JP2009189372A - ＨＩＦ−１α発現を調節するオリゴマー化合物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、ＨＩＦ−１αの機能を効果的に阻害し、例えば癌や子癇前症の治療に用いる薬剤を提供することである。
【解決手段】本発明は、低酸素症誘導因子１αに対抗するオリゴヌクレオチドを供する。（ＨＩＦ−
１α）遺伝子が、ＨＩＦ−１αの発現を調節するために供される。組成物は、ＨＩＦ−１
αをコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを含む。ＨＩＦ−１α発現の調節、及び低酸素症誘導因子１αに関連する疾病の治療
にこれら化合物を使用する方法が提供される。疾病の例としては、ガン及び子癇前症であ
る。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、核酸アナログ、又は構造的にロ
ックされた核酸［Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）］又はこれらの組
合せから構成されている。
【選択図】なし

Description

(関連出願)
本特許出願は２００２年4月5日に出願された米国仮出願第６０／３７０，１２６号の継
続出願であり、当該仮出願の全文が本明細書中に参照として取り込まれている。

本発明は、ＨＩＦ−１αの発現を調節するための組成物及び方法を提供するものである
。特に、本発明はオリゴマー化合物に関するもので、その好ましい化合物にはオリゴヌク
レオチドがあり、ＨＩＦ−１αをコードする核酸と特異的にハイブリッドを形成し得る。
このオリゴヌクレオチド化合物がＨＩＦ−１αの発現を調節することが示されており、そ
のの医薬製剤及び癌や子癇前症治療への使用が開示されている。

固形癌が２，３ミリメートル以上に増殖するのには血液供給を確立し、グルコース代謝
を増進する必要がある。癌が低酸素症をどのようにして感知し、低酸素症-誘導性の遺伝
子を活性化し、血液システムを確立するために血管新生因子を選択することによってこれ
に如何に応答するかが腫瘍生物学の中心課題である。多くの腫瘍は低酸素状態の微小環境
を含み、それが悪性化、転移、並びに放射線療法及び化学療法に対する抵抗性に関係して
いる。

低酸素症-誘導性因子-１（ＨＩＦ−１）が見出されたことにより低酸素症-誘導性遺伝
子の制御についてのある程度の洞察が与えられた（米国特許第５８８２９１４号及び国際
公開第ＷＯ９６／３９４２６号及び同第ＷＯ９９／４８９１６号公報）。ＨＩＦ−１は２
個のサブユニット、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１βから構成され、ＶＥＧＦの様な血管新
生因子並びに解糖系酵素及びグルコーストランスポーター１又は３（ＧＬＵ−１又は３）
のような解糖関連蛋白質をコードする遺伝子のエンハンサー中にある低酸素症-応答成分
（ＨＲＥｓ）と結合する。

アンチセンスＨＩＦ−１αプラスミドを腫瘍内に遺伝子移入してＨＩＦ−１αの負の制
御を組込むことにより、ＶＥＧＦ産生が抑制され腫瘍内の微細血管密度が減少することが
示されている（国際公開第ＷＯ００／７６４９７号公報；Ｓｕｎ Ｘら、Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ（２００１）８，６３８−６４５）。プラスミドにはＨＩＦ−１α（ヌクレオ
チド１５２−４５４；Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＡＦ００３６９８）の５’−末端をコードする
３２０−ｂｐのｃＤＮＡフラグメントが含まれていた。さらに、上記国際出願には、発現
ベクターが免疫治療剤と併せて使われるべきであるという事に基づく方法が述べられてい
る。しかし、この発現プラスミドからのアプローチの主たる弱点は、プラスミドの大きさ
及び発現生成物の核酸分解酵素感受性ゆえに、治療剤として適切ではないという点である
。

ＨＩＦ−１αフラグメント発現プラスミド以外に、ＨＩＦ−１αを標的としたアンチセ
ンスの２，３のオリゴヌクレオチドが、特定の生物学的メカニズム又は生物学的標的を研
究する道具として設計されている。例えば、低酸素下の外植片のＨＩＦ−１α発現をアン
チセンスで阻害するとＴＧＦβの発現が阻害されることが示されている（Ｃａｎｉｇｇｉ
ａ，Ｉ．ら，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｈ
２０００，１０５，５７７−５８７）。この特殊な研究では、ただ１種のアンチセンスオ
リゴヌクレオチドが合成され、それはＨＩＦ−１αのｍＲＮＡの開始コドンＡＵＧと隣接
する配列を標的とするホスホロチオエートであった。その配列はＨＩＦ−１α ５’−Ｇ
ＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴ−３’であり、ＨＩＦ−１αの負の調節がｍＲＮＡレベル
で明らかにされた。このオリゴは過絨毛性栄養芽細胞の発生と浸潤におけるＨＩＦ−１α
の役割を研究するために使われており、子癇前症におけるＨＩＦ−１αの潜在的な役割に
関連付けられた（Ｃａｎｉｇｇｉａ，Ｉ．ら，Ｐｌａｃｅｎｔａ（２０００），２１，Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ，，Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４，Ｓ２５
−Ｓ３０）。

上記と同じオリゴヌクレオチド配列を使った他の研究では、ＨＩＦ−１αのアンチセン
ス阻害によりペルオキシソームの増殖活性受容体（ＰＰＡＲｓ）が減少することが示され
た（Ｎａｒｒａｖｕｌａ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｌｇａｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，１６６，７５４３−７５４８（２００１））。上記のオリゴは、ＨＩＦ−１
αのプラスミノーゲン アクチベーター インヒビター−１（ＰＡＩ−１）の誘導にニッ
ケルが必要であること示すことにも使われた（Ａｎｄｒｅｗ、Ａ．Ｓ．，Ｋｌｅｉ Ｌ．
Ｒ．，Ｂａｒｃｈｏｗｓｋｙ，Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８１，Ｌ６０７−Ｌ６１５（２００１））。

また、単一のアンチセンスのオリゴヌクレオチドも、神経細胞内ＡＲＮＴ２二量体の潜
在的なパートナーとして低酸素症誘発性因子ＨＩＦ−１αの２つのスプライシング変異型
の研究に使われている。アンチセンスのオリゴヌクレオチドは５’−ＴＣＴＴＣＴＣＧＴ
ＴＣＴＣＧＣＣ−３’配列のホスホロチオエート修飾体であった。細胞をこのオリゴヌク
レオチドで処理することにより、[^３Ｈ]チミジン組込みが抑制されたが、正常酸素圧細胞
におけるアポトーシス効果はなかった（Ｄｒｕｔｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
．，１２，３７０１−３７０８（２０００））。
さらに、ＨＩＦ−１αに対する単一のアンチセンスのオリゴヌクレオチドは心臓エンド
セリン（ＥＴ）−１の遺伝子発現を阻害することが明らかにされており、ＨＩＦ−１αが
心臓障害における心筋内ＥＴ−１遺伝子発現増進に関与しているという仮説が立てられた
（非特許文献１）。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは次のような配列であった：ＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＣＧＧＴＧＣ。

Ｋａｋｉｎｕｍａ，Ｙ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３，２３８７−２３９４（２００１）

現在、ＨＩＦ−１αの合成を効果的に阻害し、疾病治療に使うことができる治療用のア
ンチセンス剤は知られていない。従って，ＨＩＦ−１αの機能を効果的に阻害し、例えば
癌や子癇前症の治療に用いる薬剤が望まれる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＨＩＦ−１αを調節する、長さが８から５０核酸塩基の化合物で、配列番号 ２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１
９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、
４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５
９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、
８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９
９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０
９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４又は１１５の少なくとも８核酸塩基部分を
含む配列を有する化合物。
（項目２）
ＨＩＦ−１αをコードする核酸分子を標的とする、長さが８から５０核酸塩基の化合物
であって、当該化合物は、ＨＩＦ−１αをコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、
ＨＩＦ−１αの発現を阻害し、そして該化合物は、配列番号 ２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３
５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８
、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、
６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７
５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８
、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０
１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１
１、１１２、１１３、１１４又は１１５の少なくとも８核酸塩基部分を含む配列を有する
化合物。
（項目３）
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１又は２のいずれか１項に記載の化合
物。
（項目４）
少なくとも一つのヌクレオチドが、少なくとも一つの核酸類縁体を含む、項目１から
３のいずれか１項に記載の化合物。
（項目５）
少なくとも一つのヌクレオチドが、少なくとも一つのロックされた核酸（ＬＮＡ）単位
を含む、項目１から４のいずれか１項に記載の化合物。
（項目６）
ＬＮＡ単位が、スキーム２の一般式の構造を有する、項目１から５に記載の化合物。

（項目７）
少なくとも一つのヌクレオチドが、スキーム３のいずれか一つの式で表されるＬＮＡ単
位を含む、項目１から６に記載の化合物：

式中、Ｘは独立して−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−及びＮ（Ｒ ^Ｈ ）から選ばれ、
Ｚ及びＺ ^＊ は独立してヌクレオシド間結合、末端基又は保護基からなる群より選ばれ、
Ｂは、天然又は非天然の核酸塩基を構成する。
（項目８）
ヌクレオシド間結合が、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−
Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ
）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−
Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ ^Ｈ ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲ ^Ｈ
）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、
−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲ ^Ｈ ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２ＮＲ ^Ｈ −、−ＮＲ ^Ｈ −Ｐ（Ｏ）２−Ｏ
−、−ＮＲ ^Ｈ −ＣＯ−Ｏ−（式中、Ｒ ^Ｈ は水素及びＣ _１−４ アルキルから選ばれたもので
ある）からなる群より選ばれる、項目４から７に記載の化合物。
（項目９）
修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、項目８に記載の
化合物。
（項目１０）
核酸塩基が、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモ
ウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、
ジアミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンからなる群より選ばれた修飾核酸塩基で
ある、項目４から９に記載の化合物。
（項目１１）
ＬＮＡ単位が、Ｄ−β又はＬ−α立体配置のいずれかのオキシＬＮＡ、チオＬＮＡ、ア
ミノＬＮＡである、項目４から１０のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１２）
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、キメラオリゴヌクレオチドである、項目１から
１１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１３）
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマー（gapmer）、ヘッドマー（headmer
）又はテールマー（tailmer）である、項目１２に記載の化合物。
（項目１４）
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０又は２１−マー（-mer）である、項目１から１３のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１５）
ＬＮＡ単位の数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１である、項目１から１４のいずれか１
項に記載の化合物。
（項目１６）
少なくとも、４ヌクレオチドがＬＮＡである、項目１から１５のいずれか１項に記載
の化合物。
（項目１７）
ＨＩＦ−１αをコードする核酸分子を標的とする、長さが８から５０核酸塩基の化合物
であって、当該化合物は、ＨＩＦ−１αをコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、
ＨＩＦ−１αの発現を阻害するものであり、そして当該化合物は、配列番号 ２、３、１
２、２２、２３、５３、５４、５５、５６、５９、６０、６１、８９、９０、９３、９４
、９５、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１
１２、１１４又は１１５の少なくとも８核酸塩基部分を含む配列を有する化合物。
（項目１８）
項目１から１７に記載の化合物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物
。
（項目１９）
薬学的に許容される担体を更に含む、項目１から１８のいずれか１項に記載の化合物
を含む医薬組成物。
（項目２０）
化合物が薬学的に許容される塩として使用される、項目１から１８のいずれか１項に
記載の化合物を含む医薬組成物。
（項目２１）
抱合体又は調剤を更に含む、項目１から１８のいずれか１項に記載の化合物を含む医
薬組成物。
（項目２２）
化合物がプロドラッグである、項目１から１８のいずれか１項に記載の化合物を含む
医薬組成物。
（項目２３）
他のオリゴマー化合物、化学療法化合物、抗炎症性化合物及び／又は抗ウイルス性化合
物を更に含む、項目１から１８のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
（項目２４）
ＨＩＦ−１αの発現を阻害するために、細胞又は組織を、項目１から２３のいずれか
１項に記載の化合物と接触させることを含む、細胞又は組織において、ＨＩＦ−１αの発
現を阻害する方法。
（項目２５）
遺伝子又は遺伝子からのＲＮＡを、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１
０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１
１３、１１４又は１１５の少なくとも８核酸塩基部分を含む配列を有するオリゴマー化合
物と接触させて遺伝子の発現を調節することよりなる、疾病に関係する遺伝子の発現を調
節する方法。
（項目２６）
化合物が、一つ又はそれ以上のＬＮＡ単位を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
化合物が、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズし、その発現を阻害する、
項目２５又は２６に記載の方法。
（項目２８）
一つ又はそれ以上のＬＮＡ単位を含むＨＩＦ−１αを標的とするオリゴヌクレオチドの
治療上有効な量を哺乳動物に投与することよりなる、ガン疾病に罹患している、又は罹り
やすい哺乳動物を治療する方法。
（項目２９）
疾病が、普通のガン、例えば、原発性及び転移性の、乳腺、結腸直腸、前立腺、膵臓、
その他の胃腸（GI）癌、肺、子宮頚、卵巣、脳、頭頚部、頚部、大腸（colon）、肝臓、
甲状腺、腎、精巣、胃、腸、大腸（bowel）、食道、脊髄、静脈洞、膀胱又は尿管癌、ま
た子癇前症、炎症性腸疾患及びアルツハイマー病、である項目２５から２８のいずれか
１項に記載の方法。
（項目３０）
細胞を調節するために、細胞を項目１から１８のアンチセンス化合物と接触させるこ
とよりなる、血管形成及び赤血球増殖、細胞増殖、鉄代謝、グルコース及びエネルギー代
謝、ｐＨ調節、組織浸潤、アポトーシス、多剤耐性、細胞ストレス応答又はマトリックス
代謝を調節する方法。
（項目３１）
細胞をインビトロで項目１から１８に記載のアンチセンス化合物の有効量と接触させ
、それによって細胞の増殖を阻害することよりなる、細胞の増殖を阻害する方法。
（項目３２）
細胞がガン細胞である項目３１に記載の方法。
（項目３３）
アポトーシスを調節するために、細胞を項目１から１８に記載のアンチセンス化合物
と接触させることよりなる、細胞におけるアポトーシスを調節する方法。
（項目３４）
アポトーシスの調節が、アポトーシス刺激に対する感作である項目３３に記載の方法
。
（項目３５）
アポトーシス刺激が細胞傷害性化学療法剤である項目３３又は３４に記載の方法。
（項目３６）
細胞を化学療法剤と接触させることを更に含む、項目３５に記載の方法。

（発明の概要）
本発明は、オリゴマー化合物、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象にし
たもので、それらはＨＩＦ−１αをコードする核酸を標的にし、ＨＩＦ−１αの発現を調
節する。本発明のオリゴマー化合物を含有する医薬及び他の組成物も供される。さらに、
当該細胞又は組織を本発明のオリゴマー化合物又は組成物の１種又はそれ以上と接触させ
ることよりなる、細胞又は組織内でのＨＩＦ−１α発現を調節する方法が供される。また
、本発明のオリゴマー化合物又は組成物の１種又はそれ以上の治療又は予防に有効な量を
投与することにより、ＨＩＦ−１αの発現に関連する病気又は症状があるか又はその傾向
にある動物又はヒトを治療する方法も開示されている。さらに、ＨＩＦ−１αの発現阻害
及びこれらＨＩＦ−１αに関連した病気の治療のためのオリゴマー化合物の使用法が供さ
れる。そのような病気の例には、異なった種類の癌、特に一般的な例えば原発性及び転移
性の乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、他の胃腸癌、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、及び
脳腫瘍が、さらに子癇前症、炎症性内臓疾患及びアルツハイマー病も同様に挙げられる。
他の癌の例には、大腸癌、肝臓癌、胸腺癌、腎臓癌、睾丸腫瘍、胃癌、小腸癌、腸癌、食
道癌、脊髄癌、血脈洞癌、膀胱癌又は尿路癌などがある。

図１は、ＨＩＦ−１α蛋白質のウェスタンブロットを示す。細胞を種々の１００ｎＭのオリゴで４時間処理した。これらの細胞を１８時間増殖させた後、厳密な低酸素状態に６時間曝した。 図２は、ＨＩＦ−１α蛋白質のウェスタンブロットを示す。Ｕ８７細胞を２００ｎＭの３種類のオリゴで４時間処理した。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に１８時間曝した。 図３は、オリゴＣｕｒ０８１３で処理したＵ８７細胞中のＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ１及びチューブリン蛋白質のウェスタンブロットを示す。これらの細胞を１００ｎＭ，２００ｎＭ，３００ｎＭ及び４００ｎＭのオリゴで２４時間処理した。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に１８時間曝した。 図４は、不一致（ミスマッチ）オリゴ（Ｃｕｒ０９６０とＣｕｒ０９６１）で処理したＵ８７細胞中のＨＩＦ−１α及びチューブリン蛋白質のウェスタンブロットを示す。これらの細胞を１００ｎＭ，２００ｎＭ，３００ｎＭ及び４００ｎＭのオリゴで２４時間処理した。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に１８時間曝した。 図５は、オリゴＣｕｒ８１３で処理した１５ＰＣ３細胞中のＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ及びチューブリン蛋白質のウェスタンブロットを示す。これらの細胞を１２５ｎＭ，２５ｎＭ，５ｎＭ及び１ｎＭのオリゴで１６時間処理した。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に６時間曝した。 図６は、５ｎＭの種々のオリゴで１６時間処理した１５ＰＣ３細胞中のＨＩＦ−１α及びチューブリン蛋白質のウェスタンブロットを示す。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に６時間曝した。 図７は、１００ｎＭの種々のオリゴで６時間処理したＵ３７３細胞中のＨＩＦ−１α及びチューブリン蛋白質のウェスタンブロットを示す。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に２０時間曝した。 図８は、１００ｎＭの種々のオリゴで６時間処理したＵ３７３細胞中のＨＩＦ−１α及びチューブリン蛋白質のウェスタンブロットを示す。これらの細胞を、処理後直ちに厳密な低酸素状態に２０時間曝した。 図９は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はＣｕｒ８１３を５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量、１日１回腹腔内投与で７日間処理したときの、異種移植Ｕ３７３腫瘍の増殖曲線を示す。縦棒は標準誤差を示す。 図１０−１は、ＧｅｎＢａｎｋの受け入れ番号ＮＭ＿００１５３０を用いて示したヒトＨＩＦ−１αの遺伝子配列で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として本明細書に組込まれているものである。 図１０−２は、ＧｅｎＢａｎｋの受け入れ番号ＮＭ＿００１５３０を用いて示したヒトＨＩＦ−１αの遺伝子配列で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として本明細書に組込まれているものであり、図１０−１の続きである。

（定義）
本明細書で使われる用語「標的核酸」は、低酸素症誘発性因子又は低酸素症誘発性因子
-１α（ＨＩＦ−１α）をコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから翻訳されたＲＮＡ（
ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む）、及びこのようなＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡ
を包含する。
本明細書で使われる用語「遺伝子」は、エクソン、イントロン、非コードの５’末端及
び３’末端領域及び調節領域を含めた遺伝子、及び現在知られているそれらのすべての変
異体及び今後解明されるいかなる変異体をも意味する。

本明細書で使われる用語「オリゴマー化合物」とは、例えば、水素結合によって標的遺
伝子である“キメラプラスト”及び“ＴＦＯ”への結合、標的遺伝子である“アンチセン
ス阻害剤”、“ｓｉＲＮＡ”、“リボザイム”及び“オリゴザイム”のＲＮＡ転写物への
結合、又は標的遺伝子である“アプタマー”、“スピーゲルマー”又は“デコイ”にコー
ドされている蛋白質への結合を介して、ヒトへの望まれた治療効果を誘導できるオリゴヌ
クレオチドを言う。

本明細書で使われる用語「ｍＲＮＡ」とは、現在知られている標的遺伝子のｍＲＮＡ転
写物、さらに同定できるいかなる転写物をも意味する。

本明細書で使われる用語「調節」とは、遺伝子発現の増加（刺激）又は減少（阻害）の
いずれかを意味する。本発明では、阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲ
ＮＡが好ましい標的である。

本明細書で使われる、アンチセンス化合物が特定の標的核酸を「標的にする」とは、ア
ンチセンス化合物が結合しその標的物の機能を調節するように、アンチセンスオリゴヌク
レオチドを細胞、動物あるいはヒトに与えることを意味する。

本明細書で使われる用語「ハイブリッド形成」とは、ワトソン−クリック、フーグステ
ィーン、逆フーグスティーン水素結合など、相補的なヌクレオシド又はヌクレオチド塩基
間の水素結合を意味する。約５０年前ワトソンとクリックは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）が二重鎖から成り、二重鎖は対面する相補的な核酸塩基の間に形成される水素結合によ
りへリックス構造をとって互いに保持し合っていることを示した。ＤＮＡ中に一般に見い
出される４種の核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びシトシ
ン（Ｃ）で、このうち核酸塩基ＧはＣと対を成し、核酸塩基ＡはＴと対を成している。Ｒ
ＮＡでは、核酸塩基チミンが核酸塩基ウラシル（Ｕ）に置換され、核酸塩基Ｔと同じよう
にＡと対を成す。標準二重らせん形成に関与する核酸塩基中の化学基がワトソン−クリッ
ク面を構成している。２年後フーグスティーンは、ワトソン−クリック面に加えて、プリ
ン核酸塩基（Ｇ及びＡ）が二重らせんの外側から確認できるフーグスティーン面を有して
おり、水素結合を介してピリミジン核酸塩基と結合するために使われて三重螺旋構造が形
成されることを示した。

本発明との関連で、「相補的な」とは、２つのヌクレオチド又はヌクレオシド配列の間
で互いに正確な対をつくる能力を言う。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置の１つの
ヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと水素結合することが出
来るなら、そのオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡはその位置において互いに相補的
であると見なされる。ＤＮＡ又はＲＮＡとオリゴヌクレオチドが互いに相補的であると見
なされるのは、オリゴヌクレオチド内の十分な数のヌクレオチドが標的のＤＮＡ又はＲＮ
Ａ内の相当するヌクレオチドと水素結合を作り、安定な複合体（コンプレックス）を形成
することが出来る場合である。生体内又は生体外で安定であるためには、アンチセンス化
合物の配列がその標的核酸と１００％相補的である必要はない。従って用語の「相補的」
及び「特異的ハイブリッド形成性」は、アンチセンス化合物が標的化合物と十分な強さで
特異的に結合し、非標的ｍＲＮＡの機能に影響を与えずに、標的の正常な機能を希望通り
に妨害することを意味する。

用語「核酸類縁体」とは、非天然の核酸を結合した化合物を言う。核酸類縁体について
は、例えばＦｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５，
４４２９−４４４３（１９９７））及びＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉ
ｎ Ｄｒｕｇ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３（２），２９３−２１３（２０００））
らの報告がある。スキーム１は選択した例を示す。

用語「ＬＮＡ」とは、１個以上の二環式のヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチ
ドのことで、ＬＮＡモノマーとも呼ばれる。ＬＮＡモノマーについては、国際公開第ＷＯ
９９／１４２２６号公報及び続く出願の国際公開第ＷＯ００／５６７４６号、同第ＷＯ０
０／５６７４８号、同第ＷＯ００／６６６０４号、同第ＷＯ００／１２５２４８号、同第
ＷＯ０２／２８８７５号、同第ＷＯ０２／０９４２５０号公報及び国際出願第ＰＣＴ／Ｄ
Ｋ０２／００４８８号に記載されている。個別の例として挙げられるチミジンＬＮＡモノ
マーは、（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）−７−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−５−メ
チル−３−（チミン−１−イル）−２，５−ジオキサ−ビシクロ[２：２：１]ヘプタンで
ある。

用語「オリゴヌクレオチド」とは、本発明との関連において、オリゴマー（オリゴとも
呼ぶ）、又は核酸ポリマー（たとえば、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ））、又は既知の核酸類縁体で、好ましくは固定された核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、又はその混合物を指す。この用語には、同じように機能す
るか或いは改良された特異的な機能の非天然部分を有するオリゴヌクレオチドと同様、天
然の核酸塩基、糖及びヌクレオシド間連結合（骨格）からなるオリゴヌクレオチドが含ま
れる。全面的に又は部分的に修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞膜
の透過性、細胞内及び細胞外の核酸分解酵素に対する望ましい抵抗性、標的核酸に対する
高い親和性のような、いくつかの望ましい特異性を有するためしばしば天然の形よりも好
ましい。上記の特性を示すＬＮＡ類縁体は特に好ましい。

用語「ユニット」はモノマーと理解する。

用語「少なくとも１」は、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７等のような、１以上の整数を意味する。
用語「チオ−ＬＮＡ」は、スキーム２中のＸ又はＹの少なくとも１つがＳ又は−ＣＨ_２
−Ｓ−から選択される固定されたヌクレオチドを意味する。チオ−ＬＮＡはベータ−Ｄ及
びアルファ−Ｌの両方の配位をとることができる。

用語「アミノ−ＬＮＡ」は、スキーム２中のＸ又はＹの少なくとも１つが−Ｎ（Ｈ）−
、−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−又は−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−から選択され、Ｒが水
素原子及びＣ_１−４のアルキル基から選択される固定されたヌクレオチドを意味する。ア
ミノ−ＬＮＡはベータ−Ｄ及びアルファ−Ｌの両方の配位をとることができる。

用語「オキシ−ＬＮＡ」は、スキーム２中のＸ又はＹの少なくとも１つがＯ又は−ＣＨ
_２−Ｏ−に相当する固定されたヌクレオチドを意味する。オキシ−ＬＮＡはベータ−Ｄ及
びアルファ−Ｌの両方の配位をとることができる。
用語「エナ−ＬＮＡ」は、スキーム２中のＹが−ＣＨ_２−Ｏ−の固定されたヌクレオチ
ドを意味する。

用語「アルファ−Ｌ−ＬＮＡ」は、スキーム３に代表される固定されたヌクレオチドを
意味する。
用語「ＬＮＡ誘導体」は、スキーム２のベータ−Ｄ−メチレンＬＮＡを除くすべての固
定されたヌクレオチド、例えば、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ
−ＬＮＡ及びエナ−ＬＮＡを意味する。

（発明の詳細な説明）
本発明には、ＨＩＦ−１αをコードする核酸分子の機能の調節に用いるオリゴマー化合
物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。調節は最終的には産生されるＨＩＦ
−１αの量の変化である。一つの実施態様において、これはＨＩＦ−１αをコードする核
酸と特異的にハイブリッドを形成するアンチセンス化合物を提供することにより達成され
る。調節は、好ましくはＨＩＦ−１αの発現の阻害であり、生産される機能性蛋白質の数
を減少させることである。ＨＩＦ−１は、赤血球増殖、細胞増殖、鉄代謝、グルコース及
びエネルギー代謝、ｐＨ制御、組織浸潤、アポトーシス、多剤耐性、細胞ストレス応答又
は間充質代謝に関与すると同じように、血管新生にも関与する。

本発明の、標的物の発現を調節するアンチセンス及び他のオリゴマー化合物は、実験に
より或いは標的物に関する配列情報及び希望の標的に対する最適なオリゴマー化合物設計
のノウ・ハウを基にした具体的な設計により同定される。これらの化合物の配列は本発明
の好ましい実施態様である。同じように、これらの好ましいオリゴマー化合物が相補的で
ある標的物中の配列モチーフ（ホットスポットと呼ぶ）が標的としての好ましいサイトで
ある。

本発明に基づく好ましいオリゴマー化合物は、配列番号 ２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５
、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、
４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６
２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５
、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、
８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１
、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１
、１１２、１１３、１１４又は１１５であり、それらの配列を表１及び表２に示す。本発
明に基づくオリゴマー化合物は標的物の強力な調節剤である。これは生体外及び生体内で
実験的に示される。３種の違った腫瘍細胞株を使った標的物の生体外阻害作用を表１及び
図１〜８に示す。図９は、生体内における標的物の負の調節（ダウンレギュレーション）
を示す。さらに、オリゴマー化合物は、例えばホスホロチオエートを有するポリヌクレオ
チドアンチセンスの標準的条件に比べてより低い濃度で強力な阻害剤であることが示され
ている。図５及び６は、本発明化合物の濃度を５ｎＭまで下げた場合の阻害作用を示す。
本発明のオリゴマー化合物によるＨＩＦ−１αの阻害作用は、図３及び５に示すように、
血管新生に関与する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現及びグルコース組込みに関
与するグルコーストランスポーター−１（ＧＵＬＴ−１）の発現をも阻害する。２つの配
列モチーフを標的とする各種設計のオリゴマー化合物（表２）は、図１及び７に示した通
り標的の強力な阻害剤であることが確認された。表１からのオリゴマー化合物を使って遺
伝子歩行を行った。そして有力なオリゴマー化合物の効果を図８に示す。上記のすべての
実験的な観察結果は、本発明に基づく化合物が医薬組成物の活性化合物になり得ることを
示すものである。

さらに、本発明に基づくオリゴマー化合物は、正常酸素圧及び酸素圧低下の状態でＨＩ
Ｆ−１αを阻害する。
本発明の１つの実施態様において、オリゴマー化合物は少なくとも１ユニットのＬＮＡ
（固定された核酸：Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）と命名された化合物を含
んでいる。
ＬＮＡモノマーの代表的な引用は、国際公開第ＷＯ９９／１４２２６号公報及び続く出
願の国際公開第ＷＯ００／５６７４６号、同第ＷＯ００／５６７４８号、同第ＷＯ００／
６６６０４号、同第ＷＯ００／１２５２４８号、同第ＷＯ０２／２８８７５号、同第ＷＯ
０２／０９４２５０号公報及び国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ０２／００４８８号に記載されて
いる二環式ヌクレオシド類縁体であり、これらの特許はすべて参照としてここに取り込ま
れる。好ましいＬＮＡモノマー構造をスキーム２に例示する。

Ｘ及びＹは次のグループの中から独立に選択される：−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、
−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ_２−又は−ＣＨ−（二重結合の一部分の場合）、−ＣＨ_２−Ｏ−、
−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−又
は−ＣＨ_２−ＣＨ−（二重結合の一部分の場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−、ここでＲは水素原子
及びＣ_１−４のアルキル基から選択される。非対称のグループはどちらの立体配置にも見
られる。

スキーム２には、４個の不斉中心が、固定した１つの立体配置に示されている。しかし
、本発明に含まれるのはスキーム２の一般式で表される化合物であり、不斉中心は違った
立体配置をとっている。従ってスキーム２の各々の不斉中心はＲ又はＳのいずれかの立体
配置で存在する。Ｒ（ｒｅｃｔｕｓ）及びＳ（ｓｉｎｉｓｔｅｒ）の定義は“ＩＵＰＡＣ
１９７４ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎ
ｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”に説明されている。これらの規定は、“Ｐｕ
ｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．４５，１３−３０（１９７６）”及び“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ
ｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９７９”に記載されている。

Ｚ及びＺ^＊はヌクレオシド間結合、末端グループ又は保護グループの中から独立して選
択される。

ヌクレオシド間の結合様式は、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ）_２‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ，Ｓ）‐Ｏ‐、
‐Ｏ‐Ｐ（Ｓ）_２‐Ｏ‐、‐Ｓ‐Ｐ（Ｏ）_２‐Ｏ‐、‐Ｓ‐Ｐ（Ｏ，Ｓ）‐Ｏ‐、‐Ｓ‐
Ｐ（Ｓ）_２‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ）_２‐Ｓ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ，Ｓ）‐Ｓ‐、‐Ｓ‐Ｐ（Ｏ
）_２‐Ｓ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（Ｒ^Ｈ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＯＣＨ_３）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（
ＮＲ^Ｈ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ‐Ｒ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＢＨ_３）‐
Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＮＨＲ^Ｈ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ）_２‐ＮＲ^Ｈ‐、‐ＮＲ^Ｈ‐Ｐ（Ｏ
）_２‐Ｏ‐、‐ＮＲ^Ｈ‐ＣＯ‐Ｏ‐、‐ＮＲ^Ｈ‐ＣＯ‐ＮＲ^Ｈ‐、‐Ｏ‐ＣＯ‐Ｏ‐、‐
Ｏ‐ＣＯ‐ＮＲ^Ｈ‐、‐ＮＲ^Ｈ‐ＣＯ‐ＣＨ_２‐、‐Ｏ‐ＣＨ_２‐ＣＯ‐ＮＲ^Ｈ‐、‐Ｏ
‐ＣＨ_２‐ＣＨ_２‐ＮＲ^Ｈ‐、‐ＣＯ‐ＮＲ^Ｈ‐ＣＨ_２‐、‐ＣＨ_２‐ＮＲ^Ｈ‐ＣＯ‐、
‐Ｏ‐ＣＨ_２‐ＣＨ_２‐Ｓ‐、‐Ｓ‐ＣＨ_２‐ＣＨ_２‐Ｏ‐、‐Ｓ‐ＣＨ_２‐ＣＨ_２‐Ｓ
‐、‐ＣＨ_２‐ＳＯ_２‐ＣＨ_２‐、‐ＣＨ_２‐ＣＯ‐ＮＲ^Ｈ‐、‐Ｏ‐ＣＨ_２‐ＣＨ_２‐
ＮＲ^Ｈ‐ＣＯ‐、‐ＣＨ_２‐ＮＣＨ_３‐Ｏ‐ＣＨ_２‐等であってよい。ここで、Ｒ^Ｈ基は
水素と、Ｃ_１‐４アルキル基から選ばれる。

末端基はそれぞれ、水素、アジド基、ハロゲン基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基
、Ｐｒｏｔ‐Ｏ‐基、Ａｃｔ‐Ｏ‐基、メルカプト基、Ｐｒｏｔ‐Ｓ‐基、Ａｃｔ‐Ｓ‐
基、Ｃ_１‐６‐アルキルチオ基、アミノ基、Ｐｒｏｔ‐Ｎ（Ｒ^Ｈ）‐基、Ａｃｔ‐Ｎ（Ｒ
^Ｈ）‐基、モノ又はジ（Ｃ_１‐６‐アルキル）アミノ基、置換されていてもよいＣ_１‐６
‐アルコキシ基、置換されていてもよいＣ_１‐６‐アルキル基、置換されていてもよいＣ
_２‐６‐アルケニル基、置換されていてもよいＣ_２‐６‐アルケニルオキシ基、置換され
ていてもよいＣ_２‐６‐アルキニル基、置換されていてもよいＣ_２‐６‐アルキニルオキ
シ基、モノリン酸エステル基又は保護されたモノリン酸エステル基、モノチオリン酸エス
テル基又は保護されたモノチオリン酸エステル基、ジリン酸エステル基又は保護されたジ
リン酸エステル基、ジチオリン酸エステル基又は保護されたジチオリン酸エステル基、ト
リリン酸エステル基又は保護されたトリリン酸エステル基、トリチオリン酸エステル基又
は保護されたトリチオリン酸エステル基から独立して選ばれる。リン酸エステル残基に付
くそのような保護基の例としては、Ｓ‐アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）基、又は、Ｓ‐
ピバロイルチオエチル（ｔ‐ブチル‐ＳＡＴＥ）基、ＤＮＡインターカレーター、光化学
的活性基、熱化学的活性基、キレート基、レポーター基、配位子、カルボキシル基、スル
ホノ基、ヒドロキシメチル基、Ｐｒｏｔ‐Ｏ‐ＣＨ_２‐基、Ａｃｔ‐Ｏ‐ＣＨ_２‐基、ア
ミノメチル基、Ｐｒｏｔ‐Ｎ（Ｒ^Ｈ）‐ＣＨ_２‐基、Ａｃｔ‐Ｎ（Ｒ^Ｈ）‐ＣＨ_２‐基、
カルボキシメチル基、スルホノメチル基がある。ここで、Ｐｒｏｔ基は各々、‐ＯＨ、‐
ＳＨ、‐ＮＨ（Ｒ^Ｈ）の保護基を、Ａｃｔ基は各々、‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＮＨ（Ｒ^Ｈ）対
する活性基であり、そしてＲ^Ｈ基は水素及びＣ_１‐６‐アルキル基から選ばれる。

ヒドロキシ置換基の保護基には、４、４′‐ジメトキシトリチルオキシ基（ＤＭＴ）、
４‐モノメトキシトリチルオキシ基（ＭＭＴ）、及びトリチルオキシ基等の置換トリチル
基、置換されていてもよい９‐（９‐フェニル）キサンテニルオキシ基（ｐｉｘｙｌ）、
置換されていてもよいメトキシテトラヒドロピラニルオキシ基（ｍｔｈｐ）、トリメチル
シリルオキシ基（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシ基（ＴＩＰＳ）、ｔｅｒｔ‐
ブチルジメチルシリルオキシ基（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルシリルオキシ基、及びフェニ
ルジメチルシリルオキシ基等のシリルオキシ基、ｔｅｒｔ‐ブチルエーテル類、アセター
ル類（２個のヒドロキシ基を含む）、アセチル基又はハロゲン置換アセチル基（クロロア
セチルオキシ基、フルオロアセチルオキシ基などの）、イソブチリルオキシ基、ピバロイ
ルオキシ基、ベンゾイルオキシ基、及び置換ベンゾイルオキシ基等のアシルオキシ基、メ
トキシメチルオキシ基（ＭＯＭ）、ベンジルオキシ類又は２、６‐ジクロロベンジルオキ
シ基（２、６‐Ｃｌ_２Ｂｚｌ）のような置換ベンジルオキシ類が含まれる。替わりに、Ｚ
又はＺ^＊がヒドロキシル基の場合、これらは、所望ならば結合手を介して固体支持体に付
着することによって保護されてもよい。

Ｚ又はＺ^＊がアミノ基の場合、その保護アミノ基の例は、フルオレニルメトキシカルボ
ニルアミノ基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ‐ブチルオキシカルボニルアミノ基（ＢＯＣ）、ト
リフルオロアセチルアミノ基、アリルオキシカルボニルアミノ基（ａｌｌｏｃ、ＡＯＣ）
、ベンジルオキシカルボニルアミノ基（Ｚ、Ｃｂｚ）、２‐クロロベンジルオキシカルボ
ニルアミノ基（２‐ＣｌＺ）のような置換ベンジルオキシカルボニルアミノ基、モノメト
キシトリチルアミノ基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチルアミノ基（ＤＭＴ）、フタロイル
アミノ基及び９‐（９‐フェニル）キサンテニルアミノ基（ｐｉｘｙｌ）である。

上記態様において、Ａｃｔは‐ＯＨ、‐ＳＨ及び‐ＮＨ（Ｒ^Ｈ）対する活性基である。
好ましい態様において、そのような活性基が、他の残基や単量体へのカップリングを媒介
する。そのようなカップリングが成功した後、この活性基はヌクレオチド間の結合に変換
される。そのような活性基は、置換されていてもよいＯ‐ホスホロアミダイト基、置換さ
れていてもよいＯ‐燐酸トリエステル基、置換されていてもよいＯ‐燐酸ジエステル基、
置換されていてもよいＨ‐燐酸エステル基、置換されていてもよいＯ‐燐酸エステル基か
ら選ばれる。

本特許における「ホスホロアミダイト基」とは、式‐Ｐ（ＯＲ^ｘ）‐Ｎ（Ｒ^ｙ）_２‐で
表される基を意味し、ここでＲ^ｘ基は、例えばメチル基、２‐シアノエチル基、又はベン
ジル基などの置換されていてもよいアルキル基を、そして各々のＲ^ｙ基はエチル基、イソ
プロピル基などでの置換されていてもよいアルキル基を意味し、又は‐Ｎ（Ｒ^ｙ）_２‐基
はモルホリノ基（‐Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２）Ｏ）を形成する。Ｒ^ｘ基としては２‐シアノ
エチル基が好ましく、そして２つのＲ^ｙ基は好ましくは同一であり、かつイソプロピル基
を示す。このように、特に適切なホスホロアミダイト基は、Ｎ、Ｎ‐ジイソプロピル‐Ｏ
‐（２‐シアノエチル）ホスホロアミダイト基である。

Ｂは天然の又は非天然のヌクレオ塩基を構成し、アデニン、シトシン、５‐メチルシトシ
ン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５‐ブロモウ
ラシル、５‐プロピニルウラシル、５‐プロピニル‐６‐フルオロウラシル、５‐メチル
チアゾールウラシル、６‐アミノプリン、２‐アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン
、７‐プロピン‐７‐デアザアデニン、７‐プロピン‐７‐デアザグアニン、２‐クロロ
‐６‐アミノプリンから選ばれる。

特に好ましい二環式の構造体を以下のスキーム３に示す：

Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−及びＮ（Ｒ^Ｈ）の場合、ＺとＺ^＊は独立して、ヌクレオ
チド間結合、末端基又は保護基の中から選ばれる。
このヌクレオチド間結合は、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ）_２‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ，Ｓ）‐Ｏ‐、‐Ｏ
‐Ｐ（Ｓ）_２‐Ｏ‐、‐Ｓ‐Ｐ（Ｏ）_２‐Ｏ‐、‐Ｓ‐Ｐ（Ｏ，Ｓ）‐Ｏ‐、‐Ｓ‐Ｐ（
Ｓ）_２‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ）_２‐Ｓ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ，Ｓ）‐Ｓ‐、‐Ｓ‐Ｐ（Ｏ）_２
‐Ｓ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（Ｒ^Ｈ）‐Ｏ‐、‐ＯＰＯ（ＯＣＨ_３）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＮＲ^Ｈ
）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ‐Ｒ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐ＰＯ（ＢＨ_３）‐Ｏ‐、
‐Ｏ‐ＰＯ（ＮＨＲ^Ｈ）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｐ（Ｏ）_２‐ＮＲ^Ｈ‐、‐ＮＲ^Ｈ‐Ｐ（Ｏ）_２‐
Ｏ‐、‐ＮＲ^Ｈ‐ＣＯ‐Ｏ‐であってよく、ここで、Ｒ^Ｈ基は水素とＣ_１‐４‐アルキル
基から選ばれる。
末端基は、水素、アジド基、ハロゲン基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシル基、Ｐｒ
ｏｔ‐Ｏ‐基、Ａｃｔ‐Ｏ‐基、メルカプト基、Ｐｒｏｔ‐Ｓ‐基、Ａｃｔ‐Ｓ‐基、Ｃ
_１‐６‐アルキルチオ基、アミノ基、Ｐｒｏｔ‐Ｎ（Ｒ^Ｈ）‐基、Ａｃｔ‐Ｎ（Ｒ^Ｈ）‐
基、モノ又ジ（Ｃ_１‐６‐アルキル）アミノ基、置換されていてもよいＣ_１‐６‐アルコ
キシ基、置換されていてもよいＣ_１‐６‐アルキル基、置換されていてもよいモノリン酸
エステル基、モノチオリン酸エステル基、ジリン酸エステル基、ジチオリン酸エステル基
、トリリン酸エステル基、トリチオリン酸エステル基の中から独立して選ばれる。ここで
Ｐｒｏｔ基は各々、‐ＯＨ基、‐ＳＨ基、及び‐ＮＨ（Ｒ^Ｈ）基に対する保護基であり、
Ａｃｔ基は各々、‐ＯＨ基、‐ＳＨ基、及び‐ＮＨ（Ｒ^Ｈ）基に対する活性基でありそし
て、Ｒ^Ｈ基は水素とＣ_１‐６‐アルキル基から選ばれる。

ヒドロキシル置換基の保護基としては、４、４′‐ジメトキシトリチルオキシ基（ＤＭ
Ｔ）、４‐モノメトキシトリチルオキシ基（ＭＭＴ）等の置換トリチル基、置換されてい
てもよい９‐（９‐フェニル）キサンテニルオキシ基（ｐｉｘｙｌ）、置換されていても
よいメトキシテトラヒドロピラニルオキシ基（ｍｔｈｐ）、トリメチルシリルオキシ基（
ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシ基（ＴＩＰＳ）、ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシ
リルオキシ基（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルシリルオキシ基、及びフェニルジメチルシリル
オキシ基などのシリルオキシ基、ｔｅｒｔ‐ブチルエーテル類、アセタール類（２個のヒ
ドロキシル基を含む）アセチル基のようなアシルオキシ基を含む。替わりに、Ｚ又はＺ^＊
がヒドロキシル基の場合、これらは、所望ならば結合手を介して固体支持体に付着するこ
とによって保護されてもよい。

Ｚ又はＺ^＊がアミノ基の場合、保護アミノ基の例としては、フルオレニルメトキシカル
ボニルアミノ基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ‐ブチルオキシカルボニルアミノ基（ＢＯＣ）、
トリフルオロアセチルアミノ基、アリルオキシカルボニルアミノ基（ａｌｌｏｃ、ＡＯＣ
）、モノメトキシトリチルアミノ基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチルアミノ基（ＤＭＴ）
、フタロイルアミノ基等がある。

上記態様において、Ａｃｔは‐ＯＨ、‐ＳＨ及び‐ＮＨ（Ｒ^Ｈ）対する活性基である。
好ましい態様において、そのような活性基が、他の残基や単量体へのカップリングを媒介
する。そのようなカップリングが成功した後、この活性基はヌクレオチド間の結合に変換
される。そのような活性基は、例えば置換されていてもよいＯ‐ホスホロアミダイト基、
置換されていてもよいＯ‐燐酸トリエステル基、置換されていてもよいＯ‐燐酸ジエステ
ル基、置換されていてもよいＨ‐ホスホン酸エステル基及び置換されていてもよいＯ‐ホ
スホン酸エステル基である。

本明細書における「ホスホロアミダイト基」は、式‐Ｐ（ＯＲ^ｘ）‐Ｎ（Ｒ^ｙ）_２‐を
意味する。ここでＲ^ｘ基は、置換されていてもよいメチル基、２‐シアノエチル基のよう
なアルキル基を、また各々のＲ^ｙ基は置換されていてもよいアルキル基を、Ｒ^ｘ基は好ま
しいくは、２‐シアノエチル基をそして２つのＲ^ｙ基は好ましくは同一であり、かつイソ
プロピル基を示す。このように、特に適切な基は、Ｎ、Ｎ‐ジイソプロピル‐Ｏ‐（２‐
シアノエチル）ホスホロアミダイト基である。

Ｂは天然又は非天然のヌクレオ塩基を構成し、アデニン、シトシン、５‐メチルシトシ
ン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５‐ブロモウ
ラシル、５‐プロピニルウラシル、６‐アミノプリン、２‐アミノプリン、イノシン、ジ
アミノプリン、２‐クロロ‐６‐アミノプリンから選ばれる。

治療の原理
当業者は、ＬＮＡを含むオリゴマー化合物が多くの異なる原理によるＨＩＦ−１α関連
疾病の治療に使うことが出来ることを理解するであろうし、従ってそれは本発明の意図す
るところである。

例えば、ＬＮＡオリゴマー化合物はアンチセンス阻害剤として設計することができ、そ
れは病気を引起こす蛋白質の生産をｍＲＮＡの段階で阻止する一重鎖の核酸である。また
、それらはアンチセンスオリゴヌクレオチドであるリボザイムあるいはオリゴザイムとし
て設計され、標的物への結合ドメインに加えて標的ｍＲＮＡを分解する触媒活性を有し（
リボザイム）、又は標的ｍＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ Ｐ）を引
込む外部誘導配列（ＥＧＳ）を含んでいる（オリゴザイム）。

同じように、ＬＮＡオリゴマー化合物はｓｉＲＮＡとして設計することが出来る。それ
らは細胞に使われ、内在性あるいは外来性の特定の遺伝子を未だ良く理解されていない“
アンチセンス様”メカニズムで静止させる小さな二重鎖のＲＮＡ分子である。

ＬＮＡオリゴマー化合物は同じようにアプタマー（及びスピーゲルマーと呼ばれる、そ
の変異体）として設計することが出来る。それらは３次元構造から分子間水素結合を形成
することにより高い親和性と特異性を有して生物学的な標的物と結合しその機能を阻止す
る核酸である。また、ＬＮＡオリゴマー化合物はデコイ（おとり）として設計することが
出来る。それらは小さな二重鎖の核酸で、細胞性転写因子のＤＮＡ結合部位を選択的に妨
害することで標的遺伝子の転写促進を阻害する。

さらに、ＬＮＡオリゴマー化合物はキメラプラストとして設計することが出来る。それ
らは、標的遺伝子配列と特異的に対合して変換させる小さな一重鎖の核酸である。従って
、この原理を使ったＬＮＡを含むオリゴマー化合物は、特にＨＩＦ−１α遺伝子の変異に
よって起こるＨＩＦ−１α関連疾病の治療に対して有用である。

最後に、ＬＮＡオリゴマー化合物はＴＦＯ（３重鎖形成オリゴヌクレオチド）として設
計することが出来る。それらは、二重鎖ＤＮＡと結合し病気を引起こす蛋白質の生産をＲ
ＮＡの転写の段階で阻止する核酸である。

オリゴヌクレオチドを作動させる治療原理に書かれるべきことは、本発明に基づいたＬ
ＮＡオリゴマー化合物が好ましくは約８から約６０の核酸塩基、すなわち約８から約６０
の連結したヌクレオシドからなることである。特に好ましい化合物は約１２から約３０の
核酸塩基からなるアンチセンスヌクレオシドで、最も好ましくは約１２−２０核酸塩基か
らなるアンチセンス化合物である。

ＬＮＡオリゴマー化合物の治療的作用を導き出す上記の原理を参考にすると、本発明の
標的物はＨＩＦ−１α遺伝子、ｍＲＮＡ又は蛋白質ということになる。最も好ましい実施
態様において、ＬＮＡオリゴマー化合物はＨＩＦ−１αのｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はＨＩＦ−
１αのｍＲＮＡに対するアンチセンス阻害剤として設計される。オリゴヌクレオチドはＨ
ＩＦ−１αのｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡに沿ったどのサイト、例えば、５’非翻訳リ
ーダー配列、エクソン、イントロン及び３’非翻訳末端ともハイブリッドを形成すること
ができる。

好ましい態様において、オリゴヌクレオチドはヒトＨＩＦ−１αのｐｒｅ−ｍＲＮＡ又
はｍＲＮＡの翻訳阻害サイトを含む部分とハイブリッドを形成する。より好ましくは、Ｈ
ＩＦ−１αオリゴヌクレオチドはＣＡＴ配列を含んでおり、それはＨＩＦ−１αのｐｒｅ
−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡのＡＵＧ開始配列と相補的である。他の実施態様においては、Ｈ
ＩＦ−１αオリゴヌクレオチドが、ヒトＨＩＦ−１αのｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライス供
与サイト（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ ｓｉｔｅ）の部分とハイブリッドを形成する。さ
らに他の実施態様においては、ＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチドが、ヒトＨＩＦ−１αの
ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライス受容サイト（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｉｔｅ
）の部分とハイブリッドを形成する。他の実施態様においては、ＨＩＦ−１αオリゴヌク
レオチドが、ヒトＨＩＦ−１αのｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡのポリアデニル化、輸送
又は分解に関与する部分とハイブリッドを形成する。

当業者は、好ましいオリゴヌクレオチドがＨＩＦ−１αのｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮ
Ａの１部分で、その配列が無関係の遺伝子からの転写では一般に生じない部分とハイブリ
ッドを形成し、治療の特異性が保たれるようになることを理解できるであろう。

本発明のオリゴマー化合物は、期待する臨床的な応答があるよう標的物に対して十分に
相補的であるように設計される。すなわち、オリゴマー化合物は期待する効果を出すため
に、標的に対して十分な強さと特異性を有して結合しなければならない。１つの実施態様
においては、ＨＩＦ−１αを調節する当該化合物が、ＨＩＦ−１αをコードする核酸では
ない他の特定の核酸も調節するように設計される。

好ましくは、本発明に基づくオリゴマー化合物が、分子内及び分子間のオリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成を抑えるよう設計される。

多くの場合、生体内又は臨床的にＨＩＦ−１α活性の調節に効果があるＬＮＡオリゴマ
ー化合物の確認は、標的遺伝子についての配列情報に基づいて行われる。しかし、通常の
当業者はそのようなオリゴマー化合物が実験的な試験によっても確認できることを理解で
きるであろう。ＨＩＦ−１αオリゴマー化合物が好ましい実施態様と比べて、例えば、配
列ホモロジーの低さ、ヌクレオチド修飾の多少、又は長さの長短はあっても、臨床的な治
療において応答を示すものは本発明の範囲に含まれる。

アンチセンス薬剤
本発明の１つの実施態様において、オリゴマー化合物は適切なアンチセンス薬剤である
。強力で安全なアンチセンス薬剤の設計に求められることは、様々なパラメーターの微調
節、例えば、親和性／特異性、体液中での安定性、細胞の組込み、作用機作、薬物動態学
的特性及び毒性などである。

親和性及び特異性：オキシメチレン２’−Ｏ，４’−Ｃ結合を有するＬＮＡ（β−Ｄ−
オキシ−ＬＮＡ）はＤＮＡ及びＲＮＡ標的配列に対して新規な結合性を示す。同じように
、ＬＮＡ誘導体、例えばアミノ−、チオ−及びα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡは相補的なＲＮＡ
及びＤＮＡに対して新規な親和性を示し、チオ−ＬＮＡの場合、ＲＮＡに対する親和性は
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡよりもさらに高い。

これらの顕著なハイブリッド形成性に加え、ＬＮＡモノマーはＤＮＡ及びＲＮＡモノマ
ー及び２’−Ｏアルキル化ＲＮＡモノマーのような他の核酸類縁体と混合するとそれらと
協調的に作用する。従って、本発明のオリゴヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノ
マーだけで構成することが出来、又はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡとＤＮＡ、ＲＮＡ又は例え
ばアミノ−、チオ−及びα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡのようなＬＮＡ誘導体を含む現状の核酸
類縁体との組合せで構成することが出来る。ＤＮＡ又はＲＮＡの標的配列に対するＬＮＡ
の新規な結合親和性、及びそのＤＮＡ、ＲＮＡ及び現状範囲の核酸類縁体との自由な混合
性は、本発明に基づく効果的で安全なアンチセンス化合物を開発するために重要な意義を
有する。

最初に、本発明の１つの実施態様において、薬理学的に必要な活性を低めることなく
アンチセンスオリゴの通常の長さを著しく短く（２０−２５ｍｅｒから例えば１２−１５
ｍｅｒに）することが出来る。オリゴ固有の特異性はその長さに対して逆の相関性がある
ので、このような短縮はＲＮＡ標的に対するアンチセンス化合物の特異性を著しく高める
。本発明の１つの実施態様は、ヒトゲノムの配列が入手できてしかもその遺伝子コード解
析が急速に進んでいるので、可能な限り短くてユニークな配列として標的ｍＲＮＡ内に確
認することである。

別の実施態様において、オリゴのサイズを縮めるためにＬＮＡを使用すると、製造工程
を著しく簡略化することが出来、その結果アンチセンス療法が病気の多様性に対して市場
競争力のある治療法を提供するための基盤を提供する。

別の実施態様において、ＬＮＡの新規な親和性は、アンチセンスオリゴが生体内で標的
ｍＲＮＡとハイブリッドを形成する能力を実質的に増強するために使われ、その結果、活
性化合物を確認するために要する時間と労力は他の化学反応による場合に比べて著しく低
減する。

別の実施態様において、ＬＮＡの新規な親和性はアンチセンスオリゴヌクレオチドの力
価を増強させるために使われ、現在の治験に比べてより有利な治療の可能性を有する化合
物の開発を可能にする。

アンチセンス阻害剤として設計した場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標的の核酸に
結合しその同族体蛋白質の発現を調節する。好ましくは、その調節が正常の発現量にくら
べて少なくとも１０％又は２０％の発現阻害であり、より好ましくは正常の発現量に比較
して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の発現阻
害である。

主として、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ残基以外に
、例えば天然のＤＮＡモノマー、ＲＮＡモノマー、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミダイト、
２’−Ｆ、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（３−ア
ミノプロピル）（ＡＰ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、２’−Ｆ−アラビノ核酸（２’
−Ｆ−ＡＮＡ）及びＤ−シクロヘキセニルヌクレオシド（ＣｅＮＡ）などを含む。また、
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ修飾のオリゴヌクレオチドは、オキシ−ＬＮＡグループに加えて
又は代わりに別のＬＮＡユニットを含むことが出来る。特に、追加の好ましいＬＮＡユニ
ットには、立体配置がＤ−βかＬ−αか又はそれらの組合せを有するチオ−ＬＮＡ又はア
ミノ−ＬＮＡモノマー、又はエナ−ＬＮＡが含まれる。通常は、ＬＮＡ修飾のオリゴヌク
レオチドには、オリゴヌクレオチド内の全ヌクレオチドを基準に、少なくとも約５，１０
，１５，２０％のＬＮＡユニットが含まれ、より一般的には、オリゴヌクレオチド内の全
ヌクレオチドを基準に、少なくとも約２０，２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０
又は９０％のＬＮＡユニットが含まれる。

体液中の安定性：本発明の１つの実施態様には、得られるオリゴマー化合物の体液中で
の安定性、例えばヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ）に対する
抵抗性を高めるために、標準ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドにＬＮＡモノマーを組
込むことが含まれる。安定性の程度は使用したＬＮＡモノマーの数、オリゴヌクレオチド
内の位置、及び使用したＬＮＡモノマーの種類に依存する。ＤＮＡ及びホスホロチオエー
トとの比較から、核酸の分解的変性に対するオリゴヌクレオチド安定化の能力の順序は次
のように確定できる：ＤＮＡ＜＜ホスホロチオエート〜オキシ−ＬＮＡ＜α−Ｌ−ＬＮＡ
＜アミノ−ＬＮＡ＜チオ−ＬＮＡ。

ＬＮＡが標準のＤＮＡ合成に適合し、多くの現状の核酸類縁体と自由に混合するという
事実により、ＬＮＡ−オリゴマー化合物のヌクレアーゼ（核酸分解酵素）耐性はヌクレア
ーゼ安定性の高い他の類縁体を取込むか又はヌクレアーゼ抵抗性のヌクレオシド間結合、
例えばホスホロモノチオエート、ホスホロジチオエート及びメチルホスホネート結合など
のを利用することにより本発明によってさらに高められる。

作用機作：本発明に基づくアンチセンス化合物から多様なメカニズムを介した治療的な
作用を引出すことができ、そして同じ化合物中にいくつかの作用を結びつけることが出来
る。１つの筋書きでは、オリゴヌクレオチドの標的（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）へ
の結合により、標的物の適正な機能に必要な他の因子（蛋白質、他の核酸など）の結合を
阻止する、つまり、立体的障害によって阻止するように働く。例えば、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、以下の事に関与する処理因子の認識及びそれとの結合に重要なｐｒｅ
−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡのどちらかの配列モチーフと結合する：スプライシング、ポリア
デニル化、細胞輸送、ＲＮＡ中のヌクレオシドの翻訳後修飾、５’-末端キャッピング、
翻訳など。ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングの場合、オリゴヌクレオチドとその標的物
との反応の結果は、不要な蛋白質発現の抑制か或いは必要な蛋白質をコードする代わりの
スプライスしたｍＲＮＡの生成、又はその両方である。他の実施態様において、オリゴヌ
クレオチドとその標的物との結合は、リボゾーム機構に物理的な障害すなわち翻訳停止を
起こし、翻訳工程を阻止する。

さらに他の実施態様において、オリゴヌクレオチドの標的物への結合は、ＲＮＡが適切
な機能を発揮するのに重要な二次構造及び高次構造をとる能力を妨害する、すなわち構造
妨害を起こす。例えば、オリゴヌクレオチドは、いろいろな機能に極めて重要な役割を演
じるステム・ループ構造の形成を妨害する。その機能は例えば、ＲＮＡをさらに安定化し
たり、種々の蛋白質に対する基本的認識モチーフを取込むようなことである。

さらに他の実施態様において、オリゴヌクレオチドの結合で標的物を不活化し、その先
のｍＲＮＡを分解する細胞内酵素を集めることにより細胞内代謝工程を阻害する。例えば
、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重螺旋のＲＮＡ部分を分解するリボヌクレア
ーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を集めるヌクレオシド区分を含む。同様に、オリゴヌクレオチド
は、例えばＲＮＡｓｅＩＩＩのような二重鎖ＲＮＡｓｅを集めるヌクレオシド区分を含む
か、又は標的ｍＲＮＡを分解する内在性の酵素（ＲＮａｓｅＰ）を集める外部誘導配列（
ＥＧＳ）を含むことが出来る。また、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅ触媒活性を示す
配列モチーフ、又はオリゴヌクレオチドに付着する部分を含むことが出来、これはハイブ
リッド形成で標的物に接近すると標的物のその先の代謝活性を無効にする。

β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡはＲＮａｓｅＨ活性を支援しないことが知られている。しかし
、本発明に基づいてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡとＤＮＡからなるキメラ体オリゴヌクレオチ
ド（ギャップマーと呼ぶ）を形成させることによりこれを変更することが出来る。ギャッ
プマーは中心伸長が４−１２ｎｔＤＮＡ、又はＲＮａｓｅＨ（ギャップ）が認識し解裂す
る特に1〜６残基のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（フランク）に挟まれた修飾モノマーを基盤
とする。フランクはＬＮＡ誘導体で構築しても良い。本発明に基づく他のキメラ構築体が
あり、それはＲＮａｓｅＨが介在するメカニズムを経由して作用する。ヘッドマーはβ−
Ｄ−オキシ−ＬＮＡの連続した伸長又は５’末端のＬＮＡ誘導体によって、続いてＤＮＡ
の連続した伸長又はＲＮａｓｅＨが認識し解裂する３’-末端の修飾モノマーによって規
定され、テイルマーはＤＮＡの連続した伸長又はＲＮａｓｅＨが認識し解裂する５’-末
端の修飾モノマーによって、続いてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡの連続した伸長又は３’末端
のＬＮＡ誘導体によって規定される。本発明に基づく他のキメラ体はミックスマーと呼ば
れ、入替わりの組成であるＤＮＡ又はＲＮａｓｅＨが認識し解裂する修飾モノマー、及び
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ及び／又はＲＮａｓｅＨの結合と開裂を仲介するかもしれないＬ
ＮＡ誘導体からなる。α−Ｌ−ＬＮＡはある程度ＲＮａｓｅＨ活性を補充するので、ギャ
プマー構築のため小さなＤＮＡギャップ又はＲＮａｓｅＨが認識し開裂する修飾モノマー
が必要になり、ミックスマー構築ではより柔軟性が導入される。図１は本発明に基づく種
々の設計の概略を示す。

薬物動態学的性質
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的な効果は、薬物動態学、例えば吸収、分配、
細胞組込み、代謝及び排泄に大きく左右される。次に、これらのパラメーターはオリゴヌ
クレオチドの基礎を成す化学物質、サイズと３次元構造からはっきりと導き出される。

前述のように、本発明に記載のＬＮＡは単一でなく、いくつかの関係する成分から成り
、分子的に違うにもかかわらず全てが相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対して驚くべき親和性
を示す。従って、ＬＮＡ化学成分は本発明に基づくオリゴの開発に独自的に適合しており
、そのオリゴは活性化合物のサイズを調節するＬＮＡの高い親和性、又は活性化合物の厳
密な分子組成を調節する種々のＬＮＡ化学成分のいずれかを利用する制御された薬物動態
学的性質を有している。後者の場合、例えばオキシ−ＬＮＡではなくアミノ−ＬＮＡを使
うとオリゴ全体の電荷が変わり、組込み及び分配の挙動に影響を与える。同じように、オ
キシ−ＬＮＡの代りにチオ−ＬＮＡを使用するとオリゴヌクレオチドの親油性が高まり、
例えば細胞膜のような親油性の障壁の透過性に影響を与える。

本発明に基づくＬＮＡオリゴヌクレオチドの動態学的な性質の調節は、さらに多種多様
な部分の付着によって行われる。例えば、オリゴヌクレオチドの細胞膜透過性は、例えば
、コレステロール部分、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質又はポリアミンのような脂質
部分をオリゴヌクレオチドに付着させることによって高められる。同じように、細胞内へ
のＬＮＡオリゴヌクレオチドの組込みは、部分をＬＮＡオリゴヌクレオチドに共役させ、
サイトプラズマへの輸送を仲介する膜内分子に作用することによって増大できる。

薬理学的性質
薬理学的性質は、オリゴマー組込の改善、オリゴマーの分解に対する抵抗性増大などに
より生物学的安定性の増大、及び／又は、例えばｍＲＮＡ配列のような標的配列とオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリッド形成の特異性及び親和性の向上などをもたらすことにより
本発明に従って強化される。

毒物学
アンチセンスオリゴに伴う毒性には基本的に２つの種類、すなわち塩基配列を含む配列
依存の毒性と配列非依存性でクラス関連の毒性がある。生来のＣｐＧ配列モチーフによる
免疫刺激に関する問題を除いては、アンチセンスオリゴヌクレオチド由の開発において最
も顕著な毒性は、配列には関係のない、例えばオリゴヌクレオチドの化学的性質及び投与
の量、方法、頻度及び期間に関するものである。オリゴヌクレオチドのホスホロチオエー
ト部類は特によく特性評価がされており、補体活性化、ＰＰＴ（部分的トロンボプラスチ
ン時間）の延長、血小板減少症、肝毒性（肝酵素の上昇）、心臓毒性、脾腫及び細網内皮
細胞の過形成など多くの副作用を誘導することが知られている。

前に述べたように、ＬＮＡ化学成分は、新規な親和性、非常に高い生物学的安定性及び
オリゴヌクレオチドの厳密な分子組成を調節する能力を発揮する。本発明の１つの実施態
様において、ＬＮＡを含む化合物は、高い力価と、もしあれば少量のホスホロチオエート
連結を併せ有するオリゴヌクレオチドの開発を可能にし、従って、それは現在のアンチセ
ンス化合物よりもより効果的で高い安全性を示す可能性が高い。

製造
本発明のオリゴ−及びポリヌクレオチドは、有機化学の当業者によく知られた核酸化学
の重合方法を使って製造することが出来る。一般に、ホスホロアミダイト法の標準のオリ
ゴメリゼーションサイクルが用いられる（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．
Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９、６１２３（１９９３）；Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃ
ａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８、２２２３（１９９
２））、しかし、例えば、Ｈ−ホスホネートやホスホロトリエステルの化学反応も使うこ
とが出来る。

本発明の或るモノマーに対しては、長いカップリング時間、及び／又は新鮮な試薬での
繰返しカップリング、及び／又はより濃縮されたカップリング試薬が使われた。

ホスホロアミダイトを使ったカップリングでは、段階的なカップリングの収率が９８％
を超える満足できるものであった。リン酸エステルのチオール化は、ホスホロジエステル
オリゴマーの合成に使われる通常の例えばヨード／ピリジン／水による酸化反応をＢｅａ
ｕｃａｇ試薬（市販品）を使う酸化反応に交換することで実施できるし、他の硫黄化試薬
によっても達成される。ホスホロチオエートＬＮＡオリゴマーは段階的カップリングの収
率が９８％以上で効果的に合成された。

β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡオリゴヌクレオチド、α−Ｌ−ＬＮＡ
及びβ−Ｄ−メチルアミノ−ＬＮＡオリゴヌクレオチドもまたホスホロアミダイト法を用
いた段階的カップリング反応により、９８％以上の収率で効果的に合成できた。

ＬＮＡオリゴマー化合物の精製は、使い捨ての逆相精製カートリッジ及び／又は逆相Ｈ
ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）及び／又はエタノール又はブタノールからの沈殿法を
使って行った。合成したオリゴヌクレオチドの純度の確認にはゲル電気泳動、逆相ＨＰＬ
Ｃ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（レーザーイオン化質量分析）、及びＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロス
プレーイオン化質量分析）を用いた。さらに、核酸塩基及び５’−ＯＨが所望ならば保護
されているＬＮＡが固定化される固体の支持材は、ＬＮＡ含有オリゴマーで３’末端にＬ
ＮＡモノマーを含む化合物を合成するための材料として特に興味がある。この例で、固体
の支持材は好ましくはＣＰＧ、例えば容易に入手できる（市販の）ＣＰＧ材又はポリスチ
レンで、その表面に、３’が機能化され、核酸塩基及び５’−ＯＨが所望ならば保護され
ているＬＮＡを、販売元が推奨する条件を使って連結される。

適応
本発明に基づく医薬組成物は多くの異なる病気の治療に使われる。例えば、種々のヒト
の固形癌及びそれらの転移癌、例えば乳房、結腸直腸、前立腺、膵臓、脳、肺、卵巣、胃
腸、頭頚部、肝臓、膀胱及び子宮頚部などの癌において、ＨＩＦ−１αが過剰発現されて
いることが見出されている（Ｚｈｏｎｇ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５
９，５８３０−５８３５（１９９９）；Ｔａｌｋｓ，Ｋ．Ｌ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５７（２）、４１１−４２１（２０００）
）。

本発明の方法は 好ましくは癌によって引起こされる病気の治療又は予防、特に次のよ
うな組織に発生する癌の治療に使われる：肺、乳房、大腸、前立腺、膵臓、肝臓、脳、睾
丸、胃、小腸、腸、脊髄、血脈洞、子宮、尿路及び卵巣。

本発明はさらに、治療を必要とするヒトに効果があるＨＩＦ−１α調節オリゴマー化合
物の量で、オリゴマーの高用量を含めるがこれに限定されない量からなる癌の予防又は治
療法を包含する。本発明はさらに、ＨＩＦ−１α調節オリゴマー化合物の短い投与期間で
の使用を包含する。正常な非癌性の細胞は、その細胞種固有の頻度特性で分裂する。細胞
が癌状態に形質転換すると、無制御の細胞増殖と細胞死の減少をもたらすため、無秩序の
細胞分裂又は細胞増殖は癌性細胞の証明でもある。癌の種類の例には、限定はされないが
、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急
性骨髄性白血病のような急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性
骨髄腫）、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌
、絨毛癌、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、膀胱癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、頭頸部癌、
脳腫瘍、原発部位未確認の癌、新生物、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、腫瘍類（例え
ば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉
腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、エビング腫瘍、平滑筋肉腫
、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺腫、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、
のう胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌
、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、隋芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血
管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）、Ｈ鎖病
、転移、又は無秩序又は異常な細胞増殖が特徴の病気又は疾患が挙げられる。

医薬組成物
本発明は、活性成分として少なくとも１つの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
構成物を含有する医薬組成物にも関連することであると理解される。本発明に基づく医薬
組成物は所望ならば薬剤担体を含有し、そして医薬組成物はさらに所望ならばアンチセン
ス化合物、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物及び／又は免疫調節化合物
を含有すると理解される。

塩類
本発明に包含されるオリゴマー化合物は、製薬上許容される種々の塩として用いること
が出来る。本明細書で使われる用語の塩類とは、本発明で確認された化合物の必要な生物
学的活性を保ち、好ましくない毒性作用が最少である塩を指す。限定されない例として、
このような塩は有機アミノ酸で形成され、そして塩基付加塩は例えば亜鉛、カルシウム、
ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウ
ム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンで、又はアンモニア、Ｎ，Ｎ−ジベンジル
エチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム又はエチレンジアミ
ン由来のカチオンで；又は（ａ）及び（ｂ）を組合せた（ｃ）の例えばタンニン酸亜鉛な
どで形成される。

プロドラッグ
本発明の１つの実施態様において、オリゴマー化合物はプロドラッグの形態をとること
が出来る。オリゴヌクレオチド類は幸いに負に荷電したイオンである。細胞膜は親油性で
あるため、オリゴヌクレオチドの細胞内組込みは、中性又は親油性のものに比べて低い。
この極性障害は、プロドラッグ法により排除できる（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｒ．Ｍ．（
１９９８）ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｖｏ
ｌ．１３１，ｐｐ．１０３−１４０を参照））。この方法では、オリゴヌクレオチドは保
護された形で調製されるので、投与されるときのオリゴは中性である。それらの保護グル
ープは除かれた後、オリゴが細胞に組込まれる様に設計される。その様な保護基の例とし
て、Ｓ−アセチルチオエチル基（ＳＡＴＥ）又はＳ−ピバロイルチオエチル基（ｔ−ブチ
ル−ＳＡＴＥ）が挙げられる。これらの保護基はヌクレアーゼに抵抗性であり、細胞内で
選択的に除去される。

抱合体
本発明の１つの実施態様において、オリゴマー化合物は配位子／抱合体と連結される。
それはアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内組込みを増すための方法である。この抱
合は５’／３’−ＯＨの末端位置で起きるが、配位の場合は糖及び／又は塩基部位で起こ
る。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドと抱合する増殖因子はトランスフェリン又は
葉酸がよい。トランスフェリン−ポリリジン−オリゴヌクレオチド複合体又は葉酸−ポリ
リジン−オリゴヌクレオチド複合体は高レベルのトランスフェリン又は葉酸受容体を発現
している細胞による組込みのために調製され得る。他の抱合体／配位子の例には、コレス
テロール部分、アクリジン及びポリ−Ｌ−リジンのような二重挿入体、１個以上の例えば
ホスホロモノチオエートなどのようなヌクレアーゼ抵抗の連結グループを有する末端キャ
ッピングなどが挙げられる。

細胞内へのオリゴヌクレオチド組込みの担体として、トランスフェリン複合体の調製が
Ｗａｇｎｅｒらによって報告されている（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０））。葉酸受容体のエンドサ
イトーシスを経由した、アンチセンスオリゴヌクレオチドの移送を含めた、葉酸−巨大分
子抱合体の細胞内輸送がＬｏｗらによって報告されている（Ｌｏｗら、米国特許第５，１
０８，９２１号公報；Ｌｅａｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，８８，５５７２（１９９１）も参照）。

製剤
本発明には、ここに開示する１つ以上のオリゴヌクレオチド化合物の製剤が含まれる。
医薬品として容認される結合剤及びアジュバントは製剤した薬品の一部に含まれる。カプ
セル、錠剤、丸薬などは、例えば次のような化合物を含んでいる：微細結晶セルロース、
結合剤としてのガム又はゼラチン；賦形剤としてのデンプン又は乳糖；潤滑剤としてのス
テアリン酸塩、種々の甘味又は香味剤。カプセルには、処方単位に脂肪油のような液状の
担体が含まれる。同じように、糖衣剤又は腸溶剤は処方単位の一部である。オリゴヌクレ
オチド製剤は、薬剤活性成分と脂肪でミセル状のエマルジョンを形成した乳剤とすること
が出来る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、求められる作用を損なわない如何なる素材、又は求め
られる作用を補完する素材とも混合することができる。これらには、他のヌクレオシド化
合物を含めた他の薬剤を含めることが出来る。

非経口、皮下、皮内又は局所投与用の製剤には無菌の希釈剤、緩衝液、等張制御剤及び
抗菌剤が含まれる。活性化合物は、変性又は体内からの迅速な排除から保護する担体を使
って調製することができ、その中にはインプラント又はコントロールされた溶出特性を有
するマイクロカプセルが含まれる。静脈投与のための好ましい担体は生理食塩水又はリン
酸緩衝生理食塩水である。

好ましくは、オリゴマー化合物が一つのユニット製剤であり、例えば医薬品として容認
される担体又は希釈剤中に、治療に有効な量で重篤な副作用を起こすことなく患者に届く
十分な量が含まれるユニット製剤である。

投与
本発明の医薬組成物は、局所的な治療か全身的か、及び治療すべき部位がどこかによっ
て、いろいろな投与方法がとられる。投与法には、（ａ）経口、（ｂ）経肺、例えば吸入
、又は噴霧器による気管内又は鼻腔内吹込みを含めた粉末あるいはエアゾールの吹込み、
（ｃ）局所で、表皮、皮内、眼、膣を含めた粘膜及び直腸送達、又は（ｄ）非経口で、静
脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射又は注入が含まれる。又は頭蓋内例えば鞘
内又は脳内室投与が挙げられる。１つの実施態様において、活性のあるオリゴは、静脈内
（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、経口、局所又は静脈ボーラスとして投与されるか、又は標的
器官に直接投与される。

局所投与のための医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム
、ゲル、点滴剤、スプレー剤、座剤、液剤及び粉剤が含まれる。従来の医薬の担体である
、水性、粉末又は油性の基材、増粘剤などは必要であるか又は望ましい。皮膜したコンド
ームや手袋なども有用である。好ましい局所製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが局
所送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面
活性剤などとの混合剤が含まれる。経口投与のための組成物及び製剤には、粉末又は顆粒
、微粒子、ナノ粒子、水又は非水系溶媒の懸濁液又は溶液、カプセル、ゲル状カプセル、
香粉、錠剤又はミニ錠剤が含まれるがこれらに限定されるものではない。非経口、鞘内又
は脳室内投与のための組成物及び製剤は、緩衝液、希釈剤及び他の適切な添加物を含む無
菌の水溶液であり、その添加物には、限定はされないが例えば、透過促進剤、担体化合物
及び製薬上許容される担体又は賦形剤が含まれる。

送達
本発明の医薬組成物には、溶液、乳剤、及びリポソーム含有製剤が含まれるが、これら
に限定されない。これらの組成物は、前調製液体、自己乳化固形物及び自己乳化半固形物
を含むがこれに限定されない種々の成分から生成される。腫瘍組織への薬剤の送達は担体
が介在する輸送により促進され、その担体にはカチオン性リポゾーム、シクロデキストリ
ン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミン ポリマー、ナノ粒
子及びミクロスフェアー（Ｄａｓｓ， Ｇ．Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
，５４（１），３−２７（２００２））が含まれるがこれらに限定されるものではない。

本発明の医薬品製剤は、剤形単位で簡易に提供でき、医薬品業界でよく知られた従来の
方法に従って調製することができる。そのような技術には、活性成分と医薬用担体また賦
形剤を会合させる段階が含まれる。一般に、製剤は 均一且つ密に活性成分と液状担体又
は細かく粉砕した固形担体又はその両方と会合させ、次に必要なら、製品の形削りをして
調製される。

本発明の組成物は、どのような剤形、例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液状シ
ロップ、ソフトゲル及び座剤にも製剤することができるが、これらに限定されるものでは
ない。本発明の組成物はまた、水、非水系又は混合溶媒の懸濁剤として製剤することがで
きる。水性懸濁液にはさらに粘度を増すための物質、例えばカルボキシメチルセルロース
ナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどが含まれる。懸濁液には安定化剤
も含まれる。

配合剤
本発明のオリゴヌクレオチドは、前立腺癌のアンドロゲン回収療法で起こる急性低酸素
症によって誘導されるＨＩＦ−１αの影響を排除するために使用できる。

本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性のある薬剤、例えばアスピリン、イブプロフ
ェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗バクテリア剤又は抗生物質等と配合させることができ
る。

ＬＮＡ含有オリゴマー化合物は、上記のように多くの治療的利用に有用である。一般的
に、本発明の治療法は、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの治療的な有効量を哺乳類、特に
ヒトに投与することを含む。

特定の実施態様において、本発明は（ａ）１つ以上のアンチセンス化合物及び（ｂ）１
つ以上のアンチセンスメカニズムでない他の化学療法剤を含む医薬組成物を提供する。化
学療法剤が本発明の化合物と共に使われる場合、個別に（例えば、ミトラマイシンとオリ
ゴヌクレオチド）、逐次的に（例えば、一定期間はミトラマイシンとオリゴヌクレオチド
、続いて別な薬剤とオリゴヌクレオチド）、又は１つ以上のこのような化学療法剤との組
合せで、又は放射線療法との組合せで使われる。当業者に公知の全ての化学療法剤は、本
発明に基づく化合物との配合治療として包含される。

これらに限定はされないが、非ステロイド系抗炎症剤及びコルチコステロイドを含む抗
炎症剤、抗ウイルス剤、及び免疫調節剤も同様に本発明の組成物中に配合される。２つ以
上を配合した化合物が一緒に又は逐次的に使われる。

他の実施態様において、本発明の組成物は、最初の核酸を標的にする１つ以上の特にオ
リゴヌクレオチドのアンチセンス化合物、及び第２の核酸を標的にする付加的な１つ以上
のアンチセンス化合物を含む。２つ以上を配合した化合物が一緒に又は逐次的に使われる
。

投与量
投与量は、治療する病状の重篤度と感応性、及び数日から数ヶ月間にわたる治療過程、
又は回復又は病気状態がなくなるまでの期間に依存する。最適な投薬計画は、患者体内の
薬剤蓄積量の測定から計算される。

最適な投与量は、個別のオリゴヌクレオチドの相対力価によって変わる。一般に、それ
は生体外及び動物モデルの生体内実験で有効性が認められるＥＣ_５０を基準に推定される
。概して、投与量は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１ｇであり、１回以上を毎日、１
週間毎、１ヶ月毎又は１年毎、さらに２年から１０年に１回、又は数時間から数ヶ月間の
連続注入で投与される。投与の繰返し率は、体液又は組織内の薬剤の滞留時間と濃度測定
結果に基づき推定される。治療に成功した後、病気の再発を防ぐために患者に維持療法を
受けさせることが望ましい。

用途
本発明のＬＮＡ含有オリゴマー化合物は、診断薬、治療薬及び予防薬のための研究試薬
として使用することができる。研究では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内及び
実験動物内のＨＩＦ−１α遺伝子合成の特異的阻害剤として使われ、それによって標的物
の機能解析又は治療的介入のための標的としての有用性評価が容易になる。診断薬におい
ては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内及び組織内のＨＩＦ−１α発現をノー
ザンブロット法、ハイブリッド形成法又は類似の技術によって検出及び定量するために使
われる。治療薬としては、ＨＩＦ−１α発現の調節により治療できる病気又は疾患の疑い
のある動物又はヒトが、本発明に基づくアンチセンス化合物の投与によって治療を受ける
。さらに、ＨＩＦ−１α発現に伴う病気又は状態の疑いのある又はそれに罹りやすいヒト
の治療又は動物、特にマウス及びラットの治療に、治療的又は予防的に有効な量の１つ以
上の本発明のアンチセンス化合物又は組成物を投与する方法が提供される。

方法
本発明の方法は、好ましくは、１つの病気によって引起こされる病気の治療又は予防の
ために利用される。本発明の１つの実施態様は、細胞又は組織内のＨＩＦ−１αの発現を
阻害する方法で、ＨＩＦ−１αの発現が阻害されるように当該細胞又は組織を本発明の化
合物と接触することよりなる。さらに、他の実施態様は、病気に関与する遺伝子の発現を
調節する方法で、遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡをオリゴマー化合物と接触させることからな
る。当該オリゴマー化合物は配列番号 ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８
、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、
９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、
１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、
１１４又は１１５の少なくとも８核酸塩基部分を含む配列を有し、それによって遺伝子発
現が調節される。これらの化合物は１つ以上のＬＮＡユニットを含む。その化合物は遺伝
子のメッセンジャーＲＮＡとハイブリッドを形成しその発現を阻害する。他の実施態様は
、癌疾患に罹っているか罹りやすい哺乳類の治療法で、ＨＩＦ−１αを標的とし１個以上
のＬＮＡユニットを含むオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量を哺乳類に投与すること
からなる。上記記載の方法は子癇前症、炎症性腸疾患及びアルツハイマー病と同様、一般
の癌、例えば原発性及び転移性の乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、他の胃腸癌、肺
癌、子宮癌、卵巣癌、脳腫瘍、頭頸部癌、子宮頸癌、大腸癌、肝臓癌、胸腺癌、腎臓癌、
睾丸腫瘍、胃癌、小腸癌、腸癌、食道癌、脊髄癌、血脈洞癌、膀胱癌、及び尿路癌などを
標的にすることができる。記載の方法は、赤血球増殖、細胞増殖、鉄代謝、グルコース及
びエネルギー代謝、ｐＨ制御、組織侵害、アポトーシス、多剤耐性、細胞ストレス応答又
は間充質代謝に関与すると同じように血管新生を調節する方法で、細胞が本発明の請求範
囲のアンチセンス化合物と接触し、その結果細胞が調節されることからなる。

ここで述べた全ての文書が本明細書中に参照として取り込まれている。

実施例
本発明が、いくつかの好ましい実施態様に従って特異性と共に記載される。それゆえに
、以下の実施例は、本発明を例示するためにのみ役立つものであって、これらに限定する
ことを意図するものではない。

モノマーの合成
Ｙ及びＸが−Ｏ−、及びＺ及びＺ^＊が保護されている−Ｏ−である、スキーム２に示し
たモノマーの製造が、文献に詳細に記載されている。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．２００１，６６，８５０４−８５１２；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４（１０），２１６４−２１７６；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００２，６，８０２−８０９及びこれらに見出される引用文献に示
されている。ここにおいて、Ｚ及びＺ^＊の保護基は、それぞれ、オキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピル−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト及びジメトキシトリチルオキシ
である。Ｘが−Ｏ−で、Ｙが−Ｓ−及びＮ（ＣＨ_３）−であるスキーム２のモノマーの製
造が、Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，１，６５５
−６６３に記載されている。

ＬＮＡオリゴヌクレオチド合成
全てのオリゴヌクレオチド合成は、ＭＯＳＳ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ機器プラットホームに
おいて１μモルスケールで実行される。合成手順は、本質的には機器のマニュアルに記載
されたようにして実行される。使用されたＬＮＡモノマーは、Ｋｏｓｈｉｎ，Ａ．Ａ．ら
、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，８５０４−８５１２に従って合成された。

ＬＮＡスクシニルヘミエステルの調整
５’−Ｏ−Ｄｍｔ−３’−ヒドロキシ−ＬＮＡモノマー５００ｍｇ）、無水コハク酸（
１．２当量）及びＤＭＡＰ（１．２当量）を、ＤＣＭ（３５ｍｌ）に溶解した。反応液を
一夜室温で撹拌した。ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１Ｍ、ｐＨ５．５（２回）及び食塩水（１回
）で抽出した後、有機層をさらに無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、蒸発した。ヘミエ
ステル誘導体が収率９５％で得られ、さらに精製することなく使用された。

ＬＮＡ−ＣＰＧ樹脂の調製
上記で調製されたヘミエステル誘導体（９０μモル）を、ＤＭＦの最小量に溶解し、Ｄ
ＩＥＡ及びｐｙＢＯＰ（９０μモル）を加え、共に１分間混合した。この前もって活性化
した混合物を手動合成機内で、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５００Å、８０−１２０メッシュ、３
００ｍｇ）と混合し、撹拌した。室温で１．５時間おいた後、支持体を濾過して除き、Ｄ
ＭＦ、ＤＣＭ及びＭｅＯＨで洗浄した。乾燥後、充填物を定量した結果、５７μモル／ｇ
であった。

ホスホロチオエートサイクル
ＣＰＧ（多孔質ガラスビーズの固相担体、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓ
ｓ）に結合した５’−Ｏ−Ｄｍｔ［Ａ（ｂｚ）、Ｃ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）及びＴ］を、
ジクロロメタン溶液中の３（ｖ／ｖ）％トリクロロ酢酸を用いて脱保護した。樹脂をアセ
トニトリルで洗浄した。ホスホロアミダイト［Ａ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、５−メチル−
Ｃ（ｂｚ）又はＴ−β−シアノエチルホスホロアミダイト］のカップリングは、アセトニ
トリル中５’−Ｏ−Ｄｍｔ保護アミダイトの０．０８Ｍ溶液を使用することによって実行
され、活性化は、アセトニトリル（０．２５Ｍ）中ＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾー
ル）を使用することによって行われた。カップリングは２分間行われた。チオール化は、
Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（アセトニトリル中０．０５Ｍ）を使用することによって実行され
、３分間反応させた。支持体をアセトニトリルで完全に洗浄し、続いてキャップ形成は、
無水酢酸のＴＨＦ溶液（ＣＡＰ Ａ）及びＮ−メチルイミダゾール／ピリジン／ＴＨＦ（
１：１：８）（ＣＡＰ Ｂ）を用いて未反応の５’−ヒドロキシル基にキャップ形成した
。キャップ形成ステップを繰り返し、アセトニトリル洗浄でサイクルを終了した。

ＬＮＡサイクル
ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）に結合した５’−Ｏ−Ｄｍｔ
［ｌｏｃＡ（ｂｚ）、ｌｏｃＣ（ｂｚ）、ｌｏｃＧ（ｉｂｕ）又はｌｏｃＴ］を、上記と
同じ手順を用いて脱保護した。カップリングは、５’−Ｏ−Ｄｍｔ［ｌｏｃＡ（ｂｚ）、
ｌｏｃＣ（ｂｚ）、ｌｏｃＧ（ｉｂｕ）又はｌｏｃＴ］−β−シアノエチルホスホロアミ
ダイト（アセトニトリル中０．１Ｍ）を使用して実行され、活性化はＤＣＩ（アセトニト
リル中０．２５Ｍ）によって行われた。カップリングは、７分間に延長された。キャップ
形成は、無水酢酸のＴＨＦ溶液（ＣＡＰ Ａ）及びＮ−メチルイミダゾール／ピリジン／
ＴＨＦ（１：１：８）の溶液（ＣＡＰ Ｂ）を用いて３０秒間行われた。亜リン酸トリエ
ステルは、Ｉ_２及びピリジンのＴＨＦ溶液を３０秒間使用することによって、より安定な
リン酸トリエステルに酸化される。支持体は、アセトニトリルで洗浄され、キャッピング
ステップが繰り返される。サイクルは、アセトニトリル洗浄によって終了した。略語：Ｄ
ｍｔ：ジメトキシトリチル、ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール。

オリゴヌクレオチド切断及び脱保護
オリゴマーは、支持体から切断され、β−シアノエチル保護基は、室温にて１時間、３
５％ＮＨ_４ＯＨで支持体を処理することによって除かれた。支持体は、濾去され、塩基の
保護基は、６５℃で４時間加熱することによって除かれた。次いで、オリゴ溶液が蒸発乾
固された。

オリゴヌクレオチドの精製
オリゴ体は、（逆相）ＲＰ−ＨＰＬＣ又は（アニオン交換）ＡＩＥによって精製される
。
ＲＰ−ＨＰＬＣ：
カラム： ＶＹＤＡＣ^ＴＭ、カタログＮｏ．２１８ＴＰ１０１０（ｖｙｄａｃ）
流速： ３ｍＬ／分
バッファー： Ａ ０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．６
Ｂ アセトニトリル
グラジエント：
時間 ０ １０ １８ ２２ ２３ ２８
Ｂ％ ０ ５ ３０ １００ １００ ０
ＩＥ：
カラム： Ｒｅｓｏｕｒｃｅ^ＴＭ１５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ社製）
流速： １．２ｍＬ／分
バッファー： Ａ ０．１Ｍ ＮａＯＨ
Ｂ ０．１Ｍ ＮａＯＨ、２．０Ｍ ＮａＣｌ
グラジエント：
時間 ０ １ ２７ ２８ ３２ ３３
Ｂ％ ０ ２５ ５５ １００ １００ ０
略語
Ｄｍｔ： ジメトキシトリチル
ＤＣＩ： ４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＭＡＰ： ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＤＩＥＡ： Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＰｙＢＯＰ： ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニ
ウムヘキサフルオロリン酸
Ｂｚ： ベンゾイル
Ｉｂｕ： イソブチリル
Ｂｅａｕｃａｇｅ： ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキサイ
ド
Ａ（ｂｚ）、Ｃ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）又はＴ：ＬＮＡ−単量体（ＬＮＡ：ロックされた
核酸）

細胞培養
アンチセンス化合物及び標的核酸の発現におけるそれらの効果は、標的核酸又はタンパ
ク質が測定し得るレベルにあるように供された細胞の種々の型の何れにおいても測定する
ことができる。これは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザン・ブロット又はウエスタンブ
ロット分析を用いて常法で測定することができる。以下の細胞型は、図示の目的のために
提供されるものであるが、しかし、その他の型も通常に使用することができる。ただし標
的が、選ばれた細胞型において発現されることが条件である。

細胞株は、以下に記載されたようにして、適当な条件下で培養され、３７℃、湿度９５
−９８％及び５％ＣＯ_２で維持された。細胞は、通常、週２−３回継代された。
Ｕ８７−ＭＧ：ヒト神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７−ＭＧは、エール塩（Earle's salt）及
び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む改変イーグル培地（ＭＥＭ）で培養された。
Ｕ３７３：ヒト神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ３７３は、エール塩及び１０％ウシ胎仔血清（Ｆ
ＣＳ）を含む改変イーグル培地（ＭＥＭ）で培養された。
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株１５ＰＣ３は、Ｄｒ．Ｆ．Ｂａａｓ、Ｎｅｕｒｏｚｉｎ
ｔｕｉｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＡＭＣ、オランダ国によって供与され、ＤＭＥＭ
（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋ＧｌｕｔａｍａｘＩ＋ゲンタマイシン
中で培養された。

嫌気的細胞培養：
低酸素条件下でのＨＩＦ発現の変化を監視するため、細胞を、化学的にＯ_２を結合する
ために加えたＡｎａｅｒｏｃｕｌｔ（Ｍｅｒｃｋ）と共にインキュベーションバッグ（Ｍ
ｅｒｃｋ）中で、０．１−１．５％のＯ_２レベルでの嫌気的条件下で培養した。嫌気的条
件は、１−２時間内に得られた。細胞を、６又は１８時間、無酸素にした。

アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理
（上記した）細胞を、トランスフェクション伝達手段として陽イオン性リポソーム処方
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｇｉｂｃｏ）を用いてオリゴヌクレオチドで処理
した。細胞を１００ｍｍ×２０ｍｍ細胞培養ペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）又は６穴プレー
ト（ＮＵＮＣ）に播種し、９０％コンフルエントまで処理した。使用したオリゴ濃度は、
１ｎＭから４００ｎＭ最終濃度までの範囲であった。オリゴ−脂質複合体の処方は、無血
清ＭＥＭ及び総容積６ｍｌ中５μｇ／ｍｌの最終脂質濃度を用い、メーカーの指示書に従
って行った。細胞を、３７℃、４又は２４時間インキュベートし、オリゴ含有培地を除去
することによって処理を停止した。細胞を洗浄し、血清含有ＭＥＭを加えた。オリゴ処理
の後、細胞を６時間の低酸素処理する前１８時間回復させるか、直接１８時間の低酸素処
理した。

総ＲＮＡの抽出
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（例えば、ＱｉａｇｅｎカタログＮｏ．７４１０
４）を使用するか、又はＴｒｉｚｏｌ試薬（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓカタログＮｏ．１５５９６）を使用するか、のいずれかで単離された。細胞株からＲＮ
Ａを単離するために、ＲＮｅａｓｙは好ましい方法であり、組織サンプルには、Ｔｒｉｚ
ｏｌは好ましい方法である。総ＲＮＡは、メーカーによって提供されたプロトコールに従
ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞株から単離された。組織
サンプルは、ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘＴ８ホモジナイザー（例えば、ＩＫＡ Ａｎａｌｙ
ｓｅｎ Ｔｅｃｈｎｉｋ）を使用してホモジナイズされ、総ＲＮＡは、メーカー提供のＴ
ｒｉｚｏｌ試薬プロトコールを使用して単離された。

第一鎖ｃＤＮＡの合成
第一鎖ｃＤＮＡの合成は、メーカーの指示書に従ってＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素
キット（カタログ＃２０５１１３、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施された。各サンプルに
つき、総ＲＮＡ０．５μｇを、ＲＮａｓｅフリーＨ_２Ｏで各１２μｌに調節し、ポリ（ｄ
Ｔ）_{１２−１８}（２．５μｇ／ｍｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，ＤＫ）２μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ（ｄＮＴＰ各５ｍＭ）２μ
ｌ、１０×バッファＲＴ２μｌ、ＲＮＡｇｕａｒｄ^ＴＭＲｎａｓｅＩＮＨＩＢＩＴＯＲ（
３３．３Ｕ／ｍｌ）（カタログ＃２７−０８１６−０１、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ，ＤＫ）１μｌ、及びＯｍｎｉＳｃｒｉ
ｐｔ逆転写酵素（４Ｕ／μｌ）１μｌと混合し、次いで、３７℃、６０分のインキュベー
ション及び酵素の加熱不活化を９３℃、５分間行った。

ＨＩＦ−１α発現のアンチセンス調節の解析
ＨＩＦ−１α発現のアンチセンス調節は、公知の種々の方法でアッセイすることができ
る。例えば、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡレベルは、ノーザン・ブロット法、拮抗ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイムＰＣＲによって定量化することができる。リアル
タイム定量ＰＣＲが、現在では好ましい。ＲＮＡ分析は、総細胞ＲＮＡ又はｍＲＮＡにつ
いて実行することができる。

ＲＮＡ分離の方法及びノーザン・ブロット法のようなＲＮＡ分析は、通常の技術であり
、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓに教示されている。

リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、市販のｉＱ多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂ
ｉｏＲＡＤより入手可能）を使用して都合よく実行することができる。

Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ｍＲＮＡレベルの定量化は、メーカーの指示書に従って、ｉＱ多色リアルタイムＰＣＲ
検出システム（ＢｉｏＲＡＤ）を使用するリアルタイム定量ＰＣＲによって決定された。

リアルタイム定量ＰＣＲは、周知技術であり、例えば、Ｈｅｉｄら、Ｒｅａｌ ｔｉｍ
ｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）
，６：９８６−９９４に教示されている。

プラチナ定量ＰＣＲスーパーミックスＵＤＧ２×ＰＣＲマスターミックスは、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎカタログ＃１１７３０から得られた。プライマー及びＴａｑＭａｎ^ＴＭプロ
ーブは、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツから得られた。

ヒトＨＩＦ−１αに対するプローブ及びプライマーは、公開されている配列情報（Ｇｅ
ｎＢａｎｋアクセスナンバーＮＭ＿００１３５、ここにおいて配列番号１として取込まれ
ている）を使用してヒトＨａ−ｒａｓ配列にハイブリダイズするように設計された。

ヒトＨＩＦ−１αに対するＰＣＲプライマーは：
前進プライマー：５’ＣＴＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＣＧＴＧＴＴ３’（アッ
セイにおける最終濃度：０．９μＭ）（配列番号１１６）、逆行プライマー：５’ＧＣＴ
ＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣ３’（アッセイにおける最終濃度：０．
９μＭ）（配列番号１１７）、及びＰＣＲプローブは：５’ＦＡＭ−ＣＣＴＣＡＧＧＡＡ
ＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＡＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’ （アッセイ
における最終濃度：０．１μＭ）（配列番号１１８）であった。

グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ量は、サン
プル調製における変動を正常化するための内部対照として使用された。ヒトＧＡＰＤＨ・
ｍＲＮＡのサンプル含量は、メーカーの指示書に従って、ヒトＧＡＰＤＨ ＡＢＩ Ｐｒ
ｉｓｍ Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログＮｏ．４３１０８８４Ｅ）を使用して定量された。

マウスＧＡＰＤＨ・ｍＲＮＡの定量用に、以下のプライマー及びプローブが設計された
：センスプライマー５’ａａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｃａａｇｇｔｃａｔｃ３’（最終濃度０
．３μＭ）、アンチセンスプライマー５’ｇｔｃａｇａｔｃｃａｃｇａｃｇｇａｃａｃａ
ｔｔ（最終濃度０．６μＭ）、ＴａｑＭａｎプローブ５’ＦＡＭ−ｇａａｇｃｔｃａｃｔ
ｇｇｃａｔｇｇｃａｔｇｇｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｔｃ−ＴＡＭＲＡ３’ （最終濃度０．
２μＭ）。

リアルタイムＰＣＲ
実施例８に記載されたようにして実行された第一鎖合成からのｃＤＮＡは、２から２０
回希釈され、リアルタイム定量ＰＣＲによって分析された。プライマー及びプローブを、
２×プラチナ定量ＰＣＲスーパーミックスＵＤＧ（カタログ＃１１７３０、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）と混合し、最終容積２５μｌになるようｃＤＮＡ３．３μｌを加えた。各サン
プルは、三回分析された。関係するＲＮＡを発現する細胞株から精製された材料について
調製されたｃＤＮＡの２倍希釈をアッセイして、アッセイ用標準曲線を作成した。滅菌水
が、鋳型のない対照としてｃＤＮＡの代わりに使用された。ＰＣＲプログラム：５０℃２
分、９５℃１０分その後続いて９５℃で４０サイクル、１５秒、６０℃、１分。

標的ｍＲＮＡ配列の相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱリアルタイム検出システムソフト
ウエアを使用して計算された閾サイクルから決定された。

ＨＩＦ−１αタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（免疫ブロッテ
ィング）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）又は蛍光標示式細胞分取（ＦＡ
ＣＳ）のような、周知技術の種々の方法で定量することができる。ＨＩＦ−１α指向の抗
体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，Ｕ
ＳＡ）、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ， Ｃｏｌｏｒａｄ
ｏ）、 Ｓｎａｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような、種々のソースから同定され、得ることができ、又は通
常の抗体生成法により調製することができる。

ＨＩＦ−１αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理効果を計るために、処
理及び非処理細胞におけるＨＩＦ−１αのタンパク質レベルを、ウェスタンブロット法を
用いて測定した。

上に記載したようにオリゴヌクレオチドで処理後、細胞をゴム製ポリスマンで、プロテ
アーゼインヒビター、フェニルメチルフッ化スルホニル（ＰＭＳＦ）を０．３７ｍｇ／ｍ
ｌ含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に掻き取ることによって収得した。

収得した細胞は、上に記載したようなＰＭＳＦ含有ＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、細胞ペレッ
トを−８０℃で冷凍して保存した。

タンパク質の抽出には、凍結細胞ペレットを、３倍量の氷冷した溶解バッファ［５０ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎ−ｉｄｅｔ Ｐ４０（Ｎｐ−
４０）、０．１％ＳＤＳ、１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭジチオト
レイトール（ＤＴＴ）、完全タンパク質阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）］に溶解した。サンプルをＶｉｂｒａＣｅｌｌ５０ソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍ
ａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．）にて、５−１０秒、２−３回超音波処理した。溶解物は使
用時まで−８０℃で貯蔵された。

タンパク質溶解物のタンパク濃度を、メーカーの指示書の通りにＢＣＡタンパク質アッ
セイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。

ＳＤＳゲル電気泳動
上記により調製されたタンパク質サンプルを、氷で解凍後、１０分間７０℃で変性した
。

サンプルを１．０ｍｍの１０％ＮｕＰａｇｅＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮＯＶＥＸ）に負
荷し、ゲルを、ＸｃｅｌｌＩＩミニセル電気泳動モジュール（ＮＯＶＥＸ）を使用したタ
ンパク質を所望の分離をするために、ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ又はＮｕＰａｇｅ ＭＯＰＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（両
者ともＮＯＶＥＸ）のいずれかのランニングバッファ中で泳動処理した。

電気泳動モジュールの内部チャンバーに、ＮｕＰａｇｅＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ（ＮＯ
ＶＥＸ）をランニングバッファに、最終濃度が２．５μｌ／ｍｌになるよう加えた。サイ
ズの対照標準として、ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＳｔａｎｄａｒｄ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゲルに負荷した。電気泳動は、１６０Ｖ、２時間行った。

セミドライブロッティング
電気泳動後、分離されたタンパク質を、セミドライブロッティングによってポリ二フッ
化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転移した。膜に吸着されるまで、膜をＮｕＰａｇｅＴｒａ
ｎｓｆｅｒＢｕｆｆｅｒで平衡化させた。ブロッティング処理は、メーカーの指示書に従
ってＴｒａｎｓ−ｂｌｏｔＳＤＳｅｍｉ−Ｄｒｙ転移細胞（ＢｉｏＲＡＤ）中で行われた
。膜を、次の使用まで４℃で保存した。

免疫検出
所望のタンパク質を検出するために、膜をタンパク質に対するポリクローナル又はモノ
クローナル抗体とインキュベートした。膜を、ブロッキングバッファ［ＴＳバッファ（１
５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．４）に溶解した２．５％脱脂乳粉末及
び５％ＢＳＡ］で、１時間撹拌してブロックした。次いで、膜を室温にてＴＳバッファで
２×１５分洗浄し、０．１％ＮａＮ_３を含むＴＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファ中、４℃にて
一夜、一次抗体とともにインキュベートした。以下の一次モノクローナル抗体及び濃度／
希釈が使用された：マウス抗Ｇｌｕｔ１（Ｔ．Ｐｌｏｕｇ，Ｔｈｅ Ｐａｎｕｍ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎより入手）１：２０、マウス抗ＨＩＦ−１α（Ｈ７
２３２０、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１μｇ／ｍｌ、マウ
ス抗α−チューブリン（Ｔ−９０２６，Ｓｉｇｍａ）１：１０，０００。一次抗体とイン
キュベーションの後、膜をＴＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファで１５分洗浄し、次いで室温で
撹拌しつつ各５分間の２回追加洗浄を行った。引き続いて、膜を、二次抗体、ペルオキシ
ダーゼ共役ポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｐ０４４７,ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ
）、の１：５０００希釈で、室温にて１時間インキュベートした。次いで、膜をＴＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ２０バッファで１５分間洗浄し、さらに撹拌しつつ室温で５分間の３回追加洗浄
を行った。最終洗浄の後、膜を、ＥＣＬ^＋Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で５分間インキ
ュベートし、引き続いてＳＴＯＲＭ８４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉ
ｎｃ．）で直ちにスキャンした。膜を除去バッファ（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
）（１００ｍＭの２−メルカプトエタノール、２％のＳＤＳ、６２．５ｍＭのトリス塩基
）ｐＨ６．７で、５０℃、３０分間低撹拌のインキュベーションによって除去処置をした
。室温で２×１０分間、ＴＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファで洗浄後、膜を乾燥し、プラスチ
ックバッグに封入して、４℃で保存した。タンパク質発現レベルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎ
ｔ、ｖｅｒ５．０ソフトウエア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使
用して、ハウスキーピングタンパク質の発現に関して定量した。

オリゴヌクレオチドによるヒトＨＩＦ−１α発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドが、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ
アクセスＮｏ．ＮＭ＿００１５３０、ここにおいて配列番号１及び図７として取入れられ
ている）を用いて、ヒトＨＩＦ−１αＲＮＡの異なった領域を標的とするために設計され
た。長さ１６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが表１に示され、配列番号を有している
。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、特にＬＮＡ又はホス
ホロチオエートなどのような人工ヌクレオチドを使用して合成されたとき、とくに効力が
あるように設計されている。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合している特定の
標的配列上の第一のヌクレオチド番号を指している。化合物は、ここで他の実施例におい
て記載されているようにウエスタンブロット分析によるＨＩＦ−１αタンパク質に対する
効果について解析された。

本実験において、ＨＩＦ−１α発現の少なくとも２０％阻害を示した配列が好ましい（
図１−９も参照せよ）。これら好ましい配列が相補性である標的部位は、ここにおいて、
「ホットスポット」と呼び、それゆえに、本発明の化合物によって標的とされるに好まし
い部位である。

ホスホロチオエート、オリゴヌクレオチドを含有するＬＮＡ、又は少なくとも一つのＬ
ＮＡセグメント及び少なくとも一つのホスホロチオエートセグメントを有するキメラオリ
ゴヌクレオチドによるＨＩＦ−１αのアンチセンス阻害
本発明に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドの第二シリーズも合成された（表２
）。これらの化合物シリーズは、完全修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、完全
修飾ＬＮＡオリゴヌクレオチド、又は二つの異なった部位を標的とする長さが１６ヌクレ
オチドのキメラオリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート（ＰＳ）から構成される領域で、一方又は両方の部位でＬＮＡセグメントに隣接し
ている領域からなる、「ギャップマー」（ＧＭ）、「ヘッドマー」（ＷＭ５）又は「テー
ルマー」（ＷＭ３）である。これらの領域はオキシＬＮＡヌクレオチドからなる。オリゴ
ヌクレオチドには蛍光色素（ＦＡＭ）で標識されたものもある。ミスマッチオリゴヌクレ
オチドもまた設計された（ＭＭ）。オキシ−ＬＮＡの全てのシトシンは核酸塩基のＣ５部
位でメチル化されている。化合物は、他の実施例に記載のようにウェスタンブロット分析
によってＨＩＦ−１αタンパク質レベルに対する効果が分析された。「標的部位」は、オ
リゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列での第一のヌクレオチド番号を示している。

表２．ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド、又は
１つ又は２つのＬＮＡセグメント及び一つのホスホロチオエートセグメントを有するキメ
ラオリゴヌクレオチドによるヒトＨＩＦ−１αタンパク質レベルの阻害（特に指示しない
限り主鎖結合はＰ＝Ｏである。ｓ：Ｐ＝Ｓ結合、小文字：デオキシ核酸、大文字：オキシ
ＬＮＡ）。

表２及び図１−６に示したように、配列番号８９−１０４の大部分は、本実験において
ＨＩＦ−１α発現の少なくとも２０％阻害を実証した、そして、それゆえに好ましいもの
である。これら好ましい配列が相補性である標的部位は、ここでは「ホットスポット」と
呼ばれ、それゆえに本発明の化合物による標的として好ましい部位である。

ＨＩＦ−１αを標的とするオリゴマー化合物のインビボにおける有効性
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するオリゴヌクレオチド治療の効果が
、異なった腫瘍細胞株を使用して測定することができる。そのような細胞株の例としては
、ヒト腫瘍細胞株Ｕ８７（神経膠芽細胞腫）、Ｕ３７３（神経膠芽細胞腫）、１５ＰＣ３
（前立腺癌）及びＣＰＨ５４Ａ（小細胞肺癌）、及びネズミ腫瘍細胞株Ｂ１６（メラノー
マ）がある。

ＬＮＡ含有オリゴを使用したヌードマウスにおける皮下腫瘍異種移植片の治療
腫瘍細胞を皮下移植し、次いで３連続移植による連続継代した。腫瘍断片１ｍｍを、Ｎ
ＭＲＩヌードマウスにトロカール針を使って皮下に移植した。別に、癌細胞を典型的には
、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）３００μｌに懸濁した１０^６細胞をＮＭＲ
Ｉヌードマウスのわき腹に皮下注射した。

マウスは、種々の投与量、最大投与量５ｍｇ／ｋｇ／日、でオリゴヌクレオチドを腹腔
内投与もしくは皮下注射によって、又は皮下移植したＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプを使用して
２８日まで、５ｍｇ／ｋｇ／日まで投与することによって、治療された。マウスの個々の
治療は、腫瘍容積が５０ｍｍ^３に達したときに開始した。対照群の平均腫瘍容積が５０ｍ
ｍ^３に達したときに、ＰＢＳでの治療が開始された。実験は、いずれかの群の腫瘍が最大
許容容積に達したときに、終了された。全てのマウスの腫瘍サイズは、ノギスでの測定に
よって毎日測定された。治療効果は、腫瘍サイズ及び腫瘍増殖率として測定された。オリ
ゴヌクレオチド治療マウスは、最後のオリゴヌクレオチド注射後２４時間に処分した。

治療期間の最後に、マウスを麻酔し、腫瘍を摘出して、直ちに液体窒素で凍結し、標的
分析とした。

結果：Ｕ３７３異種移植片腫瘍を持ったマウスは、Ｃｕｒ８１３（配列番号９７）の５
ｍｇ／ｋｇ／日、一日一回７日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、又はＰＢＳの１００μｌ／
１０ｇ／日、一日一回７日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、で治療された。各群、５匹のマ
ウスが治療された。腫瘍評価は、上記に概説したようにして実行された。腫瘍増殖曲線は
図９に示される。

腫瘍サイズの比較（ｔ検定）
日 Ｐ値
４ ０．０４７７
５ ０．０１５６
６ ０．０３５４
７ ０．０４６１
カプラン・マイヤー解析
最終結果： 腫瘍サイズ１５０ｍｍ^３：
群 Ｎｏ． 打ち切り 結果 平均生存日数
ＰＢＳ ５ ０ ５ ５
Ｃｕｒ８１３ ５ １ ４ ７
生存分布の同等性についてのログランク検定： Ｐ＝０．０１３８

ＬＮＡ含有オリゴを使用したヌードマウスにおける頭蓋内腫瘍異種移植片の治療
腫瘍細胞を、ＮＭＲＩヌードマウスに頭蓋内移植し、オリゴヌクレオチド治療を移植後
１週間に開始する。マウスを、オリゴヌクレオチドの種々の投与量、最大投与量２ｍｇ／
ｋｇの腹腔内又は皮下注射で、又はＰＢＳ投与によって治療する。治療回数は、対照群に
おける腫瘍増殖によって決められる。実験は、いずれかの群の腫瘍が最大許容サイズに達
するか、又はいずれかの群において死亡が確実になるときに終了される。治療効果は、慢
性神経損傷に至るまでの時間として測定される。オリゴヌクレオチド治療マウスは、最終
オリゴヌクレオチド注射後２４時間に殺処分される。

インビトロ解析：アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ全身治療において増殖し
たヒト腫瘍細胞でのＨＩＦ−１αタンパク質レベルの阻害
腫瘍を、溶解バッファ［２０ｍＭトリスＣ１（ｐＨ７．５）；２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００；１／１００容プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ）；１／１００容プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ）］中で、４℃にてモーター駆動ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。腫瘍
組織１００ｍｇ当たり溶解バッファ５００μｌを適用した。腫瘍溶解物を、１３，０００
Ｇで５分間、４℃にて遠心分離し、組織砕片を分離した。腫瘍抽出物のタンパク質濃度は
、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用して
測定された。標的タンパク質発現のウェスタンブロット分析は、実施例８に記載されたよ
うにして実行された。

本発明は、ある種のその好適な実施態様に従って特異的に記載された。それゆえに、以
下の例は、本発明の例示に過ぎず、それのみに限定することを意図するものではない。

Claims (1)

1. 本明細書中に記載のオリゴヌクレオチド。

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