JP2010536344A - 溶液中のアスパラギナーゼ活性の増加方法 - Google Patents

溶液中のアスパラギナーゼ活性の増加方法 Download PDF

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Abstract

安定なアスパラギナーゼ溶液か開示されている。一態様において、飲料水を処理して塩素の濃度を減少させて、アスパラギナーゼの残存酵素活性を高める。処理は、塩素成分を除去するか、塩素の濃度を減少させる添加剤を供給することによって行うことができる。添加剤としては、還元剤および塩素捕捉剤が挙げられる。除去技術としては、活性炭の使用、イオン交換、エアストリッピングが挙げられる。

Description

本発明は、アクリルアミド前駆体であるアスパラギンの食品中での量を減少させるための方法に関する。より詳細には、本発明は、溶液中の酵素アスパラギナーゼの安定性を高めることに関する。
特許文献１において検討されているように、アクリルアミドは、アスパラギンを含んだ熱処理された食品中で見つかっている。食品の調理前に該食品に酵素アスパラギナーゼを添加することにより、形成されるアクリルアミドの量を減らすことができるものもある。
アスパラギナーゼのようなアクリルアミド低減酵素を、バッチスケールではなく、商業スケールで食品に添加することには、いくつかの課題がある。たとえば、酵素アスパラギナーゼは、アスパラギンの加水分解を易化するために遊離のアスパラギンと接触しなければならない。酵素は典型的には比較的濃縮された形で供給されるので、酵素は理想的には、食品を酵素溶液に接触させる前に水性溶液中に混合および希釈される。たとえば、食品の酵素溶液への接触は、生地を作成することと、この生地に酵素溶液を混合することとを含んでいてよい。
酵素活性を定量するための既知の方法は、酵素をユニットに換算して記載することによる。酵素活性の１ユニットは、１分間に１マイクロモルの基質を転化させるのに必要な触媒としての酵素の量である。したがって、食品中のアスパラギンなどの基質または化合物の相対濃度と、食品の量とがわかれば、所望の化合物、この場合はアスパラギンを異なる化合物に転化させるのに必要なアスパラギナーゼなどの酵素のユニット数を算出することができる。
以前より理由はわからないのであるが、過剰用量（食品中のすべてのアスパラギンを転化させるのに必要な数学的に予想される量を超える量という意味）のアスパラギナーゼ酵素をマッシュポテトやコーンマサなどの食品中で用いた場合であっても、依然として生地中に測定可能な濃度のアスパラギンが残っていることが多い。
米国特許第７０３７５４０号明細書
ある種の食品が熱処理される際に形成されるアクリルアミドの量を減らすことが望ましいため、商業スケールで製造される食品中のアクリルアミド前駆体を減らすために用いられる酵素の効率を最大化する装置および方法を手に入れることが望ましいと考えられる。
本発明は、一態様において、水から塩素を除去することにより飲料水から安定なアスパラギナーゼ溶液を調製する方法に向けられている。一態様において、塩素は、イオン交換、逆浸透、活性炭によって、および／またはエアストリッピングによって除去される。一態様において、還元剤および塩素捕捉剤などの添加剤を用いて飲料水を処理する。一態様において、処理した水をアスパラギナーゼと混合して、アスパラギナーゼ溶液を調製する。本発明の上記およびさらなる特徴および利点は、下記の詳細な説明において明らかになるであろう。
飲料水の種々の処理後の残存酵素活性を示すグラフである。 種々の塩水混合物の残存酵素活性を示すグラフである。
本発明を特徴づけると確信する新規の特徴は、添付の請求項に記載する。しかしながら、本発明自体、ならびに、その好ましい使用の形態、さらなる目的および利点は、添付の図面と合わせて以下の詳細な説明を参照することにより、最もよく理解されるであろう。
一実施形態において、本発明は、アスパラギナーゼの安定性を高め、アスパラギナーゼ活性を保護する水性溶液を提供することに向けられる。アスパラギンがアクリルアミドの前駆体であることから、アスパラギナーゼ活性の強化は、食品中でのより効果的なアクリルアミド低減と言い換えることができる。本明細書中で用いる「酵素活性」は、ユニット数で表す。１ユニットのアスパラギナーゼは、１分間に１マイクロモルのアスパラギンを加水分解することができる。
一実施形態において、熱処理によって形成されるアクリルアミドの量を減らすことが望ましい食品は、生地から製造される。「加工スナック」という用語は、元の改質されていないデンプン質出発材料以外の何かをその出発成分として用いるスナック食品を意味する。たとえば、加工スナックとしては、脱水ポテト製品を出発材料として用いる加工ポテトチップスや、コーンマサをその出発材料として用いるコーンチップスが挙げられる。ただし脱水ポテト製品は、ポテト粉、ポテトフレーク、ポテト顆粒、または脱水ポテトの他の存在形態であってよい。これらの用語のいずれかが本願で用いられる場合には、これらの変形のすべてが含まれるものとする。例示にすぎず限定することはないが、アスパラギナーゼ溶液を添加することのできる「加工食品」の例としては、たとえば、トルティーヤチップス、コーンチップス、ポテトフレークおよび／または新鮮なマッシュポテトから製造されるポテトチップス、マルチグレインチップス、コーンパフ、小麦パフ、米パフ、クラッカー、パン（ライ麦、小麦、オート麦、ポテト、精白小麦粉、全粒、および混合粉など）、ソフトおよびハードプレッツェル、ペストリー、クッキー、トースト、コーントルティーヤ、フラワートルティーヤ、ピタパン、クロワッサン、パイ生地、マフィン、ブラウニー、ケーキ、ベーグル、ドーナツ、シリアル、押し出しスナック（ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｓｎａｃｋｓ）、グラノーラ製品、小麦粉、コーンミール、マサ、ポテトフレーク、ポレンタ、バターミックスおよび生地製品、冷蔵および冷凍生地、再構成食品、加工および冷凍食品、肉および野菜につけるパン粉、ハッシュブラウン、マッシュポテト、クレープ、パンケーキ、ワッフル、ピザクラスト、ピーナツバター、刻んで加工したナッツを含む食品、ジェリー、フィリング、マッシュ果物、マッシュ野菜、ビールやエールなどのアルコール飲料、ココア、ココアパウダー、チョコレート、ホットチョコレート、チーズ、犬や猫の食料などの動物食品、および、シーティングまたは押し出しにかけられるか、または生地または成分の混合物から製造される、他の任意の人または動物用食品が挙げられる。
本明細書中の「加工食品」という用語は、上記に定義したような加工スナックを含む。「食品」という用語は、前述の定義したようなすべての加工スナックおよび加工食品を含む。
本明細書でいう熱処理された食品には、アスパラギナーゼ溶液で処理することのできる食品、限定はされないがたとえば、加工スナックおよび加工食品の例としてあげた前述のすべての食品、ならびに、フレンチフライ、薄切りポテト、ヤムイモフライ、他の根菜類、調理したアスパラガス、タマネギ、トマトなどの調理野菜、コーヒ豆、ココア豆、調理した肉、乾燥果物および乾燥野菜、熱処理した動物の餌、タバコ、茶、焙煎または調理したナッツ、大豆、糖蜜、バーベキューソースなどのソース、プランテンチップス、リンゴチップス、バナナフライ、および他の調理した果物が挙げられる。
このような実施形態のいくつかによれば、生地を作るための所望の成分を水と一緒に混合して、所望の量のアスパラギナーゼも処理後の水とともに混合して、アスパラギナーゼ溶液を調製する。アスパラギナーゼ溶液は、その後、生地に加えてもよい。一実施形態において、アスパラギナーゼ溶液を所望の成分に直接混合して、生地を作る。その後、その生地を熱処理された食品にしてもよい。
商用施設においては、生地およびアスパラギナーゼ溶液を作るために使用される水は、その施設で容易に入手可能な水であり、典型的には、各地の都市給水から末端利用者に供給される飲料水である。本明細書において用いる「飲料水」とは、限定はされないが、たとえば都市水道からの水を含む、飲用に適した水道から供給される水を意味する。ほとんどすべての米国の都市水道は、飲料水が蛇口において残留塩素を含むのに十分な塩素を飲料水に添加している。多くの都市水道管区では、飲料水にクロラミンを添加しているが、これはクロラミンが塩素よりもさらに安定であるからである。本明細書において塩素とは、塩素の酸化型として定義され、限定はされないが、たとえば、クロラミンおよび次亜塩素酸塩が挙げられる。同様に、塩酸（ＨＣｌ）や塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）によって提供されるような、塩化物イオンの非酸化型は、この定義からは除外される。
本願発明者は、飲料水の特定の特徴、たとえば、塩素の存在が、アスパラギナーゼ酵素の活性を、食品製造に対する商用設定において有用でなくなる点まで低下させることを発見している。本明細書中で用いる「残存酵素活性（％として示す）」とは、対照の酵素活性をサンプルの酵素活性で割ったもののことをいい、様々な試験条件下での酵素活性の相対測定値を提供する。本願発明者はまた、飲料水の酵素活性への影響を軽減し、アスパラギナーゼの残存酵素活性を商用設定において有用であるように保護するための方法及び装置を確認した。以下の実施例は上述のことを説明するものである。
アリコートから４つの溶液を調製した。各アリコートには等しい初期アスパラギナーゼ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）活性が加えられており、各アリコートは各溶液が約５０ｍＬの全体積を有するように蒸留水または飲料水にて希釈した。溶液番号３および４に対する飲料水は、ノーステキサス地方給水区（Ｎｏｒｔｈ Ｔｅｘａｓ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｗａｔｅｒ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ）からプレーノ（米国テキサス州）へ供給される飲料水とした。各溶液において用いた水の種類を下記の表１ａに示す。
Figure 2010536344
 溶液番号２〜４のそれぞれを約３５℃にて４０分間加熱してから、溶液番号１を残存酵素活性比較のための対照として用いて、酵素活性およびｐＨを測定した。溶液番号１は、約１０℃の温度で約４０分間冷蔵した。
測定値を下記の表１ｂに示す。
Figure 2010536344
 酵素活性および残存酵素活性に対する試験は、本開示の最後に記載する試験方法を用いて行ったことを明記したい。溶液番号１（対照）と比較して、溶液番号２は、酵素活性を全く損失しなかった。溶液番号３は、ｐＨが約８．２２で、わずかにアルカリ性であり、アスパラギナーゼ酵素は約３５℃で約４０分後にその活性の約６２％を失っていた。希塩酸を飲料水（溶液番号４）に添加することにより、ｐＨが約７．５５に下がり、アスパラギナーゼは、約３５℃で約４０分間加熱後にその活性の約４８％を失っていた。したがって、溶液番号３のアルカリ度が、酵素活性のある程度の損失に関与していると思われる。ｐＨはアスパラギナーゼ活性に影響し、アスパラギナーゼ活性はｐＨが約４〜７の間である時により高くなると一般に理解されている。
アリコートから４つの溶液を調製した。各アリコートは等しい初期アスパラギナーゼ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）活性を有しており、各アリコートは各溶液が約５０ｍＬの全体積を有するように脱イオン水または飲料水にて希釈した。各溶液において用いた水の種類を下記の表２ａに示す。
Figure 2010536344
 溶液番号２〜４のそれぞれを約３５℃で約４０分間加熱してから、塩素濃度、水硬度、ｐＨおよび酵素活性を測定した。対照は加熱しなかった。測定値を下記の表２ｂに示す。
Figure 2010536344
 本データは、塩素が残存酵素活性に対して持つ負の影響を明確に実証している。たとえば、溶液番号１（対照）は、塩素を一切含まず、最も高い残存酵素活性を有していた。溶液番号２は、残存酵素活性が最も低くて、遊離塩素および全硬度のレベルが最も高かった。
溶液番号３は、遊離塩素が比較的低い濃度であり、硬度が中程度であり、残存活性は８０％を超えていた。溶液番号４は、溶液番号３と比較して、同様の遊離塩素濃度を有し、硬度が低く、わずかに高い残存活性を示した。表２ｂは、アスパラギナーゼの残存酵素活性が、塩素の濃度に反比例することを実証している。
アリコートから４つの溶液を調製した。各アリコートは等しい初期アスパラギナーゼ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）活性を有しており、各アリコートは各溶液が約５０ｍＬの全体積を有するように脱イオン水または飲料水にて希釈した。各試料において用いた水の種類を下記の表３ａに示す。
Figure 2010536344
 溶液番号２〜４のそれぞれを約３５℃で約４０分間加熱してから、遊離塩素、水全硬度、ｐＨおよび残存酵素活性を測定した。測定値を下記の表３ｂに示す。
Figure 2010536344
 上記表３ｂが示すように、溶液２によって示されるように脱イオン水に塩素を添加するか、溶液３によって示されるように飲料水中に塩素が存在することで、アスパラギナーゼ酵素の残存活性が明らかに低下する。さらに、溶液１における脱イオン水中の酵素の残存活性レベルによって実証され、溶液４におけるＢＲＩＴＡ濾過した水中の残存酵素活性によって実証されるように、塩素を除去するか、塩素が存在しない場合には、酵素の活性が明らかに増加する。溶液２に対する塩素濃度は測定されなかったが、これは、次亜塩素酸ナトリウムの形の塩素を溶液に加えたからである。また、飲料水であったので、溶液３における塩素の相対濃度は、飲料水とほぼ同じ濃度であることがわかっていた。
本試験は、飲料水中に見られる量の塩素を、塩素を含まない脱イオン水に加えて、アスパラギナーゼ活性に対する塩素の影響を確かめることにより、酵素活性に対する塩素の影響を分析することを目的とする。
アリコートから４つの溶液を調製した。各アリコートは等しい初期アスパラギナーゼ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）活性を有しており、各アリコートは各溶液が約５０ｍＬの全体積を有するように脱イオン水または飲料水にて希釈した。各試料において用いた水の種類を下記の表４ａに示す。
Figure 2010536344
 溶液番号２〜４のそれぞれを約３５℃で約４０分間加熱してから、塩素、ｐＨ、および残存酵素活性を測定した。溶液１は加熱しなかった。測定値を下記の表４ｂに示す。
Figure 2010536344
 上記表４ｂ中のデータは、塩素が単独で水に加えられた場合には、残存アスパラギナーゼ活性が実質的に低下することを実証している。しかしながら、比較的低い濃度では塩素の残存酵素活性に対する影響は小さい。
飲料水への修飾がアスパラギナーゼの残存活性に与える潜在的影響を確かめるために、５つの溶液を準備した。各溶液は、アリコートから調製し、各アリコートは等しい初期アスパラギナーゼ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）活性を有しており、各アリコートは各溶液が約５０ｍＬの全体積を有するように脱イオン水または飲料水にて希釈した。溶液をわずかに酸性にするためにクエン酸を加えた。各溶液において使用した水の種類を下記の表５ａに記載する。
Figure 2010536344
 溶液番号２〜５のそれぞれを約３５℃で約４０分間加熱してから、遊離塩素、全塩素、ｐＨおよび残存酵素活性を測定した。溶液１は加熱しなかった。測定値を下記の表５ｂに示す。
Figure 2010536344
 図１ａは、飲料水の種々の処理後の残存酵素活性を示すグラフである。酵素活性は、棒グラフの棒によって示し、全塩素濃度は線（１５０）によって示す。このデータから明らかなように、チオ硫酸塩（飲料水中の塩素濃度よりも約５倍の濃度で添加）は、塩素濃度を減少させ、酵素活性を８６％（１４０）に増加させた。１．２ｐｐｍの全塩素を有する飲料水は、わずか１２％（１１０）の比較的低い残存活性を有していた。クエン酸は、飲料水における塩素の濃度を低下させ、酵素活性を３２％（１２０）まで増加させた。
ＥＤＴＡを含む飲料水中の酵素活性（１３０）は、脱イオン水中の酵素活性（１００）と同等であったが、ＥＤＴＡは、全塩素をわずかに減少させただけであった。理論と結びつけることなく、出願人は、ＥＤＴＡが酵素を被覆することにより塩素から保護しているか、ＥＤＴＡが塩素と結びつくか、のいずれかであると確信している。たとえば、試験時には塩素が目立っているが、反応、すなわちＥＤＴＡと塩素の間の可逆反応が、塩素の酸化を防止する、またはアスパラギナーゼとの反応を防止するのかもしれない。したがって、ＥＤＴＡは塩素を不活性化すると思われる。結果として、一実施形態において、塩素がアスパラギナーゼの活性を低減することを防止する添加剤、および／または塩素を不活性化する添加剤を加えることができる。
飲料水中によく見られる硬水成分の潜在的影響を確かめるために、５つの溶液を準備した。各溶液をアリコートから調製し、各アリコートは等しい初期アスパラギナーゼ（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ、Ａ／Ｓ）活性を有しており、各アリコートは各溶液が約５０ｍＬの全体積を有するように脱イオン水または飲料水にて希釈した。各塩溶液は、プレーノ（テキサス州）からの飲料水中に見られる炭酸カルシウムの濃度の約２倍である、５ｍＭ（５ミリモル）の塩濃度となるように加えられた塩を有するようにした。たとえば、上記の表３ｂを参照して、溶液番号３（プレーノ飲料水）に対する全硬度は、約２．２８ｍＭに対応する２２８ｍｇ／Ｌである。各溶液において使用した種々の種類の塩を下記の表６ａに記載する。
Figure 2010536344
 溶液番号２〜５のそれぞれを約３５℃で約４０分間加熱してから、残存酵素活性を測定した。測定値を下記の表６ｂに示す。
Figure 2010536344
 図１ｂは、種々の塩と水との混合物の残存酵素活性のグラフであり、上記表６ｂからの結果を示すグラフである。添加された塩は酵素安定性に何ら明白な効果は有しなかった。したがって、塩素はアスパラギナーゼ活性の損失の大半に関わっていると確信される。
等しいアスパラギナーゼ初期活性を有する２つのアリコートを同等に脱イオン水（セル１）と水道水（セル２）で希釈して、第１のアスパラギナーゼ溶液と第２のアスパラギナーゼ溶液を調製した。各溶液を室温に３０分間保持した後、各アスパラギナーゼ溶液をコーンマサに加えた。マサ中のアスパラギンを、酵素をマサに加えてから５分後および１０分後に測定し、測定値を下記表７に示す。
Figure 2010536344
 上記表７に示したコーンマサ中のアスパラギンの濃度は、得られたアスパラギン濃度が、根底にある希釈アスパラギナーゼ溶液に大いに依存していることを実証するものである。上記に示した実施形態において、そのレベルの差は、脱イオン水による処理後と飲料水による処理後で、コーンマサ中のアスパラギン濃度で約一桁であった。
上記に示したデータは、アスパラギナーゼの残存活性を最大化するためには、活性塩素濃度を下げなければならないことを明確に示すものである。脱イオン水および蒸留水は高価であるので、本発明は飲料水または他の水源から塩素を選択的に除去するか、および／または不活性化することにより、残存酵素活性を最大化する方法を提供する。
飲料水中の酵素活性低減成分の濃度を低下させることのできる当該技術分野において知られるあらゆる方法を用いることができ、それには、限定はされないが、飲料水を、活性炭を通した濾過、エアストリッパー（塩素を揮発させる）、逆浸透系、および／またはイオン交換樹脂により、その活性低減成分の濃度を低減するように処理することが含まれる。飲料水は、安定な酵素溶液を調製するために活性低減成分の濃度を低下させるのに十分な量の脱イオン水または蒸留水と同飲料水とを混合することにより、処理してもよい。
本明細書中で用いる「捕捉剤」とは、塩素と反応することによって酵素活性を保護する任意の添加剤のことをいう。したがって、酵素低減成分に対する捕捉剤を飲料水に加えてもよい。たとえば、一実施形態において、塩素に対する捕捉剤であるチオ硫酸塩を飲料水に添加する。さらに、他の添加剤を用いて塩素を不活性化してもよい。たとえば、塩素は強力な酸化剤であるので、還元剤を飲料水に加えて塩素と反応させることもできる。還元剤は、酸化還元化学において、電子供与体となる化合物であることが知られており、酸化剤は電子受容体であることが知られている。したがって、一実施形態において、１つ以上の還元剤（たとえば、電子供与体）を飲料水の供給源に加えて、塩素を不活性化または中和してもよい。還元剤の例としては、限定はされないが、塩化第一スズ二水和物、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、イソアスコルビン酸（エリソルビン酸）、アスコルビン酸誘導体の塩、鉄、亜鉛、第一鉄イオン、およびその組み合わせが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、全塩素濃度を約０から約０．５ｐｐｍ未満、好ましくは０から約０．１ｐｐｍの濃度に減少させる。
一実施形態において、アスパラギナーゼを処理水と混合して、安定なアスパラギナーゼ溶液を調製し、その後アスパラギナーゼ溶液を食品と混合するようにしてもよい。一実施形態において、飲料水は十分に処理され、処理飲料水に酵素が加えられてから、少なくとも３０分間の間、より好ましくは少なくとも約４時間の間、残存酵素活性が少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であれば、安定な酵素またはアスパラギナーゼ溶液ができている。一実施形態において、残存酵素活性は、アスパラギナーゼ溶液が生地に混合されるのに必要な時間の間、少なくとも約９０％である。
本開示を手引きに、当業者は、所望の残存酵素活性を得るために必要な水組成を確認し、提供することができるであろう。
アスパラギナーゼ溶液を添加することのできる食品としては、限定はされないが、たとえば、生地、スラリー、およびアクリルアミド濃度を下げることが望まれる任意の他の消耗品が挙げられる。たとえば、一実施形態において、アスパラギナーゼ溶液をポテトフレークから作ったポテトスラリーに加える。一実施形態において、ポテトスラリーは、アスパラギナーゼ溶液をポテトフレークに加えることによって調製される。一実施形態において、アスパラギナーゼ溶液は、添加される水に対して用いられ、生地を作るための粉混合物に加えられる。一実施形態において、アスパラギナーゼ溶液は、コーンマサに加えられる。
一実施形態において、本発明は、アスパラギンを有する食品成分に加えることのできるアスパラギナーゼの安定な溶液を提供するための装置を含む。一実施形態において、装置は、水を処理するための処理系を含む。処理系は、活性炭を通して、または他の上記に列挙した除去方法によって塩素のような成分を除去することができるか、および／または、処理系は、アスパラギナーゼの活性を、添加剤未添加の場合よりも高いレベルに向上させる、限定はされないがたとえば、還元剤、塩素捕捉剤、またはＥＤＴＡを含む添加剤を提供することができる。処理水は、その後、混合槽に送られて、ここでアスパラギナーゼを該水で希釈して、安定なアスパラギナーゼ溶液を調製することができる。その後、アスパラギナーゼ溶液は計量供給などにより、加工食品製造用の生地に加えられるか、上述のように熱処理される。その後、当該技術分野において周知のように、生地をさらに加工（たとえば、押し出しやシーティングによる成形や熱処理）してもよい。当業者であれば、本開示を手引きにして、アスパラギナーゼ溶液が食品中のアクリルアミドの濃度を低減することが望まれるあらゆる場面において本発明が使用可能であることを理解するであろう。
一実施形態において、本発明は、飲料水の供給源およびアスパラギナーゼの供給源と、処理水中のアスパラギナーゼの活性を未処理の場合よりも高いレベルに向上させる処理系と、処理飲料水およびアスパラギナーゼを混合する送達系と、を含む装置からなる。一実施形態において、送達系は、処理系からの処理水とアスパラギナーゼとを受け入れる混合槽を含む。
本願の実施例に対してアスパラギナーゼ活性決定に用いた試験方法を以下に示す。
Ｉ．背景 アスパラギナーゼ活性に対するＳＩＧＭＡの手順は、ｐＨ８．６のトリスバッファ（ＳｉｇｍａカタログＡ４８８７）を用いた。食品グレードのアスパラギナーゼはｐＨ８．６において低い活性しか有さないので、アッセイはＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）でｐＨ７．０に変えて行った。
ＩＩ．原理
Figure 2010536344
 ＩＩＩ．条件：Ｔ＝３７℃、ｐＨ＝７．０、Ａ４３６、光路＝１ｃｍ
ＩＶ．方法：分光光度ストップレート判定
Ｖ．試薬
ａ．１００ｍＭのＭＯＰＳナトリウム塩（３−モルホリノプロパンスルホン酸）。２．０９ｇのＭＯＰＳ（ＳｉｇｍａＭ５１６２）を秤量する。室温において約６０ｍＬの脱イオン水に溶解する。水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨを７．０に調整する。脱イオン水で１００ｍＬにメスアップする。使用時以外は冷蔵庫にて保存する。
ｂ．１８９ｍＭのＬ−アスパラギン溶液。０．２５ｇのＬ−アスパラギン無水物を秤量し、１０ｍＬの脱イオン水に溶解する。使用時以外は冷蔵庫にて保存する。冷蔵後、使用前に超音波処理してアスパラギン結晶を溶解させる。
ｃ．６ｍＭの硫酸アンモニウム標準溶液（ＮＨ４）２ＳＯ４標準）。０．０７９ｇの硫酸アンモニウムを化学天秤の上に計りとり、０．０００１ｇまで記録秤量した。脱イオン水で溶解し、１００ｍＬの体積にまでメスアップする。使用時以外は冷蔵庫にて保存する。
ｄ．１．５Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）。２．４５ｇのトリクロロ酢酸を秤量する。脱イオン水で溶解し、１０ｍＬまでメスアップする。
ｅ．アンモニア色試薬：Ａｍｍｍｏｎｉａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｈｉｇｈ（ネスラー法、ラモッテ（ＬａＭｏｔｔｅ）コード３６４２−ＳＣ，ＶＷＲカタログ番号３４１８６−９１４）に対するテストキット。試薬番号２は水銀を含む。
ｆ．アスパラギナーゼ酵素溶液：使用直前に、室温の脱イオン水中に２．０〜４．０ユニット／ｍＬのアスパラギナーゼを含む溶液を調製する。酵素が凍っている場合には、希釈のためのアリコートをとる前に、生ぬるい水中で完全に溶かす。典型的な酵素濃度に対しては、０．１ｍＬの酵素溶液を５０ｍＬに希釈するとよい。
ＶＩ．手順：
ａ．バイアルに対する加熱ブロックを３７℃に設定する。
ｂ．調節可能なマイクロピペットを用いて、次の試薬をバイアル（ｍＬ）に移す。
Figure 2010536344
 ｃ．バイアルに蓋をし、３７℃の加熱ブロックに配置する。加熱ブロックの攪拌を開始する。
ｄ．３０分後、加熱ブロックからバイアルを除去する。バイアルの蓋をとり、ＴＣＡ試薬を迅速に加え、混合する。次に、試薬Ｆ（酵素溶液）を酵素ブランクに加える。酵素試験溶液については、バイアルを加熱ブロックから外してからＴＣＡを加えるまでの時間ができるだけ短くなるようにすべきである。ＴＣＡを加えた後、アンモニア測定までの時間は重要ではない。ブランクと標準についてはバイアルを加熱ブロックから外してからＴＣＡを加えるまでの時間は重要でない。
Figure 2010536344
 ｅ．０．２ｍＬの各溶液をピペットで試験管またはバイアルにとる。４．３０ｍＬの脱イオン水、４滴のラモッテ試薬番号１および０．５０ｍＬのラモッテ番号２を加える。溶液を混合し室温に１０〜２０分間放置してから、１ｃｍセル中の４３６ｎｍにおける吸光度を読む。脱イオン水にて分光光度計のゼロ合わせを行う。
ＶＩＩ．結果の計算
ｆ．アンモニアに対する較正曲線から酵素活性を計算する（マイクロモル／０．２ｍＬ）。
ｇ．計算段階の説明
ｉ．硫酸アンモニウム標準溶液濃度の計算：
ｍＭ＝（０．０８０９ｇ）＊（１０００ｍＭ／Ｍ）＊（２ＮＨ３／ＮＨ４ＳＯ４）／（（１３２．１４ｇ／モル）＊（０．１Ｌ））＝１２．２４ｍＭ＝ミリモル／Ｌ＝マイクロモル／ｍＬ
０．０８０９ｇが標準に対する硫酸アンモニウムの重量である場合：
ｉｉ．２．２ｍＬ標準中のＮＨ３のマイクロモルは次のように算出される。
２．２ｍＬ標準中のＮＨ３のマイクロモル＝（標準溶液のＮＨ３マイクロモル／ｍＬ）＊（標準のｍＬ）
ｉｉｉ．０．２ｍＬあたりのＮＨ３のマイクロモルは次のように算出される。
０．２ｍＬあたりのＮＨ３のマイクロモル＝（２．２ｍＬ中のＮＨ３のマイクロモル）＊（０．２ｍＬ）／（２．２ｍＬ）
ｉｖ．回帰曲線を
ｘ＝Ａ４３６
ｙ＝０．２ｍＬあたりのＮＨ３のマイクロモル
を用いて計算する。
ｖ．較正曲線から、０．２ｍＬあたりのＮＨ３のマイクロモルを計算する。
０．２ｍＬあたりのＮＨ３のマイクロモル＝（勾配）＊（Ａ４３６）＋切片
ｖｉ．希釈酵素溶液の活性を次の式によって計算する。
酵素のユニット／ｍＬ＝（遊離したＮＨ３のマイクロモル）＊（２．２０）／（０．２＊３０＊０．１）
ここで：
２．２０ｍＬ＝ステップ１からの体積（ステップ１は酵素アッセイ溶液）
０．２ｍＬ＝ステップ２において用いたステップ１の体積（ステップ２は色展開）
３０分＝アッセイ時間の分数
０．１ｍＬ＝使用した酵素の体積。
ｖｉｉ．希釈係数は、５０ｍＬを５０ｍＬに希釈された濃縮酵素の体積で割ったもの。
ｖｉｉｉ．希釈前の酵素溶液の濃度＝（希釈溶液のユニット／ｍＬ）＊（希釈係数）
本発明は、いくつかの実施形態を参照して詳述してきたが、当業者であれば、溶液中の残存アスパラギナーゼ活性を保護するための他の種々の手法を、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りで行ってよいことを理解するであろう。

Claims (20)

  1. 溶液中のアスパラギナーゼ活性を増加させる方法であって、前記方法は、
    ａ）飲料水を処理して、塩素濃度が約０．５ｐｐｍ未満の処理水とする工程と、
    ｂ）アスパラギナーゼを前記処理水と混合して、アスパラギナーゼ溶液を調製する工程とを含む方法。
  2. 飲料水を酸で処理することを含む請求項１に記載の方法。
  3. 飲料水を活性炭を用いて処理することを含む請求項１に記載の方法。
  4. 工程ａ）における前記処理水は、イオン交換樹脂を用いて処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 工程ａ）における前記処理水は、逆浸透を用いて処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記処理水は、エアストリッピングによって処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記アスパラギナーゼ溶液は、少なくとも約８０％の残存活性を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記処理水は、還元剤によって処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記還元剤は、塩化第一スズ二水和物、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、イソアスコルビン酸（エリソルビン酸）、アスコルビン酸誘導体の塩、鉄、亜鉛、第一鉄イオン、およびその組み合わせから選択される１つ以上の物質を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 前記処理水は、約８．０未満のｐＨを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記飲料水は、塩素の最終濃度を、添加剤未添加の場合よりも低い濃度にまで減少させるのに十分な添加剤で処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 前記処理水は、塩素捕捉剤によって処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. 前記添加剤はチオ硫酸塩を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  14. 飲料水から安定な酵素溶液を調製する方法であって、前記飲料水への酵素の添加後、同飲料水からの１つ以上の活性低減成分を、少なくとも約３０分にわたって残存酵素活性を与えるような量で、不活性化することによる、方法。
  15. 前記活性低減成分は塩素を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 前記塩素は、前記飲料水を活性炭に通すことによって除去されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記飲料水にＥＤＴＡが加えられることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  18. 飲料水の供給源と、アスパラギナーゼの供給源と、アスパラギナーゼとの混合前に飲料水を処理する処理系と、処理飲料水とアスパラギナーゼとを混合する送達系と、を含む装置。
  19. 前記処理系は塩素を除去することを特徴とする請求項１８に記載の装置。
  20. 前記処理系は塩素を不活性化することを特徴とする請求項１８に記載の装置。
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