JPH04349888A - マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には、本発明は、マルトテ
トラオース生成酵素遺伝子を高分泌発現ベクター断片に
連結してなるプラスミド及び、該プラスミドをバチルス
ブレビスに保有してなる新規微生物、並びに該微生物を
培養し、培養物中にマルトテトラオース生成酵素を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】マルトテトラオース生成酵素（ＥＣ３．
２．１．６０，ｅｘｏｍａｌｔｏｔｅｒａｏｈｙｄｒｏ
ｌａｓｅ）は、１９７１年ＲｏｂｙｔとＡｃｋｅｒｍａ
ｎによってシュードモナス・スツッツエリ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　　ｓｔｕｔｚｅｒｉ）の培養液中に初め
て発見された。近年マルトテトラオース生成酵素はシュ
ードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　　ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）も産生することが明
らかとなった。マルトテトラオースは臨床検査試薬や機
能性食品素材として需要が増大している。しかし、従来
知られている微生物によるマルトテトラオース生成酵素
の生産量は低く供給量を増大させることが望まれていた
。

【０００３】このような業界の要望に応えるため、本発
明者らは、先に、シュードモナス・サッカロフィラ由来
のマルトテトラオース生成酵素遺伝子をクローン化し、
該遺伝子を適当なベクターに連結し、マルトテトラオー
ス生成酵素遺伝子を発現可能な宿主菌（大腸菌）に導入
しこの形質転換体でマルトテトラオース生成酵素を製造
することに成功した（特開平２−２２２６８６号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た本発明者らの開発に係るシステムでは、未だマルトテ
トラオース生成酵素の生産量が充分ではなく、産業上必
要な量を安価に供給するには更に技術開発を行う必要が
ある。

【０００５】本発明は、このような技術の現状に鑑み、
マルトテトラオース生成酵素遺伝子をクローニングし、
この遺伝子を高分泌発現ベクターに連結し、この高分泌
発現プラスミドを宿主微生物に導入し、新規形質転換体
を作製し、更に当該新規組換体を培養し、培養物よりマ
ルトテトラオースを採取することにより産業上利用出来
る量の該酵素を安価に提供する目的でなされたものであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは、マ
ルトテトラオース生成酵素を安定にかつ効率よく生産さ
せる方法を提供すベく鋭意研究を重ねたところ、バチル
ス・ブレビスを宿主として用いてマルトテトラオース生
成酵素遺伝子を発現させることにより、培養物中に著量
のマルトテトラオース生成酵素が生産されることを見出
し、これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発
明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、宿主菌、特にバチルス
・ブレビスで高発現する新規なマルトテトラオース生成
酵素発現プラスミドに関するものである。また更に本発
明は、このプラスミドで形質転換した微生物、及びこの
形質転換体を培養することによるマルトテトラオース生
成酵素の工業的大量生産法に関するものである。以下、
本発明を具体的に説明するが、マルトテトラオース生成
酵素遺伝子をＧ４遺伝子、Ｇ４　　ｇｅｎｅないし単に
Ｇ４という場合もある。

【０００８】［（１）　　マルトテトラオース生成酵素
遺伝子のクローン化］マルトテトラオース生成酵素遺伝
子としてはマルトテトラオース生成酵素をコードするも
のであればいずれでもよく、公知の方法でクローン化さ
れたものが挙げられ、具体例としては、特開平２−２２
２６８６号公報に記載の方法に従ってクローン化された
プラスミドｐＧＦ１１が挙げられる。プラスミドｐＧＦ
１１は８．０Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマップを
図１に示す。ここで白ぬきの部分はベクターｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（ヤクトル社製）由来で、黒塗りの部分はマル
トテトラオース生成酵素遺伝子が含まれる部分であり、
各略記号はすべて制限酵素である。このプラスミドｐＧ
Ｆ１１で形質転換されたエシェリヒア・コリＣ６００−
ｐＧＦ１１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　
Ｃ−６００ｐＧＦ１１）は、微生物工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ　　Ｐ−１０４１１として寄託されている。

【０００９】Ｇ４遺伝子の導入は、例えば適当なクロー
ニングベクター（例えばｐＵＢ系ベクター）を用い、バ
チルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８
７）を宿主にして、適宜実施すればよい。

【００１０】プロモーターとしては、宿主内に機能する
ものであればいずれでもよいが、シュードモナス　　サ
ッカロフィラのマルトテトラオース生成酵素遺伝子のプ
ロモーターをそのまま利用することもできるが、バチル
ス属細菌由来のより好ましくはバチルス・ブレビス由来
のプロモーターがよい。例えばバチルス・ブレビス４７
（ＦＥＲＭ−Ｐ７２２４）あるいはバチルス・ブレビス
Ｈ１０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）の主要菌体外
蛋白質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子、ＭＷＰ遺伝子）のプロモ
ーターなどが例示される。該プロモーターは１種または
２種以上保有されていてもよい。プロモーター領域を含
有するＤＮＡは、上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻
訳開始コドン等を有していることが必要である。

【００１１】本発明において、マルトテトラオース生成
酵素は宿主の菌体内、菌体外のいずれかに蓄積されても
良いが、マルトテトラオース生成酵素の抽出、精製を容
易にし、また生産量を増大させるためには、菌体外にマ
ルトテトラオース生成酵素を蓄積させるのが望ましく、
この場合、マルトテトラオース生成酵素遺伝子の５’側
にシグナルベプチドをコードする領域を存在させる。

【００１２】シグナルペプチドとしては、マルトテトラ
オース生成酵素を宿主の菌体外に分泌させるものであれ
ばいずれでもよく、例えばシュードモナス　　サッカロ
フィラのマルトテトラオース生成酵素遺伝子のシグナル
ペプチドやバチルス・ブレビス４７あるいはバチルス・
ブレビスＨ１０２の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチ
ドなどが挙げられるが、なかでもバチルス・ブレビス４
７（ＦＥＲＭＰ−７２２４）由来のＭＷＰ蛋白質（ｍｉ
ｄｄｌｅ　　ｗａｌｌ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナル
ペプチドが好ましい。

【００１３】プラスミドを構築する方法としては、常法
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニングに
記載の方法などが例示され、Ｇ４遺伝子、プロモーター
、シグナルペプチド等のＤＮＡ断片をそれぞれ連結して
目的とするプラスミドを構築してもよいし、Ｇ４とシグ
ナルとを連結しておき、その後にプロモーター領域を連
結する等各種の変形手段を採ることも可能である。

【００１４】宿主微生物としては、バチルス・ブレビス
に属する微生物であれば何れでも良く、例えば、バチル
ス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２２４）、バチ
ルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７
）が挙げられるが、好適にはバチルス・ブレビスＨ１０
２が用いられる。なお、バチルス・ブレビスＨ１０２は
、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１とも称される（日本農
芸化学大会昭和６２年度大会講演要旨集ｐ２７、日本農
芸化学会誌６１，６６９（１９８７））。

【００１５】宿主微生物を形質転換する方法は、公知の
方法、例えばＴａｋａｈａｓｈｉらの方法［Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９８３）］、Ｔ
ａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，５３，３０９９−３１００（１９８９））などを採
用することができる。

【００１６】組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物
の選択方法は、液体選択培地で培養し、培養液中のマル
トテトラオース生成酵素活性を測定する方法、澱粉含有
寒天選択培地上にコロニーを形成させ、ヨード液を噴霧
することでアミラーゼ活性を測定する方法等既知の方法
によって測定できる。選択培地にはベクター上のマーカ
ーによって、最小培地や、抗性物質添加培地が適宜用い
られる。

【００１７】酵素活性の測定は、培養液に澱粉溶液を加
え、４０℃で保温した後、薄層クロマトグラフィーや高
速液体クロマトグラフィーを用いて生成されたマルトテ
トラオースの同定や定量をすることによって行なわれる
。

【００１８】得られたマルトテトラオース生成酵素生産
菌を液体選択培地にて３７℃で培養し、公知の方法、例
えば、アルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ａ
ｎｄＤｏｌｙ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　
　Ｒｅｓ．，７，１５１３，（１９７９））によってプ
ラスミドを得ることができる。マルトテトラオース生成
酵素遺伝子を含む組替えＤＮＡは、上記の方法で、適宜
制限酵素で切断し、他のベクターに組み込んだり、他の
宿主に導入することができる。

【００１９】［（２）　　ＤＮＡ塩基配列の決定］ＤＮ
Ａの塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法（
Ｍａｘａｍ，Ａ，Ｍ，ａｎｄ　　Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．
，Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
６５，４９９，（１９８０））やジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，ｊ．ａｎｄ　　Ｖｉｅｉ
ｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９，（１９８２））
等により決定することができる。ポリペプチドのアミノ
酸配列は、塩基配列より解読することができる。また、
ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナル配列のアミ
ノ酸配列も、同様にして決定する。

【００２０】［（３）　　マルトテトラオース生成酵素
活性を有するポリペプチドの調製］マルトテトラオース
生成酵素活性を有するポリペプチドを次のようにして調
製することができる。マルトテトラオース生成酵素産生
菌、あるいは上記の方法によってマルトテトラオース生
成酵素産生能を獲得した形質転換微生物を液体培養する
。培地としては、該微生物の通常の培養に用いられるも
のであればいずれでもよい。

【００２１】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。 該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。 栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい，該栄養物質としては、アミノ酸類
、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。

【００２２】培養後、酵素が菌体内にある場合には、培
養液を遠心分雛して菌体を得、超音波や細胞壁溶解酵素
等で処理し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗酵素液と
する。また、酵素が培地中にある場合には、培養液を遠
心分離して菌体を除き、以後の精製を行なう。得られた
粗酵素液から、塩析、透析、イオン交換樹脂、アフィニ
ティクロマトグラフ処理等一般的酵素精製法によりマル
トテトラオース生成酵素を単離することができる。

【００２３】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。

【００２４】〔実施例１　　バチルス・ブレビスへのマ
ルトテトラオース生成酵素遺伝子のクローン化〕プラス
ミドｐＧＦ１１（特開昭２−２２２６８６、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ　　Ｃ６００−ｐＧＦ１１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０４
１１）由来）に制限酵素ＸｈｏＩを作用させた。この反
応液を０．７％アガロース電気泳動に供し、そこに観察
される５．５ＫｂＤＮＡとマルトテトラオース生成酵素
遺伝子を含む２．４ＫｂＤＮＡのうち、２．４ＫｂＤＮ
Ａのみを市販のＤＮＡ精製キットＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（
ＴＭ）（フナコシ社製）により回収精製した。

【００２５】遺伝子の導入にはバチルス・ブレビスＨ１
０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）を宿主、プラスミ
ドｐＵＢ１１０ＥＸ（４．５Ｋｂ）をベクターに用いた
。 ｐＵＢ１１０ＥＸはプラスミドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲ
Ｉ部位にＸｈｏＩリンカー（宝酒造社製）を挿入したプ
ラスミド誘導体である。このｐＵＢ１１０ＥＸにＸｈｏ
Ｉを作用させた後、アルカリフォスターゼで処理し、さ
きに回収精製したマルトテトラオース生成酵素遺伝子を
含む２．４ＫｂＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、トリス
−ＰＥＧ形質転換法により、バチルス・ブレビスＨ１０
２を形質転換した。得られた形質転換処理菌体を選択培
地である１％可溶性澱粉、ネオマイシン６０μｇ／ｍｌ
、寒天１．２％を含むＴ２培地（ポリペプトン１％、肉
エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１％
、ｐＨ７．０）に塗布して３７℃で培養し、ネオマイシ
ン耐性株を得た。このネオマイシン耐性株を、ネオマイ
シン６０μｇ／ｍｌ、寒天１．２％を含むＴ２培地にて
３７℃で２４時間培養し、培養液中のマルトテトラオー
ス生成酵素活性の有無を薄層クロマトグラフィーによっ
て調べた（薄層クロマトグラフィーは、培養液をｎ−ブ
タノール：ｎ−プロパノール：水＝３：５：４の溶媒系
で６０℃、２回上昇展開を行った後、硫酸を噴霧してマ
ルトテトラオースの有無を調べた。）。その結果マルト
テトラオース生成酵素分泌株を分離することができた。

【００２６】得られたマルトテトラオース生成酵素生産
株を、ネオマイシン６０μｇ／ｍｌを含むＴ２培地にて
３７℃で培養し、培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後
、分離菌体からアルカリ抽出法によってプラスミドを分
離した。このプラスミドをプラスミドｐＨＳＤ０１と命
名し、プラスミドｐＨＳＤ０１を保持する形質転換体を
バチルス・ブレビスＨ１０２−Ｇ４（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
１０２８７）と命名した。プラスミドｐＨＳＤ０１は７
．０Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマップを図１に示
す。ここで白ぬきの部分はベクターｐＵＢ１１０ＥＸ由
来で、黒塗りの部分は染色体断片部分である。

【００２７】〔実施例２　　マルトテトラオース生成酵
素高分泌発現プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４の構築と形質
転換体の調製〕実施例１で得られたプラスミドｐＨＳＤ
０１を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断しその１．２
Ｋｂの断片と０．９５Ｋｂの断片を得た（図２）。１．
２Ｋｂの断片にはマルトテトラオース生成酵素遺伝子の
中央部より上流側、０．９５Ｋｂの断片にはその下流側
が存在している。プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）
を制限酵素ＳａｌＩとＰＳｔＩで切断し、１．２Ｋｂの
断片を挿入してｐＵＣＤ０１を得た。このプラスミドｐ
ＵＣＤ０１を持つ大腸菌ＭＶ１１８４（宝酒造製）から
モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ
ｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｐｒｅｓｓ，１９８
９）に記載の方法に従って環状１本鎖ＤＮＡを単離した
。図３に示したように、この１本鎖ＤＮＡのマルトテト
ラオース生成酵素遺伝子のシグナルペプチド切断部位よ
り上流３アミノ酸目から、６アミノ酸残基に対応するＤ
ＮＡに相補的な１本鎖ＤＮＡを化学合成した。ただし、
シグナルペプチド切断部位の上流２アミノ酸目のロイシ
ン（Ｌｅｕ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換する
ように塩基配列を変えて合成した。この合成ＤＮＡとマ
ルトテトラオース生成酵素遺伝子の中央部より上流部を
持つた環状１本鎖ＤＮＡを混合し、部分２本鎖化（アニ
ーリング）した。これにＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌ
ａｒｇｅ　　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　　Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｄ
ＮＡ　　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）で処理して環状２本鎖
化した。その後、マングビーン核酸分解酵素（Ｍｕｎｇ
　　Ｂｅａｎ　　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）と制限酵素Ｐｓｔ
Ｉで処理をし、０．９５ＫｂのＤＮＡ断片を得た。

【００２８】一方、ｐＨＳＤ０１のＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ
切断で得られたマルトテトラオース生成酵素遺伝子の中
央部より下流側を含む０．９５ＫｂのＤＮＡ断片をベク
ターｐＢＲＡＮ３のＳａｌＩ、ＰｓｔＩ切断部位に挿入
し、この０．９５ＫｂのＤＮＡ断片及びＭＷＰシグナル
ペプチド領域を含むプラスミドｐＢＲＳＤ１１を得た。 このプラスミドｐＢＲＳＤ１１を制限酵素ＮｃｏＩで切
断後Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌａｒｇｅ　　Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ　　Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ
）で処理し、その末端を平滑化した後、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉで切断した。このようにして処理したプラスミドｐＢ
ＲＳＤ１１に、上記処理にて１本鎖ＤＮＡより合成して
得られた０．９５ＫｂＤＮＡ断片をＴ４　　ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、ｐＢＲＳＤ１２を得た。このプラスミド
ｐＢＲＳＤ１２を、制限酵素ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断することでシグナルペプチドの中間付近以降か
らマルトテトラオース生成酵素遺伝子のＣ末端までをコ
ードする２．１ＫｂのＤＮＡ断片を単離した（図４）。

【００２９】続いて、発現ベクターｐＮＵ２００（Ｙａ
ｍａｇａｔａ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６，３５８９（１９
８９））をＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これ
にプラスミドｐＢＲＳＤ１２より単離した２．１ＫｂＡ
ｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼで連結し、その反応液を用いてＴａｋａｇｉらの方法
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９
（１９８９））によってバチルス・ブレビスＨ１０２（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）の形質転換を行った。得
られたエリスロマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ
ドを単離し、これをｐＮＵ２００Ｇ４と命名し（図４）
、プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４を保持する形質転換体を
バチルス・ブレビスＨ１０２−ｐＮＵ２００Ｇ４（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−　　　　　　　　　　）と命名した。

【００３０】〔実施例３〕実施例２で創製したバチルス
・ブレビスＨ１０２−ｐＮＵ２００Ｇ４（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−　　　　　　　　　　）を、グルコース１％、ペプ
トン１％、酵母エキス０．２％、肉エキス０．５％、ネ
オマイシン０．００６％の組成の培地１００ｍｌを収容
した５００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３７℃で一夜
振とう培養し、種培養液を得た。

【００３１】上記と同じ組成の培地１５ｌを収容した３
０ｌ容ジャーファーメンターに、上記で得た種培養液２
００ｍｌを加え、通気量１ｖｖｍ、撹拌数２００ｒｐｍ
で３７℃、４８時間通気撹拌培養を行った。

【００３２】得られた培養液を８０００ｒｐｍで遠心分
離することによって菌体を除去し、上澄１４ｌを得た。 この培養上澄に硫安９ｋｇを添加することにより塩析を
行い、生産されたマルトテトラオース生成酵素を沈澱物
として集めた。更にこの沈澱物を、５０ｍＭ　　ＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ６．０）を添加した１ｍＭ　　ＣａＣｌ２液
５０ｍｌに溶解後、遠心分離することにより、不溶解物
を除き同緩衝液に一夜透析した後の内液をマルトテトラ
オース生成粗酵素液とした。この粗酵素液の活性は３０
０００ＩＵ／ｍｌであった。

【００３３】

【発明の効果】本発明によってはじめてＧ４遺伝子高分
泌発現プラスミドが開発され、この新規プラスミドで形
質転換したバチルス・ブレビス等の形質転換体を培養す
ることにより、マルトテトラオース生成酵素を著量生産
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＨＳＤ０１の構築図である。

【図２】ｐＢＲＳＤ１２の構築図である。

【図３】ｐＢＲＳＤ１２の制限酵素切断地図である。

【図４】シグナルペプチドをコードする領域の導入図で
ある。

【図５】Ｇ４高分泌発現プラスミドｐＮＵ２００Ｇ４の
構築図である。

【配列表】

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　マルトテトラオース生成酵素遺伝子を
   含むＤＮＡとタンパク質高分泌発現遺伝子を含むベクタ
   ー断片を連結させてなるマルトテトラオース生成酵素発
   現プラスミド。
2. 【請求項２】　　マルトテトラオース生成酵素遺伝子の
   供与体微生物がシュードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓ
   ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）
   であることを特徴とする請求項１のプラスミド。
3. 【請求項３】　　タンパク質高分泌発現遺伝子を含むベ
   クター断片がバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
   　ｂｒｅｖｉｓ）由来のプロモーター領域であることを
   特徴とする請求項１のプラスミド。
4. 【請求項４】　　更にシグナルペプチドをコードする領
   域を連結させてなることを特徴とする請求項１のプラス
   ミド。
5. 【請求項５】　　請求項１〜請求項４のいずれか１項に
   記載のプラスミドをバチルス・ブレビスを宿主菌として
   導入してなる微生物。
6. 【請求項６】　　宿主菌であるバチルス・ブレビスがバ
   チルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８
   ７）であることを特徴とする請求項５の微生物。
7. 【請求項７】　　請求項５又は請求項６の微生物を培養
   し、培養物からマルトテトラオース生成酵素を採取する
   ことを特徴とする該酵素の製造法。