JP2003284572A - 新規ポリヌクレオチド - Google Patents

新規ポリヌクレオチド

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JP2003284572A
JP2003284572A JP2002203268A JP2002203268A JP2003284572A JP 2003284572 A JP2003284572 A JP 2003284572A JP 2002203268 A JP2002203268 A JP 2002203268A JP 2002203268 A JP2002203268 A JP 2002203268A JP 2003284572 A JP2003284572 A JP 2003284572A
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Satoshi Omura
智 大村
Haruo Ikeda
治生 池田
Atsushi Ishikawa
淳 石川
Hisashi Kikuchi
久 菊池
Hiroshi Horikawa
博司 堀川
Tadayoshi Shiba
忠義 柴
Yoshiyuki Sakaki
佳之 榊
Shohei Hattori
正平 服部
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Kitasato Institute
National Institute of Technology and Evaluation NITE
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 産業上有用な放線菌由来のポリヌクレオチド
およびポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの配列情報、該微生物の解析方法、該解析に用い
る装置およびシステム、および該微生物の育種法。 【解決手段】 放線菌に属する微生物由来のポリヌクレ
オチドおよびその断片、該ポリヌクレオチドおよびその
断片よりコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチ
ドおよびその断片を含むポリヌクレオチドアレイ、該ポ
リヌクレオチドおよびその断片の塩基配列を記録したコ
ンピュータで読みとり可能な記録媒体およびそれらの使
用、ならびに該ポリヌクレオチドおよび／またはペプチ
ド配列情報を用いた比較方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は放線菌（actinobact
eria）に属する微生物由来のポリヌクレオチドおよびそ
の断片、該ポリヌクレオチドおよびその断片よりコード
されるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびその断
片を含むポリヌクレオチドアレイ、該ポリヌクレオチド
およびその断片の塩基配列を記録したコンピュータで読
みとり可能な記録媒体およびそれらの使用、ならびに該
ポリヌクレオチドおよび／またはペプチド配列情報を用
いた比較方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】放線菌はアミノ酸、核酸、糖、有機酸、
およびそれらの類縁体等を前駆物質とする抗生物質を含
む様々な生物活性物質の生産に利用され産業上非常に有
用な微生物であり、多数の変異株が知られている。例え
ば、Streptomyces avermitilisは抗寄生虫・抗昆虫活性
を有するエバーメクチン生産菌として同定されたグラム
陽性バクテリアであり、その変異株によりエバーメクチ
ンが生産されている。該エバーメクチンは、家畜の駆虫
薬として全世界で使用されており、熱帯地方で流行して
いるヒト・オンコセルカ症のの治療および予防薬として
流行諸国で使用されている。Streptomyces avermitilis
によるエバーメクチンの生産は、おもに代謝径路および
その調節機構が変化した変異株（代謝変異株）により行
われている。
【０００３】しかしながら、大腸菌や枯草菌等と比べ
て、放線菌に関しては、基本的な遺伝学的、生化学的、
分子生物学的な知識の集積が十分とは言えず、生物活性
物質生産変異株における変異遺伝子についても、ごくわ
ずかな知見しかない。このように、これら微生物におい
ては未だ知られていないさまざまな生育、および代謝調
節機構が存在している。Streptomyces avermitilis ATC
C31267株に関しては、交雑による染色体マップが作成さ
れ、ゲノムサイズが約8,000キロベースであることが推
定されている。通常のバクテリアの遺伝子密度から算定
すると、この約8,000キロベースのゲノム中には約8,000
の遺伝子が存在すると予想されるが、Streptomyces ave
rmitilisでは、エバーメクチン生合成遺伝子を中心とし
て数十程度の遺伝子しか知られておらず、大部分の遺伝
子について塩基配列は未だ解明されていない。
【０００４】近年、いくつかの微生物、例えば大腸菌、
結核菌、酵母等についてそのゲノムの全塩基配列決定が
報告されている〔Science, 277, 1453-62 (1997)、Natur
e, 393, 537-544 (1998)、Nature, 387, 5-105 (199
7)〕。決定された全塩基配列に基づき、遺伝子領域の推
定、公知の遺伝子との塩基配列と比較が行われており、
遺伝学的、生化学的、分子生物学的な実験をすることな
く、膨大な数の遺伝子の機能の推定がなされている。ま
た近年、遺伝子あるいは遺伝子領域以外のゲノム領域の
部分核酸断片を固体支持体に固着したDNAチップあるい
はDNAアレイ等を用い、膨大な数の遺伝子について発現
状況を同時に見たり、変異を検出する技術が開発され、
酵母、結核菌、およびＢＣＧワクチンに用いられるMyco
bacterium bovis等の微生物の解析に成果を上げている
〔Science, 278, 680-686 (1997)、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA,96, 12833-38 (1999)、Science, 284, 1520-23
(1999)〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、産業
上有用な放線菌由来のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列情
報、該微生物の解析方法、該解析に用いる装置およびシ
ステム、および該微生物の育種法を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Streptom
yces avermitilis由来の全塩基配列を決定することによ
り、未だ同定されていない遺伝子領域の特定、公知遺伝
子の塩基配列および公知遺伝子に由来するアミノ酸配列
との比較による該微生物由来の未知遺伝子の機能推定、
該微生物による有用生産物の代謝調節機構の推定による
有用な生産変異株の取得が可能と考え、鋭意研究を重ね
た結果、全ゲノムショットガン法を適用することにより
Streptomyces avermitilisのゲノムの全ての塩基配列を
決定することができることを見出し、本発明を完成する
に至った。
【０００７】本発明は、放線菌由来のポリヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド、該ポリヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチドを固着したオリゴヌクレオチドアレ
イ、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、該
ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドまたは該
抗体を固着したポリペプチドアレイ、該ポリヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチドの塩基配列並びに該ポリペ
プチドのアミノ酸配列を記録したコンピュータで読みと
り可能な記録媒体および該記録媒体を用いるコンピュー
タを用いたシステム、ならびに該ポリヌクレオチドおよ
び／またはポリペプチド配列情報を用いた比較方法を提
供するものである。本発明は、以下の（１）〜（５３）
に関する。
【０００８】（１） ［１］放線菌の変異株由来の遺伝
子の変異点を同定、［２］放線菌由来の遺伝子の発現量
を測定、［３］放線菌由来の遺伝子の発現プロファイル
を解析、［４］放線菌由来の遺伝子の発現パターンを分
析、または［５］被検遺伝子と相同な遺伝子を放線菌で
検索するための、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を有する方
法； （ａ）配列番号1〜7551のいずれかに示される塩基配列
からなる第１のポリヌクレオチド類、該ポリヌクレオチ
ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第
２のポリヌクレオチド類、または第１または第２のポリ
ヌクレオチド類の連続する少なくとも10〜200塩基配列
からなる第３のポリヌクレオチド類からなる群から選ば
れる2種類以上のポリヌクレオチドを固体支持体に固着
し、ポリヌクレオチドアレイを作製する工程、（ｂ）該
ポリヌクレオチドアレイに固着されたポリヌクレオチド
と、放線菌由来の標識化ポリヌクレオチド、放線菌の変
異株由来の標識化ポリヌクレオチドまたは被検標識化ポ
リヌクレオチドの少なくとも一つとをハイブリダイズ条
件下でインキュベートする工程、（ｃ）ハイブリダイゼ
ーションを検出する検出工程、および（ｄ）ハイブリダ
イゼーション結果を解析する解析工程。
【０００９】ここで、２種類以上のポリヌクレオチド
は、例えば、第１のポリヌクレオチド類から選ばれる２
種類以上、第２のポリヌクレオチド類から選ばれる２種
類以上、第３のポリヌクレオチド類から選ばれる２種類
以上、第１、第２および第３のポリヌクレオチド類を組
合わせて選ばれる２種類以上のいずれでもよい。
【００１０】（２） 放線菌が、Streptomyces属、Stre
ptosporangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、
Nocardioides属、Pseudonocardia属、Actinobispora
属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Sacc
harothrix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、Mi
crobispora属、Microtetraspora属、Thermomonospora
属、またはMicromonospora属に属する微生物である、上
記（１）記載の方法。
【００１１】（３） Streptomyces属に属する微生物が
Streptomyces avermitilisから選ばれる微生物である、
上記（２）記載の方法。（４） 放線菌由来の標識化ポ
リヌクレオチド、放線菌の変異株由来の標識化ポリヌク
レオチドまたは被検標識化ポリヌクレオチドが、アミノ
酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物質、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の生合成に関
わる遺伝子である上記（１）記載の方法。 （５） 被検ポリヌクレオチドが、Escherichia coli由
来の被検ポリヌクレオチドである、上記（１）記載の方
法。
【００１２】（６） 配列番号1〜7551のいずれかに示
される塩基配列からなる第１のポリヌクレオチド類、該
第１のポリヌクレオチド類とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする第２のポリヌクレオチド類、また
は第１または第２のポリヌクレオチド類の連続する少な
くとも10〜200塩基配列からなる第３のポリヌクレオチ
ド類からなる群の中から選ばれる２種類以上のポリヌク
レオチドを、固体支持体に固着したポリヌクレオチドア
レイ。
【００１３】ここで、２種類以上のポリヌクレオチド
は、例えば、第１のポリヌクレオチド類から選ばれる２
種類以上、第２のポリヌクレオチド類から選ばれる２種
類以上、第３のポリヌクレオチド類から選ばれる２種類
以上、第１、第２および第３のポリヌクレオチド類を組
合わせて選ばれる２種類以上のいずれでもよい。
【００１４】（７） 配列番号1〜7551のいずれかに示
される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリ
ヌクレオチドと80％以上の相同性を有するポリヌクレオ
チド。 （８） 配列番号2〜7551のいずれかに示される塩基配
列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド。 （９） 配列番号7552〜15101のいずれかに示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドまたは該ポリヌクレチドとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００１５】（１０） 配列番号2〜7551に示される塩
基配列を有するポリヌクレオチドにおいて、タンパク質
をコードするポリヌクレオチドの５'上流または３'下流
に位置し、該ポリヌクレオチドの発現を調節する活性を
有するポリヌクレオチド。 （１１） 上記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドが有する塩基配列中の連続する少な
くとも10〜200塩基からなる配列を有するポリヌクレオ
チドまたは該ポリヌクレオチドと相補的な配列を有する
ポリヌクレオチド。
【００１６】（１２） 上記（８）〜（１１）のいずれ
か１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換え体DNA。 （１３） 上記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドまたは上記（１２）記載の組換え体
DNAを含む形質転換体。 （１４） 上記（１３）記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物中に上記（８）または（９）に記載のポリヌ
クレオチドにコードされるポリペプチドを生成蓄積さ
せ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴
とする該ポリペプチドの製造方法。
【００１７】（１５） 上記（１３）記載の形質転換体
を培地に培養し、培養物中に抗生物質を含む生物活性物
質およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種を
生成蓄積させ、該培養物から抗生物質を含む生物活性物
質およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種を
採取することを特徴とする抗生物質を含む生物活性物
質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
の製造法。
【００１８】（１６） 配列番号2〜7551から選ばれる
塩基配列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリ
ペプチド。 （１７）配列番号7552〜15101から選ばれるアミノ酸配
列を有するポリペプチド。 （１８） 上記（１６）または（１７）記載のポリペプ
チドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠
失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加
されていない該ポリペプチドの有する活性と実質的に同
一の活性を有するポリペプチド。
【００１９】（１９） 上記（１６）または（１７）記
載のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を
有するアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドの有す
る活性と実質的に同一の活性を有するポリペプチド。 （２０） 上記（１６）〜（１９）のいずれか1項に記
載のポリペプチドを認識する抗体。
【００２０】（２１） 上記（１６）〜（１９）に記載
のポリペプチドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペ
プチドから選ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペ
プチドを１種類以上、個体支持体に固着したポリペプチ
ドアレイ。 （２２） 上記（１６）〜（１９）に記載のポリペプチ
ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを認識
する抗体を１種類以上、個体支持体に固着したポリペプ
チドアレイ。
【００２１】（２３） 放線菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の手
段を備えることを特徴とするコンピュータを用いたシス
テム； (i)配列番号1〜7551から選ばれる1以上の塩基配列情
報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
するための入力手段、(ii)入力された情報を少なくとも
一時的に記録するためのデータ記録手段、(iii)該デー
タ記録手段により記録された、配列番号1〜7551から選
ばれる１以上の塩基配列情報と標的配列または標的構造
モチーフ情報とを比較し、標的配列または標的構造モチ
ーフ情報と一致または類似する塩基配列情報を検索また
は解析するコンパレータ手段、および(iv)該コンパレー
タ手段により得られた検索または解析結果を表示するた
めの出力手段。
【００２２】（２４） 放線菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工
程を含むことを特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号1〜7551から選ばれる1以上の塩基配列情
報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
する工程、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に記
録する工程、(iii)配列番号1〜7551から選ばれる１以上
の塩基配列情報と標的配列または標的構造モチーフ情報
とを比較する工程、および(iv)標的配列または標的構造
モチーフ情報と一致または類似する塩基配列情報を検索
または解析する工程。
【００２３】（２５） 放線菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の手
段を備えることを特徴とするコンピュータを用いたシス
テム； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
を入力するための入力手段、(ii)入力された情報を少な
くとも一時的に記録するためのデータ記録手段、(iii)
該データ記録手段により記録された、配列番号7552〜15
101から選ばれる１以上のアミノ酸配列情報と標的配列
または標的構造モチーフ情報とを比較し、標的配列また
は標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミノ酸
配列情報を検索または解析するコンパレータ手段、およ
び(iv)該コンパレータ手段により得られた検索または解
析結果を表示するための出力手段。
【００２４】（２６） 放線菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工
程を含有することを特徴とするコンピュータを用いた方
法； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
を入力するための入力する工程、(ii)入力された情報を
少なくとも一時的に記録する工程、(iii)該データ記録
手段により記録された、配列番号7552〜15101から選ば
れる１以上のアミノ酸配列情報と標的配列または標的構
造モチーフ情報とを比較する工程、および(iv)標的配列
または標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミ
ノ酸配列情報を検索または解析する工程。
【００２５】（２７） 放線菌由来の標的塩基配列を有
するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの機
能を決定するための、下記(i)〜(iv)の手段を備えるこ
とを特徴とするコンピュータを用いたシステム； (i)配列番号2〜7551から選ばれる１以上の塩基配列情報
および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
報、並びに標的塩基配列情報を入力するための入力手
段、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する
ためのデータ記録手段、(iii)該データ記録手段により
記録された、配列番号2〜7551から選ばれる1以上の塩基
配列情報と標的塩基配列情報とを比較し、配列番号2〜7
551から選ばれる1以上の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドと一致または類似する標的塩基配列を有するポリヌ
クレオチドがコードするポリペプチドの機能を決定する
コンパレータ手段、および(iv)該コンパレータ手段によ
り得られた機能を表示するための出力手段。
【００２６】（２８） 放線菌由来の標的塩基配列を有
するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの機
能を決定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含むこと
を特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号2〜7551から選ばれる１以上の塩基配列情報
および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
報、並びに標的塩基配列情報を入力する工程、(ii)入力
された情報を少なくとも一時的に記録する工程、(iii)
該データ記録手段により記録された、配列番号1の塩基
配列情報と標的塩基配列情報とを比較する工程、(iv)配
列番号2〜7551から選ばれる１以上の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドと一致または類似する標的塩基配列を
有するポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機
能を決定する工程。
【００２７】（２９） 放線菌由来の標的アミノ酸配列
を有するポリペプチドの機能を決定するための、下記
(i)〜(iv)の手段を備えることを特徴とするコンピュー
タを用いたシステム； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる1以上のアミノ酸
配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
ミノ酸配列情報を入力するための入力手段、(ii)入力さ
れた情報を少なくとも一時的に記録するためのデータ記
録手段、(iii)該データ記録手段により記録された、配
列番号7552〜15101から選ばれる1以上のアミノ酸配列情
報と標的アミノ酸配列情報とを比較し、配列番号7552〜
15101から選ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドと一致または類似する標的アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの機能を決定するコンパレータ手段、およ
び(iv)該コンパレータ手段により得られた機能を表示す
るための出力手段。
【００２８】（３０） 放線菌由来の標的アミノ酸配列
を有するポリペプチドの機能を決定するための、下記
(i)〜(iv)の工程を含むコンピュータを用いた方法； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
ミノ酸配列情報を入力する工程、(ii)入力された情報を
少なくとも一時的に記録する工程、(iii)該データ記録
手段により記録された、配列番号7552〜15101から選ば
れる1以上のアミノ酸配列情報と標的アミノ酸配列情報
とを比較する工程、および(iv)配列番号7552〜15101か
ら選ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド
と一致または類似する標的アミノ酸配列を有するポリペ
プチドの機能を決定する工程。
【００２９】（３１） 放線菌が、Streptomyces属、St
reptosporangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes
属、Nocardioides属、Pseudonocardia属、Actinobispor
a属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Sac
charothrix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、M
icrobispora属、Microtetraspora属、Thermomonospora
属、またはMicromonospora属する微生物である、上記
（２３）、（２５）、（２７）および（２９）のいずれ
か１項に記載のシステム。
【００３０】（３２） 放線菌が、Streptomyces属、St
reptosporangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes
属、Nocardioides属、Pseudonocardia属、Actinobispor
a属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Sac
charothrix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、M
icrobispora属、Microtetraspora属、Thermomonospora
属、またはMicromonospora属に属する微生物である、上
記（２４）、（２６）、（２８）および（３０）のいず
れか１項に記載の方法。
【００３１】（３３） Streptomyces属に属する微生物
がStreptomyces avermitilisから選ばれる微生物であ
る、上記（３１）記載のシステム。 （３４） Streptomyces属に属する微生物がStreptomyc
es avermitilisから選ばれる微生物である、上記（３
２）記載の方法。
【００３２】（３５） 配列番号1の塩基配列情報また
は該配列に基づく機能情報を記録したコンピューターで
読み取り可能な記録媒体であって、上記（２３）または
（２７）記載のシステムまたは上記（２４）または（２
８）記載の方法に用いることのできる記録媒体または記
憶装置。 （３６） 配列番号7552〜15101から選ばれる1以上のア
ミノ酸配列情報または該配列に基づく機能情報を記録し
たコンピューターで読み取り可能な記録媒体であって、
上記（２５）または（２９）記載のシステムまたは上記
（２６）または（３０）記載の方法に用いることのでき
る記録媒体または記憶装置。
【００３３】（３７） コンピューターで読み取り可能
な媒体が、フロッピーディスク、ハードディスク、磁気
テープ、ランダムアクセスメモリ(RAM)、読み出し専用
メモリ(ROM)、磁気光学ディスク(MO)、CD-ROM、CD-R、C
D-RW、DVD-ROM、DVD-RAMおよびDVD-RWからなる群から選
ばれる上記（３５）または（３６）記載のコンピュータ
ーで読み取り可能な記録媒体または記憶装置。
【００３４】（３８） 配列番号1に示される塩基配列
情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有する放線菌の
育種方法； (i) アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物
質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
の化合物を発酵法により生産できるように変異育種され
た、放線菌由来の生産菌株のゲノムまたは遺伝子の塩基
配列と、配列番号1と対応する塩基配列とを比較する工
程、(ii)(i)で得られた比較の結果より、上記生産菌株
に存在する変異点を同定する工程、(iii)(ii)の工程で
同定した変異点を、該変異を有しない放線菌に導入する
工程、および(iv)(iii)の工程で得られた放線菌の、(i)
で選ばれた化合物の発酵法による生産性を調べる工程。
【００３５】（３９） 遺伝子が、生合成経路あるいは
シグナル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、
上記（３８）記載の育種方法。 （４０） 変異点が生産性を向上または安定化させる有
効変異に関わる変異点である、上記（３８）記載の育種
方法。
【００３６】（４１） 配列番号1に示される塩基配列
情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有する放線菌の
育種方法； (i)抗生物質を含む生物活性物質、およびそれらの類縁
体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発酵法により
生産できるように変異育種された、放線菌由来の生産菌
株のゲノムまたは遺伝子の塩基配列と、配列番号1と対
応する塩基配列とを比較する工程、(ii)(i)で得られた
比較の結果より、上記生産菌株に存在する変異点を同定
する工程、(iii)(ii)の工程で同定した変異点を、該変
異を有する放線菌から除去する工程、および(iv)(iii)
の工程で得られた放線菌の、(i)で選ばれた化合物の発
酵法による生産性を調べる工程。
【００３７】（４２） 遺伝子が、生合成経路あるいは
シグナル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、
上記（４１）記載の育種方法。 （４３） 変異点が、生産性を低下あるいは不安定にさ
せる変異に関わる変異点である、上記（４１）記載の育
種方法。
【００３８】（４４） 配列番号2〜7551に示される塩
基配列情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有する放
線菌の育種方法； (i) アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物
質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
の化合物の生合成に関与するアイソザイムを配列番号2
〜7551に示される塩基配列情報に基づき同定する工程、
(ii)（i）の工程で同定したアイソザイムを同じ活性を
有するアイソザイムに分類する工程、(iii)同じ活性を
有するアイソザイムコードしている全ての遺伝子を一括
して変異させる工程、および(iv)(iii)の工程で得られ
た遺伝子を用いて形質転換した放線菌の、(i)で選ばれ
た化合物の発酵法による生産性を調べる工程。
【００３９】（４５） 配列番号2〜7551に示される塩
基配列情報を用いた、下記(i)〜(v)の工程を有する放線
菌の育種方法； (i)配列番号2〜7551に示されるオープンリーディングフ
レーム（ORF）の機能情報を整理する工程(ii)公知の生
合成経路あるいはシグナル伝達経路上の酵素に、該整理
されたORFを対応させる工程(iii)放線菌において知られ
ている生合成経路あるいはシグナル伝達経路に関する情
報と組み合わせ、不明であった放線菌における生合成経
路およびシグナル伝達経路を解明する工程、(iv)(iii)
の工程で解明された経路と所望の有用生産物の生合成経
路とを比較する工程、および(v)(iv)の工程で所望の有
用生産物の生合成に重要と判断される経路を強化するた
めに、または(iv)の工程で所望の有用生産物の生合成に
は重要ではない経路を弱めるために、配列番号2〜7551
に示される塩基配列情報に基づき遺伝子工学的手法によ
り放線菌を変異させる工程。
【００４０】（４６） 上記（３８）〜（４５）のいず
れか１項に記載の育種方法により得られる放線菌。 （４７） 放線菌が、Streptomyces属、Streptosporang
ium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、Nocardioid
es属、Pseudonocardia属、Actinobispora属、Saccharom
onospora属、Saccharopolyspora属、Saccharothrix属、
Actinopolyspora属、Actinomadura属、Microbispora
属、Microtetraspora属、Thermomonospora属、またはMi
cromonospora属に属する微生物である、上記（４６）記
載の放線菌。 （４８） Streptomyves属に属する微生物がStreptomyc
es avermitilisから選ばれる微生物である、上記（４
７）項記載の放線菌。
【００４１】（４９） 上記（４６）〜（４８）のいず
れか１項に記載の放線菌を培地に培養し、アミノ酸、核
酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物質、およびそれらの
類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を生成蓄積
させ、該培養物から該化合物を採取することを特徴とす
る該化合物の製造法。 （５０） 化合物がポリケチドである上記（４９）記載
の製造方法。
【００４２】（５１） プロテオーム解析に基づく、下
記(i)〜（vi）工程を有する有用変異に関わる蛋白質の
同定方法； (i) アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物
質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
の化合物を発酵法により生産できるように変異育種され
た、放線菌由来の生産菌株および該生産菌株の親株の菌
体よりそれぞれ菌体由来の蛋白質を調製する工程、(ii)
(i)の工程で調製した蛋白質を２次元電気泳動法により
分離する工程、(iii)分離された蛋白質を検出し、生産
菌株由来の蛋白質と親株由来の蛋白質の各発現量を比較
する工程、(iv)比較の結果、異なる発現量を示す蛋白質
をペプチダーゼで処理し、ペプチド断片を抽出する工
程、(v)(iv)の工程で得られたペプチド断片のアミノ酸
配列を解析する工程、および(vi)(v)の工程で得られた
アミノ酸配列と配列番号7552〜15101に記載のアミノ酸
配列とを比較し、該アミノ酸配列を有する蛋白質を同定
する工程。ここで、プロテオーム(proteome)とは、蛋白
質(protein)とゲノム(genome)からなる造語で、遺伝子
の発現をポリペプチドのレベルで調べる方法である。
【００４３】（５２） 放線菌が、Streptomyces属、St
reptosporangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes
属、Nocardioides属、Pseudonocardia属、Actinobispor
a属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Sac
charothrix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、M
icrobispora属、Microtetraspora属、Thermomonospora
属、またはMicromonospora属に属する微生物である、上
記（５１）記載の同定方法。 （５３） Streptomyces属に属する微生物がStreptomyc
es avermitilisから選ばれる微生物である、上記（５
２）項記載の同定方法。
【００４４】
【発明の実施の形態】以下、放線菌の全塩基配列決定に
基づいて、本発明を詳細に説明する。 １．放線菌の全塩基配列決定 本発明でいう放線菌とは、Bergeys Manual of Determin
ative Bacteriology,8, 599 (1974)に定義される、Stre
ptomyces属、Streptosporangium属、Amycolatopsis属、
Actinoplanes属、Nocardioides属、Pseudonocardia属、
Actinobispora属、Saccharomonospora属、Saccharopoly
spora属、Saccharothrix属、Actinopolyspora属、Actin
omadura属、Microbispora属、Microtetraspora属、Ther
momonospora属、またはMicromonospora属に属する微生
物をいう。
【００４５】具体的には、Streptomyces avermitilis、
Streptomyces griseus、Streptomyces hygroscopicus等
をあげることができる。より具体的には、Streptomyces
avermitilis ATCC31267をあげることができる。
【００４６】（１）放線菌のゲノムDNAの調製 放線菌を通常の方法により培養する。培地として、該微
生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有
し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然
培地、合成培地のいずれも用いることができる。例え
ば、Streptomyces avermitilisでは、該培地として、TS
B培地（17g/l ペプトン、3g/l 大豆ペプトン、5g/l 塩
化ナトリウム、2.5g/l ブドウ糖、2.5g/lリン酸一水素
カリウム、pH7.3）等をあげることができる。培養方法
としては、25〜35℃で終夜培養する。
【００４７】培養後、培養液より、遠心分離により菌体
を回収する。得られた菌体を洗浄液で洗浄する。該洗浄
液として、例えば、STEバッファー〔10.3% ショ糖、25m
mol/l Tris-塩酸、25mmol/l エチレンジアミン四酢酸
(以下、EDTAと略記)、pH8.0〕等をあげることができる。
該洗浄菌体からゲノムDNAの取得は、菌体をアガロース
に包埋した後、リゾチームおよび界面活性剤であるSDS
やサルコシル等を用いて該菌体の細胞壁を溶解後、蛋白
質をプロテイナーゼＫで分解する。さらに線状プラスミ
ドを除去するためにゲノムDNAを含むアガロースゲルブ
ロックをfield-inversion電気泳動を行う。具体的には
以下の方法を例示することができる。
【００４８】5mlの培養液から得た洗浄菌体を、2.5mlの
STEバッファーに懸濁し、2.5mlの1.5% パルスフィール
ド電気泳動サンプル調製用低融点アガロース（InCert a
garose、宝酒造社製)と混合し、80mm直径のシャーレに
流し込み、室温30分以上放置して固化させる。1〜5mg/m
lのリゾチームを含むSTEバッファーを20ml加え、30℃で
6〜20時間保温し細胞壁を消化する。STEバッファーを除
去し、TEバッファー（10mmol/l Tris塩酸塩、1mmol/l E
DTA、pH8.0）で洗浄し、1mg/mlのプロテイナーゼＫを含
む10mlの溶解緩衝液（0.5mol/l EDTA、pH9.5、1% サル
コシル）を加え、50℃で24時間穏やかに振盪し溶解す
る。溶解後、緩衝液を除去し、50mmol/l EDTA、pH8.0溶
液20mlで数回洗浄する。さらに1mM PMSFを含む50mmol/l
EDTA、pH8.0溶液を20ml加え、残存するプロテイナーゼ
Ｋを不活化させる。
【００４９】ゲノムDNAを含むアガロースゲルを5 × 5
mmのブロックに切り出し、1% アガロースゲル(45mmol/l
Trisホウ酸、1mmol/l EDTA、0.1mmol/l チオ尿素、pH
8.3)の試料溝に入れ、電気泳動緩衝液を満たし、正方向
3秒、逆方向1秒のパルス設定で120ボルト1晩、泳動を行
う。泳動終了後、アガロースブロックを取り出し、50mm
ol/l EDTA、pH8.0溶液で洗浄する。洗浄したアガロース
ブロックを65℃に保温し溶解させる。5〜10mlのTris中
和フェノールを加え、室温で5分間緩やかに振とうし、
さらに5〜10mlのクロロホルムを加え5分間緩やかに振と
うする。
【００５０】振とう後、遠心分離（10,000 × g、10分
間、20℃）を行い、水層を分取する。水層を10〜20mlの
フェノール/クロロホルム抽出（２回）を行った後、水
層に1/10量の3mol/l酢酸ナトリウム溶液、0.56倍量のイ
ソプロパノールを加え、緩やかに混和し、ゲノムDNAを
沈殿させる。生じたゲノムDNA沈殿を70%エタノールで洗
浄した後、風乾し、TEバッファーに溶解することによ
り、ゲノムDNA溶液を取得することができる。
【００５１】（２）ショットガンライブラリーの作製 上記（１）で調製した放線菌のゲノムDNAを用いてゲノ
ムDNAライブラリーを作製する方法としては、Molecular
Cloninng, A laboratory Manual,Second Edition (198
9)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）
に記載の方法を用いることができるが、特にショットガ
ン法による全塩基配列の決定に用いるのに適したゲノム
DNAライブラリーの作製法としては、以下に記載の方法
を例示する事ができる。
【００５２】上記（１）で調製した放線菌のゲノムDNA
0.1mgを、全量0.4mlになるように、TEバッファー等の緩
衝液を加え、ハイドロシェア（GeneMachines社製）を用
い、1〜2kbの断片に分断する。ハイドロシェアの処理条
件としては、出力6で20回処理する条件をあげることが
できる。得られたゲノムDNA断片はSizeSep400 Span Col
umn(SeparoseCL4B、Amasham社製)を通過させ、500 bp以
下の断片を除去する。500 bp以下の断片を除去したDNA
断片の末端を、DNAブランティングキット (DNAblunting
kit、宝酒造社製)等を用いて平滑化する。
【００５３】該DNA溶出液をフェノール/クロロホルム処
理後、エタノール沈殿しゲノムライブラリーインサート
を取得する。該インサートを、T4 DNAリガーゼ (T4 DNA
ligase、宝酒造社製)等を用いて、適当なベクター、例
えばpUC118 HincII/BAP(宝酒造社製)等にライゲーショ
ンする。ライゲーション条件としては、10〜20℃で、20
〜50時間放置する条件をあげることができる。
【００５４】得られたライゲーション反応物をエタノー
ル沈殿し、5〜20μlのTEバッファーに溶解する。該ライ
ゲーション溶液 0.5〜2μlを用いて、常法に従い大腸菌
を形質転換する。該形質転換の方法としては、大腸菌DH
5αを用いたエレクトロポレーション法を例示すること
ができる。エレクトロポレーションは、10〜25 kV/cmの
条件で行うことができる。
【００５５】形質転換した大腸菌を、寒天を含有する適
当な選択培地、例えばクローニングベクターにpUC118を
用いた場合は、10〜100mg/lのアンピシリンを含むＬＢ
平板培地〔寒天を1.5%含むLB培地（10g/l バクトトリプ
トン、5g/l 酵母エキス、10g/l 塩化ナトリウム、pH7.
0）〕に塗布し、培養する。形質転換体は、該平板培地
上に形成されるコロニーとして取得することができる。
このとき、該平板培地にX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-
インドイル-β-D-ガラクトピラノシド）およびIPTG（イ
ソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を添加して
おくことで、ゲノムDNAを含有する組換え体DNAを保有す
る形質転換株を白色コロニーとして選択することが可能
である。
【００５６】該形質転換体は、0.1mg/ml アンピシリン
を含むＬＢ培地を0.05mlずつ添加した96穴タイタープレ
ート中で静置培養する。該培養により得られた培養液は
下記（４）の実験に用いることができる。また該培養液
に50%グリセロールを0.05mlずつ添加、混合することに
より、該培養液を-80℃で保存することが可能で、要時
に用いることができる。
【００５７】（３）コスミドライブラリーの作成 上記（１）で調製した放線菌のゲノムDNA 0.1mgを、制
限酵素、例えばMboI等で部分消化し、低融点アガロース
ゲルを用いたfield-inversion電気泳動を行う。泳動
後、約40 kbのDNA断片を多く含むアガロースゲル画分を
集め、該アガロースゲルを65℃で溶解する。溶解液を順
次、フェノール処理、クロロホルムで処理した後、水層
を分取しエタノール沈殿する。
【００５８】得られたDNA断片を、該断片と連結可能な
付着末端を有するコスミドベクターに連結する。例え
ば、ゲノムDNAをMboIを用いて部分消化した場合には、
該部分消化物をpKU402〔Actonomycetol、 8, 21-25 (199
4)〕のBamHI部位に連結することができる。得られた連
結産物は、モレキュラー・クローニング第２版記載の方
法等の方法に準じて、パッケージング エキストラクト
等を用いてパッケージング後、大腸菌の形質転換に用い
ることができる。具体的には、市販のパッケージング
エキストラクトであるReady-To-Go Lambda Packaging K
it（Amasham社製）等を用いて、添付実験手順書に従
い、パッケージングし、大腸菌XL-1-BlueMR（Stratagen
e社製）株等に導入することができる。
【００５９】形質転換した大腸菌は、アンピシリンを含
むＬＢ平板培地に塗布し、培養する。形質転換体は、該
平板培地上に形成されるコロニーとして取得することが
できる。該形質転換体を、アンピシリン0.1mg/mlを含む
ＬＢ培地0.05mlを添加した96穴タイタープレート中で静
置培養する。培養により得られた培養液は、下記（４）
の実験に用いることができる。該培養液に50%グリセロー
ルを含むＬＢ培地を0.05mlずつ添加、混合することによ
り、該培養液を-80℃で保存することが可能で、要時に用
いることができる。
【００６０】（４）塩基配列の決定 （４〜１）鋳型の調製 放線菌ゲノムDNAの全塩基配列は、全ゲノムショットガ
ン法〔Science, 269, 496-512 (1995)〕を基本として決
定することができる。全ゲノムショットガン法で用いる
鋳型としては、上記（２）で調製したライブラリーを用
い、PCRにより調製することができる〔DNA Research,
5, 1-9 (1998)〕。
【００６１】具体的には、以下の方法で鋳型を調製する
ことができる。アンピシリン0.1mg/mlを含むＬＢ培地を
ウェルあたり0.08mlずつ分注した96穴タイタープレート
の各ウェルに全ゲノムショットガンライブラリー由来ク
ローンをレプリケーター（GENETIX社製）で植菌し、30
℃で終夜静置培養を行う。該培養液を、滅菌水で40倍に
希釈し、その5μlを100μg/mlのM13 forward（GTGCTGCA
AGGCGATTAAGTTGG）（配列番号15104）およびreverseプ
ライマー（TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGA）（配列番号1510
5）、Ex Taq緩衝液（宝酒造社製）、5mmol/ldATP, dGT
P, dCTP, dTTP、0.25U TaKaRa Ex Taq（宝酒造社製）を
含む溶液5μlと混合し、Biometra（Biotron社製）を用
い、96℃ 5分、引き続きて96℃15秒70℃60秒のサイクル
を20〜40回行い、挿入断片の増幅を行う。なお増幅反応
には96穴リアクションプレート（PE Biosystems社製）
等を用いることができる。
【００６２】PCR産物精製用キット（Amersham Pharmaci
a Biotech社製）により余剰プライマーおよびヌクレオ
チドの除去を行い、これをシーケンス反応の鋳型として
用いる。一部の塩基配列決定は2本鎖DNAプラスミドを鋳
型にして行うことができる。鋳型として用いる2本鎖DNA
プラスミドは以下の方法で取得することができる。アン
ピシリン0.1mg/mlを含むTSB培地（17g/l ペプトン、3g/
l 大豆ペプトン、5g/l塩化ナトリウム、2.5g/l ブドウ
糖、2.5g/l リン酸一水素カリウム、pH7.3）を1 mlずつ
分注した96穴プレートの各ウェルに、全ゲノムショット
ガンライブラリー由来クローンを植菌し、30℃で終夜振
とう培養を行う。該培養液より、プラスミド自動調製機
KURABO PI-50（倉敷紡績社製）、マルチスクリーン(Mil
lipore社製)等を用い、倉敷紡績社もしくはMillipore社
のプロトコールに従って、2本鎖DNAプラスミドを調製す
ることができる。得られた精製2本鎖DNAプラスミドを0.
1mg/ml程度になるように水に溶解し、シーケンシングの
鋳型として用いることができる。
【００６３】（４〜２）シーケンス反応 シーケンス反応は、市販のシーケンスキット等を用いて
行うことができ、具体的には以下に記載する方法を例示
することができる。ABI PRISM BigDye Terminator Cycl
e Sequencing Ready Reaction Kit（PE Biosystems社
製）溶液6μlに対し、M13順方向プライマー(M13-21)又
はM13逆方向プライマー(M13REV)〔DNA Research, 5, 1-
9 (1998)〕を各々1〜2pmol、および上記（４〜１）で調
製した鋳型（PCR産物又はプラスミド）50〜200ngを混ぜ
10μlのシーケンス反応液を調製する。
【００６４】該反応液を用い、Biometra（Biotron社
製）等を用い、35〜55サイクルのダイターミネーターシ
ーケンス反応を行う。サイクルパラメーターは市販のキ
ット、例えばABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequ
encing Ready Reaction Kit等に付属するマニュアルに
従って行うことができる。サンプルの精製は、MultiScr
een HV plate（Millipore社製）等の市販の製品を用
い、市販の製品に付属のマニュアルに従ってSephadex G
50（ファルマシア社製）などを用いて行うことができ
る。
【００６５】精製した反応物は直接分析に用いる。該反
応物は-20℃の暗所で保存でき、要時に用いることがで
きる。該反応物は、市販のシーケンサーおよびアナライ
ザーを用い、付属のマニュアルに従って分析することが
できる。市販のシーケンサーとしては、ABI 3700 DNA S
equencer（PE Biosystems社製）、MegaBace 1000 Seque
ncer（Amasham社製）等をあげることができる。アナラ
イザーとしては、ABI PRISM 3700 DNA Analyser（PE Bi
osystems社製）等をあげることができる。
【００６６】（５）アセンブリ 上記（４）で得られた配列情報の解析に用いるベースコ
ールにはphred(The University of Washington)等のソ
フトウェアを用いることができる。ベクター配列情報を
除去するには、Cross Match(The University of Washin
gton)、SPS Cross Match(Southwest Parallel Software
社製)等のソフトウェアを用いることができる。アセン
ブリにはphrap(The University of Washington)、SPS p
hrap(SouthwestParallel Software社製)等のソフトウェ
アを用いることができる。
【００６７】上記解析および結果の出力作業には、ＵＮ
ＩＸ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Maci
ntosh等のコンピューターを用いることができる。アセ
ンブリの結果得られるコンティグは、グラフィカルエデ
ィターconsed(The University of Washington)等を用い
て解析することができる。ベースコールからアセンブリ
までの一連の作業をconsedに付属するパール・スクリプ
トphredPhrapを利用して一括して行うこともできる。本
発明で、ソフトウェアはコンパレータ（比較器）とも記
載する。
【００６８】（６）ギャップ部分の塩基配列決定 上記（３）で構築したコスミドライブラリー中の各コス
ミドを（４〜１）に記載した2本鎖DNAプラスミド調製と
同様な方法で調製する。このコスミドの挿入断片末端部
の塩基配列を、ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Se
quencing ReadyReaction Kit（PE Biosystems社製)等の
市販のキットを用い、付属するマニュアルに従って決定
する。コスミド約4,000クローンの挿入断片の両末端の
シーケンシングを行い、その配列と一致する（５）で得
られたショットガンシーケンシング由来コンティグ中の
塩基配列を検索する。該作業により各コスミドクローン
と各コンティグの連鎖関係を解明し、相互整列化を行
う。
【００６９】また、コンティグではカバーされない領域
（ギャップ部）の配列は、以下の方法で決定する。コン
ティグの末端に位置する配列を含むクローンを選抜す
る。これらの中から、挿入断片の片側の末端のみの配列
しか決定されていないクローンを選抜し、挿入断片の逆
末端の配列を決定する。2つのコンティグに、挿入断片
のそれぞれの末端の配列が含まれるような全ゲノム由来
ショットガンライブラリークローンまたはコスミドクロ
ーンを同定し、該クローンの挿入断片の全塩基配列を決
定する。該方法により、このギャップ部分の塩基配列を
決定することができる。ギャップ部分をカバーするショ
ットガンライブラリークローンもしくはコスミドクロー
ンがない場合には、そのコンティグ末端の配列に相補す
るプライマーを作成し、PCRによってギャップ領域のDNA
断片を増幅する。該増幅DNA断片を鋳型として用いたプ
ライマーウォーキング法により、もしくは該増幅DNA断
片から調製したショットガンクローンの配列を決定する
ショットガン法によりシーケンシングを行い、該領域の
塩基配列を決定することができる。
【００７０】配列精度の低い領域については、consed(T
he University of Washington)のAUTOFINISH機能とNAVI
GATING機能を利用してプライマーを合成し、プライマー
ウォーキング法により配列決定を行い配列精度を高める
ことができる。このようにして決定される全ゲノムの塩
基配列として、例えば、配列番号1に示される、Strepto
myces avermitilis ATCC31267株ゲノムの全塩基配列を
あげることができる。
【００７１】（７）配列番号1で表される塩基配列を利
用した微生物ゲノムDNAの塩基配列の決定 上記で決定された、配列番号1記載のStreptomyces aver
mitilis ATCC31267株ゲノムの全塩基配列と80%以上の相
同性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号1
で表される塩基配列を利用して決定することができ、本
発明の配列番号1で表される塩基配列と80%以上の相同性
を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドも本発明の
ポリヌクレオチドである。本発明の配列番号1で表され
る塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列を有す
るポリヌクレオチドとは、配列番号1で表される塩基配
列において、連続した5〜50塩基からなるオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いて、例えば染色体DNAを
鋳型としたPCR法を利用して、その染色体DNAの全塩基配
列を決定できるポリヌクレオチドである。
【００７２】全塩基配列を決定する上で特に好ましいプ
ライマーとしては、互いに300〜500bp程度離れて位置す
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、該オリ
ゴヌクレオチドの中でも主要代謝経路に関わる蛋白質を
コードするDNAから選ばれる塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドは特に好ましい。該オリゴヌクレオチドを用
いて染色体DNAの全塩基配列を決定できるポリヌクレオ
チドとしては、例えば放線菌に属する微生物由来の染色
体DNAを構成するポリヌクレオチドをあげることがで
き、好ましくはStreptomyces属に属する微生物由来の染
色体DNAを構成するポリヌクレオチド、より好ましく
は、Streptomyces avermitilisの染色体DNAを構成する
ポリヌクレオチドをあげることができる。
【００７３】２．全ゲノム塩基配列情報を利用したオー
プンリーディングフレーム〔open reading frame（転写
解読枠）；以下、ORFと略記する〕および発現調節断片
の同定並びにORFの機能推定 上記１．により決定された、放線菌由来のゲノムの全塩
基配列情報により、ORFおよび発現調節断片を同定する
ことが可能であり、更に、同定されたORFの機能を推定
することが可能である。ORFとは、mRNAの塩基配列のう
ち、アミノ酸配列として翻訳され、蛋白質となりうる連
続した領域であり、mRNAのORFをコードする、DNA上の領
域も、ORFと呼ばれる。
【００７４】発現調節断片（expression modulating fr
agment、以下EMFと略記する）とは、作動可能に連結さ
れたORFまたはその他の配列の発現を調節する一連のポ
リヌクレオチド断片を意味する。「作動可能に連結され
た配列の発現を調節する」とは、EMFの存在により配列
の発現が変化することを意味する。EMFとしては、プロ
モーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサ
ー、リボソーム結合配列、転写終結配列等をあげること
ができる。放線菌の場合、EMFは通常、遺伝子間セグメ
ント（2つの遺伝子の間にある断片；長さ約10から200ヌ
クレオチド）に存在する。即ち、長さ10ヌクレオチド以
上の遺伝子間セグメントには、EMFが存在する場合が多
い。EMFはまた公知のEMFの配列を標的配列、標的構造モ
チーフ（または標的モチーフ）に用いて、ＦＡＳＴＡ
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-48 (198
8)〕、ＢＬＡＳＴ〔J. Mol. Biol., 215, 403-410 (199
0)〕等の適当なソフトウェアまたはコンパレータにより
推定することが可能である。または公知のEMF捕獲ベク
ター（例えば、pKK232-8； Amersham Pharmacia Biotec
h社製）により、同定および評価が可能である。
【００７５】「標的配列」とは、6個以上のヌクレオチ
ドの塩基配列あるいは2個以上のアミノ酸配列またはそ
のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。標的配列
は、配列が長くなるほど、データベース中にランダムに
現れる可能性は少なくなる。標的配列のもっとも好まし
い長さは、約10から100個のアミノ酸、または約30から30
0個のヌクレオチド残基である。「標的構造モチーフ」
または「標的モチーフ」とは、任意の合理的に選択され
る配列または配列の組み合わせをいい、当業者に公知の
手段によりポリペプチドの折り畳みに際し形成される3
次元構造に基づいて選択されるもので、種々のモチーフ
が公知である。
【００７６】ポリペプチドの標的モチーフは、例えば酵
素活性部位、蛋白質−蛋白質相互作用部位やシグナル配
列であるが、これらに限定されることはない。核酸の標
的モチーフとしては、プロモーター配列、転写調節因子
結合配列やヘアピン構造等をあげることができる。
【００７７】有用性の高いEMFとしては、例えば高効率
プロモーターや誘導発現プロモーターをあげることがで
きる。これらの取得は、発現が高いことが示されてい
る、あるいは予想される遺伝子（例えばリボソームRNA
遺伝子：GenBankアクセッション番号M16175、Z46753）
や目的の誘導パターンを示す遺伝子（例えば酢酸で誘導
されるイソクエン酸リアーゼ遺伝子：特開平5-56782）
の塩基配列を、上記１．で決定した全ゲノム塩基配列と
アラインメントして位置決定し、その上流部分（通常、
翻訳開始位置から200ないし500ヌクレオチド）のゲノム
断片を単離する事により可能である。また、上記EMF捕
獲ベクターで捕獲したプロモーターの中から高効率のも
のや目的の誘導パターンを示すものを選択することによ
り、有用性の高いEMFを取得できる。
【００７８】ORFの同定は、個々のORFに共通する特徴を
抽出し、それに基づく一般的モデルを構築し、対象配列
とそのモデルとの適合度を測ることにより行うことがで
きる。該同定には、GeneMark〔Nuc. Acids. Res., 22,
4756-67 (1994)：GenePro社製〕、GeneMark.hmm(GenePr
o社製)、GeneHacker〔蛋白質核酸酵素, 42, 3001-07(19
97)〕、Glimmer〔The Institute of Genomic Researc
h；Nuc. Acids. Res. 26, 544-548 (1998)〕等のソフト
ウェアを用いることができる。通常、これらソフトウェ
アを用いた予測には、デフォルト（初期設定）のパラメ
ータを用いるが、必要に応じてパラメータを変更しても
よい。
【００７９】上記予測作業には、UNIX、Windows、Macin
tosh等のコンピューターを用いることができる。該方法
により予測されるORFとして、例えば、配列番号1に示さ
れるStreptomyces avermitilisゲノム中に存在する、配
列番号2〜7551で示される塩基配列を有するORF等をあげ
ることができる。該ORFには配列番号7552〜15101に示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされて
いる。ORFの機能推定は、同定されたORFのアミノ酸配列
をGenBank database、OWL等由来の蛋白質コード領域か
らなるデータベースであるSwiss-Prot、PIR、GenBank-n
r-aa、GenPeptのアミノ酸データベースに対して、相同
性検索ソフトウェアBLAST、FASTA、Smith & Waterman等
を用いた公知のホモローグ配列との相同性検索すること
により行うことができる。
【００８０】また、該相同性検索により、公知の蛋白質
のアミノ酸配列との同一性および類似性も解析できる。
同一性とは、例えば、３つのアミノ酸位置が異なる10ア
ミノ酸長の２つのポリペプチドは、70%の同一性を有す
るとされる。また、互いに異なる３アミノ酸の内の１つ
について、アミノ酸は異なっても類似（例えばロイシン
とイソロイシン）であれば、80%の類似性を有するとさ
れる。このように、本発明の方法によって、放線菌由来
のゲノムの全塩基配列を決定することにより、膨大な数
の放線菌由来の新規遺伝子を同定することができ、更に
該遺伝子の機能の推定が可能となる。放線菌は産業上有
用な微生物であるため、同定された遺伝子の多くは産業
上有用である。また、推定された機能を分類することで
その微生物の特徴が明らかとなり、育種上の貴重な情報
を得ることができる。
【００８１】更に、上記で得られた、放線菌由来のORF
情報より、該微生物より対応するORFを、モレキュラー
・クローニング第２版等に記載の常法により調製し、取
得することができる。即ち、ORFに隣接する塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを合成し、それをプライマー
として、放線菌から得た染色体DNAを鋳型として用い、
通常のPCRクローニング技法によりORFを単離、取得する
ことができる。このようにして取得されるORF配列とし
て、例えば、配列番号2〜7551のいずれかに示される塩
基配列を有するポリヌクレオチドをあげることができ
る。ORFあるいはプライマーは、上記配列情報に基づ
き、ポリヌクレオチド合成機を用いても調製することが
できる。
【００８２】本発明のポリヌクレオチドとしては、上記
で取得されるORFの塩基配列を含むポリヌクレオチドお
よび該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチドをあげることがで
きる。本発明でいうポリヌクレオチドとは、一本鎖およ
び二本鎖DNAならびに一本鎖RNAを含有するが、これらに
限定されるものではない。上記で取得されるORFの塩基
配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするポリヌクレオチドには、該ORF
の縮重変異体が含まれる。縮重変異体とは、塩基配列で
は本発明のORFの配列と異なっているが、遺伝コードの
縮重により同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド断片をいう。
【００８３】具体的な例としては、配列番号1〜7551の
いずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチド等をあげることが
できる。
【００８４】ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドとは、上記で同定されたORFの
塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、
コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイ
ブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリ
ダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌ
クレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプ
ラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルター
を用いて、0.7〜1.0mol/lの塩化ナトリウム存在下、65℃
でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度の
SSC溶液(１倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol/l 塩化ナ
トリウム、15mmol/l クエン酸ナトリウムよりなる）を用
い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定
できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００８５】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
・クローニング第２版、Current Protocols in Molecul
ar Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、
カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイ
オロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques,
A Practical Approach, Second Edition, Oxford Unive
rsity (1995)等に記載されている方法に準じて行うこと
ができる。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとし
て具体的には、FASTA、BLAST、Smith-Waterman〔Meth.
Enzym., 164, 765 (1988)〕等の相同性検索ソフトウェ
アにより、デフォルト（初期設定）のパラメータを用い
て計算したときに、配列番号2〜7551に示される塩基配
列と少なくとも60%以上の相同性を有するDNA、好ましく
は80%以上の相同性を有するDNA、更に好ましくは95%以
上の相同性を有するDNAをあげることができる。
【００８６】また、本発明のポリヌクレオチドとして、
配列番号7552〜15101のいずれかに示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
または該ポリヌクレチドとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチドをあげることがで
きる。
【００８７】更に、本発明のポリヌクレオチドとして、
配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドにおいて、配列番号2〜7551から選ばれる塩基配列を
有するポリヌクレオチドの5'上流または3'下流領域に位
置し、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの
発現を調節する活性を有するポリヌクレオチドをあげる
ことができる。該ポリヌクレオチドがコードするポリペ
プチドの発現を調節する活性を有するポリヌクレオチド
として具体的には、上述したEMF即ち、プロモーター、
オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、リボソー
ム結合配列、転写終結配列等をコードするポリヌクレオ
チドをあげることができる。
【００８８】上記PCRクローニング技法によりORFを取得
する際に用いるプライマーとしては、該ORFおよび隣接
する領域の塩基配列中の連続した10〜200塩基と同じ配
列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオ
チドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをあげ
ることができる。例えば、配列番号1〜7551の何れかに
示された塩基配列中の連続した10〜200塩基と同じ配列
を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチ
ドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをあげる
ことができる。センスプライマーおよびアンチセンスプ
ライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Tm）
および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌ
クレオチドが好ましい。
【００８９】本発明のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号１〜7551の何れかに示された塩基配列中の連続した
10〜200塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドま
たは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリ
ゴヌクレオチドをあげることができる。更に、これらオ
リゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド
誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利
用することができる。
【００９０】該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オ
リゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォ
ロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導
体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN
3'-P5' ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌ
クレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースと
リン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された
オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウ
ラシルがC-5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌ
クレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルが
C-5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチ
ド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC-5プロ
ピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導
体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン
修飾シトシン（phenoxazine-modifiedcytosine)で置換
されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド
中のリボースが2'-O-プロピルリボースで置換されたオ
リゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド
中のリボースが2'-メトキシエトキシリボースで置換さ
れたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる
〔細胞工学, 16, 1463 (1997)〕。
【００９１】本発明の上記オリゴヌクレオチドおよびオ
リゴヌクレオチド誘導体は、プライマー以外にも、後述
のハイブリダイゼーション用プローブ、アンチセンス核
酸としても有用である。アンチセンス核酸として用いる
場合は、上記オリゴヌクレオチドに限らず、本発明のポ
リヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズし、かつ該ポリヌクレオチドがコードするポリペプ
チドの発現を調節する活性を有するポリヌクレオチドな
らば用いることができる。
【００９２】３．アイソザイムの推定 放線菌を用いて有用な生物活性物質が多数生産されてい
る。そのような生物活性物質として、アミノ酸、核酸、
ビタミン、糖、有機酸、抗生物質等を挙げることができ
る。放線菌におけるこれら有用な生物活性物質の生産の
生産効率を向上させるために多数の有用な変異株が取得
されている。しかし、上記微生物においては遺伝子配列
情報の知見が少ないため、主として、ニトロソグアニジ
ン（NTG）等の変異剤による変異操作により有用変異株
が取得されてきた。
【００９３】上記変異剤による変異法では、ランダムに
遺伝子を変異させることができるが、中間物質の代謝に
関わる類似性質を有するアイソザイムをコードする各々
の遺伝子を一括して変異させることは困難である。ま
た、変異剤による変異法では、ランダムに遺伝子が変異
するため、生育遅延や発泡性上昇等の培養特性低下をも
たらす有害な変異も同時に付与される可能性が高い。し
かし、遺伝子配列情報があれば、目的とするアイソザイ
ムをコードする全遺伝子を目的に応じて全て変異させる
ことが可能となり、目的とする遺伝子以外の有害な変異
が導入されることはない。
【００９４】即ち、上記２．で同定されたORF情報によ
り、放線菌中の目的とするアイソザイムの正確な数、配
列情報を取得することが可能であり、該配列情報を利用
し、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の部位
特異的変異導入法等により、目的のアイソザイム遺伝子
全てを、目的の性質を有する遺伝子に変異させ、有用物
質の生産性が向上した有用変異株を取得することができ
る。
【００９５】４．生合成経路、およびシグナル伝達経路
の解明 生合成経路、およびシグナル伝達経路は多数の生物で解
明が試みられており、多くの知見がある。しかし、放線
菌においては、まだ多くの遺伝子が同定されていなかっ
たため、不明な点が数多く存在する。このような不明な
点は下記方法により解明することができる。
【００９６】上記２．の方法により同定された、放線菌
由来のORFの推定機能情報を整理する。ここでいう「整
理」とは、推定された機能情報に従い、各々のORFがど
のような物質の生合成経路、あるいはどのようなシグナ
ル伝達経路に属するかを、公知の情報を利用して分類す
ることをいう。次に、公知の他生物の生合成経路あるい
はシグナル伝達経路上の酵素に、該整理されたORFを対
応させる。放線菌において知られている情報と組み合わ
せ、不明であった放線菌における生合成経路およびシグ
ナル伝達経路を解明することができる。
【００９７】不明あるいは明確でなかった経路を解明す
ることにより、目的とする有用生産物を生産するための
有用変異株を効率よく取得することが可能となる。即
ち、明確となった経路が目的とする有用生産物の生合成
に重要と判断される場合には、該経路を強化した変異株
を取得することにより有用変異株を取得することができ
る。また、明確となった経路が目的とする有用生産物の
生合成には重要ではないと判断される場合には、該経路
の利用頻度を低下させた変異株を取得することにより有
用変異株を取得することができる。
【００９８】５．有効変異点の解明 放線菌において、抗生物質を含む生物活性物質等の有用
生産物の生産に適した有用な変異株が多数取得されてい
るが、どのような変異点を遺伝子に付与すれば生産性を
向上させることが可能かほとんど知られていない。しか
し、放線菌から変異手法によって育種された生産菌株の
ゲノムDNAの所望の配列を、上記１.および２.の方法に
より決定された、放線菌由来の対応するゲノムDNAおよ
びORFの塩基配列と比較解析することによって、生産菌
株が有する変異点を同定することができる。
【００９９】更に、代謝経路や代謝調節機構、酵素の構
造活性相関などに関する既知の情報に基づけば、それら
の変異点の中から生産に寄与している有効変異点を容易
に特定することが可能である。既知の情報により有効変
異の特定が難しい場合には、同定された変異点を放線菌
の野生型株または該変異を有していない生産菌に導入
し、生産にプラスの効果をもたらすか否かで確かめるこ
とができる。
【０１００】６．工業的に有利な生産菌株の育種方法 抗生物質を含む生物活性物質等の目的とする有用生産物
の発酵生産に工業的に用いられている生産菌株は、一般
に、NTGなどの変異剤を用いたランダム変異と選択に基
づく変異育種を重ねることによって造成されている。
【０１０１】変異手法は発酵工業に大きな貢献をもたら
してきたが、染色体の至る所にランダムに多数の変異が
入るという重大な欠点がある。菌株改良の度に多数の変
異が、同一染色体上に蓄積されていくため、変異育種さ
れた生産菌株は、野生型株に比べて、一般に生育が悪
い、糖の消費が遅い、温度や酸素などのストレスに弱い
等の性質を有するようになり、生産性が充分に上がらな
い、雑菌汚染の影響を受けやすい、培養管理が煩雑にな
る等、実製造において製造コストを高める要因となって
いる。また、ランダム変異であるため、生産性向上の機
構は明確ではなく、次の生産性向上に向けての合理的な
育種戦略を立て難い。
【０１０２】本発明によれば、放線菌から変異手法によ
り育種された生産菌株の染色体上に蓄積された多数の変
異点の中から、生産に寄与する有効変異点を効率よく特
定することができるため、放線菌にそれらの有効変異を
組み上げていくという新たな育種方法を確立することが
できる。該方法により、有用生産菌の再構築を行うこと
が可能となり、野生型株からも、有用生産菌株を構築す
ることが可能となる。具体的には、以下の方法で有用変
異株を構築することができる。
【０１０３】変異点の一つを放線菌の野生型株に導入
し、生産にプラスの効果をもたらすか否かを調べる。こ
の評価で効果があった場合はその変異点を残し、効果が
なかった場合はその変異点をはずす。次に、効果があっ
た変異点のみを有する菌株を親株として、同様な操作を
繰り返し行っていく。一般には生合成経路の下流に律速
点が存在すると、上流の変異の有効性が明確に評価でき
ない場合があるので、この方法を用いる場合には、変異
点の評価を下流から上流に向けて順次、行っていくこと
が望ましい。
【０１０４】以上のようにして、野生型株、あるいは野
生型株のように生育速度や糖の消費能力が高い菌株をベ
ースに有効変異を再構成すれば、上述のような従来法の
欠点を持たない、短時間で発酵生産が可能なあるいは発
酵をより高い温度で実施することのできる、工業的に有
利な菌株を造成することが可能になる。
【０１０５】以上のようにして再構築した生産菌株を親
株にして、通常の変異処理法、組換えDNA技術による遺
伝子増幅法や遺伝子置換法、形質導入法、あるいは細胞
融合法を用いて、更に育種をすれば、目的生産物の生産
性が一段と高まった菌株を得ることができる。従って、
本発明の微生物としては、育種の過程で、2つ以上の有
効変異を放線菌に集積させるという工程を経た生産菌株
であれば、変異株、細胞融合株、形質転換株、形質導入
株あるいは組換えDNA技術を用いて造成した組換え株の
いずれであっても特に限定されるものではない。
【０１０６】一方、生育や生産にとって有害であると判
断された変異点が特定された場合には、現在使用してい
る生産菌株に該変異点が存在するか否かを調べ、該変異
を有している場合には野生型の遺伝子に戻すことによ
り、更に有用な生産菌株に育種することも可能である。
【０１０７】以上のような育種方法は、放線菌以外の、
産業上有利な性質を有する微生物（より安価な炭素源を
速やかに利用できる微生物、より高温でも生育できる微
生物等）にも適用することが可能である。
【０１０８】７．ポリヌクレオチドアレイの作製および
利用 （１）ポリヌクレオチドアレイの作製 上記１．および２．で取得される本発明のポリヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチドを用い、ポリヌクレオチドア
レイを作製することができる。
【０１０９】具体的には、配列番号2〜7551のいずれか
に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、該ポリ
ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチド、および/またはこれらポリ
ヌクレオチドの有する塩基配列中の連続する少なくとも
10〜200塩基からなる配列を有するポリヌクレオチド
を、１以上固体支持体に固着したポリヌクレオチドアレ
イ、並びに配列番号7552〜15101のいずれかに示される
アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
/またはこれらポリヌクレオチドの有する塩基配列中の
連続する少なくとも10〜200塩基からなる配列を有する
ポリヌクレオチドを、１以上固体支持体に固着したポリ
ヌクレオチドアレイをあげることができる。
【０１１０】本発明においてポリヌクレオチドアレイと
は、DNAチップ、DNAマイクロアレイ、DNAマクロアレイ
等と呼ばれるものを含み、固体支持体の表面に複数のポ
リヌクレオチドまたは該断片を固着させたものを示す。
固体支持体としては、平板ガラスやナイロン膜等を用い
ることができる。ポリヌクレオチドまたは該断片の固体
支持体表面への固着には、アレイ作製の一般的な手法を
用いることができる。即ち、ポリリジン等のポリカチオ
ンの付着等、化学的に表面処理した固体支持体に固着さ
せる方法〔Nat. Genet., 21, 15-19 (1999)〕等を用い
ることができる。このような化学的に表面処理した固体
支持体は市販されており、該市販品を本発明のポリヌク
レオチドアレイの固体支持体として用いることができ
る。
【０１１１】固体支持体に固着させるポリヌクレオチド
あるいはオリゴヌクレオチドとしては、上記１．および
２．で取得される本発明のポリヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチドを用いることができる。固体支持体へポ
リヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドを高密度に
固着することにより、後述の解析を効率よく実施可能で
あるが、必ずしも高密度である必要はない。高密度に固
着するためのアレイヤーロボット等の装置は、宝酒造社
（GMS417 Arrayer）等より市販されており、該市販品を
用いることができる。
【０１１２】また、光リソグラフ法等により本発明のオ
リゴヌクレオチドを固体支持体上で直接合成してもよい
〔Nat. Genet., 21, 20-24 (1999)〕。該方法ではま
ず、光照射により除去できる保護基を持ったリンカーを
スライドグラス等の固体支持体に固着させる。該固着部
位の限られた部分のみ光を透過させるためのマスク（光
リソグラフマスク）を通して光を当てる。該領域に、光
照射により除去できる保護基を持ったオリゴヌクレオチ
ドを加えることにより、光の当たった部分のみ、そのヌ
クレオチドとの連結反応が起こる。該操作を繰り返すこ
とにより、領域ごとに異なる、望みの配列のオリゴヌク
レオチドを合成することができる。通常、合成するオリ
ゴヌクレオチドの長さは、10〜30塩基である。
【０１１３】（２）ポリヌクレオチドアレイの利用 上記（１）で作製されたポリヌクレオチドアレイを用
い、下記（ａ）、（ｂ）を行うことが可能となる。 （ａ）放線菌の変異株の変異点の同定およびゲノムにコ
ードされる遺伝子の発現量ならびに発現プロファイルの
解析 放線菌の変異株由来遺伝子または被検遺伝子について、
下記（i）〜（iv）の工程を実施することにより、該遺
伝子の変異点の同定または該遺伝子の発現量ならびに発
現プロファイルを解析することができる。 （i）上記（１）の方法でポリヌクレオチドアレイを作
製する工程 （ii）（i）の工程で作製されたポリヌクレオチドアレ
イを用い、該ポリヌクレオチドアレイ上に固定化された
ポリペプチドと標識化された放線菌の変異株由来遺伝子
とをハイブリダイズ条件下でインキュベートする工程 （iii）ハイブリダイゼーションを検出する検出工程 （iv）ハイブリダイゼーション結果を解析する解析工程
【０１１４】放線菌の変異株由来遺伝子または被検遺伝
子として、例えば、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有
機酸、抗生物質およびそれらの類縁体から選ばれる少な
くとも一種の生合成に関わる遺伝子をあげることができ
る。具体的な方法を下記に詳述する。
【０１１５】ポリヌクレオチドアレイを用い、ヒトの2,
300 kbにわたる領域中のSNP（一塩基多型）が同定され
ている〔Science, 280, 1077-82 (1998)〕。該SNPの同
定方法、およびScience, 278, 680-686 (1997)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 96,12833-38 (1999)、Science,
284, 1520-23 (1999)等に記載の方法に準じ、上記
（１）で作製されたポリヌクレオチドアレイおよび放線
菌由来の核酸分子（DNA、RNA）を用い、ハイブリダイゼ
ーション法により、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有
機酸、抗生物質等に有用である該微生物の有用変異株の
変異点の同定および遺伝子発現量ならびに発現プロファ
イルの解析が可能である。
【０１１６】放線菌由来の核酸分子（DNA、RNA）の取得
はモレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法に
従って行うことができる。通常、目的とするmRNAに加
え、大過剰のリボソームRNA （rRNA）も取得されるが、
解析の大きな支障にはならない。取得された放線菌由来
の核酸分子を標識化する。該標識には蛍光色素を用いる
方法やラジオアイソトープを用いる方法等が用いられ
る。
【０１１７】具体的には、微生物より抽出したRNAにソ
ラレン-ビオチンを紫外光でクロスリンクさせ、ハイブ
リダイゼーション反応後にストレプトアビジンを結合さ
せた蛍光色素をビオチン部に結合させることにより標識
化する方法〔Nat. Biotechnol., 16, 45-48 (1998)〕、
微生物より抽出したRNAを鋳型、ランダムプライマーを
プライマーにした逆転写反応を行い、蛍光色素、例えば
Ｃｙ３、Ｃｙ５を結合させたｄＵＴＰ（Amersham Pharm
acia Biotech社製）をｃDNAに取り込ませることにより
標識化する方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12
833-38 (1999)〕等をあげることができる。
【０１１８】ランダムプライマーの代わりにORFの3'端
の相補配列群をプライマーに使用することで、標識の特
異性をより高めることも可能である〔J. Bacteriol., 1
81,6425-40 (1999) 〕。ハイブリダイゼーション法にお
ける、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄操作
は通常の方法で行うことができる〔Nat. Biotechnol.,
14, 1675-80 (1996)等〕。該操作後、標識に使用した核
酸分子のハイブリダイゼーション量に応じたハイブリダ
イゼーションの強度を測定することにより、変異点の同
定および遺伝子の発現量を算定することができる。
【０１１９】ハイブリダイゼーションの強度は、蛍光シ
グナル、放射能、発光量等を、レーザー共焦点顕微鏡、
CCDカメラ、放射線のイメージング装置（例えばAmersha
mPharmacia Biotech社製、STORM）等により可視化後、
該可視化データを定量化することにより測定することが
できる。固体支持体上のポリヌクレオチドアレイについ
ての解析・定量には、GMS418 Array Scanner（宝酒造社
製）等の市販の装置を用いることもできる。
【０１２０】遺伝子発現量の解析には、市販の解析ソフ
トウェア（例えば宝酒造社製、ImaGene；富士フイルム
社製、Array Gauge； Amersham Pharmacia Biotech社
製、ImageQuant等）を使用することができる。放線菌由
来の核酸分子として、培養経時に応じて取得された核酸
分子を用いることにより、特定の遺伝子の発現変動を追
跡することができる。該変動を把握することにより、培
養条件を最適化することが可能となる。
【０１２１】また該微生物の全ゲノム配列から明らかに
された多数の遺伝子の配列を有する核酸分子を用いるこ
とにより、該微生物の全遺伝子レベルでの発現プロファ
イル、すなわちゲノムにコードされる多数の遺伝子のう
ちどのような遺伝子群がどのような比率で発現している
かを明らかにすることができる。このようにして全ゲノ
ム配列から明らかにされた遺伝子の発現プロファイルを
把握することにより、該微生物の生物学的な状態を全遺
伝子レベルでの発現パターンとして捉えることができ
る。
【０１２２】（ｂ）被検遺伝子に相同な遺伝子の放線菌
での存在の確認 上記（１）で作製されたポリヌクレオチドアレイを用
い、放線菌以外の生物に存在する被検遺伝子に相同な遺
伝子が放線菌に存在するか否かを、検索することができ
る。該検索は、上記（ａ）の同定・解析方法において、
放線菌由来の核酸分子のかわりに、放線菌以外の生物に
存在する被検遺伝子を用いた方法により行うことができ
る。
【０１２３】８．全ゲノム塩基配列およびORF情報を記
録したコンピューターで読み取り可能な記録媒体 「コンピューターで読み取り可能な記録媒体または記憶
装置」とは、コンピューターによって直接読みとられ、
アクセスされうる任意の記録媒体または記憶装置をい
う。このような記録媒体または記憶装置としては、フロ
ッピーディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気
記録媒体、CD-ROM、CD-R、CD-RW、DVD-ROM、DVD-RAM、D
VD-RW等の光学記録媒体、RAMやROM等の電気記録媒体、
およびこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えばMO等
の磁気／光学記録媒体）をあげることができるが、これ
らに限定されるものではない。
【０１２４】上記記録媒体に記録または入力させるため
の機器、あるいは記録媒体中の情報を読み取るための機
器または装置の選択は、記録媒体の種類とアクセス方法
に基づく。また、種々のデータプロセッサープログラ
ム、ソフトウェア、コンパレータおよびフォーマット
が、本発明のポリヌクレオチド配列情報等を該媒体に記
録し、利用させるために用いられる。該情報は、例え
ば、市販のソフトウェアでフォーマットされたバイナリ
ーファイル、テキストファイルあるいはASCIIファイル
の形態で表しうる。これら配列情報にアクセスするため
のソフトウェアも公的に入手可能である。
【０１２５】該媒体に記録する情報としては、上記２．
で取得された放線菌の、全ゲノム塩基配列情報、ORFの
塩基配列情報、該ORFにコードされるアミノ酸配列情
報、該アミノ酸配列を有するポリペプチドの有する機能
情報等をあげることができる。本発明のコンピューター
で読みとり可能な記録媒体または記憶装置は、上記情報
を記録した媒体である。具体的には、配列番号1〜7551
に示される塩基配列情報、7552〜15101に示されるアミノ
酸配列情報、配列番号1〜7551に示される塩基配列が有
する機能情報、および7552〜15101に示されるアミノ酸配
列が有する機能情報を記録したコンピューターで読み取
り可能な記録媒体または記憶装置をあげることができ
る。
【０１２６】９．本発明のコンピューターで読みとり可
能な記録媒体を利用したコンピューターを用いたシステ
ム 「コンピューターを用いたシステム」とは、本発明のコ
ンピューターで読みとり可能な記録媒体に記録された情
報を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソ
フトウェア手段、およびデータ記録手段より構成された
ものをいう。ハードウェア手段は基本的に、入力装置、
データ記録装置、中央演算処理装置、出力装置からな
る。
【０１２７】ソフトウェア手段は、記録された情報と上
記ハードウェア手段を用いて、本発明の媒体に記録され
た情報に関する検索あるいは解析を行う手段を行う。具
体的には、本発明の記録媒体に記録された塩基配列、ア
ミノ酸配列等の情報から生物学的に意味のある構造、情
報を検索、解析あるいは比較するために、コンピュータ
ーを用いたシステムで実行される一つまたはそれ以上の
プログラムを使用する手段を意味する。
【０１２８】ORF、EMF領域の同定のためのソフトウェア
としては、GeneMark〔Nuc. Acids.Res., 22, 4756-67
(1994)〕、GeneHacker〔蛋白質核酸酵素, 42, 3001-07
(1997)〕、Glimmer〔The Institute of Genomic Resear
ch；Nuc. Acids. Res., 26,544-548 (1998)〕等をあげ
ることができる。通常、これらソフトウェアを用いた予
測には、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いる
が、必要に応じてパラメータを変更してもよい。
【０１２９】標的配列または標的構造モチーフに類似す
るゲノム領域またはポリペプチド領域の同定（相同性検
索）のためのソフトウェアとしては、FASTA、BLAST、Sm
ith-Waterman、GenetyxMac（Software Development社
製）、GCGパッケージ（Genetics Computer Group社
製）、GenCore（Compugen社製)等をあげることができ
る。通常、これらソフトウェアを用いた予測には、デフ
ォルト（初期設定）のパラメータを用いるが、必要に応
じてパラメータを変更してもよい。
【０１３０】このような全ゲノム配列の情報を含む記録
媒体は、放線菌のゲノムDNAがコードする遺伝子の発現
量ならびに該微生物の全遺伝子レベルでの発現プロファ
イル、すなわち該微生物のゲノムにコードされる多数の
遺伝子のうちどのような遺伝子群がどのような比率で発
現しているかを明らかにすることができるポリヌクレオ
チドアレイを作製するために有用である。データ記録手
段とは、本発明の記録媒体に記録された情報および標的
配列、標的構造モチーフ情報等を記録するメモリ、およ
びそれにアクセスしうるメモリアクセス手段をいう。
【０１３１】即ち、本発明のコンピュータを用いたシス
テムは、(i)本発明の記録媒体に記録された情報、およ
び標的配列または標的構造モチーフ情報を入力するため
の入力手段、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に
記録するためのデータ記録手段、(iii)(ii)のデータ記
録手段により記録された、本発明の記録媒体に記録され
た情報と標的配列または標的構造モチーフ情報とを比較
し、標的配列または標的構造モチーフ情報と一致または
類似する塩基配列情報を検索または解析するコンパレー
タ手段、および(iv)(iii)のコンパレータ手段により得
られた検索または解析結果を表示するための出力手段を
備えたことを特徴とする、コンピュータを用いたシステ
ムである。
【０１３２】該システムを、上記２．〜５．の方法に用
いることにより、放線菌の、ORF、EMF領域、標的配列、
標的構造モチーフ等の検索・解析、ホモローグの検索、
アイソザイムの検索・解析、生合成経路・シグナル伝達
経路の解明、有用変異点の解明、およびプロテオーム解
析で見出されたスポットの同定に利用することができ
る。上記、ホモローグには、オーソローグ、パラローグ
両者共に含まれる。
【０１３３】１０．放線菌由来のORFを利用したポリペ
プチドの製造 上記２．の方法で取得されるORFを含むポリヌクレオチ
ドを用い、本発明のポリペプチドを製造することができ
る。即ち、本発明のポリペプチドは、モレキュラー・ク
ローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・
モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用
い、例えば以下の方法により、本発明のポリヌクレオチ
ドまたはその断片を宿主細胞中で発現させて、製造する
ことができる。全長ORF配列をもとにして、必要に応じ
て、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さ
のDNA断片を調製する。
【０１３４】また、必要に応じて、本発明のポリペプチ
ドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最
適なコドンとなるように塩基を置換したDNAを調製す
る。該DNAは本発明のポリペプチドの効率的製造に有用
である。これらのDNA断片を適当な発現ベクターのプロ
モーターの下流に挿入することにより、組換えベクター
を作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適
合した宿主細胞に導入する。
【０１３５】宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細
胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現で
きるものであればいずれも用いることができる。発現ベ
クターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能な
いしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチ
ドをコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを
含有しているものが用いられる。
【０１３６】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有
してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能で
あると同時に、少なくともプロモーター、リボソーム結
合配列、本発明のDNA、転写終結配列が作動可能な状態
で構成されたベクターであることが好ましい。プロモー
ターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【０１３７】発現ベクターとしては、例えば、Streptom
yces avermitilisで複製可能なベクタープラスミドであ
るpIJ6021、およびEscherichia coliで複製可能なベク
ターであるpET3、pET11（以上Stratagene社製）、pBA
D、pThioHis、pTrcHis（以上、Invitrogen社製）、pKK2
23-3、pGEX2T(以上、Amersham Pharmacia Biotech社製）
の他、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもBoehringer M
annheim社製より市販）、pSE280（Invitrogen社製）、p
GEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pGEL1
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、p
Bluescript II SK(-)（Stratagene社製）、pSupex、pUB
110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392
(1990)〕、pGEX（Pharmacia社製）、pETシステム（Nov
agen社製）等をあげることができる。
【０１３８】プロモーターとしては、宿主細胞中で機能
するものであればいかなるものでもよい。例えば、trp
プロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモー
ター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌や
ファージ等に由来するプロモーターをあげることができ
る。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×
２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロ
モーターのように人為的に設計改変されたプロモーター
等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシ
ャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドン
との間を適当な距離（例えば6〜18塩基)に調節したプラ
スミドを用いることが好ましい。
【０１３９】本発明の組換えベクターにおいては、本発
明のDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではな
いが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置すること
が好ましい。上記構成要素のコドンは、利用される宿主
細胞や環境状況に応じて、公知の方法により、最適化す
ることが可能である。
【０１４０】宿主細胞としては、Escherichia属、Serra
tia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacteri
um属、Microbacterium属、Pseudomonas属、Streptomyce
s属、Streptosporangium属、Amycolatopsis属、Actinop
lanes属、Nocardioides属、Pseudonocardia属、Actinob
ispora属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora
属、Saccharothrix属、Actinopolyspora属、Actinomadu
ra属、Microbispora属、Microtetraspora属、Thermomon
ospora属、またはMicromonospora属等に属する微生物、
例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia col
i XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli
MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli
W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli H
B101、Escherichia coli W3110、Bacillus subtilis、B
acillus amyloliquefacines、Streptomyces avermitili
s、あるいはStreptomyces griseus、Streptomyces hygr
oscopicus、Streptomyces coelicolor、Streptomyces l
ividans 等をあげることができる。
【０１４１】Streptomyces avermitilisまたはその類縁
微生物を宿主とする場合、該ポリペプチドの発現に必要
なEMFは、本発明のポリヌクレオチドがEMFを含む限り、
ベクター側に特に備わっていなくてもよい。そのような
EMFが該ポリヌクレオチドに含まれない場合には、別にE
MFを調製し、作動可能な状態にポリヌクレオチドに連結
する必要がある。あるいは、より高い発現量もしくは特
異的な発現調節を期待する場合にも、それに見合ったEM
Fを作動可能な状態にポリヌクレオチドに連結する必要
がある。
【０１４２】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いる
ことができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（Nature）に記載の方法等をあげるこ
とができる。酵母を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、pYES2（Invitrogen社
製）、YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp5
0（ATCC37419）、pHS19、pHS15等をあげることができ
る。
【０１４３】プロモーターとしては、酵母菌株中で発現
できるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー
ター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモ
ーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プ
ロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモータ
ー、CUP1プロモーター等をあげることができる。
【０１４４】宿主細胞としては、Saccharomyces属、Sch
izosaccharomyces属、Kluyveromyces属、Trichosporon
属、Schwanniomyces属、Pichia属、Candida属等に属す
る微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizo
saccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichos
poron pullulans、Schwanniomyces alluvius、Candidau
tilis等をあげることができる。
【０１４５】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にDNAを導入する方法であればいずれも用いることがで
き、例えば、エレクトロポレーション法〔Meth. Enzy
m., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウ
ム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等を
あげることができる。
【０１４６】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、pcDNA3.1、pSinRep5、pCEP
4(Invitrogen社製)、pRev-Tre(Clontech社製)、pAxCAwt
(宝酒造社製)、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社製)、pAGE107
〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、
pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840(19
87)〕、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pREP4(Invitroge
n社製)、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、
pAGE210等をあげることができる。
【０１４７】プロモーターとしては、動物細胞中で機能
するものであればいずれも用いることができ、例えば、
サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）
遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーター、SRプロモーター等
をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエ
ンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主細
胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細
胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムス
ターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等
をあげることができる。
【０１４８】動物細胞への組換えベクターの導入方法と
しては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれ
も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション
法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシ
ウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virolo
gy, 52, 456 (1973)等をあげることができる。昆虫細胞
を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロト
コールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculo
virus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.
H. Freeman and Company, New York (1992)、Bio/Techn
ology,6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ポリ
ペプチドを発現することができる。
【０１４９】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、更に組換えウイルスを
昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることが
できる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクター
としては、例えば、pBlueBac4.5、pVL1392、pVL1393、p
BlueBacIII（ともにInvitorogen社製）等をあげること
ができる。
【０１５０】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodop
tera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovir
us Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H.
Freeman andCompany, New York (1992)〕、Trichoplusi
a niの卵巣細胞であるHigh5（Invitrogen社製）等を用
いることができる。
【０１５１】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。植物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、Tiプラスミド、タバ
コモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
【０１５２】プロモーターとしては、植物細胞中で発現
できるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロ
モーター、イネアクチン１プロモーター等をあげること
ができる。宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、ト
マト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、
イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることが
できる。
【０１５３】組換えベクターの導入方法としては、植物
細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いること
ができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/0097
7）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、
パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許
第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
【０１５４】本発明の形質転換体として、上記の組換え
ベクターを保持する形質転換体のみならず、本発明のポ
リヌクレオチドを組換えベクターとしてではなく、その
もの自体として保持する形質転換体、即ち、本発明のポ
リヌクレオチドが、宿主の染色体に組み込まれ状態で保
持された形質転換体も含まれる。酵母、動物細胞、昆虫
細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖ある
いは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができ
る。
【０１５５】以上のようにして得られる本発明の形質転
換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチド
または本発明のEMFの制御下で発現される任意のポリペ
プチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することによ
り、それらのポリペプチドを製造することができる。本
発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養
に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１５６】本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物
あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転
換体である場合、該形質転換体を培養する。培地とし
て、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培
地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよ
い。炭素源としては、該形質転換体が資化し得るもので
あればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、
これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水
分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、
エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いる
ことができる。
【０１５７】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加
水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体およびその消化物等を用いることができる。
【０１５８】無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下
で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常
16時間〜7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持す
ることが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、
アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を
用いて行う。
【０１５９】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換
えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、
必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形
質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-D-
チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用い
た組換えベクターで形質転換した微生物を培養するとき
にはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１６０】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地〔The Journal of the American Medical Associ
ation, 199, 519 (1967)〕、イーグルのMEM培地〔Scien
ce, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変MEM培地〔Viro
logy, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the
Society for the Biological Medicine, 73, 1 (195
0)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等
を用いることができる。培養は、通常ｐＨ6〜8、30〜40
℃、5%炭酸ガス存在下等の条件下で1〜7日間行う。
【０１６１】また、培養中必要に応じて、カナマイシ
ン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培
地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（Pharmi
ngen社製）、Sf-900IISFM培地（Life Technologies社
製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRH Bioscience
s社製）、Grace'sInsect Medium〔Nature, 195, 788 (1
962)〕等を用いることができる。培養は、通常pH6〜7、
25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。
【０１６２】また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシ
ン等の抗生物質を培地に添加してもよい。植物細胞を宿
主として得られた形質転換体は、細胞として、または植
物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該
形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されて
いるムラシゲ・アンド・スクーグ(ＭＳ)培地、ホワイト
(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイト
カイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いるこ
とができる。培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で
3〜60日間行う。
【０１６３】また、培養中必要に応じて、カナマイシ
ン、ハイグロマイシンB等の抗生物質を培地に添加して
もよい。上記のとおり、本発明のポリペプチドをコード
するDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生
物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、
通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成
蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取すること
により、該ポリペプチドを製造することができる。遺伝
子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー
・クローニング第２版に記載されている方法等に準じ
て、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことがで
きる。
【０１６４】本発明のポリペプチドの生産方法として
は、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌さ
せる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法が
あり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの
構造を変えることにより、該方法を選択することができ
る。本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細
胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J. B
iol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes De
velop., 4, 1288（1990)〕、および／または特開平5-33
6963、WO94/23021等に記載の方法を準用することによ
り、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させる
ことができる。
【０１６５】即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発
明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前
にシグナルペプチドを付加した形で発現させることによ
り、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌
させることができる。また、特開平2-227075に記載され
ている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を
用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させること
もできる。更に、遺伝子が導入された動物個体（トラン
スジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジ
ェニック植物）を造成することにより、本発明のポリペ
プチドを製造することもできる。
【０１６６】形質転換体が動物個体または植物個体の場
合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリ
ペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体よ
り該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチ
ドを製造することができる。動物個体を用いて本発明の
ポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の方
法〔American Journal of Clinical Nutrition, 63, 63
9S (1996)、American Journal of Clinical Nutrition,
63, 627S (1996)、Bio/Technology, 9, 830(1991)〕に
準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明のポリ
ペプチドを生産する方法をあげることができる。
【０１６７】動物個体の場合は、例えば、本発明のポリ
ペプチドをコードするDNAを導入したトランスジェニッ
ク非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生
成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取する
ことにより、該ポリペプチドを製造することができる。
該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動物の
ミルク（特開昭63-309192）、卵等をあげることができ
る。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で
発現できるものであればいずれも用いることができる
が、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるカゼ
インプロモーター、ハプトグロブリンプロモーター、ホ
エー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられ
る。
【０１６８】植物個体を用いて本発明のポリペプチドを
製造する方法としては、例えば本発明のポリペプチドを
コードするDNAを導入したトランスジェニック植物を公
知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (199
5)、Trends in Biotechnology,15, 45 (1997)〕に準じ
て栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成、蓄積さ
せ、該植物中より該ポリペプチドを採取することによ
り、該ポリペプチドを生産する方法をあげることができ
る。
【０１６９】本発明のポリペプチドはin vitro翻訳によ
り取得することもできる。in vitro翻訳系を用いて本発
明のポリペプチドを生産することもできる。in vitro翻
訳には、例えば、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にす
る方法の２通りがあるが、鋳型RNAとしては、全RNA、mR
NA、in vitro転写産物などが使用でき、鋳型DNAとして
は、転写プロモーターと翻訳開始点の下流に組み込まれ
た目的遺伝子を含むプラスミドやPCR/RT-PCR産物が使用
できる。in vitro翻訳の最適なシステムの選択には、合
成する蛋白質をコードする遺伝子の由来（原核細胞／真
核細胞）、鋳型の種類（DNA/RNA)、または合成後の蛋白
質の使用目的などを考慮して行なう必要がある。種々の
特徴を有するin vitro翻訳のキットが各社（Boehringer
Mannheim社、Promega社、Stratagene社等）から市販さ
れているが、いずれのキットを用いても、本発明のポリ
ペプチドを製造することができる。
【０１７０】in vitro転写／翻訳システムE.coli T7 S3
0 Extract System for Circular DNA(Promega社製；カ
タログ番号L1130）を用いれば、T7プロモーターを含む
プラスミドにクローン化されたDNA塩基配列の転写／翻
訳を実施することができる。またin vitro翻訳転写／翻
訳システムE.coli S30 Extract System for Linear Tem
plates(Promega社製；カタログ番号L1030）を用いれ
ば、スーパーコイル非感受性のプロモーター、例えばla
cUV5、tacなどの持つ直鎖上の原核生物のDNAを鋳型とし
て転写／翻訳を実施することができる。直鎖上の原核生
物のDNAを鋳型としては、DNAフラグメント、PCR増幅DNA
産物、重複オリゴヌクレオチド連結体、invitro転写RN
A、原核生物RNAなどが使用できる。
【０１７１】このような系を用いることで、本発明のポ
リペプチドを製造できる他に、放射性標識蛋白質の合
成、クローン化遺伝子の発現能の確認、転写反応または
翻訳反応の機能解析研究などを実施することも可能であ
る。
【０１７２】本発明の形質転換体により製造されたポリ
ペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精
製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチ
ドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了
後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁
後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリン
ホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無
細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離すること
により得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即
ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶
媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）-セフ
ァロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等のレジン
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sephar
ose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン
交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェ
ニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグ
ラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティ
ークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、
等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは
組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【０１７３】また、該ポリペプチドが宿主細胞内に不溶
体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破
砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリ
ペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの
不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈
または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下
げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻
す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリ
ペプチドの精製標品を得ることができる。
【０１７４】本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペ
プチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細
胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチド
あるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができ
る。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法に
より処理することにより培養上清を取得し、該培養上清
から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精
製標品を得ることができる。
【０１７５】上記の方法で取得されるポリペプチドが本
発明のポリペプチドであり、例えば、配列番号2〜7551
から選ばれる塩基配列を有するポリヌクレオチドにコー
ドされるポリペプチド、または配列番号7552〜15101の
いずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
をあげることができる。
【０１７６】さらに、該ポリペプチドの有するアミノ酸
配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入
または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該ポリペ
プチドの活性と実質的に同一の活性を有するポリペプチ
ドも本発明に含まれる。該ポリペプチドの活性と実質的
に同一の活性とは、欠失、置換、挿入または付加する前
のポリペプチドが有する固有の機能あるいは酵素活性な
どに代表される活性と同一の活性を意味している。該ポ
リペプチドは、 モレキュラー・クローニング第２版、
カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイ
オロジー、Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 3
15 (1985)、Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)、Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部
位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
例えば、配列番号7552〜15101のいずれかに示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAに部
位特異的変異を導入することにより、取得することがで
きる。欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸残
基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法
等の周知の方法により欠失、置換、挿入もしくは付加で
きる程度の数であり、1〜数十個、好ましくは1〜20個、
より好ましくは1〜10個、更に好ましくは1〜5個であ
る。
【０１７７】本発明のポリペプチドの有するアミノ酸配
列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま
たは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは
複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数の
アミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があること
を意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じて
もよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天
然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基とし
ては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン
酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒス
チジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メ
チオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリ
ン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-
バリン、L-システインなどがあげられる。
【０１７８】以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の
例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換
可能である。
【０１７９】Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイ
シン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン
酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシ
ン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギ
ン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミ
ノスベリン酸 Ｃ群：アスパラギン、グルタミン Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノ
ブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸 Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシ
プロリン Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【０１８０】また、得られる変異ポリペプチドが、変異
前のポリペプチドの有する活性と実質的に同一の活性を
有するためには、変異前のポリペプチドの有するアミノ
酸配列と、BLASTやFASTA等の解析ソフトウェアで、デフ
ォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算した時
に、少なくとも60%以上、通常は80%以上、特に95%以上
の相同性を有していることが好ましい。また、本発明の
ポリペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）
等の化学合成法によっても製造することができる。ま
た、Advanced ChemTech社製、Perkin elmer社製、Pharm
acia社製、Protein Technology Instrument社製、Synth
ecell-Vega社製、PerSeptive社製、島津製作所等のペプ
チド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０１８１】本発明の形質転換体は、本発明のポリペプ
チド生産以外の目的にも使用することができる。具体的
には、本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクター
を含む形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミノ
酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物質、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種を生成蓄積さ
せ、該培養物からアミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機
酸、抗生物質、およびそれらの類縁体から選ばれる少な
くとも一種を採取、製造することが可能である。
【０１８２】また、抗生物質を含む生物活性物質の生成
に使われるアミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、お
よびそれらの類縁体等の生合成経路、分解経路およびそ
の調節機構は生物種により異なる。また、抗生物質を含
む生物活性物質、およびその類縁体等の生合成経路およ
びその調節機構も生物種によって異なる。その相違を利
用して、異種由来のそれらの生合成関連遺伝子を導入す
ることで、それら生理活性物質の生産性を高めることが
可能である。それらの生物活性物質の生産のための本発
明の形質転換体の培養は、上記本発明のポリペプチド生
産のための形質転換体の培養方法と同じ方法で行うこと
ができる。培養物からの該生物活性物質の採取も、有機
溶媒転溶法、イオン交換樹脂法、吸着法、その他公知の
方法の組み合わせで行うことができる。
【０１８３】公知の方法とは、例えば宿主生物がバクテ
リアの場合、エレクトロポレーション、カルシウムトラ
ンスフェクション、プロトプラスト法、ウィルスを経る
方法等であり、真核生物の場合はマイクロインジェクシ
ョン、リン酸カルシウムトランスフェクション、陽性荷
電脂質仲介法やウィルスを用いる方法等をあげることが
できる〔モレキュラー・クローニング第２版、および、
Spectorら、Cells/ alaboratory manual，Cold Spring
Harbor Laboratory Press、1998）〕。宿主生物とは、
原核生物、下等真核生物（たとえば酵母）、または高等
真核生物（例えばほ乳類動物）、であり、それら生物か
ら単離された細胞を含む。組換えポリヌクレオチド断片
の宿主細胞内での存在形態としては、宿主染色体にイン
テグレートされてもよいし、染色体外で独立の複製単位
を有する因子（例えばプラスミド）に組み込まれた形で
もよい。これらの形質転換体は、本発明のStreptomyces
avermitilisのゲノムのORFによりコードされるポリペ
プチドの他、本発明のポリヌクレオチドおよびその断片
を生産するために用いることができる。あるいは、本発
明のEMFの制御下で任意のポリペプチドを生産するため
等に用いることができる。
【０１８４】１１．本発明のポリペプチドを認識する抗
体の調製 本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片
ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチ
ドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として
用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体等、本発明のポリペプチドを認識する抗体を作製
することができる。
【０１８５】（１）ポリクローナル抗体の作製 本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片
ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチ
ドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として
用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を
作製することができる。投与する動物として、ウサギ、
ヤギ、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリ等を用い
ることができる。
【０１８６】該抗原の投与量は動物１匹当たり50〜100
μgが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドを
スカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyani
n）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合
させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプ
チドは、ペプチド合成機で合成することができる。該抗
原の投与は、例えば、1回目の投与の後1〜2週間おきに3
〜10回行う。各投与後、3〜7日目に眼底静脈叢より採血
し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免
疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊（1
976年）、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory (1988)〕等で確認する。
【０１８７】免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分
な抗体価を示した免疫された非ヒト哺乳動物より血清を
取得し、該血清を分離、精製することによりポリクロー
ナル抗体を取得することができる。分離、精製する方法
としては、遠心分離、40〜50%飽和硫酸アンモニウムに
よる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory
manual, Cold SpringHarbor Laboratory, (1988)〕、
またはDEAE-セファロースカラム、陰イオン交換カラ
ム、プロテインAまたはG-カラムあるいはゲル濾過カラ
ム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み
合わせて処理する方法があげられる。
【０１８８】（２）モノクローナル抗体の作製 (a)抗体産生細胞の調製 免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプ
チドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを
抗体産生細胞の供給源として供する。該抗体価を示した
ラットに抗原物質を最終投与した後3〜7日目に、脾臓を
摘出する。該脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断
し、ピンセットでほぐし、1,200rpmで5分間遠心分離し
た後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリ
ス〜塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理
し赤血球を除去した後、MEM培地で3回洗浄し、得られた
脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【０１８９】(b)骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した
株化細胞を使用する。例えば、8-アザグアニン耐性マウ
ス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、P3-
U1と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81,
1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2
/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X63-A
g8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、P3-X6
3-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いるこ
とができる。これらの細胞株は、8-アザグアニン培地
〔1.5mmol/l グルタミン、5 × 10-5mol/l 2-メルカプ
トエタノール、10μg/ml ゲンタマイシンおよび10% 牛
胎児血清(FCS:CSL社製)となるようRPMI-1640培地に添加
した培地（以下、正常培地という）に、更に8-アザグア
ニンを15μg/ml加えた培地〕で継代するが、細胞融合の
3〜4日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を2 × 1
07個以上用いる。
【０１９０】(c)ハイブリドーマの作製 (a)で取得した抗体産生細胞と(b)で取得した骨髄腫細胞
をMEM培地またはＰＢＳ（1.83g リン酸二ナトリウム、
0.21g リン酸一カリウム、7.65g 食塩、蒸留水１リット
ル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄
腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、1,200rpmで5分間遠
心分離した後、上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、
攪拌しながら、37℃で、108抗体産生細胞あたり、ポリ
エチレングリコール-1000 (PEG-1000) 2g、MEM2mlおよ
びジメチルスルホキシド(DMSO)0.7mlを混合した溶液を
0.2〜1ml添加し、更に1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数
回添加する。
【０１９１】添加後、MEM培地を加えて全量が50 mlにな
るように調製する。該調製液を900rpmで5分間遠心分離
後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるや
かにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しで
ゆるやかにＨＡＴ培地〔10-4mol/l ヒポキサンチン、1.
5 × 10-5mol/l チミジンおよび4 × 10-7mol/l アミノ
プテリンとなるように正常培地に添加した培地〕100ml
中に懸濁する。該懸濁液を96穴培養用プレートに100μl
/穴ずつ分注し、5% 炭酸ガスインキュベーター中、37℃
で7〜14日間培養する。
【０１９２】培養後、培養上清の一部をとりアンチボデ
ィイズ〔Antibodies, A Laboratorymanual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べら
れている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチド
の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリド
ーマを選択する。
【０１９３】酵素免疫測定法の具体例として、以下の方
法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いた本発
明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレ
ートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述
の(ｄ)で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、
更に第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質ある
いは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウス
イムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じ
た反応を行い、本発明のポリペプチドに特異的に反応す
るものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブ
リドーマとして選択する。該ハイブリドーマを用いて、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目
は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培
地）、2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い
抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ株として選択する。
【０１９４】(d)モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン
（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する〕し
た8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(c)で取得
した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ細胞5〜20 × 106細胞/匹を腹腔内に注射す
る。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹
水癌化したマウスから腹水を採取し、3,000rpmで5分間
遠心分離して固形分を除去する。
【０１９５】得られた上清より、ポリクローナルで用い
た方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得
することができる。抗体のサブクラスの決定は、マウス
モノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノ
クローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペ
プチド量は、ローリー法あるいは280nmでの吸光度より
算出する。上記で取得される抗体は本発明の抗体であ
る。
【０１９６】該抗体は、抗体を用いた通常のアッセイ、
即ち、ラジオイムノアッセイ（RIA）、競合的結合アッ
セイ、免疫組織化学染色法（ABC法、CSA法など）、免役
沈降法、ウェスタンブロット分析、ELISAアッセイ等に
用いることができる〔An Introduction to Radioimmuno
assay and Related Techniques, エルセビア・サイエン
ス出版社（1986）、Techniques in Immunocytochemistr
y, アカデミック・プレス第１巻(1982), 第2巻（198
3）,第3巻(1985)、Practice and Theory of Enzyme Imm
unoassays, エルセビア・サイエンス出版社(1985)、酵
素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊（1976年）、Ant
ibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル（講
談社サイエンティフィック）（1987）、続生化学実験講
座５, 免役生化学研究法（東京化学同人）（1986）〕。
【０１９７】本発明の抗体はそのまま、あるいは標識し
て用いることができる。標識としては、ラジオアイソト
ープ、アフィニティー標識（ビオチン、アビジンな
ど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼなど）、蛍光標識（FITCまたはローダ
ミンなど）、常磁性原子を用いた標識をあげることがで
きる〔J. Histochem. Cytochem., 18, 315 (1970）, Me
th. Enzym.,62, 308 (1979), Immunol., 109, 129 (197
2), J. Immunol. Meth., 13, 215 (1979)〕。
【０１９８】標記アッセイ法、後述のポリペプチドアレ
イあるいはプロテオーム解析法により、該抗体あるいは
該標識抗体を用い、放線菌における本発明のポリペプチ
ドの発現、該発現の変動、該ポリペプチドの構造変化の
有無、放線菌以外の生物における本発明のポリペプチド
に相応するポリペプチドの存在の有無を解析することが
できる。また、本発明の抗体を用いたイムノアフィニテ
ィクロマトグラフにより、該抗体の認識するポリペプチ
ドを精製することができる。
【０１９９】１２．ポリペプチドアレイの作製および利
用 （１）ポリペプチドアレイの作製 上記１０．で取得される本発明のポリペプチド、または
上記１１．で取得される本発明の抗体を用いて、ポリペ
プチドアレイを作製することができる。本発明のポリペ
プチドアレイとは、プロテインチップと呼ばれるものを
含み、本発明のポリペプチドまたは抗体を固体支持体の
表面に複数固着させたものをいう。固体支持体として
は、ポリカーボネートのようなプラスチック、ポリアク
リルアミドのようなアクリル樹脂、アガロースおよびセ
ファロースのような複合炭水化物、シリカもしくはシリ
カベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス、ラテッ
クスビーズ等を用いることができる。
【０２００】本発明のポリペプチド、または抗体を、Bi
otechniques, 27, 1258-61 (1999)、Molecular medicin
e Today, 5, 326-7 (1999)、Handbook of Experimental
Immunology 4th edition Blackwell Scientific Publi
cations chapter10 (1986)、Meth. Enzym., 34, (197
4)、Advances in Experimental Medicine and Biology,
42 (1974)、US4,681,870、US4,282,287、US4,762,881、
等に記載の方法に準じて、固体支持体表面へ固着するこ
とができる。固体支持体へ本発明のポリペプチド、また
は抗体を高密度に固着することにより、後述の解析を効
率よく実施することが可能であるが、必ずしも高密度で
ある必要はない。
【０２０１】（２）ポリペプチドアレイの利用 上記（１）で作製された本発明のポリペプチドを固着し
たポリペプチドアレイを用いると、アレイに固着された
本発明のポリペプチドと結合し、相互作用するポリペプ
チドまたは化合物を同定することができる。即ち、本発
明のポリペプチドについて、下記（i）〜（iv）の工程
を実施することにより、該ポリペプチドと結合し、相互
作用するポリペプチドまたは化合物を探索することがで
きる。
【０２０２】（i）上記（１）の方法で本発明のポリペ
プチドが固着したポリペプチドアレイを作製する工程 （ii）該ポリペプチドアレイ上に固定化された本発明の
ポリペプチドと、任意の第２ポリペプチドまたは化合物
の少なくとも一つとをインキュベートする工程 (iii)アレイ上に固定化されたポリペプチドと第２ポリ
ペプチドまたは化合物の少なくとも一つとで形成された
結合体を、例えば、第２ポリペプチドまたは化合物の少
なくとも一つと結合した標識、あるいは該結合体とまた
は不結合物質が除去された後の該結合体の成分と特異的
に結合する標識を用いて検出する検出工程 （iv）該検出結果を解析する解析工程
【０２０３】本発明のポリペプチドが固着したポリペプ
チドアレイとして、具体的には、配列番号7552〜15101
から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、該ポ
リペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残
基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ該ポリペプチドの活性と実質的に同一の
活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸
配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、
かつ該ポリペプチドの活性と実質的に同一の活性を有す
るポリペプチド、該ポリペプチドの部分断片ポリペプチ
ド、および/または該ポリペプチドの一部のアミノ酸配
列を有するペプチドを、１以上固体支持体に固着したポ
リペプチドアレイをあげることができる。
【０２０４】また、上記（１）で作製された本発明の抗
体を固着したポリペプチドアレイを用いると、放線菌の
ポリペプチドの発現量の解析を行うことが可能となる。
即ち、放線菌の変異株由来遺伝子について、下記（i）
〜（iv）の工程を実施することにより、該遺伝子の発現
量を解析することができる。
【０２０５】（i）上記（１）の方法でポリペプチドア
レイを作製する工程 （ii）該ポリペプチド（第１抗体）アレイとと放線菌由
来のポリペプチドとをインキュベートする工程 （iii）アレイ上に固定化された抗体と結合したポリペ
プチドを、標識した本発明の第２抗体を用いて検出する
検出工程 (iv)該検出結果を解析する解析工程
【０２０６】本発明の抗体が固着したポリペプチドアレ
イとして、具体的には、配列番号7552〜15101から選ば
れるアミノ酸配列を有するポリペプチド、該ポリペプチ
ドのアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠
失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ該ポリペプチドの活性と実質的に同一の活性を
有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配列と
60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該
ポリペプチドの活性と実質的に同一の活性を有するポリ
ペプチド、該ポリペプチドの部分断片ポリペプチド、お
よび/または該ポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有
するペプチドを認識する抗体を、1以上固体支持体に固
着したポリペプチドアレイをあげることができる。
【０２０７】また、放線菌由来のポリペプチドとして、
培養経時に応じて取得されたポリペプチドを用いること
により、特定のポリペプチドの発現変動を追跡すること
ができる。該変動を把握することにより、培養条件を最
適化することが可能となる。放線菌の変異株由来のポリ
ペプチドを用いた場合には、変異ポリペプチドを検出す
ることができる。
【０２０８】１３．プロテオーム解析による変異株にお
ける有用変異の同定 通常、プロテオームはポリペプチドを２次元電気泳動で
分離し、分離されたポリペプチドを酵素消化後、質量分
析計(ＭＳ)とデータベース検索を用いて、該ポリペプチ
ドを同定する方法を指す。２次元電気泳動とは、原理の
異なる２種類の電気泳動を組み合わせて行う電気泳動法
のことである。例えば、１次泳動をポリペプチドの分子
量で分離し、次いでゲルを90度または、180度回転さ
せ、等電点で２次泳動し、分離することによりさまざま
な分離パターンを実現させることができる（JIS K 3600
2474）。
【０２０９】データベース検索には、上記２．および
８．で作製された本発明のポリペプチドのアミノ酸配列
情報、および本発明の記録媒体を利用することができ
る。放線菌および該微生物の変異株をそれぞれプロテオ
ーム解析することにより、両者間で変動の認められたポ
リペプチドを同定することが可能である。放線菌の野生
型株と目的産物の生産性が向上した生産菌株をそれぞれ
プロテオーム解析することにより、目的産物の生産能力
の向上を目的とした育種に有用な変異蛋白質や発現量が
変動した蛋白質を効率良く同定できる。
【０２１０】具体的な例として、Streptomyces avermit
ilisにおいては、野生型株とエバーメクチン工程菌株を
それぞれプロテオーム解析することにより、野生型株に
比べてエバーメクチン工程菌株で増大するスポットを見
出し、データベース検索することにより、エバーメクチ
ンの生産性の向上に応じて、生産量が増大するポリペプ
チドを同定することができる。
【０２１１】また、本発明の放線菌の塩基配列情報、ア
ミノ酸配列情報および該配列が記録された記録媒体を用
い、発現レベルの高い蛋白質をプロテオーム解析により
同定することにより、該蛋白質をコードする遺伝子の塩
基配列とその上流域の塩基配列も同時に検索することが
可能となり、高発現プロモーターとしての機能を有する
塩基配列を効率的に選択することができる。また、プロ
テオーム解析においては、変動するスポットが修飾を受
けた蛋白質に由来することがあるが、本発明の放線菌ゲ
ノムの塩基配列情報、アミノ酸配列情報および該配列が
記録された記録媒体を用いた検索により、修飾を受けた
蛋白質を効率良く同定することができる。
【０２１２】更に、同定された該蛋白質に関わる塩基配
列（プロモーター、ORF等の塩基配列）を本発明の放線
菌ゲノムの塩基配列情報、アミノ酸配列情報および該配
列が記録された記録媒体を用いて検索し、見出された塩
基配列を基に設計したプライマーを使用することによ
り、容易に有用変異株の有する有用変異点を特定するこ
とができる。該変異点が特定されることにより、容易に
該有用変異あるいは該有用変異から導かれる有用変異を
有する、産業上有用な変異株を育種することができる。
【０２１３】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明の内
容がこれらに限定されるものではない。 実施例１ Streptomyces avermitilisのゲノムの全塩基
配列の決定 Streptomyces avermitilisのゲノムの全塩基配列の決定
は全ゲノムショットガン法〔Science, 269, 496-512 (1
995)〕を基本とした。この方法では、ゲノムライブラリ
ーを作成し、その末端配列をランダムに決定し、その配
列をコンピューター上で連結し、全ゲノムを覆っていっ
た。具体的には以下のように行った。
【０２１４】（１）Streptomyces avermitilis ATCC312
67株のゲノムDNAの調製 Streptomyces avermitilis ATCC31267株をTSB培地（17g
/l ペプトン、3g/l 大豆ペプトン、5g/l 塩化ナトリウ
ム、2.5g/l ブドウ糖、2.5g/l リン酸一水素カリウム、
pH7.3）5mlで30℃にて終夜培養し、遠心分離により菌体
を回収した。STEバッファー（10.3% スクロース、25mmo
l/l Tris塩酸塩、25mmol/l EDTA、pH8.0）で菌体を洗浄
した後、2.5mlの1.5% パルスフィールド電気泳動サンプ
ル調製用低融点アガロース（InCert agarose、宝酒造社
製)と混合し、80mm直径のシャーレに流し込み、室温に3
0分以上放置して固化させた。
【０２１５】該シャーレに、1〜5mg/mlのリゾチームをS
TEバッファーを20ml加え、30℃で6〜20時間保温し細胞
壁を消化した。STEバッファーを除去し、TEバッファー
（10mmol/l Tris塩酸塩、1mmol/l EDTA、pH8.0）で洗浄
し、1mg/mlのプロテイナーゼＫを含む10mlの溶解緩衝液
（0.5mol/l EDTA、pH9.5、1% サルコシル）を加え、50
℃で24時間穏やかに振盪した。振盪後、緩衝液を除去
し、50mmol/l EDTA、pH8.0溶液20mlで数回洗浄した。さ
らに1mM PMSFを含む50mmol/l EDTA、pH8.0溶液を20ml加
え、残存するプロテイナーゼＫを不活化させた。
【０２１６】上記のように処理したゲノムDNAを含むア
ガロースゲルを5 × 5 mmのブロックに切り出し、1% ア
ガロースゲル(45mmol/l Trisホウ酸、1mmol/l EDTA、0.
1mmol/l チオ尿素、pH8.3)の試料溝に入れ、電気泳動緩
衝液を満たし、正方向3秒、逆方向1秒のパルス設定で12
0ボルト1晩、泳動を行った。泳動終了後、アガロースブ
ロックを取り出し、50mmol/l EDTA、pH8.0溶液で洗浄し
た。洗浄したアガロースブロックを65℃に保温し溶解さ
せた後、5〜10mlのTris中和フェノールを加え、室温で5
分間緩やかに振とうし、さらに5〜10mlのクロロホルム
を加え5分間緩やかに振とうした。
【０２１７】振とう後、遠心分離（10,000 × g、10分
間、20℃）を行い、水層を分取した。該水層を用い、10
〜20mlのフェノール/クロロホルム抽出（２回）を行っ
た後、該水層に1/10量の3mol/l酢酸ナトリウム溶液、0.
56倍量のイソプロパノールを加え、緩やかに混和し、ゲ
ノムDNAを沈殿させた。生じたゲノムDNA沈殿を70%エタ
ノールで洗浄した後、風乾し、TEバッファーに溶解する
ことにより、ゲノムDNA溶液を取得した。
【０２１８】（２）ショットガンライブラリーの作製 上記で調製した放線菌のゲノムDNA 0.1mgに、全量0.4ml
になるように、TEバッファー等の緩衝液を添加する。得
られたゲノムDNA溶液を、ハイドロシェア（GeneMachine
s社製）を用い、出力6で20回処理することにより、、該
溶液中のゲノムDNAを、1〜2kbの断片に分断した。得ら
れたゲノムDNA断片をSizeSep400 Span Column(Separose
CL4B、Amasham社製)に通過させ、500 b以下の断片を除
去した。500 b以下の断片を除去し、得られたDNA断片の
末端を、DNAブランティングキット (DNA blunting ki
t、宝酒造社製)等を用いて平滑化した。
【０２１９】平滑化したDNA断片を、フェノール/クロロ
ホルム処理後、エタノール沈殿することにより取得し、
ゲノムライブラリーインサートとして用いた。該インサ
ートを、T4 DNAリガーゼ (T4 DNA ligase、宝酒造社製)
を用いて、pUC118 HincII/BAP(宝酒造社製)に10〜20℃
で、24時間放置し、ライゲーションした。得られたライ
ゲーション反応物をエタノール沈殿し、5〜20μlのTEバ
ッファーに溶解した。
【０２２０】該ライゲーション溶液 0.5μl用い、大腸
菌 Electro-Cells DH5α（宝酒造社製）をエレクトロ
ポレーション法で形質転換した。形質転換した大腸菌を
100mg/lのアンピシリンおよび0.4mg/lのX-gal（5-ブロ
モ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトピラノシド）
含むＬＢ平板培地〔寒天を1.5%含むLB培地（10g/l バク
トトリプトン、5g/l 酵母エキス、10g/l 塩化ナトリウ
ム、pH7.0）〕に塗布し、培養した。なお、ゲノムDNAを
含有する組換え体DNAを保有する形質転換株を白色コロ
ニーとして選択した。白色コロニーの形質転換体を、0.
1mg/ml アンピシリンを含むＬＢ培地を0.05mlずつ添加
した96穴タイタープレート中、37℃で1晩静置培養し
た。培養後、該培養液に50%グリセロールを0.05mlずつ
添加、混合し、-80℃で保存した。
【０２２１】（３）コスミドライブラリーの作成 Streptomyces avermitilis ATCC31267株ゲノムDNA約0.1
mgを制限酵素MboIで部分消化し、低融点アガロースゲル
を用いたfield-inversion電気泳動（正方向0.3秒、逆方
向0.1秒）を行った。泳動後、約40 kbのDNA断片を多く
含むアガロースゲル画分を集め、該アガロースゲルを65
℃で溶解した。溶解液を順次、フェノール処理、クロロ
ホルムで処理した後、水層を分取しDNAをエタノール沈
殿した。
【０２２２】得られたDNA断片をBamHI消化したpKU402(A
ctonomycetol. 8, 21-25, 1994)と混合し、0.3mg/mlの
濃度とし、T4 DNAリガーゼ (T4 DNA ligase、宝酒造社
製)を用いて連結した。得られた連結産物は、市販のパ
ッケージング エキストラクトであるReady-To-Go Lamb
da Packaging Kit（Amasham社製）を用い、添付実験手
順書に従い、パッケージングし、大腸菌XL-1-BlueMR（S
tratagene社製）株に導入した。
【０２２３】形質導入した大腸菌は、アンピシリンを含
むＬＢ平板培地に塗布し、30℃で１晩培養した。該形質
転換体を、アンピシリン0.1mg/mlを含むＬＢ培地0.05ml
を添加した96穴タイタープレート中で静置培養した後、
該培養液に50%グリセロールを0.05mlずつ添加、混合
し、-80℃で保存した
【０２２４】（４）塩基配列の決定 （４〜１）鋳型の調製 Streptomyces avermitilis ATCC31267株ゲノムの全塩基
配列を全ゲノムショットガン法を基本にして決定した。
該方法で用いた鋳型は上記（２）で調製したライブラリ
ーよりPCR法を用いて調製した。具体的には、アンピシ
リン0.1mg/mlを含むＬＢ培地をウェルあたり0.08mlずつ
分注した96穴タイタ〜プレートに全ゲノムショットガン
ライブラリー由来クローンをレプリケーター（GENETIX
社製）で植菌し、30℃で終夜静置培養を行った。
【０２２５】該培養液を、滅菌水で40倍に希釈し、その
5μlを100μg/mlのM13 forward（5'-GTGCTGCAAGGCGATTA
AGTTGG-3'）（配列番号15104）およびreverseプライマ
ー（5'-TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGA-3'）（配列番号1510
5）、Ex Taq緩衝液（宝酒造社製）、5mmol/l dATP, dGT
P, dCTP, dTTP、0.25U TaKaRa Ex Taq（宝酒造社製）を
含む溶液5μlと混合し、Biometra（Biotron社製）を 用
い、96℃ 5分、引き続きて96℃15秒70℃60秒のサイクル
を20〜40回行い、挿入断片の増幅を行った。
【０２２６】PCR産物精製用キット（Amersham Pharmaci
a Biotech社製）により余剰プライマーおよびヌクレオ
チドの除去を行い、これをシーケンス反応の鋳型として
用いた。また、2本鎖DNAプラスミドを鋳型にして、塩基
配列を決定した。鋳型として用いる2本鎖DNAプラスミド
は以下の方法で取得した。アンピシリン0.05mg/mlを含
むTSB培地（17g/l ペプトン、3g/l 大豆ペプトン、5g/l
塩化ナトリウム、2.5g/l ブドウ糖、2.5g/l リン酸一
水素カリウム、pH7.3）を1 mlずつ分注した96穴プレー
トの各ウェルに、全ゲノムショットガンライブラリー由
来クローンを植菌し、30℃で終夜振とう培養した。
【０２２７】得られた培養液より、プラスミド自動調製
機KURABO PI-50（倉敷紡績社製）、マルチスクリーン(M
illipore社製)等を用い、倉敷紡績社もしくはMillipore
社のプロトコールに従って、2本鎖DNAプラスミドを調製
した。得られた精製2本鎖DNAプラスミドを0.1mg/ml程度
になるように水に溶解しシーケンシングの鋳型として用
いた。
【０２２８】（４〜２）シーケンス反応 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit（PE Biosystems社製）溶液6μlに対し、
M13順方向(M13-21)プライマー、またはM13逆方向(M13RE
V)プライマー〔DNA Research, 5, 1-9 (1998)〕、およ
び上記（４〜１）で調製した鋳型（PCR産物又はプラス
ミド）を混ぜ10μlのシーケンス反応液とした。プライ
マーおよび鋳型の量は各々1.6pmoleおよび50〜200ngで
ある。
【０２２９】該反応液を用い、GeneAmp PCR System 970
0 (PE Biosystems社製)で45サイクルのダイターミネー
ターシーケンス反応を行った。サイクルパラメーターは
ABIPRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kitに付属するマニュアルに従った。サンプル
の精製はMultiScreen HV plate（Millipore社製）を用
い、Millipore社のマニュアルに従って行った。精製さ
れた反応物は〜30℃の暗所で保存した。
【０２３０】ABI PRISM 3700 DNA Analyser（PE Biosys
tems社製）を用い、付属のマニュアルに従い、該乾燥反
応物を分析した。3700 DNA Analyserで得られた約200,0
00反応のデータは、サーバー（アルファサーバーES40；
Compaq社製）へ転送し保存した。約200,000反応分のデ
ータは、ゲノムサイズの約10倍に相当した。
【０２３１】（５）アセンブリ 全ての作業はUNIXプラットフォームに基づき行った。ベ
ースコールをphred(The University of Washington)
で、ベクター配列の除去をCross Match(The University
of Washington)で行い、アセンブリをphrap(The Unive
rsity of Washington)で行った。アセンブリの結果得ら
れるコンティグはグラフィカルエディターconsed（The
University of Washington）を用いて解析した。ベース
コールからアセンブリまでの一連の作業はconsedに付属
するスクリプトphredPhrapを利用することで一括して行
った。
【０２３２】（６）ギャップ部分の塩基配列決定 （３）で構築したコスミドライブラリー中の各コスミド
を（４〜１）に記載した2本鎖DNAプラスミド調製と同様
な方法で調製した。このコスミドの挿入断片末端部の塩
基配列をABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequenci
ng Ready Reaction Kit（PE Biosystems社製)を用い
て、付属するマニュアルに従って決定した。
【０２３３】コスミド約4,000クローンの挿入断片の両
末端のシーケンシングを行い、その配列と一致する
（５）で得られたショットガンシーケンシング由来コン
ティグ中の塩基配列を検索した。この作業により各コス
ミドクローンと各コンティグの連鎖関係を解明し、相互
整列化を行った。また、コンティグではカバーされない
領域（ギャップ部）の配列は、以下の方法で決定した。
【０２３４】コンティグの末端に位置する配列を含むク
ローンを選抜した。これらの中から、挿入断片の片側の
末端のみの配列しか決定されていない約4,000クローン
を選抜して、挿入断片の逆末端の配列を決定した。引き
続き、2つのコンティグに、挿入断片のそれぞれの末端
の配列が含まれるような全ゲノム由来ショットガンライ
ブラリークローンまたはコスミドクローンを同定し、該
クローンの挿入断片の全塩基配列を決定することによ
り、このギャップ部分の塩基配列を決定した。ギャップ
部分をカバーするショットガンライブラリークローンも
しくはコスミドクローンがない場合には、そのコンティ
グ末端の配列に相補するプライマーを作成し、PCRによ
ってギャップ領域のDNA断片を増幅し、これを鋳型とし
たプライマーウォーキング法、もしくは増幅したPCR断
片から調製したショットガンクローンの配列を決定する
ショットガン法によりシーケンシングを行い、該領域の
塩基配列を決定した。
【０２３５】配列精度の低い領域については、consed(T
he University of Washington) のAUTOFINISH機能とNAV
IGATING機能を利用してプライマーを合成し、プライマ
ーウォーキング法により配列決定を行い配列精度を高め
た。このようにして決定したStreptomyces avermitilis
ATCC31267株ゲノムの塩基配列を配列番号1に示す。
【０２３６】（７）ORFの同定と機能推定 配列番号1に示される塩基配列中のORFの同定は、以下の
ように実施した。まず、UNIXプラットフォーム上にてOR
F同定ソフトウェアGlimmer、GeneMark、およびGeneMar
k.hmmを用いて、ソフトウェアに付属するマニュアルに
従って、ORF領域の推定を行った。なお、対応学習資料
として、Streptomyces coelicolor A3(2)の公表データ
1,000 ORFを用いた。それらの結果をもとに、配列番号1
に示される塩基配列中のORFを同定した。
【０２３７】ORFの機能推定は、同定されたORFの塩基配
列をGeneBankデータベース由来の蛋白質コード領域から
なるデータベースであるSwiss-Prot、PIR、GenPept等の
アミノ酸データベースに対して、相同性検索することに
より、または、同定されたORFのアミノ酸配列をGeneBan
kデータベース由来の蛋白質コード領域からなるデータ
ベースであるSwiss-Prot、PIR、GenPept等のアミノ酸デ
ータベースに対して、相同性検索ソフトウェアBLASTを
用いて相同性検索することにより行った。このようにし
て決定したORFの塩基配列を配列番号2〜7551に、また当
該ORFにコードされるアミノ酸配列を配列番号7552〜151
01に示す。
【０２３８】実施例２ 新たなポリケチド化合物オリゴ
マイシンの生合成遺伝子群の探索および同定 （１）オリゴマイシン生合成遺伝子群の探索 Streptomyces avermitilisは抗寄生虫・抗昆虫活性を有
するポリケチド化合物、エバーメクチンを生産するが、
その他に数種のポリケチド化合物を併産している。しか
しながら、これらの生合成遺伝子の存在についての知見
は無く、また、エバーメクチン生合成遺伝子の一部をプ
ローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行っても
明確な同定には至っていない。ところで、ポリケチド合
成酵素遺伝子の解析から機能ドメインのうちのβ-ケト
アシル-ACP合成並びにアシル転移に関するドメインは他
のドメインに比べアミノ酸配列の相同性が高いことが知
られている〔Scinece 252, 675 (1991), Pro. Natl. Ac
ad. Sci. USA. 96, 9509 (1999)〕。
【０２３９】Streptomyces avermitilisの生産するエバ
ーメクチンの生合成遺伝子群の塩基配列のβ-ケトアシ
ル-ACP合成およびアシル転移に関するドメインのアミノ
酸配列と配列番号1に示される塩基配列とのBLAST検索を
行ったところ、数種のポリケチド合成酵素遺伝子と思わ
れる領域が見出された。そのうち全長60 kb以上の遺伝
子群２種について解析を行った。配列番号15102に示さ
れる塩基配列のORF検索を行ったところ、この領域に7つ
のポリケチド合成酵素遺伝子がコードされていることを
確認した。さらに推定されるアミノ酸配列に関してポリ
ケチド合成酵素の各ドメインとの相同性を検索すること
によってドメインの構成を明らかにした（図１）。ドメ
イン構成の解析の結果、7つの推定されたポリケチド合
成酵素は17個のモジュール（アシル側鎖伸長に関わるド
メイン群）が存在し、16回の縮合が行われているものと
推定された。これはオリゴマイシンのポリケチド骨格と
一致していた。
【０２４０】（２）オリゴマイシン生合成遺伝子群の同
定 配列番号15102に示された塩基配列にはオリゴマイシン
の生合成遺伝子群を含んでいることが推定された。この
ことを確認するため、ポリケチド合成酵素をコードする
領域に相同的組換えによる挿入変異を施し、オリゴマイ
シン生産に対する影響を検討した。配列番号15102の塩
基配列のうち、ポリケチド合成酵素をコードしていると
推察される領域の100,926塩基から104,455塩基までの3.
53 kbのBamHI断片を該ポリケチド合成酵素をコードして
いる領域を含むコスミドクローンから切り出し、pUC19
のBamHI部位にサブクローンした。3,530 bpのBamHI断片
にはBglII部位が1あり、この部位にストレプトマイシン
・スペクチノマイシン耐性遺伝子(aad3")を含む1.95 kb
のBamHI断片を連結した。
【０２４１】得られた連結物を大腸菌DH10Bに導入し、
0.1mg/mlのアンピシリン、0.1mg/mlのスペクチノマイシ
ンを含むLA培地で目的の形質転換体を選択した。形質転
換体からプラスミドDNAを抽出した後、BamHIで消化して
クローン化した5.48 kbのBamHI断片を切り出し、pKC7の
BamHI部位に連結した。連結物を大腸菌DH10Bに導入し、
0.05mg/mlのカナマイシン、0.1mg/mlのアンピシリンお
よび0.1mg/mlのスペクチノマイシンを含むLA培地で目的
の形質転換体を選択した。Streptomyces avermitilisは
DamおよびDcmによってメチル化されたDNAを制限するの
で、これらのメチル化欠損大腸菌でDNAを調製したDNAを
用いてStreptomyces avermitilisを形質転換しなければ
ならない。そこで上記で得た形質転換体からプラスミド
DNAを抽出し、damおよびdcm欠損の大腸菌GM2929株を形
質転換した。形質転換体から得たプラスミドDNAを用い
てStreptomyces avermitilisを常法にしたがってプロト
プラストとし、ポリエチレングリコールによって形質転
換し、再生培地に塗布し、30℃で培養した。
【０２４２】培養20時間後に0.1mg/mlのネオマイシンを
含む軟寒天を平板1枚あたり2.5ml重層し、さらに7日間
培養を続けることにより、形質転換体の選択を行った。
選択培地で生育した形質転換体を集め、YMS寒天培地（4
g/l 酵母エキス、10g/l 麦芽エキス、4g/l 可溶性デン
プン、20g/l 寒天、pH 7.5）に塗布し、30℃で7日間培
養した。表面に着生した胞子をかきとり、YMS寒天平板1
枚あたり200コロニーとなるように塗布し、30℃で5日間
培養した。胞子が着生したことを確認し、0.1mg/ml ス
ペクチノマイシンを含むYMS寒天平板培地、および0.002
mg/ml ネオマイシンおよび0.1mg/ml スペクチノマイ
シンを含むYMS寒天平板培地の２種類の培地にレプリカ
し、30℃で5日間培養した。
【０２４３】それぞれのプレートに生育したコロニーの
うち、ネオマイシンに感受性でスペクチノマイシンに耐
性となった、2回交叉の組換えを生じた相同的組換え体
を選択した。ポリケチド合成酵素領域に相同的組換えに
よって挿入変異を有する組換え体を、生産培地（46g/l
グルコース、24g/l ペプトン化牛乳、2.5g/l 酵母エキ
ス、20g/l 寒天、pH7.5）に1平方センチメートルのパッ
チ状に塗布し、28℃で7日間培養した。
【０２４４】培養終了後、パッチ状に生育したそれぞれ
の組換え体をくりぬき、0.5 mlのメタノールで菌体に蓄
積した培養物を抽出した。すべての組換え体の培養物か
らエバーメクチンの蓄積は観察されたが、オリゴマイシ
ンは蓄積していなかった。これらのことから配列番号15
102に含まれる7種のORFはオリゴマイシン生合成酵素を
コードしていることが明らかとなった。
【０２４５】実施例３ 新たなポリケチド化合物ペンタ
エンの生合成遺伝子群の探索および同定 （１）ペンタエン生合成遺伝子群の探索 Streptomyces avermitilisの生産するエバーメクチンの
生合成遺伝子群の塩基配列のβ-ケトアシル-ACP合成お
よびアシル転移に関するドメインのアミノ酸配列と、配
列番号1に示される塩基配列とのBLAST検索を行ったとこ
ろ、数種のポリケチド合成酵素遺伝子と思われる領域が
見出された。そのうち全長60 kb以上の遺伝子群２種の
うちの一つはオリゴマイシンの生合成遺伝子群であるこ
とが明らかになった。もう一種の遺伝子群についてオリ
ゴマイシン生合成遺伝子の解析と同様にORFの検索を行
った。
【０２４６】配列番号15103に示される塩基配列のORF検
索を行ったところ、この領域に5つのポリケチド合成酵
素遺伝子がコードされていることを確認した。さらに推
定されるアミノ酸配列に関してポリケチド合成酵素の各
ドメインとの相同性を検索することによってドメインの
構成を明らかにした（図2）。ドメイン構成の解析の結
果、5つの推定されたポリケチド合成酵素は14個のモジ
ュールが存在し、13回の縮合が行われているものと推定
された。これはペンタエン化合物フィリピンのポリケチ
ド骨格と一致していた。
【０２４７】（２）ペンタエン生合成遺伝子群の同定 配列番号15103に示された塩基配列にはペンタエンの生
合成遺伝子群を含んでいることが推定された。このこと
を確認するため、ポリケチド合成酵素をコードする領域
に相同的組換えによる挿入変異を施し、ペンタエン生産
に対する影響を検討した。配列番号15103の塩基配列の
うち、ポリケチド合成酵素をコードしていると推察され
る領域の43,293塩基から48,851塩基までの5.56 kbのSac
I断片を該ポリケチド合成酵素をコードしている領域を
含むコスミドクローンから切り出し、pUC19のSacI部位
にサブクローンした。5.56 kbのSacI断片にはEcoRV部位
が1個所あり、この部位にストレプトマイシン・スペク
チノマイシン耐性遺伝子(aad3")を含む1.95 kbのDraI断
片を連結した。
【０２４８】得られた連結物を大腸菌DH10Bに導入し、
0.1mg/ml アンピシリンおよび0.1mg/ml スペクチノマ
イシンを含むLA培地で目的の形質転換体を選択した。形
質転換体からプラスミドDNAを抽出した後、EcoRIとHind
IIIで消化してクローン化した7.51 kbのEcoRI-HindIII
断片を切り出し、pKC7のEcoRI/HindIII部位に連結し
た。連結物を大腸菌DH10Bに導入し、0.05mg/ml カナマ
イシン、0.1mg/ml アンピシリンおよび0.1mg/ml スペ
クチノマイシンを含むLA培地で目的の形質転換体を選択
した。
【０２４９】前述したようにStreptomyces avermitilis
はメチル化されたDNAを制限するため上記で得た形質転
換体からプラスミドDNAを抽出し、damおよびdcm欠損の
大腸菌GM2929株を形質転換した。形質転換体から得たメ
チル化フリーのプラスミドDNAを用い、Streptomyces av
ermitilisのプロトプラストにポリエチレングリコール
法で形質転換し、再生培地に塗布し、30℃で培養した。
【０２５０】培養20時間後に0.1mg/mlのネオマイシンを
含む軟寒天を平板1枚あたり2.5ml重層し、さらに7日間
培養を続けることにより、形質転換体を選択した。選択
培地で生育した形質転換体を集め、YMS寒天培地（4 g/l
酵母エキス、10g/l 麦芽エキス、4g/l 可溶性デンプ
ン、20g/l 寒天、pH 7.5）に塗布し、30℃で７日間培養
した。表面に着生した胞子をかきとり、YMS寒天平板1枚
あたり200コロニーとなるように塗布し、30℃で5日間培
養した。
【０２５１】胞子が着生したことを確認し、0.1mg/mlの
スペクチノマイシンを含むYMS寒天平板培地、および0.0
02 mg/ml ネオマイシンおよび0.1mg/ml スペクチノマ
イシンを含むYMS寒天平板培地の２種類の培地にレプリ
カし、30℃で５日間培養した。それぞれのプレートに生
育したコロニーのうち、ネオマイシンに感受性でスペク
チノマイシンに耐性となった、２回交叉の組換えを生じ
た相同的組換え体を選択した。
【０２５２】ポリケチド合成酵素領域に相同的組換えに
よって挿入変異を有する組換え体を、生産培地（40g/l
可溶性デンプン、20g/l脱脂大豆、0.5g/l 硫酸第一鉄7
水和物、1g/l リン酸二カリウム、0.3g/l 塩化カリウ
ム、20g/l 寒天、pH6.5）に1平方センチメートルのパッ
チ状に塗布し、28℃で７日間培養した。培養終了後、パ
ッチ状に生育したそれぞれの組換え体をくりぬき、0.5
mlのメタノールで菌体に蓄積した培養物を抽出した。す
べての組換え体の培養物からエバーメクチンの蓄積は観
察されたが、ペンタエンは蓄積していなかった。これら
のことから配列番号15103に含まれる5種のORFはペンタ
エン生合成酵素をコードしていることが明らかとなっ
た。
【０２５３】上記に示した新たなポリケチド化合物の生
合成遺伝子群の発見から例証されるように、本発明は、
従来の分子遺伝学的なクローニングの手法を用いずにポ
リケチド化合物の生合成遺伝子群を発見する上で、有効
かつ迅速な探索方法を提供するものである。さらに発見
されたポリケチド合成酵素のドメイン構成は新規ポリケ
チド化合物創製にとっても有用な情報を提供するもので
ある。このポリケチド化合物の迅速なる探索方法論は、
本発明で開示したゲノムの塩基配列情報を利用すること
によって効率的に実施できるアプローチであり、その有
効性は、本発明によって初めて見出されたものである。
【０２５４】実施例４ Streptomyces avermitilisゲノ
ム配列を用いたホモログ検索 （１）トランスケトラーゼ(Transketolase)の検索 Swiss-protデータベースより、トランスケトラーゼ（Tr
ansketolase；EC2.2.1.1）としての機能が確認されてい
る蛋白質のアミノ酸配列として大腸菌 トランスケトラ
ーゼの配列（ECTKT）を入手した。このアミノ酸配列の
全長をクエリーとして、Streptomyces avermitilisのゲ
ノム配列からなる塩基配列データベースに対して、また
はゲノム配列から予測したORF領域のアミノ酸配列から
なるデータベースに対して、FASTAプログラムを用いて
相同性検索を行った。E-valueが10 -10以下であることを
もって有為な相同性を有すると判定した。
【０２５５】その結果、Streptomyces avermitilisのゲ
ノム配列からなる塩基配列データベースまたはゲノム配
列から予測したORF領域のアミノ酸配列からなるデータ
ベース内から、配列番号1755で表される塩基配列を有す
るORF、および配列番号6292で表される塩基配列を有す
るORFによってコードされるアミノ酸配列に、大腸菌ト
ランスケトラーゼ のORFとの有為な相同性が見出され
た。
【０２５６】これらのORFにコードされるアミノ酸配列
と他の生物種のトランスケトラーゼとの類似性をより詳
細に調べるために、これらのアミノ酸配列をクエリーと
して、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)nr-aa
データベース、PDBデータベース、Swiss-Protデータベ
ース、PIRデータベース、PRFデータベースに登録されて
いるものから、重複を除いて作成されたアミノ酸配列デ
ータベース）に対して、BLASTプログラムを用いて検索
を行った。
【０２５７】その結果、これら２つのアミノ酸配列のい
ずれも、他生物種のトランスケトラーゼに対して有為な
相同性を示し、かつ他蛋白質のアミノ酸配列との相同性
と比較して明らかにトランスケトラーゼに対する相同性
が高かったことから、これら２つのORFがコードするア
ミノ酸配列を有する蛋白質はトランスケトラーゼとして
機能していると推定された。これらのことから、Strept
omyces avermitilisにはトランスケトラーゼ活性を有す
る蛋白質をコードするORFが２つ存在することが推定さ
れた。
【０２５８】（２）トランスアルドラーゼ(Transaldola
se)の検索 Swiss-protデータベースより、 トランスアルドラーゼ
（Transaldolase；EC2.2.1.2）としての機能が確認され
ている蛋白質のアミノ酸配列として大腸菌 トランスケ
トラーゼの配列TalA（D13159）およびをTalB(S80045)入
手した。これらのアミノ酸配列の全長をクエリーとし
て、Streptomyces avermitilisのゲノム配列からなる塩
基配列データベースに対して、またはゲノム配列から予
測したORF領域のアミノ酸配列からなるデータベースに
対して、FASTAプログラムを用いて相同性検索を行っ
た。E-valueが10-10以下であることをもって有為な相同
性を有すると判定した。
【０２５９】その結果、Streptomyces avermitilisのゲ
ノム配列からなる塩基配列データベースまたはゲノム配
列から予測したORF領域のアミノ酸配列からなるデータ
ベース内から、配列番号1756で表される塩基配列を有す
るORF、および配列番号6291で表される塩基配列を有す
るORFによってコードされるアミノ酸配列に、大腸菌ト
ランスケトラーゼ TalAおよびTalBのORFとの有為な相同
性が見出された。
【０２６０】これらのORFにコードされるアミノ酸配列
と他の生物種のトランスケトラーゼとの類似性をより詳
細に調べるために、これらのアミノ酸配列をクエリーと
して、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)nr-aa
データベース、PDBデータベース、Swiss-Protデータベ
ース、PIRデータベース、PRFデータベースに登録されて
いるものから、重複を除いて作成されたアミノ酸配列デ
ータベース）に対して、BLASTプログラムを用いて検索
を行った。
【０２６１】その結果、これら２つのアミノ酸配列のい
ずれも、他生物種の トランスアルドラーゼ に対して有
為な相同性を示し、かつ他蛋白質のアミノ酸配列との相
同性と比較して明らかに トランスアルドラーゼ に対す
る相同性が高かったことから、これら２つのORFがコー
ドするアミノ酸配列を有する蛋白質は トランスアルド
ラーゼ として機能していると推定された。これらのこ
とから、Streptomycesavermitilisにはトランスケトラ
ーゼ活性を有する蛋白質をコードするORFが２つ存在す
ることが推定された。なお、配列番号1756に示されるOR
Fは配列番号1755に示されるORFの下流に隣接していた。
一方、配列番号6291に示されるORFも配列番号6292に示
されるORFの下流に隣接していた。
【０２６２】（３）グルコース-6-リン酸デヒドロゲナ
ーゼ(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)の検索 Swiss-protデータベースより、グルコース-6-リン酸 デ
ヒドロゲナーゼ(Glucose-6-phosphate dehydrogenase；
EC1.1.1.49)としての機能が確認されている蛋白質のア
ミノ酸配列として大腸菌グルコース-6-リン酸 デヒドロ
ゲナーゼの配列（アクセッション番号M55005）を入手し
た。このアミノ酸配列の全長をクエリーとして、Strept
omyces avermitilisのゲノム配列からなる塩基配列デー
タベースに対して、またはゲノム配列から予測したORF
領域のアミノ酸配列からなるデータベースに対して、FA
STAプログラムを用いて相同性検索を行った。E-valueが
10 -10以下であることをもって有為な相同性を有すると
判定した。
【０２６３】その結果、Streptomyces avermitilisのゲ
ノム配列からなる塩基配列データベースまたはゲノム配
列から予測したORF領域のアミノ酸配列からなるデータ
ベース内から、配列番号1757で表される塩基配列を有す
るORF、および配列番号6290で表される塩基配列を有す
るORFによってコードされるアミノ酸配列に、大腸菌グ
ルコース-6-リン酸 デヒドロゲナーゼのORFとの有為な
相同性が見出された。
【０２６４】これらのORFにコードされるアミノ酸配列
と他の生物種のトランスケトラーゼとの類似性をより詳
細に調べるために、これらのアミノ酸配列をクエリーと
して、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)nr-aa
データベース、PDBデータベース、Swiss-Protデータベ
ース、PIRデータベース、PRFデータベースに登録されて
いるものから、重複を除いて作成されたアミノ酸配列デ
ータベース）に対して、BLASTプログラムを用いて検索
を行った。
【０２６５】その結果、これら２つのアミノ酸配列のい
ずれも、他生物種のグルコース-6-リン酸 デヒドロゲナ
ーゼに対して有為な相同性を示し、かつ他蛋白質のアミ
ノ酸配列との相同性と比較して明らかにグルコース-6-
リン酸 デヒドロゲナーゼに対する相同性が高かったこ
とから、これら２つのORFがコードするアミノ酸配列を
有する蛋白質はグルコース-6-リン酸 デヒドロゲナーゼ
として機能していると推定された。これらのことから、
Streptomyces avermitilisにはグルコース-6-リン酸 デ
ヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするORFが
２つ存在することが推定された。なお、配列番号1757に
示されるORFは配列番号1756に示されるORFの下流に隣接
していた。一方、配列番号6290に示されるORFも配列番
号6291に示されるORFの下流に隣接していた。
【０２６６】以上のことから配列番号1755に示されるOR
F、配列番号1756に示されるORFと配列番号1757に示され
るORFはオペロンを形成しており、また、配列番号6292
に示されるORF、配列番号6291に示されるORFと配列番号
6290に示されるORFもオペロンを形成していることが明
らかとなった。
【０２６７】実施例５ 新たな２次代謝産物生合成遺伝
子群の探索 Streptomyces属は多種多様の２次代謝産物を生産するこ
とが知られている。これらの２次代謝産物は生合成の様
式によって、メラニン、β-ラクタム、ペプチド、アミ
ノグリコシド、芳香族ポリケチド（テトラサイクリン、
キノン、アンスラサイクリンなど芳香環を含む物）、マ
クロライド（大環状ラクトン・ラクタムを含む）、シキ
ミ酸、テルペン、およびシデロフォアー系化合物などに
分類することができる。メラニン化合物は芳香族アミノ
酸代謝物が縮合し生成する。β-ラクタムおよびペプチ
ド系化合物はアミノ酸がリボソームによるペプチド伸長
を経ずにペプチド合成酵素によって縮合して生成する。
アミノグリコシド系抗生物質は糖およびアミノサイクリ
トールが配糖化して生成する。芳香族ポリケチド化合物
は酢酸あるいはマロン酸がII型ポリケチド合成酵素によ
って縮合、脱水、環化を経て生成する。マクロライドな
どの大環状ラクトン（ラクタムも含む）は酢酸、プロピ
オン酸などの低級脂肪酸あるいはそれらのジカルボン酸
がI型ポリケチド合成酵素によって縮合、還元などを経
たのち環化して生成する。シキミ酸系化合物は芳香族ア
ミノ酸が代謝されて生成する。テルペン系化合物はイソ
プレノイド-２リン酸が縮合して生成される。さらにシ
デロフォアー系化合物はコハク酸やジアミノカルボン酸
が結合して生成する。
【０２６８】既に報告がされているこれらの２次代謝産
物生合成酵素のアミノ酸配列と配列番号1に示される塩
基配列とのBLAST検索を行ったところ、エバーメクチ
ン、オリゴマイシンおよびポリエン化合物の他に27種の
２次代謝産物生合成遺伝子群と推定される領域が見出さ
れた。これら27種の遺伝子群の内訳はメラニン生成(芳
香族メラニンを含む)に関与する遺伝子群４種、テルペ
ン化合物生成に関与する遺伝子群５種、シデロフォアー
生成に関与する遺伝子群１種、ポリケチドラクトンある
いはラクタム化合物生成(I型ポリケチド合成酵素が関
与)に関与する遺伝子群６種、芳香族ポリケチド化合物
生成(II型ポリケチド合成酵素が関与)に関与する遺伝子
群２種、それ以外のポリケチド化合物生成(I型、II型ポ
リケチド合成酵素以外のポリケチド合成酵素が関与)に
関与する遺伝子群１種、ペプチド化合物生成(ペプチド
合成酵素が関与)に関与する遺伝子群８種であった。以
下にそれぞれの遺伝子群に含まれる配列を示す。
【０２６９】(1)メラニン生成に関与する遺伝子群 1)Mel1(tyrosinase関与)領域には配列番号1125及び配列
番号1126に示したORFが存在した。 2)Mel2(tyrosinase関与)領域には配列番号5345及び配列
番号5346に示したORFが存在した。 3)Hpd(hydroxylphenylpyruvate dioxygenase関与)領域
には配列番号5133及び配列番号5134に示したORFが存在
した。 4)Spp(II型ポリケチド合成酵素関与)領域には配列番号2
821〜2830に示したORFが存在した。
【０２７０】(2)テルペン化合物生成に関与する遺伝子
群 1)Crt領域には配列番号1008〜1014に示したORFが存在し
た。 2)Terp領域には配列番号77に示したORFが存在した。 3)Shr領域には配列番号1638〜1643に示したORFが存在し
た。 4)Geo領域には配列番号2151〜2153に示したORFが存在し
た。 5)Ptc領域には配列番号2986〜2988に示したORFが存在し
た。 (3)シデロフォアー生成に関与する遺伝子群 1)Sdf領域には配列番号5252〜5256に示したORFが存在し
た。
【０２７１】(4)ポリケチドラクトン(あるいはラクタ
ム)生成に関与する遺伝子群 1)Pks-1領域には配列番号7337〜7341に示したORFが存在
した。 2)Pks-2領域には配列番号1539〜1542に示したORFが存在
した。 3)Pks-3領域には配列番号2263〜2272に示したORFが存在
した。 4)Pks-4領域には配列番号7163〜7168に示したORFが存在
した。 5)Pks-5領域には配列番号2353〜2356に示したORFが存在
した。 6)Pks-11領域には配列番号101及び配列番号102に示した
ORFが存在した。
【０２７２】(5)芳香族ポリケチド化合物生成に関与す
る遺伝子群 1)Pks-8領域には配列番号3637〜3653に示したORFが存在
した。 2)Pks-9領域には配列番号2359〜2376に示したORFが存在
した。 (6)I型およびII型ポリケチド合成酵素以外の合成酵素で
生合成されるポリケチド化合物生成に関与する遺伝子群 1)Pks-10領域には配列番号7109及び配列番号7110に示し
たORFが存在した。
【０２７３】(7)ペプチド化合物生成に関与する遺伝子
群 1)Nrps-1領域には配列番号3179〜3190に示したORFが存
在した。 2)Nrps-2領域には配列番号3621〜3635に示したORFが存
在した。 3)Nrps-3領域には配列番号3143〜3152に示したORFが存
在した。 4)Nrps-4領域には配列番号7142〜7145に示したORFが存
在した。 5)Nrps-5領域には配列番号6586〜6611に示したORFが存
在した。 6)Nrps-6領域には配列番号595〜603に示したORFが存在
した。 7)Nrps-7領域には配列番号825〜859に示したORFが存在
した。 8)Nrps-8領域には配列番号1238〜1241に示したORFが存
在した。
【０２７４】上記のI型ポリケチド合成酵素によるポリ
ケチドラクトン(あるいはラクタム)生成に関与する遺伝
子群およびペプチド化合物生成に関与する遺伝子群のOR
Fのうち、ポリケチド合成酵素ならびにペプチド合成酵
素をコードしている領域は多機能ポリペプチドと推定さ
れる。これらのポリペプチドに存在する機能ドメインの
推定はポリケチド合成酵素およびペプチド合成酵素のそ
れぞれの機能ドメインのコンセンサス配列〔Scinece 25
2, 675 (1991), Pro. Natl. Acad. Sci. USA.96, 9509
(1999), Chem. & Biol. 6, 493 (1999)〕を調べること
によって推定することが可能である。表１にポリケチド
合成酵素と推定されるORFの機能ドメインを、表２には
ペプチド合成酵素と推定されるORFの機能ドメインなら
びに活性化される推定アミノ酸についてまとめた。
【０２７５】
【表１】
【０２７６】*はコンセンサス配列領域のアミノ酸の置
換あるいは欠失により機能していないものと推定
【０２７７】
【表２】
【０２７８】*Grs（グラミシジン合成酵素）ペプチド合
成酵素アデニリル化ドメインからのアミノ酸配列を基準
にしたN末端側からの番号。 **既存のコンセンサス配列が見出せないかあるいはアデ
ニリル化ドメインが存在しない。 ***機能ドメインの略語の説明: C, 縮合酵素; A, アデ
ニリル化酵素; T, ペプチドキャリアー蛋白; E, 転移酵
素; Te, チオエステラーゼ
【０２７９】実施例６ エバーメクチン生産向上に有効
な遺伝子の検索およびゲノム情報に基づくエバーメクチ
ン生産向上株の再構築 （１）エバーメクチン生産向上に有効な遺伝子の検索 S.avermitilis ATCC31267（野生株）とこの野生株から
変異誘起剤N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン
によるランダム変異と選択を多段階にわたり繰り返すこ
とによって得られた、エバーメクチン高生産変異株をエ
バーメクチン生産培地で培養し、24時間目および48時間
目の菌体内タンパク質と転写産物の全RNAを比較した。
その結果、数種のmRNAの転写量が異なっていることが観
察され、さらに生産培地を代え再確認したところ、これ
らのうちの２種の遺伝子の発現量が変化していることが
明らかとなった。これらの２種のmRNAのcDNA断片の部分
配列を調べたところ、配列番号3692および配列番号923
であった。配列番号923のORFはエバーメクチン生合成遺
伝子群に存在する、制御遺伝子と同定された。一方、配
列3692は新規なORFであった。配列3692に相当するmRNA
はエバーメクチン高生産株からは少量しか検出されない
ことから、当該ORFの遺伝子産物はS.avermitilisにおけ
るエバーメクチン生産に対するリプレッサーであると推
定された。
【０２８０】（２）エバーメクチン高生産株の再構築 S. avermitilis ATCC31267から変異誘起剤N-メチル-N'-
ニトロ-N-ニトロソグアニジンによるランダム変異と選
択を多段階にわたり繰り返すことによって得られた、エ
バーメクチン高生産変異株はリプレッサーである配列36
92に示したORFの遺伝子産物の発現が減少しているため
にエバーメクチンの生産が上昇しているものと推察され
た。そこで、野生株の配列番号3692に示すORFを破壊す
ることによって、エバーメクチンの生産の向上が期待で
きる。S.avermitilis ATCC31267の染色体DNAから配列番
号3692に示すORF部分およびその上流と下流を含む部分
をPCRで増幅し、ORFのほぼ中央に耐性遺伝子を配置した
DNA断片を作製し、それを野生株の染色体の同じ領域と
相同的組換えを生じさせ破壊株を作製した。配列番号OR
F3692の上流側の増幅にはプライマー1（5'- CTCGAGGATC
CGAGCGCTTCAGCACGTCGGAGATGGTT-3'）（配列番号15106）
とプライマー2（5'-CTCGAGAAGCTTCACCCAGATCACCAGGTTGT
CGCCCTCG-3'）（配列番号15107）を用い、S. avermitil
is ATCC31267の染色体DNAを鋳型としてdATP, dGTP, dCT
P, dTTP存在下Expand Taq DNA ポリメラーゼ（ベーリン
ガーマンハイム社製）0.2Uを加え、96℃、5分間で変性
させ、さらに98℃、15秒、70℃、60秒のサイクルを30回
行い、1861 bpの断片を増幅した。一方、配列番号ORF36
92の下流側の増幅にはプライマー3（5'- CTCGAGAAGCTTG
GAGCCGTACCCGTTGACGATGAAGGACC-3'）（配列番号15108）
とプライマー4（5'- CTCGAGGATCCATCTGATGCCGTCCTTCGCC
ATGCC-3'）（配列番号15109）を用い、S. avermitilis
ATCC31267の染色体DNAを鋳型としてdATP,dGTP, dCTP, d
TTP存在下Expand Taq DNA ポリメラーゼ（ベーリンガー
マンハイム社製）0.2Uを加え、96℃、5分間で変性さ
せ、さらに98℃、15秒、70℃、60秒のサイクルを30回行
い、1656 bpの断片を増幅した。それぞれの増幅断片をB
amHIおよびHindIIIで消化し、これら２の断片をHindIII
で消化したpUC19と混合し、T4 DNAポリメラーゼ、ATPを
加えて、３断片の連結を行った。連結物を大腸菌DH10B
に導入し、0.1mg/mlアンピシリンを含むLA培地で目的の
形質転換体を選択した。形質転換体からプラスミドDNA
を抽出した後、BamHIで部分消化し、さらにストレプト
マイシン・スペクチノマイシン耐性遺伝子(aad3")を含
む1.95kbのBamHI断片を連結した。連結物を大腸菌DH10B
に導入し、0.1mg/mlアンピシリンおよび0.1mg/mlスペク
チノマイシンを含むLA培地で形質転換体を選択した。そ
れぞれの形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、Ec
oRI/HindIIIで切断し、ストレプトマイシン・スペクチ
ノマイシン耐性遺伝子(aad3")がベクターのクローニン
グ部位のBamHIではなく、クローン化した断片の中央に
配置したクローンを選択した。目的の形質転換体からプ
ラスミドDNAを抽出した後、HindIIIで消化してクローン
化した5.47kbのHindIII断片を切り出し、pKC7のHindIII
部位に連結した。連結物を大腸菌DH10Bに導入し、0.05m
g/mlカナマイシン、0.1mg/mlアンピシリンおよび0.1mg/
mlスペクチノマイシンを含むLA培地で目的の形質転換体
を選択した。前述したようにStreptomyces avermitilis
はメチル化されたDNAを制限するため上記で得た形質転
換体からプラスミドDNAを抽出し、damおよびdcm欠損の
大腸菌GM2929株を形質転換した。形質転換体から得たメ
チル化フリーのプラスミドDNAを用い、Streptomyces av
ermitilis ATCC31267のプロトプラストにポリエチレン
グリコール法で形質転換し、再生培地に塗布し、30℃で
培養した。培養20時間後に0.1mg/mlのネオマイシンを含
む軟寒天を平板１枚あたり2.5ml重層し、さらに７日間
培養を続けることにより、形質転換体を選択した。選択
培地で生育した形質転換体を集め、YMS寒天培地（4g/l
酵母エキス、10g/l麦芽エキス、4g/l可溶性デンプン、2
0g/l寒天、pH 7.5）に塗布し、30℃で７日間培養した。
表面に着生した胞子をかきとり、YMS寒天平板１枚あた
り200コロニーとなるように塗布し、30℃で５日間培養
した。
【０２８１】胞子が着生したことを確認し、0.1mg/mlの
スペクチノマイシンを含むYMS寒天平板培地、および0.0
02mg/mlネオマイシンおよび0.1mg/mlスペクチノマイシ
ンを含むYMS寒天平板培地の２種類の培地にレプリカ
し、30℃で５日間培養した。それぞれのプレートに生育
したコロニーのうち、ネオマイシンに感受性でスペクチ
ノマイシンに耐性となった、２回交叉の組換えを生じた
相同的組換え体を選択した。染色体上の配列番号3692に
示されるORFに相同的組換えによって挿入変異を有する
組換え体を、生産培地（46g/lグルコース、24g/lペプト
ン化牛乳、2.5g/l酵母自己消化物 pH7.5）10 mlを含む1
00 ml容三角フラスコに移植し、28℃で７日間振盪培養
した。培養終了後、10 mlのメタノールを加え30分間振
盪し培養物を抽出した。菌体残渣を3,000rpm５分間の遠
心分離によって除去し、上清を得た。上清に含まれるエ
バーメクチンの量をODSカラム(4.6φmm × 250 mm; 移
動層; メタノール-水=80:20)を用い定量した。S. averm
itilis ATCC31267はおよそ5μg/mlのエバーメクチンを
蓄積していたが、配列番号3692に示したORFが破壊され
た組換え体からはおよそ28μg/mlのエバーメクチンの蓄
積が認められた。以上示したエバーメクチン生産向上株
の再構築から例証されるように、本発明は、従来の変異
育種の欠点を排除して工業的に有利な菌株を取得する上
で、有効かつ新規な育種方法を提供する。この有効変異
を再構成して生産菌を再構成する方法論は、本発明で開
示したゲノムの塩基配列を利用することによって効率的
に実施できるアプローチであり、その有効性は、本発明
により初めて見出されたものである。
【０２８２】
【発明の効果】本発明により、放線菌由来のポリヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチド、該ポリヌクレオチド
および/またはオリゴヌクレオチドを固着したオリゴヌ
クレオチドアレイ、ポリヌクレオチドにコードされるポ
リペプチド、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペ
プチドおよび/または該抗体を固着したポリペプチドア
レイ、該ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの
塩基配列並びに該ポリペプチドのアミノ酸配列を記録し
たコンピュータで読みとり可能な記録媒体および該記録
媒体を用いるコンピュータを用いたシステムを提供する
ことができる。
【０２８３】
【配列表のフリーテキスト】配列番号15104−人工配列
の説明：合成ＤＮＡ 配列番号15105−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号15106−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号15107−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号15108−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号15109−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０２８４】
【配列表】
配列表は公開・登録公報長大データＣＤ−ＲＯＭ「１５
（２００３）−００３（００６）」を参照。
【図面の簡単な説明】
【図１】Streptomyces avermitilis ATCC31267株のゲノ
ム上のオリゴマイシン生合成に関与する領域の遺伝子の
構成示した図である。
【図２】Streptomyces avermitilis ATCC31267株のゲノ
ム上のペンタエン生合成に関与する領域の遺伝子の構成
示した図である。
【図３】本発明のシステムを用いた例のフローチャート
である。
【図４】本発明のシステムを用いた例のフローチャート
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 ５Ｂ０７５ 1/20 Ｃ１２Ｐ 17/06 1/21 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 17/06 1/68 Ａ 21/02 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:01 1/68 1:465 // Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｃ１２Ｒ 1:045 (Ｃ１２Ｑ 1/02 1:03 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:29 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/02 15/00 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:045） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:03） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:29） (72)発明者 池田 治生 神奈川県川崎市幸区新塚越１−２−５− 1103 (72)発明者 石川 淳 神奈川県相模原市相模原１−１−23−704 (72)発明者 菊池 久 東京都渋谷区西原２−49−10 独立行政法 人製品評価技術基盤機構内 (72)発明者 堀川 博司 東京都渋谷区西原２−49−10 独立行政法 人製品評価技術基盤機構内 (72)発明者 柴 忠義 東京都武蔵野市境南町５−５−22 (72)発明者 榊 佳之 神奈川県横浜市金沢区釜利谷南２−51−42 (72)発明者 服部 正平 東京都府中市宮町１−36−５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA67 BA80 CA03 CA09 GA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ06 QQ12 QQ41 QQ79 QR16 QR32 QR56 QR75 QR80 QR82 QS14 QS16 QS34 QS38 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01Y AA15X AA22X AA24X AA26X AA32X AA41X AA48X AA50X AA50Y AA73X AA77X AA79X AA88X AA90X AA91X AB01 AC14 BA02 CA24 CA34 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA11 DA75 EA20 EA29 FA72 FA73 FA74 5B075 ND20 UU18 UU19

Claims (53)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ［１］放線菌の変異株由来の遺伝子の変
    異点を同定、［２］放線菌由来の遺伝子の発現量を測
    定、［３］放線菌由来の遺伝子の発現プロファイルを解
    析、［４］放線菌由来の遺伝子の発現パターンを分析、
    または［５］被検遺伝子と相同な遺伝子を放線菌で検索
    するための、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を有する方法； （ａ）配列番号1〜7551のいずれかに示される塩基配列
    からなる第１のポリヌクレオチド類、該ポリヌクレオチ
    ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第
    ２のポリヌクレオチド類、または第１または第２のポリ
    ヌクレオチド類の連続する少なくとも10〜200塩基配列
    からなる第３のポリヌクレオチド類からなる群から選ば
    れる2種類以上のポリヌクレオチドを固体支持体に固着
    し、ポリヌクレオチドアレイを作製する工程、（ｂ）該
    ポリヌクレオチドアレイに固着されたポリヌクレオチド
    と、放線菌由来の標識化ポリヌクレオチド、放線菌の変
    異株由来の標識化ポリヌクレオチドまたは被検標識化ポ
    リヌクレオチドの少なくとも一つとをハイブリダイズ条
    件下でインキュベートする工程、（ｃ）ハイブリダイゼ
    ーションを検出する検出工程、および（ｄ）ハイブリダ
    イゼーション結果を解析する解析工程。
  2. 【請求項２】 放線菌が、Streptomyces属、Streptospo
    rangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、Nocard
    ioides属、Pseudonocardia属、Actinobispora属、Sacch
    aromonospora属、Saccharopolyspora属、Saccharothrix
    属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、Microbispor
    a属、Microtetraspora属、Thermomonospora属、またはM
    icromonospora属に属する微生物である、請求項１記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 Streptomyces属に属する微生物がStrept
    omyces avermitilisから選ばれる微生物である、請求項
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 放線菌由来の標識化ポリヌクレオチド、
    放線菌の変異株由来の標識化ポリヌクレオチドまたは被
    検標識化ポリヌクレオチドが、アミノ酸、核酸、ビタミ
    ン、糖、有機酸、抗生物質、およびそれらの類縁体から
    選ばれる少なくとも一種の生合成に関わる遺伝子である
    請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 被検ポリヌクレオチドが、Escherichia
    coli由来の被検ポリヌクレオチドである、請求項１記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 配列番号1〜7551のいずれかに示される
    塩基配列からなる第１のポリヌクレオチド類、該第１の
    ポリヌクレオチド類とストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズする第２のポリヌクレオチド類、または第１
    または第２のポリヌクレオチド類の連続する少なくとも
    10〜200塩基配列からなる第３のポリヌクレオチド類か
    らなる群の中から選ばれる２種類以上のポリヌクレオチ
    ドを、固体支持体に固着したポリヌクレオチドアレイ。
  7. 【請求項７】 配列番号1〜7551のいずれかに示される
    塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレ
    オチドと80％以上の相同性を有するポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 配列番号2〜7551のいずれかに示される
    塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレ
    オチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
    るポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 配列番号7552〜15101のいずれかに示さ
    れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
    リヌクレオチドまたは該ポリヌクレチドとストリンジェ
    ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 配列番号2〜7551に示される塩基配列
    を有するポリヌクレオチドにおいて、タンパク質をコー
    ドするポリヌクレオチドの５'上流または３'下流に位置
    し、該ポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する
    ポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 請求項７〜１０のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチドが有する塩基配列中の連続する少な
    くとも10〜200塩基からなる配列を有するポリヌクレオ
    チドまたは該ポリヌクレオチドと相補的な配列を有する
    ポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項８〜１１のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチドを含む組換え体DNA。
  13. 【請求項１３】 請求項８〜１１のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載の組換え体DN
    Aを含む形質転換体。
  14. 【請求項１４】 請求項１３記載の形質転換体を培地に
    培養し、培養物中に請求項８または９に記載のポリヌク
    レオチドにコードされるポリペプチドを生成蓄積させ、
    該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とす
    る該ポリペプチドの製造方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１３記載の形質転換体を培地に
    培養し、培養物中に抗生物質を含む生物活性物質および
    それらの類縁体から選ばれる少なくとも一種を生成蓄積
    させ、該培養物から抗生物質を含む生物活性物質および
    それらの類縁体から選ばれる少なくとも一種を採取する
    ことを特徴とする抗生物質を含む生物活性物質、および
    それらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の製造法。
  16. 【請求項１６】 配列番号2〜7551から選ばれる塩基配
    列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 配列番号7552〜15101から選ばれるア
    ミノ酸配列を有するポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 請求項１６または１７記載のポリペプ
    チドのアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠
    失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
    り、かつアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加
    されていない該ポリペプチドの有する活性と実質的に同
    一の活性を有するポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１６または１７記載のポリペプ
    チドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ
    酸配列を含み、かつ該ポリペプチドの有する活性と実質
    的に同一の活性を有するポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１６〜１９のいずれか1項に記
    載のポリペプチドを認識する抗体。
  21. 【請求項２１】 請求項１６〜１９に記載のポリペプチ
    ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
    ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを１種
    類以上、個体支持体に固着したポリペプチドアレイ。
  22. 【請求項２２】 請求項１６〜１９に記載のポリペプチ
    ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
    ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを認識
    する抗体を１種類以上、個体支持体に固着したポリペプ
    チドアレイ。
  23. 【請求項２３】 放線菌由来の標的配列または標的構造
    モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の手段を備
    えることを特徴とするコンピュータを用いたシステム； (i)配列番号1〜7551から選ばれる1以上の塩基配列情
    報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
    するための入力手段、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録するため
    のデータ記録手段、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号1〜
    7551から選ばれる１以上の塩基配列情報と標的配列また
    は標的構造モチーフ情報とを比較し、標的配列または標
    的構造モチーフ情報と一致または類似する塩基配列情報
    を検索または解析するコンパレータ手段、および (iv)該コンパレータ手段により得られた検索または解析
    結果を表示するための出力手段。
  24. 【請求項２４】 放線菌由来の標的配列または標的構造
    モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含
    むことを特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号1〜7551から選ばれる1以上の塩基配列情
    報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
    する工程、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する工
    程、 (iii)配列番号1〜7551から選ばれる１以上の塩基配列情
    報と標的配列または標的構造モチーフ情報とを比較する
    工程、および (iv)標的配列または標的構造モチーフ情報と一致または
    類似する塩基配列情報を検索または解析する工程。
  25. 【請求項２５】 放線菌由来の標的配列または標的構造
    モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の手段を備
    えることを特徴とするコンピュータを用いたシステム； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸
    配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
    を入力するための入力手段、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録するため
    のデータ記録手段、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号755
    2〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸配列情報と標的
    配列または標的構造モチーフ情報とを比較し、標的配列
    または標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミ
    ノ酸配列情報を検索または解析するコンパレータ手段、
    および (iv)該コンパレータ手段により得られた検索または解析
    結果を表示するための出力手段。
  26. 【請求項２６】 放線菌由来の標的配列または標的構造
    モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含
    有することを特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸
    配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
    を入力するための入力する工程、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する工
    程、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号755
    2〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸配列情報と標的
    配列または標的構造モチーフ情報とを比較する工程、お
    よび (iv)標的配列または標的構造モチーフ情報と一致または
    類似するアミノ酸配列情報を検索または解析する工程。
  27. 【請求項２７】 放線菌由来の標的塩基配列を有するポ
    リヌクレオチドにコードされるポリペプチドの機能を決
    定するための、下記(i)〜(iv)の手段を備えることを特
    徴とするコンピュータを用いたシステム； (i)配列番号2〜7551から選ばれる１以上の塩基配列情報
    および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
    報、並びに標的塩基配列情報を入力するための入力手
    段、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録するため
    のデータ記録手段、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号2〜
    7551から選ばれる1以上の塩基配列情報と標的塩基配列
    情報とを比較し、配列番号2〜7551から選ばれる1以上の
    塩基配列を有するポリヌクレオチドと一致または類似す
    る標的塩基配列を有するポリヌクレオチドがコードする
    ポリペプチドの機能を決定するコンパレータ手段、およ
    び (iv)該コンパレータ手段により得られた機能を表示する
    ための出力手段。
  28. 【請求項２８】 放線菌由来の標的塩基配列を有するポ
    リヌクレオチドにコードされるポリペプチドの機能を決
    定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含むことを特徴
    とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号2〜7551から選ばれる１以上の塩基配列情報
    および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
    報、並びに標的塩基配列情報を入力する工程、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する工
    程、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号1の
    塩基配列情報と標的塩基配列情報とを比較する工程、 (iv)配列番号2〜7551から選ばれる１以上の塩基配列を
    有するポリヌクレオチドと一致または類似する標的塩基
    配列を有するポリヌクレオチドがコードするポリペプチ
    ドの機能を決定する工程。
  29. 【請求項２９】 放線菌由来の標的アミノ酸配列を有す
    るポリペプチドの機能を決定するための、下記(i)〜(i
    v)の手段を備えることを特徴とするコンピュータを用い
    たシステム； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる1以上のアミノ酸
    配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
    ミノ酸配列情報を入力するための入力手段、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録するため
    のデータ記録手段、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号755
    2〜15101から選ばれる1以上のアミノ酸配列情報と標的
    アミノ酸配列情報とを比較し、配列番号7552〜15101か
    ら選ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド
    と一致または類似する標的アミノ酸配列を有するポリペ
    プチドの機能を決定するコンパレータ手段、および (iv)該コンパレータ手段により得られた機能を表示する
    ための出力手段。
  30. 【請求項３０】 放線菌由来の標的アミノ酸配列を有す
    るポリペプチドの機能を決定するための、下記(i)〜(i
    v)の工程を含むコンピュータを用いた方法； (i)配列番号7552〜15101から選ばれる１以上のアミノ酸
    配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
    ミノ酸配列情報を入力する工程、 (ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する工
    程、 (iii)該データ記録手段により記録された、配列番号755
    2〜15101から選ばれる1以上のアミノ酸配列情報と標的
    アミノ酸配列情報とを比較する工程、および (iv)配列番号7552〜15101から選ばれる1以上のアミノ酸
    配列を有するポリペプチドと一致または類似する標的ア
    ミノ酸配列を有するポリペプチドの機能を決定する工
    程。
  31. 【請求項３１】 放線菌が、Streptomyces属、Streptos
    porangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、Noca
    rdioides属、Pseudonocardia属、Actinobispora属、Sac
    charomonospora属、Saccharopolyspora属、Saccharothr
    ix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、Microbisp
    ora属、Microtetraspora属、Thermomonospora属、また
    はMicromonospora属する微生物である、請求項２３、２
    ５、２７および２９のいずれか１項に記載のシステム。
  32. 【請求項３２】 放線菌が、Streptomyces属、Streptos
    porangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、Noca
    rdioides属、Pseudonocardia属、Actinobispora属、Sac
    charomonospora属、Saccharopolyspora属、Saccharothr
    ix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、Microbisp
    ora属、Microtetraspora属、Thermomonospora属、また
    はMicromonospora属に属する微生物である、請求項２
    ４、２６、２８および３０のいずれか１項に記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 Streptomyces属に属する微生物がStre
    ptomyces avermitilisから選ばれる微生物である、請求
    項３１項記載のシステム。
  34. 【請求項３４】 Streptomyces属に属する微生物がStre
    ptomyces avermitilisから選ばれる微生物である、請求
    項３２項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 配列番号1の塩基配列情報または該配
    列に基づく機能情報を記録したコンピューターで読み取
    り可能な記録媒体であって、請求項２３または２７記載
    のシステムまたは請求項２４または２８記載の方法に用
    いることのできる記録媒体または記憶装置。
  36. 【請求項３６】 配列番号7552〜15101から選ばれる1以
    上のアミノ酸配列情報または該配列に基づく機能情報を
    記録したコンピューターで読み取り可能な記録媒体であ
    って、請求項２５または２９記載のシステムまたは請求
    項２６または３０記載の方法に用いることのできる記録
    媒体または記憶装置。
  37. 【請求項３７】 コンピューターで読み取り可能な媒体
    が、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディス
    ク、磁気テープ、ランダムアクセスメモリ(RAM)、読み
    出し専用メモリ(ROM)、磁気光学ディスク(MO)、CD-RO
    M、CD-R、CD-RW、DVD-ROM、DVD-RAMおよびDVD-RWからな
    る群から選ばれる請求項３５または３６記載のコンピュ
    ーターで読み取り可能な記録媒体または記憶装置。
  38. 【請求項３８】 配列番号1に示される塩基配列情報を
    用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有する放線菌の育種方
    法； (i) アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物
    質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
    の化合物を発酵法により生産できるように変異育種され
    た、放線菌由来の生産菌株のゲノムまたは遺伝子の塩基
    配列と、配列番号1と対応する塩基配列とを比較する工
    程、(ii)(i)で得られた比較の結果より、上記生産菌株
    に存在する変異点を同定する工程、(iii)(ii)の工程で
    同定した変異点を、該変異を有しない放線菌に導入する
    工程、および(iv)(iii)の工程で得られた放線菌の、(i)
    で選ばれた化合物の発酵法による生産性を調べる工程。
  39. 【請求項３９】 遺伝子が、生合成経路あるいはシグナ
    ル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、請求項
    ３８記載の育種方法。
  40. 【請求項４０】 変異点が生産性を向上または安定化さ
    せる有効変異に関わる変異点である、請求項３８記載の
    育種方法。
  41. 【請求項４１】 配列番号1に示される塩基配列情報を
    用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有する放線菌の育種方
    法； (i)抗生物質を含む生物活性物質、およびそれらの類縁
    体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発酵法により
    生産できるように変異育種された、放線菌由来の生産菌
    株のゲノムまたは遺伝子の塩基配列と、配列番号1と対
    応する塩基配列とを比較する工程、(ii)(i)で得られた
    比較の結果より、上記生産菌株に存在する変異点を同定
    する工程、(iii)(ii)の工程で同定した変異点を、該変
    異を有する放線菌から除去する工程、および(iv)(iii)
    の工程で得られた放線菌の、(i)で選ばれた化合物の発
    酵法による生産性を調べる工程。
  42. 【請求項４２】 遺伝子が、生合成経路あるいはシグナ
    ル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、請求項
    ４１記載の育種方法。
  43. 【請求項４３】 変異点が、生産性を低下あるいは不安
    定にさせる変異に関わる変異点である、請求項４１記載
    の育種方法。
  44. 【請求項４４】 配列番号2〜7551に示される塩基配列
    情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有する放線菌の
    育種方法； (i) アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物
    質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
    の化合物の生合成に関与するアイソザイムを配列番号2
    〜7551に示される塩基配列情報に基づき同定する工程、
    (ii)（i）の工程で同定したアイソザイムを同じ活性を
    有するアイソザイムに分類する工程、(iii)同じ活性を
    有するアイソザイムコードしている全ての遺伝子を一括
    して変異させる工程、および(iv)(iii)の工程で得られ
    た遺伝子を用いて形質転換した放線菌の、(i)で選ばれ
    た化合物の発酵法による生産性を調べる工程。
  45. 【請求項４５】 配列番号2〜7551に示される塩基配列
    情報を用いた、下記(i)〜(v)の工程を有する放線菌の育
    種方法； (i)配列番号2〜7551に示されるオープンリーディングフ
    レーム（ORF）の機能情報を整理する工程 (ii)公知の生合成経路あるいはシグナル伝達経路上の酵
    素に、該整理されたORFを対応させる工程 (iii)放線菌において知られている生合成経路あるいは
    シグナル伝達経路に関する情報と組み合わせ、不明であ
    った放線菌における生合成経路およびシグナル伝達経路
    を解明する工程、 (iv)(iii)の工程で解明された経路と所望の有用生産物
    の生合成経路とを比較する工程、および (v)(iv)の工程で所望の有用生産物の生合成に重要と判
    断される経路を強化するために、または(iv)の工程で所
    望の有用生産物の生合成には重要ではない経路を弱める
    ために、配列番号2〜7551に示される塩基配列情報に基
    づき遺伝子工学的手法により放線菌を変異させる工程。
  46. 【請求項４６】 請求項３８〜４５のいずれか１項に記
    載の育種方法により得られる放線菌。
  47. 【請求項４７】 放線菌が、Streptomyces属、Streptos
    porangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、Noca
    rdioides属、Pseudonocardia属、Actinobispora属、Sac
    charomonospora属、Saccharopolyspora属、Saccharothr
    ix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、Microbisp
    ora属、Microtetraspora属、Thermomonospora属、また
    はMicromonospora属に属する微生物である、請求項４６
    記載の放線菌。
  48. 【請求項４８】 Streptomyves属に属する微生物がStre
    ptomyces avermitilisから選ばれる微生物である、請求
    項４７項記載の放線菌。
  49. 【請求項４９】 請求項４６〜４８のいずれか１項に記
    載の放線菌を培地に培養し、アミノ酸、核酸、ビタミ
    ン、糖、有機酸、抗生物質、およびそれらの類縁体から
    選ばれる少なくとも一種の化合物を生成蓄積させ、該培
    養物から該化合物を採取することを特徴とする該化合物
    の製造法。
  50. 【請求項５０】 化合物がポリケチドである請求項４９
    記載の製造方法。
  51. 【請求項５１】 プロテオーム解析に基づく、下記(i)
    〜（vi）工程を有する有用変異に関わる蛋白質の同定方
    法； (i) アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、抗生物
    質、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種
    の化合物を発酵法により生産できるように変異育種され
    た、放線菌由来の生産菌株および該生産菌株の親株の菌
    体よりそれぞれ菌体由来の蛋白質を調製する工程、(ii)
    (i)の工程で調製した蛋白質を２次元電気泳動法により
    分離する工程、(iii)分離された蛋白質を検出し、生産
    菌株由来の蛋白質と親株由来の蛋白質の各発現量を比較
    する工程、(iv)比較の結果、異なる発現量を示す蛋白質
    をペプチダーゼで処理し、ペプチド断片を抽出する工
    程、(v)(iv)の工程で得られたペプチド断片のアミノ酸
    配列を解析する工程、および(vi)(v)の工程で得られた
    アミノ酸配列と配列番号7552〜15101に記載のアミノ酸
    配列とを比較し、該アミノ酸配列を有する蛋白質を同定
    する工程。
  52. 【請求項５２】 放線菌が、Streptomyces属、Streptos
    porangium属、Amycolatopsis属、Actinoplanes属、Noca
    rdioides属、Pseudonocardia属、Actinobispora属、Sac
    charomonospora属、Saccharopolyspora属、Saccharothr
    ix属、Actinopolyspora属、Actinomadura属、Microbisp
    ora属、Microtetraspora属、Thermomonospora属、また
    はMicromonospora属に属する微生物である、請求項５１
    記載の同定方法。
  53. 【請求項５３】 Streptomyces属に属する微生物がStre
    ptomyces avermitilisから選ばれる微生物である、請求
    項５２項記載の同定方法。
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