JP2009201515A - 修飾組換えワクシニアウイルスおよびその他の微生物、その使用 - Google Patents

修飾組換えワクシニアウイルスおよびその他の微生物、その使用 Download PDF

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Abstract

【課題】癌遺伝子療法およびワクチン療法のための腫瘍特異的送達ビヒクルとして有用な組換えワクシニアウイルス。治療方法およびそのための微生物が提供される。腫瘍特異的抗体の作製方法、また、微生物によりコードされている遺伝子産物の作製方法、ならびにそれと反応性のある抗体が提供される。
【解決手段】これらの微生物は、腫瘍および他の増殖組織などの免疫特権組織および細胞に、また、炎症組織に、他の組織、細胞および器官に比べて集積するように設計され、従って、それらは宿主生物に対して比較的低い毒性を示す。また、これらの微生物は、それらが集積する細胞の細胞膜を漏出性とし、その結果、タンパク質および他の細胞産物に対して反応性のある抗体を産生し、また、増殖組織、特に腫瘍を利用して選択されたタンパク質または他の産物を産生させるように設計または修飾される。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
「癌遺伝子療法およびワクチン療法のための腫瘍特異的送達ビヒクルとして有用な組換えワクシニアウイルス」と題された２００３年６月１８日出願のＥＰ０３ ０１３ ８２６．７、「腫瘍組織におけるポリペプチド、ＲＮＡまたはその他の化合物の生産方法」と題された２００３年８月１４日出願のＥＰ０３ ０１８ ４７８．２および「腫瘍に対する生物の自己免疫誘導のための微生物または細胞の使用」と題された２００３年１０月２２日出願のＥＰ０３ ０２４ ２８３．８の各々の優先権を主張する。支障がない限り、これらの出願の主題は出典明示によりそのまま本明細書に含まれる。
本願はまた、同日にこれとともに出願された米国特許出願番号第１０／８７２，１５６号にも関連する。本願はまた、２００２年７月３日出願の米国特許出願第１０／１８９，９１８号の継続特許である、「腫瘍の診断および治療のための発光微生物および細胞」と題された２００４年６月１０日出願の米国特許出願第１０／８６６，６０６号；２００３年６月５日出願の米国特許出願第１０／１６３，７６３号の継続特許である、「受傷組織または炎症組織に関連する疾病の診断および治療のための発光微生物および細胞」と題された２００４年５月１９日出願の米国特許出願第１０／８４９，６６４号；「腫瘍の診断および治療のための微生物および細胞」と題された２００２年７月３１日出願の国際ＰＣＴ出願ＷＯ０３／０１４３８０；受傷または炎症組織に関連する疾病の診断および治療のための発光微生物および細胞」と題された２００３年６月５日出願のＰＣＴ出願ＷＯ０３／１０４４８５；「腫瘍診断／治療のための発光微生物および細胞」と題された２００１年７月３１日出願のＥＰ出願第０１ １１８ ４１７．３；「腫瘍の診断および治療のための発光微生物および細胞」と題された２００１年１０月３０日出願のＥＰ出願第０１ １２５ ９１１．６号；「腫瘍の診断および治療のための微生物および細胞」と題された２００４年１月２８日出願のＥＰ出願第０２ ０７９４ ６３２．６号；および「受傷組織または炎症組織に関連する疾病の診断および治療のための発光微生物および細胞」と題された２００２年６月５日出願のＥＰ出願第０２ ０１２ ５５２．２号にも関連する。支障がない限り、これらの出願の主題は出典明示によりそのまま本明細書に含まれる。
（技術分野）
マイクローブおよび細胞を含む弱毒または修飾微生物を含むワクチン、ならびにそれらの微生物およびワクチンを作製する方法が提供される。特に、修飾細菌、真核細胞およびウイルスが提供され、さらに、増殖性疾患および炎症性疾患の処置のため、ならびに腫瘍における産物の生産のためのその使用方法も提供される。
１９世紀の終盤に、微生物を用いて癌患者を処置しようと様々な試みがなされた。外科医であるWilliam Coleyは、腫瘍を有する患者に化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)の生菌を投与したが、成功は限られたものであった。２０世紀の初頭、科学者たちがマウスにおけるワクシニアウイルス性の腫瘍崩壊を報告し、これが１９４０年代から１９６０年代に、腫瘍患者に数種の生きたウイルスを投与するに至らせた。このような癌処置の道への踏み込みは成功に至らなかった。
それ以来、癌処置のために様々な遺伝子操作ウイルスが試験されてきた。例えばある研究では、非転移性結腸腺癌細胞を有するヌードマウスに、ワクシニアの増殖因子を欠損させ、そのチミジンキナーゼ遺伝子座に増強した緑色蛍光タンパク質を挿入することにより修飾したワクシニアウイルスＷＲ株の全身注射を行った。このウイルスは、この修飾ウイルスが外因性の治療遺伝子を欠いているにもかかわらず、抗腫瘍作用（１例の完全奏功を含む）を有することが認められた(McCart et al. (2001) Cancer Res 1:8751−8757)。別の研究では、黒色腫患者の第三相臨床試験で、ワクシニア黒色腫腫瘍崩壊物(vaccinia melanoma oncolysate)（ＶＭＯ）を黒色腫陽性のリンパ節近傍に注射した。対照として、New York City Board of Health株ワクシニアウイルス（ＶＶ）を黒色腫患者に投与した。ＶＭＯで処置した黒色腫患者は非処置患者の場合よりも良好な生存率を示したが、ＶＶ対照で処置した患者と同程度であった (Kim et al. (2001) Surgical Oncol 10:53−59)。
他の研究では、このアプローチでの成功が限られたものであったことが示された。この治療は、特に全身送達されたウイルスまたは細菌の場合では、全面的に有効とは言えなかった。インビボにおける微生物ビヒクル機能の制御が限られたものであるため、効果のない治療結果が得られるばかりか、安全性に関する懸念も持ち上がる。この種の治療を改良するか、または新生物性疾患の処置のためにより効果的なアプローチを開発することが望ましい。よって、本明細書の目的の中でも、新生物生疾患およびその他の疾患の処置のための治療方法および微生物を提供することが１つの目的である。
本明細書では、新生物性疾患およびその他の疾患の処置方法に用いるための治療方法、ならびにウイルス、細菌および真核細胞を含む微生物が提供される。処置の対象となる疾患は、標的化された組織および／または細胞が、それらが、また多くの場合にはそれらの局部的な環境が免疫系から何らかの方法で逃れているか、または免疫系に接近できないという点で免疫特権が与えられているものである。このような組織としては、腫瘍、ならびに他の増殖性疾患に関与するその他の組織および細胞、創傷、および炎症応答に関与するその他の組織が挙げられる。微生物は細菌細胞、ウイルスおよび哺乳類細胞を含み、非病原性となり、かつ、免疫特権組織に優先的に集積するように選択または設計される。これらの微生物はひと度、その組織または細胞またはその近傍において、そのような組織の細胞の細胞膜に影響を及ぼすと、それらは漏出するか、または崩壊するようになるが、標的細胞および腫瘍が免疫応答を惹起するに十分な時間、十分な抗体またはその他のタンパク質を漏出するように十分緩慢なものである。
微生物は、静脈投与（ｉ．ｖ．）などの全身投与を含む任意の経路により、または薬剤をリンパ管に向ける経口または鼻腔またはその他の送達系を用いて投与する。例示的な方法では、微生物は腫瘍の処置、ならびに再発および転移拡散の予防のために用いられる。例示的微生物としては、著しく弱毒化されたウイルスおよび細菌、ならびに哺乳類細胞が挙げられる。微生物は所望により、標的化組織へ、他の治療産物を含む他の産物を送達するよう修飾してもよい。
これらの微生物を腫瘍を含む宿主に投与すると、宿主内のこれらの腫瘍は本質的に抗原およびタンパク質工場となる。これを利用することができれば、これらの腫瘍はその微生物によりコードされているか、またはその微生物により産生されるタンパク質またはその他の細胞産物を生産するために使用できる。さらに、その微生物ならびに腫瘍細胞により産生される産物に対する抗体を単離するために、宿主の血清を採取することもできる。従ってまた、その微生物を動物、通常には非ヒト動物に投与し、腫瘍を採取してその産物を単離することにより、遺伝子産物を生産するための方法も提供される。また、タンパク質またはその他の産物を発現するまたは産生する微生物を宿主、一般には非ヒト宿主に投与し、その宿主から血清を採取し、そのタンパク質またはその他の産物と特異的に結合する抗体を単離することにより、代謝産物または中間体などのタンパク質または細胞産物を選択するための抗体を作製する方法も提供される。
よって、免疫特権細胞または組織、特に腫瘍の排除のための方法および微生物が提供される。この方法は、漏出タンパク質およびその他の化合物を生じる腫瘍細胞など、非宿主タンパク質に対する宿主のワクチンとなる腫瘍抗原など、および、宿主の免疫系による腫瘍細胞などの免疫特権細胞の除去をもたらす腫瘍抗原などといった免疫特権細胞に優先的に集積する微生物を投与、一般には全身投与することを含む。これらの微生物は、急速に細胞を溶解する能力で選択するのではなく、むしろ、腫瘍などの免疫特権細胞に集積する能力で選択し、その結果、免疫応答を惹起するのに十分な量かつ十分な時間で抗原の漏出が起こる。
従って、腫瘍に対する生物の自己免疫を誘導するための、異種ＤＮＡ、ポリペプチドまたはＲＮＡを含む微生物または細胞の使用が提供される。特に、これらの微生物は、腫瘍に集積し、かつ、非腫瘍性の細胞、組織または器官には集積するとしてもごくわすかしか集積しない（宿主には無毒である）ように、また、いくつかの方式では、腫瘍細胞溶解または細胞膜の崩壊をもたらし、その結果、腫瘍抗原が漏出するように選択または設計する。このような微生物の例として、ＬＩＶＰ由来ワクシニアウイルスおよび本明細書に記載の細菌、およびまた腫瘍を標的とするように、また、細胞膜を崩壊するように修飾された哺乳類細胞がある。これらの微生物は、腫瘍細胞抗原の漏出を媒介または増強し、かつ／または抗腫瘍化合物などの治療薬である異種産物を発現するように修飾することができる。
また、（ａ）目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む微生物または細胞を担癌生物に注射し、（ｂ）その腫瘍に対する抗体を単離することにより、腫瘍に対する抗体を生産するための方法も提供される。
免疫特権組織および細胞（腫瘍細胞など）に集積するが、非標的器官および組織には毒性レベルまで集積せず、かつ、免疫特権組織または細胞を有する動物に投与した際に、免疫特権細胞またはその産物に対する抗腫瘍（または抗腫瘍抗原）抗体の産生によるなどの自己免疫を生じる弱毒微生物が提供される。これらの微生物は、緩慢な溶解またはアポトーシスプロセスによるなどして、免疫特権細胞を漏出性とするように選択または作出される。この目的はこのような漏出性を達成することであって、宿主が免疫応答を開始できないほど急速に細胞を溶解することではない。
免疫特権細胞を排除するための微生物の使用および使用方法が提供される。これらの微生物は所望により、レポーター遺伝子および／または微生物の遺伝子を妨害するその他の異種核酸を含んでもよく、また、微生物が集積する細胞または組織において遺伝子および／またはタンパク質発現を変更するＲＮＡ（ＲＮＡｉを含む）などの治療産物または産物をコードおよび提供することもできる。提供されるウイルスとしては、ワクシニアの修飾ＴＫおよびＨＡ遺伝子、ならびに修飾Ｆ３遺伝子またはＦ３遺伝子に相当する遺伝子座を含む弱毒ポックスウイルスがある。特に、修飾ＴＫおよびＨＡ遺伝子、ならびに所望により修飾Ｆ３遺伝子または遺伝子座を含む組換えワクシニアウイルスが提供され、ここでは、生じたウイルスは非標的器官には毒性レベルまで集積しない。ＴＫ遺伝子およびＦ３遺伝子が修飾されているワクシニアウイルス、ならびにＨＡおよびＦ３遺伝子が修飾されているワクシニアウイルス、ならびに３つ全ての遺伝子が修飾されているウイルスが提供される。修飾は１以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換による不活性化を含み、それによりウイルスの活性または産生が変更される。変更には、治療タンパク質をコードする核酸などの異種核酸の挿入が含まれる。
例示的な態様では、ワクシニアウイルスはＬｉｓｔｅｒ株ウイルス、特にＬＩＶＰ株ウイルスである（ＬＩＶＰとは、現在広く普及しているウイルス株の原株供給者であるthe Institute of Viral Preparations, Moscow, RussiaのＬｉｓｔｅｒウイルスをさす）。修飾は、Ｆ３と呼ばれる遺伝子座のユニークなＮｏｔＩ部位におけるウイルスの修飾を含む。特に、この修飾はワクシニアウイルスＬＩＶＰ株ＤＮＡのＦ３遺伝子の３５番またはＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ断片内の１４７５番にある。
この異種核酸は、そのタンパク質をコードする核酸と作動可能なように連結されている調節配列を含み得る。調節配列としては、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐ７．５および初期／後期ワクシニアｐＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターが挙げられる。この微生物の異種核酸は検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導し得る産物をコードすることができる。検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを生じ得る産物の含有により、この微生物は免疫特権細胞が排除された際に排除され得ることから、投与された微生物の分布をモニタリングするとともに治療効力をモニタリングすることができる。
本明細書で例示される三重突然変異ワクシニアウイルスなどの組換えウイルスを含む宿主細胞が提供される。また、本明細書で提供されるか、または本方法で用いられるいずれかの微生物を含む腫瘍細胞も意図される。
本明細書の方法で用いるための、医薬上許容されるビヒクル中にこれらの微生物を含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物は、限定されるものではないが、静脈内投与用などの全身投与を含むいずれの投与様式用にも製剤できるか、または製剤される。これらの組成物は、微生物と会合されたリポソームおよびミセルを含む、脂質に基づく担体のような送達ビヒクルを含み得る。
また、動物において腫瘍細胞などの免疫特権細胞を排除するための方法（およびそれら微生物の使用）であって、医薬組成物を動物に投与し、それにより、ウイルスが免疫特権細胞に集積することで、それらの細胞の排除またはそれらの数の減少をもたらす自己免疫を媒介することによる方法も提供される。
動物において免疫特権細胞または組織を排除するための治療方法であって、動物に微生物を投与することによる方法も提供され、この方法では、その微生物が免疫特権細胞に集積し；その微生物が非罹患器官および組織には集積せず、動物において毒性が低く；その微生物が免疫特権細胞において細胞膜の漏出をもたらし、それにより、その動物がそれらの細胞またはそれらの細胞の産物に対する自己抗体を産生する。これらの方法には、腫瘍処置、創傷を含む炎症症状の処置、ならびに乾癬、癌、糖尿病性網膜症、再狭窄およびその他のこのような疾患を含む増殖性疾患の処置が含まれる。これらの微生物は非罹患器官、特に卵巣または精巣に集積しないことが望ましい。
微生物は弱毒細菌、弱毒ウイルスおよび哺乳類細胞であってよく、例えば、ポックスウイルスおよびその他の細胞質内ウイルス、ビブリオ菌、大腸菌、サルモネラ菌、連鎖球菌およびリステリア菌などの細菌、Ｂ細胞およびリンパ球（Ｔ細胞など）を含む免疫細胞、ならびに幹細胞などの哺乳類細胞がある。
組換えワクシニアウイルスを作出する方法であって、（ａ）（ｉ）制限部位ｘに挿入された修飾Ｆ３遺伝子を含むワクシニアシャトルプラスミド、および（ｉｉ）制限部位において消化された脱リン酸化ｗｔ ＶＶ（ＶＧＬ）ＤＮＡ、を作製すること；（ｂ）プソラレン−ＵＶ（ＰＵＶ）不活性化ヘルパーＶＶ（ＶＧＬ）に感染した宿主細胞を、ステップ（ａ）の構築物（ｉ）および（ｉｉ）の混合物でトランスフェクトすること；そして（ｃ）それらの形質転換体から組換えワクシニアウイルスを単離することによる方法が提供される。宿主細胞としては、ＣＶ-１細胞が挙げられる。
また、ポリペプチドもしくはＲＮＡ、または細胞産物などの化合物の生産のための方法も提供され、よって、その微生物の使用も提供される。このような方法は、（ａ）そのポリペプチドもしくはＲＮＡをコードする核酸を含むか、または産物としての化合物を産生する微生物を担癌動物に投与するステップ、なお、その微生物は免疫特権細胞に集積し；かつ、その微生物は、免疫特権細胞または組織を含まない器官および組織には毒性レベルまで集積しない；（ｂ）その動物から腫瘍組織を採取するステップ；および（ｃ）その腫瘍からポリペプチドもしくはＲＮＡまたは化合物を単離するステップを含み得る。
注記したように、これらの微生物としては、真核細胞、原核細胞およびウイルス、例えば、細胞質内ウイルス、弱毒細菌、幹細胞または免疫細胞が挙げられる。細菌は弱毒ビブリオ菌、大腸菌、リステリア菌、サルモネラ菌および連鎖球菌株の中から選択することができる。この微生物は蛍光タンパク質（すなわち、緑色、赤色および青色蛍光タンパク質ならびにその修飾変異体）および／またはルシファーと接触した際に光を発するルシフェラーゼなどの検出可能な産物を発現または産生することができ、また、治療産物などの付加的な産物をコードすることもできる。本明細書で提供される方法および使用では、動物は非ヒト動物であってよく、あるいはヒトも含み得る。
また、ポリペプチド、ＲＮＡ分子または細胞内化合物と、そのポリペプチド、ＲＮＡ分子または化合物と特異的に反応する抗体とを同時に生産するための方法であって、ａ）前記化合物、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を発現または産生する微生物を担癌動物に投与すること；そしてｂ）その動物の血清から抗体を単離すること、による方法も提供される。この方法は所望により、ステップａ）の後に、その動物から腫瘍組織を採取すること；およびその腫瘍組織から前記ポリペプチド、ＲＮＡ分子または細胞内化合物を単離することを含んでもよい。
また、動物において、腫瘍細胞などの免疫特権細胞または組織を排除するための方法、およびそのための微生物の使用が提供され、それは少なくとも２種の微生物を投与することによるものであり、それらの微生物は同時に、逐次にまたは間欠的に投与され、それらの微生物が免疫特権細胞に集積し、それによりその動物が免疫特権細胞または組織に対して自己免疫化される。
免疫特権細胞または組織の排除のための薬剤の製剤を目的とした少なくとも２種の微生物の使用が提供され、そこでは、それらが免疫特権細胞に集積し、それによりその動物が免疫特権細胞または組織に対して自己免疫化される。免疫特権細胞または組織の排除のために動物に投与することを目的として製剤された少なくとも２種の微生物を含む組合せが提供される。所望により投与に関する使用説明書およびその他の試薬を伴う、パッケージングされた組合せを含むキットが提供される。
免疫特権細胞において産生される産物に対して自己免疫を誘導することを目的とした、異種核酸をコードする微生物の使用が提供され、そこでは、投与した際に、その免疫特権組織を含む動物には無毒であるようにその微生物が免疫特権組織に集積し、かつ他の組織または器官には集積しないかまたは十分低いレベルでしか集積しない。
免疫特権組織または細胞において産生される産物に対する抗体の生産のための方法であって、（ａ）選択されたタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸を含む微生物を、免疫特権組織または細胞を含む動物に投与すること；そして（ｂ）動物の血液または血清から、そのタンパク質またはＲＮＡに対する抗体を単離すること、による方法が提供される。
また、被験体において免疫特権細胞または組織の増殖を阻害するための方法であって、（ａ）被験体に、検出可能な遺伝子産物をコードする修飾微生物を投与すること；（ｂ）被験体におけるその検出可能な遺伝子産物の存在を、その検出可能な遺伝子産物が実質的に被験体の免疫特権組織または細胞だけに存在するようになるまでモニタリングすること；そして（ｃ）被験体に、その微生物と共働して免疫特権細胞または組織の増殖を阻害する働きをする治療化合物を投与することによるか、または、（ａ）被験体に、検出可能な遺伝子産物をコードする修飾微生物を投与すること；（ｂ）被験体に、その微生物の病原性を軽減する治療物質を投与すること；（ｃ）被験体における検出可能な遺伝子産物の存在を、その検出可能な遺伝子産物が実質的に被験体の免疫特権組織または細胞だけに存在するようになるまでモニタリングすること；そして（ｄ）治療化合物の投与を終了または中止し、それにより微生物が病原性を増し、免疫特権細胞または組織の増殖が阻害されることによる方法が提供される。
図１Ａは、用いた組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ８の概略図である。組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ８は、実施例１に記載のインビボ組換え法を用いることで構築した。ＮｏｔＩで消化した野生型ワクシニアウイルスＤＮＡと非消化プラスミドＤＮＡ ｐＮＺ２の複合体を、インビボ組換えのためにＰＵＶ−ＶＶ感染細胞にトランスフェクトした。ＶＧＬは、野生型ワクシニアウイルス（Ｌｉｓｔｅｒ ＡＴＣＣ ＶＲ−１５４９株）；ＲＶＧＬ８は、ＮｏｔＩ部位にｌａｃＺ遺伝子をコードする組換えワクシニアウイルス；ＮｏｔＬおよびＮｏｔＲは、ワクシニアウイルスゲノムのユニークなＮｏｔＩ制限部位の左および右セグメント；ｐＥ／Ｌは、合成初期／後期ワクシニアウイルスプロモーター；ｐ７．５は、初期／後期ワクシニアウイルスプロモーター；ｌａｃＺは、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子である。 図１Ｂは、実施例に記載の種々のワクシニア株の概略図である。これらのウイルスで達成された結果は実施例に示す。 図２は、腫瘍における核酸分子、タンパク質および代謝化合物またはその他の細胞産物などの産物を生産するための方法のフローチャートを示す。
（詳細な説明）
Ａ．定義
Ｂ．腫瘍特異的治療のための微生物
Ｂ．腫瘍特異的治療のための微生物
１．特徴
ａ．弱毒化
ｉ．毒性の軽減
ｉｉ．腫瘍に集積し、その他の器官には実質的に集積しない
ｉｉｉ．腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起または増強する能力
ｉｖ．病原性と腫瘍抗原の放出のバランス
ｂ．免疫原性
ｃ．複製成分
ｄ．遺伝的変異体
ｉ．修飾された特徴
ｉｉ．外因的遺伝子発現
ｉｉｉ．検出可能な遺伝子産物
ｉｖ．治療遺伝子産物
ｖ．超抗原の発現
ｖｉ．採取する遺伝子産物の発現
２．ウイルス
ａ．細胞質内ウイルス
ｉ．ポックスウイルス
ａ．ワクシニアウイルス
ｂ．修飾ワクシニアウイルス
ｃ．Ｆ３遺伝子
ｄ．多重修飾
ｅ．Ｌｉｓｔｅｒ株
ｉｉ．その他の細胞質内ウイルス
ｂ．アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス
３．細菌
ａ．好気性細菌
ｂ．嫌気性細菌
４．真核細胞
Ｃ．弱毒微生物の作出方法
１．遺伝的修飾
２．上記特徴に関するスクリーニング
３．ヒトにおけるこのような微生物の開発方法
Ｄ．治療方法
１．投与
ａ．微生物投与前のステップ
ｂ．投与様式
ｃ．用量
ｄ．投与回数
ｅ．同時投与
ｉ．複数の微生物の投与
ｉｉ．治療化合物
ｆ．被験体の状態
２．モニタリング
ａ．微生物の遺伝子発現のモニタリング
ｂ．腫瘍サイズのモニタリング
ｃ．抗体力価のニタリング
ｄ．健康状態の診断のモニタリング
ｅ．処置と統合したモニタリング
Ｅ．遺伝子産物および抗体の生産方法
１．組換えタンパク質およびＲＮＡ分子の生産
２．抗体の生産
Ｆ．医薬組成物、組合せおよびキット
１．医薬組成物
２．宿主細胞
３．組合せ
４．キット
Ｇ．実施例
Ａ．定義
特に断りのない限り、本明細書で用いられている技術用語および科学用語は全て、当業者によって共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本明細書における開示全体のいたるところで引用されている特許、特許出願および公報、ウェブサイトならびにその他の刊行物は、特に断りのない限り、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。本明細書の用語に複数の定義がある場合には、本節の定義が優先する。ＵＲＬまたはその他このような識別名もしくはアドレスで引用がなされている場合には、このような識別名は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報は移り変わることがあるが、同等の情報が既知であるか、インターネットおよび／または適当なデータベースを検索するなどすることで容易に入手できるものと理解される。それらの引用は、そのような情報の利用可能性および公的普及を証明するものである。
本明細書において、微生物とは、哺乳類細胞などの真核細胞、ウイルスおよび細菌を含む単離された細胞またはウイルスをさす。これらの微生物は腫瘍ならびにその他の免疫特権細胞および組織に集積し、かつ、その他の組織または器官での集積が最小となるようなそれらの能力に関して修飾または選択される。集積は、特定の形質に対する微生物の選択または修飾の効力により、あるいは細胞の適切な選択により起こる。微生物は、その形質を変更し、かつ／または遺伝子産物を送達するようにさらに修飾することができる。本明細書で提供される微生物は一般には、病原性の軽減、毒性の軽減、正常器官または組織よりも腫瘍における優先的な集積、免疫原性の増強、腫瘍細胞に対して免疫応答を惹起または増強する能力の増強、溶解力または腫瘍細胞死滅力の増強、溶解力または腫瘍細胞死滅力の低下などの１以上の特徴を示すように、野生型に対して修飾される。
本明細書において、免疫特権細胞および組織とは、免疫系から隔離されている、固形腫瘍および受傷組織などの細胞および組織をさす。一般に、微生物の投与はその微生物を排除する免疫応答を惹起するが、免疫特権部位はこの免疫応答から遮蔽または隔離され、微生物は生き残り、通常複製可能となる。免疫特権組織としては、受傷組織などの炎症組織、および腫瘍組織などの増殖組織が挙げられる。
本明細書において、遺伝子に関して「修飾」とは、欠損遺伝子、または１以上の末端切断、突然変異、挿入または欠失を有する、一般には少なくとも１つの変化、通常は機能の部分的欠損を伴う遺伝子産物をコードする遺伝子をさす。
本明細書において、Ｆ３遺伝子とは、ワクシニアウイルス株ＬＩＶＰのＦ３遺伝子に相当する、ワクシニアウイルスなどのウイルスの遺伝子または遺伝子座をさす。これには、実質的に同じ、または少なくとも関連のある生物機能を有する遺伝子産物をコードする、いずれかのワクシニアウイルス株またはポックスウイルスのＦ３遺伝子またはゲノム内の遺伝子座が含まれる。本明細書に包含されるＦ３遺伝子は一般に、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。本明細書に包含されるＦ３遺伝子によりコードされるタンパク質は一般に、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。また、修飾または除去した際に毒性の軽減および／または腫瘍における集積の増大（非腫瘍性細胞、組織および器官と比べて）をもたらす、他のウイルスの対応する遺伝子座も含まれる。ＬＩＶＰのＦ３遺伝子と同等な他のウイルスの対応する遺伝子座は、そのウイルスゲノムにおける遺伝子の構造的位置により決定することができ、すなわち、ＬＩＶＰ Ｆ３遺伝子は、ワクシニアウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ断片上の、Goebel et al., Virology (1990) 179:247−266が定義しているようなオープンリーディングフレームＦ１４ＬとＦ１５Ｌの間に、ＯＲＦ Ｆ１４ＬおよびＦ１５Ｌとは逆向きに位置しており、従って、オルトポックスウイルスを含むポックスウイルスのような他のウイルスの対応する遺伝子座が含まれる。
本明細書において、微生物の弱毒とは、その微生物を投与した場合に弱毒化されていない微生物よりも、宿主に対する有害または有毒な作用を軽減または除去することを意味する。
本明細書において、毒性の低い微生物とは、投与した際に、微生物がその宿主の器官および組織に、器官に損傷または害をもたらすほどには集積しないこと、あるいは、疾病を投薬処置するよりもよりよい程度で宿主の生存に影響を及ぼすことを意味する。
本明細書において、被験体（または生物体）とは、ヒトを含む動物をさす。
本明細書において、動物とは、限定されるものではないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットなどのげっ歯類；ニワトリなどの家禽類；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヒツジ類(ovine)などの反芻動物；ならびにブタ、ウマ、ネコ、イヌおよびウサギなどのその他の動物といったいずれの動物も含む。非ヒト動物とは、意図する動物としてヒトを除く。
本明細書において、標的化組織における微生物の集積とは、そのマイクローブが宿主の器官または組織に感染するのに十分長い期間の後の、その生物のいたるところに微生物が分布していることをさす。当業者が認識しているように、マイクローブの感染期間はマイクローブ、標的とされる器官または組織、宿主の免疫応答性、および用量によって異なる。通常、集積は、そのマイクローブに感染した後、約１日〜約１週間の時点で決定することができる。本明細書の目的では、微生物は腫瘍などの標的組織に優先的に集積するが、宿主のその他の組織および器官からは、その微生物の毒性が軽度であるか、または許容され、たいていの場合致死的でない程度に排除される。
本明細書において、優先的な集積とは、第一の場所に、第二の場所における集積よりも高いレベルで微生物が集積することをさす。よって、正常組織または器官に対して腫瘍などの免疫特権組織に優先的集積する微生物とは、微生物が正常組織または器官に集積するよりも高いレベルで腫瘍などの免疫特権組織に微生物をさす。
本明細書において、腫瘍またはその他の免疫特権部位で産生される「化合物」とは、１以上の遺伝子を発現する、導入された微生物、通常には組換え微生物の存在により腫瘍により産生されるいずれの化合物もさす。例えば、腫瘍で産生される化合物は例えば、代謝産物、コードされているポリペプチドもしくはＲＮＡ、または組換えポリペプチド（例えば、酵素）により、および腫瘍または免疫特権組織もしくは細胞の細胞機構により生成される化合物であり得る。
本明細書において、投与のための送達ビヒクルとは、宿主動物への送達のための作用因子（本明細書で提供される微生物など）と会合している、脂質に基づく、または他のポリマーに基づく組成物、例えば、リポソーム、ミセル、または逆ミセルをさす。
本明細書において、「ウイルスベクター」は、その技術分野で認識されている意味に従って用いる。それはウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子へとパッケージングされ得る核酸ベクター構築物をさす。これらのウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞にＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の核酸を導入する目的で用いることができる。ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、乳頭種ウイルスベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
本明細書において、腫瘍崩壊ウイルスとは、腫瘍細胞で選択的に複製するウイルスをさす。
本明細書において、「疾病または疾患」とは、例えば、感染または遺伝子欠損から起こり、識別可能な症状によって特徴付けられる、生物体の病態をさす。
本明細書において、新生物（新形成）とは異常な新しい増殖をさし、従って、良性であっても悪性でもあってもよいが、腫瘍と同義である。過形成とは異なり、新生物増殖は起源となる刺激がなくなっても持続する。
本明細書において、新生物性疾患とは、腫瘍発生、増殖、転移および進行を含む癌を含むいずれの疾患もさす。
本明細書において、癌は、いずれの種類であれ悪性腫瘍によって引き起こされるか、または悪性腫瘍によって特徴付けられる疾病をさす一般用語である。
本明細書において、腫瘍に対して用いる悪性とは、増殖制御および位置的制御を欠き、転移能を有する原発腫瘍をさす。
本明細書において、転移とは、罹患プロセスに主として含まれる部位から離れた異常細胞または新生細胞の増殖をさす。
本明細書において、抗癌薬または化合物（「抗腫瘍薬または抗新生物薬」と互換的に用いられる）とは、抗癌処置に用いられ薬剤または化合物をさす。これらには、単独または他の化合物とともに用いた場合に、新生物性疾患、腫瘍および癌に関連する臨床症状または診断マーカーを緩和する、軽減する、改善する、予防するまたはその緩解状態に置くもしくは維持することができ、かつ、本明細書で提供される方法、組合せおよび組成物において使用できるいずれの薬剤も含まれる。抗新生物薬の例としては、単独もしくは組み合わせて用いられる、かつ／またはアルキル化剤、代謝拮抗物質、ある種の天然物、プラチナ錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ある種のホルモン、アンタゴニストおよび抗癌多糖類などの他の薬剤と組み合わせて用いられる、本明細書で提供される微生物が挙げられる。
一般に、本明細書の方法の実施のため、また、本明細書で提供される微生物を用いる場合には、起源となる腫瘍は切除せず、投与した微生物を集積させ、それらの細胞が漏出性となった際、または溶解した際に抗原またはその他の産物因子を得るために用いる。これらの抗原は宿主内で免疫応答を惹起するのに役立ち得る。これらの抗原および産物はその腫瘍から単離することができる。
本明細書において、血管形成は、限定されるものではないが、腫瘍に関連する新血管新生および創傷に関連する新血管新生を含む、新たな血管構造の確立および維持（新血管新生）に直接的または間接的に関与するプロセス全体を包含するものとする。
本明細書において、相同とは、約２５％を超える、例えば２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％といった核酸配列の同一性を意味する。必要であれば、相同性％を特定し得る。「相同性」および「同一性」はしばしば互換的に用いられるが、タンパク質に関する相同性は保存的アミノ酸変化を含み得る。一般に、配列（タンパク質または核酸）を最高の配列の一致が得られるようにアラインする（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。配列同一性により、同一のアミノ酸の数は、各供給者によって確立されているデフォルトギャップペナルティーとともに用いて、標準的アライメントアルゴリズムプログラムによって求められる。実質的に相同な核酸分子は、一般に中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、目的とする核酸分子の長さの全域にわたって、またはその全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％または９０％にわたってハイブリダイズする。また、そのハイブリダイズする核酸分子のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も提供される。（タンパク質に関しては、相同性の決定のため、同一のアミノ酸だけでなく保存的アミノ酸をアラインすることができ、この場合には、同一性％と相同性％は異なる。）任意の２つの核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」であるヌクレオチド配列を有するかどうかは、例えばPearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444のようなデフォルトパラメーターを用いる「ＦＡＳＴＡ」プログラム（他のプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))が挙げられる）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Mrtin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994,およびCarillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)のような既知のコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる。例えば、the National Center for Biotechnology InformationデータベースのＢＬＡＳＴ関数を用いて同一性を決定することができる。他の商業的または公的に利用できるプログラムとしては、ＤＮＡＳｔａｒの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム(Madison, WI)およびthe University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)の「Ｇａｐ」プログラム(Madison WI)が挙げられる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性％は、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる（例えば、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443、Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482により改訂されている)。
要するに、ＧＡＰプログラムは、類似性を、アラインされた同じ記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数をその２つの配列のうち短い方の記号の総数で割ったものとして定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメーターとしては、（１）一元比較マトリックス（同一の１と同一でない０の値を含む）およびSchwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353−358 (1979)が記載しているような、Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の荷重比較マトリックス；（２）各ギャップのペナルティーは３．０、および各ギャップの各記号のペナルティーは０．１０を追加；および（３）末端ギャップにはペナルティーなしを含み得る。よって、本明細書において「同一性」とは、試験ポリペプチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の比較を表す。
本明細書において、あるポリペプチドのアミノ酸が、配列表に示されているアミノ酸など、開示されているアミノ酸に相当するという場合、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準的アライメントアルゴリズムを用い、そのポリペプチドを開示されている配列とともにアラインすると、同一性または相同性が最大となる（保存されているアミノ酸がアラインされる場合）ことが確認されたアミノ酸をさす。
本明細書において、「〜と少なくとも９０％同一」とは、参照ポリペプチドと比較して同一性％が９０〜１００％であることをさす。９０％以上のレベルの同一性は、例として示すと、１００アミノ酸長の試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドを比較するとして、試験ポリペプチドの１０％（すなわち１００のうち１０）のアミノ酸だけが参照ポリペプチドのアミノ酸と異なっていることを示す。試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドの間でも同様の比較を行うことができる。このような差異を、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布している点突然変異として表すことができるか、または、最大許容、例えば１０／１００アミノ酸差異（約９０％同一）までの可変長の１以上の遺伝子座にクラスター化することができる。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルでは、結果はプログラムやギャップパラメーターセットによって異なることはなく、このような高いレベルの同一性は、多くの場合ソフトウエアに頼らなくとも容易に評価することができる。
本明細書において、プライマーとは、それからプライマー伸長産物の合成が始まる、２以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、一般には３を超えるものを含むオリゴヌクレオチドをさす。合成の助けとなる実験条件としては、ヌクレオシド三リン酸ならびにＤＮＡポリメラーゼのような重合および伸長のための薬剤、ならびに好適なバッファー、温度およびｐＨの存在が含まれる。
本明細書において、化学発光とは、エネルギーを特異的にある分子にチャネリングし、それを電気的励起状態とし、次に光子を放出させ、それにより可視光を発する化学反応をさす。温度はこのチャネリングエネルギーには影響しない。従って、化学発光は化学エネルギーの光エネルギーへの直接的変換を含む。
本明細書において、発光とは、エネルギー発生的化学プロセスの励起産物が発光を伴ってその基底状態に戻る際に生じる検出可能な電磁線、一般にはＵＶ、ＩＲまたは可視電磁線をさす。化学発光は化学反応から生じる発光である。生物発光は、基質および／または酵素としての生体分子（またはその合成型または類似体）を用いる化学反応から生じる化学発光である。
本明細書において、化学発光の一種である生物発光とは、生体分子、特にタンパク質による光の放出をさす。生物発光の必須条件は、基質ルシフェリンに対して働くオキシゲナーゼであるルシフェラーゼの存在下で結合型であるか、または遊離型である酸素分子である。生物発光は、酸素分子の存在下で基質ルシフェリン（生物発光基質）に対して働き、その基質を励起状態に変換するオキシゲナーゼである酵素または他のタンパク質（ルシフェラーゼ）によって生じ、より低いエネルギーレベルに戻る際に光の形でエネルギーを放出する。
本明細書において、生物発光を生じさせるための基質および酵素は一般にそれぞれルシフェリンおよびルシフェラーゼと呼ばれる。その特定の種に関していう場合、明確にするために各一般用語は、例えば細菌ルシフェリンまたはホタルルシフェラーゼなどと、それが由来する生物の名称とともに用いる。
本明細書において、ルシフェラーゼとは、発光反応を触媒するオキシゲナーゼをさす。例えば、細菌ルシフェラーゼはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）および脂肪族アルデヒドの酸化を触媒し、その反応は光を生じる。海洋節足動物に見られる別種のルシフェラーゼはウミホタル(Cypridina (Vargula))ルシフェリンの酸化を触媒し、また別種のルシフェラーゼは甲虫類(Coleopteras)ルシフェリンの酸化を触媒する。
よって、ルシフェラーゼとは、生物発光反応（生物発光を生じる反応）を触媒する酵素または光タンパク質をさす。ホタルおよびカイアシ類(Gaussia)およびウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、生物発光生成反応中に触媒的に働いて変化しない酵素である。ルシフェリンが非共有結合するエクオリン光タンパク質などのルシフェラーゼ光タンパク質は、生物発光生成反応中にルシフェリンの放出によるなどして変化する。ルシフェラーゼは、生物中に天然に存在するタンパク質、または天然に生じるタンパク質とは異なる熱安定性のような１以上の特性を有する突然変異誘発により生じた変異体などのその変異体もしくは突然変異体である。ルシフェラーゼおよびその修飾突然変異体または変異体は周知のものである。本明細書の目的では、ルシフェラーゼという場合には、これらの光タンパク質またはルシフェラーゼのいずれかをさす。
よって、例えば「ウミシイタケルシフェラーゼ」とは、ウミシイタケ属のメンバーから単離された酵素、または別の近縁カイアシ類などのいずれか他の供給源から得られた、あるいは合成により製造された同等の分子を意味する。それには実質的に活性を変化させない保存的アミノ酸置換を有するウミシイタケルシフェラーゼを包含するものとする。好適なアミノ酸保存的置換は当業者に公知であり、一般に結果として生じた分子の生物活性を変化させずに行える。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は実質的に生物活性を変化させないことを認識している（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224参照）。
本明細書において、「オワンクラゲＧＦＰ」とは、オワンクラゲ科由来のＧＦＰおよびその突然変異体または変異体をさす。このような変異体および他種由来のＧＦＰは周知のものであり、当業者ならば入手可能であり、既知である。この名称は、放射スペクトルおよび生物発光生成系のスペクトル出力のシフトなど、活性および物理特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を有するＧＦＰを包含する。これらのルシフェラーゼおよびルシフェリンならびにそのアクチベーターは、生物発光生成試薬または成分と呼ばれる。一般に、これらの試薬のサブセットが製造者の製品とともに提供されるか、または製造者の製品と組み合わせられる。生物発光はその組合せを残りの試薬と接触させた際に生じる。従って、本明細書において、これらの成分ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびＯ２、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋などのその他の因子は生物発光生成試薬（または薬剤または成分）とも呼ばれる。
本明細書において、生物発光基質とは、ルシフェラーゼ、およびいずれかの必要なアクチベーターの存在下で酸化され、光を生じる化合物をさす。これらの基質は本明細書ではルシフェリンと呼ばれ、生物発光反応において酸化を受ける基質である。これらの生物発光基質としては、いずれのルシフェリンまたはその類似体、もしくはルシフェラーゼが相互作用して光を生じるいずれの合成化合物も含まれる。典型的な基質としては、光生成反応においてルシフェラーゼまたはタンパク質の存在下で酸化されるものを含む。よって、生物発光基質としては、当業者がルシフェリンとして認識しているものを含む。ルシフェリンとしては、例えば、ホタルルシフェリン、ウミホタル(Cypridina)（Vargulaとしても知られる）ルシフェリン（セレンテラジン）、細菌ルシフェリン、ならびにこれらの基質の合成類似体、または生物発光を生じる反応においてルシフェラーゼの存在下で酸化されるその他の化合物が挙げられる。
本明細書において、生物発光基質へと変換し得るとは、生物発光基質を生じる、酸化または還元などの化学反応を受けやすいことを意味する。例えば、生物発光細菌の発酵生成反応は、フラビンレダクターゼ酵素による、フラビンモノヌクレオチド基（ＦＭＮ）の還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）への還元を含む。この還元型フラビンモノヌクレオチド（基質）は次に酸素（アクチベーター）および細菌ルシフェラーゼと反応し、長鎖アルデヒドの存在下でさらに反応を受けて光を生じる中間体ペルオキシフラビンを形成する。この反応に関しては、還元型フラビンと長鎖アルデヒドが基質である。
本明細書において、生物発光生成系とは、生物発光反応を行うのに必要な試薬のセットをさす。よって、特定のルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびその他の基質、溶媒ならびに生物発光反応を遂行するのに必要であり得るその他の試薬が生物発光系をなす。よって、生物発光生成系とは、適当な反応条件下で生物発光を生じるいずれの試薬セットもさす。適当な反応条件とは、ｐＨ、塩濃度および温度など、生物発光反応が起こるのに必要な条件をさす。一般に、生物発光系は、生物発光基質であるルシフェリン、ルシフェラーゼ酵素と光タンパク質を含むルシフェラーゼ、および１以上のアクチベーターを含む。特定の生物発光系は、そのルシフェラーゼが由来する特定の生物に対して特定することができ、例えば、ウミシイタケ生物発光系はウミシイタケから単離されたか、または組換え手段もしくはこれらのルシフェラーゼの修飾を用いて産生されたルシフェラーゼのようなウミシイタケルシフェラーゼを含む。この系はまた、酸素、および酸素の存在下でルシフェラーゼが反応して光を生じる基質などの、生物発光反応を遂行するのに必要な特定のアクチベーターも含む。
本明細書において、蛍光タンパク質とは、蛍光発生能（すなわち、ある波長でエネルギーを吸収し、別の波長でそれを放出する能力）を有するタンパク質をさす。例えば、緑色蛍光タンパク質とは、約５１０ｎｍに発光スペクトルのピークを有するポリペプチドをさす。
本明細書において、遺伝的治療または遺伝子療法は、そのような治療が求められる疾患または症状を有する哺乳類、特にヒトの特定の細胞である標的細胞への、ＤＮＡなどの異種核酸の導入を含む。ＤＮＡなどの核酸を、ＤＮＡなどの異種核酸が発現され、それによりコードされている治療産物が産生されるように、直接またはベクターもしくはその他の送達ビヒクルなどで選択された標的細胞に導入する。あるいは、ＤＮＡなどの異種核酸は、何らかの方法で治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することがきるか、または治療産物の発現を何らかの方法で直接的または間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードすることができる。遺伝的治療はまた、欠陥遺伝子を置換する遺伝子産物をコードする核酸を送達するか、またはそれが導入される哺乳類または細胞によって産生される遺伝子産物を補足するために使用できる。導入された核酸は、その哺乳類宿主では通常産生されないか、または治療上有効な量もしくは治療上有用な時点で産生されないその増殖因子インヒビター、または腫瘍壊死因子もしくはその受容体のようなそのインヒビターといった治療化合物をコードすることができる。治療産物をコードするＤＮＡなどの異種核酸をその産生または発現を増強するか、またはそうでなければ変化させるために罹患宿主の細胞に導入する前に修飾することができる。遺伝的治療はまた、遺伝子発現のインヒビターまたはレプレッサーまたはその他のモジュレーターの送達も含み得る。
本明細書において、異種核酸は、それが発現する微生物によってはインビボで通常産生されない、または微生物によって産生されるが、遺伝子座が異なるか、もしくは示差的に発現するか、または転写、翻訳、またはその他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって、ＤＮＡなどの内因性の核酸の発現を変化させるメディエーターを媒介するかもしくはコードする核酸である。異種核酸は、多くの場合、それが導入される細胞には内在せず、別の細胞から得られたか、または合成的に生産されたものである。しかしながら、異種核酸は内生であってもよいが、異なる遺伝子座から発現されるか、またはその発現または配列が変化されている。必ずしも必要ではないが、一般に、このような核酸はそれが発現される細胞によって通常産生されないか、またはそれが発現される細胞において何らかの方法で修飾されているＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種核酸（ＤＮＡなど）はまた、外来核酸（ＤＮＡなど）と呼ぶこともできる。よって、異種核酸または外来核酸は、ゲノム内に見られる対応核酸分子（ＤＮＡなど）として正確な配向または位置で存在しない核酸分子を含む。それはまた別の生物または別種由来（すなわち、外因性）の核酸分子もさし得る。本明細書では、当業者が、その核酸が発現される細胞に対して異種または外来であると認識するかまたは見なすいずれの核酸（ＤＮＡなど）も異種核酸に包含され、異種核酸は内生的にも発現される、外から加えた核酸も含む。異種核酸の例としては、限定されるものではないが、追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸（薬剤耐性を付与するタンパク質など）、治療上有効な物質（抗癌剤、酵素およびホルモンなど）をコードする核酸、および抗体などのその他の型のタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡなど）が挙げられる。異種核酸によってコードされる抗体は、その異種核酸が導入されている細胞の表面で分泌または発現させることができる。
本明細書において、遺伝子療法のための治療上有効な産物は、その核酸を宿主に導入した際に、遺伝疾患または獲得疾患の症状、兆候を改善もしくは除去するか、またはその疾患を治癒させる産物が発現される核酸、一般にはＤＮＡ（またはｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡを含む）などのＲＮＡ産物）によってコードされる産物である。また、ＲＮＡｉおよびアンチセンスなどの生物学的に活性な核酸分子も含まれる。
本明細書において、癌または腫瘍処置または薬剤とは、単独または他の処置もしくは化合物と組み合わせて用いた場合に、欠陥のある血管形成と関連する臨床症状または診断マーカーを緩和する、軽減する、改善する、予防するかまたはその緩解状態に置く、もしくは維持することができるいずれの治療計画および／または化合物もさす。
本明細書において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体を含み、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびそれらの混合物も含む。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブまたはプライマーについては、所望により蛍光または放射性標識などの検出可能な標識などで標識してもよく、一本鎖分子が提供される。このような分子は一般に、それらの標的が統計学的にユニークであるような長さであるか、またはあるライブラリーをプロービングまたはプライミングするために低いコピー数（一般には５未満、通常は３未満）のものである。通常、プローブまたはプライマーは、目的とする遺伝子と相補的または同一の配列の少なくとも１４、１６または３０の連続するヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸長であってよい。
本明細書において、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、およびその他のシグナル配列といったヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列に対する異種核酸の作動可能な連結とは、このような核酸（ＤＮＡなど）とこのようなヌクレオチド配列との間の関係をさす。例えば、異種ＤＮＡとプロモーターとの作動可能な連結とは、そのようなＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによりそのプロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターの間の物理的関係をさす。よって、作動可能なように連結されるか、または作動可能なように結合されるとは、核酸（ＤＮＡなど）と、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、およびその他のシグナル配列といったヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列との機能的関係をさす。例えば、ＤＮＡとプロモーターとの作動可能な連結とは、このようなＤＮＡの転写は、そのＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼよりそのプロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターの間の物理的かつ機能的関係をさす。発現および／またはインビトロ転写を至適化するには、余分な、不適切な可能性のある選択的翻訳誘導（すなわち、開始）コドン、または転写もしくは翻訳レベルで発現を妨げるか、または低下させることができるその他の配列を除去するために、それらのクローンの５’非翻訳部分に除去、付加または変更を行う必要があり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位（例えば、Kozak J. Biol. Chem. 266:19867−19870 (1991)参照）を開始コドンのすぐ５’側に挿入し、発現を増強することもできる。このような修飾が望ましいかどうか（または必要かどうか）は経験的に決定することができる。
本明細書において、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列とは、通常、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下でそのＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成できるに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を意味し、従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重らせんＤＮＡ（またはｄｓＲＮＡ）の一本鎖を試験することができるか、または、三重らせんの形成をアッセイすることもできる。ハイブリダイズ能力はアンチセンス核酸の相補性の程度と長さによって異なる。通常、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含み得る、コードＲＮＡと誤対合する塩基が多くなり、なおかつ、安定な二重らせん（または場合によっては三重らせん）を形成する。当業者ならば、標準的な手順により誤対合の許容度を確認してハイブリダイズした複合体の融点を決定することができる。
本明細書において、特定の医薬組成物の投与によるなどの特定の疾患の症状の改善とは、恒久的であれ一時的であれ、持続的であれ一過性であれ、その組成物の投与に起因または関連し得るいずれの軽減もさす。
本明細書において、アンチセンスポリヌクレオチドとは、ｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのセンス鎖に相補的なヌクレオチド塩基の合成配列をさす。適当な条件下でセンスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドを混合すると、その２つの分子の結合、またはハイブリダイゼーションに至る。これらのポリヌクレオチドがｍＲＮＡと結合（ハイブリダイズ）すると、タンパク質合成（翻訳）の阻害が起こる。これらのポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡと結合すると、ＲＮＡ合成（転写）の阻害が起こる。結果として翻訳および／または転写が阻害されると、センス鎖によりコードされているタンパク質の合成の阻害に至る。アンチセンス核酸分子は一般に、標的核酸と特異的に結合するのに十分なヌクレオチド数、通常には少なくとも５個の連続するヌクレオチド、多くの場合には、少なくとも１４または１６または３０個の連続するヌクレオチド、または目的の遺伝子をコードする核酸分子のコード部分に相補的な修飾ヌクレオチドを含む。
本明細書において、抗体とは、天然のものであれ、部分的または全面的に合成により生産されたものであれ免疫グロブリンをさし、その抗体の特異的結合能を保持するそのいずれの誘導体も含む。ゆえに抗体は免疫グロブリン結合ドメインに相同な、または実質的に相同な結合ドメインを有するいずれのタンパク質も含む。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、いずれの免疫グロブリン種のメンバーも含む。
本明細書において、抗体フラグメントとは、全長抗体の特異的結合能を少なくとも一部保持する全長より短いいずれの抗体誘導体もさす。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、ＦＶ、ｄｓＦＶダイアボディーおよびＦｄフラグメントが挙げられる。このフラグメントには、ジスルフィド結合などによってともに連結された複数の鎖も含み得る。抗体フラグメントは、通常には少なくとも約５０のアミノ酸、一般には少なくとも２００のアミノ酸を含む。
本明細書において、Ｆｖ抗体フラグメントは、非共有結合により連結された１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と１つの可変軽鎖ドメインからなる。
本明細書において、ｄｓＦＶとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化させるような操作型分子間ジスルフィド結合を有するＦｖをさす。
本明細書において、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、ｐＨ４．０〜４．５においてペプシンで消化することから得られる抗体フラグメントであり、同等のフラグメントを生産するために組換え生産が可能である。
本明細書において、Ｆａｂ断片は免疫グロブリンをパパインで消化することから得られる抗体フラグメントであり、同等のフラグメントを生産するために組換え生産が可能である。
本明細書において、ｓｃＦＶは、いずれの順でもよいが、ポリペプチドリンカーにより共有結合された可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメントをさす。このリンカーはこれら２つの可変ドメインを実質的な支障なく架橋するような長さのものである。リンカーには、溶解度を高めるため、いくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基が全域に分散した（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基が含まれる。
本明細書において、ヒト化抗体とは、ヒトに投与しても免疫応答を惹起しないようヒト配列のアミノ酸を含むように修飾された抗体をさす。このような抗体の作製方法は公知である。例えば、このような抗体を作製するためには、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたはその他の原核生物もしくは真核細胞（大腸菌またはＣＨＯ細胞など）のコード核酸を、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づいている抗体を発現するように、組換え核酸技術により変更する。このような非可変領域を同定するためのコンピュータープログラムが設計されている。
本明細書において、ダイアボディーは二量体ｓｃＦＶであり、ダイアボディーは一般にｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを有し、それらは通常二量体を形成する。
本明細書において、組換えＤＮＡ法の使用による組換え手段による生産とは、クローニングされたＤＮＡによりコードされているタンパク質を発現させるための、分子生物学で周知の方法の使用を意味する。
本明細書において、評価するまたは決定するとは、ある産物の活性に関して絶対的な値を得るという点で、また、指数、比、パーセンテージ、または活性レベルの指標となる視覚的もしくはその他の値を得るという点で、定量的かつ定性的決定を含む。評価は直接的なものであっても間接的なものであってもよい。
本明細書において、生物活性とは、化合物もしくは微生物のインビボ活性、またはそれもしくは組成物あるいはその他の混合物をインビボ投与した際に生じる生理応答をさす。よって、生物活性はこのような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬理活性を包含する。生物活性は、このような活性を試験または使用するために設計されたインビトロ系で観察することができる。
本明細書において、特定の疾病の処置に有効な微生物または化合物の量とは、その疾病に関連する症状を改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分な量である。このような量は単一用量として投与することもできるし、あるいは、それが効果的となる投与計画に従って投与することもできる。その量は疾病を治癒させ得るが、一般には疾病の症状を改善するために投与される。所望の症状改善を達成するために反復投与が必要な場合もある。
本明細書において、２つの核酸配列に関して同等というとき、目的とする２つの配列が同じ配列のアミノ酸または同等のタンパク質をコードしていることを意味する。２つのタンパク質もしくはペプチドまたは他の分子に関して同等を用いる場合、それは、これら２つのタンパク質またはペプチドが、その変化がそのタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないアミノ酸置換（限定されるものではないが、保存的変化など）または構造のみを有する実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。特性に関して同等というとき、その特性は同じ程度で存在している必要はないが（例えば、２つのペプチドは同じ種類の酵素活性を異なる割合で示してもよい）、通常はそれらの活性は実質的に同じである。２つのヌクレオチド配列に関して相補的というとき、その２つのヌクレオチド配列が対向するヌクレオチドとの間で、一般には２５％未満、１５％未満または５％未満の誤対合でハイブリダイズし得ることを意味する。必要に応じて、相補性のパーセンテージが特定されるだろう。一般に、この２つの分子はそれらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択される。
本明細書において、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調節する薬剤または化合物はそのタンパク質の活性を低下もしくは増強、もしくはそうでなければ変化させるか、または細胞においてその核酸の発現を何らかの方法で上方制御または下方制御する、またはそうでなければ変化させる。
本明細書において、新生物性疾患を処置または予防するための方法とは、腫瘍、その転移、それら腫瘍の血管新生または疾病を特徴付けるその他のパラメーターなどのいずれかの症状が軽減される、改善される、予防される、緩解状態に置かれる、または緩解状態で維持されることを意味する。それはまた、新生物性疾患および転移の顕著な特徴がその処置によって除去される、軽減される、または予防され得ることを意味する。その顕著な特徴の限定されない例としては、基底膜および近傍の細胞外マトリックスの制御されない崩壊、ならびに内皮細胞の移動、分裂および新たな機能化毛細血管への組織化、およびそのような機能化毛細血管の持続が挙げられる。
本明細書において、プロドラッグは、インビボ投与の際に、生物学的、薬学的または治療学的に活性な形態の化合物へ代謝される、またはそうでなければ変換される化合物である。プロドラッグを製造するためには、医薬上活性な化合物を、その活性な化合物が代謝プロセスによって再生されるように修飾する。このプロドラッグは薬物の代謝安定性もしくは輸送の特徴を変化させるように、または副作用もしくは毒性をマスクするように、または薬物のフレーバーを改善するように、または薬物のその他の特徴または特性を変化させるように設計することができる。インビボにおける薬物動態プロセスと薬物代謝の知識により、当業者ならば、医薬的に活性な化合物がひと度分かれば、その化合物のプロドラッグを設計することができる（例えば、Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388−392参照）。
本明細書において、プロモーター領域またはプロモーターエレメントまたは調節領域とは、それが作動可能なように連結されているＤＮＡまたはＲＮＡの転写を制御するＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントをさす。プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写の開始に十分な特定の配列が含まれる。このプロモーター領域の部分はプロモーターと呼ばれる。さらに、プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始活性をモジュレートする配列が含まれる。これらの配列はシス作用因子であってもよいし、あるいはトランス作用因子に応答するものであってもよい。調節の性質に応じ、プロモーターは構成的であっても調節型であってもよい。原核生物での使用のために意図されるプロモーターの例としては、バクテリオファージＴ７およびＴ３プロモーターが挙げられる。
本明細書において、受容体とは、リガンドに対して親和性を有する分子をさす。受容体は天然に生じる分子であっても合成分子であってもよい。受容体はまた、当技術分野では抗リガンドとも呼ばれる。本明細書において、受容体および抗リガンドは互換的である。受容体はそれらの変更されない状態で用いることもできるし、あるいはホモ二量体としてなど、他のポリペプチドと結合させることもできる。受容体は共有結合させても非共有結合させてもよく、あるいは特定の結合物質またはリンカーを介して直接的または間接的のいずれかで結合メンバーと物理的に接触させてもよい。受容体の例としては、限定されるものではないが、抗体、細胞膜受容体、表面受容体および内在化型受容体、特定の抗原決定基と反応性のあるモノクローナル抗体および抗血清（ウイルス、細胞、またはその他の物質に対するものなど）、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラが挙げられる。
本明細書において、サンプルとは、被分析物アッセイが望まれる被分析物を含み得るいずれのものもさす。サンプルは、体液または生体組織などの生体サンプルであってもよい。体液の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生体組織は、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織を含む、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造の構造物質の１つをなすそれらの細胞間物質を伴った特定種の細胞の集合体である。生体組織の例にはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞も含まれる。
本明細書において、誤対合のパーセンテージを決定する上でのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは次の通りである。
１）高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中ストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
当業者ならば、安定なハイブリッドのために洗浄ステップを選択することを知っているし、また、ＳＳＰＥの成分も知っている（例えば、Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), vol. 3, p. B.13参照、また、一般に用いられている実験用溶液について記載のある多くのカタログも参照）。ＳＳＰＥは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝０．１８Ｍ ＮａＣｌである。さらに、当業者ならば、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍで決定され（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／１））、従って、ハイブリッドの安定性に決定的な洗浄条件におけるパラメーターはＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）のナトリウムイオン濃度と温度だけであることを認識している。本明細書で提供される核酸分子はいずれも、少なくとも低ストリンジェンシー、通常には中または高ストリンジェンシーの条件下で、開示されている分子の全長の少なくとも７０、８０、９０％にわたってハイブリダイズするものも含み得る。同等のストリンジェンシーを別のバッファー、塩および温度を用いて達成することもできると理解される。限定されるものではないが、例を挙げれば、低ストリンジェンシー条件を用いる手順は次の通りである（Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981)も参照）：
ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコール、１％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（１０×ＳＳＣは、１．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１５Ｍクエン酸ナトリウムをｐＨ７に調整したものである）を含有する溶液中、４０℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは次のように改変した同じ溶液で行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸、および５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中、４０℃で１８〜２０時間インキュベートした後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、５５℃で１．５時間洗浄する。この洗浄溶液を新しい溶液に置き換え、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターをブロットドライし、オートラジオグラフィーに露光する。必要に応じて、フィルターを６５〜６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムに再露光する。使用できる他の低ストリンジェンシー条件も当技術分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションに用いる場合）。
限定されるものではないが、例を挙げれば、例えば限定されるものではないが、かかる中ストリンジェンシー条件を用いる手段を含む、中ストリンジェンシー条件を用いる手順は次の通りである：ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５×デンハートの溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、５５℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは同じ溶液で行い、５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中、５５℃で１８〜２０時間インキュベートした後、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、６０℃で３０分間２回洗浄する。フィルターを拭き取って乾燥させ、オートラジオグラフィーに露光する。使用できる他の中ストリンジェンシー条件も当技術分野で周知である。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間行う。限定されるものではないが、例を挙げれば、高ストリンジェンシー条件を用いる手順は次の通りである：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなるバッファー中、６５℃で８時間〜一晩行う。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール、および０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間行う。その後、０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄を行った後、オートラジオグラフィーを行う。使用できる他の高ストリンジェンシー条件も当技術分野で周知である。
実質的に同一または相同または類似という用語は、関連分野の当業者によって理解されている程度に様々であり、通常は、少なくとも６０％または７０％の同一性を意味し、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を意味する。
本明細書において、ある産物と実質的に同一とは、目的とする特性が十分に不変であり、従って、その産物の代わりに実質的に同一な産物が使用できるほど十分類似していることを意味する。
本明細書において、実質的に純粋とは、純度を評価するために当業者に使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの標準的な分析法によって測定した場合に容易に検出できる不純物を明らかに含まないほどに十分相同であるか、または、さらに精製しても、その物質の酵素活性および生物活性などの物理化学特性を検出可能には変化させないほどに十分純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための精製方法は当業者に公知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体または異性体の混合物であり得る。このような場合、さらなる精製は化合物の比活性を高める可能性がある。
本明細書において、ポリペプチドと特異的に結合する抗体などの分子は一般に、少なくとも約１０６ｌ／ｍｏｌ、１０７ｌ／ｍｏｌ、１０８ｌ／ｍｏｌ、１０９ｌ／ｍｏｌ、１０１０ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を有し、目的のタンパク質に対し、他のタンパク質に対するよりも通常少なくとも２倍、５倍、通常には１０倍または１００倍またはそれ以上といった高い親和性で結合する。例えば、チモーゲン型など、全長分子に比べてプロテアーゼドメインと特異的に結合する抗体は、プロテアーゼドメインのみを含むポリペプチドに対し、全長のチモーゲン型に対するよりも少なくとも約２倍、一般には５倍または１０倍高い親和性で結合する。このような特異的結合はまた、選択的結合とも呼ばれる。よって、特異的または選択的結合とは、標的化部位または遺伝子座に対し、非標的化部位または遺伝子座に対するよりも高い結合親和性（通常には少なくとも２倍、５倍、１０倍またはそれ以上）をさす。
本明細書において、治療薬、治療化合物、治療計画、または化学療法薬という用語は、ワクチンを含む、当業者に公知の通常の薬物および薬物療法を含む。
本明細書において、処置とは、病態、疾患または疾病の症状が改善される、またはそうでなければ有益に変化するいずれの様式も意味する。処置はまた、本明細書で記載され、提供される微生物のいずれの医薬的使用も包含する。
本明細書において、増殖性疾患は細胞の異常な増殖を伴う疾患を含む。このような疾患としては、限定されるものではないが、新生物性疾患、乾癬、再狭窄、黄斑変性、糖尿病性網膜症、炎症応答および炎症性疾患（創傷治癒応答を含む）が挙げられる。
本明細書において、ベクター（またはプラスミド）とは、その発現または複製のいずれかのために異種核酸を細胞に導入するのに用いられる独立したエレメントをさす。これらのベクターは一般にエピソームとして維持されるが、遺伝子またはその一部の、ゲノムの染色体への組み込みを起こすように設計することもできる。また、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも意図される。このようなベクターの選択および使用は当業者に周知である。発現ベクターとしては、そのようなＤＮＡ断片の発現を達成し得るプロモーター領域などの調節配列と作動可能なように連結されているＤＮＡを発現し得るベクターが含まれる。よって、発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入された際に、クローニングされているＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をさす。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞で複製可能なもの、およびエピソームとして維持されるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。
本明細書において、組合せとは、２以上のもののいずれの集合も含む。
本明細書において、組成物とは、いずれの混合物もさす。それは溶液、懸濁液、エマルション、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそのいずれかの組合せであり得る。
本明細書において、流体とは、流動可能ないずれの組成物もさす。よって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよびその他このような組成物の形態である組成物を包含する。
本明細書において、キットは、所望によりその組合せの使用に関する説明書、および／またはこのような使用のための他の反応物および成分を含んでもよいパッケージングされた組合せである。
限定されるものではないが、開示を明確にするため、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
Ｂ．腫瘍特異的治療のための微生物
本明細書では、新生物性疾患およびその他の増殖性疾患ならびに炎症性疾患の治療のための微生物、およびそのような微生物の作製方法および使用方法が提供される。本明細書で提供されるマイクローブ（または微生物）を媒介とする処置方法は、宿主への微生物の投与、腫瘍などの標的細胞または組織における微生物の集積、その結果としてのそれらの細胞の漏出または溶解を含み、それにより漏出または放出された抗原に対する免疫応答が具備され、それによりその微生物が集積している組織または細胞の阻害が起こる。
癌処置の遺伝子療法に加え、癌ワクチン療法または抗腫瘍免疫などのワクチン療法のために、生きた弱毒微生物を使用することができる。例えば、腫瘍に対する免疫は、マイクローブにより送達された抗原またはサイトカインを介した腫瘍特異的Ｔ細胞媒介応答を含む。このようにするために、これらのマイクローブは、他の重要ないずれの器官にも最小限の感染で腫瘍組織に特異的に標的化され得、また、抗原および／またはサイトカインを生産するために修飾または提供され得る。
本明細書で提供される微生物および本明細書におけるこのような微生物の使用は、腫瘍および／または転移を含み、さらに受傷組織および細胞も含む免疫特権細胞または免疫特権組織に集積し得る。本明細書で提供される微生物は一般にそれらの微生物が投与された被験体からは、その被験体の免疫系の活動によって排除され得るが、微生物は腫瘍などの免疫特権細胞および組織でもやはり集積、生存および増殖することができ、これはこのような免疫特権領域が宿主の免疫系から隔離されているからである。よって、本明細書で提供される、腫瘍および／または転移に適用されるような方法、およびそれに関連する治療方法は、受傷細胞および組織を含む他の免疫特権細胞および組織にも容易に適用することができる。
１．特徴
本明細書で提供され、本明細書の方法で用いられる微生物は弱毒され、免疫原性であり、かつ、複製能を有する。
ａ．弱毒化
本明細書で提供される方法で用いられるマイクローブは一般に弱毒されている。弱毒マイクローブは、宿主で疾病を引き起こす能力が軽減されている。この能力の軽減は、マイクローブの病原能に対する様々な異なる修飾のいずれに起因するものであってもよい。例えば、マイクローブは、その非弱毒型に比べて毒性が軽減されていてもよいし、非腫瘍器官または組織における集積能が軽減されていてもよいし、細胞溶解または細胞死を起こす能力が軽減されていてもよいし、あるいは、複製能が軽減されていてもよい。しかしながら、本明細書で提供される弱毒マイクローブは少なくともいくらかの複製能、および腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織を漏出もしくは溶解させる、または細胞死を受けさせる、またはそうでなければ腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織に対する免疫応答を生じさせる、もしくは増強する能力を保持している。
ｉ．毒性の軽減
マイクローブは、宿主の健康状態を悪化させる１以上の化合物を製造することによりそれらの宿主に対して有毒となり得る。宿主に対する毒性は、敗血性ショック、神経作用、または筋肉作用を含む様々な様式のいずれかで顕在化し得る。本明細書で提供されるマイクローブは、宿主に対して軽減された毒性を有し得る。本方法および組成物のマイクローブの軽減された毒性は、宿主が有毒作用を受けない毒性から、宿主がマイクローブの有毒作用から一般に死に至らない毒性までの範囲に及び得る。いくつかの態様では、マイクローブは、宿主が一般に、腫瘍性、転移性または壊死性の器官または組織に対する作用を超えて、宿主内のマイクローブの存在から顕著な長期作用を持たないように毒性が軽減されたものである。例えば、軽減された毒性として約１ヶ月未満持続する微熱または微弱感染があり得、この発熱または感染後には、宿主はその発熱または感染からくる毒性作用を受けない。別の例では、軽減された毒性は、マイクローブの投与後、宿主に約５％以下の意図しない体重低下として測定される場合もある。他の例では、マイクローブは宿主に対して全く毒性を持たない。
例としてのワクシニアウイルスＬＩＶＰ株（広く利用できる弱毒Ｌｉｓｔｅｒ株）は使用されている他のワクシニアウイルスに比べて軽減された毒性を有し、さらに修飾されている。修飾ＬＩＶＰが作製されている。これらのＬＩＶＰはＴＫ遺伝子およびＨＡ遺伝子、さらに所望によりＦ３と呼ばれる遺伝子座に挿入を含む。軽減された毒性の例として、これらの組換えワクシニアウイルスは、対応する野生型ワクシニアウイルスに比べて、免疫系が損なわれたマウス（ヌードマウス）に対するそれらの毒性が試験された。野生型ワクシニアウイルスＶＧＬ（ＬＩＶＰ株）を１×１０７ＰＦＵ／マウスで静脈（ｉ．ｖ．）注射するとヌードマウスで毒性が生じ、７個体のうち３個体のマウスで体重が低下し、死に至った（ウイルス注射後１週間で１個体のマウスが死に、ウイルス注射後１０日目に１個体のマウスが死に至った）。ＲＶＧＬ８と呼ばれる組換えワクシニアウイルス（Ｆ３遺伝子座にＬａｃＺが挿入）は、１×１０７ＰＦＵ／マウスでｉ．ｖ．注射した後も、ヌードマウスにおいて有毒作用を示さなかった。ＲＶＧＬ８ウイルスに関連する毒性の容易に検出できる兆候はなかった。よって、ワクシニアウイルスＬＩＶＰ株ゲノムのＮｏｔＩ部位（Ｆ３遺伝子に位置）への挿入は、宿主に対するワクシニアウイルスの毒性を軽減する。同様の修飾がその毒性を軽減するため、他のポックスウイルスおよびその他のウイルスにも行うことができる。必要であれば、このような修飾は実験的に同定することができる。
ｉｉ．腫瘍などの免疫特権細胞および組織に集積し、その他の器官には実質的に集積しない
マイクローブは宿主の様々な組織および器官のいずれにも集積し得る。集積は宿主全体に一様に分布するときもあるし、あるいは１つまたはいくつかの器官または組織に濃縮されるときもある。本明細書で提供されるマイクローブは腫瘍および転移物のような免疫特権細胞および組織などの標的化された組織に集積し得る。いくつかの態様では、本明細書で提供されるマイクローブは、野生型マイクローブを用いた場合に起こる集積と同等またはそれ以上の、正常器官または組織に比した、腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織における集積を示す。他の態様では、本明細書で提供されるマイクローブは、他の特定の器官または組織における集積と同等またはそれ以上の、腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織における集積を示す。例えば、本明細書で提供されるマイクローブは、他の特定の器官または組織における集積よりも少なくとも約２倍高い、少なくとも約５倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１，０００倍高い、少なくとも約１０，０００倍高い、少なくとも約１００，０００倍高い、または少なくとも約１，０００，０００倍高い、腫瘍細胞などの免疫特権細胞および組織における集積を示し得る。
いくつかの態様では、マイクローブは、１以上の選択組織または器官には集積せずに、腫瘍細胞のような免疫特権細胞および組織などの標的化組織および細胞に集積し得る。例えば、マイクローブは脳には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは神経細胞には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは卵巣には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは血液には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは心臓には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは膀胱には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは精巣には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは脾臓には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。別の例では、マイクローブは肺には集積せずに、腫瘍細胞に集積し得る。
当業者ならば、限定されるものではないが、マイクローブの毒性、用量、処置する腫瘍、宿主の免疫応答性、および宿主の病態を含む当技術分野で既知の様々な因子に従って、そのマイクローブが、非標的器官または組織よりも、腫瘍のような免疫特権細胞および組織などの標的化組織または細胞に選択的に集積する所望の能力を決定することができる。
本明細書では、正常器官または組織に比べて腫瘍などの免疫特権細胞および組織での選択的集積の例として、腫瘍サンプルと種々の器官において種々のワクシニアウイルスの存在をアッセイしたものが提供される。野生型ＶＧＬウイルスは腫瘍、精巣、膀胱、および肝臓、ならびに脳からも回収された。組換えウイルスＲＶＧＬ８は、ほとんどの場合で腫瘍に見られ（マウス＃２４では、ウイルスは精巣、膀胱および肝臓に見られ；マウス＃２２では、精巣に見られた）、６個体の供試マウスの中で脳組織からはウイルスは回収されなかった。よって、この知見は、腫瘍治療目的でＦ３遺伝子に挿入を有する組換えワクシニアウイルスＬＩＶＰ株の腫瘍集積特性を証明するものである。
ｉｉｉ．腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起または増強する能力
本明細書の微生物は、腫瘍細胞のような免疫特権細胞および組織などの標的化組織または細胞において抗原に対する免疫応答を生じるか、または増強する。この免疫応答は、免疫刺激サイトカインの存在および免疫応答を生じ得る抗原化合物の放出を含む様々な機構のいずれによっても惹起され得る。
細胞は、微生物感染などの感染に応答して、それらの細胞に対する免疫応答を刺激すべくシグナルを送り出すことができる。このような細胞から送り出されるシグナルの例としては、抗原、サイトカインおよびケモカイン、例えばインターフェロン−γおよびインターロイキン−１５などが挙げられる。本明細書で提供される微生物は、標的細胞にそれらマイクローブによる感染に応答してこのようなシグナルを送り出させることができ、その結果、腫瘍細胞などの標的細胞または組織に対する宿主の免疫系の刺激をもたらす。
別の態様では、腫瘍細胞などの標的細胞または組織は、腫瘍に対する免疫応答を具備する際に宿主の免疫系によって認識可能な１以上の化合物を含み得る。このような抗原化合物は細胞表面または腫瘍細胞の化合物であってもよく、また、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組合せであってもよい。マイクローブにより媒介される抗原化合物の放出の結果、宿主の免疫系に腫瘍に対する免疫応答を具備させることができる。腫瘍細胞によって放出される抗原化合物の量は、被験体において免疫応答を誘発するに十分ないずれの量であってもよく、例えば、１以上の腫瘍細胞から放出された抗原化合物は、白血球に感受性をもつことが知られている生物にて、宿主の免疫応答［作用］を誘発することができる。
抗原放出の期間とは、宿主が１以上の腫瘍抗原に対する免疫応答を確立するのに十分な時間である。いくつかの態様では、この期間は、宿主が１以上の腫瘍抗原に対する持続的な免疫応答を確立するのに十分な時間である。当業者ならば、被験体における腫瘍抗原のレベル、異なる腫瘍抗原の数、抗原の抗原性、宿主の免疫応答性、および宿主の血管に対する抗原物質の接近を含む、被験体が免疫応答を発達させる期間に影響を及ぼす様々な因子に基づいてこのような期間を決定することができる。一般に、抗原放出の期間は少なくとも約１週間、少なくとも約１０日、少なくとも約２週間、または少なくとも約１ヶ月であり得る。
本明細書で提供される微生物は、腫瘍細胞などの標的細胞および組織に抗原化合物を放出させることができる様々な特性のうちいずれを有していてもよい。特性の例としては、腫瘍細胞における細胞溶解能およびアポトーシス誘発能がある。腫瘍細胞を溶解させることができないか、または腫瘍を細胞死に至らせることができないマイクローブも、そのようなマイクローブが腫瘍細胞からの抗原化合物をいくらか放出または提示させ得るときには、やはり本明細書で提供される方法において使用可能である。溶解または細胞死を伴わない抗原放出または提示の様々な機構が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、抗原化合物の分泌、細胞膜透過性の増強、または細胞表面発現の変更、または腫瘍細胞が宿主の免疫系によって評価され得るときには腫瘍細胞におけるＭＨＣ提示の変更を含む、このような機構はいずれも本明細書で提供されるマイクローブにより使用可能である。宿主の免疫系が活性化される機構とは無関係に、腫瘍にマイクローブが存在することの正味の結果は、腫瘍細胞に対して少なくとも部分的な宿主の免疫系の刺激である。一例では、これらのマイクローブは、そのマイクローブに感染していない腫瘍細胞に対して免疫応答を生じさせることができる。
一態様では、本明細書で提供されるマイクローブは、腫瘍細胞にその腫瘍細胞表面には存在しない抗原を放出させることができる。腫瘍細胞は免疫応答を生じさせることができるタンパク質などの化合物を産生することができるが、その抗原化合物が腫瘍細胞表面にないときには、抗原化合物は免疫応答を生じさせることはなく、腫瘍は増殖でき、転移さえ可能である。本方法の範囲内で、本明細書で提供されるマイクローブは、細胞内の抗原化合物をその細胞から、また腫瘍から放出させることができ、その結果、そのような抗原に対する免疫応答を誘発することができる。たとえ必ずしも全ての腫瘍細胞が抗原を放出していなくとも、免疫応答はまず「漏出性」の腫瘍細胞を標的とすることができ、この免疫応答のバイスタンダー(bystander)効果が、「漏出性」の腫瘍細胞の周囲でさらなる腫瘍細胞死を招くことができる。
ｉｖ．病原性と腫瘍抗原の放出のバランス
腫瘍のような免疫特権細胞および組織などの標的細胞および組織の処置を含む典型的な
方法は、その迅速かつ完全な除去を引き起こすように設計されている。例えば、多くのウイルス、細菌または真核細胞は、腫瘍細胞をはじめ様々な細胞で溶解および／またはアポトーシスを誘導し得る。旺盛な溶解または細胞死の誘導が可能な微生物は病原性が高い可能性があり、宿主に死をもたらすことさえある。さらに、このような急速かつ完全な溶解に基づく治療方法は一般に治療上無効である。
これに対し、本明細書で提供される微生物は激しく細胞死または溶解を誘導することはない。それらは標的細胞または組織に集積する限りは、細胞死誘導能が限定されているか、または細胞死誘導能を全く持ち得ず、それに対して免疫応答が具備される抗原の漏出を誘導するような細胞膜の変化をもたらす。それらのアポトーシス作用または溶解作用は、宿主が標的組織に対して有効な免疫応答を具備するに十分な時間、十分な抗原漏出を可能とするよう十分遅いか、または効果的でないことが望ましい。このような免疫応答は単独で、または微生物の溶解／アポトーシス作用と組み合わさって標的組織の排除、およびまた組織または細胞のさらなる発達（転移または再発など）の排除をもたらす。本明細書で提供されるマイクローブは限定された細胞死誘導能しか持たないが、本明細書で提供されるマイクローブはやはり宿主の免疫系を刺激して腫瘍細胞を攻撃することができる。その結果、このような微生物はまた一般に、宿主に対する実質的な毒性を有する見込みが低くなる。
一態様では、これらのマイクローブは腫瘍細胞死誘導能を限定されているか、または全く持たないが、なお腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発または増強する。一例では、微生物により媒介される腫瘍細胞死の速度は、腫瘍細胞の増殖または複製の速度よりも遅い。別の例では、微生物により媒介される腫瘍細胞死の速度は、宿主が１以上の腫瘍抗原に対して持続的な免疫応答を確立するのに十分遅い。一般に、細胞死の時間は抗腫瘍免疫応答を確立するのに十分なものであり、宿主および標的細胞または組織に応じて、少なくとも約１週間、少なくとも約１０日、少なくとも約２週間、または少なくとも約１ヶ月であり得る。
別の態様では、本明細書で提供されるマイクローブは、非腫瘍組織では実質的な細胞死を誘導することなく、腫瘍細胞において細胞死を誘導することができる。このような態様では、非腫瘍細胞において実質的な細胞死が起こらない限り、さらには所望により、宿主が腫瘍細胞に対して免疫応答を具備する十分な能力を持っている限り、これらのマイクローブは、腫瘍細胞を激しく死滅させ得る。
一態様では、マイクローブの細胞死誘導能は、それらのマイクローブに対する宿主の免疫応答よりも遅い。宿主がマイクローブによる感染を制御する能力は、微生物抗原に対する免疫応答（例えば、抗体力価）によって決定することができる。一般に、宿主がマイクローブに対して免疫応答を具備した後は、それらマイクローブは宿主での病原性が軽減され得る。よって、マイクローブの細胞死誘導能がそれらマイクローブに対する宿主の免疫応答よりも遅いとき、マイクローブにより媒介される細胞死は宿主にとって重大な疾病または死の危険性なく起こり得る。一例では、マイクローブの腫瘍細胞死誘導能は、それらマイクローブに対する宿主の免疫応答よりも遅い。
ｂ．免疫原性
本明細書で提供される微生物はまた免疫原性であってもよい。免疫原性微生物は、その微生物に対する宿主の免疫応答を作り出すことができる。一態様では、これらの微生物は大きな抗−（微生物）抗体力価をもたらすに十分免疫原性であり得る。本明細書で提供される微生物は免疫応答惹起能を有し得る。この免疫応答はウイルス抗原に応答して活性化され得るか、または、微生物感染によって誘導されるサイトカインもしくはケモカインの産生の結果として活性化され得る。微生物に対する免疫応答は、その宿主生物に対する病原性の可能性を引き下げ得るものである。
微生物に対する免疫応答はまた、腫瘍細胞などの標的組織または細胞の死滅ももたらすことができる。一態様では、微生物感染に対する免疫応答は、腫瘍抗原に対する抗体の発達を含む、腫瘍細胞に対する免疫応答をもたらすことができる。一例では、その微生物に対して具備された免疫応答は「バイスタンダー効果」により腫瘍細胞の死滅をもたらすことができ、そこでは、感染した腫瘍細胞近傍の非感染腫瘍細胞が感染細胞と同時に死滅するか、あるいはまた細胞外微生物近傍の非感染腫瘍細胞が微生物と同時に死滅する。バイスタンダー効果の腫瘍細胞死の結果として、腫瘍細胞抗原は細胞から放出でき、宿主生物の免疫系は腫瘍細胞抗原に対する免疫応答を具備することができ、その結果、腫瘍それ自体に対する免疫応答が生じる。
一態様では、微生物は、超抗原化合物を含む１以上の抗原化合物を発現するように選択または修飾され得る。超抗原などのこれらの抗原化合物は内因性遺伝子産物であってもよいし、または外因性遺伝子産物であってもよい。トキソイドを含む超抗原は当技術分野で公知のものであり、本明細書の他所にも記載されている。
ｃ．複製成分
本明細書で提供される微生物は複製能を有し得る。様々なウイルスまたは細菌系において、投与する微生物は、宿主に対する病原性の危険性を制限するために複製不能とされる。複製不能であればその微生物から宿主を保護することができるが、その微生物の腫瘍細胞感染および死滅能も制限されてしまい、一般に一時的な効果しか得られない。これに対し、本明細書で提供される微生物は弱毒されてはいるが複製能を有し得るので、宿主に対する毒性が低く、かつ、主として腫瘍に、または腫瘍のみに集積することになる。よって、本明細書で提供される微生物は宿主に対する病原性を生み出さずに複製能を有し得る。
本明細書で提供される微生物の弱毒化としては、限定されるものではないが、微生物の複製能の低減が挙げられる。例えば、微生物は、その微生物の複製を制御する転写アクチベーターなどの複製に関連する活性を低下させるべく、または除去すべく修飾することができる。一例では、ウイルスなどの微生物は、修飾されたウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を有していてもよい。
ｄ．遺伝的変異体
本明細書で提供される微生物はそれらの野生型から修飾され得る。修飾には様々な変化のいずれかを含んでよく、一般には微生物のゲノムまたは核酸分子に対する変化を含む。核酸分子の修飾の例としては、末端切断、挿入、欠失および突然変異が挙げられる。修飾の一例として、微生物遺伝子を末端切断、挿入、欠失または突然変異により修飾できる。挿入の一例としては、外因性遺伝子を微生物のゲノムに挿入することができる。
ｉ．修飾された特徴
本明細書で提供される微生物の修飾は、病原性、毒性、腫瘍に優先的に集積する能力、細胞溶解または細胞死誘導能、腫瘍細胞に対して免疫応答を惹起する能力、免疫原性、複製能のような本明細書で提供されるものを含む微生物の特徴の修飾をもたらすことができる。変異体は、当技術分野で公知であり、Murphy et al., Virus Res. 1994, 32:13−26で呼吸器合胞体ウイルスに関して例示されているように、突然変異誘発、および細胞培養または組織培養での継代と目的特性の選抜などの一般法により得ることができる。
また変異体は突然変異誘発法によって得ることもでき、ここでは、微生物の核酸残基が野生型に対して付加、除去または修飾される。組換えに基づく方法、制限エンドヌクレアーゼに基づく方法、およびＰＣＲに基づく方法を含む、様々な既知の突然変異誘発法のいずれを用いてもよい。突然変異誘発法は遺伝子などの特定のヌクレオチド配列に向けることもできるし、あるいはランダムであってもよく、ランダムな場合は、所望の特徴に基づく選択法を用いて突然変異した微生物を選択することができる。選択された微生物および選択された微生物の特定の既知の修飾に応じ、様々な微生物修飾のうちいずれを行ってもよい。
ｉｉ．外因的遺伝子発現
本明細書で提供される微生物はまた、１以上の外因性遺伝子を発現する能力を有し得る。遺伝子発現は遺伝子によりコードされるタンパク質の発現、および／または遺伝子によりコードされるＲＮＡ分子の発現を含み得る。いくつかの態様では、これらの微生物は外因性遺伝子の産物を腫瘍から採取できるよう十分高いレベルとする外因性遺伝子を発現することができる。内因性遺伝子の発現は構成的プロモーターにより、または誘導プロモーターにより制御することができる。発現はまた、その微生物により発現される１以上のタンパク質またはＲＮＡ分子によって左右され得る。誘導プロモーター系の例としては、酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインと、また単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインと融合されているプロゲステロン受容体を含むキメラ転写因子、および１以上の外因性遺伝子と連結されているアデノウイルス主要後期Ｅ１Ｂ ＴＡＴＡボックスの上流の一連のＧＡＬ４認識配列を含む合成プロモーターが挙げられ、この例の系では、被験体にＲＵ４８６を投与すれば、外因性遺伝子を誘導することができる。発現される外因性遺伝子としては、治療遺伝子産物をコードする遺伝子、画像化に使用できる遺伝子産物などの検出可能な遺伝子産物をコードする遺伝子、採取しようとする遺伝子産物をコードする遺伝子、採取しようとする抗体の抗原をコードする遺伝子が挙げられる。本明細書で提供される微生物はインビボおよびインビトロで遺伝子を発現させるのに使用できる。タンパク質の例としては、リポータータンパク質（大腸菌β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、検出を補助するタンパク質、すなわち検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導し得るタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、緑色および赤色蛍光タンパク質、トランスフェリン受容体）、腫瘍治療に有用なタンパク質（シュードモナスＡ内毒素、ジフテリア毒、ｐ５３、Ａｒｆ、Ｂａｘ、腫瘍壊死因子−α、ＨＳＶ ＴＫ、大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アンギオスタチン、エンドスタチン、種々のサイトカイン類）および他の多くのタンパク質が挙げられる。
ｉｉｉ．検出可能な遺伝子産物
本明細書で提供される微生物は、その産物が検出可能であるか、またはその産物が検出可能なシグナルを提供できる１以上の遺伝子を発現し得る。様々な検出可能な遺伝子産物（検出可能なタンパク質など）が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される微生物とともに使用することができる。検出可能なタンパク質としては、検出可能な化合物と特異的に結合することができる受容体または他のタンパク質、蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルを発することができるタンパク質、検出可能な反応を触媒することができるか、または検出可能な産物の形成を触媒することができる酵素が挙げられる。
いくつかの態様では、微生物は、検出可能なシグナルを発することができるか、または検出可能な反応を触媒することができるタンパク質をコードする遺伝子を発現する。検出可能なシグナルを発することができるか、または検出可能な反応を触媒することができるタンパク質（発光または蛍光タンパク質など）をコードする様々なＤＮＡ配列は公知であり、本明細書で提供される微生物および方法において使用可能である。光を発するタンパク質をコードする遺伝子の例としては、Vibrio haeveyiの細菌ルシフェラーゼ(Belas et al., Science 218 (1982), 791−793)、Vibrio fischeriiの細菌ルシフェラーゼ(Foran and Brown, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 177)、ホタルルシフェラーゼ(de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7(1987), 725−737)、オワンクラゲ（Aequorea victoria）のエクオリン(Prasher et al., Biochem. 26 (1987), 1326−1332)、ウミシイタケ(Renilla renformis)のウミシイタケルシフェラーゼ(Lorenz et al., PNAS USA 88 (1991), 4438−4442)およびオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質(Prasher et al., Gene 111 (1987), 229−233)由来の遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子を微生物において形質転換および発現させれば、例えば低照度画像化カメラを用いて、微生物コロニーの検出を可能にすることができる。ｌｕｘ Ａ遺伝子とｌｕｘ Ｂ遺伝子を融合させれば、十分機能的なルシフェラーゼタンパク質を得ることができる(Escher et al., PNAS 86 (1989), 6528−6532)。この融合遺伝子（Ｆａｂ２）を様々な微生物に導入した後、微生物感染およびルシフェラーゼの発現に基づく画像化が行われている。いくつかの態様では、細菌で発現されたルシフェラーゼは発光のためにデカナールまたはコエレンテラジンなどの基質を外から加える必要がある。他の態様では、微生物は、デカナールなどのルシフェラーゼ基質を提供し得るタンパク質を含み得る完全なｌｕｘオペロンを発現することができる。例えば、完全なｌｕｘオペロン配列を含む細菌は、腹膜注射、筋肉注射、または静脈注射すると、生きたマウスで細菌の可視化および局在が可能となり、これはそのルシフェラーゼの発光が組織を透過でき、外部検出可能であることを示している(Contag et al., Mol. Microbiol. 18 (1995), 593−603)。
他の態様では、微生物は、検出可能な化合物と結合できるか、または検出可能な化合物と結合できる産物を形成し得る遺伝子を発現することができる。受容体、金属結合タンパク質、リガンド結合タンパク質、および抗体を含む、検出可能な化合物と特異的に結合するタンパク質などの様々な遺伝子産物が当技術分野で公知である。様々な検出可能な化合物のうちいずれを用いてもよく、様々な既知の画像化法のいずれによって画像化してもよい。化合物の例としては、受容体リガンドおよび抗体に対する抗原が挙げられる。用いる画像化法に応じ、リガンドを標識することもできる。画像化法の例としては、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）および磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）などの様々な磁気共鳴法のいずれもが含まれ、また、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、コンピューター対軸断層撮影法（ＣＡＴ）、電子ビームコンピューター断層撮影法（ＥＢＣＴ）、高分解コンピューター断層撮影法（ＨＲＣＴ）、下環状断層撮影法、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、螺旋状コンピューター断層撮影法および超音波断層撮影法を含む様々な断層撮影法のいずれもが含まれる。
磁気共鳴映像法に適当な標識は当技術分野で公知であり、例えば、ガドリニウムキレートおよび酸化鉄が挙げられる。造影剤におけるキレートの使用は当技術分野で公知である。断層撮影法に適当な標識は当技術分野で公知であり、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏまたは６４Ｃなどのβ−放射体、または（ｂ）１２３Ｉなどのγ−放射体が挙げられる。例えばＰＥＴ用のトレーサーとして使用可能なその他の放射性核種の例としては、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６０Ｃｕ（ＩＩ）、６７Ｃｕ（ＩＩ）、５７Ｎｉ、５２Ｆｅおよび１８Ｆが挙げられる。有用な放射性核種標識剤の例としては、６４Ｃｕ標識操作抗体フラグメント(Wu et al., PNAS USA 97 (2002), 8495−8500)、６４Ｃｕ標識ソマトスタチン(Lewis et al., J. Med. Chem. 42(1999), 1341-1347)、６４Ｃｕ−ピルバルデヒド−ビス（Ｎ４メチルチオセミカルバゾン）（６４Ｃｕ−ＰＴＳＭ）(Adonai et al., PNAS USA 99 (2002), 3030−3035)、５２Ｆｅ−クエン酸(Leenders et al., J. Neurochem. Transm. Suppl. 43 (1994), 123−132)、５２Ｆｅ／５２ｍＭｎ−クエン酸(Calonder et al., J. Neurochem. 73 (1999), 2047−2055)および５２Ｆｅ標識水酸化鉄（ＩＩＩ）−スクロース複合体(Beshara et al., Br. J. Haematol. 104 (1999), 288−295,296-302)が挙げられる。
ｉｖ．治療遺伝子産物
本明細書で提供される微生物は、その産物が細胞死を誘導するか、またはその産物が抗腫瘍免疫応答を誘導する１以上の遺伝子を発現することができ、このような遺伝子は治療遺伝子とみなすことができる。有毒タンパク質もしくはアポトーシスタンパク質、またはｓｉＲＮＡなど、様々な治療遺伝子産物が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される微生物とともに使用可能である。これらの治療遺伝子は、例えばチャネル形成タンパク質またはその他の溶解タンパク質として宿主細胞を直接死に至らせることにより、あるいはアポトーシスを誘導することにより、あるいは不可欠な細胞プロセスを阻害することにより、あるいは細胞に対する免疫応答を誘導することにより、あるいは同等の作用を有する化合物と相互作用させることにより、例えば、活性の低い化合物を細胞傷害性化合物に変換することにより働き得る。
いくつかの態様では、微生物は治療タンパク質を発現することができる。腫瘍処置のために発現させることができる多数の治療タンパク質が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、腫瘍サプレッサー、毒素、細胞増殖抑制タンパク質、およびサイトカインが挙げられる。限定されるものではないが、このようなタンパク質を例として挙げれば、ＷＴ１、ｐ５３、ｐ１６、Ｒｂ、ＢＲＣＡ１、嚢胞性繊維症トランスメンブラン受容体（ＣＦＴＲ）、因子ＶＩＩＩ、低密度リポタンパク質受容体、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、インスリン、副甲状腺ホルモン、α−１−抗トリプシン、ｒｓＣＤ４０Ｌ、Ｆａｓ−リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、抗体、マイクロシンＥ４９２、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、大腸菌Ｓｈｉｇ毒素、大腸菌ベロ毒素１、およびハイパーフォリンがある。
他の態様では、微生物は、活性の低い化合物を腫瘍細胞死を誘導する化合物に変換するタンパク質を発現することができる。このようなプロドラッグ化合物の変換法の例としては、酵素変換および光分解変換が挙げられる。多様なタンパク質／化合物対が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル、水疱帯状疱疹チミジンキナーゼ／ガンシクロビル、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロウラシル、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ／６−メチルプリンデオキシリボシド、βラクタマーゼ／セファロスポリン−ドキソルビシン、カルボキシペプチダーゼＧ２／４−［（２−クロロエチル）（２−メスロキシ(mesuloxy)エチル）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸、シトクロムＰ４５０／アセトミノフェン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ／インドール−３−酢酸、ニトロレダクターゼ／ＣＢ１９５４、ウサギカルボキシルエステラーゼ／７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン、マッシュルームチロシナーゼ／ビス−（２−クロロエチル）アミノ−４−ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、βガラクトシダーゼ／１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ(dihyro)−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール、βグルクロニダーゼ／エピルビシン−グルクロニド、チミジンホスホリラーゼ／５’−デオキシ５−フルオロウリジン、デオキシシチジンキナーゼ／シトシンアラビノシド、およびリナメラーゼ／リナマリンが挙げられる。
別の態様では、治療遺伝子産物はｓｉＲＮＡ分子であり得る。このｓｉＲＮＡ分子は、限定されるものではないが、癌遺伝子、増殖因子、血管形成誘導遺伝子、または受容体などの腫瘍誘導遺伝子の発現に対して向けることができる。ｓｉＲＮＡ分子はまた、細胞増殖、細胞複製または細胞生存に不可欠ないずれの遺伝子の発現にも向けることができる。ｓｉＲＮＡ分子はまた、細胞膜を安定化させる、またはそうでなければ腫瘍細胞から放出される腫瘍細胞抗原の数を制限するいずれの遺伝子の発現にも向けることができる。ｓｉＲＮＡの設計は選択されたｓｉＲＮＡの標的に応じて容易に決定することができ、ｓｉＲＮＡの設計および遺伝子の下方制御の方法は、米国特許公報第２００３０１９８６２７号に例示されているように、当技術分野で公知である。
一態様では、治療化合物は調節配列によって制御することができる。例えば、哺乳類宿主細胞において機能的な、好適な調節配列は当技術分野で公知のものである。一例では、この調節配列は天然または合成ワクシニアウイルスプロモーターを含み得る。別の態様では、この調節配列はポックスウイルスプロモーターを含む。ウイルス微生物を用いる場合、強力な後期プロモーターを用いて、高レベルの外来遺伝子発現を達成することができる。しかしながら、初期および中期プロモーターも使用可能である。一態様では、これらのプロモーターは初期および後期プロモーターエレメント、例えば、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐ７．５、ワクシニア後期プロモーターｐ１１、合成初期／後期ワクシニアｐＥ／Ｌプロモーター(Patel et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9431−9435; Davison and Moss, (1989), J Mol Biol 210, 749−769; Davison et al., (1990), Nucleic Acids Res. 18, 4285−4286; Chakrabarti et al., (1997), BioTechniques 23, 1094−1097)を含む。
ｖ．超抗原の発現
本明細書で提供される微生物は１以上の超抗原を発現するように修飾され得る。超抗原は、多くの場合、Ｔ細胞の大きな応答によってもたらされる大きな免疫応答を活性化させることができる抗原である。様々な超抗原が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ジフテリア毒、ブドウ球菌内毒素（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＤ、ＳＥＥおよびＳＥＨ）、毒性ショック症候群毒素１、剥奪性(Exfoliating)毒素（ＥＸｆｔ）、化膿連鎖球菌(Streptococcal Pyrogenic)外毒素Ａ、ＢおよびＣ（ＳＰＥ Ａ、ＢおよびＣ）、マウス乳癌ウイルスタンパク質（ＭＭＴＶ）、連鎖球菌Ｍタンパク質、ウェルシュ菌(Clostridial Perfringens)内毒素（ＣＰＥＴ）、マイコプラズマ関節炎超抗原が挙げられる。
多くの超抗原は毒素でもあることから、毒性を軽減した微生物の発現が望まれる場合には、この超抗原を、その毒性を軽減しながら、その超抗原性の少なくともいくらかを保持するように修飾することができ、その結果、トキソイドなどの化合物が得られる。様々な組換え超抗原および超抗原のトキソイドが当技術分野で公知であり、本明細書で提供される微生物で容易に発現させることができる。トキソイドの例としては、米国特許第６，４５５，６７３号に例示されているようなジフテリア毒のトキソイド、および米国特許公報第２００３０００９０１５号に例示されているようなブドウ球菌内毒素のトキソイドが挙げられる。
ｖｉ．採取する遺伝子産物の発現
採取を目的とした微生物により発現可能な遺伝子の例としては、ヒト遺伝子がある。遺伝子の例の一覧としては、Dr. Victor A. McKusickとジョンズ・ホプキンス大学その他の共同研究者らが著述および編集し、また、NCBI（the National Center for Biotechnology Information）、Online Mendelian Inheritance in Man, OMIMTM、ジョンズ・ホプキンス大学(Baltimore, Md．)のCenter for Medical Genetics、およびNational Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md．), 1999がWorld Wide Web向けに開発したヒト遺伝子と遺伝疾患の一覧、ならびにＰｕｂＭｅｄおよびＧｅｎｂａｎｋなどの公開データベースで利用できるもの（例えば、(ncbi．nlm．nih．gov/entrez/query．fcgi？db＝OMIM)参照）が挙げられる。これらの遺伝子としては、限定されるものではないが、２３９ｆ２ｈ９、３ｐｋ、４ｅｂｐ１、４ｅｂｐ２、ａｌ１、ａｌ２ｍ１、ａｌ２ｍ２、ａｌ２ｍ３、ａｌ２ｍ４、ａｌ５、ａ１ｂ、ａｌｂｇ、ａｌｓｔ、ａ２ｍ、ａ２ｍｒ、ａ２ｍｒａｐ、ａａ、ａａａ、ａａａ、ａａｂｔ、ａａｃ１、ａａｃ２、ａａｃｔ、ａａｄａｃ、ａａｎａｔ、ａａｒｓ、ａａｓ、ａａｔ、ａａｖｓ１、ａｂｃ１、ａｂｃ２、ａｂｃ３、ａｂｃ７、ａｂｃ８、ａｂｃｒ、ａｂｉ１、ａｂｌ１、ａｂｌ２、ａｂｌ１、ａｂｏ、ａｂｐ、ａｂｐ１、ａｂｐａ、ａｂｐｘ、ａｂｒ、ａｃａａ、ａｃａｃ、ａｃａｃａ、ａｃａｃｂ、ａｃａｄ１、ａｃａｄｍ、ａｃａｄｓ、ａｃａｄｓｂ、ａｃａｄｖ１、ａｃａｔ、ａｃａｔ１、ａｃａｔ２、ａｃｃ、ａｃｃｂ、ａｃｃｎ１、ａｃｃｎ２、ａｃｃｐｎ、ａｃｅ１、ａｃｈ、ａｃｈｅ、ａｃｈｍ１、ａｃｈｍ２、ａｃｈｒｂ、ａｃｈｒｄ、ａｃｈｒｇ、ａｃｌｓ、ａｃｌｙ、ａｃｏ１、ａｃｏ２、ａｃｏｘ、ａｃｏｘ１、ａｃｏｘ２、ａｃｏｘ３、ａｃｐ１、ａｃｐ２、ａｃｐ５、ａｃｐｐ、ａｃｒ、ａｃｒｖ１、ａｃｓ３、ａｃｓ３、ａｃｓ４、ａｃｔ２、ａｃｔ３５、ａｃｔａ１、ａｃｔａ２、ａｃｔａ３、ａｃｔｂ、ａｃｔｃ、ａｃｔｇ１、ａｃｔｇ２、ａｃｔ１１、ａｃｔｎ１、ａｃｔｎ２、ａｃｔｎ３、ａｃｔｓａ、ａｃｕｇ、ａｃｖｒ１、ａｃｖｒ２ｂ、ａｃｖｒｌ１、ａｃｖｒｌｋ１、ａｃｖｒｌｋ２、ａｃｖｒｌｋ３、ａｃｙ１、ａｄ１、ａｄ２、ａｄ３、ａｄ４、ａｄ５、ａｄａ、ａｄａｍ１０、ａｄａｍ１１、ａｄａｍ１２、ａｄａｍ３、ａｄａｍ３ａ、ａｄａｍ３ｂ、ａｄａｍ８、ａｄａｒ、ａｄａｒｂ１、ａｄａｒｂ２、ａｄｃｐ１、ａｄｃｐ２、ａｄｃｙ１、ａｄｃｙ２、ａｄｃｙ３、ａｄｃｙ３、ａｄｃｙ４、ａｄｃｙ５、ａｄｃｙ６、ａｄｃｙ７、ａｄｃｙ８、ａｄｃｙ９、ａｄｃｙａｐ１、ａｄｃｙａｐｌｒ１、ａｄｄ１、ａｄｄ２、ａｄｄ３、ａｄｄ１、ａｄｆｎ、ａｄｈ１、ａｄｈ２、ａｄｈ３、ａｄｈ４、ａｄｈ５、ａｄｈ７、ａｄｈａｐｓ、ａｄｈｃ１＠、ａｄｈｒ、ａｄｈｒ、ａｄｋ、ａｄ１、ａｄｍ、ａｄｍｌｘ、ａｄｏｒａ１、ａｄｏｒａ２ａ、ａｄｏｒａ２ｂ、ａｄｏｒａ２１、ａｄｏｒａ２１、ａｄｏｒａ３、ａｄｐｒｔ、ａｄｒａ１ａ、ａｄｒａ１ｂ、ａｄｒａ１ｃ、ａｄｒａ１ｄ、ａｄｒａ２ａ、ａｄｒａ２ｂ、ａｄｒａ２ｃ、ａｄｒａ２１１、ａｄｒａ２１２、ａｄｒａ２ｒ、ａｄｒｂ１、ａｄｒｂ１ｒ、ａｄｒｂ２、ａｄｒｂ２ｒｌ１、ａｄｒｂ３、ａｄｒｂｋ１、ａｄｒｂｋ２、ａｄｓ１、ａｄｓｓ、ａｄｔｂ１、ａｄｘ、ａｄｘｒ、ａｅ１、ａｅ２、ａｅ３、ａｅｇｌ１、ａｅｍｋ、ａｅｓ、ａｆ１０、ａｆ１７、ａｆ４、ａｆ６、ａｆ８ｔ、ａｆ９、ａｆｄ１、ａｆｄｎ、ａｆｇ３、ａｆｇ３１１、ａｆｍ、ａｆｐ、ａｆｘ１、ａｇａ、ａｇｃ１、ａｇｅｒ、ａｇ１、ａｇｍｘ１、ａｇｍｘ２、ａｇｐ１、ａｇｐ７、ａｇｐｓ、ａｇｒｎ、ａｇｒｐ、ａｇｒｔ、ａｇｓ、ａｇｔ、ａｇｔｉ１、ａｇｔｒ１、ａｇｔｒ１ａ、ａｇｔｒ２、ａｇｔｒｌ１、ａｇｘｔ、ａｈｃ、ａｈｃｙ、ａｈｄ、ａｈｄｓ、ａｈｎａｋ、ａｈｏ２、ａｈｒ、ａｈｓｇ、ａｈｘ、ａｉｂ１、ａｉｃ、ａｉｃ１、ａｉｅｄ、ａｉｈ１、ａｉｈ２、ａｉｈ３、ａｉｍ１、ａｉｒ、ａｉｒｃ、ａｉｒｅ、ａｋ１、ａｋ２、ａｋ３、ａｋａｐ１４９、ａｋｔ１、ａｋｔ２、ａｋｕ、ａｌａｄ、ａｌａｓ１、ａｌａｓ２、ａｌｂ、ａｌｂ２、ａｌｂａ、ａｌｃａｍ、ａｌｄ、ａｌｄｈ１、ａｌｄｈ１０、ａｌｄｈ２、ａｌｄｈ３、ａｌｄｈ４、ａｌｄｈ５、ａｌｄｈ６、ａｌｄｈ９、ａｌｄ１１、ａｌｄｏａ、ａｌｄｏｂ、ａｌｄｏｃ、ａｌｄｒ１、ａｌｄｓ、ａｌｋ、ａｌｋ１、ａｌｋ２、ａｌｋ３、ａｌｋ６、ａｌｍｓ１、ａｌｏｘ１２、ａｌｏｘ１５、ａｌｏｘ５、ａｌｐ、ａｌｐｉ、ａｌｐ１、ａｌｐｐ、ａｌｐｐ１２、ａｌｒ、ａｌｒ、ａｌｓ１、ａｌｓ２、ａｌｓ４、ａｌｓ５、ａｌｓｓ、ａｍｂｎ、ａｍｂｐ、ａｍｃｄ１、ａｍｃｄ２ｂ、ａｍｃｎ、ａｍｃｎ１、ａｍｃｘ１、ａｍｄ１、ａｍｄｍ、ａｍｅｌｘ、ａｍｅｌｙ、ａｍｆｒ、ａｍｇ、ａｍｇ１、ａｍｇｘ、ａｍｈ、ａｍｈｒ、ａｍｈｒ２、ａｍｌ１、ａｍｌ１ｔ１、ａｍｌ２、ａｍｌ３、ａｍｏｇ、ａｍｐｄ１、ａｍｐｄ２、ａｍｐｄ３、ａｍｐｈ、ａｍｐｈ１、ａｍｐｋ、ａｍｔ、ａｍｙ１ａ、ａｍｙ１ｂ、ａｍｙ１ｃ、ａｍｙ２ａ、ａｍｙ２ｂ、ａｎ２、ａｎｃ、ａｎｃｒ、ａｎｇ、ａｎｇ１、ａｎｈ１、ａｎｋ１、ａｎｋ２、ａｎｋ３、ａｎｏｐ１、ａｎｏｖａ、ａｎｐ、ａｎｐｅｐ、ａｎｐｒａ、ａｎｐｒｂ、ａｎｐｒｃ、ａｎｓ、ａｎｔ１、ａｎｔ２、ａｎｔ３、ａｎｔ３ｙ、ａｎｘ１、ａｎｘ１１、ａｎｘ１３、ａｎｘ２、ａｎｘ２１４、ａｎｘ３、ａｎｘ４、ａｎｘ５、ａｎｘ６、ａｎｘ７、ａｎｘ８、ａｏａｈ、ａｏｃ２、ａｏｘ１、ａｐ２ｔｆ、ａｐａｈ１、ａｐｂａ１、ａｐｂａ２、ａｐｂｂ１、ａｐｂｂ２、ａｐｃ、ａｐｃｓ、ａｐｅ、ａｐｅｃｅｄ、ａｐｅｈ、ａｐｅｘ、ａｐｉ１、ａｐｉ２、ａｐｉ３、ａｐｊ、ａｐｌｐ、ａｐｌｐ１、ａｐｌｐ２、ａｐｎｈ、ａｐｏ３１、ａｐｏａ１、ａｐｏａ２、ａｐｏａ４、ａｐｏｂ、ａｐｏｂｅｃ１、ａｐｏｃ１、ａｐｏｃ２、ａｐｏｃ３、ａｐｏｃ４、ａｐｏｄ、ａｐｏｅ、ａｐｏｅｒ２、ａｐｏｈ、ａｐｏｌｍｔ、ａｐｏｌｐ１＠、ａｐｏｌｐ２＠、ａｐｐ、ａｐｐｂｐ１、ａｐｐｌ１、ａｐｒｆ、ａｐｒｔ、ａｐｓ、ａｐｔ１、ａｐｔｌ１ｇ１、ａｐｘ１、ａｐｙ、ａｑｄｑ、ａｑｐ０、ａｑｐ１、ａｑｐ２、ａｑｐ２１、ａｑｐ３、ａｑｐ４、ａｑｐ５、ａｑｐ６、ａｑｐ７、ａｒ、ａｒ１、ａｒａ、ａｒａｆ１、ａｒａｆ２、ａｒｃｎ１、ａｒｄ１、ａｒｄ１、ａｒｅｇ、ａｒｆ１、ａｒｆ２、ａｒｆ３、ａｒｆ４１、ａｒｆ５、ａｒｇ、ａｒｇ１、ａｒｇｓ、ａｒｈ１２、ａｒｈ６、ａｒｈ９、ａｒｈａ、ａｒｈｂ、ａｒｈｃ、ａｒｈｇ、ａｒｈｇａｐ２、ａｒｈｇａｐ３、ａｒｈｇａｐ６、ａｒｈｇｄｉａ、ａｒｈｇｄｉｂ、ａｒｈｈ、ａｒｉｘ、ａｒｌ２、ａｒｍｄ１、ａｒｎｔ、ａｒｎｔ１、ａｒｏ、ａｒｐ、ａｒｐ１、ａｒｐｋｄ、ａｒｒ３、ａｒｒｂ１、ａｒｒｂ２、ａｒｓａ、ａｒｓａｃｓ、ａｒｓｂ、ａｒｓｃ１、ａｒｓｃ２、ａｒｓｄ、ａｒｓｅ、ａｒｓｆ、ａｒｔ、ａｒｔ１、ａｒｔ３、ａｒｔ４、ａｒｔｓ、ａｒｖｄ１、ａｒｖｄ２、ａｒｖｄ３、ａｒｖｄ４、ａｓ、ａｓａｔ、ａｓｂ、ａｓｃｌ１、ａｓｃｌ２、ａｓｃｔ１、ａｓｄ１、ａｓｄ２、ａｓｇｒ１、ａｓｇｒ２、ａｓｈ１、ａｓｉｐ、ａｓ１、ａｓｌｎ、ａｓｍ１、ａｓｍａ、ａｓｍｄ、ａｓｍｔ、ａｓｍｔｌｘ、ａｓｍｔｙ、ａｓｎｒｓ、ａｓｎｓ、ａｓｐａ、ａｓｓ、ａｓｔｍ１、ａｓｔｎ、ａｓｖ、ａｔ、ａｔ１、ａｔ２ｒ１、ａｔ３、ａｔａ、ａｔｂｆ１、ａｔｃａｙ、ａｔｆ１、ａｔｈ１、ａｔｈｓ、ａｔｍ、ａｔｏｈ１、ａｔｏｘ１、ａｔｐ１ａ１、ａｔｐ１ａ２、ａｔｐ１ａ３、ａｔｐ１ａ１１、ａｔｐ１ｂ１、ａｔｐ１ｂ２、ａｔｐ１ｂ３、ａｔｐ１ｂ１１、ａｔｐ１ｇ１、ａｔｐ２ａ１、ａｔｐ２ａ２、ａｔｐ２ａ３、ａｔｐ２ｂ、ａｔｐ２ｂ１、ａｔｐ２ｂ２、ａｔｐ２ｂ２、ａｔｐ２ｂ３、ａｔｐ２ｂ４、ａｔｐ４ａ、ａｔｐ４ｂ、ａｔｐ５、ａｔｐ５ａ、ａｔｐ５ｂ、ａｔｐ５ｇ１、ａｔｐ５ｇ２、ａｔｐ５ｇ３、ａｔｐ５ｏ、ａｔｐ６ａ、ａｔｐ６ｂ１、ａｔｐ６ｃ、ａｔｐ６ｅ、ａｔｐ６ｎ１、ａｔｐ７ａ、ａｔｐ７ｂ、ａｔｐｍ、ａｔｐｓｂ、ａｔｐｓｋ１、ａｔｐｓｋ２、ａｔｑ１、ａｔｒ、ａｔｒ、ａｔｒ１、ａｔｒ１、ａｔｒ２、ａｔｒｃ１、ａｔｒｃ２、ａｔｒｘ、ａｔｓ、ａｔｓｖ、ａｔｘ１、ａｔｘ２、ａｕ、ａｕｆ１、ａｕｆ１ａ、ａｕｔ、ａｖｃｄ、ａｖｅｄ、ａｖｐ、ａｖｐｒ１ａ、ａｖｐｒ１ｂ、ａｖｐｒ２、ａｖｐｒ３、ａｖｒｐ、ａｖｓｄ、ａｗａ１、ａｘ１、ａｘｌ１ｇ、ａｘｓｆ、ａｚｆ１、ａｚｆ２、ａｚｇｐ１、ａｚｕ１、ｂ１２０、ｂ１４４、ｂｌｇ１、ｂ２９、ｂ２ｍ、ｂ２ｍｒ、ｂ３ｇａｌｔ４、ｂ４ｇａｌｔ１、ｂａ２ｒ、ｂａｂ１、ｂａｇ１、ｂａｉ１、ｂａｉ２、ｂａｉ３、ｂａｋ１、ｂａｍ２２、ｂａｐ１、ｂａｐ１３５、ｂａｐｘ１、ｂａｒｄ１、ｂａｒｋ２、ｂａｓ、ｂａｔ１、ｂａｔ２、ｂａｔ３、ｂａｔ４、ｂａｔ５、ｂａｘ、ｂｂ１、ｂｂｂｇ１、ｂｂｂｇ２、ｂｂｓ１、ｂｂｓ２、ｂｂｓ３、ｂｂｓ４、ｂｂｓ５、ｂｃａｓ１、ｂｃａｔ１、ｂｃａｔ２、ｂｃａｔｅ２、ｂｃｄ１、ｂｃｅｉ、ｂｃｈｅ、ｂｃｋｄｈａ、ｂｃｋｄｈｂ、ｂｃｌ１、ｂｃｌ１０、ｂｃｌ２、ｂｃｌ２ａ１、ｂｃｌ２１２、ｂｃｌ３、ｂｃｌ５、ｂｃｌ６、ｂｃｌ７、ｂｃｌ７ａ、ｂｃｌ８、ｂｃｌ９、ｂｃｌｗ、ｂｃｍ、ｂｃｍ１、ｂｃｍａ、ｂｃｎｓ、ｂｃｎｓ、ｂｃｐ、ｂｃｐｍ、ｂｃｐｒ、ｂｃｒ、ｂｃｒｌ２、ｂｃｒｌ３、ｂｃｒｌ４、ｂｃｓｇ１、ｂｃｔ１、ｂｃｔ２、ｂｄｂ、ｂｄｂ１、ｂｄｃ、ｂｄｅ、ｂｄｋｒｂ１、ｂｄｋｒｂ２、ｂｄｍｆ、ｂｄｍｒ、ｂｄｎｆ、ｂｅｄ、ｂｅｄｐ、ｂｅｋ、ｂｅｎｅ、ｂｅｖｉ、ｂｆ、ｂｆ１、ｂｆ２、ｂｆｈｄ、ｂｆｉｃ、ｂｆｌｓ、ｂｆｎｃ２、ｂｆｐ、ｂｆｓｐ１、ｂｆｔ、ｂｇｌａｐ、ｂｇｍｒ、ｂｇｎ、ｂｇｐ、ｂｈｄ、ｂｈｐｃｄｈ、ｂｈｒ１、ｂｉｃｄ１、ｂｉｄ、ｂｉｇｈ３、ｂｉｎ１、ｂｉｒ、ｂｊｓ、ｂｋｍａ１、ｂｌａｓｔ１、ｂｌａｕ、ｂｌｋ、ｂｌｍ、ｂｌｍｈ、ｂｌｔｒ、ｂｌｖｒａ、ｂｌｖｒｂ、ｂｌｙｍ、ｂｍａｌ１、ｂｍｄ、ｂｍｈ、ｂｍｉ１、ｂｍｐ１、ｂｍｐ２、ｂｍｐ２ａ、ｂｍｐ２ｂ１、ｂｍｐ３、ｂｍｐ４、ｂｍｐ５、ｂｍｐ６、ｂｍｐ７、ｂｍｐ８、ｂｍｐｒ１ａ、ｂｍｐｒ１ｂ、ｂｍｘ、ｂｍｙｂ、ｂｎ５１ｔ、ｂｎｃ、ｂｎｃ１、ｂｎｐ、ｂｏｒ、ｂｐａｄ、ｂｐａｇ１、ｂｐａｇ２、ｂｐｅｓ、ｂｐｅｓ１、ｂｐｅｓ２、ｂｐｇｍ、ｂｐｈ１、ｂｐｉ、ｂｒ、ｂｒ１４０、ｂｒａｆ、ｂｒｃａ１、ｂｒｃａ２、ｂｒｃａ３、ｂｒｃａｃｏｘ、ｂｒｃｄ１、ｂｒｃｄ２、ｂｒｄｔ、ｂｒｆ１、ｂｒｈｃ、ｂｒｉｃ、ｂｒｋｓ、ｂｒｎ３ａ、ｂｒｎ３ｂ、ｂｒｎ３ｃ、ｂｒｒｎ１、ｂｒｗ１ｃ、ｂｓ、ｂｓａｐ、ｂｓｅｐ、ｂｓｆ２、ｂｓｇ、ｂｓｎｄ、ｂｓｓ１、ｂｓｔ１、ｂｓｔ２、ｂｔａｋ、ｂｔｃ、ｂｔｄ、ｂｔｅｂ、ｂｔｅｂ１、ｂｔｇ１、ｂｔｇ２、ｂｔｈｓ、ｂｔｋ、ｂｔｋ１、ｂｔｎ、ｂｔｓ、ｂｕｂ１ｂ、ｂｕｂｒ１、ｂｗｒ１ａ、ｂｗｒ１ｂ、ｂｗｓ、ｂｗｓｃｒ１ａ、ｂｗｓｃｒ１ｂ、ｂｚｒｐ、ｂｚｘ、ｃ１１ｏｒｆ１３、ｃ１ｎｈ、ｃ１ｑａ、ｃ１ｑｂ、ｃ１ｑｂｐ、ｃ１ｑｇ、ｃ１ｒ、ｃ１ｓ、ｃ２、ｃ２１ｏｒｆ１、ｃ２１ｏｒｆ２、ｃ２１ｏｒｆ３、ｃ２ｔａ、ｃ３、ｃ３ｂｒ、ｃ３ｄｒ、ｃ３ｇ、ｃ４ａ、ｃ４ｂ、ｃ４ｂｐａ、ｃ４ｂｐｂ、ｃ４ｆ、ｃ４ｓ、ｃ５、ｃ５ａｒ、ｃ５ｒ１、ｃ６、ｃ７、ｃ８ａ、ｃ８ｂ、ｃ８ｇ、ｃ９、ｃａ１、ｃａ１２、ｃａ１２５、ｃａ２、ｃａ２１ｈ、ｃａ３、ｃａ４、ｃａ５、ｃａ６、ｃａ７、ｃａ８、ｃａ９、ｃａａｆ１、ｃａｂｐ９ｋ、ｃａｃ、ｃａｃ＠、ｃａｃａ、ｃａｃｄ、ｃａｃｎａ１ａ、ｃａｃｎａ１ｂ、ｃａｃｎａ１ｃ、ｃａｃｎａ１ｄ、ｃａｃｎａ１ｅ、ｃａｃｎａ１ｆ、ｃａｃｎａ１ｓ、ｃａｃｎａ２、ｃａｃｎｂ１、ｃａｃｎｂ２、ｃａｃｎｂ３、ｃａｃｎｂ４、ｃａｃｎｇ、ｃａｃｎｌ１ａ１、ｃａｃｎｌ１ａ２、ｃａｃｎｌ１ａ３、ｃａｃｎｌ１ａ４、ｃａｃｎｌ１ａ５、ｃａｃｎｌ１ａ６、ｃａｃｎｌ２ａ、ｃａｃｎｌｂ１、ｃａｃｎｌｇ、ｃａｃｐ、ｃａｃｔ、ｃａｃｙ、ｃａｄ、ｃａｄ１１、ｃ
ａｄａｓｉ１、ｃａｅ１、ｃａｅ３、ｃａｆ、ｃａｆ１ａ、ｃａｇａ、ｃａｇｂ、ｃａｉｎ、ｃａｋ、ｃａｋ１、ｃａｌ１１、ｃａｌｂ１、ｃａｌｂ２、ｃａｌｂ３、ｃａｌｃ１、ｃａｌｃ２、ｃａｌｃａ、ｃａｌｃｂ、ｃａｌｃｒ、ｃａｌｄ１、ｃａｌｌａ、ｃａｌｍ１、ｃａｌｍ２、ｃａｌｍ３、ｃａｌｍ１１、ｃａｌｍ１３、ｃａｌｎａ、ｃａｌｎａ３、ｃａｌｎｂ、ｃａｌｎｂ１、ｃａｌｒ、ｃａｌｓ、ｃａｌｔ、ｃａｌｕ、ｃａｍ、ｃａｍｋ４、ｃａｍｋｇ、ｃａｍｌ１、ｃａｍｌｇ、ｃａｍｐ、ｃａｎ、ｃａｎｐ３、ｃａｎｘ、ｃａｐ２、ｃａｐ３、ｃａｐ３７、ｃａｐｂ、ｃａｐｇ、ｃａｐ１、ｃａｐｎ１、ｃａｐｎ２、ｃａｐｎ３、ｃａｐｎ４、ｃａｐｐａ２、ｃａｐｐｂ、ｃａｐｒ、ｃａｐｓ、ｃａｐｚａ２、ｃａｐｚｂ、ｃａｒ、ｃａｒｐ、ｃａｒｓ、ｃａｒｔ１、ｃａｓ、ｃａｓ２、ｃａｓｉ１、ｃａｓｐ１、ｃａｓｐ１０、ｃａｓｐ２、ｃａｓｐ３、ｃａｓｐ３、ｃａｓｐ４、ｃａｓｐ５、ｃａｓｐ６、ｃａｓｐ７、ｃａｓｐ８、ｃａｓｑ１、ｃａｓｑ２、ｃａｓｒ ｃａｓｔ、ｃａｔ、ｃａｔ１、ｃａｔ４、ｃａｔｆ１、ｃａｔｍ、ｃａｖ１、ｃａｖ２、ｃａｖ３、ｃｂｂｍ、ｃｂｄ、ｃｂｆａ１、ｃｂｆａ２、ｃｂｆａ２ｔ１、ｃｂｆａ３、ｃｂｆｂ、ｃｂｇ、ｃｂ１、ｃｂｌ２、ｃｂｌｎ２、ｃｂｐ、ｃｂｐ、ｃｂｐ２、ｃｂｐ６８、ｃｂｒ１、ｃｂｓ、ｃｂｔ、ｃｂｔ１、ｃｃ１０、ｃｃａ、ｃｃａ１、ｃｃａ１１、ｃｃａ１２、ｃｃｂ１１、ｃｃｃｋｒ５、ｃｃｇ１、ｃｃｇ２、ｃｃｈｌ１ａ１、ｃｃｈｌ１ａ２、ｃｃｈｌ１ａ３、ｃｃｈ１ｂ１、ｃｃｋ、ｃｃｋａｒ、ｃｃｋｂｒ、ｃｃ１、ｃｃｍ１、ｃｃｍ２、ｃｃｍ３、ｃｃｎ１、ｃｃｎａ、ｃｃｎｂ１、ｃｃｎｃ、ｃｃｎｄ１、ｃｃｎｄ２、ｃｃｎｄ３、ｃｃｎｅ、ｃｃｎｆ、ｃｃｎｇ１、ｃｃｎｈ、ｃｃｎｔ、ｃｃｎｔ１、ｃｃｏ、ｃｃｒ１０、ｃｃｒ２、ｃｃｒ３、ｃｃｒ９、ｃｃｓｐ、ｃｃｔ、ｃｃｖ、ｃｃｚｓ、ｃｄ、ｃｄ１０、ｃｄ１１ａ、ｃｄ１１ｂ、ｃｄ１１ｃ、ｃｄ１３、ｃｄ１３７、ｃｄ１４、ｃｄ１５、ｃｄ１５１、ｃｄ１５６、ｃｄ１６、ｃｄ１６４、ｃｄ１８、ｃｄ１９、ｃｄ１ａ、ｃｄ１ｂ、ｃｄ１ｃ、ｃｄ１ｄ、ｃｄ１ｅ、ｃｄ２、ｃｄ２０、ｃｄ２２、ｃｄ２３、ｃｄ２４、ｃｄ２６、ｃｄ２７、ｃｄ２７１、ｃｄ２８、ｃｄ２８１ｇ、ｃｄ２８１ｇ２、ｃｄ３０、ｃｄ３２、ｃｄ３３、ｃｄ３４、ｃｄ３６、ｃｄ３６１１、ｃｄ３６１２、ｃｄ３７、ｃｄ３８、ｃｄ３９、ｃｄ３９１１、ｃｄ３ｄ、ｃｄ３ｅ、ｃｄ３ｇ、ｃｄ３ｚ、ｃｄ４、ｃｄ４０、ｃｄ４０１ｇ、ｃｄ４１ｂ、ｃｄ４３、ｃｄ４４、ｃｄ４５、ｃｄ４６、ｃｄ４７、ｃｄ４８、ｃｄ４９ｂ、ｃｄ４９ｄ、ｃｄ５、ｃｄ５３、ｃｄ５７、ｃｄ５８、ｃｄ５９、ｃｄ５１、ｃｄ６、ｃｄ６３、ｃｄ６４、ｃｄ６８、ｃｄ６９、ｃｄ７、ｃｄ７０、ｃｄ７１、ｃｄ７２、ｃｄ７４、ｃｄ７９ａ、ｃｄ７９ｂ、ｃｄ８０、ｃｄ８１、ｃｄ８２、ｃｄ８２、ｃｄ８６、ｃｄ８ａ、ｃｄ８ｂ、ｃｄ８ｂ１、ｃｄ９、ｃｄ９４、ｃｄ９５、ｃｄ９７、ｃｄ９９、ｃｄａ、ｃｄａ１、ｃｄａ３、ｃｄａｎ１、ｃｄａｎ２、ｃｄａｎ３、ｃｄｂ２、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２０、ｃｄｃ２５ａ、ｃｄｃ２５ｂ、ｃｄｃ２５ｃ、ｃｄｃ２７、ｃｄｃ２１１、ｃｄｃ２１２、ｃｄｃ２１４、ｃｄｃ３４、ｃｄｃ４２、ｃｄｃ５１、ｃｄｃ７、ｃｄｃ７１１、ｃｄｃｄ１、ｃｄｃｄ２、ｃｄｃｄ３、ｃｄｃ１１、ｃｄｃｒｅ１、ｃｄｇ１、ｃｄｇｄ１、ｃｄｇｇ１、ｃｄｇｓ２、ｃｄｈ１、ｃｄｈ１１、ｃｄｈ１２、ｃｄｈ１３、ｃｄｈ１４、ｃｄｈ１５、ｃｄｈ１６、ｃｄｈ１６、ｃｄｈ１７、ｃｄ２、ｃｄｈ３、ｃｄｈ３、ｃｄｈ５、ｃｄｈ７、ｃｄｈ８、ｃｄｈｂ、ｃｄｈｈ、ｃｄｈｐ、ｃｄｈｓ、ｃｄｋ２、ｃｄｋ３、ｃｄｋ４、ｃｄｋ５、ｃｄｋ７、ｃｄｋ８、ｃｄｋ９、ｃｄｋｎ１、ｃｄｋｎ１ａ、ｃｄｋｎ１ｂ、ｃｄｋｎ１ｃ、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｄｋｎ２ｂ、ｃｄｋｎ２ｄ、ｃｄｋｎ３、ｃｄｋｎ４、ｃｄｌ１、ｃｄｍ、ｃｄｍｐ１、ｃｄｍｔ、ｃｄｐｘ１、ｃｄｐｘ２、ｃｄｐｘｒ、ｃｄｒ１、ｃｄｒ２、ｃｄｒ３、ｃｄｒ６２ａ、ｃｄｓｎ、ｃｄｓｐ、ｃｄｔｂ、ｃｄｗ５０、ｃｄｘ１、ｃｄｘ２、ｃｄｘ３、ｃｄｘ４、ｃｅａ、ｃｅｂｐ、ｃｅｂｐａ、ｃｅｂｐｂ、ｃｅｂｐｄ、ｃｅｂｐｅ、ｃｅｃｒ、ｃｅ１、ｃｅｌ１、ｃｅｎ１、ｃｅｎｐａ、ｃｅｎｐｂ、ｃｅｎｐｃ、ｃｅｎｐｃ１、ｃｅｎｐｅ、ｃｅｎｐｆ、ｃｅｒｄ４、ｃｅｓ、ｃｅｓ１、ｃｅｔｎ１、ｃｅｔｐ、ｃｆ、ｃｆ２ｒ、ｃｆａｇ、ｃｆａｇ、ｃｆｃ、ｃｆｄ１、ｃｆｅｏｍ１、ｃｆｅｏｍ２、ｃｆｈ、ｃｆｌ１、ｃｆｌ２、ｃｆｎｄ、ｃｆｎｓ、ｃｆｔｒ、ｃｇ１、ｃｇａ、ｃｇａｔ、ｃｇｂ、ｃｇｄ、ｃｇｆ１、ｃｇｈ、ｃｇｒｐ、ｃｇｓ２３、ｃｇｔ、ｃｇｔｈｂａ、ｃｈａｃ、ｃｈａｔ、ｃｈｃ１、ｃｈｄ１、ｃｈｄ２、ｃｈｄ３、ｃｈｄ４、ｃｈｄ５、ｃｈｄｒ、ｃｈｅ１、ｃｈｅ２、ｃｈｅｄ、ｃｈｅｋ１、ｃｈｇａ、ｃｈｇｂ、ｃｈｇｃ、ｃｈｈ、ｃｈｉ３１１、ｃｈｉｐ２８、ｃｈｉｔ、ｃｈｋ１、ｃｈｌｒ１、ｃｈｌｒ２、ｃｈｍ、ｃｈｍ１、ｃｈｎ、ｃｈｎ１、ｃｈｎ２、ｃｈｏｐ１０、ｃｈｒ、ｃｈｒ３９ａ、ｃｈｒ３９ｂ、ｃｈｒ３９ｃ、ｃｈｒｍ１、ｃｈｒｍ２、ｃｈｒｍ３、ｃｈｒｍ４、ｃｈｒｍ５、ｃｈｒｎａ１、ｃｈｒｎａ２、ｃｈｒｎａ３、ｃｈｒｎａ４、ｃｈｒｎａ５、ｃｈｒｎａ７、ｃｈｒｎｂ１、ｃｈｒｎｂ２、ｃｈｒｎｂ３、ｃｈｒｎｂ４、ｃｈｒｎｄ、ｃｈｒｎｅ、ｃｈｒｎｇ、ｃｈｒｓ、ｃｈｓ１、ｃｈｘ１０、ｃｉｉｐｘ、ｃｉｐ１、ｃｉｒｂｐ、ｃｉｓｈ、ｃｋ２ａ１、ｃｋａｐ１、ｃｋｂ、ｃｋｂｂ、ｃｋｂｅ、ｃｋｍ、ｃｋｍｍ、ｃｋｍｔ１、ｃｋｍｔ２、ｃｋｎ１、ｃｋｎ２、ｃｋｒ３、ｃｋｒ１１、ｃｋｒ１３、ｃ１、ｃｌ１００、ｃｌａ１、ｃｌａ１、ｃｌａｃ、ｃｌａｐｂ１、ｃｌａｐｍ１、ｃｌａｐｓ３、ｃｌｃ、ｃｌｃ７、ｃｌｃｋ２、ｃｌｃｎ１、ｃｌｃｎ２、ｃｌｃｎ３、ｃｌｃｎ４、ｃｌｃｎ５、ｃｌｃｎ６、ｃｌｃｎ７、ｃｌｃｎｋａ、ｃｌｃｎｋｂ、ｃｌｄ、ｃｌｄｎ３、ｃｌｄｎ５、ｃｌｇ、ｃｌｇ１、ｃｌｇ３、ｃｌｇ４ａ、ｃｌｇ４ｂ、ｃｌｉ、ｃｌｉｍ１、ｃｌｉｍ２、ｃｌｋ２、ｃｌｋ３、ｃｌｎ１、ｃｌｎ２、ｃｌｎ３、ｃｌｎ５、ｃｌｎ６、ｃｌｎ８０、ｃｌｎｓ１ａ、ｃｌｎｓ１ｂ、ｃｌｐ、ｃｌｐｐ、ｃｌｐｓ、ｃｌｔａ、ｃｌｔｂ、ｃｌｔｃ、ｃｌｔｃ１１、ｃｌｔｄ、ｃｌｔｈ、ｃｌｕ、ｃｍａ１、ｃｍａｈ、ｃｍａｒ、ｃｍｄ１、ｃｍｄ１ａ、ｃｍｄ１ｂ、ｃｍｄ１ｃ、ｃｍｄ１ｄ、ｃｍｄ１ｅ、ｃｍｄ１ｆ、ｃｍｄ３ａ、ｃｍｄｊ、ｃｍｈ１、ｃｍｈ２、ｃｍｈ３、ｃｍｈ４、ｃｍｈ６、ｃｍｋｂｒ１、ｃｍｋｂｒ２、ｃｍｋｂｒ３、ｃｍｋｂｒ５、ｃｍｋｂｒ６、ｃｍｋｂｒ７、ｃｍｋｂｒ８、ｃｍｋｂｒ９、ｃｍｋｂｒ１２、ｃｍｋｌｒ１、ｃｍｋｒ１１、ｃｍｋｒ１２、ｃｍｌ、ｃｍｍ、ｃｍｍ２、ｃｍｏａｔ、ｃｍｐ、ｃｍｐｄ１、ｃｍｐｄ２、ｃｍｐｄ２、ｃｍｐｄ３、ｃｍｐｘ１、ｃｍｔ１ａ、ｃｍｔ１ｂ、ｃｍｔ２ａ、ｃｍｔ２ｂ、ｃｍｔ２ｄ、ｃｍｔ２ｄ、ｃｍｔ４ａ、ｃｍｔ４ｂ、ｃｍｔｎｄ、ｃｍｔｘ１、ｃｍｔｘ２、ｃｎａ１、ｃｎａ２、ｃｎｂｐ１、ｃｎｃ、ｃｎｃｇ１、ｃｎｃｇ２、ｃｎｃｇ３１、ｃｎｄ、ｃｎｇ３、ｃｎｇａ１、ｃｎｇａ３、ｃｎｇｂ１、ｃｎｎ１、ｃｎｎ２、ｃｎｎ３、ｃｎｐ、ｃｎｒ１、ｃｎｓｎ、ｃｎｔｆ、ｃｎｔｆｒ、ｃｎｔｎ１、ｃｏ、ｃｏｃａ１、ｃｏｃａ２、ｃｏｃｈ、ｃｏｄ１、ｃｏｄ２、ｃｏｈ１、ｃｏｉｌ、ｃｏｌ１０ａ１、ｃｏｌ１１ａ１、ｃｏｌ１１ａ２、ｃｏｌ１２ａ１１、ｃｏｌ１３ａ１、ｃｏｌ１５ａ１、ｃｏｌ１６ａ１、ｃｏｌ１７ａ１、ｃｏｌ１８ａ１、ｃｏｌ１９ａ１、ｃｏｌ１ａ１、ｃｏｌ１ａ２、ｃｏｌ１ａｒ、ｃｏｌ２ａ１、ｃｏｌ３ａ１、ｃｏｌ４ａ１、ｃｏｌ４ａ２、ｃｏｌ４ａ３、ｃｏｌ４ａ４、ｃｏｌ４ａ５、ｃｏｌ４ａ６、ｃｏｌ５ａ１、ｃｏｌ５ａ２、ｃｏｌ６ａ１、ｃｏｌ６ａ２、ｃｏｌ６ａ３、ｃｏｌ７ａ１、ｃｏｌ８ａ１、ｃｏｌ８ａ２、ｃｏｌ９ａ１、ｃｏｌ９ａ１、ｃｏｌ９ａ２、ｃｏｌ９ａ３、ｃｏｌｑ、ｃｏｍｐ、ｃｏｍｔ、ｃｏｐｅｂ、ｃｏｐｔ１、ｃｏｐｔ２、ｃｏｒｄ１、ｃｏｒｄ２、ｃｏｒｄ５、ｃｏｒｄ６、ｃｏｒｔ、ｃｏｔ、ｃｏｘ１０、ｃｏｘ４、ｃｏｘ５ｂ、ｃｏｘ６ａ１、ｃｏｘ６ｂ、ｃｏｘ７ａ１、ｃｏｘ７ａ２、ｃｏｘ７ａ３、ｃｏｘ７ａｍ、ｃｏｘ８、ｃｐ、ｃｐ１０７、ｃｐ１１５、ｃｐ２０、ｃｐ４７、ｃｐ４９、ｃｐａ１、ｃｐａ３、ｃｐｂ２、ｃｐｂ２、ｃｐｄ、ｃｐｅ、ｃｐｅｔｒ２、ｃｐｍ、ｃｐｎ、ｃｐｎ１、ｃｐｎ２、ｃｐｏ、ｃｐｐ、ｃｐｐ３２、ｃｐｐ３２、ｃｐｐｉ、ｃｐｓ１、ｃｐｓｂ、ｃｐｓｄ、ｃｐｔ１ａ、ｃｐｔ１ｂ、ｃｐｔ２、ｃｐｕ、ｃｐｘ、ｃｐｘ、ｃｐｘｄ、ｃｒ１、ｃｒ２、ｃｒ３ａ、ｃｒａｂｐ１、ｃｒａｂｐ２、ｃｒａｐｂ、ｃｒａｒｆ、ｃｒａｔ、ｃｒｂｐ１、ｃｒｂｐ２、ｃｒｄ、ｃｒｄ１、ｃｒｅｂ１、ｃｒｅｂ２、ｃｒｅｂｂｐ、ｃｒｅｂ１１、ｃｒｅｍ、ｃｒｆｂ４、ｃｒｆｒ２、ｃｒｈ、ｃｒｈｂｐ、ｃｒｈｒ、ｃｒｈｒ１、ｃｒｈｒ２、ｃｒｉｐ、ｃｒｋ、ｃｒｋ１、ｃｒｍ１、ｃｒｍｐ１、ｃｒｍｐ２、ｃｒｐ、ｃｒｐ１、ｃｒｓ、ｃｒｓ１ｃ、ｃｒｓ２、ｃｒｓ３、ｃｒｓａ、ｃｒｔ、ｃｒｔｌ１、ｃｒｔｍ、ｃｒｘ、ｃｒｙ１、ｃｒｙ２、ｃｒｙａ１、ｃｒｙａ２、ｃｒｙａａ、ｃｒｙａｂ、ｃｒｙｂ１、ｃｒｙｂ２、ｃｒｙｂ３、ｃｒｙｂａ１、ｃｒｙｂａ２、ｃｒｙｂａ４、ｃｒｙｂｂ１、ｃｒｙｂｂ２、ｃｒｙｂｂ３、ｃｒｙｇ１、ｃｒｙｇ２、ｃｒｙｇ３、ｃｒｙｇ４、ｃｒｙｇ８、ｃｒｙｇ＠、ｃｒｙｇａ、ｃｒｙｇｂ、ｃｒｙｇｃ、ｃｒｙｇｄ、ｃｒｙｇｓ、ｃｒｙｍ、ｃｒｙｚ、ｃｓ、ｃｓａ、ｃｓｂ、ｃｓｂｐ１、ｃｓｃｉ、ｃｓｄ、ｃｓｄ２、ｃｓｄａ、ｃｓｅ、ｃｓｅ１１、ｃｓｆ１、ｃｓｆ１ｒ、ｃｓｆ２、ｃｓｆ２ｒａ、ｃｓｆ２ｒｂ、ｃｓｆ２ｒｙ、ｃｓｆ３、ｃｓｆ３ｒ、ｃｓｈ１、ｃｓｈ２、ｃｓｋ、ｃｓｍｆ、ｃｓｎ１、ｃｓｎ１０、ｃｓｎ２、ｃｓｎ３、ｃｓｎｂ１、ｃｓｎｂ２、ｃｓｎｂ３、ｃｓｎｋ１ａ１、ｃｓｎｋ１ｄ、ｃｓｎｋ１ｅ、ｃｓｎｋ１ｇ２、ｃｓｎｋ２ａ１、ｃｓｎｋ２ａ２、ｃｓｎｋ２ｂ、ｃｓｎｕ３、ｃｓｏ、ｃｓｐｂ、ｃｓｐｇ１、ｃｓｐｇ２、ｃｓｐｇ３、ｃｓｒ、ｃｓｒｂ、ｃｓｒｐ、ｃｓｒｐ１、ｃｓｒｐ２、ｃｓｔ１、ｃｓｔ１、ｃｓｔ２、ｃｓｔ３、ｃｓｔ４、ｃｓｔ４、ｃｓｔ５、ｃｓｔ６、ｃｓｔａ、ｃｓｔｂ、ｃｓｘ、ｃｔ２、ｃｔａａ１、ｃｔａａ２、ｃｔａｇ、ｃｔｂ、ｃｔｂｐ１、ｃｔｂｐ２、ｃｔｇｆ、ｃｔｈ、ｃｔｈｍ、ｃｔｋ、ｃｔｌａ１、ｃｔｌａ３、ｃｔｌａ４、ｃｔｌａ８、ｃｔｍ、ｃｔｎｎａ１、ｃｔｎｎａ２、ｃｔｎｎｂ１、ｃｔｎｎｄ、ｃｔｎｎｄ１、ｃｔｎｒ、ｃｔｎｓ、ｃｔｐ、ｃｔｐｃｔ、ｃｔｐｓ、ｃｔｒ１、ｃｔｒ２、ｃｔｒｂ１、ｃｔｒ１、ｃｔｓａ、ｃｔｓｂ、ｃｔｓｃ、ｃｔｓｄ、ｃｔｓｅ、ｃｔｓｇ、ｃｔｓｇ１２、ｃｔｓｈ、ｃｔｓｋ、ｃｔｓ１、ｃｔｓｓ、ｃｔｓｗ、ｃｔｓｚ、ｃｔｘ、ｃｕｂｎ、ｃｕｌ３、ｃｕｌ４ｂ、ｃｕｌ５、ｃｕｔｌ１、ｃｖａｐ、ｃｖｄ１、ｃｖｌ、ｃｘ２６、ｃｘ３１、ｃｘ３２、ｃｘ３７、ｃｘ４０、ｃｘ４３、ｃｘ４６、ｃｘ５０、ｃｘｂ３ｓ、ｃｘｃｒ４、ｃｘｏｒｆ４、ｃｙｂ５、ｃｙｂ５６１、ｃｙｂａ、ｃｙｂｂ、ｃｙｃ１、ｃｙｋ４、ｃｙｌｄ１、ｃｙｍｐ、ｃｙｐ１、ｃｙｐ１１ａ、ｃｙｐ１１ｂ１、ｃｙｐ１１ｂ２、ｃｙｐ１７、ｃｙｐ１９、ｃｙｐ１ａ１、ｃｙｐ１ａ２、ｃｙｐ１ｂ１、ｃｙｐ２１、ｃｙｐ２４、ｃｙｐ２７、ｃｙｐ２７ａ１、ｃｙｐ２７ｂ１、ｃｙｐ２ａ、ｃｙｐ２ａ３、ｃｙｐ２ａ６、ｃｙｐ２ｂ、ｃｙｐ２ｃ、ｃｙｐ２ｃ１９、ｃｙｐ２ｃ９、ｃｙｐ２ｄ、ｃｙｐ２ｄ＠、ｃｙｐ２ｅ、ｃｙｐ２ｅ１、ｃｙｐ２ｆ１、ｃｙｐ２ｊ２、ｃｙｐ３ａ４、ｃｙｐ４ａ１１、ｃｙｐ４ｂ１、ｃｙｐ５１、ｃｙｐ７、ｃｙｐ７ａ１、ｃｙｒ６１、ｃｙｒｎ１、ｃｙｒｎ２、ｃｚｐ３、ｄ１０ｓ１０５ｅ、ｄ１０ｓ１７０、ｄ１０ｓ１７０、ｄ１１ｓ３０２ｅ、ｄ１１ｓ６３６、ｄ１１ｓ８１３ｅ、ｄ１１ｓ８３３ｅ、ｄ１２ｓ２４８９ｅ、ｄ１２ｓ５３ｅ、ｄ１３ｓ１０５６ｅ、ｄ１３ｓ２５、ｄ１４ｓ４６ｅ、ｄ１５ｓ１２、ｄ１５ｓ２２６ｅ、ｄ１５ｓ２２７ｅ、ｄ１６ｓ２５３
１ｅ、ｄ１６ｓ４６９ｅ、ｄ１７ｓ１３６ｅ、ｄ１７ｓ８１１ｅ、ｄ１８ｓ８９２ｅ、ｄ１９ｓ２０４、ｄ１９ｓ３８１ｅ、ｄ１ｓ１１１、ｄ１ｓ１５５ｅ、ｄ１ｓ１６６ｅ、ｄ１ｓ１７３３ｅ、ｄ１ｓ２２２３ｅ、ｄ１ｓ６１、ｄ２ｈ、ｄ２ｓ２０１ｅ、ｄ２ｓ４４８、ｄ２ｓ４８８ｅ、ｄ２ｓ６９ｅ、ｄ３ｓ１２３１ｅ、ｄ３ｓ１３１９ｅ、ｄ３ｓ４８ｅ、ｄ４、ｄ４ｓ９０、ｄ５ｓ１７０８、ｄ５ｓ３４６、ｄ６、ｄ６ｓ１１０１、ｄ６ｓ２０７ｅ、ｄ６ｓ２２４５ｅ、ｄ６ｓ２２８ｅ、ｄ６ｓ２２９ｅ、ｄ６ｓ２３０ｅ、ｄ６ｓ２３１ｅ、ｄ６ｓ５１ｅ、ｄ６ｓ５２ｅ、ｄ６ｓ５４ｅ、ｄ６ｓ８１ｅ、ｄ６ｓ８２ｅ、ｄ７ｓ４３７、ｄ８ｓ２２９８ｅ、ｄ９ｓ４６ｅ、ｄａ１、ｄａ２ｂ、ｄａｂ２、ｄａｃ、ｄａｄ１、ｄａｆ、ｄａｇ、ｄａｇ１、ｄａｇ２、ｄａｇｋ１、ｄａｇｋ４、ｄａｍ１０、ｄａｍ６、ｄａｍｏｘ、ｄａｎ、ｄａｏ、ｄａｐ、ｄａｐ３、ｄａｐ５、ｄａｐｋ１、ｄａｒ、ｄａｔ１、ｄａｘ１、ｄａｘｘ、ｄａｚ、ｄａｚｈ、ｄａｚ１、ｄｂａ、ｄｂｃｃｒ１、ｄｂｃｎ、ｄｂｈ、ｄｂｉ、ｄｂｉ、ｄｂ１、ｄｂｍ、ｄｂｎ１、ｄｂｐ、ｄｂｐ、ｄｂｐ１、ｄｂｐ２、ｄｂｐａ、ｄｂｔ、ｄｂｘ、ｄｂｙ、ｄｃｃ、ｄｃｅ、ｄｃｉ、ｄｃｋ、ｄｃｎ、ｄｃｏｈ、ｄｃｐ１、ｄｃｒ、ｄｃｒ３、ｄｃｔ、ｄｃｔｎ１、ｄｃｘ、ｄｄｂ１、ｄｄｂ２、ｄｄｃ、ｄｄｈ１、ｄｄｈ２、ｄｄｉｔ１、ｄｄｉｔ３、ｄｄｏｓｔ、ｄｄｐ、ｄｄｐａｃ、ｄｄｒ、ｄｄｘ１、ｄｄｘ１０、ｄｄｘ１１、ｄｄｘ１２、ｄｄｘ１５、ｄｄｘ１６、ｄｄｘ２ａ、ｄｄｘ３、ｄｄｘ５、ｄｄｘ６、ｄｄｘ９、ｄｅｃ、ｄｅｃｒ、ｄｅｆ１、ｄｅｆ４、ｄｅｆ５、ｄｅｆ６、ｄｅｆａ１、ｄｅｆａ４、ｄｅｆａ５、ｄｅｆａ６、ｄｅｆｂ１、ｄｅｆｂ２、ｄｅｋ、ｄｅｎｎ、ｄｅｎｔｓ、ｄｅｐ１、ｄｅｒ１２、ｄｅｓ、ｄｆｆ１、ｄｆｆａ、ｄｆｆｒｘ、ｄｆｆｒｙ、ｄｆｎ１、ｄｆｎ２、ｄｆｎ３、ｄｆｎ４、ｄｆｎ６、ｄｆｎａ１、ｄｆｎａ１０、ｄｆｎａ１１、ｄｆｎａ１２、ｄｆｎａ１３、ｄｆｎａ２、ｄｆｎａ２、ｄｆｎａ４、ｄｆｎａ５、ｄｆｎａ６、ｄｆｎａ７、ｄｆｎａ８、ｄｆｎａ９、ｄｆｎｂ１、ｄｆｎｂ１２、ｄｆｎｂ１３、ｄｆｎｂ１４、ｄｆｎｂ１６、ｄｆｎｂ１７、ｄｆｎｂ１８、ｄｆｎｂ２、ｄｆｎｂ３、ｄｆｎｂ４、ｄｆｎｂ５、ｄｆｎｂ６、ｄｆｎｂ７、ｄｆｎｂ８、ｄｆｎｂ９、ｄｇｃｒ、ｄｇｃｒ２、ｄｇｃｒ２、ｄｇｃｒ６、ｄｇｉ１、ｄｇｋａ、ｄｇｋｑ、ｄｇｐｔ、ｄｇｐｔ、ｄｇｓ、ｄｇｓ２、ｄｇｓｉ、ｄｇｕ、ｄｈｃ２、ｄｈｃｒ７、ｄｈｆｒ、ｄｈｌａｇ、ｄｈｐ、ｄｈｐｒ、ｄｈｐｓ、ｄｈｒｄ、ｄｈｔｒ、ｄｉ、ｄｉ１、ｄｉａ、ｄｉａ１、ｄｉａ２、ｄｉａ４、ｄｉａｐｈ１、ｄｉａｐｈ２、ｄｉｆ２、ｄｉｆｆ６、ｄｉｐｉ、ｄｉｒ、ｄｋｃ、ｄｋｃ１、ｄｌｃ１、ｄｌｄ、ｄｌｇ１、ｄｌｇ２、ｄｌｇ３、ｄｌｇ４、ｄｌｓｔ、ｄｌｘ１、ｄｌｘ２、ｄｌｘ２、ｄｌ３、ｄｌｘ４、ｄｌｘ５、ｄｌｘ６、ｄｌｘ７、ｄｌｘ８、ｄｍ、ｄｍ２、ｄｍａｈｐ、ｄｍｂｔ１、ｄｍｄ、ｄｍｄａ１、ｄｍｄ１、ｄｍｈ、ｄｍｋ、ｄｍｐ１、ｄｍｐｋ、ｄｍｓｆｈ、ｄｍｔ、ｄｍｔ１、ｄｍｔｎ、ｄｎａ２１、ｄｎａｈ、ｄｎａｈ１、ｄｎａｈ１１、ｄｎａｈ１２、ｄｎａｈ２、ｄｎａｈｃ１、ｄｎａｈｃ１１、ｄｎａｈｃ２、ｄｎａｈｃ３、ｄｎａｓｅ１、ｄｎａｓｅ１１１、ｄｎａｓｅ１１３、ｄｎａｓｅ２、ｄｎｃｈ２、ｄｎｃ１、ｄｎｃｍ、ｄｎｅｃ１、ｄｎｅ１１、ｄｎ１、ｄｎ１１、ｄｎ１１１、ｄｎｍ１、ｄｎｍｔ１、ｄｎｍｔ２、ｄｎｐｋ１、ｄｎｓ、ｄｎｔｔ、ｄｏ、ｄｏｃ１、ｄｏｃ２、ｄｏｃｋ１、ｄｏｃｋ１８０、ｄｏｄ、ｄｏｋ１、ｄｏｍ、ｄｐ１、ｄｐ１、ｄｐ２、ｄｐ３、ｄｐａｇｔ２、ｄｐｃ４、ｐｄ、ｄｐｄｅ１、ｄｐｄｅ２、ｄｐｄｅ３、ｄｐｄｅ４、ｄｐｅｐ１、ｄｐｈ２１２、ｄｐｐ、ｄｐｐ４、ｄｐｐ６、ｄｐｔ、ｄｐｙｄ、ｄｐｙｓ、ｄｐｙｓ１１、ｄｐｙｓ１２、ｄｒ１、ｄｒ３、ｄｒ３１ｇ、ｄｒ５、ｄｒａ、ｄｒａｄ、ｄｒａｄａ、ｄｒａ１、ｄｒｄ１、ｄｒｄ１ｂ、ｄｒｄ１ｂ、ｄｒｄ１１２、ｄｒｄ２、ｄｒｄ３、ｄｒｄ４、ｄｒｄ５、ｄｒｉ１１、ｄｒｐ１、ｄｒｐ１、ｄｒｐ２、ｄｒｐ２、ｄｒｐ３、ｄｒｐ１ａ、ｄｒｔ、ｄｓｃ１、ｄｓｃ２、ｄｓｃ３、ｄｓｃ３、ｄｓｃ４、ｄｓｃａｍ、ｄｓｃｒ、ｄｓｇ１、ｄｓｇ２、ｄｓｇ３、ｄｓｐ、ｄｓｐｇ３、ｄｓｐｐ、ｄｓｓ、ｄｓｓ１、ｄｔｄ、ｄｔｄｐ２、ｄｔｄｓｔ、ｄｔｎａ、ｄｔｒ、ｄｔｓ、ｄｕｓ、ｄｕｓｐ１、ｄｕｓｐ１１、ｄｕｓｐ２、ｄｕｓｐ３、ｄｕｓｐ４、ｄｕｓｐ５、ｄｕｓｐ６、ｄｕｓｐ７、ｄｕｓｐ８、ｄｕｔ、ｄｖ１、ｄｖ１１、ｄｖ１１、ｄｖ１３、ｄｘｆ６８ｓ１ｅ、ｄｘｓ１２７２ｅ、ｄｘｓ１２８、ｄｘｓ１２８３ｅ、ｄｘｓ４２３ｅ、ｄｘｓ４３５ｅ、ｄｘｓ５２２ｅ、ｄｘｓ６４８、ｄｘｓ７０７、ｄｘｓ８２３７ｅ、ｄｘｙｓ１５５ｅ、ｄｙｌｘ２、ｄｙｒｋ、ｄｙｓ、ｄｙｓｆ、ｄｙｔ１、ｄｙｔ３、ｄｙｔ５、ｄｙｔ６、ｄｙｔ７、ｄｙｔ８、ｄｙｔ９、ｄｙｘ１、ｄｙｘ２、ｅ１１ｓ、ｅ１４、ｅ１ｂ、ｅ２ａ、ｅ２ｆ１、ｅ２ｆ２、ｅ２ｆ３、ｅ２ｆ４、ｅ３、ｅ４ｆ、ｅ４ｆ１、ｅ４ｔｆ１ａ、ｅ４ｔｆ１ｂ、ｅａ１、ｅａａｃ１、ｅａａｔ１、ｅａａｔ２、ｅａｃ、ｅａｄ、ｅａｇ、ｅａｐ、ｅａｒｌ、ｅａｒ２、ｅａｒ３、ｅｂａｆ、ｅｂｆ、ｅｂｉ１、ｅｂｍ、ｅｂｎ１、ｅｂｎ１、ｅｂｎ２、ｅｂｒ２ａ、ｅｂｓ１、ｅｂｖｍ１、ｅｂｖｓ１、ｅｃ１、ｅｃａ１、ｅｃｂ２、ｅｃｅ１、ｅｃｇｆ１、ｅｃｈ１、ｅｃｈｓ１、ｅｃｋ、ｅｃｍ１、ｅｃｐ、ｅｃｓ１、ｅｃｔ２、ｅｄ１、ｅｄ２、ｅｄ３、ｅｄ４、ｅｄａ、ｅｄａ３、ｅｄｄｒ１、ｅｄｇ３、ｅｄｇ６、ｅｄｈ、ｅｄｈ１７ｂ２、ｅｄｈ１７ｂ２、ｅｄｈ１７ｂ３、ｅｄｍ１、ｅｄｍ２、ｅｄｍ３、ｅｄｍｄ、ｅｄｍｄ２、ｅｄｎ、ｅｄｎ１、ｅｄｎ２、ｅｄｎ３、ｅｄｎｒａ、ｅｄｎｒｂ、ｅｅｃ１、ｅｅｃ２、ｅｅｆ１ａ１、ｅｅｆ１ａ２、ｅｅｆ１ｂ１、ｅｅｆ１ｂ２、ｅｅｆ１ｂ３、ｅｅｆ１ｂ４、ｅｅｆ２、ｅｅｇ１、ｅｅｇｖ１、ｅｅｋ、ｅｅｎ、ｅｆ１ａ、ｅｆ２、ｅｆｅ２、ｅｆｅｍｐ１、ｅｆｌ６、ｅｆｍｒ、ｅｆｎａ１、ｅｆｎａ３、ｅｆｎａ４、ｅｆｎｂ１、ｅｆｎｂ２、ｅｆｎｂ３、ｅｆｐ、ｅｆｔｕ、ｅｇｆ、ｅｇｆｒ、ｅｇｉ、ｅｇｒ１、ｅｇｒ２、ｅｇｒ３、ｅｇｒ４、ｅｈｈａｄｈ、ｅｈｏｃ１、ｅｉ、ｅｉｆ１ａ、ｅｉｆ２ｇ Ａ、ｅｉｆ２ｓ３ Ａ、ｅｉｆ３ｓ１０、ｅｉｆ３ｓ６、ｅｉｆ４ａ１、ｅｉｆ４ａ２、ｅｉｆ４ｃ、ｅｉｆ４ｅ、ｅｉｆ４ｅｂｐ１、ｅｉｆ４ｅ２、ｅｉｆ４ｅ１１、ｅｉｆ４ｅ１２、ｅｉｆ４ｇ、ｅｉｆ４ｇ１、ｅｉｆ４ｇ２、ｅｉｆ５ａ、ｅｊｍ１、ｅｌ１、ｅｌａ１、ｅｌａ２、ｅｌａｍ１、ｅｌａｎｈ２、ｅｌａｖ１１、ｅｌａｖ１２、ｅｌａｖ１４、ｅｌｃ、ｅｌｅ１、ｅｌｆ３、ｅｌｋ１、ｅｌｋ２、ｅｌｋ３、ｅｌｋ４、ｅｌ１、ｅｌｎ、ｅｍ９、ｅｍａｐ、ｅｍａｐ１、ｅｍｄ、ｅｍｄ２、ｅｍｋ１、ｅｍｐ１、ｅｍｐ５５、ｅｍｒ１、ｅｍｓ１、ｅｍｔ、ｅｍｔｂ、ｅｍｘ１、ｅｍｘ２、ｅｎ１、ｅｎ２、ｅｎａ７８、ｅｎｄ、ｅｎｄｏｇ、ｅｎｆｌ２、ｅｎｇ、ｅｎ１、ｅｎｏ１、ｅｎｏ２、ｅｎｏ３、ｅｎｐｅｐ、ｅｎｔ１、ｅｎｔｋ、ｅｎｕｒ１、ｅｎｕｒ２、ｅｎｘ２、ｅｏｓ、ｅｐ３、ｅｐ３００、ｅｐａ、ｅｐｂ３、ｅｐｂ３１１、ｅｐｂ４１、ｅｐｂ４１１２、ｅｐｂ４２、ｅｐｂ４９、ｅｐｂ７２、ｅｐｈａ１、ｅｐｈａ２、ｅｐｈａ３、ｅｐｈａ８、ｅｐｈｂ１、ｅｐｈｂ２、ｅｐｈｂ３、ｅｐｈｂ４、ｅｐｈｂ６、ｅｐｈｔ１、ｅｐｈｔ２、ｅｐｈｔ３、ｅｐｈｘ１、ｅｐｈｘ２、ｅｐｉｍ、ｅｐｌｇ１、ｅｐｌｇ２、ｅｐｌｇ３、ｅｐｌｇ４、ｅｐｌｇ５、ｅｐｌｇ８、ｅｐｍ１、ｅｐｍ２、ｅｐｍ２ａ、ｅｐｍｒ、ｅｐｏ、ｅｐｏｒ、ｅｐｐｋ、ｅｐｒｓ、ｅｐｓ１５、ｅｐｓ８、ｅｐｔ、ｅｒｂａ１、ｅｒｂａ２、ｅｒｂａ１２、ｅｒｂａ１３、ｅｒｂｂ２、ｅｒｂｂ３、ｅｒｂｂ４、ｅｒｃ５５、ｅｒｃｃ１、ｅｒｃｃ２、ｅｒｃｃ３、ｅｒｃｃ４、ｅｒｃｃ５、ｅｒｃｃ６、ｅｒｃｍ１、ｅｒｄａ１、ｅｒｆ１、ｅｒｇ、ｅｒｇ３、ｅｒｇｉｃ５３、ｅｒｈ、ｅｒｋ、ｅｒｋ１、ｅｒｋ２、ｅｒｋ３、ｅｒｍ、ｅｒｐ１１、ｅｒｖ１、ｅｒｖ１、ｅｒｖ３、ｅｒｖｒ、ｅｒｖｔ１、ｅｒｖｔ２、ｅｒｖｔ３、ｅｒｖｔ４、ｅｒｖｔ５、ｅｒｙｆ１、ｅｓ１、ｅｓ１３０、ｅｓａ、ｅｓａ１、ｅｓａ４、ｅｓａｔ、ｅｓｂ３、ｅｓｄ、ｅｓｇ、ｅｓｒ、ｅｓｒ１、ｅｓｒ２、ｅｓｒ１１、ｅｓｒ１２、ｅｓｒｒａ、ｅｓｒｒｂ、ｅｓｒｒｇ、ｅｓｓ１、ｅｓｔ、ｅｓｔ、ｅｓｔ２、ｅｓｔ２５２６３、ｅｓｘ、ｅｔｆａ、ｅｔｆｂ、ｅｔｆｄｈ、ｅｔｋ１、ｅｔｋ２、ｅｔｍ１、ｅｔｍ２、ｅｔｏ、ｅｔｓ１、ｅｔｓ２、ｅｔｖ１、ｅｔｖ３、ｅｔｖ４、ｅｔｖ５、ｅｔｖ６、ｅｖｃ、ｅｖｃ１、ｅｖｄａ、ｅｖｄｂ、ｅｖｉ１、ｅｖｉ２、ｅｖｉ２ａ、ｅｖｉ２ｂ、ｅｖｐ１、ｅｖｒ１、ｅｖｘ１、ｅｖｘ２、ｅｗｓ、ｅｗｓｒ１、ｅｘｌｍ１、ｅｘｔ１、ｅｘｔ２、ｅｘｔ３、ｅｘｔ１１、ｅｘｔ１２、ｅｙａ１、ｅｙａ２、ｅｙａ３、ｅｙｃ１１、ｅｙｃ１３、ｅｚｈ１、ｅｚｈ１、ｅｚｈ２、ｆ１０、ｆ１１、ｆ１２、ｆ１３ａ、ｆ１３ａ１、ｆ１３ｂ、ｆ２、ｆ２ｒ、ｆ２ｒｌ２、ｆ２ｒｌ３、ｆ３、ｆ５、ｆ５ｆ８ｄ、ｆ７、ｆ７ｅ、ｆ７ｒ、ｆ８ａ、ｆ８ｂ、ｆ８ｃ、ｆ８ｖｗｆ、ｆ９、ｆａ、ｆａ１、ｆａａ、ｆａｂｐ１、ｆａｂｐ２、ｆａｂｐ３、ｆａｂｐ４、ｆａｂｐ６、ｆａｃ１、ｆａｃａ、ｆａｃｃ、ｆａｃｄ、ｆａｃｅ、ｆａｃ１１、ｆａｃ１２、ｆａｃ１３、ｆａｃ１４、ｆａｃｖ１１、ｆａｄ、ｆａｄｄ、ｆａｄｋ、ｆａｈ、ｆａｋ２、ｆａｌｄｈ、ｆａｌ１３９、ｆａｌｚ、ｆａｎｃａ、ｆａｎｃｃ、ｆａｎｃｄ、ｆａｎｃｅ、ｆａｎｃｇ、ｆａｐ、ｆａｐａ、ｆａｒｒ、ｆａｓ、ｆａｓ１、ｆａｓｎ、ｆａｓｔ１、ｆａｔ、ｆａｕ、ｆｂｌｎ１、ｆｂｌｎ２、ｆｂｎ１、ｆｂｎ２、ｆｂｎ１、ｆｂｐ１、ｆｃａｒ、ｆｃｃ１、ｆｃｅ、ｆｃｅ２、ｆｃｅｒ１ａ、ｆｃｅｒ１ｂ、ｆｃｅｒ１ｇ、ｆｃｅｒ２、ｆｃｇｒ１ａ、ｆｃｇｒ１ｂ、ｆｃｇｒ１ｃ、ｆｃｇｒ２ａ、ｆｃｇｒ３ａ、ｆｃｇｒｔ、ｆｃｍｄ、ｆｃｎ１、ｆｃｎ２、ｆｃｐ、ｆｃｐ１、ｆｃｐｘ、ｆｃｔ３ａ、ｆｄｃ、ｆｄｆｔ１、ｆｄｈ、ｆｄｐｓ１１、ｆｄｐｓ１２、ｆｄｐｓ１３、ｆｄｐｓ１４、ｆｄｐｓ１５、ｆｄｘ１、ｆｄｘｒ、ｆｅ６５、ｆｅ６５１１、ｆｅａ、ｆｅｂ１、ｆｅｂ２、ｆｅｃｂ、ｆｅｃｈ、ｆｅｎ１、ｆｅｏ、ｆｅｏｍ、ｆｅｏｍ１、ｆｅｏｍ２、ｆｅｒ、ｆｅｓ、ｆｅｔ１、ｆｅｖｒ、ｆｆｍ、ｆｇａ、ｆｇａｒａｔ、ｆｇｂ、ｆｇｃ＠、ｆｇｄ１、ｆｇｄｙ、ｆｇｆ１、ｆｇｆ１０、ｆｇｆ１１、ｆｇｆ１２、ｆｇｆ１３、ｆｇｆ１４、ｆｇｆ２、ｆｇｆ２、ｆｇｆ３、ｆｇｆ４、ｆｇｆ５、ｆｇｆ６、ｆｇｆ７、ｆｇｆ８、ｆａｆ９、ｆｇｆａ、ｆｇｆｂ、ｆｇｆｒ１、ｆｇｆｒ２、ｆｇｆｒ３、ｆｇｆｒ４、ｆｇｇ、ｆｇｒ、ｆｇｓ１、ｆｈ、ｆｈ、ｆｈ３、ｆｈｃ、ｆｎｆ１、ｆｈｆ３、ｆｈｆ４、ｆｈｈ２、ｆｈｉｔ、ｆｈ１１、ｆｈ１２、ｆｈｒ２、ｆｉｃ１、ｆｉｇｆ、ｆｉｈ、ｆｉｍ、ｆｉｍ１、ｆｉｍ３、ｆｉｍｇ、ｆｋｂｐ１２、ｆｋｂｐ１ａ、ｆｋｂｐ２、ｆｋｈ２、ｆｋｈ１１、ｆｋｈ１１０、ｆｋｈ１１２、ｆｋｈ１１５、ｆｋｈ１１６、ｆｋｈ１１７、ｆｋｈ１２、ｆｋｈ１５、ｆｋｈ１６、ｆｋｈ１７、ｆｋｈ１８、ｆｋｈ１９、ｆｋｈｒ、ｆｋｈｒ１１、ｆｌｇ、ｆｌｉ１、ｆｌｉｉ、ｆｌｎ１、ｆｌｎ２、ｆｌｎａ、ｆｌｎｂ、ｆｌｎｍｓ、ｆｌｏｔ２、ｆｌｔ１、ｆｌｔ２、ｆｌｔ３、ｆｌｔ４、ｆｍｆ、ｆｍｎ、ｆｍｏ１、ｆｍｏ２、ｆｍｏ３、ｆｍｏｄ、ｆｍｒ１、ｆｍｒ２、ｆｍｓ、ｆｌ１、ｆｎ１２、ｆｎｒａ、ｆｎｒｂ、ｆｎｒｂ１、ｆｎｔａ、ｆｎｔｂ、ｆｏｌｈ、ｆｏｌｈ１、ｆｏｌｒ１、ｆｏｌｒ２、ｆｏｌｔ、ｆｏｓ、ｆｏｓｂ、ｆｏｓ１１、ｆｏｓ１２、ｆｐａｈ、ｆｐｃ、ｆｐｄ１、ｆｐｄｍｍ、ｆｐｆ、ｆｐｇｓ、ｆｐ１、ｆｐｐ、ｆｐｒ１、ｆｐｒｈ１、ｆｐｒｈ２、ｆｐｒ１１、ｆｐｒ１２、ｆｐｒｐ、ｆｐｓ１２、ｆｐｓ１３、ｆｐｓ１４、ｆｐｓ１５、ｆｒ、ｆｒａｐ１、ｆｒａｘａ、ｆｒａｘｅ、ｆｒａｘｆ、ｆｒｄａ、ｆｒｅａｃ２、ｆ
ｒｅａｃ６、ｆｒｅａｃ９、ｆｒｇ１、ｆｒｐ１、ｆｒｖ１、ｆｒｖ２、ｆｒｖ３、ｆｓｇ１、ｆｓｇｓ、ｆｓｈｂ、ｆｓｈｄ１ａ、ｆｓｈｍｄ１ａ、ｆｓｈｐｒｈ１、ｆｓｈｒ、ｆｓｓｖ、ｆｔｈ１、ｆｔｈ１６、ｆｔ１、ｆｔｚ１、ｆｔｚｆ１、ｆｕｃａ１、ｆｕｃａ２、ｆｕｒ、ｆｕｓ、ｆｕｓｅ、ｆｕｔ１、ｆｕｔ２、ｆｕｔ３、ｆｕｔ４、ｆｕｔ５、ｆｕｔ６、ｆｕｔ７、ｆｕｔ８、ｆｖｔ１、ｆｘｒ１、ｆｘｙ、ｆｙ、ｆｙｎ、ｆｚｄ１、ｆｚｄ２、ｆｚｄ３、ｆｚｄ５、ｆｚｄ６、ｆｚｄ７、ｆｚｒ、ｇ０ｓ８、ｇ１０ｐ１、ｇ１０ｐ２、ｇ１７、ｇ１７ｐ１、ｇ１９ｐ１、ｇ１ｐ１、ｇ１ｐ２、ｇ１ｐ３、ｇ２２ｐ１、ｇ６ｐｃ、ｇ６ｐｄ、ｇ６ｐｄ１、ｇ６ｐｄ１、ｇ６ｐｔ、ｇ６ｐｔ１、ｇ６ｓ、ｇ７ｐ１、ｇａ２、ｇａａ、ｇａｂａｔｒ、ｇａｂｐａ、ｇａｂｐｂ１、ｇａｂｒａ１、ｇａｂｒａ２、ｇａｂｒａ３、ｇａｂｒａ４、ｇａｂｒａ５、ｇａｂｒａ６、ｇａｂｒｂ１、ｇａｂｒｂ２、ｇａｂｒｂ３、ｇａｂｒｄ、ｇａｂｒｅ、ｇａｂｒｇ１、ｇａｂｒｇ２、ｇａｂｒｇ３、ｇａｂｒｒ１、ｇａｂｒｒ２、ｇａｄ１、ｇａｄ２、ｇａｄ３、ｇａｄｄ１５３、ｇａｄｄ４５、ｇａｋ、ｇａ１、ｇａｌｂｐ、ｇａｌｃ、ｇａｌｅ、ｇａｌｇｔ、ｇａｌｋ１、ｇａｌｋ２、ｇａｌｎ、ｇａｌｎａｃｔ、ｇａｌｎｒ、ｇａｌｎｒ１、ｇａｌｎｓ、ｇａｌｎｔ１、ｇａｌｎｔ２、ｇａｌｎｔ３、ｇａｌｒ１、ｇａｌｔ、ｇａｎ、ｇａｎ１、ｇａｎａｂ、ｇａｎｃ、ｇａｐ、ｇａｐ１ｍ、ｇａｐ４３、ｇａｐｄ、ｇａｒ２２、ｇａｒｐ、ｇａｒｓ、ｇａｒｔ、ｇａｓ、ｇａｓ１、ｇａｓ２、ｇａｓ４１、ｇａｓ６、ｇａｓ７、ｇａｓｒ、ｇａｓｔ、ｇａｔａ１、ｇａｔａ２、ｇａｔａ３、ｇａｔａ４、ｇａｔａ６、ｇａｙ１、ｇｂａ、ｇｂａｓ、ｇｂｂｂ１、ｇｂｂｂ２、ｇｂｅ１、ｇｂｐ１、ｇｂｘ２、ｇｃ、ｇｃａｐ、ｇｃａｐ２、ｇｃｄｈ、ｇｃｆ１、ｇｃｆ２、ｇｃｆｘ、ｇｃｇ、ｇｃｇｒ、ｇｃｈ１、ｇｃｋ、ｇｃｋｒ、ｇｃｎ５１１、ｇｃｎ５１２、ｇｃｎｆ、ｇｃｎｔ１、ｇｃｎｔ２、ｇｃｐ、ｇｃｐ２、ｇｃｓ、ｇｃｓ１、ｇｃｓｆ、ｇｃｓｆｒ、ｇｃｓｐ、ｇｃｔｇ、ｇｃｙ、ｇｄａ、ｇｄｅ、ｇｄｆ５、ｇｄｆ８、ｇｄｈ、ｇｄｉ１、ｇｄｉ２、ｇｄｉｄ４、ｇｄｌｄ、ｇｄｎｆ、ｇｄｎｆｒ、ｇｄｎｆｒａ、ｇｄｎｆｒｂ、ｇｄｘ、ｇｄｘｙ、ｇｅ、ｇｅｍ、ｇｅｎｅｙ、ｇｅｙ、ｇｆ１、ｇｆ１、ｇｆａｐ、ｇｆｅｒ、ｇｆｅｒ、ｇｆｉ１、ｇｆｐｔ、ｇｆｒａ１、ｇｆｒａ２、ｇｇｃｘ、ｇｇｔ１、ｇｇｔ２、ｇｇｔａ１、ｇｇｔｂ１、ｇｇｔｂ２、ｇｈ１、ｇｈ２、ｇｈｃ．ＲＴＭ、ｇｈｄｘ、ｇｈｎ、ｇｈｒ、ｇｈｒｆ、ｇｈｒｈ、ｇｈｒｈｒ、ｇｈｓ、ｇｈｖ、ｇｉｆ、ｇｉｆｂ、ｇｉｐ、ｇｉｐ、ｇｉｐｒ、ｇｉｒｋ１、ｇｉｒｋ２、ｇｉｒｋ３、ｇｉｒｋ４、ｇｊａ１、ｇｊａ３、ｇｊａ４、ｇｊａ５、ｇｊａ８、ｇｊｂ１、ｇｊｂ２、ｇｊｂ３、ｇｋ、ｇｋ２、ｇｌａ、ｇｌａｔ、ｇｌｂ１、ｇｌｂ２、ｇｌｃ１ａ、ｇｌｃ１ｂ、ｇｌｃ１ｃ、ｇｌｃ１ｄ、ｇｌｃ１ｆ、ｇｌｃ３ａ、ｇｌｃ３ｂ、ｇｌｃ１ｃ、ｇｌｃ１ｒ、ｇｌｃｔ２、ｇｌｃｔ３、ｇｌｄｃ、ｇｌｅｐｐ１、ｇｌｇ１、ｇｌｉ、ｇｌｉ２、ｇｌｉ３、ｇｌｉ４、ｇｌｎｎ、ｇｌｎｓ、ｇｌｏ１、ｇｌｏ２、ｇｌｐ１ｒ、ｇｌｒａ１、ｇｌｒａ２、ｇｌｒａ３、ｇｌｒｂ、ｇｌｒｘ、ｇｌｓ、ｇｌｕｄ１、ｇｌｕｄ２、ｇｌｕ１、ｇｌｕｒ１、ｇｌｕｒ２、ｇｌｕｒ３、ｇｌｕｒ４、ｇｌｕｒ５、ｇｌｕｒ６、ｇｌｕｒ７、ｇｌｕｔ１、ｇｌｕｔ２、ｇｌｕｔ３、ｇｌｕｔ４、ｇｌｕｔ５、ｇｌｖｒ１、ｇｌｖｒ２、ｇｌｙ９６、ｇｌｙａ、ｇｌｙｂ、ｇｌｙｓ１、ｇｌｙｔ１、ｇｌｙｔ１、ｇｌｙｔ２、ｇｍ２ａ、ｇｍａ、ｇｍｃｓｆ、ｇｍｄｓ、ｇｍ１、ｇｍｐｒ、ｇｍｐｓ、ｇｎａ１１、ｇｎａｌ５、ｇｎａｌ６、ｇｎａｉ１、ｇｎａｉ２、ｇｎａｉ２ａ、ｇｎａｉ２ｂ、ｇｎａｉ２１、ｇｎａｉ３、ｇｎａ１、ｇｎａｏ１、ｇｎａｑ、ｇｎａｓ、ｇｎａｓ１、ｇｎａｔ１、ｇｎａｔ２、ｇｎａｚ、ｇｎｂ１、ｇｎｂ２、ｇｎｂ３、ｇｎｇ５、ｇｎ１１、ｇｎｐｔａ、ｇｎｒｈ１、ｇｎｒｈ２、ｇｎｒｈｒ、ｇｎｓ、ｇｎｔ１、ｇｏｌｇａ４、ｇｏｔ１、ｇｏｔ２、ｇｐ１３０、ｇｐ１ｂａ、ｇｐ１ｂｂ、ｇｐ２、ｇｐ２ｂ、ｇｐ３９、ｇｐ３ａ、ｇｐ７５、ｇｐ７８、ｇｐ９、ｇｐａ、ｇｐａｍ、ｇｐａｔ、ｇｐｂ、ｇｐｃ、ｇｐｃ１、ｇｐｃ３、ｇｐｃ４、ｇｐｄ、ｇｐｄ１、ｇｐｄ２、ｇｐｄｓ１、ｇｐｅ、ｇｐｉ、ｇｐｉ２、ｇｐｍ６ａ、ｇｐｍ６ｂ、ｇｐｏａ、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１０、ｇｐｒ１１、ｇｐｒ１２、ｇｐｒ１３、ｇｐｒ１５、ｇｐｒ１７、ｇｐｒ１８、ｇｐｒ１９、ｇｐｒ２、ｇｐｒ２０、ｇｐｒ２１、ｇｐｒ２２、ｇｐｒ２３、ｇｐｒ２５、ｇｐｒ２９、ｇｐｒ３、ｇｐｒ３０、ｇｐｒ３１、ｇｐｒ３２、ｇｐｒ３５、ｇｐｒ３７、ｇｐｒ３９、ｇｐｒ４、ｇｐｒ５、ｇｐｒ６、ｇｐｒ７、ｇｐｒ８、ｇｐｒ９、ｇｐｒｃｙ４、ｇｐｒｋ２１、ｇｐｒｋ４、ｇｐｒｋ５、ｇｐｒｋ６、ｇｐｒｖ２８、ｇｐｓａ、ｇｐｓｃ、ｇｐｔ、ｇｐｘ１、ｇｐｘ２、ｇｐｘ３、ｇｐｘ４、ｇｒ２、ｇｒｂ１、ｇｒｂ１０、ｇｒｂ２、ｇｒｆ２、ｇｒｉａ１、ｇｒｉａ２、ｇｒｉａ３、ｇｒｉａ４、ｇｒｉｄ２、ｇｒｉｋ１、ｇｒｉｋ２、ｇｒｉｋ３、ｇｒｉｋ４、ｇｒｉｋ５、ｇｒｉｎ１、ｇｒｉｎ２ａ、ｇｒｉｎ２ｂ、ｇｒｉｎ２ｃ、ｇｒｉｎ２ｄ、ｇｒｉｎａ、ｇｒｋ１、ｇｒｋ５、ｇｒｋ６、ｇｒ１、ｇｒ１１１、ｇｒｍ３、ｇｒｍ８、ｇｒｍｐ、ｇｒｎ、ｇｒｏ１、ｇｒｏ２、ｇｒｏ３、ｇｒｐ、ｇｒｐ５８、ｇｒｐ７８、ｇｒｐｒ、ｇｒｘ、ｇｓ、ｇｓ１、ｇｓａｓ、ｇｓｃ、ｇｓｃ１、ｇｓｅ、ｇｓｈｓ、ｇｓ１、ｇｓｍ１、ｇｓｎ、ｇｓｐ、ｇｓｐｔ１、ｇｓｒ、ｇｓｓ、ｇｓｔ１２、ｇｓｔ１１、ｇｓｔ２、ｇｓｔ２、ｇｓｔ３、ｇｓｔ４、ｇｓｔ５、ｇｓｔａ１、ｇｓｔａ２、ｇｓｔｍ１、ｇｓｔｍ１１、ｇｓｔｍ２、ｇｓｔｍ３、ｇｓｔｍ４、ｇｓｔｍ５、ｇｓｔｐ１、ｇｓｔｔ２、ｇｔ１、ｇｔ３３５、ｇｔａ、ｇｔｂ、ｇｔｂｐ、ｇｔｄ、ｇｔｆ２ｅ２、ｇｔｆ２ｆ１、ｇｔｆ２ｈ１、ｇｔｆ２ｈ２、ｇｔｆ２ｈ４、ｇｔｆ２ｉ、ｇｔｆ２ｓ、ｇｔｆ３ａ、ｇｔｇ、ｇｕｃ１ａ２、ｇｕｃ１ａ３、ｇｕｃ１ｂ３、ｇｕｃ２ｃ、ｇｕｃ２ｄ、ｇｕｃ２ｆ、ｇｕｃａ１ａ、ｇｕｃａ１ｂ、ｇｕｃａ２、ｇｕｃａ２、ｇｕｃａ２ａ、ｇｕｃａ２ｂ、ｇｕｃｓａ３、ｇｕｃｓｂ３、ｇｕｃｙ１ａ２、ｇｕｃｙ１ａ３、ｇｕｃｙ１ｂ３、ｇｕｃｙ２ｃ、ｇｕｃｙ２ｄ、ｇｕｃｙ２ｆ、ｇｕｋ１、ｇｕｋ２、ｇｕｌｏ、ｇｕｌｏｐ、ｇｕｓｂ、ｇｕｓｍ、ｇｕｓｔ、ｇｘｐ１、ｇｙｐａ、ｇｙｐｂ、ｇｙｐｃ、ｇｙｐｅ、ｇｙｓ、ｇｙｓ１、ｇｙｓ２、ｇｚｍａ、ｇｚｍｂ、ｇｚｍｈ、ｇｚｍｍ、ｈ、ｈ１４２ｔ、ｈ１９、ｈ１ｆ０、ｈ１ｆ１、ｈ１ｆ２、ｈ１ｆ３、ｈ１ｆ４、ｈ１ｆ５、ｈ１ｆｖ、ｈ２ａ、ｈ２ａｘ、ｈ２ａｚ、ｈ２ｂ、ｈ２ｂ、ｈ３ｆ２、ｈ３ｆ３ｂ、ｈ３ｆｔ、ｈ３ｔ、ｈ４、ｈ４ｆ２、ｈ４ｆ５、ｈ４ｆａ、ｈ４ｆｂ、ｈ４ｆｅ、ｈ４ｆｇ、ｈ４ｆｈ、ｈ４ｆｉ、ｈ４ｆｊ、ｈ４ｆｋ、ｈ４ｆ１、ｈ４ｆｍ、ｈ４ｍ、ｈ６、ｈａ２、ｈａｂｐ１、ｈａｄｈａ、ｈａｄｈｂ、ｈａｄｈｓｃ、ｈａｆ、ｈａｇｈ、ｈａｈ１、ｈａｉｐ１、ｈａ１、ｈａｐ、ｈａｐ１、ｈａｐ２、ｈａｒｓ、ｈａｓ２、ｈａｔ１、ｈａｕｓｐ、ｈｂ１、ｈｂ１、ｈｂ６、ｈｂａ１、ｈｂａ２、ｈｂａｃ＠、ｈｂｂ、ｈｂｂｃ＠、ｈｂｄ、ｈｂｅ１、ｈｂｅｇｆ、ｈｂｆ２、ｈｂｇ１、ｈｂｇ２、ｈｂｇｒ、ｈｂｈｒ、ｈｂｍ、ｈｂｐ、ｈｂｑ１、ｈｂｚ、ｈｃ２、ｈｃ３、ｈｃａ、ｈｃａｔ２、ｈｃｃｓ、ｈｃｄｈ、ｈｃｆ２、ｈｃｆｃ１、ｈｃｇ、ｈｃｋ、ｈ１１、ｈｃ１２、ｈｃ１３、ｈｃｌｓ１、ｈｃｐ、ｈｃｐ１、ｈｃｓ、ｈｃｖｓ、ｈｄ、ｈｄａｃ１、ｈｄｃ、ｈｄｇｆ、ｈｄｈｃ７、ｈｄｌｂｐ、ｈｄｌｄ、ｈｄｌｄｔ１、ｈｄｒ、ｈｅｄ、ｈｅｄ、ｈｅｇｆ１、ｈｅｋ、ｈｅｋ３、ｈｅｌｎ１、ｈｅｍ１、ｈｅｍａ、ｈｅｍｂ、ｈｅｍｃ、ｈｅｍｐａｓ、ｈｅｎ１、ｈｅｎ２、ｈｅｐ、ｈｅｐ１０、ｈｅｒ２、ｈｅｒ４、ｈｅｒｇ、ｈｅｒｖ１、ｈｅｓ１、ｈｅｓｘ１、ｈｅｔ、ｈｅｘａ、ｈｅｘｂ、ｈｆ１、ｈｆ１０、ｈｆｃ１、ｈｆｅ、ｈｆｅ２、ｈｆｈ１１、ｈｆｓｐ、ｈｇｄ、ｈｇｆ、ｈｇｆ、ｈｇｆ１、ｈｇ１、ｈｈ、ｈｈ７２、ｈｈｃ１、ｈｈｃ２、ｈｈｄ、ｈｈｈ、ｈｈｍｊｇ、ｈｈｒ２３ａ、ｈｈｔ１、ｈｈｔ２、ｈｉａｐ２、ｈｉｇｍ１、ｈｉｌｄａ、ｈｉｎｔ、ｈｉｏｍｔ、ｈｉｐ、ｈｉｐ１、ｈｉｐ１１６、ｈｉｐ２、ｈｉｒ、ｈｉｒａ、ｈｉｓ１、ｈｉｓ２、ｈｉｖｅ１、ｈｉｖｅｐ１、ｈｉｖｅｐ２、ｈｊｃｄ、ｈｋ１、ｈｋ２、ｈｋ３、ｈｋ３３、ｈｋｅ４、ｈｋｅ６、ｈｋｒ１、ｈｋｒ２、ｈｋｒ３、ｈｋｒ４、ｈｌ１１、ｈｌ１９、ｈｌａ−ａ、ｈｌａ−ｂ、ｈｌａ−ｃ、ｈｌａ−ｃｄａ１２、ｈｌａ−ｄｍａ、ｈｌａ−ｄｍｂ、ｈｌａ−ｄｎａ、ｈｌａ−ｄｏｂ、ｈｌａ−ｄｐａ１ｈｌａ−ｄｐｂ１、ｈｌａ−ｄｑａ１、ｈｌａ−ｄｒｌｂ、ｈｌａ−ｄｒａ、ｈｌａ−ｅ、ｈｌａ−ｆ、ｈｌａ−ｇ、ｈｌａ−ｈａ２、ｈｌａｄｐ、ｈｌａｆ、ｈｌａｌｓ、ｈｌｃｓ、ｈｌｍ２、ｈｌｐ、ｈｌｐ３、ｈｌｒ１、ｈｌｒ２、ｈｌｔ、ｈｌｘ１、ｈｌｘｂ９、ｈｍａａ、ｈｍａｂ、ｈｍａｔ１、ｈｍｂｓ、ｈｍｃｓ、ｈｍｇ１、ｈｍｇ１４、ｈｍｇ１７、ｈｍｇ２、ｈｍｇｃ１、ｈｍｇｃｒ、ｈｍｇｃｓ１、ｈｍｇｃｓ２、ｈｍｇｉｃ、ｈｍｇｉｙ、ｈｍｇｘ、ｈｍｍｒ、ｈｍｎ２、ｈｍｏｘ１、ｈｍｏｘ２、ｈｍｒ、ｈｍｓ１、ｈｍｓｎ１、ｈｍｘ１、ｈｍｘ２、ｈｎｄ、ｈｎｆ１ａ、ｈｎｆ２、ｈｎｆ３ａ、ｈｎｆ３ｂ、ｈｎｆ４ａ、ｈｎｐ３６、ｈｎｐｃｃ６、ｈｎｒｐａ１、ｈｎｒｐａ２ｂ１、ｈｎｒｐｄ、ｈｎｒｐｆ、ｈｎｒｐｇ、ｈｎｒｐｈ１、ｈｎｒｐｈ２、ｈｎｒｐｈ３、ｈｎｒｐｋ、ｈｏｍｇ、ｈｏｐｓ、ｈｏｘ１０、ｈｏｘ１１、ｈｏｘ１２、ｈｏｘ１＠、ｈｏｘ１ａ、ｈｏｘ１ｂ、ｈｏｘ１ｃ、ｈｏｘ１ｄ、ｈｏｘ１ｅ、ｈｏｘ１ｆ、ｈｏｘ１ｇ、ｈｏｘ１ｈ、ｈｏｘ１ｉ、ｈｏｘ１ｊ、ｈｏｘ２＠、ｈｏｘ２ａ、ｈｏｘ２ｂ、ｈｏｘ２ｃ、ｈｏｘ２ｄ、ｈｏｘ２ｅ、ｈｏｘ２ｆ、ｈｏｘ２ｇ、ｈｏｘ２ｈ、ｈｏｘ２ｉ、ｈｏｘ３＠、ｈｏｘ３ａ、ｈｏｘ３ｂ、ｈｏｘ３ｃ、ｈｏｘ３ｄ、ｈｏｘ３ｅ、ｈｏｘ３ｆ、ｈｏｘ３ｇ、ｈｏｘ４＠、ｈｏｘ４ａ、ｈｏｘ４ｂ、ｈｏｘ４ｃ、ｈｏｘ４ｄ、ｈｏｘ４ｅ、ｈｏｘ４ｆ、ｈｏｘ４ｇ、ｈｏｘ４ｈ、ｈｏｘ４ｉ、ｈｏｘ７、ｈｏｘ８、ｈｏｘａ１、ｈｏｘａ１０、ｈｏｘａ１１、ｈｏｘａ１３、ｈｏｘａ３、ｈｏｘａ４、ｈｏｘａ５、ｈｏｘａ６、ｈｏｘａ７、ｈｏｘａ９、ｈｏｘａ＠、ｈｏｘｂｌ、ｈｏｘｂ２、ｈｏｘｂ３、ｈｏｘｂ４、ｈｏｘｂ５、ｈｏｘｂ６、ｈｏｘｂ７、ｈｏｘｂ８、ｈｏｘｂ９、ｈｏｘｂ＠、ｈｏｘｃ１２、ｈｏｘｃ１３、ｈｏｘｃ４、ｈｏｘｃ５、ｈｏｘｃ６、ｈｏｘｃ８、ｈｏｘｃ９、ｈｏｘｃ＠、ｈｏｘｄ１、ｈｏｘｄ１０、ｈｏｘｄ１１、ｈｏｘｄ１２、ｈｏｘｄ１３、ｈｏｘｄ３、ｈｏｘｄ４、ｈｏｘｄ８、ｈｏｘｄ９、ｈｏｘｄ＠、ｈｏｘｈｂ９、ｈｐ、ｈｐ４、ｈｐａｆｐ、ｈｐｃ１、ｈｐｃ２、ｈｐｃａ、ｈｐｃａ１１、ｈｐｃｘ、ｈｐｄ、ｈｐｄｒ１、ｈｐｄｒ２、ｈｐｅ１、ｈｐｅ２、ｈｐｅ３、ｈｐｅ４、ｈｐｅ５、ｈｐｅｃｔ１、ｈｐｆｈ、ｈｐｆｈ２、ｈｐｇｄ、ｈｐｌｈ１、ｈｐｌｈ２、ｈｐｎ、ｈｐｒ、ｈｐｒｔ、ｈｐｒｔ１、ｈｐｓ、ｈｐｔ、ｈｐｔ１、ｈｐｔｐ、ｈｐｔｘ、ｈｐｖ１８ｉ１、ｈｐｖ１８ｉ２、ｈｐｘ、ｈｒ、ｈｒａｓ、ｈｒｂ、ｈｒｃ、ｈｒｃ１、ｈｒｃａ１、ｈｒｄ、ｈｒｅｓ１、ｈｒｆ、ｈｒｇ、ｈｒｇａ、ｈｒｈ１、ｈｒｈ２、ｈｒｍｔ１１１、ｈｒｐｔ２、ｈｒｘ、ｈｒｘ、ｈｒｙ、ｈｓａ１１、ｈｓａ１２、ｈｓａｎ１、ｈｓａｓ１、ｈｓｃｒ２、ｈｓｄ１１、ｈｓｄ１１ｂ１、ｈｓｄ１１ｂ２、ｈｓｄ１１ｋ、ｈｓｄ１１１、ｈｓｄ１７ｂ１、ｈｓｄ１７ｂ２、ｈｓｄ１７ｂ３、ｈｓｄ１７ｂ４、ｈｓｄ３ｂ１、ｈｓｄ３ｂ２、ｈｓｈ、ｈｓｎ１、ｈｓｏｒｃ１、ｈｓｐ２７、ｈｓｐ７３、ｈｓｐａ１ａ、ｈｓｐａ１ｂ、ｈｓｐａ１１、ｈｓｐａ２、ｈｓｐａ３、ｈｓｐａ４、ｈｓｐａ５、ｈｓｐａ６、ｈｓｐａ７、ｈｓｐａ８、ｈｓｐａ９、ｈｓｐｂ１、ｈｓｐｂ２、ｈｓｐｃ２、ｈｓｐｃａ１１、
ｈｓｐｃａ１２、ｈｓｐｃａ１３、ｈｓｐｃａ１４、ｈｓｐｃｂ、ｈｓｐｇ１、ｈｓｐｇ２、ｈｓｒ１、ｈｓｓｔ、ｈｓｔｄ、ｈｓｔｆ１、ｈｔｃ２、ｈｔｆ４、ｈｔｋ、ｈｔｋ１、ｈｔ１、ｈｔｌｆ、ｈｔｌｖｒ、ｈｔｎ１、ｈｔｎ２、ｈｔｎ３、ｈｔｎｂ、ｈｔｏｒ、ｈｔｒ１ａ、ｈｔｒ１ｂ、ｈｔｒ１ｄ、ｈｔｒ１ｅ、ｈｔｒ１ｅ１、ｈｔｒ１ｆ、ｈｔｒ２ａ、ｈｔｒ２ｂ、ｈｔｒ２ｃ、ｈｔｒ３、ｈｔｒ４、ｈｔｒ５ａ、ｈｔｒ６、ｈｔｒ７、ｈｔｒｘ１、ｈｔｓ１、ｈｔｔ、ｈｔｘ、ｈｔｘ１、ｈｕｂ、ｈｕｄ、ｈｕｐ２、ｈｕｒ、ｈｕｓ、ｈｖｌｓ、ｈｖｂｓ１、ｈｖｂｓ６、ｈｖｂｓ７、ｈｖｅｍ、ｈｖｈ２、ｈｖｈ３、ｈｖｈ８、ｈｘｂ、ｈｘｂ１、ｈｙ、ｈｙａ、ｈｙａ１１、ｈｙｄ２、ｈｙｇｎ１、ｈｙ１、ｈｙｐ、ｈｙｐｌｉｐ１、ｈｙｐｐ、ｈｙｐｘ、ｈｙｒ、ｈｙｒｃ１、ｈｙｓ、ｉａ１、ｉａ２、ｉａｐ、ｉａｐｐ、ｉａｒ、ｉａｒｓ、ｉｂｄ１、ｉｂｄ２、ｉｂｍ２、ｉｂｓｐ、ｉｃａ１、ｉｃａｍ１、ｉｃａｍ２、ｉｃａｍ３、ｉｃｃａ、ｉｃｈ１、ｉｃｒ２、ｉｃｒ２ｂ、ｉｃｓ１、ｉｄ１、ｉｄ２、ｉｄ３、ｉｄ４、ｉｄａ、ｉｄｄ、ｉｄｄｍ１、ｉｄｄｍ１０、ｉｄｄｍ１１、ｉｄｄｍ１２、ｉｄｄｍ１３、ｉｄｄｍ１５、ｉｄｄｍ１７、ｉｄｄｍ２、ｉｄｄｍ３、ｉｄｄｍ４、ｉｄｄｍ５、ｉｄｄｍ６、ｉｄｄｍ７、ｉｄｄｍ８、ｉｄｄｍｘ、ｉｄｅ、ｉｄｇ２、ｉｄｈ１、ｉｄｈ２、ｉｄｈ３ａ、ｉｄｈ３ｇ、ｉｄｏ、ｉｄｓ、ｉｄｕａ、ｉｅｒ１、ｉｅｒ３、ｉｅｘ１、ｉｆ、ｉｆｃｒ、ｉｆｇｒ２、ｉｆｉ１６、ｉｆｉ２７、ｉｆｉ３５、ｉｆｉ４、ｉｆｉ５１１１、ｉｆｉ５４、ｉｆｉ５６、ｉｆｉ６１６、ｉｆｉ７８、ｉｆｎａ１、ｉｆｎａ１０、ｉｆｎａ１３、ｉｆｎａ１４、ｉｆｎａ１６、ｉｆｎａ１７、ｉｆｎａ２１、ｉｆｎａ６、ｉｆｎａ７、ｉｆｎａ８、ｉｆｎａ＠、ｉｆｎａｉ１、ｉｆｎａｒ１、ｉｆｎａｒ２、ｉｆｎｂ１、ｉｆｎｂ２、ｉｆｎｂ３、ｉｆｎｇ、ｉｆｎｇｒ１、ｉｆｎｇｒ２、ｉｆｎｇｔ１、ｉｆｎｒ、ｉｆｎｗ１、ｉｆｒｄ２、ｉｇａ、ｉｇａｔ、ｉｇｂ、ｉｇｂｐ１、ｉｇｄ１、ｉｇｄａ１、ｉｇｄｃ１、ｉｇｄｓ２、ｉｇｅｒ、ｉｇｅｓ、ｉｇｆ１、ｉｇｆ１ｒ、ｉｇｆ２、ｉｇｆ２ｒ、ｉｇｆｂｐ１、ｉｇｆｂｐ１０、ｉｇｆｂｐ２、ｉｇｆｂｐ３、ｉｇｆｂｐ４、ｉｇｆｂｐ６、ｉｇｆｂｐ７、ｉｇｆｒ１、ｉｇｆｒ２、ｉｇｆｒ３、ｉｇｈ＠、ｉｇｈａ１、ｉｇｈａ２、ｉｇｈｄ、ｉｇｈｄｙ２、ｉｇｈｅ、ｉｇｈｇ１、ｉｇｈｇ２、ｉｇｈｇ３、ｉｇｈｇ４、ｉｇｈｊ、ｉｇｈｍ、ｉｇｈｍｂｐ２、ｉｇｈｒ、ｉｇｈｖ＠、ｉｇｉ、ｉｇｊ、ｉｇｋ＠、ｉｇｋｃ、ｉｇｋｄｅ１、ｉｇｋｊ、ｉｇｋｊｒｂ１、ｉｇｋｖ、ｉｇｌｃ、ｉｇｌｃ１、ｉｇ１ｊ、ｉｇｌｐ１、ｉｇｌｐ２、ｉｇｌｖ、ｉｇｍ、ｉｇｏ１、ｉｇｓｆ１、ｉｈｈ、ｉｋ１、ｉｋｂａ、ｉｌ１０、ｉｌ１０ｒ、ｉｌ１１、ｉｌ１１ｒａ、ｉｌ１２ａ、ｉｌ１２ｂ、ｉｌ１２ｒｂ１、ｉｌ１２ｒｂ２、ｉｌ１３、ｉｌ１３ｒａ１、ｉｌ１３ｒａ２、ｉｌ１５、ｉｌ１５ｒａ、ｉｌ１７、ｉｌ１ａ、ｉｌ１ｂ、ｉｌ１ｂｃ、ｉｌ１ｒ１、ｉｌ１ｒ２、ｉｌ１ｒａ、ｉｌ１ｒａｐ、ｉｌ１ｒｂ、ｉｌ１ｒｎ、ｉｌ２、ｉｌ２ｒ、ｉｌ２ｒａ、ｉｌ２ｒｂ、ｉｌ２ｒｇ、ｉｌ３、ｉｌ３ｒａ、ｉｌ３ｒａｙ、ｉｌ４、ｉｌ４ｒ、ｉｌ４ｒａ、ｉｌ５、ｉｌ５ｒａ、ｉｌ６、ｉｌ６ｒ、ｉｌ６ｓｔ、ｉｌ７、ｉｌ７ｒ、ｉｌ８、ｉｌ８ｒａ、ｉｌ８ｒｂ、ｉｌ９、ｉｌ９ｒ、ｉｌａ、ｉｌｆ１、ｉｌｌｂｐ、ｉｍｄ１、ｉｍｄ２、ｉｍｄ４、ｉｍｄ５、ｉｍｄ６、ｉｍｐａ１、ｉｍｐｄｈ１、ｉｍｐｄｈ２、ｉｍｐｄｈ１１、ｉｍｐｇ１、ｉｍｐｔ１、ｉｎｄｘ、ｉｎｆａ２、ｉｎｆａ４、ｉｎｆａ５、ｉｎｇ１、ｉｎｈａ、ｉｎｈｂａ、ｉｎｈｂｂ、ｉｎｈｂｃ、ｉｎｉ１、ｉｎｋ４ｂ、ｉｎｌｕ、ｉｎｐ１０、ｉｎｐｐ１、ｉｎｐｐ５ａ、ｉｎｐｐ５ｂ、ｉｎｐｐ５ｄ、ｉｎｐｐ１１、ｉｎｓ、ｉｎｓｉｇ１、ｉｎｓ１、ｉｎｓ１３、ｉｎｓ１４、ｉｎｓｒ、ｉｎｓｒｒ、ｉｎｔ１、ｉｎｔ１１１、ｉｎｔ２、ｉｎｔ３、ｉｎｔ４、ｉｎｔ６、ｉｏｓｃａ、ｉｐ２、ｉｐｆ１、ｉｐ１、ｉｐｍ１５０、ｉｐｏｘ、ｉｐｐ、ｉｐｐ２、ｉｐｗ、ｉｑｇａｐ１、ｉｒ１０、ｉｒ２０、ｉｒｅｂ１、ｉｒｅｂ２、ｉｒｆ１、ｉｒｆ２、ｉｒｆ４、ｉｒｆ４、ｉｒｒ、ｉｒｓ１、ｉｓａ、ｉｓｃｗ、ｉｓ１１、ｉｓｌｒ、ｉｓｏｔ、ｉｓｓｘ、ｉｔ１５、ｉｔｂａ１、ｉｔｂａ２、ｉｔｆ、ｉｔｆ２、ｉｔｇａ１、ｉｔｇａ２、ｉｔｇａ２ｂ、ｉｔｇａ４、ｉｔｇａ５、ｉｔｇａ６、ｉｔｇａ７、ｉｔｇａｄ、ｉｔｇａ１、ｉｔｇａｍ、ｉｔｇａｖ、ｉｔｇａｘ、ｉｔｇｂ１、ｉｔｇｂ２、ｉｔｇｂ３、ｉｔｇｂ４、ｉｔｇｂ６、ｉｔｇｂ７、ｉｔｉ、ｉｔｉｈ１、ｉｔｉｈ２、ｉｔｉｈ３、ｉｔｉｈ４、ｉｔｉｈ１１、ｉｔｉ１、ｉｔｋ、ｉｔｍ１、ｉｔｐａ、ｉｔｐｋａ、ｉｔｐｋｂ、ｉｔｐｒ１、ｉｔｐｒ２、ｉｔｐｒ３、ｉｔｓｎ、ｉｖｄ、ｉｖ１、ｊａｇ１、ｊａｋ１、ｊａｋ２、ｊａｋ３、ｊｂｓ、ｊｃａｐ、ｊｈ８、ｊｉｐ、ｊｋ、ｊｍｅ、ｊｍｊ、ｊｏａｇ、ｊｐｄ、ｊｒｋ、ｊｒｋ１、ｊｔｋ１４、ｊｔｖ１、ｊｕｎ、ｊｕｎｂ、ｊｕｎｄ、ｊｕｐ、ｊｖ１８、ｊｗｓ、ｋ１２ｔ、ｋａｉ１、ｋａｌ１、ｋａｒ、ｋａｒｓ、ｋａｔｐ１、ｋｃｎａ１、ｋｃｎａ１０、ｋｃｎａ１ｂ、ｋｃｎａ２ｂ、ｋｃｎａ３、ｋｃｎａ４、ｋｃｎａ５、ｋｃｎａ６、ｋｃｎａ７、ｋｃｎａ８、ｋｃｎａ９、ｋｃｎａｂ１、ｋｃｎａｂ２、ｋｃｎｂ１、ｋｃｎｃ１、ｋｃｎｃ２、ｋｃｎｃ３、ｋｃｎｃ４、ｋｃｎｅ１、ｋｃｎｈ１、ｋｃｎｈ２、ｋｃｎｊ１、ｋｃｎｊ１０、ｋｃｎｊ１１、ｋｃｎｊ１２、ｋｃｎｊ１５、ｋｃｎｊ３、ｋｃｎｊ４、ｋｃｎｊ５、ｋｃｎｊ６、ｋｃｎｊ６、ｋｃｎｊ７、ｋｃｎｊ８、ｋｃｎｊｎ１、ｋｃｎｋ１、ｋｃｎｋ２、ｋｃｎｋ３、ｋｃｎｍａ１、ｋｃｎｑ１、ｋｃｎｑ２、ｋｃｎｑ３、ｋｃｎｑ４、ｋｃｎｓ２、ｋｄ、ｋｄｒ、ｋｅ１、ｋｅｒａ、ｋｆ１、ｋｆｓ、ｋｆｓｄ、ｋｆｓ１、ｋｈｋ、ｋｉａａ０１２２、ｋｉｄ、ｋｉｄ１、ｋｉｆ２、ｋｉｆ３ｃ、ｋｉｆ５ｂ、ｋｉｐ１、ｋｉｐ２、ｋｉｓｓ１、ｋｉｔ、ｋｌｃ２、ｋｌｋ１、ｋｌｋ２、ｋｌｋ３、ｋｌｋ３、ｋｌｋｂ１、ｋｌｋｒ、ｋｌｒｂ１、ｋｌｒｃ１、ｋｌｒｃ２、ｋｌｒｃ３、ｋｌｒｃ４、ｋｌｒｄ１、ｋｌｓｔ、ｋｍｓ、ｋｍｓ、ｋｎｇ、ｋｎｏ、ｋｎｓ１、ｋｎｓ２、ｋｎｓ１１、ｋｎｓ１４、ｋｏｘ１、ｋｏｘ１１、ｋｏｘ１２、ｋｏｘ１３、ｋｏｘ１５、ｋｏｘ１６、ｋｏｘ１８、ｋｏｘ１９、ｋｏｘ２、ｋｏｘ２、ｋｏｘ２２、ｋｏｘ２５、ｋｏｘ３０、ｋｏｘ３２、ｋｏｘ４、ｋｏｘ５、ｋｏｘ６、ｋｏｘ７、ｋｏｘ９、ｋｐｎａ３、ｋｐｐｓ１、ｋｐｐｓ２、ｋｒａｇ、ｋｒａｓ１ｐ、ｋｒａｓ２、ｋｒｅｖ１、ｋｒｇ２、ｋｒｎ１、ｋｒｎ１１、ｋｒｏｘ２０、ｋｒｔ１、ｋｒｔ１０、ｋｒｔ１２、ｋｒｔ１３、ｋｒｔ１４、ｋｒｔ１５、ｋｒｔ１６、ｋｒｔ１７、ｋｒｔ１８、ｋｒｔ１９、ｋｒｔ２ａ、ｋｒｔ２ｅ、ｋｒｔ３、ｋｒｔ４、ｋｒｔ５、ｋｒｔ６ａ、ｋｒｔ６ｂ、ｋｒｔ７、ｋｒｔ８、ｋｒｔ９、ｋｒｔｈａ２、ｋｒｔｈａ５、ｋｒｔｈｂ１、ｋｒｔｈｂ６、ｋｓ、ｋｔｎ１、ｋｕ７０、ｋｕｐ、ｋｖｌｑｔ１、ｋｗｅ、１１．２、１１ ｃａｍ、１２３ｍｒｐ、ｌａｂ７、ｌａｂ７２、ｌａｃ、ｌａｃｉ、ｌａｃｓ、ｌａｄ、ｌａｄ、ｌａｄ１、ｌａｆ４、ｌａｇ３、ｌａｇ５、ｌａｉｒ１、ｌａｋ１、ｌａｌｂａ、ｌａｌ１、ｌａｍ１、ｌａｍａ１、ｌａｍａ２、ｌａｍａ３、ｌａｍａ３、ｌａｍａ４、ｌａｍａ５、ｌａｍｂ１、ｌａｍｂ２、ｌａｍｂ２、ｌａｍｂ２ｔ、ｌａｍｂ３、ｌａｍｂｒ、ｌａｍｃ１、ｌａｍｃ２、ｌａｍｍ、ｌａｍｎｂ２、ｌａｍｐ、ｌａｍｐ１、ｌａｍｐ２、ｌａｍｒ１、ｌａｍｓ、ｌａｐ、ｌａｐ１８、ｌａｐｔｍ５、ｌａｒ、ｌａｒ１、ｌａｒｄ、ｌａｒｇｅ、ｌａｒｓ、ｌｂｐ、ｌｂｒ、ｌｃａ、ｌｃａ１、Ｉｃａｄ、Ｉｃａｍｂ、ｌｃａｔ、ｌｃｃｓ、ｌｃｆｓ２、ｌｃｈ、ｌｃｋ、ｌｃｎ１、ｌｃｎ２、ｌｃｏ、ｌｃｐ１、ｌｃｐ２、ｌｃｔ、ｌｄ、ｌｄ７８、ｌｄｂ１、ｌｄｂ２、ｌｄｃ、ｌｄｈ１、ｌｄｈ３、ｌｄｈａ、ｌｄｈｂ、ｌｄｈｃ、ｌｄｌｒ、ｌｅ、ｌｅｃｔ２、ｌｅｆ１、ｌｅｆｔｙ１、ｌｅｆｔｙ２、ｌｅｐ、ｌｅｐｒ、ｌｅｒｋ５、ｌｅｒｋ８、ｌｅｕ１、ｌｅｕ７、ｌｅｕｔ、ｌｆａ１ａ、ｌｆａ３、ｌｆｈ１１、ｌｆｐ、ｌｇａ１ｓ１、ｌｇａ１ｓ３、ｌｇａ１ｓ３ｂｐ、ｌｇａ１ｓ７、ｌｇｃｒ、Ｉｇｍｄ１、ｌｇｍｄ１ａ、ｌｇｍｄ１ｂ、ｌｇｍｄ１ｃ、ｌｇｍｄ１ｄ、ｌｇｍｄ２ｂ、ｌｇｍｄ２ｃ、ｌｇｍｄ２ｄ、ｌｇｍｄ２ｅ、ｌｇｍｄ２ｆ、ｌｇｍｄ２ｇ、ｌｇｍｄ２ｈ、ｌｇｓ、ｌｇｔｎ、ｌｈｂ、ｌｈｃｇｒ、ｌｈｓ、ｌｈｘ１、ｌｈｘ３、ｌｉ、ｌｉ２、ｌｉｆ、ｌｉｆｒ、ｌｉｇ１、ｌｉｇ３、ｌｉｇ４、ｌｉｍ１、ｌｉｍ２、ｌｉｍａｂ１、ｌｉｍｋ１、ｌｉｍｐｉｉ、ｌｉｐ２、ｌｉｐａ、ｌｉｐｂ、ｌｉｐｃ、ｌｉｐｄ、ｌｉｐｅ、ｌｉｐｏ、ｌｉｓ１、ｌｉｓ２、ｌｉｓｘ、ｌｉｔａｆ、ｌｋｂ１、ｌｋｎ１、ｌｌｇ１１、ｌｍａｎ１、ｌｍｎ１、ｌｍｎ２、ｌｍｎａ、ｌｍｎｂ１、ｌｍｎｂ２、ｌｍｏ１、ｌｍｏ２、ｌｍｏ３、ｌｍｏ４、ｌｍｏ５、ｌｍｐ１０、ｌｍｐ２、ｌｍｐ７、ｌｍｐｘ、ｌｍｓ、ｌｍｘ１、ｌｍｘ１ａ、ｌｍｘ１ｂ、ｌｍｙｃ、ｌｎｈｒ、ｌｎｒｈ、ｌｏｃｒ、ｌｏｈ１１ｃｒ２ａ、ｌｏｒ、ｌｏｔ１、ｌｏｘ、ｌｏｘ１、ｌｏｘ１１、ｌｐａ、ｌｐａａｂ、ｌｐａａｔａ、ｌｐａｐ ｌｐｃ１、ｌｐｃ２ｄ、ｌｐｄ１、ｌｐｈ、ｌｐｉ、ｌｐ１、ｌｐｎａ３、ｌｐｐ、ｌｐｓ、ｌｐｓａ、ｌｑｔ１、ｌｑｔ２、ｌｑｔ３、ｌｑｔ４、ｌｒ３、ｌｒｅｌ、ｌｒｅ２、ｌｒｐ、ｌｒｐ１、ｌｒｐ２、ｌｒｐ５、ｌｒｐ７、ｌｒｐ８、ｌｒｐａｐ１、ｌｒｐｒ１、ｌｒｓ１、ｌｓａｍｐ、ｌｓｉｒｆ、ｌｓ１、ｌｓｎ、Ｉｓｐ１、ｌｓｓ、ｌｓｔ１、ｌｔａ、ｌｔａ４ｈ、ｌｔｂ、ｌｔｂ４ｒ、ｌｔｂｐ１、ｌｔｂｐ２、ｌｔｂｐ２、ｌｔｂｐ３、ｌｔｂｐ３、ｌｔｂｒ、ｌｔｃ４ｓ、Ｉｔｆ、ｌｔｋ、ｌｔｎ、ｌｕ、ｌｕｍ、ｌｕｘｓ、ｌｕｚｐ、ｌｗ、ｌｙ６４、ｌｙ６ｅ、ｌｙ９、ｌｙａｍ１、ｌｙｂ２、ｌｙｆ１、ｌｙ１１、ｌｙｎ、ｌｙｐ、ｌｙｓｔ、ｌｙｔ１０、ｌｙｚ、ｌｚｔｒ１、ｍ１１ｓ１、ｍ１３０、ｍ１７ｓ１、ｍ１７ｓ２、ｍ１９５、ｍ１ｓ１、ｍ３ｓ１、ｍ４ｓ１、ｍ６ａ、ｍ６ｂ、ｍ６ｐ２、ｍ６ｐｒ、ｍ６ｓ１、ｍ７ｖ１、ｍ７ｖｓ１、ｍａｂ２１１、ｍａｃ１ａ、ｍａｃ２、ｍａｃ２５、ｍａｃａｍ１、ｍａｃｓ、ｍａｄ、ｍａｄ２１１、ｍａｄｄ、ｍａｄｈ１、ｍａｄｈ２、ｍａｄｈ３、ｍａｄｈ４、ｍａｄｈ５、ｍａｄｈ６、ｍａｄｈ６、ｍａｄｈ７、ｍａｄｈ９、ｍａｄｍ、ｍａｄｒ１、ｍａｆ、ｍａｆｄ１、ｍａｆｄ２、ｍａｇ、ｍａｇｅ１、ｍａｇｅｂ３、ｍａｇｅｂ４、ｍａｇｅ１１、ｍａｇｏｈ、ｍａｇｐ、ｍａｇｐ１、ｍａｇｐ２、ｍａｋ、ｍａ１、ｍａ１１、ｍａｎ２ａ２、ｍａｎａ１、ｍａｎａ２、ｍａｎａ２ｘ、ｍａｎｂ、ｍａｎｂ１、ｍａｎｂａ、ｍａｏａ、ｍａｏｂ、ｍａｐ１ａ、ｍａｐ１ａ１ｃ３、ｍａｐ１ｂ、ｍａｐ１ｂ１ｃ３、ｍａｐ２、ｍａｐ４、ｍａｐ８０、ｍａｐ９７、ｍａｐｋ１、ｍａｐｋａｐ３、ｍａｐｋｋｋ４、ｍａｐｔ、ｍａｒ、ｍａｒｋ３、ｍａｒｓ、ｍａｓ１、ｍａｓｐ１、ｍａｔ１ａ、ｍａｔ２ａ、ｍａｔａ１、ｍａｔａ２、ｍａｔｋ、ｍａｔｎ１、ｍａｔｎ３、ｍａｘ、ｍａｚ、ｍｂ、ｍｂｄ１、ｍｂ１、ｍｂ１２、ｍｂｐ、ｍｂｐ１、ｍｂｓ、ｍｂｓ２、ｍｃ１ｒ、ｍｃ２ｒ、ｍｃ３ｒ、ｍｃ４ｒ、ｍｃ５ｒ、ｍｃａｄ、ｍｃｃ、ｍｃｄｃ１、ｍｃｄｒ１、ｍｃｆ２、ｍｃｆ３、ｍｃｆｄ１、ｍｃｈ２、ｍｃｈ３、ｍｃｈ４、ｍｃｈ５、ｍｃｋｄ、ｍｃ１、ｍｃ１１、ｍｃｍ、ｍｃｍ２、ｍｃｍ２、ｍｃｍ３、ｍｃｍ６、ｍｃｍ７、ｍｃｍｔ、ｍｃｏｐ、ｍｃｏｒ、ｍｃｐ、ｍｃｐ１、ｍｃｐ３、ｍｃｐｈ１、ｍｃｒ、ｍｃｓ、ｍｃｓｆ、ｍｃｓｐ、ｍｃｔ１、ｍｄ１、ｍｄｂ、ｍｄｃ、ｍｄｃｒ、ｍｄｄｃ、ｍｄｅｇ、ｍｄｆ１、ｍｄｇ、ｍｄｇ１、ｍｄｈ１、ｍｄｈ２、ｍｄｋ、ｍｄｋ、ｍｄｍ２、ｍｄｍ４、ｍｄｒ１、ｍｄｒ３、ｍｄｒｓ１、ｍｄｒｖ、ｍｄｓ、ｍｄｓ１、ｍｄｕ１、ｍｄｕ２、ｍｄｕ３、ｍｄｘ、ｍｅ１、ｍｅ２、ｍｅａ、
ｍｅａ６、ｍｅｃ１１、ｍｅｃｐ２、ｍｅｄ、ｍｅｆ、ｍｅｆ２ａ、ｍｅｆ２ｂ、ｍｅｆ２ｃ、ｍｅｆ２ｄ、ｍｅｆｖ、ｍｅｈｍｏ、ｍｅｉｓ１、ｍｅｉｓ２、ｍｅｋｋ、ｍｅｋｋ１、ｍｅｋｋ４、ｍｅ１、ｍｅｌ１８、ｍｅｌｆ、ｍｅｍｏ１、ｍｅｎ１、ｍｅｎ２ａ、ｍｅｏｘ１、ｍｅｏｘ２、ｍｅｐ１ａ、ｍｅｐ１ｂ、ｍｅｒ２、ｍｅｒ６、ｍｅｓｔ、ｍｅｔ、ｍｅｔｒｓ、ｍｆａｐ１、ｍｆａｐ２、ｍｆａｐ３、ｍｆａｐ４、ｍｆｄ１、ｍｆｉ２、ｍｆｓ１、ｍｆｓ２、ｍｆｔ、ｍｆｔｓ、ｍｇ５０、ｍｇａ、ｍｇａ１、ｍｇａ３、ｍｇａｔ１、ｍｇａｔ２、ｍｇａｔ５、ｍｇｃ１、ｍｇｃｎ、ｍｇｃｒ、ｍｇｃｔ、ｍｇｄｆ、ｍｇｅａ、ｍｇｆ、ｍｇｉ、ｍｇｍｔ、ｍｇｐ、ｍｇｓａ、ｍｇｓｔ１、ｍｇｓｔ２、ｍｈｃ、ｍｈｃ２ｔａ、ｍｈｐ２、ｍｈｓ、ｍｈｓ２、ｍｈｓ３、ｍｈｓ４、ｍｈｓ６、ｍｉａ、ｍｉｃ１０、ｍｉｃ１１、ｍｉｃ１２、ｍｉｃ１７、ｍｉｃ１８、ｍｉｃ２、ｍｉｃ２ｘ、ｍｉｃ２ｙ、ｍｉｃ３、ｍｉｃ４、ｍｉｃ７、ｍｉｃａ、ｍｉｃｂ、ｍｉｄ１、ｍｉｄａｓ、ｍｉｆ、ｍｉｆ、ｍｉｇ、ｍｉｐ、ｍｉｐ２ａ、ｍｉｐ２ｂ、ｍｉｐ３ｂ、ｍｉｐｅｐ、ｍｉｔｆ、ｍｉｗｃ、ｍｊｄ、ｍｋ、ｍｋｉ６７、ｍｋｋｓ、ｍｋｐ２、ｍｋｐ３、ｍｋｐｘ、ｍｋｓ、ｍｋｓ、ｍｋｓ１、ｍｋｓ２、ｍｌａ１、ｍｌｃｋ、ｍｌｆ１、ｍｌｆ２、ｍｌｈ１、ｍｌｋ１、ｍｌｋ３、ｍｌ１、ｍｌ１２、ｍｌ１ｔ１、ｍｌ１ｔ２、ｍｌ１ｔ３、ｍｌ１ｔ４、ｍｌ１ｔ６、ｍｌ１ｔ７、ｍｌｍ、ｍｌｍ、ｍｌｎ、ｍｌｐ、ｍｌｒ、ｍｌｒｇ、ｍｌｒｗ、ｍｌｓ、ｍｌｔｎ、ｍｌｖａｒ、ｍｌｖｉ２、ｍｌｖｔ、ｍｍａｃ１、ｍｍｅ、ｍｍｐ１、ｍｍｐ１０、ｍｍｐ１１、ｍｍｐ１２、ｍｍｐ１３、ｍｍｐ１４、ｍｍｐ１５、ｍｍｐ１６、ｍｍｐ１７、ｍｍｐ１９、ｍｍｐ２、ｍｍｐ２１、ｍｍｐ２２、ｍｍｐ３、ｍｍｐ７、ｍｍｐ８、ｍｍｐ９、ｍｎ、ｍｎ、ｍｎｂ、ｍｎｂｈ、ｍｎｄａ、ｍｎｇ１、ｍｎｋ、ｍｎｓ、ｍｎｔ、ｍｏｃｏｄ、ｍｏｃｓ１、ｍｏｃｓ２、ｍｏｄｙ１、ｍｏｄｙ３、ｍｏｇ、ｍｏｋ２、ｍｏｍ１、ｍｏｓ、ｍｏｔ２、ｍｏｖ３４、ｍｏｘ１、ｍｏｘ２、ｍｏｘ４４、ｍｏｚ、ｍｐ１９、ｍｐｂ１、ｍｐｄ１、ｍｐｄｚ、ｍｐｅ、ｍｐｅ１６、ｍｐｇ、ｍｐｉ、ｍｐｉｆ２、ｍｐ１、ｍｐ１１ｇ、ｍｐｏ、ｍｐｐ１、ｍｐｐ２、ｍｐｐ３、ｍｐｐｂ、ｍｐｒｉ、ｍｐｒｎ、ｍｐｓ２、ｍｐｓ３ａ、ｍｐｓ３ｃ、ｍｐｓ４ａ、ｍｐｓｈ、ｍｐｔｓ、ｍｐｖ１７、ｍｐｚ、ｍｒ１、ｍｒ７７、ｍｒｂｃ、ｍｒｃ１、ｍｒｅ１１、ｍｒｅ１１ａ、ｍｒｇ１、ｍｒｇｈ、ｍｒｏｓ、ｍｒｐ、ｍｒｐ、ｍｒｐ１、ｍｒｐ１２３、ｍｒｓ、ｍｒｓｄ、ｍｒｓｒ、ｍｒｓｔ、ｍｒｘ１、ｍｒｘ１４、ｍｒｘ２、ｍｒｘ２０、ｍｒｘ２１、ｍｒｘ２３、ｍｒｘ２９、ｍｒｘ４１、ｍｒｘ４８、ｍｒｘ４９、ｍｒｘ９、ｍｒｘａ、ｍｒｘｓ１、ｍｒｘｓ２、ｍｒｘｓ３、ｍｒｘｓ４、ｍｒｘｓ５、ｍｒｘｓ６、ｍｒｘｓ８、ｍｓ３３１５、ｍｓ３３６、ｍｓｇ１、ｍｓｈ２、ｍｓｈ３、ｍｓｈ４、ｍｓｈ６、ｍｓｉ１、ｍｓｋ１６、ｍｓｋ３９、ｍｓｋ４１、ｍｓｌｒ１、ｍｓｍｂ、ｍｓｎ、ｍｓｒ１、ｍｓｓ１、ｍｓｓ４、ｍｓｓ４、ｍｓｓｅ、ｍｓｔ、ｍｓｔ１、ｍｓｔ１ｒ、ｍｓｔｄ、ｍｓｔｎ、ｍｓｕｄ１、ｍｓｘ１、ｍｓｘ２、ｍｔ１ａ、ｍｔ１ｂ、ｍｔ１ｅ、ｍｔ１ｆ、ｍｔ１ｇ、ｍｔ１ｈ、ｍｔ１ｉ、ｍｔ１ｊ、ｍｔ１ｋ、ｍｔ１ｌ、ｍｔ１ｘ、ｍｔ２、ｍｔ２ａ、ｍｔ３、ｍｔａｃｒ１、ｍｔａｐ、ｍｔｂｔ１、ｍｔｃｐ１、ｍｔｅｒｆ、ｍｔｆ１、ｍｔｈ１、ｍｔｈｆｃ、ｍｔｈｆｄ、ｍｔｈｆｒ、ｍｔｋ１、ｍｔｍ１、ｍｔｍｒ１、ｍｔｍｘ、ｍｔｎｒ１ａ、ｍｔｎｒ１ｂ、ｍｔｐ、ｍｔｐａ、ｍｔｒ、ｍｔｒｎｓ、ｍｔｒｒ、ｍｔｓ、ｍｔｓ、ｍｔｓ１、ｍｔｓ１、ｍｔｓ２、ｍｔｔｆ１、ｍｔｘ、ｍｔｘｎ、ｍｕ、ｍｕｃ１、ｍｕｃ２、ｍｕｃ３、ｍｕｃ４、ｍｕｃ５、ｍｕｃ５ａｃ、ｍｕｃ５ｂ、ｍｕｃ６、ｍｕｃ８、ｍｕ１、ｍｕｍ１、ｍｕｐｐ１、ｍｕｓｋ、ｍｕｔ、ｍｖｋ、ｍｖｌｋ、ｍｖｗｆ、ｍｗｆｅ、ｍｘ、ｍｘ１、ｍｘ２、ｍｘｉ１、ｍｘｓ１、ｍｙｂ、ｍｙｂ１１、ｍｙｂ１２、ｍｙｂｐｃ１、ｍｙｂｐｃ２、ｍｙｂｐｃ３、ｍｙｂｐｃｆ、ｍｙｂｐｈ、ｍｙｃ、ｍｙｃ１１、ｍｙｃ１２、ｍｙｃｌｋ１、ｍｙｃｎ、ｍｙｄ８８、ｍｙｆ３、ｍｙｆ４、ｍｙｆ５、ｍｙｆ６、ｍｙｈ１、ｍｙｈ１０、ｍｙｈ１１、ｍｙｈ１２、ｍｙｈ２、ｍｙｈ３、ｍｙｈ４、ｍｙｈ６、ｍｙｈ７、ｍｙｈ８、ｍｙｈ９、ｍｙｋ１、ｍｙ１、ｍｙ１１、ｍｙ１２、ｍｙ１３、ｍｙ１４、ｍｙ１５、ｍｙｌｋ、ｍｙｍｙ、ｍｙｏ１０、ｍｙｏ１５、ｍｙｏ１ａ、ｍｙｏ１ｃ、ｍｙｏ１ｄ、ｍｙｏ１ｅ、ｍｙｏ５ａ、ｍｙｏ６、ｍｙｏ７ａ、ｍｙｏ９ｂ、ｍｙｏｃ、ｍｙｏｄ１、ｍｙｏｇ、ｍｙｐ１、ｍｙｐ２、ｍｙｐ３、ｍｙｒ５、ｍｚｆ１、ｎ３３、ｎａｂ１、ｎａｂ２、ｎａｂｃ１、ｎａｃ１ａ、ｎａｃａ、ｎａｃａｅ、ｎａｃｐ、ｎａｄｍｒ、ｎａｇａ、ｎａｇｃ＠、ｎａｇｌｕ、ｎａｇｒ１、ｎａｉｐ、ｎａｍｓｄ、ｎａｎｔａ３、ｎａｐ１１４、ｎａｐ２、ｎａｐ２１、ｎａｐｂ、ｎａｐｔｂ、ｎａｒｓ、ｎａｔ１、ｎａｔ１、ｎａｔ２、ｎｂ、ｎｂ４ｓ、ｎｂａｔ、ｎｂｃ３、ｎｂｃｃｓ、ｎｂｃｃｓ、ｎｂｉａ１、ｎｂｓ、ｎｂｓ、ｎｂｓ１、ｎｃａ、ｎｃａｄ、ｎｃａｍ１、ｎｃａｎ、ｎｃｂｐ、ｎｃｃ１、ｎｃｃ２、ｎｃｃ３、ｎｃｃ４、ｎｃｃｔ、ｎｃｆ１、ｎｃｆ２、ｎｃｆ４、ｎｃｋ、ｎｃ１、ｎｃｓｔ２、ｎｃｘ１、ｎｃｘ２、ｎｄ、ｎｄｈｉｉ、ｎｄｎ、ｎｄｐ、ｎｄｓｔ１、ｎｄｕｆａ１、ｎｄｕｆａ２、ｎｄｕｆａ５、ｎｄｕｆａ６、ｎｄｕｆａ７、ｎｄｕｆｂ８、ｎｄｕｆｂ９、ｎｄｕｆｓ１、ｎｄｕｆｓ２、ｎｄｕｆｓ４、ｎｄｕｆｓ７、ｎｄｕｆｓ８、ｎｄｕｆｖ１、ｎｄｕｆｖ２、ｎｄｕｆｖ３、ｎｅｂ、ｎｅｃ１、ｎｅｃ２、ｎｅｄｄ１、ｎｅｄｄ２、ｎｅｄｄ４、ｎｅｆｈ、ｎｅｆ１、ｎｅｇｆ１、ｎｅｇｆ２、ｎｅ１１１、ｎｅｂ１１２、ｎｅｍ１、ｎｅｏ１、ｎｅｐ、ｎｅｔ、ｎｅｔ１、ｎｅｕ、ｎｅｕ、ｎｅｕｄ４、ｎｅｕｒｏｄ、ｎｅｕｒｏｄ２、ｎｅｕｒｏｄ３、ｎｆ１、ｎｆ１ａ、ｎｆ２、ｎｆａｔｃｌ、ｎｆａｔｃ２、ｎｆａｔｐ、ｎｆｅ１、ｎｆｅ２、ｎｆｅ２１１、ｎｆｅ２１２、ｎｆｅ２ｕ、ｎｆｉａ、ｎｆｉｂ、ｎｆｉｃ、ｎｆｉｘ、ｎｆｋｂ１、ｎｆｋｂ２、ｎｆｋｂ３、ｎｆｋｂｉａ、ｎｆｋｂｉ１１、ｎｆｒｋｂ、ｎｆｙａ、ｎｆｙｂ、ｎｇａ１、ｎｇｂｅ、ｎｇｆｂ、ｎｇｆｇ、ｎｇｆｉｃ、ｎｇｆｒ、ｎｇ１、ｎｇｎ、ｎｈｂｐ、ｎｈｃｐ１、ｎｈｃｐ２、ｎｈｅ１、ｎｈｅ３、ｎｈｅ４、ｎｈｅ５、ｎｈｌｈ１、ｎｈｌｈ２、ｎｈｐ２１１、ｎｈｓ、ｎｉｄ、ｎｉｄｄｍ１、ｎｉｎｊ１、ｎｉｐｐ１、ｎｉｐｓｎａｐ１、ｎｉｐｓｎａｐ２、ｎｉｓ、ｎｋｌｒ、ｎｋｃｃ１、ｎｋｃｃ２、ｎｋｇ２、ｎｋｇ２ａ、ｎｋｇ２ｃ、ｎｋｇ２ｅ、ｎｋｇ２ｆ、ｎｋｈｃ、ｎｋｎａ、ｎｋｎａｒ、ｎｋｎｂ、ｎｋｒｐ１ａ、ｎｋｓ１、ｎｋｓｆ２、ｎｋｔｒ、ｎｋｘ２ａ、ｎｋｘ３．２、ｎｋｘ３ａ、ｎｋｘ６ａ、ｎｌｉ、ｎｍ、ｎｍ１、ｎｍ２３、ｎｍｂ、ｎｍｂｒ、ｎｍｄａｒ１、ｎｍｄａｒ２ａ、ｎｍｄａｒ２ｂ、ｎｍｄａｒ２ｃ、ｎｍｄａｒ２ｄ、ｎｍｄａｒａ１、ｎｍｅ１、ｎｍｅ２、ｎｍｅ４、ｎｍｏｒ１、ｎｍｏｒ２、ｎｍｓ１、ｎｍｙｃ、ｎｎａｔ、ｎｍｎｔ、ｎｎｏ１、ｎｏｇ、ｎｏｌｌ、ｎｏｓ１、ｎｏｓ２ａ、ｎｏｓ２ｂ、ｎｏｓ２ｃ、ｎｏｓ３、ｎｏｔ、ｎｏｔｃｈ１、ｎｏｔｃｈ２、ｎｏｔｃｈ３、ｎｏｔｃｈ４、ｎｏｖ、ｎｏｖ、ｎｏｖ２、ｎｏｖａ１、ｎｏｖａ３、ｎｏｖｐ、ｎｐ、ｎｐ１０、ｎｐａｔ、ｎｐｃ、ｎｐｃ１、ｎｐｄ、ｎｐｈ１、ｎｐｈ２、ｎｐｈｌ２、ｎｐｈｎ、ｎｐｈｐ１、ｎｐｈｐ２、ｎｐｈｓ１、ｎｐｍ１、ｎｐｐａ、ｎｐｐｂ、ｎｐｐｃ、ｎｐｐｓ、ｎｐｒ１、ｎｐｒ２、ｎｐｒ３、ｎｐｓ１、ｎｐｔ１、ｎｐｔ２、ｎｐｔｘ２、ｎｐｙ、ｎｐｙ１ｒ、ｎｐｙ２ｒ、ｎｐｙ３ｒ、ｎｐｙ５ｒ、ｎｐｙ６ｒ、ｎｑｏ２、ｎｒａｍｐ、ｎｒａｍｐ１、ｎｒａｍｐ２、ｎｒａｐ、ｎｒａｓ、ｎｒｂ５４、ｎｒｃａｍ、ｎｒｄ１、ｎｒｆ１、ｎｒｆ１、ｎｒｆ２、ｎｒｇｎ、ｎｒｉｐ１、ｎｒｋ２、ｎｒ１、ｎｒｔｎ、ｎｒｕ、ｎｓ１、ｎｓｆ、ｎｓｐ、ｎｓｐ１１、ｎｓｒｄ９、ｎｔ４、ｎｔ５、ｎｔ５、ｎｔｃｐ１、ｎｔｃｐ２、ｎｔｆ３、ｎｔｆ４、ｎｔｆ５、ｎｔｈ１１、ｎｔｎ、ｎｔｎ、ｎｔｎ２１、ｎｔｒｋ１、ｎｔｒｋ２、ｎｔｒｋ３、ｎｔｒｋ４、ｎｔｒｋｒ１、ｎｔｒｋｒ３、ｎｔｓ、ｎｔｔ、ｎｔｔ、ｎｕｃ１、ｎｕｃｂ１、ｎｕｍａ１、ｎｕｐ２１４、ｎｕｐ９８、ｎｕｒｒ１、ｎｖ１、ｎｙｓ１、ｎｙｓ２、ｎｙｓａ、ｏａ１、ｏａ２、ｏａ３、ｏａｒ、ｏａｓｄ、ｏａｔ、ｏａｔ１１、ｏａｔ２２、ｏａｔ２３、ｏａｔｐ、ｏａｚ、ｏｂ、ｏｂ１０、ｏｂｆ１、ｏｂｐ、ｏｂｒ、ｏｃａ２、ｏｃｍ、ｏｃｐ２、ｏｃｒ１、ｏｃｒ１１、ｏｃｔ、ｏｃｔ１、ｏｃｔ１、ｏｃｔ２、ｏｃｔ２、ｏｃｔ３、ｏｃｔ７、ｏｃｔｎ２、ｏｃｔｓ３、ｏｄｃ１、ｏｄｄｄ、ｏｄｆ１、ｏｄｇ１、ｏｄｏｄ、ｏｆｃ１、ｏｆｃ２、ｏｆｃ３、ｏｆｄ１、ｏｆｅ ｏｇ２２、ｏｇｄｈ、ｏｇｇ１、ｏｇｒ１、ｏｇｓ１、ｏｇｓ２、ｏｈｄｓ、ｏｈｓ、ｏｉａｓ、ｏｉｐ１、ｏｋ、ｏｌｆ１、ｏｌｆｍｆ、ｏｌｆｒ１、ｏｌｆｒ２、ｏｍｇ、ｏｍｇｐ、ｏｍｐ、ｏｎ、ｏｐ２、ｏｐａ１、ｏｐａ２、ｏｐａ３、ｏｐｃａ３、ｏｐｃｍ１、ｏｐｄ１、ｏｐｇ１、ｏｐｈｎ１、ｏｐ１１、ｏｐｎ、ｏｐｐｇ、ｏｐｒｄ１、ｏｐｒｋ１、ｏｐｒｍ１、ｏｐｒｔ、ｏｐｔａ２、ｏｐｔｂ１、ｏｑｔ１、ｏｒｌｄ２、ｏｒｌｆ１、ｏｒｃ１１、ｏｒｃ２１、ｏｒｃ４１、ｏｒｃ５１、ｏｒｆｘ、ｏｒｍ１、ｏｒｍ２、ｏｒｗ、ｏｓｂｐ、ｏｓｍ、ｏｓｐ、ｏｓｔ、ｏｓｔ４８、ｏｓｘ、ｏｔｃ、ｏｔｆ１、ｏｔｆ２、ｏｔｆ３、ｏｔｍ、ｏｔｏｆ、ｏｔｓ、ｏｔｘ１、ｏｔｘ２、ｏｖｃ、ｏｖｃｓ、ｏｖｏ１１、ｏｘ４０、ｏｘａ１１、ｏｘｃｔ、ｏｘｔ、ｏｘｔｒ、ｏｚｆ、ｐ、ｐ、ｐ１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１６７、ｐ２８、ｐ２ｒｘ３、ｐ２ｒｘ４、ｐ２ｒｙ１、ｐ２ｒｙ２、ｐ２ｒｙ４、ｐ２ｒｙ７、ｐ２ｕ、ｐ２ｘ３、ｐ２ｘ４、ｐ２ｙ１、ｐ２ｙ２、ｐ２ｙ２、ｐ２ｙ４、ｐ３ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４５０ｃ１１、ｐ４５０ｃ１７、ｐ４５０ｃ２ａ、ｐ４５０ｃ２ｄ、ｐ４５０ｃ２ｅ、ｐ４５０ｓｃｃ、ｐ４ｈａ、ｐ４ｈａ１、ｐ４ｈａ１、ｐ４ｈｂ、ｐ５ｃｄｈ、ｐ７９ｒ、ｐａ２ｇ４、ｐａｂ１、ｐａｂ２、ｐａｂｐ２、ｐａｂｐ１１、ｐａｃ１、ｐａｃ１、ｐａｃａｐｒ、ｐａｃｅ、ｐａｃｅ４、ｐａｅｐ、ｐａｆ１、ｐａｆ２、ｐａｆａｈ、ｐａｆａｈ１ｂ１、ｐａｆａｈ１ｂ２、ｐａｆａｈ１ｂ３、ｐａｇａ、ｐａｈ、ｐａｈｘ、ｐａｉ１、ｐａｉ２、ｐａｉｃｓ、ｐａｋ１、ｐａｋ３、ｐａｌｂ、ｐａｌｓ、ｐａｍ、ｐａｎｇ、ｐａｐ、ｐａｐａ、ｐａｐａ２、ｐａｐｐａ、ｐａｒ１、ｐａｒ１、ｐａｒ２、ｐａｒ３、ｐａｒ４、ｐａｒ４、ｐａｒ５、ｐａｒｋ１、ｐａｒｋ２、ｐａｒｋ３、ｐａｗｒ、ｐａｘ１、ｐａｘ２、ｐａｘ３、ｐａｘ４、ｐａｘ５、ｐａｘ６、ｐａｘ７、ｐａｘ８、ｐａｘ９、ｐｂｃａ、ｐｂｃｒａ、ｐｂｆｅ、ｐｂｇ ｐｂｔ、ｐｂｘ１、ｐｂｘ２、ｐｂｘ３、ｐｃ、ｐｃ１、ｐｃ２、ｐｃ３、ｐｃ３、ｐｃａ１、ｐｃａｄ、ｐｃａｐ、ｐｃａｒ１、ｐｃｂｃ、ｐｃｂｄ、ｐｃｂｐ１、ｐｃｂｐ２、ｐｃｃａ、ｐｃｃｂ、ｐｃｄｈ７、ｐｃｄｘ、ｐｃｈｃ、ｐｃｈｃ１、ｐｃｉ、ｐｃｋ１、ｐｃ１、ｐｃ１ｐ、ｐｃｍ１、ｐｃｍ１、ｐｃｍｔ１、ｐｃｎａ、ｐｃｎｔ、ｐｃｏｌｃｅ、ｐｃｐ、ｐｃｐ４、ｐｃｓ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２、ｐｃｓｋ３、ｐｃｓｋ４、ｐｃｓｋ５、ｐｃｓｋ６、ｐｃｔｋ１、ｐｃｔｋ３、ｐｃｙｔ１、ｐｄｂ、ｐｄｂ２、ｐｄｃ、ｐｄｃ、ｐｄｃｄ１、ｐｄｃｄ２、ｐｄｄｒ、ｐｄｅ１ａ、ｐｄｅ１ｂ、ｐｄｅ１ｂ１、ｐｄｅ３ｂ、ｐｄｅ４ａ、ｐｄｅ４ｂ、ｐｄｅ４ｃ、ｐｄｅ４ｄ、ｐｄｅ５ａ、ｐｄｅ６ａ、ｐｄｅ６ｂ、ｐｄｅ６ｃ、ｐｄｅ６ｄ、ｐｄｅ６ｇ、ｐｄｅ６ｈ、ｐｄｅ７ａ、ｐｄｅａ、ｐｄｅａ２、ｐｄｅｂ ｐｄｅｂ、ｐｄｅｇ、ｐｄｅｓｌｂ、ｐｄｇｂ、ｐｄｇｆａ、ｐｄｇｆｂ、ｐｄｇｆｒ、ｐｄｇｆｒａ、ｐｄｇｆｒｂ、ｐｄｈａ１、ｐｄｈａ２、ｐｄｈｂ、ｐｄｊ、ｐｄｋ４、ｐｄｎｐ１
、ｐｄｎｐ２、ｐｄｎｐ３、ｐｄｒ、ｐｄｓ、ｐｄｓ１、ｐｄｘ１、ｐｄｙｎ、ｐｅ１、ｐｅａ１５、ｐｅｂｐ２ａ１、ｐｅｂｐ２ａ３、ｐｅｃａｍ１、ｐｅｄ、ｐｅｄ、ｐｅｄｆ、ｐｅｅ、ｐｅｇ１、ｐｅｇ３、ｐｅｍｐ、ｐｅｎｋ、ｐｅｎｔ、ｐｅｏ、ｐｅｏ１、ｐｅｏ２、ｐｅｐａ、ｐｅｐｂ、ｐｅｐｃ、ｐｅｐｄ、ｐｅｐｅ、ｐｅｐｎ、ｐｅｐｓ、ｐｅｒ、ｐｅｒ２、ｐｅｔａ３、ｐｅｔｓ１、ｐｅｘ１、ｐｅｘ５、ｐｅｘ６、ｐｅｘ７、ｐｆ４、ｐｆ４ｖ１、ｐｆａｓ、ｐｆｂｉ、ｐｆｃ、ｐｆｄ、ｐｆｈｂ１、ｐｆｉｃ１、ｐｆｉｃ２、ｐｆｋｆｂ１、ｐｆｋｆｂ２、ｐｆｋ１、ｐｆｋ−ｍｎ、ｐｆｋｐ、ｐｆｋｘ、ｐｆ１、ｐｆｍ、ｐｆｎ１、ｐｆｎ２、ｐｆｒｘ、ｐｇａ３、ｐｇａ４、ｐｇａ５、ｐｇａｍ１、ｐｇａｍ２、ｐｇａｍｍ、ｐｇｃ、ｐｇｄ、ｐｇｆ、ｐｇｆｔ、ｐｇｋ１、ｐｇｋ２、ｐｇｋａ、ｐｇ１、ｐｇｌ１、ｐｇｌ２、ｐｇｍ１、ｐｇｍ２、ｐｇｍ３、ｐｇｍ５、ｐｇｎ、ｐｇｐ、ｐｇｐ１、ｐｇｒ、ｐｇｓ、ｐｇｔ、ｐｇｙ１、ｐｇｙ３、ｐｈａ１、ｐｈａ２、ｐｈａ２ａ、ｐｈａ２ｂ、ｐｈａｐ１、ｐｈｂ、ｐｈｃ、ｐｈｅ１ａ、ｐｈｅ３、ｐｈｅｘ、ｐｈｆ１、ｐｈｈｉ、ｐｈｈｉ、ｐｈｋ、ｐｈｋａ１、ｐｈｋａ２、ｐｈｋｂ、ｐｈｋｄ、ｐｈｋｇ１、ｐｈｋｇ２、ｐｈ１、ｐｈｌ１１、ｐｈｏｇ、ｐｈｏｘ１、ｐｈｏｘ２ａ、ｐｈｐ、ｐｈｐ１ｂ、ｐｈｐｘ、ｐｈｙｈ、ｐｉ、ｐｉ１０、ｐｉ３、ｐｉ４、ｐｉ５、ｐｉ６、ｐｉ７、ｐｉ８、ｐｉ９、ｐｉｇａ、ｐｉｇｃ、ｐｉｇｆ、ｐｉｇｈ、ｐｉｇｒ、ｐｉｋ３ｃ２ｂ、ｐｉｋ３ｃａ、ｐｉｋ３ｒ１、ｐｉｋ４ｃｂ、ｐｉ１、ｐｉｍ１、ｐｉｎ、ｐｉｎ１、ｐｉｎ１１、ｐｉｐ、ｐｉｐ５ｋ１ｂ、ｐｉｒ１、ｐｉｒ５１、ｐｉｔ、ｐｉｔ１、ｐｉｔｐｎ、ｐｉｔｘ１、ｐｉｔｘ２、ｐｉｔｘ３、ｐｊｓ、ｐｋ１、ｐｋ１２０、ｐｋ３、ｐｋ４２８、ｐｋｃａ、ｐｋｃｂ、ｐｋｃｃ、ｐｋｃｇ、ｐｋｃｓ１、ｐｋｄ１、ｐｋｄ２、ｐｋｄ４、ｐｋｄｔｓ、ｐｋｈｄ１、ｐｋｌｒ、ｐｋｍ２、ｐｋｐ１、ｐｋｓ１、ｐｋｓ１、ｐｋｓ２、ｐｋｕ１、ｐｌ、ｐｌａ２、ｐｌａ２ａ、ｐｌａ２ｂ、ｐｌａ２ｇ１ｂ、ｐｌａ２ｇ２ａ、ｐｌａ２ｇ４、ｐｌａ２ｇ４ａ、ｐｌａ２ｇ５、ｐｌａ２１、ｐｌａ２１、ｐｌａｇ１、ｐｌａｇ１１、ｐｌａｎｈ１、ｐｌａｎｈ２、ｐｌａｎｈ３、ｐｌａｔ、ｐｌａｕ、ｐｌａｕｒ、ｐｌｂ、ｐｌｃ、ｐｌｃ１、ｐｌｃｂ３、ｐｌｃｂ４、ｐｌｃｄ１、ｐｌｃｅ、ｐｌｃｇ１、ｐｌｃｇ２、ｐｌｃ１、ｐｌｄ１、ｐｌｅｃ１、ｐｌｇ、ｐｌｇｆ、ｐｌｇ１、ｐｌｉ、ｐｌｎ、ｐｌｏｄ、ｐｌｏｄ２、ｐｌｏｓ１、ｐｌｐ、ｐｌｓ、ｐｌｓ１、ｐｌｔ１、ｐｌｔｎ、ｐｌｔｐ、ｐｌｚｆ、ｐｍｃａ１、ｐｍｃａ２、ｐｍｃａ３、ｐｍｃａ４、ｐｍｃｈ、ｐｍｃｈ１１、ｐｍｃｈ１２、ｐｍｄ、ｐｍｅ１１７、ｐｍｉ１、ｐｍ１、ｐｍｍ１、ｐｍｍ２、ｐｍｐ２、ｐｍｐ２２、ｐｍｐ３５、ｐｍｐ６９、ｐｍｐ７０、ｐｍｓ１、ｐｍｓ２、ｐｍｓ１１、ｐｍｓ１２、ｐｍｘ１、ｐｎ１、ｐｎｄ、ｐｎｅｍ、ｐｎｋｄ、ｐｎｌｉｐ、ｐｎｍｔ、ｐｎｏｃ、ｐｏｄ１、ｐｏｄｘ１、ｐｏｆ、ｐｏｆ１、ｐｏ１２ｒｂ、ｐｏｌａ、ｐｏｌｂ、ｐｏｌｄ１、ｐｏｌｄ２、ｐｏｌｅ、ｐｏｌｇ、ｐｏｌｒ２ａ、ｐｏｌｒ２ｃ、ｐｏｌｒ２ｅ、ｐｏｌｒ２ｇ、ｐｏｌｒ２ｉ、ｐｏｌｒｍｔ、ｐｏｌｚ、ｐｏｍｃ、ｐｏｎ、ｐｏｎ１、ｐｏｎ２、ｐｏｎ３、ｐｏｒ、ｐｏｒｃ、ｐｏｔｘ、ｐｏｕ１ｆ１、ｐｏｕ２ａｆ１、ｐｏｕ３ｆ１、ｐｏｕ３ｆ２、ｐｏｕ３ｆ３、ｐｏｕ３ｆ４、ｐｏｕ４ｆ１、ｐｏｕ４ｆ３、ｐｏｕ５ｆ１、ｐｐ、ｐｐｌ４、ｐｐ２、ｐｐ４、ｐｐ５、ｐｐａｃ、ｐｐａｒｄ、ｐｐａｒｇ、ｐｐａｒｇ１、ｐｐａｒｇ２、ｐｐａｔ、ｐｐｂｐ、ｐｐｃｄ、ｐｐｄ、ｐｐｅｆ１、ｐｐｅｆ２、ｐｐｆｉａ３、ｐｐｇｂ、ｐｐｈ、ｐｐｈ１、ｐｐｉａ、ｐｐｉｄ、ｐｐｉｌ１、ｐｐｋｂ、ｐｐｋｓ１、ｐｐｋｓ２、ｐｐ１、ｐｐｌａ２、ｐｐｍｘ、ｐｐｎｄ、ｐｐｎｏｃ、ｐｐｏ１、ｐｐｏｘ、ｐｐｐ１ａ、ｐｐｐ１ｃａ、ｐｐｐ１ｃｂ、ｐｐｐ１ｃｃ、ｐｐｐ１ｒ２、ｐｐｐ１ｒ５、ｐｐｐ１ｒ７、ｐｐｐｄ１ｒ８、ｐｐｐ２ｂ、ｐｐｐ２ｃａ、ｐｐｐ２ｃｂ、ｐｐｐ２ｒ１ｂ、ｐｐｐ２ｒ４、ｐｐｐ２ｒ５ａ、ｐｐｐ２ｒ５ｂ、ｐｐｐ２ｒ５ｃ、ｐｐｐ２ｒ５ｄ、ｐｐｐ２ｒ５ｅ、ｐｐｐ３ｃａ、ｐｐｐ３ｃｂ、ｐｐｐ３ｃｃ、ｐｐ３ｒ１、ｐｐｐ４ｃ、ｐｐｐ５ｃ、ｐｐｔ、ｐｐｔ２、ｐｐｘ、ｐｐｙ、ｐｐｙｒ１、ｐｒ＠、ｐｒａｄ１、ｐｒｂ１、ｐｒｂ２、ｐｒｂ３、ｐｒｂ４、ｐｒｃａ１、ｐｒｃａ２、ｐｒｃｃ、ｐｒｃｐ、ｐｒｅ１ｐ、ｐｒｅｐ、ｐｒｆ１、ｐｒｇ、ｐｒｇ１、ｐｒｇ１、ｐｒｇｓ、ｐｒｈ１、ｐｒｈ２、ｐｒｉｍ１、ｐｒｉｍ２ａ、ｐｒｉｍ２ｂ、ｐｒｉｐ、ｐｒｋ１、ｐｒｋａａ１、ｐｒｋａａ２、ｐｒｋａｂ１、ｐｒｋａｃａ、ｐｒｋａｃｂ、ｐｒｋａｃｇ、ｐｒｋａｇ１、ｐｒｋａｇ２、ｐｒｋａｒ１ａ、ｐｒｋａｒ１ｂ、ｐｒｋａｒ２ｂ、ｐｒｋｃａ、ｐｒｋｃｂ１、ｐｒｋｃｄ、ｐｒｋｃｇ、ｐｒｋｃｉ、ｐｒｋｃｌ１、ｐｒｋｃｎｈ１、ｐｒｋｃｑ、ｐｒｋｃｓｈ、ｐｒｋｄｃ、ｐｒｋｇ１、ｐｒｋｇ１ｂ、ｐｒｋｇ２、ｐｒｋｇｒ１ｂ、ｐｒｋｇｒ２、ｐｒｋｍ１、ｐｒｋｍ３、ｐｒｋｍ４、ｐｒｋｍ９、ｐｒｋｎ、ｐｒｋｒ、ｐｒｋｘ、ｐｒｋｙ、ｐｒ１、ｐｒｌｒ、ｐｒｍ１、ｐｒｍ２、ｐｒｍｔ２、ｐｒｎｐ、ｐｒｏａ、ｐｒｏｃ、ｐｒｏｄｈ、ｐｒｏｈｂ、ｐｒｏｐ１、ｐｒｏｓ１、ｐｒｏｓ３０、ｐｒｏｘ１、ｐｒｐ８、ｐｒｐｈ、ｐｒｐｓ１、ｐｒｐｓ２、ｐｉｐｓａｐ１、ｐｒｒ１、ｐｒｒ２、ｐｒｓ、ｐｒｓｃ１、ｐｒｓｓ１、ｐｒｓｓｌ１、ｐｒｓｓ２、ｐｒｓｓ７、ｐｒｓｓ８、ｐｒｓｓ１１、ｐｒｔｎ３、ｐｒｔｓ、ｐｓａ、ｐｓａ、ｐｓａｃｈ、ｐｓａｐ、ｐｓｂｇ１、ｐｓｂｇ２、ｐｓｃ２、ｐｓｃ５、ｐｓｃａ、ｐｓｄ、ｐｓｅｎ１、ｐｓｅｎ２、ｐｓｆ１、ｐｓｆ２、ｐｓｇ１、ｐｓｇ１１、ｐｓｇ１２、ｐｓｇ１３、ｐｓｇ２、ｐｓｇ３、ｐｓｇ４、ｐｓｇ５、ｐｓｇ６、ｐｓｇ７、ｐｓｇ８、ｐｓｇ１１、ｐｓｋｈ１、ｐｓｍ、ｐｓｍａ１、ｐｓｍａ２、ｐｓｍａ３、ｐｓｍａ５、ｐｓｍｂ１、ｐｓｍｂ１０、ｐｓｍｂ２、ｐｓｍｂ３、ｐｓｍｂ４、ｐｓｍｂ５、ｐｓｍｂ８、ｐｓｍｂ９、ｐｓｍｃ１、ｐｓｍｃ２、ｐｓｍｃ３、ｐｓｍｃ５、ｐｓｍｄ７、ｐｓｍｄ９、ｐｓｍｅ１、ｐｓｍｅ２、ｐｓｏｒｓ１、ｐｓｏｒｓ２、ｐｓｏｒｓ３、ｐｓｐ、ｐｓｐｓ１、ｐｓｐｓ２、ｐｓｓ１、ｐｓｓｔ、ｐｓｔ、ｐｓｔ、ｐｓｔ１、ｐｓｔｉ、ｐｔａｆｒ、ｐｔｃ、ｐｔｃ、ｐｔｃ、ｐｔｃｈ、ｐｔｄ、ｐｔｅｎ、ｐｔｇｄｓ、ｐｔｇｅｒ１、ｐｔｇｅｒ２、ｐｔｇｅｒ３、ｐｔｇｆｒ、ｐｔｇｆｒｎ、ｐｔｇｉｒ、ｐｔｇｓ１、ｐｔｇｓ２、ｐｔｈ、ｐｔｈｌｈ、ｐｔｈｒ、ｐｔｈｒ１、ｐｔｈｒ２、ｐｔｋ１、ｐｔｋ２、ｐｔｋ２ｂ、ｐｔｋ３、ｐｔｋ７、ｐｔｌａｈ、ｐｔｍａ、ｐｔｍｓ、ｐｔｎ、ｐｔｏｓ１、ｐｔｐ１８、ｐｔｐ１ｂ、ｐｔｐ４ａ１、ｐｔｐ４ａ２、ｐｔｐａ、ｐｔｐａ、ｐｔｐｄ、ｐｔｐｇ、ｐｔｐｇ１、ｐｔｐｇｍｃ１、ｐｔｐｎ１、ｐｔｐｎ１０、ｐｔｐｎ１１、ｐｔｐｎ１２、ｐｔｐｎ１３、ｐｔｐｎ１４、ｐｔｐｎ２、ｐｔｐｎ５、ｐｔｐｎ６、ｐｔｐｎ７、ｐｔｐｒａ、ｐｔｐｒｂ、ｐｔｐｒｃ、ｐｔｐｒｃａｐ、ｐｔｐｒｄ、ｐｔｐｒｅ、ｐｔｐｒｆ、ｐｔｐｒｇ、ｐｔｐｒｈ、ｐｔｐｒｊ、ｐｔｐｒｋ、ｐｔｐｒ１１、ｐｔｐｒｌ２、ｐｔｐｒｍ、ｐｔｐｒｎ、ｐｔｐｒｏ、ｐｔｐｒｓ、ｐｔｐｒｚ１、ｐｔｐｔ、ｐｔｓ、ｐｔｓ１ｒ、ｐｔｘ１、ｐｔｘ３、ｐｕｊｏ、ｐｕｍ、ｐｕｒ１、ｐｕｒ１、ｐｕｒａ、ｐｖａｌｂ、ｐｖｒ、ｐｖｒ１１、ｐｖｒ１２、ｐｖｒｒ１、ｐｖｒｒ２、ｐｖｓ、ｐｖｔ１、ｐｗｃｒ、ｐｗｐ２、ｐｗｐ２ｈ、ｐｗｓ、ｐｘａａａ１、ｐｘｅ、ｐｘｅ１、ｐｘｆ、ｐｘｍｐ１、ｐｘｍｐ１１、ｐｘｍｐ３、ｐｘｒ１、ｐｙｃｒ１、ｐｙｃｓ、ｐｙｇｂ、ｐｙｇ１、ｐｙｇｍ、ｐｙｋ２、ｐｙｓｔ１、ｐｙｓｔ２、ｐｚｐ、ｑａｒｓ、ｑｄｐｒ、ｑｉｎ、ｑｍ、ｑｐｃ、ｑｐｒｓ、ｒａｂ、ｒａｂ１、ｒａｂ１３、ｒａｂ１ａ、ｒａｂ２１、ｒａｂ３ａ、ｒａｂ３ｂ、ｒａｂ４、ｒａｂ５、ｒａｂ５ａ、ｒａｂ６、ｒａｂ７、ｒａｂｇｄｌａ、ｒａｂｇｄｉｂ、ｒａｂｇｇｔａ、ｒａｂｇｇｔｂ、ｒａｂｉｆ、ｒａｃ２、ｒａｃ３、ｒａｄ１、ｒａｄ１７、ｒａｄ２３ａ、ｒａｄ２３ｂ、ｒａｄ５１ａ、ｒａｄ５１ｃ、ｒａｄ５１ｄ、ｒａｄ５３１１、ｒａｄ５２、ｒａｄ５４、ｒａｄ６ａ、ｒａｄ６ｂ、ｒａｆ１、ｒａｆａ１、ｒａｇ１、ｒａｇ２、ｒａｇｅ、ｒａｌａ、ｒａｌｂ、ｒａｌｇｄｓ、ｒａｍｐ、ｒａｎｂｐ２１１、ｒａｎｂｐ３、ｒａｏ、ｒａｐ１ａ、ｒａｐ１ｂ、ｒａｐ１ｇａ１、ｒａｐ１ｇｄｓ１、ｒａｐ２ａ、ｒａｐ７４、ｒａｐｓｎ、ｒａｒａ、ｒａｒｂ、ｒａｒｇ、ｒａｒｓ、ｒａｓａ１、ｒａｓａ２、ｒａｓｇｆｒ３、ｒａｓｋ２、ｒｂ１、ｒｂｂｐ２、ｒｂｂｐ５、ｒｂｂｐ６、ｒｂ１１、ｒｂ１２、ｒｂｍ１、ｒｂｍ２、ｒｂｍ３、ｒｂｍｙ１ａ１、ｒｂｐ１、ｒｂｐ２、ｒｂｐ３、ｒｂｐ４、ｒｂｐ５、ｒｂｐ５６、ｒｂｐ６、ｒｂｑ３、ｒｂｔｎ１、ｒｂｔｎ１１、ｒｂｔｎ１２、ｒｃａ１、ｒｃａｃ＠、ｒｃｃ１、ｒｃｃｐ１、ｒｃｃｐ２、ｒｃｄ１、ｒｃｄ２、ｒｃｄｐ１、ｒｃｎ１、ｒｃｎ２、ｒｃｐ、ｒｃｖ１、ｒｄ、ｒｄｂｐ、ｒｄｃ７、ｒｄｐ、ｒｄｐａ、ｒｄｒｃ、ｒｄｓ、ｒｄｔ、ｒｄｘ、ｒｅｃａ、ｒｅｃｃ１、ｒｅｃｑ１、ｒｅｄ１、ｒｅｄ２、ｒｅｇ、ｒｅｇ１ａ、ｒｅｇ１、ｒｅ１、ｒｅｌａ、ｒｅｌｎ、ｒｅｎ、ｒｅｎｂｐ、ｒｅｎｓ１、ｒｅｎｔ１、ｒｅｐ８、ｒｅｑ、ｒｅｔ、ｒｅｖ３、ｒｅｖ３１、ｒｆｃ１、ｒｆｃ２、ｒｆｃ３、ｒｆｃ４、ｒｆｃ５、ｒｆｐ、ｒｆｘ１、ｒｆｘ２、ｒｆｘ５、ｒｆｘａｎｋ、ｒｆｘａｐ、ｒｇｃ１、ｒｇｒ、ｒｇｓ、ｒｇｓ１、ｒｇｓ１４、ｒｇｓ１６、ｒｇｓ２、ｒｇｓ２、ｒｇｓ３、ｒｇｓ５、ｒｈ５０ａ、ｒｈａｇ、ｒｈｂｄ１、ｒｈｃ、ｒｈｃｅ、ｒｈｄ、ｒｈｅｂ２、ｒｈｏ、ｒｈｏ７、ｒｈｏｇａｐ２、ｒｈｏｇａｐ３、ｒｈｏｈ１２、ｒｈｏｈ６、ｒｈｏｈ９、ｒｈｏｋ、ｒｈｏｍ１、ｒｈｏｍ２、ｒｈｏｍ３、ｒｉｅｇ１、ｒｉｅｇ２、ｒｉｇｅ、ｒｉｇｕｉ、ｒｉｎｇ１、ｒｉｎｇ１０、ｒｉｎｇ１１、ｒｉｎｇ１２、ｒｉｎｇ３、ｒｉｎｇ３１、ｒｉｎｇ４、ｒｉｎｇ５、ｒｉｎｇ６、ｒｉｎｇ７、ｒｉｐ、ｒｉｐ１４０、ｒｉｚ、ｒｋ、ｒ１、ｒｌｂｐ１、ｒｌｆ、ｒｌｎ１、ｒｌｎ２、ｒｍｃｈ１、ｒｍｄ１、ｒｍｒｐ、ｒｍｒｐｒ、ｒｎ５ｓ１＠、ｒｎａｓｅ１、ｒｎａｓｅ２、ｒｎａｓｅ３、ｒｎａｓｅ４、ｒｎａｓｅ５、ｒｎａｓｅ６、ｒｎａｓｅ１、ｒｎａｓｅｌｉ、ｒｎｅ１、ｒｎｆ１、ｒｎｆ３、ｒｎｆ４、ｒｎｆ５、ｒｎｈ、ｒｎｐｅｐ、ｒｎｐｕｌｚ、ｒｎｒ１、ｒｎｒ２、ｒｎｒ３、ｒｎｒ４、ｒｎｒ５、ｒｎｓ１、ｒｎｓ２、ｒｎｓ３、ｒｎｓ４、ｒｎｓ４、ｒｎｓ４ｉ、ｒｎｔｍｉ、ｒｎｕ１、ｒｎｕ１５ａ、ｒｎｕ１７ａ、ｒｎｕ１７ｂ、ｒｎｕｌａ、ｒｎｕ２、ｒｎｕ３、ｒｏ５２、ｒｏｍ１、ｒｏｍｋ１、ｒｏｎ、ｒｏｒ１、ｒｏｒａ、ｒｏｒｂ、ｒｏｒｃ、ｒｏｒｇ、ｒｏｓ１、ｒｏｓｐ１、ｒｏｘ、ｒｐ１、ｒｐ１０、ｒｐ１０５、ｒｐ１１、ｒｐ１２、ｒｐ１３、ｒｐ１４、ｒｐ１５、ｒｐ１７、ｒｐ１８、ｒｐ１９、ｒｐ２、ｒｐ２２、ｒｐ２４、ｒｐ２５、ｒｐ３、ｒｐ４、ｒｐ６、ｒｐ７、ｒｐ９、ｒｐａ１、ｒｐａ２、ｒｐａ３、ｒｐｄ３１１、ｒｐｅ、ｒｐｅ６５、ｒｐｅ１１９ｒｐ１２２、ｒｐ１２３ａ、ｒｐ１２３１、ｒｐ１２９、ｒｐ１３０、ｒｐ１３５ａ、ｒｐ１３６ａ、ｒｐ１７ａ、ｒｐｍｓ１２、ｒｐｎ１、ｒｐｎ２、ｒｐｏ１２、ｒｐｓ１１、ｒｐｓ１４、ｒｐｓ１７、ｒｐｓ１７ａ、ｒｐｓ１７ｂ、ｒｐｓ１７１１、ｒｐｓ１７１２、ｒｐｓ１８、ｒｐｓ２０ａ、ｒｐｓ２０ｂ、ｒｐｓ２４、ｒｐｓ２５、ｒｐｓ３、ｒｐｓ４ｘ、ｒｐｓ４ｙ、ｒｐｓ６、ｒｐｓ６ｋａ１、ｒｐｓ６ｋａ２、ｒｐｓ６ｋａ３、ｒｐｓ８、ｒｐｓｍ１２、ｒｐｔｐｍ、ｒｐｕ１、ｒｐｘ、ｒｒａｄ、ｒｒａｓ、ｒｒｂｐ１、ｒｒｅｂ１、ｒｒｍ１、ｒｒｍ２、ｒｒｐ、ｒｒｐ２２、ｒｓ１、ｒｓ１、ｒｓｃｌａ１、ｒｓｋ１、ｒｓｋ２、ｒｓｋ３、ｒｓｎ、ｒｓｓ、ｒｓｔｓ、ｒｓｕ１、ｒｔ６、ｒｔｅｆ
１、ｒｔｋｎ、ｒｔｎ１、ｒｔｎ２、ｒｔｓ、ｒｔｓ、ｒｔｔ、ｒｗｓ、ｒｘｒａ、ｒｘｒｂ、ｒｘｒｇ、ｒｙｒ１、ｒｙｒ２、ｒｙｒ３、ｒｚｒｂ、ｒｚｒｇ、ｓ１００ａ１、ｓ１００ａ１０、ｓ１００ａ１１、ｓ１００ａ１２、ｓ１００ａ１３、ｓ１００ａ２、ｓ１００ａ３、ｓ１００ａ４、ｓ１００ａ５、ｓ１００ａ６、ｓ１００ａ７、ｓ１００ａ８、ｓ１００ａ９、ｓ１００ｂ、ｓ１００ｄ、ｓ１００ｅ、ｓ１００、ｓ１００ｐ、ｓ１５２、ｓ４、ｓ７、ｓａａ１、ｓａａ２、ｓａａ４、ｓａｃｓ、ｓａｆｂ、ｓａｇ、ｓａｈ、ｓａｈｈ、ｓａｉ１、ｓａｋａｐ８４、ｓａｌ１１、ｓａｌ１２、ｓａｍｓ１、ｓａｍｓ２、ｓａｐ、ｓａｐ１、ｓａｐ１、ｓａｐ２、ｓａｐ６２、ｓａｒ、ｓａｒ１、ｓａｒ２、ｓａｒｄ、ｓａｓ、ｓａｔ、ｓａｔｂ１、ｓａｔｔ、ｓｂｍａ、ｓｃ、ｓｃ１、ｓｃ５ｄ１、ｓｃａ１、ｓｃａ１０、ｓｃａ２、ｓｃａ２、ｓｃａ３、ｓｃａ４、ｓｃａ５、ｓｃａ６、ｓｃａ７、ｓｃａ８、ｓｃａ８、ｓｃａｒ、ｓｃｃａ１、ｓｃｃａ２、ｓｃｃｄ、ｓｃｄ、ｓｃｅｈ、ｓｃｇ１、ｓｃｇ２、ｓｃｇ３、ｓｃｈａｄ、ｓｃｉｄａ、ｓｃｉｄｘ、ｓｃｉｄｘ１、ｓｃ１、ｓｃｌｃ１、ｓｃｌ１、ｓｃｎ、ｓｃｎ１ａ、ｓｃｎ１ｂ、ｓｃｎ２ａ、ｓｃｎ２ａ１、ｓｃｎ２ａ２、ｓｃｎ２ｂ、ｓｃｎ３ａ、ｓｃｎ４ａ、ｓｃｎ５ａ、ｓｃｎ６ａ、ｓｃｎ８ａ、ｓｃｎｎ１ａ、ｓｃｎｎ１ｂ、ｓｃｎｎ１ｄ、ｓｃｎｎ１ｇ、ｓｃｏｔ、ｓｃｐ、ｓｃｐ１、ｓｃｐ２、ｓｃｐｎ、ｓｃｒａ１、ｓｃｒａ１、ｓｃｓ、ｓｃｔｒ、ｓｃｙａ１、ｓｃｙａ１１、ｓｃｙａ１３、ｓｃｙａ１４、ｓｃｙａ１５、ｓｃｙａ１６、ｓｃｙａ１９、ｓｃｙａ２、ｓｃｙａ２１、ｓｃｙａ２２、ｓｃｙａ２４、ｓｃｙａ２５、ｓｃｙａ３、ｓｃｙａ３１１、ｓｃｙａ４、ｓｃｙａ５、ｓｃｙａ７、ｓｃｙａ８、ｓｃｙｂ５、ｓｃｙｂ６、ｓｃｙｄ１、ｓｃｚｄ１、ｓｃｚｄ２、ｓｃｚｄ３、ｓｃｚｄ４、ｓｃｚｄ５、ｓｃｚｄ６、ｓｃｚｄ７、ｓｃｚｄ８、ｓｄｃ１、ｓｄｃ２、ｓｄｃ４、ｓｄｆ１、ｓｄｆ２、ｓｄｈ１、ｓｄｈ２、ｓｄｈａ、ｓｄｈｂ、ｓｄｈｃ、ｓｄｈｄ、ｓｄｈｆ、ｓｄｓ２２、ｓｄｔｙ３、ｓｄｙｓ、ｓｅ、ｓｅａ、ｓｅｃ１３１１、ｓｅｃ１３ｒ、ｓｅｃ１４ｌ、ｓｅｃ７、ｓｅｄ１、ｓｅｄｔ、ｓｅｆ２、ｓｅｌ１ｌ、ｓｅｌｅ、ｓｅｌ１、ｓｅｌｐ、ｓｅｌｐ１ｇ、ｓｅｍａ３ｆ、ｓｅｍａ４、ｓｅｍａ５、ｓｅｍｇ、ｓｅｍｇ１、ｓｅｍｇ２、ｓｅｎ１、ｓｅｐ、ｓｅｐｐ１、ｓｅｒｃａ１、ｓｅｒｃａ３、ｓｅｒｋ１、ｓｅｓ１、ｓｅｔ、ｓｅｘ、ｓｆ、ｓｆ１、ｓｆａ１、ｓｆｄ、ｓｆｍｄ、ｓｆｒｓ１、ｓｆｒｓ２、ｓｆｒｓ７、ｓｆｔｂ３、ｓｆｔｐ１、ｓｆｔｐ２、ｓｆｔｐ４、ｓｆｔｐａ１、ｓｆｔｐａ２、ｓｆｔｐｂ、ｓｆｔｐｃ、ｓｆｔｐｄ、ｓｇｂ、ｓｇｃａ、ｓｇｃｂ、ｓｇｃｄ、ｓｇｃｇ、ｓｇｄ、ｓｇｋ、ｓｇｌｔ１、ｓｇｌｔ２、ｓｇｍ１、ｓｇｎｅ１、ｓｇｐ２、ｓｇｐａ、ｓｇｓｈ、ｓｈ２ｄ１ａ、ｓｈ３ｂｐ２、ｓｈ３ｄ１ａ、ｓｈ３ｇｂｒ、ｓｈ３ｐ１７、ｓｈｂ、ｓｈｂｇ、ｓｈｃ１、ｓｈｃ１１、ｓｈｆｄ１、ｓｈｆｄ２、ｓｈｆｍ１、ｓｈｆｍ２、ｓｈｆｍ３、ｓｈｈ、ｓｈｉｐ、ｓｈｍｔ１、ｓｈｍｔ２、ｓｈｏｃ２、ｓｈｏｔ、ｓｈｏｘ、ｓｈｏｘ２、ｓｈｐｓ１、ｓｈｓ、ｓｈｓｆ１、ｓｉ、ｓｉａｈ１、ｓｉａｈ２、ｓｉａｓｄ、ｓｉａｔ１、ｓｉａｔ４、ｓｉａｔ４ｃ、ｓｉａｔ８、ｓｉｄｓ、ｓｉ１、ｓｉｌｖ、ｓｉｍ１、ｓｉｍ２、ｓｉｐａ１、ｓｉｓ、ｓｉｖ、ｓｉｘ１、ｓｉｘ５、ｓｊａ、ｓｊｓ、ｓｋｉ、ｓｋｉ２、ｓｋｉ２ｗ、ｓｋｉｖ２１、ｓｋｐ１ａ、ｓｋｐ１ｂ、ｓｋｐ２、ｓｌａ、ｓｌａｐ、ｓｌｂｐ、ｓｌｃ、ｓｌｃ１０ａ１、ｓｌｃ１０ａ２、ｓｌｃ１２ａ１、ｓｌｃ１２ａ２、ｓｌｃ１２ａ３、ｓｌｃ１４ａ１、ｓｌｃ１４ａ２、ｓｌｃ１５ａ１、ｓｌｃ１６ａ１、ｓｌｃ１６ａ２、ｓｌｃ１７ａ１、ｓｌｃ１７ａ２、ｓｌｃ１８ａ１、ｓｌｃ１８ａ２、ｓｌｃ１８ａ３、ｓｌｃ１９ａ１、ｓｌｃ１ａ１、ｓｌｃ１ａ２、ｓｌｃ１ａ３、ｓｌｃ１ａ４、ｓｌｃ１ａ５、ｓｌｃ２０ａ１、ｓｌｃ２０ａ２、ｓｌｃ２０ａ３、ｓｌｃ２１ａ２、ｓｌｃ２１ａ３、ｓｌｃ２２ａ１、ｓｌｃ２２ａ２、ｓｌｃ２２ａ５、ｓｌｃ２ａ１、ｓｌｃ２ａ２、ｓｌｃ２ａ３、ｓｌｃ２ａ４、ｓｌｃ２ａ５、ｓｌｃ２ｃ、ｓｌｃ３ａ１、ｓｌｃ４ａ１、ｓｌｃ４ａ２、ｓｌｃ４ａ６、ｓｌｃ５ａ１、ｓｌｃ５ａ２、ｓｌｃ５ａ３、ｓｌｃ５ａ５、ｓｌｃ６ａ１、ｓｌｃ６ａ１０、ｓｌｃ６ａ１２、ｓｌｃ６ａ２、ｓｌｃ６ａ３、ｓｌｃ６ａ４、ｓｌｃ６ａ６、ｓｌｃ６ａ８、ｓｌｃ６ａ９、ｓｌｃ７ａ１、ｓｌｃ７ａ２、ｓｌｃ７ａ４、ｓｌｃ７ａ５、ｓｌｃ７ａ７、ｓｌｃ８ａ１、ｓｌｃ８ａ２、ｓｌｃ９ａ１、ｓｌｃ９ａ２、ｓｌｃ９ａ３、ｓｌｃ９ａ４、ｓｌｃ９ａ５、ｓｌｄ、ｓｌｅ１、ｓｌｅｂ１、ｓｌｉｍ１、ｓｌｎ、ｓｌｏ、ｓｌｏｓ、ｓｌｐ７６、ｓｌｓ、ｓｌｕｇ、ｓｍ１、ｓｍ２２、ｓｍａ４、ｓｍａｄ１、ｓｍａｄ１、ｓｍａｄ２、ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ４、ｓｍａｄ５、ｓｍａｄ６、ｓｍａｄ７、ｓｍａｄ９、ｓｍａ１、ｓｍａｍ１、ｓｍａｒｃａ１、ｓｍａｒｃａ２、ｓｍａｒｃａ３、ｓｍａｒｃａ５、ｓｍａｒｃｂ１、ｓｍａｘ２、ｓｍｃ１、ｓｍｃｃ、ｓｍｃｒ、ｓｍｃｘ、ｓｍｃｙ、ｓｍｌ１、ｓｍｎ、ｓｍｎ１、ｓｍｎ２、ｓｍｎｒ、ｓｍｏ、ｓｍｏｈ、ｓｍｐｄ１、ｓｍｓ、ｓｍｔ３、ｓｍｔ３ｈ１、ｓｍｔｎ、ｓｍｕｂｐ２、ｓｎ、ｓｎａｐ２５、ｓｎａｔ、ｓｎｃａ、ｓｎｃｂ、ｓｎｃｇ、ｓｎｆ２ｈ、ｓｎｆ２１１、ｓｎｆ２１２、ｓｎｆ２１３、ｓｎｆ５、ｓｎ１、ｓｎｎ、ｓｎｒｐ７０、ｓｎｒｐａ、ｓｎｒｐｅ、ｓｎｒｐｎ、ｓｎｔ１、ｓｎｔ２ｂ１、ｓｎｔ２ｂ２、ｓｎｔｂ１、ｓｎｔ１、ｓｎｘ、ｓｏａｔ、ｓｏｄ１、ｓｏｄ２、ｓｏｄ３、ｓｏｌｈ、ｓｏｎ、ｓｏｒｄ、ｓｏｒ１１、ｓｏｓ１、ｓｏｓ２、ｓｏｘ１、ｓｏｘ１０、ｓｏｘ１１、ｓｏｘ２、ｓｏｘ２０、ｓｏｘ２２、ｓｏｘ３、ｓｏｘ４、ｓｏｘ９、ｓｐ１、ｓｐ１、ｓｐ３、ｓｐ３、ｓｐ４、ｓｐａ１、ｓｐａｇ１、ｓｐａｇ４、ｓｐａｍ１、ｓｐａｒｃ、ｓｐａｔ、ｓｐｂｐ、ｓｐｃｈ１、ｓｐｄ、ｓｐｆ３０、ｓｐｇ３ａ、ｓｐｇ４、ｓｐｇ５ａ、ｓｐｇ６、ｓｐｇ７、ｓｐｇ８、ｓｐｇ９、ｓｐｇｐ、ｓｐｇｙｌａ、ｓｐｈ２、ｓｐｉ１、ｓｐｉｎｋ１、ｓｐｋ、ｓｐｍｄ、ｓｐｎ、ｓｐｐ１、ｓｐｐ２、ｓｐｐｍ、ｓｐｒ、ｓｐｒｋ、ｓｐｒｒ１ａ、ｓｐｒｒ１ｂ、ｓｐｒｒ２ａ、ｓｐｒｒ２ｂ、ｓｐｒｒ２ｃ、ｓｐｒｒ３、ｓｐｓ１、ｓｐｓｍａ、ｓｐｔａ１、ｓｐｔａｎ１、ｓｐｔｂ、ｓｐｔｂｎ１、ｓｒａ１、ｓｒａ２、ｓｒｃ、ｓｒｃ１、ｓｒｃ１、ｓｒｃ２、ｓｒｄ５ａ１、ｓｒｄ５ａ２、ｓｒｅｂｆ１、ｓｒｅｂｆ２、ｓｒｉ、ｓｒｋ、ｓｒｍ、ｓｒｎ１、ｓｒｐ１４、ｓｒｐ１９、ｓｒｐ４６、ｓｒｐｒ、ｓｒｐｘ、ｓｒｓ、ｓｒｖｘ、ｓｒｙ、ｓｓ、ｓｓ、ｓｓａ、ｓｓａ１、ｓｓａ２、ｓｓａｄｈ、ｓｓａｖ１、ｓｓｂｐ、ｓｓｄｄ、ｓｓｒ２、ｓｓｒｃ、ｓｓｔ、ｓｓｔｒ１、ｓｓｔｒ２、ｓｓｔｒ３、ｓｓｔｒ４、ｓｓｔｒ５、ｓｓｘ１、ｓｓｘｔ、ｓｔ２、ｓｔ３、ｓｔ４、ｓｔ５、ｓｔ６、ｓｔ８、ｓｔａ、ｓｔａｃ、ｓｔａｍ、ｓｔａｒ、ｓｔａｔ、ｓｔａｔ１、ｓｔａｔ３、ｓｔａｔ４、ｓｔａｔ５、ｓｓｘ１、ｓｔｃ１、ｓｔｃｈ、ｓｔｄ、ｓｔｄ、ｓｔｅ、ｓｔｅｐ、ｓｔｆ１、ｓｔｆａ、ｓｔｆｂ、ｓｔｇｄ１、ｓｔｇｄ２、ｓｔｇｄ３、ｓｔｇｄ４、ｓｔｈｅ、ｓｔｋ１、ｓｔｋ１１、ｓｔｋ１５、ｓｔｋ２、ｓｔｋ６、ｓｔ１、ｓｔｍ、ｓｔｍ２、ｓｔｍ７、ｓｔｍｙ１、ｓｔｍｙ２、ｓｔｍｙ３、ｓｔｐ、ｓｔｐ１、ｓｔｐ２、ｓｔｓ、ｓｔｓ１、ｓｔｘ、ｓｔｘｌｂ、ｓｔｘ７、ｓｔｘｂｐ１、ｓｔｘｂｐ２、ｓｕｌｔｌｃ１、ｓｕｐｔ６ｈ、ｓｕｒ、ｓｕｒ１、ｓｕｒｆ１、ｓｕｒｆ２、ｓｕｒｆ３、ｓｕｒｆ４、ｓｕｒｆ５、ｓｕｒｆ６、ｓｖｃｔ２、ｓｖｍｔ、ｓｗ、ｓｘｉ２、ｓｙｂ１、ｓｙｂ２、ｓｙｂ１１、ｓｙｃｐ１、ｓｙｋ、ｓｙｍ１、ｓｙｎ１、ｓｙｎ２、ｓｙｎ３、ｓｙｎｇａｐ、ｓｙｎｓ１、ｓｙｐ、ｓｙｔ、ｓｙｔ１、ｓｙｔ２、ｓｙｔ３、ｓｙｔ４、ｓｙｔ５、ｔ、ｔ３ｄ、ｔａａ１６、ｔａｃ１ｒ、ｔａｃ２、ｔａｃ２ｒ、ｔａｃ３、ｔａｃｒ１、ｔａｃｒ２、ｔａｆ２、ｔａｆ２ａ、ｔａｆ２ａ、ｔａｆ２ｄ、ｔａｆ２ｈ、ｔａｆ２ｎ、ｔａｆｉｉ１００、ｔａｇｌｎ、ｔａｋ１、ｔａｌ１、ｔａｌ２、ｔａｌｄｏ１、ｔａｍ、ｔａｎ１、ｔａｐ１、ｔａｐ２、ｔａｐａ１、ｔａｐｂｐ、ｔａｐｖｒ１、ｔａｒｓ、ｔａｓ、ｔａｓｋ、ｔａｔ、ｔａｕｔ、ｔａｘ、ｔａｘ１、ｔａｚ、ｔｂｇ、ｔｂｐ、ｔｂｐ１、ｔｂｓ、ｔｂｘ１、ｔｂｘ２、ｔｂｘ３、ｔｂｘ５、ｔｂｘａ２ｒ、ｔｂｘａｓ１、ｔｃ１、ｔｃ２、ｔｃｂｐ、ｔｃｄ、ｔｃｅａ１、ｔｃｅｂ１１、ｔｃｅｂ３、ｔｃｆ１、ｔｃｆ１２、ｔｃｆ１３、ｔｃｆ１３１１、ｔｃｆ１４、ｔｃｆ１５、ｔｃｆ１７、ｔｃｆ１９、ｔｃｆ２、ｔｃｆ２０、ｔｃｆ２１、ｔｃｆ３、ｔｃｆ４、ｔｃｆ５、ｔｃｆ６１１、ｔｃｆ６１２、ｔｃｆ７、ｔｃｆ８、ｔｃｆ９、ｔｃｆｅｂ、ｔｃｆ１１、ｔｃｆ１４、ｔｃｌ１、ｔｃｌ１ａ、ｔｃｌ２、ｔｃｌ３、ｔｃｌ４、ｔｃｌ５、ｔｃｎ１、ｔｃｎ２、ｔｃｏ、ｔｃｏｆ１、ｔｃｐ１、ｔｃｐ１０、ｔｃｐ１１、ｔｃｐ２２８、ｔｃｐｔ、ｔｃｒａ、ｔｃｒｂ、ｔｃｒｄ、ｔｃｒｇ、ｔｃｒｚ、ｔｃｓ１、ｔｃｔａ、ｔｃｔｅ１、ｔｃｔｅ３、ｔｃｔｅ１１、ｔｄｆ、ｔｄｆａ、ｔｄｆｘ、ｔｄｇ、ｔｄｇｆ１、ｔｄｎ、ｔｄｏ、ｔｄｏ２、ｔｄｔ、ｔｅａｄ４、ｔｅｃ、ｔｅｃ、ｔｅｃｋ、ｔｅｃｔａ、ｔｅｆ、ｔｅｇｔ、ｔｅｋ、ｔｅ１、ｔｅｍ、ｔｅｐ１、ｔｅｒｃ、ｔｅｒｆ１、ｔｅｒｔ、ｔｅｓ１、ｔｅｓｋ１、ｔｅｘ２８、ｔｆ、ｔｆ２ｓ、ｔｆ６、ｔｆａ、ｔｆａｍ、ｔｆａｐ２ａ、ｔｆａｐ２ｂ、ｔｆａｐ２ｃ、ｔｆａｐ４、ｔｆｃｏｕｐ１、ｔｆｃｏｕｐ２、ｔｆｃｐ２、ｔｆｄｐ１、ｔｆｄｐ２、ｔｆｅ３、ｔｆｆ１、ｔｆｆ２、ｔｆｆ３、ｔｆｉｉｉａ、ｔｆｎ、ｔｆｐｉ、ｔｆｐｉ２、ｔｆｒ、ｔｆｒｃ、ｔｆｓ１、ｔｆｔ、ｔｇ、ｔｇ７３７、ｔｇｂ１、ｔｇｂ２、ｔｇｄ、ｔｇｆａ、ｔｇｆｂ１、ｔｇｆｂ２、ｔｇｆｂ３、ｔｇｆｂ４、ｔｇｆｂｉ、ｔｇｆｂｒ１、ｔｇｆｂｒ２、ｔｇｆｂｒ３、ｔｇｆｂｒｅ、ｔｇｆｒ、ｔｇｍ１、ｔｇｍ２、ｔｇｍ３、ｔｇｍ４、ｔｇｎ３８、ｔｇｎ４６、ｔｈ、ｔｈａｓ、ｔｈｂｄ、ｔｈｂｐ１、ｔｈｂｓ１、ｔｈｂｓ２、ｔｈｂｓ３、ｔｈｃ、ｔｈｈ、ｔｈ１、ｔｈｏｐ１、ｔｈｐｏ、ｔｈｒ１、ｔｈｒａ、ｔｈｒａ１、ｔｈｒａ１、ｔｈｒｂ、ｔｈｒｍ、ｔｈｒｓｐ、ｔｈｙ１、ｔｉａｌ１、ｔｉａｍ１、ｔｉａｒ、ｔｉｃ、ｔｉｅ、ｔｉｅ１、ｔｉｅ２、ｔｉｇｒ、ｔｉ１、ｔｉｌ３、ｔｉｌ４、ｔｉｍ、ｔｉｍｐ、ｔｉｍｐ１、ｔｉｍｐ２、ｔｉｍｐ３、ｔｉｎｕｒ、ｔｉｔｆ１、ｔｉｔｆ２、ｔｊｐ１、ｔｋ１、ｔｋ２、ｔｋｃ、ｔｋｃｒ、ｔｋｒ、ｔｋｔ、ｔｋｔ２、ｔｋｔ１１、ｔｌａ５１９、ｔｌｃｎ、ｔｌｅ１、ｔｌｅ２、ｔｌｅ３、ｔｌｈ１、ｔｌｎ、ｔｌｒ１、ｔｌｒ２、ｔｌｒ３、ｔｌｒ４、ｔｌｒ５、ｔｍ４ｓｆ１、ｔｍ４ｓｆ２、ｔｍ７ｓｆ２、ｔｍｃ、ｔｍｄ、ｔｍｄｃｉ、ｔｍｅｍ１、ｔｍｆ１、ｔｍｉｐ、ｔｍｏｄ、ｔｍｐ、ｔｍｐｏ、ｔｍｐｒｓｓ２、ｔｍｓ、ｔｍｓａ、ｔｍｓｂ、ｔｍｖｃｆ、ｔｎａ、ｔｎｄｍ、ｔｎｆ、ｔｎｆａ、ｔｎｆａｉｐ１、ｔｎｆａｉｐ２、ｔｎｆａｉｐ４、ｔｎｆａｉｐ６、ｔｎｆａｒ、ｔｎｆｂ、ｔｎｆｂｒ、ｔｎｆｃ、ｔｎｆｃｒ、ｔｎｆｒ１、ｔｎｆｒ２、ｔｎｆｒｓｆ１０ｂ、ｔｎｆｒｓｆ１２、ｔｎｆｒｓｆ１４、ｔｎｆｒｓｆ１６、ｔｎｆｒｓｆ１７、ｔｎｆｒｓｆ１ａ、ｔｎｆｒｓｆ１ｂ、ｔｎｆｒｓｆ４、ｔｎｆｒｓｆ５、ｔｎｆｒｓｆ６、ｔｎｆｒｓｆ６ｂ、ｔｎｆｒｓｆ７、ｔｎｆｒｓｆ８、ｔｎｆｒｓｆ９、ｔｎｆｓｆ１１、ｔｎｆｓｆ１２、ｔｎｆｓｆ５、ｔｎｆｓｆ６、ｔｎｆｓｆ７、ｔｎｎｃ１、ｔｎｎｃ２、ｔｎｎｉ１、ｔｎｎｉ２、ｔｎｎｉ３、ｔｎｎｔ１、ｔｎｎｔ２、ｔｎｎｔ３、ｔｎｐ１、ｔｎｐ２、ｔｎｒ、ｔｎｓ、ｔｎｘ、ｔｎｘａ、ｔｏｃ、ｔｏｐ１、ｔｏｐ２、ｔｏｐ２ａ、ｔｏｐ２ｂ、ｔｏｐ３、ｔｐ１、ｔｐ１２０、ｔｐ２５０、ｔｐ５３、ｔｐ５３ｂｐ２、
ｔｐ６３、ｔｐ７３、ｔｐａ、ｔｐｂｇ、ｔｐｃ、ｔｐｃ、ｔｐｈ、ｔｐｈ２、ｔｐｉ１、ｔｐ１２、ｔｐｍ１、ｔｐｍ２、ｔｐｍ３、ｔｐｍ４、ｔｐｍｔ、ｔｐｏ、ｔｐｏ、ｔｐｐ２、ｔｐｒ、ｔｐｒ１、ｔｐｒｄ、ｔｐｓ１、ｔｐｓ２、ｔｐｓｎ、ｔｐｓｔ１、ｔｐｓｔ２、ｔｐｔ、ｔｐｔ１、ｔｐｔｐｓ、ｔｐｘ、ｔｐｘ１、ｔｒ、ｔｒ２、ｔｒ４、ｔｒａ１、ｔｒａｆ１、ｔｒａｆ５、ｔｒａｉｌｒ２、ｔｒａｎ、ｔｒａｎｃｅ、ｔｒａｐ１７０、ｔｒｃ３、ｔｒｃ８、ｔｒｅ、ｔｒｅｂ３６、ｔｒｅｋ、ｔｒｆ１、ｔｒｇ１、ｔｒｈ、ｔｒｈｒ、ｔｒｉｃ５、ｔｒｉｏ、ｔｒｉｐ１、ｔｒｉｐ１４、ｔｒｉｐ６、ｔｒｋ、ｔｒｋ１、ｔｒｋａ、ｔｒｋｂ、ｔｒｋｃ、ｔｒｋｅ、ｔｒｌ１、ｔｒｌ２、ｔｒｍ１、ｔｒｍ１、ｔｒｍ２、ｔｒｍａ、ｔｒｍｉ１、ｔｒｍｉ２、ｔｒｎ、ｔｒｎ１、ｔｒｏ、ｔｒｐ１、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ｔｒｐ３、ｔｒｐｃ１、ｔｒｐｍ２、ｔｒｐｏ、ｔｒｐｓ１、ｔｒｐｓ２、ｔｒｑ１、ｔｒｒ、ｔｒｒ３、ｔｒｒａｐ、ｔｒｓｐ、ｔｒｔ１、ｔｒｔ２、ｔｒｖ１、ｔｒｖ２、ｔｒｖ３、ｔｒｖ４、ｔｒｖ５、ｔｒｙ１、ｔｒｙ２、ｔｓ、ｔｓ１３、ｔｓ５４６、ｔｓｂｎ５１、ｔｓｃ ｔｓｃ１、ｔｓｃ２、ｔｓｄ、ｔｓｅ１、ｔｓｇ１０１、ｔｓｇ７、ｔｓｈｂ、ｔｓｈｒ、ｔｓｉｘ、ｔｓｐ３、ｔｓｐｙ、ｔｓｓｃ３、ｔｓｔ１、ｔｓｔ１、ｔｓｔａ３、ｔｓｙ、ｔｔｃ１、ｔｔｃ３、ｔｔｆ、ｔｔｆ１、ｔｔｆ２、ｔｔｇ２、ｔｔｉｍ１、ｔｔｎ、ｔｔｐ、ｔｔｐ１、ｔｔｐａ、ｔｔｒ、ｔｕｂａ３、ｔｕｂａｌ１、ｔｕｂｂ、ｔｕｆｍ、ｔｕｆｔ１、ｔｕｌｐ１、ｔｕｐｌｅ１、ｔｗ、ｔｗｅａｋ、ｔｗｉｋ１、ｔｗｉｓｔ、ｔｘｇｐ１１、ｔｘｋ、ｔｘｎ、ｔｘｎｒ、ｔｘｎｒｄ１、ｔｙｈ、ｔｙｋ１、ｔｙｋ２、ｔｙｋ３、ｔｙｍｓ、ｔｙｒ、ｔｙｒ１、ｔｙｒｏ３、ｔｙｒｐ１、ｔｙｒｐ２、ｔｙｓ、ｕ１７ｈｇ、ｕｌｒｎｐ、ｕ２２ｈｇ、ｕ２ａｆ１、ｕ２ａｆｌｒｓ１、ｕ２ａｆｌｒｓ２、ｕ２ａｆｌｒｓ３、ｕｂａ５２、ｕｂｂ、ｕｂｃ、ｕｂｃ４、ｕｂｃ７、ｕｂｃ８、ｕｂｃｈ２、ｕｂｃ１、ｕｂｅ１、ｕｂｅ２、ｕｂｅ２ａ、ｕｂｅ２ｂ、ｕｂｅ２ｅ２、ｕｂｅ２ｇ、ｕｂｅ２ｇ２、ｕｂｅ２ｈ、ｕｂｅ２ｉ、ｕｂｅ２１１、ｕｂｅ２ｖ１、ｕｂｅ３ａ、ｕｂｈ１、ｕｂｉｄ４、ｕｂ１１、ｕｃｈ１１、ｕｃｎ、ｕｃｐ１、ｕｃｐ２、ｕｃｐ３、ｕｄｐｇｄｈ、ｕｅｖ１、ｕｆｄ１１、ｕｆｓ、ｕｇａｌｔ、ｕｇｂ、ｕｇｃｇ、ｕｇｄｈ、ｕｇｎ、ｕｇｐ１、ｕｇｐ２、ｕｇｐｐ２、ｕｇｔ１、ｕｇｔ１ａ１、ｕｇｔ２ｂ１１、ｕｇｔ２ｂ１５、ｕｇｔ２ｂ１７、ｕｇｔ２ｂ４、ｕｇｔ２ｂ７、ｕｇｔ２ｂ８、ｕｇｔ２ｂ９、ｕｇｔ１、ｕｈｇ、ｕｈｘ１、ｕｋｈｃ、ｕｍｏｄ、ｕｍｐｈ２、ｕｍｐｋ、ｕｍｐｓ、ｕｎｃ１８、ｕｎｃ１８ｂ、ｕｎｄ、ｕｎｇ、ｕｎｒ、ｕｎｒ、ｕｏｘ、ｕｐ、ｕｐｋ１ｂ、ｕｐｓ、ｕｑｂｐ、ｕｑｃｒｂ、ｕｑｃｒｃ１、ｕｑｃｒｃ２、ｕｑｃｒｆｓ１、ｕｑｏｒ１、ｕｑｏｒ１３、ｕｑｏｒ２２、ｕｒｋ、ｕｒｋｒ、ｕｒｏｃ、ｕｒｏｄ、ｕｒｏｓ、ｕｓｆ１、ｕｓｆ２、ｕｓｈ１、ｕｓｈ１ａ、ｕｓｈ１ｂ、ｕｓｈ１ｃ、ｕｓｈ１ｄ、ｕｓｈ１ｅ、ｕｓｈ１ｆ、ｕｓｈ２ａ、ｕｓｈ３、ｕｓｐ１１、ｕｓｐ５、ｕｓｐ７、ｕｓｐ９ｘ、ｕｓｐ９ｙ、ｕｔ１、ｕｔ２、ｕｔｅ、ｕｔｒ、ｕｔｒｎ、ｕｔｘ、ｕｔｙ、ｕｖ２０、ｕｖ２４、ｕｖｏ、ｖａｃｈｔ、ｖａｃｍ１、ｖａｍｐ１、ｖａｍｐ２、ｖａｒｓ１、ｖａｓｐ、ｖａｔ１、ｖａｔ２、ｖａｖ、ｖａｖ１、ｖａｖ２、ｖｂｃｈ、ｖｂｐ１、ｖｃａｍ１、ｖｃｆ、ｖｃ１、ｖｃｐ、ｖｄａｃ１、ｖｄａｃ２、ｖｄｄ１、ｖｄｉ、ｖｄｒ、ｖｅｇｆ、ｖｅｇｆｂ、ｖｅｇｆｄ、ｖｅｇｆｒ３、ｖｇｆ、ｖｇ１、ｖｇｒ１、ｖｈ１、ｖｈｒ、ｖｉｌ１、ｖｉｌ２、ｖｉｍ、ｖｉｐ、ｖｉｐｒ１、ｖｉｐｒ２、ｖｉｓ１、ｖｌａ１、ｖｌａ５ａ、ｖｌａｃｓ、ｖｌｃａｄ、ｖｌｄｌｒ、ｖｍａｔ１、ｖｍｃｍ、ｖｍｄ１、ｖｍｄ２、ｖｎｒａ、ｖｎｔ、ｖｐ、ｖｐｐ１、ｖｐｐ３、ｖｐｒｅｂ１、ｖｐｒｅｂ２、ｖｒｆ、ｖｒｋ１、ｖｒｋ２、ｖｒｎｆ、ｖｒｎｉ、ｖｓｎ１１、ｖｔｎ、ｖｗｆ、ｖｗｓ、ｗａｆ１、ｗａｒｓ、ｗａｓ、ｗｂｓ、ｗｄ１、ｗｄｒ２、ｗｅｅ１、ｗｆｒｓ、ｗｆｓ、ｗｆｓ１、ｗｇｎ１、ｗｈｃｒ、ｗｉ、ｗｉｓｐ１、ｗｉｓｐ２、ｗｉｓｐ３、ｗｎｄ、ｗｎｔ１、ｗｎｔ１０ｂ、ｗｎｔ１３、ｗｎｔ１４、ｗｎｔ１５、ｗｎｔ２、ｗｎｔ３、ｗｎｔ５ａ、ｗｎｔ７ａ、ｗｎｔ７ｂ、ｗｎｔ８ｂ、ｗｒｂ、ｗｒｎ、ｗｓ１、ｗｓ２ａ、ｗｓ２ｂ、ｗｓ４、ｗｓｎ、ｗｓｓ、ｗｓｓ、ｗｔ１、ｗｔ２、ｗｔ３、ｗｔ４、ｗｔ５、ｗｔｓ、ｗｔｓ１、ｗｗｓ、ｘ１１、ｘｂｐ１、ｘｂｐ２、ｘｃｅ、ｘｄｈ、ｘｅ１６９、ｘｅ７、ｘｅ７ｙ、ｘｇ、ｘｇｒ、ｘｈ２、ｘｉａｐ、ｘｉｃ、ｘｉｓｔ、ｘｋ、ｘｌａ、ｘｌａ２、ｘｌｐ、ｘｌｐｄ、ｘｌｒｓ１、ｘｍ、ｘｐａ、ｘｐｂ、ｘｐｃ、ｘｐｃｃ、ｘｐｃｔ、ｘｐｆ、ｘｐｆ、ｘｐｇ、ｘｐｍｃ２ｈ、ｘｐｎｐｅｐ２、ｘｐｏ１、ｘｒｃｃ１、ｘｒｃｃ２、ｘｒｃｃ３、ｘｒｃｃ４、ｘｒｃｃ５、ｘｒｃｃ９、ｘｒｓ、ｘｓ、ｘｗｎｔ２、ｙｂ１、ｙｅｓ１、ｙｋ１４０、ｙ１１、ｙｒｒｍ１、ｙｔ、ｙｗｈａ１、ｙｗｈａｂ、ｙｗｈａｈ、ｙｗｈａｚ、ｙｙ１、ｚａｃ、ｚａｇ、ｚａｎ、ｚａｐ７０、ｚｆ８７、ｚｆｍ１、ｚｆｐ３、ｚｆｐ３６、ｚｆｐ３７、ｚｆｘ、ｚｆｙ、ｚｉｃ１、ｚｉｃ２、ｚｉｃ３、ｚｉｐｋ、ｚｎｆ１、ｚｎｆ１０、ｚｎｆ１１７、ｚｎｆ１１ａ、ｚｎｆ１１ｂ、ｚｎｆ１２、ｚｎｆ１２１、ｚｎｆ１２３、ｚｎｆ１２４、ｚｎｆ１２５、ｚｎｆ１２６、ｚｎｆ１３、ｚｎｆ１４、ｚｎｆ１４１、ｚｎｆ１４４、ｚｎｆ１４６、ｚｎｆ１４７、ｚｎｆ１５７、ｚｎｆ１６、ｚｎｆ１６０、ｚｎｆ１６２、ｚｎｆ１６３、ｚｎｆ１６５、ｚｎｆ１６９、ｚｎｆ１７３、ｚｎｆ１７９、ｚｎｆ１８９、ｚｎｆ１９、ｚｎｆ１９２、ｚｎｆ１９３、ｚｎｆ１９５、ｚｎｆ１９８、ｚｎｆ２、ｚｎｆ２０、ｚｎｆ２００、ｚｎｆ２０４、ｚｎｆ２１７、ｚｎｆ２２、ｚｎｆ２３、ｚｎｆ２４、ｚｎｆ２５、ｚｎｆ２６、ｚｎｆ２７、ｚｎｆ２９、ｚｎｆ３、ｚｎｆ３２、ｚｎｆ３４、ｚｎｆ３５、ｚｎｆ３６、ｚｎｆ３８、ｚｎｆ４、ｚｎｆ４０、ｚｎｆ４１、ｚｎｆ４２、ｚｎｆ４４、ｚｎｆ４５、ｚｎｆ４６、ｚｎｆ５、ｚｎｆ６、ｚｎｆ６９、ｚｎｆ７、ｚｎｆ７０、ｚｎｆ７１、ｚｎｆ７２、ｚｎｆ７３、ｚｎｆ７４、ｚｎｆ７５、ｚｎｆ７５ａ、ｚｎｆ７５ｃ、ｚｎｆ７６、ｚｎｆ７７、ｚｎｆ７９、ｚｎｆ８、ｚｎ８０、ｚｎｆ８１、ｚｎｆ８３、ｚｎｆ９、ｚｎｆｃ１５０、ｚｎｆｃ２５、ｚｎｆｘｙ、ｚｎｔ３、ｚｎｔ４、ｚｐ３ａ、ｚｐ３ｂ、ｚｐｋ、ｚｗｓ１、およびｚｙｘが挙げられる。
さらに、細菌、植物、酵母および哺乳類（例えば、マウス）由来の遺伝子が本明細書で提供される微生物とともに使用可能である。大腸菌遺伝子の限定されない例としては、ａａｒＦ、ａａｓ、ａａｔ、ａｂｐＳ、ａｂｓ、ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｃｃＤ、ａｃｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＢ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ａｃｅＫ、ａｃｋＡ、ａｃｋＢ、ａｃｎＡ、ａｃｎＢ、ａｃｐＤ、ａｃｐＰ、ａｃｐＳ、ａｃｐＸ、ａｃｒＡ、ａｃｒＢ、ａｃｒＣ、ａｃｒＤ、ａｃｒＥ、ａｃｒＦ、ａｃｒＲ、ａｃｓ、ａｄａ、ａｄｄ、ａｄｈＢ、ａｄｈＣ、ａｄｈＥ、ａｄｈＲ、ａｄｉＡ、ａｄｉＹ、ａｄｋ、ａｅｇＡ、ａｅｒ、ａｅｓ、ａｇａＡ、ａｇａＢ、ａｇａＣ、ａｇａＤ、ａｇａＩ、ａｇａＲ、ａｇａＳ、ａｇａＶ、ａｇａＷ、ａｇａＺ、ａｇｐ、ａｈｐＣ、ａｈｐＦ、ａｉｄＢ、ａｉｓ、ａｌａＳ、ａｌａＴ、ａｌａＵ、ａｌａＶ、ａｌａＷ、ａｌａＸ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ａｌｄＨ、ａｌｋＡ、ａｌｋＢ、ａｌｐＡ、ａｌｒ、ａｌｓＡ、ａｌｓＢ、ａｌｓＣ、ａｌｓＥ、ａｌｓＫ、ａｌｘ、ａｍｉＡ、ａｍｉＢ、ａｍｎ、ａｍｐＣ、ａｍｐＤ、ａｍｐＥ、ａｍｐＧ、ａｍｐＨ、ａｍｔＢ、ａｍｙＡ、ａｎｓＡ、ａｎｓＢ、ａｐａＧ、ａｐａＨ、ａｐｈＡ、ａｐｐＡ、ａｐｐＢ、ａｐｐＣ、ａｐｐＹ、ａｐｔ、ａｑｐＺ、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＣ、ａｒａＤ、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ａｒａＪ、ａｒｃＡ、ａｒｃＢ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＭ、ａｒｇＰ、ａｒｇＱ、ａｒｇＲ、ａｒｇＳ、ａｒｇＴ、ａｒｇＵ、ａｒｇＶ、ａｒｇＷ、ａｒｇＸ、ａｒｇＹ、ａｒｇＺ、ａｒｏＡ、ａｒｏＢ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＩ、ａｒｏＫ、ａｒｏＬ、ａｒｏＭ、ａｒｏＰ、ａｒｏＴ、ａｒｓＢ、ａｒｓＣ、ａｒｓＲ、ａｒｔＩ、ａｒｔＪ、ａｒｔＭ、ａｒｔＰ、ａｒｔＱ、ａｓｃＢ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｄ、ａｓｌＡ、ａｓｌＢ、ａｓｍＡ、ａｓｎＡ、ａｓｎＢ、ａｓｎＣ、ａｓｎＳ、ａｓｎＴ、ａｓｎＵ、ａｓｎＶ、ａｓｎＷ、ａｓｐＡ、ａｓｐＣ、ａｓｐＳ、ａｓｐＴ、ａｓｐＵ、ａｓｐＶ、ａｓｒ、ａｓｕ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢ、ａｔｏＣ、ａｔｏＤ、ａｔｏＳ、ａｔｐＡ、ａｔｐＢ、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ、ａｔｐＥ、ａｔｐＦ、ａｔｐＧ、ａｔｐＨ、ａｔｐＩ、ａｖｔＡ、ａｚａＡ、ａｚａＢ、ａｚｌ、ｂａｃＡ、ｂａｅＲ、ｂａｅＳ、ｂａｒＡ、ｂａｓＲ、ｂａｓＳ、ｂａｘ、ｂｃｐ、ｂｃｒ、ｂｅｔＡ、ｂｅｔＢ、ｂｅｔＩ、ｂｅｔＴ、ｂｆｄ、ｂｆｍ、ｂｆｒ、ｂｇｌＡ、ｂｇｌＢ、ｂｇｌＦ、ｂｇｌＧ、ｂｇｌＪ、ｂｇｌＴ、ｂｇｌＸ、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、ｂｉｏＰ、ｂｉｐＡ、ｂｉｒＡ、ｂｉｓＣ、ｂｉｓＺ、ｂｌｃ、ｂｏｌＡ、ｂＲＮＱ、ｂｒｎＲ、ｂｒｎＳ ｂｒｎＴ、ｂｔｕＢ、ｂｔｕｃ、ｂｔｕＤ、ｂｔｕＥ、ｂｔｕＲ、ｂｙｍＡ、ｃａｄＡ、ｃａｄＢ、ｃａｄＣ、ｃａｆＡ、ｃａｉＡ、ｃａｉＢ、ｃａｉＣ、ｃａｉＤ、ｃａｉＥ、ｃａｉＦ、ｃａｉＴ、ｃａｌＡ、ｃａｉＣ、ｃａｌＤ、ｃａｎ、ｃａｒＡ、ｃａｒＢ、ｃｂｌ、ｃｂｐＡ、ｃｂｔ、ｃｃａ、ｃｃｍＡ、ｃｃｍＢ、ｃｃｍＣ、ｃｃｍＤ、ｃｃｍＥ、ｃｃｍＦ、ｃｃｍＧ、ｃｃｍＨ、ｃｄｄ、ｃｄｅ、ｃｄｈ、ｃｄｓＡ、ｃｄｓＳ、ｃｅｄＡ、ｃｅｌＡ、ｃｅｌＢ、ｃｅＩＣ、ｃｅｌＤ、ｃｅｌＦ、ｃｆａ、ｃｆｃＡ、ｃｈａＡ、ｃｈａＢ、ｃｈａＣ、ｃｈｅＡ、ｃｈｅＢ、ｃｈｅＲ、ｃｈｅＷ、ｃｈｅＹ、ｃｈｅＺ、ｃｈｐＡ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＲ、ｃｈｐＳ、ｃｉｒＡ、ｃｉｔＡ、ｃｉｔＢ、ｃｌｄ、ｃｉｐＡ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｃｌｐＸ、ｃｌｓ、ｃｍｋ、ｃｍｌＡ、ｃｍｒ、ｃｍｔＡ、ｃｍｔＢ、ｃｏａＡ、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ、ｃｏｂＵ、ｃｏｄＡ、ｃｏｄＢ、ｃｏｆ、ｃｏｇ？、ｃｏｒＡ、ｃｐｄＡ、ｃｐｄＢ、ｃｐｓＡ、ｃｐｓＢ、ｃｐｓＣ、ｃｐｓＤ、ｃｐｓＥ、ｃｐｓＦ、ｃｐｓＧ、ｃｐｘＡ、ｃｐｘＢ、ｃｐｘＰ、ｃｐｘＲ、ｃｒｃＡ、ｃｒｃＢ、ｃｒｅＡ、ｃｒｅＢ、ｃｒｅＣ、ｃｒｅＤ、ｃｒｇ、ｃｒｌ、ｃｒｐ、ｃｒｒ、ｃｓｄＡ、ｃｓｇＡ、ｃｓｇＢ、ｃｓｇＤ、ｃｓｇＥ、ｃｓｇＦ、ｃｓｇＧ、ｃｓｉＡ、ｃｓｉＢ、ｃｓｉＣ、ｃｓｉＤ、ｃｓｉＥ、ｃｓｉＦ、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＣ、ｃｓｐＤ、ｃｓｐＥ、ｃｓｐＧ、ｃｓｒＡ、ｃｓｒＢ、ｃｓｔＡ、ｃｓｔＣ、ｃｕｐ、ｃｕｔＡ、ｃｕｔＣ、ｃｕｔＥ、ｃｕｔＦ、ｃｖａＡ（ＣｏｌＶ）、ｃｖａＢ（ＣｏｌＶ）、ｃｖａＣ（Ｃｏ−ｌＶ）、ｃｖｉ（ＣｏｌＶ）、ｃｖｐＡ、ｃｘｍ、ｃｙａＡ、ｃｙｂＢ、ｃｙｂＣ、ｃｙｃＡ、ｃｙｄＡ、ｃｙｄＢ、ｃｙｄＣ、ｃｙｄＤ、ｃｙｎＲ、ｃｙｎＳ、ｃｙｎＴ、ｃｙｎＸ、ｃｙｏＡ、ｃｙｏＢ、ｃｙｏＣ、ｃｙｏＤ、ｃｙｏＥ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＢ、ｃｙｓＣ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＥ、ｃｙｓＧ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＱ、ｃｙｓＳ、ｃｙｓＴ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＸ？、ｃｙｓＺ？、ｃｙｔＲ、ｄａｃＡ、ｄａｃＢ、ｄａｃＣ、ｄａｃＤ、ｄａｄＡ、ｄａｄＢ、ｄａｄＱ、ｄａｄＸ、ｄａｍ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｄｂｐＡ、ｄｃｄ、ｄｃｍ、ｄｃｐ、ｄｃｒＢ、ｄｃｔＡ、ｄｃｔＢ、ｄｃｕＡ、ｄｃｕＢ、ｄｃｕＣ、ｄｄＩＡ、ｄｄｌＢ、ｄｄｐＡ、ｄｄｐＢ、ｄｄｐＣ、ｄｄｐＤ、ｄｄｐＦ、ｄｄｐＸ、ｄｅａＤ、ｄｅｄＡ、ｄｅｄＤ、ｄｅｆ、ｄｅｇＰ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｄｅｌ、ｄｅｏＡ、ｄｅｏＢ、ｄｅｏＣ、ｄｅｏＤ、ｄｅｏＲ、ｄｆｐ、ｄｇｄ、ｄｇｋＡ、ｄｇｋＲ、ｄｇｏＡ、ｄｇｏＤ、ｄｇｏＫ、ｄｇｏＲ、ｄｇｏＴ、ｄｇｓＡ、ｄｇｔ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ、ｄｉｎＦ、ｄｉｎＧ、ｄｉｎＩ、ｄｉｎＹ、ｄｉｐＺ、ｄｊｌＡ、ｄｋｓＡ、ｄｌｄ、ｄｍｓＡ、ｄｍｓＢ、ｄｍｓＣ、ｄｎａＡ、ｄｎａＢ、ｄｎａＣ、ｄｎａＥ、ｄｎａＧ、ｄｎａＩ、ｄｎａＪ、ｄｎａＫ、ｄｎａＬ、ｄｎａＮ、ｄｎａＱ、ｄｎａＴ、ｄｎａＸ、ｄｐｐＡ、ｄｐｐＢ、ｄｐｐＣ、ｄｐｐＤ、ｄｐｐＦ、ｄｐｐＧ、ｄｐｓ、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣ、ｄｓｂＧ、ｄｓｄＡ、ｄｓｄＣ、ｄｓｄＸ、ｄｓｒＡ、ｄｓｒＢ、ｄｕｔ、ｄｖｌ、ｄｘｓ、ｅｂｇＡ、ｅｂｇＢ、ｅｂｇＣ、ｅｂｇＲ、ｅｃｆａ、ｅｃｏ、ｅｃｐＤ、ｅｄａ、ｅｄｄ、ｅｆｐ、ｅｎｉｒＡ、ｅｍｒＢ、ｅｍｒＤ、ｅｍｒＥ、ｅｎｄＡ、ｅｎｏ、ｅｎｔＡ、ｅｎｔＢ、ｅｎｔＣ、ｅｎｔＤ、ｅｎｔＥ、ｅｎｔＦ、ｅｎｖＮ、ｅｎｖＰ、ｅｎｖＱ、ｅｎｖＲ、ｅｎｖＴ、ｅｎｖＹ、ｅｎｖＺ、ｅｐｄ、ＥｐｐＡ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ＥｐｐＢ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ＥｐｐＣ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ＥｐｐＤ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ＥｐｐＥ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ＥｐｐＧ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ＥｐｐＨ、ｍｉｎｉｇｅｎｅ、ｅｒａ、ｅｓｐ、ｅｖｇＡ、ｅｖｇＳ、ｅｘｂＢ、ｅｘｂＣ、ｅｘｂＤ、ｅｘｐＡ、ｅｘｕＲ、ｅｘｕＴ、ｆａｂＡ、ｆａｂＢ、ｆａｂＤ、ｆａｂＦ、ｆａｂＧ、ｆａｂＨ、ｆａｂＩ、ｆａｂＺ、ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ、ｆａｄＨ、ｆａｄＬ、ｆａｄＲ、ｆａｒＲ、ｆａｔＡ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、ｆｂｐ、ｆｃｌ、ｆｃｓＡ、ｆｄｈＤ、ｆｄｈＥ、ｆｄｈＦ、ｆｄｎＧ、ｆｄｎＨ、ｆｄｎＩ、ｆｄｏＧ、ｆｄｏＨ、ｆｄｏＩ、ｆｄｒＡ、ｆｄｘ、ｆｅａＢ、ｆｅａＲ、ｆｅｃＡ、ｆｅｃＢ、ｆｅｃＣ、ｆｅｃＤ、ｆｅｃＥ、ｆｅｃＩ、ｆｅｃＲ、ｆｅｏＡ、ｆｅｏＢ、ｆｅｐＡ、ｆｅｐＢ、ｆｅｐＣ、ｆｅｐＤ、ｆｅｐＥ、ｆｅｐＧ、ｆｅｓ、ｆｅｘＢ、ｆｆｈ、ｆｆｓ、ｆｈｌＡ、ｆｈｌＢ、ｆｈｕＡ、ｆｈｕＢ、ｆｈｕＤ、ｆｈｕＥ、ｆｈｕＦ、ｆｉｃ、ｆｉｍＡ、ｆｉｍＢ、ｆｉｍＣ、ｆｉｍＤ、ｆｉｍＥ、ｆｉｍＦ、ｆｉｍＧ、ｆｉｍＨ、ｆｉｍＩ、ｆｉｐＢ、ｆｉｐＣ、ｆｉｓ、ｆｉｕ、ｆｉｘＡ、ｆｉｘＢ、ｆｉｘＣ、ｆｉｘＸ、ｆｋｌＢ、ｆｋｐＡ、ｆｌｄＡ、ｆｌｇＡ、ｆｌｇＢ、ｆｌｇＣ、ｆｌｇＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｇＦ、ｆｌｇＧ、ｆｌｇＨ、ｆｌｇＩ、ｆｌｇＪ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＮ、ｆｌｈＡ、ｆｌｈＢ、ｆｌｈｃ、ｆｌｈＤ、ｆｌｉＡ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｉＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｉＧ、ｆｌｉＨ、ｆｌｉＩ、ｆｌｉＪ、ｆｌｉＫ、ｆｌｉＬ、ｆｌｉＭ、ｆｌｉＮ、ｆｌｉＯ、ｆｌｉｐ、ｆｌｉＱ、ｆｌｉＲ、ｆｌｉＳ、ｆｌｉＴ、ｆｌｉＹ、ｆｌｉＺ、ｆｌｋ、ｆｌｕ、ｆｍｔ、ｆｎｒ、ｆｏｃＡ、ｆｏｃＢ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＣ、ｆｏｌＤ、ｆｏｌＥ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＰ、ｆｏｌＸ、ｆｐｒ、ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ、ｆｒｄＤ、ｆｒｒ、ｆｒｕＡ、ｆｒｕＢ、ｆｒｕＫ、ｆｒｕＲ、ｆｓｒ、ｆｔｎ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＪ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＹ、ｆｔｓＺ、ｆｕｃＡ、ｆｕｃＩ、ｆｕｃＫ、ｆｕｃＯ、ｆｕｃＰ、ｆｕｃＲ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｕｒ、ｆｕｓＡ、ｆｕｓＢ、ｇａｂＣ、ｇａｂＤ、ｇａｂＰ、ｇａｂＴ、ｇａｄＡ、ｇａｄＢ、ｇａｄＲ、ｇａｌＥ、ｇａｌＦ、ｇａｌＫ、ｇａｌＭ、ｇａｌＰ、ｇａｉＲ、ｇａｌＳ、ｇａｌＴ、ｇａｌＵ、ｇａｐＡ、ｇａｐＣ、ｇａｒＡ、ｇａｒＢ、ｇａｔＡ、ｇａｔＢ、ｇａｔＣ、ｇａｔＤ、ｇａｔＲ、ｇａｔＹ、ｇａｔＺ、ｇｃｄ、ｇｃｌ、ｇｃｐＥ、ｇｃｖＡ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、ｇｃｖＲ、ｇｃｖＴ、ｇｄｈＡ、ｇｅｆ、ｇｇｔ、ｇｉｄＡ、ｇｉｄＢ、ｇｉｐ、ｇｌｃＢ、ｇｌｃＣ、ｇｌｃＤ、ｇＩｃＥ、ｇｌｃＧ、ｇｌｄＡ、ｇｌｆ、ｇｌｇＡ、ｇｌｇＢ、ｇｌｇＣ、ｇｌｇＰ、ｇｌｇＳ、ｇｌｇＸ、ｇｌｋ、ｇｌｍＭ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＸ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｇｌｎＧ、ｇｌｎＨ、ｇｌｎＫ、ｇｌｈＬ、ｇｌｎＰ、ｇｌｎＱ、ｇｌｎＲ、ｇｌｎＳ、ｇｌｎＴ、ｇｌｎＵ、ｇｌｎＶ、ｇｌｎＷ、ｇｌｎＸ、ｇｌｏＡ、ｇｌｐＡ、ｇｌｐＢ、ｇｌｐＣ、ｇｌｐＤ、ｇｉｐＥ、ｇｉｐＦ、ｇｉｐＧ、ｇｌｐＫ、ｇｌｐＱ、ｇｉｐＲ、ｇｌｐＴ、ｇｌｐＸ、ｇＩｔＡ、ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔＥ、ｇｌｔＦ、ｇｌｔＨ、ｇｌｔＪ、ｇｌｔＫ、ｇｌｔＬ、ｇｌｔＭ、ｇｌｔＰ、ｇｌｔＲ、ｇｌｔＳ、ｇｌｔＴ、ｇｌｔＵ、ｇｌｔｖ、ｇｌｔＷ、ｇｌｔＸ、ｇｌｙＡ、ｇｌｙＱ、ｇｌｙＳ、ｇｌｙＴ、ｇｌｙＵ、ｇｌｙｖ、ｇｌｙＷ、ｇｌｙＸ、ｇｌｙＹ、ｇｍｄ、ｇｍｋ、ｇｍｍ、ｇｎｄ、ｇｎｔＫ、ｇｎｔＰ、ｇｎｔＲ、ｇｎｔＳ、ｇｎｔＴ、ｇｎｔＵ、ｇｎｔＶ、ｇｏａＧ、ｇｏｒ、ｇｐｈ、ｇｐｍＡ、ｇｐｐ、ｇｐｒＡ、ｇｐｒＢ、ｇｐｓＡ、ｇｐｔ、ｇｒｅＡ、ｇｒｅＢ、ｇｒｏＬ、ｇｒｏＳ、ｇｒｐＥ、ｇｒｘＡ、ｇｒｘＢ、ｇｒｘＣ、ｇｓｈＡ、ｇｓｈＢ、ｇｓｋ、ｇｓｐ、ｇｓｐ＊、ｇｓｔ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢ、ｇｕａＣ、ｇｕｒＢ、ｇｕｒＣ、ｇｕｔＭ、ｇｕｔＱ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｈｃａＢ、ｈｃａＣ、ｈｃａＤ、ｈｃａＥ、ｈｃａＦ、ｈｃａＲ、ｈｃａＴ、ｈｄｅＡ、ｈｄｅＢ、ｈｄｅＤ、ｈｄｈＡ、ｈｅｌＤ、ｈｅｍＡ、ｈｅｍＢ、ｈｅｍＣ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＥ、ｈｅｍＦ、ｈｅｍＧ、ｈｅｍＨ、ｈｅｍＫ、ｈｅｍＬ、ｈｅｍＭ、ｈｅｍＸ、ｈｅｍＹ、ｈｅｐＡ、ｈｅｔ、ｈｆｌＢ、ｈｆｌＣ、ｈｆｌＫ、ｈｆｌＸ、ｈｆｑ、ｈｈａ、ｈｉｐＡ、ｈｉｐＢ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＩ、ｈｉｓＪ、ｈｉｓＭ、ｈｉｓＰ、ｈｉｓＱ、ｈｉｓＲ、ｈｉｓＳ、ｈｉｐＡ、ｈｌｙＥ、ｈｍｐ、ｈｎｓ、ｈｏｌＡ、ｈｏｌＢ、ｈｏｌＣ、ｈｏｌＤ、ｈｏｌＥ、ｈｏｐＢ、ｈｏｐＣ、ｈｏｐＤ、ｈｐｔ、ｈｒｐＡ、ｈｒｐＢ、ｈｒｓＡ、ｈｓｃＡ、ｈｓｃＢ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＳ、ｈｓｌＣ、ｈｓｌＤ？、ｈｓｌＥ−Ｈ、ｈｓｌＪ、ｈｓｌＫ、ｈｓＩＬ−Ｎ、ｈｓｌＯ−Ｒ、ｈｓｌＵ、ｈｓｌＶ、ｈｓｌＷ、ｈｔｇＡ、ｈｔｐＧ、ｈｔｐＸ、ｈｔｒＢ、ｈｔｒＣ、ｈｔｒＥ、ｈｔｒＬ、ｈｕｐＡ、ｈｕｐＢ、ｈｙａＡ、ｈｙａＢ、ｈｙａＣ、ｈｙａＤ、ｈｙａＥ、ｈｙａＦ、ｈｙｂＡ、ｈｙｂＢ、ｈｙｂＣ、ｈｙｂＤ、ｈｙｂＥ、ｈｙｂＦ、ｈｙｂＧ、ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、ｈｙｃＩ、ｈｙｄＡ、ｈｙｄＧ、ｈｙｄＨ、ｈｙｄＮ、ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ
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ｓｅｒＳ、ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ、ｓｅｒＶ、ｓｅｒＷ、ｓｅｒＸ、ｓｆａ、ｓｆｃＡ、ｓｆｉＣ、ｓｆｓＡ、ｓｆｓＢ、ｓｈｉＡ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒ、ｓｉｘＡ、ｓｌｏＢ、ｓｌｐ、ｓｌｒ、ｓｌｔ、ｓｌｙＤ、ｓｌｙＸ、ｓｍｐ、ｓｍｔＡ、ｓｏｄＡ、ｓｏｄＢ、ｓｏｄＣ、ｓｏｈＡ、ｓｏｈＢ、ｓｏｌＡ、ｓｏｘＲ、ｓｏｘＳ、ｓｐｅＡ、ｓｐｅＢ、ｓｐｅＣ、ｓｐｅＤ、ｓｐｅＥ、ｓｐｅＦ、ｓｐｅＧ、ｓｐｆ、ｓｐｏＴ、ｓｐｐＡ、ｓｐｒ、ｓｒｌＡ、ｓｒｌＢ、ｓｒｌＤ、ｓｒｌＥ、ｓｒｌＲ、ｓｒｍＢ、ｓｒｎＡ、ｓｓａＥ、ｓｓａＧ、ｓｓａＨ、ｓｓｂ、ｓｓｅＡ、ｓｓｅＢ、ｓｓｐＡ、ｓｓｐＢ、ｓｓｒＡ、ｓｓｒＳ、ｓｓｙＡ、ｓｓｙＤ、ｓｔｆＺ、ｓｔｋＡ、ｓｔｋＢ、ｓｔｋＣ、ｓｔｋＤ、ｓｔｐＡ、ｓｔｒＣ、ｓｔｒＭ、ｓｔｓＡ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｓｕｃＣ、ｓｕｃＤ、ｓｕｆＩ、ｓｕｇＥ、ｓｕｈＡ、ｓｕｈＢ、ｓｕｌＡ、ｓｕｐＱ、ｓｕｒＡ、ｓｕｒＥ、ｓｙｄ、ｔａｂＣ、ｔａｇ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ、ｔａｎＡ、ｔａｎＢ、ｔａｐ、ｔａｒ、ｔａｓ、ｔａｕＡ、ｔａｕＢ、ｔａｕＣ、ｔａｕＤ、ｔｂｐＡ、ｔｄｃＡ、ｔｄｃＢ、ｔｄｃＣ、ｔｄ
ｃＤ、ｔｄｃＥ、ｔｄｃＦ、ｔｄｃＧ、ｔｄｃＲ、ｔｄｈ、ｔｄｉ ｔｄｋ、ｔｅｈＡ、ｔｅｈＢ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｔｇｔ、ｔｈｄＡ、ｔｈｄＣ、ｔｈｄＤ、ｔｈｉＢ？、ｔｈｉＣ、ｔｈｉＤ、ｔｈｉＥ、ｔｈｉＦ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ、ｔｈｉＩ、ｔｈｉＪ、ｔｈｉＫ、ｔｈｉＬ、ｔｈｉＭ、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｔｈｒＳ、ｔｈｒＴ、ｔｈｒＵ、ｔｈｒＶ、ｔｈｒＷ、ｔｈｙＡ、ｔｉｇ、ｔｋｔＡ、ｔｋｔＢ、ｔｌｄＤ、ｔｌｎＡ、ｔｍｋ、ｔｎａＡ、ｔｎａＢ、ｔｎａＣ、ｔｎｍ、ｔｏｌ−ｏｒｆ１、ｔｏｌ−ｏｒｆ２、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｔｏｌＣ、ｔｏｌＤ、ｔｏｌＥ、ｔｏｌＩ、ｔｏｌＪ、ｔｏｌＭ、ｔｏｌＱ、ｔｏＩＲ、ｔｏｎＢ、ｔｏｐＡ、ｔｏｐＢ、ｔｏｒＡ、ｔｏｒＣ、ｔｏｒＤ、ｔｏｒＲ、ｔｏｒＳ、ｔｏｒＴ、ｔｐｉＡ、ｔｐｒ、ｔｐｘ、ｔｒｅＡ、ｔｒｅＢ、ｔｒｅＣ、ｔｒｅＦ、ｔｒｅＲ、ｔｒｇ、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＤ、ｔｒｋＧ、ｔｒｋＨ、ｔｒｍＡ、ｔｒｍＢ、ｔｒｍＣ、ｔｒｍＤ、ｔｒｍＥ、ｔｒｍＦ、ｔｒｍＨ、ｔｒｍＵ、ｔｒｎＡ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＲ、ｔｒｐＳ、ｔｒｐＴ、ｔｒｕＡ、ｔｒｕＢ、ｔｒｘＡ、ｔｒｘＢ、ｔｒｘＣ、ｔｓａＡ、ｔｓｆ、ｔｓｍＡ、ｔｓｒ、ｔｓｘ、ｔｔｄＡ、ｔｔｄＢ、ｔｔｋ、ｔｕｆＡ、ｔｕｆｆＢ、ｔｕｓ、ｔｙｎＡ、ｔｙｒＡ、ｔｙｒＢ、ｔｙｒＰ、ｔｙｒＲ、ｔｙｒＳ、ｔｙｒＴ、ｔｙｒＵ、ｔｙｒＶ、ｕｂｉＡ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＣ、ｕｂｉＤ、ｕｂｉＥ、ｕｂｉＦ、ｕｂｉＧ、ｕｂｉＨ、ｕｂｉＸ、ｕｃｐＡ［］、ｕｄｋ、ｕｄｐ、ｕｇｐＡ、ｕｇｐＢ、ｕｇｐＣ、ｕｇｐＥ、ｕｇｐＱ、ｕｈｐＡ、ｕｈｐＢ、ｕｈｐＣ、ｕｈｐＴ、ｕｉｄＡ、ｕｉｄＢ、ｕｉｄＲ、ｕｍｕＣ、ｕｍｕＤ、ｕｎｇ、ｕｐｐ、ｕｐｐＳ、ｕｐｓ、ｕｒａＡ、ｕｓｇ−１、ｕｓｂＡ、ｕｓｐＡ、ｕｕｐ、ｕｖｈ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、ｕｖｓ、ｕｘａＡ、ｕｘａＢ、ｕｘａＣ、ｕｘｕＡ、ｕｘｕＢ、ｕｘｕＲ、ｖａｌＳ、ｖａｌＴ、ｖａｌＵ、ｖａｌＶ、ｖａｌＷ、ｖａｌＸ、ｖａｌＹ、ｖａｌＺ、ｖｓｒ、ｗｒｂＡ、ｘａｐＡ、ｘａｐＢ、ｘａｐＲ、ｘａｓＡ、ｘｅｒＣ、ｘｅｒＤ、ｘｎｉ、ｘｓｅＡ、ｘｓｅＢ、ｘｔｈＡ、ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｘｙｌＥ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、ｘｙｌＨ、ｘｙｌＲ、ｙｃｃＡ、ｙｈｈＰ、ｙｉｈＧ、ｙｊａＢ、ｆｌ４７、ｙｊａＤ、ｙｏｈＦ、ｙｑｉＥ、ｙｒｆＥ、ｚｉｐＡ、ｚｎｔＡ、ｚｎｕＡ、ｚｎｕＢ、ｚｎｕＣ、ｚｕｒ、およびｚｗｆが挙げられる。
マウス遺伝子の限定されない例としては、Ｉｌｒ１、Ｉｌｒ２、Ｇａｓ１０、Ｔｎｐ１、Ｉｎｈｂｂ、Ｉｎｈａ、Ｃｒｅｂ１、Ｍｐｍｖ３４、Ａｃｒｄ、Ａｃｒｇ、Ｉｌ１１０、Ｏｔｆ１、Ｒａｂ１１ｂ−ｒ、Ａｂｌ１、ａｌｄ、Ａｍｈ−ｒｓ１、Ｂｃ１２Ｂ、Ｃｃｈｌｌａ３、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ２、Ｇｐｃｒ１６、Ｈｔｒ５ｂ、Ｉｄｄ５、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ５、Ｉ１８ｒｂ、Ｋｒａｓ２−ｒｓ１、Ｍｏｖ７、Ｍｐｍｖ６、Ｍｐｍｖ１６、Ｍｐｍｖ２２、Ｍｐｍｖ２５、Ｍｐｍｖ２９、Ｍｐｍｖ４２、Ｍｔｖ７、Ｍｔｖ２７、Ｍｔｖ３９、Ｏｐｒｋ１、Ｏｔｆ３−ｒｓ１、Ｏｔｆ８、Ｏｔｆ１１−ｒｓ１、Ｐｔｇｓ２、Ｒｅｎ１、Ｒｅｎ２、Ｒｉｌ３、Ｓｘｖ、Ｔａｚ４−ｒｓ１、Ｔｇｆｂ２、Ｗｎｔ６、Ｘｍｍｖ６、Ｘｍｍｖ９、Ｘｍｍｖ３６、Ｘｍｍｖ６１、Ｘｍｍｖ７４、Ｘｍｖ２１、Ｘｍｖ３２、Ｘｍｖ４１、Ｉ１２ｒａ、Ａｂ１、Ｍｐｍｖ３、Ｒａｐ１ａ−ｐｓ２、ａｎｘ、Ｍｐｍｖ４３、Ｒｙｒ３、Ｒａｓ１２−４、Ａｄｒａ２ｂ、Ａｖｐ、Ｇｌｖｒ１、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｍｐｍｖ２８、Ｏｘｔ、Ｐｃｓｋ２、ａ、Ｘｍｖ１０、Ｔｃｆ４、Ａｃｒａ、Ａｃｒａ４、Ａｋ１、Ｂｄｎｆ、ｂｓ、Ｃｙｃｔ、Ｃｙｐ２４、Ｄｂｈ、Ｆｓｈｂ、Ｇｃｇ、Ｇｄｆ５、Ｇｎａｓ、Ｇｐｃｒ８、Ｇｒｉｎ１、Ｈｃｓ４、Ｈｉｏｒ２、Ｈｓｐ８４−２、Ｉｄｄ１２、Ｉｌｒｎ、Ｊｕｎｄ２、Ｋｒａｓ３、Ｍｃ３ｒ、Ｍｐｍｖ１４、Ｍｔｖ４０、Ｍｘｉ１−ｒｓ１、Ｏｔｆ３−ｒｓ２、Ｐｔｇｓ１、Ｐｔｐｒａ、Ｒａｐｓｎ、Ｓｒｃ、Ｓｖｐ１、Ｓｖｐ３、Ｔｃｆ３ｂ、Ｗｔ１、Ｘｍｍｖ７１、Ｘｍｖ４８、Ｃｃｎａ、Ｆｇｆ２、Ｆｔｈ−ｒｓ１、Ｃｓｆｍ、Ｍｏｖ１０、Ｅｇｆ、Ａｃｒｂ２、Ｃａｐ１、Ｃｒｈ、Ｆｉｍ３、Ｆｐｓ１１、Ｇｌｕｔ２、Ｇｐｃｒ２、Ｇｒｉａ２、Ｈｓｄ３ｂ−１、Ｈｓｄ３ｂ−２、Ｈｓｄ３ｂ−３、Ｈｓｄ３ｂ−４、Ｈｓｐ８６−ｐｓ２、Ｉｄｄ３、Ｉ１２、Ｉ１７、Ｍｐｖｍｖ９、Ｍｐｍｖ２０、Ｍｔｖ４．８、Ｎｇｆｂ、Ｎｐｒａ、Ｎｒａｓ、Ｎｒａｓ、Ｎｔｒｋ、Ｏｔｆ３−ｒｓ３、Ｏｔｆ３−ｒｓ４、Ｒａｐ１ａ、Ｔｓｈｂ、Ｘｍｍｖ２２、Ｘｍｍｖ６５、Ｍｏｓ、Ｒａｓ１２−７、Ｌｙｒ、Ｉｆａ、Ｉｆｂ、Ｊｕｎ、ａｚｈ、ｄｂ、Ｉｐｐ、Ｍｐ１、Ｄｏ１、Ａｋ２、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ４、Ｃｄｃ２１１、Ｃｇａ、Ｆｇｒ、Ｆｏｃ１、Ｆｐｓ１２、Ｇａｂｒｒ１、Ｇａｂｒｒ２、Ｇｄｆ６、Ｇｌｕｔ１、Ｇｎｂ１、Ｇｐｃｒ１４、Ｇｒｂ２−ｐｓ、Ｇｒｉｋ３、Ｇｒｉｋ５、Ｈｓｐ８６−１ｐｓ４、Ｈｔｒ１ｄａ、Ｈｔｒ１ｄｂ、Ｉｄｄ９、Ｉｆａ１、Ｉｆａ２、Ｉｆａ３、Ｉｆａ４、Ｉｆａ５、Ｉｆａ６、Ｉｆａ７、Ｉｆａ８、Ｉｆａ９、Ｉｆａ１０１Ａｐ１８、Ｌｍｙｃ１、Ｍｐｍｖ１９、Ｍｐｍｖ４４、Ｍｔｖ１３、Ｍｔｖ１４、Ｍｔｖ１７、Ｎｐｐｂ、Ｏｔｆ６、Ｏｔｆ７、Ｒｉ１２、Ｓｋｉ、Ｔｎｆｒ２、Ｗｎｔ４、Ｘｍｍｖ８、Ｘｍｍｖ２３、Ｘｍｍｖ６２、Ｘｍｖ１、Ｘｍｖ２、Ｘｍｖ８、Ｘｍｖ９、Ｘｍｖ１４、Ｘｍｖ４４、Ｘｐａ、Ｔｅｃ、Ｆｇｆ５、Ｎｏｓ１、Ｔｃｆ１、Ｅｐｏ、Ｇｎｂ２、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ３、Ａｃｈｅ、Ａｄｒａ２ｃ、Ａｄｒｂｋ２、Ａｆｐ、Ａｌｂ１、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｃｙｐ３、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ１３、Ｄｒｄ１ｂ、Ｄｒｄ５、Ｆｇｆｒ３、Ｆｌｋ１、Ｇｃ、Ｇｎｒｈｒ、Ｇｐｃｒ１、Ｈｃｓ５、Ｈｎｆ１、Ｈｔｒ５ａ、Ｉ１５ｒ、Ｉ１６、Ｋｉｔ、Ｌｔｒｍ３、Ｍｇｓａ、Ｍｐｍｖ７、Ｍｐｍｖ１３、Ｍｐｍｖ２３、Ｍｔｖ３２、Ｍｔｖ４１、Ｐｄｇｆａ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｐｏｒ、Ｔｘｋ、Ｘｍｍｖ３、Ｘｍｍｖ５、Ｘｍｍｖ５２、Ｘｍｖ１７、Ｘｍｖ２８、Ｘｍｖ３４、Ｘｍｖ３８、Ｘｍｖ４５、Ｚｐ３、Ｔｒｈ、Ｒａｆ１、Ｆｔｈ−ｒｓ２、Ｎｔｆ３、Ｋｒａｓ２、Ｐｔｈｌｈ、Ｍｏｖ１、Ａｌｏｘ５、Ｂｒａｆ２、Ｃｆｔｒ、Ｅｇｒ４、Ｆｐｓｌ１０、Ｆｇｆ６、Ｇｄｆ３、Ｇｈｒｆｒ、Ｇｌｕｔ３、Ｇｒｉｎ２ａ、Ｈｉｏｒ３、Ｈｏｘａ１０、ｈｏｐ、Ｉｃａ１、Ｉ１５ｒ、Ｉｎｔ４１、Ｉｔｐｒ１、Ｋｒａｇ、Ｍａｄ、Ｍｅｔ、Ｍｉ、Ｍｔｖ８、Ｍｔｖ２３、Ｍｔｖ２９、Ｍｔｖ３３、Ｍｔｖ３４、Ｎｋｎａ、Ｎｐｙ、ｏｂ、Ｏｔｆ３−ｒｓ５、Ｔｇｆａ、Ｔｎｆｒ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ７Ａ、Ｘｍｍｖ２７、Ｘｍｖ２４、Ｘｍｖ６１、Ｆｏｓｂ、Ｒｙｒ１、Ｎｇｆａ、Ｕｆｏ、Ｘｒｃｃ１、Ａｂｐａ、Ａｂｐｇａ、Ｇａｂｒａ４、Ｇａｓ２、Ａｃｒａ７、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ７、Ｅｇｆｂｐ３、Ｘｍｖ３０、Ｚｐ２、Ｆｅｓ、Ｐｃｓｋ３、Ｃａｌｃ、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１０、Ｐｔｈ、Ａｄ、Ｂｃ１３、Ｃｅａ、Ｃｅａ２、Ｃｅａ３、Ｃｅａ４、Ｃｅａ５、Ｃｅａ６、Ｃｅｂｐ、Ｄｍ９、Ｄｍ１５、Ｄｒｄ４、Ｅｇｆｂｐ１、Ｅｇｆｂｐ２、Ｅｒｃｃ２、Ｆｇｆ３、Ｆｇｆｒ２、Ｇａｂｒａ５、Ｇａｂｒｂ３、Ｇｔｘ、Ｈｃｓ１、Ｉｇｆ１ｒ、Ｉｇｆ２、Ｉ１４ｒ、Ｉｎｓ２、Ｉｎｔ４０、Ｌｈｂ、Ｍｐｍｖ１、Ｍｔｖ１、Ｍｔｖ３５、Ｎｇｆｇ、Ｎｔｆ５、Ｏｔｆ２，２、Ｐｋｃｃ、Ｒａｓ１４、Ｒｒａｓ、Ｒｙｒ、Ｓｖｐ２、Ｔｃｆ３ｇ、Ｔｇｆｂ１、ｔｕｂ、Ｘｍｍｖ３１、Ｘｍｍｖ３５、Ｘｍｍｖ７３、Ｘｍｖ３３、Ｘｍｖ５３、Ｔａｚ８３、Ａｄｒｂ３、Ｊｕｎｂ、Ｊｕｎｄ１、Ｍｅ１、Ｇｐｃｒ１９−ｒｓ２、Ａｇｔ、Ｃａｄｐ、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ９、Ｅ、Ｆｇｆｒ１、Ｇａｓ６、Ｇｎｂ−ｒｓ１、Ｈｃｓ２、Ｉｎｓｒ、Ｍａｆ、Ｍｏｖ３４、Ｍｐｍｖ２１、Ｍｐｍｖ４１、Ｍｔｖ２１、Ｍｔｎｒ１ａ、Ｐｌａｔ、Ｒａｓ１５−２、Ｒａｓ１６、Ｓｎｔｂ２、Ｘｍｍｖ２９、Ｘｍｖ１２、Ｘｍｖ２６、Ｘｍｖ６２、Ｅｐｏｒ、Ｇｐｃｒ１３、Ｏｔｆ１１、Ｐｔｈｒ、Ａｃｒａ３、Ａｃｒａ５、Ａｃｒｂ４、Ｃａｍｋ１、Ｃｄｃ２５Ｍｍ、Ｃｒｂｐ、Ｃｒｂｐ２、Ｃｓｋ、Ｃｙｐ１１ａ、Ｃｙｐ１９、Ｄｒｄ２、Ｅｔｓ１、Ｆｌｉ１、Ｇｎａｉ２、Ｇｎａｔ１、Ｇｐｃｒ６、Ｇｒｉａ４、Ｈｇｆ１、Ｈｉｏｒ１、Ｈｐｘ、Ｈｓｐ８６−１ｐｓ３、Ｈｓｔ２、Ｉｄｄ２、Ｉ１１ｂｃ、Ｌａｇ−ｒｓ１、Ｌａｐ１８−ｒｓ１、Ｍ１１、Ｍｐｍｖ２７、Ｐｅｎｋ、Ｐｇｒ、Ｒａｓ１２−２、Ｔｐ１１、Ｔｒｆ、Ｘｍｍｖ２、Ｘｍｍｖ６７、Ｘｍｖ１５、Ｘｍｖ１６、Ｘｍｖ２５、Ｘｍｖ６０、Ｍｇｆ、Ａｍｈ、Ｂｒａｆ、Ｃｄｃ２ａ、Ｄｍｄ１、Ｅｓｔｒ、Ｆｐｓ１３、Ｆｐｓ１４、Ｆｐｓ１５、Ｇｌｉ、Ｇｐｃｒ１７、Ｇｒｉｋ２、Ｉｆｇｒ、Ｉｇｆ１、Ｍｐｍｖ５、Ｍｐｍｖ１２、Ｍｐｍｖ４０、Ｍｙｂ、Ｏｐｒｍ、Ｐｇ、Ｐｍｃｈ、Ｒｏｓ１、Ｘｍｖ３１、Ｘｍｖ５１、Ｘｍｖ５４、Ｃａｍｋ２ｂ、Ｅｇｆｒ、Ｉｎｔ６、Ｌｉｆ、Ｍｔｖ４４、Ｅｗｓ、Ｃｓｆｇｍ、Ｆｌｔ４、Ｉ１３、Ｉ１４、Ｉ１５、Ｉｒｆ１、Ｇｒｉａ１、Ｇｌｕｔ４、Ｃｒｈｒ、Ｃｓｆｇ、Ｍｏｖ９、Ｘｍｖ２０、Ａｃｒｂ、Ｍｐｍｖ４、Ｍｐｍｖ１５、Ｎｇｆｒ、Ｎｏｓ２、Ｒａｒａ、Ｔａｚ４、Ｔｃｆ２、Ｘｍｖ４２、Ｍｔｖ３、Ａｄｒａ１、Ｃｒｋｏ、ｄｆ、Ｅｒｂｂ２、Ｇａｂｒａ１、Ｇａｂｒａ６、Ｇａｂｒｇ２、Ｇｈ、Ｇｌｒａ１、Ｇｒｂ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｓｐ８６−ｐｓ１、Ｉｄｄ４、Ｉｇｆｂｐ１、Ｉｇｆｂｐ３、Ｉ１１３、Ｉｎｔ４、Ｍｐｍｖ２、Ｍｐｍｖ８、Ｍｐｍｖ１８、Ｍｔｖ４５、ｎｕ、Ｐｋｃａ、Ｒａｂ１、Ｒｅ１、Ｓｈｂｇ、Ｔｃｆ７、Ｔｈｒａ、Ｔｎｚ１、Ｔｒｐ５３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｘｍｖ４、Ｘｍｖ５、Ｘｍｖ４７、Ｘｍｖ４９、Ｘｍｖ６３、Ａｋｔ、Ａｍｈ−ｒｓ４、Ｃｃｓ１、Ｆｐｓ１６、Ｆｏｓ、Ｇｄｆ７、Ｈｃｓ３、Ｈｓｐ７０−２、Ｈｓｐ８４−３、Ｈｓｐ８６−１、ｈｙｔ、Ｌｔｒｍ１、Ｍａｘ、Ｍｐｍｖ１１、Ｍｐｍｖ２４、Ｍｔｖ９、Ｍｔｖ３０、Ｐｏｍｃ１、Ｔｃｆ３ａ、Ｔｄａ２、Ｔｇｆｂ３、Ｔｐｏ、Ｔｓｈｒ、Ｘｍｍｖ２１、Ｘｍｍｖ２５、Ｘｍｍｖ３４、Ｘｍｍｖ５０、Ｇｌｉ３、Ｘｍｖ５５、Ｒｙｒ２、Ｉｎｈｂａ、Ｇａｓ１、Ｐｃｓｋ１、Ａｍｈ−ｒｓ２、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ６、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１３、Ｃｒｈｐｂ、Ｄａｔ１、Ｄｒｄ１ａ、Ｆｇｆｒ４、Ｆｐｓ１７、Ｆｉｍ１、Ｇｐｃｒ１５、Ｇｐｃｒ１８、Ｈｂｖｉ、Ｈｉｌｄａ、Ｈｔｒ１ａ、Ｉｄｄ１１、Ｉ１９、Ｌｔｒｍ４、Ｍａｋ、ｍｅｓ、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐｒ１、Ｒａ１、Ｒａｓａ、Ｓｒｄ５ａ１、Ｔｐｂｐ、Ｘｍｖ１３、Ｘｍｖ２７、Ｒａｒｂ、Ｒｂｐ３、Ｈｔｒ２、Ｒｂ１、Ａｃｒａ２、Ｃａｍｋｇ、Ｃｃｈ１１ａ２、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ５、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１２、Ｇｎｒｈ、Ｍｔｖ１１、Ｎｒａｓ−ｐｓ、Ｏｔｆ３−ｒｓ６、Ｐｌａｕ、Ｐｔｐｒｇ、Ｔｒｐ５３−ｐｓ、Ｗｎｔ５Ａ、Ｘｍｖ１９、Ｇｈｒ、Ｉ１７ｒ、Ｌｉｆｒ、Ｍｌｖｉ２、Ｐｒｌｒ、Ｍｙｃ、Ｒｉｌ１、ｃｏｇ、Ａｍｈ−ｒｓ７、Ｉ１２ｒｂ、Ｐｄｇｆｂ、Ａｃｒ、ＣＰ２、Ｒａｒｇ、Ｓｐ１−１、Ｗｎｔ１、Ａｆｒ１、Ａｔｆ４、Ｂｚｒｐ、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１１、Ｃｙｐ１１ｂ、Ｉ１３ｒｂ１、Ｉ１３ｒｂ２、Ｉｎｓ３、Ｉｔｇａ、Ｍｌｖｉ１、Ｍｌｖｉ３、Ｍｔｖ３６、Ｐｄｇｆｅｃ、Ｓｖｐ５、Ｔｅｆ、Ｔｒｈｒ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｘｍｍｖ５５、Ｘｍｍｖ７２、Ｘｍｖ３７、Ｔｎｐ２、Ｅｔｓ２、Ｃａｓｒ、Ｃｈｕｃｋ−ｒｓ１、ｄｉｎ、Ｄｒｄ３、Ｅｒｇ、Ｇ２２ｐ１、Ｇａｐ４３、Ｇａｓ４、Ｇｒｉｋ１、Ｈｔｒ１ｆ、Ｉｆｇｔ、Ｉｎｔ５３、Ｌｔｒｍ２、Ｍｐｍｖ１７、Ｍｔｖ６、Ｍｔｖｒ１、Ｐｉｔ１、Ｘｍｖ３、Ｘｍｖ３５、Ｘｍｖ５０、Ｉｇｆ２ｒ、Ｍａｓ、Ｔｃｄ３、Ｇｌｐ１ｒ、Ｉｄｄ１、Ｔｌａ、Ａｅｇ１、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ３、Ｃｄｃ２ｂ、Ｃｓｉ、Ｃｙｐ２１、Ｃｙｐ２１−ｐｓ１、Ｆｐｓ１８、Ｇｎａ−ｒｓ１、Ｇｐｃｒ１９−ｒｓ１、Ｇｒｒ１、Ｇｒｒ２、Ｈｏｍ１、Ｈｓｃ７０ｔ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７０−１、Ｈｓｐ７０−３、Ｈｓｐ８４−１、Ｈｓｔ１、Ｈｓｔ４、Ｈｓｔ５、Ｈｓｔ６、Ｈｙｅ、Ｉｎｔ３、Ｉｔｐｒ３、Ｌａｐ１８−ｒｓ２、Ｏｔｆ３、Ｐｔｐｒｓ、Ｒａｂ１１ｂ、Ｒａｓ１２−１、Ｒａｓ１２−３、Ｒａｓ１３、Ｒｒｓ、Ｒｘｒｂ、Ｔａｓ、Ｔｃｄ１、Ｔｃｄ２、Ｔｅｒａ１、Ｔｌａ−ｒｓ、Ｔｎｆａ、Ｔｎｆｂ、Ｔｐｘ１、Ｔｐｘ２、Ｘｍｍｖ１５、Ｘｍｖ３６、Ｘｍｖ５７、Ｃｓｆｍｒ、Ｐｄｇｆｒｂ、Ａｄｒｂ２、Ａｐｃ、Ｃａｍｋ２ａ、Ｃａｍｋ４、Ｄｃｃ、Ｆｇｆ１、Ｇｎａ１、Ｇｐｃｒ７、Ｇｒ１１、Ｇｒｐ、Ｈｓｐ７４、Ｍｃｃ、Ｍｔｖ２、Ｍｔｖ３８、Ｐｔｐｎ２、Ｔｐ１２、Ｘｍｖ２２、Ｘｍｖ２３、Ｘｍｖ２９、Ｆｔｈ、Ｃｓｆｇｍｒａ、Ｍｘｉ１、Ａｄｒａ２ａ、Ａｄｒｂ１、Ａｄｒｂｋ１、Ｃｈｕｃｋ、Ｃｙｐ１７、Ｇｎａ１４、Ｇｎｂ−ｐｓ１、Ｈｃｓ６、Ｈｔｒ７、Ｉｄｅ、Ｉｎｓ１、Ｌｐｃ１、Ｐｏｍｃ２、Ｓｅａｏ、Ｔｌｘ１、Ｘｍｍｖ４２、Ｘｍｖ１８、Ｔｃｆｅ３、Ａｒａｆ、Ａｖｐｒ２、ｍｄｘ、Ａｒ、Ｚｆｘ、Ｏｔｆ９、Ｃｃｇ１、Ｃｃｎｂ１−ｒｓ８、Ｆｐｓ１９、Ｇａｂｒａ３、Ｇｌｒａ２、Ｇｌｒａ４、Ｇｒｉａ３、Ｇｒｐｒ、Ｈｓｐ７４−ｐｓ１、Ｈｓｔ３、Ｈｔｒ１ｃ、Ｉ１２ｒｇ、Ｍｏｖ１４、Ｍｏｖ１５、Ｍｔｖ２８、Ｏｔｆ３−ｒｓ８、Ｓｔｓ、Ｓｘａ、Ｓｘｒ、Ｘｔａ、Ｔｄｙ、Ｈｙａ、Ｚｆｙ１、Ｚｆｙ２、Ｍｏｖ１５、Ｍｏｖ２４、Ｍｔｖ３１、Ｍｔｖ４２、Ｓｄｍａ、Ｓｐｙ、Ｓｔｓ、Ｓｘａ、Ｓｘｒ、ＸｍｍｖＹ、Ｘｍｖ７、Ｘｍｖ１１、およびＸｍｖ４０が挙げられる。
インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)遺伝子の限定されない例としては、Ａｃｃ、ａｃｅ、Ａｄｋ、Ａｍ、Ａｍｖ−１、Ａｍｖ−２、Ａｎｅ、ａｐｈ、Ａｒｃ、Ａｒｅ、ａｒｇ、Ａｒ１（Ａｒｃ）、ａｓｐ、Ｂ、ｂｃ−ｕ、ｂｃ−１．ｓｕｐ．１、ｂｃ−１．ｓｕｐ．２、ｂｃ−２．ｓｕｐ．１、ｂｃ−２．ｓｕｐ．２、ｂｃ−３、Ｂｃｍ、Ｂｅｇ、Ｂｉｐ、ｂｌｕ、Ｂｐｍ、Ｂｓｍ、Ｂｙ−１、Ｂｙ−２、Ｃ、Ｃ／ｃ、ｃ．ｓｕｐ．ｃｒ、Ｃ．ｓｕｐ．ｃｉｒ、Ｃ．ｓｕｐ．ｍａ（Ｍ，Ｒ．ｓｕｐ．ｍａ）、Ｃ．ｓｕｐ．ｒ、Ｃ．ｓｕｐ．ｒｅｓ、Ｃ．ｓｕｐ．ｒｈｏ、Ｃ．ｓｕｐ．ｓｔ、［Ｃ．ｓｕｐ．ｓｔ Ｒ Ａｃｃ］（Ａｅｑ）、ｃ．ｓｕｐ．ｕ（ｉｎｈ、ｉ．ｓｕｂ．ｅ）、［ｃ．ｓｕｐ．ｕ Ｐｒｐ．ｓｕｐ．ｉ］（Ｐｒｐ、ｃ．ｓｕｐ．ｕｉ、Ｎｕｄ）、［ｃ．ｓｕｐ．ｕｐｒｐ．ｓｕｐ．ｓｔ］（ｐｒｐ．ｓｕｐ．ｓｔ）、［Ｃ Ｐｒｐ］（Ｐｒｐ）、ｃ．ｓｕｐ．ｖ、［Ｃ Ｒ］（Ｒ）、［Ｃ ｒ］（ｒ）、Ｃａ、Ｃａｍ、Ｃａｖ、ｃｃ、ｃｈ１、ｃ１、ｃｍ１、Ｃｏ−１（Ａ）、Ｃｏ−２（Ａｒｅ）、Ｃｏ−３（Ｍｅｘｉｑｕｅ １）、Ｃｏ−３．ｓｕｐ．２、Ｃｏ−４（Ｍｅｘｉｑｕｅ ２）、Ｃｏ−５（Ｍｅｘｉｑｕｅ ３）、Ｃｏ−６、Ｃｏ−７、ｃｒ−１ ｃｒ−２、ｃｒｙ、ｃｓ、Ｃｔ、ｃｔｖ−１ ｃｔｖ−２、ｃｙｖ（ｂｙ−３）、Ｄ（Ｃａｎ、Ｉｎｓ）、Ｄａ、Ｄｂ、ｄｅｆ、ｄｇｓ（ｇ１、ｌｅ）、ｄｉａ、Ｄｉａｐ−１、Ｄｉａｐ−２、ｄｉｆｆ、ｄｉｓ、Ｄ１−１ Ｄ１−２（ＤＬ．ｓｕｂ．１ ＤＬ．ｓｕｂ．２）、ｄｏ、ｄｓ（ｔｅ）、ｄｔ−１．ｓｕｐ．ａ ｄｔ−２．ｓｕｐ．ａ、ｄｔ−１．ｓｕｐ．ｂ ｄｔ−２．ｓｕｐ．ｂ、ｄｗ−１ ｄｗ−２、Ｅａ Ｅｂ、ｅｒｓ（ｒｅｓｔｒ）、ｅｒｓ−２、Ｅｓｔ−１、Ｅｓｔ−２、ｅｘｐ、Ｆ、Ｆａ、ｆａｓｔ、Ｆｂ Ｆｃ、ｆａ ｆｂ ｆｃ、Ｆｃｒ、Ｆｃｒ−２、ｆｄ、Ｆｅ−１ Ｆｅ−２、Ｆｉｎ（ｉｎ）、Ｆｏｐ−１、Ｆｏｐ−２、Ｆｒ、Ｆｒ−２、Ｇ（Ｆｌａｖ、Ｃａ、Ｏｃｈ）、Ｇａ、ｇａｓ、ｇｌｂ、Ｇｐｉ−ｃ１、Ｇｒ、Ｈｂ１（Ｌ．ｓｕｂ．ＨＢ−１）、Ｈｂｎｃ（ＳＣ．ｓｕｂ．ＨＢ−１）、Ｈｂｐ（ＰＤ．ｓｕｂ．ＨＢ−１）、ｈｍｂ、Ｈｓｓ、Ｈｓｗ、Ｈｔ−１ Ｈｔ−２（Ｌ−１ Ｌ−２）、Ｉ、Ｉａ Ｉｂ、ｉａｎ−１ ｉａｎ−２（ｉａ）、ｌｂｄ、ｉｃｏ、Ｉｇｒ（Ｉｈ）、ｉｌｏ、ｉｐ、ｉｔｅｒ、ｉｖ、ｉｗ、Ｊ（Ｓｈ）、Ｋｅ、Ｌ、ｌａ、Ｌａｎ、Ｌｄ、Ｌｄｓ（Ｄｓ）、Ｌｅｃ、Ｌｉ（Ｌ）、ｌｏ、Ｉｒ−１ ｌｒ−２、ｍａｒ、Ｍｅ、Ｍｅｌ（Ｍｅ）、Ｍｅｌ−２（Ｍｅ−２）、ｍｅｌ−３（ｍｅ−３）、Ｍｆ、ｍｉ、ｍｉａ、Ｍｉｃ（Ｍｉｐ）、ｍｉｖ、Ｍｒｆ、Ｍｒｆ．ｓｕｐ．２、ｍｒｆ、ｍｓ−１、Ｍｕｅ、ｍｕ ｍｕｔａｔｏｒ、Ｎａｇ、Ｎｄ−１ Ｎｄ−２（Ｄ−１ Ｄ−２）、ｎｉｅ、ｎｎｄ（ｓｙｍ−１）、ｎｎｄ−２、Ｎｏ、ｎｔｓ（ｎｏｄ）、Ｎｕｄｕｓ、ｏｌ、Ｐ、ｐ．ｓｕｐ．ｇｒｉ（Ｇｒｉ、ｖ．ｓｕｐ．Ｐａｌ）、ｐａ、ｐｃ、ｐｇ（ｐａ．ｓｕｂ．１）、Ｐｈａ、Ｐｍｖ、ｐｐｄ（ｎｅｕ）、Ｐｒ、ｐｒｃ（ｐｃ）、Ｐｒｘ、ｐｕｎｃ、ｒａｍ、Ｒｂｃｓ（ｒｂｃＳ）、ｒｆ−１、ｒｆ−２、ｒｆ−３、ｒｆｉ（ｉ）、Ｒｆｓ （ｍ）、Ｒｋ、ｒｋ、ｒｋ．ｓｕｐ．ｄ（ｌｉｎ）、ｒｎ−１ ｒｎ−２（ｒ ｒ）、ｒｎｄ、Ｒｏ、Ｓａｌ、ｓｂ、ｓｂ．ｓｕｐ．ｍｓ、ｓｂ−２、ｓｂ−３、ｓｉ１、Ｓｋｄｈ、ｓ１、Ｓｍｖ、Ｓｔ、Ｓｕｒ、ｓｗ−１ ｓｗ−２、Ｔ、ｔ（ｚ−１）、Ｔｈ−１ Ｔｈ−２、Ｔｍ、Ｔｏ、Ｔｏｒ（Ｔ）、Ｔｒ、ｔｒｉ、ｔｒｖ、Ｔｓ、ｔｗ、ｕｎｉ、Ｕｎｉ−２、ｕｎｉ．ｓｕｐ．ｎｄｅ、ｕｎｉ．ｓｕｐ．ｎｉｅ、Ｕｒ−１、Ｕｒ−２、Ｕｒ−２．ｓｕｐ．２、Ｕｒ−３（Ｕｒ−３、Ｕｒ−４）、Ｕｒ−３．ｓｕｐ．２、Ｕｒ−４、（Ｕｐ−２、Ｕｒ−Ｃ）、Ｕｒ−５、（Ｂ−１９０）、Ｕｒ−６（Ｕｒ．ｓｕｂ．ａ、Ｕｒ−Ｇ）、Ｕｒ−７（Ｒ．ｓｕｂ．Ｂ１１）、Ｕｒ−８（Ｕｐ−１）、Ｕｒ−９（Ｕｒ．ｓｕｂ．ｐ）、ｕｓ、Ｖ（Ｂ１）、ｖ．ｓｕｐ．ｌａｅ（Ｃｏｒ）、ｖ、ｖａｒ、ｖｉ（ｖｉｒ．ｓｕｂ．ｆ）、ｗｂ、Ｗｍｖ、Ｘ．ｓｕｐ．ｓｕ、ｙ、およびＺが挙げられる。
サッカロミセス・セレビシエ遺伝子の限定されない例としては、ＰＲＥ３、ＰＵＰ１、ＰＵＰ３、ＰＲＥ２、ＰＲＥ１０、ＰＲＥ１、ＰＲＥ８、ＳＣＬ１、ＰＵＰ２、ＰＲＥ５、ＰＲＥ７、ＰＲＥ４、ＲＰＴ２、ＲＰＴ３、ＲＰＮ３、ＲＰＮ１１、ＲＰＮ１２、ＲＰＴ６、ＲＰＮ１、ＲＰＮ２、ＲＰＴ１、ＲＰＴ５、ＲＰＴ４、ＳＫＩ６、ＲＲＰ４、ＤＩＳ３、ＴＳＣ１０、ＲＡＴ１、ＧＮＤ１、ＥＸＯ７０、ＥＲＧ１０、ＡＣＣ１、ＲＰＰ０、ＡＣＴ１、ＡＲＰ１００、ＡＲＰ３、ＰＡＮ１、ＡＲＰ２、ＡＲＰ４、ＡＲＰ９、ＳＰＥ２、ＣＹＲ１、ＡＬＡ１、ＴＰＳ１、ＴＵＢ１、ＡＢＦ１、ＤＥＤ８１、ＮＩＰ１、ＹＨＣ１、ＳＮＵ７１、ＡＴＭ１、ＭＡＫ５、ＲＯＫ１、ＤＥＤ１、ＳＰＢ４、ＡＵＲ１、ＰＳＥ１、ＡＬＧ１、ＴＵＢ２、ＢＰＬ１、ＭＳＬ５、ＥＲＧ２４、ＥＲＧ２６、ＥＲＧ２５、ＣＭＤ１、ＨＣＡ４、ＳＨＥ９、ＳＨＥ１０、ＣＡＫ１、ＰＩＳ１、ＣＨＯ１、ＣＤＳ１、ＥＳＲ１、ＮＵＤ１、ＣＤＣ４７、ＣＤＣ１３、ＣＤＣ３７、ＣＤＣ１、ＣＤＣ４、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣ４６、ＣＤＣ３、ＫＡＲ１、ＢＢＰ１、ＨＲＰ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＨＳＰ１０、ＳＭＣ１、ＳＭＣ２、ＣＨＣ１、ＣＦＴ２、ＣＬＰ１、ＣＯＰ１、ＳＥＣ２６、ＳＥＣ２７、ＲＥＴ２、ＳＥＣ２１、ＣＯＦ１、ＣＣＴ４、ＣＣＴ１、ＣＣＴ６、ＳＥＣ２４、ＳＥＣ７、ＰＣＦ１１、ＲＮＡ１５、ＲＮＡ１４、ＦＩＰ１、ＹＳＨ１、ＴＦＢ４、ＴＳＭ１、ＡＰＣ２、ＡＰＣ５、ＳＥＣ３１、ＴＡＦ４７、ＴＡＰ４２、ＭＰＰ１０、ＣＤＣ５３、ＣＫＳ１、ＣＤＣ２８、ＫＩＮ２８、ＣＮＳ１、ＥＲＧ１１、ＤＢＰ１０、ＤＢＰ８、ＰＲＯ３、ＤＹＳ１、ＡＬＲ１、ＴＩＤ３、ＤＮＡ２、ＳＳＬ２、ＲＡＤ３、ＲＦＡ３、ＲＦＡ２、ＲＦＡ１、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＲＦＣ３、ＲＦＣ２、ＲＦＣ１、ＴＯＰ２、ＲＡＰ１、ＲＰＣ２５、ＰＲＩ２、ＰＲＩ１、ＰＯＬ１、ＰＯＬ１２、ＨＵＳ２、ＣＤＣ２、ＰＯＬ２、ＤＰＢ２、ＲＰＢ１０、ＲＰＡ１３５、ＲＰＡ１９０、ＲＰＡ４３、ＲＰＢ８、ＲＰＯ２６、ＲＰＢ５、ＲＰＣ４０、ＲＰＣ１９、ＳＲＢ７、ＳＲＢ４、ＲＧＲ１、ＲＰＢ１１、ＳＲＢ６、ＲＰＢ２、ＲＰＢ７、ＲＰＯ２１、ＲＥＴ１、ＲＰＯ３１、ＲＰＣ３１、ＲＰＣ３４、ＲＰＣ５３、ＲＰＣ８２、ＲＰＢ１２、ＲＰＢ３、ＤＰＭ１、ＤＩＰ２、ＲＮＴ１、ＣＤＣ８、ＣＤＣ１４、ＤＵＴ１、ＵＢＡ２、ＵＢＡ１、ＵＢＣ９、ＣＤＣ３４、ＥＮＰ１、ＥＲＤ２、ＳＳＳ１、ＳＥＣ６１、ＳＥＣ６３、ＳＥＣ６２、ＧＮＡ１、ＧＰＩ８、ＤＡＭ１、ＤＵＯ１、ＩＲＲ１、ＰＲＰ３、ＴＩＭ９、ＨＳＨ４９、ＳＵＰ３５、ＥＸＭ２、ＭＥＸ６７、ＥＲＧ９、ＥＲＧ２０、ＦＡＳ２、ＦＡＳ１、ＮＯＰ１、ＦＡＤ１、ＡＯＳ１、ＦＢＡ１、ＮＣＢ２、ＢＲＮ１、ＴＵＢ４、ＧＤＩ１、ＧＯＧ５、ＳＲＭ１、ＣＤＣ２５、ＳＰＴ１６、ＹＩＦ２、ＢＥＴ４、ＣＤＣ４３、ＭＲＳ６、ＢＥＴ２、ＰＲＯ１、ＧＬＮ１、ＧＬＮ４、ＧＲＳ１、ＹＩＰ１、ＦＯＬ２、ＧＰＡ１、ＣＤＣ４２、ＳＡＲ１、ＹＰＴ１、ＳＥＣ４、ＧＳＰ１、ＴＥＭ１、ＲＨＯ１、ＣＤＣ２４、ＲＮＡ１、ＧＵＫ１、ＶＭＡ１６、ＰＭＡ１、ＨＫＲ１、ＳＩＳ１、ＭＧＥ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＦ１、ＨＡＳ１、ＭＯＴ３、ＨＴＳ１、ＥＳＡ１、ＨＳＬ７、ＨＯＭ６、ＲＩＢ７、ＳＬＹ１、ＣＳＬ４、ＰＵＲ５、ＣＳＥ１、ＩＰＰ１、ＭＤＭ１、ＵＳＯ１、ＳＯＦ１、ＭＡＫ１１、ＬＡＳ１、ＴＥＬ２、ＤＰＢ１１、ＳＧＤ１、ＦＡＬ１、ＭＴＲ３、ＭＴＲ４、ＳＰＰ２、ＳＩＫ１、ＲＲＰ７、ＰＯＰ４、ＲＲＰ１、ＰＯＰ３、ＢＦＲ２、ＣＤＣ５、ＮＲＤ１、ＭＥＴ３０、ＭＣＭ６、ＲＲＰ４６、ＳＡＳ１０、ＳＣＣ２、ＥＣＯ１、ＰＲＰ４３、ＢＥＴ３、ＢＥＴ５、ＳＴＮ１、ＮＦＳ１、ＩＤＩ１、ＳＲＰ１、ＫＡＰ９５、ＣＢＦ２、ＳＫＰ１、ＣＥＰ３、ＣＴＦ１３、ＥＲＧ７、ＫＲＳ１、ＰＳＡ１、ＰＭＩ４０、ＡＬＧ２、ＳＳＦ１、ＭＥＤ７、ＲＳＣ４、ＣＤＣ５４、ＭＣＭ２、ＡＦＧ２、ＥＲＧ１２、ＭＶＤ１、ＣＤＣ４８、ＭＨＰ１、ＥＲＶ１、ＳＳＣ１、ＴＩＭ４４、ＴＩＭ１７、ＴＩＭ２３、ＴＯＭ２２、ＴＯＭ４０、ＭＡＳ１、ＭＣＤ１、ＭＭＣ１、ＳＴＵ１、ＪＡＣ１、ＡＢＤ１、ＣＥＧ１、ＰＡＢ１、ＭＴＲ２、ＳＥＣ１６、ＲＯＴ１、ＩＮＯ１、ＭＬＣ１、ＭＹＯ２、ＧＰＩ２、ＳＰＴ１４、ＮＡＴ２、ＮＭＴ１、ＴＲＭ１、ＮＣＰ１、ＮＢＰ１、ＡＣＦ２、ＳＰＰ４１、ＮＵＴ２、ＬＣＰ５、ＰＲＰ１９、ＮＭＤ３、ＲＦＴ１、ＮＮＦ１、ＮＤＣ１、ＣＲＭ１、ＫＡＲ２、ＮＩＰ２９、ＮＡＢ２、ＮＩＣ９６、ＮＵＰ１４５、ＮＵＰ４９、ＮＵＰ５７、ＮＵＰ１５９、ＮＳＰ１、ＮＵＰ８２、ＣＤＣ３９、ＮＰＬ４、ＰＯＰ７、ＮＴＦ２、ＭＡＫ１６、ＮＰＬ３、ＮＯＰ２、ＮＯＰ４、ＮＨＰ２、ＮＯＰ１０、ＧＡＲ１、ＮＢＰ３５、ＷＢＰ１、ＳＴＴ３、ＳＷＰ１、ＯＳＴ２、ＯＳＴ１、ＯＲＣ１、ＯＲＣ６、ＯＲＣ５、ＯＲＣ４、ＯＲＣ３、ＲＲＲ１、ＳＡＴ２、ＰＷＰ２、ＰＥＸ３、ＴＯＲ２、ＰＩＫ１、ＳＥＣ１４、ＳＴＴ４、ＭＳＳ４、ＰＣＭ１、ＧＰＭ１、ＳＥＣ５３、ＥＲＧ８、ＹＰＤ１、ＰＡＰ１、ＮＡＢ３、ＲＲＮ７、ＳＥＮ１、ＣＦＴ１、ＰＲＰ１１、ＰＲＰ２１、ＰＲＰ３９、ＰＲＰ２４、ＰＲＰ９、ＳＬＵ７、ＰＲＰ２８、ＰＲＰ３１、ＩＦＨ１、ＰＴＡ１、ＳＵＢ２、ＦＭＩ１、ＭＡＳ２、ＥＳＳ１、ＰＦＹ１、ＰＯＬ３０、ＰＯＰ１、ＰＤＩ１、ＲＡＭ２、ＣＤＣ７、ＳＭＰ３、ＣＤＣ１５、ＹＴＨ１、ＱＲＩ２、ＹＡＥ１、ＳＦＩ１、ＳＥＣ１、ＢＥＴ１、ＳＥＣ６、ＳＥＣ１３、ＳＥＣ２、ＳＥＣ８、ＣＢＦ５、ＣＤＣ１９、ＹＲＢ１、ＲＨＣ１８、ＤＢＦ４、ＳＤＳ２２、ＭＣＭ３、ＣＥＦ１、ＡＬＧ１１、ＧＡＡ１、ＭＯＢ１、ＮＩＰ７、ＴＩＰ２０、ＳＥＣ５、ＳＥＣ１０、ＧＰＩ１０、ＲＲＰ３、ＣＤＣ４５、ＤＩＢ１、ＭＩＦ２、ＨＯＰ２、ＰＢＮ１、ＮＯＰ５、ＲＰＰ１、ＰＯＰ５、ＰＯＰ８、ＰＯＰ６、ＥＲＯ１、ＭＰＴ１、ＤＮＡ４３、ＥＳＰ１、ＳＭＣ３、ＬＳＴ８、ＳＴＳ１、ＲＰＭ２、ＲＮＲ１、ＲＮＲ２、ＲＮＲ４、ＲＰＳ２０、ＲＰＬ２５、ＲＰＬ３、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ４３Ａ、ＲＰＬ５、ＲＰＬ１０、ＲＰＳ３、ＣＥＴ１、ＹＲＡ１、ＳＮＭ１、ＧＬＥ１、ＤＢＰ５、ＤＲＳ１、ＤＢＰ６、ＢＲＲ２、ＲＲＮ３、ＲＲＮ６、ＲＲＮ１１、ＭＥＤ６、ＰＲＰ１６、ＲＰＲ２、ＤＩＭ１、ＲＲＰ４３、ＲＲＰ４２、ＲＲＰ４５、ＳＥＣ２０、ＢＯＳ１、ＣＤＣ１２、ＧＬＣ７、ＰＫＣ１、ＩＰＬ１、ＳＧＶ１、ＮＲＫ１、ＲＡＤ５３、ＬＣＢ２、ＬＣＢ１、ＭＰＳ１、ＳＥＳ１、ＳＰＣ３、ＳＥＣ１１、ＲＩＯ１、ＡＲＰ７、ＮＥＯ１、ＹＪＵ２、ＰＯＢ３、ＡＲＨ１、ＩＱＧ１、ＨＲＴ１、ＨＹＭ１、ＭＡＫ２１、ＦＵＮ２０、ＦＵＮ９、ＮＢＮ１、ＳＴＢ５、ＹＩＦ１、ＳＭＸ４、ＹＫＴ６、ＳＦＴ１、ＳＭＤ１、ＰＲＰ６、ＬＳＭ２、ＮＵＦ１、ＳＰＣ９７、ＳＰＣ４２、ＳＰＣ９８、ＣＤＣ３１、ＳＰＣ１９、ＳＰＣ２５、ＳＰＣ３４、ＳＰＣ２４、ＮＵＦ２、ＰＲＰ４０、ＭＣＤ４、ＥＲＧ１、ＳＭＣ４、ＣＳＥ４、ＫＲＲ１、ＳＭＥ１、ＴＲＡ１、ＲＬＰ７、ＳＣＨ９、ＳＭＤ３、ＳＮＰ２、ＳＳＦ２、ＳＰＣ７２、ＣＤＣ２７、ＣＤＣ２３、ＣＤＣ１６、ＡＰＣ１、ＡＰＣ１１、ＡＰＣ４、ＡＲＣ１９、ＲＰＮ６、ＲＰＮ５、ＲＳＣ６、ＲＳＣ８、ＳＴＨ１、ＳＦＨ１、ＴＩＭ１２、ＴＩＭ２２、ＴＩＭ１０、ＳＱＴ１、ＳＬＳ１、ＪＳＮ１、ＳＴＵ２、ＳＣＤ５、ＳＳＵ７２、ＡＳＭ４、ＳＥＤ５、ＵＦＥ１、ＳＹＦ１、ＳＹＦ２、ＣＣＴ５、ＴＢＦ１、ＴＯＡ２、ＴＯＡ１、ＳＵＡ７、ＴＡＦ９０、ＴＡＦ６１、ＴＡＦ２５、ＴＡＦ６０、ＴＡＦ１７、ＴＡＦ１４５、ＴＡＦ１９、ＴＡＦ４０、ＴＡＦ６７、ＴＦＡ２、ＴＦＡ１、ＦＣＰ１、ＴＦＧ１、ＴＦＧ２、ＴＦＢ１、ＣＣＬ１、ＳＳＬ１、ＴＦＢ３、ＴＦＢ２、ＰＺＦ１、ＢＲＦ１、ＴＦＣ５、ＴＦＣ４、ＴＦＣ３、ＴＦＣ７、ＴＦＣ６、ＴＦＣ１、ＳＰＴ１５、ＴＨＩ８０、ＴＨＳ１、ＳＰＴ６、ＳＰＴ５、ＲＯＸ３、ＲＥＢ１、ＭＣＭ１、ＭＥＤ４、ＭＯＴ１、ＭＥＤ８、ＥＦＢ１、ＹＥＦ３、ＳＵＩ１、ＣＤＣ９５、ＴＩＦ１１、ＳＵＩ３、ＧＣＤ１１、ＳＵＩ２、ＧＣＤ６、ＧＣＤ７、ＧＣＤ２、ＧＣＤ１、ＲＰＧ１、ＧＣＤ１０、ＰＲＴ１、ＴＩＦ３４、ＣＤＣ３３、ＴＩＦ５、ＳＵＰ４５、ＧＣＤ１４、ＴＩＭ５４、ＳＥＣ１７、ＴＰＴ１、ＴＲＬ１、ＣＣＡ１、ＳＥＮ５４、ＳＥＮ２、ＳＥＮ１５、ＳＥＮ３４、ＷＲＳ１、ＳＬＮ１、ＴＹＳ１、ＳＮＵ５６、ＰＲＰ４２、ＣＵＳ１、ＰＲＰ４、ＰＲＰ８、ＳＮＵ１１４、ＵＳＳ１、ＵＦＤ１、ＳＭＴ３、ＲＳＰ５、ＱＲＩ１、ＡＬＧ７、ＵＧＰ１、ＶＴＩ１、ＶＡＳ１、ＳＥＣ１８、ＣＴＲ８６、およびＺＰＲ１が挙げられる。
２．ウイルス
本明細書で提供される微生物はウイルスを含む。このようなウイルスは一般に、本明細書で提供される微生物の１以上の特徴を有する。例えば、本明細書で提供されるウイルスは減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍などの免疫特権細胞および組織における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性タンパク質を発現する能力およびそれらの組合せを有し得る。いくつかの態様では、これらのウイルスは、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化させる能力を有する。
本明細書で提供されるウイルスはポックスウイルスなどの細胞質内ウイルスであってもよいし、またはアデノウイルスなどの核ウイルスであってもよい。本明細書で提供されるウイルスはそれらの生活環の一部として、宿主細胞の原形質膜の溶解を有し得る。あるいは、本明細書で提供されるウイルスはそれらの生活環の一部として、出芽またはエキソサイトーシスなどの非溶解経路による宿主細胞の出口を有し得る。本明細書で提供されるウイルスは、宿主生物に、そのウイルスの生活環の一部として誘導される溶解またはアポトーシスの結果として、ウイルス感染腫瘍細胞に対して免疫応答を発達させることができる。本明細書で提供されるウイルスはまた、宿主生物に、そのウイルスの生活環の一部として溶解またはアポトーシスが誘導されるかどうかにかかわらず、溶解またはアポトーシスの結果としてウイルス感染腫瘍細胞に対して免疫応答を発達させるように遺伝子操作することもできる。いくつかの態様では、本明細書で提供されるウイルスは、宿主生物に、腫瘍細胞を溶解することなく、または腫瘍細胞の細胞死を誘導することなく、腫瘍細胞に対して免疫応答を具備させることができる。
当業者ならば、限定されるものではないが、ウイルスの意図する使用（例えば、外因性タンパク質の生産、抗体の生産または腫瘍治療）、宿主生物、および腫瘍の種類を含む様々な因子により、様々なウイルスのいずれから選択することができる。
ａ．細胞質内ウイルス
本明細書で提供されるウイルスは、ウイルスの生活環が宿主細胞の核へのウイルス核酸分子の侵入を必要としない細胞質内ウイルスであってもよい。様々な細胞質内ウイルスが知られており、限定されるものではないが、ポックスウイルス、アフリカブタコレラ科ウイルス、および種々のＲＮＡウイルス（ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルス、コロナウイルスおよびラブドウイルスなど）が挙げられる。いくつかの態様では、ウイルスの核酸分子はウイルスの生活環を通じて宿主細胞の核へ侵入しない。他の態様では、ウイルスの生活環は宿主細胞の核タンパク質を用いることなく遂行し得る。他の態様では、ウイルスの毒力または病原性は、ウイルス複製に関与する１以上のウイルスタンパク質の活性をモジュレートすることによりモジュレート可能である。
ｉ．ポックスウイルス
一態様では、本明細書で提供されるウイルスはポックスウイルス科から選択される。ポックスウイルスとしては、オルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モラシポックスウイルスおよびヤタポックスウイルスなどのコルドポックスウイルス亜科、ならびに昆虫ポックスウイルスＡ、昆虫ポックスウイルスＢ、および昆虫ポックスウイルスＡなどのエントモポックスウイルス亜科が含まれる。コルドポックスウイルス亜科は脊椎動物のポックスウイルスであり、同じ抗原性、形態および宿主域を有し、従って、本明細書ではこのような様々なポックスウイルスが使用できる。当業者ならば、その属または個々のウイルスの既知の特性に従って、また、ウイルスの選択された特性（例えば、病原性、免疫応答惹起能、優先的腫瘍局在）、ウイルスの意図する使用、腫瘍の種類および宿主生物に従って、特定のコルドポックスウイルス属または個々のコルドポックスウイルス亜科を選択することができる。コルドポックスウイルス属の例としては、オルソポックスウイルスおよびアビポックスウイルスが挙げられる。
アビポックスウイルスは様々な異なる鳥類に感染することが知られており、ヒトに投与されてきた。アビポックスウイルスの例としては、カナリアポックスウイルス、ニワトリポックスウイルス、ユキヒメドリポックス(juncopox)ウイルス、カバイロハッカポックス(mynahpox)ウイルス、ハトポックスウイルス、オウムポックスウイルス、ウズラポックスウイルス、クジャクポックスウイルス、ペンギンポックスウイルス、スズメポックスウイルス、ムクドリポックスウイルス、およびシチメンチョウポックスウイルスが挙げられる。
オルソポックスウイルスは、齧歯類、家畜動物、霊長類およびヒトを含む様々な異なる哺乳類に感染することが知られている。いくつかのオルソポックスウイルスは広い宿主域を有するが、他のものの宿主域は狭い。オルソポックスウイルスの例としては、バッファローポックスウイルス、ラクダポックスウイルス、ウシポックスウイルス、エクトロメリアウイルス、サルポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、スナネズミポックスウイルス、ウアシン・ギシューウイルスワクシニアウイルス、天然痘ウイルスおよびハタネズミポックスウイルスが挙げられる。いくつかの態様では、選択されるオルソポックスウイルスは、ウシポックスウイルス、サルポックスウイルス、ワクシニアウイルスまたは天然痘ウイルスなど、ヒトに感染することが知られるオルソポックスウイルスであり得る。所望により、ヒトに感染することが知られているオルソポックスウイルスは、ウシポックスウイルス、サルポックスウイルスまたはワクシニアウイルスなど、広い宿主域を有するオルソポックスウイルス群から選択することができる。
ａ．ワクシニアウイルス
オルソポックスウイルスの一例としてワクシニアウイルスがある。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｗｙｅｔｈ、ＩＨＤ−Ｊ、およびＩＨＤ−Ｗ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ａｎｋａｒａ、ＭＶＡ、Ｄａｉｒｅｎ Ｉ、Ｌ−ＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、ＬＩＶＰ、ＷＲ ６５−１６、Connaught、New York City Board of Healthを含む、様々なワクシニアウイルス株が利用できる。ワクシニアウイルスの例としては、ＬｉｓｔｅｒまたはＬＩＶＰワクシニアウイルスが挙げられる。既知のワクシニアウイルスのいずれも、または本明細書で提供される、または当業者にとってワクシニアウイルスの毒性が軽減されていることが既知のものに対応するその修飾物が挙げられる。しかしながら一般にこの突然変異は多重突然変異であり、このウイルスは毒性を軽減すべくさらに選択される。
ワクシニアウイルスの直鎖ｄｓＤＮＡウイルスゲノムはおよそ２００ｋｂの大きさであり、全部でおよそ２００の潜在的遺伝子をコードする。ウイルス遺伝子の発現は３つの段階に分けることができる。初期段階では、遺伝子発現は主としてウイルス複製のため、そして宿主の免疫系からの防御のためのものである。中期段階では、後期トランスアクチベーターを含む、初期段階で発現に利用されない遺伝子が発現できる。後期段階では、活発な転写は主として成熟ウイルスを構築するためのウイルスの構造成分を目的としたものである。
ワクシニアウイルスは、癌遺伝子療法およびワクチン療法に用いるための様々な特徴を有する。それは広い宿主域と細胞種域を有する。ワクシニアは細胞質内ウイルスであるので、生活環の間、そのゲノムを宿主ゲノムに組み込まない。宿主の転写機構を必要とする他の多くのウイルスとは異なり、ワクシニアウイルスはウイルスゲノムにコードされている酵素を用いて宿主細胞の細胞質でその独自の遺伝子発現を支持することができる。ワクシニアウイルスゲノムは大きな外来遺伝子担持能を有するが、最大２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡ断片（ワクシニアゲノムサイズのおよそ１２％）を挿入することができる。いくつかのワクシニア株のゲノムが完全に配列決定されており、多くの必須および非必須遺伝子が同定されている。異なる株でも高い配列相同性があるので、あるワクシニア株の遺伝情報を、他の株で修飾ウイルスを設計および作製するために使用できる。最後に、遺伝子操作による修飾ワクシニア株の生産技術も十分確立されている(Moss, Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (1993), 86−90；Broder and Earl, Mol. Biotechnol. 13 (1999), 223−245; Timiryasova et al., Biotechniques 31 (2001), 534−540)。
歴史的に見て、ワクシニアウイルスは天然痘感染に対する免疫化のために用いられてきた。より最近では、修飾ワクシニアウイルスが様々な疾病に対抗するためのワクチンとして開発されている。弱毒ワクシニアウイルスは細胞を媒介とする免疫応答を誘発することができる。プライム／ブーストワクチン療法、非複製ワクシニアウイルスによるワクチン療法などの戦略、またはこれらの戦略の組合せは、安全かつ効果的なワクチン療法プロトコールの開発のための有望な結果を示している。これまでの研究からの突然変異ワクシニアウイルスは、目的の組織だけにウイルスビヒクルの効率的な送達（例えば、腫瘍における）ができない、可能性のある重大な合併症のため安全性を欠く（例えば、幼児においては、種痘性湿疹および脳炎、また、成人においては、その個人が重篤な免疫不全であれば、播種性または進行性種痘疹が生じることがある）といった様々な欠点を示す。
ｂ．修飾ワクシニアウイルス
本明細書では、本明細書の他所でより全般的に記載されているように、挿入、突然変異または欠失を有するワクシニアウイルスが提供される。これらのワクシニアウイルスは低毒性を持つよう、そして標的組織に集積するように修飾または選択される。このようなウイルスの例としては、ＬＩＶＰ株に由来するものがある。
挿入、突然変異または欠失の例は、野生株に対して弱毒されたワクシニアウイルスにおいて生じるようなものがある。例えば、ワクシニアウイルスの挿入、突然変異または欠失は、例えば、毒性を軽減すること、感染力を軽減すること、複製能を軽減すること、またはワクシニアウイルスが集積し得る非腫瘍器官または組織の数を減らすことにより、ワクシニアウイルスの病原性を低下させることができる。他の挿入、突然変異または欠失の例としては、限定されるものではないが、その微生物の抗原性を増強するもの、検出または画像化を可能とするもの、微生物の毒性を増強するもの（所望により、誘導プロモーターにより制御する）が挙げられる。例えば、修飾はヌクレオチド代謝、宿主の相互作用およびウイルス形成に関与する遺伝子において行うことができる。本明細書では、当技術分野で公知のワクシニアウイルスの様々な挿入、突然変異または欠失のいずれでも使用でき、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、ＶＧＦ遺伝子（米国特許公報第２００３００３１６８１号で教示）；出血領域またはＡ型封入体領域（米国特許第６，５９６，２７９号で教示）；Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｆ、Ｆ１３Ｌ、またはＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ（米国特許第６，５４８，０６８号で教示）；Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６ＲまたはＢ５Ｒ遺伝子（例えば、Katz et al., J. Virology 77:12266−12275 (2003)参照）；ＳａｌＦ７Ｌ（例えば、Moore et al., EMBO J. 1992 11:1973−1980参照）；Ｎ１Ｌ（例えば、Kotwal et al., Virology 1989 171:579−587参照）；Ｍ１λ（例えば、Child et al., Virology. 1990 174:625−629参照）；ＨＲ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫＦ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＮＭ、ＲＲ、またはＢａｍＦ（例えば、Lee et al., J Virol. 1992 66:2617−2630参照）；またはＣ２１Ｌ（例えば、Isaacs et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 89:628−632参照）の挿入、突然変異または欠失が挙げられる。
ｃ．Ｆ３遺伝子
当技術分野で公知の突然変異の他、本明細書で提供されるワクシニアウイルスはＦ３遺伝子（配列番号１；Ｆ３遺伝子の例はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５７９７７に示されており、ここにはＦ３ ＬＩＶＰ株のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列が含まれている；Mikryukov et al., Biotekhnologiya 4:442−449 (1988)参照）。例えば、このＦ３遺伝子は、ワクシニアウイルスＬＩＶＰ株ＤＮＡ(Mikryukov et al., Biotekhnologiy 4 (1988), 442−449)の、Ｆ３遺伝子内に位置するユニークな単一のＮｏｔＩ制限部位の３５番においてか、またはＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ断片内の１４７５番において、外来ＤＮＡ配をＮｏｔＩで消化したウイルスＤＮＡへ挿入することにより修飾されている。本明細書で示されるように、ｌａｃＺまたはルシフェラーゼ／ＧＦＰを含む核酸分子をＬＩＶＰ株のＦ３遺伝子のＮｏｔＩ部位（Ｍ５７９７７ではヌクレオチド１４７３〜１４８０、または配列番号１のヌクレオチド３３〜４０）に挿入すると、野生型ワクシニアウイルスに対して、脳および心臓を含むヌードマウスの非腫瘍器官におけるワクシニアウイルスの集積を低下させることができる。従って、本明細書で提供される方法で使用するため、ワクシニアウイルスはＦ３遺伝子の挿入、突然変異もしくは欠失、または相当する遺伝子座の突然変異を含み得る。例えば、本明細書で示されるように、Ｆ３分断修飾型ＬＩＶＰワクシニアウイルスは、インビボにおいて腫瘍細胞で選択的に複製することができる。よって、Ｆ３遺伝子が分断された修飾ワクシニアウイルス（例えば、修飾ＬＩＶＰ株）は、腫瘍に向けた遺伝子療法ならびに腫瘍および転移の検出のための方法など、本明細書で提供される方法において使用可能である。
よって、本明細書では、Ｆ３遺伝子の修飾を有するワクシニアウイルスが提供される。例えば、本明細書で提供されるワクシニアウイルスは、Ｆ３遺伝子への外来ＤＮＡの挿入を含み得る。外来ＤＮＡの挿入の例としては、ワクシニアＬＩＶＰ株におけるＦ３遺伝子のＮｏｔＩ部位に相当する部位におけるか、または配列番号１の３５番における挿入が挙げられる。本明細書で提供されるＦ３修飾ワクシニアウイルスは腫瘍で特異的にコロニー形成し得ることから、治療遺伝子の腫瘍特異的送達に使用できる。種々のワクシニアウイルス株のヌクレオチド配列に対してＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)によるＧｅｎＢａｎｋデータ解析を行った。この解析に基づき、ワクシニアウイルスＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株(Goebel et al., Virology 179 (1990), 247−266)において、ＮｏｔＩ制限部位が、Ｆ１４ＬおよびＦ１５Ｌ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に位置していることが判明した。よって、ＶＶゲノムＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子を挿入しても生命維持に必要な遺伝子は分断されない。ＶＶ ＬＩＶＰ株では、ＮｏｔＩ制限部位は、未知の機能を有するＦ３遺伝子をコードするＯＲＦ内に位置する(Mikryukov et al., Biotekhnologiya 4 (1988), 442−449)。よって、Ｆ３遺伝子のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子を挿入すると、Ｆ３遺伝子が分断された。このＦ３遺伝子が修飾できるということは、それがウイルス複製にとって必須でない役割を有する可能性があることを示唆している。Ｆ３遺伝子はウイルス複製には必須でないかもしれないが、動物実験の結果は、Ｆ３遺伝子の分断がウイルスの毒力の軽減、脳または卵巣で複製できないこと、および腫瘍組織で優先的に複製できることと関連があることを示唆している。
このＦ３遺伝子は、ＷＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２４３３１２．１のヌクレオチド４２２３８〜４２３８７）、Ａｎｋａｒａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８．１のヌクレオチド３７１５５〜３７３０４）、Ｔｉａｎ Ｔａｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９５６８９のヌクレオチド４１８０８〜４１９５４）、Ａｃａｍｂｉｓ ３０００（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５．１のヌクレオチド３１３６５〜３１５１４）およびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７．１のヌクレオチド４５３６８〜４５５１７）株を含む様々な異なるワクシニアウイルス株で保存されている。Ｆ３遺伝子はまた、大きなポックスウイルス科、特に、ウシポックスウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９４３５５．２のヌクレオチド５８４９８〜５８６４７）、ウサギポックスウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ４８４６６９．１のヌクレオチド４６９６９〜４７１１８）、ラクダポックスウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ００９０８９．１のヌクレオチド４３３３１〜４３４８０）、エクトメリアウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１２８２５．２のヌクレオチド５１００８〜５１１５７）、サルポックスウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３８０１３８．１のヌクレオチド４２５１５〜４２６６０）、および天然痘ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６９１９８．１のヌクレオチド３３１００〜３３２４９）などのオルソポックスウイルスの間で保存されている。従って、様々なワクシニアウイルス株を含むオルソポックスウイルスなどのポックスウイルスにおけるＦ３遺伝子の同等物の修飾も提供される。当業者ならば、様々なポックスウイルス、オルソポックスウイルスおよびワクシニアウイルスにおいて同等なＦ３遺伝子の位置を特定することができる。例えば、ポックスウイルス、オルソポックスウイルスおよびワクシニアウイルスにおけるＦ３遺伝子の同等物としては、配列番号１におけるＦ３遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を含む遺伝子が挙げられる。別の例では、ポックスウイルス、オルソポックスウイルスおよびワクシニアウイルスにおけるＦ３遺伝子の同等物は、配列番号２におけるＦ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を含む遺伝子が挙げられる。別の例では、ＬＩＶＰにおけるＦ３遺伝子と同等かどうかはウイルスゲノム内でのその構造的位置によって決定することができ、すなわち、Ｆ３遺伝子は、ワクシニアウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ断片上の、Goebel et al., Virology (1990) 179:247−266が定義しているようなオープンリーディングフレームＦ１４ＬとＦ１５Ｌの間に、ＯＲＦ Ｆ１４ＬおよびＦ１５Ｌとは逆向きに位置しており、当業者ならば、多様なポックスウイルスなど、多様な関連ウイルスの構造的に同等の領域に位置する遺伝子を容易に特定することができる。
比較タンパク質配列分析から、タンパク質機能に関するいくつかの洞察が明らかになった。Ｆ３遺伝子（ＬＩＶＰ株）によってコードされているタンパク質と最も一致するのは、線虫(Caenorhabditis elegans)由来のプロリル４−ヒドロキシラーゼαサブユニット前駆体（４−ＰＨα）である(Veijola et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 26746−26753)。このαサブユニットはヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼβサブユニットと活性なα−β二量体を形成する。プロリル４−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１１．２）は、コラーゲンにおいて４−ヒドロキシプロリンの形成を触媒する。この脊椎動物酵素はα２−β２四量体であり、そのβサブユニットはタンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ（ＰＤＩ）と同一である。ワクシニアウイルスの複製に対するこのタンパク質の重要性は未知であるが、このタンパク質が欠損すると、ワクシニアウイルスの腫瘍組織への再標的化が起こり得る。
ｄ．多重修飾
本明細書で提供されるワクシニアウイルスはまた、２以上の挿入、突然変異または欠失を含み得る。よって、本明細書で示される遺伝子座または当技術分野で既知の他の遺伝子座の２以上の挿入、突然変異または欠失を含むワクシニアウイルスも含まれる。一態様では、ワクシニアウイルスはＦ３遺伝子に１つの挿入、突然変異または欠失と、１以上の付加的な挿入、突然変異または欠失を含む。修飾ワクシニアウイルスの一態様では、少なくともＦ３遺伝子は外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。Ｆ３遺伝子の修飾などの修飾は一般に、その遺伝子または遺伝子産物の少なくとも部分的な不活性化を招く。一例では、このＦ３遺伝子とＴＫ遺伝子が、外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。別の例では、このＦ３遺伝子とＨＡ遺伝子が、外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。別の例では、Ｆ３遺伝子とＴＫ遺伝子およびＨＡ遺伝子の双方が外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。別の例では、ＨＡ遺伝子とＴＫ遺伝子が外来ヌクレオチド配列の挿入により修飾されている。よって、本組成物および方法は、（ａ）Ｆ３遺伝子、（ｂ）ＴＫ遺伝子、および（ｃ）ＨＡ遺伝子の２以上が修飾されている修飾ワクシニアウイルスを含む。一態様では、Ｆ３遺伝子、ＴＫ遺伝子およびＨＡ遺伝子の少なくとも２つが、例えば、そのコード領域内のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換により不活性化されているか、またはこれら遺伝子のうち２以上の調節配列が挿入、欠失または突然変異により不活性化されている。
ｅ．Ｌｉｓｔｅｒ株
別の態様では、本明細書で提供されるウイルスおよび方法はワクシニアウイルスのＬｉｓｔｅｒ株に対する修飾に基づくこともできる。Ｌｉｓｔｅｒ（Ｅｌｓｔｒｅｅとも呼ばれる）ワクシニアウイルスは様々な供給源のいずれから入手してもよい。例えば、ＥｌｓｔｒｅｅワクシニアウイルスはＡＴＣＣで受託番号ＶＲ−１５４９として入手できる。Ｌｉｓｔｅｒワクシニア株は腫瘍細胞において高い形質導入効率を有し、遺伝子発現レベルも高い。
一態様では、Ｌｉｓｔｅｒ株は、Ｌｉｓｔｅｒ株をさらに弱毒することにより作出されたＬＩＶＰ(Lister virus from the Institute of Viral Preparations, Moscow, Russia)株などの弱毒Ｌｉｓｔｅｒ株であってもよい。このＬＩＶＰ株は世界中、特にインドおよびロシアでワクチン療法に用いられたものであり、広く利用可能である。
このＬＩＶＰ株は、高い形質導入効率を維持しつつ、病原性を軽減したものである。例えば、本明細書で提供されるように、Ｆ３分断により修飾されたＬＩＶＰワクシニアウイルスはインビボにおいて腫瘍細胞で選択的に複製することができる。一態様において、本明細書では、修飾ＴＫ遺伝子を有するウイルス、修飾ＨＡ遺伝子を有するウイルス、修飾Ｆ３遺伝子を有するウイルス、ならびに修飾ＨＡ遺伝子、修飾ＴＫ遺伝子、および修飾Ｆ３遺伝子のうち２以上を有するウイルスを含む修飾ＬＩＶＰウイルスが提供される。
ｉｉ．その他の細胞質内ウイルス
また、本明細書では、ポックスウイルスではない細胞質内ウイルスも提供される。細胞質内ウイルスは宿主細胞の核にウイルス核酸分子を導入しなくとも複製することができる。このような様々な細胞質内ウイルスが当技術分野で公知であり、アフリカブタコレラ科のウイルス、ならびにアレナウイルス、ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、およびラボウイルスなどの種々のＲＮＡウイルスが挙げられる。トガウイルスの例としては、シンドビスウイルスが挙げられる。アレナウイルスの例としては、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスが挙げられる。ラボウイルスの例としては、水疱性口内炎ウイルスが挙げられる。パラミクソウイルスの例としては、ニューカッスル病ウイルスおよび麻疹ウイルスが挙げられる。ピコルナウイルスの例としては、ポリオウイルス、ウシエンテロウイルスおよびライノウイルスが挙げられる。フラビウイルスの例としては、黄熱病ウイルスが挙げられ、弱毒黄熱病ウイルスは、Barrett et al., Biologicals 25:17−25 (1997), and McAllister et al., J. Virol. 74:9197−9205 (2000)で例示されているように当技術分野で公知である。
また、本明細書では、野生型ウイルスに対して１以上の特徴を増強するための、上記で示したウイルスの修飾も提供される。このような特徴としては、限定されるものではないが、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させるための増大された能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せが挙げられる。いくつかの態様では、修飾ウイルスは、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化させる能力を有する。他の態様では、これらのウイルスは、画像化に使用できる遺伝子を含む、１以上の検出可能な遺伝子を発現するように修飾することができる。他の態様では、これらのウイルスは、その遺伝子産物を採取するため、かつ／またはその遺伝子産物に対する抗体を採取するために１以上の遺伝子を発現させるために修飾することができる。
ｂ．アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス
さらに本明細書では、それらの生活環に、核酸分子の、宿主細胞の核への侵入を含むウイルスも提供される。このような様々なウイルスが当技術分野で公知であり、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびオルソミクソウイルスが挙げられる。ヘルペスウイルスの例としては、１型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスが挙げられる。パポーバウイルスの例としては、ヒト乳頭腫ウイルスおよびＳＶ４０ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、レンチウイルスが挙げられる。オルソミクソウイルスの例としては、インフルエンザウイルスが挙げられる。パルボウイルスの例としては、アデノ随伴ウイルスが挙げられる。
また、本明細書では、野生型ウイルスに対して１以上の特徴を増強するための、上記で示したウイルスの修飾も提供される。このような特徴としては、限定されるものではないが、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させるための増大された能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せが挙げられる。いくつかの態様では、修飾ウイルスは、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化させる能力を有する。他の態様では、これらのウイルスは、画像化に使用できる遺伝子を含む、１以上の検出可能な遺伝子を発現するように修飾することができる。他の態様では、これらのウイルスは、その遺伝子産物を採取するため、かつ／またはその遺伝子産物に対する抗体を採取するために、１以上の遺伝子を発現させるために修飾することができる。
３．細菌
また、本明細書で提供される方法では細菌も使用できる。所望の特徴を有する様々な細菌のいずれもが使用できる。一態様では、好気性細菌が使用できる。別の態様では、嫌気性細菌が使用できる。別の態様では、細胞外細菌が使用できる。別の態様では、細胞内細菌が使用できる。
いくつかの態様では、本明細書で提供される細菌は細胞外細菌であってよい。様々な細胞外細菌が当技術分野で公知であり、ビブリオ菌、乳酸菌、連鎖球菌、大腸菌が挙げられる。細菌の例としては、コレラ菌、化膿連鎖球菌、および大腸菌が挙げられる。他の態様では、本明細書で提供される細菌は細胞内細菌であってよい。様々な細胞内細菌が当技術分野で公知であり、リステリア菌、サルモネラ菌、クロストリジウム菌、およびビフィドバクテリウム(bifodobacterium)が挙げられる。細胞内細菌の例としては、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifodobacterium longum)およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifodobacterium adolescentis)が挙げられる。さらなる細菌としては、クラビバクター・ミシガネンシス亜種ミシガネンシス(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)、アゾリゾビウム・カウリノダンス(Azorhizobium caulinodans)、キサントモナス・キャンペストリスｐｖ．ベシカトリア(Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria)、およびキサントモナス・キャンペストリスｐｖ．キャンペストリス(Xanthomonas campestris pv. campestris)などの植物細菌が挙げられる。
本明細書で提供される細菌のさらなる例としては磁性細菌がある。このような細菌は、鉄系造影剤の集積によって腫瘍の検出を可能とする。磁性細菌は淡水堆積物および海洋堆積物から単離することができる。磁性細菌は磁気粒子（Ｆｅ３０４）を産生できる(Blakemore, Annu. Rev. Microbiol. 36 (1982), 217−238)。そのため、磁性細菌は、不溶形態および可溶形態の双方の鉄を利用できる効率的な鉄取り込み系を有している。磁性細菌(Magnetospirillum magnetic)ＡＭＢ−１は、磁気粒子の生産を目的に単離および培養されたこのような磁性細菌の一例である(Yang et al., Enzyme Microb. Technol. 29 (2001), 13−19)。本明細書で示されるように、これらの磁性細菌（天然に存在するもの、または遺伝的に修飾されたもの）を静脈注射すると、腫瘍に選択的に集積し得る。よって、これらの細菌は腫瘍に鉄系造影剤を集積するために使用でき、これによりＭＲＩによる腫瘍検出が可能となる。同様に、他の天然源から単離された細菌の金属集積株も、腫瘍の標的化、造影剤からの金属の吸収、および腫瘍の画像化に使用できる。
また、本明細書では、野生型細菌に対して１以上の特徴を増強するための、細菌の修飾も提供される。このような特徴としては、限定されるものではないが、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させるための増大された能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せが挙げられる。いくつかの態様では、修飾細菌は、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化させる能力を有する。他の態様では、これらの細菌は、画像化に使用できる遺伝子を含む、１以上の検出可能な遺伝子を発現するように修飾することができる。他の態様では、これらの細菌は、その遺伝子産物を採取するため、かつ／またはその遺伝子産物に対する抗体を採取するために、１以上の遺伝子を発現させるために修飾することができる。
ａ．好気性細菌
従来の研究では、腫瘍への投与のためには嫌気性細菌が好ましいとの仮説が立てられていた(Lemmon et al., 1997 Gene Therapy 4:791−796)。本明細書で示されるように、好気性細菌は腫瘍で生存および増殖可能であることが決定づけられた。よって、本明細書で提供される方法で用いられる細菌は、酸素が供給される環境で生存および増殖可能な細菌を含み得る。いくつかの態様では、これらの細菌は生存および増殖するために酸素が供給される環境に存在しなければならない。様々な好気性細菌が当技術分野で公知であり、乳酸菌、サルモネラ菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ビブリオ菌、リステリア菌、および大腸菌が挙げられる。細菌の例としては、コレラ菌、リステリア菌、ネズミチフス菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・カセイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・パラカセイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・パランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・サリバリアス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・スポロゲネス(Lactobacillus sporogenes)、ラクトバチルス・ラクチス(Lactobacillus lactis)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)、スメグマ菌(Myobacterium smegmatis)、マイコバクテリア・バカエ(Mycobacterium vaccae)、マイコバクテリア・ミクロチ(Mycobacterium microti)、マイコバクテリア・ハバナ(Mycobacterium habana)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)が挙げられる。
ｂ．嫌気性細菌
本明細書で提供される方法で用いられる細菌は、生存および増殖のために酸素を必要としない細菌を含み得る。いくつかの態様では、これらの細菌は生存および増殖するために酸素がない環境に存在しなければならない。様々な好気性細菌が当技術分野で公知であり、クロストリジウム菌、ビフィドバクテリウムが挙げられる。細菌の例としては、ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ノービ菌(Clostridium novyi)、クロストリジウム・ソルデリー(Clostridium sordellii)、クロストリジウム・アブソナム(Clostridium absonum)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス(Clostridium bifermentans)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticus)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・インファチス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ラテロスポラム(Bifidobacterium laterosporus)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)、イスラエル放線菌(Actinomyces israelii)、ユーバクテリウム・レンタム(Eubacterium lentum)、ペプトストレプトコッカス・アンエアロビス(Peptostreptococcus anaerobis)、およびペプトコッカス・プレボッティー(Peptococcus prevotti)、およびアシドアミノコッカス・ファーメンタス(Acidaminococcus fermentans)が挙げられる。
４．真核細胞
本明細書で提供される微生物、ならびにそのような微生物を作製および使用する方法にはまた、霊長類などの哺乳類を含む多細胞真核生物に由来する細胞を含む真核細胞も包含され、細胞の例としては、ヒト細胞がある。一般に、これらの細胞は単離細胞である。例えば、真核細胞は、霊長類腫瘍細胞などの哺乳類腫瘍細胞を含む腫瘍細胞であってよく、霊長類腫瘍細胞の例としては、ヒト乳癌細胞などのヒト腫瘍細胞がある。別の例では、真核細胞はヒト繊維肉腫細胞などの繊維肉腫細胞を含み得る。ヒト繊維肉腫細胞の例としては、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１２１、ＣＲＬ−１２０１１またはＣＲＬ−１２０１２）が挙げられる。別の例では、真核細胞は霊長類幹細胞などの哺乳類幹細胞を含む幹細胞を含み、霊長類幹細胞の例としてはヒト幹細胞が挙げられる。
また、本明細書では、野生型細菌に対して１以上の特徴を増強するための、真核細胞の修飾も提供される。このような特徴としては、限定されるものではないが、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せが挙げられる。いくつかの態様では、修飾真核細胞は、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化させる能力を有する。他の態様では、これらの真核細胞は、画像化に使用できる遺伝子を含む、１以上の検出可能な遺伝子を発現するように修飾することができる。他の態様では、これらの真核細胞は、その遺伝子産物を採取するため、かつ／またはその遺伝子産物に対する抗体を採取するために、１以上の遺伝子を発現させるために修飾することができる。
Ｃ．修飾微生物の作出方法
本明細書で提供される微生物は、ウイルス、細菌および真核細胞などの微生物を修飾するための、当技術分野で周知の標準的方法により形成することができる。要するに、これらの方法は微生物に１以上の遺伝的修飾を導入した後、その修飾を反映した特性に関して、または目的とする他の特性に関してそれらの微生物をスクリーニングすることを含む。
１．遺伝的修飾
分子生物学の標準的技術を用いて、本明細書で提供される修飾微生物を作製することができる。このような技術としては、種々の核酸操作技術、核酸導入プロトコール、核酸増幅プロトコール、および当技術分野で公知の他の分子生物学が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的突然変異誘発を用いて、突然変異を目的の遺伝子に導入することができる。あるいは、相同組換えを用いて目的の標的配列に突然変異または外因性配列を導入することもできる。核酸導入プロトコールとしては、塩化カルシウム形質転換／トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介核酸導入、Ｎ−［１−（２，３−ジオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート媒介形質転換、およびその他が挙げられる。別の突然変異誘発プロトコールでは、特定の遺伝子における点突然変異は、正の選択圧を使用するために選択することもできる。例えば、Current Techniques in Molecular Biology(Ed. Ausubel, et al.)参照。核酸増幅プロトコールとしては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。当技術分野では、多様なウイルスおよび細胞性生物に関して、プラスミド、ベクター、プロモーターおよびその他の調節配列などの核酸ツールの使用が周知である。さらに多様な核酸ツールが、ＡＴＣＣおよび種々の商業ソースを含む多くの異なる供給源から入手可能である。当業者ならば、技術および設計の選択に関する知識に従い、特定のウイルスまたは細胞性生物の遺伝的修飾に適当なツールおよび方法を容易に選択することができる。
様々な修飾はいずれも、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的方法を用いて容易に達成することができる。これらの修飾は一般に、微生物ゲノムの１以上の末端切断、欠失、突然変異または挿入である。一態様では、この修飾は特定の配列に特異的に向けることができる。これらの修飾は、限定されるものではないが、調節配列、遺伝子コード配列、または既知の役割を持たない配列を含む、微生物ゲノムの様々な領域のいずれかに向けることもできる。修飾に利用できる微生物ゲノムの様々な領域はいずれも、本明細書に具体的に挙げられている微生物を含む、多くの微生物に関して当技術分野で容易に分かる。限定されない例として、本明細書の他所で示されている様々なワクシニア遺伝子の遺伝子座は、本明細書で提供される微生物に関して標的化可能な異なる領域の数を例示している。別の態様では、この修飾は完全に、または部分的にランダムであってよく、従って、いずれの特定の修飾微生物の選択も、その修飾微生物の目的の特性に応じて決定することができる。
いくつかの態様では、この微生物は外因性遺伝子を発現するように修飾することができる。外因性遺伝子産物の例としては、タンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。これらの修飾微生物は検出可能な遺伝子産物、治療遺伝子産物、製造または採取のための遺伝子産物、抗体採取のための抗原性遺伝子産物が挙げられる。このような遺伝子産物の特徴は本明細書の他所に記載されている。外因性遺伝子を発現するよう生物を修飾するいくつかの態様では、その修飾はまた、外因性遺伝子の発現を調節するための１以上の調節配列も含み得る。当技術分野で公知のように、調節配列は外因性遺伝子の構成的発現が可能なものであっても、あるいは、外因性遺伝子の誘導的発現が可能なものであってもよい。さらに、この調節配列は外因性遺伝子の発現レベルの制御が可能なものであってもよい。いくつかの例では、誘導的発現は、腫瘍細胞に存在するか、または微生物に感染した腫瘍細胞に存在する細胞性因子またはその他の因子の制御下に置くことができる。他の例では、誘導的発現は、ＩＰＴＧ、ＲＵ４８６またはその他の公知の誘導化合物を含む投与可能な物質の制御下に置くことができる。様々な調節配列はいずれも、既知の因子および設計の適性に従って当業者に利用可能である。遺伝子産物の製造および採取などのいくつかの態様では、この調節配列は高レベルの構成的遺伝子発現をもたらすことができる。抗（遺伝子産物）抗体の採取などのいくつかの態様では、この調節配列は低レベルの構成的遺伝子発現をもたらすことができる。腫瘍治療の態様では、治療タンパク質を誘導プロモーターまたは外的誘導プロモーターの制御下に置くことができる。
他の態様では、器官または組織特異的発現が調節配列により制御可能である。標的器官、例えば、処置する腫瘍のみでの発現を達成するために、外来ヌクレオチド配列を組織特異的プロモーターと連結し、遺伝子療法に使用することができる。このようなプロモーターは当業者に周知のものである（例えば、Zimmermann et al., (1994) Neuron 12, 11−24; Vidal et al.; (1990) EMBO J. 9, 833−840; Mayford et al., (1995), Cell 81, 891−904; Pinkert et al., (1987) Genes ＆ Dev. 1, 268−76参照）。
いくつかの態様では、これらの微生物を２以上のタンパク質を発現するように修飾することができ、この場合、その２以上のタンパク質の組合せはいずれも、１以上の検出可能な遺伝子産物、治療遺伝子産物、製造もしくは採取のための遺伝子産物、または抗体採取のための抗原性遺伝子産物であり得る。一態様では、微生物は検出可能なタンパク質および治療タンパク質を発現するように修飾することができる。別の態様では、微生物は検出のための２以上の遺伝子産物または２以上の治療遺伝子産物を発現するように修飾することができる。例えば、ルシフェラーゼ基質の生合成に関与する１以上のタンパク質をルシフェラーゼとともに発現させることができる。２以上の外因性遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を同じかまたは異なる調節配列下で調節することができ、これらの遺伝子を単一または複数の遺伝子操作ステップで、その微生物ゲノムの同じかまたは異なる領域に挿入することができる。いくつかの態様では、検出可能な遺伝子産物をコードする遺伝子などの１つの遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くことができ、一方、治療遺伝子産物をコードする遺伝子などの第二の遺伝子を誘導プロモーターの制御下に置くことができる。２以上の遺伝子を微生物に挿入する方法は当技術分野で公知であり、多様な外因性遺伝子、調節配列、および／またはその他の核酸配列を用い、多様な微生物に対して、容易に行うことができる。
微生物修飾法を実施する一例では、ワクシニアウイルスＬＩＶＰ株を、ウイルスゲノムの３つの異なる位置に外因性ＤＮＡの挿入を含むように修飾した。当技術分野で公知の一般法を用い、既知の分子生物学ツール、および当技術分野で知られているかまたは本明細書で開示されている配列を、Ｆ３遺伝子、ＴＫ遺伝子および／またはＨＡ遺伝子に挿入を含むウイルスを含む修飾ワクシニアウイルス株を作出ために用いることができる。例えば、Mikryukov, et al., Biotekhnologya 4 (1998), 442−449; Goebel et al., Virology 179 (1990), 247−266; Antoine et al., Virology 244 (1998), 365−396; Mayr et al., Zentbl. Bakteriol. Hyg. Abt 1 Orig. B 167 (1978), 375−390; Ando and Matumoto, Jpn. J. Microbial. 14 (1979), 181−186; Sugimoto et al., Microbial. Immuol. 29 (1985), 421−428; Takahashi−Nishimaki et al., J. Gen. Virol. 68 (1987), 2705−2710参照。これらの方法としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor NY (1989)および本明細書に開示されている実施例に記載されているように、インビトロ組換え技術、合成法およびインビボ組換え法が含まれる。当業者ならば、例えば配列番号１または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０もしくは３２のＦ３遺伝子、またはその断片を、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用い、いずれかのワクシニア株からＦ３の遺伝子産物（または関連の遺伝子産物）をコードする遺伝子を単離することができる。
組換え微生物を産生する方法は当技術分野で公知である。本明細書で例示のために組換えワクシニアウイルスの作出方法が提供されている。Ｆ３遺伝子に挿入を有する組換えワクシニアウイルスは以下のステップ：（ａ）（ｉ）制限部位Ｘに挿入された修飾Ｆ３遺伝子を含むワクシニアシャトルプラスミド、および（ｉｉ）制限部位Ｘにおいて消化された脱リン酸化ｗｔ ＶＶ（ＶＧＬ）ＤＮＡを作製すること；（ｂ）ＰＵＶ不活性化ヘルパーＶＶ（ＶＧＬ）に感染した宿主細胞を、ステップａの（ｉ）および（ｉｉ）の構築物の混合物でトランスフェクトすること；および（ｃ）それらの形質転換体から組換えワクシニアウイルスを単離することにより作製することができる。当業者ならば、例えば実施例１の示されている説明および図１の凡例に従ってこのような方法をいかに実施するかが分かる；Timiryasova et al., Biotechniques 31 (2001), 534-540も参照。一態様では、制限部位Ｘはユニークな制限部位である。様々な好適な宿主細胞も当業者に公知であり、ニワトリ胚、ウサギ、ハムスターおよびサル腎細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＲＫ１３、ＣＶ−１、Ｖｅｒｏ、ＢＳＣ４０およびＢＳＣ−１サル腎細胞を含む、ワクシニアウイルス感染に感受性のある多数の哺乳類、鳥類および昆虫細胞および組織が挙げられる。
２．上記特徴に関するスクリーニング
修飾微生物は、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる増強された能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せなどの本明細書に記載の特徴を含む、いずれの所望の特徴に関してもスクリーニングすることができる。例えば、これらの修飾微生物は、腫瘍細胞を激しく死滅させることなく、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力に関してスクリーニングすることができる。別の例では、これらの微生物は、画像化に使用できる遺伝子を含む、検出可能な１以上の遺伝子の発現に関して、あるいは、遺伝子産物の製造もしくは採取のため、かつ／またはその遺伝子産物に対する抗体の採取のための１以上の遺伝子の発現に関してスクリーニングすることができる。
本明細書に示した実施例で実証されるように、このような特徴に関するスクリーニングのための様々な既知の方法のいずれもが実施可能である。所望の特徴に関するスクリーニングのための方法の一例としては、限定されるものではないが、細胞培養またはその他のインビトロ媒体での増殖、複製および／または遺伝子発現（外因性遺伝子の発現を含む）のモニタリングが挙げられる。細胞培養はいずれの生物、いずれの組織源に由来するものでもよく、腫瘍組織を含み得る。所望の特徴に関してスクリーニングする他の方法例としては、限定されるものではないが、マウス、サルまたは類人猿などの非ヒト動物を含み、所望によりヒトも含む動物に微生物を投与すること、およびその微生物、その腫瘍および／またはその動物をモニタリングすることを含み、モニタリングは、その微生物および／またはその腫瘍のインビボ画像化（例えば、微生物の遺伝子発現の低照度画像化または超音波腫瘍画像化）、その腫瘍の外部モニタリング（例えば、腫瘍の大きさの外部測定）、その動物のモニタリング（例えば、動物の体重、血小板、抗体力価、脾臓の大きさ、または肝臓の大きさのモニタリング）によって行うことができる。所望の特徴に関してスクリーニングする他の方法例としては、限定されるものではないが、器官または腫瘍においてその微生物の存在および／またはその微生物による遺伝子発現を決定するための腫瘍を含む様々な器官の採取、脾臓または肝臓など、免疫応答または微生物のクリアランスに関連する器官の採取、腫瘍の大きさおよび腫瘍細胞の活力を決定するための腫瘍の採取、抗体または抗体産生細胞の採取といった方法を含む、その微生物の作用および位置ならびにその微生物による発現のための非ヒト動物の採取が挙げられる。このようなスクリーニング法およびモニタリング法は、当技術分野で公知のように、様々な組合せのいずれで使用してもよい。一態様では、微生物を、その微生物を非ヒト動物またはヒトなどの動物に投与した後、インビボ画像化によりモニタリングすることによりスクリーニングすることができる。別の態様では、微生物を、その微生物を非ヒト動物などの動物に投与し、インビボ画像化によりモニタリングし、その後、その動物を採取することによりスクリーニングすることができる。よって、本明細書では、微生物を、腫瘍を有する動物などの動物に投与すること、およびその動物、その動物の腫瘍（存在する場合）および／または微生物を１以上の特徴に関してモニタリングすることにより、微生物を所望の特徴に関してスクリーニングするための方法が提供される。また、本明細書では、微生物を、腫瘍を有する非ヒト動物などの非ヒト動物に投与すること、その動物を採取すること、およびその動物の器官、抗体力価、および／または腫瘍（存在する場合）を１以上の特徴に関してアッセイすることにより、微生物を所望の特徴に関してスクリーニングするための方法も提供される。
本明細書では、微生物を減弱された病原性または軽減された毒性に関してスクリーニングするための方法が提供され、この場合、その病原性または毒性は、限定されるものではないが、被験体の健康状態の評価、被験体の体重測定、被験体の血液または尿分析、および被験体内の微生物の組織分布のモニタリングを含む様々な技術により決定することができ、このような技術はインビボにおいて生きた被験体で行うこともできるし、あるいは死後に行うこともできる。また方法は、インビボまたはインビトロで決定することができる、微生物の細胞を溶解する能力または細胞死を誘導する能力も含み得る。
被験体が閾値体重を下回ったとき、その微生物はその被験体に対して病原性があるとみなすことができる。閾値の例としては、参照に対して体重の約５％以上の低下、約１０％以上の低下、または約１５％以上の低下が挙げられる。体重参照は当技術分野で用いられている様々な参照のいずれかから選択してもよく、例えば、体重参照はその試験被験体と同じ条件を有する対照被験体（例えば、正常なもの、または腫瘍を注入したもの）であってもよく、この場合、対照の体重の変化を、微生物投与後の一定期間の被験体の体重の変化と比較する。
被験体の血液または尿の分析は、免疫応答のレベル、被験体における毒素のレベル、または腎臓、膵臓、肝臓および脾臓などの被験体の細胞、組織または器官のその他のレベルを示し得る。設定された閾値レベルを上回ったレベルは、その被験体に対するその微生物の病原性を示し得る。微生物の病原性を示すための血液または尿の成分の閾値レベルは当技術分野で周知であり、本明細書では、このような閾値はいずれも、その微生物の病原性または毒性の所望の耐性により選択することができる。
被験体における微生物の組織分布は、その微生物の病原性または毒性を示し得る。一態様では、病原体または毒性のない微生物の組織分布は、他の組織または器官に対して大部分腫瘍に存在し得る。大部分腫瘍に存在する微生物は、例えば、その微生物が他のいずれの特定の器官または組織に集積するよりも少なくとも約２倍高く、少なくとも約５倍高く、少なくとも約１０倍高く、少なくとも約１００倍高く、少なくとも約１，０００倍高く、少なくとも約１０，０００倍高く、少なくとも約１００，０００倍高く、または少なくとも約１，０００，０００倍高く集積し得る。
本明細書では、微生物を組織分布または集積に関してスクリーニングするための方法が提供され、そこでは、その組織分布が、限定されるものではないが、非ヒト被験体の採取、被験体における検出可能な遺伝子産物のインビボ画像化を含む様々な技術により決定され得る。採取は非ヒト被験体を安楽死させること、および腫瘍における微生物の集積、また所望により１以上のさらなる組織または器官における集積を決定することにより行うことができる。集積は、限定されるものではないが、検出可能な遺伝子産物（例えば、ｇｆｐまたはβガラクトシダーゼ）などの遺伝子産物の検出、組織、器官または腫瘍サンプルの組織学的または顕微鏡的評価、あるいは組織、器官または腫瘍サンプルに存在するプラークまたはコロニー形成単位の数の測定を含む様々な方法のいずれかによって決定され得る。一態様では、微生物の所望の量の組織分布が他の組織または器官に対して大部分腫瘍に存在し得る。大部分腫瘍に存在する微生物は、例えば、その微生物が他のいずれの特定の器官または組織に集積するよりも少なくとも約２倍高く、少なくとも約５倍高く、少なくとも約１０倍高く、少なくとも約１００倍高く、少なくとも約１，０００倍高く、少なくとも約１０，０００倍高く、少なくとも約１００，０００倍高く、または少なくとも約１，０００，０００倍高く集積し得る。
また、本明細書では、免疫応答を惹起し得る微生物をスクリーニングする方法が提供され、その免疫応答は腫瘍細胞に対するものであっても、または微生物に対するものであってもよい。免疫応答を惹起する能力を測定するための様々な方法が当技術分野で公知であり、被験体における免疫活性の全体的な増強の測定、被験体における抗微生物または抗腫瘍抗体の増加の測定、微生物で処置した（一般には非ヒト）被験体の、その後の感染／腫瘍形成を予防するか、または微生物もしくは腫瘍細胞を迅速に排除する能力の試験を含む。また方法は、インビボまたはインビトロで決定することができる、微生物の細胞を溶解する能力または細胞死を誘導する能力も含み得る。
また、本明細書では、微生物の複製速度をモニタリングすることによる、複製能の増強または低下を決定するための方法も提供される。このような測定はインビボでもインビトロでも行うことができる。例えば、細胞培養における複製の速度を用いて微生物の複製能を決定することができる。別の態様では、被験体の組織、器官または腫瘍における複製能を用いて複製能を測定することができる。いくつかの態様では、非腫瘍組織および器官における複製能の低下がスクリーニングにおいて選択すべき特徴となり得る。他の態様では、腫瘍における複製能の増強がスクリーニングにおいて選択すべき特徴となり得る。
また、本明細書では、外因性遺伝子などの微生物の遺伝子発現能を決定する方法も提供される。このような方法はインビボでもインビトロでも行うことができる。例えば、これらの微生物は、その微生物の生存を可能とするか、またはその微生物に、Ｘ−ｇａｌが青色を呈するなど、検出可能なシグナルを付与させる、遺伝子を発現する能力に関して選択プレート上でスクリーニングされ得る。また、このような方法はインビボでも行うことができ、この場合、発現は、例えば、組織、器官、腫瘍、または非ヒト被験体の採取によるか、または被験体のインビボ画像化により決定することができる。
また、本明細書では、それに対して被験体が抗体を発達させ得る外因性遺伝子を含む、それに対して被験体が抗体を発達させ得る遺伝子を発現する微生物の能力を決定する方法も提供される。このような方法は、様々な非ヒト被験体のいずれかを用い、インビボで行うことができる。例えば、遺伝子発現は、微生物が投与された非ヒト被験体を放血させ、その微生物により発現された遺伝子に対する抗体の存在に関してその血液（または血清）をアッセイすることによるか、またはプロダクションブリードおよびターミナルブリードなどのポリクローナル抗体の採取に通常用いられる他のいずれかの方法により決定することができる。
また、本明細書では、減弱された病原性、軽減された毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる増強された能力、増強された免疫原性、増強または低下された複製能、外因性タンパク質を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む、本明細書で示される２以上の特徴を有する微生物をスクリーニングするための方法が提供される。インビボ画像化など、単一のモニタリング技術を２以上の特徴を確認するために用いることもでき、あるいは、選択された特徴に従って、また、用いるモニタリング技術に従って当業者が決定できるような様々な異なるモニタリング技術を使用することもできる。
Ｄ．治療方法
本明細書では、癌細胞、腫瘍および転移を含む免疫特権細胞または組織を処置または予防する方法を含む治療方法が提供される。本明細書で提供される方法は、微生物を腫瘍および／または転移を含む被験体に投与することを含む。本明細書で提供される方法は、その微生物が腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍の大きさを減じる必要はない。その代わりに、本明細書で提供される方法は、被験体において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強し得る微生物を被験体に投与することを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供される微生物は、被験体において微生物により誘導される疾病を引き起こすことなく被験体に投与することができる。いくつかの態様では、これらの微生物は腫瘍または転移に集積し得る。いくつかの態様では、これらの微生物は被験体において抗腫瘍免疫応答を惹起することができ、この場合、微生物が引き起こす抗腫瘍免疫応答は一般に、微生物が引き起こす腫瘍細胞死がほとんどない、または全くない結果として、この微生物を媒介とする抗腫瘍免疫応答は何日間か、例えば１週間以上、１０日以上、２週間以上、または１ヶ月以上といった間にわたって発達し得る。いくつかの例示的方法では、この微生物は腫瘍に存在でき、微生物がそれ自体、腫瘍の増殖を抑えるに十分な腫瘍細胞死を誘導することなく、抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。
いくつかの態様において、本明細書では、被験体において選択された抗原または選択された抗原種に対して抗体産生を惹起または増強するための方法が提供され、これらの方法は、腫瘍および／または転移に集積することができ、かつ腫瘍からの選択された抗原または選択された抗原種の放出を誘導することができ、その結果、その選択された抗原または選択された抗原種に対して抗体の産生が起こり得る微生物を被験体に投与することを含む。投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性遺伝子を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む１以上の特徴を有し得る。
本明細書で提供される方法では、微生物により発現される外因性遺伝子産物などの選択された抗原、または腫瘍の微生物感染の結果として腫瘍から放出される（例えば、溶解、アポトーシス、分泌、または腫瘍からの抗原放出を引き起こすその他の機構による）１以上の腫瘍抗原などの選択された抗原種を含む、様々な抗原のいずれもが標的化可能である。少なくともいくつかの態様では、選択された抗原または選択された抗原種の放出を何日間か、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１０日、少なくとも２週間または少なくとも１ヶ月の間維持することが望ましい。
また、本明細書では、被験体内で持続的な抗原放出を提供するための方法が提供され、これらの方法は、腫瘍および／または転移に集積することができ、かつ持続的な抗原放出を誘導し、その結果、その抗原に対する抗体産生が起こり得る微生物を被験体に投与することを含む。この持続的な抗原放出は何日間か、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１０日、少なくとも２週間または少なくとも１ヶ月間持続し得る。投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性遺伝子を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む１以上の特徴を有し得る。この持続的な抗原放出は微生物に感染した宿主による免疫応答を生じさせることができ、その宿主はその抗原に対する抗体を発達させることができ、かつ／またはその宿主は、腫瘍細胞に対する免疫応答を含む、その抗原を発現する細胞に対する免疫応答を具備することができる。よって、この持続的な抗原放出は、腫瘍細胞に対する免疫を生じさせることができる。いくつかの態様では、この微生物を媒介とする持続的な抗原放出により誘導される、腫瘍細胞に対する免疫応答は全ての腫瘍細胞の完全な除去または死滅をもたらし得る。
また、本明細書では、被験体において腫瘍増殖を阻害するための方法が提供され、これらの方法は、腫瘍および／または転移に集積することができ、抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる微生物を被験体に投与することを含む。腫瘍または転移に集積された微生物の結果として誘導される抗腫瘍免疫応答は、腫瘍増殖の阻害をもたらし得る。投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性遺伝子を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む１以上の特徴を有し得る。
また、本明細書では、被験体において転移の増殖または形成を阻害するための方法が提供され、これらの方法は、腫瘍および／または転移に集積することができ、抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる微生物を被験体に投与することを含む。腫瘍または転移に集積された微生物の結果として誘導される抗腫瘍免疫応答は、転移の増殖または形成の阻害をもたらし得る。投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性遺伝子を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む１以上の特徴を有し得る。
また、本明細書では、被験体において腫瘍および／または転移の大きさを減じるための方法が提供され、これらの方法は、腫瘍および／または転移に集積することができ、かつ抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる微生物を被験体に投与することを含む。腫瘍または転移に集積された微生物の結果として誘導される抗腫瘍免疫応答は、腫瘍および／または転移の大きさの縮小をもたらし得る。投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性遺伝子を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む１以上の特徴を有し得る。
また、本明細書では、被験体から腫瘍および／または転移を排除するための方法が提供され、これらの方法は、腫瘍および／または転移に集積することができ、かつ抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる微生物を被験体に投与することを含む。腫瘍または転移に集積された微生物の結果として誘導される抗腫瘍免疫応答は被験体からの腫瘍および／または転移の排除をもたらし得る。投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性遺伝子を発現する能力、および微生物で発現された遺伝子産物に対して抗体産生を惹起する能力を含む１以上の特徴を有し得る。
腫瘍増殖を低下させるまたは阻害する方法、転移の増殖および／または形成を阻害する方法、腫瘍または転移の大きさを減じる方法、腫瘍または転移を排除する方法、または本明細書で提供されるその他の腫瘍治療法は、宿主において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することを含む。本質的に抗腫瘍的である、この宿主の免疫応答は、微生物が集積した腫瘍および／または転移に対して具備され得、また、微生物が被験体に投与された後に形成する腫瘍および／または転移を含む、微生物が集積しなかった腫瘍および／または転移に対しても具備され得る。よって、その増殖または形成が阻害されるか、その大きさが減じられるか、または排除される腫瘍および／または転移は、微生物が集積した腫瘍および／または転移であり得るか、または、微生物が集積しなかった腫瘍および／または転移でもあり得る。よって、本明細書では、腫瘍増殖を低下させるまたは阻害する方法、転移の増殖および／または形成を阻害する方法、腫瘍または転移の大きさを減じる方法、腫瘍または転移を排除する方法、またはその他の腫瘍治療法が提供され、これらの方法は被験体に微生物を投与することを含み、そこでその微生物は少なくとも１つの腫瘍または転移に集積し、被験体において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強し、かつ、その免疫応答はまた、微生物細胞が集積しなかった腫瘍および／または転移に対しても具備される。別の態様では、新生物性疾患の再発を阻害もしくは予防する、または新たな腫瘍増殖を阻害もしくは予防するための方法が提供され、これらの方法は腫瘍および／または転移に集積することができ、抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる微生物を被験体に投与することを含み、この抗腫瘍免疫応答は新生物性疾患の再発を阻害もしくは予防すること、または新たな腫瘍増殖を阻害もしくは予防することができる。
腫瘍増殖を低下させるまたは阻害する方法、転移の増殖および／または形成を阻害する方法、腫瘍または転移の大きさを減じる方法、腫瘍または転移を排除する方法、またはその他の腫瘍治療法などの本明細書で提供される腫瘍または新生物性疾患治療法はまた、腫瘍細胞溶解または腫瘍細胞死を誘導し得る微生物を被験体に投与することを含み得る。このような微生物は、被験体において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強し得る微生物と同じ微生物であり得る。本明細書で提供される微生物のような微生物は、内因性遺伝子の発現の結果としてかまたは外因性遺伝子の結果として、細胞溶解または腫瘍細胞死を誘導することができる。内因性遺伝子または外因性遺伝子は、溶解チャネルの形成またはアポトーシス経路の活性化を含む、当技術分野で知られているような直接的作用または間接的作用の結果として腫瘍細胞溶解を誘導するか、細胞増殖を阻害することができる。外因性遺伝子産物などの遺伝子産物は、プロドラッグを活性型の細胞傷害形態へと活性化し、このような遺伝子が発現されるところで細胞死をもたらす働きをし得る。
このような抗原産生または腫瘍および／または転移の処置の方法は、遺伝子療法、癌遺伝子療法、またはワクチン療法などの治療を目的とする、本明細書に記載されている修飾微生物、またはＦ３遺伝子、ＴＫ遺伝子および／またはＨＡ遺伝子の修飾を含む本明細書で提供されるワクシニアウイルスと同等の機能を持つ修飾を有する微生物の投与を含み得る。このような微生物を用いて、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を刺激し、このような応答から利益を受け得る被験体において強い細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。例えば、この微生物は、免疫反応性抗原(Earl et al. (1986), Science 234, 728−831; Lathe et al. (1987), Nature (London) 326, 878−880)、細胞腫瘍関連抗原(Bernards et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6854−6858; Estin et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1052−1056; Kantor et al. (1992), J. Natl. Cancer Inst. 84, 1084−1091; Roth et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4781−4786)および／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）、共刺激分子（Ｂ７−１、Ｂ７−２）(Rao et al. (1996), J. Immunol. 156, 3357−3365; Chamberlain et al. (1996), Cancer Res. 56, 2832−2836; Oertli et al. (1996), J. Gen. Virol. 77, 3121−3125; Qin and Chatterjee (1996), Human Gene Ther. 7, 1853−1860; McAneny et al. (1996), Ann. Surg. Oncol.3, 495−500)、またはその他の治療タンパク質を発現する微生物を用いて腫瘍または病変部から細胞を排除することにより、その微生物に感染した腫瘍またはその他の感染性疾患に対する予防効果および治療効果をもたらすことができる。
本明細書で提供されるものとしては、固形腫瘍はワクシニアウイルスなどの微生物で処理して、著しい腫瘍特異的微生物複製もたらすことができ、これにより腫瘍において腫瘍タンパク質抗原およびウイルスタンパク質の産生に至り得る。本明細書で示されるように、マウスへのワクシニアウイルス投与は感染した腫瘍細胞の溶解、およびその結果としての腫瘍細胞特異的抗原の放出をもたらした。これらの抗原が体内に継続的に漏出することで、マウスにおいて、腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質、およびウイルスにコードされている操作タンパク質に対する、極めて高レベルの抗体力価が（およそ７〜１４日で）もたらされた。新たに合成された抗腫瘍抗体および増強されたマクロファージ、好中球総数は血管を通じて腫瘍へ継続的に送達され、それにより腫瘍に対して活性化された免疫系の動員がもたらされた。この活性化された免疫系は次に、ウイルス粒子を含む腫瘍の外来化合物を排除した。このことは、外来抗原で追加免疫した抗体産生物の放出および腫瘍タンパク質に対する抗体の持続的応答と、ワクシニアウイルス感染および複製により誘導された自己免疫ワクチン療法系、その後の細胞溶解、タンパク質の漏出および抗体産生の増強のような機能とを相互に連関させた。よって、本方法は、特権ウイルス、細菌、および哺乳類細胞の増殖の部位として免疫特権腫瘍部位を有する全ての腫瘍系に適用でき、宿主固有の免疫系によって腫瘍を排除に至らせることができる完全なプロセスを提供することができる。
他の態様では、被験体を免疫化する方法が提供され、これらの方法は、その抗原に対して被験体が免疫応答を発達させる１以上の抗原を発現する微生物を被験体に投与することを含む。これらの免疫抗原は、天然痘に対する免疫に用いられるワクシニアウイルスのワクシニア抗原など、その微生物に内在するものであってよい。あるいは、この免疫抗原は、ウイルスキャプシドまたは細菌細胞表面で発現するインフルエンザまたはＨＩＶ抗原など、その微生物により発現される外因性抗原であってもよい。よって、修飾ワクシニアウイルスをはじめ本明細書で提供される微生物はワクチンとして使用可能である。
１．投与
本明細書で提供される方法を実施する場合、微生物を、腫瘍を有するかまたは新生細胞を有する被験体、または免疫化された被験体を含む被験体に投与すればよい。投与する微生物は本明細書で提供される微生物、または被験体への投与に関して既知のその他の微生物、例えば、ワクチン療法に用いられることが知られているいずれかの微生物のような抗原微生物を含む、被験体への治療的投与に関して知られているいずれの既知微生物であってもよい。いくつかの態様では、投与される微生物は、減弱された病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、高い免疫原性、複製能、および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにそれらの組合せといった特徴を含む微生物である。
ａ．微生物投与前のステップ
いくつかの態様では、微生物を被験体に投与する前に１以上のステップを行うことができる。限定されるものではないが、微生物の投与に適当な症状を有するかどうか被験体を診断すること、被験体の免疫応答性の測定、被験体の免疫化、化学療法薬での被験体の処置、放射線での被験体の処置、または被験体の外科的処置を含む様々な先行ステップのいずれを行ってもよい。
微生物を治療目的で担癌被験体に投与することを含む態様では、被験体は一般に、新生物性の症状を有することが事前に診断されている。診断方法はまた、新生物性症状の種類の決定、新生物性症状のステージの決定、被験体おける１以上の腫瘍の大きさの決定、被験体のリンパ節における転移細胞または新生細胞の有無の決定、または被験体の転移の存在の決定を含み得る。微生物を被験体に投与する治療法の態様のいくつかは、原発腫瘍の大きさまたは新生物性疾患のステージを決定するステップを含んでよく、原発腫瘍の大きさが閾値体積以上であるか、または新生物性疾患のステージが閾値ステージ以上であれば、その被験体に微生物が投与される。類似の態様では、原発腫瘍の大きさが閾値体積よりも小さいか、または新生物性疾患のステージが閾値ステージ以下であれば、その被験体には微生物はまだ投与せず、このような方法では腫瘍の大きさまたは新生物性疾患のステージが閾値量に達するまでその被験体をモニタリングし、その後、被験体に微生物を投与することを含み得る。閾値の大きさは、腫瘍の増殖速度、その微生物の腫瘍に感染する能力、およびその被験体の免疫応答性を含むいくつかの因子によって異なり得る。一般に、閾値の大きさは、その微生物が宿主の免疫系によって完全には除去されずに腫瘍または腫瘍近傍に集積し、かつ複製するのに十分な大きさであり、一般にはまた、宿主がそれらの腫瘍細胞に対して免疫応答を具備するに十分な期間、一般には約１週間以上、約１０日以上、または約２週間以上、微生物感染を持続するに十分な大きさでもある。ワクシニアウイルスなどのウイルスに関する閾値腫瘍サイズの例としては、少なくとも約１００ｍｍ３、少なくとも約２００ｍｍ３、少なくとも約３００ｍｍ３、少なくとも約４００ｍｍ３、少なくとも約５００ｍＭ３、少なくとも約７５０ｍＭ３、少なくとも約１０００ｍＭ３、または少なくとも約１５００ｍＭ３である。閾値新生物性疾患ステージもまた、特定の新生物性疾患のステージ決定に必要な特異的な要件、新生物性疾患の増殖攻撃性、その微生物の腫瘍または転移に感染する能力、およびその被験体の免疫応答性を含むいくつかの因子によって異なり得る。一般に、閾値ステージは、その微生物が宿主の免疫系によって完全には除去されずに腫瘍または転移に集積し、かつ複製するのに十分なステージであり、一般にはまた、宿主がそれらの新生細胞に対して免疫応答を具備するに十分な期間、一般には約１週間以上、約１０日以上、または約２週間以上微生物感染を持続するに十分な大きさでもある。閾値ステージの例は、最低ステージ（例えば、ステージＩまたはそれに相当するもの）を超えるいずれのステージであってもよいし、または原発腫瘍が閾値サイズよりも大きいいずれのステージであってもよいし、または転移細胞が検出されるいずれのステージであってもよい。
他の態様では、被験体に微生物を投与する前に、被験体の免疫応答性を決定することができる。本明細書で提供される被験体に微生物を投与する方法は、被験体において免疫応答を誘導または増強することを含み得る。よって、被験体に微生物を投与する前に、被験体の免疫応答を具備する能力を決定することができる。本明細書で提供される方法において、当技術分野で公知の様々な免疫応答性試験のいずれを行ってもよい。免疫応答性試験の例としては、ＡＢＯ血球凝集力価（ＩｇＭ）、白血球接着不全（ＬＡＤ）、顆粒球機能（ＮＢＴ）、Ｔ細胞およびＢ細胞量、破傷風抗体力価、唾液ＩｇＡ、皮膚試験、扁桃試験、補体Ｃ３レベル、および因子Ｂレベル、およびリンパ総数を調べるものが挙げられる。当業者ならば、被験体の免疫応答性のレベルに応じ、微生物の免疫原性に応じ、そして所望により処置する新生物性疾患の免疫原性に応じて、被験体に微生物を投与するのが望ましいかどうかを決定することができる。一般に、当業者が、被験体がその微生物に対して免疫応答を具備する十分な能力があると判断できるならば、その被験体は免疫応答性があるとみなすことができる。
いくつかの態様では、被験体は本明細書で提供される方法に従って微生物を被験体に投与する前に免疫化され得る。免疫化は被験体の微生物に対して免疫応答を具備する能力を高める、または被験体が微生物に対して免疫応答を具備できる速度を高めるのに役立ち得る。免疫化はまた、被験体に対して微生物の病原性の危険性を引き下げるのに役立ち得る。いくつかの態様では、この免疫化は投与する治療微生物と類似の免疫微生物を用いて行うことができる。例えば、この免疫微生物は治療微生物の複製不能変異体であり得る。他の態様では、この免疫材料は投与する治療微生物の消化物であり得る。既知の微生物に対して被験体を免疫化するための様々な方法はいずれも当技術分野で公知であり、本明細書で使用可能である。一例では、例えば、１μｇのプソラレンと３６５ｎｍの紫外線４分間で処理したワクシニアウイルスが複製不能となり得る。別の態様では、この微生物は、例えば小児ワクチン療法など、過去にそれに対して被験体が免疫化された微生物と同じかまたは類似のものを選択することができる。
別の態様では、この被験体は、腫瘍および／または転移の化学療法、放射線療法または外科的除去などの癌処置の事前ステップなく、微生物を投与したものであり得る。本明細書で提供される方法は、微生物の腫瘍に侵入するかまたは腫瘍近傍に局在する能力を利用するのであるが、これらの腫瘍細胞は被験体の免疫系から保護され、これらの微生物はその後このような免疫保護領域において増殖でき、また、腫瘍から、被験体の免疫系が腫瘍抗原を認識し、かつ免疫応答を具備できる場所へと腫瘍抗原を放出、一般には持続的に放出させることができる。このような方法では、十分な大きさの腫瘍または十分に発達した免疫保護状態の存在が腫瘍に対する微生物の投与の成功に、また、十分な腫瘍抗原産生に有利であり得る。腫瘍が外科的に除去されるならば、これらの微生物は、他の新生細胞（例えば、小転移）には局在することができないときがあり、それはこのような細胞が、これらの微生物が生存および増殖できるような免疫保護環境を作り出すに十分にまだ成熟を受けてない可能性があるか、またはそれらの微生物が、新生細胞に局在できるとしても、細胞の数または塊の大きさがそれらの微生物が腫瘍抗原を持続的に放出させて宿主に抗腫瘍免疫応答を具備させるには小さすぎる可能性があるからである。よって、例えば、本明細書では、原発腫瘍を除去しない腫瘍または新生物性疾患を有する被験体にか、または少なくともいくらかの腫瘍または新生細胞が意図的に被験体に留まるようにされた腫瘍または新生物性疾患を有する被験体に微生物を投与するという、腫瘍または新生物性疾患の処置方法が提供される。化学療法または放射線療法などの他の典型的な癌処置法では、このような方法は一般に、被験体の免疫系を弱める副作用を持つ。このような化学療法または放射線療法による被験体の処置は、抗腫瘍免疫応答を具備する被験体の能力を低下させることがある。よって、例えば、本発明では、化学療法または放射線療法などの免疫系弱化療法で被験体を処置することなく、腫瘍または新生物性疾患を有する被験体に微生物を投与するという、腫瘍または新生物性疾患の処置方法が提供される。
もう１つの態様では、被験体に微生物を投与する前に、被験体を、原発腫瘍を除去しないか、または被験体の免疫系を弱めない１以上の癌処置ステップで処置することができる。腫瘍が外科的除去または免疫系弱化療法を用いずに処置できる、より精巧な様々な癌処置法が開発されつつある。例示的な方法としては、免疫系を弱めることなく腫瘍または新生細胞の増殖速度を低下させる化合物を投与すること（例えば、腫瘍抑制化合物を投与することによるか、腫瘍細胞特異的化合物を投与することによる）、または血管形成阻害化合物を投与することを含む。よって、被験体に微生物を投与することを含む複合法は、癌療法をさらに改良することができる。よって、本明細書では、例えば、被験体の免疫系を弱めることなく腫瘍増殖を遅くする化合物または腫瘍の血管新生を阻害する化合物を投与する前または後に、ともに被験体に微生物を投与する方法が提供される。
ｂ．投与様式
被験体に微生物を投与するには、その投与様式が微生物の腫瘍または転移への侵入を可能とする限り、いずれの様式を用いてもよい。投与様式としては、限定されるものではないが、静脈投与、腹腔投与、皮下投与、筋肉投与、局所投与、腫瘍内投与、多重穿刺（例えば、天然痘ワクチンとともに用いられているもの）、吸入、鼻腔投与、経口投与、腔内投与（例えば、カテーテルを介した膀胱への投与、坐薬または浣腸による消化管への投与）、耳内投与または眼内投与が挙げられる。当業者ならば、被験体および微生物に適合し、かつ、腫瘍および／または転移に到達する微生物が得られる可能性もある投与様式を選択することができる。投与経路は、当業者ならば、疾病の性質、腫瘍の種類、および医薬組成物に含まれる特定の微生物を含む様々な因子のいずれかに従って選択することができる。標的部位への投与は、例えば、コロイド分散系としての弾道送達により行うことができ、あるいは、全身送達は、動脈注射により行うことができる。
ｃ．用量
用量は、様々な方法および量のいずれであってもよく、当業者ならば公知の臨床因子に従って決定することができる。医学分野で公知のように、ある任意の患者の用量は、その被験体の種、大きさ、体表面積、年齢、性別、免疫応答性、および健康状態、投与する特定の微生物、投与の期間および経路、疾病の種類およびステージ（例えば、腫瘍の大きさ）、ならびに同時に投与する薬物などの他の化合物を含む多くの因子に依存し得る。上記の因子の他、このようなレベルは、当業者が決定できるような微生物の感染力および微生物の性質に左右され得る。本明細書で提供される方法で用いられるウイルスの少なくともいくつかは、本明細書で用いられている細菌よりも感染力が高いものがある。よって、本方法のいくつかの態様では、ウイルスは細菌よりも低いレベルで投与することができる。本方法では、微生物の適性最低用量レベルは、腫瘍または転移においてその微生物が生存、増殖および複製するに十分なレベルであり得る。６５ｋｇのヒトにウイルスを投与する場合の最低レベルの例としては、少なくとも約５×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、少なくとも約１×１０６ｐｆｕ、少なくとも約５×１０６ｐｆｕ、少なくとも約１×１０７ｐｆｕ、または少なくとも約１×１０８ｐｆｕが挙げられる。６５ｋｇのヒトに細菌を投与する場合の最低レベルの例としては、少なくとも約５×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）、少なくとも約１×１０７ｃｆｕ、少なくとも約５×１０７ｃｆｕ、少なくとも約１×１０８ｃｆｕ、または少なくとも約１×１０９ｃｆｕが挙げられる。本方法では、微生物の適性最高用量レベルは、宿主に毒性がないレベル、３倍以上の脾腫が生じないレベル、約１日後または約３日後または約７日後に正常な組織または器官にコロニーまたはプラークを生じないレベルであり得る。６５ｋｇのヒトにウイルスを投与する場合の最高レベルの例としては、せいぜい約５×１０１０ｐｆｕ、せいぜい約１×１０１０ｐｆｕ、せいぜい約５×１０９ｐｆｕ、せいぜい約１×１０９ｐｆｕ、またはせいぜい約１×１０８ｐｆｕが挙げられる。６５ｋｇのヒトに細菌を投与する場合の最高レベルの例としては、せいぜい約５×１０１１ｐｆｕ、せいぜい約１×１０１１ｐｆｕ、せいぜい約５×１０１０ｐｆｕ、せいぜい約１×１０１０ｐｆｕ、またはせいぜい約１×１０９ｐｆｕが挙げられる。
ｄ．投与回数
本明細書で提供される方法は、被験体への微生物の単回投与または被験体への微生物の多回投与を含み得る。いくつかの態様では、腫瘍内に微生物を確立するには、そこで微生物が増殖でき、被験体において抗腫瘍応答を誘導または増強することができる場所には単回投与で十分であり、このような方法は、被験体において抗腫瘍応答を誘導または増強するためにさらなる微生物の投与を必要とせず、例えば腫瘍増殖の阻害、転移の増殖または形成の阻害、腫瘍または転移の大きさの低減、腫瘍または転移の排除、新生物性疾患の再発または新たな腫瘍形成の阻害または予防、あるいはその他の癌治療効果をもたらすことができる。他の態様では、微生物は異なる時期に、一般には少なくとも１日おきに投与することができる。分割投与は、前の投与で腫瘍または転移への微生物の送達が不十分であった場合でも、腫瘍または転移への微生物の送達確率を高めることができる。分割投与は、微生物の増殖が起こり得る腫瘍または転移における局在を高めることができるか、そうでなければ、腫瘍に集積する微生物の力価を高めることができ、これにより、宿主の抗腫瘍免疫応答を惹起または増強する上で、腫瘍からの抗原またはその他の化合物の放出規模を高めることができ、さらにまた、所望により、微生物に基づく腫瘍溶解または腫瘍細胞死のレベルを高めることができる。微生物の分割投与は微生物抗原に対する被験体の免疫応答をさらに拡大することができ、これにより、微生物が集積した腫瘍または転移に対する宿主の免疫応答を拡大することができ、また、被験体が抗腫瘍免疫応答を具備する確率を高めることができる。
分割投与を行うとき、各投与は他の投与用量と同じまたは異なる用量であってよい。一態様では、全ての投与用量が同じである。他の態様では、最初の用量は１回以降のその後の用量よりも多くてもよく、例えば、その後の用量よりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍多くてもよい。最初の用量が１回以降のその後の用量よりも多い分割投与法の一例では、その後の全ての用量は最初の投与と同じか少なくてよい。
分割投与は、２回、３回、４回、５回または６回投与を含む、２回以上のいずれかの投与回数を含み得る。当業者ならば、治療法をモニタリングするための当技術分野で公知の方法および本明細書で提供されるその他のモニタリング法に従い、１回以上のさらなる投与を行う投与回数またはその実施が望ましいかどうかを容易に決定することができる。よって、本明細書で提供される方法は、被験体に微生物の１回以上の投与を施す方法を含み、その投与回数は被験体をモニタリングし、そのモニタリングの結果に基づき、１回以上のさらなる投与を施すかどうかを決定することにより決定することができる。１回以上のさらなる投与を施すかどうかの決定は、限定されるものではないが、腫瘍増殖の誘導または腫瘍増殖の阻害、新たな転移の出現または転移の阻害、被験体の抗微生物抗体力価、被験体の抗腫瘍抗体力価、被験体の全体的な健康状態、被験体の体重、腫瘍および／または転移にだけ微生物が存在するかどうか、正常組織または器官に微生物が存在するかどうかを含む、様々なモノタリング結果に基づくものであり得る。
投与間の期間は様々であり得る。投与間の期間は、投与回数に関して記載したようなモニタリングステップ、被験体が免疫応答を具備する期間、被験体が正常組織から微生物をクリアランスする期間、または腫瘍もしくは転移微生物が増殖する期間を含む様々な因子のいずれかの関数であり得る。一例では、この期間は被験体が免疫応答を具備する期間の関数であってもよく、例えば、この期間は被験体が免疫応答を具備する期間よりも長く、例えば、約１週間より長く、約１０日より長く、約２週間より長く、または約１ヶ月より長くて良い；別の例では、この期間は被験体が免疫応答を具備する期間よりも短くてよく、例えば、約１週間より短く、約１０日より短く、約２週間より短く、または約１ヶ月より短くて良い。別の例では、この期間は被験体が正常組織から微生物を除去する期間の関数であってもよく、例えば、この期間は被験体が正常組織から微生物を除去する期間よりも長く、例えば、約１日より長く、約２日より長く、約３日より長く、約５日より長く、または約１週間より長い。別の例では、この期間は腫瘍または転移における微生物増殖の期間の関数であってもよく、例えば、この期間は、検出可能なマーカーを発現する微生物を投与した後に腫瘍または転移において検出可能なシグナルが生じる期間よりも長くてよく、例えば、約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１ヶ月である。
ｅ．同時投与
また、異なる治療微生物または治療化合物などのさらなる治療物質が投与される方法も提供される。これらは最初の微生物と同時、逐次または間欠的に投与することができる。このさらなる治療物質は微生物またはその遺伝子産物と相互作用できるか、またはこのさらなる治療物質は微生物とは独立に作用し得る。
ｉ．複数の微生物の投与
２種以上の微生物を被験体に投与するための方法が提供される。投与は同時、逐次または間欠的に行うことができる。複数の微生物を単一の組成物として投与することもできるし、または２以上の組成物として投与することもできる。この２種以上の微生物は、少なくとも２種の細菌、少なくとも２種のウイルス、少なくとも２種の真核細胞、または細菌、ウイルスおよび真核細胞から選択される２種以上のものであり得る。この複数の微生物は、微生物を含有する組成物の組合せとして、および／または投与向けにパッケージングされた微生物および所望によりその使用説明書を含むキットとして提供することができる。これらの組成物は単位用量投与（すなわち、直接投与）として製剤された微生物であり、希釈剤またはその他の添加剤が必要な場合もある。
一態様では、少なくとも１種の微生物が、低病原性、低毒性、腫瘍における優先的集積、腫瘍細胞に対して免疫応答を活性化させる能力、免疫原性、複製能、外因性タンパク質を発現する能力、およびそれらの組合せなどの特徴を有する、本明細書で提供されるもののような修飾微生物である。これらの微生物はほぼ同時に投与することもできるし、または異なる時点で投与することもできる。これらの微生物は同じ組成物または同じ投与法で投与することもできるし、または別の組成物または異なる投与方法で投与することもできる。
一例では、細菌およびウイルスを被験体に投与することができる。この細菌およびウイルスは同時に投与することもできるし、異なる時点で投与することもできる。例えば、細菌を投与する前にウイルスを投与してもよいし、またはウイルスを投与する前に細菌を投与してもよいが、一般には細菌を投与する前にウイルスを投与する。本明細書で示されるように、被験体に細菌を投与する前に被験体にウイルスを投与すれば、細菌だけを投与する方法に比べ、腫瘍で集積および／または増殖することができる細菌の量が増える。
よって、細菌の投与前にウイルスの投与を含む本明細書で提供される方法によれば、そうではないとき、すなわち、細菌だけを投与する方法、またはウイルスの投与と同時もしくはウイルスの投与前に細菌を投与する方法で投与されるものよりも低用量の細菌を投与できる。例えば、いくつかの態様では、投与する細菌は用いる細菌の能力を制限する１以上の特性を有してよく、このような特徴としては、限定されるものではないが、毒性、腫瘍特異性の低い集積、および制限された増殖能が挙げられる。１以上の制限された特性を有する、投与する細菌はより低い用量で投与する必要があるか、または腫瘍特異的集積および／または増殖に補助を必要とする場合がある。本明細書では、制限された特性を有するこのような細菌を投与する方法が提供され、ここでは、その制限された細菌をより少量で投与することができるように、高い特異性で集積できるように、かつ／または腫瘍において高い増殖能を有することができるように、細菌を投与する前にウイルスを投与する。
投与間の期間は、当業者が決定できるような、所望の作用を達成するいずれの期間であってもよい。種々の微生物の投与間の期間の選択は、モニタリングステップの結果、被験体が免疫応答を具備する期間、被験体が正常組織から微生物を除去する期間、または腫瘍または転移における微生物増殖の期間を含む、同じ微生物の投与間の期間を選択するためのものと類似のパラメーターに従って決定することができる。一例では、この期間は被験体が免疫応答を具備する期間の関数であってよく、例えば、この期間は被験体が免疫応答を具備する期間よりも長くてよく、例えば、約１週間より長く、約１０日より長く、約２週間より長く、または約１ヶ月より長くて良い；別の例では、この期間は被験体が免疫応答を具備する期間よりも短くてよく、例えば、約１週間より短く、約１０日より短く、約２週間より短く、または約１ヶ月より短くて良い。別の例では、この期間は被験体が正常組織から微生物を除去する期間の関数であってよく、例えば、この期間は被験体が正常組織から微生物を除去する期間よりも長くてよく、例えば約１日より長く、約２日より長く、約３日より長く、約５日より長く、または約１週間より長くて良い。別の例では、この期間は、腫瘍または転移における微生物増殖の期間の関数であってよく、例えば、この期間は、検出可能なマーカーを発現する微生物を投与した後、腫瘍または転移において検出可能なシグナルが生じる期間よりも長くてよく、例えば、約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１ヶ月である。一例では、まずウイルスを投与し、このウイルスを投与して約５日後に細菌を投与すればよい。別の例では、まずウイルスを投与し、被験体の腫瘍においてウイルスによりコードされている検出可能な遺伝子産物が検出される際に、場合によっては、ウイルスによりコードされている検出可能な遺伝子産物が被験体の腫瘍でのみ検出される場合に細菌を投与すればよい。
ｉｉ．治療化合物
これらの方法は微生物またはその複数を被験体に投与するのに加えて、被験体に１以上の治療化合物を投与することを含み得る。治療化合物は、腫瘍治療効果に関して単独で、または微生物とともに作用し得る。単独で作用し得る治療化合物としては、腫瘍増殖を阻害することができるか、転移の増殖および／または形成を阻害することができるか、腫瘍または転移の大きさを小さくすることができるか、微生物の腫瘍において蓄積し、腫瘍において複製する能力を低下させることなく腫瘍または転移を排除することができるか、また、被験体において抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる様々な既知の化学療法薬化合物のいずれもが含まれる。
微生物とともに作用する治療化合物としては、例えば、微生物の発現を変化させる化合物、または微生物により発現される遺伝子と相互作用し得る化合物、またはその微生物に有毒な化合物を含む、微生物の増殖を阻害し得る化合物が挙げられる。微生物とともに作用する治療化合物としては、例えば、微生物の増殖、毒性、腫瘍死滅、または免疫応答惹起特性を増強する治療化合物を含み、また、例えば、微生物の増殖、毒性、または細胞死滅特性を低下させる治療化合物も含み得る。よって、本明細書では、微生物とともに微生物の増殖、毒性、腫瘍細胞死滅または免疫応答惹起特性を増強する働きができる１以上の治療化合物を被験体に投与する方法が提供される。また、本明細書では、微生物とともに微生物の増殖、毒性、腫瘍細胞死滅特性を低下させる働きができる１以上の治療化合物を被験体に投与する方法も提供される。
一態様では、微生物の増殖、毒性、細胞死滅、または免疫応答惹起特性を増強する働きができる治療化合物は遺伝子発現を変化させ得る化合物であり、この変化した遺伝子発現は被験体において腫瘍細胞の死滅の増加または抗腫瘍免疫応答の増強をもたらし得る。遺伝子発現を変化させる化合物は、例えば、内因性の微生物遺伝子および／または外因性の微生物遺伝子を含む１以上の微生物遺伝子の発現に増加または低下をもたらし得る。例えば、遺伝子発現を変化させる化合物は、細胞溶解または細胞死を誘導し得るか、免疫応答を惹起し得るか、プロドラッグ様化合物の変換を触媒し得るか、または腫瘍細胞遺伝子の発現を阻害し得る外因性遺伝子などの遺伝子の転写を微生物において誘導または増強し得る。ＩＰＴＧおよびＲＵ４８６を含む、遺伝子発現を変化させ得る多様な化合物はいずれも当技術分野で公知である。発現が上方制御可能な遺伝子の例としては、毒素、プロドラッグを抗腫瘍薬に変換できる酵素、サイトカイン、転写調節タンパク質、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムを含む、タンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。別の例では、遺伝子発現を変化させる化合物は、微生物の毒性を軽減し得る、または微生物の増殖を低下させ得る外因性遺伝子などの遺伝子の転写を微生物において阻害し得る、または低下させ得る。ｓｉＲＮＡ化合物、転写インヒビターまたは転写アクチベーターのインヒビターを含む、遺伝子発現を低下させ得る、または阻害し得る様々な化合物はいずれも本明細書で提供される方法で使用可能である。発現が下方制御可能な遺伝子の例としては、溶解、ヌクレオチド合成または増殖を抑制する微生物タンパク質またはＲＮＡ、および細胞死、免疫反応性、溶解、または微生物複製を抑制する細胞タンパク質またはＲＮＡ分子を含む、タンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。
別の態様では、微生物とともに微生物の増殖、毒性、腫瘍細胞死滅または免疫応答惹起特性を増強する働きができる治療化合物は、微生物により発現される遺伝子産物と相互作用し得る化合物であり、このような相互作用は被験体における腫瘍細胞の死滅の増加または抗腫瘍免疫応答の増強をもたらし得る。微生物により発現される遺伝子産物と相互作用し得る治療化合物としては、例えば、プロドラッグ、またはその被験体に投与された形態では毒性またはその他の生物活性がほとんどないかまたは全くないその他の化合物が挙げられるが、この化合物が微生物により発現される遺伝子産物と相互作用した後は、限定されるものではないが、細胞傷害性、アポトーシス誘導能、または免疫応答惹起能を含む、腫瘍細胞死をもたらす特性を発達させることができる。様々なプロドラッグ様物質は当技術分野で公知であり、このような化合物セットの例は本明細書の他所で開示されており、このような化合物としては、ガンシクロビル、５−フルオロウラシル、６−メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン−ドキソルビシン、４−［（２−クロロエチル）（２−メスロキシ(mesuloxy)エチル）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸、アセトミノフェン、インドール−３−酢酸、ＣＢ１９５４、７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン、ビス−（２−クロロエチル）アミノ−４−ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ(dihyro)−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール、エピルビシン−グルクロニド、５’−デオキシ５−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、およびリナマリンが挙げられる。
別の態様では、微生物とともに微生物の増殖、毒性または細胞死滅特性を低下させる働きができる治療化合物は、微生物の複製を阻害し得るか、微生物の毒素を阻害し得るか、または微生物を死滅させ得る化合物である。微生物の複製を阻害し得るか、微生物の毒素を阻害し得るか、または微生物を死滅させ得る治療化合物は一般に、限定されるものではないが、微生物のＤＮＡ複製、微生物のＲＮＡ転写、ウイルスコートタンパク質の構築、外膜または多糖の構築を阻害し得る化合物を含む、微生物の生活環の１以上のステップを遮断し得る化合物が含まれ得る。微生物の生活環の１以上のステップを遮断し得る様々な化合物はいずれも当技術分野で公知であり、公知の抗生物質、微生物ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、微生物ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、微生物のＤＮＡ複製またはＲＮＡ転写を調節するタンパク質のインヒビターが挙げられる。一例では、微生物が細菌であるとき、化合物は抗生物質であり得る。別の例では、微生物は、化合物によって阻害することができる、すなわち、所望により宿主生物に有毒であってもよいＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなど、微生物の生活環タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。
ｆ．被験体の状態
別の態様では、被験体に微生物を投与するための本明細書で提供される方法は、麻酔した被験体、警戒中の被験体、高体温の被験体、低体温の被験体、または腫瘍における微生物の集積に影響を及ぼすことが知られている被験体のその他の状態を含む、様々な状態のいずれにある被験体に対しても行うことができる。本明細書で示されるように、麻酔されている被験体は麻酔されていない被験体よりも腫瘍における微生物の集積速度が遅くなり得ることが判明している。さらに本明細書では、低体温の被験体は正常体温の被験体よりも腫瘍における微生物の集積速度が遅くなり得ることが判明していることも示される。よって、本明細書では、被験体に微生物を投与する方法が提供され、その方法は被験体に微生物を投与することを含んでよく、その被験体は全身麻酔などの麻酔下になく、例えば、被験体は局所麻酔下にあってもよく、あるいは麻酔されていなくてもよい。また、本明細書では、被験体に微生物を投与する方法が提供され、その方法は体温変化を有する被験体に微生物を投与することを含んでもよく、この体温変化は腫瘍に集積する微生物の能力に影響を及ぼすことができ、一般には、体温の低下は腫瘍に集積する微生物の能力を低下させ得る。よって、一例としての態様では、被験体に微生物を投与する方法が提供され、その方法は正常を上回る温度まで被験体の体温を高めること、および被験体に微生物を投与することを含み、この微生物は、正常体温の被験体の腫瘍に集積する微生物の能力に対して、高体温の被験体でより容易に集積することができる。
２．モニタリング
本明細書で提供される方法は、被験体のモニタリング、腫瘍のモニタリングおよび／または被験体に投与した微生物のモニタリングのうち１以上のステップをさらに含み得る。限定されるものではないが、腫瘍の大きさのモニタリング、抗（腫瘍抗原）抗体力価のモニタリング、転移の存在および／または大きさのモニタリング、被験体のリンパ節のモニタリング、被験体の体重、または血液もしくは尿マーカーを含む他の健康指標のモニタリング、抗（微生物抗原）抗体力価のモニタリング、微生物での検出可能な遺伝子産物の発現のモニタリング、および被験体の腫瘍、組織または器官における微生物力価の直接的モニタリングを含む様々なモニタリングステップのいずれを本明細書で提供される方法に含んでもよい。
モニタリングの目的は、単に被験体の健康状態または被験体の治療処置の進行を評価することであってもよいし、または同じかもしくは異なる微生物のさらなる投与が妥当かどうかを決定すること、またはある化合物がその治療法の有効性を高める働きをし得るか、またはある化合物が被験体に投与された微生物の病原性を軽減する働きをし得る場合に、その化合物を被験体に投与する時期、または投与するかどうかを決定することであってもよい。
ａ．微生物の遺伝子発現のモニタリング
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、微生物により発現される１以上の遺伝子をモニタリングすることを含み得る。本明細書で提供されるもの、またはそうでなければ、当技術分野で公知などの微生物は、限定されるものではないが、検出可能なタンパク質を含む１以上の検出可能な遺伝子産物を発現し得る。
本明細書で示されるように、微生物で発現される検出可能な遺伝子産物の測定は、被験体に存在する微生物のレベルの正確な決定を提供し得る。さらに本明細書で示されるように、例えば断層撮影法を含む画像化法による検出可能な遺伝子産物の位置の測定は、被験体内の微生物の局在を決定することができる。よって、本明細書では、本明細書で提供される、検出可能な微生物遺伝子産物をモニタリングすることを含む方法は、被験体の１以上の器官または組織における微生物の有無、および／または被験体の腫瘍または転移における微生物の有無を決定するために使用できる。さらに、本明細書で提供される、検出可能な微生物遺伝子産物をモニタリングすることを含む方法は、１以上の器官、組織、腫瘍または転移に存在する微生物の力価を決定するために使用できる。被験体において微生物の局在および／または力価をモニタリングすることを含む方法は、微生物の病原性を決定するために使用でき、正常組織および器官の微生物感染、特に感染レベルはそのプローブの病原性を示し得るので、被験体において微生物の局在および／または量をモニタリングする方法は、微生物の病原性を決定するために使用できる。本明細書で提供される方法は被験体における特定の場所での微生物の量をモニタリングするために使用できることから、被験体において微生物の局在および／または力価をモニタリングすることを含む方法は複数の時点で行うことができ、よって、被験体の１以上の器官または組織における微生物の複製速度を含む被験体における微生物の複製速度を決定することができ、従って、微生物遺伝子産物をモニタリングする方法は、微生物の複製能を決定するために使用できる。本明細書で提供される方法はまた、様々な器官または組織、および腫瘍または転移に存在する微生物の量を定量するためにも使用でき、また、それにより被験体における微生物の優先的集積の程度を示すことができ、よって、本明細書で提供される微生物遺伝子産物モニタリング法は、正常組織または器官に優先して腫瘍または転移に集積する微生物の能力を決定する方法において使用できる。本明細書で提供される方法で用いられる微生物は腫瘍全体に集積することができるか、または腫瘍内の複数の部位に集積することができ、かつ、転移にも集積することができることから、本明細書で提供される、微生物遺伝子産物をモニタリングするための方法は、被験体に存在する腫瘍の大きさまたは転移の数を決定するために使用できる。一定の時間にわたって腫瘍または転移におけるこのような微生物遺伝子産物の存在をモニタリングすることは、腫瘍の増殖もしくは退縮、または新たな転移の発達もしくは転移の消失を含む、腫瘍または転移における変化を評価するために使用でき、また、腫瘍の増殖もしくは退縮、または新たな転移の発達もしくは転移の消失の速度、または腫瘍の増殖もしくは退縮、または新たな転移の発達もしくは転移の消失の速度変化を決定するためにも使用できる。よって、微生物遺伝子産物をモニタリングする方法は、腫瘍の増殖もしくは退縮、または新たな転移の発達もしくは転移の消失の速度、または腫瘍の増殖もしくは退縮、または新たな転移の発達もしくは転移の消失の速度変化を決定することにより、被験体の新生物性疾患をモニタリングするため、または新生物性疾患の処置の有効性を決定するために使用できる。
様々な検出可能なタンパク質はいずれも本明細書で提供されるモニタリング法で検出可能であり、このような検出可能なタンパク質の限定されない例としては、様々な蛍光タンパク質のいずれも（例えば、緑色蛍光タンパク質）、様々なルシフェラーゼのいずれも、遺伝子導入タンパク質またはその他の鉄結合タンパク質、あるいは受容体、結合タンパク質、および抗体が挙げられ、この場合、その受容体、結合タンパク質または抗体に特異的に結合する化合物は検出可能な薬剤であってもよいし、または検出可能な物質（例えば、放射性核種または造影剤）で標識することもできる。
ｂ．腫瘍サイズのモニタリング
また、本明細書では、腫瘍および／または転移の大きさおよび位置をモニタリングする方法も提供される。腫瘍および／または転移の大きさは、外部評価法または断層撮影法もしくは磁気映像法を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれによってモニタリングしてもよい。当技術分野で公知の方法の他、本明細書で提供される、例えば微生物遺伝子発をモニタリングする方法は、腫瘍および／または転移の大きさをモニタリングするために使用できる。
いくつかの時点で大きさをモニタリングすると、腫瘍または転移の大きさの増大または退縮に関する情報が得られ、また、被験体におけるさらなる腫瘍および／または転移の存在に関する情報が得られる。いくつかの時点で腫瘍の大きさをモニタリングすると、被験体における新生物性疾患の処置の有効性を含む、被験体における新生物性疾患の発症に関する情報が得られる。
ｃ．抗体力価のモニタリング
本明細書で提供される方法はまた、被験体への微生物の投与に応答して産生される抗体を含む、被験体において抗体力価をモニタリングすることを含み得る。本明細書で提供される方法において投与される微生物は内因性の微生物抗原に対して免疫応答を惹起することができる。本明細書で提供される方法において投与される微生物はまた、微生物により発現される外因性遺伝子に対しても免疫応答を惹起することができる。本明細書で提供される方法において投与される微生物はまた、腫瘍抗原に対しても免疫応答を惹起することができる。微生物抗原、微生物により発現される外因性の遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体力価のモニタリングは、微生物の毒性をモニタリングする方法、処置方法の有効性をモニタリングする方法、または生産または採取のための遺伝子産物または抗体のレベルをモニタリングする方法において使用できる。
一態様では、抗体力価のモニタリングは、微生物の毒性をモニタリングするために使用できる。微生物に対する抗体力価は、その微生物を被験体に投与した後の一定の期間にわたって変化し、いくつかの特定の時点での低い抗（微生物抗原）抗体力価は高い毒性を示し、他の時点での抗（微生物抗原）抗体力価は高い毒性を示し得る。本明細書で提供される方法で用いられる微生物は免疫原性であってよく、従って、その微生物を被験体に投与した後間もなく、免疫応答を惹起し得る。一般に、それに対して被験体の免疫系がすぐさま強い免疫応答を具備することができる微生物は、被験体の免疫系が全ての正常器官または組織から微生物を除去できた際に低毒性となる微生物であり得る。よって、いくつかの態様では、その微生物を被験体に投与した後間もなくの微生物抗原に対する高い抗体力価は、微生物の低毒性を示し得る。これに対し、免疫原性がそれほど高くない微生物は、宿主に対してその微生物の強い毒性を生じ得るような強い免疫応答を惹起することなく宿主生物に感染することができる。よって、いくつかの態様では、その微生物を被験体に投与した後間もなくの微生物抗原に対する高い抗体力価は、微生物の低毒性を示し得る。
他の態様では、抗体力価のモニタリングは、処置方法の有効性をモニタリングするために使用できる。本明細書で提供される方法では、抗（腫瘍抗原）抗体力価などの抗体力価は、新生物性疾患を処置する治療方法などの治療方法の有効性を示し得る。本明細書で提供される治療方法は、腫瘍および／または転移に対して免疫応答を誘導または増強することを含み得る。よって、抗（腫瘍抗原）抗体力価をモニタリングすることにより、腫瘍および／または転移に対して免疫応答を誘導または増強する上で、治療方法の有効性をモニタリングすることができる。本明細書で提供される治療方法はまた、腫瘍に集積でき、かつ、抗腫瘍免疫応答を誘導または増強し得る微生物を被験体に投与することを含み得る。よって、腫瘍または転移に集積した微生物に対して免疫応答を具備する宿主の能力をモニタリングすることができ、これは被験体がまた抗腫瘍免疫応答も具備したことを示し得るか、または被験体が抗腫瘍免疫応答を具備する可能性があることを示し得るか、または被験体が抗腫瘍免疫応答を具備可能なことを示し得る。
他の態様では、抗体力価のモニタリングは、生産および／または採取のための遺伝子産物または抗体のレベルをモニタリングするために使用できる。本明細書で示されるように、方法は、腫瘍に集積した微生物において外因性遺伝子を発現させることにより、タンパク質、ＲＮＡ分子またはその他の化合物を生産するために使用できる。さらに本明細書では、腫瘍に集積した微生物の外因性遺伝子発現によって産生されるタンパク質、ＲＮＡ分子またはその他の化合物に対する抗体を生産するための方法が提供される。このタンパク質、ＲＮＡ分子またはその他の化合物に対する抗体力価のモニタリングは、腫瘍に集積した微生物によるタンパク質、ＲＮＡ分子またはその他の化合物の産生レベルを示し得るか、またはこのようなタンパク質、ＲＮＡ分子またはその他の化合物に特異的な抗体のレベルを直接示し得る。
ｄ．健康状態の診断のモニタリング
本明細書で提供される方法はまた、被験体の健康状態をモニタリングする方法を含み得る。本明細書で提供される方法のいくつかは、新生物性疾患の治療方法を含む治療方法である。被験体の健康状態のモニタリングは、当技術分野で公知のように、その治療方法の有効性を決定するために使用できる。本明細書で提供される方法はまた、被験体に微生物を投与するステップも含み得る。被験体の健康状態のモニタリングは、被験体に投与した微生物の病原性を決定するために使用できる。当技術分野で公知のように、新生物性疾患、感染性疾患、または免疫関連疾患などの疾病をモニタリングするための様々な健康診断方法のいずれもがモニタリング可能である。例えば、被験体の体重、血圧、脈拍、呼吸、血色、体温またはその他の観察可能な状態が被験体の健康状態を示し得る。さらにまた、被験体由来のサンプルにおける１以上の成分の有無またはレベルも被験体の健康状態を示し得る。典型的なサンプルとしては血液および尿サンプルが挙げられ、この場合、１以上の成分の有無またはレベルは、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断試験を行うことにより決定することができる。被験体の健康状態の指標となる成分の例としては、限定されるものではないが、白血球数、ヘマトクリット、Ｃ反応性タンパク質濃度が挙げられる。
ｅ．処置と統合したモニタリング
また、本明細書では、治療をモニタリングする方法が提供され、その治療的判定はこのモニタリングの結果に基づくものであり得る。本明細書で提供される治療方法は、被験体に微生物を投与することを含み、この微生物は腫瘍および／または転移に優先的に集積することができ、かつ、そこでこの微生物は抗腫瘍免疫応答を誘導または増強することができる。このような治療方法は、特定の微生物の多数回投与、第二の微生物の投与、または治療化合物の投与を含む様々なステップを含み得る。被験体に投与する微生物または化合物の量、時期または種類の決定は、その被験体のモニタリングから得られた１以上の結果をもとにすることができる。例えば、被験体の抗体力価は、微生物または化合物を投与するのが望ましいかどうか、微生物または化合物の投与量、および投与する微生物または化合物の種類を決定するために使用でき、例えば、低抗体力価はさらなる微生物、異なる微生物、または微生物遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を投与するのが望ましいことを示し得る。別の例では、被験体の全身的な健康状態は、微生物または化合物を投与するのが望ましいかどうか、微生物または化合物の投与量、および投与する微生物または化合物の種類を決定するために使用でき、例えば、その被験体が健康であると決定された場合は、さらなる微生物、異なる微生物、または微生物遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を投与するのが望ましいことを示し得る。別の例では、微生物により発現される検出可能な遺伝子産物のモニタリングは、微生物または化合物を投与するのが望ましいかどうか、微生物または化合物の投与量、および投与する微生物または化合物の種類を決定するために使用できる。このようなモニタリング方法は、その治療方法が効果的かどうか、その治療方法が被験体に対して病原性があるかどうか、その微生物が腫瘍または転移に集積したかどうか、およびその微生物が正常組織または器官に集積したかどうかを決定するために使用できる。このような決定をもとに、さらなる治療方法が望まれるかどうか、またその形態を導き出すことができる。
一態様では、ある治療方法が効果的かどうかの決定は、さらなる治療方法を導き出すために使用できる。本明細書で示されるように、またはそうでなければ当技術分野で公知のように、ある治療方法が効果的かどうかを決定するためには、様々なモニタリング方法のいずれを用いてもよい。モニタリング方法が、その治療方法が効果的であることを示せば、現行の治療を維持する（微生物または化合物のさらなる投与を含み得る）判断を下すことができるか、またはさらなる投与の必要はないとの判断を下すことができる。モニタリング方法が、その治療方法が効果的でないことを示せば、それらのモニタリング結果は、治療経過を中止すべきかどうか（例えば、微生物が被験体に対して病原性である場合）、または変更すべきかどうか（例えば、微生物が宿主生物に害を与えることはないが、抗腫瘍免疫応答を惹起することもなく腫瘍に集積する場合）、または頻度もしくは量を増やすべきかどうか（例えば、微生物が腫瘍にほとんど、または全く集積しない場合）を示し得る。
一例では、モニタリングは、微生物が被験体に対して病原性であることを示し得る。このようなとき、その微生物の被験体への投与を終了するという判断、より低いレベルの微生物を被験体に投与するという判断、異なる微生物を被験体に投与するという判断、またはその微生物の病原性を軽減する化合物を被験体に投与するという判断を下すことができる。一例では、病原性があると決定された微生物の投与を終了することができる。別の例では、次回の投与に関して、病原性があると決定された微生物の用量を減らすことができ、このような例の一形態では、被験体に病原性微生物を投与する前に、腫瘍に集積するその病原性微生物の能力を高め得る別の微生物で被験体を前処置することができる。別の例では、被験体は、被験体に対して病原性がある細菌またはウイルスを投与されてよく、このような病原性微生物の投与には、例えば、抗生物質、抗微生物化合物、病原性減弱化合物（例えば、溶解またはアポトーシス遺伝子産物の発現を下方制御する化合物）、または本明細書の他所で記載されているように、微生物の増殖、毒性、または細胞死滅特性を軽減し得るその他の化合物の投与を伴ってもよい。このような例の一形態では、微生物の局在をモニタリングすることができ、その微生物が腫瘍および／または転移に集積するが、正常組織または器官には集積しないと決定された場合、その抗生物質、抗微生物化合物または病原性減弱化合物の投与を終了することができ、その微生物の病原活性は腫瘍および／または転移に限って、活性化または増強され得る。このような例の別の形態では、抗生物質、抗微生物化合物または病原性減弱化合物の投与を終了した後、微生物および／または微生物の病原性の存在をさらにモニタリングすることができ、例えば、正常器官または組織へ拡散すること、または毒素を血管へ放出すること、またはそうでなければ腫瘍または転移を超えて及ぶような病原作用を持つことにより、この微生物が宿主への驚異を有すると決定されれば、このような化合物の投与を再開することができる。
別の例では、微生物が被験体の腫瘍または転移に集積したかどうかをモニタリングすることができる。このような決定の際には、被験体にさらなる微生物、異なる微生物または化合物をさらに投与するという判断を下すことができる。一例では、腫瘍または転移におけるウイルス存在のモニタリングは、その被験体に細菌を投与することを決定する際に使用でき、その場合、例えば、細菌の投与量は腫瘍または転移におけるウイルスの存在および／または量に応じて少なくすることができる。同様の例で、腫瘍または転移におけるウイルス存在のモニタリングは、その被験体にいつ微生物を投与するかを決定する際に使用でき、その場合、例えば、腫瘍または転移におけるウイルスの存在および／または選択された量を検出した際に細菌を投与することができる。別の例では、腫瘍における微生物の存在のモニタリングは、被験体に化合物を投与することを決定する際に使用でき、この化合物は微生物の病原性、増殖、または免疫原性を増強することができるか、またはそうでなければこの化合物は微生物の増殖、毒性、腫瘍細胞死滅、または免疫応答惹起特性を増強するために、その微生物とともに働くことができ；このような例の一形態では、この微生物は、例えば、このような化合物の不在下で溶解または細胞死滅能をほとんど持たないか、または全く持たないものであってよく；このような例のさらなる形態では、腫瘍または転移における微生物の存在のモニタリングは、正常組織または器官における微生物の不存在のモニタリングと組み合わせることができ、この場合、微生物が腫瘍または転移に存在し、正常器官または組織には全く存在しないか、または実質的に存在しない場合に化合物が投与され；このような例のさらなる形態では、腫瘍または転移における微生物の量をモニタリングすることができ、この場合、微生物が腫瘍または転移に十分なレベルで存在する場合に化合物が投与される。
Ｅ．遺伝子産物および抗体の生産方法
本明細書では、外因性遺伝子の産物の生産のための、および／または外因性遺伝子産物に特異的な抗体の生産のための微生物、ならびにそのような微生物を製造および使用するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、生物活性タンパク質の効率的な組換え生産をもたらす。ＥＰ Ａ１ １ ２８１ ７７２では、発光融合遺伝子構築物ｒＶＶ−ｒｕｃ−ｇｆｐを担持するワクシニアウイルス（ＬＩＶＰ株）をヌードマウスに静注した際、そのウイルス粒子は、発光の吸光によって測定したところ４日以内に全ての内部器官から除去されることが分かったことが開示されている。これに対し、注射したワクシニアウイルスの運命が、皮下移植したＣ６ラット神経膠腫細胞から増殖した腫瘍を有するヌードマウスと同様の経過をたどったとき、ウイルス粒子は腫瘍組織に一定時間留まり、持続的な発光をもたらすことが分かった。同じ腫瘍におけるウイルスによりコードされている融合タンパク質の存在および増幅を、実体顕微鏡下でＧＦＰ蛍光を観察することにより、また、低照度ビデオ撮影カメラ下でルシフェラーゼにより触媒される発光を検出することにより生きた動物でモニタリングした。腫瘍特異的な発光は、Ｃ６神経膠腫の皮下移植を有するヌードマウスにウイルスを注入した４日後に検出された。ｒＶＶ−ｒｕｃ−ｇｆｐウイルス粒子の腫瘍集積はまた、移植したＰＣ−３ヒト前立腺細胞から発達した皮下腫瘍を有するヌードマウスでも、ＭＣＦ−７ヒト乳癌の正所移植を有するマウスでも見られた。さらに、免疫応答性ラットにおける頭蓋内Ｃ６ラット神経膠腫細胞移植片、およびＣ５７マウスにおけるＭＢ−４９ヒト膀胱腫瘍細胞移植片もこのワクシニアウイルスで標的化した。原発乳癌の他、反対側の乳房領域、ならびに露出している肺表面の結節にも小さな転移腫瘍が外部検出されたが、このことは、反対側乳房および肺への転移を示唆する。要するに、発光細胞または微生物、例えば、ワクシニアウイルスは転移腫瘍の検出および処置に使用できることが示された。
同様の結果が、マウスに静注され、すぐに低照度画像装置下で動物全体を可視化できる発光細菌（サルモネラ菌、ビブリオ菌、リステリア菌、大腸菌）を用いて得られた。無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスおよび免疫応答性Ｃ５７マウスの双方で、免疫系による除去の結果として、細菌を注入して２４時間後には発光は検出されなかった。移植したＣ６神経膠腫細胞から発達した腫瘍を有するヌードマウスでは、発光は、腫瘍を持たないマウスと同様、細菌の送達から２４時間後、動物から完全になくなっていた。しかしながら、注射から４８時間後、腫瘍領域だけに起源する強く、急速に増強する発光が見られた。この所見は、腫瘍組織における連続的な細菌複製を示している。発光の程度は用いる細菌株によって異なった。前立腺癌、膀胱癌、および乳癌を有するヌードマウスにおいて、この持続的発光とともにホーミング−インプロセス(homing−in process)も実証された。乳癌モデルで例示されたように、原発腫瘍の他、転移腫瘍も可視化できた。また、膀胱癌を有する免疫応答性Ｃ５７マウスならびに脳神経膠腫移植片を有するＬｅｗｉｓラットでも、腫瘍特異的な発光が見られた。腫瘍では、発光細菌が循環中へ放出されたり、同じ動物においてその後に移植された腫瘍を再びコロニー化したりするようなことは一度も見られなかった。さらに、Ｒｕｃ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する哺乳類細胞を血流中に注入した際、神経膠腫腫瘍へ向かい、そこで増殖することも見出された。これらの知見は、例えば吸光によりシグナル伝達される腫瘍発達および血管形成の抑制、ならびに癌処置用の治療遺伝子構築物と組み合わせた細菌および哺乳類細胞に基づく腫瘍ターゲッティング系の開発を目的とした、発光などのシグナルに基づく腫瘍の検出に有用な多機能ウイルスベクターを設計するための道すじを拓いた。これらの系は次のような利点を有する：（ａ）それらは正常組織に影響を及ぼすことなく、特異的に腫瘍を標的とする；（ｂ）それら治療遺伝子構築物の発現および分泌を、所望により、分泌のスイッチをオンまたはオフできる誘導プロモーターの制御下に置くことができる；そして（ｃ）腫瘍内のその送達系の位置を、遺伝子発現の活性化およびタンパク質送達の前に直接可視化することにより確認することができる。
本明細書で示されるように、腫瘍における細菌、ウイルスおよび真核細胞の集積に基づく上記の系は、クローン化されたヌクレオチド配列を起源とするタンパク質およびその他の生体化合物の簡単、迅速かつ安価な生産に使用できる。この系はまた、同じ動物で、ポリペプチド、ＲＮＡまたはその他の生体化合物（腫瘍組織中）、およびそれらの化合物に対する抗体（血清中）の同時過剰生産にも有用である。本明細書で示されるように、静注後、ワクシニアウイルスなどの微生物は動物の腫瘍に侵入し得、その腫瘍の免疫特権状態のために、それらの腫瘍組織で優先的に複製することができ、それにより、それらの腫瘍において、挿入された遺伝子にコードされているタンパク質を過剰生産することができる。腫瘍組織を採取した後、局在しかつ過剰発現したタンパク質は、腫瘍ホモジネートから簡単な手順で単離することができる。さらに、同動物の血流には、腫瘍で生産された目的タンパク質のうち０．２％〜０．３％しか見られなかったという知見に基づけば、マウスのワクチン療法と過剰生産されたタンパク質に対する十分な抗体産生が同時に達成された。よって、同マウス（または他のいずれかの動物）からの血清を採取し、腫瘍において過剰生産されたタンパク質または他の産物に対するマウス由来の抗体として使用することができる。
よって、本明細書では、腫瘍を含む被験体に微生物を投与することにより、非ヒト被験体において遺伝子産物および／または抗体を生産する方法が提供され、ここで、微生物は、生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡ、その発現が生産しようとする化合物の形成をもたらし得るタンパク質またはＲＮＡ、またはそれに対する抗体を生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡを発現する。本明細書で提供される方法は、腫瘍を含む被験体に、生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡ、その発現が生産しようとする化合物の形成をもたらし得るタンパク質またはＲＮＡ、またはそれに対する抗体を生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡをコードする外因性遺伝子を発現する微生物を投与することをさらに含み得る。本明細書で提供される方法は、腫瘍を含む被験体に、生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡ、その発現が生産しようとする化合物の形成をもたらし得るタンパク質またはＲＮＡ、またはそれに対する抗体を生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡをコードする遺伝子を発現する微生物を投与することをさらに含んでよく、このような遺伝子発現は、例えば、転写アクチベーターもしくはインデューサー、または転写サプレッサーにより調節することができる。本明細書で提供される、タンパク質、ＲＮＡ、化合物または抗体を生産するための方法は、検出可能なタンパク質を検出することにより、被験体における微生物の局在および／またはレベルをモニタリングすることをさらに含んでよく、この検出可能なタンパク質は選択した遺伝子の発現を示すことができるか、またはその微生物が選択した遺伝子の発現を誘導する準備が整っていること、または発現の抑制が終結もしくは中止される準備が整っていることを示し得る。また、本明細書では、腫瘍を含む被験体に微生物を投与することにより、非ヒト被験体において遺伝子産物および／または抗体を生産する方法が提供され、この微生物は、生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡ、その発現が生産しようとする化合物の形成をもたらし得るタンパク質またはＲＮＡ、またはそれに対する抗体を生産すべく選択したタンパク質またはＲＮＡを発現し、その微生物を投与する被験体はトランスジェニック動物ではない。また、本明細書では、腫瘍を含む被験体に微生物を投与することにより、非ヒト被験体において遺伝子産物および／または抗体を生産する方法が提供され、この微生物は生産すべく選択したタンパク質を発現し、その被験体内の腫瘍は、選択したタンパク質を翻訳後プロセシングするその能力によって選択される。
この系の利点としては次の点が挙げられる：
（ａ）新規のポリペプチドコードカセットを担持するトランスジェニック動物を作製する必要がないこと；
（ｂ）この腫瘍系は組織培養よりも効率がよいこと；
（ｃ）宿主動物にマイナスの作用がなく、腫瘍において、動物の発達タンパク質または他の有毒タンパク質を妨げるタンパク質を過剰生産することができること；
（ｄ）この系は、ｃＤＮＡクローニングからタンパク質および抗血清の生産まで４〜６週間以内と、迅速であること；
（ｅ）この系は比較的安価であり、容易にスケールアップできること；
（ｆ）適切なタンパク質の折りたたみおよび修飾が達成できること；
（ｇ）高い抗原性が達成でき、より良い抗体生産に有益であること；そして
（ｈ）発酵槽として、腫瘍を有するマウスなどの動物において種特異的細胞に基づくタンパク質生産が達成できる。
遺伝子産物および／または遺伝子産物に対する抗体の生産のための方法例を表した図が図２にある。
一態様では、目的のポリペプチド、ＲＮＡまたは化合物を生産するための方法が提供され、この方法は次のステップを含む：（ａ）目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む微生物を担癌動物の注射すること；（ｂ）その動物から腫瘍組織を採取すること；および（ｃ）その腫瘍組織から目的のポリペプチド、ＲＮＡまたは化合物を単離すること。
方法例のステップは次のように要約することができる（特定の態様、すなわち、発光タンパク質をコードする遺伝子を付加的に含むワクシニアウイルスに関して示す）：
（１）目的のＤＮＡまたはｃＤＮＡをワクシニアウイルスゲノムへ挿入すること；
（２）そのワクシニアウイルスゲノムを発現マーカーとしての発光タンパク質構築物で修飾すること；
（３）組換えおよび細胞培養におけるウイルスの集合；
（４）挿入を担持する個々のウイルス粒子のスクリーニング、およびその後の大規模ウイルス生産と濃縮；
（５）それらのウイルス粒子を、ヒト、非ヒト霊長類またはその他の哺乳類起源の腫瘍を担持するマウスまたはその他の動物に投与すること；
（６）発光に基づく、動物におけるウイルス複製とタンパク質の過剰生産の確認；
（７）腫瘍組織、および所望により血液（別途）の採取；および
（８）常法を用いた、腫瘍からの過剰生産されたタンパク質の精製、および所望により血液からの抗血清の精製。
本明細書で提供される方法では、動物で複製し、動物に病原性がなく、例えば弱毒され、かつ、動物の免疫系によって認識される限り、いずれの微生物を用いてもよい。いくつかの態様では、このような微生物はまた、外因性遺伝子も発現し得る。好適な微生物および細胞は、例えば、ＥＰ Ａ１ １ ２８１ ７７２およびＥＰ Ａ１ １ ２８１ ７６７に開示されている。また、当業者ならば、所望の腫瘍を有する動物を作製する方法を知っている（例えば、ＥＰ Ａ１ １ ２８１ ７６７またはＥＰ Ａ１ １ ２８１ ７７７参照）。
また、目的のポリペプチド、ＲＮＡまたは化合物とそのポリペプチド、ＲＮＡまたは化合物に対する抗体とを同時生産する方法も提供され、その方法は次のステップを含む：（ａ）目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む微生物を担癌動物に投与すること；（ｂ）その動物から腫瘍組織を採取すること；（ｃ）その腫瘍組織から目的のポリペプチド、ＲＮＡまたは化合物を単離すること；そして（ｄ）その動物から得られた血清からそのポリペプチド、ＲＮＡまたは化合物を単離すること。このアプローチは、有毒または不安定であるか、または適切な折りたたみまたは修飾のために種特異的な細胞環境を必要とするポリペプチドおよび／またはそれらのポリペプチドに対する抗体を作製するために使用できる。
別の態様では、この微生物は、発光もしくは蛍光タンパク質などの検出可能なタンパク質、または検出可能なシグナルを誘導し得るタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
一般に、これらの微生物または細胞を目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および発光もしくは蛍光タンパク質などの検出可能なタンパク質、または検出可能なシグナルを誘導し得るタンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトするための方法では、これらのヌクレオチド配列はベクターまたは発現ベクター内に存在する。当業者ならば様々な発現ベクターをよく知っており、腫瘍の感染に用いる微生物、腫瘍の細胞種、感染させる生物、および当技術分野で公知のその他の因子に従って選択することができる。いくつかの態様では、この微生物は、本明細書で開示されているウイルスを含むウイルスであり得る。よって、これらのヌクレオチド配列は、適当な発現カセットを含む組換えウイルスに含まれていてよい。本明細書での使用に好適なウイルスとしては、限定されるものではないが、バキュロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルスまたはパルボウイルス、例えばＭＶＭまたはＨ−１が挙げられる。このベクターはまた、ＭｏＭＵＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶまたはＧａＬＶなどのレトロウイルスであってもよい。哺乳類細胞における発現に関して好適なプロモーターとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ｐＣＭＶ）がある。さらに、組織および／または器官特異的プロモーターも使用可能である。例えば、これらのヌクレオチド配列は高い発現を可能とするプロモーターと作動可能なように連結することができる。このようなプロモーターとしては、例えば、誘導プロモーターが挙げられ；このような様々なプロモーターは当業者に公知である。
タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を作製するため、また、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたはウイルスを構築するためには、当技術分野で公知の一般法を使用できる。これらの方法としては、当技術分野で知られているように、例えば、インビトロ組換え技術、合成法およびインビボ組換え法が含まれ、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに例示されている。細胞をトランスフェクトする方法、トランスフェクト細胞を表現型により選択する方法、トランスフェクト体を表現型により選択する方法、およびタンパク質またはＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを用いることによりそれらのヌクレオチド配列を発現させる方法は当技術分野で公知である。
いくつかの態様では、腫瘍において生産するタンパク質またはＲＮＡは、被験体に内在する物質によるか、または被験体に投与することができる物質により誘導可能なプロモーターなどの誘導プロモーターと連結することができる。よって、本明細書では、腫瘍においてタンパク質またはＲＮＡを生産する方法が提供され、その生産はある物質を被験体に投与すること、および所望により、その腫瘍を採取し、その腫瘍からそのタンパク質またはＲＮＡを単離することにより誘導することができる。このような誘導方法は、被験体において微生物をモニタリングする方法と組み合わせることができる。例えば、微生物は、検出可能なタンパク質を検出することによりモニタリングすることができる。モニタリングを含む方法では、被験体における微生物の所望の局在および／またはレベルの検出は微生物遺伝子発現の誘導と統合することができる。例えば、微生物により発現される検出可能なタンパク質が腫瘍で検出されるが、正常器官または組織では感知できるほどには検出されないとき、その被験体にインデューサーを投与することができる。別の例では、微生物により発現される検出可能なタンパク質が腫瘍で検出され、正常器官または組織でも検出される場合、正常器官または組織で検出可能なタンパク質が検出されなくなるまでインデューサーの投与を中止または延期することができる。別の例では、微生物により発現される検出可能なタンパク質が腫瘍において十分なレベルで検出される場合、被験体にインデューサーを投与することができる。別の例では、微生物により発現される検出可能なタンパク質が腫瘍において十分なレベルで検出されないとき、腫瘍で検出可能なタンパク質が十分なレベルで検出されるまでインデューサーの投与を中止または延期することができる。
また、本明細書では、タンパク質またはＲＮＡ、および遺伝子発現のサプレッサーをコードする微生物を投与することにより、腫瘍においてタンパク質またはＲＮＡを生産する方法も提供される。この遺伝子発現のサプレッサーは、所定の期間、または微生物が腫瘍においては集積するが、正常器官または組織には集積しない期間、または十分なレベルの微生物が腫瘍に集積するまでの期間投与され得、その時点でサプレッサーの投与を終了または中止することができ、それによりそのタンパク質またはＲＮＡの発現をもたらすことができる。当業者に認識されているように、検出可能なタンパク質のモニタリングおよびインデューサーの投与に関して本明細書で提供されているものと類似の方法を、サプレッサーの投与の終了または中止に適用することもできる。
一態様では、この微生物は細菌、例えば、本明細書で提供されているもののような弱毒細菌である。細菌の例としては、弱毒ネズミチフス菌(Salmonella thyphimurium)、弱毒コレラ菌、弱毒リステリア菌または大腸菌が挙げられる。あるいは、ワクシニアウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルスウイルスなどのウイルスを本明細書で提供される方法に用いてもよい。方法例では、ウイルスはワクシニアウイルスである。本方法で使用可能な他の細胞としては、繊維腫細胞などの哺乳類細胞が含まれ、ヒト繊維腫細胞などのヒト細胞が挙げられる。
実験動物または家畜動物を含む、様々な動物のいずれを用いてもよく、例えば、マウス、ラットおよびその他の齧歯類、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびウマが挙げられる。動物の例として、マウスがある。腫瘍は、動物に腫瘍細胞を移植することにより作出することができる。通常、目的のポリペプチド、ＲＮＡ、または化合物の生産のためには、増殖の速い腫瘍種など、いずれの固形腫瘍種も使用できる。増殖の速い腫瘍種の例としては、Ｃ６ラット神経膠腫およびＨＣＴｌ１６ヒト結腸癌腫が挙げられる。通常、目的の抗体の生産のためには、比較的増殖の遅い腫瘍種が使用できる。増殖の遅い腫瘍種の例としては、ＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫およびＧＩ−１０１Ａヒト乳癌が挙げられる。Ｔ細胞非依存的な抗体生産に関しては、同種異系腫瘍または異種移植片を担持するｎｕ−／ｎｕ−マウスが使用でき、Ｔ細胞依存的抗体生産に関しては、同系腫瘍を有する免疫応答性マウスが使用できる。いくつかの態様では、生産する化合物がタンパク質である場合など、選択される微生物は、例えば、腫瘍細胞の翻訳成分を用いるウイルスなどの、腫瘍細胞の翻訳成分（例えば、タンパク質、小胞、基質）を用いる微生物であり得る。このような例では、腫瘍細胞種は、タンパク質分解、グリコシル化、脂質化(lipidylation)、ジスルフィド形成、および完成のために細胞成分を必要とし得る再折りたたみまたは多量体の構築を含む、タンパク質に対して行われる所望の翻訳後プロセシングに応じて選択することができる。いくつかの例では、この選択された腫瘍細胞種は発現されるタンパク質と同じ種であってよく、従って、このタンパク質の種特異的翻訳後プロセシングが起こり、一例としての腫瘍細胞種により発現されるタンパク質種はヒトである。
１．組換えタンパク質およびＲＮＡ分子の生産
腫瘍組織を動物から外科的に摘出することができる。腫瘍組織をホモジナイズした後、目的のポリペプチド、ＲＮＡまたはその他の生体化合物を確立された方法に従って精製することができる。例えば、組換えポリペプチドの場合、そのポリペプチドはｈｉｓタグなどの結合可能なタグを含んでもよく、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製することができる。動物の腫瘍におけるこのポリペプチドまたはＲＮＡの十分な量の集積に必要な時間は、例えば動物の種類または腫瘍の種類などの多くの因子によって異なり、当業者ならば慣例の実験によって決定することができる。一般に、目的のポリペプチドの発現はウイルス注入から２日後に検出することができる。発現は注射後約２週間をピークとし、最大２ヶ月持続する。いくつかの態様では、腫瘍における目的のポリペプチドまたはＲＮＡの量は、微生物により発現される検出可能な物質をモニタリングすることにより求めることができ、その検出可能な物質の濃度は、腫瘍における目的のポリペプチドまたはＲＮＡの量を反映することができる。
別の態様では、目的のポリペプチド、ＲＮＡまたはその他の化合物は被験体内で製造することができ、被験体に有益な作用をもたらす。一例では、微生物は、タンパク質もしくはＲＮＡ、または被験体によっては製造されない化合物を製造するタンパク質をコードし得る。一例では、微生物は、インスリン産生能を欠いているか、または血管系において高いインスリン濃度を必要とする被験体の血管系に放出可能な、インスリンなどのペプチドホルモンまたはサイトカインをコードし得る。別の例では、血友病などの血液凝固欠陥を有する被験体において、血液凝固因子を製造することができる。いくつかの態様では、腫瘍において生産するタンパク質またはＲＮＡを、高グルコース濃度によって誘導可能なプロモーターなどの誘導プロモーターに連結することができる。このような場合、このタンパク質またはＲＮＡの製造は被験体内の１以上の物質に応じて、または例えばＲＵ４８６などの転写を誘導できる化合物など、被験体に投与可能な１以上の物質により制御することができる。よって、いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、腫瘍を有する被験体に、有益な遺伝子産物または有益な化合物を製造し得る遺伝子産物をコードする１以上の遺伝子を発現し得る微生物を投与することを含み得る。
２．抗体の生産
また、目的の抗体を生産する方法であって、以下のステップ：（ａ）抗原をコードするヌクレオチド配列を含む微生物を担癌動物に投与すること；そして（ｂ）その動物から得た血清からその抗原に対する抗体を単離することを含む方法も提供される。この抗原に対する抗体は周知の方法に従って単離および精製され得る。特定の混入抗原（例えば、細菌抗原）に対する抗体は吸着により除去することができ、標的抗原に対する抗体は、アフィニティー精製、例えば、カラムのリガンドとして組換え抗原を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーによるなど、当技術分野で公知の方法によって混入抗体から分離することができる。抗体は１回の採取で動物から集めることもできるし、または、当技術分野で公知のように回収放血により経時的に集めることもできる。
Ｆ．医薬組成物、組合せおよびキット
本明細書では、本明細書で提供される微生物と１以上の成分を含む医薬組成物、組合せおよびキットが提供される。医薬組成物は、微生物と医薬担体を含み得る。組合せは、２種以上の微生物、微生物と検出可能な化合物、微生物と微生物発現調節化合物、微生物と治療化合物を含み得る。キットは、本明細書で提供される医薬組成物および／または組合せ、および使用説明書、被験体において微生物を検出するための装置、被験体に化合物を投与するための装置および被験体に化合物を投与するための装置などの１以上の成分を含み得る。
１．医薬組成物
また、本明細書では、修飾微生物と好適な医薬担体を含む医薬組成物が提供される。好適な医薬担体の例は当技術分野で公知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体は常法により調剤することができ、好適な用量で被験体に投与することができる。微生物の送達に使用できるコロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション（混合）、ミセル、リポソームおよびリポプレックスを含む脂質に基づく系が挙げられる。コロイド系の一例としてはリポソームがある。所望の組織だけに送達を達成するためには、器官特異的または細胞特異的リポソームが使用できる。リポソームの標的化は、当業者ならば一般に知られている方法を適用して行うことができる。この標的化は、受動的標的化（リポソームが洞様毛細血管を含む器官のＲＥＳの細胞に分布する自然の傾向を利用する）または能動的標的化（例えば、周知の方法によりリポソームと特定のリガンド、例えば、抗体、受容体、糖類、糖脂質、タンパク質などとを結合させることによる）を含む。これらの方法では、リポソームを、特異的細胞表面リガンドを介して特定の組織、例えば、腫瘍組織に標的化するためにモノクローナルを使用することができる。
２．宿主細胞
また、本明細書では、修飾ワクシニアウイルスなどの本明細書で提供される微生物を含む宿主細胞も提供される。これらの宿主細胞は、ワクシニアウイルスなどの微生物感染に感受性のある組織様々な哺乳類、鳥類および昆虫細胞および組織のいずれもを含み、ニワトリ胚、ウサギ、ハムスターおよびサル腎細胞、例えば、ＣＶ−１、ＢＳＣ４０、Ｖｅｒｏ、ＢＳＣ４０およびＢＳＣ−１、およびヒトＨｅＬａ細胞が挙げられる。これらの宿主細胞を形質転換する方法、形質転換体を表現型により選択する方法などは当技術分野で公知である。
３．組合せ
組合せとしては、微生物と１以上の成分を含み得る。本明細書ではまた、組合せはいずれも、微生物の代わりに、微生物と１以上の成分を含む医薬組成物および／または宿主細胞も含み得る。
組合せの例としては、２種以上の微生物、微生物と検出可能な化合物、微生物と微生物発現調節化合物、または微生物と治療化合物が挙げられる。２種以上の微生物を含む組合せは、例えば、本明細書で提供される方法を実施する上で、２種の微生物の逐次投与を含む、両者とも被験体に投与できる２種以上の微生物を含み得る。一例では、組合せはウイルスと細菌を含んでもよく、その場合、例えば、まずウイルスを被験体に投与し、次に細菌を被験体に投与することができる。
本明細書で提供される組合せは、微生物と検出可能な化合物を含み得る。検出可能な化合物は、リガンドもしくは基質、または微生物により発現されるタンパク質もしくはＲＮＡ分子と相互作用することができ、かつ／または特異的に結合することができ、さらに、断層撮影技術、分光光度技術または磁気共鳴技術により検出可能なシグナルなどの、検出可能なシグナルをもたらすことができる他の化合物を含み得る。検出可能な化合物の例としては、放射性核種を含む磁気共鳴、超音波または断層撮影法造影剤などの造影剤であり得るか、またはそれを含み得る。検出可能な化合物は、本明細書の他所で示されている化合物、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々な化合物のいずれを含んでもよい。一般に、本明細書で提供される組合せにおいて微生物とともに含まれる検出可能な化合物は、基質、リガンドであるか、またはそうでなければその微生物によりコードされているタンパク質またはＲＮＡと特異的に相互作用することができる化合物であり、いくつかの例では、このタンパク質またはＲＮＡは外因性のタンパク質またはＲＮＡである。微生物／検出可能な化合物の例としては、ルシフェラーゼ／ルシフェリン、β−ガラクトシダーゼ／（４，７，１０−トリ（酢酸）−１−（２−β−ガラクトピラノシルエトキシ）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン）ガドリニウム（Ｅｇａｄ）、および当技術分野で公知の他の組合せをコードする微生物が挙げられる。
本明細書で提供される組合せは、微生物と微生物遺伝子発現調節化合物を含み得る。遺伝子発現を調節する化合物は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、転写アクチベーター、インデューサー、転写サプレッサー、ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、およびＲＮＡ結合化合物（ｓｉＲＮＡまたはリボザイムなど）が挙げられる。当技術分野で公知の様々な遺伝子発現調節化合物はいずれも、本明細書で提供される組合せに含めることができる。一般に、本明細書で提供される組合せにおいて微生物とともに含まれる遺伝子発現調節化合物は、その組合せの微生物の、転写因子またはＲＮＡなどの遺伝子発現において活性な１以上の化合物と結合する、それを阻害する、またはそれと反応することができる化合物である。微生物／発現モジュレーターの例としては、酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインと、また単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインと融合された突然変異ヒトプロゲステロン受容体を有し、また、アデノウイルス主要後期Ｅ１Ｂ ＴＡＴＡボックスの上流に一連のＧＡＬ４認識配列を含む合成プロモーターも含む、キメラ転写因子複合体をコードする微生物であってもよく、この場合、化合物はＲＵ４８６である（例えば、Yu et al., Mol Genet Genomics 2002 268:169−178参照）。当技術分野で公知の様々な他の微生物／発現モジュレーターの組合せも、本明細書で提供される組合せに含めることができる。
本明細書で提供される組合せは、微生物と治療化合物を含み得る。治療化合物としては、微生物により発現される酵素の基質となる化合物、微生物を死滅させるか、または微生物の増殖もしくは毒性を阻害し得る化合物、あるいは本明細書で提供されるか、または当技術分野で微生物とともに働くことが知られている他の治療化合物を含み得る。一般に、本明細書で提供される組合せにおいて微生物とともに含まれる治療化合物は、その微生物によりコードされている酵素の基質、またはその組合せの微生物に対して有効であることが知られている抗微生物薬など、微生物とともに働き得る化合物である。微生物／治療化合物の組合せの例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル、および化膿連鎖球菌／ペニシリンをコードする微生物を含み得る。本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々な既知の組合せはいずれも、本明細書で提供される組合せに含めることができる。
４．キット
キットは、所望により、他の試薬または装置、使用説明書を含み得る組合せでパッケージングされる。本明細書で提供されるキットはいずれも、微生物の代わりに、微生物および／または組合せと１以上の成分を含む医薬組成物、宿主細胞を含み得る。
キットの例としては、本明細書で提供される微生物を含んでよく、さらに所望により使用説明書、被験体において微生物を検出するための装置、被験体に化合物を投与するための装置および被験体に化合物を投与するための装置などの１以上の成分を含み得る。
一例では、キットは説明書を含み得る。説明書は一般に、微生物および所望によりキットに含まれている他の成分、微生物の投与に関する被験体の適切な状態、適切な用量、および適切な投与法を決定するための方法を含む投与方法を記載した有形の表現を含む。説明書はまた、処置期間にわたって被験体をモニタリングするための指針も含み得る。
別の例では、キットは、被験体において微生物を検出するための装置を含み得る。被験体において微生物を検出するための装置は、例えばルシフェラーゼから発せられたもの、または緑色蛍光タンパク質からの蛍光などの光を検出するための低照度画像装置、ＭＲＩまたはＮＭＲ装置などの磁気共鳴測定装置、ＰＥＴ、ＣＴ、ＣＡＴ、ＳＰＥＣＴまたはその他の関連スキャナーなどの断層撮影スキャナー、超音波装置、または被験体内の微生物により発現されたタンパク質を検出するのに使用できるその他の装置を含み得る。一般に、このキットの装置は、キットの微生物により発現された１以上のタンパク質を検出することができる。例えば、ルシフェラーゼを発現する微生物と低照度画像装置、または緑色蛍光タンパク質を発現する微生物と低照度画像装置など、微生物と検出装置を含む様々なキットはいずれも、本明細書で提供されるキットに含めることができる。
本明細書で提供されるキットはまた、被験体に微生物を投与す当技術分野で公知のるための装置も含み得る。薬物またはワクチンを投与するための様々な装置はいずれも、本明細書で提供されるキットに含めることができる。装置の例としては、皮下針、静脈針、カテーテル、無針注射装置、吸入器、および点眼瓶などの液体分注器が挙げられる。一般に、キットの微生物を投与するための装置は、そのキットの微生物に適合性のあるものであり、例えば、高圧注射装置などの無針注射装置は、高圧注射によって損傷を受けない微生物とともにキットに含めることができるが、高圧注射によって損傷を受ける微生物とともには、一般に、キットに含めない。
本明細書で提供されるキットはまた、被験体に化合物を投与するための装置も含み得る。被験体に薬物を投与するための、当技術分野で公知の様々な装置はいずれも、本明細書で提供されるキットに含めることができる。装置の例としては、皮下針、静脈針、カテーテル、無針注射装置、吸入器、および液体分注器が挙げられる。一般に、キットの化合物を投与するための装置は化合物の所望の投与法と適合している。例えば、皮下送達される化合物を皮下針およびシリンジとともにキットに含めることができる。
Ｇ．実施例
以下の実施例は単に説明のために示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
組換えウイルスの作製
ＶＧＬと呼ばれる、野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ）ＬＩＶＰ株（the Lister Institute of Viral Preparations, Moscow, Russia由来、もとはＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１５４９のＬｉｓｔｅｒ株の弱毒により誘導された周知のウイルス株；Al’tshtein et al., (1983) Dokl. Akad. Nauk USSR 285:696−699参照）を、本明細書でＲＶＧＬＸと称する組換えウイルスの構築のための親ウイルスとして用いた。全てのワクシニアウイルスを、スクロース勾配(Yoklik)を用いて精製した。ＶＶを増殖させ、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−７０）を用いたプラークアッセイにより力価を求めた。組換えワクシニアウイルスを構築するための方法は当業者に公知である（例えば、Chakrabarti et al., 1985 Mol. Cell Biol. 5:3403および米国特許第４，７２２，８４８号参照）。表１は本実施例に記載の組換えＶＶ株をまとめたものである。
ＰＵＶ処置によるＶＶの不活性化
ＬＩＶＰ ＶＶ（３×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を１μｇ／ｍｌのプソラレン(Calbiochem, La Jolla, CA)とともにインキュベートし、ハンクのバッファー中、室温にて１０分間懸濁させた後、３６５ｎｍの長波長ＵＶ真空管５本を備えたＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００ ＵＶ架橋装置(Stratagent, La Jolla CA)内で５分間照射してＰＵＶ−ＶＶを作出した。
ＲＶＧＬ８：ＬＩＶＰのＦ３へのＬａｃＺの挿入
ｌａｃＺ遺伝子が挿入されたＮｏｔＩ部位を含む組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ８の構築は、Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31, 534−540に記載の通りに行った。要するに、これは次のようにして作製した。ワクシニアｐ７．５プロモーターと強力な合成ワクシニアｐＥ／Ｌプロモーターの制御下にｌａｃＺ遺伝子を含む、ｐＳＣ６５（Chakrabarti et al. (1997), BioTechniques 23, 1094−1097参照；また、Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley−Interscience Supplement 15:16.17.2 (1992)も参照；また、本明細書の配列番号５およびＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／３２６４６の配列番号５７も参照）のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ断片（３２９３ｂｐ）を、制限酵素消化により単離し、クレノウ酵素で平滑末端とし、ｐＮＴ８プラスミド(Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31: 534−540)のＳｍａＩ部位にクローニングし、シャトルプラスミドｐＮＺ２を作出した。
ｐＮＴ８を構築するため、鋳型としてのＶＶとともに次のプライマー：
フォワード：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号３）；
リバース：５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＴＧＣＧＧＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号４）
を用いて、野生型ＶＶ ＬＩＶＰ株のＮｏｔＩ領域を増幅した。得られた９７２ｂｐ断片は、５’末端と３’末端にそれぞれフランキングＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいた。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ２８(Benes et al., (1993) Gene 130: 151)に挿入した。プラスミドｐＵＣ２８はｐＵＣ１８（ＡＴＣＣから受託番号３７２５３として入手可能）から、プライマー：
ｐＵＣ２８ Ｉ：５’ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴ３’（配列番号６）；
ｐＵＣ２８ ＩＩ：３’ＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＴＡＧＣＴＡＣ５’（配列番号７）
を用い、合成オリゴアダプターをｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＳｓｔＩ部位に導入することにより作製する。これはｐＵＣ１８のポリリンカーにＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、およびＮｃｏＩ部位を導入する。
プラスミドｐＮＺ２は、プラスミドｐＳＣ６５（Chakrabarti et al. (1997), BioTechniques 23, 1094 1097参照；また、Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley−Interscience Supplement 15:16.17.2 (1992)も参照；また、本明細書の配列番号５およびＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／３２６４６の配列番号５７も参照）に由来するワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐ７．５および合成初期／後期ワクシニアｐＥ／Ｌプロモーターの制御下に大腸菌ｌａｃＺ遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む。プラスミドｐＮＺ２は、ＶＧＬウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５４９）のＮｏｔＩ部位へのｌａｃＺの相同組換えをもたらし、ＲＶＧＬ８と呼ばれる組換えワクシニアウイルスを作出する。ＮｏｔＩで消化した野生型ワクシニアウイルスＤＮＡと消化しないプラスミドＤＮＡ ｐＮＺ２の複合体を、インビボ組換えのため、ＰＵＶ ＶＶ感染細胞にトランスフェクトし、ＲＶＧＬ８を作出した（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。本明細書に記載されているＲＶＧＬ８およびその他の組換えワクシニアウイルスを下表１に一覧化する。
突然変異ウイルスの形成／トランスフェクション
６０ｍｍディッシュ(Corning, Corning, NY, USA)で増殖させたＣＶ−１アフリカミドリザル腎繊維芽細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−７０）を多重感染度（ＭＯＩ）１でＰＵＶ−ＶＶ（プソラレンおよびＵＶで処理したＬＩＶＰ株；例えば、Tsung et al. (1996), J. Virol. 70, 165−171; Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31, 534−540; Timiryasova et al. (2001), J. Gene 3 Med. 3, 468−477参照）に感染させた。
感染２時間後、それらの細胞を、ＮｏｔＩで消化したウイルスＤＮＡ（４μｇ）と完全なプラスミドＤＮＡ（４μｇ）の混合物でトランスフェクトした。細胞の脂質媒介トランスフェクションを、ＤＮＡ１μｇ当たり５μｌのＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ試薬(Gene Therapy Systems, San Diego, CA, USA)を製造業者の説明書に従って用いて行った。細胞をトランスフェクション混合物中で４時間インキュベートした後、２０％のウシ胎児血清を含有する培地を添加した。細胞変性効果を光学顕微鏡により毎日モニタリングした。細胞を、ウイルスプラークが形成し、完全な細胞変性効果が生じるまで５〜７日間インキュベートした。次に、感染細胞を採取し、０．５ｍｌの培地に再懸濁させ、凍結および解凍を３回行ってウイルスを放出させた。小規模および大規模組換えウイルス保存株を作製するために単一のウイルスプラークを選択し、それらの遺伝子の挿入および発現に関して分析した。
突然変異体の確認
ウイルスＤＮＡをサザンブロットにより分析した。要するに、ウイルスＤＮＡを単離するため、１０ｃｍプレートで増殖させたＣＶ−１細胞の密集単層を野生型ＶＶ（ＬＩＶＰ株）または単一の組換えプラークから得られたウイルス保存株のＶＶに感染させた。細胞変性効果が完全となったとき、細胞を採取し、そのペレットを３ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ９．０に再懸濁させた。ウイルス粒子を溶解させ、プロテイナーゼＫで処理し、ウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により単離した。このＤＮＡを１００μ１の無菌水に再懸濁させた。このウイルスＤＮＡサンプルを３７℃で一晩、ＮｏｔＩで消化した後、フェノール−クロロホルム処理を行い、沈殿させ、そして１０μｇのＤＮＡサンプルを０．８％アガロースゲルで分離した。このＤＮＡを、正電荷を有するナイロン膜(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)に移し、ＧＳジーンリンカー(Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用いてこの膜に固定した。ＤＮＡのＤＩＧ標識は非放射性ＤＮＡ標識および検出キット(Roche Diagnostics Corporation)を用い、６０分間３７℃でインキュベートすることで行った。このメンブランを、ｌａｃＺ遺伝子をコードするプラスミドｐＮＺ２の変性ＤＩＧ標識３３５７ｂｐ ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション条件およびブロットの展開は製造業者が示しているように行った。
このバンドの推定サイズは３３５７ｂｐである。ＮｏｔＩで消化したウイルスＤＮＡと３３５７ｂｐ ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより、ｌａｃＺ遺伝子の、ウイルスゲノムのＮｏｔＩ部位への組み込みを確認した。
単一のＴＫ遺伝子突然変異を有するＲＶＧＬ２およびＲＶＧＬ２３ウイルスの構築
組換えウイルスＲＶＧＬ２の構築には、ワクシニアウイルスＬＩＶＰを用いた。組換えウイルスＲＶＧＬ２３の構築には、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）を用いた。ウミシイタケルシフェラーゼとオワンクラゲＧＦＰの融合物のｃＤＮＡ（ｒｕｃ−ｇｆｐ；１７８８ｂｐ；Wang et al., (1996) Bioluminescence Chemiluminescence 9:419−422; Wang et al., (2002) Mol. Genet. Genomics 268:160−168; Wang et al. (1997) pp 419−422 in Bioluminescence and Chemiluminescence: molecular reporting with photons, Hastings et al., eds., Wiley, Chicheser UK；また、米国特許第５，９７６，７９６号も参照；また、ｒｕｃ−ｇｆｐ構築物の配列を示す本明細書の配列番号８も参照）を、制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩにより、Wang et al., (1996) Bioluminescence Chemiluminescence 9:419−422およびWang et al., (2002) Mol. Genet. Genomics 268:160−168ならびに以下に簡単に記載されているプラスミドｐｃＤＮＡ−ｒｕｃ−ｇｆｐ（ＲＧ）から切り出し、そしてｐＳＣ６５プラスミドのＳｍａＩ部位（配列番号５参照；また、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／３２６４６の配列番号５７も参照）に挿入し、ｐＳＣ６５−ＲＧ−１プラスミドＤＮＡを得た。
要するに、ｐｃＤＮＡ−ｒｕｃ−ｇｆｐを作製するために、修飾ウミシイタケルシフェラーゼコードＤＮＡをコードするＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（Wang et al. (1997) pp 419−422 in Bioluminescence and Chemiluminescence: molecular reporting with photons, Hastings et al., eds., Wiley, Chicheser UK）を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にクローニングし、ウミシイタケルシフェラーゼの発現をＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。ウミシイタケルシフェラーゼＯＲＦの末端の停止コドンを除去し、得られたプラスミドをＮｏｔＩで消化した。ヒト化オワンクラゲＧＦＰをコードするＯＲＦを含むＮｏｔＩ断片(Zolotukhin et al., (1996) J. Virol. 70:4646−4654)をｐＴＲ−β−アクチンプラスミドから切り出し、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするプラスミドのＮｏｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ−ｒｕｃ−ｔｈｅ ｒｕｃ−ｇｆｐと称した。
ワクシニアＰＥ／Ｌプロモーターの制御下にｒｕｃ−ｇｆｐ融合物、およびＶＶのｐ７．５プロモーターの制御下に大腸菌β−ガラクトシダーゼを含む新たなプラスミドｐＳＣ６５−ＲＧ−１を、単一のＴＫ遺伝子によって分断されたＬＩＶＰ株のＲＶＧＬ２およびＷＲ株のＲＶＧＬ２３ウイルスの構築に用いた。ＣＶ−１細胞に、ＭＯＩ ０．１でｗｔ ＬＩＶＰまたはｗｔ ＷＲウイルスを感染させ、２時間後、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche)を用いてｐＳＣ６５−ＲＧ−１プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。インキュベーション２４時間後、細胞を３回凍結および解凍してウイルスを放出させた。組換えウイルスを、ＣＶ−細胞上、基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄピラノシド（Ｘ−ｇａｌ，Stratagene, Cedar Creek, TX, USA）の存在下でスクリーニングした。４回のウイルス純化の後、全てのウイルスプラークがβ−ガラクトシダーゼ発現に関して陽性であった。ｒｕｃ−ｇｆｐ融合タンパク質の発現は、それぞれ発光アッセイおよび蛍光顕微鏡により確認した。ウイルスの概略地図を図１Ｂに示した。
単一の遺伝子突然変異を有するＲＶＧＬ５およびＲＶＧＬ９ウイルスの構築
組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ５は、ワクシニアゲノムのＨＡ遺伝子に挿入されたワクシニア後期ｐ１１プロモーターの制御下のｌａｃＺ遺伝子を含む(Timiryasova et al. (1993) Mol Biol 27:392−402；また、Timiryasova et al., (1992) Oncol. Res 11:133−144も参照)。組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ９は、ＶＶゲノムのＦ３遺伝子に挿入された合成初期／後期ワクシニアプロモーター（ＰＥ／Ｌ）の制御下のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｒｕｃ）と緑色蛍光タンパク質のｃＤＮＡ（ｇｆｐ）の融合物を含む(Timiryasova et al., (2000) pp. 457−459 in Proceedings of the 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Case et al., eds)。ＲＶＧＰ５およびＲＶＧＬＰ９は、ＲＶＧＬＰ２およびＲＶＧＬＰ２３に関して記載した通りに構築した。
ＴＫおよびＦ３遺伝子の二重突然変異を有するＲＶＧＬ２０ウイルスの構築
ポリＡ配列を有するヒトトランスフェリン受容体（ｈＴＲ）（２８００ｂｐ）のｃＤＮＡをＢａｍＨＩによりｐＣＤＴＲ１プラスミド（ＡＴＣＣ受託番号５９３２４および５９３２５）を単離し、クレノウで処理し、ｐＳＣ６５プラスミド（本明細書の配列番号５およびＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／３２６４６の配列番号５７参照）のＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＳＣ−ＴｆＲおよびｐＳＣ−ｒＴｆＲを得た。プラスミドｐＳＣ−ｒＴｆＲは、ワクシニアＰＥ／Ｌプロモーターと反対の方向にｃＤＮＡ ｈＴＲ、およびワクシニアＴＫ遺伝子への挿入のためのワクシニア配列よりフランキングされた初期／後期ワクシニアｐ７．５プロモーターの制御下に大腸菌β−ガラクトシダーゼを含む。ＲＶＧＬ２０ウイルスの構築には、ｐＳＣ−ｒＴｆＲを用いた。Ｆ３遺伝子座にｒｕｃ−ｇｆｐ融合物を含み、単一の欠損を有する組換えウイルスＲＶＧＬ９は、ＬＩＶＰ株においてユニークなＮｏｔＩ部位を含むものであり（上記参照、また、Timiryasova et al., (2000) pp. 457−459 in Proceedings of the 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Case et al., edsも参照）、上記のような相同組換によりＲＶＧＬ２０ウイルスの作出のための親ウイルスとして用いた。ＲＶＧＬ２０ウイルスの概略は図１Ｂに示されている。
ＴＫ、Ｆ３およびＨＡ遺伝子の突然変異を有するＲＶＧＬ２１ウイルスの構築
大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）のｃＤＮＡ（１８７９ｂｐ）を、ＸｂａＩ（クレノウ断片で平滑末端化）およびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＬａｃＧｕｓプラスミド（Invitrogen；本明細書の配列番号９参照）から遊離させ、ＸｈｏＩ（クレノウで処理）およびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＣ１１プラスミドｐＳＣ６５(Chakrabarti et al.(1985) Mol. Cell Biol. 5:3403−3409；本明細書の配列番号５およびＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／３２６４６の配列番号５７参照)の、ワクシニアｐ１１後期プロモーターの制御下にクローニングし、プラスミドｐＳＣ−ＧＵＳを得た。ｐＳＣ−ＧＵＳプラスミド由来のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ワクシニアの血球凝集素遺伝子へ抗原遺伝子を挿入するためのベクターであるｐＶＹ６プラスミド（例えば、Flexner et al., (1988) Nature 355:259−262; Flexner et al., (1988) Virology 166: 339−349参照；また、米国特許第５，７１８，９０２号も参照）をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化したものに挿入し、ｐＶＹ−ＧＵＳプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＶＹ−ＧＵＳプラスミドと呼び、血球凝集素（ＨＡ）遺伝子への挿入のためのワクシニア配列によりフランキングされた、ワクシニア後期プロモーターｐ１１の制御下にｇｕｓをコードするｃＤＮＡを含む。二重の欠損を有する組換えウイルスＲＶＧＬ２０を、ＲＶＧＬ２１ウイルスの構築のための親ウイルスとして用いた。ＣＶ−１細胞に、ＭＯＩ ０．１でＲＶＧＬ２０ウイルスを感染させた。感染２時間後、細胞を、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬(Roche)を用いて、ｐＶＹ−ＧＵＳプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。組換えウイルスプラークを、ＣＶ−１細胞において、寒天培地にβ−グルクロニダーゼ基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＡ）(Research Products Int. Co., Mt. Prospect, IL, USA)を添加した際の色をスクリーニングすることで選択した。Ｘ−ＧｌｃＡの存在下、寒天培地で８回の純化を行った後、純粋な組換えウイルスＲＶＧＬ２１が選択された。ＲＶＧＬ２１ウイルスはＴＫ、Ｆ３およびＨＡ遺伝子に分断を有しており、図１Ｂに概略が示されている。
インビトロウイルス増殖
ＣＶ−１、Ｃ６（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１０７）、Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−６４７５）、およびＧＩ−１０１Ａ(Rumbaugh−Goodwin Institute for Cancer Research Inc. Plantation, FL；米国特許第５，６９３，５３３号)細胞を２４ウェルプレートに、それぞれ１×１０５、２×１０５、４×１０５、および２×１０５細胞／ウェルで播種した。翌日、これらの細胞に同時に０．００１または０．０１ＰＦＵ／細胞の野生型ＬＩＶＰおよびその突然変異株を感染させた。このウイルス懸濁液を細胞単層（０．１５ｍｌ／ウェル）に加え、３７℃で１時間、１０分ごとに軽く振盪しながらインキュベートした。次に、ウイルスを取り出し、適当な完全増殖培地を加え（１ｍｌ／ウェル）、その後、３７℃にてウイルス感染後２４、４８、７２および９６時間インキュベートした。休止細胞培養物を確立するため、ＣＶ−１細胞の密集単層を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃で６日間インキュベートした。これらの休止細胞を感染させ、上記のような感染後同じ時点で採取した。感染細胞からウイルスを凍結および解凍１回で放出させた。ウイルス力価はＣＶ−１細胞に対するプラークアッセイにより２回測定し、ＰＦＵ／ｍｌで表した。
表１
組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）の一覧
Figure 2009201515
Figure 2009201515
（実施例２）
ウイルスレベルのインビトロ分析
ＬａｃＺ
組換えワクシニアウイルスにより誘導されたｌａｃＺ発現の分析は従前に記載されている通りに行った(Timiryasova et al. (2001), BioTechniques 31, 534−540)。要するに、６ウェルプレート(Corning, Corning, NY, USA)で増殖させたＣＶ−１細胞にウイルス原液の１０倍希釈液を感染させた。このウイルスを３７℃で１時間、時々揺動しながら吸収させた。次に、このウイルス接種物を、１％の寒天を含む完全培地に置き換え、４８時間インキュベーションを行った。ウイルスプラークを可視化するため、１ｍｌ当たり３００μｇのＸ−Ｇａｌ(Molcular Probes, Eugene, Oregon, USA)と０．１％のニュートラルレッド(Sigma, St. Louis, MO, USA)を第２の寒天上層に加え、プラークを計数し、３７℃で１２時間インキュベートした後に単離した。インビトロ細胞におけるワクシニアウイルスのレベルはまた、細胞のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を測定することによっても求めることができる。
プラーク形成単位によって測定されるＶＶのインビトロ感染力
ｗｔ ＬＩＶＰウイルスおよびその突然変異株の感染および複製能を、３種類の腫瘍細胞系統（Ｃ６、ＧＩ−１０１Ａ、Ｂ１６−Ｆ１０）で分裂ＣＶ−１細胞および休止ＣＶ−１細胞について分析した。これらの結果は、ワクシニア突然変異株が、ＭＯＩ ０．００１で、分裂ＣＶ−１細胞に効率的に感染および複製することを示す。分裂ＣＶ−１細胞からは、有意な収量のワクシニアウイルスが得られた。分裂ＣＶ−１細胞におけるＶＶおよびその突然変異株の収量は、休止ＣＶ−１細胞の場合よりも約１０倍高かった。インビトロ研究においてワクシニア突然変異株とｗｔウイルスの間のウイルス回収については有意な違いはなかった。分裂ＣＶ−１細胞においては、ＴＫ、Ｆ３およびＨＡ遺伝子の分断はＶＶ突然変異株の複製に差をもたらすことはなかった。３種類の腫瘍細胞を試験した。ＭＯＩ ０．００１での細胞変性効果に対する相対的感受性は次の通りであった：ＣＶ−１（分裂、最高）、ＣＶ−１（休止）、Ｃ６、ＧＩ−１０１Ａ、Ｂ１６−Ｆ１０（最低）。マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞はＭＯＩ ０．００１でのウイルス感染に感受性がなかった。ＭＯＩ ０．０１で感染した黒色腫細胞からは極めて低いウイルス力価が回収された。また、ＷＲ株はインビトロで黒色腫細胞にＬＩＶＰ株よりも効率的に感染することができ、ウイルス回収率もＬＩＶＰ株よりも高かったことも認められた。
（実施例３）
動物モデルおよびアッセイ
動物モデル
動物試験には６〜８週齢の無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）およびＣ５７ＢＬ／６マウス（Harlan Animal Res., Inc., Wilmington, MA）を用いた。各５匹または４匹のマウス群に０．１ｍｌ量の静注にて１０７ＰＦＵのＶＶを静脈感染させた。マウスを、ｒｕｃおよびｇｆｐの発現に関してそれぞれ低照度画像装置および蛍光画像装置で画像化した。この研究は開始に先だって、the Animal Research Committee of LAB Research International Inc. (San Diego, CA, USA)の承認を得た。動物の取り扱いは、LAB Research International Inc. (San Diego, CA, USA)の免許獣医の指示のもとで行った。
神経膠腫モデル
皮下神経膠腫腫瘍を確立するため、ラット神経膠腫Ｃ６細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１０７）をトリプシン処理により採集し、６〜８週齢の雄無胸腺マウスの右後脚に５×１０５細胞／０．１ｍｌ／マウスを皮下注射（ｓ．ｃ．）した。Ｃ６細胞移植後７日目、腫瘍サイズ中央値が約１５０ｍｍ３になった際に、１０７ＰＦＵ／０．１ｍｌ／マウスの用量のウイルスを静注（ｉ．ｖ．）した。ウイルス注射後１４日目にマウスを殺した。ＲＶＧＬ９ウイルスを用いた動態研究では、ウイルス注射後２０分、１時間、４時間、１８時間、３６時間、３日、５日、７日および１４日目にマウスを殺した。
乳癌モデル
皮下（ｓ．ｃ）乳癌を発達させるため、ヒト乳癌ＧＩ−１０１Ａ細胞(Rumbaugh−Goodwin Institute for Cancer Research Inc. Plantation, FL；米国特許第５，６９３，５３３号)を５×１０６細胞／０．１ｍｌ／マウスの用量で、６〜８週齢の雌無胸腺マウスの右後脚に皮下注射した。ＧＩ−１０１Ａ細胞の移植後３０日目、腫瘍サイズ中央値が約５００ｍｍ３になった際に、１０７ＰＦＵ／マウスの用量のウイルスを静注した。ウイルス注射後１４日目にマウスを殺した。生存実験および乳癌治療研究用のマウスは長期間（ウイルス注射後１００日以上）維持した。約４０００ｍｍ３の大きさの腫瘍を発達させた、かつ／または体重が５０％減のマウスを殺した。
黒色腫モデル
黒色腫モデルに関しては、２×１０５細胞／０．０４ｍｌ／マウスの用量のマウス黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−６４７５）を、６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠に注射した。細胞移植後１８日目、腫瘍が確立された際（腫瘍サイズ中央値約１００ｍｍ３）に、１０７／マウスの用量のウイルスを静注した。マウスはウイルス注射後１０日目に殺した。
動物モデルにおけるワクシニアウイルス
ヌードマウスの腫瘍および器官からのワクシニアウイルスの回収
殺した動物から血液を採集し、器官（肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、卵巣、膀胱、脳、心臓）および腫瘍を採取し、プロテアーゼインヒビターの混合物を含むＰＢＳ中でホモジナイズした。器官の解剖または切開ごとに鋏と鉗子を交換し、組織の交差混入がないようにした。サンプルを凍結および解凍し、１，０００ｇで５分間遠心分離した。ウイルス力価を、ＣＶ−１細胞に対し、血清フリー培地で希釈した上清において、プラークアッセイおよび４８時間インキュベーション後、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレット溶液でのそれらの染色により求めた。各サンプルを２回ずつアッセイし、ウイルス力価を平均ＰＦＵ／ｇ組織として表した。
アッセイの測定
皮下ヒト乳癌を担持する６週齢のヌードマウスで生存研究を行った。マウスに１０７のワクシニアウイルスを静注し、生存を追跡した。１週間に２回、個々の体重を測定した。ウイルス感染後の体重の増／減をパーセンテージとして算出した：（ウイルス注射日の体重（ｇ）−腫瘍重（ｇ）／モニタリング日の体重（ｇ）−腫瘍重（ｇ））×１００％。安楽死させた動物から脾臓を摘出し、秤量した。ＲＳＷは次のように算出した：ＲＳＷ＝脾臓の重量（ｇ）×１０４／動物体重（ｇ）−腫瘍重（ｇ）。平均腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達するか、または疾病の兆候が現れた際にマウスを安楽死させた。the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従い、人道的に急速ＣＯ２安楽死を行った。
レポーター遺伝子アッセイ
ＬａｃＺ
マウスの組織サンプルおよび血清中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性を、製造業者の説明書に従い、化学発光ガラクト−ライトプラス（商標）アッセイ系(Applied Biosystems, Bedford, MA, USA)を用いて測定した。要するに、１〜２０μｌのサンプルを、１：１００希釈した反応バッファー希釈液２００μｌを含む試験管に移し、室温で３０分間インキュベートした。サンプルの入ったこの試験管に３００μ１アリコートの促進剤（−ＩＩ）を加え、手早く混合し、照度計を用いてシグナルを読みとった。β−ガラクトシダーゼ活性を組織１ｇ当たりの相対発光量(relative light units)（ＲＬＵ）として表した。精製大腸菌β−ガラクトシダーゼ(Sigma)を陽性対照として用い、標準曲線を作製した。
ルシフェラーゼ
ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、従前に記載されているもの(Yu and Szalay, 2002)を若干改変し、Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ ２０ｅ照度計(Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA)を用いてホモジナイズした後の組織サンプルの上清において測定した。要するに、２０μｌのサンプルを、基質コエレントラジンを含む５００μｌのルシフェラーゼアッセイバッファー（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．４）に加えた。ルシフェラーゼ活性は１０秒間隔で測定し、組織１ｇ当たりのＲＬＵとして表した。
アッセイ結果
ワクシニアウイルスＲＶＧＬ８の腫瘍選択的複製
６匹のマウス由来の腫瘍サンプルおよび種々の器官、ならびに正常器官からのｗｔ ＬＩＶＰ（ＶＧＬ）およびＲＶＧＬ８の回収。ＶＧＬは腫瘍、精巣、膀胱、および肝臓、ならびに脳から回収された。しかしながら、組換えウイルスＲＶＧＬ８はほぼ腫瘍だけに見られ（マウス＃２４では、精巣、膀胱および肝臓に、マウス＃２２では、精巣にウイルスが見られた）、６匹の供試動物の脳組織からはウイルスは回収されなかった。この知見は、ＮｏｔＩ部位の分断を有するＲＶＧＬ８の安全性を証明するものである。
経時的なＲＶＧＬ９の存在
単一のＦ３遺伝子突然変異を有し、ｒｕｃ−ｇｆｐを担持するワクシニアウイルスＲＶＧＬ９を用い、皮下神経膠腫を有する免疫抑制無胸腺マウスに静脈投与した後のベクターの組織分布パターンを評価した。この組換えウイルスを用いた組織分布データは、このＶＶ株によるウイルス分布と腫瘍ターゲッティングを示した。ｒｕｃおよびｇｆｐの発現に基づくマウスにおけるウイルス複製の非侵襲的画像化により、動態研究を行った。皮下ラット神経膠腫Ｃ６を担持する各群４〜５匹の動物に、尾の静脈から１０７のＲＶＧＬ９ウイルスを注射した。ウイルス注射後２０分、１時間、４時間、１８時間および３６時間、３日、５日および１４日で動物を殺した。ウイルス静注後のいずれの時点でも、脳、膀胱または精巣から活性のあるウイルス粒子は回収されなかった。ウイルス注射後初期の時点では、脾臓、心臓および肺からいくらかのウイルス粒子が回収された。感染１８時間後、これらの器官のＲＶＧＬ９ウイルスの力価は低下した。１８時間後、心臓組織においてウイルスは回収されず、脾臓および肺からは、ウイルス注射後それぞれ３２２１．０および３５２１．９ＰＦＵ／ｇ組織が回収されたのに対し、１４日目では、それぞれ１５６．５および４４ＰＦＵ／ｇ組織前後が回収された。肝臓および腎臓からのウイルス回収のパターンは、脾臓、心臓、または肺のパターンとは異なっていた。ウイルス注射後の初期の時点で、腎臓にウイルスはなく、肝臓からは１７４．９ＰＦＵ／ｇ組織のウイルスが回収された。ウイルス注射後５日目では、これらの器官のウイルス力価は上昇し、ウイルス注射後１４日目で低下した。腫瘍組織では、ウイルスの検出はウイルス投与（１．６×１０３ＰＦＵ／ｇ組織）１８時間後に始まり、観測中経時的に劇的に増加した（７日目では１．８×１０８ＰＦＵ／ｇ組織）。腫瘍組織のウイルスは、１回のウイルス静注の後、６０日以上検出可能であった。これらの結果は、これらのワクシニア突然変異株の腫瘍特異的複製を証明するものである。ウイルス回収と腫瘍および器官における導入遺伝子の発現との間には相関が認められた。ＲＶＧＬ９ウイルス動態のデータをもとに、黒色腫および神経膠腫および乳癌モデルにおける種々のワクシニア突然変異株の組織分布研究にはそれぞれ１０日または１４日を用いた。
神経膠腫を担持するマウスにおける種々のＶＶの存在
皮下神経膠腫を担持する免疫不全マウスにおいてワクシニアウイルスの組織分布を調べるため、Ｃ６ラット神経膠腫細胞移植後７日目に、ウイルスを１×１０７ＰＦＵ／０．１ｍｌ／マウスの用量で静注した。ウイルス注射後１４日目にマウスを殺し、種々の組織でウイルス力価を測定した。ｗｔ ＷＲウイルスを注射したマウスはウイルスの病原性のために病状を示し、死に至った。従って、ＷＲを注射したマウスはウイルス注射後７日目に殺した。野生型ＬＩＶＰウイルスは脳からだけでなく、分析した全ての組織から回収された。ｗｔ ＬＩＶＰを注射したマウスから回収されたウイルス粒子の量は、ＶＶのｗｔ ＷＲ株の場合よりもはるかに少なかった。これらの結果を表１Ａに示す。
表１Ａ 神経膠腫モデルにおけるヌードマウス組織からのウイルスの回収ａ
Figure 2009201515
これらの結果は、ｗｔ ＬＩＶＰ株に対し、ＷＲ株を注射したマウスの脳では１００００倍を超えるウイルスが回収されたことを示す。野生型ＷＲ株ウイルスは、ウイルス注射後７日目のマウスの血清から回収された（６００ＰＦＵ／２０μｌ）。ＬＩＶＰ突然変異株を注射したマウスの７日目の血清では、ウイルスは回収されなかった。血清中のｗｔ ＬＩＶＰのレベルは７日目には試験しなかった。ＷＲ株のＴＫ−突然変異株（ＲＶＧＬ２３）では脳において約１．９×１０６ＰＦＵ／ｇ組織が見られたのに対し、ＬＩＶＰ株のＴＫ−突然変異株（ＲＶＧＬ２）を注射したマウスでは１．４×１０３ＰＦＵ／ｇ組織であった。
ＶＶ ＬＩＶＰ株の他の全ての突然変異体はほぼ腫瘍だけに見られ、二重突然変異体または三重突然変異体を注射したマウスの脳組織からはウイルスは回収されなかった（表１Ａ）。ｗｔ ＬＩＶＰに比べ、ＷＲを注射したマウスの腫瘍からは３倍といった多量のウイルス粒子が回収された。ＬＩＶＰの突然変異株の腫瘍組織におけるウイルス回収量の平均値はｗｔ ＬＩＶＰの場合に類似し、ＷＲのＴＫ−突然変異株の場合と同等であった。
乳癌を有するマウスにおける種々のＶＶの存在
皮下ＧＩ−１０１Ａヒト乳癌を有する免疫抑制マウスにおける組織分布のデータを表１Ｂに示す。
表１Ｂ 乳癌モデルにおけるヌードマウス組織からのウイルスの回収
Figure 2009201515
乳癌組織からは神経膠腫組織の約１０倍を超えるウイルス粒子が回収された。ｗｔ ＬＩＶＰまたはその突然変異株のいずれかを注射したマウスの脳組織からはウイルス粒子は回収されなかった。ｗｔ ＷＲおよびＷＲ株 ＶＶのＴＫ−ウイルスを注射したマウスの脳組織からはそれぞれ７．２×１０６および１．６×１０４ＰＦＵ／ｇが回収された（表１Ｂ）。安楽死させたマウスの器官の解剖の際、ｗｔ ＷＲおよびＷＲウイルスのＴＫ−を注射したマウスの卵巣は、他の全てのマウス群に比べて著しく肥大していたことが判明した。卵巣からのウイルス回収の分析では、卵巣におけるｗｔ ＷＲおよびＴＫ− ＷＲ株の高い力価、例えば、それぞれ８．０×１０７および２．７×１０７ＰＦＵ／ｇが示された。ｗｔ ＬＩＶＰウイルスを注射したマウスの卵巣からは約１．６×１０３ＰＦＵ／ｇが回収されたが、ＬＩＶＰ株に由来する突然変異株を注射したマウスの卵巣または脳のいずれからもウイルス粒子は全く回収されなかった（表１Ｂ）。
黒色腫を担持するマウスにおける種々のＶＶの存在
足蹠に黒色腫を担持する免疫応答性マウスにおけるＶＶの組織分布も研究した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞移植後１７日目のＢＬ／６マウスに、尾の静脈から、１０７ＰＦＵ／マウスの用量のウイルスを静注した。ウイルス注射後１０日目に、ＰＢＳを注射した対照群で腫瘍の大きさが大きくなったため、全ての群のマウスを殺した。これらの結果を表１Ｃに示す。
表１Ｃ 黒色腫モデルにおけるＣ５７ＢＬ／６マウス組織からのウイルスの回収
Figure 2009201515
ａ ３〜５匹のマウス／群のウイルス回収量の平均値ＰＦＵ／ｇ組織
ｂ ウイルス注射後７日目にマウスを殺犠牲にした。
ｃ ＰＦＵ／２０μｌ血清
ｄ ウイルス注射後９日目にマウスを殺犠牲にした。
ｅ 全ての供試組織でウイルスは回収されなかった。
ウイルスを注射した免疫応答性マウスの腎臓、肺、脾臓、脳、精巣、膀胱、肝臓、心臓、および血清からはウイルスは回収されなかった。ウイルスは腫瘍組織のみから回収された。ＬＩＶＰ、ＴＫ−ＬＩＶＰ、ｗｔ ＷＲ、およびＴＫ−ＷＲを注射したマウスの腫瘍からは、他の群の約１０倍のウイルス粒子が回収された。
（実施例５）
組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ７、ＲＶＧＬ９およびＲＶＧＬ２１による、ヌードマウスに移植したヒト乳癌の退縮
ＲＶＧＬ７およびＲＶＧＬ９
図１Ｂはこれらの実験に用いた組換えワクシニアウイルス概略図を示す。ＲＶＧＬ７は、ＲＶＧＬ９の作製に関して記載したように作製した。ＲＶＧＬ７はＥＧＦＰおよびｌａｃＺをコードする核酸を含み、ＴＫ遺伝子に挿入されたｐＥ／Ｌおよびｐ７．５レギュレーター領域を含む。
ヌードマウスにおける腫瘍の発光画像および蛍光画像
ヒトＧＩ−１０１Ａ乳癌細胞（５×１０６細胞／マウス）を、マウスの右大腿に皮下移植した。細胞移植後３０日目に、ウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質の融合物を発現するＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ウイルスＲＶＧＬ９（ＲＶＧＬ９＝ｒＶＶ−ＲＧ＝ｒＶＶｒｕｃ−ｇｆｐ）を、１×１０７ＰＦＵ／マウスの用量で尾の静脈から静注した。ウイルス注射後９日目、すなわち、細胞移植後３９日目に、ＧＦＰの蛍光画像およびルシフェラーゼ発現の低照度画像を採取したところ、ウイルスの蔓延が示された。
ワクシニアウイルスＲＶＧＬ７またはＲＶＧＬ９による、ヌードマウスに移植した乳癌の退縮
ヒトＧＩ−１０１Ａ乳癌細胞（５×１０６細胞／マウス）を、マウスの右大腿に皮下移植した。細胞移植後３０日目に、マウスにＲＶＧＬ７＝ｒＶＶ−ＧＦＴ＝ＴＫ−またはＲＶＧＬ９−ｒＶＶ−ｒｕｃ−ｇｆｐ＝ＮｏｔＩ（３）分断ウイルス（０．１ｍｌ中１×１０７ＰＦＵ／マウス）およびＰＢＳ対照を静注した。ＧＩ−１０１Ａ細胞移植後６５日目、ウイルスまたはＰＢＳ注射後３５日目に画像を撮った。これらの結果は、ＴＫ−またはＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ワクシニアウイルスを注射したマウスにおける腫瘍体積が、ＰＢＳを注射したマウスの腫瘍に比べて著しく退縮していることを示す。
ウイルス投与後のヒト乳癌におけるＧＦＰ
ヒトＧＩ-１０１Ａ乳癌細胞（５×１０６細胞／マウス）を、マウスの右大腿に皮下移植した。細胞移植後３０日目に、マウスにＲＶＧＬ７＝ｒＶＶ−ＧＦＰ＝ＴＫ−またはＲＶＧＬ９＝ｒＶＶ−ＲＧ−ｒＶＶ−ｒｕｃ−ｇｆｐ−ＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ウイルス（０．１ｍｌ中１×１０７ｐｆｕＰＦＵ／マウス）を静注した。これらのデータは、ＴＫ−またはＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ワクシニアウイルスを注射したマウスの腫瘍領域におけるＧＦＰの発現を示す。マウス身体の他の部位ではＧＦＰシグナルは見られなかった。これらの結果はまた、ＧＦＰの発現が、尾の静脈からウイルスを注射した後４８時間といった早期に可視化できることを示した。ウイルス注射後１６日目に極めて強いＧＦＰシグナルが見られたが、これはそれぞれＴＫ−またはＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ウイルスに関して約１３００〜１６２０ｍｍ３の腫瘍体積に相当するものであった。腫瘍体積の縮小によるＧＦＰシグナルの低下は、２５日目（ＴＫ−またはＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ウイルスのそれぞれに関して１２１８〜１２７７ｍｍ３）および３２日目（ＴＫ−またはＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ウイルスのそれぞれに関して５１４〜８８７ｍｍ３）に見られた。
腫瘍体積の経時的推移
Ｇ１−１０１Ａ乳癌細胞を５×１０６細胞／マウスの用量で、４〜５週齢の雌無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスの右大腿に皮下移植した。腫瘍移植後３０日目、腫瘍体積が約５００ｍｍ３に達した際に、単回量の（０．１ｍｌ中１×１０７ＰＦＵ／マウス）のＲＶＧＬ７＝ｒＶＶ−ＧＦＰ＝ＴＫ−またはＲＶＧＬ９＝ｒＶＶ−ＲＧ＝ｒＶＶ−ｒｕｃ−ｇｆｐ＝ＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ワクシニアウイルスまたはＰＢＳ対照を静注した（尾の静脈から）。１週間に２回、腫瘍の寸法をノギスで測定し、（Ｌ×Ｈ×Ｗ）／２［式中、Ｌ、ＨおよびＷはそれぞれ、腫瘍の長さ、幅および高さを表す］で体積を算出し、ｍｍ３で表した。これらのデータは、ＴＫ−、ＮｏｔＩ（Ｆ３）分断ワクシニアウイルスを注射したマウスにおける有意な（６５日目で６０〜８０％）腫瘍の退縮を示す。これに対し、ＰＢＳを注射したマウスでは、腫瘍が極めて急速に増殖した。
吸光による腫瘍退縮のモニタリング
ｗｔ ＬＩＶＰ、ＬＩＶＰ株の突然変異株である単一Ｆ３−、単一ＴＫ−、および二重Ｆ３−、ＴＫ−の１回静注で処置した免疫抑制マウスの１００％で、皮下ＧＩ−１０１Ａ乳癌の退縮が起こった。上記ウイルスで処置したマウスではある程度の毒性が見られた。三重欠損ＴＫ、Ｆ３およびＨＡ遺伝子を有するＲＶＧＬ２１ウイルスはヌードマウスにおいて毒性を示さなかったことから、このウイルスを長期研究に用いた。三重突然変異ＲＶＧＬ２１ウイルスを用いた場合の高用量処置と低用量処置の間の抗腫瘍活性および生存率の差は有意ではなかった。ＲＶＧＬ２１を注射したマウスの腫瘍領域におけるＧＦＰの発現をモニタリングした。マウス身体の他の部位ではＧＦＰシグナルは見られなかった。ＧＦＰの発現は、尾の静脈からウイルスを注射した後４８時間といった早期に可視化できる。ウイルス注射後１６日目に、発明者らはＧＦＰの極めて強いシグナルを観測したが、これは約１３００〜１６２０ｍｍ３の腫瘍体積に相当するものであり、２５日目（１２１８〜１２７７ｍｍ３）と３２日目（５１４〜８８７ｍｍ３）に、腫瘍体積の縮小により、ＧＦＰシグナルが低下した。腫瘍体積の縮小はマウスの視診によっても明らかであった。
（実施例６）
ワクシニアウイルスの毒性および毒力の軽減
マウス体重および生存率のモニタリングによるワクシニアウイルスの病原性の軽減
種々の皮下腫瘍を有する無胸腺および免疫応答性マウスにおいて、ウイルスの静脈投与後の体重変化率％を調べた。ｗｔ ＬＩＶＰおよびｗｔ ＷＲおよびいくつかの突然変異株を１０７ＰＦＵ／マウスの用量で尾の静脈から注射したところ、２週間の観察期間内で進行性のワクシニアウイルス感染が見られた。投与後１週間で、マウスは尾と足蹠に典型的な水疱形成を示した。その後、体重が減少し、口腔域の腫脹を伴う場合もあり、ひどい場合には、死に至った。ＶＶのＷＲ株の場合、マウスはウイルスの静注後７日目に脂肪が始まった。一方、組換えＬＩＶＰウイルスを受容しているマウスは、同じ期間中、体重が増加するか、同じ体重を維持した。
神経膠腫モデルにおけるヌードマウスの体重
５×１０５／０．１ｍｌ／マウスの用量のラット神経膠腫Ｃ６細胞を、０日目にヌードマウス（５〜６週齢の雄マウス）に皮下移植した。７日目にワクシニアウイルスを１×１０７ＰＦＵ／０．１ｍｌ／マウスの用量で静注した（尾の静脈から）。１週間に２回動物を秤量した。注射後１４日目の体重の増／減をパーセンテージとして算出した：ウイルス注射日の体重−腫瘍重（ｇ）／１４日目の体重−腫瘍重（ｇ）×１００％。ＶＧＬ（野生型ワクシニアウイルスＬＩＶＰ株）およびＲＶＧＬ５（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎ−分断型）の注射はヌードマウスに毒性を生じ、マウスは体重減を続ける。組換えワクシニアウイルスＲＶＧＬ５（ＨＡ分断型）、ＲＶＧＬ７（ＴＫ分断型）、ＲＶＧＬ８（ＮｏｔＩ（Ｆ３）分断型）、ＲＶＧＬ１９（二重、ＴＫ−およびＮｏｔＩ（Ｆ３）分断型）はヌードマウスにおける毒性が小さく、いくらかの体重減の後、感染後１０日目にマウスは体重増加を始めた。
ＶＶの野生型ＷＲ株を注射した、神経膠腫を有するヌードマウスは、ウイルス注射後７日目に体重の３１．９％を失った。ＷＲ株のＴＫ−ウイルスを注射したマウスは、ウイルス注射後１４日目に体重の２２．４％を失ったのに対し、ＶＶ ＬＩＶＰ株のＴＫ−ウイルスを注射したマウス群では１．５％であった。野生型ＬＩＶＰ株を注射した全てのマウスが少なくとも１４日間（試験期間）生存した。ＶＧＬ（ｗｔ ＶＶ ＬＩＶＰ株）を注射した、腫瘍を持たないマウスは、体重の１１．２３％を失った。ＶＧＬ（ｗｔ ＶＶ）またはＲＶＧＬ１（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎ−分断型）を注射した、腫瘍を担持するマウスは、それぞれ体重の１５．７９％および１０．１８％を失った。ｗｔ ＬＩＶＰ群のマウスは体重の１５．８％を失ったのに対し、ＰＢＳ注射群では９．４％であった。ＲＶＧＬ２（ＴＫ−）、ＲＶＧＬ５（ＨＡ−）、ＲＶＧＬ７（ＴＫ−）、ＲＶＧＬ８（Ｆ３−）、ＲＶＧＬ９（Ｆ３−）、ＲＶＧＬ２０（ＴＫ−、Ｆ３−）、ＲＶＧＬ２１（ＴＫ−、Ｆ３−、ＨＡ−）を注射した担癌マウスは、ウイルス注射後１４日目にそれぞれ体重の１．５％、０．４％、２．１％、５．０％、７．３％、２．４％、および３．２％を失ったに過ぎなかった。二重遺伝子分断ＲＶＧＬ１９（ＴＫ−およびＦ３−）を有するウイルスを注射した担癌マウスは、０日目の体重に比べ、体重の０．７３％増を示した。体重の結果に基づけば、ワクシニアウイルスゲノムにおけるＨＡ、ＴＫ、Ｆ３（ＮｏｔＩ部位）の単一分断、およびＴＫ、Ｆ３（ＮｏｔＩ部位）遺伝子の二重分断は、ワクシニアウイルスＬＩＶＰ株の毒力および毒性を軽減する。
しかしながら、ｗｔ ＶＶ ＷＲ株の注射はヌードマウスに極めて有毒であり、ウイルス注射後７日目に死に至った。ＬＩＶＰ株の野生型および突然変異株ＶＶはヌードマウスに対する毒性が小さかった。種々のＬＩＶＰ株を注射したヌードマウスはいくらかの体重を失ったが、感染後１０日目以降に体重増を始めた。
乳癌モデルにおける無胸腺マウスの体重
ワクシニアウイルス静注後の、皮下ＧＩ−１０１Ａヒト乳癌を有する無胸腺マウスの体重変化をモニタリングした。ｗｔ ＷＲ株を注射したマウスは、ウイルスの毒性のため、体重の２５．６％を失い、死に至った。ｗｔ ＬＩＶＰウイルスを注射したマウスは長期間生存したが、マウスは体重の２６．４％を失った。ＴＫ−ＷＲ株を注射したマウスは体重の１７．８％を失ったが、ＴＫ−ＬＩＶＰウイルスを注射したマウスは体重の１．９％増を示した。ＬＩＶＰ株の他の突然変異株を注射したマウスは全て安定しており、これらのマウスではウイルスに関連する毒性は見られなかった。
黒色腫モデルにおける免疫応答性マウスの体重
足蹠にマウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫を担持する免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるワクシニアウイルスの毒性を研究した。試験中、全ての群のマウスが生存したが、ｗｔ ＷＲ株は、ｗｔ ＬＩＶＰおよび組換え株よりも免疫応答性マウスにおいて毒性が高かった。ｗｔ ＷＲ株を注射したマウスは、ウイルスの静注後１０日目に体重の約１１．４％を失ったが、ｗｔ ＬＩＶＰ株ならびにその二重（ＲＶＧＬ２０）および三重（ＲＶＧＬ２１）突然変異株を注射したマウスはそれぞれ、体重の２．２％、１．３％、および０．６％を失ったに過ぎなかったのに対し、ＰＢＳを注射したマウスでは体重の７．１％減であった。ＲＶＧＬ２（ＴＫ−）、ＲＶＧＬ５（ＨＡ−）、ＲＶＧＬ９（Ｆ３−）、およびＲＶＧＬ２３（ＴＫ−ＷＲ株）を静脈投与したマウスは同じ期間に体重増を続けた。
乳癌担持マウスのウイルス感染後の長期生存
長期生存に対する種々の突然変異の効果を調べるため、皮下ＧＩ−１０１Ａヒト乳癌を担持するマウスに用量１０７のウイルスを静脈投与し、ウイルス感染後の生存率を観測した。これらの結果は、注射したウイルスによって生存率に違いがあることを示した。皮下乳癌を担持するヌードマウスにＷＲ株を注射したところ（静注、１×１０７／マウス）、死亡率１００％となり、５匹の打ち４匹のマウスがウイルス注射後９日目に死に至り、１匹が１１日目に死に至った。ＬＩＶＰ株を注射したマウスは３５日生存した。単一突然変異ウイルスＲＶＧＬ９（Ｆ３−）を注射したマウスには毒性が表れ、ウイルス注射後３４日目に２５％のマウスが死に至ったが、ＬＩＶＰ株におけるＦ３遺伝子の欠損は、マウスの生存を５７日まで引き延ばした。二重突然変異ウイルスＲＶＧＬ２０（Ｆ３−、ＴＫ−）を注射したマウスは、ウイルス注射後３４日目に死に始めたが、Ｆ３を注射したマウスよりも長く生存した。ＲＶＧＬ２０ウイルスを注射したマウスは６５日目の時点で生存率５０％を達成し、１１６日まで有意に長い生存期間を示した。ＬＩＶＰウイルスの単一突然変異ＴＫ−ウイルスは、単一突然変異Ｆ３−ウイルスまたは二重突然変異Ｆ３−，ＴＫ−ウイルスよりも病原性が低く、ＴＫ−ウイルス注射後８０日では全てのマウスが生存しており、１４．３％のマウスが１３０日生存した。三重突然変異ＴＫ−、Ｆ３−、およびＨＡ−ウイルス（ＲＶＧＬ２１）を注射した全てのマウスが１３０日（試験期間）生存し、他群のマウスに比べてウイルス毒性の兆候なく生存を続けた。
種々のマウスにおける脾腫
免疫能力免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウス
いくつかの群の動物が脾臓肥大を示したことから、相対的脾臓重（ＲＳＷ）を算出した。これらの結果を次の通り表２に示す。
表２ 腫瘍を有するかまたは有さないマウスにおける相対的脾臓重（ＲＳＷ）
Figure 2009201515
n＝4−8マウス/群の平均値±SD
RSW＝脾臓重(g)×104/(動物体重(g)−腫瘍重(g))
a p＜02.02 腫瘍なしのLIVP、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
b p＜0.039 腫瘍なしのPBS、腫瘍なしのLIVP、RVGL5、WR、RVGL23に対して
c p＜0.046 PBS、RVGL2、RVGL20、RVGL21を除く全ての群に対して
d p＜0.006 腫瘍なしのLIVP、PBS、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
e p＜0.048 腫瘍なしのPBS、LIVP、RVGL2、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
f p＜0.045 PBS、RVGL2、RVGL21sを除く全ての群に対して
g p＜0.035 PBS、LIVP、RVGL20、WR、RVGL23に対して
hp＜0.049 腫瘍なしのLIVP、RVGL20、WR、RVGL23を除く全ての群に対して
i p＜0.049 他の全ての群に対して
上記表２に示されるように、ある程度の脾腫がマウスに見られた。免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに関しては、ＰＢＳ、ＬＩＶＰ、ＲＶＧＬ２０、ＷＲおよびＲＶＧ１２３を注射した腫瘍マウスでは、非腫瘍マウスに比べて統計学的に有意な差（ｐ＜０．０３５）が見出された。ｗｔ ＶＶ ＬＩＶＰ株を注射したマウスでは、他の全ての群より著しく肥大していた（ｐ＜０．０４９）。これに対し、腫瘍を持たないマウスでは、最小の脾臓が見出された。
神経膠腫を有するヌードマウス
皮下神経膠腫を有するかまたは有さないヌードマウスでは、ｗｔ ＷＲまたはＷＲのＴＫ−ウイルスを注射したマウスはそれぞれ最低のＲＳＷ３７．３または４６．９を有し、これは腫瘍を持たず、ＰＢＳを注射したマウスのＲＳＷ（４３．６）より小さかった。ＲＶＧＬ５（ＨＡ−）およびＲＶＧＬ２１（ＴＫ−、Ｆ３−、ＨＡ−）群ではそれぞれ最高のＲＳＷ１４３．８および１１４．が認められた。ＰＢＳ注射群に比べ、ｗｔ ＬＩＶＰ、ＲＶＧＬ２、ＲＶＧＬ９、ＲＶＧＬ２０４を注射したマウス群の間で統計学的に有意な差は見られなかった。
乳癌を有するヌードマウス
皮下ヒト乳癌を担持する免疫抑制マウスにおけるＲＳＷのこれらの結果は、ｗｔ ＬＩＶＰおよびその突然変異株を注射した全てのマウスが、ｗｔ ＷＲまたはＴＫ−ＷＲウイルスを注射したマウスに比べて肥大した脾臓を有することを示す（ｐ＜０．０４５）。最大の肥大は、ＬＩＶＰ株の単一ＨＡ−、単一Ｆ３−、二重Ｆ３−、ＴＫ−突然変異株を注射したマウスで見られた。
注射にＲＶＧＬ２１を用いたときのその他の結果
２匹のマウス＃４３７および＃４５８は、ＲＶＧＬ２１注射後（それぞれ１０７および４×１０５を静注）１９０日を超えて生存し、疾病またはウイルスに関連する毒性の兆候もなかった。
ＧＩ−１０１Ａ細胞移植後３０日目に（腫瘍体積＝５９４．９ｍｍ３）、１０７のＲＶＧＬ２１をマウス＃４３７に静注した。ウイルス注射後１０１日目に（皮下腫瘍の大きさ＝２２０．４ｍｍ３）、皮下の胸部領域に転移（硬質組織）が見られた。腫瘍の大きさは１２２３．６ｍｍ３であり、これは１４８日目までに消失した。皮下腫瘍は消失せず、再び増殖を始めたが、マウスは転移のないままであった。
マウス＃４５８は右後部４分の１に最初の皮下腫瘍（ＧＩ−１０１Ａ）を有していた。最初の腫瘍が退縮し始めたときに（ＲＶＧＬ２１ウイルス注射後２９日、腫瘍の大きさ＝１９２４．３ｍｍ３）、左後部４分の１に第二の同系腫瘍を皮下移植した。第二の腫瘍はゆっくりと増殖し、１２０５．７ｍｍ３の大きさに達し、退縮を始めた。ウイルス注射後１２７日目にマウスに最初の腫瘍は見られなくなり、第二の腫瘍の大きさは４３９．６ｍｍ３となった。腫瘍は退縮を続け、それらの細胞は死に至った。身体は、宿主に寄与していた残留腫瘍細胞（宿主から来ていた腫瘍の血管骨格など）を徐々に吸収した。これらはやはり外来のものとはみなされないので、免疫系もそれらを破壊することはない。他方、腫瘍細胞は長く消失し、免疫系およびウイルスにより除去された。第二の同系腫瘍の減少は、このマウスが腫瘍細胞に対する抗体を発達させたことを示す。これらの抗体は題意の同系腫瘍の減少をもたらした。
（実施例７）
腫瘍に対する生物の自己免疫を誘導するための微生物または細胞の使用
本実施例は、本明細書、および「腫瘍組織におけるポリペプチド、ＲＮＡまたは他の化合物の生産」に関する先行出願ＥＰ ０３ ０１８ ４７８．２で提供される方法が、腫瘍組織に対する抗体の生産のためにも使用できることを示す。これらの抗体は担癌生物の自己免疫をもたらす。さらに、これらの抗体は単離して、他の生物体での腫瘍の処置にも使用できる。
腫瘍に対する生物の自己免疫を誘導するための方法、ならびに目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードするＤＮＡを含み得る、細胞を含む微生物の使用が提供される。また、（ａ）所望により目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含んでもよいウイルスまたは細胞などの微生物を、担癌生物に注射すること、そして（ｂ）その腫瘍に対する抗体を単離することによる、腫瘍に対する抗体を生産する方法も提供される。
本実施例はさらに、腫瘍に集積する、本明細書で提供される三重突然変異ワクシニアウイルス株などの微生物が、腫瘍による抗体の産生を可能とするに十分な期間、それらに腫瘍抗原を放出させることを実証するものである。これは、ｎｕ−／ｎｕ−マウス（Ｔ細胞欠損マウス）において異種ＧＩ−１０１Ａ固形乳癌およびそれらの転移の縮小および排除を示すことにより例示される。
ステップ＃１：５週齢の雌ｎｕ−／ｎｕ−マウスを選び、ＧＩ−１０１Ａ細胞を、エストロゲンおよびプロゲステロンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。密集状態にし、細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次に、細胞（５×１０６細胞／マウス）をマウスに皮下注射した。腫瘍増殖を２日ごとに注意深くモニタリングした。
ステップ＃２：腫瘍増殖の２つの段階（腫瘍サイズ４００〜６００ｍｍ３と腫瘍サイズ〜１７００ｍｍ３）で、精製したワクシニアウイルス粒子（ＲＶＧＬ１２）を各腫瘍マウスに、尾の静脈からの静注により送達した。コロニー純化したウイルスをＣＶ−１細胞系統で増幅し、細胞内のウイルス粒子をスクロース勾配遠心分離により精製した。２種類の濃度のウイルス（ＰＢＳ溶液に再懸濁させた１０６ｐｆｕ／１００μｌと１０７ｐｆｕ／１００μｌ）を注射した。ウイルスの複製は、ウイルスを媒介とする緑色蛍光タンパク質の発現の可視化により外部的にモニタリングした。腫瘍の発達は、デジタルノギスによる腫瘍体積の測定によりモニタリングした。
ワクシニアウイルスＲＶＧＬ１２＋ＧＣＶ（ガンシクロビル）、およびＲＶＧＬ１２（ＲＶＧＬ１２は、ｇｆｐをコードする核酸が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ；配列番号３５および３６参照）に置き換えられていること以外はＲＶＧＬ７と同じである）を、ＧＩ−１０１Ａ細胞移植後６７日目に注射した。２回目の投与はＲＶＧＬ１２ａと表し、細胞移植後３０日目に注射した。
ステップ＃３：ウイルス投与後、最初、腫瘍は〜９００ｍｍ３（ウイルス注射の時点では４００〜６００ｍｍ３から）の大きさまで、また、〜２４００ｍｍ３（１７００ｍｍ３から）の大きさまで増殖を続けたことが分かった。その後、増殖速度はおよそ６〜８日間低下した。
ステップ＃４：ウイルス注射後およそ１４日で、腫瘍体積が急速に小さくなり始めた。ウイルス適用後４０日で、全ての処置動物が６０％を超える腫瘍退縮を示した。ウイルス処置後６５日で、多くの動物が完全な腫瘍退縮を示した。
ステップ＃５：動物の中には数週間で完全に腫瘍がなくなったものもあり、それらの体重は正常に戻った。ＲＶＧＬ−１２＋ＧＣＶ処置の結果、１３日目のピーク体積から８６％の腫瘍退縮が起こり（ウイルス注射後５２日目）、ＲＶＧＬ−１２処置の結果、ピーク体積（１３日目）から８４．５％の腫瘍退縮が起こった（５２日目）。ＲＶＧＬ−１２ａ処置の結果、ピーク体積（１２日目）から９８．３％の腫瘍退縮が起こった（８９日目）。ＰＢＳ＋ＧＣＶ対照処置後では、平均腫瘍体積が３８日で９１．８％増加した。
ステップ＃６：免疫の活性化レベルを測定した。退縮中の腫瘍を有する動物から血清を得、外来タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、ワクシニアウイルスタンパク質、およびＧＩ−１０１Ａ癌細胞タンパク質に対する免疫力価を測定した。以下の供給源から得た以下の抗血清を用い、次に挙げたサンプルを分析した。
サンプル：
１）マウス細胞溶解物（対照）；
２）精製および変性させたワクシニアウイルス粒子；
３）ＧＩ−１０１Ａ腫瘍細胞溶解物；
４）精製緑色蛍光タンパク質；
５）精製ルシフェラーゼタンパク質；
６）精製β−ガラクトシダーゼタンパク質
抗血清：
ａ）非腫瘍マウス由来の抗血清；
ｂ）ＧＩ−１０１Ａ腫瘍マウス由来の抗血清；
ｃ）ワクシニア静注後１４日目のＧＩ−１０１Ａ腫瘍マウス由来の抗血清；
ｄ）ワクシニア静注後６５日目のＧＩ−１０１Ａ腫瘍マウス由来の抗血清；
ｅ）ワクシニア静注後８０日目（ＧＩ−１０１Ａ腫瘍排除後）の腫瘍フリーマウス由来の抗血清
これらの結果は、腫瘍において腫瘍タンパク質抗原およびウイルスタンパク質の産生をもたらす、大量の腫瘍特異的ワクシニアウイルスの腫瘍内複製が存在することを示した。さらに、このワクシニアウイルスは感染した腫瘍細胞を溶解し、それにより腫瘍細胞特異的抗原を放出する。これらの抗原が体内に継続的に放出されることで、マウスの体内に、外来細胞タンパク質（腫瘍タンパク質）、ウイルスタンパク質、およびウイルスによりコードされる操作型タンパク質に対する、極めて高いレベルの抗体力価がもたらされた（およそ７〜１４日）。新たに合成された抗腫瘍抗体および増強されたマクロファージ、好中球総数は、血管系を介して腫瘍に継続的に送達され、それにより腫瘍内部に活性化された免疫系が補充される。その後、この活発な免疫系はウイルス粒子を含む腫瘍を排除した。この、外来抗原の放出により追加刺激される抗体産生と腫瘍に含まれているタンパク質に対する抗体の継続的逆行の相互連結は、ワクシニアウイルス複製に始まり、細胞溶解、タンパク質漏出および抗体産生の増強が後続する自己免疫ワクチン系として機能する。
（実施例８）
担癌マウスにおける、ワクシニアウイルスにより送達されたｌａｃＺを介したβ−ガラクトシダーゼおよび抗β−ガラクトシダーゼの産生
３５匹の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（５週齢、２５ｇ、雄）を用い、ゲノムに種々の欠損を有するワクシニアウイルス（ＬＩＶＰ株）の生体分布および腫瘍ターゲッティングを実証した。表１に示すように、マウスを各５匹の７群に分けた。
Figure 2009201515
第２群から７群では、Ｃ６神経膠腫を皮下に発達させた。腫瘍細胞移植（５×１０５細胞／マウス）後５日目に、各動物を多重感染度（ＭＯＩ）１×１０７のウイルス１ｍｌで尾からの静注により処置した。ウイルス注射後２週間で全てのマウスを殺し、血液サンプルを採取した。また、ウイルス力価およびβ−ガラクトシダーゼ分析のため、動物から種々の器官および腫瘍を採取した。
β−ガラクトシダーゼ分析は、β−ガラクトシダーゼの検出のための化学発光レポーター遺伝子アッセイ系であるガラクト−ライトプラス系(Applied Biosystems)を製造業者の説明書に従って用いて行った。
β−ガラクトシダーゼ発現の測定
野生型ワクシニアウイルス（レポーター遺伝子もβ−ガラクトシダーゼ遺伝子も持たない）を注射した非腫瘍マウスならびに腫瘍マウスでは、器官、血液および腫瘍サンプルにおいてβ−ガラクトシダーゼの発現は検出されなかった。これに対し、β−ガラクトシダーゼ発現ウイルスに感染させたマウスの腫瘍では、抗レベルのβ−ガラクトシダーゼが発現した。また、表２に示されるように、β−ガラクトシダーゼは血液サンプルにおいても検出されたが、血液サンプルからウイルスは回収されなかった。
Figure 2009201515
抗β−ガラクトシダーゼ抗体の産生
マウス血液中に存在するβ−ガラクトシダーゼの量が抗体産生を惹起するのに十分なものかどうかを決定するため、２匹のマウス（第５群のマウス＃１１６と第６群の＃１１９）から血清を採集し、ウエスタン分析でβ−ガラクトシダーゼに対する一次抗体に関して試験した。大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ(Roche, 567 779)を抗原標準として用い、マウスモノクローナル抗大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ(Sigma, G6282)を抗体陽性対照として用いた。β−ガラクトシダーゼのさらなる供給源として、ＭＯＩ １ｐｆｕ／細胞でのＲＶＧＬ７感染後２４時間目のＣＶ−１細胞から総タンパク質を得、＃１４３と呼ばれるマウス（ＲＶＧＬ７で処置）から腫瘍タンパク質サンプルを得た。
タンパク質サンプルは３反復で調製し、各セットにはβ−ガラクトシダーゼ抗原対照、ＲＶＧＬ７感染ＣＶ−１細胞の細胞溶解物、およびマウス＃１４３の腫瘍溶解物が含まれる。全てのタンパク質サンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、ＢｉｏＲａｄセミドライブロッティング系を用いてＮｉｔｒｏＢｉｎｄニトロセルロースメンブラン（ＭＳＩ）に移した。１：３０００マウスモノクローナル抗β−ガラクトシダーゼ、または１：３０００マウス＃１１６または＃１１９のいずれかから採取したマウス血清のいずれかとおよび１：３０００ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ(BioRad)を用いて免疫ブロットを行った。検出にはＡｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｏｐｔｉ−４ＣＮ検出キット(BioRad)を用いた。
これらの結果は、マウス＃１１６および＃１１９から採取した血清が、市販のマウス抗β−ガラクトシダーゼ標準と比べて類似のレベルの抗体を示したことを示し、また、担癌マウス＃１１６および＃１１９がβ−ガラクトシダーゼに対する抗体を産生したことを証明した。
（実施例９）
腫瘍治療のための哺乳類細胞
本明細書で示されるように、ある種の細菌、ウイルス、および哺乳類細胞（ＢＶＭＣ）は、全身投与したとき、腫瘍に侵入し、選択的に複製する。従って、担癌生物において、全身注射した哺乳類細胞およびある種の細菌（サルモネラ菌、クロストリジウム腫、ビブリオ菌、大腸菌などの嫌気性菌）細胞はここでも固形腫瘍に侵入し、複製する。腫瘍の検出および治療には、遺伝的に標識した細胞を使用できる。ＢＶＭＣターゲッティングを介した腫瘍での遺伝子発現の他、導入遺伝子と組織／腫瘍特異的プロモーターを連結することによっても腫瘍特異的な遺伝子発現が達成できる。腫瘍特異的遺伝子発現を得るためには、様々な体系的ターゲッティングスキームが使用できる。これらの戦略には、前立腺特異的プロモーターによって指示されるウイルス遺伝子発現など、特定の器官でのみ遺伝子発現を活性化させる組織／腫瘍特異的プロモーターの使用；細胞外マトリックス（すなわち、コラーゲン）標的化ウイルスベクターの使用；および抗体に向けられたウイルスベクターの使用が含まれる。腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター粒子、複製選択的ＨＳＶ、ワクシニアウイルスおよびこのような他のウイルスなど、マーカー遺伝子または治療遺伝子のための腫瘍特異的送達ビヒクルとしての、条件により複製するウイルスも探索されている。
発光タンパク質をコードするＢＶＭＣを齧歯類に全身投与すると、腫瘍特異的マーカー遺伝子発現が起こり、発光に基づきリアルタイムで検出される。結果として、動物における原発腫瘍および事前には分からなかった転移の位置がインビボで明らかになる。従って、診断を治療および治療と組み合わせることができる。腫瘍におけるリンパ系の障害は、血管系を逃れた後、宿主の免疫監視による腫瘍からの細菌クリアランスの欠如の一因である可能性がある。
（実施例１０）
化膿連鎖球菌投与後に腫瘍の発達が阻害される
本実施例および以下の実施例は、腫瘍にコロニー形成させるための細菌細胞の使用；コロニー形成を定量するための細胞におけるリポーターの使用；腫瘍阻害のためのコロニー化弱毒細菌細胞の使用を実証するものである。細菌およびウイルスは同時投与するか、または逐次投与する。細菌の前にウイルスを投与すると、細菌による腫瘍内コロニー形成が高まる。プロドラッグを活性化する酵素を発現する細菌を投与し、それによりコロニー形成した細胞を標的化する。
細菌株
化膿連鎖球菌Ｍ−タイプ１ Ｔ−タイプ１（ＡＴＣＣカタログ番号７００２９４）を細菌ルシフェラーゼ発現カセット(Lamberton GR, Pereau MJ, Illes K, Kelly IL, Chrisler J, Childers BJ, Oberg KC, Szalay AA. 2002. Construction and characterization of a bioluminescent Streptococcus pyogenes. Proceedings of the 12th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Case JF, Herring PJ, Robison BH, Haddock SHD, Kricka LJ, Stanley PE (eds). Chichester: Wiley, pp 85−88)を含むｐＤＣ１２３−ｌｕｘＦプラスミドで形質転換させた。ルシフェラーゼは外から加えたデカナールの存在下で検出することができる。
形質転換した化膿連鎖球菌をＢＨ１培地中、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下、３７℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、ＯＤ６００で細胞を計数し、注射に関して示された密度になるよう、ＢＨ１培地に再懸濁させた。
腫瘍の発達と細菌の注射
２５週齢のマウスの右側大腿に皮下注射を行った。各マウスに、ｐＬＥＩＮ由来レトロウイルス（Clontech；また、ＷＯ０３／１４３８０も参照）で形質転換した５×１０５ Ｃ６神経膠腫細胞を注射した。これらの皮下腫瘍を、細菌注射に先立ち、移植後７日間発達させた。
細菌注射のため、担癌マウスをイソフルオランで麻酔した。これらの懸濁液を、２９ １／２ゲージの針を取り付けた１ｃｃインスリンシリンジで、外科的に露出させた大腿静脈から静注した。注射後、切開部を縫合した。
細菌注射後、１週間に２回、デジタルノギスを用いて腫瘍増殖をモニタリングした。さらに、最終の時点で蛍光画像と写真画像を採取した。発光細菌の存在は、３０μｌのデカナールを動物に静注することにより分析した。動物全体の細菌ルシフェラーゼ活性に関する分析は、Yu et al. (2004) Nature Biotechnology 22(3): 313−20と類似の方法に従った。要するに、麻酔した動物を光子計数のための暗箱(ARGUS 100 low light Imager, Hamamatsu)に入れた。動物の腹側および背側から１分間光子を収集し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ３．１ソフトウエア(Media Cybernetics)および／またはＬｉｇｈｔｔｏｏｌｓ（登録商標）マクロイメージングシステムを用いて画像を記録した。また、光学画像も記録した。発光画像を光学画像に重ね合わせて動物上の発光活性の位置を決定した。位置決定した領域、例えば腫瘍領域における光子放射の総強度も記録した。摘出した腫瘍および粉砕した組織から化膿連鎖球菌を単離し、ＬＢ−クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）プレートに置いた。デカナール蒸気の存在下で発光細菌を計数した。
結果
４群のマウスを試験した。各群は５匹のマウスを含んだ。
Figure 2009201515
７日間腫瘍発達させた後に腫瘍体積を測定し、腫瘍発達後２１日目から化膿連鎖球菌を注射した。
化膿連鎖球菌を含まない対照群のマウスは、２週間にわたって継続的かつ加速的な腫瘍増殖を示した。化膿連鎖球菌を注射したマウスでは腫瘍増殖はもっと遅かった。第３群と４群は腫瘍増殖速度が最も遅かった。両群はモニタリング期間中、遅い直線速度を維持したが、細菌を注射していない対照群は後期ほど加速化された腫瘍増殖を示した。
細菌注射後のどの時点でも、第３群および４群のマウスの腫瘍体積は対照マウス（第１群）よりも小さかった。２１日目、対照群の平均腫瘍体積は、第３群および４群の平均腫瘍体積よりもおよそ２．５〜３倍大きかった。最低力価の細菌を注射した第２群も、後期の時点では対照群より腫瘍体積が小さくなったが、第３群および４群よりも大きかった。
また、繊維肉腫モデルでも、細菌のコロニー形成および腫瘍阻害をアッセイする。ｐＬＥＩＮレトロウイルスで形質転換したＨＴ１０８０繊維肉腫細胞を５週齢の雄ヌードマウスの右側大腿に皮下注射する（５×１０５細胞／マウス）。ｐＤＣ１２３−ｌｕｘＦで形質転換した化膿連鎖球菌を、８日または１４日腫瘍増殖させた後の動物の大腿静脈に注射する（各時点５匹）。１群５匹には、対照群とするため注射は行わない。以降の各時点で、腫瘍の増殖とルシフェラーゼ活性をモニタリングする。化膿連鎖球菌を腫瘍から単離し、ＢＨ１＋クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）プレートで培養する。デカナール蒸気の存在下で発光細菌コロニーを計数する。
（実施例１１）
コレラ菌の腫瘍への局在
プラスミドおよび細菌株
弱毒コレラ菌Ｂｅｎｇａｌ２株血清型０１３９，Ｍ０１０ ＤａｔｔＲＳ１を、ｌｕｘＣＤＡＢＥカセット(Voisey et al. (1998) Biotechniques 24:56−58)を含むｐＬＩＴＥ２０１で形質転換させた。形質転換株は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現のために発光株となる。
腫瘍の発達および細菌注射
ヌードマウス群（ｎ＞２０）に、本明細書の実施例に記載のように、Ｃ６神経膠腫（５００ｍｍ３）を移植した。１×１０８の形質転換細菌（コレラ菌）を１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた。この細菌懸濁液を各マウスの右後ろ脚に注射した。注射後、これらの動物を実施例Ａに記載のように、低照度画像装置下でモニタリングした。
比較のため、独立した実験で、ヌードマウス群（ｎ＞２０）に、本明細書の実施例に記載のように、Ｃ６神経膠腫（５００ｍｍ３）を移植した。これらのマウスに１×１０８ｐｆｕ／マウスのｒＶＶ−ＲＵＣ−ＧＦＰウイルスを注射した（実施例１および４参照）。
結果
力価およびルシフェラーゼ活性
２種の各注射群からのマウスを注射後の各時点で殺した。腫瘍を摘出し、ホモジナイズした。細菌力価およびウイルス力価ならびにルシフェラーゼ活性を、本明細書の実施例に記載のように測定した。
細菌力価およびウイルス力価とも、注射後に上昇した。細菌増殖の経時的増加は腫瘍のルシフェラーゼレベルと比例していた。コレラ菌を注射したマウスにおける細菌力価と腫瘍のルシフェラーゼ活性のログ−ログプロットは、細菌力価とルシフェラーゼ活性との間の直線的関係を示した。ｒＶＶ−ＲＵＣ−ＧＦＰウイルスを注射したマウス群もまた、ウイルス力価とルシフェラーゼ活性との間の直線的関係を示した。
Figure 2009201515
Figure 2009201515
これらの試験は、力価とルシフェラーゼ活性との間の直線的関係を示した。よって、注射した細菌および／またはウイルスのルシフェラーゼ活性は、力価の相対的尺度として用いることができる。
局在
コレラ菌の局在は本発明の実施例にウイルスに関して記載したようにして行った。要するに、ＣＯ２ガスで安楽死させた動物から器官および血液サンプルを単離した。器官を粉砕し、細菌力価の分析のため、クロラムフェニコール薬剤選択を伴う寒天プレートにプレーティングした。
注射したマウスの腫瘍、肝臓、精巣、脾臓、腎臓、肺、心臓、膀胱および脳で細菌力価をアッセイした。０時間、その後、コレラ菌注射後１５０時間までの各時点で、殺したマウスからサンプルを採取した。
注射直後の時点（ｔ＝０）で、コレラ菌は全てのサンプルに存在し、肝臓および脾臓で最高レベルであった。注射後５０時間までは、腫瘍組織を除く全ての組織でコレラ菌の力価は低下していた。これに対し、コレラ菌の力価は０時間に対して約４桁上昇していた。このレベルは残りの試験中、やや上昇し、その後一定に留まった。感染後１５０時間まで、腫瘍を除く全てのサンプルで力価が低下していた。例えば、肝臓の力価は０時点からおよそ５桁低下していた。１５０時間の時点で、腫瘍組織のコレラ菌力価は他の組織サンプルより約６桁高かった。
（実施例１２）
細菌およびウイルスの同時投与および逐次投与
コレラ菌／ｐＬＩＴＥ（実施例Ｂ参照）およびワクシニアウイルスＶＶ−ＴＫ−−ｇｆｐ−ｌａｃＺ（実施例４参照）を一緒に、または同時に投与した。Ｃ６神経膠腫を有するヌードマウス群に、下表に示されるように細菌および／またはウイルスを注射した。各群３匹の雄マウスに注射した。細菌および／またはウイルスは腫瘍移植後１１日目と１６日目に注射した。腫瘍増殖、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ活性を、本明細書の実施例に記載されているようにモニタリングした。
Figure 2009201515
結果
２１日目（腫瘍移植後２１日）に動物を殺した。各動物から腫瘍を摘出し、粉砕した。第３群、４群および５群についてはウイルス力価をアッセイした。第１群、２群および５群については細菌力価をアッセイした。力価（コロニー形成単位およびプラーク形成単位）の測定は、これまでに実施例に記載したように行った。
第１群、２群および５群の腫瘍の細菌力価を比較したところ、細菌力価は、まず１１日目にワクシニアウイルスを注射し、その後、１６日目にコレラ菌を注射した第１群で最高であったことが示された。１６日目に細菌とウイルスを同時投与した場合（第５群）では、中間的な細菌力価であった。１６日目にコレラ菌だけを注射した第２群、第１群または５群のいずれよりも腫瘍組織の細菌力価が低かった。従って、腫瘍は、まずＶＶ−ＴＫ−−ｇｆｐ−ｌａｃＺウイルスがコロニー形成した場合に細菌がコロニー形成しやすかった。
第３群、４群および５群のウイルス力価を比較したところ、１６日目にウイルスだけを注射した第４群が最高のウイルス力価を示し、第５群および第３群がこれに次いだ。第５群のウイルス力価は第３群よりもやや高かったが、明らかに有意な差とはいえなかった。第４群の１匹のマウスは、第４群の他の２匹のマウスのウイルス力価に比べて極端にかけ離れた値のウイルス力価を示した。このマウスを含めずに数値を再評価したが、全般的な傾向は同じであった。第４群の平均ウイルス力価は、第３群および５群のウイルス力価にずっと近かった。この分析における３群からのデータに有意な差はなかった。従って、予め細菌を投与した後にウイルスを投与しても、ウイルス単独の投与に比べて、腫瘍のウイルスコロニー形成を有意に変化させなかった。
（実施例１３）
ＰＮＰ発現細菌およびプロドラッグの投与による腫瘍阻害
プラスミド ｐＳＯＤ−ＤｅｏＤは、構成的ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）プロモーターの制御下に、細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（ＰＮＰ）(Sorcher et al. (1994) GeneTher. 1(4):223−238)を含む。プラスミドｐＳＯＤ−ＤｅｏＤ−ｌｕｘは、ｐＳＯＤ−ＤｅｏＤに挿入されたｌｕｘＣＤＡＢＥ発現カセット(Voisey et al. (1998) Biotechniques 24:56−58)を含む。
ＰＮＰは無毒のプロドラッグ６−メチルプリンデオキシリボース（６−ＭＰＤＲ）を、ＤＮＡの複製、転写および翻訳を阻害する６−メチルプリンに変換する(Sorcher et al. (1994) GeneTher. 1(4):223−238)．
腫瘍増殖阻害
ヌードマウスに、ｐＬＥＩＮレトロウイルス形質転換Ｃ６神経膠腫細胞を注射した。このｐＬＥＩＮレトロウイルスはウイルスプロモーターＬＴＲ（Clontech；また、ＷＯ０３／１４３８０も参照）の制御下でＥＧＦＰを発現する。細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌ＤＨ５αを、腫瘍移植後８日目に、プロドラッグ（６−メチルプリンデオキシリボース（６−ＭＰＤＲ））と一緒に、またはなしに注射した。その後の各時点で腫瘍体積をモニタリングした（これまでの実施例で行った通り）。
Figure 2009201515
第２群および３群は、腫瘍移植後８日目から２１日目まで同等の腫瘍増殖を示した。ＰＮＰを発現する大腸菌とプロドラッグの双方を受容した第１群は、最後の時点で、対照の第２群および３群と比べ、腫瘍の大きさに〜２０％の減少を示した。
腫瘍増殖に対する細菌のコロニー形成およびプロドラッグの効果をさらに試験するため、ヒト乳癌モデルであるヌードマウスにおけるＧＩ−１０１Ａ腺癌を選択した。ＧＩ−１０１ＡはＧＩ−１０１に由来するものであった。ＧＩ−１０１は、Rumbaugh−Goodwin Institute for Cancer Researchで研究者らが、５７歳女性患者の浸潤性腺管癌（ステージＩＩＩａ、Ｔ３Ｎ２ＭＸ）の局部的な一次再発から得たものである。皮下異種移植ヌードマウスモデルでは、腫瘍は一貫して肺に転移する。ＧＩ−１０１Ａは、Ｃ６神経膠腫モデルに比べて増殖の遅い腫瘍モデルである。
１５匹の４週齢雌ヌードマウスの右側大腿に、各々ＧＩ−１０１Ａ細胞を皮下注射する。腫瘍発達後３０日に細菌を注射する。大腸菌ＤＨ５αをｐＳＯＤ−ＤｅｏＤまたはｐＳＯＤ−ＤｅｏＤ−ｌｕｘで形質転換させる。これらの細菌をＬＢ培地中、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下、３７℃で一晩増殖させる。一晩増殖させた後、細菌をＯＤ６００で計数し、細菌をＢＨ１培地に示された密度で再懸濁させる。これらの懸濁液を、２９ １／２ゲージの針を取り付けた１ｃｃインスリンシリンジで、外科的に露出させた静脈から、またはそうでなければ示されているようにして動物に静注する。注射後、切開部を縫合する。
細菌の注射後、４日ごとにマウス群にプロドラッグを投与する。１週間に２回、腫瘍増殖をデジタルノギスでモニタリングする。本明細書の実施例に記載されているように、ルシフェラーゼの画像化を行う。終了時に動物を殺し、実施例Ｂに記載されているように器官をアッセイする。組織学的分析を行い、細菌のコロニー形成および／または薬物処置による腫瘍壊死の程度を測定する。
当業者には改変が明らかであり、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。

Claims (24)

  1. ポリペプチドもしくはＲＮＡ分子または生産化合物の生産のための方法であって、
    （ａ）そのポリペプチドもしくはＲＮＡをコードする核酸を含むか、または産物として化合物を産生する微生物を固形腫瘍担持非ヒト動物に投与すること；なお、
    その微生物は免疫特権細胞に集積し；かつ
    その微生物は、免疫特権細胞または組織を含まない器官および組織には毒性レベルまで集積しないものであり；
    （ｂ）その動物から腫瘍組織を採取すること；そして
    （ｃ）その採取した腫瘍からポリペプチドもしくはＲＮＡまたは化合物を単離すること
    を含む、方法。
  2. 前記微生物が弱毒細菌またはウイルスである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記微生物が細胞質内ウイルスである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記微生物が細菌であり、前記細菌が弱毒ビブリオ菌株、大腸菌株、リステリア菌株、サルモネラ菌株および連鎖球菌株の中から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 請求項１〜４に記載の方法であって、前記宿主が前記ポリペプチド、ＲＮＡ分子または化合物と特異的に反応する抗体を生産し、
    そしてその動物の血清から抗体を単離し、それによりポリペプチド、ＲＮＡ分子または化合物と、前記ポリペプチド、ＲＮＡ分子または化合物に対する抗体を同じ宿主内に産生すること
    をさらに含む、方法。
  6. その動物から腫瘍組織を採取し；そして
    その採取した腫瘍織から前記ポリペプチド、ＲＮＡ分子または生産化合物を単離し、
    その後に抗体を単離する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記微生物がウイルスである、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記微生物がポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびシンドビスウイルスの中から選択されるウイルスである、請求項１〜３および請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記微生物が、レポーター遺伝子構築物をコードするＤＮＡ分子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記レポーター遺伝子構築物が、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導もしくは生成するタンパク質をコードする、請求項９に記載の方法。
  11. 前記タンパク質がルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記レポーター遺伝子構築物が生物発光生成系をコードし、さらに所望により蛍光タンパク質をコードする、請求項９に記載の方法。
  13. 前記微生物が細菌である、請求項１〜３、５、６および９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記微生物がウイルスである、請求項１〜３、５、６および９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ワクシニアウイルスがＬＩＶＰ株である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記細菌が弱毒コレラ菌である、請求項１３に記載の方法。
  18. さらに宿主の血清から宿主腫瘍抗原に特異的な抗体を単離することも含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記微生物が細菌またはウイルスである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記微生物が弱毒細胞質内ウイルスである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記微生物が弱毒ポックスウイルスである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記微生物がワクシニアウイルスである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ウイルスがＬｉｓｔｅｒ株である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ウイルスがＬＩＶＰ株である、請求項２３に記載の方法。
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