JP2004129576A - 超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法 - Google Patents
超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】超好熱性古細菌由来のエンドグルカナーゼの新規な製造方法の提供。
【解決手段】バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のシグナルペプチド領域をコードするＤＮＡ配列の下流に、超好熱性古細菌由来でアミノ末端（Ｎ−末端）に１ないし２０個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする核酸配列が接続された遺伝子発現ベクターを有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し、エンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、古細菌由来超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
【選択図】 なし
【解決手段】バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のシグナルペプチド領域をコードするＤＮＡ配列の下流に、超好熱性古細菌由来でアミノ末端（Ｎ−末端）に１ないし２０個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする核酸配列が接続された遺伝子発現ベクターを有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し、エンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、古細菌由来超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はバチルス・ブレビス由来であって改良したシグナルペプチドを利用して、遺伝子組み換え法により一部改変した超耐熱性エンドグルカナーゼをバチルス属細菌で分泌生産させる方法に関するものである。
エンドグルカナーゼはセルラーゼ等として、繊維加工、飼料製造、食品加工、バイオマスよりの燃料やプラスチック原料の製造等に幅広く利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
異種タンパク質の分泌生産としてはこれまでにバチルス属細菌による分泌生産の総説（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗ， ５７， １０９−１３７ （１９９３）、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによる分泌生産の総説〔Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １１， ９０５−９１０ （１９９３）〕， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等のカビによる工業生産の報告（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， １４１９−１４２２ （１９８８） ； Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ９７６−９８１ （１９９１））等のように多数報告されている。しかしながら、これらの宿主を用いる生産系によって、古細菌由来の超耐熱性エンドグルカナーゼを高効率で分泌生産した成功例は知られていない。大腸菌を用いれば、ごく少量の酵素（１ｍｇ／Ｌ程度）を得ることは可能であるが、効率的な菌体外への大量生産は全く期待できない。
【０００３】
本発明の１つの実施態様において分泌生産されるセルラーゼ（エンドグルカナーゼの一種）は、Ｄ−グルコースがβ−１，４結合で直鎖状につながったホモ多糖であるセルロースをセロオリゴ糖に分解する反応を触媒する酵素であり、真菌類、放線菌、真性細菌、古細菌を含む多数の微生物により、生成分泌される。また、セルラーゼはオリゴ糖をセロビオースへ、さらにグルコースにまで分解する酵素群の総称である。
【０００４】
例えば、アルカリ性の環境下でよく生育するバチルス属細菌の一種が生産するアルカリセルラーゼは、ｐＨ５〜１１で安定なうえ、界面活性剤やアルカリプロテアーゼにも安定である故、洗剤に配合されると木綿衣類の表面微少繊維をセルラーゼが分解し、付着の汚れを除去するので強力な洗浄力を有する洗剤用酵素として広く使用されるようになった。その他セルラーゼの多様な性質によって、幅広く利用されている。
【０００５】
一方、バチルス属細菌の一種、バチルス・ブレビスを宿主として異種タンパク質を効率良く分泌生産するシステムは長年にわたる研究によって開発され、バチルス・ブレビス４７（特許第２０８２７２７号、特開昭６２−２０１５８３号公報）の主要菌体外タンパク質の一種であるＭＷタンパク質（ＭＷＰ）遺伝子のプロモーターおよびその遺伝子にコードされるシグナルペプチド領域を利用した分泌ベクターを作成し、タンパク質の分泌生産系が確立されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２１７， ２３−３３ （１９９４））。さらに、バチルス・ブレビスの中で菌体外プロテアーゼの生産量が特に少ないバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が分離され、これを宿主としたタンパク質生産系が開発されている（特許第１７８５５１８号、特開昭６３−５６２７７号公報）。
【０００６】
耐熱性α−アミラーゼの高効率分泌生産（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２２７９−２２８９（１９８９） やヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）の高生産（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， ３５８９−３５９３ （１９８９）、特開平２−３１６８２号公報、特許第２７８７５８５号）、ヒトインターロイキン−２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１， １８５８−１８６１ （１９９７） やヒトインターロイキン−６（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ６６５−６６９ （２０００） などの分泌生産に成功している。なかでもＥＧＦについては極めて高い生産量（１．５ｇ／Ｌ）が得られ、既に羊の採毛薬として工業的に生産されている（Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２１， ２０８−２１４ （１９９８）。
【０００７】
【特許文献１】
特許第１７８５５１８号
【特許文献２】
特許第２０８２７２７号
【特許文献３】
特許第２７８７５８５号
【特許文献４】
特開昭６２−２０１５８３
【特許文献５】
特開昭６３−５６２７７号公報
【特許文献６】
特開平２−３１６８２号公報
【０００８】
【非特許文献１】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗ， ５７， １０９−１３７ （１９９３）
【非特許文献２】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｙ， １１， ９０５−９１０ （１９９３）
【非特許文献３】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， １４１９−１４２２ （１９８８）
【非特許文献４】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ９７６−９８１ （１９９１）
【非特許文献５】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２１７， ２３−３３ （１９９４）
【０００９】
【非特許文献６】
Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２２７９−２２８９ （１９８９）
【非特許文献７】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， ３５８９−３５９３ （１９８９）
【非特許文献８】
Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１， １８５８−１８６１ （１９９７）
【非特許文献９】
Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ６６５−６６９ （２０００）
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２１， ２０８−２１４ （１９９８）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまで見出されたほとんどのエンドグルカナーゼは、至適温度が３５℃から６０℃付近であり、結晶状のセルロースや繊維の処理にも、耐熱性の低いカビ由来の酵素が使用されているのが現状であるが、処理効率を高めるにはより高温下で反応を行う必要がある。従って、１００℃近い高温でもなお、安定かつ強力な触媒活性を失わない超耐熱性エンドグルカナーゼが渇望されていた。
【００１１】
最近、そのような高温に耐性を示すエンドグルカナーゼが超好熱性細菌ピロコッカスから見出されているが、その酵素をコードする遺伝子を発現ベクターに組込んでから、宿主の大腸菌に導入して少量の生産（１ｍｇ／Ｌ程度）が得られているに過ぎない（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６８， ４３０−４３３ （２００２））。本発明は、微生物、特に細菌類を用いて超耐熱性エンドグルカナーゼを効率的、大量に製造する方法を提供するのを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、バチルス・ブレビスが原核・真核いずれの細胞由来の外来遺伝子でも高発現できる宿主菌であること、および分泌生産の効率は分泌生産させる目的タンパク質、特にそのタンパク質のアミノ末端側のアミノ酸配列・構造によって左右されることに着目し、種々検討を加え研究した結果、産業上重要な異種タンパク質、特にエンドグルカナーゼを効率良くバチルス・ブレビスによって分泌生産する方法を発明するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の方法は、バチルス・ブレビスを用いる宿主ベクター系により、バチルス・ブレビス由来の改良シグナルペプチド領域をコードする配列：
【化２】
（特開平４−１０３８９１；特開平７−１７０９８４；Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４）；Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１， １８５８−１８６１ （１９９７））の下流に、アミノ末端に１ないし複数個、例えば１〜２０個、のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼ遺伝子配列を結合した発現ベクターを構築し、その発現ベクターをバチルス・ブレビスに導入し、得られた形質転換体を培養し、生じたタンパク質を菌体外に効率良く分泌生産させ、菌体外に放出されたタンパク質を回収することによって、多量の目的異種タンパク質、特にエンドグルカナーゼを得る方法である。
【００１４】
この方法で異種タンパク質、特にエンドグルカナーゼのアミノ末端に少なくとも１ないし複数個のアミノ酸を付加することが必須であり、シグナルペプチドの改良のみでは効率的生産は達成できない。逆に、分泌させる異種タンパク質のみを改変して、改良シグナルペプチドを用いなければ矢張り効率生産を得ることができない。この両者の条件が効率的分泌に必要である。
【００１５】
従って、本発明は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のシグナルペプチド領域をコードするＤＮＡ配列の下流に、超好熱性古細菌由来でアミノ末端（Ｎ−末端）に１ないし２０個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする核酸配列が接続された遺伝子発現ベクターを有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し、エンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、古細菌由来超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法を提供する。
【００１６】
前記シグナルペプチドとしては、バチルス・ブレビス由来で細胞表層タンパク質遺伝子のシグナルペプチドは、下記のアミノ酸配列：
【化３】
を有し、好ましくは配列番号：２に示すアミノ酸配列を示すものである。
【００１７】
前記エンドグルカナーゼとしては、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属古細菌由来のエンドグルカナーゼが好ましく、具体例として配列番号４に示すアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼが挙げられる。前記エンドグルカナーゼは更に、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加により修飾されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００１８】
前記エンドグルカナーゼのＮ−末端に付加されるアミノ酸の数は、好ましくは１〜１５個であり、具体的なアミノ酸、またはアミノ酸配列の例としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２９）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３１）、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３２）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）またはＡｌａ−Ｇｕｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）が挙げられる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において製造の対象にするのは、古細菌由来のエンドグルカナーゼであり、その生産微生物である古細菌の例としてピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物が挙げられ、より具体的な例として、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｕｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）が挙げられる。古細菌由来のエンドグルカナーゼの具体例としては、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、このアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列の一例として配列番号３に示す塩基配列が挙げられる。
【００２０】
エンドグルカナーゼのごとき加水分解酵素の場合、その活性のためには本来のアミノ酸配列が必須ではなく、酵素全体の内、活性に必須でない領域のアミノ酸配列を、１又は複数のアミノ酸の付加（例えば末端への付加）、除去または欠失、他のアミノ酸による置換、アミノ酸の挿入（配列内部への）、などにより修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質でも、本来の活性を維持していることがよく知られている。
【００２１】
従って、本発明のエンドグルカナーゼは、配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するもののみならず、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つエンドグルカナーゼの酵素活性を維持しているエンドグルカナーゼの変異体も本発明エンドグルカナーゼの範囲に属する。上記のアミノ酸配列の修飾に係るアミノ酸の数は１〜数個、即ち１０個以下であることが望ましく、好ましくは７個以下、例えば５個以下、例えば３個以下である。
【００２２】
上記の、エンドグルカナーゼのＮ−末端には、エンドグルカナーゼの生産性を増強するため、１〜複数個、好ましくは１〜２０個のアミノ酸を付加する。付加するアミノ酸の数は、例えば１〜１５個ていどであり、特に限定されない。付加するアミノ酸の種類は特に限定されず、例えば表１に示す如く、種々のアミノ酸を用いることが出来る。種々のアミノ酸又はアミノ酸配列の具体例として、例えば次のものが挙げられる。
【００２３】
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２９）、
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３１）、
Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３２）、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）
Ａｌａ−Ｇｕｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）
【００２４】
上記のアミノ酸やペプチドには、エンドグルカナーゼが分泌されるために生体膜を通過する過程で有利になると考えられる酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ）や小さい中性アミノ酸（Ａｌａ，Ｔｈｒなど）を用いる一方、不利になるようなアミノ酸である塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ）や疎水性の強いアミノ酸（Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅなど）を避ける。
【００２５】
バチルス・ブレビスを用いる異種タンパク質を菌体外に分泌生産するために使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、ＳＤ配列、適切なシグナルペプチド、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、およびバチルス・ブレビス菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を含む適切な配列を適切な位置に有するものである。この構築物のために使用できるベクターは特定の種類に制限されず、バチルス・ブレビス菌中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても染色体に組込まれるものであってもよい。
【００２６】
バチルス・ブレビス由来のプラスミドは特に好ましい。これらには、例えばｐＨＴ９２６（特開平４−２１６６０５号公報）、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。バチルス・サチルス（枯草菌）で利用されているｐＵＢ１１０（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １３４， ３１８−３２９ （１９７８））も利用できる。また、ファージ、トランスポゾン等も利用しうる。本発明に使用できるプロモーター、ＳＤ、改良前のシグナルペプチドは特に限定されず、宿主内で機能するものであればいずれでもよいが、バチルス・ブレビス４７またはＨＰＤ３１由来のプロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドをコードする遺伝子（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７０， ９３５−９４５ （１９８８）， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２， １３１２−１３２０ （１９９０））を用いるのが有効である。
【００２７】
本発明で使用するシグナルペプチドは、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（新分類では、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する）由来のものであり、好ましくはそれを修飾して改良したものである。このシグナルペプチドの本来のアミノ酸配列を配列番号：１に示し、改良されたシグナルペプチドのアミノ酸配列の一例を下記：
【００２８】
【化４】
に示し、その具体的な配列の一例を配列番号：２に示す。
【００２９】
改良されたシグナルペプチドは、ヒト、動物を含む真核生物の遺伝子を発現・分泌させる場合に特に必要で、改良されたシグナルペプチドを使用しない場合に比べその生産効率は１０倍以上になる（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４）；特開平４−１０３８９１号公報）。そもそも、シグナルペプチドの改良なしには発現ベクターをバチルス・ブレビスへ導入することが非常に困難である。プラスミドを構築する方法としては、常法が適宜用いられ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２） に記載の方法等が例示される。
【００３０】
前記条件にて構築された発現ベクターに改変エンドグルカナーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを用いて、微生物を形質転換すれば、改変エンドグルカナーゼを効率良く分泌生産しうる形質転換体を得ることができる。外来遺伝子産物をコードする遺伝子を組込んだベクターで形質転換する宿主菌としては、ベクター、プロモーターが発現可能な微生物であれば何れでもよく、本発明ではバチルス・ブレビス細菌が用いられる。バチルス・ブレビスとは好気性のグラム陽性桿菌であり、例えばバチルス・ブレビス４７（特開昭６０−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８３号公報）、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＨＰＤ３１と同一の菌種）（特開昭６３−５６２７７号公報）等が挙げられる。また、これらの変異株も含まれる。
【００３１】
微生物を形質転換する方法は公知の方法でよく、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ らの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５６， １１３０ （１９８３））、やＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ３０９９−３１００ （１９８９））等が例示される。
【００３２】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体が生育して、目的とする外来遺伝子産物を生産しうるものであればいかなるものでもよい。該培地に含有される炭素源としては、グルコース、グリセロール、でんぷん、糖蜜、有機酸等が挙げられる。窒素源としては、カゼイン、ペプトン、大豆ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カザミノ酸、尿素等の有機窒素源と硫酸アンモニウム、塩酸アンモニウム等の無機窒素源等が挙げられる。また、糖と無機窒素源を主とする合成培地を用いて培養してもよい。栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸塩基等が挙げられる。
【００３３】
また、培養に際して必要であれば、培地に抗生物質、例えばアンピシリン、エリスロマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等が加えられる。さらに必要であればＴｗｅｅｎ４０等の界面活性剤、グリシン、消泡剤等が加えられる。
培地のｐＨは５〜９．５であり、より好ましくは６〜８である。好気的条件下で、培養温度は通常２０℃〜４０℃であり、培養時間は４８〜２００時間である。
【００３４】
本発明によって菌体外に分泌されたタンパク質は、当該者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることによって分離精製することができる。
【００３５】
【実施例】
本発明は以下の実施例および添付の図面によって、さらに具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。
実施例において使用された発現・分泌ベクターは次の種類がある。枯草菌などで頻用されるｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ １５， ９３−１０３ （１９８６））をベースとして、その複製起点、ｐＨＷ１（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５０， ８０４−８１４ （１９８２））のエリスロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドへバチルス・ブレビス４７菌の細胞表層タンパク質遺伝子（ｍｗｐ）（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７０， １７６−１８６ （１９８８））のプロモーター領域、さらにシグナルペプチドをコードする領域を挿入したｐＮＵ２１０（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２１７，２３−３３ （１９９３））が作成された。
【００３６】
プラスミドｐＮＵ２１２はｐＮＵ２１０のｍｗｐの翻訳開始コドン近傍の１塩基を変更してＢｓｐＨＩサイトを造成し（ｐＮＵ２１１の作成）、ｐＮＵ２１１にある２ヶ所のＮｃｏＩサイトのうち、シグナルペプチド領域のサイトのみに変更してｐＮＵ２１２を作成した（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４））。
【００３７】
プラスミドｐＮＨ３２６はｐＮＨ３００のｍｗｐシグナル配列をＲ２Ｌ６シグナル配列（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４））に変更して作成したものである（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６６， ３０４−３０９ （２０００））。プラスミドｐＮＨ３００はＰ４、Ｐ５のプロモーター領域、ｍｗｐシグナル配列、並びにマルチクローニングサイトを有するｐＮＵ２１０のＤＮＡ断片をｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ， １５， ９３−１０３ （１９８６））に挿入して作成した。ベクターｐＮＨ３００及びｐＮＨ３２６はネオマイシン耐性遺伝子のみを有し、これらプラスミドによる形質転換株の選択に使用する。
【００３８】
実施例１． アミノ末端へ１ないし複数個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする塩基配列を有する発現ベクターの調製
発現・分泌ベクターの構築の代表例として、アミノ末端にアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼ遺伝子を発現ベクターに組込む様式を図１に示した。
【００３９】
（１）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵ２１２をＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ にて消化して得られる約４．３ｋｂの断片に、ｐＮＨ３２６をＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ にて消化して得られる約１００ｂｐの断片を連結し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６を得た。
ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来のエンドグルカナーゼ遺伝子をコードするＯＲＦ（ＰＨ１１７１）（配列番号４）を有するプラスミドｐＥＴ−ＥＧＰｈ（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６８， ４３０−４３３ （２００２））を鋳型として、順方向プライマー（配列番号５）および逆方向プライマー（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。
【００４０】
得られた断片をＮｃｏＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＮｃｏＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．３ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端には何も付加されない、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＥＧ）を調製した。本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂの塩基配列が正しいことを確認した。
配列番号５；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡ ＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡ ＴＡＴＣＡＡＡＣＡＣ ＣＧＡ−３’
配列番号６；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴ ＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴ ＡＴ
【００４１】
（２）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ａ−ＥＧの構築
上記ｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、順方向プライマー（配列番号７）および逆方向プライマー（配列番号６）を用いたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＰｓｔＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．４ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵＲ２Ｌ６−Ａ−ＥＧ）を調製した。この塩基配列の正しいことを上記（１）と同様の方法で確認した。
配列番号７；５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡ ＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴ ＡＴＣＡＡＡＣＡＣＣ ＧＡ−３’
配列番号６；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴ ＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴ ＡＴ−３’
【００４２】
（３）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｖ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号８（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＶａｌが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号８；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＧＴ ＡＧＡＡＡＡＴＡＣＡ ＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡ ＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４３】
（４）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｄ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号９（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＡｓｐが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号９；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡ ＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡ ＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡ ＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４４】
（５）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｔ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号１０（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＴｈｒが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号１０；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＡＣ ＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡ ＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡ ＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４５】
（６）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＤＰ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号１１（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＡｓｐ−Ｐｒｏが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号１１；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡ ＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴ ＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣ ＡＡＡＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４６】
（７）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＤＰ−ＥＧの構築
上記鋳型を使用し、配列番号１２および配列番号６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．３ｋｂｐ の断片と連結し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧを得た。
【００４７】
得られたプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩによって消化して得られる約５．６ｋｂｐ のＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１（配列番号１３）およびＩＰ２（配列番号１４）同士をアニールさせることによって調製した２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：２８）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＤＰ−ＥＧ）を調製した。塩基配列の確認も行った。
配列番号１２；５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧ ＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣ ＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡ ＣＣＧＡ−３’
配列番号１３；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡ−３’
配列番号１４；５’−ＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣ ＴＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００４８】
（８）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＥＡＡＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ５（配列番号１５）およびＩＰ６（配列番号１６）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：２９）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列の確認も行った。
配列番号１５；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡ−３’
配列番号１６；５’−ＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣ ＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００４９】
（９）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＡＡＥＥＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ７（配列番号１７）およびＩＰ８（配列番号１８）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：３０）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列の確認も行った。
配列番号１７；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ ＣＴＧＡＡＧＡＡ−３’
配列番号１８；５’−ＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣ ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５０】
（１０）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＡＡＡＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ９（配列番号１９）およびＩＰ１０（配列番号２０）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：３１）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列も確認した。
配列番号１９；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＣＡＧＣＡＧＣＡ−３’
配列番号２０；５’−ＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣ ＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５１】
（１１）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＮＳＤＳＥＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１１（配列番号２１）およびＩＰ１２（配列番号２２）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：３２）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列も確認した。
配列番号２１；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧ ＡＴＡＧＴＧＡＡ−３’
配列番号２２；５’−ＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴ ＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５２】
（１２）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＥＡＡＴＴＴＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１３（配列番号２３）およびＩＰ１４（配列番号２４）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）の配列が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列も確認した。
配列番号２３；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣ ＴＡＣＴＡＣＡ−３’
配列番号２４；５’−ＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴ ＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴ ＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧ ＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５３】
（１３）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＥＡＡＴＴＴＡＰＫＤＰ−ＥＧｔの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型に使用し、配列番号１２および配列番号２７のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．３ｋｂｐ の断片と連結し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧｔを得た。
【００５４】
ＥＧｔは配列番号３に示すエンドグルカナーゼ遺伝子からコードされるポリペプチド（シグナルペプチドを除く、第１アミノ酸残基から第４３０アミノ酸残基まで）であり、ＥＧはＥＧｔよりカルボキシ末端から４２アミノ酸残基少ないポリペプチド。
【００５５】
得られたプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧｔをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩによって消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１５（配列番号２５）およびＩＰ１６（配列番号２６）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）の配列が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。
【００５６】
本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂｐ の塩基配列が正しいことを確認した。
配列番号２５；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣ ＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴ ＣＣＡＡＡＧ−３’
配列番号２６；５’−ＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧ ＡＧＣＴＧＴＡＧＴＡ ＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴ ＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣ ＧＡＡＡＧＣ−３’
配列番号２７；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴ ＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣ ＣＣＴＴＣＴＴＡＡＧ−３’
【００５７】
（１４）プラスミドｐＮＵ２１２−ＥＧの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、配列番号５および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＮｃｏＩ−ＸｂａＩにて消化し、プラスミドｐＮＵ２１２をＮｃｏＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる断片約４．３ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼの末端には何も付加されない、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵ２１２−ＥＧ）を調製した。また、本発現プラスミドは、改良配列ではなく原配列のシグナルペプチドを有する。塩基配列も確認した。
【００５８】
（１５）プラスミドｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧの構成
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、配列番号７および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵ２１２をＰｓｔＩ−ＸｂａＩで消化してえられる約４．３ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、発現プラスミド（ｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧ）を調製した。塩基配列も確認した。
【００５９】
（１６）プラスミドｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧｔの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、配列番号７および配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調整した。この後のプラスミド調製過程は上記（１５）の場合と全く同様であるが、得られた発現プラスミドはｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧｔであった。塩基配列も確認した。
【００６０】
（１７）プラスミドｐＮＨ３２６−Ａ−ＥＧの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、ＥＧ３（配列番号７）およびＥＧ２（配列番号６）をプライマーとしたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＨ３２６をＰｓｔＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約３．９ｋｂｐ の断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂｐ の塩基配列が正しいことを確認した。
【００６１】
（１８）プラスミドｐＮＨ３２６−Ａ−ＥＧｔの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、ＥＧ３（配列番号７）およびＥＧ８（配列番号２７）をプライマーとしたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＨ３２６をＰｓｔＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約３．９ｋｂｐ の断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂｐ の塩基配列が正しいことを確認した。
【００６２】
実施例２． 発現ベクターを有するバチルス・ブレビスによるエンドグルカナーゼの分泌生産
実施例１の（１）〜（１８）で構築した各種発現ベクター・プラスミドによってバチルス・ブレビスＨＰＤ３１株、或いは３１−ＯＫ株を形質転換し、得られた形質転換体を好気的に培養することによって、エンドグルカナーゼを培養液中に分泌生産させた。生産はそれぞれの菌を生産用培地（３％ポリペプトン−Ｓ、０．８％酵母エキス、３％グルコース、その他、必要に応じて各種金属塩、Ｔｗｅｅｎ−４０、エリスロマイシン、ネオマイシン等を含有する）に接種し、３０℃、振とう培養で数日間培養することにより行った。それらの培養液の上清中のエンドグルカナーゼ活性を測定した結果を表１に示す。
【００６３】
分泌生産されたエンドグルカナーゼ量は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質として活性を測定することにより測定した。０．２ｍｌの１％ＣＭＣ水溶液と０．２ｍｌの０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を混合し、これに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して一晩透析した培養液上清を加え、８５℃にて反応させた。０．２ｍｌの反応液と０．４ｍｌのＳｏｍｏｇｉ銅液を混合し、沸騰浴中にて２０分間加熱した後、０．４ｍｌのＮｅｌｓｏｎ試薬を混合した。
【００６４】
この溶液の、５００ｎｍにおける吸光度を測定し、別にグルコースを用いて作成した検量線より、還元性末端量（Ｍａｉｎ）を測定した。また、培養液の代わりに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）を用いたブランク１、ＣＭＣの代わりに水を用いたブランク２を同様に処理し、それぞれの還元性末端量を測定した。Ｍａｉｎの値とブランク１およびブランク２の差を算出することにより、反応によって増加した還元性末端量を求めた。活性１単位（Ｕ）はＣＭＣから１分間に１ｍｇグルコースに相当する還元力を生じる酵素量と定義した。精製酵素の比活性は８．５Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００６５】
【表１】
【００６６】
表１から、エンドグルカナーゼ生産量は、そのアミノ末端に１ないし数個のアミノ酸を付加した場合にアミノ酸を付加しない場合の生産量の５〜２０数倍になり、顕著に増加することが分かる。また、本酵素の生産量をその比活性で重量に換算すると、効率よい場合は１リットル当たり１００ｍｇ以上であり、大腸菌による生産量の約１００倍であった。
【００６７】
実施例１の（２）及び（１３）の発現ベクターによって得られたエンドグルカナーゼを含有する培養液を遠心分離し、菌体を除いた後、硫安塩析、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等により、電気泳動的に単一に精製した。そのタンパク質の分子量、酵素活性、耐熱性、最適ｐＨ、基質特異性、などは、大腸菌で生産されたものと一致した。アミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、（２）及び（１３）のどちらの場合もＡ或いはＡＥＥＡＡＴＴＴＡＰＫＤＰの付加したエンドグルカナーゼが生産されていることが明らかになり、それらの付加アミノ酸やペプチドが酵素の性質に有意の影響を与えていないことが示された。
【００６８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の発現プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｘ−ＥＧの構築過程を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明はバチルス・ブレビス由来であって改良したシグナルペプチドを利用して、遺伝子組み換え法により一部改変した超耐熱性エンドグルカナーゼをバチルス属細菌で分泌生産させる方法に関するものである。
エンドグルカナーゼはセルラーゼ等として、繊維加工、飼料製造、食品加工、バイオマスよりの燃料やプラスチック原料の製造等に幅広く利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
異種タンパク質の分泌生産としてはこれまでにバチルス属細菌による分泌生産の総説（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗ， ５７， １０９−１３７ （１９９３）、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによる分泌生産の総説〔Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １１， ９０５−９１０ （１９９３）〕， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等のカビによる工業生産の報告（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， １４１９−１４２２ （１９８８） ； Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ９７６−９８１ （１９９１））等のように多数報告されている。しかしながら、これらの宿主を用いる生産系によって、古細菌由来の超耐熱性エンドグルカナーゼを高効率で分泌生産した成功例は知られていない。大腸菌を用いれば、ごく少量の酵素（１ｍｇ／Ｌ程度）を得ることは可能であるが、効率的な菌体外への大量生産は全く期待できない。
【０００３】
本発明の１つの実施態様において分泌生産されるセルラーゼ（エンドグルカナーゼの一種）は、Ｄ−グルコースがβ−１，４結合で直鎖状につながったホモ多糖であるセルロースをセロオリゴ糖に分解する反応を触媒する酵素であり、真菌類、放線菌、真性細菌、古細菌を含む多数の微生物により、生成分泌される。また、セルラーゼはオリゴ糖をセロビオースへ、さらにグルコースにまで分解する酵素群の総称である。
【０００４】
例えば、アルカリ性の環境下でよく生育するバチルス属細菌の一種が生産するアルカリセルラーゼは、ｐＨ５〜１１で安定なうえ、界面活性剤やアルカリプロテアーゼにも安定である故、洗剤に配合されると木綿衣類の表面微少繊維をセルラーゼが分解し、付着の汚れを除去するので強力な洗浄力を有する洗剤用酵素として広く使用されるようになった。その他セルラーゼの多様な性質によって、幅広く利用されている。
【０００５】
一方、バチルス属細菌の一種、バチルス・ブレビスを宿主として異種タンパク質を効率良く分泌生産するシステムは長年にわたる研究によって開発され、バチルス・ブレビス４７（特許第２０８２７２７号、特開昭６２−２０１５８３号公報）の主要菌体外タンパク質の一種であるＭＷタンパク質（ＭＷＰ）遺伝子のプロモーターおよびその遺伝子にコードされるシグナルペプチド領域を利用した分泌ベクターを作成し、タンパク質の分泌生産系が確立されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２１７， ２３−３３ （１９９４））。さらに、バチルス・ブレビスの中で菌体外プロテアーゼの生産量が特に少ないバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が分離され、これを宿主としたタンパク質生産系が開発されている（特許第１７８５５１８号、特開昭６３−５６２７７号公報）。
【０００６】
耐熱性α−アミラーゼの高効率分泌生産（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２２７９−２２８９（１９８９） やヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）の高生産（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， ３５８９−３５９３ （１９８９）、特開平２−３１６８２号公報、特許第２７８７５８５号）、ヒトインターロイキン−２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１， １８５８−１８６１ （１９９７） やヒトインターロイキン−６（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ６６５−６６９ （２０００） などの分泌生産に成功している。なかでもＥＧＦについては極めて高い生産量（１．５ｇ／Ｌ）が得られ、既に羊の採毛薬として工業的に生産されている（Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２１， ２０８−２１４ （１９９８）。
【０００７】
【特許文献１】
特許第１７８５５１８号
【特許文献２】
特許第２０８２７２７号
【特許文献３】
特許第２７８７５８５号
【特許文献４】
特開昭６２−２０１５８３
【特許文献５】
特開昭６３−５６２７７号公報
【特許文献６】
特開平２−３１６８２号公報
【０００８】
【非特許文献１】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗ， ５７， １０９−１３７ （１９９３）
【非特許文献２】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｙ， １１， ９０５−９１０ （１９９３）
【非特許文献３】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， １４１９−１４２２ （１９８８）
【非特許文献４】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ９７６−９８１ （１９９１）
【非特許文献５】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２１７， ２３−３３ （１９９４）
【０００９】
【非特許文献６】
Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２２７９−２２８９ （１９８９）
【非特許文献７】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， ３５８９−３５９３ （１９８９）
【非特許文献８】
Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１， １８５８−１８６１ （１９９７）
【非特許文献９】
Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ６６５−６６９ （２０００）
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２１， ２０８−２１４ （１９９８）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまで見出されたほとんどのエンドグルカナーゼは、至適温度が３５℃から６０℃付近であり、結晶状のセルロースや繊維の処理にも、耐熱性の低いカビ由来の酵素が使用されているのが現状であるが、処理効率を高めるにはより高温下で反応を行う必要がある。従って、１００℃近い高温でもなお、安定かつ強力な触媒活性を失わない超耐熱性エンドグルカナーゼが渇望されていた。
【００１１】
最近、そのような高温に耐性を示すエンドグルカナーゼが超好熱性細菌ピロコッカスから見出されているが、その酵素をコードする遺伝子を発現ベクターに組込んでから、宿主の大腸菌に導入して少量の生産（１ｍｇ／Ｌ程度）が得られているに過ぎない（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６８， ４３０−４３３ （２００２））。本発明は、微生物、特に細菌類を用いて超耐熱性エンドグルカナーゼを効率的、大量に製造する方法を提供するのを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、バチルス・ブレビスが原核・真核いずれの細胞由来の外来遺伝子でも高発現できる宿主菌であること、および分泌生産の効率は分泌生産させる目的タンパク質、特にそのタンパク質のアミノ末端側のアミノ酸配列・構造によって左右されることに着目し、種々検討を加え研究した結果、産業上重要な異種タンパク質、特にエンドグルカナーゼを効率良くバチルス・ブレビスによって分泌生産する方法を発明するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の方法は、バチルス・ブレビスを用いる宿主ベクター系により、バチルス・ブレビス由来の改良シグナルペプチド領域をコードする配列：
【化２】
【００１４】
この方法で異種タンパク質、特にエンドグルカナーゼのアミノ末端に少なくとも１ないし複数個のアミノ酸を付加することが必須であり、シグナルペプチドの改良のみでは効率的生産は達成できない。逆に、分泌させる異種タンパク質のみを改変して、改良シグナルペプチドを用いなければ矢張り効率生産を得ることができない。この両者の条件が効率的分泌に必要である。
【００１５】
従って、本発明は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のシグナルペプチド領域をコードするＤＮＡ配列の下流に、超好熱性古細菌由来でアミノ末端（Ｎ−末端）に１ないし２０個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする核酸配列が接続された遺伝子発現ベクターを有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し、エンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、古細菌由来超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法を提供する。
【００１６】
前記シグナルペプチドとしては、バチルス・ブレビス由来で細胞表層タンパク質遺伝子のシグナルペプチドは、下記のアミノ酸配列：
【化３】
【００１７】
前記エンドグルカナーゼとしては、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属古細菌由来のエンドグルカナーゼが好ましく、具体例として配列番号４に示すアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼが挙げられる。前記エンドグルカナーゼは更に、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加により修飾されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００１８】
前記エンドグルカナーゼのＮ−末端に付加されるアミノ酸の数は、好ましくは１〜１５個であり、具体的なアミノ酸、またはアミノ酸配列の例としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２９）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３１）、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３２）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）またはＡｌａ−Ｇｕｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）が挙げられる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において製造の対象にするのは、古細菌由来のエンドグルカナーゼであり、その生産微生物である古細菌の例としてピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物が挙げられ、より具体的な例として、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｕｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）が挙げられる。古細菌由来のエンドグルカナーゼの具体例としては、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、このアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列の一例として配列番号３に示す塩基配列が挙げられる。
【００２０】
エンドグルカナーゼのごとき加水分解酵素の場合、その活性のためには本来のアミノ酸配列が必須ではなく、酵素全体の内、活性に必須でない領域のアミノ酸配列を、１又は複数のアミノ酸の付加（例えば末端への付加）、除去または欠失、他のアミノ酸による置換、アミノ酸の挿入（配列内部への）、などにより修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質でも、本来の活性を維持していることがよく知られている。
【００２１】
従って、本発明のエンドグルカナーゼは、配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するもののみならず、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つエンドグルカナーゼの酵素活性を維持しているエンドグルカナーゼの変異体も本発明エンドグルカナーゼの範囲に属する。上記のアミノ酸配列の修飾に係るアミノ酸の数は１〜数個、即ち１０個以下であることが望ましく、好ましくは７個以下、例えば５個以下、例えば３個以下である。
【００２２】
上記の、エンドグルカナーゼのＮ−末端には、エンドグルカナーゼの生産性を増強するため、１〜複数個、好ましくは１〜２０個のアミノ酸を付加する。付加するアミノ酸の数は、例えば１〜１５個ていどであり、特に限定されない。付加するアミノ酸の種類は特に限定されず、例えば表１に示す如く、種々のアミノ酸を用いることが出来る。種々のアミノ酸又はアミノ酸配列の具体例として、例えば次のものが挙げられる。
【００２３】
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２９）、
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３１）、
Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３２）、
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）
Ａｌａ−Ｇｕｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）
【００２４】
上記のアミノ酸やペプチドには、エンドグルカナーゼが分泌されるために生体膜を通過する過程で有利になると考えられる酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ）や小さい中性アミノ酸（Ａｌａ，Ｔｈｒなど）を用いる一方、不利になるようなアミノ酸である塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ）や疎水性の強いアミノ酸（Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅなど）を避ける。
【００２５】
バチルス・ブレビスを用いる異種タンパク質を菌体外に分泌生産するために使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、ＳＤ配列、適切なシグナルペプチド、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、およびバチルス・ブレビス菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を含む適切な配列を適切な位置に有するものである。この構築物のために使用できるベクターは特定の種類に制限されず、バチルス・ブレビス菌中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても染色体に組込まれるものであってもよい。
【００２６】
バチルス・ブレビス由来のプラスミドは特に好ましい。これらには、例えばｐＨＴ９２６（特開平４−２１６６０５号公報）、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。バチルス・サチルス（枯草菌）で利用されているｐＵＢ１１０（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １３４， ３１８−３２９ （１９７８））も利用できる。また、ファージ、トランスポゾン等も利用しうる。本発明に使用できるプロモーター、ＳＤ、改良前のシグナルペプチドは特に限定されず、宿主内で機能するものであればいずれでもよいが、バチルス・ブレビス４７またはＨＰＤ３１由来のプロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドをコードする遺伝子（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７０， ９３５−９４５ （１９８８）， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２， １３１２−１３２０ （１９９０））を用いるのが有効である。
【００２７】
本発明で使用するシグナルペプチドは、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（新分類では、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する）由来のものであり、好ましくはそれを修飾して改良したものである。このシグナルペプチドの本来のアミノ酸配列を配列番号：１に示し、改良されたシグナルペプチドのアミノ酸配列の一例を下記：
【００２８】
【化４】
【００２９】
改良されたシグナルペプチドは、ヒト、動物を含む真核生物の遺伝子を発現・分泌させる場合に特に必要で、改良されたシグナルペプチドを使用しない場合に比べその生産効率は１０倍以上になる（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４）；特開平４−１０３８９１号公報）。そもそも、シグナルペプチドの改良なしには発現ベクターをバチルス・ブレビスへ導入することが非常に困難である。プラスミドを構築する方法としては、常法が適宜用いられ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２） に記載の方法等が例示される。
【００３０】
前記条件にて構築された発現ベクターに改変エンドグルカナーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを用いて、微生物を形質転換すれば、改変エンドグルカナーゼを効率良く分泌生産しうる形質転換体を得ることができる。外来遺伝子産物をコードする遺伝子を組込んだベクターで形質転換する宿主菌としては、ベクター、プロモーターが発現可能な微生物であれば何れでもよく、本発明ではバチルス・ブレビス細菌が用いられる。バチルス・ブレビスとは好気性のグラム陽性桿菌であり、例えばバチルス・ブレビス４７（特開昭６０−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８３号公報）、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＨＰＤ３１と同一の菌種）（特開昭６３−５６２７７号公報）等が挙げられる。また、これらの変異株も含まれる。
【００３１】
微生物を形質転換する方法は公知の方法でよく、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ らの方法（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５６， １１３０ （１９８３））、やＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ３０９９−３１００ （１９８９））等が例示される。
【００３２】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体が生育して、目的とする外来遺伝子産物を生産しうるものであればいかなるものでもよい。該培地に含有される炭素源としては、グルコース、グリセロール、でんぷん、糖蜜、有機酸等が挙げられる。窒素源としては、カゼイン、ペプトン、大豆ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カザミノ酸、尿素等の有機窒素源と硫酸アンモニウム、塩酸アンモニウム等の無機窒素源等が挙げられる。また、糖と無機窒素源を主とする合成培地を用いて培養してもよい。栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸塩基等が挙げられる。
【００３３】
また、培養に際して必要であれば、培地に抗生物質、例えばアンピシリン、エリスロマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等が加えられる。さらに必要であればＴｗｅｅｎ４０等の界面活性剤、グリシン、消泡剤等が加えられる。
培地のｐＨは５〜９．５であり、より好ましくは６〜８である。好気的条件下で、培養温度は通常２０℃〜４０℃であり、培養時間は４８〜２００時間である。
【００３４】
本発明によって菌体外に分泌されたタンパク質は、当該者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることによって分離精製することができる。
【００３５】
【実施例】
本発明は以下の実施例および添付の図面によって、さらに具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。
実施例において使用された発現・分泌ベクターは次の種類がある。枯草菌などで頻用されるｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ １５， ９３−１０３ （１９８６））をベースとして、その複製起点、ｐＨＷ１（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５０， ８０４−８１４ （１９８２））のエリスロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドへバチルス・ブレビス４７菌の細胞表層タンパク質遺伝子（ｍｗｐ）（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７０， １７６−１８６ （１９８８））のプロモーター領域、さらにシグナルペプチドをコードする領域を挿入したｐＮＵ２１０（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２１７，２３−３３ （１９９３））が作成された。
【００３６】
プラスミドｐＮＵ２１２はｐＮＵ２１０のｍｗｐの翻訳開始コドン近傍の１塩基を変更してＢｓｐＨＩサイトを造成し（ｐＮＵ２１１の作成）、ｐＮＵ２１１にある２ヶ所のＮｃｏＩサイトのうち、シグナルペプチド領域のサイトのみに変更してｐＮＵ２１２を作成した（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４））。
【００３７】
プラスミドｐＮＨ３２６はｐＮＨ３００のｍｗｐシグナル配列をＲ２Ｌ６シグナル配列（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２， ３５８−３６３ （１９９４））に変更して作成したものである（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６６， ３０４−３０９ （２０００））。プラスミドｐＮＨ３００はＰ４、Ｐ５のプロモーター領域、ｍｗｐシグナル配列、並びにマルチクローニングサイトを有するｐＮＵ２１０のＤＮＡ断片をｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ， １５， ９３−１０３ （１９８６））に挿入して作成した。ベクターｐＮＨ３００及びｐＮＨ３２６はネオマイシン耐性遺伝子のみを有し、これらプラスミドによる形質転換株の選択に使用する。
【００３８】
実施例１． アミノ末端へ１ないし複数個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする塩基配列を有する発現ベクターの調製
発現・分泌ベクターの構築の代表例として、アミノ末端にアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼ遺伝子を発現ベクターに組込む様式を図１に示した。
【００３９】
（１）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵ２１２をＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ にて消化して得られる約４．３ｋｂの断片に、ｐＮＨ３２６をＢｓｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ にて消化して得られる約１００ｂｐの断片を連結し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６を得た。
ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来のエンドグルカナーゼ遺伝子をコードするＯＲＦ（ＰＨ１１７１）（配列番号４）を有するプラスミドｐＥＴ−ＥＧＰｈ（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６８， ４３０−４３３ （２００２））を鋳型として、順方向プライマー（配列番号５）および逆方向プライマー（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。
【００４０】
得られた断片をＮｃｏＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＮｃｏＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．３ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端には何も付加されない、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＥＧ）を調製した。本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂの塩基配列が正しいことを確認した。
配列番号５；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡ ＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡ ＴＡＴＣＡＡＡＣＡＣ ＣＧＡ−３’
配列番号６；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴ ＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴ ＡＴ
【００４１】
（２）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ａ−ＥＧの構築
上記ｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、順方向プライマー（配列番号７）および逆方向プライマー（配列番号６）を用いたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＰｓｔＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．４ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵＲ２Ｌ６−Ａ−ＥＧ）を調製した。この塩基配列の正しいことを上記（１）と同様の方法で確認した。
配列番号７；５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡ ＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴ ＡＴＣＡＡＡＣＡＣＣ ＧＡ−３’
配列番号６；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴ ＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴ ＡＴ−３’
【００４２】
（３）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｖ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号８（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＶａｌが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号８；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＧＴ ＡＧＡＡＡＡＴＡＣＡ ＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡ ＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４３】
（４）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｄ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号９（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＡｓｐが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号９；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡ ＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡ ＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡ ＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４４】
（５）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｔ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号１０（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＴｈｒが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号１０；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＡＣ ＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡ ＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡ ＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４５】
（６）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＤＰ−ＥＧの構築
上記と同一の鋳型を使用し、配列番号１１（順方向）および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。その後は、上記（１）と同様の方法でエンドグルカナーゼのアミノ末端にＡｓｐ−Ｐｒｏが付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミドを調製した。
配列番号１１；５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡ ＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴ ＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣ ＡＡＡＣＡＣＣＧＡ−３’
【００４６】
（７）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＤＰ−ＥＧの構築
上記鋳型を使用し、配列番号１２および配列番号６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．３ｋｂｐ の断片と連結し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧを得た。
【００４７】
得られたプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩによって消化して得られる約５．６ｋｂｐ のＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１（配列番号１３）およびＩＰ２（配列番号１４）同士をアニールさせることによって調製した２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：２８）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＤＰ−ＥＧ）を調製した。塩基配列の確認も行った。
配列番号１２；５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧ ＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣ ＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡ ＣＣＧＡ−３’
配列番号１３；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡ−３’
配列番号１４；５’−ＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣ ＴＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００４８】
（８）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＥＡＡＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ５（配列番号１５）およびＩＰ６（配列番号１６）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：２９）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列の確認も行った。
配列番号１５；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡ−３’
配列番号１６；５’−ＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣ ＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００４９】
（９）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＡＡＥＥＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ７（配列番号１７）およびＩＰ８（配列番号１８）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：３０）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列の確認も行った。
配列番号１７；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ ＣＴＧＡＡＧＡＡ−３’
配列番号１８；５’−ＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣ ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５０】
（１０）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＡＡＡＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ９（配列番号１９）およびＩＰ１０（配列番号２０）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：３１）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列も確認した。
配列番号１９；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＣＡＧＣＡＧＣＡ−３’
配列番号２０；５’−ＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣ ＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５１】
（１１）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＮＳＤＳＥＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１１（配列番号２１）およびＩＰ１２（配列番号２２）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの配列（配列番号：３２）が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列も確認した。
配列番号２１；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧ ＡＴＡＧＴＧＡＡ−３’
配列番号２２；５’−ＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴ ＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴ ＧＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５２】
（１２）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＥＡＡＴＴＴＤＰ−ＥＧの構築
プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩにて消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１３（配列番号２３）およびＩＰ１４（配列番号２４）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）の配列が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。塩基配列も確認した。
配列番号２３；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣ ＴＡＣＴＡＣＡ−３’
配列番号２４；５’−ＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴ ＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴ ＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧ ＣＧＡＡＡＧＣ−３’
【００５３】
（１３）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−ＡＥＥＡＡＴＴＴＡＰＫＤＰ−ＥＧｔの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型に使用し、配列番号１２および配列番号２７のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約４．３ｋｂｐ の断片と連結し、プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧｔを得た。
【００５４】
ＥＧｔは配列番号３に示すエンドグルカナーゼ遺伝子からコードされるポリペプチド（シグナルペプチドを除く、第１アミノ酸残基から第４３０アミノ酸残基まで）であり、ＥＧはＥＧｔよりカルボキシ末端から４２アミノ酸残基少ないポリペプチド。
【００５５】
得られたプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６ｃＥＧｔをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩによって消化して得られる約５．６ｋｂのＤＮＡ断片に、互いに相補的なオリゴヌクレオチドＩＰ１５（配列番号２５）およびＩＰ１６（配列番号２６）同士をアニールさせた２本鎖ＤＮＡ断片を結合し、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）の配列が付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。
【００５６】
本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂｐ の塩基配列が正しいことを確認した。
配列番号２５；５’−ＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣ ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣ ＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴ ＣＣＡＡＡＧ−３’
配列番号２６；５’−ＧＡＴＣＣＴＴＴＧＧ ＡＧＣＴＧＴＡＧＴＡ ＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴ ＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣ ＧＡＡＡＧＣ−３’
配列番号２７；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴ ＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣ ＣＣＴＴＣＴＴＡＡＧ−３’
【００５７】
（１４）プラスミドｐＮＵ２１２−ＥＧの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、配列番号５および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＮｃｏＩ−ＸｂａＩにて消化し、プラスミドｐＮＵ２１２をＮｃｏＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる断片約４．３ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼの末端には何も付加されない、エンドグルカナーゼ発現プラスミド（ｐＮＵ２１２−ＥＧ）を調製した。また、本発現プラスミドは、改良配列ではなく原配列のシグナルペプチドを有する。塩基配列も確認した。
【００５８】
（１５）プラスミドｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧの構成
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、配列番号７および配列番号６の合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＵ２１２をＰｓｔＩ−ＸｂａＩで消化してえられる約４．３ｋｂの断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、発現プラスミド（ｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧ）を調製した。塩基配列も確認した。
【００５９】
（１６）プラスミドｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧｔの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、配列番号７および配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調整した。この後のプラスミド調製過程は上記（１５）の場合と全く同様であるが、得られた発現プラスミドはｐＮＵ２１２−Ａ−ＥＧｔであった。塩基配列も確認した。
【００６０】
（１７）プラスミドｐＮＨ３２６−Ａ−ＥＧの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、ＥＧ３（配列番号７）およびＥＧ２（配列番号６）をプライマーとしたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＨ３２６をＰｓｔＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約３．９ｋｂｐ の断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂｐ の塩基配列が正しいことを確認した。
【００６１】
（１８）プラスミドｐＮＨ３２６−Ａ−ＥＧｔの構築
上記（１）のｐＥＴ−ＥＧＰｈを鋳型として、ＥＧ３（配列番号７）およびＥＧ８（配列番号２７）をプライマーとしたＰＣＲを実施し、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ断片を調製した。得られた断片をＰｓｔＩ−ＸｂａＩによって消化し、プラスミドｐＮＨ３２６をＰｓｔＩ−ＸｂａＩにて消化して得られる約３．９ｋｂｐ の断片と連結することによって、分泌されるエンドグルカナーゼのＮ末端にＡｌａが付加されるように、エンドグルカナーゼ発現プラスミドを調製した。本プラスミド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列はＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡシークエンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約１．５ｋｂｐ の塩基配列が正しいことを確認した。
【００６２】
実施例２． 発現ベクターを有するバチルス・ブレビスによるエンドグルカナーゼの分泌生産
実施例１の（１）〜（１８）で構築した各種発現ベクター・プラスミドによってバチルス・ブレビスＨＰＤ３１株、或いは３１−ＯＫ株を形質転換し、得られた形質転換体を好気的に培養することによって、エンドグルカナーゼを培養液中に分泌生産させた。生産はそれぞれの菌を生産用培地（３％ポリペプトン−Ｓ、０．８％酵母エキス、３％グルコース、その他、必要に応じて各種金属塩、Ｔｗｅｅｎ−４０、エリスロマイシン、ネオマイシン等を含有する）に接種し、３０℃、振とう培養で数日間培養することにより行った。それらの培養液の上清中のエンドグルカナーゼ活性を測定した結果を表１に示す。
【００６３】
分泌生産されたエンドグルカナーゼ量は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質として活性を測定することにより測定した。０．２ｍｌの１％ＣＭＣ水溶液と０．２ｍｌの０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を混合し、これに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して一晩透析した培養液上清を加え、８５℃にて反応させた。０．２ｍｌの反応液と０．４ｍｌのＳｏｍｏｇｉ銅液を混合し、沸騰浴中にて２０分間加熱した後、０．４ｍｌのＮｅｌｓｏｎ試薬を混合した。
【００６４】
この溶液の、５００ｎｍにおける吸光度を測定し、別にグルコースを用いて作成した検量線より、還元性末端量（Ｍａｉｎ）を測定した。また、培養液の代わりに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．６）を用いたブランク１、ＣＭＣの代わりに水を用いたブランク２を同様に処理し、それぞれの還元性末端量を測定した。Ｍａｉｎの値とブランク１およびブランク２の差を算出することにより、反応によって増加した還元性末端量を求めた。活性１単位（Ｕ）はＣＭＣから１分間に１ｍｇグルコースに相当する還元力を生じる酵素量と定義した。精製酵素の比活性は８．５Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００６５】
【表１】
表１から、エンドグルカナーゼ生産量は、そのアミノ末端に１ないし数個のアミノ酸を付加した場合にアミノ酸を付加しない場合の生産量の５〜２０数倍になり、顕著に増加することが分かる。また、本酵素の生産量をその比活性で重量に換算すると、効率よい場合は１リットル当たり１００ｍｇ以上であり、大腸菌による生産量の約１００倍であった。
【００６７】
実施例１の（２）及び（１３）の発現ベクターによって得られたエンドグルカナーゼを含有する培養液を遠心分離し、菌体を除いた後、硫安塩析、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等により、電気泳動的に単一に精製した。そのタンパク質の分子量、酵素活性、耐熱性、最適ｐＨ、基質特異性、などは、大腸菌で生産されたものと一致した。アミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、（２）及び（１３）のどちらの場合もＡ或いはＡＥＥＡＡＴＴＴＡＰＫＤＰの付加したエンドグルカナーゼが生産されていることが明らかになり、それらの付加アミノ酸やペプチドが酵素の性質に有意の影響を与えていないことが示された。
【００６８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の発現プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６−Ｘ−ＥＧの構築過程を示す図である。
Claims (7)
- バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のシグナルペプチド領域をコードするＤＮＡ配列の下流に、超好熱性古細菌由来でアミノ末端（Ｎ−末端）に１ないし２０個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする核酸配列が接続された遺伝子発現ベクターを有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し、エンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、古細菌由来超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
- 前記シグナルペプチドがバチルス・ブレビス由来で細胞表層タンパク質遺伝子のシグナルペプチドを改変した下記のアミノ酸配列：
- 前記エンドグルカナーゼがピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属古細菌由来のエンドグルカナーゼである請求項１及び２記載の方法。
- 前記エンドグルカナーゼが配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エンドグルカナーゼが、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加により修飾されたアミノ酸配列を有する請求項１〜３に記載の方法。
- 前記エンドグルカナーゼのＮ−末端に付加されるアミノ酸の数が１〜１５個である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エンドグルカナーゼのＮ−末端に付加されるアミノ酸が、次のアミノ酸またはアミノ酸配列：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２９）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３１）、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３２）、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３３）またはＡｌａ−Ｇｕｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）を構成する、請求項６に記載の方法。
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