JP2008543733A

JP2008543733A - 固相結合型サイモシンα−１およびその合成

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Publication number: JP2008543733A
Application number: JP2008509384A
Authority: JP
Inventors: アルベリシオ、フェルナンド; クルズ、ルイス・ハビエール; ガルシア、ラモス・イェシカ; トゥッラ−プーセ、フディト
Original assignee: ロンザア−ゲ−
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2006-05-04
Publication date: 2008-12-04
Also published as: DE602006008781D1; NO20074623L; IL186774A0; US20090171068A1; CA2600303A1; ZA200708110B; DK1891104T3; EP1891104B1; KR20080012884A; CN101166761A; MX2007013400A; PT1891104E; ATE440856T1; AU2006243344A1; WO2006117227A2; ES2332666T3; WO2006117227A3; EP1891104A2; AU2006243344B2

Abstract

本発明はサイモシンα_１の固相合成法に関する。そのペプチドまたは断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）レジン上で合成される。本発明による方法は、高い収率および純度の生成物を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、通常合成が困難なペプチドのための固相ペプチド合成法、およびそれぞれのペプチド−固相コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）に関する。

固相ペプチド合成の試みは、十分確立された日常的な方法が存在するにも関わらず、良好で効率的な合成は、合成するペプチド配列に大きく依存するという状態である。

天然のペプチドまたはタンパク質部分を由来とするいくつかのペプチド配列は、多くの「通常の」ペプチドでは非常に有効に使用できるレジン上であっても、その他のものに比べて簡単にはうまくいかない。文献では、ベータ−シート形成による、レジン上での鎖間の凝集を予防する観点から、溶媒系の慎重な微調整がしばしば提案されてきた。しかし、ジクロロメタン、Ｎメチル−ピロリドンまたはジメチルホルムアミドを用いる溶媒工学（最終的には、トリフルオロエタノールといったらせん構造を安定させる特定の極性溶媒が補われる）は合成が困難なペプチドに対する対処法を提供するにはほど遠い。

サイモシン（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ）α_１（国際的な非商標の製薬名ではサイマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ））は、Ｎアセチル化された２８ｍｅｒペプチドホルモンであり、ヒト胸腺に生じ、慢性Ｂ型肝炎の治療剤として用いられる。

その直鎖全長固相合成法（ｌｉｎｅａｒｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、早くから記述されているが、現在まで収率の低さに悩まされている。残念なことに、サイモシンα_１のアミノ酸配列中には、合成のための段階的方法である古典的な部分カップリング法（ｓｅｇｍｅｎｔｃｏｕｐｌｉｎｇａｐｐｒｏａｃｈ）において、接合部残基（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｓｉｄｕｅ）として用いることが可能なグリシンまたはプロリンが含まれない。

Ｅｃｈｎｅｒらは、Ｗａｎｇ−ポリスチレンレジン上での直鎖固相合成法を記述している（ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅｍ．１９８８，１０９５−１０９７）。記述によると、個々のカップリング後に、カイザー試験によりＤＭＦ中にてＢＯＰ試薬を用いてカップリング効率が確認されているが、５回のカップリング毎にしか、カップリングしていないペプチドのアセチル化によるキャッピングが行われていない。保護されおよび末端アセチル化されたペプチドのレジンからの切断を、濃縮されたトリフルオロ酢酸を用いて行っている；その後、レジンおよび液相を濾過によって分離し、ペプチド産物をジエチルエーテルで沈殿させて回収している。このように改修された沈殿物を定量し、「粗生成物」と名付けている。収率は、７６％と算出されている。その後初めて、粗生成物の最初のクロマトグラフィー精製が行われ、続いて、逆相ＨＰＬＣが行われている。このようにして得られた精製された生成物については、収率が示されていない。

Ｅｃｈｎｅｒの方法における問題点は、合成の際に短く望ましくない配列変種をもたらす不完全な鎖カップリングが、収率の算出において考慮されていないことである。「粗生成物」は、合成で得られた全てのペプチド種のまとまりであり、これには不完全に保護された／アルキル化されたペプチドが含まれている。しかしながら、直鎖合成法で得られる純粋なペプチドは、困難なペプチドを扱う際に問題となる；興味深いことに、Ｅｃｈｎｅｒは、このように得られる精製された生成物の収率について全く記述しておらず、また、合成のクオリティーを示すために当該分野において日常的に示されるＨＰＬＣクロマトグラムが文献中に全くない。我々が行ったところによると、Ｅｃｈｎｅｒの合成方法では、正しい生成物の収率は非常に低く、大部分は、粗生成物の大部分を成す不適切なペプチド生成物であった。

Ｅｃｈｎｅｒの方法に関する別の問題点（彼自身も指摘している：１０９５ページ、左カラム、第３段落）は、サイモシンα_１のＣ末端アミノ酸（アスパラギン）を有するＷａｎｇレジンのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）である；Ｅｃｈｎｅｒが行ったローディングは０．１５ｍｍｏｌ／ｇであったが、これは非常に低いものである。分解副反応の危険性のないレジンのローディングのために、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（４，４’−ジメトキシジフェニルメチル−）−ＯＨアミノ酸を用いなければならない。

本発明の目的は、改善されたサイモシンα_１の固相合成法を発明することである。この目的は、請求項１に記載の方法によって解決される。

本発明によると、以下の工程を含む、サイモシンα_１、または成熟サイモシンα_１のＣ末端切断型（残基１−２７を含む）もしくはＮ末端切断型（少なくとも残基１９−２８を含む）もしくは切断型（少なくとも残基１９−２７を含む）の固相上での合成方法が提供される：
ａ．好ましくは、ポリスチレン−ＰＥＧ混合レジン、ＰＥＧポリエーテル−ポリエステル混合レジンまたはＰＥＧポリエーテル−ポリアミド混合レジンおよび本質的に純粋なＰＥＧレジンから成る群から選択されるＰＥＧレジンに、適切に保護されたＦＭＯＣ−ＧｌｕまたはＦＭＯＣ−Ａｓｎ残基をカップリングさせる；
ｂ．ＦＭＯＣ合成によってペプチド鎖を伸長させる（ここにおいて、個々のアミノ酸の側鎖は、適切な保護基によって誘導体化してよい）；
ｃ．任意に、最後のＮ末端残基をアセチル化する；および
ｄ．レジンからペプチドを切断する。

本発明による方法は、単一の固相直鎖合成法にて、前例のない精製度で、それゆえに高い収率でサイマルファシンペプチドを合成することを可能とする。本発明によると、固相上でＣ末端断片のみを合成し、セグメントのカップリングにより、あらゆる全長ペプチドまたは少なくともより長い形態のペプチドを構成することも可能であり、それは、好ましい１つの実施態様において、シュードプロリンジペプチド法（ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｌｉｎｅｄｉｐｅｐｔｉｄｅｍｅｔｈｏｄ）（Ｗｏｈｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，９２１８）によってＣ末端ＳｅｒまたはＴｈｒがラセミ化に対する保護を受けたＮ末端断片のカップリングを用いて行われる。

好ましくは、合成されるペプチドは、以下の配列を有するサイモシンα_１（前駆体ペプチドと区別される、成熟した活性のあるサイモシンα_１とも言及される）であり；
１−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２８
ここにおいて、個々のアミノ酸鎖は保護されておらず、または、必要に応じて、個々の所定のアミノ酸残基が当該分野の通常の知識により適切に保護される（例えば、下記Ｂｏｄａｎｓｋｙの文献参照）。より好ましくは、そのようなペプチドは、レジンからの切断前であって直鎖合成後のステップにて、Ｎ末端アセチル化される。医薬としても用いられる天然のサイマルファシンは、Ｎ末端アセチル化されている。

特に、本発明者らは、主にサイマルファシンペプチドのＣ末端側の半分、約１９−２８残基が、鎖の欠失により大量の不純物を招き、そのため直鎖合成にて得られる最終生成物の収率を減少させることを発見した。ペプチドのこの部分は、合成することが非常に困難であるとわかった。

逆に、直鎖合成の際に、上記Ｗｏｈｒらの方法により、そのようなオキサゾリジンジペプチドを用いることも可能である。個々に保護された（好ましくはＦｍｏｃ−）アミノ酸の代わりに、そのようなジペプチドを用いる利点は、サイマルファシンの配列、特にジペプチドＡｓｐ−Ｔｈｒから推論できる；オキサゾリンジペプチド誘導体を使用することで、合成の際のアスパルチミド（ａｓｐａｒｔｉｍｉｄｅ）形成の回避が促進されると考えられる。

同様に、グルタリミド（ｇｌｕｔａｒｉｍｉｄｅ）形成の回避に、特別な保護基の使用を必要としてよい。

本発明において、カップリング反応の実行のためにＦｍｏｃ化学が強く好まれるが、Ｂｏｃ化学も同様に、別の実施態様として本発明の実施に用いてよい。

ペプチド合成のためのカップリング試薬は、当該分野で周知である（Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２^ｎｄｅｄ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９３、および、本願におけるカップリング添加剤または補助剤の役割についての考察を参照）。カップリング試薬は、混成無水物（例えばＴ３Ｐ：プロパンホスホン酸無水物）またはその他のアシル化剤、例えば活性化エステルまたは酸ハロゲン化物（例えばＩＣＢＦ、イソブチル−クロロホルメート）であってよい。または、カルボジイミド（例えば１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）、活性化ベンゾトリアジン誘導体（ＤＥＰＢＴ：３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）またはベンゾトリアゾールのウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）もしくはホスホニウム塩誘導体であってよい。

鎖伸長の際の、最高の収率、短い反応時間およびラセミ化に対する保護の観点から、反応が塩基の存在下で行われる場合に遊離カルボン酸基を活性化させることができるベンゾトリアゾールのウロニウム塩類およびホスホニウム塩から成る群から、カップリング試薬が選択されることが好ましい。そのようなウロニウムまたはホスホニウムカップリング塩の適切で同様に好ましい例は、例えば、ＨＢＴＵ（Ｏ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＡＯＰ、ＨＣＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＣＴＵ（Ｏ−１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＴＯＴＵ（Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＰｙＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシビス−（ピロリジノ）−ウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。

好ましくは、ＤＥＰＢＴまたはそれと同等なもの、ウロニウムまたはホスホニウム塩試薬を使用する場合、カップリングステップを実行するために、更なるまたは第２の弱塩基試薬が必要である。これは特定の塩基に対応したものであり、この塩基とは、その共役酸がｐＫａ７．５〜１５、より好ましくはｐＫａ７．５〜１０（ペプチドまたはアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のα−アミノ基を除外）のｐＫａ値を有するものであり、好ましくは三級の立体障害のあるアミンである。そのような例またはより好ましい例は、ヒューニッヒ塩基（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアニリン、２，４，６−トリアルキルピリジンまたは直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルを有するＮ−アルキル−モルフォリン、より好ましくはＮ−メチルモルフォリンまたはコリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）であり、最も好ましくはコリジンである。

カップリング添加剤、特にベンゾトリアゾール型のカップリング添加剤の使用もまた既知である（上記、Ｂｏｄａｎｓｋｙの文献参照）。それらの使用は、高度に活性化する前述のウロニウムまたはホスホニウム塩カップリング試薬を用いる場合に特に好ましい。それゆえ、更に好ましくは、カップリング試薬添加剤は、活性化エステルの形成が可能な求核性ヒドロキシ化合物であり、より好ましくは酸性の求核性Ｎ−ヒドロキシ官能基（Ｎは、イミド、またはＮ−アシルもしくはＮ−アリール置換トリアゼノである）を有しており、最も好ましくは、カップリング添加剤は、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体（もしくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体）または、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアジン誘導体である。そのようなカップリング添加剤Ｎ−ヒドロキシ化合物は、ＷＯ９４／０７９１０およびＥＰ−４１０１８２に広く記載されており、それぞれの開示は本願に援用される。例として、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）がある。Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン誘導体、第１におよび主にＨＯＯＢｔが特に好ましい。

カップリング添加剤のアンモニウム塩化合物は既知であり、例えばＵＳ４８０６６４１に、カップリング化学におけるそれらの使用が記述されている。

更に特に好ましい実施態様において、ウロニウムまたはホスホニウム塩カップリング試薬は、ウロニウム塩試薬であり、好ましくは、それはＨＣＴＵ、ＴＣＴＵまたはＨＢＴＵであり、より好ましくはＨＣＴＵまたはＴＣＴＵであり、最も好ましくは、Ｎ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンまたはその塩との組み合わせで反応に用いられる。

本発明の状況において、ＨＣＴＵおよびＴＣＴＵおよびこれらの考えられる類似体は、結晶構造分析からウロニウム部分よりもむしろイソニトロソ部分を含むことが示され（Ｏ．Ｍａｒｄｅｒ、Ｙ．ＳｈｖｏおよびＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏによる「ＨＣＴＵａｎｄＴＣＴＵ：ＮｅｗＣｏｕｐｌｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｓ：ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＰｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎＧｏｒｄｏｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅＦｅｂ．２００２＆ＣｈｉｍｉｃａＯｇｇｉ２００２，２０：３７−４１）、複素環式コア上のＮ−アミジノ置換基が、代わりにグアニジウム構造を生じさせるにもかかわらず、ＨＣＴＵおよびＴＣＴＵは「ウロニウム塩試薬」という用語に包含されると定義される。本状況において、化合物のそのようなクラスは、本発明によるウロニウム塩試薬の「グアニジウム型サブクラス」と称される。

塩基不安定なＮαの脱保護は、当該分野において日常的に行ってよく、例えば、Ｆｍｏｃ化学の場合にはＮ−メチルモルフォリン中の２０％ピペリジンで行われる。添加される最後のアミノ酸（例えば、典型的に、成熟サイマルファシンのＮ末端セリン）は、当然、Ｆｍｏｃの他にＮ末端保護基を有してよく、例えば、それは、Ｂｏｃまたはアセチル保護基を有してよい（しかしながら、後者は、通常、ペプチドの脱保護されたＮ末端アミノ酸のカップリング後のアセチル化によって、より便利に導入してよい）。好ましくは、最後のＮ末端残基の保護のために、Ｆｍｏｃ以外の直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）の保護基を用いてもよい。例として、Ａｌｌｏｃ保護基（例えば一級アミンの保護のために）（何れもＰｄ（０）に触媒されるアシル基転移によってペプチドから選択的に除去可能である）（Ｇｏｍｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｎ^α−Ａｌｌｏｃｔｅｍｐｏｒａｒｙｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｕｓｅｏｆａｍｉｎｅ−ｂｏｒａｎｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓａｓａｌｌｙｌｇｒｏｕｐｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．１，１９９９，２８７１−２８７４）、Ｄｄｅ基（Ｂｙｃｒｏｆｔｅｔａｌ．，ＡｎｏｖｅｌｌｙｓｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒＳＰＰＳｏｆｂｒａｎｃｈｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３，ｐ．７７８−７７９）、ヒドラジン分解によって除去可能なジメドン誘導体、およびその機能的相同体、例えばＮｄｅ基（Ｎ−１−（４−ニトロ−１，３−ジオキソインダン−２−イリデン）−エチル基（Ｋｅｌｌａｍｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ５４，１９９８，ｐ．６８１７−６８３２）；Ｎ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル（Ｃｈａｎ１９９５）が挙げられる。Ｄｄｅ、その誘導体および相同体とは、それらの遊離型で反応していない状態の式ＩＩＩによる機能的ジオキソアルキリデン部分が共通するＤｄｅ型保護基として集合的に言及される：
ＩＩＩ（−ＣＯ−）_２Ｃ＝Ｃ（−Ｒ）（−ＯＨ）
ここにおいて、Ｒは、置換または非置換アルキルであり、好ましくは２つのカルボニル基は、ａ−ＣＨ２−ＣＲ’Ｒ’’−ＣＨ２−、−ＮＲ’−ＣＯ−ＮＲ’’−または−ＣＲ’＝ＣＲ’’−骨格で繋がった環状構造を形成している。好ましくは、Ｒ’，Ｒ’’はアルキルであり、または、共同してアリールとなっている。

また、修飾されたまたはタグを付加された直交性の保護基を用いることも容易に可能であり、そのような保護基は、そのような可逆性アフィニティータグを用いた引き続くアフィニティークロマトグラフィーまたは親和性が改善された「標準的」ＲＰＨＰＬＣによって単純な精製が可能であるという付加的な利点をもたらす。この場合、合成されるペプチドは、全体の脱保護を避ける穏やかな条件の下で、最適にレジンから切断され、精製が行われ、Ｎ末端プローブが選択的に取り外され、続くＮ末端アセチル化が可能となり、最終的に全体的なペプチドの脱保護が行われる。そのような例は、Ｂａｌｌらによる文献（Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．１９９２，４０：３７０−３７９ａｎｄＢａｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ１９９４，６８６：７３−８８）に記述されるようなＦｍｏｃ誘導体である。

２０％ピペリジン−ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でＦｍｏｃ基の除去を実行すること（例えば、２ｘ１分、２ｘ１０分、１ｘ５分）は、本発明に特に好ましい。同様に好ましくは、Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨ（５当量）のカップリングを、ＤＭＦまたは同様な溶媒中で上述のカップリング試薬を用いて、６０から１２０分間行う。合成の最適化のため、特に個々の配列の位置のカップリング時間の最適化のために、カップリング後にニンヒドリン試験を行い、陽性の場合は同じ条件でカップリングを繰り返し、陰性の場合はその工程を続けた。２度目のカップリング後においてニンヒドリン試験がなお陽性の場合は、欠失したペプチド鎖のキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）のために、Ａｃ_２ＯおよびＤＩＥＡによってまたは同様な方法によってアセチル化の工程を行った。その後、そのような強化された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）カップリングおよび／またはキャッピング手順を、同一条件下で、特定の配列位置の反復合成に適用した。特に、実験の項で例示するように、レジンの選択は、配列位置特異的なカップリングの問題に強く影響することがわかった。

本発明によると、固相はＰＥＧレジンを含む。本発明によると、それらによって、格別な収率および純度で、サイマルファシンまたは困難性を伴うサイマルファシンの中心的なペプチド断片の合成が可能となる。本状況において、「固相」の定義は、不活性レジンマトリックスの他に、ペプチドとの連結のための、または更なるグラフト化リンカー（ｇｒａｆｔｅｄｌｉｎｋｅｒ）またはハンドル（ｈａｎｄｌｅ）との連結のための、不活性マトリックス物質上の複合リンカー（ｉｎｔｅｇｒａｌｌｉｎｋｅｒ）を含む。

そのようなレジンは、例えばＵＳ２００３０７８３７２Ａ１に記載されている；ＰＥＧが固相に組み込まれていることで、そのようなレジンは両親媒性の特性を得ることができ、そのことが、従来のレジン物質との違いを生んでいる。それらは、例えば膨潤後のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄレジンのような従来の固体様挙動ではなく、「ゲル様」挙動をとることが知られる。この特徴は、例えば洗浄、カップリング、脱保護ステップ等の際の拡散／液体交換の観点から、サイクルの回数を減らすことができるという利点があると言われている。特に、本発明によると、そのようなＰＥＧレジンはまた、劇的に、ならびに純度および収率を予想外に相乗的に改善して、ペプチドのための困難でペプチド特異的なカップリング工程の効率を大幅に改善することがわかっている。「ＰＥＧレジン」という用語は、本状況において一般に、ポリエーテル共重合またはブロック共重合体（少なくともＰＥＧ型ポリエーテルを含む）を含む重合レジンまたは略してＰＥＧポリエーテルレジンに関するものと厳密に解釈される。本願で使用されるポリエーテルという用語は、従来の感覚において、ポリオキシアルケニル重合体に関し、例えば、それぞれポリオキシエチレンもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン、またはこれらの混合型の重合体に関する。カーボン単量体（オキシラン以外の単量体ユニットを含む）の重合といった、そのような種類のレジンの異なる実施態様が存在し、ポリエーテル化学だけに制限されない。したがって、固相のレジン基材は、例えば、両親媒性ポリスチレン−ＰＥＧ混合レジン（例えば、ＴｅｎｔａｇｅｌによるＵＳ４９０８４０５参照）またはＰＥＧ−ポリアミドもしくはＰＥＧ−ポリエステル混合レジン（例えば、ＫｅｍｐｅによるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，７０８３；ａｌｓｏｃｐ．ＵＳ５，９１０，５５４Ａ）によって構成してよい。通常、レジンのローディングは効率性がより低く、および／または、特に酸性培地における化学的安定性が、しばしば従来のレジン（例えば古典的なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリスチレン−ＤＶＢ）のそれに匹敵しない。ポリスチレン−ＰＥＧ混合レジンは、より高いローディングに達するが、ＰＥＧ含有量の減少のため、両親媒性がより低くなる。

適切なＰＥＧレジン物質の層への非ＰＥＧレジン基材のグラフト化によって得られたＰＥＧレジンを使用することも可能である（例えば、Ｋａｔｅｓらによる、Ｈｉｇｈ−ｌｏａｄｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ（ＰＥＧ−ＰＳ）ｇｒａｆｔｓｕｐｐｏｒｔｓｆｏｒｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ１９９８，４７：３６５−３８０）。

本発明による非常に好ましい実施態様において、ＰＥＧレジンは、実質的に純粋なＰＥＧ−ポリエーテルレジンであり、より好ましくは、何れの、究極的には更に置換された、ポリスチレン共重合またはブロック共重合部分（ｓｈａｒｅ）を欠くものであり、更により好ましくは、更にどんな内部エステルまたはアミド官能基を含まず、ただポリエーテル官能基のみを含むものである。実質的に純粋なＰＥＧ−ポリエーテルレジンとはまた、本質的に純粋なＰＥＧ−ポリエーテルレジン、または、上に定義されるようなＰＥＧ−ポリエーテル部分から本質的に成るレジンことを意味してよい。最も好ましくは、それは、純粋なＰＥＧレジンまたはＰＥＧ−ポリエーテルレジンである。好ましくは、「実質的に純粋な」という意味は、純粋なＰＥＧレジンの上記構造の定義が、固相物質の乾燥重量の少なくとも７０％に達し、わずかな割合でその他の種類の重合体の添加が許されることである。そのような理想的に純粋なＰＥＧレジン物質は、通常のＦｍｏｃ合成の際に、良好な適合性および標準溶媒による取扱いの容易さとともに、最適な化学的安定性をもたらす。特に、後者の定義において、レジンを、直接または複合および／またはグラフト化リンカーを介してペプチドに架橋する末端エステルまたはアミド結合は重要ではない。というのは、それらは、内部構造的、架橋結合の特徴ではなく、従って、ここに関して、「純粋なＰＥＧ」の定義に影響しないためである。そのような「純粋で」、非常に両親媒性（ａｍｐｈｉｌｉｃ）のＰＥＧレジンは、幾つかの会社から提供されており、例えば、ＭａｔｒｉｘＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社（カナダ、ケベック州）（「ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ」ブランド）またはＶｅｒｓａｍａｔｒｉｘＡ．Ｓ．（デンマーク）から提供され、およびＷＯ０２／４０５５９に記載されている。それらは、０．５ｍｍｏｌ／ｇを超えるローディング容量を提供してよい（例えば、前述のＷＯ０２／４０５５９に記載されるＣｈｅｍＭａｔｒｉｘブランドレジン参照）。ペプチドの結合のために、そのようなレジンは、末端複合リンカー（例えばヒドロキシメチル遊離基またはそれに由来する「準天然（ｑｕａｓｉ−ｎａｔｉｖｅ）」アミノメチル、カルボキシル、またはブロモメチルもしくはヨードメチル遊離基）を有してよく、または、固相の結合のための既知のグラフト化リンカーまたはハンドル（例えば、Ｗａｎｇ、ＰＡＬ、４−アルコキシベンズアルデヒドまたはＲｉｎｋもしくはＳｉｅｂｅｒアミドリンカー）から誘導されてよい。

特に、本発明によるＰＥＧレジンの驚くべき特徴の更なる要素として、配列範囲１９−２８におけるその他の重要な残基のカップリング効率が改善されることがわかり、このことは自明なことではない一方で、特に、従来のレジン（例えばＰＳ−ＤＶＢまたはＣＴＣ−ＰＳ−ＤＶＢ）と比較して、末端Ａｓｐ／Ａｓｎ残基の側鎖アンカリング（ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎａｎｃｈｏｒｉｎｇ）を用いる場合に、２つめのアミノ酸（２７番目Ｇｌｕ）のカップリングが、突然きわめて難しいステップになることがわかった。それゆえ、ＰＥＧレジンおよび特に純粋なまたは実質的に純粋なＰＥＧ−ポリエーテルレジンを用いる場合、レジンにアンカリングするＡｓｎ部位への２７番目残基の強化されたおよび／または反復したカップリングが必要であった。「強化された（ｅｘｔｅｎｅｄｅｄ）」とは、より大きい当量のＦｍｏｃアミノ酸の使用、または平均残基よりも多いカップリング回数の使用に関する。

本発明の更なる対象は、このように得られるさまざまなペプチド−固相コンジュゲートである。前述したような定義および説明は、同様にこれらの対象にあてはまる。

そのような対象は、式Ｉによるペプチドコンジュゲートである：

ここにおいて、各々のアミノ酸残基は個々に保護されておりまたは保護されておらず、Ｒ３は、複合リンカーを含むＰＥＧ−レジン固相であり、Ｒ２はｘが０または１であるグラフト化リンカーであり、および、Ｒ１は、水素、保護基またはペプチジル遊離基であり、好ましくは、５０未満、好ましくは２５未満のアミノ酸残基のペプチジル遊離基であり、および、ここにおいて、Ｒ１がペプチジル遊離基である場合、前記遊離基の個々のアミノ酸残基は個々に保護されおり、または保護されておらず、および、前記ペプチジル遊離基のＮ末端は、遊離型であり、アセチル化されており、または保護基Ｙで保護されている。

従って、好ましくは、Ｒ１は、Ｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−、Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、またはＨ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（Ｙは、前述の通りであり、Ａｃはアセチルである）のペプチジル遊離基である。

Ｇｕｉｌｌｉｅｒ、Ｏｒａｉｎ、およびＢｒａｄｌｅｙによって定義されるリンカー（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００，２０９１−２１５７，２０００）は、単に固定された保護基とみなされ、２つのタイプのうちの１つに分類される：（ａ）固相コア物質の一部が、不可分にリンカーの部分を形成し、またはそのような部分であり、共に一緒にＲ３を構成する、複合リンカー、および（ｂ）リンカーＲ２が、複合リンカー／固相Ｒ３の上で、付加的に固体支持体（ｓｏｌｉｄｓｕｐｐｏｒｔ）に結合しており、例えばより穏和な切断条件を可能としている、非複合またはグラフト化リンカーＲ２。複合リンカー−固相の典型的な例は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）、２−クロロトリチル（ＣＴＣ）、アミノメチル等である。グラフト化リンカーＲ２が任意である一方で、複合リンカーは必須である。典型的な例は、４−ヒドロキシメチルフェノキシアセチル−または４ヒドロキシメチル安息香酸である。

従来、ペプチドは、Ｃ末端残基の１−カルボン酸官能基を介して、固相またはグラフト化リンカーにそれぞれ結合している。

好ましくは、本発明によると、サイマルファシンの合成、または前述したその断片および変種（ｖａｒｉａｎｔｓ）の合成は、２つめの最後のＧｌｕまたはＣ末端ＡｓｐもしくはＡｓｎ残基の側鎖アンカリングによって達成される。「２つめの最後のＧｌｕ」とは、本状況において、固相にアンカリングするＧｌｕ−Ａｓｐ保護ジペプチドを意味してよく、または、天然のサイマルファシンのＣ末端Ａｓｐを欠くサイマルファシン変種の合成が、前記Ｇｌｕ残基から開始されることを意味してもよい。−予想外なことに、側鎖アンカリングがより効果的な合成をもたらすことがわかった。βカルボン酸基を介して固相またはグラフト化リンカーにアンカリングする末端Ａｓｐ残基は、レジンからの切断の後、合成後にアミド化されてもよい。より好ましくはしかし、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（好ましくはｔｅｒｔブチル保護基で、そのＣカルボン酸基が十分に保護されている）は、アミド産生リンカー（ａｍｉｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｌｉｎｋｅｒ）、好ましくはグラフト化アミド産生リンカーに側鎖アンカリングしている；レジンからの切断後の最終的な生成物に関して、アミド産生リンカーの使用のため、そのようなコンジュゲートを、同様に「側鎖アンカリングＡｓｎ」とみなしてよく、およびそう名付けてよい。そのようなアミド産生リンカーの例および非常に好ましい実施態様は、例えば、’Ｒｉｎｋアミド’４−（２’，４’−ジメトキシベンジル−アミノメチル）−フェノキシ−レジン、Ｓｉｅｂｅｒレジン（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９８７，２８，２１０７−２１１０）または同様な９−アミノ−キサンテニル−型レジン、ＰＡＬレジン（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏｅｔａｌ．，１９８７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ３０，２０６−２１６）である。別の、アミド産生リンカーのやや好ましい例は、Ｍｅｉｓｅｎｂａｃｈらの文献（１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｐ．１２６５ｆ）による、特別に置換されたトリチル−アミン誘導体である。これらは、レジンからのペプチドの切断により、Ｃα−カルボキサミドが産生されまたは解放される（Ｆｍｏｃ−化学適合性）リンカー基の例である。言うまでもなく、そのようなアミドリンカーの使用は、もちろん、行われる固相合成の種類に依存し、すなわち、例えば、カップリングに使用されるのが、従来のＢｏｃまたは現在の習慣的な直交性のＦｍｏｃ保護化学かどうか；Ｂｏｃ特異的アミドレジンリンカーがＰＡＭであるかどうかに依存する。したがって、そのようなリンカー基を含む固相は、本状況において「アミド生成固相」と称される。

カップリング試薬を用いる、１または２のリンカーを含む、固相上のＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕの取り込み（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，ｖａｎＡｂｅｌ，Ｂａｒａｎｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．，３５，２８４−２８６，１９９０）は記述されており、本発明の状況において適用してよい。通常、ウロニウム型カップリング試薬が、これを達成するために好ましい。

この側鎖アンカリング戦略の利点は以下の通りである。

（ｉ）固体支持体への第１のアミノ取り込みは、アミド結合を通して、より定量的な収率で行われ、それゆえ、ペプチド結合の形成のために用いられるのと同じ試薬を用いることが可能である。加えて、Ｗａｎｇ型レジンへのアスパラギン誘導体の取り込みは、側鎖アミドが保護されていない場合、低収率で、ラセミ化のリスクをともなって、およびβ−シアノアラニンの形成をともなって起こる（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓｅｔａｌ．，１９５８，Ａｍ．ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．８０：２５５８）。さらに、側鎖非保護アスパラギンは、１−カルボン酸基およびカルボキサミド基を通して、ハロゲンレジンに取り込むことが可能であり、例えば適切に保護されたＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｍｂｈ）−ＯＨアミノ酸の使用を要求し、最終的にペプチドの脱保護の段階で更なる問題を作る。

（ｉｉ）酸不安定性ｔＢｕに基づく保護基（第１の残基の１−カルボン酸の、ならびにＡｓｐおよびＧｌｕ残基のω−カルボン酸のｔＢｕエステル、ＳｅｒおよびＴｈｒ側鎖のｔＢｕエーテル）およびリジン側鎖のための酸不安定性Ｂｏｃに関与する側鎖アンカリング戦略が、最終的な全体の脱保護を容易にするだろう。なぜなら、Ｈ_２０といった単純なスカベンジャーを使用することができるからである。対照的に、Ａｓｐがトリチル、キサンチル（ｘａｎｔｙｌ）または２，４，６−トリメトキシベンジル保護基を組み込まれる場合、それは付加的なスカベンジャーの存在を必要とする。

（ｉｉｉ）バックボーンペプチド鎖の側鎖アンカリング戦略への成長は、アンカリングが側鎖を介すために、１−カルボン酸アンカリング戦略より高い柔軟性があるだろう。

下記スキームＩは、サイマルファシン（ザダシン（Ｚａｄａｘｉｎｅ））のための、本発明によるＰＥＧレジン上での、最も好ましくは純粋なまたは実質的に純粋なＰＥＧレジン上での、最も好ましい合成の様式を要約している（ここにおいて、リンカー１はアミド産生リンカーであり、リンカー２は複合リンカーである）。

スキームＩ
（ｉ）カップリング試薬を用いた、１または２のリンカーを含む、固体支持体（ＳＳ）上でのＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕの取り込み（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，ｖａｎＡｂｅｌ，Ｂａｒａｎｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．，３５，２８４−２８６，１９９０）。
（ｉｉ）残りのＦｍｏｃ保護アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒのためにｔＢｕ；およびＬｙｓのためにＢｏｃ）によるペプチド鎖の延長。
（ｉｉｉ）アセチル化。
（ｉｖ）固体支持体からのペプチドの切断および保護基の除去（１段階（高酸濃度溶液）または２段階（低酸濃度溶液、それに続き高酸濃度溶液）で行うことが可能である）。

一般的方法：Ｆｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ−ＰＳ−レジンはＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（スイス、ラウフェルフィンゲン（Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ））より、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘレジンはＭａｔｒｉｘＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ（カナダ、ケベック）より、２−Ｃｌ−ＴｒｔＣｌ−レジンはＣＢＬ（ギリシャ、パトラス）より、ＨＣＴＵはＬｕｘｅｍｂｏｕｒｇＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＬｔｄ．（イスラエル、テルアビブ）より、保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体はＩＲＩＳＢｉｏｔｅｃｈ（ドイツ、マルクトゥレドヴィッツ）より入手した。

フィルタを取り付けたガラス漏斗またはポリエチレン多孔性ディスクを取り付けたポリプロピレン注射器（５０ｍＬ）の一方にて、固相合成を行った。溶媒および可溶性試薬を吸入によって除去した。ピペリジン−ＤＭＦ（２：８、ｖ／ｖ）を用いて、Ｆｍｏｃ基の除去を行った（２ｘ１分、２ｘ１０分、１ｘ５分）。脱保護、カップリングおよび再度の脱保護のステップ間の洗浄は、それぞれ１０ｍＬ溶媒／ｇレジンを用いて、ＤＭＦ（５ｘ０．５分）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｘ０．５分）で行った。ペプチド合成変換および洗浄は２５℃で行った。ペプチジル−レジンの一定分量（約２ｍｇ）をＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ（９５：５）で１時間切断し、得られた中間生成物をＨＰＬＣで分析することで、固相上で行われる合成について管理した。ＨＰＬＣ逆相カラムＳｙｍｍｅｔｒｙ（商標）Ｃ１８４，６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ（カラムＡ）は、Ｗａｔｅｒｓ（アイルランド）から入手した。分析的ＨＰＬＣは、２溶媒送達ポンプ（Ｗａｔｅｒｓ１５２５）、および自動注入器（Ｗａｔｅｒｓ７１７ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）、２重波長検出器（Ｗａｔｅｒｓ２４８７）を含むＷａｔｅｒｓ装置にて行った。ＵＶ検出は、２１５または２２０ｎｍで、水（＋０．０４５％ＴＦＡ）に対して３０％から１００％のＣＨ_３ＣＮ（＋０．０３６％ＴＦＡ）の直線勾配にて、１５分間行った。

ペプチドサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳ−ＭＳ分析は、ＡＣＨマトリックスを用いて、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＶｏｙａｇｅｒＤＥＲＰで行った。

実施例１
Ａｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−レジン）−ＯｔＢｕ。

ステップ１
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−レジン）−ＯｔＢｕの側鎖アンカリング
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−レジン（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）（５ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を、多孔性ディスクを取り付けたガラス漏斗に置いた。続いて、レジンを、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｘ０．５分）、ＤＭＦ（３ｘ０．５分）、およびピペリジン（一般的方法に記載されるとおり）およびＤＭＦ（５ｘ０．５分）による洗浄／処理に供した。次に、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ（４．１１ｇ、５当量）およびＤＩＥＡ（３．４ｍＬ、１０当量）の入ったＤＭＦ（９ｍＬ）を添加し、ＨＣＴＵ（３．９６ｇ、４．８当量）の入ったＤＭＦ（５ｍＬ）を添加した。混合物を機械的に２時間撹拌し続け、レジンをＤＭＦ（３ｘ０．５分）で洗浄した。ニンヒドリン試験は陰性であった。Ａｃ_２Ｏ（０．５ｍＬ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７ｍＬ、５ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（１４ｍＬ）を添加し、１５分間機械的に撹拌し、レジンをフィルタでろ過し、ＤＭＦ（３ｘ０．５分）で洗浄した。
成功したローディングは、０．４ｍｍｏｌ／ｇと決定された。

ステップ２
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−レジン）−ＯｔＢｕ。

Ｆｍｏｃ基を除去し、続いて、Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨ（５−１０当量）を、ＤＩＥＡ（３．４ｍＬ、１０当量）の入ったＤＭＦ（９ｍＬ）と共に、上記のペプチジル−レジン（ステップ１）に添加し、ＨＣＴＵ（３．９６ｇ、４．８当量）の入ったＤＭＦ（５ｍＬ）を添加した。混合物を、機械的に１−２時間撹拌し、レジンをＤＭＦ（３ｘ０．５分）で洗浄し、ニンヒドリン試験を行った。試験が陽性（青色）となった場合、カップリングを繰り返し、一方わずかに茶色になった場合は、Ａｃ_２Ｏ（０．５ｍＬ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７ｍＬ、５ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（１４ｍＬ）にて、１５分間機械的に撹拌しながらアセチル化のステップを行った。ピペリジン処理の後、一定分量のレジンをとった。位置Ｅ２７、Ｋ１９、それぞれの位置で、１回当たり少なくとも３５分の反応時間で１０当量のＦｍｏｃアミノ酸を用いたダブルカップリングを行った。

ステップ３
Ａｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−レジン）−ＯｔＢｕ。

機械的に撹拌しながら、Ａｃ_２Ｏ（０．５ｍＬ，５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７ｍＬ，５ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（１４ｍＬ）にて、最終的なアセチル化を１５分間行った。このとき、ニンヒドリン試験は陰性であった。レジンを乾燥し、得られた量は１６．５ｇであった。

ステップ４
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ（ザダシン、サイマルファシン）。

レジンからの一段階切断および全体の脱保護を行った。ステップ３によるレジンの一部（５ｇ）を、多孔性ディスクを取り付けたガラス漏斗に入れ、冷却したＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ（９５：５）（３５ｍＬ）で２時間処理し、その後、溶液をろ過し、更にレジンをＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ（９５：５）（１０ｍＬ）で洗浄した。１つにしたＴＦＡ溶液を、冷却したｔブチルメチルエーテル（３５０ｍＬ）に注ぎ、混合物を遠心分離した。固体物をデカンテーションで分離した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ，ｃａｌｃｄ．３１０６．５０．Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ３１０７．３６［Ｍ＋Ｈ］＋。

粗製ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、生成物はほとんど純粋であり、収率は９０％に達することがわかった（図１）。２つのマイナーな混入ピークは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８Ｈｙｐｅｒｓｉｌ、１０−３０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ／水、４５分間）によって容易に除去することができ、正しい生成物ピークがほとんど完璧に回収され、純粋な生成物が得られた（図２）。

実施例２：比較例
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ（ザダシン、サイマルファシン）。

Ｆｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ−ＰＳ−レジン（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ）（３．３３ｇ、２ｍｍｏｌ）を、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−レジンの代わりに用いた以外は、実施例１および２に記載される実験方法と同様に行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ，ｃａｌｃｄ．３１０６．５０．Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ３１０７．２４［Ｍ＋Ｈ］＋。

ＲＰ−ＨＰＬＣによりピーク面積として決定される粗製生成物混合物の純度および収率は、不純物によるブロードなスペクトルをともなって、わずか４０％の収率であった（図３）。

実施例３：比較例
Ａｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｏ−（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ）−レジン。

ステップ１
ＣＴＣレジン上でのＣα末端アンカリングによる、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｏ−ＴｒｔＣｌ−レジンの作製
２−Ｃｌ−ＴｒｔＣｌ−レジン（０．２ｇ，１．６４ｍｍｏｌ／ｇ；Ａｍｂｅｒｓｙｎｔｈ（商標）ＣＴＣ（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓフランス、パリ）、ポリスチレン−１％ジビニルベンゼンから成るマトリックス）を、ポリエチレンフィルターディスクを取り付けた１０ｍＬポリプロピレン注射器に入れた。次に、レジンをＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｘ０．５分）で洗浄し、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（０．７の当量）およびＤＩＥＡ（２４１μＬ）の入ったＣＨ_２Ｃｌ_２（２．５ｍＬ）の溶液を添加し、混合物を１５分間撹拌し、更にＤＩＥＡ（１２１μＬ、全７当量）を添加し、混合物を４５分間撹拌した。１０分間撹拌した後、ＭｅＯＨ（１６０μＬ）を添加して反応を停止させた。その後、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｏ−ＴｒｔＣｌ−レジンを、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｘ０．５分）およびＤＭＦ（３ｘ０．５分）で洗浄した。Ｆｍｏｃの検出から算出されるローディングは０．８ｍｍｏｌ／ｇであった。

ステップ２
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＣｌＴｒｔ−ＰＳ−レジン。

Ｆｍｏｃ基を除去し、続いて、Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨ（１０当量）を、ＤＩＥＡ（２０当量）の入ったＤＭＦ（９ｍＬ）と共に、上記ペプチジル−レジン（ステップ１）に添加し、その後、ＨＣＴＵ（９．６の当量）の入ったＤＭＦを添加した（ＡＢＩ自動合成機４３３Ａ、カップリグ時間６０分）。

ステップ３
Ａｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＣｌＴｒｔ−ＰＳ−レジン。

散発的な手動の撹拌を行いながら、Ａｃ_２Ｏ（０．５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（２ｍＬ）によって最終的なアセチル化を１５分間行った。ニンヒドリン試験は陰性だった。

ステップ４
Ａｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。

上記ステップ３による保護されたペプチドを、ＴＦＡ−Ｅｔ_３ＳｉＨ−ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１：９８）（５ｘ３０秒）によりレジンから切断した。ろ液をＨ_２Ｏ（４ｍＬ）に回収し、Ｈ_２Ｏを減圧下で部分的に除去した。次に、アセトニトリル（ＡＣＮ）を添加し、Ｈ_２Ｏ除去により生じた固体を溶解させ、溶液を凍結乾燥させた。

ステップ５
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ（ザダシン、サイマルファシン）。

ステップ４による保護されたペプチドを、ＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ（９５：５、５ｍＬ）に溶解し、混合物を１時間撹拌した。次に、溶液をろ過し、更にレジンをＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ（９５：５）（１ｍＬ）で洗浄した。１つにしたＴＦＡ溶液を、冷却したｔブチルメチルエーテル（２５ｍＬ）に注ぎ、混合物を遠心分離した。固体をデカンテーションで分離した。その後、Ｈ_２Ｏ（５ｍＬ）を添加し凍結乾燥させた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ，ｃａｌｃｄ．３１０６．５０．Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋３１０７．９８。

ＲＰ−ＨＰＬＣのピーク面積として決定される粗製物の純度および収率は、多数の不適当な鎖変種による強いバックグラウンドのスメアを伴って、正しい生成物は２０％であった（図４）。手動のカップリングによる短い断片（Ｌｙｓ１９からＡｓｎ２８）の固相合成の慎重な反復、および全ステップ後のニンヒドリン試験から、しばしば鎖合成がＶ２２の取り込みの後に効果的に停止することがわかった；３つの連続したカップリング（Ｅ２１、Ｋ２０およびＫ１９）は、非常に非効率的であり、反応していない鎖のキャップ形成が必要なことが示された。ダブルカップリング、カップリング時間の延長および使用するＦｍｏｃアミノ酸の当量の増加は、満足に問題を解決できず、非常に効果的な合成法を確立することはできなかった（図５）。

実施例４：比較例
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ（ザダシン、サイマルファシン）。

ＭＢＨＡレジン（ポリスチレン−１％ジビニルベンゼンをベースとする４−メチルベンズヒドリルアミンレジンＬＬ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（商標），Ｍｅｒｃｋ／ドイツ）にＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋハンドルを組み込んだ点、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕを、実施例１のステップ１に記載されるように、Ｒｉｎｋ部分のＦｍｏｃ基の除去の後、Ｒｉｎｋアミノメチルグラフト化リンカーに側鎖アンカリングさせた点以外は、実施例２と本質的に同様な実験方法とした。ローディングは、０．６６ｍｍｏｌ／ｇと決定された。位置Ｄ２８（すなわちＮ２８）、Ｅ２７，Ｅ２１，Ｋ２０，Ｋ１９におけるダブルカップリングにより、ＨＣＴＵ（１０当量）を用いて３５分間カップリングを行った。前述したようにアセチル化を行った後、一段階切断および脱保護を、ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（９５：５）により行った。ＲＰ−ＨＰＬＣで決定される粗製の純度および収率は、２７％であった（図６）。

実施例５
ＮＨ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ（サイマルファシンの断片１９−２８）
例１で示される配列位置にてダブルカップリングは行わず、３５分間の均一な単一のカップリング時間を適用した以外は、側鎖アンカリングおよび合成は、本質的に例１で記述されるように、Ｒｉｎｋ−Ｃｈｅｍｍａｔｒｉｘレジン上で行った。ＨＰＬＣダイアグラムにて、２７番目Ｇｌｕ残基の欠失が、唯一ではあるものの優位な鎖停止副産物として見られた（図７）。例１で述べたように、この副産物は、Ｅ２７における強化され反復したカップリングにより効率よく抑制することができた。

実施例６
ＮＨ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ（サイマルファシンの断片１９−２８）
Ｒｉｎｋアミノメチルリンカーでグラフト化されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ社製ＰＥＧ−ＭＢＨＡレジン（ＭｅＯ［ＰＥＧ］２０００−ＣＯ−Ｏｒｎ−ＭＢＨＡ−ＰＳ−レジン、上述のＫａｔｅｓらによる文献（Ｈｉｇｈ−ｌｏａｄＰＥＧ−ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｇｒａｆｔｓｕｐｐｏｒｔｓｆｏｒｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に同様に記載）を使用したこと以外は、本質的に実施例１に記載されるように、側鎖アンカリングおよび合成を行った。Ｒｉｎｋ−ＰＥＧ−ＭＢＨＡレジンのローディングは、０．５５ｍｍｏｌ／ｇであった。特に、ダブルカップリングを、配列位置Ｅ２７，Ｅ２１，Ｋ２０，Ｋ１９にて行った。ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定された粗製の純度および収率は、９２％であった（図８）。

図１は、実施例１による粗製ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図２は、実施例１による、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８Ｈｙｐｅｒｓｉｌ、１０−３０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ／水、４５分間）による精製後の、ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図３は、実施例２による粗生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図４は、実施例３による粗生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図５は、実施例３によるＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図６は、実施例４による粗生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図７は、実施例５による粗生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。図８は、実施例６による粗生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。

Claims

式Ｉによるペプチドコンジュゲート：

ここにおいて、各々のアミノ酸残基は個々に保護されておりまたは保護されておらず、Ｒ３は、複合リンカーを含むＰＥＧ−レジン固相であり、Ｒ２はｘが０または１であるグラフト化リンカーであり、および、Ｒ１は、水素、保護基またはペプチジル遊離基であり、好ましくは、５０未満、好ましくは２５未満のアミノ酸残基のペプチジル遊離基であり、および、ここにおいて、Ｒ１がペプチジル遊離基である場合、前記遊離基の個々のアミノ酸残基は個々に保護されおり、または保護されておらず、および、前記遊離基のＮ末端は、遊離型であり、アセチル化されており、または保護基Ｙで保護されている。
前記保護基Ｙが、Ｆｍｏｃ基、Ｄｄｅ型基、Ｂｏｃ基またはこれらの保護基の誘導体、好ましくはＦｍｏｃもしくはＤｄｅ型基の誘導体であって、このように保護されたペプチドが、適したクロマトグラフィー固体マトリックス物質に対して可逆的に親和性結合できるようにする部位を含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
前記保護基Ｙが、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー固体マトリックス物質に対する可逆的な親和性結合を可能とすることを特徴とする、請求項３に記載のペプチドコンジュゲート。
前記Ｒ１が、Ｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−、Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、またはＨ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（Ｙは、前記の通りの意味を有する）であることを特徴とする、請求項１から３の何れか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
以下の工程を含む、サイモシンα_１、サイモシンα_１のＣ末端切断型（残基１−２７を含む）、サイモシンα_１のＮ末端切断型（少なくとも残基１９−２８を含む）または成熟サイモシンα_１の切断型（少なくとも残基１９−２７を含む）の固相上での合成方法：
ａ．好ましくは、ポリスチレン−ＰＥＧ混合レジン、ＰＥＧポリエーテル−ポリエステル混合レジンまたはＰＥＧポリエーテル−ポリアミド混合レジンおよび本質的に純粋なＰＥＧレジンから成る群から選択されるＰＥＧレジン固相に、適切に保護されたＦＭＯＣ−Ｇｌｕ、ＦＭＯＣ−ＡｓｐまたはＦＭＯＣ−Ａｓｎ残基をカップリングさせる；
ｂ．ＦＭＯＣ合成によってペプチド鎖を伸長させる（ここにおいて、個々のアミノ酸の側鎖は、適切な保護基によって誘導体化されてよい）；
ｃ．任意に、最後のＮ末端残基をアセチル化する；および
ｄ．レジンからペプチドを切断する。
前記合成されるペプチドが、以下の配列を有するサイモシンα_１であることを特徴とする、請求項５に記載の方法：
１−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２８
ここにおいて、個々のアミノ酸鎖は、保護されていない、または適切に保護されている。
前記ＰＥＧレジンが両親媒性レジンであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
前記ＰＥＧレジンのローディング容量が少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇであって、好ましくはＰＥＧレジンが、本質的にポリスチレン共重合部分（ｓｈａｒｅ）を欠くことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
複合および／またはグラフト化リンカーを除いて、前記ＰＥＧレジンが、実質的に純粋なポリエーテル−ＰＥＧレジンであり、好ましくは純粋なＰＥＧ−ポリエーテルレジンであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。