JP2003135068A

JP2003135068A - ウシ腫瘍壊死因子の製造方法

Info

Publication number: JP2003135068A
Application number: JP2001334078A
Authority: JP
Inventors: Makoto Mizukami; 誠水上; Yasuaki Murahashi; 保昭村橋; Shogo Ebisu; 省吾恵比須; Yuichi Yokomizo; 祐一横溝; Yasuyuki Mori; 康行森; Shigeki Inumaru; 茂樹犬丸; Takao Tsuji; 孝雄辻
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd; Fujita Health University; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd; Fujita Health University; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2001-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2003-05-13

Abstract

(57)【要約】【解決手段】成熟型ウシ腫瘍壊死因子（ｂｏｖｉｎｅ
Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α：
ｂＴＮＦ−α）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドにより形質転
換されたブレビバチルス・チョーシネンシス（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）を培
養することにより、ウシ腫瘍壊死因子を培養物中に生
成、蓄積せしめ、これを採取すること、を特徴とするウ
シ腫瘍壊死因子の製造方法。【効果】高純度のウシ腫瘍壊死因子（ウシＴＮＦ−
α）の大量生産が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウシ腫瘍壊死因子
（ｂｏｖｉｎｅＴｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃ
ｔｏｒ−α：ｂＴＮＦ−α）（以下、「ウシＴＮＦ−
α」ということもある）を遺伝子組換え技術により効率
的に大量製造する方法に関するものであり、更に詳細に
は、成熟型ウシＴＮＦ−αのアミノ酸配列をコードする
遺伝子のＤＮＡを組み込んだプラスミドにより形質転換
されたブレビバチルス・チョーシネンシス（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）を培養
し、培養中に生成したウシＴＮＦ−αを採取することを
特徴とするウシＴＮＦ−αの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏ
ｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）はサイトカイ
ンの一種で、抗腫瘍活性、抗微生物活性、分化・増殖の
調節、免疫系への伝達、起炎作用、組織の修復などの活
性を有している。最近、ＴＮＦ−αが牛、羊、山羊など
の家畜の乳房炎などの病気の予防及び治療に効果のある
ことが分かり、従来の抗生物質治療とともに補助的治療
としての利用が検討され、効率的な生産方法の開発が求
められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＴＮＦ
−αが家畜の乳房炎の予防及び治療に効果があることが
明らかになった。畜産産業に重要な位置を占める牛のＴ
ＮＦ−αについても研究が進められ、ウシＴＮＦ−αが
乳牛の乳房炎の治療に有効なことが確認された。このウ
シＴＮＦ−αは、分子量約１７ｋＤのタンパク質で、２
３３アミノ酸残基の膜結合前駆体として生合成される。
ウシＴＮＦ−α前駆体のＮ末端から７６残基は分泌シグ
ナルペプチドであり、その７６残基が切断された１５７
アミノ酸残基が成熟型ウシＴＮＦ−αとして細胞外に分
泌される。ウシＴＮＦ−αの前駆体及び成熟型ウシＴＮ
Ｆ−αのアミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｑ０
６５９９などに示されている。また成熟型ウシＴＮＦ−
αのアミノ酸配列を配列番号１（図１、図２）に示し
た。このウシＴＮＦ−αを牛の治療に使用するに当たっ
て大量のウシＴＮＦ−αが必要とされるが、生体には極
微量しか存在せず、入手の手段が実質的になかった。本
発明は、ウシＴＮＦ−αの大量製造法を提供することに
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、ウシＴＮＦ−αは
生体内には極微量しか存在しないことから、生体から抽
出する方法は少なくとも工業的には採算がとれる方法で
はない点に鑑み、各方面から検討した結果、遺伝子組換
え技術による効率的大量生産に着目した。

【０００５】そして本発明者らは、鋭意研究の結果、ウ
シＴＮＦ−αをコードする遺伝子のクローニングに成功
し、該遺伝子を含有する発現プラスミドの作成にも成功
し、該遺伝子を効率的に発現することのできる宿主菌を
各方面から広くスクリーニングした。そして、ブレビバ
チルス・チョーシネンシスに着目した。

【０００６】ブレビバチルス・チョーシネンシス（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）
（従来は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂ
ｒｅｖｉｓ）。ＳｈｉｄａＯ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙ
ｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，９３９−９４６
（１９９６）において分類学的位置の変更があった。）
に属する菌株には、タンパク質を菌体外に分泌生産し、
培養液中にタンパク質分解酵素を生産しない菌株が多
く、遺伝子組換えの宿主菌として様々なタンパク質の生
産に利用されている。例えば、高木らはブレビバチルス
・チョーシネンシスに属する菌株のひとつであるブレビ
バチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−６８６３）（本菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２
（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）を宿
主菌としてサイトカインの１種であるｈ−ＥＧＦの大量
生産技術を確立し、ｈ−ＥＧＦを培養液中に約３ｇ／ｌ
分泌生産させることに成功している（BIO INDUSTRY, 8,
275(1991)）。

【０００７】本発明者らは、このブレビバチルス・チョ
ーシネンシスＨＰＤ３１の変異株であるブレビバチルス
・チョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ
−６６２３）を用い、成熟型ウシＴＮＦ−αのアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドにより形質転換を行ったところ、形質転
換体が得られることを確認し、そして更にこの形質転換
体を培養することにより、発現プラスミドベクターに組
込まれた目的ＤＮＡを発現せしめ、ウシＴＮＦ−αを菌
体外に大量に分泌生産することにはじめて成功し、これ
らの有用新知見を基に更に研究を行い、ここにウシＴＮ
Ｆ−αを大量生産する方法を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、成熟型ウシＴＮＦ−
αのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
断片を組み込んだプラスミドにより形質転換されたブレ
ビバチルス・チョーシネンシスを培養することにより、
ウシＴＮＦ−αを培養物中に生成、蓄積せしめ、これを
採取すること、を特徴とするウシＴＮＦ−αの製造方法
に関するものである。以下、本発明について詳述する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の製造方法により製造され
るタンパク質のアミノ酸配列は、ウシＴＮＦ−α活性を
有するものであれば、特に限定されないが、好ましく
は、成熟型ウシＴＮＦ−αのもの（配列番号１）であ
る。また、本発明において成熟型ウシＴＮＦ−αをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡとしては、配列番号１
（図１、図２）に示すウシＴＮＦ−αのアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するＤＮＡならばいずれでもよ
いが、たとえば配列番号６（図１、図２）に示す塩基配
列を有するＤＮＡを用いることができる。なお、図１、
図２において、成熟型ウシＴＮＦ−αのアミノ酸配列
（１５７アミノ酸）を下段に示し、塩基配列（４７４ｂ
ｐ）を上段に示す。

【００１０】このウシＴＮＦ−αをコードする塩基配列
を有するＤＮＡ断片を宿主菌に導入し保持させるベクタ
ーは、宿主菌内で複製可能なプラスミドなら如何なるも
のでもよい。例えば、ブレビバチルス・チョーシネンシ
スで複製可能なｐＵＢ１１０、ｐＮＵ２００（鵜高重
三、日本農芸化学会誌、61, 669(1987)）、ｐＨＹ７０
０（S. Ebisu et al., Biosci. Biotech. Biochem., 5
6, 812〜813(1992)）、ｐＨＴ１１０（特許第２７２７
３９１号）やこれらの派生体などのプラスミドを使用で
きる。特に好ましい例としてｐＨＴ１１０の派生体であ
るｐＨＴ２６を挙げることができる。ｐＨＴ２６は、ｐ
ＨＴ１１０のＨＷＰシグナル配列をＲ２Ｌ６型の改変Ｈ
ＷＰシグナル配列（特開平７−１７０９８４号）に置き
換え、その改変ＨＷＰシグナル配列の下流にアディプシ
ンタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、更にマルチ
クローニングサイトの下流にバチルス・リケニフォルミ
ス由来α−アミラーゼのターミネーターをコードするＤ
ＮＡを挿入することにより構築されたプラスミドベクタ
ーである。ｐＨＴ２６の制限酵素地図を図３に示す。こ
れらのプラスミドを構築する方法としては、公知の方法
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning 2n
d ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab
oratory, 1989）に記載の方法などが例示される。

【００１１】本発明において宿主菌として用いる細菌は
ブレビバチルス・チョーシネンシスであるが、特にブレ
ビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６８６３）やその変異株であるブレビバチルス・
チョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ−
６６２３）などが好適に使用できる。

【００１２】宿主菌であるブレビバチルス・チョーシネ
ンシスを形質転換する方法は、エレクトロポレーション
法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法その他公知の方法で良
く、例えば、Takahashiらの方法（Takahashi et al.,
J. Bacteriol., 156, 1130 (1983)）またはTakagiらの
方法（H. Takagi et al., Agric. Biol. Chem., 53, 30
99-3100 (1989)）などが例示される。

【００１３】形質転換されたブレビバチルス・チョーシ
ネンシスの培養に用いる培地は、形質転換体が生育して
ウシＴＮＦ−αを生産しうるものであれば如何なるもの
でもよい。

【００１４】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いられる。また窒
素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カザミノ酸、グリシンなどの有機窒素源、尿素、
硫酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられる。
その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カ
リウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの無機
塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を示す
菌はその生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよ
い。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸などが挙げられる。

【００１５】また、培養に際して必要があれば、培養の
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要に
より、消泡剤、例えば大豆油、ラード油、各種界面活性
剤などを加えてもよい。培地の初発ｐＨは５．０〜９．
０、さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度
は通常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７
℃であり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好
ましくは２４〜９６時間である。

【００１６】本発明においては、形質転換体を前記の条
件で培養することによって、培養物中にウシＴＮＦ−α
が生成、蓄積される。このようにして得られたウシＴＮ
Ｆ−αは公知の方法により、例えばＵＦ膜、ＭＦ膜など
を用いた膜処理、硫安分画法、クロマトグラフィーなど
（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂（１９８５））で
精製することができる。

【００１７】ウシＴＮＦ−αの回収、精製は、上記のよ
うに既知の蛋白質精製方法を適宜利用して実施すればよ
く、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈澱、限外濾過、
イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およ
びアフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、等電点
電気泳動などの方法を１種又は２種以上組合せて実施す
ることができる。

【００１８】具体的には、例えば次のようにしてもよ
い。先ず、培養物を遠心分離またはＭＦ膜で処理するこ
とによって菌体を除いた後、上澄液またはろ過液に硫安
を加え、更にその上澄液をＵＦ膜で濾過することにより
ウシＴＮＦ−αを回収し、更に精製する為に分画分子量
の異なるＵＦ膜で分画することにより精製を行うことも
出来る。分画画分を更にイオン交換樹脂等により分画精
製し、必要があれば凍結乾燥すればよい。このようにし
て得られたウシＴＮＦ−αの生理活性については、既知
の方法であるＭＴＴ法（T. Mosmann, J. Immunol. Met
h., 65, 55-63 (1983))で測定することができる。

【００１９】本発明により、ブレビバチルス・チョーシ
ネンシスを宿主菌とすることが可能となり、ウシＴＮＦ
−αを大量に、しかも菌体外に生産することがはじめて
可能となった。特に本発明においては、ウシＴＮＦ−α
を遺伝子組換え技術によって大量に生産することを可能
にしただけでなく、ウシＴＮＦ−αは菌体外に分泌生産
されるため、回収、精製工程がきわめて簡単化され、且
つコンタミネーションの危険性も低く、きわめて効率的
にしかも純度の高いウシＴＮＦ−αを大量に生産するこ
とができる。

【００２０】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに
限定されるものではない。

【００２１】

【実施例１】形質転換体の調製（１）ウシＴＮＦ−αをコードするＤＮＡのクローン化ウシの肺胞洗浄液から付着法（新生化学実験講座１２−
Ｉ，東京化学同人，日本生化学会編，ｐ３〜６）により
マクロファージ（ＡＭφ）を分離し、ｉｎｖｉｔｒｏ
で４時間１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（リポポリサッカライ
ド）で刺激した。このＡＭφからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮ
Ａを抽出し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを得た。

【００２２】ここで得たウシｃＤＮＡをテンプレートに
して、ＰＣＲ法で配列番号２（図４）および配列番号３
（図５）のプライマーを合成して、分泌シグナル部分を
含むウシＴＮＦ−α前駆体をコードするＤＮＡ（約７０
２ｂｐ）を増幅した。増幅ＰＣＲ産物は、TA cloning法
（Invitrogen社製 TA Cloning Kit）を用いてプラスミ
ドpCR II（Invitrogen社製）に連結した。この連結ＤＮ
Ａを用いて、E.coli INVαF’(Invitrogen社製)を形質
転換し、ＬＢ寒天培地（１．０％ Tryptone,０．５％ Y
east Extract，１．０％ NaCl，ｐＨ７．０，１．５％
Agar）に塗布して、アンピシリン耐性株を選択した。選
択株よりプラスミドを抽出して、ウシＴＮＦ−α前駆体
をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＣＲＩＩｂ
ＴＮＦ−αを得た。

【００２３】更に、Cludts I.らの報告（Cytokine 4, 3
36-341 (1993））に従い、２種類のプライマーＤＮＡ
（ＮＩＨＴＮＦ−Ｎ：配列番号４（図６）、ＨＴＮＡ−
Ｃ２：配列番号５（図７）を合成した。先に得たプラス
ミドｐＣＲＩＩｂＴＮＦ−αをテンプレートにし、上
記により合成した２種類のプライマーＮＩＨＴＮＦ−
Ｎ、ＨＴＮＡ−Ｃ２を用いてＰＣＲ法で増幅した。

【００２４】ＰＣＲは、配列番号４のプライマーＮＩＨ
ＴＮＦ−Ｎと配列番号５のプライマーＨＴＮＡ−Ｃ２を
各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、
ｄＮＴＰ２００μＭ、ｐＣＲＩＩｂＴＮＦ−α鋳型Ｄ
ＮＡ１ｎｇ、１００μｌＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭＭｇ²⁺、５０ｍＭ塩
化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を
混合し、９６℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性
（９４℃、６０秒）、プライマーのアニーリング（５４
℃、６０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を
２５サイクルさせることによって行った。

【００２５】増幅させたＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩとＢａ
ｍＨＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動
に供し、成熟型ウシＴＮＦ−αをコードする塩基配列
（４７４ｂｐ）を含む４９４ｂｐのＤＮＡ断片を回収し
た。成熟型ウシＴＮＦ−αの塩基配列（４７４ｂｐ：１
５７アミノ酸に対応するコドン及び終止コドンＴＧＡを
含む）を配列番号６（図１、図２のそれぞれ上段）に示
した。

【００２６】プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（Takara社製）
をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理した後、０．８％アガロ
ースゲル電気泳動に供して３．１ｋｂの断片を回収し、
先に得た成熟型ウシＴＮＦ−αをコードする塩基配列を
含む４９４ｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結した。連結ＤＮＡを用いてE.coli JM109（大腸
菌ＪＭ１０９）を形質転換し、ＬＡ寒天培地に塗布をし
て、アンピシリン耐性を持つ株を選択した。選択株より
プラスミドを抽出して成熟型ウシＴＮＦ−αをコードす
るＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＶ１１８ＮｂＴＮ
Ｆ−αを得た。また、ここで得た株をＥ．ｃｏｌｉＪＭ
ｌ０９／ｐＴＶ１１８ＮｂＴＮＦ−αとした。

【００２７】（２）ｐＨＴ２６ｂＴＮＦ−αの構築プラスミドｐＮＥ２１０（蛋白質、核酸、酵素、３７
（３）２５８−２６８（１９９２））をＳｐｅＩとＳａ
ｌＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に
供して９９１ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。さらに、
プラスミドｐＨＴ２６をＳｐｅＩとＳａ１Ｉで処理した
後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して３．１ｋ
ｂのＤＮＡ断片を回収し、先に得た９９１ｂｐのＤＮＡ
断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮ
Ａを用いてブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３
１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ−６６２３）をエレクロトポ
レーション法（Agric. Biol. Chem., 53, 3009-3100 (1
989)）で形質転換し、Ｅｍ１０μｇ／ｍｌ含有ＴＭＥ寒
天培地（ペプトン１％、酵母エキス０．２％、肉エ
キス０．５％、グルコース１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ０．００１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１
％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、エリスロマ
イシン１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）に塗布をして、
エリスロマイシン耐性株を選択した。選択株よりプラス
ミドを抽出してプラスミドｐＨＴ２６・Ｎｃｏを得た。
また、ここで得た株をブレビバチルス・チョーシネンシ
スＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＨＴ２６・Ｎｃｏとした。

【００２８】（１）で得たプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ
ｂＴＮＦ−αをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理した後、
０．８％アガロースゲル電気泳動に供して、成熟型ウシ
ＴＮＦ−αをコードする塩基配列（４７４ｂｐ）を含む
４９４ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

【００２９】プラスミドｐＨＴ１１０・ＮｃｏをＮｃ
ｏＩとＢａｍＨＩで処理した後、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動に供して、４．１ｋｂの断片を回収し、先に
得た成熟型ウシＴＮＦ−αをコードする塩基配列（４７
４ｂｐ）を含む４９４ｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバ
チルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６２３）をエレクトロポレーション法（Agri
c. Biol. Chem., 53, 3009-3100(1989)）で形質転換
し、Ｅｍ１０μｇ／ｍｌ含有ＴＭＥ寒天培地（ペプトン
１％、酵母エキス０．２％、肉エキス０．５％、グ
ルコース１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、
ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ ₄・７Ｈ₂
Ｏ０．０００１％、エリスロマイシン１０μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ７．２）に塗布をして、エリスロマイシン耐性
株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出して成熟型
ウシＴＮＦ−αをコードするＤＮＡを保持するプラスミ
ドｐＨＴ２６ｂＴＮＦ−αを得た。

【００３０】また、ここで得た株をブレビバチルス・チ
ョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＨＴ２６ｂＴＮＦ
−α（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅ
ｎｓｉｓＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＨＴ２６ｂＴＮＦ−
α）と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生
物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１８２４０として国内
寄託した。

【００３１】

【実施例２】形質転換体の培養及びウシＴＮＦ−αの精
製（１）ブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１−
Ｓ５／ｐＨＴ２６ｂＴＮＦ−αの培養得られた形質転換体ブレビバチルス・チョーシネンシス
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＨＴ２６ｂＴＮＦ−αを３０Ｌジ
ャーファーメンターを用いてＥｍ１０μｇ／ｍｌ含有２
ＳＬ液体培地（ペプトンＳ４％、酵母エキス０．５
％、グルコース２％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１
％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、エリスロマイシン１０μ
ｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）にて３０℃で３日間振とう培養
を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウシＴ
ＮＦ−αモノクローナル抗体を用いたウエスタンプロッ
ト法により解析を行った。解析の結果、ウシＴＮＦ−α
の推定分子量１７ｋＤであり、相当の分子量の位置に染
色バンドを示し、その濃さよりウシＴＮＦ−αが２００
ｍｇ／Ｌ培地中に生産されている事が確認された。Ｂ．
ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＨＴ
２６ｂＴＮＦ−αによるウシＴＮＦ−αの分泌生産のパ
ターンを図面代用写真に示す（図８）。図中、ＣＢＢ
ｓｔａｉｎはクマシーブリリアントブルー染色像を示
し、Ｗ．Ｂ．はウエスタンブロッティング像を示す。

【００３２】（２）ウシＴＮＦ−αの精製ブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／
ｐＨＴ２６ｂＴＮＦ−αの培養液１８Ｌをポアサイズ
０．４５μｍのペリコンカセット膜（ミリポア社）を用
いて除菌し、約１８ＬのウシＴＮＦ−α培養上清液を得
た。次に、ウシＴＮＦ−α培養上清液に３０％飽和にな
るように硫安を３１７０ｇ加え、よく溶解させ、３時間
以上静置した。硫安を加えたウシＴＮＦ−α培養上清液
をポアサイズ０．４５μｍのペリコンカセット膜を用い
て濾過し、ウシＴＮＦ−αを濃縮液側に回収し、濃縮終
了後２５％飽和硫安を含む５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）ｂｕｆｆｅｒを５Ｌ加水して夾雑蛋白質
を濾過液側へ洗い流した。

【００３３】加水終了後、濃縮液側に５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）ｂｕｆｆｅｒ２Ｌを加えて
ウシＴＮＦ−αを溶解させ、再度濾過を行って、ウシＴ
ＮＦ−αを濾過液側に回収した。ここで得たウシＴＮＦ
−α液２Ｌを分画分子量１０，０００のペリコンカセッ
ト膜を用いて濾過し、５０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）ｂｕｆｆｅｒ５Ｌを加えて脱塩を行い、３００
ｍｌのウシＴＮＦ−α液を得た。ここで得たウシＴＮＦ
−α液３００ｍｌに７０ｍＭのＮａＣｌ（１．２ｇ）を
加えて、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＤＥＡＥ６５０Ｍゲル
５０ｍｌ（東ソー株）を充填したカラムに通し、色素及
び夾雑蛋白質をＤＥＡＥゲルに吸着させ、ウシＴＮＦ−
αを非吸着溶出液として回収した。

【００３４】回収した３００ｍｌのウシＴＮＦ−α液を
セロハン製透析膜を用いて超純水で透析を行い、これを
凍結乾燥し精製粉末ウシＴＮＦ−αを得た。精製ウシＴ
ＮＦ−αの純度は８０％で、培養液からの回収率は３０
％であった。

【００３５】

【実施例３】ウシＴＮＦ−αの活性測定実施例２で得たウシＴＮＦ−αについてＭＴＴ法によっ
てその活性を測定した。液体窒素（−１９６℃）保存中
のＷｅｈｉ１６４細胞ｃｌｏｎｅ２８−４（マウス繊維
肉腫）を３７℃で速やかに溶解し、ＲＰＭＩ１６４０培
地（血清なし）５０ｍｌ中に冷凍保存細胞を良く懸濁す
る。細胞懸濁液を遠心し（４℃、１，０００ｒ．ｐ．
ｍ．、１０分）、上清を除いた後、ＲＰＭＩ１６４０培
地（２０％血清入り）に再懸濁後、シャーレに移し、３
７℃、ＣＯ₂インキュベーターで２〜３日間培養する。
更に、Ｗｅｈｉ１６４細胞ｃｌｏｎｅ２８−４細胞をＲ
ＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含
む）中で継代培養する。培養終了後セルスクレーバーを
用いてＷｅｈｉ１６４細胞を細胞をつぶさないように注
意しながら、培養用シャーレから剥ぎとる。得られた細
胞懸濁液は血球計算板を用いて、細胞数を測定した後、
９６穴シャーレに１穴あたり１００μｌ／ｗｅｌｌの濃
度になるように細胞を分配する。

【００３６】５０ｍｇ／ｍｌのウシＴＮＦ−αを二倍希
釈法により５００ｎｇ／ｍｌ〜０．０６ｎｇ／ｍｌにな
るようにし、９６穴シャーレに各々１００μｌずつ分配
する。３７℃、５％ＣＯ₂を含むインキュベーター内で
１８時間培養を行った後、各ウェルに２５μｌずつのＭ
ＴＴ溶液(MTT ; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di
phenyl tetrazolium bromideを５ｍｇ／ｍｌ PBSに溶
解)を加える。２時間、３７℃、５％ＣＯ₂を含むインキ
ュベーター内で培養した後、培養液を１００μｌ吸い取
り、溶出溶液（１２．５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、５０ＤＭ
Ｆ（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｌｍａｍｉｄｅ）、
２．５％酢酸（８０％濃度）、２．５％１Ｎ塩酸ｐＨ
４．７）を１００μｍｌ／ｗｅｌｌ添加した。３７℃で
一晩抽出した後、良く攪拌し、吸光度を測定した（Ｏ．
Ｄ．ａｔ５７０ｎｍ）。その結果、ウシＴＮＦ−αのＥ
Ｄ₅₀は、１３．７５ｍｇ／ｍｌであり、活性を持ったウ
シＴＮＦ−αの生産が確認できた。

【００３７】

【発明の効果】本発明によって、高純度のウシＴＮＦ−
αを効率的に大量生産することがはじめて可能となり、
得られた組換えウシＴＮＦ−αは家畜の乳房炎の予防及
び／又は治療に有効に利用することができる。

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 National Agricultural Research Organization； Higeta Shoyu Co., Ltd.,; and Fujita Gakuen 〈120〉 Producing Method of Bovine Tumor Necrosis Factor-α 〈130〉 6444 〈141〉 2001-10-31 〈160〉 6 〈210〉 1 〈211〉 157 〈212〉 PRT 〈213〉 Bovine gene 〈400〉 1 Leu Arg Ser Ser Ser Gln Ala Ser Ser Asn Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asp Ile Asn Ser Pro Gly Gln Leu Arg Trp Trp Asp Ser Tyr 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Met Ala Asn Gly Val Lys Leu Glu Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Arg Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr Pro Leu Phe Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Ile Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Trp Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro Asp Tyr Leu Asp Tyr 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 〈210〉 2 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 2 atgagcacca aaagcatgat ccgggatgtg 30 〈210〉 3 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 3 tcacagggcg atgatcccaa agtagatttg 30 〈210〉 4 〈211〉 42 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 4 aaaccatggc tttcgctctc aggtcctctt ctcaagcctc aa 42 〈210〉 5 〈211〉 34 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 5 aaaggatcct cacagggcga tgatcccaaa gtag 34 〈210〉 6 〈211〉 474 〈212〉 DNA 〈213〉 Bovine 〈400〉 6 ctcaggtcct cttctcaagc ctcaagtaac aagccggtag cccacgttgt agccgacatc 60 aactctccgg ggcagctccg gtggtgggac tcgtatgcca atgccctcat ggccaacggt 120 gtgaagctgg aagacaacca gctggtggtg cctgctgacg ggctttacct catctactca 180 caggtcctct tcaggggcca aggctgccct tccaccccct tgttcctcac ccacaccatc 240 agccgcattg cagtctccta ccagaccaag gtcaacatcc tgtctgccat caagagccct 300 tgccacaggg agaccccaga gtgggctgag gccaagccct ggtatgaacc catctaccag 360 ggaggagtct tccagctgga gaagggagat cgcctcagtg ctgagatcaa cctgccggac 420 tacctggact atgccgagtc tgggcaggtc tactttggga tcatcgccct gtga 474

【図面の簡単な説明】

【図１】成熟型ウシＴＮＦ−αのアミノ酸配列（下段）
及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（上段）を示
す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】ｐＨＴ２６の制限酵素地図である。

【図４】プライマー（配列番号２）を示す。

【図５】プライマー（配列番号３）を示す。

【図６】プライマーＮＩＨＴＮＦ−Ｎを示す。

【図７】プライマーＨＴＮＡ−Ｃ２を示す。

【図８】形質転換体と非形質転換体（コントロール）の
培養物のクマシーブリリアントブルー染色像及びウエス
タンブロッティング像を示す図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者水上誠茨城県鹿島郡波崎町7293−９ (72)発明者村橋保昭千葉県木更津市東太田４−６−９サンセールかずさＰｏ３Ｂ−106 (72)発明者恵比須省吾千葉県銚子市清水町2798−１ (72)発明者横溝祐一茨城県つくば市並木４丁目11 919−103 (72)発明者森康行茨城県つくば市要１−２ (72)発明者犬丸茂樹茨城県つくば市並木四丁目10−１ (72)発明者辻孝雄愛知県豊明市沓掛町田楽ヶ窪１−98 学校法人藤田保健衛生大学・医学部内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA11 BA28 CA04 CA20 DA05 EA04 GA14 GA19 GA27 HA03 4B064 AG07 CA02 CA19 CC01 CC03 CC06 CC12 CC24 CD02 CD09 CD22 CD30 CE03 CE04 CE06 CE07 CE11 DA01 DA11 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウシ腫瘍壊死因子（ｂｏｖｉｎｅＴｕ
ｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α：ｂＴＮ
Ｆ−α）活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだプラス
ミドにより形質転換されたブレビバチルス・チョーシネ
ンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅ
ｎｓｉｓ）を培養することにより、ウシ腫瘍壊死因子を
培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取すること、を
特徴とするウシ腫瘍壊死因子の製造方法。
【請求項２】ウシ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク
質のアミノ酸配列が配列番号１に示す成熟型ウシ腫瘍壊
死因子のものであること、を特徴とする請求項１に記載
のウシ腫瘍壊死因子の製造方法。
【請求項３】ウシ腫瘍壊死因子活性を有するタンパク
質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列が配列
番号６の塩基配列で示されるものであること、を特徴と
する請求項１又は２に記載のウシ腫瘍壊死因子の製造方
法。