JPH0630782A

JPH0630782A - 酵素反応方法

Info

Publication number: JPH0630782A
Application number: JP18769492A
Authority: JP
Inventors: Akio Karigome; 昭夫刈米; Ryuzo Hayashi; 隆造林; Yoshio Hashizume; 義雄橋爪
Original assignee: New Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1992-07-15
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 1994-02-08

Abstract

(57)【要約】【目的】遊離または固定化された酵素反応に関し、特
に簡便に水道水を用いて酵素反応を行う方法を提供す
る。【構成】遊離または固定化された少なくとも１種の酸
化還元酵素を含む酵素反応系に用いる溶液を利用した酵
素反応方法において、用水に脱残留塩素処理を施した水
道水を用いる。脱残留塩素処理としては煮沸処理、曝気
処理、またはチオ硫酸塩の添加を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遊離または固定化され
た少なくとも１種の酸化還元酵素を利用した酵素反応方
法であり、特に簡便な工程で実施できる酵素反応方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素は生物が営む数多くの反応について
それぞれ存在し、その生物が生存可能な温和な条件下で
円滑に反応を進行させる触媒である。従って、常温常圧
下で目的の反応のみを進行させることが容易であり、酵
素の持つ基質特異性ならびに反応特異性は製造、分析な
どの各分野において広く利用されている。

【０００３】例えば、食品製造分野においては転化糖の
生産、水あめの生産などに物質生産用触媒として応用さ
れており、また医薬品製造分野においても有用物質の物
質生産用触媒として用いられることが多い。さらに、食
品分析や医療分析などの分野では、被測定物質を検出器
で検出する被検出物質に変換するための分析用触媒とし
て広く用いられている。

【０００４】これらの利用範囲の拡大は、酵素反応が優
れた基質特異性をもつために従来用いられてきた化学的
方法よりも反応効率に優れている、温和な条件下で反応
が進行するのでエネルギー収支に優れている、などの利
点によるものである。さらに近年では、優れた性質を持
つ酵素のスクリーニング、遺伝子組み換えによる酵素製
造量の増大、タンパク質工学による酵素の性質改変、よ
り反応効率に優れる酵素固定化方法の開発などの利用技
術の進展にともない適応範囲はさらに拡大しつつある。

【０００５】分析用触媒に用いられている酵素は多種多
様であるが、なかでもＥＣ１群の酸化還元酵素は、基質
と反応する際に物理的、化学的あるいは電気化学的に検
出可能な物質の増減を伴う場合が多く有用な酵素であ
る。このような酵素には、グルコースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１．１．３．４）、ガラクトースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１．１．３．９）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ
１．１．３．１０）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ
１．１．３．１３）、アルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ
１．２．３．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ
１．２．３．２）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ
１．２．３．３）、ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．
２）、アスコルビン酸オキシダーゼ（１．１０．３．
３）などがあり、各種測定キット・各種測定装置に分析
用触媒として用いられている。

【０００６】さらに、これらの酵素と他の酵素、すなわ
ちＥＣ２群の転移酵素、ＥＣ３群の加水分解酵素、ＥＣ
４群の除去付加酵素、ＥＣ５群の異性化酵素、ＥＣ６群
の合成酵素と適宜組み合わせて適用することにより分析
対象はますます広がり大きな期待を寄せられている。酸
化還元酵素の利用形態としては、各分析試薬メーカーが
販売している測定キットのように溶液状酵素として発色
試薬等と組み合せて利用する方法、分析機器メーカーが
販売している測定装置のように固定化酵素とし酵素反応
の検出装置と組み合せて利用する方法などがあり、一般
分析においてはアミラーゼ類やグルコシダーゼ類の酵素
実験における生成物の定量や、食品中のグルコース、ス
クロース、マルトース、マルトオリゴ糖、エタノール、
L-乳酸、亜硫酸の定量などに、医療分析においては、尿
や血液中のグルコース量を知るために用いられている。

【０００７】一般に酵素は触媒作用を期待して用いられ
る物質であるから、溶液状酵素を用いる場合でもその消
費量は少なく、さらに固定化等の技術が酵素の再利用を
可能にするために処理装置や分析装置のランニングコス
トを低下させることが可能である。このように酵素を用
いる反応方法は、低ランニングコストであり操作が簡単
である半面、生体触媒であるがゆえに様々の制限が加わ
ることがある。例えば、穏和な条件下での使用は可能で
あっても、極端な高温、高圧、低ｐＨ、高ｐＨなどの条
件下では酵素蛋白質そのものが変性してしまったり、酵
素活性が失われたりして阻害や失活が引き起こされる。
また、溶液中に痕跡量含まれる酸化物質や還元物質も、
酵素の活性を司る活性中心部位や酵素蛋白の構造自体に
変化を及ぼす場合もあり、これら制限は酵素がタンパク
質であることから遊離酵素のみならず、程度の差はあれ
固定化酵素を用いる場合にもあてはめられる事項であ
る。

【０００８】通常このような問題点を克服するために、
酵素にとって適当な反応用水系溶液を用いて、必要なら
ば溶液温度を制御しつつ酵素反応を進行させることは必
須となっている。さらに酵素分析など、酵素反応の速度
や安定性に精密さが求められる場合には、酵素反応用溶
液にはｐＨの安定性を持つ緩衝液が用いられることも多
く、いずれの場合にしろ反応用水系溶液には酵素に悪影
響を与えない性質が求められる。

【０００９】このような理由があるために、酵素を物質
生産用触媒、分析用触媒のいずれに用いる場合でも酵素
の触媒としての性質を失わしめたり阻害するような物質
が反応用溶液中に存在することは許されず、特に精密さ
を要求される酵素分析などでは蒸留水や著しい場合には
超純水などを用いて反応用水系溶液が調製されている。
これは一般の水道水等の用水中に、ごく微量ではあるが
酵素を失活させたり活性を阻害するような物質が存在し
ているために実用に耐えないからである。蒸留水や超純
水はその調製に多くの人力とエネルギーを必要とするた
めに、酵素分析に占める用水に必要な費用の割合は大き
なものとなっていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしこのように蒸留
水や超純水などを用いることによって、用水に多大の人
力やエネルギーを消費することは、簡単に行える酵素反
応の準備に労力を要することになり、より簡便に酵素反
応を行うことの障害となっていた。つまり、従来行われ
ている方法では本来簡便に行われるべき酵素反応の利点
を充分に活かすものとはいえなかった。

【００１１】本発明は、物質生産触媒、分析触媒として
特に有用である酸化還元酵素に関し、遊離または固定化
された少なくとも１種の酵素を含む酵素反応系に用いる
水系溶液に注目し、特に簡便な工程で実施できる酵素反
応方法を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、遊離または固
定化された酵素を利用する反応方法であり、酵素に接す
る水性媒体として煮沸処理、曝気処理、チオ硫酸塩の添
加処理より選ばれる少なくとも１つの脱残留塩素処理を
施した水道水を利用する酵素反応方法である。本発明
は、遊離または固定化された酵素を利用する反応方法で
あり、煮沸処理、曝気処理、チオ硫酸塩の添加処理より
選ばれる少なくとも１つの脱残留塩素処理を施した水道
水を用いて調製した溶液を酵素に接する水系溶液として
使用する酵素反応方法。

【００１３】また、脱残留塩素処理が、水道水にチオ硫
酸塩を添加することによって行われる上記の酵素反応方
法を開示する。本発明は、酵素が固定化された酸化還元
酵素であり、水系溶液がフロー方式の基質濃度測定に用
いる移動相であり、酵素反応方法が、試料中の基質と酸
化還元酵素の反応で生成または消費される電極活性物質
を電気化学的に計測することによるフロー方式の基質測
定方法である上記の酵素反応方法を開示する。

【００１４】

【作用】酵素に接する水系溶液としては、フロー方式の
測定における移動相、酵素電極の固定化酵素等の洗浄
液、酵素を利用したバッチ式測定における反応用溶液等
を例示できる。本発明で水系溶液とは、本発明特定の方
法で脱残留塩素処理した水道水に単に試料を溶解したサ
ンプル溶液等も含めた概念であり、必ずしも緩衝液とは
限らない。

【００１５】理論的には酵素反応を行うための水系溶液
には、たとえ微量といえども酵素反応に直接機能的に関
与しない物質は存在しないことが望ましい。酵素反応に
とっての不純物はしばしば酵素の活性を失わしめる場合
がある。固定化酵素の場合、遊離酵素に比較して固定化
処理を施した影響により多少その性質を変化させる場合
も見受けられるが、基本的には遊離酵素の性質が反映さ
れるためにやはり水系溶液の不純物によってその失活が
おこる。この失活現象が安定に酵素反応を利用するうえ
での障害となるために、その製造には細心の注意を要す
る。

【００１６】例えば、酸化還元酵素の一つであるグルコ
ースオキシダーゼの場合、その活性を失わせるような物
質としては、８−ヒドロキシキノリン、セミカルバジ
ド、硝酸ナトリウムなどがあ。しかし、これはほんの一
例であって、タンパク質自体に変性をもたらすような強
酸、強アルカリは論を待たず、微量の金属イオンあるい
は酸化物質または還元物質などによっても失活や阻害が
起こってしまう。

【００１７】このような問題を避けるために従来では反
応用溶液等の用水には蒸留水や超純水が用いられてき
た。しかし蒸留水や超純水を用いると、用水の準備に費
やす労力と費用は大きなものとなり簡便に酵素反応を行
う妨げとなる。一方用水のうちで最も簡便に入手可能な
ものは水道水であり、水道水は飲用しても生命現象を損
なうことのないように厚生省令に水質基準が決められて
いるので水質的にも安定しているが、酸化還元酵素を含
む酵素反応系の反応用溶液等として用いた場合には、酸
化還元酵素を失活させてしまうという問題があった。

【００１８】この現象は水道水中に存在する痕跡量の残
留塩素が存在するために酸化還元酵素の活性中心が影響
を受けていることが原因と推定できる。これは、水道水
を原材料として蒸留処理を施した蒸留水を反応用溶液等
の用水として用いた場合にはグルコースオキシダーゼな
ど酸化還元酵素の酵素活性が影響を受けない事実から推
定することができる。

【００１９】前述の蒸留等の処理は残留塩素の影響を除
去するのに簡便な手段のひとつではあるが、水を一旦部
分蒸発させて水蒸気を回収するために多くのエネルギー
を消費するという問題点がある。従って水道水中に含ま
れる痕跡量の残留塩素を酵素にとって無害な物質に変換
してしまうか、除去してしまえば蒸留に要するエネルギ
ーの消費を伴うことなく反応用溶液等の製造が可能とな
るが、残留塩素を酵素にとって無害な物質に変換するよ
うな手段、または簡便に除去する方法が必要となる。

【００２０】有効と思われる手段には、例えば水道水中
に含まれる痕跡量の酸化物質または還元物質と反応する
ような化合物を添加すれば可能ではあるが、添加する化
合物と酸化物質または還元物質との反応生成物が酵素活
性に対して悪影響がなく、かつ剰余の前記添加した化合
物が酵素にとってなんら悪影響を与えない性質を持って
いなければならないために、その選定には困難がともな
い一般には実施されていなかったのが現状であった。

【００２１】そこで本発明では水質的に安定しており、
入手も容易な水道水を用水として用い、簡単に実施可能
な脱残留塩素処理を実施した水系溶液より酵素反応用溶
液等を製造する。用いる水道水は水質基準に適合した水
であるので、ろ過等の前処理なしに用いることができ
る。もちろん何らかの前処理を行っても本発明の実施を
妨げるものではない。

【００２２】脱残留塩素の手段としては、水道水の煮
沸、水道水の曝気、水道水へのチオ硫酸塩の添加の
いずれかまたはこれらを組み合わせた処理を行う。脱残
留塩素の手段に水道水の煮沸を適用する場合、３〜３０
分程度、通常は５分程度沸騰状態を維持すればよい。通
常、水道水を煮沸し放冷した用水を用いて緩衝液等の酵
素反応用溶液を調製すれば良いが、緩衝剤等の添加物に
影響を与えないならば、各成分を添加、調製後に煮沸・
放冷を行うことも可能である。

【００２３】また、脱残留塩素の手段に水道水の曝気を
適用する場合、水道水の総体積、温度、気体流量、気体
と水道水の接触面積等の因子に左右されるために一概に
曝気時間は決められないが、通常溶存気体の置換に適用
される手法で充分である。用いる気体は残留塩素の置換
が目的であることを考慮すれば、塩素ガスはもちろん適
さない。また溶解することにより、酵素反応用溶液の成
分と反応を起こす可能性のあるもの、例えば二酸化炭素
ガスなども好ましくない。従って、好ましく用いること
のできる気体は、窒素ガス、酸素ガス、空気などであ
り、特に空気は費用的な面からより好ましく用いられ
る。

【００２４】脱残留塩素の手段に水道水へのチオ硫酸塩
の添加を適用する場合、添加することのできるチオ硫酸
塩は水溶性塩であれば種類を選ばないが、チオ硫酸ナト
リウム、チオ硫酸カリウムなどが好ましく用いられる。
剰余のチオ硫酸塩は酸化還元酵素に対して悪影響を与え
ることはないが、酵素反応用溶液等のイオン強度等を考
慮すれば、添加濃度は０．０１〜５０ｐ．ｐ．ｍ．程度
の範囲が望ましく、より好ましくは０．１〜１ｐ．ｐ．
ｍ．程度の範囲である。添加されたチオ硫酸塩によっ
て、水道水中の塩素が還元されることによって酸化還元
酵素の活性に悪影響を与えない物質に変換される。

【００２５】本発明による製造方法により、脱残留塩素
処理を施した水道水を用いて作った酵素反応用溶液等は
酸化還元酵素の活性を損なうことなく酵素分析等の精密
な酵素反応測定に用いることが可能である。水系溶液を
フロー方式の測定に用いる移動相とする場合は、水道水
に煮沸処理、曝気処理、またはチオ硫酸塩の添加処理を
少なくとも１つ実施してリン酸−ＮａＯＨやＴｒｉｓ−
ＨＣｌ等、通常酵素反応に用いられる緩衝液に調製す
る。また、バッチ式測定における反応用溶液とする場合
も、同様に脱塩素処理を施した水道水を用いて緩衝液を
調製して用いる。

【００２６】水系溶液を酵素電極等の洗浄液とする場合
は、水道水に煮沸処理、曝気処理、またはチオ硫酸塩の
添加処理のうち少なくとも１つの脱塩素処理を施したも
のをそのまま用いるか、あるいは必要ならば緩衝液に調
製して用いる。その他測定装置の洗浄液、試料の希釈用
溶液等に利用できる。また、遊離の酵素を利用する場合
は、水系溶液を酵素の希釈用溶液、保存用溶液等として
利用できる。

【００２７】酵素反応法としては、前記した酸化還元酵
素を用いた測定、例えば、グルコースオキシダーゼを用
いたグルコースの測定、アルコールオキシダーゼを用い
たエタノールの測定、L-乳酸オキシダーゼを用いた L-
乳酸の測定などが挙げられる。また、酸化還元酵素とＥ
Ｃ２群の転移酵素、ＥＣ３群の加水分解酵素、ＥＣ４群
の除去付加酵素、ＥＣ５群の異性化酵素、ＥＣ６群の合
成酵素と適宜組み合わせた複合酵素反応系を用いた測定
に用いることが可能である。一例として、インベルター
ゼ（ＥＣ３．２．１．２６）・ムタロターゼ（ＥＣ
５．１．３．３）とグルコースオキシダーゼを組み合わ
せたスクロースの測定、L-乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．２７）・ L- 乳酸オキシダーゼを組み合
わせたピルビン酸の測定などが挙げられる。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

【００２９】実施例１酸化還元酵素として、グルコースオキシダーゼを用い
た。（１）酵素反応用溶液の調製水道水１ｌに、チオ硫酸ナトリウム（分子量１５８．
１）を０．６３２ｍｇ添加し、０．６３２ｐ．ｐ．ｍ．
の濃度とした。この水道水を用いて、５０ｍＭ塩化カリ
ウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを含んだ１００ｍＭリン
酸緩衝液を作成し、ｐＨを６．０に調製した。（２）酵素電極の作成方法直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋１．４Ｖで５分間の電
解処理を行う。

【００３０】その後白金線をよく水洗した後、４０℃で
１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキ
シシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、洗浄
した。＜酵素含有膜の形成＞このアミノシラン化した白金線上
にグルコースに応答する酵素系を次のように固定化し
た。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中
に、グルコースオキシダーゼ（シグマ社製、タイプＩ
Ｉ）５ｍｇ／ｍｌ、牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆ
ｒａｃｔｉｏｎＶ）５ｍｇ／ｍｌ及びグルタルアルデ
ヒドを０．２％を含む溶液を５μｌ滴下し、４０℃で１
５分間処理して固定化を行った。（３）測定装置図１に示した如く酵素電極を配置したフロー型測定装置
を用いた。

【００３１】このフロー型測定装置は、高速液体クロマ
トグラフィ用のインジェクタ３（レオダイン社製７１２
５型）と、上述した手順で作成された酵素電極７を取り
付けた測定用セル５を内径０．５ｍｍ、長さ１．０ｍの
フッ素樹脂製配管４で接続されている。内容積４０μｌ
の測定用セル５には、酵素電極７とＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極８が緩衝液の管路を介して対向して配置されてお
り、さらに対極９として取り付けらたステンレス鋼から
成る配管が接続されている。これらは、恒温槽１０の内
部に設置され、槽内の温度は３７℃± ０．２℃に保持
されている。酵素電極７にはポテンシオスタット１１に
よってＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋０．６Ｖの電
圧が印加され、電極で生成される過酸化水素を最終的に
電気化学的測定の対象として検出するようにした。検出
信号はＡ／Ｄ変換器１２、通信ケーブル１３を介してコ
ンピュータ１４に転送してデータ処理を行った。

【００３２】緩衝液リザーバ１からの緩衝液の送液に
は、コンピュータによって送液ポンプ２を制御し、１．
０ｍｌ／ｍｉｎの流量で送液されるように設定されてい
る。緩衝液は、本発明による酵素反応用溶液である。測
定を終えた緩衝液は、廃液リザーバ６で捕捉される。（４）測定方法恒温槽温度が平衡に達した後、グルコースの標準液を５
μｌ注入した。

【００３３】４０ｍＭの濃度まで検出値と濃度に比例関
係が成立しているのを確認したのち、１０ｍＭの濃度の
グルコース液を１時間毎に注入した。（５）結果測定結果を表１と図２に示す。グルコース電極の出力値
の単位はμＡである。酵素反応用溶液を送液した経過時
間の単位は時間である。

【００３４】

【表１】

【００３５】酵素反応用溶液を送液開始後５時間経過し
ても、グルコースオキシダーゼの活性低下は認められな
かった。

【００３６】比較例１（１）酵素反応用溶液の調製未処理の水道水を用いて、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍ
Ｍアジ化ナトリウムを含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液を
作成し、ｐＨを６．０に調製した。（２）酵素電極の作成方法実施例１に同じ。（３）測定装置実施例１に同じ。（４）測定方法実施例１に同じ。（５）結果測定結果を表２と図３に示す。グルコース電極の出力値
の単位はμＡである。酵素反応用溶液を送液した経過時
間の単位は時間である。

【００３７】

【表２】

【００３８】酵素反応用溶液を送液開始後５時間経過し
た時点で、グルコースオキシダーゼの活性は初期の約８
９％にまで低下した。

【００３９】実施例２脱残留塩素の手段として、水道水の煮沸を行った。（１）酵素反応用溶液の調製水道水１ｌを、ガラスビーカーに入れガスバーナで加熱
した。ビーカーの口を開放したまま、沸騰開始後１５分
間煮沸し、室温（２７℃）まで放冷した。この水道水を
用いて、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウ
ムを含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液を作成し、ｐＨを
６．０に調製した。（２）酵素電極の作成方法実施例１に同じ。（３）測定装置実施例１に同じ。（４）測定方法実施例１に同じ。（５）結果測定結果を表３と図４に示す。グルコース電極の出力値
の単位はμＡである。酵素反応用溶液を送液した経過時
間の単位は時間である。

【００４０】

【表３】

【００４１】酵素反応用溶液を送液開始後５時間経過し
ても、グルコースオキシダーゼの活性低下は認められな
かった。

【００４２】

【発明の効果】本発明により簡便な工程で酸化還元酵素
用の酵素反応用溶液等を製造することが可能となった。
実施例１，実施例２においては１日当たり８時間の測定
を７日間行ってもグルコース電極の出力値に変化はな
く、蒸留水等を用いて酵素反応用溶液を調製した場合と
同様に測定を行うことができた。

【００４３】一方、比較例１では１日当たり８時間の測
定を３日間行ったところグルコース電極の出力値がほぼ
消失し、測定できなくなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１、実施例２および比較例１にお
いて用いたグルコース測定装置の構成図の１例である。

【図２】図２は実施例１における測定結果を図示したも
のである。縦軸はグルコース電極の出力値をあらわして
おり、単位はμＡである。横軸は酵素反応用溶液を送液
した経過時間をあらわしており、単位は時間である。

【図３】図３は比較例１における測定結果を図示したも
のである。縦軸はグルコース電極の出力値をあらわして
おり、単位はμＡである。横軸は酵素反応用溶液を送液
した経過時間をあらわしており、単位は時間である。

【図４】図４は実施例２における測定結果を図示したも
のである。縦軸はグルコース電極の出力値をあらわして
おり、単位はμＡである。横軸は酵素反応用溶液を送液
した経過時間をあらわしており、単位は時間である。

【符号の説明】

１緩衝液リザーバ２送液ポンプ３インジェクタ４配管５測定用セル６廃液リザーバ７酵素電極８Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極９対極１０恒温槽１１ポテンシオスタット１２Ａ／Ｄ変換器１３通信ケーブル１４コンピュータ１５プリンター

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遊離または固定化された酵素を利用する
反応方法であり、煮沸処理、曝気処理、チオ硫酸塩の添
加処理より選ばれる少なくとも１つの脱残留塩素処理を
施した水道水を用いて調製した溶液を酵素に接する水系
溶液として使用する酵素反応方法。
【請求項２】脱残留塩素処理が、水道水にチオ硫酸塩
を添加することによって行われる請求項１記載の酵素反
応方法。
【請求項３】酵素が固定化された酸化還元酵素であ
り、水系溶液がフロー方式の基質濃度測定に用いる移動
相であり、酵素反応方法が、試料中の基質と酸化還元酵
素の反応で生成または消費される電極活性物質を電気化
学的に計測することによるフロー方式の基質測定方法で
ある請求項１記載の酵素反応方法。