JP2004504607A - ネスト化ソーティングおよびハイスループットスクリーニングのための結合タンパク質およびタグのコレクションならびにそれら使用 - Google Patents

ネスト化ソーティングおよびハイスループットスクリーニングのための結合タンパク質およびタグのコレクションならびにそれら使用 Download PDF

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Abstract

捕捉試薬が特異的である、ポリペプチドタグを含むソーティングタンパク質にツールとして使用される抗体のような抗タグ捕捉試薬のアドレス可能コレクションを本明細書で提供する。当該コレクションを使用するネスト化ソーティングの方法をも提供する。その方法には、タグ化分子のライブラリーを作成するため、特有の、事前に選択したポリペプチドをコードする核酸分子のセットを導入することにより分子のタグ化コレクション群を作成し；タグを導入する前または後の何れかにおいて、ライブラリーをＮの分割物に分割し；個々の分割物を翻訳し、その個々の分割物をＮの捕捉試薬コレクション群の１つと反応させ；目的の分子群と結合したポリペプチドタグに結合した捕捉試薬を同定し、そしてそれにより目的の分子を含む、分割したコレクション群のうちの１つを同定するステップが含まれる。その方法には、更に、タグの新しいセットを加えること、および同じまたは異なるコレクション捕捉試薬群によりソーティングプロセスを繰り返すことが含まれ、それにより、目的のタンパク質または分子が同定される。

Description

【０００１】
関連出願
３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）の下、優先権の米国で利益を、発明の名称“ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮＳ ＯＦ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＦＯＲ ＮＥＳＴＥＤ ＳＯＲＴＩＮＧ ＡＮＤ ＨＩＧＨ ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ”であるＤａｎａ Ａｕｌｔ−Ｒｉｃｈｅの、２０００年７月１９日出願、米国仮出願番号６０／２１９１８３に関し、請求する。国際的な優先権を、米国仮出願番号６０／２１９，１８３に関し、請求する。許可されるならば、米国仮出願番号６０／２１９，１８３の内容すべてを引用により本明細書に加える。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、結合タンパク質のコレクション（本明細書では捕捉試薬と呼ぶ）および多様性ライブラリー（遺伝子ライブラリーを含む）の機能調査のためのその使用方法に関する。当該方法およびコレクションの技術は、ロボットマイクロ−ウェルハイスループットスクリーニングおよびアレイおよび関連技術に組込まれる。
【０００３】
本発明の背景
ゲノミクスおよびプロテオミクス
ヒトゲノムプロジェクトは、遺伝学的データの雪崩（ａｖａｌａｎｃｈｅ）を生じた。これらのデータの解明により、生物学がより理解され、最終的には、薬物創製の発展を導くこととなる。遺伝子配列情報の有用性により、生物医学的研究が構成される方法および発見の速度が変化している。しかし、ゲノム配列の獲得により、何の遺伝子か、あるいはコード化されたタンパク質はどのように機能するか、どのように細胞および組織が生育するのかが示されるわけではなく、ましてや病因についての洞察および疾患の治癒が提供されるものでもない。配列決定により得られる情報の所産以前に、ゲノムが十分理解され、コード化タンパク質およびその機能が同定されなければならない。
【０００４】
そのため、プロテオミクスの出現（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ）があり、その挑戦により、ヒトゲノムおよび他のゲノムの配列決定の効果により得られた過剰な情報が解明されることとなる。その焦点は、配列により同定される遺伝子の機能を決定することである。しかし、それは、配列決定により遺伝子を同定する仕事は、遺伝子またはコード化タンパク質の機能を発見することよりも簡単である。遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するための、生物化学的、遺伝学的および情報科学的アプローチを含む種々のアプローチでは、その同定の試みが為されている。情報科学的アプローチでは、遺伝子配列を、既知または既知とされている機能を有するタンパク質をコードする遺伝子配列と比較するコンピューター探索に基づく遺伝子機能を決定する試みが為されている。遺伝子配列と機能との間の断絶のため、これらのアプローチの成功は制限されている。遺伝子機能の決定は、遺伝学および生物化学の典型的アプローチに依存しつづけている。当該遺伝学的アプローチは、遺伝子機能の破壊、その後のその破壊による効果の観察に基づいており、生物化学的アプローチは、機能と相関する生物化学的変化に基づいている。進歩のため、ハイスループットな分析が必要とされている。
【０００５】
ゲノミクスのため、ハイブリダイゼーション反応に依存するハイスループットアレイが、遺伝子を同定する手段として用いられている。プロテオミクスは、ハイスループットの方法論にはまだなじまない。例えば、ＤＮＡマイクロアレイが用いられ、所定サンプル中の数千の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量を決定する。ＤＮＡの遺伝子は、タンパク質に翻訳される前に中間体分子としてｍＲＮＡに転写される。２つのサンプル由来のｍＲＮＡは、２種類の色素を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により別々に標識され、混合され、次いで、アレイ上で浸す。このＰＣＲ産物は、ヌクレオチドの相補配列を含む核酸を含むアレイ中のスポットに特異的に結合する。色素の割合は、２サンプル中のｍＲＮＡの相対量を決定する。次いで、コンピューターアルゴリズムを使用し、データを評価し、インタープリトする。タンパク質は、細胞性調節の中心であり、ｍＲＮＡ発現とタンパク質発現との間に直接相関がないため、このＤＮＡマイクロアレイ分析は、本来的に制限される。タンパク質の活性は、他のタンパク質との相互作用または代謝の結果としてしばしば、その構造の微妙な変化により調節され得る。更に、タンパク質は、異なる半減期を有し、細胞内で区画に分けられている。結果として、細胞のタンパク質状態、またはｍＲＮＡと協同する「プロテオーム」に関する情報を得ることは難しい。
【０００６】
タンパク質分析技術は、タンパク質分離および検出の組合せに基づく。二次元（２−Ｄ）ゲルシステムでは、タンパク質は、一方向には荷電により、そして他の方向には大きさにより分離する。分離後、タンパク質は、ゲルからの切除およびマススペクトロメトリーによる分析により同定される。２−Ｄゲル方法は１，０００を超えるタンパク質を同時に分析するけれども、これらの方法は、巨大サンプルの要求物、低い溶解性、低い感度、結果の不一致およびロースループット（ｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）により制限される。
【０００７】
遺伝子シャッフリングおよびエラー−プロンＰＣＲによるランダム飽和変異誘発（ｒａｎｄｏｍ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のようなタンパク質進化法は、タンパク質の望ましい特性を「進化」させる選択を伴う変異と関連し、それにより、例えば、産業工程で使用するための触媒を作成するため、新規研究試薬を作成するため、および組換え抗体の能力を改善する手段が提供される。可能な構造変異の量は多い。例えば、１００アミノ酸を含む比較的小さいタンパク質との可能な組合せの数は２０１００である。更なる多様性は、合成性、または「非自然性」のアミノ酸を含むことにより提供される。タンパク質評価法は、数兆のタンパク質変異を含む遺伝子のコレクションを作成し得る。これら数兆の中に、望ましい特性を有するタンパク質がある。これらの多様性を生ずる方法を生かす鍵は、これら非常に大きな「乾草堆」の中にある望ましい「針」を見つけ出す能力である。これは、抗生物質の耐性の獲得のような、選択方法論を使用し、固定化捕捉分子に結合させ、および蛍光性の獲得その後の粒子ソート化により、試みられる。進化する特性に依存し、選択スキームが常に可能であるわけではない。ハイスループットロボットシステムを使用する個々の試験は、選択システムに代わるものであるが、これらのシステムは、５０万クローンを超える調査のためには非実用的である。これらの方法では、これらの多様性作成法の能力を完全に活用することはできない。
【０００８】
タンパク質のサンプル多様性コレクションを同定し、タンパク質およびその機能を同定する新規方法の必要があることは明らかである。そのため、ここでは、タンパク質の多様性コレクションのうちの望ましいタンパク質を同定するための方法および産物を提供することを目的とする。また、ここでは、その方法を行うための産物を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明の要約
本明細書では、巨大コレクション由来の分子、特にタンパク質および核酸をスクリーニングし同定するための方法および製品を提供する。特に、同定可能タンパク質結合パートナーに特異的に結合する捕捉試薬のコレクション（すなわち、抗体のようなレセプターまたは他のレセプター）を、本明細書ではポリペプチドタグと称し、ここで、個々の捕捉試薬が、エピトープまたはリガンドまたはその部分のような事前に選択したポリペプチドタグに対し高い選択性および特異性で結合するように選択又は設計されている、コレクションを提供する。抗体のような同定可能な捕捉試薬を含むコレクションは、抗体のような捕捉試薬が同定可能（アドレス可能）である限り、液相および固相形式を含む任意の適当な形式で提供される。捕捉試薬のアドレス可能アレイを本明細書で例示する。アレイについて本明細書で例示した方法は、ＲＦタグ、検出可能ビーズ、バー被覆ビーズに結合する抗体のような捕捉試薬を含む任意の他の形式および他の形式で実施され得る。そのコレクションは、ソートするための装置として役立ち、最終的に、目的のタンパク質および遺伝子および他の分子を同定する。
【００１０】
エピトープタグのような、事前に選択したポリペプチドタグは、ソートされるタンパク質のような分子に結合される。その結合は、任意の手段により行われ得、スクリーニングされるタンパク質をコードする核酸に、タグをコードする核酸を組込む増幅を伴う増幅スキームまたはライゲーションを用い通常行われる。
【００１１】
タンパク質−タグ−標識コレクションを用いソートする方法を本明細書で提供する。本明細書では、ソーティングにより、タンパク質の巨大な多様性コレクションから望ましい特性でタンパク質を同定する方法を提供する。本明細書で提供する結合タンパク質（捕捉試薬）のアドレス可能コレクションおよび方法に重要なのは、既知配列の事前に選択されたポリペプチドタグのセットに結合する、抗体のような捕捉試薬の選択である。ポリペプチドタグは、抗体のような捕捉試薬に特異的に結合する十分な数のアミノ酸を含む。抗体のような捕捉試薬のコレクションは、少なくとも約１０、より少なくとも約３０、５０、１００、２００、２５０、またはそれより多く、少なくとも約５００、１０００またはそれより多い種類の、種々のメンバーのポリペプチドタグのセットに結合する抗体のような捕捉試薬を含む。抗体のような捕捉試薬のコレクションを作成する方法を本明細書で提供する。
【００１２】
抗体のようなアドレス可能捕捉試薬コレクションは、当該捕捉試薬と特異的に反応するポリペプチドのアミノ酸配列でタグ化される分子をソートする手段を提供する。当該ソーティングは、コレクション中の抗体のような捕捉試薬と、ソートされる分子のコレクションに導入されるエピトープタグのようなポリペプチドタグとの間での高い特異性に依存する。
【００１３】
ある実施態様では、抗体のようなアドレス可能捕捉試薬は、固相上の区別できるアドレス可能位置に提供される、複数の捕捉試薬を含むアレイとして提供される。アレイ上の個々のアドレスは、特異的な、事前に決定したタグに結合する抗体のような捕捉試薬を含む。一般的に、個々の位置の抗体のようなすべての捕捉試薬は、同一であるか実質的に同一であるが、個々の試薬が、事前に設計するか事前に選択したポリペプチドタグを生ずる分子、一般的にはタンパク質に選択的に結合する特異的な高い結合親和性（ｋａは一般的には少なくとも約１０−７から１０−９である）を有する必要があるのみである。
【００１４】
実施において、ポリペプチドタグでタグ化されるタンパク質を、捕捉試薬のアレイ上で浸すか、適当な結合条件下、ビーズのような同定可能な支持体に結合する捕捉試薬のコレクションと反応させる。特定捕捉試薬に対する、事前に選択したタグの結合特異性の特性により、タンパク質は、事前に選択したタグによりソートされる。次いで、タグの同定が知られているが、それは特定捕捉試薬と反応するためであり、その同定は、カラーコード化またはバーコード化のようなものを含む光学的コード化、またはマイクロ波のような電子的タグ化または周波数（ｒａｄｉｏ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）（ＲＦ）−タグ化、粒子に対する結合のようなアレイまたはそのアイデンティファイアー中の位置の効果により、知られる。
【００１５】
ある実施態様では、抗体は、固相形式で提供され、より好ましくは、個々の位置が同定されるアドレス可能アレイとして構成される。バーコードまたは他の記号または同定の印もまた、抗体の方向付けまたはポジショニングの目的のために固相アレイに含まれ得る。複数のそのアレイが単一マトリクス支持体に含まれ得る。ある実施態様では、アレイが配置され、例えば９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルまたはそれよりも高い密度形式でマッチする大きさである。他の実施態様では、３０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００または通常の数のような、例えば、３０から１０００抗体配置を有する２４アレイ、個々が配置されている。ある実施態様では、３０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００または他の通常の数のような、３０から１０００抗体位置までを有する、例えば９６またはそれより多いアレイ、それぞれが配置されている。
【００１６】
他の実施態様では、固体支持体は、液相中で扱うことができ、次いで二次元アレイ中に層となるミクロスフェアのような、コード化粒子（ビーズ）を構成する。ミクロスフェアのような粒子は、コード化されており、所望により、カラーまたはバーコード化、化学的コード化、電子的コード化のようにコード化されており、またはそれに結合したビーズおよび捕捉試薬を同定し得る任意の適当なコードを用いコード化される。その捕捉試薬は、支持体上で被覆されるか、または他には当該支持体に結合している。
【００１７】
抗体のような捕捉試薬のコレクションは、種々の過程で使用され得るツールであり、以下に限らないが、治療、診断、研究試薬、プロテオミクス親和性マトリクス、改善した触媒を同定するため酵素工学のための、抗体親和性成熟のための、小分子捕捉タンパク質および配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質のための、タンパク質相互作用マッピングのための、および高親和性Ｔ細胞レセプターの開発および同定のための、抗体の迅速同定が含まれる（例えば、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８： ７５４−７５９）。
【００１８】
エピトープのようなポリペプチドのタグは、化学的結合を含む任意の適当な方法により分子中に導入され得る。それらは、種々の方法によりタンパク質中に導入され得る。これらには、例えば、タグをコードするプライマーを用いる増幅によるか、またはオリゴヌクレオチドのライゲーション、所望によりその後の増幅によるタンパク質をコードする核酸中への導入、またはタグをコードするプラスミドのセット中へのクローニングによる導入が含まれる。例えば、エピトープのようなポリペプチドのタグは、生ずる増幅核酸中にタグを導入するよう設計したプライマーを用いｃＤＮＡライブラリーから増幅、典型的にはＰＣＲすることにより、タンパク質中に導入される。複数のそのタグは、最終的に核酸中に導入され、核酸の翻訳においてソーティングし得、望ましいタンパク質をコードする核酸を選択的増幅する配列を提供する。
【００１９】
ポリペプチドタグは、抗体のような捕捉試薬が結合するように設計されるか選択されるアミノ酸配列（本明細書では、および本明細書の目的のために、「Ｅ」と称し、それは一般的にはエピトープと呼ばれており、任意の捕捉試薬が結合するアミノ酸配列が含まれる）を含む。タグのＥタンパク質（エピトープとして本明細書では称しており、抗体に結合するアミノ酸配列に制限されない点に注意）は、捕捉試薬に選択的に結合する十分な数のアミノ酸を含む。また、特定実施態様では、本明細書でディバイダー（Ｄ）として称する配列を含み、それには、１またはそれより多いアミノ酸、典型的には、少なくとも３アミノ酸が含まれ、一般的には４から６のアミノ酸が含まれる。エピトープおよびディバイダー配列は、タグをコードするＤＮＡの増幅のため、または他の目的のため、必要であるため、更なるアミノ酸および付加領域を含み得る。以下に示すように、ポリペプチドタグはまた、「Ｃ」と称する領域を含み得る。
【００２０】
エピトープのような結合対のタグで標識した分子をソーティングするための、抗体コレクションのような捕捉試薬（本明細書ではレセプターと称する）のコレクションを用いる方法を提供する。当該方法は、タグをコードする核酸を添加することによるマスタータグ化ライブラリーを作成すること；Ｎの反応物中でマスターライブラリーの一部を分割すること；ディバイダー配列をコードする核酸で各反応物を増幅し、翻訳し、Ｎの翻訳した反応物混合物を作成すること；例えば、ウエスタンブロッティングに使用する条件を用い、抗体の１コレクションと、個々の反応混合物とを反応させること；適当なスクリーニングにより目的のタンパク質を同定し、それにより、目的タンパク質が結合する捕捉試薬の特性によりタンパク質上の特定ポリペプチドタグを同定することを含む。
【００２１】
第一のソートは、重要なファクターにより、多様性を減少するように設計する。次いで、標準的なスクリーニング法を用い、新規サブライブラリーをスクリーニングし得る。多様性の更なる減少が望ましいならば、第二のソートを行い得る。抗体（または他のレセプター）の数、Ｄおよびプールの数および第一のスクリーニングにおけるコレクションの数の適当な選択により、任意の第二のスクリーニングは、生ずるコレクションが単一のタンパク質のみまたは少数のタンパク質のみを含むように設計し得る。
【００２２】
目的タンパク質が翻訳された、核酸を含む核酸反応混合物から出発する第二のソートを行い得る。このステップでは、新規セットのポリペプチドタグを、増幅またはライゲーションその後の増幅により核酸に加える。この前またはこれと同時に、エピトープタグのような事前のポリペプチドタグをコードする核酸を、制限酵素などを用いる切断によるか、またはエピトープコード化核酸の一部またはすべてを破壊するプライマーを用いる増幅によるか、いずれかにより取除かれる。新規タグを追加し、生ずる核酸を翻訳し、抗体の単一アドレス可能コレクションと反応させる。ポリペプチドタグによるタンパク質ソート、およびスクリーニングを行い、目的タンパク質を同定する。この時点で、抗体コレクションのアドレス可能位置での分子の多様性は、１である（または１から１０のオーダーである）。次いで、目的タンパク質を含む核酸を、同定したポリペプチドタグをコードする核酸を含む核酸分子を増幅し、それにより、目的タンパク質をコードする核酸を産生するタグで増幅する。増幅のためのプライマー、特に第二または更なるソーティングステップを考慮した方法におけるプライマーは、プライマーとして役立ち、それにより、コード化タンパク質から少なくともポリペプチドタグの「Ｅ」部分を取除く、タグのすべての部分または重要部分を含み得る。
【００２３】
特定のソーティングステップ（ステップｉ）の場合、Ｅｌ−Ｅｍと称するＭポリペプチドタグがあり、それは、コレクション中の抗体のような異なる捕捉試薬の数と同数であり、Ｎｉのディバイダー領域［式中、Ｎは、それぞれ個々のディバイダー領域により増幅されるサンプル数であり、ｉは、少なくとも１である］は、ソーティングステップに関連する。それぞれのソーティングステップにおいて、タグおよびディバイダー領域の数は異なり得る。ここで、Ｄｌ−Ｄｎと称するＮのディバイダー領域がある。Ｎはまた、ソーティング過程における第一ステップで使用する複製アレイまたはコレクションの数である。当該過程の第一ステップは、最初の多様性およびＭおよびＮに依存する特定量により多様性を減少する。
【００２４】
例示した実施態様では、マスターライブラリーは、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーであり、ポリペプチドタグは、ライブラリー中のｃＤＮＡ分子中に導入されるプライマーまたはオリゴヌクレオチドによりコードされる。これらの方法における第一のステップにおいて、核酸のマスターコレクション（それぞれは、一般的には、核酸分子、エピトープを含む事前に決定したポリペプチド（すなわち、捕捉試薬に特異的に結合する必要のある特定アミノ酸配列）をコードする核酸の３’末端または５’末端のような一端において含まれる）を調製する。マスターコレクション由来のサンプルは、５０、１００、２００、２５０（または通常９６、または多数（９６、９６×１、９６×２．．．ｎ［式中、ｎは、１から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、５００、１０ｒのような、必要な数多いプールまでであり、ここで、ｒは、２またはそれ以上である］））のようなＮのプールに分けられる。個々のプールにおいて、ｎのディバイダー配列（Ｄｎ）のうちの１つを用い、特定のＤを含むすべての核酸を増幅する。
【００２５】
個々の増幅プールを翻訳し、それに含まれるタンパク質を、抗体コレクションのような捕捉試薬コレクションの１つと接触させ、ここで、タグは、個々の捕捉試薬が特異的であり、アドレス可能な２または３次元アレイにおける位置、または同定可能な特定支持体に対する結合の特性（ｖｉｒｔｕｅ）などによって、知られている。接触後、捕捉試薬タンパク質複合体は、目的タンパク質に特異的なアッセイのような標準的方法を用い、または他の適当な試薬の添加により同定される。比色分析性、発光性、蛍光性および他のアッセイは、予期されるスクリーニングアッセイの中に含まれる。目的タンパク質が結合する、捕捉試薬、すなわち抗体を同定すること、およびプールがその捕捉試薬を含むことにより、オリジナルのＤｎプールが知られ、当該プール中のエピトープおよび多様性がｎ×ｍ減少する。ＦＡと称する、エピトープの部分を含み、Ｅのすべてを含むプライマーのセットを用い、Ｄｍプールを増幅する。これは、同定化Ｅタグを含み、翻訳したタンパク質中のエピトープを破壊し、そしてポリペプチドタグコード化核酸分子の新規セットをプール中へ導入し、次いで、翻訳し、抗体の単一コレクションと接触するプールのメンバーのみを増幅する；当該コレクションをスクリーニングし複合体を同定する。ＦＢ［式中、ＦＢはエピトープのすべてまたは一部である］を含むプライマーを用いる、同定化Ｅタグをコードする核酸の増幅、その後の翻訳により、目的タンパク質を含むサンプルを生ずる。
【００２６】
多様性の更なる減少が望ましいならば、更なるソーティングステップを、ＭｉおよびＮｉタグ［式中、ｉは、ソーティングステップの数であり、ＭおよびＮが個々のステップで異なり得ることを表している］を用い行う。それぞれのＭおよびＮは、多様性の望ましい減少を行い得るように選択され得る。ライブラリーの多様性＝Ｄｉｖは、ライブラリー中の異なる遺伝子またはタンパク質の数であり、Ｎｉは、特定のソーティングステップに使用するディバイダー配列（個々のディバイダー配列をＤｎと称する（ｎは２からＮまでであり、典型的には少なくとも約１０からＮｉ×Ｍｉである））の数であり、ポリペプチドタグの数であり、Ｍｉは、コレクション中の、抗体のような異なる捕捉試薬および／または他のレセプターまたはその部分の数であり、そして、個々のポリペプチドタグをＥｍと称し、ここで、ｍは２からＭであり、好ましくは少なくとも約１０からＭであり、ｉは１からＱであり、Ｑは抗体コレクションを用いるソーティングステップの数である。特に、ライブラリーの多様性（Ｄｉｖ）、Ｄｉｖ＝（Ｎｉ×Ｍｉ）（Ｎｉ＋１×Ｍｉ＋１）．．．（ＭＱ×ＮＱ）、ここで、ｉ、ソーティングステップは１からＱである。Ｎ、Ｎｉ．．．ＮＱが個々のステップで同じ数であり、Ｍ、Ｍｉ．．．ＭＱが個々のステップで同じ数ならば、ＤＩＶ＝（Ｎ×Ｍ）Ｑ。目的が、１のような望ましいレベルに多様性を減少させることであるならば、Ｄｉｖ／（Ｎｉ×Ｍｉ）（Ｎｉ−１×Ｍｉ−１）．．．（ＭＱ×ＮＱ）＝望ましいレベルの多様性であり、個々のソートにおけるＭおよびＮは、結果的に選択される。
【００２７】
ここで、例えば、ライブラリー中に１０６タンパク質が存在し、個々のコレクション（Ｍ）中に１００種の抗体が存在し、１００複製抗体コレクションを用い（Ｎ）、２つのソーティングステップ（Ｑ＝２）が存在するならば、１０６（Ｄｉｖ）の多様性を有するライブラリーのため、初期マスターコレクションを分割する反応物の数は１００となる。一般的に、ソートの数は、１または２である。それはもっと多くてもよいが、最後のステップを、このステップにおいて、ある位置の実質的にすべての分子が同じとなるように、設計する。他に、より少ないソーティングステップ、典型的には１が存在し、それは、実質的に多様性を減少する。他のスクリーニング法を、更なるソーティングステップの代わりに使用し、目的のライブラリーメンバーに相当するタンパク質を同定し得る。この例では、第一のソート後、多様性は減少し、それにより、目的のライブラリーメンバーに相当するタンパク質が１００中で約１で存在する；多様性（ＤＩＶ）は、ファクター１０４で減少する。第二ソートを行う以外に、他のスクリーニング法を使用し、１００中のうちの望ましい１つを同定し得る。
【００２８】
コレクションの、抗体のような捕捉試薬メンバーを選択し、調製する方法をも提供する。ポリペプチドタグを設計し、タグに特異的に結合する抗体を調製するための方法を提供する。プライマーおよびプライマーのセットを調製する方法をも提供する。
【００２９】
ソーティング過程を行うためのタグを導入するためのオリゴヌクレオチドおよびそのセットをも提供する。プライマーまたは二本鎖（または部分的二本鎖）として使用する実施態様のため、タグ化タンパク質の調製のためライゲーションにより導入される実施態様のための一本鎖である、オリゴヌクレオチドのセットをも提供する。プライマーを設計するための方法をもまた提供する。
【００３０】
抗タグ抗体のような、捕捉試薬と結合しているかまたは捕捉試薬で被覆されているアレイまたはビーズのセット（すなわち、粒子支持体）、および捕捉試薬が特異的に結合するポリペプチドタグまたは当該ポリペプチドタグをコードする発現ベクターのセットの組合せを提供する。当該ベクターは、所望により、目的のｃＤＮＡライブラリーの挿入のためのマルチクローニングサイトを含む。当該組合せは、更に、サブクローニングに必要な酵素および緩衝液、および目的のサブライブラリーの回収に使用するライブラリーおよびオリゴヌクレオチドプライマーの形質転換のためのコンピテントセルを含み得る。抗タグ抗体のような捕捉試薬で被覆されるかまたは捕捉試薬に結合した２以上のアレイまたはビーズのセット、ポリペプチドタグをコードするオリゴヌクレオチドのセット、目的のｃＤＮＡライブラリーに付加する必要のある任意の共通領域、および所望により、ライゲーション、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用する任意の酵素および緩衝液を含む組合せ、ならびに／またはライブラリーにおいてｃＤＮＡにタグのパネルを付加するために必要な組合せをも提供する。当該組合せは、更に、タグ化ｃＤＮＡのタンパク質産物のインビトロ転写および翻訳のためのシステム、および所望により目的のサブライブラリーの回収のために使用するオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。研究室で使用するため適当にパッケージしたこれらの組合せを含み、所望により使用のための指示書を含むキットをも提供する。
【００３１】
ある実施態様では、抗体のような捕捉試薬のコレクションと、捕捉試薬が選択的に結合するポリペプチドエピトープをコードするオリゴヌクレオチドの組合せを提供する。オリゴヌクレオチドおよび抗体のような捕捉試薬を含み、所望により、指示書および／または更なる試薬を含むキットを提供する。当該組合せには、事前に決定したエピトープのセット、および個々のエピトープをコードするオリゴヌクレオチドのセットに特異的に結合する、抗体のような捕捉試薬のコレクションが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖であるか、または制限エンドヌクレアーゼ切断により生ずる一本鎖オーバーハングのような二本鎖および一本鎖部分を含む。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１は、ネスト化ソーティングの概念を解説したものである。
図２もまた、ネスト化ソーティングを解説したものである；このソートは、図１で解説したソートと同一であるが、Ｆ２およびＦ３サブライブラリーはアレイに配置されている点が異なる。
図３は、高多様性遺伝子ライブラリー（ｈｉｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）のネスト化ソートのためのツールとしての抗体アレイの使用を解説したものである。
図４は、変異遺伝子のライブラリーを探索するために本明細書で提供した方法の適用を解説したものである。
図５は、組換え抗体ライブラリーを構成する方法を解説したものである。
図６は、ポリペプチド（エピトープ）タグを、プライマー付加を用い、組換え抗体に組込むための１つの方法を示す。
図７は、リンカー付加を用いる他のスキームを示したものである。
図８は、組換え抗体ライブラリーを探索するための本明細書の適用を示したものである。
図９は、本明細書において提供されるプライマーのエレメント、および必要とされるプライマーのセットを略図的に示したものである。
図１０および１１は、ＥＤおよびＥＤＣプライマーを構成するための他の方法を示す；図１０では、オリゴヌクレオチドは、固体支持体上で３’から５’へ化学的に合成され、図１１の方法では、オリゴヌクレオチドは、オーバーラッピングハイブリダイゼーションに基づき自己アセンブルする。
図１２は、アレイで使用するためのハイブリドーマ細胞から産生するイムノグロブリン（Ｉｇ）を発見するためのハイスループットスクリーニングを示したものである。
図１３（図１３Ａおよび１３Ｂ）は、組換えヒト抗体を調製するための抗体鎖増幅用の典型的プライマー（配列番号１２−７３）を示したものである（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄの８７−８８頁の表３３参照、また、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ７７９−７８３およびＫａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ参照）。
図１４（Ａ−Ｄ）は、抗体作成のための本明細書の方法の使用を示したものである。
図１５は、修飾された特異性（または修飾された特異性を有する任意のタンパク質）を用い抗体を同定するための本明細書の方法の使用を示したものである。
図１６は、同時抗体探索（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅａｒｃｈｅｓ）のために本明細書の方法の使用を示したものである。
図１７は、酵素作成プロトコールにおける本明細書の方法の使用を示したものである。
図１８は、タンパク質相互作用マッピングプロトコールにおける本明細書の方法の使用を示したものである。
図１９は、複数のポリペプチドタグをソーティングに使用するときのタグの数の増加率を示したものである。
【００３３】
制限するつもりではなく、明確な開示のため、詳細な説明を以下のサブセクションに分けている。
【００３４】
（本発明の詳細な説明）
Ａ．定義
他に特記しなければ、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同一である。本明細書の用語の定義と異なる場合には、定義は、このセクションに記載の意味に依存する。許されるならば、本明細書の開示で全体を通して言及する、すべての特許、出願、公開出願および他の刊行物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列を、引用によりすべて組込む。
【００３５】
本明細書で使用する場合、ネスト化ソーティングとは、本明細書で提供する抗体のアドレス可能コレクションを使用して、多様性を減少させる過程をいう。
【００３６】
本明細書で使用する場合、抗タグ捕捉試薬（または本明細書では捕捉試薬のアドレス可能コレクションという）、抗体のような、タンパク質製剤（すなわち、レセプター）のアドレス可能コレクションは、エピトープ（抗原中のエピトープのようなアミノ酸配列）を含む事前に選択したポリペプチドタグに特異的に結合し、ここで、コレクションのうちの個々のメンバーは、標識され、および／または抗体のような捕捉試薬およびタグの同定を可能となるよう位置付けられる。アドレス可能コレクションは、典型的にはアレイまたはコード可能（ｃｏｄａｂｌｅ）コレクションであり、この場合、それぞれの位置は、単一の特異性を有する抗体のようなレセプターを含み、同定可能である。化学性（ｃｈｅｍｉｃａｌ）、電子性、呈色性、蛍光性または他のタグのような他の個別のアイデンティファイアーが含まれるならば、当該コレクションは、液相中にあり得る。捕捉試薬は、抗体および他の抗タグレセプターを含む。エピトープのような事前に決定したアミノ酸配列に特異的に結合する任意のタンパク質は、捕捉試薬としての使用が予期される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、一般にタグと称される本明細書のポリペプチドタグは、捕捉試薬に特異的に結合するアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本明細書で使用する場合、エピトープタグは、抗体のような抗タグ捕捉試薬が特異的に結合するエピトープとして称される本明細書のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をいう。ポリペプチドおよびエピトープタグの場合、それぞれが結合する特異的アミノ酸配列を本明細書では一般的にエピトープという。レセプターに結合する任意のアミノ酸配列が予期される。本明細書の目的の場合、捕捉試薬に特異的に結合する、エピトープタグのエピトープ部分のようなタグのアミノ酸配列を「Ｅ」と称し、個々の特有のエピトープはＥｍである。文脈に依存して、「Ｅｍ」はまた、エピトープを構成するアミノ酸をコードする核酸配列をいう。エピトープタグのようなポリペプチドタグはまた、ディバイダー領域によりコードされているアミノ酸を含み得る。特に、エピトープタグは、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドによりコードされており、それはタグの導入に使用される。リファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）が形成され核酸に関してエピトープタグとなるとき（すなわち、特定レセプターまたはその部分と結合対となる）、それは、リファレンスが形成されるタグをコードする核酸である。単純化のため、個々のポリペプチドタグはＥｍとして称される；核酸を述べるとき、Ｅｍは核酸であり、エピトープをコードする核酸配列をさす；翻訳タンパク質を述べるとき、Ｅｍはアミノ酸をさす（実際にはエピトープ）。Ｅの数は、アドレス可能コレクション中の抗体の数に相当する。「ｍ」は、典型的には少なくとも１０、より好ましくは３０またはそれ以上、より好ましくは５０または１００またはそれ以上であり、所望の、かつ実用的な数となり得る。最も好ましい「ｍ」は、約１０００またはそれ以上である。
【００３９】
本明細書で使用する場合、Ｄｎは、個々のディバイダー配列をいう。本明細書で述べるように、分割が他の方法で行われる特定実施態様では、Ｄｎは任意である。個々のＥｍのように、Ｄｎは、状況に応じて核酸またはアミノ酸の何れかとなる。個々のＤｎは、サブセットの核酸を増幅するプライミング部位として役立つ核酸によりコードされるディバイダー配列である。得られた増幅サブセットの核酸は、増幅でプライミング部位として使用するＥｍ配列およびＤｎ配列のコレクションのすべてを含む。本明細書で記載したように、核酸は、個々のＥｍＤｎをコードする部分、好ましくは末端部分において含まれる。一般的に、コード化核酸は、ライブラリー中の核酸分子において５’−Ｅｍ−Ｄｎ−３’である。Ｄは、サブライブラリーを作成する特異的増幅のためのヌクレオチドの任意の特有配列である。巨大なライブラリーの場合、オリジナルライブラリーは、サブライブラリーに分けられ、次いで、マスターライブラリーにタグコード化配列を加える以外に、タグコード化配列を加える。ライブラリーが大きくなればなるほど、当該ライブラリー中の特有配列の特定にはより長い配列が必要となるため、Ｄの大きさは、ソートされるライブラリーの機能であるといえる。方法における機能はＰＣＲ増幅用のプライミング部位として役立つことから、応用に応じた一般的なＤは、少なくとも１４から１６核酸塩基であり、アミノ酸配列をコードしているかもしれないし、またコードしていないかもしれない；Ｄは２からｎであり、ここで、ｎは０または任意の望ましい数であり、そして一般的には１０から１０，０００、１０から１０００、５０から５００、および約１００から２５０である。Ｄのその数は、１０６かまたはそれよりも大きくなり得る。ディバイダー配列Ｄを用い、タグ化マスターライブラリーから「ｎ」のサンプルそれぞれを増幅し、一般的に、最初のソートで使用する、アレイのような抗体コレクションの数に等しくなる。最初のスクリーニングにおいてコレクション（部分（ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ））が多くなればなるほど、アドレス可能位置あたりの多様性は少なくなる。最初の分割数は、ライブラリーの多様性および捕捉試薬の数に基づき選択される。Ｅが大きくなればなるほど、より小さなＤが必要となり、特定の多様性（Ｄｉｖ）を有するライブラリーの場合には逆となる。本明細書に使用するように、多様性（Ｄｉｖ）は、核酸ライブラリーのようなライブラリーにおける異なる分子の数をいう。多様性は、より大きな任意のライブラリー中の分子の総数とは異なる。多様性が大きくなればなるほど、存在する実際の複製物の数は少なくなる。典型的には、（異なる分子の数）／（総分子数）は約１である。ランダムにタグ化されマスターライブラリーを作成する分子の数は、最初の多様性よりも小さく、マスターライブラリー中の実質的な個々の分子は異なる。
【００４０】
本明細書で使用するように、アレイは、３またはそれより多いメンバーを含む抗体のようなエレメントのコレクションをいう。アドレス可能アレイは、当該アレイのメンバーが、典型的には、固相支持体上の位置によるか、同定可能または検出可能標識、色、蛍光、電子のシグナル（すなわち、目的の分子の相互作用を実質的には変えないＲＦ、マイクロ波または他の周波数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ））、バーコードまたは他の記号（ｓｙｍｂｏｌｏｇｙ）、化学的または他のそのような標識といったものの特長により、同定されるものである。ここで、一般に、アレイのメンバーは、固相表面上の別個の同定可能位置に固定されるか、ミクロスフェアまたは他の特定支持体（本明細書ではビーズと称する）に対し付着するように、同定可能標識に直接的または間接的に結合され、でなければ会合され、そして溶液中で懸濁されるかまたは表面上で広げられる。
【００４１】
本明細書で使用するように、支持体（また、マトリクス支持体、マトリクス、不溶性支持体または固体支持体と称する）は、目的の分子、典型的には生物学的分子、有機分子または生体特異的リガンドが結合するかまたは接触する任意の固体または半固体または不溶性支持体をいう。その物質には、以下に限らないが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石、アガロース、ポリサッカライド、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン、ラバー、および固相合成、親和性分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよび他のそのような応用のため支持体として使用する他の物質といった、化学的および生物学的分子合成および分析のための親和性物質または支持体として使用する任意の物質が含まれる。本明細書におけるマトリクスは、微粒子であり得るか、マイクロタイターディッシュまたはウェル、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のそのような物質のような連続表面型となり得る。微粒子、典型的には粒子であるとき、少なくとも５−１０ｍｍまたはそれよりも小さな大きさとなる。本明細書で、集合的に「ビーズ」と称する粒子は、必要ではないが、しばしば球状である。しかし、そのリファレンスは、ランダムな形、針、繊維および伸長化（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）を含む任意の形となり得る、マトリクスのジオメトリーを制限しない。おおよそ球状の「ビーズ」、特に、液相中で使用し得るミクロスフェアもまた、予期される。「ビーズ」には、付加構成成分が、本明細書の方法および分析を妨げない限り、磁石を用い分離するための磁性または常磁性粒子（例えば、Ｄｙｎａ ｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ））のような付加構成要素が含まれ得る。
【００４２】
本明細書で使用するように、マトリクスまたは支持体粒子は、個別の粒子の形であるマトリクス物質をいう。粒子は任意の形および大きさをしているが、典型的には、少なくとも、１００ｍｍまたはそれ未満、５０ｍｍまたはそれ未満、１０ｍｍまたはそれ未満、１ｍｍまたはそれ未満、１００μｍまたはそれ未満、５０μｍまたはそれ未満の寸法であり、典型的には、１００ｍｍ３またはそれ未満、５０ｍｍ３またはそれ未満、１０ｍｍ３またはそれ未満および１ｍｍ３またはそれ未満、１００μｍ３またはそれ未満の大きさであり、１立方ミクロンのオーダーとなり得る。その粒子を集合的に「ビーズ」と称する。
【００４３】
本明細書で使用するように、レセプターと交換可能的に使用される捕捉試薬とは、所定のリガンドに対する親和性または定義されるアミノ酸配列との親和性を有する分子をいう。捕捉試薬は、天然に生じ得るか、または合成分子であり、核酸、小有機体、タンパク質および特定アミノ酸配列に特異的に結合する複合体を含む任意の分子を含み得る。捕捉試薬は、本分野で抗リガンドとして称され得るレセプターである。本明細書で使用するように、捕捉試薬、レセプターおよび抗リガンドなる用語は交換可能である。捕捉試薬は、不変状態で使用し得るか、または他の種との集合として使用され得る。それらは、特定結合物質またはリンカーを介し、直接的または間接的の何れかで、結合メンバーと共有結合的または非共有結合的に結合または物理的に接触し得る。捕捉試薬の例には、以下に限らないが、抗体、細胞膜レセプター表面レセプターおよび内在化レセプター、モノクローナル抗体および特異的抗原決定基（ウイルス、細胞または他の物質といったもの）を有する抗血清反応性または単離性成分、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、ポリサッカライド、細胞、細胞膜、およびオルガネラが含まれる。
【００４４】
捕捉試薬の例には、以下に限らないが、
ａ）酵素および他の触媒ポリペプチド、以下に限らないが、基質が特異的に結合する当該酵素および触媒ポリペプチド部分、結合活性は維持し触媒活性は欠損するよう修飾した酵素；
ｂ）抗原またはアミノ酸配列に特異的に結合する抗体およびその部分；
ｃ）核酸；
ｄ）細胞表面レセプター、オピエートレセプターおよびホルモンレセプターならびにホルモンのようなリガンドに特異的に結合する他のレセプター、
が含まれる。本明細書のコレクションの場合、個々のポリペプチドタグとして、本明細書でいう他の結合パートナーは、基質、抗原配列、核酸結合タンパク質、レセプターリガンドまたはその結合部分をいう。
【００４５】
記載するように、分子の対、互いに特異的に結合する一般的なタンパク質が本明細書で予期される。対の１つのメンバーは、タグとして使用され、ライブラリーに結合する核酸によりコードされるポリペプチドであり、他のメンバーは、特異的に結合する任意のものである。捕捉試薬のコレクションには、典型的には少なくとも約３から１０アミノ酸である既知または既知の可能性ある定義アミノ酸配列に特異的に結合する、抗体のようなレセプターまたは酵素もしくはその部分、およびその混合物を含む。
【００４６】
本明細書で使用するように、抗体とは、免疫グロブリン、天然のものまたは部分的もしくは完全に合成されたものをいい、抗体の特異的結合能を維持する任意の誘導体が含まれる。ここで、抗体には、免疫グロブリン結合ドメインに相同性または実質的に相同性のある結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。本明細書の目的のため、抗体には、軽鎖、および重鎖の可変領域からなる、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントが含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーが含まれる。また、本明細書では、アミノ酸配列に特異的に結合するレセプターも予期される。
【００４７】
ここで、本明細書の目的のため、一般的に本明細書で捕捉試薬／ポリペプチドタグとして称する、任意のセットの結合メンバーの対が、抗体およびエピトープ自体の代わりに使用され得る。本明細書の方法は、特異的相互作用のための、抗体／エピトープタグのような捕捉試薬／ポリペプチドタグに依存し、レセプター／リガンド（エピトープタグ）の任意の組合せが使用し得る。更に、本明細書の目的のため、用いる抗体のような捕捉試薬はその結合部分となり得る。
【００４８】
本明細書で使用するように、抗体フラグメントとは、全長よりも短く、全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持している抗体の任意の誘導体をいう。抗体フラグメントの例には、以下に限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）およびＦｄフラグメントが含まれる。当該フラグメントには、例えば、ジスルフィド架橋により、同時結合する複数の鎖が含まれ得る。抗体フラグメントは、一般的に、少なくとも約５０アミノ酸、および典型的には、少なくとも２００アミノ酸を含む。
【００４９】
本明細書で使用するように、Ｆｖ抗体フラグメントは、非共有結合性相互作用により結合する可変重（ＶＨ）ドメインおよび可変軽（ＶＬ）ドメインからなる。
【００５０】
本明細書で使用するように、ｄｓＦｖとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化する、作成分子内ジスルフィド結合を有するＦｖをいう。
【００５１】
本明細書で使用するように、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、免疫グロブリンをｐＨ４．０−４．５でペプシンで消化した結果、得られた抗体フラグメントである：それは組換えで作成され得る。
【００５２】
本明細書で使用するように、Ｆａｂフラグメントは、免疫グロブリンをパパインで消化した結果、得られた抗体フラグメントである：それは組換えで作成され得る。
【００５３】
本明細書で使用するように、任意のオーダーでポリペプチドリンカーにより共有結合する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメントをいう。当該リンカーは、２つの可変ドメインが実質的に妨げられることなく架橋するような長さとなる。典型的なリンカーは、溶解度を増加させるため幾つかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基がいたるところに分散している（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基である。
【００５４】
本明細書で使用するように、ディアボディーは、二量体ｓｃＦｖである：ディアボディーは典型的にｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを有し、それらは好ましくは二量体化する。
【００５５】
本明細書で使用するように、ヒト化抗体とは、ヒトへ投与しても免疫応答が誘発しないような「ヒト」アミノ酸配列を含むように修飾した抗体をいう。その抗体の調製方法は既知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、組換えＤＮＡ技術により変化し、非可変領域のアミノ酸組成物がヒト抗体に基づいている抗体を発現する。コンピュータープログラムはその領域を同定するように設計されている。
【００５６】
本明細書で使用するように、高分子とは、数百から数百万までの分子量を有する任意の分子をいう。高分子には、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、および生体により一般的に合成され、合成的にまたは組換え分子生物学的方法を用いて調製され得る他の分子が含まれる。
【００５７】
本明細書で使用するように、「バイオポリマー」なる用語は、結合により結合する、２またはそれより多い単量体サブユニットまたはその誘導体または高分子からなる、高分子群を含む生物学的分子を意味する場合に使用する。バイオポリマーは、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物または脂質、またはそれらの誘導体もしくは組合せ、例えばペプチド核酸部分またはグリコプロテイン、それぞれを含む核酸分子であり得る。バイオポリマーには、以下に限らないが、核酸、タンパク質、ポリサッカライド、脂質および他の高分子群が含まれる。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのフラグメントが含まれる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア核酸、クロロプラスト核酸および別々の遺伝学的物質を有する他のオルガネラから誘導され得る。
【００５８】
本明細書で使用するように、生体分子は、天然で見られる任意の化合物、またはその誘導体である。生体分子には、以下に限らないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴサッカライドおよびモノサッカライドが含まれる。
【００５９】
本明細書で使用するように、「核酸」なる用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにＲＮＡまたはＤＮＡの何れかの類似体または誘導体のような一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチドをいう。「核酸」なる用語には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡのような核酸の類似体および他のその類似体ならびにその誘導体または組合せも含まれる。
【００６０】
本明細書で使用するように、「ポリヌクレオチド」なる用語は、少なくとも２つの結合ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーをいい、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡまたはＲＮＡ誘導体が含まれ、当該誘導体には、例えば、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合、例えばホスホトリエステル結合、ホスホラミデイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）以外の「バックボーン」結合が含まれる。「オリゴヌクレオチド」なる用語はまた、本明細書では「ポリヌクレオチド」と本質的に同義的に使用するが、当業者であれば、オリゴヌクレオチド、例えばＰＣＲプライマーは、一般的には、約５０未満から１００ヌクレオチドの長さを有することを認識している。
【００６１】
ポリヌクレオチド中に含まれるヌクレオチド類似体は、例えば、質量修飾ヌクレオチドであり、それにより、ポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドを検出し得る蛍光性、放射活性、発光性または化学発光性の標識のような検出可能標識を含むヌクレオチド；または固体支持体へのポリヌクレオチドの固定化を促進するビオチンまたはチオール基のような反応基を含むヌクレオチドの質量の区別が可能となる。ポリヌクレオチドはまた、選択的切断、例えば、化学的、酵素学的または光分解的な切断である１またはそれより多いバックボーン結合を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１またはそれより多いデオキシリボヌクレオチド、その後に続いて、１またはそれより多いリボヌクレオチド、そしてその後に続き得る１またはそれより多いデオキシリボヌクレオチドを含み、その配列は、塩基加水分解により、リボヌクレオチド配列で切断される。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ペプチド核酸結合により結合するヌクレオチド、およびホスホジエステル結合または他の適当な結合により結合する３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドを含み得、そしてポリメラーゼにより伸長することができる、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの切断に比較的耐性のある１つまたはそれより多い結合を含み得る。ペプチド核酸配列は、既知の方法（例えば、Ｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２７９２−２７９９ （１９９７）参照）を用い、調製され得る。
【００６２】
本明細書に使用するように、オリゴヌクレオチドとは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡのような核酸類似体、およびその組合せを含むポリマーをいう。本明細書の目的のため、プライマーおよびプローブは一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００６３】
本明細書で使用するように、組換えによる産生とは、組換えＤＮＡ方法を用いることを意味し、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の既知方法の使用を意味する。
【００６４】
本明細書で使用するように、産物に実質的に同一であるとは、目的の特性が、全く変わらないぐらいに十分に類似することを意味し、その結果、実質的に同一の産物は産物の代わりに使用し得る。
【００６５】
本明細書で使用するように、２つの核酸配列をいうとき、等価物とは、対象の２つの配列が、同一アミノ酸配列または等価タンパク質をコードすることを意味する。２つのタンパク質またはペプチドについて「等価物」を使用するとき、それは、２つのタンパク質またはペプチドが、当該タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変えない保存的アミノ酸置換（例えば、表１、上、参照）のみと共に実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。特性について「等価物」というときは、その特性が同程度である必要はないが、その活性は好ましくは実質的に同じである必要がある。２つのヌクレオチド配列をいう際の「相補的」とは、２つのヌクレオチド配列において、対となるヌクレオチドの間で、好ましくは２５％未満のミスマッチ、より好ましくは１５％未満のミスマッチ、もっとより好ましくは５％未満のミスマッチ、最も好ましくはミスマッチが全くなくハイブリダイズし得ることを意味する。一般的に本明細書において相補的であるとみなすのは、２つの分子が、高緊縮条件下でハイブリダイズする場合である。
【００６６】
本明細書で使用するように、特定の緊縮条件下でハイブリダイズするとは、２つの一本鎖ＤＮＡフラグメントの間で形成されるハイブリッドの安定性を述べるときに使用し、洗浄ステップより弱いか同程度の緊縮条件下でアニーリングした後の、そのハイブリッドを洗浄するイオン強度および温度の条件をいう。典型的に、高、中、および低緊縮とは、以下の条件またはその条件と同程度の条件を含む：
１）高緊縮：０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中緊縮：０．２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低緊縮：１．０×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。
等価条件とは、生じたハイブリッドにおいて、実質的に同じ割合のミスマッチを選択する条件をいう。ホルムアルデヒド、ＦｉｃｏｌｌおよびＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液のような成分の添加は、ハイブリダイゼーションが構成されるような温度および反応の速度のようなパラメーターに影響を与える。そのため、４２℃での２０％ホルムアミドにおける５×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーションは、実質的に、低緊縮条件下の上記ハイブリダイゼーションで再引用した条件と同じである。ＳＳＰＥ、ＳＳＣおよびＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓの方法および脱イオン化ホルムアミドの作成は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８に記載されている；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｖｏｌ． ３， ｐ．Ｂ． １３参照、また、通常使用される研究用溶液を記載している多くのカタログも参照。等価の緊縮は、他の緩衝液、塩および温度を用い行われ得ると理解される。
【００６７】
用語「実質的に」同一または相同または類似とは、当業者により理解されるように前後関係によって変化し、一般的には、少なくとも７０％同一性を意味し、好ましくは少なくとも８０％同一性を意味し、より好ましくは少なくとも９０％同一性を意味し、そして最も好ましくは少なくとも９５％同一性を意味する。
【００６８】
本明細書で使用するように、組成物とは、任意の混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれら任意の組合せであり得る。
【００６９】
本明細書で使用するように、組合せとは、２つまたはそれより多いアイテムの間の任意の結合をいう。その組合せは、２つの組成物または２つのコレクションのような２つまたはそれより多い別個のアイテムであり得、２つまたはそれより多いアイテムの単一混合物のようなその混合物、またはその任意のバリエーションであり得る。
【００７０】
本明細書で使用するように、液体とは、流れることができる任意の組成物をいう。そのため、液体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそのような組成物の型である組成物を含む。
【００７１】
本明細書で使用するように、アミノ酸の適当な保存置換は、当業者に既知であり、生じる分子の生物学的活性を一般的に変えることなく、行い得る。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換により、実質的な生物学的活性が変化することはないと当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８７， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． ｃｏ．， ｐ．２２４）。
【００７２】
その置換は、好ましくは以下のような表１に開示のものに従って行われる。
【表１】
表１
Figure 2004504607
他の置換もまた可能であり、経験的に、または既知の保存置換に従い、決定され得る。
【００７３】
本明細書で使用するように、本明細書で見られる種々のアミノ酸配列で生ずるアミノ酸は、既知の、３文字表記または１文字表記で同定される。種々のＤＮＡフラグメントで生ずるヌクレオチドは、本分野で通常用いる標準的な１文字表示で示す。
【００７４】
本明細書中で使用するように、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物は、特記しない限り、通常の用法、認識されている略語、またはＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅにおけるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（（１９７２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１： １７２６参照）に従う。
【００７５】
本明細書における方法およびコレクションは、抗体捕捉試薬、および抗体が結合するエピトープを含むポリペプチドタグに対する特定リファレンスで例示されるが、本明細書における方法が任意の捕捉試薬および任意のポリペプチドタグで実施し得ると理解される。また、任意の捕捉試薬およびポリペプチドタグのコレクションの組合せにより、本明細書に記載の任意の実施態様での使用が予期されることも理解される。また、物理的アレイの型、またはカラービーズに結合した捕捉試薬のような標識化コレクションの型のいずれであっても、アレイに対するリファレンスが任意のアドレス可能コレクションを含むことを意図されることが理解される。
【００７６】
Ｂ．オリゴヌクレオチド／プライマーの設計および調製
アレイに対する高多様性ライブラリー（ｌａｒｇｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）のソーティングおよび望ましい性質を有するクローンを含む特定プールの増殖は、特異的ポリペプチドタグでライブラリーを特徴的にタグ化する能力に依存する。オリゴヌクレオチドセットは、化学的に合成され、オーバーラッピング配列をランダムに組合し、そして一緒にライゲーションしてプライマーまたはリンカーのコレクションの酵素学的生成のための鋳型を作成する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の何れかであり、マスターライブラリー中へ組込む方法に依存する。例えば、通常の制限酵素部位を用いるような二本鎖バージョンのライゲーション、その後の共通領域を用いる増幅により組込まれ得るか、またはＰＣＲ増幅により組込まれ得、この場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００７８】
１．プライマー
本明細書では、プライマーである核酸分子のセットを提供するか、または二本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、それは、プライマー群の二本鎖バージョンおよびプライマー群のセットの組合せであり、および／または二本鎖のものは、本明細書で提供される方法の種々のステップで使用され、および／または用いる実施態様に依存する。分子をタグ化するための方法の幾つかの実施態様で用いられるプライマーは、その方法の実施の中枢となる。当該プライマーは、図９に示すような式を含む、オリゴヌクレオチドを含む。当該プラスミドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドは制限酵素部位を含み、それは、以下に示すように、例えば抗体ライブラリーのための目的遺伝子の充分な部分の標的増幅のためである。これらのプライマーは、フォワードまたはリバースプライマーであり、この場合、フォワードプライマーは、ＰＣＲ増幅の最初のラウンドで使用される。下記のような、および図で示した当該プライマーをセットとして提供する。１またはそれより多い個々のセットの組合せもまた提供する。当該プライマーは、本明細書で提供する方法の中枢となる。
【００７９】
２．オリゴヌクレオチド／プライマーの調製
二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドを構成するための任意の適当な方法を用い得る。多数のオリゴヌクレオチドの調製に適用され得る方法を特に目的としている。２つの方法を図１０および１１で示しており、以下で考察する。
【００８０】
図９は、タグ化ライブラリーの構成のための物理的エレメントおよび目的遺伝子（タンパク質）の同定のためのアドレス可能抗タグ抗体コレクションの使用を示している。４つのオリゴヌクレオチド／プライマーセットは、アドレス可能コレクションに加えて提供され、それは、説明目的のために、アレイ、当該アレイを分析するイメージングシステムまたはリーダーおよび所望により当該リーダーによって回収される情報を処理するソフトウェアとして提供される。示した実施態様では、プライマーセットはＥｍＤｎＣを含み、ここで、Ｃは、すべてのオリゴヌクレオチドの間での共通部分であり、異なるＥおよび／またはＤ配列（例えば、Ｄ１からＤｎ；ＥｌからＥｎ）を用い、すべてのタグ化核酸の増幅のための領域として役立つ；ＤＣは、異なるＤ配列（Ｄ１からＤｎ）および所望により共通領域用のＣを用い、ＦＡＥＣは、異なるＦＡ配列（例えば、ＦＡ１からＦＡｎ）を用いる；およびＦＢＣは、異なるＦＢ配列（例えば、ＦＢ１からＦＢｎ）を用いる。個々のＦＡは、個々のエピトープの部分を含み、プライマーとして役立ち、対応するＥｍをコードする核酸を増幅するが、生ずる増幅核酸は、Ｅｍエピトープを含まない。ＦＢｎはＦＡｎに類似するが、エピトープの維持が望ましいならば、Ｅｎが含まれ得る点が異なる。
【００８１】
図１０および図１１は、例として、抗体スクリーニングのための、ＥＤおよびＥＤＣ、ＦＡおよびＦＢオリゴヌクレオチド／プライマーを構成するための２種の方法の概略を示す。例えば、ｎをあわせもつＶＬＦＯＲプライマー、例えばｍを有する１，０００種のＥ配列、例えば１，０００種のＤ配列および約１３種のＪｋａｐｐａＦｏｒ配列の合成。これにより、全部で（１，０００）（１，０００）（１３）＝１３，０００，０００種のオリゴヌクレオチドが生ずる。進行合成ステップにおいて種々の配列領域をランダムに組合せることにより、プライマーの巨大な多様性コレクションが調製され得る。
【００８２】
最初の方法（図１０）は、固相合成ストラテジーを使用する。第二の方法（図１１）は、オーバーラッピング相補的配列に基づき自己アセンブルするＤＮＡ分子の能力を使用する。固相合成は、反応間の基質分子から容易に固定化産物分子が精製され得、反応条件をより調節し得るという利点を有する。自己アセンブリ法は、あまり労働を必要としないという利点がある。
【００８３】
図１０オリゴヌクレオチドは、固体支持体から３’から５’へ化学的に合成される。対照的に、ＤＮＡは、５’から３’へ酵素学的に合成される。ＶＬＦＯＲプライマーを作成するため、ＣおよびＤ配列は、標準的方法を用い固体支持体から化学的に合成される。更なる合成用にオリゴヌクレオチドを固相に結合するため、強力な求核原子を、アミノリンクの添加により組込み、その後、基質からオリゴヌクレオチドを切断する。アミノリンクは、オリゴヌクレオチドの５’末端に一級アミンを導入する。次いで、アミノリンクにおけるアミノ基は、常磁性ビーズのような固相に、トシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはヒドラジン基のようなビーズ上のアミン反応基との反応により、結合し得る。生ずるオリゴヌクレオチドは、適当な５’から３’方向であるＣおよびＤ配列により、ビーズに共有結合する。
【００８４】
Ｅ配列群の混合物を、オリゴヌクレオチドに、ＤＮＡ「パッチ」の使用により加え、生ずるニックをＤＮＡリガーゼでシールする。非組込みの基質ＤＮＡは伸長産物から生成し、Ｊｋａｐｐａ ｆｏｒ配列の混合物をプライマーに添加する。完全ＶＬＦＯＲプライマーはビーズから放出されるが、当該ビーズはｃＤＮＡ合成をプライムするオリゴヌクレオチドの能力を妨げることはない。
【００８５】
図１１で解説した方法は、オーバーラッピングハイブリダイゼーションに基づき自己アセンブルするオリゴヌクレオチドに依存する。二本鎖ＤＮＡ分子は、最初に、分子の＋および−鎖をコードするオリゴヌクレオチドから作成される。これらのオリゴヌクレオチドを合わせ、ハイブリダイズさせ、ニック化二本鎖ＤＮＡ分子を作成し、当該分子上のニックはＤＮＡリガーゼの添加によりシールする。シール化分子は、新規ＤＮＡ分子の酵素学的合成のための鋳型として使用する。ＤＮＡ合成は、ビオチンのような固体支持体に結合し得る５’末端に基を有するオリゴヌクレオチド、または上記のようなアミノリンク化学を用いプライムされる。
【００８６】
酵素学的合成の間の反応基の組込みは、合成完了後の一本鎖分子の精製を可能とする。完全ＶＬＦＯＲプライマーは、ビーズから放出され得るが、ビーズは、ｃＤＮＡ合成をプライムするオリゴヌクレオチドの能力を妨げない。
【００８７】
Ｃ．アドレス可能抗タグレセプターコレクションを用いるネスト化ソーティング
目的タンパク質を同定および選択するための先の方法は、富化の連続ラウンドの間に作成される選択バイアスにより、妨げられる。本明細書で提供するように、選択バイアスは、選択以外のソーティングに基づく同定方法の使用により避けることができる。本明細書のこれらの方法は、複数の実質的に同一性の、好ましくは複製性の、抗体のような製剤のコレクションのような捕捉試薬のコレクションの使用に依存し、その製剤は、標的ライブラリー中のタンパク質に結合するかまたは標的核酸ライブラリーによりコードされる、事前に選択したアミノ酸配列（一般的に、エピトープのような、少なくとも約５から１０、典型的には７または８アミノ酸）に特異的に結合する。捕捉試薬またはその結合部分が特異的に結合するアミノ酸配列を含む捕捉試薬およびポリペプチドタグの組合せを提供する。当該タグは、核酸ライブラリー、またはソート化された分子の他のライブラリーのメンバーに結合し得る。
【００８８】
１．概要
位置付けアドレス可能アレイのような、アドレス可能抗タグ捕捉試薬コレクションは、高い親和性および特異性を有する、エピトープタグのような、事前選択および／または事前設計したポリペプチドタグに結合する抗体のような、コレクション異種捕捉試薬（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ ａｇｅｎｔｓ）を含む。典型的なコレクションは、少なくとも約３０、より好ましくは１００、より好ましくは５００、最も好ましくは少なくとも１０００の、抗体のような捕捉試薬を含み、その捕捉試薬は、例えば、アレイ上で特定配置を占めることにより、またはバーコード支持体、カラーコード、またはＲＦタグ標識支持体または他のそのようなアドレス可能形態の支持体に結合する特徴により、アドレス可能である。個々の配置またはアドレスは、単一の特定タグに結合する、抗体のような単一型捕捉試薬を含む。タグ化タンパク質は、アレイ中の抗体のようなレセプターのコレクションと、抗体のようなレセプターとの複合化に適当な条件下、エピトープタグを介し、接触する。結果として、タンパク質は、それぞれ取り付けられたタグによりソートされる。
【００８９】
これらアドレス可能抗タグ抗体コレクションは、以下のものに限らないが、治療、診断、試薬およびプロテオミクス親和性マトリクスのための；遺伝子シャッフリング法（ｇｅｎｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ）（これに限らず）のような酵素工学的適用において；改善した触媒の同定のため、抗体親和性成熟（ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のため；小分子捕捉タンパク質、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の同定のため、単一鎖Ｔ細胞レセプター結合タンパク質のため、およびＭＨＣを認識する高親和性分子のため；ならびにタンパク質相互作用マッピングのため、抗体の迅速な同定を含む種々の適用を有する。典型的なプロトコールを図１−４、１２、１４Ａ−Ｄおよび１５−１８に示す。
【００９０】
２．ソーティング法
エピトープタグで標識された分子をソーティングに、抗体のようなレセプターコレクションを用いる方法を提供する。当該方法は、タグをコードしている核酸を加えることによりマスタータグ化ライブラリーを作成し；マスターライブラリーの一部をＮの反応物に分け、個々の反応物を、ディバイダー配列をコードする核酸で各反応物を増幅し、翻訳してＮの翻訳化反応混合物を産生し；個々の反応混合物を、抗体のような捕捉試薬の１コレクションと反応させ；適当なスクリーニングにより目的タンパク質を同定し、それによって、目的のタンパク質におけるタグが結合する捕捉試薬の特徴によりタンパク質における特定ＥＤタグを同定する、ステップを含む。
【００９１】
最初のソーティングステップは実質的に多様性を減少させる。望ましいならば、更なるソーティングを行うか、または生じるライブラリーを当業者に既知の任意の方法によりスクリーニングする。所望により、第二のソート、すなわち、目的のタンパク質が翻訳される核酸を含む核酸反応混合物から開始されるソートを行う。このステップにおいて、新規のセットのエピトープタグを、増幅またはライゲーション、その後の増幅により核酸に加える。この前、またはこれと同時に、前のエピトープタグをコードする核酸を、制限酵素といった切断によるか、またはエピトープコード化核酸の一部またはすべてを破壊するプライマーを用いる増幅によるか、何れかにより取除く。新規タグを加え、生ずる核酸を翻訳し、抗体の単一アドレス可能コレクションと反応させる。ポリペプチドタグによるタンパク質ソート、およびスクリーニングを行い、目的のタンパク質を同定する。この点において、抗体コレクションのアドレス可能位置における分子の多様性は１となる（または１から１００、典型的には１から１０のオーダーとなる）。次いで、目的のタンパク質を含む核酸を、同定化エピトープタグをコードする核酸を含む核酸分子を増幅するタグを用い増幅し、それにより、目的のタンパク質をコードする核酸を生ずる。増幅のためのプライマーは、プライマーとして役立ち、それによりコード化されているタンパク質からエピトープを除くタグのすべてまたはタグの重要部分のみを含む。本明細書により、多様なコレクションのソーティング（すなわち、多様性の減少）が可能となる方法が提供される。１のステップを含むソートは、実質的に多様性を減少する。所望なるソーティングステップの使用により、一般に多様性は１０未満、一般に１に減少する。
【００９２】
マスターライブラリーの分割
上記のように、本明細書におけるソーティング過程における最初のステップには、マスターライブラリーをＮのサブライブラリーに分割することが含まれる。上記のように、「Ｄ」配列およびタグはマスターライブラリーに導入され得、次いで、そのマスターライブラリーは、増幅のため別のＤ’を用い「Ｎ」のサブライブラリーに更に分割される。
【００９３】
上記のように、「Ｄ」の包含は任意であり；分割はマスターライブラリーをサブライブラリーに物理的に分割し、次いで「Ｅ」タグコード化または「ＥＣ」タグコード化配列をサブライブラリーに導入することにより行い得る。これは、一般的に、最初のライブラリーが非常に大きいとき、生ずるサブライブラリーが大きくなり、タグの分布を確実に均一になるように行う。
【００９４】
３．ソーティングするためのマスターライブラリーの作成
このステップにおいて、個々のディバイダー配列に結合する個々のエピトープをコードするタグを、典型的にはｃＤＮＡライブラリーであるマスターライブラリーに導入する。核酸に二本鎖ＤＮＡフラグメントを加え、組み込む当業者に既知の任意の方法が用い得る。特に、種々の方法が本明細書で予期される。これらには、（１）それらを組込むためのＰＣＲ増幅を用いること（本明細書で例示する）；（２）それらを直接またはリンカー（以下参照）を介しライゲーションすること、必要ならば、ライゲーション産物は本明細書に記載の他の方法により増幅し得、それは、本明細書の既述の見地から当業者により容易に分割し得る。
【００９５】
最初のタグ化において、核酸ライブラリーの構成メンバーにおけるＥ、ＥＤまたはＥＤＣのセットのオリゴヌクレオチドを加える場合、その目的は、すべてのＥｍおよびすべてのＤｎの一様な分布を得ることであり、１のみの個々の型の分子においてそれらを有することである。当該タグは、異なる分子間でランダムに分布しなければならない。分子の数が、タグの数に比べて大きい限り（平均して、コレクション中の約１のみの個々の型の分子が個々のタグを得るように）、そのタグは均一に分布する。本明細書において、タグの数と比較して実質的に過剰である、コレクション中の分子の総数が好ましい。その過剰とは、少なくとも１００倍、より好ましくは１０００倍である。必要ならば、正確な割合は、経験的に決定され得る。実施においては、多様性よりも反応物中の分子が多いことはない。平均して、それぞれ異なる分子は、異なるタグを有し、１のみのそれぞれ異なる分子がタグ化される。
【００９６】
当該方法を実施するため、エピトープ標識分子のライブラリーを、個々のタグが分子においてランダムに分布するように、非標識ライブラリー中へタグをランダムに導入することにより調製する。実験により、タグがｃＤＮＡライブラリー中にランダムにおよび均等に導入され得ることが示される。
【００９７】
マスターライブラリーを、抗体のｎ数のアドレス可能コレクション（個々のコレクションはｍ種のエピトープ特異性を有する抗体を含む）と反応する、Ｄ１−Ｄｎとして同定される、プールに分ける。アレイのような個々のコレクションを、コレクションまたは他のそのアイデンティファイアーにおいて、例えば、バーコード、ノーテーションまたはシンボルまたはカラーコード、電子タグまたはカラーもしくは同定可能化学的タグのような他のアイデンティファイアーを含む光学的コードにより、プールの１つと結合させる。その反応は、エピトープが抗体に特異的に結合する条件下で行い、抗体およびエピトープタグ標識分子の生ずる複合体は、望ましい性質を有する分子を特異的に同定するアッセイを用いスクリーニングする。抗体の特定コレクションおよび望ましい性質を有する分子を含む特定タグを伴う抗体は同定され、それによって、特定Ｄｎプールおよび分子上のエピトープタグもまた同定され、それによりｎ×ｍのコレクションの多様性を減少する。
【００９８】
４．エピトープタグの組込みの方法
他の核酸に、ポリペプチドをコードする核酸分子を結合するか、または他の分子にポリペプチドを結合する、当業者に既知の任意の方法が予期される。例示として種々のその方法を述べる。記載するように、抗体捕捉試薬に対する特定リファレンス、および抗体が結合するエピトープを含むポリペプチドタグを用い述べているが、本明細書の方法は、任意の捕捉試薬およびそのポリペプチドタグを用い実施され得ると認識される。
【００９９】
ａ．タグ導入のために環状プラスミドベクターを作成するライゲーション
上記するように、プライマーをライブラリーメンバーに導入するための増幅プロトコールの使用に加えて、プライマーは、直接のライゲーションにより、例えば、タグおよび他の望ましい配列をコードする核酸を含むプラスミドベクター中への導入により、導入され得る。二本鎖プラスミドベクター中へのｃＤＮＡのサブクローニングは、当業者に既知である。１つの方法には、スティッキー末端としても知られている５’または３’オーバーハングを作る部位特異的制限エンドヌクレアーゼで、精製二本鎖プラスミドを消化することが含まれる。二本鎖ｃＤＮＡを同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、相補的スティッキー末端を作成する。他に、ベクターＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方に平滑末端を作成し、ライゲーションに使用する。消化したｃＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを、適当な緩衝液中のＤＮＡリガーゼ（通常、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから得たＴ４ＤＮＡリガーゼおよび緩衝液を用いる）と共に混合し、１６℃でインキュベーションし、ライゲーションさせる。ライゲーション反応物の部分を、種々の方法により、ＤＮＡ取り込みの能力を有するＥ． ｃｏｌｉ中に形質転換する（エレクトロポレーション、または化学的コンピテントセルの熱ショックの２つが通常方法である）。形質転換ミックスのアリコートを、使用するプラスミドに適当な抗生物質を含む半固体培地上にプレートする。環状プラスミドを取り入れた細菌のみが選択培地上でコロニーを形成する。特定メンバーのライブラリーの作成は同様の方法で行うが、ベクター中に挿入されるｃＤＮＡは、異なるｃＤＮＡクローンの混合物である。これら異なるｃＤＮＡクローンを、当業者に既知の種々の方法により作成する。
【０１００】
ｃＤＮＡライブラリーからのタンパク質発現に使用するライブラリーの作成に望ましいｃＤＮＡクローンの直接クローニングの場合、異なるスティッキー末端を生ずる２種の制限エンドヌクレアーゼをプラスミドの消化に使用する。ｃＤＮＡライブラリーメンバーは、ｃＤＮＡの反対末端においてこれら２つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むように作成する。他に、相補的オーバーハングを作る別の制限エンドヌクレアーゼを用いる（例えば、ＮｇｏＭＩＶによるプラスミドの消化およびＢｓｐＥＩによるｃＤＮＡの消化、何れの場合も５’ＣＣＧＧオーバーハングを生じ、そのためライゲーションに適合する）。更に、プラスミドベクター中へのｃＤＮＡの直接導入により、ベクター中に含まれる調節配列の制御の下、ｃＤＮＡが作成される。調節配列には、プロモーター、転写の開始および終止の部位、翻訳の開始および終止の配列、またはＲＮＡ安定化配列を含み得る。望ましいならば、ｃＤＮＡの挿入により、発現タンパク質の精製に使用し、親和性試薬をタンパク質の検出に使用し、亜細胞性コンパートメントへのタンパク質の指示に使用し、タンパク質の翻訳後プロセッシングにシグナルを与えるタンパク質エレメントを含む、更なるタンパク質エレメントをコードする配列と同じ翻訳リーディングフレームで、ｃＤＮＡが位置する。
【０１０１】
例えば、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）には、アラビノース誘導性プロモーター（ａｒａＢＡＤ）、リボゾーム結合配列、ＡＴＧ開始コドン、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質由来のシグナル配列、ｍｙｃエピトープタグ、ポリヒスチジン領域、ｒｒｎＢ転写ターミネーター、ならびにａｒａＣおよびβ−ラクタマーゼオープンリーディングフレーム、およびＣｏｌＥ１複製オリジンが含まれる。ｃＤＮＡクローンの挿入に有用なクローニング部位は、挿入ｃＤＮＡクローンが最初に使用酵素で消化されないように、そしてｃＤＮＡがベクター中に含まれる望ましいコード領域と同じリーディングフレームとなるように、設計され、および／または選択される。発現ベクター中への単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）の挿入のためには、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位の使用が通常である。そのため、ｓｃＦｖの発現用にｐＢＡＤ／ｇＩＩＩベクターを修飾するために、オリゴヌクレオチドＰＤＫ−２８（配列番号６）およびＰＤＫ−２９（配列番号７）をハイブリダイズし、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ ＤＮＡに挿入する。得られたベクターは、遺伝子ＩＩＩリーダー配列およびエピトープタグと同じリーディングフレームでｓｃＦｖ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ の「Ｍｏｕｓｅ ｓｃＦｖ Ｍｏｄｕｌｅ」のような標準的方法で作る）を挿入し得る。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、発現タンパク質のライブラリーを、複数のエピトープタグおよびそれらを認識する抗体を用いて更に分割（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅ）する。複数のエピトープタグを用いタンパク質の発現用ライブラリーを作成するため、上記の技術を僅かに改良したサブクローニング技術を用いる。複数のｃＤＮＡクローンは、生ずるライブラリーが別エピトープタグでタグ化されるｃＤＮＡクローンを含み、個々のエピトープタグが均等に表されるように、異なるプラスミドベクター（単一型プラスミドベクターの代わりに）の混合物中へ挿入される。挿入ｃＤＮＡメンバーと融合して翻訳されるエピトープタグとは異なるように、マルチプルプラスミドベクターが作成される。例えば、１０００のエピトープタグ配列があれば、１０００種のベクターが構成され、２５０のエピトープタグ配列があれば、２５０種のベクターが構成される。当業者ならば、これらベクターの構成方法が複数あることを理解する。解説として、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩプラスミドのｍｙｃエピトープコード化領域は、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素消化により除かれ、巨大な４．１ｋｂフラグメントが単離される。オリゴヌクレオチドＰＤＫ−３２（配列番号８）とＰＤＫ−３３（配列番号９）のハイブリダイゼーションにより、ＸｂａＩおよびＳａｌＩに適合するオーバーハングが作成され、それにより、当該産物は、直接挿入され、ＨＡ１１抗体のエピトープをコードする（以下の表を参照）。ＰＤＫ−３４（配列番号１０）とＰＤＫ−３５（配列番号１１）のハイブリダイゼーション産物の挿入により、挿入ｃＤＮＡのフレームでＦＬＡＧ Ｍ２エピトープ（以下の表を参照）を有するベクターが生ずる。
【表２】
Figure 2004504607
【０１０３】
これら個々のベクターは、ベクター中にｃＤＮＡクローンをサブクローニングし得るＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をシェアしている。同様に、更なるオリゴヌクレオチドは、種々のベクターのコレクションを作成するため同じ位置に挿入し得る多種のエピトープタグをコードするように設計され得る。
【０１０４】
異なるエピトープタグを含むベクターに対応するプラスミドＤＮＡは、当業者に既知の方法を用い調製される（Ｑｉａｇｅｎカラム、ＣｓＣｌ密度勾配精製など）。個々のプラスミドから精製した二本鎖ＤＮＡをＯＤ２６０または他の方法で定量し、次いで、２つの制限酵素による消化前に同量を合わせ、仔ウシ腸ホスファターゼで処置する（ＣＩＰ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。目的のｃＤＮＡクローンはまた、同じ制限酵素で消化する。消化プラスミドＤＮＡおよびｃＤＮＡクローンをアガロースゲルで分離し、不必要なスティッキー末端を取除き、標準的方法（Ｑｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ， ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ｋｉｔなど）を使用しアガロース切片から精製する。ｃＤＮＡクローンおよびプラスミド混合物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と３：１のモル比（ベクターへの挿入）で１×リガーゼ緩衝液中で反応させる。典型的に、ライゲーション反応物は、約１０ｎｇ／μｌプラスミドＤＮＡおよび０．５ｕｎｉｔｓ／μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼを適当な緩衝液中に含み、１６℃で１２から１６時間インキュベーションする。当該反応物は、滅菌水で８−１０倍希釈し、アリコートをエレクトロポレーションによりＴＯＰ１０Ｆ’（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのエレクトロコンピタントＥ． ｃｏｌｉ細胞）中に形質転換する。ＳＯＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ＳＯＣは、ｐＨ７で２％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、８．５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ グルコースである）のような液体培地を添加し、細胞を１時間３７℃で回復させる。形質転換混合物のアリコートを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレートする。プレートを３７℃で１２から１６時間インキュベーションし、次いで各クローンを分析する。この分析により、最初の混合物中に存在する個々のエピトープタグは、最終ライブラリー中で均等となることが示される。
【０１０５】
例えば、ＥＤＣ配列を含む一連のプラスミドベクターは、当該一連の個々のベクターがＥＤＣ配列の単一組合せを含むように、作成される。例えば、１０００のＥ配列は１０００のＤ配列および単一のＣ配列と組合せて存在するならば、１０６（１０００×１０００×１）の組合せが可能であり、それゆえ、１０６ベクターが作成される。これらの個々のベクターが制限酵素エンドヌクレアーゼ部位をシェアし、ベクター中にｃＤＮＡクローンをサブクローニングし得る（好ましくは定方向的（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ））。１０６すべてのベクターから精製したプラスミドＤＮＡを混合し、次いで、制限エンドヌクレアーゼで消化する。他に、各ベクターを示すＤＮＡを消化し、次いで混合し、レシピエントベクターのプールを作成する。目的のライブラリーを示す二本鎖ｃＤＮＡを、また、制限エンドヌクレアーゼで消化し、ベクター消化により作成される末端にライゲーションが適合する末端を作成する。これは、ベクターおよびｃＤＮＡの消化の場合と同じ酵素を用いることにより、または相補性オーバーハングを生ずるものを用いることにより（例えば、ＮｇｏＭＩＶとＢｓｐＥＩの両方により５’ＣＣＧＧオーバーハングを生じ、そのためライゲーションに適合する）、行い得る。他に、ベクターＤＮＡとｃＤＮＡの両方の平滑末端を作成し、ライゲーションに使用する。消化ｃＤＮＡクローンおよび消化ベクターＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼまたは他の適合可能酵素のようなＤＮＡリガーゼを用い、適当な反応緩衝液中、ライゲーションする。生じたＤＮＡを細菌、酵母に形質転換するか、またはインビトロのＲＮＡ転写の鋳型として直接使用する。ベクターの設計は、制限エンドヌクレアーゼ部位におけるｃＤＮＡの挿入により、ｃＤＮＡが発現し得るプロモーター配列の制御下にｃＤＮＡが位置するように行う。加えて、ベクターからのタンパク質発現において、エピトープタグに融合したｃＤＮＡコード化ポリペプチドを含む融合タンパク質が産生されるように、ｃＤＮＡをＥ配列と同じリーディングフレームにする。コード化エピトープタグが、生ずるタンパク質のＮまたはＣ末端の何れかと融合するように、ベクター中にＥ配列を位置付ける。（制限酵素消化、ＤＮＡライゲーション、および形質転換には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １参照）
【０１０６】
ｂ．直鎖状タグ化ｃＤＮＡを生ずる配列のライゲーション
ｃＤＮＡライブラリーの作成後、配列を、ライゲーションを介しｃＤＮＡクローンに加える。個々のＥＤＣ配列組合せを含む直鎖状、二本鎖ＤＮＡを種々の方法により作成する（合成、配列を含むプラスミドの消化、より短いオリゴヌクレオチドのアセンブリなど）。異なるＥＤＣ配列を含むこれら直鎖状ｄｓＤＮＡを、それぞれが混合物中で均等に示されるように混合する。この混合物を二本鎖ｃＤＮＡライブラリーと合わせ、適当な緩衝液中、核酸リガーゼを用いライゲーションする。これは、好ましくはＤＮＡリガーゼであるが、ＥＤＣタグがＲＮＡで構成されるかまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子であるならばＲＮＡリガーゼを使用し、また、ライブラリーは、ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの形となる。１つの実施態様では、ＥＤＣ配列は両末端で平滑末端となり、さらに、一方のみの末端は、ライゲーションが定方向的に生じ（ＥＤＣ配列に関し）、Ｅ配列がｃＤＮＡと同じリーディングフレームでもたらされるように（生ずるタンパク質のＮまたはＣの何れかの末端において）、リン酸化する。他の実施態様では、ＥＤＣ配列は、一方の末端で平滑末端となり、ライゲーションが定方向的に生じるように他の末端にオーバーハングを有する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｃｈａｐｔｅｒ ８参照）。ＥＤＣ配列は、連続的に二本鎖となり、一本鎖中心部分を有する部分的に二本鎖となり得る。
【０１０７】
他の実施態様では、ｃＤＮＡライブラリーは、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように作成され、同じ制限酵素部位は、適当な酵素による個々の消化において適合する末端が作成されるように、ＥＤＣ配列中に含まれる。消化ライブラリーは、適当な緩衝液中でＤＮＡリガーゼを用い消化ＥＤＣ配列の混合物とライゲーションする。他の実施多様では、ｃＤＮＡライブラリーは、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように作成し、ＥＤＣ配列は、ｃＤＮＡにおいて作成されるオーバーハングに適合するオーバーハングを生ずる制限酵素部位を含むように、消化する。これら２つの適合可能部位のライゲーションにおいて、配列は、オーバーハング作成に使用する何れかの酵素では切断できないように、作成される。この場合、ライゲーション反応の産物は、オーバーハング作成に使用する酵素により消化される。他に、ライゲーション反応は、オーバーハング作成に使用する酵素の存在下、生ずる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９９ Ａｕｇ； ２７（２）： ３２８−３０， ３３２−４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９２ Ｊａｎ； １２ （１）： ２８， ３０）。
【０１０８】
この方法は、ｃＤＮＡとｃＤＮＡとのライゲーションまたはＥＤＣ配列とＥＤＣ配列とのライゲーションを減少および／または除去し、そのため、ｃＤＮＡ−ＥＤＣ産物を富化する。適合可能オーバーハングを作成し得る酵素対には、ＡｇｅＩ／ＸｍａＩ、ＡｓｃＩ／ＭｌｕＩ、ＢｓｐＥＩ／ＮｇｏＭＩＶ、ＮｃｏＩ／ＰｃｉＩおよび他のもの（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ２０００−２００１ カタログ ｐ１８４および２１８の表の一部）が含まれる。ＥＤＣ配列およびｃＤＮＡは、ライゲーション後、同じリーディングフレームとなるように設計される。そのため、この構成物からのタンパク質発現において、エピトープタグに融合するｃＤＮＡコード化ポリペプチドを含む融合タンパク質を産生する。Ｅ配列は、コード化エピトープタグが、得られるタンパク質のＮまたはＣ末端のいずれかと融合するように、最終構成物中に位置する。
【０１０９】
他の実施態様では、ｃＤＮＡ、ＥＤＣ配列またはその両方が、ＤＮＡにハイブリダイズするＲＮＡを伴う領域を含むように、作成される。ＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡオーバーハングが生ずるように、適当なＲＮＡｓｅ（タイプ２ＲＮＡｓｅ Ｈを含む）による消化により取除かれ得る。このオーバーハングは、上記方法により、または制限エンドヌクレアーゼ消化により、何れかにより生ずる適合可能オーバーハングに結合し得る。更に、オーバーハングおよびフランキング配列は、ＥＤＣ配列が他のＥＤＣ配列にライゲーションされるならば、生ずる配列は特定制限酵素により消化し得る方法で、設計される。同様に、ｃＤＮＡを他のｃＤＮＡにライゲーションさせるならば、生ずる配列は、他の制限酵素により切断し得る。ライゲーション反応は、制限酵素の存在下生じ、またはその後に酵素により処理し、ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはＥＤＣ−ＥＤＣライゲーションイベントの発生を減少する（上記酵素対および引用文献を参照のこと）。ＥＤＣ配列およびｃＤＮＡは、ライゲーション後、同じリーディングフレームとなるように設計する。そのため、この構成物からのタンパク質発現において、エピトープタグに融合するｃＤＮＡコード化ポリペプチドを含む融合タンパク質を産生する。Ｅ配列は、コード化エピトープタグが、生じるタンパク質のＮまたはＣ末端の何れかに融合するように、最終構成物中に位置付けられる。他の実施態様では、ＰＣＲを用い、ｃＤＮＡ、および特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより複製することはできないＲＮＡ配列の特定領域を含むＰＣＲプライマーを用いる異なるＥＤＣ配列を作成する。そのため、ＲＮＡオーバーハングは、同じ方法によりまたは制限酵素消化により生ずる相補的オーバーハングにライゲーションし得るように、維持される。ＲＮＡまたはＤＮＡオーバーハングクローニングは、Ｃｏｌｊｅｅ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００ Ｊｕｌ； １８ （７）： ７８９−９１）に記載されている。
【０１１０】
他の実施態様では、ＥＤＣ配列は、ｃＤＮＡの３’領域やＥＤＣ配列の５’領域に相補的なスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイズによりｃＤＮＡ配列の近くにもたらされる（Ｌａｎｄｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ４８７， １９８８）。ｃＤＮＡとＥＤＣとの結合は、適当な反応条件下、核酸リガーゼにより行う。他の実施態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの５’領域およびＥＤＣ配列の３’領域に相補的である。何れの場合も、ｃＤＮＡライブラリーの異なるメンバーは、共通領域（３’または５’末端において）をシェアし、異なるＥＤＣ配列もまた共通配列をシェアし（５’または３’末端において）、それにより、単一スプリントオリゴヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡライブラリーの任意のメンバーにハイブリダイズし、また一連のＥＤＣ配列のそれぞれにハイブリダイズし得る。これらの個々の実施態様では、スプリントオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびＥＤＣ配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組合せであり得る。ｃＤＮＡ、ＥＤＣ配列およびスプリントオリゴヌクレオチドの混合物は、高温で変性し、二次構造およびハイブリダイゼーションの存在を排除する。次いで、ハイブリダイゼーションが生ずるように当該反応物を冷却する。スプリントオリゴヌクレオチドがモル過剰で存在する場合、３つの望ましいコンポーネントを含むハイブリダイゼーション産物（ｃＤＮＡ、ＥＤＣおよびスプリントオリゴヌクレオチド）を得る。核酸リガーゼを添加し、当該反応物を適当な条件下、インキュベーションする。
【０１１１】
他の実施態様では、スプリントオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡライブラリーおよびＥＤＣ配列を上記の例のように設計する。次いで、リガーゼ鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ， Ｆ． Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｔｈｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＰＣＲ Ｗｏｒｌｄ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｖｏｌ． １ ｐｐ． ５−１６参照； また米国特許番号５，４９４，８１０参照）は、複数サイクルの、変性、ハイブリダイゼーション、および熱安定性リガーゼによるライゲーションを用い行う。ｃＤＮＡ−ＥＤＣ産物の増幅の場合、二本鎖ｃＤＮＡおよび二本鎖ＥＤＣ配列が必要である。
【０１１２】
ｃ．タグ導入のためのプライマー伸長およびＰＣＲ
他の実施態様では、ＥＤＣ配列は、ｃＤＮＡライブラリーの作成に間にｃＤＮＡクローンに加えられる。この場合、ＥＤＣ配列は、望ましいｍＲＮＡ群にハイブリダイズし得るように設計される。このＥＤＣは、プライマーとして役立ち、ＲＮＡは、逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ、Ｍ−ＭｕＬＶ−ＲＴまたは鋳型としてＲＮＡに相互的なＤＮＡを合成する他の酵素）を用いるＤＮＡの合成に鋳型として役立つ。新規合成ｃＤＮＡは、ＲＮＡに相補的であり、５’末端でＥＤＣ配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼを用いる第二の鎖合成により、ＲＮＡの３’末端に対応する末端においてＥＤＣと共に二本鎖ＤＮＡが生ずる。この実施態様では、一連のＥＤＣ配列のすべてのメンバーが、ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションのための共通３’末端をシェアする（例えば、遺伝子ファミリーの類似メンバーのライブラリーの場合）。他に、ＥＤＣ配列は、ＲＮＡをランダムプライミングするための３’末端にランダムヌクレオチドの配列を有する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８）。
【０１１３】
他の実施態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、ＥＤＣ配列をｃＤＮＡクローンに加える。ｃＤＮＡライブラリーは、すべてのメンバーが３’末端で共通領域をシェアする方法で作成される（例えば、この共通配列を含むオリゴヌクレオチドにより第一鎖ｃＤＮＡ合成をプライムするか、または二本鎖ｃＤＮＡクローンにリンカー配列をライゲーションする）。更に、ｃＤＮＡライブラリーの個々のメンバーは、５’末端に別の共通配列（「Ｃ」）をシェアする。一連のＥＤＣ配列における個々の特有のメンバーは、ｃＤＮＡ中の共通領域の１つに相補的な共通３’末端を有する。ＥＤＣ配列のこの混合物は、ポリメラーゼ連鎖反応中の増幅プライマーの１つとして役立つ。ｃＤＮＡの反対の末端の共通領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、第二の増幅プライマーとして役立つ。ｃＤＮＡライブラリーを、適当な緩衝液条件中で、一連のＥＤＣ増幅プライマー、第二のプライマーおよび熱安定性ポリメラーゼ（Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕなど）と合わせ、複数サイクルの、変性、ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメライゼーションを行う。他に、ｃＤＮＡライブラリーを、共通配列の添加後、更に分割し、アリコートを適当な緩衝液条件中で、個々のＥＤＣ配列、第二のプライマーおよび熱安定性ポリメラーゼ（Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕなど）と混合し、複数サイクルの、変性、ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメライゼーションを行う。
【０１１４】
ｄ．遺伝子シャッフリングによる挿入
他の実施態様において、ＥＤＣ配列を、「ＤＮＡシャッフリング」または分子ブリーディング（例えば、Ｇｅｎｅ １９９５ Ｏｃｔ １６； １６４ （１）： ４９−５３； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９４ Ｏｃｔ ２５； ９１ （２２）： １０７４７−５１； 米国特許番号６，１１７，６７９）によりｃＤＮＡに加える。一連のＥＤＣ配列中の個々のメンバーは、ｃＤＮＡライブラリーメンバー中の共通領域の１つに相補的な共通３’末端を有する。ｃＤＮＡライブラリーの作成または変異誘発の間、ＥＤＣ配列は、ＰＣＲ反応物中に含まれ、そのＥＤＣ配列は、ｃＤＮＡクローンのフラグメントと共にアセンブルされ得る。
【０１１５】
ｅ．組換えストラテジー
組換えストラテジーはまた、ｃＤＮＡクローン中へのタグの導入に使用し得る。例えば、三重らせん体誘発組換えは、ｃＤＮＡクローンにＥＤＣ配列を加えるのに使用する。ｃＤＮＡライブラリーは、すべてのメンバーが一端において共通配列をシェアする方法で作成する。一連のＥＤＣ配列は、ｃＤＮＡライブラリー中の共通配列に相当相同性のある領域を含むように設計する。ＥＤＣ配列およびｃＤＮＡライブラリーは、第三の相同性オリゴヌクレオチドによる細胞フリー組換えシステム（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１ Ｍａｙ ２５； ２７６ （２１）： １８０１８−２３）において組合され、組換えが生じ得る。
【０１１６】
他の実施態様では、部位特異的組換えが使用され、ｃＤＮＡクローンにＥＤＣ配列が加えられる。部位特異的組換えシステムは、ｌｏｘＰ／ｃｒｅ（米国特許番号６，１７１，８６１； 米国特許番号６，１４３，５５７）、ＦＬＰ／ＦＲＴ（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ２９： ２２７−２３４ （１９８２））、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位を有するラムダインテグラーゼ（米国特許番号５，８８８，７３２）、および多数の他のものを含む。一連のＥＤＣ配列およびｃＤＮＡライブラリーのメンバーは、リコンビナーゼタンパク質により認識される共通配列を含むように設計される（例えば、ｌｏｘＰ部位）。ＥＤＣ配列およびｃＤＮＡライブラリーは、組換えが生じ得る適当な条件下、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、ｃｒｅリコンビナーゼ）を含む細胞フリー組換えシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ２００１ Ｊｕｎ； ２２（１）： １３５−４０）中で組合される。他に、組換えイベントは、望ましいリコンビナーゼを発現する細菌、真菌、または高等真核生物細胞のような細胞内で生ずる（例として、米国特許番号５，９１６，８０４、６，１７４，７０８および６，１４０，１２９）。
【０１１７】
他の実施態様では、細胞中の相同組換えは、ＥＤＣ配列をｃＤＮＡクローンに加えるために使用する。Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９８ Ｏｃｔ； ２０ （２）： １２３−８）、酵母（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００１ Ｍａｒ； ３０（３）： ５２０−３）、および哺乳類細胞（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ． １９８４； ４９： １９１−７）を、ＤＮＡセグメントの組換えに使用する。ＥＤＣ配列を、ｃＤＮＡを含むプラスミドベクター中の２つの分離領域に相同な５’および３’領域の両方を含むように設計する。相同領域の長さは使用する細胞型に依存する。ｃＤＮＡおよびＥＤＣ配列を細胞中に共形質転換し、相同組換えは、細胞中で発現する組換え／修復酵素により行う（例えば、米国特許番号６，２３８，９２３参照）。
【０１１８】
ｆ．トランスポザーゼによる組込み
他の実施態様では、トランスポザーゼは、ｃＤＮＡクローンへＥＤＣ配列を転移させるために使用する。トランスポゾンの組込みは、ランダムにまたは非常に高い特異性で行われ得る。Ｔｎ７のようなトランスポゾンは、高部位特異的であり、ＤＮＡのセグメントの移動に使用される（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ４５６６−４５７９ （１９９３））。ＥＤＣ配列は、逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（使用するトランスポザーゼに特異的）間に含まれる。ｃＤＮＡライブラリー（または存在するプラスミドベクター）のメンバーは、トランスポザーゼにより認識される標的配列を含む（例えば、ａｔｔＴｎ７）。インビトロまたはインビボ転移反応により、ＥＤＣ配列がこの部位に挿入される。
【０１１９】
ｇ．スプライシングによる組込み
他の実施態様では、ＲＮＡスプライスアクセプターおよびドナー配列が隣接するＥＤＣ配列は、転写され翻訳されるｍＲＮＡ中に組込むような方法で種々の細胞系のゲノム中に挿入される（米国特許番号６，０９６，７１７および米国特許番号５，９４８，６７７参照）。タンパク質は、これらの有機体から単離され、それゆえ、エピトープタグを含み、抗体のコレクションにより分離されやすい。
【０１２０】
他の実施態様では、ＥＤＣ配列は、ＲＮＡのトランススプライシングによりライブラリーメンバーに加えられる。ＲＮＡはＥＤＣ配列を形成し、ＲＮＡスプライスアクセプター配列が先に位置するか、またはその後、スプライスドナー配列がｃＤＮＡクローンのライブラリーを受け入れる細胞中で発現する。ＲＮＡのトランススプライシング（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９ Ｍａｒ； １７（３）： ２４６−５２、および米国特許番号６，０１３，４８７）により、ＥＤＣ配列はライブラリーメンバーに加えられる。
【０１２１】
４．第一のソーティングステップ
タンパク質が核酸ライブラリーによりコードされる実施態様でソーティングする場合、タンパク質を、事前に選択されたタグを含む核酸から産生する。少なくとも１つまでの一連のソーティングステップを行う。最初のステップでは、最初のタグが、直接の結合により、またはマスターライブラリーを作成するエピトープＥｍおよびディバイダー領域Ｄｎをコードするオリゴヌクレオチドのプライマー組込みにより、核酸中に導入される。個々の核酸分子は、ｍのエピトープのうちの１つおよびｎのディバイダーのうちの１つをコードする一端における領域を含む。
【０１２２】
次のステップでは、ｎのサンプルのそれぞれが、Ｄｎを含むプライマーにより増幅され、ｎのセットの増幅核酸サンプルを作成し、ここで、個々のサンプルは、主として、単一のＤｎおよびすべてのＥ（Ｅｌ−Ｅｍ）を含む増幅配列を含む。ｎのサンプルのそれぞれすべてのアリコートまたは部分が翻訳され、ｎの翻訳サンプルが産生される。個々の「ｎ」の翻訳反応からのタンパク質は、抗体のような捕捉試薬、コレクションの１つと接触し、この場合、コレクション中の個々の捕捉試薬は特異的にＥｍと反応し、抗体のような個々の捕捉試薬は、同定され得、捕捉試薬によるポリペプチドタグへの特異的結合により捕捉試薬タンパク質複合体が産生される。
【０１２３】
生ずる複合体は、好ましくは色素生産的、発光的、蛍光的のレポーターを用い、スクリーニングされ、目的のタンパク質に結合するものに同定され、それにより、目的のタンパク質に結合するＥｍおよびＤｎを同定する。
【０１２４】
５．第二のソーティングステップ
ソートすべきタンパク質の多様性により、複数の可能なタンパク質が最初のソート後同定されるならば、更なるソーティングステップを用い得る。他に通常のまたは他のスクリーニング法は、同定タンパク質から目的タンパク質を同定するために使用し得る。この段階での多様性が比較的低い（例えば、１から約５０００など）ならば、同定Ｄｎを含むサンプルは、通常のまたは標準のスクリーニング方法を用いスクリーニングし得るか、または更に多様性を減少させるため第二のソーティングステップを行い得る。
【０１２５】
そのため、第一のソート後の多様性が実際に高い（例えば、約１００以上、または５００以上または１０３以上、または応用および望ましい結果に応じて、高すぎて当業者が他の方法によりスクリーニングできないと思うならば、いくらでも）ならば、更なるソーティングステップを行う。
【０１２６】
これら更なるステップの場合、同定Ｄｎを含むサンプル中の核酸は、結合核酸の増幅に十分であるが、Ｅｐの再導入には不十分な、個々のエピトープコード化タグ（それぞれＥｐと称する）の部分（ＦＡｐと称する）をそれぞれ含む一連のプライマーのセットで増幅され、この場合、個々のプライマーは、式ＨＯ−ＦＡ−ＥＰのヌクレオチド配列を含むかその配列であり、更にこの場合、ｐは１からｍの整数である。この増幅により、核酸中にエピトープコード化配列の別の１つを導入し、サブライブラリーメンバー中で分散するすべてのエピトープを再び含むｃＤＮＡクローン（オリジナルのサブライブラリー）のコレクションを作成する。
【０１２７】
この第二のソーティングステップでは、増幅を新規セットのタグに導入するならば、コンカテマー形成は、低濃度のＦＡプライマーを用い、その後、ＦＡプライマーにより導入される共通領域をコードする過剰のプライマーにより最小化され得る。ＦＡプライマーを使用の後、共通プライマーが組込みのためＦＡプライマーと拮抗する。Ｃ領域が鋳型核酸分子中に組込まれるからである。
【０１２８】
他に、上記のように、新規セットのエピトープコード化配列は、鋳型に対するリンカーを介してライゲーションされ得る。これを行うため、この鋳型は、特有制限酵素で切断され、リンカーはライゲーションされる。これにより、エピトープコード化酵素の存在が除かれ、新規セットのエピトープと置換される。ライゲーション後、共通領域で増幅され得る。他の方法もまた使用し得る。
【０１２９】
第二ソーティングステップのためのサブライブラリーの作成において、マスターライブラリーに関し、平均して、個々異なる分子は異なるタグを有し、それぞれの種類のうちの１つがタグ化されることを確実にする条件を使用する必要がある。このラウンドでは、平均して、１つのタグは、異なる分子のそれぞれに結合する。しかし、このラウンドでは、多様性は、最初のソーティングステップにより多様性をｍ×ｎに減少しているため、非常に低くなる。サブライブラリーメンバー中において、ポリペプチドタグコード化配列に結合し分散する、上記任意の方法を使用し得る。
【０１３０】
適当な化学量論を選択することにより、異なるタグが、ライブラリー中の個々の異なるメンバーと確実に一体化する（ｇｅｔ ｏｎ）。エピトープコード化分子のメンバーは、サブライブラリー中の分子の数に比して小さくなり、それにより、異なる分子群の間での一様に確実に分布し、それによって、任意の特定タグが特定ライブラリーメンバーとなる見込みは小さい。最初のソーティングステップおよびマスターライブラリーの調製に関し、好ましい割合および濃度が、それらを変えおよび試験することにより経験的に決定され得る。
【０１３１】
生ずるサブライブラリー中の核酸が翻訳され、例えば、ウエスタンブロッティング条件下で翻訳タンパク質が、抗体のような捕捉試薬のコレクションの１つ（または多数のその複製物）と接触し、捕捉試薬タンパク質複合体を形成する。複合体中のタンパク質をスクリーニングし、目的のタンパク質に結合するエピトープに結合する、抗体またはレセプターのような捕捉試薬遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）（または座位（ｌｏｃｉ））を同定し、それにより、「Ｅ」、目的のタンパク質と結合するエピトープ配列を同定する。Ｅｑと称する同定「Ｅ」、エピトープ配列を含むサブライブラリー中の核酸分子は、式５’ＦＢｓ３’（または５’ＣＦＢｓ３’）を含むプライマーで特異的に増幅し、ここで、個々のＦＢは、エピトープ配列のＥｍ部分を用いる結合核酸の増幅に重要であり、Ｅｍのすべてまたは一部を含む。これは、目的の核酸分子を特異的に増幅する。
【０１３２】
要約すると、多様性（Ｄｉｖ）は、ライブラリー中の異なる分子の総数（すなわち、１０８）、Ｎ＝Ｄ１−Ｄｎの除数（その数は、１０２のような捕捉試薬の異なるコレクションの数である）；Ｍ＝１０３のような異なるエピトープタグ（および捕捉試薬）Ｅｌ−Ｅｍの数と均しい。当該方法を開始するため、マスタータグ化ライブラリーを調製し、Ｎ回分割する。Ｎのサンプルの部分を翻訳し、Ｍの捕捉試薬（ソート１）をそれぞれ含むＮのアレイにスポットする。このステージでは、Ｍ×Ｎ＝１０５である。この第二のソートの場合、１０３のような「Ｍ」、新規エピトープを使用し、核酸を翻訳し、抗体のような１０３の捕捉試薬の１つのアレイにソートし、それにより、多様性は１０８に減少する。結果として、アレイにおける個々の遺伝子座（粒子同定可能支持体への結合を供するならばコレクションのメンバー）は、単一型のタンパク質および単一捕捉試薬を有する。ソーティングステップの数は、任意の望ましい数であり得るが、典型的には１または２である。ソートの数がより高くなれば、第一のソートにおける検出アッセイの感度は非常に高くなる。多様性の結果として、目的のタンパク質の濃度が低くなるためである。上記のように、ＭおよびＮは、個々のソーティングステップで異なり得る。
【０１３３】
分子のコレクション、特にタンパク質、ＤＮＡ、小分子のコレクションおよび他のコレクションの種類をソートし得る、ネスト化ソーティングの方法を図１−１８に示す。ネスト化ソーティングの概念を図１に示す。この例では、ｃＤＮＡのような７４，０８８種のアイテムを含むマスターコレクションを、４２のサブライブラリー（Ｆ１サブライブラリー）中に当該コレクションをランダムに分割することにより、探索する。４２のＦ１サブライブラリーが、例えば、プローブとの結合またはプローブとの反応により、またはタンパク質−タンパク質特異的相互作用により、目的のアイテムを含むものを同定した後、そのグループを更にランダムに４２の新規サブライブラリー（Ｆ２サブライブラリー）に分割し、目的のアイテムを含むサブライブラリーを再び同定する。目的のアイテムを含むＦ２サブライブラリーの最終分割により、１つのみのアイテムをそれぞれ含む４２の新規グループを作成する。目的のアイテムは、ソーティング系列に基づき唯一同定され得る。
【０１３４】
示した例では、目的のアイテムは、５番目のＦ１サブライブラリー、３１番目のＦ２サブライブラリー、および１６番目のＦ３サブライブラリーで同定した。マスターコレクションの７４，０８８アイテムのうち、１つのみがソート系列Ｆ１５／Ｆ２３１／Ｆ３１６となる。
【０１３５】
図２で解説するソートは、図１で解説するソートと同一であるが、Ｆ２およびＦ３サブライブラリーはアレイ中に配列される点が異なる。この図は、また、ソートの結果として個々のサブライブラリー中のアイテムの多様性が減少し；例示のマスターコレクションが７４，０８８アイテムを含むこと、４２のＦ１サブライブラリーがそれぞれ１，７６４アイテムを含むこと、４２のＦ２サブライブラリーが４２のアイテムを含むこと、そして４２のＦ３サブライブラリーがアイテムを１つのみ含むことを示す。最初の２つの図は、ネスト化ソーティングに基づく理論的探索を示している。
【０１３６】
図３は、高多様性遺伝子ライブラリーのネスト化ソートのツールとして、抗体アレイのような捕捉試薬アレイの使用を示す。マスター遺伝子ライブラリーを最初にランダムにサブライブラリーの数に、ＰＣＲのような分離増幅反応のにより、分割する。増幅反応には、マスター鋳型プールから遺伝子の異なるサブライブラリー（Ｆ１サブライブラリー）を特異的に増幅するプライマーの適当な設計により、事前に選択したエピトープをコードし、遺伝子中に組込まれる特有ヌクレオチド配列のセットを使用する。これらの増幅反応は、例えば、適合性サーモサイクラーを用い９６ウェル（または３８４ウェルまたはそれよりも高い密度）で行う。
【０１３７】
個々のウェル中の増幅遺伝子をタンパク質産物に翻訳し、次いで、それぞれからサンプルを適用し、アレイのような捕捉試薬コレクションを分離する（すなわち、９６ウェルプレート中の個々のウェルからのタンパク質を９６捕捉試薬アレイの１つに適用する）。アレイにおいて、抗体のような捕捉試薬にに対する結合により、タンパク質を、プライマーを使用しタンパク質に加える既知特有アミノ酸配列（エピトープ）を認識するアレイ上の定義位置にソートする。ソーティングの後、目的のタンパク質を含むアレイ上のアドレスを同定し、アレイ中のスポットに結合するエピトープコード化配列を有するタンパク質からのサブライブラリーからの核酸を、例えばＰＣＲで増幅する。
【０１３８】
この第二の増幅ステップの間、既知エピトープの新規セットを核酸に組込み、それにより、更なる捕捉試薬アレイ（Ｆ３）を用い更にソートされ得る。
【０１３９】
図３の表は、ＰＣＲによる最初の分割の数がどれくらいか、およびアレイを組合し、例えば１００万（１０６）から１０億（１０９）種を超える遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを探索できる捕捉試薬の数はどれくらいか、を示す。例えば、最初の遺伝子ライブラリーを、増幅により１００のＦ１サブライブラリーに分割し得、次いで１００種のエピトープを認識する捕捉試薬を有する２つのアレイを使用し更に分割し得る。最初の遺伝子ライブラリーが１０６種の遺伝子を含むならば、サブライブラリー中のＦ３アドレスは単一型の遺伝子を含む（１０６／１００／１００／１００＝１）。ＰＣＲ増幅により１０００のＦ１サブライブラリーに分割され、次いでＦ２およびＦ３サブライブラリーを作成する１，０００種のエピトープを認識する捕捉試薬を有する２アレイを用い更に分割される最初の遺伝子ライブラリーは、１０９種の遺伝子（１０９／１，０００／１，０００／１，０００＝１）の探索に使用し得る。
【０１４０】
サブライブラリー中への遺伝子ライブラリー分割は、プライマーの対を用い、ＤＮＡ配列を特異的に増幅するＰＣＲ増幅反応の能力に基づく。両方のプライマーは、鋳型ＤＮＡの何れかの末端において配列にハイブリダイズする必要があるが、鋳型配列のサブセットは、プライマー対を用い増幅し得、この場合、その一方のプライマーは、すべての鋳型配列に共通であり、他方のプライマーは、目的の遺伝子配列に特異的である。例えば、特定遺伝子は、しばしば、目的の遺伝子に特異的である一方のプライマーおよびｃＤＮＡ分子のすべてに共通なオリゴ（ｄＡ）テイルにハイブリダイズする他方のプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーから増幅する。
【０１４１】
６．単一の融合タンパク質中の複数タグの使用
本明細書で提供するシステムはエピトープタグを使用し、ｓｃＦｖのライブラリーのようなタンパク質ライブラリーを更に分割する。例えば、１０００タグおよび１０９ｓｃＦｖのライブラリーでは、それぞれのタグに対し１０６のｓｃＦｖが存在する。目的のｓｃＦｖのような単一のライブラリーメンバーを同定するため、多数の個々のｓｃＦｖ（１０６）をスクリーニングするか、１以上の小部分（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いる。より多数のタグを用いると、ライブラリーは、より少ないステップで少数のタンパク質に減少し得る。
【０１４２】
組合せのアプローチを用い、小セットの捕捉試薬タグ対を多数セットとして有効に用い得る。単一のｓｃＦｖ融合タンパク質のようなタンパク質中に複数のタグを組込むことにより、より少ないタグのよりよい使用が行い得る。比較として、３００の捕捉試薬タグ対があり、個々のメンバーに結合する単一のタグを伴う１０９メンバーのライブラリーがあるならば、３００タグは、個々の型のタグが３．３×１０６メンバーに結合するように１０９メンバーを分割する。１／３のタグをそれぞれ３つの部位で使用するような組合せ形態で個々のメンバーに組込まれる３つのタグによると、合計１００×１００×１００（または１０６）の組合せがある。これら１０６のタグ組合せを用い、１０９メンバーをタグあたり１０００メンバーに分割する。そのため、限られた数のタグによる単一ステップにおいて、ライブラリーは有効に再分割（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅ）する。
【０１４３】
最も間単な実施態様では、部位Ｘでｘタグ、部位Ｙでｙタグおよび部位Ｚでｚタグの例を考慮する。これらのタグを個々に使用するならば、ｘ＋ｙ＋ｚの組合せがある。これらのタグを組合せて使用するならば、（ｘ）（ｙ）（ｚ）の組合せがある。個々の部位（ｘ，ｙおよびｚ）におけるタグの数が総数（ｎ）の１／３であると仮定すると、個々の使用の場合、Ｃ＝（ｎ／３）×３＝ｎであるか、タグの存在と同じぐらい多くの総数の組合せ（Ｃ）が存在し、ここで、コンビナトリアル的使用の場合、Ｃ＝（ｎ／３）３となる。個々の部位での各タグ数が増加するので、コンビナトリアルタグの数は、より高い割合で増加する（図１９参照）。より多数の有効なタグを用い、タグあたりのライブラリーのメンバー数は減少する。初期ライブラリーにおけるタグあたりのより少ないメンバーは、より少ない連続的ラウンドのスクリーニングを生ずるか、またはハイスループットスクリーニングで評価するクローンのより少ない数を生ずるか、いずれかである。
【０１４４】
単一タグを用いるか、または組合せで複数タグを用いるか、いずれであっても、手順は実質的に同じである。発現ライブラリー由来のタンパク質は、タグに対する、抗体のような捕捉試薬に結合するエピトープタグの特性により更に分割される（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅ）。上記で存在する例では（３つのタグを組合せて使用する）、個々のライブラリーメンバーは、３種の抗タグ捕捉試薬に結合する。個々のコンビナトリアルタグは、それ自身のセットのアドレスを、単一アドレスの代わりのアレイにおいて、有する。例えば、部位Ｘの１−１００、部位Ｙの１０１−２００および部位Ｚの２０１−３００で合計３００タグが存在するならば、典型的なコンビナトリアルタグは、アドレスＸ２７−Ｙ１３２−Ｚ２８９を有する。他のコンビナトリアルタグもまたは、捕捉試薬のようなＸ２７抗タグ捕捉試薬、またはＹ１３２またはＺ２８９捕捉試薬を使用するが、他の組合せは、３つすべてを使用するわけではない。抗原が、個々のタグが結合する３つの捕捉試薬に結合するライブラリーメンバーに結合するならば、コンビナトリアルタグは、知られることとなり、ライブラリーメンバーはオリジナルライブラリーから回収され得る。
【０１４５】
コンビナトリアルタグを伴う特定ライブラリープールの回収は、単一タグを伴うライブラリープールを回収する実質的な方法で行う。本明細書に記載のように、ライブラリーから部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を回収する１つの方法にポリメラーゼ連鎖反応を使用する。例示のため、３つすべてのタグが発現タンパク質のＣ末端にあると仮定すると、Ｘタグは、ｓｃＦｖのようなライブラリーメンバーに最も近く、次いで、Ｙタグ、更にＺタグが近くなる。ｃＤＮＡのコーディング鎖におけるＤＮＡセグメントのオーダーは、５’共通＞ｓｃＦｖ＞Ｘ＞Ｙ＞Ｚ３’となる。
【０１４６】
特定の部分母集団は、共通プライマーおよびＺ２８９タグに相当するプライマーで開始する連続ラウンドＰＣＲにより回収され得る。この反応由来の産物を、共通プライマーおよびＹ１３２タグプライマーを用いる次の反応に使用する。この反応由来の産物を、共通プライマーおよびＸ２７プライマーを用いる、その後の反応に使用する。３つの連続ラウンドの増幅の後、当該産物はすべて、ｘ２７−Ｙ１３２−Ｚ２８９の組合せで初めにタグ化されていた、ｓｃＦｖのようなライブラリーメンバーに相当する。当業者ならば、ライブラリーが複数のネスト化共通配列を有している限り、複数種の共通プライマーが異なるラウンドで使用されることを理解している。当業者ならばまた、複数タグがコード化ＤＮＡの反対側末端にあり、それゆえ発現タンパク質の反対側末端に存在し得ることを理解している。発現エピトープタグは直鎖状であり、ジスルフィド結合で束縛され、骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）構造で束縛され、融合タンパク質のループで発現し、連続であるか、または可動性もしくは非可動性リンカー配列により分離され得ることも理解される。
【０１４７】
１つの実施態様では、例えば、単一骨格融合タンパク質は、挿入エピトープタグと共に複数部位を含む。これは、エピトープを空間的に分離し、互いの干渉なしにすべて認識し得る。下記の基準をタンパク質骨格を選択する際に考慮する：１）抗原性の高い傾向を有するアミノ酸にさらされる表面をより簡単に同定する既知結晶構造、２）目的ｃＤＮＡライブラリーに融合するための遊離ＮおよびＣ末端、３）種々のタンパク質発現システムにおける高レベルの産生および溶解性（特にＥ． ｃｏｌｉペリプラズム）、４）インビトロ転写／翻訳の許容力、５）ジスルフィド結合の非存在、６）野生型タンパク質が単量体であること、７）ｓｃＦｖの溶解性または機能性を増加する許容性を有すること。結晶構造を使用すると、エピトープタグライブラリーの挿入のために位置が選択される。これらの部位は、自然では、比較的直線状であるエピトープを空間的に分離する（例えば、αヘリックスの一端、β鎖間のターンまたはヘリックス間のループ）。
【０１４８】
Ｄ．抗体の調製
１．アドレス可能抗タグ抗体の抗体およびコレクション
本明細書における方法は、分子、特にタンパク質のライブラリー（またはコレクション）に結合するポリペプチドタグに特異的に結合する抗体のような捕捉試薬の能力に依存する。特定タグに対する個々の抗体（またはコレクション中の他のレセプター）の特異性は、既知であるか、またはアレイにおける遺伝子座のすべての抗体が特定エピトープタグに特異的となるように、例えば抗体をアレイすることにより、容易に確かめられる。
【０１４９】
他に、例えば、カラービーズまたはバーコード化ビーズまたは支持体を含む所望によりコード化タグに対する結合により、個々の抗体が同定され得るか、または例えば、マイクロリアクターを電子タグまたはバーコード化支持体（例えば、米国特許番号６，０２５，１２９、米国特許番号６，０１７，４９６、米国特許番号５，９７２，６３９、米国特許番号５，９６１，９２３、米国特許番号５，９２５，５６２、米国特許番号５，８７４，２１４、米国特許番号５，７５１，６２９、米国特許番号５，７４１，４６２参照）、または化学タグ（米国特許番号５，４３２，０１８、米国特許番号５，５４７，８３９参照）またはカラータグに供することにより、または物理的にアドレス可能アレイの代わりに使用し得るアドレス可能方法により、電子タグに結合し得る。例えば、個々の抗体型は、カラーコードタグ（すなわち、カラーソート可能ビーズ）または周波数（ｒａｄｉｏ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）タグ（ＲＦ）のような、ＩＲＯＲＩ ＭＩＣＲＯＫＡＮＳ（商標）およびＭＩＣＲＯＴＵＢＥＳ（商標）ミクロリアクター（米国特許番号６，０２５，１２９、米国特許番号６，０１７，４９６、米国特許番号５，９７２，６３９、米国特許番号５，９６１，９２３、米国特許番号５，９２５，５６２、米国特許番号５，８７４，２１４、米国特許番号５，７５１，６２９、米国特許番号５，７４１，４６２、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／３１７３２、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／１５８２５参照、また米国特許番号６，０８７，１８６参照）のような電子タグと会合する支持体マトリクスに結合し得る。本明細書で提供する方法およびコレクションの場合、個々の型の抗体は、ＭＩＣＲＯＫＡＮまたはＭＩＣＲＯＴＵＢＥマイクロリアクター支持体マトリクスおよび会合ＲＦタグ、バーコード、カラー、カラービーズまたは抗体のようなレセプターを同定する役割をする他のアイデンティファイアー、および抗体のようなレセプターが結合するエピトープタグに結合し得る。
【０１５０】
本明細書の例示的目的のため、リファレンスから、抗体および当該抗体が特異的に結合するエピトープをコードするタグを作成する。特異的に結合する任意対の分子が予期され；本明細書の目的のため、抗体のような分子をレセプターと称し、およびそれに結合するリガンドのような分子はエピトープであることが理解される。当該エピトープは、典型的に、抗体のようなレセプターまたはその特異的結合フラグメントに特異的に結合するアミノ酸の短い配列である。
【０１５１】
また、本明細書の例示のために、リファレンスから、位置付けアレイを作成する。しかし、その他の同定方法が本明細書の方法による使用に容易に適用され得ることが理解される。抗体のようなレセプターの同定（すなわち、エピトープタグ特異性）が既知であることのみが必要である。二次元アレイまたは三次元アレイの何れかであり、また所望により、コード化ビーズまたはカラー化支持体またはＲＦタグまたはほかの形式に結合する、アドレス可能レセプター（すなわち、抗体）のコレクションが生じ、それを本明細書の方法に用い得る。
【０１５２】
抗体のコレクションとポリペプチドタグ標識分子のライブラリーとを反応させ、次いで、スクリーニングアッセイを行い、望ましい性質のエピトープ標識分子が結合する抗体のコレクションのメンバーを同定することにより、分子のライブラリーの多様性の減少が生ずる。抗体の個々のコレクションは、多様性の減少をもたらすためのソーティング装置として役立つ。当該過程を複数回繰り返すことにより、多様性の迅速なおよび実質的な減少をもたらし得る。
【０１５３】
２．捕捉試薬の調製
ソートの質は、ソーティングアレイを作成する抗体のような捕捉試薬のコレクションの質に依存する。結合親和性および特異性の必要性に加え、アレイ中の捕捉試薬（抗体）により結合するエピトープは、増幅反応（ＰＣＲ）のプライミング部位として使用されるＥ、ＦＡおよびＦＢ配列を決定する。図１２は、コレクション中の使用のために抗体産生に使用するためのハイブリドーマ細胞から産生する免疫グロブリン（Ｉｇ）を発見するためのハイスループットスクリーニングの概略を示している。
【０１５４】
ハイブリドーマ細胞は、非免疫化マウスか、またはランダムジスルフィド束縛化七量体エピトープのライブラリーまたは他のランダムペプチドライブラリーを発現するタンパク質で免疫化されたマウスのいずれかから作成される。安定なハイブリドーマ細胞は、高Ｉｇ産生およびエピトープ結合のため最初にスクリーニングされる。Ｉｇ産生は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより培養上清中で測定される。エピトープ結合はまた、免疫に使用するハプテンの混合物（エピトープタグ化タンパク質）がＥＬＩＳＡプレートに固定化されるＥＬＩＳＡアッセイにより測定され、培養上清の結合ＩｇＧは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用い測定される。両アッセイは、９６ウェル型または他の適当な型で行う。例えば、約１０，０００ハイブリドーマがこれらのスクリーニングから選択される。
【０１５５】
次に、Ｉｇは、固定化Ｉｇ結合タンパク質（プロテインＡ、ＧまたはＬ）と共にフィルターを含む９６ウェルまたはより高密度精製プレートを用い別々に精製する。精製Ｉｇの量は、９６ウェルまたはより高密度プレート型の標準的プロテインアッセイを用い測定する。個々の培養物由来の低ミクログラム量のＩｇが、この精製法の使用に予想される。
【０１５６】
精製Ｉｇを、標準的ピン型アレイシステムを用いニトロセルロースフィルター上に別々にスポットする。当該精製Ｉｇがまた合わされて、同量の個々のＩｇを有する混合物を生ずる。混合Ｉｇを、ランダムジスルフィド束縛化七量体エピトープを発現するバクテリオファージのライブラリーをパン（ｐａｎ）する固相支持体として使用される常磁性ビーズに結合する。バッチパンニングは、精製Ｉｇに対し、ファージ発現エピトープのファージディスプレイライブラリーを富化する。この富化は、ファージライブラリーの多様性を劇的に減少する。
【０１５７】
次いで、富化したファージディスプレイライブラリーは、精製Ｉｇのアレイに結合し、緊縮的に洗浄する。Ｉｇ結合ファージは、電荷結合素子（ＣＣＤ）に基づくイメージングシステムで検出可能な化学ルミネセンスシグナルを生ずる抗ファージ抗体ＨＲＰ結合体で染色することにより検出する。最も強いシグナルを生ずるアレイ中のスポットを除外し、ファージを溶出し増殖させる。回収ファージにより発現するエピトープは、ＤＮＡ配列決定により同定し、親和性および特異性で更に評価する。この方法は、同系エピトープを認識する高親和性、高特異性抗体のコレクションを生ずる。連続スクリーニングは、質を改善した抗体のより大きなコレクションを生ずる。
【０１５８】
３．抗タグ捕捉試薬アレイの調製
個々のスポットは、単一の特異性を有する抗体のような複数の捕捉試薬を含む。個々のスポットは、検出に適当な大きさである。１から３００ミクロンのオーダー、典型的には１から１００、１から５０および１から１０ミクロンのスポットは、アレイの大きさ、標的分子および他のパラメーターに依存する。一般的に、スポットは、５０から３００ミクロンである。アレイの調製において、十分な量が、望ましい特性を有するタンパク質の検出のために機能的にカバーされる表面に送達される。一般的に、アレイ調製のため送達された抗体含有混合物の体積は、ナノリッター体積（１から約９９ナノリッターまで）であり、一般的に約１ナノリッターまたはそれ未満であり、典型的には、約５０と２００ピコリッターとの間である。これは、非常におおよそであるが、スポットあたり約１０００万から１００，０００分子あり、この場合、個々のスポットは、単一のエピトープを認識する抗体のような捕捉試薬を有する。例えば、１０００万分子が存在し、遺伝子座と反応するタンパク質混合物中に１０００種のものがあるならば、スポットあたり１０４の個々の型の分子が存在する。アレイの大きさおよび個々のスポットは、スクリーニングステップ中の陽性反応が、好ましくは、アレイ全体または複数のアレイ（２４、９６またはそれより多いアレイのような）を同時にイメージすることによりイメージされ得るようになる。
【０１５９】
ＫＯＤＡＫペーパープラスゼラチンのような支持体（典型的支持体は以下参照）または他の適当なマトリクスを使用し得、次いで、インクジェットおよびスタンピングテクノロジーまたは他の適当な分配方法および装置を使用し、再現可能なようにアレイをプリントする。当該アレイを、例えば、ピエゾまたはインクジェットプリンターまたは他のそのようなナノリッターまたはより少量の分配装置を用いプリントする。例えば、１０００スポットを有するアレイをプリントし得る。２４または４８、９６またはそれより多い複数の複製アレイを、通常９６ウェルプレートの大きさのシート上に置くことができる。
【０１６０】
本明細書で予期できる実施態様では、抗体アレイの複製をそれぞれ伴うアレイのシートである。これらは、例えば、ピエゾまたはインクジェット分配システムを用い調製される。多数、例えば１０００は、例えば、１０００種のホール（５００μＭホールを有するスタンプなど）を伴うプリントヘッドを使用し、同時にプリントされ得る。それは、例えば、１０００種の抗体のような捕捉試薬でそれぞれ満たされる、１０００ホールのような多くのホールを有するモールド化プラスチックから作成され得る。個々のホールはリザーバ（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に結合し得、そのリザーバは、抗体のような捕捉試薬をプリントヘッド中に最終的に分配する、小さいサイズの導管（ｃｏｎｄｕｉｔ）に結合する。シートにおける個々のアレイは、空間的に分離され得、および／またはプラスチックリッジのような物理的バリアまたは疎水性バリアのような化学的バリア（すなわち、疎水性バリアにより分離されるヒドロゲル）により分離され得る。アレイを有するシートは、通常、９６ウェルプレートまたはそれよりも高い密度の大きさであり得る。個々のアレイは、事前に選択したセットのエピトープタグに特異的な複数のアドレス可能抗タグ抗体を含む。例えば、３３×３３アレイは、おおよそ１０００抗体を含み、個々のアレイ上の個々のスポットは、事前決定した単一のエピトープに特異的結合する抗体を含む。バリアにより分離される複数のアレイを用い得る。
【０１６１】
表面上に抗体を分配する場合、その目的は、機能性表面適用範囲（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ）であり、それにより、スクリーニングした望ましいタンパク質が検出可能となる。これを行うため、出発コレクションから、例えば、約１から２ｍｇ／ｍｌを使用し、抗体あたり約５００ピコリッターをアレイ上のスポットごとに置く。正確な量は経験的に決定し得、表面および検出方法の感度のような幾つかの変数に依存し得る。当該抗体は、例えば、スルフヒドリル結合により好ましくは表面上のアミドに共有結合する。他の例示の分配および固定化システムには、以下に限らないが、例えば、Ｇｅｎｏｍｅｔｒｉｘ（ガラス上でプリントするためのシステムを有する）から；Ｉｌｌｕｍｉｎａ（支持体としてファイバーオプティックスケーブルのチップを用いる）から；Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（チップ表面プラズモン共鳴を有する（すなわち、タンパク質誘導化ゴールド））から；Ｍｉｃｒｏｆａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐｌａｎｏ ＴＸからのようなインジェクトシステム；Ｉｎｃｙｔｅ， Ｐａｌ Ａｌｔｏ， ＣＡ， Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａ， Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｅｒｉｄｅｎ ＣＴ、および適当な支持体表面にタンパク質を分配および固定化するための他のシステムから利用可能なシステムが含まれる。ブラント（ｂｌｕｎｔ）およびクイルピン（ｑｕｉｌｌ ｐｉｎ）、ソレノイドおよびピエゾナノリッターディスペンサーおよび他のものといった他のシステムもまた予期される。
【０１６２】
４．他のコレクションの調製
捕捉試薬を、同定可能なビーズまたは粒子支持体に結合する。例えば、捕捉試薬は、所望により、Ｌｕｍｉｎｅｘ， Ａｕｓｔｉｎ Ｔｘからのようなコード化ミクロスフェアに結合し、カプセル化した蛍光性色素を含む。色素をカプセル化するミクロスフェアは、任意の適当な物質から調製され（例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ０１／１３１１９およびＷＯ９９／１９５１５参照、以下の記載参照）、スチレン−エチレン−ブチレン−スチレンブロックコポリマー、ホモポリマー、ゼラチン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、樹脂、ガラス、および任意の他の適当な支持体（マトリクス物質）を含み、直径、約１ナノメーターから約１０ミリメーターの大きさとなる。１０種の濃度のうち例えば２種の色素の組合せの特性より、複数の、特有の蛍光によりそれぞれ同定可能なミクロスフェア（この例では１００）を生ずる。
【０１６３】
他に、クロモホアまたはカラー色素または他のカラー物質の組合せをカプセル化し、ミクロスフェアまたは他の粒子中にカプセル化する種々の異なる色を生じ、次いで、抗体のような捕捉試薬の支持体として使用する。抗体のような個々の捕捉試薬を特定のカラー化ビーズに結合し、それにより同定可能となる。抗体のような、結合捕捉試薬と共にビーズを生じた後、エピトープタグ化分子との反応は液相中で行い得る。エピトープと反応するビーズを同定し、ビーズの色の結果から特定エピトープが既知となる。次いで、その結合分子が誘導されるサブライブラリーを同定する。
【０１６４】
Ｅ．抗体を固定化するための支持体
抗体を固定化するための支持体は、リガンドおよび他の分子の固定化が知られる任意の不溶性物質であり、親和性クロマトグラフィーのような、生物学的活性物質の固定化での、多くの化学合成および分離において、およびタンパク質、アミノ酸および他の有機分子およびポリマーを含む生体分子の化学的合成の間に、使用される。適当な支持体には、生体適合性ポリマーを含む任意の物質が含まれ、抗体物質の結合のための支持体マトリクスとして作用し得る。当該支持体物質は、化学的または生物学的スクリーニング反応を干渉しないように選択される。
【０１６５】
本明細書での使用も予期される支持体には、ミクロプレートおよびビーズ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬから商業的に入手可能であり、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡおよびＰａｃｋａｒｄ， Ｍｅｒｉｄｅｎ， ＣＴからのプラスチックシンチレーションビーズ、およびＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸからのカラー化ビーズベース化支持体（ミクロスフェア中にカプセル化される蛍光粒子））のようなフルオロホア含有または含浸支持体が含まれる（米国出願番号０９／１４７，７１０を基礎とする国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ／０１１４５８９参照、米国出願番号０９／０２２，５３７を基礎とする国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ／０１１３１１９参照）。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘからのミクロスフェアは、蛍光粒子のカプセル化の特性により内部的にカラーコード化されており、液体アレイとして提供され得る。抗体（エピトープ）のような捕捉試薬は、任意の適当な方法により直接または間接的に結合され、ビーズおよび結合タンパク質の表面との結合または相互作用は、それらが結合するビーズのカラーの特性により同定され得る。検出は、任意の手段により実施可能であり、カラー化（呈色）反応およびビーズのカラーの特性（呈色性）によりミクロスフェア（ビーズ）の色において検出可能な変化を生ずる色素生産的または蛍光的ディテクターまたはレポーターと組合わせ得る。ビーズに基づくアレイの場合、抗タグ捕捉試薬は、別反応においてカラーコード化ビーズに結合する。ビーズのコードは、それに結合する抗体のような捕捉試薬を同定する。次いで、ビーズを混合し得、その後、結合ステップを溶液中で行い得る。次いで、それらは、例えば、透明な蓋で微小作製（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅ）フローチャンバー（ビーズの単一層のみから二次元アレイを形成し得る）中にパッケージすることにより、アレイされ得る。タンパク質が結合するビーズが同定され、それにより、捕捉試薬およびタグが同定される。当該ビーズを例えば、ＣＣＤカメラでイメージ化し、反応するビーズを同定する。そのビーズのコードを同定し、それにより、捕捉試薬を同定し、次に、ポリペプチドタグおよび最終的に目的タンパク質を同定する。
【０１６６】
当該支持体はまた、比較的不活性のポリマーであり得、それは、イオン放射することによりグラフトし得、ポリスチレン、または誘導され、そして支持体として使用され得るポリマーのような他のもののコーティーングの結合が可能となる。単量体の放射線グラフトは、支持体上で生ずる表面特性の多様性を可能とする（例えば、Ｍａｅｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２： ２０３−２１２； およびＢｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ８０２４−８０２６参照）。例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレンのようなポリマーに対し、ビニル単量体のような単量体の放射線分解グラフティングまたは単量体の混合物は、異なる表面特性を有する合成物を生ずる。これらの方法を用い、ペプチドおよび他の分子の合成のための不溶性支持体にポリマーをグラフトする。
【０１６７】
支持体は、典型的には、固体、多孔性、変形可能、または堅固であり、任意の必要な構造およびジオメトリー（ビーズ、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空ファイバー、針、固体ファイバー、ランダム型、薄フィルムおよび膜、および最も好ましくはアドレス可能座位を有する固体表面型を含むがこれらに限らない）を有する不溶性サブストレートである。支持体はまた、捕捉試薬抗体および他の分子が支持体を扱う目的のため付着しない、テフロンストリップのような不活性ストリップまたは他の物質を含み得、同定可能記号を含み得る。
【０１６８】
その支持体の調製および使用は当業者に既知であり、そのような多くの物質および調製が知られている。例えば、アガロースおよびセルロースのような天然に生ずる物質は、各ソースから単離され得、既知のプロトコールに従い加工され、合成物質は、既知プロトコールに従い調製され得る。これら物質には、以下に限らないが、無機質、天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれ、以下に限らないが、セルロース、セルロース誘導体、アクリル性樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼン等との架橋するポリスチレン（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３： １３８５−１３９０参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラバー、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然のスポンジ（ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｏｎｇｅ）、および他の多くのものが含まれる。支持体の選択は、溶解度のような物理的および化学的性質、官能基、機構的安定性、表面エリア膨張性、疎水性または親水性特性および目的の使用により、少なくとも一部、決定される。
【０１６９】
１．天然支持体物質
天然に生ずる支持体には、以下に限らないが、アガロース、他のポリサッカライド、コラーゲン、セルロースおよびそれらの誘導体、ガラス、シリカおよびアルミナが含まれる。単離、修飾および支持体としての使用に適当な処置方法は、当業者に既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ参照）。アガロースのようなゲルは、容易に本明細書の使用に適用し得る。ポリペプチド、タンパク質および炭水化物のような天然ポリマー；半導特性を有する、シリコンのようなメタロイドおよびゲルマニウムもまた本明細書の使用に適用し得る。白金、金、ニッケル、銅、亜鉛、スズ、パラジウム、銀のような金属もまた本明細書の使用に適用可能である。目的の他の支持体には、Ｐｔ−ＰｔＯ、Ｓｉ−ＳｉＯ、Ａｕ−ＡｕＯ、ＴｉＯ２、Ｃｕ−ＣｕＯなどのような金属およびメタロイドの酸化物が含まれる。また、原子間力顕微鏡で観察する分子の調製に使用するような、ニオブ酸リチウム、ヒ化ガリウム、およびリン化インジウムのような半導体化合物、およびニッケル被覆雲母表面（例えば、ＩＩＩ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ６４： ９１９参照）もまた、支持体として使用し得る。そのマトリクス物質の調製のための方法は既知である。
【０１７０】
例えば、米国特許番号４，１７５，１８３は、水不溶性ヒドロキシアルキル化架橋化再生化セルロースおよびその調製の方法が記載されている。試薬の密接な化学量論特性を用い産物を調製する方法を記載する。ゲルクロマトグラフィーの直接の産物の使用およびイオン交換体の調製での中間体としての使用も記載されている。
【０１７１】
２．合成支持体
当業者に既知の無数の合成支持体および方法が存在する。合成支持体は、典型的に、官能性マトリクスの多量体化により、または合成単量体および天然で発生するマトリクス単量体またはアガロースのような多量体由来の２以上の単量体由来の共重合により、作製される。
【０１７２】
合成マトリクスには、以下に限らないが、アクリルアミド、デキストラン誘導体およびデキストラン共重合体、アガロース−ポリアクリルアミドブレンド、種々の官能基を有する他のポリマーおよびコポリマー、メタクリレート誘導体およびコポリマー、ポリスチレンおよびポリスチレンコポリマー（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３： １３８５−１３９０； Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ｉｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈ． Ｃｏｌｌｅｃｔ． Ｐａｐ．， Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．， １ｓｔ， Ｅｐｔｏｎ， Ｒｏｇｅｒ （Ｅｄ）， ｐｐ． ４５３−４５９； Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ｉｎ Ｐｅｐｔ．， Ｐｒｏｃ． Ｅｕｒ． Ｐｅｐｔ． Ｓｙｍｐ．， ２０ｔｈ， Ｊｕｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ）， ｐｐ． １９６−１９８； Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ８０２４−８０２６； Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｉｓｒ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． １７： ２４３−２４７； Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ． ４３： ２８４５−２８５２； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４２： ３７９５−３７９８； 米国特許番号４，５０７，２３０； 米国特許番号４，００６，１１７；および米国特許番号５，３８９，４４９）が含まれる。その支持体マトリクスの調製のための方法は当業者に既知である。
【０１７３】
合成支持体には、ポリビニルアルコール、アクリレートおよびアクリル酸（ポリエチレンコアクリル酸、ポリエチレンコメタクリル酸、ポリエチレンコエチルアクリレート、ポリエチレンコメチルアクリレート、ポリプロピレンコアクリル酸、ポリプロピレンコメチルアクリル酸、ポリプロピレンコエチルアクリレート、ポリプロピレンコメチルアクリレート、ポリエチレンコビニルアセテート、ポリプロピレンコビニルアセテートなど）のようなポリマーおよびコポリマーから作製されるもの、およびポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリプロピレンコマレイン酸無水物などのような酸無水物を含むものも含まれる。リポソームもまた、親和性精製のための固体支持体として使用される（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ３３： １７３）。
【０１７４】
例えば、米国特許番号５，４０３，７５０はポリウレタンに基づくポリマーの調製について記載している。米国特許番号４，２４１，５３７は、鎖伸長ポリオールから調製する親水性ポリウレタンゲル組成物を含む植物培養培地について記載している；ランダム共重合は、プレポリマーが室温で液体であるように、５０％までのプロピレンオキシド単位で行い得る。米国特許番号３，９３９，１２３は、３５％までのポリ（プロピレンオキシ）グリコールまたはポリ（ブチレンオキシ）グリコールを有するポリ（エチレンオキシ）グリコールを含むイソシアネート末端化プレポリマーの、わずかに架橋したポリウレタンポリマーについて記載している。これらのポリマーにおいて、有機性ポリアミンは架橋剤として使用される。他の支持体およびその調製は、米国特許番号４，１７７，０３８、４，１７５，１８３、４，４３９，５８５、４，４８５，２２７、４，５６９，９８１、５，０９２，９９２、５，３３４，６４０、５，３２８，６０３に記載されている。
【０１７５】
米国特許番号４，１６２，３５５は、少なくとも１つのペンダントハロメチル基を有するアミンイミド（ａｍｉｎｉｍｉｄｅ）およびビニルのポリマーである、親和性クロマトグラフィーの使用に適当なポリマーについて記載している。親和性クロマトグラフィー中で結合するための部位を提供するアミンリガンドは、ペンダントハロメチル基の一部との反応によりポリマーに結合し、ペンダントハロメチル基の残りはペンダント親水性基を含むアミンと反応する。このポリマーを有するサブストレートを被覆する方法もまた述べられている。典型的なアミンイミドは、１，１−ジメチル−１−（２−ヒドロキシオクチル）アミンメタクリルイミドであり、ビニル化合物は、クロロメチルスチレンである。
【０１７６】
米国特許番号４，１７１，４１２は、Ｄ−アミノ酸単位を含む共有結合Ｄ−アミノ酸またはペプチドを有する、好ましくはマクロポーラス特性の親水性ポリマーゲルに基づく特異的支持体について述べている。基礎支持体は、アクリル酸およびメタクリル酸のヒドロキシアルキルエステルまたはヒドロキシアルキルアミドの共重合により調製され、それに伴い、アクリレートまたはメタクリレートコモノマーの架橋は、ジアミン、アミノ酸またはジカルボン酸との反応により修飾され、生ずるカルボキシ末端またはアミノ末端基は、アミノ酸のＤ−類似体またはペプチドで縮合される。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドはまた、担体の表面上で段階的に合成され得る。
【０１７７】
米国特許番号４，１７８，４３９は、陽イオン交換体およびその調製方法について記載している。米国特許番号４，１８０，５２４は、シリカ支持体上での化学合成について記載している。
【０１７８】
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＩＡＭ； 例えば、米国特許番号４，９３１，４９８および４，９２７，８７９）もまた使用し得る。ＩＡＭは、細胞膜環境を真似ており、好ましくは細胞膜と会合する分子との結合に使用され得る（例えば、Ｐｉｄｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １２： １４９）。
【０１７９】
当該支持体の中で、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／０４３８９、ＷＯ００／０４３８２およびＷＯ００／０４３９０に記載のもの；マトリクス物質で被覆されるＫＯＤＡＫフィルム支持体が本明細書で予期される（目的の他の支持体の場合米国特許番号５，７４４，３０５および５，５５６，７５２参照）。目的のものは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）からのもののような、カラー化「ビーズ」である。
【０１８０】
３．固定化および活性化
多くの方法が、固体または液体支持体へのタンパク質および他の生体分子の固定化に開発された（例えば、Ｍｏｓｂａｃｈ （１９７６） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４４； Ｗｅｅｔａｌｌ （１９７５） Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ａｎｔｉｇｅｎｓ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ； ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ， Ｓｃｏｕｔｅｎ， ｅｄ．， ｐｐ． ２５３−３９１参照；一般的には、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐａｒｔ Ｂ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３４， ｅｄ． Ｗ． Ｂ． Ｊａｋｏｂｙ， Ｍ． Ｗｉｌｃｈｅｋ， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９７４）； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ４２， ｅｄ． Ｒ． Ｄｕｎａｌａｐ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９７４）参照）。
【０１８１】
最も通常的に使用される方法の中には、吸収および吸着または支持体への共有結合があり、その結合は直接かリンカーを介するか何れかであり、例えば、多くのジスルフィド結合、チオエーテル結合、束縛ジスルフィド結合（ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ）、および当業者に既知のアミンおよびチオール基のような遊離反応基間の共有結合である（例えば、ｔｈｅ ＰＩＥＲＣＥ ＣＡＴＡＬＯＧ， ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， １９９２−１９９３（試薬の調製および使用が記載されており、その試薬の市場の源を提供する）およびＷｏｎｇ （１９９３） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ Ｌｉｎｋｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ参照；また、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ６９０９； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４： １０６４６； Ｋｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６： ２６６１； Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１： ４７０８； Ｓｕｃｈｏｌｅｉｋｉ （１９９４） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｔｔｒｓ． ３５： ７３０７； およびＳｕ−Ｓｕｎ Ｗａｎｇ （１９７６） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４１： ３２５８， Ｐａｄｗａ ｅｔ ａｌ． （１９７１） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４１： ３５５０ およびＶｅｄｅｊｓ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４９： ５７５（感光性リンカーについて記載している）参照）。
【０１８２】
固定化を行うため、タンパク質または他の生体分子の溶液は、アルミナ、炭素、イオン交換樹脂、セルロース、ガラスまたはセラミックのような支持体物質と接触させる。過フッ化炭化水素ポリマーは、生体分子が吸着により結合する支持体として使用する（米国特許番号３，８４３，４４３、公開された国際ＰＣＴ出願ＷＯ／８６０３８４０）。
【０１８３】
種々の方法が、タンパク質および核酸を含む生物学的分子、固体支持体に対する分子を結合するために知られている（例えば、米国特許番号５４５１６８３参照）。例えば、米国特許番号４，６８１，８７０は、シリカ支持体上への遊離アミノ基またはカルボキシル基の導入方法が記載されている。その後、これらの基は、カルボジイミド存在下、タンパク質または他の抗リガンドのような他の基に共有結合し得る。他に、シリカマトリクスは、アルカリ条件下、ハロゲン化シアンによる処置によって活性化され得る。抗リガンドは、活性化表面への添加において表面に共有結合する。他の方法は、ビオチン、アビジンおよびエクステンダーの複数層の連続適用を介するポリマー表面の修飾を含む（例えば、米国特許番号４，２８２，２８７参照）；他の方法は、光感受性非天然アミノ酸群をポリペプチド鎖に組込むことにより、およびその産物を低エネルギー紫外光にさらすことにより、ポリペプチド鎖が固体サブストレートに結合する、光活性化を含む（例えば、米国特許番号４，７６２，８８１参照）。オリゴヌクレオチドはまた、ソラレン化合物のような光化学的に活性な試薬、およびサブストレートに光試薬（ｐｈｏｔｏｒｅａｇｅｎｔ）を結合するカップリング剤を使用し結合する（例えば、米国特許番号４，５４２，１０２および米国特許番号４，５６２，１５７参照）。光試薬の光化学反応により、核酸分子はサブストレートに結合し、表面結合プローブを供する。
【０１８４】
ガラス、合成ポリマーおよび架橋ポリサッカライドのような化学的に活性化された固体マトリクス支持体に対する、タンパク質もしくは他の生体分子または有機性分子粒子もしくは生物学的粒子の共有結合は、よりしばしば、固定化技術に使用される。分子または生物学的粒子は、マトリクス支持体に直接結合し得るか、または金属のようなリンカーを介し結合し得る（例えば、米国特許番号４，１７９，４０２、およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ． ４： ７３−７８）。この方法の例は、アガロースのようなポリサッカライド支持体の臭化シアン活性化である。酵素固定化および親和性クロマトグラフィーのためのペルフルオロカーボンポリマーに基づく支持体の使用は米国特許番号４，８８５，２５０に記載されている。この方法では、生体分子は、米国特許番号４，９５４，４４４に記載のペルフルオロオクチルプロピルイソシアネートのようなペルフルオロアルキル化剤との反応により最初に修飾する。次いで、修飾タンパク質は、フルオロカーボン支持体上に吸着され、固定化される。
【０１８５】
支持体の活性化および使用は、既知であり、任意の既知の方法により実施し得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。例えば、アミノ酸のカップリングは、当分野で知られている技術により行われ得、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， １９８４， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄで供されている。
【０１８６】
分子はまた、例えば、ＩｇＧ結合配列のような分子の天然結合部位、または金属イオンを結合する遺伝学的修飾タンパク質を用い、Ｃｏ（ＩＩＩ）のような動力学的不活性金属イオン結合を介し支持体に結合し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４， ７３ （１９９２）； ＩＩＩ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ６４： ９１９； Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ５９５： １１３−１９９； 米国特許番号５，４４３，８１６； Ｈａｌｅ （１９９５） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｍｅ． ２３１： ４６−４９参照）。
【０１８７】
固体支持体に分子および生物学的粒子を結合するための他の適当な方法が当業者に既知である（例えば、米国特許番号５，４１６，１９３）。これらのリンカーには、タンパク質および核酸などの分子を支持体に化学的に結合させるのに適当なリンカーが含まれ、以下に限らないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、束縛ジスルフィド結合、アミンおよびチオール基のような遊離反応基間の共有結合が含まれる。これらの結合を、異種二機能性試薬を用いて作り、当該部分の一方または両方の反応性チオール基を作製し、次いで、当該一部分上のチオール基を、反応性マレイミド基またはチオール基が他で結合する反応性チオール基またはアミン基と反応させる。他のリンカーは、より酸性の細胞内コンパートメント中で切断される、ビスマレイミドトキシ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅｏｔｈｏｘｙ）プロパン、酸不安定性トランスフェリン結合体およびアジピン酸ジヒドラジドのような酸切断可能リンカー；ＵＶまたは可視光にさらされると切断するクロスリンカー、およびヒトＩｇＧ１の不変領域からＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３のような可変ドメイン（ｖａｒｉｏｕｓ ｄｏｍａｉｎ）のようなリンカーを含む（Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０： ３７９−３８６）。
【０１８８】
現在、好ましい結合は、分子または生物学的粒子を支持体表面に吸着させることにより実施する直接の結合である。他の好ましい結合は、光にさらされることにより達成され得る光切断可能結合である（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７： ５５８８； Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ３： １０４−１０７（これらのリンカーは引用により、本明細書に組込む）参照）。光切断可能リンカーは、切断波長が結合部分を損傷しないように、選択される。光切断可能リンカーは、光にさらされることにより切断されるリンカーである（例えば、Ｈａｚｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９８１） ｉｎ Ｐｅｐｔ．， Ｐｒｏｃ． Ｅｕｒ． Ｐｅｐｔ． Ｓｙｍｐ．， １６ｔｈ， Ｂｒｕｎｆｅｌｄｔ， Ｋ （Ｅｄ）， ｐｐ． １０５−１１０（システインの光切断可能保護基としてニトロベンジル基の使用を記載している）； Ｙｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ １９０： ６９−８２（ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメチルローダミンコポリマーを含む水溶性光切断可能コポリマーを記載している）； Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ３： １０４−１０７（ＵＶ光近く（３５０ｎｍ）にさらされることにより光分解崩壊するクロスリンカーおよび試薬を記載している）； およびＳｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ４２： ２３１−２３７（光切断可能結合を生ずるニトロベンジルオキシカルボニルクロリドを記載する））。他のリンカーには、フルオライド不安定性リンカー（例えば、Ｒｏｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７： ５７１２参照）、および酸不安定性リンカー（例えば、Ｋｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３８： １４２７）が含まれる。選択リンカーは、特定の適用に依存し、必要に応じ、経験的に選択され得る。
【０１８９】
Ｆ．ライブラリー由来の望ましい性質のタンパク質を同定するための方法の使用１．捕捉試薬のアレイイング
エピトープタグが特異的に結合する捕捉試薬分子は、例えば、同定可能なビーズ、ミクロスフェアのような支持体、または固体表面に結合される。結合は、イオン性、共有結合性、物理的、ファンデルワールス結合のような任意の適当な結合を介し実施され得る。それは、直接または適当なリンカーを介して実施され得る。例示的目的のために、表面でのアレイイングを記載する。
【０１９０】
グリセロール（１−２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）における０．１Ｍ ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）の緩衝液中で濃度１−２ｍｇ／ｍｌの精製抗体１μｌを、膜（ＵｌｔｒａＢｉｎｄ膜、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ；ＦＡＳＴにニトロセルロース被覆スライド、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、化学的不活性化ガラススライド、スーパーアルデヒドスライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）、ポリリシン被覆ガラス、活性化ガラス、または特異的薄膜および自己アセンブル化モノレイヤー（国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／０４３８９、ＷＯ００／０４３８２およびＷＯ００／０４３９０）上に、自動化アレイイングツール（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｙｓ； ＰｉｘＳｙｓ ＮＱ； Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ； ＢｉｏＣｈｉｐ Ａｒｒａｙｅｒ； Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ； Ｔｏｔａｌ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ； ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ； Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ； Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘおよび他から利用可能なシステムなど）を用い、スポットする。当該スポットを、適当な時間、１−２分間またはそれ以上、典型的には３０分から１時間、風乾し得る。２つの膜の結合を記載する。ＵｌｔｒａＢｉｎｄ膜（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ）は、一次アミンと反応する活性化アルデヒド基を含み、膜と抗体のような捕捉試薬との間に共有結合を形成する。非反応アルデヒドは、５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液のような適当なブロッキング溶液で、またはＢＢＳＡ−Ｔ（最終濃度０．０５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）となるように加えたＴｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ）を伴う１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈するＢｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）のようなタンパク質含有溶液）で、約３０分のような適当な時間、インキュベーションすることによりブロックする。そのフィルターはＰＢＳでリンスする。
【０１９１】
抗体のような捕捉試薬はまた、この使用のために修飾し、パーソナルコンピューター（ＰＣ）のようなコンピューターにつないだ、例えばインジェクトプリンター（すなわち、Ｃａｎｏｎ ｍｏｄｅｌ ＢＪＣ ８２００、カラーインジェクトプリンター）を用い、例えばニトロセルロースペーパー（Ｓｃｈｌｉｅｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）のような膜上に、置くことができる。その修飾には、プリントヘッドからのカラーインクカートリッジの取除き、およびプリントヘッド中のインクパッドリザーバウェル上にシール化方法にフィットするようにハンドカットした、例えば１ミリリッターピペットチップとの置換えが含まれる。抗体溶液を、インクパッドリザーバ上にシートされるピペットチップリザーバ中にピペットする。
【０１９２】
修飾したプリンターを使用し、プリントしたイメージを、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔで作製する。次いで、当該イメージを、フィットするようにカットしたニトロセルロースフィルター上にプリントし、次いで、プリントするペーパーのシートの中央を覆うようにテープする。次いで、ペーパーのセットを、プリンター直前のプリンターにフィードする。
【０１９３】
抗体のような精製捕捉試薬をまた、ＦＡＳＴニトロセルロース被覆スライド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にスポットし得る。ニトロセルロースは、非共有結合性吸着によりタンパク質と結合する。ニトロセルロースは、ｃｍ２あたり約１００μｇ結合する。抗体のような捕捉試薬の結合後、残りの結合部位は、３０分間のような適当な時間、５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはＢＢＳＡ−Ｔの溶液と共にインキュベーションすることによりブロックする。
【０１９４】
ニトロセルロースへの抗体の直接結合から非方向性結合が生ずる。活性化固定化抗体分子の割合は、抗体捕捉タンパク質（プロテインＡ、プロテインＧ、または抗ＩｇＧモノクローナル抗体など）で被覆されるニトロセルロースに結合することにより、増加し得る。抗体捕捉タンパク質は、タグ化抗体のようなライブラリータンパク質の適用前に、アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を用い、ニトロセルロースに結合する。ビオチニル化抗体はまた、アビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）で被覆した表面上に被覆し得る。スポットの大きさおよび間隔は、使用するフィルターおよびアッセイの感度に依存して調節され得る。典型的なスポットは、直径、約３００−５００μｍであり、５００−８００μｍのピッチを有する。
【０１９５】
抗体はまた、活性化ガラスサブストレート上にプリントされ得る。プリント前に、ガラスは、Ａｑｕａｓｏｎｉｃ Ｃｌｅａｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＷＲ）中で５分間、ウォームタップウォーター（ｗａｒｍ ｔａｐ ｗａｔｅｒ）中の１：１０希釈の洗浄剤で連続的に超音波により洗浄し、蒸留水および１００％メタノール（ＨＰＬＣ品質）で数回リンスし、その後、４５℃のクラス１００オーブン中で乾燥させる。クリーンガラスは、１０分間、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）（無水エタノール中５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶液中に浸漬することにより、化学的に機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）する。次いで、当該ガラスを、９５％エタノールでリンスし、その後、風乾し、次いで、２時間、キュアするまで真空オーブン中で８０℃に加熱する。次いで、当該表面を、抗体、またはビオチンで当該抗体に結合するアビジンまたはストレプアビジン中の第一級アミンまたは遊離スルフヒドリル基に結合するように、更に修飾し得る。アミン反応性表面を作製するため、機能化ガラスを、２０分間、室温で、ビス［スルホスクシンイミジル］サブストレート（ＢＳ３）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、５ｍｇ／ｍｌ）で処理する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−活性化ガラス表面を、蒸留水でリンスし、３７℃のダストフリークラスの１００オーブン中に１５分間、乾燥するまで置く。抗体を直接この表面に結合させ得るか、または当該表面を、抗体に結合するプロテインＡ、プロテインＧまたは抗ＩｇＧモノクローナル抗体またはアビジン／ストレプアビジンのようなタンパク質で被覆し、ビオチニル化タンパク質に結合させる。スルフヒドリル反応性表面を作製するため、機能化ガラスを、室温で２０分間、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）で処理する。マレイミド活性化ガラス表面を蒸留水でリンスし、３７℃のダストフリークラスの１００オーブン中に１５分間乾燥するまで置く。ビオチニル化表面を作製するため、機能化ガラスを、室温で２０分間、ＥＺ−リンクＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理する。ビオチニル化ガラス表面を蒸留水でリンスし、３７℃のダストフリークラスの１００オーブン中に１５分間乾燥するまで置く。上記と同じ固定化ストラテジーを、無機薄膜上で形成される自己アセンブル化モノレイヤー中で使用し得る。
【０１９６】
２．変異遺伝子のライブラリーからの遺伝子の同定のための例示的使用
図４は、変異遺伝子のライブラリーの探索するための本明細書の方法の使用を示している。種々の方法による特定遺伝子領域の変異は、しばしば、組換え抗体の結合親和性を改善するエラープロンＰＣＲまたは遺伝子シャッフリング変異誘発技術により生ずる変異遺伝子のような、変異遺伝子によりコードされるタンパク質の特性の改善に使用される。表面ディスプレイによる選択と結合するこの技術は、数オーダーのマグニチュード（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）による抗体の結合親和性の改善のために使用される。変異はまた、酵素の触媒特性の改善のために使用される。本明細書の方法は、望ましい特性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子をスクリーニングおよび同定する手段を提供する。
【０１９７】
最初に、種々の機能性ドメインを含むオリゴヌクレオチドのセットを遺伝子の３’末端に加え、遺伝子および配列（「エピトープ」ではＥと称し、「ディバイダー」では、Ｄと称し、「共通」ではＣと称する）の更なるセットにハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含むプライマーを組込むことにより変異が生ずる。ＥＤＣ配列は、核酸の機能によりそれぞれ定義される配列のセットを構成する。記載したように、Ｅ配列は、コレクション中の抗体により特異的に認識されるエピトープをコードする。それらは、変異させた遺伝子のコーディング配列とインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で組込まれ、親タンパク質との融合として発現される。Ｄ配列は、エピトープの下流域の特定配列セットである。それらは、マスター群を「分割する」特定プライミン部位として役立つ。それらは、非コード配列であり得、発現化変異タンパク質の一部となる必要はない。Ｃ配列は、すべての遺伝子に対し「共通」な配列であり、すべての遺伝子鋳型の同時ＰＣＲ増幅としての手段を提供する。前記したように、特定実施態様では、Ｄおよび／またはＣ配列は任意である。重要なことに、ＥおよびＤ配列は、生ずるＤＮＡ分子間にランダムに分布する。例えば、１００Ｅ配列および１００Ｄ配列を合わし、１０，０００（１００×１００＝１０，０００）の特有のタグ化ｃＤＮＡ分子を作製する。同様に、１，０００Ｅ配列および１，０００Ｄ配列を合わし、１，０００，０００（１，０００×１，０００＝１，０００，０００）の特有のタグ化ｃＤＮＡ分子を作製する。
【０１９８】
Ｅ、ＣおよびＤ配列を、変異誘発分子の末端に加える前、または後、遺伝子中の定義領域は、種々の標準的方法により変異誘発する。変異手順は、Ｅ、Ｄ、Ｃ配列中に変異を生じないようにする。変異誘発が完了した後、変異ＤＮＡを最初のＰＣＲ反応物セットに鋳型として加え、Ｆ１サブライブラリーを作製する。鋳型ＤＮＡに加えて、Ｄ、Ｃプライマーセットを、それぞれのＰＣＲが種々ＤＮＡ配列に相補的なプライマーを含むように、別々に加える。例えば、図４では、第二ＰＣＲチューブは、１００Ｄ配列（Ｄ２）のうちの１つのみを含むＤ、Ｃプライマーを含む以外、チューブのレスト（ｒｅｓｔ）は同一である。この説明では、チューブ５０は、１００のＤ配列（Ｄ５０）のうちの一種を含むこと以外、Ｆ１反応チューブのレストは、同一である。生ずるＰＣＲ増幅産物は、遺伝子間にランダムに分布する１００種のＥ配列のすべてを含むが、１００のＤ配列１つのみを含む。解説において、ＰＣＲチューブ５０は、同じＤ５０配列、同じＣ配列を有し、分子（ＥＤ５０Ｃ）間にランダムに分布する異なるＥ配列を有するすべてのサブライブラリーＤＮＡ分子（Ｆ１５０）を生ずる。
【０１９９】
作製されたＦ１ＤＮＡ分子は、転写−翻訳抽出を用いインビトロで発現する。プロモーター、リボゾーム結合部位、およびインビトロ転写および翻訳の実施のための当業者に既知の他の調節配列を含む適当な調節ＤＮＡ配列を、タグ化工程の間にＤＮＡフラグメント中に組み込む。図４に解説のように、Ｆ１５０ＤＮＡ分子の発現により、異なるエピトープタグを含むタンパク質のコレクションを生ずる。細菌または他のインビボシステムで産生されるタンパク質もまた使用され得る。
【０２００】
生ずる発現化タンパク質を、エピトープのそれぞれに選択的に結合する抗体とエピトープとの間で結合が可能な条件下、アレイ型のような抗体コレクションでインキュベートする。これは、抗体に対するタンパク質の特異的結合の結果である。抗体をアレイに配置するならば、これにより、タンパク質同系エピトープに結合する固定化抗体を含むアレイ上の位置にタグ化タンパク質を分布する結果となる。結合の後、アレイを洗浄し、プローブし、そしてルシフェラーゼを用いるような、例えば酵素学的標識により当業者に既知の任意の方法により分析する。例えば、分析は、フォトマルチプライヤーチューブのようなディテクター、光ダイオードアレイまたは好ましくは放出する光を検出する電荷結合素子（ＣＣＤ）に基づくイメージングディテクターを用い光子コレクションにより実施し得る。光子は、局所的酵素学的化学ルミネセンス、特に生体ルミネセンス反応により生じ得る。光子コレクションが好ましい。比較的安価で、非常に感度がよく、その感度は、収集時間を増やすことにより増幅し得るからである。
【０２０１】
例として、探索を用い、活性の増加を供与するルシフェラーゼ酵素に対する変異を同定するならば、当該アレイは洗浄し、サブストレート中に浸し、次いで、光子の出力を増加することによる測定としてルシフェラーゼ活性の増加に関し分析する。アレイ中の「最も明るいスポット」は、最も好都合の変異を有する酵素と結合する。
【０２０２】
他の例として、探索を用い、抗原に対する抗体の親和性の増加を同定するならば、当該アレイを洗浄し、次いで、タグ化抗原でインキュベーションする。抗原をビオチン、または抗体−ＨＲＰ複合体でタグ化するならば、タグが定義エピトープであるならば、抗原のタグを用い、ストレプアビジン結合ＨＲＰのような二次検出試薬に結合させる。再び、「最も明るいスポット」は、最も多い抗原量を結合する、最も高い親和性を有する変異抗体を含む。
【０２０３】
「最も明るいスポット」の位置およびそのスポットにおける抗体のエピトープ結合特異性を知るため、目的変異遺伝子と結合するＥ配列を同定する。ソートのこの時点で、目的の遺伝子の鋳型（図４に示すような）は、Ｆ１５０サブライブラリー中にあることおよびＥ２３配列を含むことが判る（Ｆ１５０／Ｆ２２３）。
【０２０４】
Ｅ２３配列を含む遺伝子は、Ｆ１５０サブライブラリーからの鋳型ＤＮＡおよびＥ２３配列（ＦＡ２３ Ｅ Ｃ）に相当する配列を有するＰＣＲプライマーを用い増幅し得る。マスターライブラリーを最初に分けるために使用するＤ Ｃセットのプライマーのように、ＦＡ Ｅ Ｃセットのプライマーを用い、特異的Ｅ配列を含む鋳型を増幅させ、同時に増幅遺伝子中にＥ配列を再分布する。ＦＡ Ｅ Ｃプライマーは、３つの機能性領域から構成される。ＦＡ領域は、鋳型中に存在するＥ配列の上流フラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａ）に相当する配列を含む。ＦＡ領域は、ハイブリダイゼーション特異性を供与するが、翻訳においては、エピトープ結合特異性を供与しない任意量のＥ配列を含む。前の通り、Ｅ領域は、エピトープ配列をコードし、Ｃ領域は、増幅の共通領域をコードする。ＦＡおよびＥ配列は遺伝子のコード領域とインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）である。生ずる増幅遺伝子は、Ｆ２サブライブラリー（Ｆ２２３）を示す。
【０２０５】
Ｆ２サブライブラリーからの増幅遺伝子をインビトロで発現させ、抗体アレイでインキュベーションし、再プローブ化し、分析する。前の通り、このアレイ中の「明るいスポット」は、目的変異遺伝子と結合するＥ配列を同定する。ソートにおけるこの点において、目的の遺伝子（図４に示すように）から、Ｆ１５０およびＦ２２３サブライブラリー中にあること、およびＥ４５配列（Ｆ１５０／Ｆ２２３／Ｆ３４５）を含むことが判る。この情報から、Ｅ４５配列（ＦＢ４５ Ｃ）に特異的なプライマーを用い増幅し得る特定遺伝子が同定される。ＦＢ Ｃプライマーは、２つの機能性領域からなる。ＦＢ領域は、鋳型中に存在するＥ配列の下流フラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｂ）に相当する配列を含む。ＦＢは、Ｅのすべてまたは一部を含み得る；Ｃは任意である。ＦＢは、ハイブリダイゼーション特異性を供与するＥコード化配列までおよびすべてを含む任意の部分を含む。前の通り、Ｃ領域は、増幅のための共通配列をコードする。生ずる増幅化遺伝子は、Ｆ３サブライブラリー（Ｆ３４５）を表す。
【０２０６】
Ｇ．組換え抗体の同定
技術の他の適用は、組換え抗体の同定のための使用である。望ましい特性を有する抗体を組換え抗体遺伝子の巨大なプールから選別する。組換え抗体ライブラリーを構成するための標準的方法の概観を図５に示している。最初のステップには、脾臓細胞（ｓｐｌｅｅｎｏｃｙｔｅ）または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離したｍＲＮＡから組換え抗体遺伝子をクローニングすることが含まれる。機能性抗体フラグメントは、可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖遺伝子の遺伝学的クローニングおよび組換えにより作製され得る。ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子は、脾臓細胞またはＰＢＬから単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに最初に逆転写することによりクローニングする。ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子の特異的増幅は、これらの遺伝子に隣接する共通領域に相当するＰＣＲプライマーのセットで行う。ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子をリンカーＤＮＡ配列と合わせる。単一鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の典型的リンカー配列は、アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする。ＶＨ−リンカー−ＶＬ遺伝子は、ＰＣＲでアセンブルされ、増幅され、その産物は、直接転写および翻訳され得、発現プラスミド中にクローニングされ、次いで、インビトロまたはインビボの何れかで発現され、機能性組換え抗体フラグメントを産生する。
【０２０７】
組換え抗体ライブラリー構成の方法は、本明細書のソーティング方法を用いる使用に適用され得る。これは、Ｅ Ｄ Ｃ配列を、ＶＨ鎖およびリンカー配列でアセンブルする前のＶＬ鎖遺伝子中に組込むことにより、行う。組換え抗体ライブラリーをＥ Ｄ Ｃ配列でタグ化した後、Ｆ１サブライブラリーへ分け、その後、上記のようなアレイでスクリーニングすることによりソートする。
【０２０８】
２種の方法は、Ｅ Ｄ Ｃ配列の増幅ＶＬ鎖遺伝子中への組込みに関し、解説している。第一の方法では、Ｅ Ｄ Ｃ配列は、第一鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの部分であり、第二の方法におけるｃＤＮＡ合成（図６）の間に組込まれ、Ｅ Ｄ Ｃ配列は、二本鎖ＤＮＡリンカー分子の添加によりｃＤＮＡ合成（図７）後に組込まれる。
【０２０９】
図６は、どのようにＥ Ｄ Ｃ配列が、プライマー組込みによりＶＬ鎖遺伝子に置かれるのかを示している。ＶＨ鎖遺伝子は、標準的方法を用いクローニングする。脾臓細胞またはＰＢＬから単離されるｍＲＮＡは、普遍的オリゴｄＴプライマーまたはＩＧ遺伝子特異的プライマーを用いｃＤＮＡに変換される。ＶＨ遺伝子は、次いで、これらの遺伝子に隣接する共通配列に相補的なプライマーセットを用い特異的に増幅される。ＶＨＢＡＣＫプライマーはまた、アセンブル化遺伝子のインビトロ転写および翻訳に必要なプロモーター配列を含み、および／または以下に限らないが細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞のような細胞中でインビボ発現するためプラスミドベクター中にサブクローニングし得る。
【０２１０】
ＶＬ遺伝子は、ＶＬ遺伝子（Ｊｋａｐｐａ ｆｏｒ）およびＥ Ｄ Ｃ配列に隣接する下流共通配列に相補的な配列のセットを含む逆転写プライマー（ＶＬＦＯＲ）のセットを使用しクローニングする。ＥＤＣ配列は、ＶＬＦＯＲプライマー中の配列のために５’からＪｋａｐｐａ向きに位置する。ｃＤＮＡの第二鎖を、ＶＬ遺伝子（Ｖｋａｐｐａ ｂａｃｋ）の上流共通領域に対し相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド（ＶＬＢＡＣＫ）を使用しプライムする。第二鎖ｃＤＮＡ合成後、ＶＬ遺伝子をＶＬＢＡＣＫおよびＶＬＦＯＲ−Ｃプライマーの組み合わせで増幅する。ＶＬＦＯＲ−Ｃプライマーは、ＥＤＣ配列のＣ領域に相補的な配列からなる。
【０２１１】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅の後、当該フラグメントを、制限酵素で消化し、リンカーを有するオーバーラッピング末端を作る。ＶＨ−リンカーＶＬフラグメントを、ＤＮＡリガーゼでシールし、次いでＶＨＢＡＣＫおよびＶＬＦＯＲ−Ｃプライマーを用い増幅する。
【０２１２】
図７で示す第二の方法では、ＶＨ遺伝子は、上記のように増幅する。この方法は、ＶＬ遺伝子第一鎖合成が、特有制限部位５’からＪｋａｐｐａ ｆｏｒ配列までを含むオリゴヌクレオチドでプライムする、最初とは異なる。この制限部位を、特有の結合力のある末端を制限酵素消化により生じ得るように、生ずるｃＤＮＡの３’−末端に組込む。当該リンカーを切断ｃＤＮＡと混合し、リガーゼでシールし、次いで、ＶＨＢＡＣＫおよびＶＬＦＯＲ−Ｃプライマーの組合せで増幅させる。
【０２１３】
図８は、組換え抗体ライブラリーを探索するための方法を概説する。ＶＨおよびＶＬ遺伝子を上記のようにクローニングし、ＥＤＣ配列を抗体遺伝子の３’末端に加え、マスターライブラリーを作製する。Ｆ１サブライブラリーを、ＤＣセットのＰＣＲプライマーを用い作製する。当該解説は、１００のＦ１サブライブラリーを示し、Ｆ１２、Ｆ１５０およびＦ１９９のＤＣプライマーを示し、Ｆ１５０反応からの増幅産物を示す。
【０２１４】
Ｆ１５０サブライブラリー遺伝子の転写および翻訳は、含まれているエピトープ（Ｅ配列）によりランダムにグループ化され得る、抗体のような種々の組換え捕捉試薬を作製する。発現タンパク質をアレイ上で浸し、特異的エピトープタグを結合する抗体を含むアレイ中のスポット上にソートし得る。サブライブラリーＦ１５０からのｓｃＦｖをアレイに結合させた後、標識抗原をアレイ上で浸す。抗原における標識は、ストレプアビジン結合ＨＲＰのような第二検出試薬への結合に使用されるビオチンのような化学的タグであり得、または当該抗原をエピトープタグ化し得、検出は、抗エピトープ抗体ＨＲＰ複合体で行い得る。結合後、当該アレイを洗浄し、プローブ化し、分析する。分析は、典型的には、ＣＣＤに基づくイメージングディテクターを用い光子コレクションにより行い、光子は、典型的には、局所性酵素学的化学ルミネセンス反応により生ずる。再び、「最も明るいスポット」が、最も多い量の抗原に結合する最も親和性のある組換え抗体を含む。
【０２１５】
「最も明るいスポット」の位置およびそのスポット中の抗体のエピトープ結合特異性を知るため、目的の組換え抗体と結合するＥ配列を同定する。ソートにおけるこの点で、目的の遺伝子の鋳型（図８に示すような）が、Ｆ１５０サブライブラリー中に位置し、Ｅ２３配列を含むことがわかる。
【０２１６】
Ｅ２３配列を含む遺伝子を、Ｆ１５０サブライブラリーからの鋳型ＤＮＡおよびＥ２３配列（ＦＡ２３ Ｅ Ｃ）に相当する配列を有するＰＣＲプライマーを用い、増幅し得る。マスターライブラリーを最初に分けるために使用するＤ Ｃセットのプライマーのように、ＦＡ Ｅ Ｃセットのプライマーを、特異的Ｅ配列を含む増幅鋳型に使用し、同時に増幅遺伝子中のＥ配列を再分布する。ＦＡ２３ＥＣプライマーを用い、Ｆ１５０サブライブラリー由来の鋳型ＤＮＡを増幅する。生ずる増幅遺伝子は、Ｆ２サブライブラリー、Ｆ２２３を示す。目的の抗体の最初の整列（ｌｉｎｅａｇｅ）はＦ１５０／Ｆ２２３である。
【０２１７】
Ｆ２サブライブラリーからの増幅遺伝子は、インビトロまたはインビボシステム中で発現し、抗体アレイと共にインキュベーションし、再プローブ化し、分析する。前の通り、このアレイ中の「明るいスポット」は、目的の組換え抗体遺伝子と結合するＥ配列を同定する。ソートのこの点において、目的の遺伝子（図８に解説するような）は、Ｆ１５０およびＦ２２３サブライブラリー中にあり、Ｅ４５配列（Ｆ１５０／Ｆ２２３／Ｆ３４５）を含むことが判る。この情報は、Ｅ４５配列（ＦＢ４５Ｃ）に特異的なプライマーを用い増幅し得る特定遺伝子を同定する。この生ずる増幅遺伝子は、単一型の組換え抗体を含むＦ３サブライブラリー（Ｆ３４５７７）を示す。
【０２１８】
Ｈ．結合抗原の検出
結合ポリペプチドタグ化分子は、当業者に既知の任意の適当な方法により検出され得、それは、標的分子の機能を有する。例示の検出方法は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）システムおよびルシフェリン／ルシフェラーゼシステム、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、標識抗体、フルオロホアおよびアイソトープのような化学ルミネセンスおよび生体ルミネセンス生成試薬の使用を含む。これらは、フィルム、光子コレクション、スキャンニングレーザー、ウエーブガイド、エリプソメトリー、ＣＣＤおよび他のイメージング手段を用い検出し得る。
【０２１９】
記載の通り、アドレス可能抗タグ捕捉試薬コレクションの使用には、以下に限らないが、単一抗原または複数抗原を見つけることを含む（これらに限らない）ｓｃＦＶを同定する組換え抗体ｓｃＦｖライブラリーの探索；タグ化変異ライブラリーを含む変異ライブラリーの探索；エラープロンＰＣＲによる変異；小分子バインダーの探索、抗体親和性増加の探索、遺伝子特性の促進の探索（ＡＰ、ＨＲＰ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）のための遺伝子シャッフリングによる変異；配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の探索；タンパク質−タンパク質相互作用のためのｃＤＮＡライブラリーの探索；および任意の他のそのような応用が含まれる。
【０２２０】
実施例
以下の実施例は、解説目的のためだけに含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【０２２１】
実施例１
抗タグ抗体コレクションの調製
Ａ．抗体−タグ対のコレクションの作成
ペプチドタグに結合する抗体のコレクションを使用し、タグに結合する分子をソートする。ポリペプチドタグに特異的に結合する抗体のコレクションは、種々の方法により生じ得る。２例を以下に述べる。
【０２２２】
１．ハイブリドーマスクリーニング
第一の例では、アレイに対し高親和性および高特異性の抗体を、ペプチドエピトープのランダムコレクションを発現するファージディスプレイライブラリーに対し個々のハイブリドーマ細胞のランダム選択化コレクションをスクリーニングすることにより、同定する。ハイブリドーマ細胞は、骨髄腫細胞と、天然（非免疫化）マウスから単離された脾臓細胞（ｓｐｌｅｅｎｏｃｙｔｅ）との融合により作製する。適当な培養を行った後、おおよそ１０−３０，０００の個々の細胞クローン（モノクローナル）が単離され、９６ウェルプレートに別々に増殖させる。このコレクションからの培養上清を、有意な量の抗体を分泌する培養物を同定するための抗ＩｇＧ抗体を用いるＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。抗体産生が低い培養は中止する。このモノクローナルコレクション由来の抗体を、ハイスループット９６ウェル精製方法を用い培養上清から別々に親和性精製し、当該量を精製し、定量した。
【０２２３】
精製抗体を、フィルター上へのロボットスポッティングによりアレイし、また、次いで、常磁性ビーズに結合させて別々に混合し、ランダムシステイン束縛七量体アミノ酸配列（ｒａｎｄｏｍ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｈｅｐｔａｍｅｒｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をディスプレイする繊維状Ｍ１３バクテリオファージライブラリーから高親和性エピトープをパンニングするサブストレートを作成する。当該ファージライブラリーを、ファージライブラリーを抗体被覆ビーズと混合し、ビーズからの遊離性結合ファージ（ｌｏｏｓｅｌｙ−ｂｏｕｎｄ ｐｈａｇｅ）を洗浄することにより高親和性エピトープをディスプレイするファージとして富化する（パンニング）。数ラウンドのパンニングにより、コレクション中に存在するモノクローナル抗体に強固に結合するファージを含むライブラリーが高富化される。高親和性ファージ抗体対を分離および同定するため、富化ファージライブラリーを、高緊縮結合条件下でアレイ化抗体を含むフィルターでインキュベーションする。フィルターにおける抗体に結合するファージを、ＨＲＰ結合抗ファージ抗体および化学ルミネセンスサブストレートで染色し、ルミネセンスシグナルを生じさせることにより同定する。当該シグナルは、ハイレゾリューションＣＣＤカメライメージング装置を用いを定量する。高親和性結合ファージを、フィルターから回収し、増殖させる。個々のスポットから回収した幾つかの独立ファージクローンを配列決定し、相当する抗体として共通高親和性エピトープを同定する。
【０２２４】
ａ．ハイブリドーマの作成
ハイブリドーマ細胞は、当業者に既知の方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）により調製する。ハイブリドーマ細胞は、マウス脾臓細胞（ｓｐｌｅｅｎｏｃｙｔｅ）とマウス骨髄腫細胞の融合により作製する。融合の場合、非免疫化マウスの脾臓から単離した抗体産生細胞を、骨髄腫細胞と混合し、融合する。他に、ハイブリドーマ細胞は、異なるエピトープタグの混合物を含む組換えタンパク質（例えば、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ＤＨＦＲ）で事前に免疫化したマウスから単離した脾臓細胞（ｓｐｌｅｅｎｏｃｙｔｅ）から作製し、担体に結合する（すなわち、Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、ＫＬＨ）。当該エピトープタグは、ＤＨＦＲ遺伝子との遺伝学的融合物の一部として発現するランダムシステイン束縛化（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅ）ペプチドである。当該ランダムペプチドは、合成変性オリゴヌクレオチドからアセンブルされるＤＮＡ挿入物によりコードされており、繊維状バクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇＩＩＩ）中へクローニングする。ペプチドライブラリーをコードするＤＮＡは、商業的に利用可能である（Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７ＣＴＭ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７ＣＴＭライブラリーはおおよそ３．７×１０９種のペプチドを含む。
【０２２５】
融合後、細胞を選択培地中に希釈し、マルチウェル組織培養ディッシュ中にプレートする。マウス骨髄腫細胞の自然で（ｈｅａｌｔｈｙ）、迅速な分割培養物を、２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および２×ＯＰＩを含む培地２０ｍｌ中に希釈する。培地は、典型的にＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修飾Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥ）またはＲＰＭＩ１６４０培地である。培地の成分は既知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）。抗体産生細胞は、マウスからの脾臓の無菌切除および細胞中への脾臓破壊、および２×ＯＰＩ培地での洗浄による巨大組織の切除によって、調製される。典型的なマウス脾臓は、おおよそ５×１０７から２×１０８リンパ球を含む。調製されるハイブリドーマが任意の抗原に対する免疫によって富化されることはないため、１を超えるマウスからの脾臓を使用し、細胞を混合する。当数の脾臓細胞および骨髄腫細胞を遠心分離（４００×ｇで５分間）でペレットとし、当該ペレットを、血清のない培地５ｍｌに別々に再懸濁し、次いで合わせる。４３％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液を加え、０．８４％とする。当該細胞をＰＥＧ含有培地中にゆっくりと再懸濁し、次いで、４００×ｇで５分間の遠心分離により再ペレット化し、２０％ＦＢＳを含む培地５ｍｌ中の再懸濁液により洗浄し、再ペレットし、２０％ＦＢＳ、１×ＯＰＩおよび１×ＡＨ（ＡＨは選択培地である；１×ＡＨは５．８μＭアザセリンおよび０．１ｍＭヒポキサンチン）の上清培地で２回洗浄する。細胞を３７℃でＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションする。クローンは４日後、顕微鏡で見ることができる。
【０２２６】
ｂ．ハイブリドーマ細胞の単離
安定ハイブリドーマを、乏しい培地（ｐｏｏｒ ｍｅｄｉｕｍ）中で数日間増殖させることにより選択する。次いで、培地を新しい培地と置換え、単一ハイブリドーマを制限希釈クローニングにより単離する。ハイブリドーマ細胞は非常に低いプレーティング効率を有するため、単一細胞クローニングは、フィーダー細胞またはコンディション化培地の存在下、行う。新しく単離した脾臓細胞を、通常組織培地条件下では増殖せず、ハイブリドーマ細胞の拡大の間に喪失するフィーダー細胞と同様に使用し得る。この手順では、脾臓は、外観的にマウスから取除き、破壊する。放出細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地中で繰り返し洗浄する。脾臓は、典型的に、１０６細胞／ｍｌで１００ｍｌ生ずる。当該フィーダー細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり５０μｌでプレートし、２４時間増殖させた。自然のハイブリドーマ細胞を、２０％ＦＢＳ、２×ＯＰＩを含む培地中に、ｍｌあたり２０細胞の濃度に希釈する。細胞は、できるだけ遊離のクランプとなる。希釈化ハイブリドーマ細胞５０μｌをフィーダー細胞に加え、最終体積１００μｌとする。クローンは、４日で現れ始める。他に、単一細胞は、単一細胞を個々にピペッティングすることによる単一細胞ピッキングにより単離し得る。単一細胞はまた、軟寒天中での増殖により得られ得る。一旦、自然な安定な培養が行われると、当該細胞は、１０％ＦＢＳで上清化したＤＭＥ（またはＲＰＭＩ１６４０）培地中での増殖により維持される。安定な細胞を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような凍結防止剤を含む培地中でゆっくりと凍結させることにより液体窒素中で保存し得る。細胞により生ずる特定量の抗体を、ＥＬＩＳＡ法により培地上清中の抗体量を測定することにより決定する。
【０２２７】
２．ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
個々の培養上清からの抗体精製を親和性結合により行う。親和性結合サブストレートの数が利用可能である。下記の手順は、固定化プロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む商業的に利用可能なサブストレートに基づいており、製造者指示手順に従っている。端的に、培養上清を１：１で結合緩衝液（０．１Ｍ ホスフェート、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．２）で希釈し、０．２ｍｌまでの希釈サンプルを、結合緩衝液を事前に装備したＲｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ Ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）に適用する。ウェルを３×０．２ｍｌ結合緩衝液で洗浄する。２×０．１ｍｌの溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．８）で結合抗体を溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２０μｌと合わせる。９６ウェルフィルタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）と組合せてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過を用い精製抗体を脱塩する。
【０２２８】
ファージパンニングサブストレートを作製するため、上記のように別々に精製した抗体をあわせ得る。他に、精製抗体混合物は、プール化培養上清からバッチ精製により得られ得る。乏しい培地上清からの抗体の精製はまた、親和性結合により行う。多数の親和性結合サブストレートが利用可能である。下記の手順は、固定化プロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む商業的に利用可能なサブストレートに基づいており、製造者が指示する手順に従う。端的に、培養上清を結合緩衝液で１：１に希釈し、４ｍｌまでの希釈サンプルを、結合緩衝液で事前に装備したＡｆｆｉｎｉｔｙ ＰａｃｋＴＭ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ Ｃｏｌｕｍｎ （Ｐｉｅｒｃｅ）に適用する。結合緩衝液２０ｍｌでカラムを洗浄し、または２５０ｎｍの吸収がバックグラウンドに帰する（ｒｅｔｕｒｎ）まで洗浄する。結合抗体を６−１０ｍｌの溶出緩衝液で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５を含む１ｍｌ画分中に回収する。吸収２８０ｎｍおよび乏しい適当画分により結合タンパク質の放出をモニターする。ＥｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅＴＭ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い精製抗体を脱塩する。
【０２２９】
３．フィルター上への抗体のアレイイング
個々のハイブリドーマ培養物から精製する抗体を、自動化アレイイングツール（ＰｉｘＳｙｓ ＮＱナノリッター分配ワークステーション、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ； ＢｉｏＣｈｉｐ Ａｒｒａｙｅｒ； Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ； Ｔｏｔａｌ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ； ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ； Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ； Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用い、１μｇ−１ｍｇ／ｍｌ濃度で０．１Ｍ ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ｐＨ７．４の緩衝液中、１μｌを膜（ＵｌｔｒａＢｉｎｄ膜、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ；ＦＡＳＴニトロセルロース被覆スライド、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にスポットする。当該スポットを１−２分間、風乾する。ＵｌｔｒａＢｉｎｄ膜は、第一級アミンと反応する活性化アルデヒド基を含み、膜と抗体との間で共有結合を形成する。非反応アルデヒドは、３０分間、５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液でインキュベーションすることによりブロックされる。当該フィルターは、５０ｍＭ ＰＢＳでリンスし得、次いで完全に風乾させる。
【０２３０】
４．常磁性ビーズにおけるファージディスプレイライブラリーのパンニング
繊維状バクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇＩＩＩ）に対するＮ末端遺伝学的融合の一部として発現するランダムシステイン束縛化ペプチドを含むファージライブラリーは、本質的に記載されているように構成される（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。ランダムペプチドは、合成変性オリゴヌクレオチドからアセンブルされるＤＮＡ挿入物によりコードされており、ｇＩＩＩにクローニングされる。これらのライブラリーは、商業的に利用可能である（Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７ＣＴＭ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７ＣＴＭライブラリーは、おおよそ３．７×１０９独立クローンを含む。
【０２３１】
Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７ＣＴＭライブラリーからの２×１０１１ファージビリオンを、マウスＩｇＧのＦｃドメイン（Ｄｙｎａｌ； このモノクローナルはヒト抗体に結合しない）に特異的な精製抗体３００μｇおよびヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体と合わせ、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で最終体積０．２ｍｌとする。抗体の最終濃度はおおよそ１０ｎＭである。室温で２０分間インキュベーションする。
【０２３２】
ファージ抗体溶液をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ）と合わせる。当該ビーズを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ、０．０２％アジド化ナトリウム中の懸濁液として供給する。ビーズを、ファージと混合する前に数回、ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄する。当該ビーズは磁石（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ， Ｄｙｎａｌ）の適用により溶液から分離する。ファージ抗体溶液を加え、０．１μｇ／１０７ビーズの濃度とし、ゆっくりとチルティングおよびローテーションしつつ４℃で３０分間インキュベーションする。ヒト抗体の包含により、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに固定化したヒト抗体に結合するファージの選択を妨げる。加えて、ブロッカーとしての溶解ヒト細胞からのヒトタンパク質の包含は、ヒト細胞中にも存在するファージエピトープの選択を妨げる。当該選択抗体ファージ対は、試験するサンプル中に天然に存在するタンパク質と拮抗しない。
【０２３３】
当該方法の次のステップで、磁石を使用し液体から取除き、ＴＢＳＴ１ｍｌの洗浄緩衝液中にビーズを懸濁する。洗浄ステップを１０回繰り返す。最後の洗浄ステップ後、０．２Ｍ グリシンＨＣｌ、ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（１ｍｌ）中にビーズを懸濁し、液体回収前に室温で１０分間インキュベーションすることにより、捕捉ファージを溶出する。回収液体のｐＨは１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．１（０．１５ｍｌ）を加えることにより直ちに中性化する。溶出液の少量のアリコートを、ＬＢ−Ｔｅｔプレート上でＥＲ２７３８大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）を伝染させることにより力価する。
【０２３４】
ＥＲ２７３８ Ｅ． ｃｏｌｉのｍｉｄ−ｌｏｇ培養物２０ｍｌの添加により溶出液を増幅し、４．５時間ＬＢ−Ｔｅｔ中で増殖させる。１０，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によりＥ． ｃｏｌｉ細胞からファージビリオンを分離し、新しいチューブに移す。繰り返して、８０％を超える上清を新しいチューブに移す。１／６体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ ｗ／ｖポリエチレングリコール−８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を添加し、その後、一夜４℃で沈殿させることにより濃縮する。当該ファージを１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより回収し、当該ペレットをＴＢＳ１ｍｌ中に再懸濁する。微小遠心分離チューブ中でＰＥＧ／ＮａＣｌを用いファージを再沈殿し、当該ペレットをＴＢＳ０．２ｍｌ、０．０２％アジド化ナトリウム中に再懸濁した。微小遠心分離を１分間行い、任意の残りの物質を取除く。上清は増幅化溶出液である。増幅化溶出液を力価し、上記のように３回パンニングを繰り返す。個々のラウンドのパンニングおよび増幅により、ファージのプールは、抗体に結合するファージとして富化する。インプットとして使用するファージの濃度を一定に保つならば、回収されるファージの数は増大する。ファージは、４℃で保存するか、滅菌グリセロールで１：１に希釈し−２０℃で保存する。
【０２３５】
５．ファージによる抗体アレイの染色
個々の培養上清から調製するアレイ化抗体を含むフィルターを富化ファージライブラリーでプローブする。この方法は、標準的ウェスタンブロッティングまたはドットブロッティング手順と類似する。端的に、ブロック化フィルターは、ＴＢＳＴ、ｐＨ７．４、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中で再水和し、１時間４℃でインキュベーションする。ファージを加え、濃度２×１０１１ファージ／ｍｌとし、室温で３０分間フィルターと共にインキュベーションする。ハイブリダイゼーション溶液を回収し、当該フィルターをブロッキング溶液（ＴＢＳＴ、ｐＨ７．４、０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよびヒト細胞由来可溶性タンパク質）で大量に洗浄する。ブロッキング溶液に、１ｍｇ／ｍｌストック濃度から、ブロッキング緩衝液中で１：１００，０００から１：５００，０００希釈したＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体を加え、１時間ゆっくりと振盪しつつインキュベーションする。少なくとも４から６回、ＴＢＳＴで膜を洗浄する。当該ブロットを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｐｉｅｒｃｅ）中に５分間、完全に濡らす。当該フィルターを、オートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ）にさらすことによりイメージし得るか、またはホスホイメージャー（ＢｉｏＲａｄ）のようなイメージング装置または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ａｌｐｈａｌｎｎｏｔｅｃｈ； Ｋｏｄａｋ）のようなイメージング装置を用いイメージ化し得る。
【０２３６】
６．フィルターからのファージの回収およびエピトープの配列決定
ファージは、イメージングから同定されたファージを含むスポットを切除することによりフィルターから回収され得る。ファージは、０．２Ｍ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（０．５ｍｌ）中のフィルター切片を再懸濁し、液体を回収する前に１０分間室温でインキュベーションすることにより、フィルターから溶出させる。回収液のｐＨは、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．１（０．０７５ｍｌ）を加えることにより直ちに中性化される。溶出液の少量のアリコートを、ＬＢ−Ｔｅｔプレート上でＥＲ２７３８ Ｅ． ｃｏｌｉを伝染させることにより力価する。単離プラーク（典型的に１０プラーク）をＤＮＡ単離のためにピックし、共通エピトープの定義のために配列決定する。プラークは、滅菌ピペットチップまたは爪楊枝を用い自然なｍｉｄ−ｌｏｇ培養物から新しく１：１００に希釈したＥＲ２７３８ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞の培養物１ｍｌを接種し、振盪しつつ４から５時間３７℃でインキュベーションすることにより増幅する。ファージは、３０秒間微小遠心分離により回収し、新しいチューブに上清０．５ｍｌを移し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ０．２ｍｌを加え、ゆっくりと１０分間混合した後、室温で静置し得る。ファージを、遠心分離の最高速度で１０分間、微小遠心管中で遠心分離することによりファージをペレットとする。任意の残りの上清を廃棄し、当該ペレットをイオジン緩衝液０．１ｍｌおよびエタノール０．２５ｍｌ中に完全に懸濁し、単一鎖ＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾する。ＤＮＡを標準的方法で配列決定する。
【０２３７】
Ｂ．選択的感染
ファージディスプレイのような選択的感染技術を用い、タンパク質−タンパク質対の相互作用を同定する。これらシステムは、細菌と感染ウイルス（ファージ）との間の感染プロセスを仲介する、タンパク質−タンパク質相互作用の必要性に有利となる。繊維状Ｍ１３ファージは、細菌のＦ線毛に最初に結合することによりＥ． ｃｏｌｉに通常感染する。当該ウイルスは、ｔｒａＡ遺伝子によりコードされるＦ線毛タンパク質の個別領域における線毛に結合する。この結合は、ファージのチップにおけるマイナーコートタンパク質（プロテイン３）により仲介される。Ｆ線毛タンパク質におけるファージ結合部位（ｔｒａＡ遺伝子における１３アミノ酸配列）を工作し、ファージ結合部位のランダム混合物を発現する細菌の巨大な群を作製する。
【０２３８】
ファージコートタンパク質（プロテイン３）をまた、工作し、別種の単一鎖抗体構造のライブラリーを示す。細菌の感染およびウイルスのインターナリゼーションは、そのため、適当な抗体ペプチドエピトープ相互作用により仲介する。細菌およびウイルスＤＮＡに適当な抗生物質耐性マーカーを置くことにより、個々のコロニーは、抗体およびそれに相当するペプチドエピトープの両方の遺伝子を含むように選択し得る。組換え抗体ファージは、非免疫化マウスから調製したライブラリーをディスプレイし、ｔｒａＡ遺伝子中のファージ結合部位中にランダムペプチド配列を含む細菌株は商業的に利用可能である（Ｂｉｏｌｎｖｅｎｔ， Ｌｕｎｄ， Ｓｗｅｄｅｎ）。組換え抗体ライブラリーの作製を以下に記載する。
【０２３９】
Ｃ．抗体の発現および精製
ハイブリドーマ上清からの抗体の精製は、親和性結合により行う。多くの親和性結合サブストレートが利用可能である。下記の手順は、固定化タンパク質Ｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む商業的に利用可能なサブストレートに基き、製造者が指示する手順に従う。端的に、培養上清を結合緩衝液（０．１Ｍ ホスフェート、０．１５Ｍ塩化ナトリム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．２）で１：１に希釈し、４ｍｌまでの希釈サンプルを、結合緩衝液を事前に装備したＡｆｆｉｎｉｔｙ ＰａｃｋＴＭ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）に適用する。カラムを結合緩衝液２０ｍｌで洗浄し、または２５０ｎｍの吸収がバックグラウンドに帰する（ｒｅｔｕｒｎ）まで洗浄する。結合抗体を６−１０ｍｌの溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ２．８）で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（１００μｌ）を含む１ｍｌ画分中に回収する。吸収２８０ｎｍおよび乏しい適当画分により結合タンパク質の放出をモニターする。ＥｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅＴＭ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い精製抗体を脱塩する。当該精製を適当にスケールし得る。他に、抗体は、プロテインＡ（またはプロテインＧ）、ＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＦＰＬＣクロマトグラフシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する親和性クロマトグラフィーにより精製し得る。製造者が指示するプロトコールに従う。
【０２４０】
組換え抗体は、発現し、記載のように精製する（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）。端的に、組換え抗体をコードする遺伝子を誘導可能プロモーターを含む発現プラスミド中にクローニングする。活性組換え抗体の産生は、多数の分子内ジスルフィド結合の形成に依存する。細菌細胞質の環境は縮小し、そのため、ジスルフィド結合形成が妨げられる。この問題の１つの解決は、分泌シグナルペプチドを、ペリプラズムの非縮小環境への輸送を指示する抗体に遺伝学的に融合することである（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ４９３７−４９４２）。
【０２４１】
他に、抗体は、不溶性のインクルージョンボディーとして発現し、ジスルフィド結合の形成を促進する条件下、インビトロでリフォールディングし得る。適当な抗生物質を含むＬＢ培地０．５Ｌに接種し、３２℃で１０時間振盪する。産生培地（リッターあたり、３ｇ硫酸アンモニウム、２．５ｇリン酸カルシウム、３０ｇカゼイン、０．２５ｇ硫酸マグネシウム、０．１ｍｇ塩化カルシウム、１０ｍｌ Ｍ−６３塩濃度、０．２ｍｌ ＭＡＺＵ ２０４ Ａｎｔｉｆｏａｍ（Ｍａｚｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、３０ｇグルコース、０．１ｍｇビオチン、１ｍｇニコチンアミド、適当な抗生物質、ｐＨ７．４）９．５リッターを接種するためにスターター培地を使用する。ｐＨ７．２でＣｈｅｍａｐ（など）ファーメンターを使用し、発酵させ、分あたり培地に対し１：１ｖ／ｖでエアレーションし、３２℃で８００ｒｐｍで振盪する。６００ｎｍでの吸収が１８−２０に到達したとき、４２℃で１時間加熱し、次いで１０分間１０℃に冷却し、その後、細胞ペーストを７，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞ペーストを回収する。回収は、典型的に、１０リッター発酵物から２００−３００ｇウェット細胞ペーストであり、凍結を維持する。
【０２４２】
組換え抗体を、２．５リッター細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフロリド；ＰＭＳＦ）中に再懸濁することにより、融解細胞ペースから可溶性にし、４℃で維持する。再懸濁細胞をＭａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ細胞ホモジナイザーに３回通過させ、次いで、２４，３００×ｇで３０分間、６℃で遠心分離により不溶性抗体を回収する。当該ペレットを細胞溶解緩衝液１．２リッター中に再懸濁し、ホモジナイゼーションおよび回収を上記のように５回繰り返す。洗浄したペレットを凍結保存し得る。組換え抗体を、細胞ペレットのグラムあたり変性緩衝液（６Ｍ 塩酸グアニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ 塩化カリウム）６ｍｌ中に再可溶化することにより、復元する。２４，３００×ｇ、４５分間、６℃での遠心分離から上清を、変性緩衝液で２８０ｎｍで光学密度２５に希釈し、そして冷（４−１０℃）リフォルディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中にゆっくりと希釈し、１：１０希釈を２時間に渡り行う。当該溶液は、少なくとも２０時間４℃で静置し、その後、０．４５μｍ微小孔膜を通し濾過する。次いで、当該濾液は、約５００ｍｌに濃縮し、その後、ＨＰＬＣを使用し最終精製する。
【０２４３】
濾液は、伝導率がＨＰＬＣ緩衝液ＡのものにマッチするまでＨＰＬＣ緩衝液Ａ（６０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．５ｍＭ 酢酸カルシウム、ｐＨ６．５）で透析する。透析サンプル（６０ｍｇまで）を２１．５ｍｍ×１５０ｍｍポリアスパラギン酸ＰｏｌｙＣＡＴカラムに負荷し、ＨＰＬＣ緩衝液Ａで平衡化し、ＨＰＬＣ緩衝液ＡとＢ（ＨＰＬＣ緩衝液Ｂは、６０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．５ｍＭ 酢酸カルシウム、ｐＨ７．５）との間の５０分間直線状勾配でカラムから溶出させる。残りのタンパク質はＨＰＬＣ緩衝液Ｃ（６０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ７．５）で溶出させる。回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０２４４】
Ｄ．エピトープタグによるタンパク質の捕捉およびその検出のための例示アレイおよびその使用
実施例６にも記載の通り、本明細書の方法の機能化を解説するため、例えば、ヒトインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質エピトープのような異なるペプチドエピトープに対し特異的な捕捉抗体（アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを有する）を、タグに、例えばｓｃＦｖに使用する。例えば、ヒトフィブロネクチン（ＨＦＮ）に対する抗原特異性を有するｓｃＦｖをＨＡエピトープでタグ化し、そのため、ＨＡペプチドに特異的な抗体により認識され、ＨＦＮの抗原特異性を有する分子（ＨＡ−ＨＦＮ）を作製する。
【０２４５】
ニトロセルロース膜のような膜上に抗ＨＡタグ捕捉抗体を含む、捕捉抗体を置いた（ｄｅｐｏｓｉｔ）後、それらを室温および適当な湿度で適当な時間乾燥させる（例えば、１０分間から３時間であり、それは、経験的に決定され得る）。乾燥後、置いた、乾燥した抗ＨＡ捕捉抗体で膜をブロックし、必要ならば、最終濃度０．０５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）となるように加えるＴｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；Ｓｉｇｍａ）を有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１×となるまで希釈した、Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）のようなタンパク質含有溶液でブロックし、膜に非特異的に結合するタンパク質により生ずるバックグラウンドシグナルを除く。本明細書に含まれる後の記載に関し、ＢＢＳＡ−Ｔとしてブロッキング試薬が言及され、０．０５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳをＰＢＳ−Ｔとして言及する。ブロッキング時間は、例えば、３０分間から３時間の間で変化し得る。この手順の下記のその後の全インキュベーション（洗浄を除く）の場合、インキュベーション時間は、約２０分間から２時間の間で変化する。同様に、インキュベーション温度は、室温から約３７℃の間で変化し得る。すべての場合において、正確な条件が経験的に決定され得る。
【０２４６】
置かれた抗ＨＡ捕捉抗体を含む膜のブロッキング後、ペプチドエピトープタグ化ｓｃＦｖを伴うインキュベーションを行い得る。精製ｓｃＦｖ（または、誘導によるｓｃＦｖの発現を目的とするプラスミド構成物を保持するＥ． ｃｏｌｉ培養物からのｓｃＦｖの精製の間に得られる細菌性培養物上清、または異なる粗亜細胞性画分）はＢＢＳＡ−Ｔ中で種々の濃度（例えば、０．１と１００μｇ／ｍｌとの間）に希釈され得る。次いで、置いた抗ペプチドタグ捕捉抗体を有する膜を、このＨＡ−ＨＦＮ ｓｃＦｖ抗原溶液と共にインキュベーションする。置いた抗ＨＡ捕捉抗体および結合ＨＡ−ＨＦＮ ｓｃＦｖ抗原を有する膜を、１またはそれより多い回数（例えば、３回）、ＰＢＳＴで、適当な時間（例えば、洗浄あたり３−５分間）、種々の温度で洗浄する。
【０２４７】
置いた抗ＨＡ捕捉抗体および結合ＨＡ−ＨＦＮ ｓｃＦｃｖ抗原を伴う膜を、ＰＢＳ−Ｔで複数回（典型的には３回）、適当な時間（例えば、典型的には洗浄あたり３から５分間）、種々の温度で洗浄する。置いた抗ＨＡ捕捉抗体および結合ＨＡ−ＨＦＮ ｓｃＦｖを有する膜を、証明目的のために、ビオチン化ヒトフィブロネクチン（Ｂｉｏ−ＨＦＮ）（捕捉ＨＡ−ＨＦＮ ｓｃＦｖにより認識される抗原である）と共にインキュベーションする。Ｂｉｏ−ＨＦＮを連続的にＢＢＳＡ−Ｔで希釈する（例えば、１から１０μｇ／ｍｌ）。生ずる膜を適当な回数（典型的には３）ＰＢＳ−Ｔで、適当な時間（典型的には、洗浄あたり３から５分間）、種々の温度で洗浄し、次いで、連続的に希釈した（例えば、ＢＢＳＡ−Ｔ中１：１０００から１：１００，０００）Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ・ＨＲＰＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共にインキュベーションする。生ずる膜を前の通り洗浄し、ＰＢＳでリンスし、ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｐｉｅｒｃｅ）で現像（ｄｅｖｅｌｏｐｅ）し、次いで、例えば、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０ＣＦまたは他のイメージングシステムのようなイメージングシステムを用いイメージする。１：１のペルオキシド溶液：ルミノール混合物を調製し、少量をイメージステーションのプラテンにプレートする。
【０２４８】
次いで、膜を、アレイサイドを下にプラテンの中央に置き、膜の抗体含有部分の表面領域をカメラレンズのイメージング範囲の中央に位置させる。この方法で、プラテンに存在する少量のディベロッパーは、スライドの抗体含有部分の表面エリア全体に接触し得る。当該イメージステーションカバーを、抗体アレイイメージ捕捉のため閉じる。カメラフォーカス（ズーム）は、イメージする膜の大きさに依存して変化する。露光時間は、現像膜から発出するシグナル強度（明るさ）に依存して変化し得る。カメラｆ−ストップセッティングは、１．２と１６との間で無制限に調節し得る。
【０２４９】
アレイイメージのアーカイビングおよび分析は、例えば、Ｋｏｄａｋ ＩＤ３．５．２ソフトウェアパッケージを用い行い得る。目的の領域（ＲＯＩ）を、捕捉抗体のグループをフレームするソフトウェアを用い描く（アレイ上の既知の位置でプリントする）。正味の、合計の、最小値の、最大値のおよび平均の強度を表す、ＲＯＩ値数、同様に標準偏差およびＲＯＩピクセルエリアは、例えば、ソフトウェアにより自動的に算出される。これらのデータを、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに、統計分析のために変換する。
【０２５０】
実施例２
タグ化ｃＤＮＡライブラリーの調製およびプライマーの調製
ターゲットに対する抗体のアレイを、ソーティング装置として使用する。ｃＤＮＡライブラリー由来のタンパク質をアレイの表面上で浸し、ライブラリータンパク質と遺伝学的に融合するペプチドエピトープを特異的認識し結合する抗体を含むスポットに結合する。このシステムの鍵は、比較的多数の遺伝子（おおよそ１０６から１０９）上の比較的小数のタグ（おおよそ１，０００）にランダムに結合し均等に分布する能力である。タグの、ライブラリー中の遺伝子間での均等な分布を確実とするため、タグは、ＰＣＲ増幅前に遺伝子中に組込まれる。これらの仕事を行うため、種々の方法を本明細書に記載する。
【０２５１】
ｃＤＮＡライブラリー作成のため、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞から最初に単離し、次いで、第二ステップでＤＮＡに変換する。第一ステップでは、酵素ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素；ＲＴａｓｅ）を用いＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子生ずる。次いでＲＮＡ鎖を、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔのようなポリメラーゼのフラグメント）を用い新規に合成したＤＮＡ鎖により、置換する。
【０２５２】
ある方法は、タグのためのＤＮＡ配列を含む第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーのコレクションの使用に依存する。この場合、プライマーは単一鎖オリゴヌクレオチドであり、タグは組込まれ、その後、第二鎖ｃＤＮＡを合成する。第二鎖ｃＤＮＡ合成の後、生ずる分子をＰＣＲで増幅する。他の方法では、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重分子は、定義されたヌクレオチドオーバーハングを生ずるよう切断される新規物質の３’末端における特有制限酵素切断を組込むプライマーを使用し、作製する。リンカーＤＮＡ分子のコレクションは、相補的オーバーハングを含み、タグのためのＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ分子上にライゲーションし、次いでＰＣＲ増幅する。第二の方法では、リンカーは二本鎖分子であり、タグは、第二鎖ｃＤＮＡ合成後、組込まれる。何れの方法も、プライマーまたはリンカーの何れかとして分子の巨大多様性コレクションの生成に依存する。これらの分子の調製を以下に記載する。
【０２５３】
Ａ．方法Ｉ：プライマー伸長
ライブラリー構成は、ｍＲＮＡの単離から始まる。ｍＲＮＡの直接の単離を、オリゴｄＴセルロースを用い親和性精製により行う。この方法のための試薬を含むキットは多数の供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から商業的に利用可能であり、製造者が指示する方法に従い単離する。加えて、多数組織から単離したｍＲＮＡはまた、これらの供給者から直接得られ得る。
【０２５４】
ｃＤＮＡライブラリー構成物は、本質的に記載のように行う（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。第一鎖合成は、以下のものを４℃で最終体積５０μｌで混合することにより行う；１０μｇ ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ）、１０μｇ ＶＬＦＯＲ−共通プライマーミックス（ＶＬＦＯＲ−共通は以下に記載する）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、７０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１ｍＭ）、４ｍＭ ジチオスレイトール、２５ユニットＲＮａｓｅインヒビター、６０ユニットマウス逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。１時間、３７℃でインキュベーションする。第二鎖合成の場合、以下の混合物を第一鎖合成溶液に直接加え、最終体積１４２μｌとし；５ｍＭ 塩化マグネシウム、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１ユニットＲＮＡｓｅＨ、４５ユニットＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、そして室温で１５分間インキュベーションする。この混合物に、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ ５μｌを加え、反応を止める。最終体積を１５０μｌとする。新規合成ｃＤＮＡを同体積のフェノール：クロロホルムでの抽出により精製し、非組込みｄＮＴＰを、１０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．６で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０によるクロマトグラフィーで分離する。溶出ＤＮＡを、０．１×体積の３Ｍ 酢酸ナトリムの添加により沈殿させ、２体積のエタノールで、２５℃で少なくとも１５分間インキュベーションし、１２，０００ｇ、１５分間、４℃の遠心分離により回収し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、次いで、ＴＥ（ｐＨ７．６）８０μｌに溶解する。
【０２５５】
他の方法では、固相合成（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）を用いるｃＤＮＡライブラリーの生成を含む。この方法では、第一鎖ｃＤＮＡ合成として使用するプライマーは固体支持体（常磁性ビーズ、アガロース、またはポリアクリルアミド）に結合する。ｍＲＮＡは、固定化オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることにより捕捉し、逆転写する。ｃＤＮＡの固定は、緩衝液およびプライマーの交換の容易化に利点となる。更に、固相に固定化したｃＤＮＡは、異なるセットのプライマーを用い、同一ライブラリーでの複数回増幅を可能とするｃＤＮＡの安定性を増加する。固相ＰＣＲを用いるプライマー生成を本明細書に記載する；そのプライマーを作製する任意の方法が予期される。
【０２５６】
Ｂ．方法ＩＩ：リンカー融合
方法Ｉに関し、ライブラリー構成は、ｍＲＮＡの単離から始まる。ｍＲＮＡの直接の単離は、オリゴｄＴセルロースを使用する親和性精製により行う。この方法のための試薬を含むキットは多数の供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から商業的に利用可能であり、製造者が指示する方法に従い単離する。加えて、多数組織から精製したｍＲＮＡはまた、これらの供給者から直接得られ得る。
【０２５７】
ｃＤＮＡライブラリー構成物は、本質的に記載のように行う（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。第一鎖合成は、以下のものを４℃で最終体積５０μｌで混合することにより行う；１０μｇ ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ）、１０μｇ ５’制限配列−オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、７０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１ｍＭ）、４ｍＭ ジチオスレイトール、２５ユニットＲＮａｓｅインヒビター、６０ユニットマウス逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｉｃａ）。１時間、３７℃でインキュベーションする。第二鎖合成の場合、以下の混合物を第一鎖合成溶液に直接加え、最終体積１４２μｌとし；５ｍＭ 塩化マグネシウム、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１ユニットＲＮＡｓｅＨ、４５ユニットＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、オリゴ（ｄＴ）プライマーの５’末端部位を認識する制限酵素１Ｕ、そして室温で１５分間インキュベーションする。この混合物に、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（５μｌ）を加え、反応を止める。最終体積を１５０μｌとする。新規合成ｃＤＮＡを同体積のフェノール：クロロホルムでの抽出により精製し、非組込みｄＮＴＰを、１０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．６で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０によるクロマトグラフィーで分離する。溶出ＤＮＡを、０．１×体積の３Ｍ 酢酸ナトリム（ｐＨ５．２）の添加により沈殿させ、２体積のエタノールで、２５℃で少なくとも１５分間インキュベーションし、１２，０００ｇ、１５分間、４℃の遠心分離により回収し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、次いで、ＴＥ（ｐＨ７．６）８０μｌに溶解し、ＤＮＡ濃度を２６０ｎｍ吸収で測定する。次いで、ｃＤＮＡライブラリーを、ｃＤＮＡ分子の３’末端を消化する制限に特有リンカーを加えることによりタグ化する。リンカーは下記のように調製し、同数のｃＤＮＡおよびリンカー分子、１０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１００Ｕ／μｌ）、１μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ、１μｌ ライゲーション緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴ、５００μｇ ＢＳＡ）を含み、水で最終体積１０μｌとした反応物中で精製ｃＤＮＡにライゲーションし、４時間１６℃でインキュベーションする。ライゲーション後、ｃＤＮＡを、リンカー特異的プライマーを用い増幅する。ＰＣＲ条件は、３５μｌ 水、５μｌ Ｔａｑ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１．５μｌ ５ｍＭ ｄＮＴＰミックス（濃度１．２５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰを有するｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの等モル）、２．５μｌ リンカー特異的プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、２．５μｌ ＶＨＢＡＣＫプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、２．５μｌ ｃＤＮＡであり、２滴のミネラルオイルをオーバーレイする。９４℃に加熱し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを添加する。９４℃１分間、５７℃１分間、７２℃２分間の３０サイクルを用い増幅する。ＰＣＲ反応物に、７．５Ｍ 酢酸アンモニウムを、最終濃度２Ｍとなるように加え、１体積のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、２５℃で１０分間インキュベーションする。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間）によりＤＮＡをペレットとし、０．３Ｍ 酢酸ナトリム１００μｌ中にペレットを溶解させ、２．５体積のエタノールを加えることにより再沈殿させる。−２０℃で３０分間インキュベーションする。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間）によりペレットとし、７０％エタノールでペレットをリンスする。真空で１０分間乾燥させ、次いで、１０−１００μｌ ＴＥ緩衝液中に乾燥ペレットを溶解させ０．２−１．０ｍｇ／ｍｌとする。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍ吸収で測定する。
【０２５８】
実施例３
組換え抗体
抗体は、治療、診断および基礎研究に用いられる高価な試薬である。高い特異性、高い親和性の抗体による迅速な同定を可能とする新規技術の必要性がある。最も高価な抗体は、疾患処置に直接使用できるものである。治療抗体は、医薬の分野で受け入れられたものとなった。組換え抗体は、非ヒトモノクローナル抗体よりも免疫性の低い抗体を作成するヒト抗体遺伝子から作製され得る。例えば、ハーセプチン、ｐ１８５ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質のエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）に結合する組換えヒト抗体は、乳癌処置として受け入れられており、その治療に重要となっている。
【０２５９】
治療性抗体の他の例には、腎臓移植拒絶の処置のためのＯＫＴ３；ジゴキシン毒性の処置のためのＤｉｇｉｂｉｎｄ；血管形成合併症（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の処置のためのＲｅｏＰｒｏ；結腸癌の処置のためのＰａｎｏｒｅｘ；非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ種の処置のためのＲｉｔｕｘａｎ；急性腎移植拒絶の処置のためのＺｅｎａｐａｘ；小児性感染疾患の処置のためのＳｙｎａｇｉｓ；腎移植拒絶の処置のためのＳｉｍｕｌｅｃｔ；クローン病の処置のためのＲｅｍｉｃａｄｅが含まれる。治療抗体を発見するための最近の方法は、強烈に、骨の折れる作業であり、時間を必要とする。
【０２６０】
抗体が、医学診断産業を変える。サブストレートに対する抗体の特異性は、前立腺特異的抗原、小分子代謝および薬物のような広範囲のタンパク質疾患マーカーの臨床試験に使用し得る。新規の抗体に基づく診断ツールは、疾患段階および徴候予測のよりよい診断評価を行う医師の手助けとなる。
【０２６１】
抗体はまた、タンパク質精製、サンプル中の特定タンパク質および他の生体分子の量の測定、タンパク質修飾の同定および測定、および細胞中のタンパク質の位置の同定に使用される強力な研究試薬である。複合調節および細胞中のシグナリングシステムの現在の知識は、広くは、研究抗体の利用可能性に帰する。
【０２６２】
我々の身体の免疫防御システムの一部として、抗体は、他のタンパク質（抗原）を特異的に認識し強固に結合するように設計される。身体では、多数の多様性の抗体構造体を産生するコンビナトリアル遺伝子シャッフリングのエレガントなシステムが発達している。我々の身体は、陰性選択（アポトーシス）および陽性選択（クローン拡大）の組合せを使用し、有用な抗体を同定し、数十億の非有用性構造体を排除する。抗原に対する抗体の結合は、更に、「親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」として知られる選択の第二相で精製される。この方法では、更なる多様性が、クローン拡大により選択される、思いがけない身体変異により生ずる（すなわち、高親和性の抗体を発現する細胞は、より弱い抗体を産生する細胞よりもより早く増殖する）。
【０２６３】
抗体は、化学的架橋により強力に同時に保持される４種のタンパク質鎖（２つのより長い「重」鎖および２つのより短い「軽」鎖）を構成する。抗体による最大範囲の抗原認識は、抗体分子の末端の抗原認識部位中の構造可変部（「重」および「軽」鎖が一体となる（「可変領域」と呼ぶ））により行われる。免疫システムの抗体産生細胞は、ＤＮＡを再配列し、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子の単一組合せを生ずる。
【０２６４】
抗体アセンブリの過程は、組換えＤＮＡ技術を使用し行われ得る。ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子に隣接する共通ＤＮＡ配列は、ヒト細胞の群から精製したｍＲＮＡからＰＣＲ遺伝子増幅し得るプライミング領域として役立ち得、増幅遺伝子は、組換えの天然過程を真似る試験管中でランダムにアセンブルし得る。アセンブル組換え抗体遺伝子は、１０億種類以上の組合せを典型的に含む、コレクションまたは「ライブラリー」を形成する。
【０２６５】
ライブラリー中で望ましい抗体クローンを同定するため、種々の選択スキームが開発されている。タンパク質ディスプレイ技術は、ゲノム型（遺伝物質またはＤＮＡ）を表現型（遺伝物質またはタンパク質の構造発現）とリンクさせる。ウイルスまたは細胞の表面上でタンパク質を発現する能力は、親和性選択技術と結合し得る。この強力な組合せは、最も高い親和性によりタンパク質が巨大多様性群（１０億種以上の構造変異体をしばしば含む）から選び出されることを可能とする。
【０２６６】
繊維状バクテリオファージディスプレイシステムでは、抗体遺伝子ライブラリーは、細菌性ウイルス（ファージ）の先端部で発現し、高親和性抗体のディスプレイは、固定化抗原に結合することにより選択される。繰り返しのラウンドの選択は、望ましい特性を含む抗体を富化する。しかし、ファージディスプレイは、細菌性細胞のＤＮＡ取り込み能力および人工選択バイアスにより制限される。
【０２６７】
リボゾームディスプレイでは、クローニングした抗体遺伝子をｍＲＮＡに転写し、次いで、リボゾームとの結合を介し同系列ｍＲＮＡとの結合を維持するように、インビトロで翻訳する。抗体−リボゾーム−ｍＲＮＡ複合体は、親和性精製により選択し、ＰＣＲにより増幅する。繰り返しラウンドの選択は、望ましい特性を含む抗体を富化する。他のアプローチは、転写タンパク質に対するｍＲＮＡのピューロマイシン共有結合により作製されるｍＲＮＡ−タンパク質融合物を使用し、生ずるハイブリッド分子を親和性富化により選択する。
【０２６８】
組換え抗体ｃＤＮＡライブラリーのタグ化
以下で、組換え抗体ｃＤＮＡライブラリーをタグ化するための方法を記載する。タグ化プライマーＶＬＦＯＲは、５種の機能性単位を含む（Ｊｋａｐｐａ ｆｏｒ、エピトープ、Ｄ、および共通）（図１０および１１）。Ｊｋａｐｐａ ｆｏｒ領域は、免疫グロブリン遺伝子をコードするｍＲＮＡに位置する共通配列を特異的に認識し増幅する機能を有する。天然免疫グロブリン分子は、２つの同一重鎖（Ｈ鎖）および２つの同一軽鎖（Ｌ鎖）からなる。Ｂ細胞は、別々のｍＲＮＡ分子としてＨおよびＬ鎖遺伝子を発現する。ＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡは機能領域：可変領域および定常領域からなる。可変重鎖領域（ＶＨ）は、可変性、多様性、および結合性遺伝子（ＶＤＪ組換えと称する）の組換えとして作成する。可変軽鎖領域（ＶＬ）は、可変性および結合性遺伝子（ＶＪ組換えと称する）の組換えにより作製される。結合遺伝子は、軽鎖の共通領域の前にある。
【０２６９】
Ｊｋａｐｐａ ｆｏｒ配列は、同一であり、多数のＶＬ遺伝子の増幅に使用する２５種のＤＮＡ配列のセットを構成する。これらの配列は、通常、組換え抗体ライブラリーの作製に使用され、ＰＣＲによるＶＬ遺伝子の増幅開始のプライマーとして役立つ。
【０２７０】
機能性領域「Ｄ」は、特異的ＰＣＲ増幅を配列に供することによりライブラリーを「分割する」のに使用される配列をいう。それらは、既知配列からなる。例として、配列５’−ＧＡＴＣ（Ａ）（Ｔ）ＧＡＴＣ（Ｇ）ＴＣ（Ｃ）ＧＡ（Ａ）Ｇ−３’配列番号１があり、括弧のある位置は変化する。Ｄ配列をコードするオリゴヌクレオチドはお互いの中におよびデータベース中の既知配列中に同一性を有する最小の配列を提供し、ＰＣＲ間で特異的増幅が最大となるように設計する。タグ中にこれらの配列を組込むことにより、ライブラリーが、異なる配列に特異的になプライマーを用いるＰＣＲ増幅により分割され得る。例えば、ライブラリーが上記配列でタグ化されるならば、配列５’−ＧＡＴＣ（Ａ）（Ｔ）ＧＡＴＣ（Ｇ）ＴＣ（Ｃ）ＧＡ（Ａ）Ｇ−３’配列番号２を含むプライマーは、タグ化分子の一群を特異的に増幅し、その一方、配列５’−ＧＡＴＣ（Ｇ）（Ｇ）ＧＡＴＣ（Ａ）ＴＣ（Ａ）ＧＡ（Ａ）Ｇ−３’配列番号３を含むプライマーはタグ化分子の別群を増幅する。
【０２７１】
機能性領域「エピトープ」は、アレイ中、抗体のような捕捉試薬により特異的に認識されるペプチド「エピトープ」をコードする配列を含む。これらの配列は、機能性ペプチドタグが生ずるように、インフレームでＪｋａｐｐａ ｆｏｒ配列と結合する。終止配列がエピトープに続く。
【０２７２】
機能性領域「共通」（Ｃ）は、転写および翻訳のための終止配列を含む非可変性配列を含む。この配列は、すべてのタグに共通であるため、タグ化ｃＤＮＡライブラリー中の分子の全コレクションの増幅に使用され得る。プライマー／リンカーコレクションを作製するために使用し得る、可能な数の種々の配列は、極端に大きく、容易に推測され得る。
【０２７３】
Ｂ．プライマー作製のための固相ＰＣＲおよび他の方法
プライマーを作製するための固相ＰＣＲは、この方法における使用として例示される。この方法では、上流オリゴヌクレオチドは、固相に結合する（常磁性ビーズ、アガロース、またはポリアクリルアミドのように）。結合は、オリゴヌクレオチドの５’末端にアミノリンクを最初に結合することにより行い、その後、シンセサイザー支持体からオリゴヌクレオチドを切断する。次いで、アミノリンクを、ＮＨＳ−、トシル−、またはヒドラジン反応基を含む活性化固相と反応させ得る。
【０２７４】
他の方法は、４の機能性領域のミクロスケールの化学的ＤＮＡ合成により別々に合成される（＋）鎖および（−）鎖オリゴヌクレオチドを用いことを含む。オリゴヌクレオチドを、オーバーラッピング領域を含むように設計し、それによって、等量で混合すると、それらはハイブリダイゼーションにより合わされ、「ニックの入った」二本鎖ＤＮＡ分子のコレクションを形成する。当該ニックは、酵素学的にＤＮＡリガーゼでシールされる。シール化二本鎖分子は、プライマーとしてビオチン化オリゴヌクレオチドを使用し、ＤＮＡ合成の鋳型として使用する。プライマーの一本鎖分子を作製するため、ビオチン化鎖は、ストレプアビジン被覆常磁性ビーズに結合することにより精製する。非ビオチン化鎖は、変性後分離される。
【０２７５】
実施例４
組換え抗体ライブラリーの構成
Ａ．組換え抗体の調製
組換え抗体ライブラリーは、当業者に既知の方法で調製される（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ参照；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）。機能性抗体フラグメントは、マウスまたはヒト由来の可変性重（ＶＨ）鎖および可変性軽（ＶＬ）鎖遺伝子の遺伝学的クローニングおよび組換えにより作製され得る。ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子は、脾臓組織から単離したポリ（Ａ）ＲＮＡを逆転写し、次いでＰＣＲによりＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子を増幅する特異的プライマーを使用することによりクローニングする。ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子は、リンカー領域により結合される（一本鎖抗体フラグメント、ｓｃＦｖを生ずる典型的リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードするＤＮＡ配列を含む）。ＶＨ−リンカー−ＶＬ遺伝子がアセンブルされ、ＰＣＲ増幅した後、産物を転写し、直接翻訳するか、または発現プラスミド中にクローニングし、インビボまたはインビトロのいずれかで発現する。
【０２７６】
ライブラリー構成は、ｍＲＮＡの単離から開始する。ｍＲＮＡの直接単離は、オリゴｄＴセルロースを使用し親和性精製により行う。この方法のための試薬を含むキットは多数の供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から商業的に利用可能であり、製造者が指示する方法に従い単離する。加えて、多数組織から単離したｍＲＮＡはまた、これらの供給者から直接得られ得る。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、本質的には上記の通りである。
【０２７７】
ＶＨおよびＶＬ鎖遺伝子の増幅は、これらの遺伝子に隣接する共通配列に相当するＰＣＲプライマーのセットで行われる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）。０．５ｍｌ微小遠心分離チューブ中に以下を混合する：３５μｌ 水、５μｌ Ｔａｑ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１．５μｌ ５ｍＭ ｄＮＴＰミックス（濃度１．２５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰを有するｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの等モル混合物）、２．５μｌ ＦＯＲプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、２．５μｌ ＢＡＣＫプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）。当該混合物をＵＶ光２５４ｎｍに５分間さらす。新しい０．５ｍｌチューブ中、４７．５μｌ照射混合物を２．５μｌｃＤＮＡに加え、所望により、２滴のミネラルオイルをオーバーレイする。９４℃に加熱し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕを添加する。９４℃１分間、５７℃１分間、７２℃２分間の３０サイクルを用い増幅する。低融点アガロースゲル中での電気泳動によりプライマーから増幅ＤＮＡを単離および精製する。ＶＨおよびＶＬ鎖ＤＮＡの量を算出する。マウス抗体ライブラリーの場合、以下の反応物を調製する：ＶＨおよびＶＬ鎖ＤＮＡおよびリンカーＤＮＡそれぞれ約５０ｎｇ、２．５μｌ Ｔａｑ緩衝液、２μｌ ５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、水で２５μｌとし、１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）。９４℃１．５分間、６５℃３分間の２０サイクルを用い増幅する。
【０２７８】
当該反応物に、２５μｌの以下の混合物を加える：２．５μｌ Ｔａｑ緩衝液、２μｌ ５ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌ ＶＨＢＡＣＫプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、５μｌのＶＬＦＯＲプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、水および１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。９４℃１分間、５０℃１分間７２℃２分間の３０サイクル行い、最終伸長ステップ７２℃で１０分間行い、増幅する。低融点アガロースゲル中での電気泳動によりプライマーから増幅したＤＮＡを単離および精製する。更なる増幅は、遺伝子またはクローニングのための制限酵素部位の効率的転写および翻訳に必要なＤＮＡ配列を発現プラスミド中に組込むプライマーを用い行う。当該増幅は、本質的には上述している。増幅後、ＤＮＡは精製し、転写／翻訳するか、または制限酵素により消化し、クローニングする。
【０２７９】
Ｂ．組換え抗体の発現および精製
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０システムを用いるインビトロ転写／翻訳の場合（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ； Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１； ９０２２−９０２６）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始部位を含む上流プライマー、および所望により位置付けられた
【化１】
Figure 2004504607
（配列番号４、小文字は非転写配列）のようなシャイン−ダルガルノ配列（ＡＧＧＡ）を用い増幅する。インビトロ転写／翻訳に使用するＰＣＲ産物を以下のように精製する。ＰＣＲ反応物に、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを最終濃度２Ｍとなるように加え、１体積のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、２５℃で１０分間インキュベーションする。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間）によりＤＮＡをペレットとし、当該ペレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウム１００μｌ中に溶解し、２．５体積のエタノールを加えることにより再沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベーションする。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分間）によりＤＮＡをペレットとし、７０％エタノールでペレットをリンスする。ペレットを真空で１０分間乾燥させ、次いで、１０−１００μｌ ＴＥ緩衝液中に乾燥ペレットを溶解させ０．２−１．０ｍｇ／ｍｌとする。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍ吸収で測定する。結合転写／翻訳は、以下の反応により行う。氷上の０．５ｍｌチューブに、Ｐｒｅｍｉｘ（８７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ８．０、４７６ｍＭ グルタミン酸カリウム、７５ｍＭ 酢酸アンモニウム、５ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ 酢酸マグネシウム、２０のアミノ酸それぞれ１．２５ｍＭ、５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰそれぞれ１．２５ｍＭ、５０ｍＭ ホスホエノールピルベート（三ナトリウム塩）、２．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、８７．５ｍｇ／ｍｌ ポリエチレングリコール（８０００ＭＷ）、５０μｇ／ｍｌ ホリニン酸、２．５ｍＭ ｃＡＭＰ）２０μｌ、精製ＰＣＲ産物（ＴＥ中おおよそ１μｇ）、４０ＵファージＲＮＡポリメラーゼ（４０Ｕ／μｌ）を加え、水で最終体積３５μｌとする。１５μｌのＳ３０を加え、ゆっくりと混合し、３７℃で６０分間インキュベーションする。０℃に冷却することにより反応を停止させる。
【０２８０】
ウサギ網状赤血球ライゼートを有するインビトロ転写／翻訳の場合（Ｍａｋｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４４： １７７−１８０）、アセンブル化ＶＨ−リンカー−ＶＬ遺伝子フラグメントを、Ｔ７ＶＨおよびＶＬＦＯＲプライマーそれぞれ２５０ｎＭを含む新しいＰＣＲ混合物中で増幅し、９４℃１分間、６４℃１分間、７２℃１．５分間の２５サイクルで増幅する。上流プライマーＴ７ＶＨは、配列
【化２】
Figure 2004504607
（配列番号５）（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（小文字）を含む）および所望により位置付けられたＡＴＧ開始コドンを有する。
【０２８１】
他に、組換え抗体は、例えば、以下に限らないが、細菌、酵母、昆虫および哺乳類システムおよび細胞のような、種々の発現システムでインビボで発現し得る。Ｅ． ｃｏｌｉの発現は上記している。
【０２８２】
実施例５
ｓｃＦｖの作製および産生
ＨＦＮ７．１ハイブリドーマ（ＨＦＮ７．１はＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ−１６０６で寄託されている）および１０Ｆ７ＭＮハイブリドーマ（１０Ｆ７ＭＮはＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＢ−８１６２で寄託されている）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られる。ＨＦＮ７．１により産生されるＩｇＧは、ヒトフィブロネクチンを認識し、１０Ｆ７ＭＮにより産生されるＩｇＧはヒトグリコホリン−ＭＮを認識する。細胞は、培養物（Ｃｏｖａｎｃｅ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＣＡ）中の増殖により増大し、凍結ペレットとして提供する。メッセンジャーＲＮＡは、製造者指示書に従い、ｍＲＮＡ ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い調製する。精製ｍＲＮＡ５００ｎｇを滅菌ＲＮＡｓｅフリーＨ２Ｏ中に２５ｎｇ／μｌで希釈し、６５℃で１０分間変性させ、次いで、氷上で５分間冷却する。第一鎖ｃＤＮＡは、”Ｍｏｕｓｅ ｓｃＦｖ Ｍｏｄｕｌｅ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に記載される試薬および方法を使用し作製する。
【０２８３】
このキットはまた、一本鎖フラグメント可変性抗原結合分子の作製のため記載されている通りに（例えば、米国特許番号４，９４６，７７８（記載されているｓｃＦｖの構成を記載している）参照）、本質的に使用する。端的に、免疫グロブリン重および軽鎖遺伝子の可変領域は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼによる３０サイクル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、９４℃、１：００；５５℃、１：００；７２℃、１：００）で増幅し、産物は、２％アガロースゲルで分離し、ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出および沈殿によりアガロース切片から精製する。重および軽鎖フラグメントの定量の後、それらを、７サイクルの増幅（９４℃、１：００；６３℃、４：００）によりリンカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａによるＭｏｕｓｅ ｓｃＦｖ Ｍｏｄｕｌｅ中に提供されている）とアセンブルする。プライマーを添加し、更なる３０サイクル（９４℃、１：００；５５℃、１：００；７２℃、１：００）行い、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位をｓｃＦｖに結合させる。
【０２８４】
殆どのｓｃＦｖ構成プロトコールに使用するＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位に適合させるマルチクローニングサイトの改変により、ｓｃＦｖの発現用にｐＢＡＤ／ｇＩＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾する。オリゴヌクレオチドＰＤＫ−２８およびＰＤＫ−２９をハイブリダイズし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのライゲーションにより、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＤＮＡ中に挿入する。得られるベクター（ｐＢＡＤｍｙｃ）は、遺伝子ＩＩＩリーダー配列およびエピトープタグと同じリーディングフレームのｓｃＦｖの挿入物となる。ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩベクターの他の特徴は、強固に調節された発現のためのアラビノース誘導性プロモーター（ａｒａＢＡＤ）、リボゾーム結合配列、ＡＴＧ開始コドン、Ｅ． ｃｏｌｉペリプラズム中のｓｃＦｖ発現のためのＭ１３繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質由来シグナル配列、９Ｅ１０モノクローナル抗体により認識するためのｍｙｃエピトープタグ、金属キレートカラム上の精製のためのポリヒスチジン領域、ｒｒｎＢ転写ターミネーター、ならびにａｒａＣおよびβ−ラクタマーゼオープンリーディングフレーム、および複製のＣｏｌＥ１オリジンを含む。
【０２８５】
更なるベクターを、ｍｙｃエピトープの位置にＨＡエピトープ（ＨＡ１１、１２ＣＡ５またはＨＡ７モノクローナル抗体との融合タンパク質を認識するためのｐＢＡＤＨＡ）またはＦＬＡＧエピトープ（ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体との融合タンパク質を認識するためのｐＢＡＤＭ２）を含むように作製する。
【０２８６】
ハイブリドーマおよびｐＢＡＤｍｙｃ発現ベクターから誘導されるｓｃＦｖを、ＳｆｉおよびＮｏｔＩで連続的に消化し、アガロースゲルで分離する。ＤＮＡフラグメントをゲル切片から精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションする。Ｅ． ｃｏｌｉへの形質転換後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地で一晩増殖させ、個々のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地（ＹＴ培地は、０．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、０．８％バクト−トリプトン）中に接種し、２５０ｒｐｍで一夜、３７℃で振盪する。培養物を０．２％アラビノース含有２×ＹＴ中に２倍希釈し、２５０ｒｐｍで更に４時間、３０℃で振盪する。次いで、培養物を標準的ＥＬＩＳＡで、抗原に対する反応性でスクリーニングする。
【０２８７】
端的に、９６ウェルポリスチレンプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６、４℃中、１０μｇ／ｍｌ抗原（Ｓｉｇｍａ）で一夜被覆する。プレートを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）で二回リンスし、ＴＢＳＴ（３％ＮＦＭ−ＴＢＳＴ）中の３％非脂質乾燥ミルクで、１時間３７℃でブロックする。当該プレートを、ＴＢＳＴで４回洗浄し、浄化していない培養物４０μｌを、５×ＰＢＳ中１０％ＮＦＭ１０μｌを含むウェルに添加する。３７℃１時間のインキュベーション後、プレートをＴＢＳＴで４回洗浄する。ｍｙｃエピトープタグを認識する９Ｅ１０モノクローナル（Ｃｏｖａｎｃｅ）を、３％ＮＦＭ−ＴＢＳＴ中０．５μｇ／ｍｌに希釈し、ウェル中、１時間３７℃でインキュベーションする。プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、３％ＮＦＭ−ＴＢＳＴ中、１：２５００）と共に１時間、３７℃でインキュベーションする。ＴＢＳＴにより更に４回洗浄した後、ウェルをＯ−フェニレンジアミンサブストレート（Ｓｉｇｍａ、０．０５シトレートホスフェート緩衝液ｐＨ５．０中、０．４ｍｇ／ｍｌ）で現像し、３Ｎ ＨＣｌで停止する。プレートは４９２ｎｍでマイクロプレートリーダーで測定する。上記０．５ＯＤユニットの示数を顕在化する培養物を陽性と評価し、更なる抗原のパネルに対する反応性の欠如を再試験する。他の抗原に対する反応性を欠き、特定抗原に対する反応は繰返し生ずるクローンを増殖させ、ＤＮＡを調製し、ｓｃＦｖを標準的方法によりｐＢＡＤＨＡおよびｐＢＡＤＭ２ベクターにサブクローニングする。
【０２８８】
精製ｓｃＦｖの巨大スケール調製の場合、誘導化培地からの浸透性ショック液体を金属キレートと反応させ、ポリヒスチジンタグ化ｓｃＦｖを捕捉する。端的に、望ましいクローンを表す単一コロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ ４００ｍｌ中に接種し、２５０ｒｐｍで一夜、３７℃で浸透する。培地を、０．１％アラビノースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ８００ｍｌに希釈する。この培養物を２５０ｒｐｍで４時間３０℃で振盪し、ｓｃＦｖを発現させ得る。細菌を３０００×ｇ、４℃、１５分間でペレットとし、２０％シュクロース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に５．０ＯＤユニット（６００ｎｍ吸収）となるように再懸濁する。細胞は氷上で２０分間インキュベーションし、次いで、３０００×ｇ、４℃、１０分間でペレットとする。上清を取除き、取っておく。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に５．０ＯＤユニットで再懸濁後、細胞を氷上で１０分間インキュベーションし、３０００×ｇ、４℃、１０分間でペレットとする。このステップの上清を上記の上清と合わし、ＮａＣｌ、イミダゾール、ＭｇＣｌ２を最終濃度がそれぞれ１Ｍ、１０ｍＭ、および１０ｍＭとなるように加える。ニッケル−ニトリル酢酸アガロースビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を、合わせた上清と共に一夜４℃で攪拌する。ビーズを３０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離により回収し、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ イミダゾール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、カラムに負荷する。樹脂をパックし、この洗浄緩衝液をフロースルーした後、ｓｃＦｖは、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ イミダゾール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の連続的０．５ｍｌ画分で溶出する。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｅｎｄｏｇｅｎ）で染色し、十分な量のｓｃＦｖを含むものをプールし、ＰＢＳで一夜４℃で透析する。精製ｓｃＦｖを、修飾Ｌｏｗｒｙ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用い、製造者指示書に従い、定量化し、使用するまでＰＢＳ＋２０％グリセロール中、−８０℃で保存する。
【０２８９】
実施例６
抗体を捕捉するためのアレイの調製およびその使用
サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡキット
ヒトサイトカイン検出に利用可能な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭキットを、特定実験の「サンドイッチアッセイ」を生ずるように使用した。「サンドイッチ」は、結合捕捉抗体、精製サイトカイン抗原、ディテクター抗体、およびストレプトアビジン・ＨＲＰＯからなる。これらのキットは、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅから得られ、以下のヒトサイトカインの検出に使用される：ヒト腫瘍ネクローシスファクターα（Ｈｕ ＴＮＦ−α； ｃａｔａｌｏｇ＃ＣＨＣ１７５４、ｌｏｔ＃ ００１９０１）およびヒトインターロイキン６（Ｈｕ ＩＬ−６； ｃａｔａｌｏｇ＃ＣＨＣ１２６４、ｌｏｔ＃ ００２９０１）。
【０２９０】
抗タグ捕捉抗体
ｓｃＦｖ機能および特異性の微小アレイ分析の場合、赤血球凝集素（インフルエンザウイルス赤血球凝集素エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡに特異的なＨＡ．１１；Ｃｏｖａｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ＃ＭＭＳ−１０１Ｐ， ｌｏｔ＃１３９０２７００２）およびＭｙｃ（Ｍｙｃ腫瘍タンパク質のＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬアミノ酸領域に特異的な９Ｅ１０； Ｃｏｖａｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ＃ＭＭＳ−１５０Ｐ， ｌｏｔ＃１３９０４８００２）に特異的な捕捉抗体を使用した。陰性対象マウスＩｇＧ抗体（ＦＬＯＰＣ−２１； Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ＃Ｍ３６４５）もまたこれらのアッセイに含んだ。
【０２９１】
修飾インクジェットプリンターまたはピン型マイクロアレイプリンターの何れかによりプリントするためのＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ捕捉抗体の調製
修飾インクジェットプリンターまたはピン型マイクロアレイプリンター（以下参照）を使用するＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ抗体をプリントする前に、これらのキットからの捕捉抗体をグリセロール中に希釈し、１−２ｍｇ／ｍｌとし、最終グリセロール濃度は１％から１０％とした。典型的にこれらの混合物は、バルクで作成され、４℃で微小遠心分離チューブ中で保存した。
【０２９２】
ピン型マイクロアレイプリンターによるプリントのための抗ペプチドタグ捕捉抗体の調製
特定ｓｃＦｖ上に存在するペプチドタグに特異的な捕捉抗体を連続的な２倍希釈により調製した。捕捉抗体ストック（１ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度２０％グリセロールとなるように希釈し、典型的に最終捕捉抗体濃度が８００から６ｉｇ／ｍｌとなった。捕捉抗体希釈をバルクで調製し、微小遠心分離チューブ中で４℃で保存し、プリンティング直前に９６ウェルマイクロタイタープレート（ＶＷＲ ｃａｔａｌｏｇ＃６２４０６−２４１）中に負荷した。他に、捕捉抗体希釈は、プリンティング直前に９６ウェルマイクロタイタープレートで直接行った。
【０２９３】
修飾インクジェットプリンターを用いる捕捉抗体のプリンティング
ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ捕捉抗体は、この適応のために修飾したインクジェットプリンター（Ｃａｎｏｎ ｍｏｄｅｌ ＢＪＣ ８２００ ｃｏｌｏｒ ｉｎｋｊｅｔ）でプリントした。六色インクカートリッジを最初にプリントヘッドから取除いた。次いで、１ミリリッターピペットチップを、プリントヘッド中のインクパッドリザーバウェル上をシール形態で適合するように切断する。次いで、グリセロール中の種々の濃度の捕捉抗体を、インクパッドリザーバ上にシールするピペットチップ中にピペットした（典型的に、ブラックインクリザーバのパッドを使用した）。
【０２９４】
修飾プリンターを用いるプリントイメージ作製のため、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔを使用し、白黒で種々のオンスクリーンイメージを作製した。次いで、イメージを、プリンターペーパーの８．５×１１のセンターにフィットしテープするように切断したニトロセルロースペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ （Ｓ＆Ｓ） Ｐｒｏｔｒａｎ ＢＡ８５、孔サイズ０．４５μｍ、ＶＷＲ， ｃａｔａｌｏｇ ＃ １０４０２５８８， ｌｏｇ＃ ＣＦ０６２８−１）にプリントした。この二つのペーパーセットを、プリンティング直前にプリンター中に手でフィードした。イメージのプリンティング後、抗体を室温で３０分間乾燥させた。次いで、ニトロセルロースをプリントペーパーから取除き、下記のように処理した（Ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓ： ＦＡＳＴ ｓｌｉｄｅｓ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒｓ ｐｒｉｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ参照）。
【０２９５】
ピン型マイクロアレイプリンターを使用する捕捉抗体プリンティング
捕捉抗体希釈は、ピン−プリンター−スタイルマイクロアレイヤー（ＭｉｃｒｏＳｙｓ ５１００； Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ； ＴｅｌｅＣｈｅｍ ＡｒｒａｙｌｔＴＭ Ｃｈｉｐｍａｋｅｒ ２ ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｉｎｇ ｐｉｎｓ， ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＣＭＰ２）を用い、ニトロセルローススライド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ ＦＡＳＴＴＭ ｓｌｉｄｅｓ； ＶＷＲ ｃａｔａｌｏｇ ＃ １０４８４１８２， ｌｏｔ ＃ ＥＭＤＺ０１８）上にプリントした。プリンティングは、製造者プリンティングソフトウェアプログラム（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’ ＡｘＳｙｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １，７，０，７９）および単一ピン（数実験の場合）、または４つのピン（数実験の場合）を用い行った。典型的なプリントプログラムパラメーターは以下のとおりであった：ソースウェルドウェル時間３秒；タッチオフ１６回；０．５ｍｍピッチでプリントしたミクロスポット；スライドに対するピンダウンシード（１０ ｍｍ／ｓｅｃで開始、２０ｍｍ／ｓｅｃでトップ、１０００ｍｍ／ｓｅｃ２で加速）；スライドドウェル時間５ミリセカンド；洗浄サイクル（２移動＋リンスタンクに５ｍｍ；真空乾燥５秒）；最後に真空乾燥５秒。マイクロアレイパターンを、特定マイクロアレイ配置に適するように事前にプログラムした（会社内で（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ））。多くの場合、複製アレイを単一スライド上にプリントし、その後、複数アナライトパラメーター（１例のような）の分析をその単一プリントスライド上で行う。次に、そのスライドから得られる実験データの量を最大化する。捕捉抗体希釈物を含むマイクロタイタープレート（殆どの実験で９６ウェル、幾つかの実験では３８４ウェル）を、スライド上へのプリンティングのため、マイクロアレイプリンターに負荷した。Ｃｈｉｐｍａｋｅｒ２ピン用の１ｎｌ／マイクロスポットの、報告されているプリント体積（ポスト−タッチ−オフ、上記参照）に基づき、捕捉抗体濃度は、プリントマイクロスポット中で典型的に８００から６ｐｇ／マイクロスポットの範囲で含まれる。
【０２９６】
プリンティングは、マイクロアレイプリンター製造者により推奨されるような５０−５５％相対湿度（ＲＨ）で行った。ＲＨは、マイクロアレイプリンターに組込まれたポータブルの加湿機により５０−５５％に維持した。プリンティング時間の平均は５−１５分間であり；プリント時間は、プリントする特定マイクロアレイに依存した。プリンティングが終了したとき、スライドをプリンターから取除き、室温およびＲＨで３０分間乾燥させた。
【０２９７】
ブロッキング試薬、ＰＢＳおよびＰＢＳ−Ｔ
捕捉抗体プリンティング後、スライドのブロッキングを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＢｕｐＨＴＭ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ ｐａｃｋｓ； Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ＃２８３７４）中に希釈したＢｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡＴＭ（１０％ ｏｒ １０×ｓｔｏｃｋ； Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３７５２５）を用い行った。次いで、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレート；Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｐ−７９４９）を加え、最終濃度０．０５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）とした。生じたブロッカーを以下、ＢＢＳＡ−Ｔと称し、その一方、生じた、０．０５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳをＰＢＳ−Ｔと称する。
【０２９８】
ＦＡＳＴスライドのためのチャンバーアセンブリーのインキュベーション
単一ＦＡＳＴスライド上の捕捉抗体の個々のマイクロアレイの単離のため、スロット化アルミニウムブロックを機械加工し、ＦＡＳＴＴＭスライドの大きさにマッチさせた。Ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｉｓｏｌａｔｏｒ ｇａｓｋｅｔｓ（Ｇｒａｃｅ ＢｉｏＬａｂｓ； ＶＷＲ ｃａｔａｌｏｇ＃ｓ１０４８５０１１ および１０４８５０１２）を手で切断し、スロット化アルミニウムブロックに適合させた。次いで、プリント化スライド、ガスケットおよびアルミニウムブロックからなる「サンドイッチ」をアセンブルし、バインダークリップ中０．７５で同時に保持した。１つの抗体ミクロアレイを単離する、１つの単離チャンバーのための最小および最大体積は、５０−２００μｌであった。
【０２９９】
抗体および抗原インキュベーションのためのベーシックプロトコール：ＣｙｔｏＳｅｔＴＭ捕捉抗体でプリントされたＦＡＳＴスライドおよびニトロセルロースフィルター
ＦＡＳＴスライドまたはニトロセルロースフィルター上にＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ捕捉抗体をプリンティングした後、これらの支持体メディアは、記載のように乾燥させた。次いで、スライドおよびフィルターを、ＢＢＳＡ−Ｔで、３０分間から１時間、室温（フィルター）または３７℃（スライド）でブロックした。すべてのインキュベーションをオービタルテーブル（室温インキュベーション）上で、またはシェイキングインキュベーター（３７℃インキュベーション）中で行った。
【０３００】
次いで、精製、組換えサイトカイン抗原（個々のキットに含まれる）を、ＢＢＳＡ−Ｔ中に種々の濃度（典型的には１−１０ｎｇ／ｍｌ）で希釈した。次いで、ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ捕捉抗体を含むスライドまたはフィルターを、この抗原溶液と共に、室温（フィルター）または３７℃（スライド）でインキュベーションした。次いで、スライドおよびフィルターを、３回ＰＢＳ−Ｔで、洗浄あたり３−５分間、室温で洗浄した。次いで、結合抗原と共に捕捉抗体を含む、これらのスライドおよびフィルターを、ＢＢＳＡ−Ｔ中に１：２５００希釈したディテクター抗体（個々のキットに含まれる）と共に、室温（フィルター）または３７℃（スライド）でインキュベーションした。次いで、スライドおよびフィルターを上記のようにＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
【０３０１】
次いで、捕捉抗体、結合抗原、および結合ディテクター抗体を含む、これらのスライドおよびフィルターを、ＢＢＳＡ−Ｔ中１：２５００希釈したストレプトアビジン・ＨＲＰＯと共に、１時間、室温（フィルター）または３７℃（スライド）でインキュベーションした。次いで、スライドおよびフィルターを上記のようにＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、スライドおよびフィルターを現像させ、下記のようにイメージ化した。
【０３０２】
抗体および抗原インキュベーションのためのベーシックプロトコール：抗ペプチドタグ捕捉抗体でプリントされたＦＡＳＴスライド
ＦＡＳＴスライド上への抗ペプチドタグ捕捉抗体のプリンティング後、スライドを記載のように乾燥させた。次いで、スライドをＢＢＳＡ−Ｔで、３０分間から１時間、３７℃、シェイキングインキュベーター（３７℃インキュベーション）中でブロックした。
【０３０３】
次いで、ペプチドタグを含む精製ｓｃＦｖを、ＢＢＳＡ−Ｔ中で種々の濃度（典型的には０．１と１００ｉｇ／ｍｌ）で希釈した。次いで、抗ペプチドタグ捕捉抗体を含むスライドを、この抗原溶液と共に１時間、３７℃でインキュベーションした。次いで、スライドを３回、ＰＢＳ−Ｔで、洗浄あたり３−５分間、室温で洗浄した。
【０３０４】
次いで、抗ペプチドタグ捕捉抗体および結合ｓｃＦｖを含むスライドを、ＢＢＳＡ−Ｔで種々濃度（典型的には１−１０ｉｇ／ｍｌ）に希釈されたビオチニル化ヒトフィブロネクチンまたはビオチニル化ヒトグリコホリン（抗原として）と共に、１時間３７℃でインキュベーションした。次いで、スライドを上記のようにＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
【０３０５】
次いで、抗ペプチドタグ捕捉抗体、結合ｓｃＦｖ、および結合ビオチニル化抗原を含むスライドを、ＢＢＳＡ−Ｔで１：１０００または１：１００，０００に希釈されたニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）・ＨＲＰＯと共に、１時間３７℃でインキュベーションした。次いで、スライドを下記のように現像し、イメージ化した。
【０３０６】
抗体マイクロアレイを含むＦＡＳＴＴＭスライドおよびニトロセルロースフィルターの現像およびイメージ化
ＰＢＳ−Ｔ中での洗浄後、抗ペプチドタグ抗体、結合ｓｃＦｖ、抗原、およびニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）・ＨＲＰＯを含むスライド、またはＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭ抗体、結合サイトカイン抗原、ディテクター抗体、およびストレプトアビジン・ＨＲＰＯを含むニトロセルロースフィルターをＰＢＳでリンスし、次いで、製造者の推奨にしたがって、ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ および ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ＃３７０７５）で現像した。
【０３０７】
ＦＡＳＴＴＭスライドおよびフィルターを、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０ＣＦを使用しイメージ化した。ペルオキシド溶液：ルミノールの１：１混合物を調製し、小体積のこの混合物をイメージステーションのプラテンに置く。次いで、スライドを、プラテンの中央に個々に置き（マイクロアレイ−サイドダウン）、それによって、スライドのニトロセルロース含有部分の表面領域（ミクロアレイを含む）をカメラレンズのイメージング範囲の中央に位置させる。この方法で、プラテンに存在する少量のディベロッパーは、スライドのニトロセルロース含有部分の表面領域全体に接触し得る。ニトロセルロースフィルターを、プラテン上の幾分多量のディベロッパーを用い、同じ方法で処理した。次いで、イメージステーションカバーを閉じ、マイクロアレイイメージを捕捉した。カメラフォーカス（ズーム）は、フィルター用に、７５ｍｍ（最大；ＦＡＳＴＴＭスライドの場合）または２５ｍｍにセットした。露光時間は、３０秒から５分間の範囲とした。カメラｆ−ストップセッティングは、１．２と８の範囲とした（イメージステーションｆ−ストップセッティングは、１．２と１６の範囲で無制限に調節する）。
【０３０８】
マイクロアレイイメージのアーカイビングおよび分析
マイクロアレイイメージのアーカイビングおよび分析は、例えば、Ｋｏｄａｋ １Ｄ３．５．２ソフトウェアパッケージを用い行う。目的の領域（ＲＯＩ）を、典型的に、４（２×２）または６４（８×８）マイクロスポットのグループ中で、捕捉抗体のグループをフレームするように描く（マイクロアレイ上の既知の位置でプリントする）。正味の、合計の、最小値の、最大値のおよび平均の強度を表す、ＲＯＩ値数、同様に標準偏差およびＲＯＩピクセルエリアは、ソフトウェアにより自動的に算出される。次いで、これらのデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに、統計分析のために変換する。
【０３０９】
結果
ヒト腫瘍ネクローシスファクターα（ＴＮＦ−α）捕捉抗体（ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭキットから）の２つのマイクロアレイ型パターンを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔを使用する修飾インクジェットプリンターでニトロセルロース上にプリントした。ＴＮＦ−α捕捉抗体をプリンティングのために１％グリセロール中に１．２５ｎｇ／ｍｌに希釈した。乾燥後、フィルターをＢＢＳＡ−Ｔでブロックした。次いで、マイクロアレイを、抗原として精製組換えヒトＴＮＦ−α（５．６５ｎｇ／ｍｌ）でプローブとした。次いで、フィルターをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、ディテクター抗体およびストレプトアビジン・ＨＲＰＯを結合抗原の検出に使用した。ＰＢＳ−Ｔ中で洗浄後、マイクロアレイを、化学ルミネセンスを用い現像し、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０ＣＦを使用しイメージ化した。ハイレゾリューションイメージは、５０μｍ未満の見えるサイズでジェレイチャー（ｇｅｒａｔｕｒｅ）した。
【０３１０】
インターロイキン６（ＩＬ−６）捕捉抗体（ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭキットから）の単一マイクロアレイを、図で示すパターンをプリントするようプログラムしたピン型マイクロアレイプリンター（４ピンプリントパターン）により、ＦＡＳＴＴＭスライド上にプリントした。ＩＬ−６捕捉抗体を１０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。捕捉抗体の１ナノリッターマイクロスポットは、５００ｐｇ／マイクロスポットを含むようにプリントした。乾燥後、スライドをＢＢＳＡ−Ｔでブロックした。次いで、マイクロアレイを、抗原として精製組換えヒトＩＬ−６（５ｎｇ／ｍｌ）でプローブした。次いで、スライドをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、ディテクター抗体およびストレプトアビジン・ＨＲＰＯを結合抗体の検出に使用した。ＰＢＳ−Ｔ中での洗浄後、マイクロアレイを、化学ルミネセンスを用い現像し、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０ＣＦでイメージ化した。当該方法により３００μｍスポットに相当するアレイ特徴サイズを有する明るいイメージを生ずる。更なる実験では、捕捉抗体または抗原の希釈は、抗原結合量と作製シグナルとの間の直接の関係に相当するシグナルを増加または減少した。
【０３１１】
マイクロアレイ（８×８マイクロスポット）の抗ペプチドタグ捕捉抗体（インフルエンザウイルス赤血球凝集素エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡに特異的なＨＡ．１１； Ｍｙｃ腫瘍タンパク質のＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬアミノ酸領域に特異的な９Ｅ１０；およびＦＬＯＰＣ−２１、特異性の知られていない陰性対照抗体）を、図に示すパターンでプリントするようにプログラムしたピン型マイクロアレイプリンター（４ピンプリントパターン）を用い、ＦＡＳＴＴＭスライド上にプリントした。捕捉抗体は、２０％グリセロール中に０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１ナノリッターマイクロスポットは、５００、２５０、１２５および６２．５ｐｇ／マイクロスポットの連続２倍希釈を含むようにプリントした。乾燥後、フィルターをＢＢＳＡ−Ｔでブロックした。次いで、マイクロアレイは、アラビノース導入によりＨＡ−ＨＦＮ ｓｃＦｖの発現を指示するプラスミド構成物を保有するＥ． ｃｏｌｉ株から回収したペリプラズムライゼートおよび培養上清のアリコートで連続的にプローブした。次いで、スライドをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、マイクロアレイをビオチニル化ヒトフィブロネクチン（３．３ｉｇ／ｍｌ）でプローブした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、マイクロアレイを過剰のニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）・ＨＲＰＯでプローブした（１：１０００）。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、マイクロアレイを、化学ルミネセンスを用い現像し、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０ＣＦでイメージ化した。
【０３１２】
ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）捕捉抗体（ＣｙｔｏＳｅｔｓＴＭキットから）のマイクロアレイを、図に示したパターンをプリントするようにプログラムしたピン型マイクロアレイプリンター（４ピンプリントパターン）で、ＦＡＳＴＴＭスライドおよび４種の表面上にプリントした。ヒトＩＬ−６捕捉抗体は、２０％グリセロール中に希釈し、３００、１００、３３、１１、３．６、１、０．３および０．１ｐｇ／マイクロスポットの範囲で連続３倍希釈となるようにプリントした。ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）に特異的な陰性対照捕捉抗体もまた、５０ｐｇ／マイクロスポットでプリントした。乾燥後、スライドをＢＢＳＡ−Ｔでブロックした。次いで、マイクロアレイを、抗原として精製組換えヒトＩＬ−６（５ｎｇ／ｍｌ）でプローブした。次いで、スライドをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いでディテクター抗体およびストレプトアビジン・ＨＲＰＯを結合抗原の検出に使用した。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、マイクロアレイを、化学ルミネセンスを用い現像し、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０ＣＦでイメージ化した。シグナルは、１ｐｇ／スポットおよびそれより多い濃度を含むスポットで見られた。
【０３１３】
修飾は当業者にとって明らかであり、そのため、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネスト化ソーティングの概念を解説したものである。
【図２】図２もまた、ネスト化ソーティングを解説したものである。
【図３】図３は、高多様性遺伝子ライブラリー（ｈｉｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）のネスト化ソートのためのツールとしての抗体アレイの使用を解説したものである。
【図４】図４は、変異遺伝子のライブラリーを探索するために本明細書で提供した方法の適用を解説したものである。
【図５】図５は、組換え抗体ライブラリーを構成する方法を解説したものである。
【図６】図６は、ポリペプチド（エピトープ）タグを、プライマー付加を用い、組換え抗体に組込むための１つの方法を示す。
【図７】図７は、リンカー付加を用いる他のスキームを示したものである。
【図８】図８は、組換え抗体ライブラリーを探索するための本明細書の適用を示したものである。
【図９】図９は、本明細書において提供されるプライマーのエレメント、および必要とされるプライマーのセットを略図的に示したものである。
【図１０】図１０は、ＥＤおよびＥＤＣプライマーを構成するための他の方法を示す。
【図１１】図１１は、ＥＤおよびＥＤＣプライマーを構成するための他の方法を示す。
【図１２】図１２は、アレイで使用するためのハイブリドーマ細胞から産生するイムノグロブリン（Ｉｇ）を発見するためのハイスループットスクリーニングを示したものである。
【図１３】図１３は、組換えヒト抗体を調製するための抗体鎖増幅用の典型的プライマー（配列番号１２−７３）を示したものである
【図１４】図１４は、抗体作成のための本明細書の方法の使用を示したものである。
【図１５】図１５は、修飾された特異性（または修飾された特異性を有する任意のタンパク質）を用い抗体を同定するための本明細書の方法の使用を示したものである。
【図１６】図１６は、同時抗体探索（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅａｒｃｈｅｓ）のために本明細書の方法の使用を示したものである。
【図１７】図１７は、酵素作成プロトコールにおける本明細書の方法の使用を示したものである。
【図１８】図１８は、タンパク質相互作用マッピングプロトコールにおける本明細書の方法の使用を示したものである。
【図１９】図１９は、複数のポリペプチドタグをソーティングに使用するときのタグの数の増加率を示したものである。

Claims (98)

  1. 個々の捕捉試薬がひとつのポリペプチドに特異的に結合する、複数の捕捉試薬、および
    ひとつの事前に選択したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を個々に含む複数のオリゴヌクレオチド
    を含む、組合せであって、ここで、
    該オリゴヌクレオチドによりコードされる該事前に選択したポリペプチドが、該捕捉試薬が結合するポリペプチドを含み、そして
    該オリゴヌクレオチドが、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖である、
    組合せ。
  2. 該捕捉試薬が抗体であり、そして該事前に選択したポリペプチドが、該捕捉試薬が結合するエピトープを含む、請求項１の組み合わせ。
  3. 該捕捉試薬が、アレイに配列している、請求項１の組合せ。
  4. 該抗体が、アレイに配列している、請求項２の組合せ。
  5. 該捕捉試薬が、固体支持体に直接的にまたは間接的に結合している、請求項１の組合せ。
  6. 該抗体が、固体支持体に直接的にまたは間接的に結合している、請求項２の組合せ。
  7. 該支持体が、粒子である、請求項５の組合せ。
  8. 該アレイがアドレス可能である、請求項３の組合せ。
  9. 該アレイがアドレス可能である、請求項２の組合せ。
  10. 該粒子が光学的にコードされている、請求項７の組合せ。
  11. 該個々のオリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの領域を含み、ここで、当該領域は、標的ライブラリーに特有の配列を含むヌクレオチド配列を含むディバイダー領域、およびコレクション中の捕捉試薬が結合するアミノ酸配列をコードするエピトープコード化領域である、
    請求項１の組合せ。
  12. 該ディバイダー領域が、該エピトープコード化領域の３’である、請求項１１の組合せ。
  13. 該ディバイダーおよびエピトープ領域が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項１１の組合せ。
  14. 該ディバイダーおよびエピトープ領域が少なくとも約１５ヌクレオチドを含む、請求項１３の組合せ。
  15. それぞれの該オリゴヌクレオチドが更に共通領域を含み、ここで、該共通領域は、当該セット中のそれぞれの該オリゴヌクレオチドによりシェアされ、そして該共通領域を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子を増幅するための特有のプライミング部位として役立つのに十分な長さである、請求項１３の組合せ。
  16. 該共通領域が、該エピトープコード化領域および／または該ディバイダー領域の３’である、請求項１５の組合せ。
  17. 個々のオリゴヌクレオチドが、該捕捉試薬が結合する、事前に選択した複数個のポリペプチドを含む、請求項１の組合せ。
  18. 該複数個が３である、請求項１７の組合せ。
  19. 該捕捉試薬が、固体支持体上の区別され得る位置に固定化され、ここで、個々の位置の捕捉試薬が、該事前に選択したポリペプチドの１つに特異的に結合する、請求項１の組合せ。
  20. 該捕捉試薬が抗体であり、該事前に選択したポリペプチドが、該抗体が結合する１個または複数個のエピトープを含む、請求項１９の組合せ。
  21. 相互に異なるポリペプチドに特異的に結合する３から１０６までの該捕捉試薬を含む、請求項１の組合せ。
  22. 相互に異なるエピトープに特異的に結合する３から１０６までの該抗体を含む、請求項２の組合せ。
  23. 該ディバイダー、エピトープおよび共通領域のそれぞれの長さが、少なくとも約１４ヌクレオチドである、請求項１５の組合せ。
  24. 該オリゴヌクレオチドが、式：
    ５’−Ｅｍ−３’
    ［式中、個々のＥは、捕捉試薬が結合するアミノ酸配列をコードし、ここで、個々のアミノ酸配列は当該セットの中で特有であり、
    ｍは、独立して、２またはそれより多い整数である。］
    を含む、請求項１の組合せ。
  25. 個々のオリゴヌクレオチドが、共通領域Ｃを更に含み、そして
    式：
    ５’Ｃ−Ｅｍ３’
    ［式中、該共通領域は、該セット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドによりシェアされ、当該共通領域を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子を増幅するための特有のプライミング部位として役立つのに十分な長さである。］
    を含む、請求項２４の該オリゴヌクレオチドのセット。
  26. 該オリゴヌクレオチドが、式：
    ５’−Ｄｎ−Ｅｍ−３’
    ［式中、個々のＤは、該オリゴヌクレオチドのセットの中で特有の配列であって、少なくとも約１０ヌクレオチドを含み、
    個々のＥは、捕捉試薬が結合するアミノ酸配列をコードし、ここで、個々のアミノ酸配列は該セットの中で特有であり、
    ｎおよびｍのそれぞれは、独立して、２またはそれより多い整数である。］
    を含む、請求項１の組合せ。
  27. 該捕捉試薬が抗体であり、そして該アミノ酸の特有配列がエピトープを含む、請求項１６の組合せ。
  28. ｍは、組合せにおいて種々のエピトープ特異性を有する抗体の数であり、ｎは、約２から１０６まで（１０６を含む）である、請求項２７の組合せ。
  29. ｍは、当該組合せにおける、異なるエピトープ特異性を有する捕捉試薬の数であり、ｎは、約２から１０６まで（１０６を含む）である、請求項２６の組合せ。
  30. ｎは、約２から約１０４まで（１０４を含む）である、請求項２８の組合せ。
  31. ｎは、約２から約１０４まで（１０４を含む）である、請求項２９の組合せ。
  32. ｎは、約２から約１０２まで（１０２を含む）である、請求項２９の組合せ。
  33. 約１０３までの抗体を含む、請求項２の組合せ。
  34. 該ディバイダーおよびエピトープ領域のそれぞれの長さが、独立して少なくとも約１４ヌクレオチドである、請求項１１の組合せ。
  35. 該ディバイダーおよびエピトープ領域のそれぞれの長さが、独立して少なくとも約１６ヌクレオチドである、請求項１１の組合せ。
  36. 該オリゴヌクレオチドが一本鎖プライマーである、請求項１の組合せ。
  37. 該オリゴヌクレオチドが二本鎖である、請求項１の組合せ。
  38. 式：
    ５’−Ｄｎ−Ｅｍ−３’
    ［式中、個々のＤは、該オリゴヌクレオチドセットの中の特有の配列であって、少なくとも約１０ヌクレオチドを含み、
    個々のＥは、エピトープを含むアミノ酸配列をコードし、
    個々のエピトープは、該セットの中で特有であり、
    個々のエピトープは、捕捉試薬が結合する配列であり、
    ｎおよびｍは、それぞれ独立して、２またはそれより多い整数であり、そして
    該オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖および／または部分的に二本鎖である。］
    を含むオリゴヌクレオチドのセット。
  39. ｍ×ｎが約１０から約１０１２（１０１２を含む）である、請求項３８のオリゴヌクレオチドのセット。
  40. ｍ×ｎが約１０から約１０９（１０９を含む）である、請求項３８のオリゴヌクレオチドのセット。
  41. ｍ×ｎが約１０から約１０６（１０６を含む）までである、請求項３８のオリゴヌクレオチドのセット。
  42. 個々のオリゴヌクレオチドが更に共通領域Ｃを含み、式：
    ５’Ｃ−Ｄｎ−Ｅｍ３’
    ［式中、該共通領域は、該セット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドによりシェアされ、そして該共通領域を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子を増幅するための特有プライミング部位として役立つのに十分な長さである。］
    を含む、請求項３８のオリゴヌクレオチドのセット。
  43. 請求項３８のオリゴヌクレオチドのセット、および式：
    ５’Ｃ−Ｄｎ３’
    ［式中、Ｃは、該セットの中のすべてのオリゴヌクレオチドに共通のヌクレオチド配列である。］
    のオリゴヌクレオチドのもう一つのセット
    を含む、オリゴヌクレオチドのセットの組合せ。
  44. 請求項４２のオリゴヌクレオチドのセット、および式：
    ５’Ｃ−Ｄｎ３’
    ［式中、Ｃは、該セットの中のすべてのオリゴヌクレオチドに共通のヌクレオチド配列である。］
    のオリゴヌクレオチドのもう一つのセットを含む、オリゴヌクレオチドのセットの組合せ。
  45. 請求項４３のオリゴヌクレオチドのセット、および式：
    ５’Ｃ−Ｅｐ−ＦＡｓ３’
    ［式中、Ｅｐは、Ｅｌ−Ｅｍエピトープコード化オリゴヌクレオチドの１つであり、
    ＦＡｓは、プライマーとして使用されるとき、Ｅｐを含む核酸を増幅するためには十分であるが、Ｅｍによりコードされるエピトープをコードするには不十分なＥｐ部分を含むヌクレオチドの配列を含み、
    ｓおよびｐは、それぞれ２またはそれより多く、ｍまでの整数である。］
    のオリゴヌクレオチドのもう一つのセットを含む、オリゴヌクレオチドのセットの組合せ。
  46. 請求項４４のオリゴヌクレオチドのセット、および式：
    ５’Ｃ−Ｅｐ−ＦＡｓ３’
    ［式中、Ｅｐは、Ｅｌ−Ｅｍエピトープコード化オリゴヌクレオチドの１つであり、
    個々のＦＡｓは、プライマーとして使用されるとき、Ｅｐを含む核酸を増幅するためには十分であるが、Ｅｍによりコードされるエピトープをコードするには不十分なＥｐ部分を含むヌクレオチド配列を含み、
    ｓおよびｐは、それぞれ２またはそれより多く、ｍまでの整数である。］
    のオリゴヌクレオチドのもう一つのセットを含む、オリゴヌクレオチドのセットの組合せ。
  47. 請求項４５のオリゴヌクレオチドのセット、および式：
    ５’Ｃ−ＦＢｚ−３’
    ［式中、ｚは、２からＭの整数であり、
    Ｃは、該セット中の個々のオリゴヌクレオチドに共通の領域であり、
    個々のＦＢｚは、Ｅｐを含む核酸を増幅するためには十分であるＥｐ部分およびそれぞれのＥｐを少なくとも含むヌクレオチド配列を含む。］
    のオリゴヌクレオチドのもう一つのセットを含む、オリゴヌクレオチドのセットの組合せ。
  48. 請求項４６のオリゴヌクレオチドのセット、および式：
    ５’−ＦＢｚ−３’
    ［式中、ｚは、２からＭの整数であり、
    個々のＦＢｚは、Ｅｐを含む核酸を増幅するためには十分であるＥｐ部分および個々のＥｐを少なくとも含むヌクレオチド配列を含む。］
    のオリゴヌクレオチドのもう一つのセットを含む、オリゴヌクレオチドのセットの組合せ。
  49. 分子のコレクションをソートするためのシステムであって、
    ａ）請求項１の組合せ、および
    ｂ）ソートの結果を分析するためのソフトウエアを有するコンピューターシステム
    を含む、当該システム。
  50. 分子のコレクションをソートするためのシステムであって、
    ａ）請求項２の組合せ、および
    ｂ）ソートの結果を分析するためのソフトウエアを有するコンピューターシステム
    を含む、当該システム。
  51. コレクション中における捕捉試薬への結合を、検出するためのリーダーを更に含む、請求項４９のシステム。
  52. 該リーダーがイメージングシステムを含む、請求項５１のシステム。
  53. 該コンピューターシステムが、データを保存し、および／または該リーダーによって収集されたデータを評価する、請求項５０のシステム。
  54. 該イメージングシステムが、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光ダイオードのアレイである、請求項５２のシステム。
  55. 捕捉試薬を結合するための支持体；および
    該支持体に結合した捕捉試薬の複数のアレイを含む複数のアレイであって、ここで、
    個々の捕捉試薬が、事前に選択したポリペプチドに特異的に結合し、
    該捕捉試薬が、区別できる位置に固定化されており、こここで、個々の位置の捕捉試薬は、該事前に選択されたポリペプチドの１つに特異的に結合し、そして
    複数存在する個々のアレイが、他のものの複製物である、
    当該アレイ。
  56. 該捕捉試薬が抗体であり、該事前に選択されたポリペプチドが、該抗体が特異的に結合するエピトープを含む、請求項５５の複数のアレイ。
  57. 個々のアレイが疎水領域または物理的バリアにより他のアレイから隔離されている、請求項５５の複数のアレイ。
  58. 該支持体が、ゼラチンで被覆されまたはシリコンもしくは誘導体化シリコンで被覆されている、請求項５６の複数のアレイ。
  59. 該捕捉製剤が抗体である、請求項３８のオリゴヌクレオチドのセット。
  60. 請求項３８のオリゴヌクレオチドのセットのうちのそれぞれの１つを、タグ化ライブラリーを作成するための核酸分子のライブラリー中の核酸分子中に組込むことを含む、タグ化ライブラリーを作成するための方法。
  61. 請求項６０の方法により作成されるライブラリー。
  62. 個々のオリゴヌクレオチドが、共通領域を更に含み、式：５’Ｃ−Ｄｎ−Ｅｍ−３’［式中、Ｃは個々のオリゴヌクレオチドに共通の領域である。］を有する、請求項６０の方法。
  63. 領域Ｅｍをそれぞれ含むオリゴヌクレオチドのセットのうちのそれぞれ１つを、タグ化ライブラリーを作成するための核酸分子のライブラリー中の核酸分子中に組込むことを含み、ここで、
    該オリゴヌクレオチドは、式：
    ５’−Ｅｍ−３’
    であり、
    個々のＥは、捕捉試薬が特異的に結合するアミノ酸配列をコードし、
    それぞれのそのアミノ酸配列は、該セットの中で特有であり、そして
    ｍは、独立して、２またはそれより多い整数である、
    タグ化ライブラリーを作成するための方法。
  64. Ｅが、抗体が結合するエピトープをコードし、そして
    該捕捉試薬が抗体である、
    請求項６３の方法。
  65. 請求項６３の方法により作成されたライブラリー。
  66. 請求項６４の方法により作成されたライブラリー。
  67. 核酸ライブラリーをスクリーニングするための方法であって、
    ａ）請求項６３の方法によりタグ化ライブラリーを作成すること、
    ｂ）該ライブラリーまたはそのサブライブラリーを翻訳すること、
    ｂ）翻訳されたライブラリーまたはサブライブラリー由来のタンパク質を、捕捉試薬のコレクションと接触させ、タグ化タンパク質と捕捉試薬との複合体を作成すること、ここで、それぞれの捕捉試薬は、Ｅｍをコードするポリペプチドに特異的に結合し、そしてそれぞれの捕捉試薬は同定可能（ｉｄｅｎｔｉｆｉａｂｌｅ）であり、
    ｃ）該複合化捕捉試薬をスクリーニングし、目的の翻訳タンパク質に結合するものを同定し、それにより、目的のタンパク質に結合するＥｍを同定すること、
    を含む、当該方法。
  68. ｄ）目的タンパク質に結合するＥｍをコードする核酸分子を単離すること、
    を更に含む、請求項６７の方法。
  69. 該捕捉試薬が抗体である、請求項６７の方法。
  70. 該捕捉試薬が、位置付けアレイに配置されている、請求項６７の方法。
  71. 該捕捉試薬が、同定可能粒子に結合する、請求項６７の方法。
  72. 該粒子が、光学的にコードされている、請求項７１の方法。
  73. 該ライブラリーが作成される、個々のオリゴヌクレオチドが、式：５’Ｄｎ−Ｅｍ−３’を含む、請求項６７の方法。
  74. 該ライブラリーが作成される、個々のオリゴヌクレオチドが、式：５’Ｃ−Ｄｎ−Ｅｍ−３’を含む、請求項６７の方法。
  75. ネスト化ソートのための方法であって、
    ａ）請求項３８のオリゴヌクレオチドのセットのうちのそれぞれの１つを、Ｎのメンバーを含むマスターコレクションを作成するための個々の核酸分子の一端に組込むことにより、核酸分子のタグ化コレクションを作成すること、
    ｂ）Ｄｎを含むプライマーによりｎ個のサンプルをそれぞれ増幅し、ｎ個セットの増幅核酸反応物を作成すること、ここで、それぞれの反応物は、単一のＤｎおよびすべてのＥｍを含む増幅配列を含む、
    ｃ）個々のサンプルを翻訳し、ｎ個の翻訳したサンプルを作成すること、
    ｄ）それぞれの翻訳した反応物由来のタンパク質を、ｎ個のコレクションの捕捉試薬のうちの１つと接触させ、その複合体を作成すること、ここで、該コレクション中のそれぞれの捕捉試薬は、Ｅｍによりコードされるアミノ酸配列と特異的に反応し、それぞれの抗体が同定され得る、
    ｅ）該複合体をスクリーニングし、目的のタンパク質と結合するものを同定すること、これにより、目的のタンパク質をコードする核酸分子に結合するＥｍおよびＤｎを同定すること、
    を含む当該方法。
  76. 該捕捉試薬が抗体である、請求項７５の方法。
  77. 結合核酸を増幅するのに十分であるが、すべてのＥｍを再導入するのには不十分なＥｍ部分をそれぞれ含むプライマーのセットで、同定したＥｍ、Ｄｎを含むサンプル中で核酸を増幅することを更に含み、ここで、個々のプライマーは、式Ｅｍ−ＦＡｓ［式中、ｍおよびｓはそれぞれ２またはそれより多くＭまでの整数であり、エピトープタグの数である。］を含み、
    それにより、Ｅｍ配列のうちの異なる１つを核酸に導入し、すべてのＥｍ配列を再び含むサブライブラリーを作成することを更に含む、請求項７５の方法。
  78. 更に、
    該サブライブラリー中の核酸を翻訳すること、
    捕捉試薬のコレクションを、該翻訳したタンパク質と接触させること、
    目的のタンパク質に結合したＥｍによりコードされるアミノ酸配列に結合する捕捉試薬をスクリーニングおよび同定し、それにより、Ｅｍを同定すること、および
    該サブライブラリー中の同定したＥｍタグを特異的に増幅すること
    を含む、請求項７７の方法。
  79. 該捕捉試薬のコレクションが、アドレス可能なアレイを含む、請求項７７の方法。
  80. 該捕捉試薬が同定可能なように標識されいている、請求項７７の方法。
  81. 該捕捉試薬が、光学的にコード化された粒子支持体に結合する、請求項７９の方法。
  82. 標識が、着色された、色素生産的、発光的、化学的、蛍光的または電子的である、請求項８１の方法。
  83. ステップａ）の該オリゴヌクレオチドは式：５’Ｃ−Ｄｎ−Ｅｍ３’を有する、請求項７５の方法。
  84. 該Ｅタグをコードする核酸が、ＰＣＲ増幅により、またはライブラリーにおける核酸へのライゲーションとその後必要に応じて実施される増幅により、導入される、請求項７５の方法。
  85. ステップａ）中の該オリゴヌクレオチドがプラスミド中にある、請求項８４の方法。
  86. 捕捉試薬のコレクションが、アドレス可能なアレイを含む抗体である、請求項７５の方法。
  87. アドレス化が、該抗体を同定可能なように標識することにより行われる、請求項８６の方法。
  88. 標識が、光学的、色素生産的、発光的、化学的、蛍光的または電子的である、請求項８７の方法。
  89. 該抗体が、バーコードまたは周波数（ｒａｄｉｏ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）タグで標識された支持体に結合されている、請求項８６の方法。
  90. 該抗体が、カラービーズである支持体に結合されている、請求項８６の方法。
  91. 個々の分子がエピトープタグのセットのうちの１つで標識されている、分子のコレクションであって、
    ここで、個々のエピトープタグが、ｎ個のディバイダー領域から選択されるディバイダー領域、およびｍ個のエピトープから選択されるエピトープ領域を含み、個々のディバイダー領域が、少なくとも約３アミノ酸を含み、
    個々のエピトープ領域が、抗体が特異的に結合できるエピトープを構成するのに十分な数のアミノ酸を含む、
    当該コレクション。
  92. ｍ×ｎ個の異なるエピトープタグが存在する、請求項９１の収集物。
  93. 約３０から約１０４までの捕捉試薬を含む、請求項１の組合せ。
  94. ｎが、約２から１０５まで（１０５を含む）である、請求項２９の組合せ。
  95. ｎが、約２から約１０３まで（１０３を含む）である、請求項２９の組合せ。
  96. 核酸ライブラリーをソートする方法であって、
    エピトープをコードするヌクレオチド配列を核酸ライブラリーのメンバーに結合させる、
    該ライブラリーを翻訳し、結合エピトープタグを有するコード化タンパク質を作成すること、
    結合エピトープタグを有する該翻訳したライブラリーを、エピトープに特異的に結合する捕捉試薬のコレクションと接触させること、
    を含む、当該方法。
  97. 捕捉試薬のコレクションがアレイを含む、請求項９６の方法。
  98. 捕捉試薬のコレクションが抗体を含む、請求項９６の方法。
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