ｐＨ ３−１０両性電解質ならびに分子量標準
（Ｍ_r２０，１００、トリプシンインヒビター（大
豆）；２４，０００、トリプシノーゲン；２９，００
０、カルボニッックアンヒドラーゼ；３６，０００、グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；４
５，０００、アルブミン（卵）；６６，０００、アルブ
ミン（ウシ）；９７，４００、ホスホリラーゼＢ；１１
６，０００、β−ガラクトシダーゼ）をＳｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍ
Ｏ）から購入した。ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａ
ｙ ＲｅａｇｅｎｔｓをＰｉｅｒｃｅ （Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ， ＩＬ）から購入した。全ての他の化学物質は分
析用でありＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたは
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．のいずれかから
購入した。

【０１２０】第一次元。等電点電気泳動ゲル（ＩＥＦ）
（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．， ２５０：４００９， １９７５）を内径０．３
ｃｍの１１ｃｍ長のガラス管中で作製し、底部をパラフ
ィルムで密封した。チューブゲルは、４％アクリルアミ
ド、９Ｍ尿素、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、および
２％両性電解質を含み、これを２段階で調製した。第１
に以下の成分を混合し、ＡＧ ５０１−Ｘ８樹脂（４５
ｍｇ／ｍｌ混合物）の存在下で約１０分間穏やかに撹拌
した：アクリルアミドストック溶液（３８％（ｗ／ｖ）
アクリルアミドおよび２％（ｗ／ｖ）Ｎ，Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミド（Ｈ₂Ｏ中））２．５ｍｌ、１０
％（ｗ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｈ₂Ｏ中）
５．０ｍｌ、尿素１３．７５ｇ、およびＨ₂Ｏ ３．７
５ｍｌ。次いでアクリルアミド混合物をガラスウール栓
を通して濾過し、樹脂を除去した。第２に各タンパク質
について、４．２３ｍｌアクリルアミド混合物、５％
ｐＨ ３−１０ 両性電解質（５０％Ｐｈａｒｍａｌｙ
ｔｅｓおよび５０％Ｂｉｏｌｙｔｅｓ）、適当な容量の
可溶化タンパク質サンプル、および脱イオン水を混合す
ることによりゲルを調製し、全容量４．９８ｍｌを得
た。約２分間脱気した後、調製したばかりの１０％（ｗ
／ｖ）過硫酸アンモニウム５．０μｌおよびＮ，Ｎ，
Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン３．５μｌを添
加した。迅速にゲルをキャストし（０．７６ｍｌゲル混
合物／チューブ）、脱イオン水を重層し、そして３時間
重合させた。全てのタンパク質サンプルを、ゲル混合物
に添加する前に、１３，０００×ｇで３分間遠心分離し
た。

【０１２１】このチューブを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄ
ｅｌ １５５ゲル電気泳動セル（下方（陽極）チャンバ
ーに０．０１Ｍリン酸、上方（陰極）チャンバーに脱気
した０．０２Ｍ水酸化ナトリウムを含む）中に置いた。
等電点電気泳動を室温で１８時間３５０Ｖの一定電圧下
で行った。等電点電気泳動が完了した後、空気充填シリ
ンジ／ゴム管状アセンブリをチューブの塩基性側の末端
に取り付け、少量の圧力を加えることにより、ゲルを穏
やかにガラス管から外した。ＩＥＦのｐＨグラジエント
を表面電極（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定した。次い
でゲルを５．０ｍｌ平衡緩衝液（０．０６２ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ６．８中２．３％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、５％β−メルカプトエタノール、および１０％（ｖ
／ｖ）グリセロール）中で１０分間穏やかに撹拌し、ま
たはエタノール／ドライアイス浴で急速に凍結し、使用
するまで−７０℃で保存した。

【０１２２】第二次元。サンプルをＬａｅｍｍｌｉの方
法に従って４％アクリルアミド濃縮用ゲルを用いて１０
％ゲル（１．５ｍｍ厚さ、１４．５ｃｍ長さ）上でスラ
ブＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。第一次元ＩＥＦゲ
ルおよび分子量標準（平衡緩衝液中１％アガロースに埋
包された）を０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．
８中１％アガロースを用いて濃縮用ゲルにつなげた。電
気泳動を、染料がゲルの約１００％の長さまで流れるま
で、１００ｍＡ／ゲルの一定電流を用いて室温（２０〜
２５℃）で行った。

【０１２３】固定および染色。二次元スラブゲル内で分
離したタンパク質をメタノール／酢酸／水（４０／１０
／５０）中で一晩固定した。固定ゲルを標準法によりク
マシーブルーで染色するか、または以下の変法に従って
銀染色した。固定ゲルを染色前に最低１時間、２０％エ
タノールを３回交換して洗浄した。染色は標準法により
行った（Ｍｅｒｒｉｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．， １０４：４４１，１９８４）。ゲルを絶えず
穏やかに撹拌しながら３０〜４５分間染色した。次い
で、染色したゲルを染色を発色させる前に２０％エタノ
ールを２回交換して総計で２０分間洗浄した。ゲルをエ
タノール／酢酸／水（２０／１０／７０）中に置くこと
により染色の発色を停止させた。バックグラウンド染色
は、ゲルをＫｏｄａｋ Ｒａｐｉｄ Ｆｉｘｅｒ（フィ
ルム強度）に２〜５分間置くことにより除去した。次い
で、ゲルを総計で３０分間水を３回交換し、その後５分
間Ｋｏｄａｋハイポ清浄剤中で洗浄して、ゲルから固定
液を除去した。ハイポ清浄剤を、最小限１時間２０％エ
タノールを３回交換して洗浄することにより、ゲルから
除去した。最後に、各ゲルを２枚のＢｉｏＧｅｌＷｒａ
ｐ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．， Ｃａｒｍｅ
ｌ， ＮＹ）間に挟み込むことにより染色ゲルを室温で
乾燥した。

【０１２４】染色ゲルの撮影。銀染色ゲルの直接現像を
Ｋｏｄａｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｕｐ
ｌｉｃａｔｉｎｇ Ｆｉｌｍを用いて製造者の指示に従
って行った。このフィルムはゲルに見出されるタンパク
質を永久的に記録し、照明ボックスの助けによりいくつ
かのゲルにわたってタンパク質パターンの視覚マッチン
グを行い得る。いくつかの場合では、Ｋｏｄａｋ Ｅｋ
ｔａｐａｎ ４×５インチシートフィルムを用いてゲル
を撮影し、１６×２０インチのオルトフィルム上に現像
した。得られた現像写真は、透明フィルム基材上に大き
な黒点としてタンパク質のスポットを示した。これらの
現像写真を大判にすると試験が容易であり、そしてタン
パク質パターンの違いを正確に直接現像写真上に記録で
きた。

【０１２５】（７．２．８ ＳＣＰＦ活性についてのバ
イオアッセイ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１−Ｄまたは２
−Ｄのいずれか）から溶出したタンパク質中のＳＣＰＦ
の存在または非存在を、本発明者らの研究室において生
育させたＣＤ３４⁺細胞株（ＭＬ−１）による［³Ｈ］−
メチルチミジン（［³Ｈ］Ｔｄｒ）取り込みを用いる増
殖アッセイにおいて測定した（セクション８．１を参照
のこと）。あるいは、他のＣＤ３４⁺細胞（例えばＫＧ
−１ａ ＣＤ３４⁺細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４６．
１））がアッセイに用いられてＳＣＰＦ活性について調
製物をテストした。

【０１２６】簡単にいえば、１×１０⁵ＭＬ−１細胞
を、１０％ＦＢＳおよびＬ−グルタミンを含有するＩｓ
ｃｏｖｅｓ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地を入れた丸底９６
ウエルマイクロタイタープレートのウエル中に１００μ
ｌ／ウエルの容量で播種した。連続２倍希釈した推定Ｓ
ＣＰＦタンパク質調製物をウエルに３つ組で添加した
（１００μｌ／ウエル）。次いで、培養物を大気中５％
ＣＯ₂の湿潤雰囲気下で３７℃で４８時間インキュベー
トした。インキュベートした後、培養物を培養の最後の
１６〜１８時間ウエル当たり１μＣｉの［³Ｈ］−Ｔｄ
ｒで標識した。ラジオアイソトープ取り込み量を液体シ
ンチレーション計数により定量した。表６および７は、
それぞれＫＧ−１ａおよびＭＬ−１細胞を用いるバイオ
アッセイについてのトリチウム化チミジン取り込みを示
す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの３７ｋＤタンパク質から単離し
た推定ＳＣＰＦ（セクション７．１．２．を参照のこ
と）の２倍希釈物をテストし、そしてトリチウム化チミ
ジン取り込みの結果はＳＣＰＦ生物活性が調製物中に存
在することを示した（コントロールと比較）。

【０１２７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で同定された３７ｋＤ
タンパク質から単離した調製物を用いて、２−Ｄゲルを
流した。クマシーブルーで染色した後、複数のＳＣＰＦ
イソ型が２−Ｄゲル上で同定された。ゲルを切片に分
け、８枚のタンパク質含有スライスを取り出した。タン
パク質を８枚のスライスから上述の７．１．２．に記載
のようにして溶出した。バイオアッセイを各スライスか
らの溶出タンパク質に関して行った。トリチウム化チミ
ジンの取り込みは、スライス４番において見られたイソ
型から生成されたタンパク質調製物と相関した（表８、
データはＣＰＭで示す）。スライス４番において同定さ
れたＳＣＰＦイソ型は、表面電極分析により決定される
ように、ｐＨ ７．０〜８．０の範囲のタンパク質を表
す。この画分の生物活性は、バイオアッセイにおいてサ
イトカインの２倍希釈物により見られるように典型的な
希釈効果を示した。

【０１２８】表８で同定された生物活性データは、ＳＡ
Ｍ．１抗体を用いるウエスタンブロット分析によりさら
に確認された。上述のように流した二次元ゲル（ｐＨグ
ラジエントゲルおよび続く分子量ゲル）をニトロセルロ
ースフィルターまたはＰＶＤＦフィルター上にブロット
し、そして一次抗体としてＳＡＭ．１および二次抗体と
してアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ
（Ｈ ＆ Ｌ）を用いて標準ハイブリダイゼーション法
を用いてハイブリダイズした（ＢｉｏＲａｄ）。このデ
ータは、抗体がｐＨ範囲が７．０〜８．０のタンパク質
と強く反応することを明らかにし、このｐＨ範囲は、Ｓ
ＣＰＦ生物活性を示した領域と一致した。

【０１２９】ＳＣＰＦは、ＳＡＭ．１または他のＳＣＰ
Ｆ特異的抗体を用いて、標準免疫アフィニティー法によ
り２−Ｄゲル上で別々のスポットから、均一になるまで
さらに精製した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第８章、Ｃｏｌｉｇ
ｅｎ，ら， 編、１９９２）。ＳＣＰＦは免疫アフィニ
ティーマトリックスから溶出され、次いで上述のように
等電点電気泳動にかけられるが、好ましくはｐＨ範囲は
ｐＨ６〜８のより狭い範囲で行う。ゲル中で分離したタ
ンパク質は、次いで上述のバイオアッセイにおいてＳＣ
ＰＦ生物活性についてスクリーニングされ得る。

【０１３０】

【表６】

【０１３１】

【表７】

【０１３２】

【表８】 （７．２．９ ネズミ７５１細胞株由来のＳＣＰＦの配
列分析）３７ｋＤａタンパク質の１７ｋＤａフラグメン
トを、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で生育させた７５１細
胞の調整無血清上清から濃縮および精製した。簡単にい
えば、７５１細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４
０培地中で約８０％集密になるまで増殖させた。次いで
培養物を２回ＰＢＳで洗浄し無血清ＲＰＭＩ中で培養し
た。インキュベートしてから１２時間後、細胞を回収
し、上清を集め、４℃での低速遠心分離により清澄化し
た。上清を凍結乾燥して乾燥させ、−２０℃で保存し
た。凍結乾燥したタンパク質を０．１％トリフルオロ酢
酸（ｐＨ１．９）中に再懸濁し、４℃で一晩透析し、そ
の後低速遠心分離した。

【０１３３】約２００μｌの調製物を０．１％ＴＦＡ、
ｐＨ１．９中で平衡化した逆相ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔ
ｅｒｓ， Ｎｏｖａｐａｋ−Ｃ１８）に注入し、そして
０．１％ＴＦＡ、ｐＨ１．９中の０〜２０％のアセトニ
トリルの直線グラジエントで１０分間で溶出し、次いで
０．１％ＴＦＡ、ｐＨ１．９中の２０％〜６０％のアセ
トニトリルで１時間溶出した。画分を集め、各々のアリ
コートをＳＡＭ．１抗体を用いるウエスタン分析を用い
て分析した。ＳＡＭ．１ポジティブポリペプチドは、３
０〜３３％アセトニトリルの範囲で溶出した。次いで、
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製した。

【０１３４】ＳＡＭ．１ポジティブポリペプチドは約１
７ｋＤに移動した。このバンドをＳＤＳゲルから切り出
し、リジル−Ｃエンドペプチダーゼで消化してフラグメ
ントを形成させた。このフラグメントを逆相Ｃ８カラム
（Ｗａｔｅｒｓ）上で分画した。次いで、ペプチドを自
動アミノ酸シーケンサーを用いて記載されるように配列
決定した（Ｈｕｎｋａｐｅｌｌｅｒら， 「Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｇａｓ−ｐｈａｓｅｐｒｏｔ
ｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ」、Ｄ．
Ｅ． Ｓｈｉｒｅｌｅｙ，編、Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ
Ｊ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ２２３〜２４７
頁、１９８６）。

【０１３５】タンパク質データベース（Ｄａｙｈｏｆ
ｆ）検索により独特である４つのペプチドを抗ペプチド
抗血清の産生のために合成した。抗体を、以下のように
してペプチドに対して生じさせた（ウサギにおいて、Ｈ
ＴＩ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒａｍｏｎａ，
ＣＡ）。０日目の初回免疫は完全フロイントアジュバン
ト（ＣＦＡ）中に乳化した３００μｇ抗原であった。２
１、４２、および６３日目に行ったブースト免疫は、不
完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化した３
００μｇ抗原であった。ウサギを各接種時点ならびに接
種後の４９、７７、および８４日目に採血し、そして血
清を、ＳＣＰＦタンパク質に反応性の抗体の存在につい
て７５１細胞ライゼートを用いてウエスタンブロットに
よりテストした。

【０１３６】ペプチドＫＤＲＧＡＧＡＬに対して合成し
た抗体は、ウエスタンブロット上で２つのタンパク質
（１７ｋＤａおよび３７ｋＤａ）と特異的に反応した。
図１９は、以下の細胞ライゼートとの抗ペプチド血清反
応性のウエスタンブロット分析を示す：レーン１、２、
および３：それぞれ１５μｌ、３０μｌ、および４０μ
ｌの７５１細胞ライゼート（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢ
Ｓ）；レーン４、５、および６：それぞれ１５μｌ、３
０μｌ、および４０μｌの７５１細胞ライゼート（ＲＰ
ＭＩ＋１０％ＦＢＳ）＋５０％無血清上清（ＭＬ−１細
胞由来）；レーン７、８、および９は、ネガティブコン
トロールとして免疫前血清を用いてブロットして３０μ
ｌの７５１ＮＡ細胞ライゼートを示す。

【０１３７】３７ｋＤａのバンドをゲルから切り出し、
上記のようにして抽出し、そして以下の８．４に記載の
ようにして造血細胞のコロニーアッセイにより生物活性
についてテストした。

【０１３８】（７．２．１０ 他の成長因子との相乗作
用についてのアッセイ）ＭＬ−１細胞株を、ヒト死体椎
体由来の骨髄から免疫選抜したＣＤ３４⁺から単離およ
び精製した（セクション８．１を参照のこと）。免疫選
抜したＣＤ３４ ⁺細胞をサイトカインに曝す前および後
にＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ３８−ＦＩＴＣ、およびＣｒ−
ＰｅｒＣＰで染色した。ＣＤ３４⁺細胞（２×１０⁵個）
を種々のサイトカインを単独または組み合わせて添加し
たまたは添加しない１．０ｍｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ培地
中で培養した（表９および表１０を参照のこと）。細胞
を培養前に数え、そして培養６日後に再度数えた。次い
で、細胞をＳＣＰＦ抗体ＳＡＭ．１で染色し、ＦＡＣＳ
分析にかけた。ＣＤ３４⁺細胞を、サイド光散乱（ｓｉ
ｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ）およびＰＥ蛍光に従って、リス
トモードでゲートした。２つの異なるサイズのＣＤ３４
⁺細胞集団（大および小）が、フォワード光散乱（ｆｏ
ｒｗａｒｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ）に基づいて
同定された。これらの細胞をＣＤ３８およびＤｒ発現に
ついて分析した。データを大および小ＣＤ３４⁺細胞集
団についてそれぞれ表９および１０中に示す。これらの
結果はＳＣＰＦおよびＩＬ−３が、それらが単独で与え
られた場合、細胞周期に入るように細胞を刺激し得たこ
とを示す。ＳＣＰＦ＋ＩＬ−３の組合せは、大ＣＤ３４
⁺細胞の総数ならびに小ＣＤ３４⁺細胞の総数の増大にお
いて相加的そしておそらく相乗的な作用を有する。

【０１３９】

【表９】

【０１４０】

【表１０】 （８．実施例：ヒトＭＬ−１細胞株由来幹細胞増殖因
子）以下に記載の実験は、ヒト細胞株ＭＬ−１由来のＳ
ＣＰＦが、約２３ｋＤａの分子量および約７．７のｐＩ
（尿素の存在下の２Ｄゲル電気泳動により決定された）
ならびに約２７ｋＤａ（一次元ゲル電気泳動から決定さ
れた）を有することを示す。

【０１４１】（８．１ ＭＬ−１細胞株の起源）ＣＤ３
４⁺富化骨髄細胞の不均一な集団をヒト死体椎体から調
製した（一般的にＬａ Ｒｕｓｓａ，ら， Ｅｘｐ．
Ｈｅｍ．， ２０：４４２， １９９２；Ｓｔａｎｌｅ
ｙ，ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：６８
９， １９９２；Ｋｅｓｓｌｅｒ，ら， Ｂｌｏｏｄ
（増補１）、７０：３２１ａ， １９８７）。これらの
細胞を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミ
ン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１００ｎ
ｇ／ｍｌ 細胞株７５１由来ＳＣＰＦを補足したＩｓｃ
ｏｖｅｓ改変Ｄｕｂｂｅｃｃｏｓ最少必須培地（ＩＭＤ
Ｍ）において、大気中５％ＣＯ₂雰囲気下で３７℃でイ
ンビトロ培養した。

【０１４２】３日ごとに外因性の細胞株７５１由来ＳＣ
ＰＦを４２日間にわたって補足した（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）。この期間中、細胞の計数を毎日単位で行った。生
存細胞数は培養９〜１０日頃減少した。細胞増殖によっ
て示されるように、培養ほぼ１４日目に、細胞は細胞株
７５１由来ＳＣＰＦに応答性になるようであった。

【０１４３】初期培養から４２日後、残存細胞を、細胞
株７５１由来ＳＣＰＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を１週間に
一度補足した上記培地において継代培養し、維持した。
継代培養からほぼ４〜６週間、細胞は外因性の細胞株７
５１由来ＳＣＰＦの非存在下で成長し得ることが明らか
となった。このことは細胞株（ＭＬ−１）がそれ自身の
成長因子を生産し得ることを示唆した。次いで、ＭＬ−
１細胞株を分析し、存在する固有の細胞表面マーカーの
レパートリーを決定し、ＣＤ３４⁺、ＨＬＡ^-、ＤＲ⁺、
ＣＤ３８^-、ＣＤ２^-、ＣＤ３^-、ＣＤ４^-、およびＣＤ８
^-であることが分かった。表１１は、フローサイトメト
リー表現型分析の結果を示す。

【０１４４】表１１ ＭＬ−１細胞のフローサイトメトリー表現型

【０１４５】

【表１１】 さらに、ＭＬ−１細胞を核型分析し、種々の逆位および
転座が見られた。特定のパターンは、以下の通りであ
る：４６， ＸＹ， ｄｅｌ （４ｑ）， −５， ｄ
ｅｌ （７ｑ）， −８， ＋ｉ （８ｑ）ｘ２， −
１２， ＋ｄｅｒ（１２） ｔ （８ｑ；１２ｑ），
ｄｅｌ （１６ｑ）， −１７， ＋ｄｅｒ （１７）
ｔ （５ｑ；１７ｑ）， ２０ｐ＋。

【０１４６】（８．２ ＳＣＰＦのゲル精製）ＭＬ−１
細胞を後期対数期まで成長させ、そして２μｇ／ｍｌア
プロチニンを含有するＴＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で可溶化した。細胞ライゼートを、分子量の
概算値を得るために１Ｄ Ｔｒｉｓ−トリシンゲル（Ｓ
ｃｈａｇｇｅｒおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ， Ａｎａ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６６：３６８， １９８
７）上で、そして等電点の概算値を得るために等電点電
気泳動ゲル（ｐＩ ３〜１０、ＦＭＣ）上で電気泳動し
た。

【０１４７】全細胞ライゼートのドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）中での一次元ゲル電気泳動をＴｒｉｓ−ト
リシンゲル（Ｓｃｈａｇｇｅｒおよびｖｏｎ Ｊａｇｏ
ｗ，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６６：３６
８， １９８７）を用いて行った。アクリルアミド濃度
は、濃縮用ゲルについては５％Ｔ、３％Ｃであり、分離
用ゲルについては１０％Ｔ、３％Ｃであった。ゲルをク
マシーブルーで染色するか、あるいはＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（ＰＶＤＦ）膜にブロットし、抗ＳＣＰＦ抗体
（ＳＡＭ．１）を用いてウエスタン法によりプローブし
た。ウエスタンブロットは標準法により行った。ＰＶＤ
Ｆ膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉ
ｓ生理食塩水、ｐＨ ８中で作製された５％ｂｌｏｔｔ
ｏ（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂粉乳）でブロックした。一
次抗体（ＳＡＭ．１）をｂｌｏｔｔｏで１／１，０００
に希釈し、室温で２時間または低温下で一晩ブロットと
共にインキュベートした。二次抗体を、アルカリホスフ
ァターゼ結合抗ウサギ抗体であり、これをｂｌｏｔｔｏ
で１／５，０００に希釈し、上述と同様にしてブロット
とインキュベートした。免疫応答性タンパク質は、ブロ
ットをアルカリホスファターゼに対する基質と標準法に
よりインキュベートすることにより明らかにされた。新
鮮な調製物において、抗体は、約２７ｋＤａの１つのバ
ンドを明らかにした。他方で、４℃で短時間保存した調
製物は２つのバンドを生じ、これは主要バンドは約２７
ｋＤａであり、そして別の弱いバンドはほぼ１４．５ｋ
Ｄａのバンドであった。１４．５ｋＤａバンドの強度は
保存が長いほど増大し、これによりこのバンドはある種
のタンパク質分解事象により２７ｋＤａバンドから誘導
されたことが示唆された。

【０１４８】ヒトＳＣＰＦのｐＩを決定するために、ま
ずトリトンライゼートをＡｍｉｃｏｎミクロ濃縮器に通
して画分を濃縮し、０．０６％ＣＨＡＰＳを含有する１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７）で塩を取り除い
た。タンパク質を、平床電気泳動（ＢｉｏＲａｄ）によ
りＩｓｏＧｅｌ Ａｇａｒｏｓｅ ＩＥＦ（ＦＭＣ）ゲ
ル（ｐＩ範囲３〜１０）を用いて等電点に集めた。等電
点に集めた後、タンパク質を、Ｔｒｉｓ生理食塩水、ｐ
Ｈ ７．５中で３０分間圧ブロットすることによりＩｍ
ｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ膜に移した。ＳＣＰＦを、抗ＳＣＰ
Ｆ抗体（ＳＡＭ．１）およびアルカリホスファターゼ結
合二次抗体を用いてウエスタンブロットにより同定し
た。この方法を用いて、２つのバンドがｐＩ ５．１５
（１４．５ｋＤａ）およびｐＩ ９（２７ｋＤａ）で同
定された。

【０１４９】２Ｄゲル電気泳動については、上述のよう
にして０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に可溶化し
た細胞ライゼート由来のタンパク質を、Ｓｅｍｐｌｅ−
Ｒｏｗｌａｎｄら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ， １２：３０７， １９９１の手順に従って２Ｄゲ
ル電気泳動により分離した。第一次元は、ｐＨが５と９
との間に及ぶ７Ｍ尿素中５％アクリルアミド等電点電気
泳動ゲルであった。キャリア両性電解質（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）をｐＨ範囲３〜１０の４％ｖ／ｖ濃度で用い
た。３００μｇの全タンパク質を第一次元ゲル混合物に
重合前に添加した。サンプルを室温で１６時間７５０ｖ
で泳動し、最後に１時間１０００ｖで泳動した。ｐＨを
表面電極を用いて測定した。第二次元は、１２％アクリ
ルアミドＳＤＳスラブゲル（厚さ１ｍｍ）であり、これ
をブロモフェノールブルー染料マーカーがゲルの底に達
するまで一定電流（２０ｍＡ／ゲル）で泳動した。ゲル
をクマシーブルーまたは銀のいずれかで染色するか（Ｗ
ｒａｙら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８：
１９７， １９８１）、あるいはＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ
（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気ブロット
した。分子量標準（２００、９７、６９、４６、３０、
および２１．５ｋＤａ、Ａｍａｒｓｈａｍ Ｒａｉｎｂ
ｏｗマーカー）を第二次元においてゲルに目盛りをつけ
るために用いた。

【０１５０】２Ｄゲルおよびブロットは、全細胞ライゼ
ート中で２つのスポットのみが抗体と相互作用すること
を示した。このゲルを８Ｍ尿素中で流してタンパク質構
造を分離させると、完全分子に埋め込まれたいくつかの
アミノ酸が暴露された。その結果、小さなバンドは、１
７ｋＤａの見かけ分子量および約７．０５のｐＩを有し
ていた。大きなバンドは２３ｋＤａの見かけ分子量およ
び約７．７のｐＩを有していた。平床ＩＥＦゲルと２Ｄ
ゲルとにおいて得られる値の差異は、おそらく尿素の存
在による。平床ＩＥＦ系では、尿素が用いられないの
で、その結果、タンパク質は折り畳みが解除されない。

【０１５１】Ａｕｒｏｄｙｅで染色した同じゲルおよび
ブロッティング後の銀染色ゲルの第２ブロットの試験
は、２３ｋＤａの分子量を有する十分に分解された強い
スポットおよび１７ｋＤａのやや弱い強度のスポットを
明らかにし、これらのスポットは抗体により明らかにさ
れた位置に相当する。これらのスポットはまた、クマシ
ーブルーで染色した伴ゲルにおいても見られた。

【０１５２】（８．３ ＳＣＰＦのイオン交換精製）Ｓ
ＣＰＦをＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２、Ｗｈａｔｍａ
ｎ）およびＣＭ−セルロース（ＢｉｏＲａｄ、充填済カ
ラム）上のクロマトグラフィーでＭＬ−１ライゼートか
ら精製した。１４．５ｋＤａタンパク質（ｐＩ ５．１
５）は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７、０．０
６％ ＣＨＡＰＳ、および１ｍＭ ＰＭＳＦ中でＤＥＡ
Ｅに吸着した。カラムを０〜１．０ＭのＮａＣｌ直線グ
ラジエントで展開した。１４．５ｋＤａタンパク質は
０．２Ｍと０．３５Ｍとの間のＮａＣｌで溶出した。２
７ｋＤａタンパク質（ｐＩ ９）は、ＤＥＡＥに結合し
なかったが、他方大部分の細胞性タンパク質は結合し、
従ってこの工程で除去される。素通り画分を集め、１０
ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ ６．０に対して透析し、そして同
じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セルロース上でクロマトグ
ラフィーによって分析した。ＣＭ−セルロースカラムも
また上述と同様にＮａＣｌ直線グラジエントで展開し
た。再度、２７ｋＤａタンパク質は、これらの条件下で
はこのカラムに認められる程度には結合しないが、結合
した細胞性タンパク質の第２のセットから分離される。

【０１５３】サンプルを、タンパク質を結合させるＭｏ
ｎｏ Ｓカラムを通してクロマトグラフィーから回収し
た。このカラムをＮａＣｌの直線グラジエント（０．１
から０．５Ｍ）で５０分間展開する。２つのタンパク質
ピークが抗ＳＡＭ抗体と十分に交差反応した。第１のピ
ークは５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、そして第２のピー
クは１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。第２のピーク
は、ウエスタンブロット上で抗体とのより強い反応を与
えた。２つの画分は、２−Ｄゲル電気泳動および抗ＳＡ
Ｍ抗体を用いるウエスタンブロット分析により決定され
たいくつかの同じタンパク質を含有していた。

【０１５４】（８．４ ＭＬ−１由来のヒトＳＣＰＦの
生物活性）上述した平床免疫電気泳動ゲル由来の画分
を、市販のバイオアッセイ法（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，
ＣＡ）を用いてテストした。このアッセイは、代謝活性
の検出に基づいて蛍光／比色成長指標を取り込む。この
レドックス指標は、細胞成長培地が細胞増殖によって還
元されると、蛍光を発光し、そして変色を生じさせる。

【０１５５】ＫＧ−１Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４
６−１）を容量１００μｌで９６ウエルマイクロプレー
トに１×１０⁵細胞／ウエルで播種した。２組のウエル
にサンプル希釈液（１００μｌ）を添加し、増殖速度の
増大により示されるように生物活性についてテストし
た。次いで、プレートを空気中５％ＣＯ₂の湿潤雰囲気
下で３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベ
ートした後、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ試薬を培養容量の
１０％に等しい量（２０μｌ）で添加し、このプレート
をさらに６時間インキュベーターに戻した。変色は５７
０ｎｍの波長で測定した。バックグラウンド吸光度を６
００ｎｍで測定し、そしてこれを差し引いた。図２０Ａ
およびＢに示したデータはバックグラウンドを差し引い
た吸光度である。テストしたサンプルはＩＥＦゲルのｐ
Ｈ ９．０（Ａ）および５．０（Ｂ）由来の領域であっ
た（これらはＭＬ−１細胞からのライゼートが等電点で
集められた領域である）。これらの領域（Ｉ−９．１〜
Ｉ−９．４およびＩ−５．１〜Ｉ−５．６）はまた、Ｓ
ＡＭ．１抗体を用いて免疫反応性についても分析した
（ウエスタンブロット分析）。生物活性はｐＩ−９．０
領域でのみ見られた。サンプルＩ−９．３が最大の生物
活性を有するようであった。テストしたｐＩ ５．０画
分のいずれにおいても活性は見られなかった。このバイ
オアッセイ法を用いて、上述した２−Ｄゲルから単離お
よび精製したタンパク質（ｐＩ ７．７、２３ｋＤａ）
がヒトＳＣＰＦペプチドであることが分かる。

【０１５６】さらに、クロマトグラフィー後に回収した
部分精製調製物を、免疫選抜ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の
細胞増殖の刺激について、既出の記載のようにして、ク
ロノジェニックアッセイにおいてテストした（Ｃｏｌｏ
ｎｙ Ａｓｓａｙｓ ｏｆＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ
Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌ
ｏｓｅ Ｍｅｄｉａ． Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ． Ｐｒｅｐａ
ｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔａｆｆ ｏｆｔｈｅ Ｔｅ
ｒｒｙ Ｆｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉａ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｖａｎｃ
ｏｕｖｅｒ， Ｂ．Ｃ．， Ｃａｎａｄａ Ｖ５Ｚ １
Ｌ３， １９９２を参照のこと）。簡単にいえば、希釈
細胞を、培養皿で必要とされた最終濃度の１０倍でＲｅ
ａｄｙ−Ｍｉｘ Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅを予
め分注したチューブに添加した（例えば、２組のアッセ
イ培養が所望される場合、３ｍｌのＲｅａｄｙ−Ｍｉｘ
を入れた１５ｍｌ容チューブに１ｍｌあたり２×１０⁶
細胞を０．３ｍｌを添加するか、または４組のアッセイ
が所望される場合、５ｍｌのＲｅａｄｙ−Ｍｉｘを入れ
た１５ｍｌ容チューブに０．５ｍｌを添加することによ
る）。これにより１．１ｍｌの最終プレート混合物当た
り２×１０⁵細胞の最終濃度が得られる。１０倍濃度の
細胞懸濁液を加えることにより、細胞は最終容量の１０
分の１の容量で加えられる。Ｒｅａｄｙ−Ｍｉｘ Ｍｅ
ｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅを大量に購入した場合（例
えば１ボトル当たり１００ｍｌ）、この全体の量を、１
６ゲージの平端針をつけた５ｍｌ容のディスポーザブル
シリンジを用いて、１５ｍｌ容チューブに５ｍｌ容量の
うち３ｍｌとして前もって分注しておかねばならない。
細胞をチューブに添加した直後、内容物を強くボルテッ
クス撹拌して、細胞をむらなく懸濁させた（３ｍｌの最
終メチルセルロース混合物の約３分の２がチューブの側
壁に付着している）。ボルテックス撹拌した後、チュー
ブを数分間放置し、存在するいかなる大きな気泡をも表
面に浮き上がらせる（５分で十分である）。（これは細
胞が培養される混合物であるため、細胞は、必要であれ
ば、プレートする前に室温で数時間この状態で、続くコ
ロニー形成に悪影響を及ぼさずに放置され得ることに留
意されたい）。次に、最終細胞含有混合物を１．１ｍｌ
容量で、滅菌３５ｍｍペトリ皿中にプレートした。プレ
ートした各チューブについて、１６ゲージ平端針をとり
つけた新たな滅菌ディスポーザブル３ｍｌ容シリンジを
用いた。次いで、この皿を１００ｍｍペトリ皿の中に２
つずつ置いた。３番目の３５ｍｍ皿（蓋なし）を水皿の
ために加えた。水皿の目的は、続く２〜３週間のインキ
ュベート期間の間、最大湿度が得られるようにすること
である。アッセイ培養に用いられる３５ｍｍペトリ皿
は、それらが線維芽細胞を付着および成長させ得ないこ
とについて予備テストした。これは、骨髄細胞がたいて
いの供給者により市販されているいわゆるペトリ（非組
織培養用）皿において培養される場合に容易に生じ、そ
してこれが生じる場合、造血コロニー形成はしばしばあ
いまいになるか、または阻害さえされる。皿を回転およ
び傾斜させることにより、粘性のメチルセルロース混合
物が各皿の表面にわたって均一に広がり、メニスカスを
皿の全ての面の壁に付着させる。３ｍｌの滅菌水を各水
皿に添加した。

【０１５７】培養物を３７℃湿潤インキュベーター中の
水平なトレー上に置き、大気中５％ＣＯ₂の内部雰囲気
を維持した。インキュベーション１０〜１２日後、培養
皿を取り出し、１度に１つずつ６０ｍｍ区画化組織培養
皿の中に置き（蓋をつけたまま）、倒立顕微鏡を用いて
インサイチュでのコロニーを記録した。コロニー数は、
最も多い成熟型の赤血球コロニー形成細胞由来（すなわ
ちＣＦＵ−Ｅおよび成熟ＢＦＵ−Ｅ由来）のより小さい
赤血球コロニーを含んでいた。次いで、皿をさらに８〜
１０日間インキュベーターに戻した。この時間の最後
で、より大きな赤血球コロニー（原始ＢＦＵ−Ｅ由
来）、全顆粒球形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ由来）、お
よび多系統細胞含有コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来）
は同じ皿において最も容易に区別され、そして最も正確
に計数された。

【０１５８】調製物は、短期間（３日）および長期増殖
アッセイにおいてＤＮＡ合成を５〜１０倍刺激すること
を示した。この約２３ｋＤａの画分はまた、上述のよう
にして骨髄細胞および臍帯血液細胞のメチルセルロース
に基づくアッセイにおいてＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−
ＧＭ、およびＢＦＵ−Ｅ前駆細胞数を増大させた。臍帯
血由来ＣＤ３４＋細胞をこの画分で処理したとき、ＣＤ
３４＋／ＣＤ３８−表現型を有する細胞の５倍の増大が
１２日間にわたって観察された。

【０１５９】タンパク質スポットはまた、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌおよび１００ｍＭ ＮａＣｌでＭｏｎｏ Ｓカラ
ムから溶出した物質の２−Ｄゲルから切り出し、各画分
を用いて刺激したＰＤＬ−１（ＣＤ３４＋）細胞を用い
る標準コロニー形成アッセイを用いて生物活性について
分析した。あるいは、生物活性は、トリチウム化チミジ
ン取り込みまたは比色アッセイにより測定され得、これ
は上述したように、単離したばかりの３４＋または当業
者に公知の他の利用可能なＣＤ３４＋細胞を用いて行わ
れ得る。生物活性を、５０ｍＭで溶出したピークから同
定されたＳＡＭ．１反応性スポットおよび１００ｍＭで
溶出したピークから同定されたＳＡＭ．１反応性スポッ
トについて測定した。１００ｍＭ画分における主要スポ
ットのみが単離され、ＰＤＬ−１生物活性アッセイによ
り、ポジティブであることが分かった。これらのタンパ
ク質を配列決定し、いくつかは脂質結合性タンパク質で
あることが分かった。

【０１６０】５０ｍＭ画分からＳＣＰＦについて予想さ
れる分子量範囲に分離した約１３個のスポット（図２
１）もまた単離し、生物活性についてテストした。ゲル
のウエスタンブロットは、いくつかのスポットがＳＡ
Ｍ．１抗体と相互作用することを示した。伴ゲルをＰＶ
ＤＦに対して電気ブロットし、そしてクマシーブルーで
染色した（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ら， １９９２，
前出、Ｕｎｉｔ ８．１０， 参考として援用）。ス
ポット９は、抗体ポジティブであり、これを伴われるＰ
ＶＤＦブロットから切り出した。スポット９はまた生物
活性であることが見出されたが、このタンパク質はＮ末
端でブロックされていたので、配列分析を行うことはで
きなかった。スポット９におけるタンパク質の配列は現
在では慣例的な方法により決定され得、この方法として
は、酵素分解フラグメント化およびタンパク質がブロッ
クされるときに通常用いられる標準法によるペプチド配
列分析が挙げられる。このような方法は当業者に周知で
ある。スポット８は、ＳＡＭ．１抗体とは反応性ではな
かったが、ＰＤＬ−１アッセイにおいて生物活性であっ
た。スポット８の配列分析は、これがマンガン（Ｍｎ）
スーパーオキシドジスムターゼであることを明らかにし
た。

【０１６１】関連ＳＣＰＦスポットのｐＩは、２−Ｄゲ
ル電気泳動により決定されるように、図２０に示す。ｐ
Ｉは、サンプルが尿素で変性された後、２−Ｄゲルから
決定した。（これは、ＩＥＦにより分析した場合（ここ
ではタンパク質は尿素で変性されていない）の天然状態
のタンパク質とは異なる）。１３個のスポットは約６．
２〜７．８の範囲のｐＩおよび２３〜２７ｋＤａ範囲の
ＭＷを有していた。

【０１６２】８．５ ＳＣＰＦと種々のサイトカインに
対する抗体との反応性ＳＣＰＦが既に同定されたサイト
カインであるかまたは新規なタンパク質であるかを決定
するために、ウエスタンブロット分析を行った。表１２
は、抗ＳＡＭ．１、抗ｈＩＬ−３、抗ｈＩＬ−１１、抗
ｈＧＭ−ＣＳＦ、抗ｈＳＣＦ、抗ｈＩＬ−１ａ、抗ｈＩ
Ｌ−β、および抗ｈＧ−ＣＳＦとそれら自身（ポジティ
ブコントロールとして）およびＳＣＰＦとの反応性の結
果を示す。ＳＡＭ．１以外の抗体はどれもＳＣＰＦと反
応しなかった。

【０１６３】

【表１２】 （９．細胞株の寄託）７５１細胞株およびＭＬ−１細胞
株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）に寄託されて
おり、以下の受諾番号を有する： 細胞株 受諾番号 ７５１−ＮＡ−１５ ＣＲＬ １０９９２ ＭＬ−１ ＣＲＬ １１４５１ 本発明は、本発明の個々の局面の１つの説明として意図
されている記載の特定の実施態様によって限定されず、
そして機能的に等価な任意の細胞株、ＤＮＡ構築物、ま
たは因子は本発明の範囲内にある。実際、本明細書中に
示されそして記載されている説明に加えてなされる本発
明の種々の改変は、前述の記載および添付の図面から当
業者に明らかとなるものである。このような改変は添付
の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

【０１６４】本発明は、自己分泌性成長因子に関する。
特に、本発明は、幹細胞増殖因子（ＳＣＰＦ）の生産、
精製、および使用に関する。種々の細胞株において、本
発明のタンパク質は、２つの形態、すなわち可溶形態お
よび膜結合形態で存在する。このタンパク質は、少ない
割合のヒト骨髄細胞の表面で検出可能であり、そしてこ
れらの細胞の増殖を刺激する。従って、ＳＣＰＦは、広
範な適用を有しており、その適用は、造血幹細胞の増殖
の増強を包含するがこれに限定されない。さらに、抗体
によるタンパク質の除去は、腫瘍細胞成長の制御に有用
であり得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 フローサイトメトリー分析による表現型の特
徴付け。７５１細胞株は、非神経性外胚葉胚細胞（抗Ｐ
ＡＰ、抗ＨＣＧ）、および神経起源の胚細胞（抗サイト
ケラチン、ビメンチン、ＮＳＥ、ＧＦＡＰ、およびＮＦ
Ｐ）の細胞骨格構造に特異的な抗原マーカーに対して指
向する抗体で染色した。抗ＨＬＡクラスＩをコントロー
ルとして使用した。染色パターンは、枠内に示すが、こ
の細胞株がニューロン系統またはグリア系統の細胞に分
化し得る原始神経外胚葉細胞であることを示している。

【図２】 ［³⁵Ｓ］−メチオニン代謝標識後の７５１細
胞からの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグ
ラフおよびＡｍｂｉｓスキャン。上清は、インビトロで
の成長の際に、７５１−ＧＣ（＝元の胚細胞後）を
³⁵Ｓ：−パルスした後、２４時間で回収した。７５１−
Ｔ２（＝ｎｕ／ｎｕネズミ継代細胞）は、原始皮下腫瘍
から単離した。７５１−Ｍｅｔ ｎｕ／ｎｕネズミ継代
細胞は、肝臓転移から単離した。Ａｍｂｉｓスキャン
は、３２ｋＤａタンパク質に対して指向し、ネズミ腫
瘍、転移腫瘍、および組織培養でのみ継代した元の胚細
胞株からの３２ｋＤａタンパク質の分泌において量的な
違いを示す。

【図３】 ＳＡＭ．１抗体を用いて７５１細胞から精製
した３７ｋＤａのゲル精製タンパク質（ＳＣＰＦ）のウ
エスタンブロット分析。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの
クマシーブルー染色は３７ｋＤａタンパク質を示してい
る。（Ｂ）パネル３Ａにおけるゲルのウエスタンブロッ
ト。

【図４】 腫瘍成長の抗体阻害。ＳＡＭ．１抗体（抗Ｓ
ＣＰＦ）を用いて、軟寒天（メチルセルロース）での腫
瘍細胞コロニー形成を阻害した。棒グラフは、抗体濃度
を関数としてコロニーの阻害（絶対数）を示す。ＮＲＳ
は、１：２０希釈の正常ウサギ血清である。下部のパネ
ルは、メチレンブルーで染色した実際のコロニーを示
す。

【図５】 腫瘍成長の抗体阻害。この図は、ＤＮＡ複製
を測定するトリチウム化チミジンの取り込みを関数とし
てＳＡＭ．１抗体による腫瘍成長の阻害を示す。細胞を
１０，０００細胞／ウエルで９６ウエルマイクロプレー
トに播き、そして希釈を変えた抗血清を各ウエルに添加
した。各希釈は、３組で反復させた。培養４８時間後、
細胞を³Ｈ−チミジン（１Ｕ／ウエル）で標識し、１２
時間再度培養し、その後細胞を回収し、ラジオアイソト
ープの取り込みをシンチレーションカウンターを用いて
測定した。データは、７５１細胞の増殖、そして非常に
原始的な骨髄細胞株（ＢＯ−ＢＭ．１）がこの抗体によ
り阻害されるが、Ａ２５１神経芽腫細胞株は阻害されな
いことを示す。

【図６】 クロノジェニック活性から単離されたヒト骨
髄芽細胞のフローサイトメトリー分析：ＣＤ３４発現。

【図７】 長期インビトロ培養におけるＣＤ３４⁺細胞
の複製：ＣＤ３４⁺細胞は、７５１細胞から精製したＳ
ＣＰＦを用いて誘導し、その後、インビトロ培養した。

【図８】 ７５１細胞由来ＳＣＰＦに応答して生じる正
常ヒト骨髄の増殖：トリチウム化チミジン取り込みアッ
セイ。

【図９Ａ】 ＳＡＭ．１（抗ＳＣＰＦ）抗体で染色した
粘着涸渇ヒト骨髄（９Ａ）および臍帯血（９Ｂ）のフロ
ーサイトメトリー分析。黒線は、ＦＩＴＣヤギ抗ウサギ
コントロールを表し、青線は、ヤギ抗マウスＦＩＴＣコ
ントロールを表す。ＨＬＡクラスＩ（緑線）をポジティ
ブコントロールとして用いた。

【図９Ｂ】 ＳＡＭ．１（抗ＳＣＰＦ）抗体で染色した
粘着涸渇ヒト骨髄（９Ａ）および臍帯血（９Ｂ）のフロ
ーサイトメトリー分析。黒線は、ＦＩＴＣヤギ抗ウサギ
コントロールを表し、青線は、ヤギ抗マウスＦＩＴＣコ
ントロールを表す。ＨＬＡクラスＩ（緑線）をポジティ
ブコントロールとして用いた。

【図１０】 二重染色（ＳＡＭ．１およびＣＤ３４）す
るヒト臍帯血の集団の分析。

【図１１】 免疫磁気ビーズにより単離されたＣＤ３４
⁺細胞に結合するＳＡＭ．１の１色および２色のフロー
サイトメトリー分析。（１ａ）ヤギ抗ウサギＦＩＴＣコ
ントロール、（１ｂ） ＳＡＭ．１抗体で染色したＣＤ
３４⁺細胞、（１ｃ）ＨＬＡクラスＩマウスモノクロー
ナル抗体で染色されたＣＤ３４⁺細胞、（２ａ）ヤギ抗
マウスＰＥコントロール、（２ｂ）抗ＣＤ３４抗体で染
色したＣＤ３４⁺細胞、（２ｃ）ヤギ抗マウスＦＩＴＣ
コントロール、（３ｂ）ＳＡＭ．１（ＦＩＴＣ）および
抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＰＥ）で二重染色した
ＣＤ３４⁺細胞。

【図１２】 フローサイトメトリー分析による、ＳＡ
Ｍ．１および抗ＣＤ３４の単独および組合せでの結合効
率の比較。

【図１３】 ７５１細胞由来のＳＣＰＦを用いるＣＤ３
４⁺細胞の長期インビトロ培養。

【図１４】 ７５１細胞由来のＳＣＰＦを用いる長期培
養で増大したＣＤ３４⁺細胞のフローサイトメトリー分
析（３色）：ゲートＣ。

【図１５】 ７５１細胞由来のＳＣＰＦを用いる長期培
養で増大したＣＤ３４⁺細胞のフローサイトメトリー分
析（３色）：ゲートＢ。

【図１６】 ７５１細胞由来のＳＣＰＦの骨髄クロノジ
ェニック活性。（Ａ）ＣＳＦ（１００ｕ／ｍｌ ＧＭ−
ＣＳＦ、１００ｕ／ｍｌ ＩＬ−３、１ｕ／ｍｌ ＥＰ
Ｏ）のみの混合物のＢＦＵ活性（Ｂ）種々の濃度でのＳ
ＣＰＦのＢＦＵ活性。（Ｃ）１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＰ
Ｆと混同したＣＳＦのＢＦＵ活性。データは、ＳＣＰＦ
が単独でＢＦＵ活性を誘導し得ること（Ｂ）およびまた
ＣＳＦ混合物と相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｅｓ）する
こと（Ｃ）を示す。

【図１７】 ７５１細胞由来のＳＣＰＦの骨髄クロノジ
ェニック活性。（Ａ）（１００ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、１００ｕ／ｍｌ ＩＬ−３、１ｕ／ｍｌＥＰＯ）の
みの混合物のＣＦＵ−ＧＭ活性、（Ｂ）種々の濃度での
ＳＣＰＦのＣＦＵ−ＧＭ活性、（Ｃ）１００ｎｇ／ｍｌ
のＳＣＰＦと混同したＣＳＦのＣＦＵ−ＧＭ活性。デー
タは、ＳＣＰＦが単独でＣＦＵ−ＧＭ活性を誘導し得る
こと（Ｂ）およびまたＣＳＦ混合物と相乗作用すること
（Ｃ）を示す。

【図１８】 ７５１細胞由来のＳＣＰＦの骨髄クロノジ
ェニック活性。（Ａ）（１００ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、１００ｕ／ｍｌ ＩＬ−３、１ｕ／ｍｌＥＰＯ）の
みの混合物のＣＦＵ−ＧＥＭＭ活性、（Ｂ）種々の濃度
でのＳＣＰＦのＣＦＵ−ＧＥＭＭ活性、（Ｃ）１００ｎ
ｇ／ｍｌのＳＣＰＦと混同したＣＳＦのＣＦＵ−ＧＥＭ
Ｍ活性。データは、ＳＣＰＦが単独でＣＦＵ−ＧＥＭＭ
活性を誘導し得ないこと（Ｂ）およびまたＣＳＦ混合物
と相乗作用すること（Ｃ）を示す。

【図１９】 抗ペプチド抗血清を用いるウエスタンブロ
ット分析。レーン１、２、および３：７５１細胞ライゼ
ート（ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ）をそれぞれ１５μ
ｌ、３０μｌ、および４０μｌ；レーン４、５、および
６：７５１細胞ライゼート（ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢ
Ｓ）＋ＭＬ−１細胞由来の５０％無血清上清；それぞれ
１５μｌ、３０μｌ、および４０μｌ；レーン７、８、
および９は、ネガティブコントロールとして免疫前血清
とブロットした３０μｌの７５１ＮＡ細胞ライゼートを
示す。

【図２０】 ＭＬ−１細胞由来のＳＣＰＦの生物活性。
（Ａ）ｐＨ９．０領域のＩＥＦゲルによる細胞増殖、
（Ｂ）ｐＨ５．０領域のＩＥＦゲルによる細胞増殖。デ
ータは、生物活性がｐＩ９．３を有する物質（２７ｋＤ
ａ）に主に存在したことを示す。ｐＨ５．０領域の物質
に生物活性は観察されなかった。

【図２１】 ＭＬ−１細胞由来のＳＣＰＦの２−Ｄゲル
電気泳動。ゲルは、Ｍｏｎｏ Ｓカラムからの５０ｍＭ
ＮａＣｌ画分由来のＳＣＰＦについて予測される分子
量範囲に分離した１３のスポットを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｅ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 パトリシア ディー． ローマン アメリカ合衆国 フロリダ 32817， オ ーランド， ミッション ベイ ブールバ ード 3396， アパートメント 187 (72)発明者 ナンシー ディー． デンスロー アメリカ合衆国 フロリダ 32607， ゲ インズビル， エヌ．ダブリュー． ７テ ィーエイチ プレイス 3515 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 BA21 CA04 DA02 EA04 GA11 4B064 AG02 BA14 BF06 CA19 CC24 CE11 CE12 CE14 4B065 AA94X AA94Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA16 BA03 CA18 CA27 DB52 ZA512 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB01 CC22 CC23 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 EA20 EA50 FA72 FA74 GA23 GA31 HA05 HA17

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １１４５１を
   有する細胞株ＭＬ−１から得られる幹細胞増殖因子であ
   って、以下の特性を有するポリペプチドを含む、幹細胞
   増殖因子： ａ）ヒトＣＤ３４⁺骨髄幹細胞の増殖を刺激する； ｂ）尿素の存在下での２次元ゲル電気泳動によって決定
   された、２３ｋＤａの分子量を有する； ｃ）ドデシル硫酸ナトリウムの存在下での１次元ゲル電
   気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定された、２７
   ｋＤａの分子量を有する； ｄ）尿素の存在下での２次元ゲル電気泳動によって決定
   された、約７．７の等電点を有する； ｅ）尿素の存在下でのフラットベッドゲル電気泳動によ
   って決定された、約９の等電点を有する； ｆ）ＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来の多系統細胞の増殖を刺激す
   る；および ｇ）ＭｏｎｏＳに結合するが、ＤＥＡＥセルロースにも
   ＣＭセルロースにも結合しない。
2. 【請求項２】 抗ｈＩＬ−３、抗ｈＩＬ−１１、抗ｈＧ
   Ｍ−ＣＳＦ、抗ｈＳＣＦ、抗ｈＩＬ−１ａ、抗ｈＩＬ−
   Ｂ、抗ｈＧ−ＣＳＦ、またはＳＣＰＦと非反応性であ
   る、請求項１に記載の幹細胞増殖因子。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の幹細胞増殖因子を産生
   するための方法であって、 ａ）請求項１に記載の幹細胞増殖因子をコードするヌク
   レオチド配列を含有する細胞を培養する工程であって、
   該幹細胞増殖因子は、Ｎ−末端アミノ酸配列ＫＤＲＧＡ
   ＧＡＬを含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、生物学
   的に活性な幹細胞増殖因子が該培養された細胞によって
   発現されるように、遺伝子発現を指向する調節ヌクレオ
   チド配列の作動可能な制御下にある、工程；および ｂ）該培養から生物学的に活性な幹細胞増殖因子を回収
   する工程、を包含する、方法。
4. 【請求項４】 ヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激するための
   インビボの方法であって、該骨髄幹細胞を請求項１に記
   載の幹細胞増殖因子と接触させる工程を包含する、方
   法。
5. 【請求項５】 前記骨髄幹細胞がＣＤ３４⁺である、請
   求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記骨髄幹細胞をサイトカインと接触さ
   せる工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記サイトカインが、ＩＬ−３、ＩＬ−
   ６、またはＳＣＦである、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の幹細胞増殖因子によっ
   て刺激される腫瘍細胞の増殖を阻害するためのインビボ
   の方法であって、該腫瘍細胞と、該幹細胞増殖因子に結
   合するかまたはそれを中和する抗体または抗体フラグメ
   ントとを、インビボで接触させる工程を包含する、方
   法。
9. 【請求項９】 ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １１４５１を
   有する細胞株。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の幹細胞増殖因子を含
    有する薬学的組成物。