RS63513B1 - Anti-transtiretin antitela - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA

[0001] Smatra se da je nekoliko bolesti uzrokovano abnormalnim savijanjem i agregacijom proteina specifičnih za bolest. Ovi proteini se mogu akumulirati u patološki dijagnostičke akumulacije, poznate kao amiloidi, koje se vizualizuju određenim histološkim bojama. Smatra se da amiloidi izazivaju inflamatorne odgovore i imaju višestruke negativne posledice po zahvaćena tkiva. Pored toga, manji agregati abnormalno savijenog proteina mogu postojati i ispoljavati citotoksične efekte.

[0002] Transtiretin (TTR) je jedan od mnogih proteina za koje je poznato da se pogrešno savijaju i agregiraju (na primer, prolaze kroz amiloidogenezu). Amiloidoza povezana sa transtiretinom obuhvata dva oblika bolesti: porodičnu bolest koja nastaje zbog pogrešnog savijanja mutiranog ili varijantnog TTR i sporadičnu, ne-genetsku bolest uzrokovanu pogrešnom agregacijom divljeg tipa TTR. Proces amiloidogeneze TTR može izazvati patologiju u nervnom sistemu i/ili srcu, kao i u drugim tkivima.

[0003] US2014056904 otkriva antitela i njihove vezujuće fragmente koji specifično vezuju ceo ili deo EHAEVVFTA; i izolovane peptide, izolovane nukleinske kiseline, imunogene, kompozicije, imunoanalize i komplete i postupak korišćenja navedenih reagenasa za otkrivanje pogrešno savijenog TTR.

REZIME PRONALASKA ZA KOJI SE TRAŽI ZAŠTITA

[0004] Ovde su otkrivena antitela koja se specifično vezuju za transtiretin koji sadrže tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca uglavnom iz antitela 5A1. Neka takva antitela sadrže tri Kabat CDR regiona teška lanca (SEQ ID NOS:6-8, respektivno) i CDR regiona lakog lanca (SEQ ID NOS:14, 15, i 17, respektivno) antitela 5A1. U nekim antitelima, CDR-H1 teškog lanca je kompozit Kabat-Chothia CDR-H1 (SEQ ID NO:52). Neka takva antitela su monoklonska antitela. Neka takva antitela su himerna, humanizovana, izmenjene površine ili humana antitela. Neka takva antitela imaju izotip humanog IgG1. Neka takva antitela imaju humani IgG2 ili IgG4 izotip.

[0005] Neka takva otkrivena antitela su humanizovana ili himerna 5A1 antitela koja se specifično vezuju za transtiretin, pri čemu je 5A1 mišje antitelo koje karakteriše zreli varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:1 i zreli varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO:9.

[0006] U nekim otkrivenim antitelima, humanizovani zreli varijabilni region teškog lanca sadrži tri CDR regiona teškog lanca 5A1, i humanizovani zreli varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDR regiona lakog lanca 5A1, osim što pozicija L55 može biti C ili S. U nekim antitelima, humanizovani zreli varijabilni region teškog lanca sadrži tri CDR regiona teškog lanca Kabat od 5A1 (SEQ ID NOs:6-8), a humanizovani zreli varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDR regiona lakog lanca Kabat od 5A1 (SEQ ID NOs:14, 15 i 17) osim što pozicija L55 može biti C ili S.

[0007] Pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže zreli varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i zreli varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13.

[0008] U nekim takvim antitelima, najmanje jednu od sledećih pozicija zauzima aminokiselina kao što je navedeno: poziciju H29 zauzima F, poziciju H93 zauzima V, poziciju L55 zauzima S, a poziciju L85 zauzima V. U nekim takvim antitelima, najmanje dve od sledećih pozicija zauzimaju aminokiseline kao što je navedeno: poziciju H29 zauzima F, poziciju H93 zauzima V, poziciju L55 zauzima S i poziciju L85 zauzima V. U nekim takvim antitelima, najmanje tri od sledećih položaja zauzima aminokiselina kao što je navedeno: poziciju H29 zauzima F, poziciju H93 zauzima V, poziciju L55 zauzima S, a poziciju L85 zauzima V. U nekim takvim antitelima, sve sledeće pozicije zauzima aminokiselina kao što je navedeno: poziciju H29 zauzima F, poziciju H93 zauzima V, poziciju L55 zauzima S i poziciju L85 zauzima V.

[0009] Pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže zreli varijabilni region teškog lanca koji ima amiokiselinsku sekvencu identičnu sa SEQ ID NO:5 i zreli varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa SEQ ID NO:13.

[0010] Takva antitela obuhvataju zreli varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:5 i zreli varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO:13.

[0011] U nekim antitelima prema pronalasku, antitelo je intaktno antitelo. U nekim antitelima prema pronalasku, antitelo je vezujući fragment. U nekim takvim antitelima, vezujući fragment je jednolančano antitelo, Fab ili Fab'2 fragment.

[0012] U nekim antitelima prema pronalasku, zreli varijabilni region lakog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca i zreli varijabilni region teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca. U nekim takvim antitelima, konstantni region teškog lanca je mutantni oblik prirodnog humanog konstantnog regiona teškog lanca koji ima smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u odnosu na prirodni ljudski konstantni region teškog lanca. U nekim takvim antitelima, konstantni region teškog lanca je izotip IgG1. U nekim takvim antitelima, zreli varijabilni region teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO: 23 i/ili zreli varijabilni region lakog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO:25.

[0013] U nekim otkrivenim antitelima, sve razlike u CDR regionima zrelog varijabilnog regiona teškog lanca i zrelog varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NOS: 1 i 9, respektivno, nalaze se na pozicijama H60-H65.

[0014] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koje od gore navedenih antitela pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0015] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira teški i laki lanac bilo kog od gore navedenih antitela pronalaska. U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu takvim rekombinantnim ekspresionim vektorom.

[0016] Takođe je otkriven postupak humanizacije antitela, koji sadrži:

(a) izbor antitela akceptora;

(b) identifikaciju aminokiselinskih ostataka mišjeg antitela koje treba zadržati;

(c) sintetisanje nukleinske kiseline koja kodira humanizovani teški lanac koji sadrži CDR regione teškog lanca mišjeg antitela i nukleinske kiseline koja kodira humanizovani laki lanac koji sadrži CDR regione lakog lanca antitela miša; i

(d) ekspresije nukleinskih kiselina u ćeliji domaćinu da bi se proizvelo humanizovano antitelo;

pri čemu mišje antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9

[0017] Takođe je otkriven postupak za proizvodnju humanizovanog, himernog ili izmenjene površine antitela, pri čemu postupak sadrži:

(a) kultivisanje ćelija transformisanih nukleinskim kiselinama koje kodiraju teške i lake lance antitela, tako da ćelije luče antitelo; i

(b) prečišćavanje antitela iz medijuma ćelijske kulture;

pri čemu je antitelo humanizovani, himerni ili izmenjene površine oblik 5A1.

[0018] Takođe je otkriven postupak za proizvodnju ćelijske linije koja proizvodi humanizovano, himerino ili antitelo izmenjene površine, pri čemu postupak sadrži:

(a) uvođenje vektora koji kodira teške i lake lance antitela i selektabilnog markera u ćelije; (b) razmnožavanje ćelija pod uslovima za selekciju ćelija koje imaju povećan broj kopija vektora;

(c) izolovanje pojedinačnih ćelija iz izabranih ćelija; i

(d) izradu banke ćelija kloniranih iz jedne ćelije odabrane na osnovu prinosa antitela;

pri čemu je antitelo humanizovani, himerni ili oblik 5A1 izmenjene površine.

[0019] Neki takvi postupci dalje obuhvataju razmnožavanje ćelija pod selektivnim uslovima i skrining za ćelijske linije koje prirodno eksprimiraju i izlučuju najmanje 100 mg/L/10<6>ćelija/24h.

[0020] Takođe je otkriven postupak inhibicije ili smanjenja agregacije transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji obuhvata primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gore navedenih antitela, čime se inhibira ili smanjuje agregacija transtiretina kod subjekta.

[0021] Takođe je otkriven postupak inhibicije ili smanjenja formiranja transtiretinskih fibrila kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji obuhvata primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gore navedenih antitela, čime se inhibira ili smanjuje akumulacija transtiretina kod subjekta.

[0022] Takođe je otkriven postupak za smanjenje naslaga transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gore navedenih antitela, čime se smanjuju naslage transtiretina kod subjekta.

[0023] Takođe je otkriven postupak uklanjanja agregiranog transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kojeg od gore navedenih antitela, čime se uklanja agregirani transtiretin iz subjekta u odnosu na subjekt koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom koji nije primio antitelo.

[0024] Takođe je otkriven postupak stabilizacije netoksične konformacije transtiretina kod subjekta koji ima ili kod koga postoji rizik od razvoja amiloidoze posredovane transtiretinom, koji sadrži primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gore navedenih antitela, čime se stabilizuje ne-toksična konformacija transtiretina kod subjekta.

[0025] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili postizanje profilakse amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, pri čemu upotreba obuhvata primenu na subjekta efikasnog režima bilo kog od gore navedenih antitela.

[0026] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo pronalaska za upotrebu u odlaganju početka amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, pri čemu upotreba sadrži primenu na subjekta efikasnog režima antitela prema pronalasku.

[0027] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje in vitro postupak dijagnostikovanja amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji sadrži dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa efikasnom količinom bilo kog od gore navedenih antitela pronalaska. Neki takvi postupci dalje sadrže detekciju vezivanja antitela za transtiretin, pri čemu prisustvo vezanog antitela ukazuje da subjekt ima amiloidozu posredovanu transtiretinom. Neki takvi postupci dalje sadrže poređenje vezivanja antitela za biološki uzorak sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak, pri čemu povećano vezivanje antitela za biološki uzorak u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje da subjekt ima amiloidozu posredovanu transtiretinom.

[0028] U nekim takvim postupcima, biološki uzorak i kontrolni uzorak sadrže ćelije istog porekla tkiva. U nekim takvim postupcima, biološki uzorak i/ili kontrolni uzorak je krv, serum, plazma ili čvrsto tkivo. U nekim takvim postupcima, čvrsto tkivo je iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta.

[0029] U nekim upotrebama, amiloidoza posredovana transtiretinom je porodična transtiretinska amiloidoza ili sporadična transtiretinska amiloidoza. U nekim takvim upotrebama, porodična transtiretinska amiloidoza je porodična amiloidna kardiomiopatija (FAC), porodična amiloidna polineuropatija (FAP) ili selektivna amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNSA). U nekim takvim upotrebama, sporadična transtiretinska amiloidoza je senilna sistemska amiloidoza (SSA) ili senilna kardijačna amiloidoza (SCA).

[0030] U nekim upotrebama, amiloidoza posredovana transtiretinom je povezana sa akumulacijom amiloida u srcu, perifernom nervnom sistemu, autonomnom nervnom sistemu, bubrezima, očima ili gastrointestinalnom traktu subjekta.

[0031] Takođe je otkriven postupak detekcije prisustva ili odsustva naslaga transtiretina kod subjekta, koji sadrži dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta za koji se sumnja da sadrži akumulaciju amiloida sa efikasnom količinom bilo kog od gore navedenih antitela. Neki takvi postupci dalje sadrže detekciju vezivanja antitela za transtiretin, pri čemu detekcija vezanog antitela ukazuje na prisustvo naslaga transtiretina. Neki takvi postupci dalje sadrže poređenje vezivanja antitela za biološki uzorak sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak, pri čemu povećano vezivanje antitela za biološki uzorak u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje da subjekt ima amiloidozu posredovanu transtiretinom. U nekim takvim postupcima, biološki uzorak i kontrolni uzorak sadrže ćelije istog porekla tkiva. U nekim takvim postupcima, biološki uzorak i/ili kontrolni uzorak je krv, serum, plazma ili čvrsto tkivo. U nekim takvim postupcima, čvrsto tkivo je iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta.

[0032] Takođe je otkriven postupak za određivanje nivoa transtiretinskih depozita kod subjekta, koji obuhvata primenu bilo kog od gore navedenih antitela i detekciju prisustva vezanog antitela kod subjekta. U nekim takvim postupcima, prisustvo vezanog antitela se utvrđuje pozitronskom emisionom tomografijom (PET).

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0033]

Sl. 1 prikazuje poravnanje varijabilnih regiona teškog lanca mišjeg 5A1 antitela, antitela mišjeg modela, humanih akceptorskih antitela i humanizovanih verzija 5A1 antitela. CDR regioni kako su definisani pomoću Kabat su zatvoreni u boksove, osim što je prvi zatvoreni boks sastavljen od Chothia CDR-H1 i Kabat CDR-H1, sa Kabat CDR-H1 podvučenim i boldiranim.

Sl. 2 prikazuje poravnanje varijabilnih regiona lakog lanca mišjeg 5A1 antitela, antitela mišjeg modela, humanih akceptorskih antitela i humanizovanih verzija 5A1 antitela. CDR regioni kako su definisani pomoću Kabat su priloženi

Sl. 3A & 3B: Sl.3A prikazuje krivu vezivanja mišjih antitela 5A1, 6C1, 9D5 i 14G8 za TTR tretiran sa ph4. Sl.3B prikazuje krivu vezivanja mišjih antitela 5A1, 6C1, 9D5 i 14G8 za ph4 tretirani ili nativni TTR

Sl. 4A, 4B & 4C: Sl. 4A prikazuje inhibiciju formiranja TTR-Y78F vlakana od strane mis-TTR antitela. Sl. 4B prikazuje inhibiciju formiranja TTR-V122I vlakana od strane 14G8. Sl.

4C prikazuje inhibiciju formiranja TTR-V122I vlakana pomoću kontrolnog antitela.

Sl. 5A i 5B: Sl. 5A prikazuje denzitometrijsku analizu Western Blot analize uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (uzorak #21, #22, #23, #24, #25 i #27) i uzoraka normalnih subjekata (Uzorak #11, #12, #15, #18, #19, #20) koristeći 9D5 mis-TTR antitelo. Sl. 5B prikazuje denzitometrijsku analizu Western blot analize istih uzoraka korišćenjem 5A1 mis-TTR antitela.

Sl. 6 prikazuje MesoScale Discovery (MSD) test na ploči uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (uzorak #21, #22, #23, #24, #25, #27) i uzoraka normalnih subjekata (uzorak #11, # 12, #15, #18, #19, #20) koristeći antitelo 6C1.

Sl. 7A i 7B: Sl.7A prikazuje efekat antitela 14G8 na uzimanje F87M/L110M TTR od strane THP-1 ćelija. Sl. 7B prikazuje efekat svakog od mis-TTR antitela na unos V30M TTR od strane THP-1 ćelija.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0034]

SEQ ID NO:1 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 5A1 antitela.

SEQ ID NO:2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu šablona strukture varijabilnog regiona teškog lanca miša.

SEQ ID NO:3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog akceptora teškog lanca pristupni broj AGP01680.

SEQ ID NO:4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 1 (Hu5A1VHv1).

SEQ ID NO:5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 2 (Hu5A1VHv2).

SEQ ID NO:6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRH1 mišjeg 5A1 antitela.

SEQ ID NO:7 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRH2 mišjeg 5A1 antitela.

SEQ ID NO:8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRH3 mišjeg 5A1 antitela.

SEQ ID NO:9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 5A1 antitela.

SEQ ID NO: 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu šablona strukture varijabilnog regiona lakog lanca miša.

SEQ ID NO: 11 prikazuje aminokiselinsku sekvencu pristupnog broja akceptora varijabilnog lakog lanca BAH04766.

SEQ ID NO:12 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 1 (Hu5A1VLv1).

SEQ ID NO:13 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 2 (Hu5A1VLv2).

SEQ ID NO:14 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRL1 antitela miša 5A1.

SEQ ID NO:15 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRL2 mišjeg 5A1 antitela. SEQ ID NO:16 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRL2 verzije 2 humanizovanog mišjeg antitela 5A1.

SEQ ID NO:17 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Kabat CDRL3 mišjeg 5A1 antitela. SEQ ID NO:18 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 5A1 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO:19 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 5A1 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO:20 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 5A1 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO: 21 prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 5A1 antitela sa signalnim peptidom.

SEQ ID NO:22 prikazuje aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca IgG1. SEQ ID NO:23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera konstantnog regiona teškog lanca IgG1 G1m3.

SEQ ID NO:24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca IgG1 G1m3.

SEQ ID NO:25 predstavlja sekvencu aminokiselina primera konstantnog regiona lakog lanca sa N-terminalnim argininom.

SEQ ID NO:26 prikazuje aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca bez N-terminalnog arginina.

SEQ ID NO:27 prikazuje aminokiselinsku sekvencu regiona teškog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 1.

SEQ ID NO:28 prikazuje aminokiselinsku sekvencu regiona teškog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 2.

SEQ ID NO:29 prikazuje aminokiselinsku sekvencu regiona lakog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 1.

SEQ ID NO:30 prikazuje aminokiselinsku sekvencu regiona lakog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 2.

SEQ ID NO:31 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina datu u pristupnom broju P02766.1 (UniProt).

SEQ ID NO:32 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina datu u pristupnom broju AAB35639.1 (GenBank).

SEQ ID NO:33 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina datu u pristupnom broju AAB35640.1 (GenBank).

SEQ ID NO:34 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretina navedenu u pristupnom broju i ABI63351.1 (GenBank).

SEQ ID NO: 35 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog transtiretinskog epitopa od ostataka 89-97.

SEQ ID NO: 36 prikazuje aminokiselinsku sekvencu potencijalnog transtiretin imunogena. SEQ ID NO: 37 prikazuje aminokiselinsku sekvencu potencijalnog transtiretin imunogena. SEQ ID NO:38 prikazuje aminokiselinsku sekvencu potencijalnog transtiretin imunogena. SEQ ID NO:39 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region teškog lanca IgG1 G1m3.

SEQ ID NO: 40 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca sa N-terminalnim argininom.

SEQ ID NO: 41 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca bez N-terminalnog arginina.

SEQ ID NO: 42 prikazuje aminokiselinsku sekvencu signalnog peptida konstantnog regiona teškog lanca.

SEQ ID NO:43 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid konstantnog regiona teškog lanca.

SEQ ID NO: 44 prikazuje aminokiselinsku sekvencu signalnog peptida konstantnog regiona lakog lanca.

SEQ ID NO:45 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid konstantnog regiona lakog lanca.

SEQ ID NO: 46 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region lakog lanca miša 5A1.

SEQ ID NO:47 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog lanca miša 5A1.

SEQ ID NO:48 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 1 (Hu5A1VHv1).

SEQ ID NO:49 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 2 (Hu5A1VHv2).

SEQ ID NO:50 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region lakog

1

lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 1 (Hu5A1VLv1).

SEQ ID NO:51 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region lakog lanca humanizovanog 5A1 antitela, verzija 2 (Hu5A1VLv2).

SEQ ID NO:52 prikazuje aminokiselinsku sekvencu kompozitnog CDR-H1 (ostaci 26-35) mišjeg 5A1 antitela.

DEFINICIJE

[0035] Monoklonska antitela ili drugi biološki entiteti se obično obezbeđuju u izolovanom obliku. To znači da je antitelo ili drugi biološki entitet obično najmanje 50% tež./tež. čist od interferirajućih proteina i drugih zagađivača koji nastaju njegovom proizvodnjom ili prečišćavanjem, ali ne isključuje mogućnost da se monoklonsko antitelo kombinuje sa viškom farmaceutski prihvatljivog nosača (jednog ili više) ili drugog vehikuluma namenjenog da olakša njegovu upotrebu. Ponekad su monoklonska antitela najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% tež./tež. čista od interferirajućih proteina i kontaminanata iz proizvodnje ili prečišćavanja. Često je izolovano monoklonsko antitelo ili drugi biološki entitet dominantna makromolekularna vrsta koja ostaje nakon njegovog prečišćavanja.

[0036] Specifično vezivanje antitela za njegov ciljni antigen znači afinitet od najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, ili 10<10>M<-1>. Specifično vezivanje je detektabilno više i razlikuje se od nespecifičnog vezivanja koje se javlja za najmanje jedno nesrodno ciljno mesto. Specifično vezivanje može biti rezultat formiranja veza između određenih funkcionalnih grupa ili određenog prostornog uklapanja (npr., tip brave i ključa) dok je nespecifično vezivanje obično rezultat van der Valsovih sila. Međutim, specifično vezivanje ne znači nužno da se antitelo vezuje za jednu i samo jedno ciljno mesto.

[0037] Osnovna strukturna jedinica antitela je tetramer podjedinica. Svaki tetramer uključuje dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "težak" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena. Ovaj varijabilni region je inicijalno eksprimiran povezan sa signalnim peptidom koji se može cepati. Varijabilni region bez signalnog peptida se ponekad naziva zrelim varijabilnim regionom. Tako, na primer, zreli varijabilni region lakog lanca označava varijabilni region lakog lanca bez signalnog peptida lakog lanca. Karboksiterminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za funkciju efektora.

[0038] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, respektivno. U okviru lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni su spojeni sa "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu težak lanac takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više aminokiselina. Videti generalno, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch.7.

[0039] Varijabilni region lakog ili teškog lanca imunoglobulina (koji se ovde takođe naziva "varijabilni domen lakog lanca" ("VL domen") ili "varijabilni domen teškog lanca" ("VH domen"), respektivno) se sastoji od "okvirnog" regiona prekinut sa tri „regiona koji određuju komplementarnost“ ili „CDR regiona“. Okvirni regioni služe za usklađivanje CDR regiona za specifično vezivanje za epitop antigena. CDR regioni uključuju aminokiselinske ostatke antitela koji su primarno odgovorni za vezivanje antigena. Od amino-terminusa do karboksilterminusa, kako VL tako i VH domeni obuhvataju sledeće okvire (FR) i CDR regione: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR regioni 1, 2 i 3 VL domena se ovde takođe označavaju, respektivno, kao CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3; CDR regioni 1, 2 i 3 VH domena se takođe ovde označavaju kao CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3.

[0040] Dodeljivanje aminokiselina svakom VL i VH domenu je u skladu sa bilo kojom konvencionalnom definicijom CDR. Konvencionalne definicije uključuju, Kabat definiciju (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesida, MD, 1987 and 1991), definicija Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); kompozit Chothia Kabat CDR u kome je CDR-H1 kompozit Chothia i Kabat CDR regiona; definicija AbM koju koristi softver za modeliranje antitela kompanije Oxford Molecular; i definicija kontakta Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (videti Tabelu 1). Kabat obezbeđuje široko korišćenu konvenciju numerisanja (Kabat numerisanje) u kojoj se odgovarajućim ostacima između različitih teških lanaca ili između različitih lakih lanaca dodeljuje isti broj. Kada se kaže da antitelo sadrži CDR regione prema određenoj definiciji CDR regiona (npr., Kabat) ta definicija specificira minimalni broj CDR ostataka prisutnih u antitelu (tj. Kabat CDR regioni). To ne isključuje da su prisutni i drugi ostaci koji potpadaju pod drugu konvencionalnu CDR definiciju, ali van navedene definicije. Na primer, antitelo koje sadrži CDR regione koje definiše Kabat uključuje, između ostalih mogućnosti, antitelo u kome CDR regioni sadrže Kabat CDR ostatke i nema drugih CDR ostataka, i antitelo u kome je CDR H1 kompozit Chothia-Kabat CDR H1 i drugi CDR regioni sadrže Kabat CDR ostatke i bez dodatnih CDR ostataka na osnovu drugih definicija.

Tabela 1

[0041] Termin "antitelo" uključuje intaktna antitela i njihove vezujuće fragmente. Tipično, fragmenti su u kompeticiji sa intaktnim antitelom iz kojeg su izvedeni za specifično vezivanje za ciljno mesto uključujući odvojene teške lance, lake lance Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanotela i Fv. Fragmenti se mogu proizvesti tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim odvajanjem intaktnih imunoglobulina. Termin "antitelo" takođe uključuje bispecifično antitelo i/ili humanizovano antitelo. Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških/lakih lanca i dva različita mesta vezivanja (videti, npr. Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)); Kostelni et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). U nekim bispecifičnim antitelima, dva

1

različita para težak/laki lanac uključuju humanizovani par težak/laki lanac 5A1 i par težak lanac/laki lanac specifičan za drugačiji epitop na transtiretinu od onog koji je vezan za 5A1.

[0042] U nekim bispecifičnim antitelima, jedan par težak lanac/laki lanac je humanizovano 5A1 antitelo kao što je dalje otkriveno u nastavku, a drugi par težak lanac/laki lanac je iz antitela koje se vezuje za receptor eksprimiran na krvno-moždanoj barijeri, kao što je insulinski receptor, receptor faktora rasta sličnog insulinu (IGF), receptor leptina, ili receptor lipoproteina, ili receptor transferina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Takvo bispecifično antitelo se može preneti preko krvno-moždane barijere transcitozom posredovanom receptorom. Unos bispecifičnog antitela u mozak može se dodatno poboljšati konstrukcijom bispecifičnog antitela da bi se smanjio njegov afinitet prema receptoru krvno-moždane barijere. Smanjen afinitet prema receptoru rezultirao je širom raspodelom u mozgu (videti, npr. Atval et al., Sci. Trans. Med.

3, 84ra43, 2011; Iu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).

[0043] Primeri bispecifičnih antitela takođe mogu biti: (1) antitelo sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig), gde svaki laki i teški lanac sadrže dva varijabilna domena u tandemu kroz kratku peptidnu vezu (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) Tandab, koji je fuzija dva jednolančana diatela koja rezultiraju tetravalentnim bispecifičnim antitelom koje ima dva mesta vezivanja za svaki od ciljnih antigena; (3) fleksibilno telo, koje je kombinacija scFvs sa diatelom što rezultira multivalentnim molekulom; (4) takozvani "dock and lock" molekul, zasnovan na "dimerizaciji i pristajanju domena" u Protein kinazi A, koji, kada se primeni na Fab fragmente, može dati trovalentni bispecifični vezujući protein koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana za različiti Fab fragment; ili (5) takozvani molekul Škorpiona, koji sadrži, npr., dva scFvs spojena sa oba kraja humanog Fc-regiona. Primeri platformi korisnih za pripremu bispecifičnih antitela uključuju BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab i Mab2 (F-star), Fc-konstruisan IgGl (Xencor) ili DuoBody (zasnovan na razmeni Fab grana, Genmab).

[0044] Termin "epitop" se odnosi na mesto na antigenu za koje se antitelo vezuje. Epitop se može formirati od uzastopnih aminokiselina ili neuzastopnih aminokiselina koje su postavljene jedna uz drugu tercijarnim savijanjem jednog ili više proteina. Epitopi formirani od susednih aminokiselina (takođe poznati kao linearni epitopi) se obično zadržavaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem (takođe poznati kao konformacioni epitopi) obično gube pri tretmanu sa denaturišućim rastvaračima.

Epitop tipično uključuje najmanje 3, a češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, rendgensku kristalografiju i 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu. Videti, npr. Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, ur. (1996). Epitop može biti linearan, kao što je epitop od, na primer, 2-5, 3-5, 3-9 ili 5-9 kontinuiranih aminokiselina iz SEQ ID NO:31. Epitop takođe može biti konformacioni epitop uključujući, na primer, dva ili više nekontinuiranih segmenata aminokiselina unutar ostataka 89-97 SEQ ID NO:31. Ako se kaže da se antitelo vezuje za epitop unutar aminokiselina 89-97 transtiretina (TTR), na primer, ono što se podrazumeva je da je epitop unutar navedenog opsega aminokiselina uključujući i one koje definišu spoljne granice opsega. To ne znači nužno da svaka aminokiselina unutar opsega čini deo epitopa. Tako, na primer, epitop unutar aminokiselina 89-97 TTR može da se sastoji od aminokiselina 89-97, 89-96, 90-96, 91-96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 ili 89-93, između ostalih linearnih segmenata SEQ ID NO:35, ili u slučaju konformacionih epitopa, nekontinuiranih segmenata aminokiselina SEQ ID NO:35.

[0045] Antitela koja prepoznaju iste ili preklapajuće epitope mogu se identifikovati jednostavnim imunotestom koji pokazuje sposobnost jednog antitela da je u kompeticiji sa vezivanjem drugog antitela za ciljni antigen. Epitop antitela se takođe može definisati rendgenskom kristalografijom antitela vezanog za njegov antigen da bi se identifikovali kontaktni ostaci. Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju epitope koji se preklapaju ako neke mutacije aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.

[0046] Konkurencija između antitela je određena testom u kome antitelo koje se testira inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen (videti, npr. Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Test antitelo je u kompeticiji sa referentnim antitelom ako je višak test antitela (npr., najmanje 2x, 5x, 10x, 20x ili 100x) inhibira vezivanje referentnog antitela za najmanje 50% izmereno u kompetitivnom testu vezivanja. Neka test antitela inhibiraju vezivanje referentnog antitela za najmanje 75%, 90% ili 99%. Antitela identifikovana kompetitivnim testom (kompetitivna antitela) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop koji je dovoljno proksimalni od epitopa vezanog referentnim antitelom da bi došlo do sterične smetnje.

1

[0047] Termin "prirodni" u odnosu na strukturu transtiretina (TTR) odnosi se na normalnu savijenu strukturu TTR u svom ispravnom funkcionalnom stanju (tj. TTR tetramer). Pošto je TTR tetramer u svom prirodno savijenom obliku, ne-nativni oblici TTR uključuju, na primer, pogrešno savijene TTR tetramere, TTR monomere, agregirane oblike TTR i fibrilne oblike TTR. Ne-nativni oblici TTR mogu uključiti molekule koji sadrže divlji tip TTR aminokiselinskih sekvenci ili mutacija.

[0048] Termin "pogrešno savijen" u odnosu na TTR odnosi se na sekundarnu i tercijarnu strukturu monomera ili multimera TTR polipeptida i ukazuje da je polipeptid usvojio konformaciju koja nije normalna za taj protein u njegovom ispravnom funkcionalnom stanju. Iako pogrešno savijanje TTR može biti uzrokovano mutacijama u proteinu (npr., delecija, supstitucija ili adicija), TTR proteini divljeg tipa takođe mogu biti pogrešno savijeni kod bolesti, izlažući specifične epitope.

[0049] Termin "farmaceutski prihvatljiv" znači da je nosač, razblaživač, ekscipijens ili pomoćna supstanca kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije i da nije suštinski štetan za primaoca.

[0050] Termin "pacijent" uključuje ljude i druge subjekte sisara koji primaju bilo profilaktički ili terapeutski tretman.

[0051] Pojedinac je u povećanom riziku od bolesti ako subjekt ima barem jedan poznati faktor rizika (npr., genetski, biohemijski, porodičnu istoriju i situaciono izlaganje) stavljajući pojedince sa tim faktorom rizika u statistički značajan veći rizik od razvoja bolesti od pojedinaca bez faktora rizika.

[0052] Termin "biološki uzorak" odnosi se na uzorak biološkog materijala unutar ili koji se može dobiti iz biološkog izvora, na primer čoveka ili sisara. Takvi uzorci mogu biti organi, organele, tkiva, delovi tkiva, telesne tečnosti, periferna krv, krvna plazma, krvni serum, ćelije, molekuli kao što su proteini i peptidi, i bilo koji delovi ili kombinacije izvedene iz njih. Termin biološki uzorak takođe može da obuhvati bilo koji materijal dobijen obradom uzorka. Izvedeni materijal može uključivati ćelije ili njihovo potomstvo. Obrada biološkog uzorka može uključivati jednu ili više od filtracije, destilacije, ekstrakcije, koncentracije, fiksacije, inaktivacije ometajućih komponenti i slično.

[0053] Termin "kontrolni uzorak" odnosi se na biološki uzorak za koji nije poznato ili se sumnja da uključuje monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike transtiretina (TTR), kao što su TTR amiloidne naslage. Kontrolni uzorci se mogu dobiti od osoba koje nisu obolele od TTR amiloidoze ili posebno odabranog tipa TTR amiloidoze. Alternativno, kontrolni uzorci se mogu dobiti od pacijenata obolelih od TTR amiloidoze ili posebno

1

odabranog tipa TTR amiloidoze. Takvi uzorci se mogu dobiti istovremeno sa biološkim uzorkom za koji se smatra da sadrži TTR amiloidozu ili drugom prilikom. I biološki uzorak i kontrolni uzorak mogu se dobiti iz istog tkiva (npr., deo tkiva koji sadrži i TTR amiloidne naslage i okolno normalno tkivo). Poželjno, kontrolni uzorci se u suštini ili u potpunosti sastoje od tkiva bez TTR amiloidnih naslaga i mogu se koristiti u poređenju sa biološkim uzorkom za koji se smatra da sadrži TTR amiloidne naslage. Poželjno je da je tkivo u kontrolnom uzorku istog tipa kao i tkivo u biološkom uzorku (npr., kardiomiociti u srcu).

[0054] Termin "bolest" se odnosi na bilo koje abnormalno stanje koje narušava fiziološku funkciju. Termin se široko koristi da obuhvati bilo koji poremećaj, bolest, abnormalnost, patologiju, bolest, stanje ili sindrom kod kojih je fiziološka funkcija oštećena, bez obzira na prirodu etiologije.

[0055] Termin "simptom" se odnosi na subjektivni dokaz bolesti, kao što je izmenjen hod, kako ga subjekt percipira. „Znak“ se odnosi na objektivne dokaze o bolesti koju je primetio lekar.

[0056] Za potrebe klasifikacije supstitucija aminokiselina kao konzervativnih ili nekonzervativnih, aminokiseline su grupisane na sledeći način: Grupa I (hidrofobni bočni lanci): met, ala, val, leu, ile; Grupa II (neutralni hidrofilni bočni lanci): cys, ser, thr; Grupa III (kiseli bočni lanci): asp, glu; Grupa IV (bazni bočni lanci): asn, gln, his, lys, arg; Grupa V (ostaci koji utiču na orijentaciju lanca): gly, pro; i Grupa VI (aromatični bočni lanci): trp, tyr, phe. Konzervativne supstitucije uključuju supstitucije između aminokiselina u istoj klasi. Nekonzervativne supstitucije predstavljaju zamenu člana jedne od ovih klasa za člana druge.

[0057] Procentualna identičnost sekvenci se određuju sa sekvencama antitela maksimalno usklađenim po Kabat konvenciji o numerisanju. Nakon poravnanja, ako predmetni region antitela (npr., ceo zreli varijabilni region teškog ili lakog lanca) se poredi sa istim regionom referentnog antitela, procentualna identičnost sekvence između subjekta i regiona referentnog antitela je broj pozicija koje zauzima ista aminokiselina kod oba subjekta i referentni region antitela podeljen ukupnim brojem poravnatih pozicija dva regiona, sa prazninama koje se ne računaju, pomnoženo sa 100 da bi se pretvorilo u procenat.

[0058] Kompozicije ili postupci "koji sadrže" ili "uključuju" jedan ili više navedenih elemenata mogu uključivati druge elemente koji nisu posebno navedeni. Na primer, kompozicija koja "sadrži" ili "uključuje" antitelo može sadržati samo antitelo ili u kombinaciji sa drugim sastojcima.

[0059] Označavanje opsega vrednosti uključuje sve cele brojeve unutar opsega ili koji definišu opseg, i sve podopsege definisane celim brojevima unutar opsega.

1

[0060] Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, termin „oko“ obuhvata vrednosti unutar standardne granice greške merenja (npr., SEM) navedene vrednosti.

[0061] Statistička značajnost znači p≤0,05.

[0062] Oblici jednine članova „a“, „an“ i „the“ uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, termin "jedinjenje" ili "najmanje jedno jedinjenje" može uključivati mnoštvo jedinjenja, uključujući njihove smeše.

DETALJAN OPIS

I. Opšte

[0063] Pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za ostatke 89-97 transtiretina (TTR). Antitela imaju kapacitet da se vežu za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR. Antitela mogu da se koriste za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja povezanih sa akumulacijom TTR ili akumulacijom TTR naslaga (npr. TTR amiloidoza). Antitela se takođe mogu koristiti za dijagnostikovanje TTR amiloidoze i inhibiranje ili smanjenje agregacije TTR, između ostalih primena.

II. Ciljni molekuli

[0064] Transtiretin (TTR) je transportni protein seruma i cerebrospinalne tečnosti od 127-aminokiselina i 55 kDa koji se prvenstveno sintetiše u jetri. Takođe se naziva prealbumin, prealbumin koji vezuje tiroksin, ATTR i TBPA. U svom matičnom stanju, TTR postoji kao tetramer. Kod homozigota, tetrameri sadrže identične podjedinice sa 127 aminokiselina bogate beta-listom. Kod heterozigota, TTR tetrameri se sastoje od varijanti i/ili podjedinica divljeg tipa, tipično kombinovanih na statistički način.

[0065] Ustanovljena funkcija TTR u krvi je za transport holo-retinol vezujućeg proteina. Iako je TTR glavni nosilac tiroksina (T4) u krvi glodara, koristeći mesta vezivanja koja su ortogonalna onima koja se koriste za holo-retinol vezujući protein, T4mesta vezivanja su praktično prazna kod ljudi.

[0066] TTR je jedan od najmanje trideset različitih humanih proteina za čije se ekstracelularno pogrešno savijanje i/ili pogrešno sklapanje (amiloidogeneza) u spektar agregatnih struktura smatra da uzrokuje degenerativne bolesti koje se nazivaju amiloidne bolesti. TTR prolazi kroz konformacione promene da bi postao amiloidogen. Delimično

1

odvijanje otkriva delove uglavnom nenaelektrisanih hidrofobnih ostataka u proširenoj konformaciji koji se efikasno sastavljaju u uglavnom nestrukturirane sferne agregate koji na kraju prolaze kroz konformaciju u unakrsne amiloidne strukture beta lista.

[0067] Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, upućivanje na transtiretin (TTR) ili njegove fragmente ili domene uključuje prirodne humane aminokiselinske sekvence uključujući njihove izoforme, mutante i njihove alelne varijante. Primeri TTR polipeptidnih sekvenci su označeni pristupnim brojevima P02766.1 (UniProt) (SEQ ID NO:31), AAB35639.1 (GenBank) (SEQ ID NO:32), AAB35640.1 (GenBank) (SEQ ID NO:33) i ABI63351.1 (GenBank) (SEQ ID NO:34). Ostaci su numerisani prema Swiss Prot P02766.1, sa prvom aminokiselinom zrelog proteina (tj. ne uključujući signalnu sekvencu od 20 aminokiselina) označen kao ostatak 1. U bilo kom drugom TTR proteinu, ostaci su numerisani prema odgovarajućim ostacima u P02766.1 na maksimalnom poravnanju.

III. Transtiretinska amiloidoza

[0068] Transtiretinska (TTR) amiloidoza je sistemski poremećaj koji se karakteriše patogenim, pogrešno savijenim TTR i ekstracelularnim taloženjem amiloidnih fibrila sastavljenih od TTR. TTR amiloidoza je generalno uzrokovana destabilizacijom prirodnog oblika TTR tetramera (zbog ekoloških ili genetskih uslova), što dovodi do disocijacije, pogrešnog savijanja i agregacije TTR u amiloidne fibrile koje se akumuliraju u različitim organima i tkivima, uzrokujući progresivnu disfunkciju. Videti, npr. Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012.); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

[0069] Kod ljudi, i divlji tip TTR tetramera i mešani tetrameri koji se sastoje od mutantnih i divljih podjedinica mogu da se disociraju, pogrešno savijaju i agregiraju, pri čemu proces amiloidogeneze dovodi do degeneracije postmitotičkog tkiva. Prema tome, TTR amiloidoze obuhvataju bolesti uzrokovane patogenim pogrešno savijenim TTR koji je rezultat mutacija u TTR ili rezultat ne-mutiranog, pogrešno savijenog TTR.

[0070] Na primer, senilna sistemska amiloidoza (SSA) i senilna srčana amiloidoza (SCA) su tipovi amiloidoze koji su povezani sa uzrastom koji su rezultat taloženja divljeg tipa TTR amiloida izvan i unutar kardiomiocita srca. TTR amiloidoza je takođe najčešći oblik nasledne (porodične) amiloidoze, koja je uzrokovana mutacijama koje destabilizuju TTR protein. TTR amiloidoze povezane sa tačkastim mutacijama u TTR genu uključuju porodičnu amiloidnu polineuropatiju (FAP), porodičnu amiloidnu kardiomiopatiju (FAC) i retku selektivnu

1

amiloidozu centralnog nervnog sistema (CNSA). Pacijenti sa naslednom (porodičnom) TTR amiloidozom su skoro uvek heterozigoti, što znači da su TTR tetrameri sastavljeni od mutantnih i/ili divljeg tipa TTR podjedinica, generalno statistički raspoređenih. Nasledne (porodične) verzije TTR amiloidoze su generalno autozomno dominantne i obično se javljaju ranije od sporadičnih bolesti (SSA i SCA).

[0071] Postoji preko 100 mutacija u genu koji kodira TTR koje su uključene u autozomno dominantne poremećaje FAP i FAC. Videti, npr. US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat.

17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dvulet and Benson, Biochem. Biophis. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Ove mutacije koje izazivaju amiloid su raspoređene po celom molekulu TTR. Generalno, što su mutantne podjedinice više destabilizujuće za strukturu TTR tetramera, to je raniji početak amiloidne bolesti. Patogeni potencijal TTR varijante je generalno određen kombinacijom njegove nestabilnosti i efikasnosti ćelijske sekrecije. Početna patologija uzrokovana nekim TTR varijantama dolazi od njihovog selektivnog uništavanja srčanog tkiva, dok ona kod drugih TTR varijanti dolazi od kompromitovanja perifernog i autonomnog nervnog sistema. Čini se da oštećenje tkiva uzrokovano TTR amiloidogenezom u velikoj meri potiče od toksičnosti malih, difuzionih TTR agregata, iako akumulacija ekstracelularnog amiloida može doprineti i gotovo sigurno kompromitovati strukturu organa u kasnim stadijumima TTR amiloidoze.

[0072] TTR amiloidoza se javlja u mnogo različitih oblika, sa značajnim fenotipskim varijacijama među pojedincima i geografskim lokacijama. Na primer, TTR amiloidoza se može predstaviti kao progresivna, aksonalna senzorna autonomna i motorna neuropatija. TTR amiloidoza se takođe može predstaviti kao infiltrativna kardiomiopatija.

[0073] Starost pojave simptoma povezanih sa bolešću varira između druge i devete decenije života, sa velikim varijacijama u različitim populacijama. Multisistemska uključenost TTR amiloidoze je ključ za njenu dijagnozu. Na primer, dijagnoza TTR amiloidoze se razmatra kada je prisutno jedno ili više od sledećeg: (1) porodična istorija neuropatske bolesti, posebno povezana sa srčanom insuficijencijom; (2) neuropatski bol ili progresivni senzorni poremećaji nepoznate etiologije; (3) sindrom karpalnog tunela bez očiglednog uzroka, posebno ako je bilateralni i zahteva hirurško oslobađanje; (4) poremećaji gastrointestinalnog motiliteta ili disfunkcija autonomnog nerva nepoznate etiologije (npr. erektilna disfunkcija, ortostatska hipotenzija, neurogena gladera); (5) srčana bolest koju karakterišu zadebljani zidovi komora u odsustvu hipertenzije; (6) uznapredovali atrio-ventrikularni blok nepoznatog porekla, posebno kada je praćen zadebljanjem srca; i (6) inkluzije staklastog tela tipa vate. Vidi Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Ostali simptomi mogu uključivati, na

2

primer, polineuropatiju, gubitak čula, bol, slabost u donjim udovima, dishidrozu, dijareju, zatvor, gubitak težine i urinarnu inkontinenciju/retenciju.

[0074] Dijagnoza TTR amiloidoze se obično oslanja na biopsiju ciljnog organa, nakon čega sledi histološko bojenje isečenog tkiva bojom specifičnom za amiloid, Kongo crvenom. Ako se primeti pozitivan test na amiloid, naknadno se vrši imunohistohemijsko bojenje za TTR kako bi se osiguralo da je prekursorski protein odgovoran za formiranje amiloida zaista TTR. Za porodične oblike bolesti, pre postavljanja dijagnoze potrebna je demonstracija mutacije gena koji kodira TTR. Ovo se može postići, na primer, elektroforezom izoelektričnog fokusiranja, lančanom reakcijom polimeraze ili laserskom disekcijom/tečnom hromatografijom-tandemskom masenom spektrometrijom. Videti, npr. US 2014/0056904; Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012.); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

IV. Antitela

A. Specifičnost vezivanja i funkcionalna svojstva

[0075] Pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela kao što su definisana u zahtevima, koja se vezuju za transtiretin (TTR) protein, tačnije, za epitope unutar aminokiselinskih ostataka 89-97 (SEQ ID NO:35) TTR. Takvi epitopi su zakopani u nativni TTR tetramer i izloženi u monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR.

[0076] Antitelo označeno kao 5A1 je mišje antitelo. Ovo antitelo se specifično vezuje unutar aminokiselinskih ostataka 89-97 (SEQ ID NO:35) TTR. Ovo antitelo se dalje karakteriše njegovom sposobnošću da se vezuje za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne forme TTR, ali ne i za nativne tetramerne oblike TTR. Pored toga, ovo antitelo karakteriše njegova imunoreaktivnost na TTR-posredovano amiloidozno srčano tkivo, ali ne i na zdravo srčano tkivo. Sposobnost vezivanja za specifične proteine ili njihove fragmente može se demonstrirati korišćenjem primera formata testova datih u primerima.

[0077] Neka antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop kao antitelo označeno 5A1. Sekvence zrelih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca 5A1 označene su SEQ ID NOS: 1 i 9, respektivno. Druga antitela koja imaju takvu specifičnost vezivanja mogu se proizvesti imunizacijom miševa sa TTR ili njegovim delom uključujući željeni epitop (npr., SEQ ID NO:35), i skrining rezultujućih antitela za vezivanje za monomerni TTR ili peptid koji sadrži SEQ ID NO:35, izborno u konkurenciji sa antitelom koje ima varijabilne regione miša 5A1 (IgG1, kapa). Fragmenti TTR uključujući željeni epitop mogu biti povezani sa nosačem koji pomaže da se izazove odgovor antitela na fragment i/ili se kombinuju sa ađuvansom koji pomaže da se izazove takav odgovor. Takva antitela se mogu testirati na diferencijalno vezivanje za monomerne verzije TTR divljeg tipa ili njegov fragment (npr., SEQ ID NO:31) u poređenju sa mutantima specificiranih ostataka. Skrining protiv takvih mutanata preciznije definiše specifičnost vezivanja da bi se omogućila identifikacija antitela čije je vezivanje inhibirano mutagenezom određenih ostataka i koja verovatno dele funkcionalna svojstva drugih antitela sa primerima. Mutacije mogu biti sistematska supstitucija sa alaninom (ili serinom ako je alanin već prisutan) jedan po jedan ostatak, ili u šire raspoređenim intervalima, kroz ciljno mesto ili kroz njegov deo u kome se zna da se nalazi epitop. Ako isti skup mutacija značajno smanjuje vezivanje dva antitela, ta dva antitela vezuju isti epitop.

[0078] Antitela koja imaju specifičnost vezivanja odabranog mišjeg antitela (npr. 5A1) takođe mogu da se proizvedu korišćenjem varijante metode prikaza faga. Videti Winter, WO 92/20791. Ovaj postupak je posebno pogodan za proizvodnju humanih antitela. U ovom postupku, ili varijabilni region teškog ili lakog lanca izabranog mišjeg antitela se koristi kao početni materijal. Ako je, na primer, varijabilni region lakog lanca izabran kao početni materijal, konstruiše se biblioteka faga u kojoj članovi prikazuju isti varijabilni region lakog lanca (tj. mišji početni materijal) i drugačiji varijabilni region teškog lanca. Varijabilni regioni teškog lanca mogu se, na primer, dobiti iz biblioteke preuređenih humanih varijabilnih regiona teškog lanca. Fag koji pokazuje snažno specifično vezivanje (npr., najmanje 10<8>i poželjno najmanje 10<9>M<-1>) za monomerni TTR ili njegov fragment (npr., aminokiselinski ostaci 89-97). Varijabilni region teškog lanca iz ovog faga tada služi kao početni materijal za konstruisanje dalje biblioteke faga. U ovoj biblioteci, svaki fag prikazuje isti varijabilni region teškog lanca (tj. region identifikovan iz prve biblioteke prikaza) i drugačiji varijabilni region lakog lanca. Varijabilni regioni lakog lanca mogu se dobiti na primer iz biblioteke preuređenih humanih varijabilnih regiona lakog lanca. Opet, fag pokazuje snažno specifično vezivanje za monomerni TTR ili njegov fragment (npr., aminokiselinski ostaci 89-97). Nastala antitela obično imaju istu ili sličnu specifičnost epitopa kao mišji početni materijal.

[0079] Druga antitela se mogu dobiti mutagenezom cDNK koja kodira teške i lake lance primera antitela, kao što je 5A1. Monoklonska antitela koja su najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa 5A1 u aminokiselinskoj sekvenci zrelog teškog i/ili lakog lanca varijabilnih regiona i održavaju njegova funkcionalna svojstva, i/ili koja se razlikuju od odgovarajućeg antitela malim brojem funkcionalno nevažnih supstitucija aminokiselina (npr., konzervativne supstitucije), delecije ili insercije su takođe otkrivene. Takođe su otkrivena monoklonska antitela koja imaju najmanje jedan ili svih šest CDR regiona kako je definisano konvencionalnom definicijom, ali poželjno Kabat, koji su 90%, 95%, 99% ili 100% identični odgovarajućim CDR regionima 5A1.

[0080] Takođe su otkrivena antitela koja imaju neke ili sve (npr., 3, 4, 5, i 6) CDR regioni u potpunosti ili suštinski iz 5A1. Takva antitela mogu uključivati varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje dva, a obično sva tri, CDR regiona u potpunosti ili suštinski iz varijabilnog regiona teškog lanca 5A1 i/ili varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje dva i obično sva tri, CDR regioni u potpunosti ili suštinski iz varijabilnog regiona lakog lanca 5A1. Antitela mogu uključivati i teške i lake lance. CDR je uglavnom iz odgovarajućeg 5A1 CDR regiona kada ne sadrži više od 4, 3, 2 ili 1 supstitucija, insercija ili delecija, osim što CDRH2 (kada ga definiše Kabat) ne može imati više od 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucija, inserija ili delecija. Takva antitela mogu imati najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa 5A1 u aminokiselinskoj sekvenci zrelih varijabilnih regiona teškog i/ili lakog lanca i održavaju svoja funkcionalna svojstva i/ili se razlikuju od 5A1 po malom broju funkcionalno nebitnih aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativne supstitucije), delecija ili insercija.

[0081] Neka antitela identifikovana ovakvim testovima mogu da se vežu za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne forme TTR, ali ne i za nativne tetramerne oblike TTR, kao što je opisano u primerima ili na drugi način. Slično tome, neka antitela su imunoreaktivna na tkivo amiloidoze posredovano TTR, ali ne i na zdravo tkivo.

[0082] Neka antitela se mogu koristiti da inhibiraju ili smanje agregaciju TTR, inhibiraju ili smanje formiranje TTR fibrila, smanjuju ili čiste TTR naslage ili agregirani TTR, ili stabilizuju netoksične konformacije TTR u životinjskom modelu ili kliničkom ispitivanju. Neka antitela se mogu koristiti za lečenje, efekat profilakse ili odlaganje početka TTR amiloidoze kao što je prikazano u životinjskom modelu ili kliničkom ispitivanju. Primeri životinjskih modela za testiranje aktivnosti protiv TTR amiloidoze uključuju one opisane u Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem. 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); i Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).

B. Ne-humana antitela

2

[0083] Proizvodnja drugih neljudskih antitela, npr., od miša, zamorčeta, primata, zeca ili pacova, protiv monomernog TTR ili njegovog fragmenta (npr., aminokiselinski ostaci 89-97) može se postići, na primer, imunizacijom životinje sa TTR ili njegovim fragmentom. Videti Harlow & Lane, Antibodies, Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Takav imunogen se može dobiti iz prirodnog izvora, sintezom peptida ili rekombinantnom ekspresijom. Izborno, imunogen se može primeniti fuzionisan ili na drugi način u kompleksu sa proteinom nosačem. Izborno, imunogen se može primeniti sa ađuvansom. Može se koristiti nekoliko tipova ađuvansa kao što je opisano u nastavku. Za imunizaciju laboratorijskih životinja poželjan je potpuni Frojndov ađuvans praćen nepotpunim ađuvansom. Zečevi ili zamorci se obično koriste za pravljenje poliklonskih antitela. Miševi se obično koriste za pravljenje monoklonskih antitela. Antitela se testiraju na specifično vezivanje za monomerni TTR ili epitop unutar TTR (npr., epitop koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka 89-97). Takav skrining se može postići određivanjem vezivanja antitela za kolekciju monomernih TTR varijanti, kao što su TTR varijante koje sadrže aminokiselinske ostatke 89-97 ili mutacije unutar ovih ostataka, i određivanjem koje se TTR varijante vezuju za antitelo. Vezivanje se može proceniti, na primer, pomoću Western blota, FACS ili ELISA.

C. Humanizovana antitela

[0084] Humanizovano antitelo je genetski konstruisano antitelo u kome su CDR regioni nehumanog „donorskog” antitela graftovani u sekvence humanih „akceptorskih” antitela (videti, npr. Queen, US 5,530,101 i 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; i Foote, US 6,881,557). Sekvence akceptorskih antitela mogu biti, na primer, sekvenca zrelog humanog antitela, kompozit takvih sekvenci, konsenzusna sekvenca sekvenci humanih antitela ili sekvenca regiona zametne linije. Dakle, humanizovano antitelo je antitelo koje ima najmanje tri, četiri, pet ili ili sve CDR regione u potpunosti ili suštinski iz sekvenci donorskog antitela i okvirnih sekvenci varijabilnog regiona i konstantnih regiona, ako su prisutni, u potpunosti ili suštinski iz sekvenci humanog antitela. Slično, humanizovani teški lanac ima najmanje jedan, dva i obično sva tri CDR regiona u potpunosti ili suštinski iz teškog lanca antitela donatora, i okvirnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i konstantni region teškog lanca, ako je prisutan, uglavnom iz humaih sekvenci okvira varijabilnog regiona teškog lanca čoveka i konstantnog regiona. Slično, humanizovani laki lanac ima najmanje jedan, dva i obično sva tri CDR regiona u potpunosti ili suštinski iz lakog lanca antitela donora, i okvirnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca i konstantni region lakog lanca, ako je prisutan, uglavnom iz humane sekvence okvira varijabilnog regiona lakog lanca i konstantnog regiona. Osim nanotela i dAb, humanizovano antitelo obuhvata humanizovani teški lanac i humanizovani laki lanac. CDR u humanizovanom antitelu je u suštini od odgovarajućeg CDR u ne-humanom antitelu kada je najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% odgovarajućih ostataka (kao što je definisano bilo kojom konvencionalnom definicijom, ali poželjno definisano od strane Kabata) identično između odgovarajućih CDR regiona. Okvirne sekvence varijabilnog regiona lanca antitela ili konstantnog regiona lanca antitela su uglavnom iz okvirne sekvence varijabilnog regiona ili humanog konstantnog regiona, respektivno kada je najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% odgovarajućih ostataka definisanih sa bilo kojom konvencionalnom definicijom, ali poželjno definisani od strane Kabata su identično.

[0085] Iako humanizovana antitela često uključuju svih šest CDR regiona (poželjno kako ih je definisao Kabat) od mišjih antitela, mogu se napraviti i sa manje od svih CDR regiona (npr., najmanje 3, 4 ili 5 CDR regiona) od mišjeg antitela (npr., Pascalis et al., J. Immunol.

169:3076, 2002; Vajdos et al., J. iz Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).

[0086] U nekim antitelima, samo deo CDR regiona, odnosno podskup CDR ostataka potrebnih za vezivanje, koji se nazivaju SDR regioni, je potreban da bi se zadržalo vezivanje u humanizovanom antitelu. CDR ostaci koji ne dolaze u kontakt sa antigenom i nisu u SDR regionima mogu se identifikovati na osnovu prethodnih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDR H2 često nisu potrebni), iz regiona Kabat CDR regiona koji leže izvan Chothia hipervarijabilnih petlji (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), molekularnim modeliranjem i/ili empirijski, ili kako je opisano u Gonzales et al., Mol. Immunol.41: 863, 2004. U takvim humanizovanim antitelima na pozicijama u kojima je odsutan jedan ili više CDR ostataka donora ili u kojima je ceo CDR donora izostavljen, aminokiselina koja zauzima tu poziciju može biti aminokiselina koja zauzima odgovarajući položaj (po Kabat numeraciji) u akceptorskoj sekvenci antitela. Broj takvih supstitucija akceptora za donatorske aminokiseline u CDR regionima koje treba uključiti odražava ravnotežu konkurentskih razmatranja. Takve supstitucije su potencijalno korisne u smanjenju broja mišjih aminokiselina u humanizovanom antitelu i posledično smanjenju potencijalne imunogenosti. Međutim, zamene takođe mogu izazvati promene afiniteta, a poželjno je izbegavati značajna smanjenja afiniteta. Pozicije za supstituciju unutar CDR regiona i aminokiseline za supstituciju takođe mogu biti odabrane empirijski.

2

[0087] Sekvence humanih akceptorskih antitela mogu izborno biti izabrane od mnogih poznatih sekvenci humanih antitela da bi se obezbedio visok stepen identičnosti sekvence (npr., 65-85% identičnosti) između okvira varijabilnog regiona humane akceptorske sekvence i odgovarajućih okvira varijabilnog regiona lanca donorskog antitela.

[0088] Primeri akceptorskih sekvenci za teški lanac su varijabilni region ljudskog zrelog teškog lanca AGP01689 (SEQ ID NO:3) ili druga podgrupa humanog teškog lanca 1. SEQ ID NO:3 akceptorska sekvenca uključuje dva CDR regiona koji imaju isti kanonski oblik kao mišji 5A1 teški lanac. Primeri akceptorskih sekvenci za laki lanac su varijabilni regioni humanog zrelog lakog lanca sa NCBI pristupnim kodom BAH04766 (SEQ ID NO:11) i drugi varijabilni regioni lakog lanca humane kapa podgrupe 2.

[0089] Određene aminokiseline iz strukturnih ostataka humanog varijabilnog regiona mogu se izabrati za supstituciju na osnovu njihovog mogućeg uticaja na CDR konformaciju i/ili vezivanje za antigen. Istraživanje takvih mogućih uticaja je modeliranjem, ispitivanjem karakteristika aminokiselina na određenim lokacijama ili empirijskim posmatranjem efekata supstitucije ili mutageneze određenih aminokiselina.

[0090] Na primer, kada se aminokiselina razlikuje između ostatka okvira mišjeg varijabilnog regiona i odabranog ostatka okvira varijabilnog regiona čoveka, aminokiselina humanog okvira može biti zamenjena ekvivalentnom okvirnom aminokiselinom iz mišjeg antitela kada se razumno očekuje da aminokiselina:

(1) nekovalentno vezuje antigen direktno;

(2) je u blizini CDR regiona ili unutar CDR kao što je definisano od Chothia, ali ne i Kabat;

(3) inače stupa u interakciju sa CDR regionom (npr., je unutar oko 6 Å od CDR regiona), (npr., identifikovan modeliranjem lakog ili teškog lanca na rešenoj strukturi homolognog poznatog lanca imunoglobulina); ili

(4) je ostatak koji učestvuje u VL-VH interfejsu.

[0091] Ostaci okvira iz klasa (1) do (3) kako ih je definisala Queen, US 5,530,101, ponekad se naizmenično nazivaju kanonskim i Vernijeovim ostacima. Ostaci okvira koji pomažu da se definiše konformacija CDR petlje ponekad se nazivaju kanonskim ostacima (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Ostaci okvira koji podržavaju konformacije petlje za vezivanje antigena i igraju ulogu u finom podešavanju pristajanja antitela na antigen ponekad se nazivaju Vernijeovi ostaci

2

(Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).

[0092] Drugi okvirni ostaci koji su kandidati za supstituciju su ostaci koji stvaraju potencijalno mesto glikozilacije. Drugi kandidati za supstituciju su akceptorske humane okvirne aminokiseline koje su neuobičajene za humani imunoglobulin na toj poziciji. Ove aminokiseline mogu biti supstituisane sa aminokiselinama sa ekvivalentnog položaja antitela miša donora ili sa ekvivalentnih pozicija tipičnijih humanih imunoglobulina.

[0093] Primeri humanizovanih antitela su humanizovani oblici mišjeg 5A1 antitela, koje obuhvata zrele varijabilne regione teškog i lakog lanca koji imaju sekvence aminokiselina koje sadrže SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:9, respektivno. Pronalazak obezbeđuje primer humanizovanog zrelog varijabilnog regiona teškog lanca: Hu5A1VHv2 (SEQ ID NO:5). Pronalazak dalje daje primer varijabilnog regiona zrelog lakog lanca čoveka: Hu5A1VLv2 (SEQ ID NO:13).

[0094] Slike 1 i 2 prikazuju poravnanja varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca, respektivno, 5A1, antitela mišjeg modela, humanih akceptorskih antitela i humanizovanih verzija antitela 5A1. Slike takođe pokazuju položaje CDR regiona, kanonskih ostataka, Vernijeovih ostataka i ostataka interfejsa. Pozicije na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između akceptorskih sekvenci miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Međutim, ovde slike pokazuju nekoliko takvih ostataka koji se razlikuju između akceptorskih sekvenci miša i čoveka. Položaji teških lanaca 29 i 93 su razmatrani za supstituciju, jer su se ljudski i mišji ostaci razlikovali na ovim pozicijama. Pozicija 29 je unutar Chothia CDRH1 regiona, a pozicija 93 je ostatak koji doprinosi VH-VL interfejsu. Položaji lakog lanca 85 (unutar okvira varijabilnog regiona) i 55 (unutar CDRL2) su razmatrani za supstituciju na osnovu toga što su ostaci koji zauzimaju ove pozicije u ravnom CDR transplantatu neuobičajeni za položaje u humanim antitelima. Na poziciji 85, T ostatak ljudskog akceptora je zamenjen mišjim V ostatkom. Na poziciji 55, ostatak cisteina miša je zamenjen sa serinskim ostatkom. Serin nije prisutan u humanom akceptoru, tako da ova zamena nije ni povratna ni napredna mutacija. Tri druga okvira varijabilnog regiona Vernijeove pozicije na kojima se razlikuju akceptorski ostaci miša i čoveka su H49, H75 i L69. Ove pozicije mogu izborno da se mutiraju unazad (S49A, K75R i T69A, respektivno).

[0095] Ovde, kao i drugde, prvi pomenuti ostatak je ostatak humanizovanog antitela nastalog graftovanjem Kabat CDR regiona ili kompozitnih Chothia Kabat CDR regiona u slučaju CDR-H1 u humani akceptorski okvir, a drugi pomenuti ostatak je ostatak koji se razmatra za zamenu takvog ostatka. Dakle, unutar okvira varijabilnih regiona, prvi pomenuti ostatak je humani (T85V, V29F i A93H), a unutar CDR regiona, prvi pomenuti ostatak je mišji (C55S).

2

[0096] Primeri antitela uključuju prikazane zrele varijabilne regione teškog i lakog lanca VHv2/VLv2 ili H2L2). U nekim takvim antitelima je zadržano najmanje 1, 2, 3 ili sve 4 mutacije prisutne u bilo kojoj od SEQ ID NOS: 5 ili 13. U nekim antitelima, jedna ili obe VHpozicije 29 i 93 zauzimaju F i V respektivno. U nekim antitelima, jedna ili obe VLpozicije 55 i 85 zauzimaju S i V. CDR regioni takvih humanizovanih antitela mogu biti identični ili suštinski identični CDR regionima 5A1 mišjeg donora antitela. CDR regioni se mogu definisati bilo kojom konvencionalnom definicijom (npr., Chothia, ili kompozit Chothia i Kabat), ali su poželjno kako ih definiše Kabat.

[0097] Okvirne pozicije varijabilnih regiona su u skladu sa Kabat numeracijom osim ako nije drugačije navedeno. Druge takve varijante se tipično razlikuju od sekvenci prikazanih teških i lakih lanaca Hu5A1 u malom broju (npr., obično ne više od 1, 2, 3, 5, 10 ili 15) zamena, delecija ili insercija. Takve razlike su obično u okviru, ali se mogu pojaviti i u CDR regionima.

[0098] Mogućnost za dodatne varijacije u humanizovanim varijantama 5A1 su dodatne povratne mutacije u okvirima varijabilnih regiona. Mnogi ostaci okvira koji nisu u kontaktu sa CDR regionima u humanizovanom mAb mogu prihvatiti supstitucije aminokiselina sa odgovarajućih pozicija donorskog mišjeg mAb ili drugih mišjih ili humanih antitela, pa čak i mnogi potencijalni CDR-kontaktni ostaci su takođe podložni supstituciji. Čak i aminokiseline unutar CDR regiona mogu biti izmenjene, na primer, sa ostacima koji se nalaze na odgovarajućoj poziciji humane akceptorske sekvence koja se koristi za snabdevanje okvira varijabilnog regiona. Pored toga, alternativne humane akceptorske sekvence mogu se koristiti, na primer, za teški i/ili laki lanac. Ako se koriste različite akceptorske sekvence, jedna ili više od gore preporučenih povratnih mutacija možda neće biti izvedene jer su odgovarajući donorski i akceptorski ostaci već isti bez povratnih mutacija.

[0099] Poželjno je da zamene ili povratne mutacije u Hu5A1 varijantama (bilo da su konzervativne ili ne) nemaju značajan uticaj na afinitet vezivanja ili potenciju humanizovanog mAb, odnosno njegovu sposobnost da se veže za monomerni TTR (npr., potencija u nekim ili svim testovima opisanim u ovim primerima varijanti humanizovanog 5A1 antitela je u suštini ista, tj. unutar eksperimentalne greške, kao kod miša 5A1).

D. Himerna i antitela promenjene površine

[0100] Otkriće dalje obezbeđuje himerne i oblike sa izmenjenom površinom nehumanih antitela.

2

[0101] Himerno antitelo je antitelo u kome su zreli varijabilni regioni lakih i teških lanaca nehumanog antitela (npr., miša) kombinovani sa humanim konstantnim regionima lakog i teškog lanca. Takva antitela suštinski ili u potpunosti zadržavaju specifičnost vezivanja mišjeg antitela i čine oko dve trećine humane sekvence.

[0102] Obloženo antitelo je tip humanizovanog antitela koje zadržava neke i obično sve CDR regione i neke od ostataka okvira ne-humanog varijabilnog regiona ne-humanog antitela, ali zamenjuje druge ostatke okvira varijabilnog regiona koji mogu doprineti B- ili T -ćelijskim epitopima, na primer izloženi ostaci (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) sa ostacima sa odgovarajućih pozicija sekvence humanog antitela. Rezultat je antitelo u kome su CDR regioni u celini ili suštinski od ne-humanog antitela, a okviri varijabilnih regiona ne-humanog antitela postaju sličniji ljudskim supstitucijama. Oblici antitela sa promenjenom površinom za koja se traži zaštita su uključeni u pronalazak.

E. Humana antitela

[0103] Humana antitela protiv monomernog TTR ili njegovog fragmenta (npr., aminokiselinski ostaci 89-97 (SEQ ID NO:35) TTR) su obezbeđeni različitim tehnikama opisanim u nastavku. Neka ljudska antitela se biraju putem kompetitivnih eksperimenata vezivanja, metodom prikaza faga prema Winter-u, gore, ili na neki drugi način, da bi imala istu specifičnost epitopa kao određeno mišje antitelo, kao što je jedno od mišjih monoklonskih antitela opisanih u primerima. Humana antitela se takođe mogu testirati na određenu specifičnost epitopa korišćenjem samo fragmenta TTR, kao što je TTR varijanta koja sadrži samo aminokiselinske ostatke 89-97 TTR, kao ciljni antigen, i/ili skriningom antitela na kolekciju TTR varijante, kao što su TTR varijante koje sadrže različite mutacije unutar aminokiselinskih ostataka 89-97 TTR.

[0104] Postupci za proizvodnju humanih antitela uključuju postupak trioma od Oestberg et al., Hibridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent br.4,634,664; i Engleman et al., US Patent 4,634,666, korišćenje transgenih miševa uključujući gene humanog imunoglobulina (videti, npr. Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397; US 5,874,299; US 5,814,318; US 5,789,650; US 5,770,429; US 5,661,016; US 5,633,425; US 5,625,126; US 5,569,825; US 5,545,806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); i Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) i metode prikaza faga (videti, npr. Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US 5,877,218; US 5,871,907; US 5,858,657; US 5,837,242; US 5,733,743; i US 5,565,332).

2

F. Izbor konstantnog regiona

[0105] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca himernih, promenjene površine ili humanizovanih antitela mogu biti povezani sa najmanje delom humanog konstantnog regiona. Izbor konstantnog regiona delimično zavisi od toga da li su poželjna citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela, ćelijska fagocitoza zavisna od antitela i/ili citotoksičnost zavisna od komplementa. Na primer, humani izotipovi IgG1 i IgG3 imaju citotoksičnost zavisnu od komplementa, a humani izotipovi IgG2 i IgG4 nemaju. Humani IgG1 i IgG3 takođe indukuju jače efektorske funkcije posredovane ćelijama od humanih IgG2 i IgG4. Konstantni regioni lakog lanca mogu biti lambda ili kapa.

[0106] Jedna ili nekoliko aminokiselina na amino ili karboksi kraju lakog i/ili teškog lanca, kao što je C-terminalni lizin teškog lanca, može nedostajati ili je derivatizovano u proporciji ili svim molekulima. Supstitucije se mogu izvršiti u konstantnim regionima da bi se smanjila ili povećala efektorska funkcija kao što je citotoksičnost posredovana komplementom ili ADCC (videti, npr. Winter et al., US Patent br. 5,624,821; Tso et al., US Patent br.

5,834,597; i Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), ili da produži poluživot kod ljudi (videti, npr. Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Primeri supstitucija uključuju Gln na poziciji 250 i/ili Leu na poziciji 428 (EU numeracija se koristi u ovom paragrafu za konstantni region) za povećanje poluživota antitela. Supstitucija na bilo kojoj ili svim pozicijama 234, 235, 236 i/ili 237 smanjuje afinitet za Fcγ receptore, posebno FcγRI receptor (videti, npr. US 6,624,821). Supstitucija alanina na pozicijama 234, 235 i 237 humanog IgG1 može se koristiti za smanjenje efektorskih funkcija. Neka antitela imaju supstituciju alanina na pozicijama 234, 235 i 237 humanog IgG1 za smanjenje efektorskih funkcija. Izborno, pozicije 234, 236 i/ili 237 u humanom IgG2 su supstituisane sa alaninom, a pozicija 235 sa glutaminom (videti, npr. US 5,624,821). U nekim antitelima, koristi se mutacija na jednoj ili više pozicija 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 i 331 prema EU numerisanju humanog IgG1. U nekim antitelima se koristi mutacija na jednoj ili više pozicija 318, 320 i 322 prema EU numerisanju humanog IgG1. U nekim antitelima, pozicije 234 i/ili 235 su zamenjene alaninom i/ili pozicija 329 je supstituisana glicinom. U nekim antitelima, izotip je humani IgG2 ili IgG4.

[0107] Primer humanog kapa konstantnog regiona lakog lanca ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 25. Antitela se mogu eksprimirati kao tetrameri koji sadrže dva laka i dva teška lanca, kao odvojeni teški lanci, laki lanci, kao Fab, Fab', F(ab')2 i Fv, ili kao jednolančana antitela u kojima su zreli varijabilni domeni teškog i lakog lanca povezani preko spejsera.

[0108] Humani konstantni regioni pokazuju alotipsku varijaciju i izoalotipsku varijaciju između različitih individua, to jest, konstantni regioni se mogu razlikovati kod različitih individua na jednom ili više polimorfnih pozicija. Izoalotipovi se razlikuju od alotipova po tome što se serumi koji prepoznaju izoalotip vezuju za nepolimorfni region jednog ili više drugih izotipova. Tako, na primer, drugi konstantni region teškog lanca je alotipa IgG1 G1m3 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23. Referenca na humani konstantni region uključuje konstantni region sa bilo kojim prirodnim alotipom ili bilo kojom permutacijom ostataka koji zauzimaju pozicije u prirodnim alotipovima.

G. Ekspresija rekombinantnih antitela

[0109] Poznato je nekoliko postupaka za proizvodnju himernih i humanizovanih antitela korišćenjem ćelijske linije koja eksprimira antitela (npr., hibridom). Na primer, imunoglobulinski varijabilni regioni antitela mogu se klonirati i sekvencirati korišćenjem dobro poznatih postupaka. U jednom postupku, varijabilni VH region teškog lanca se klonira pomoću RT-PCR koristeći iRNK pripremljenu iz ćelija hibridoma. Konsenzusni prajmeri se koriste za vodeći peptid VH regiona koji obuhvata kodon inicijacije translacije kao 5' prajmer i g2b prajmer specifičan za konstantne regione 3'. Primeri prajmera su opisani u američkoj patentnoj publikaciji US 2005/0009150 od strane Schenk et al. (u daljem tekstu „Schenk“). Sekvence iz više, nezavisno izvedenih klonova se mogu uporediti kako bi se osiguralo da nema promena tokom amplifikacije. Sekvenca VH regiona se takođe može odrediti ili potvrditi sekvenciranjem VH fragmenta dobijenog 5' RACE RT-PCR metodologijom i 3' g2b specifičnog prajmera.

[0110] VL region lakog lanca može da se klonira na analogan način. U jednom pristupu, konsenzusni set prajmera je dizajniran za amplifikaciju VL regiona korišćenjem 5' prajmera dizajniranog da se hibridizuje sa VL regionom koji obuhvata kodon inicijacije translacije i 3' prajmera specifičnog za Ck region nishodno od V-J regiona spajanja. U drugom pristupu, 5'RACE RT-PCR metodologija se koristi za kloniranje VL koji kodira cDNK. Primeri prajmera su opisani u Schenk, supra. Klonirane sekvence se zatim kombinuju sa sekvencama koje kodiraju humane (ili druge ne-humane vrste) konstantne regione.

[0111] U jednom pristupu, varijabilni regioni teškog i lakog lanca su rekonstruisani da kodiraju splajsne sekvence donora nishodno od odgovarajućih VDJ ili VJ spojeva i kloniraju se u vektor ekspresije sisara, kao što je pCMV-hγ1 za teški lanac i pCMV-Mcl za laki lanac.

1

Ovi vektori kodiraju ljudske γ1 i Ck konstantne regione kao egzonske fragmente nishodno od kasete inseriranog varijabilnog regiona. Nakon verifikacije sekvence, ekspresioni vektori teškog i lakog lanca mogu se ko-transfektovati u CHO ćelije da bi se proizvela himerna antitela. Kondicionirani medijum je sakupljen 48 sati nakon transfekcije i analiziran Western blot analizom za proizvodnju antitela ili ELISA za vezivanje antigena. Himerna antitela su humanizovana kao što je gore opisano.

[0112] Himerna, promenjene površine, humanizovana i humana antitela se tipično proizvode rekombinantnom ekspresijom. Rekombinantni polinukleotidni konstrukti tipično uključuju sekvencu za kontrolu ekspresije koja je operativno povezana sa kodirajućim sekvencama lanaca antitela, uključujući prirodno povezane ili heterologne kontrolne elemente ekspresije, kao što je promotor. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu biti promotorski sistemi u vektorima sposobnim za transformaciju ili transfekciju eukariotskih ili prokariotskih ćelija domaćina. Jednom kada je vektor ugrađen u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava u uslovima pogodnim za visok nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci i sakupljanje i prečišćavanje antitela koja reaguju unakrsno.

[0113] Ovi ekspresioni vektori se tipično mogu replicirati u organizmima domaćinima ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK domaćina. Obično ekspresioni vektori sadrže markere za selekciju, npr., otpornost na ampicilin ili otpornost na higromicin, da bi se omogućila detekcija onih ćelija transformisanih sa željenim DNK sekvencama.

[0114] E. coli je jedan prokariotski domaćin koristan za ekspresiju antitela, posebno fragmenata antitela. Mikrobi, kao što je kvasac, takođe su korisni za ekspresiju. Saccharomices je domaćin kvasac sa pogodnim vektorima koji imaju sekvence za kontrolu ekspresije, oridžin replikacije, terminacione sekvence i slično po želji. Tipični promotori uključuju 3-fosfoglicerat kinazu i druge glikolitičke enzime. Inducibilni promotori kvasca uključuju, između ostalog, promotore alkohol dehidrogenaze, izocitohroma C i enzima odgovornih za korišćenje maltoze i galaktoze.

[0115] Ćelije sisara se mogu koristiti za ekspresiju nukleotidnih segmenata koji kodiraju imunoglobuline ili njihove fragmente. Videti Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Razvijen je niz pogodnih ćelijskih linija domaćina sposobnih da luče intaktne heterologne proteine i uključuju CHO ćelijske linije, različite COS ćelijske linije, HeLa ćelije, HEK293 ćelije, L ćelije i mijelome koji ne proizvode antitela uključujući Sp2/0 i NS0. Ćelije mogu biti nehumane. Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu uključivati sekvence za kontrolu ekspresije, kao što su oridžin replikacije, promotor, pojačivač (Queen et al., Immunol. Rev.89:49 (1986)), i neophodna mesta za obradu informacija, kao što su mesta

2

vezivanja ribozoma, mesta spajanja RNK, mesta poliadenilacije i sekvence terminatora transkripcije. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu uključivati promotore izvedene iz endogenih gena, citomegalovirusa, SV40, adenovirusa, goveđeg papiloma virusa i slično. Videti Co et al., J. Immunol.148:1149 (1992).

[0116] Alternativno, sekvence koje kodiraju antitela mogu biti ugrađene u transgene za uvođenje u genom transgene životinje koja nije humana i naknadnu ekspresiju u mleku transgene životinje (videti, npr. U.S. Pat. br.5,741,957; U.S. Pat. br.5,304,489; i U.S. Pat. br.

5,849,992). Pogodni transgeni uključuju kodirajuće sekvence za lake i/ili teške lance operativno povezane sa promotorom i pojačivačem iz gena specifičnog za mlečnu žlezdu, kao što je kazein ili beta laktoglobulin.

[0117] Vektori koji sadrže DNK segmente od interesa mogu se preneti u ćeliju domaćina postupcima u zavisnosti od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hloridom se obično koristi za prokariotske ćelije, dok se tretman kalcijum fosfatom, elektroporacija, lipofekcija, biolistika ili transfekcija zasnovana na virusu mogu koristiti za druge ćelijske domaćine. Drugi postupci koji se koriste za transformaciju ćelija sisara uključuju upotrebu polibrena, fuziju protoplasta, lipozoma, elektroporaciju i mikroinjekciju. Za proizvodnju transgenih ne-humanih životinja, transgeni se mogu mikroinjektirati u oplođene oocite ili se mogu ugraditi u genom ne-humanih embrionalnih matičnih ćelija, a jezgra takvih ćelija preneti u enukleisane oocite.

[0118] Nakon uvođenja vektora koji kodiraju teške i lake lance antitela u ćelijsku kulturu, ćelijski skupovi se mogu pregledati na produktivnost rasta i kvalitet proizvoda u medijumu bez seruma. Grupe ćelija koje se najviše proizvode mogu se zatim podvrgnuti kloniranju jedne ćelije zasnovanom na FACS da bi se stvorile monoklonske linije. Mogu se koristiti specifične produktivnosti iznad 50 pg ili 100 pg po ćeliji dnevno, koje odgovaraju titrima proizvoda većim od 7,5 g/L kulture. Antitela proizvedena od strane jednoćelijskih klonova takođe se mogu testirati na zamućenost, svojstva filtracije, PAGE, IEF, UV skeniranje, HP-SEC, mapiranje ugljenih hidrata-oligosaharida, masenu spektrometriju i test vezivanja, kao što su ELISA ili Biacore. Odabrani klon se zatim može staviti u više bočica i zamrznuti za kasniju upotrebu.

[0119] Kada se jednom eksprimiraju, antitela se mogu prečistiti u skladu sa standardnim procedurama tehnike, uključujući hvatanje proteina A, HPLC prečišćavanje, hromatografiju na koloni, gel elektroforezu i slično (videti generalno, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

[0120] Može se koristiti metodologija za komercijalnu proizvodnju antitela, uključujući optimizaciju kodona, selekciju promotora, selekciju transkripcionih elemenata, selekciju terminatora, kloniranje jedne ćelije bez seruma, izradu banke ćelija, korišćenje selekcionih markera za amplifikaciju broja kopija, terminator CHO, ili poboljšanje titra proteina (videti, npr. US 5,786,464; US 6,114,148; US 6,063,598; US 7,569,339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; i US 5,888,809).

H. Testovi skrininga antitela

[0121] Antitela mogu biti podvrgnuta nekoliko skrininga uključujući testove vezivanja, funkcionalne skrininge, skrininge na životinjskim modelima bolesti povezanih sa TTR depozitima i klinička ispitivanja. Testovi vezivanja testiraju specifično vezivanje i, izborno, afinitet i specifičnost epitopa za monomerni TTR ili njegov fragment. Na primer, testovi vezivanja mogu da otkriju antitela koja se vezuju za aminokiselinske ostatke 89-97 (SEQ ID NO:35) TTR, koji je epitop koji je zakopan u nativnom TTR tetrameru i izložen u monomernom, pogrešno savijenom, agregiranom ili fibrilne forme TTR. Antitela se takođe mogu testirati na sposobnost da vezuju pre-fibrilarne, ne-nativne konformacije TTR i TTR amiloidnih fibrila, ali ne i prirodne TTR konformacije. Na primer, antitela se mogu testirati na sposobnost vezivanja za monomerne forme TTR nastale disocijacijom ili disagregacijom nativnog tetramernog TTR, i može se vršiti kontra-skrining protiv nativnog tetramernog TTR, kao što je opisano u primerima ili na drugi način. Slično, antitela se takođe mogu testirati na njihovu imunoreaktivnost na tkivu amiloidoze posredovanom TTR, ali ne i na zdravom tkivu. Takvi skrininzi se ponekad izvode u konkurenciji sa primerom antitela, kao što je antitelo koje ima promenljive regione 5A1 ili IgG1 kapa izotipa. Izborno, ili antitelo ili TTR ciljno mesto je imobilizovano u takvom testu.

[0122] Funkcionalni testovi se mogu izvesti u ćelijskim modelima uključujući ćelije koje prirodno eksprimiraju TTR ili transfektovane sa DNK koja kodira TTR ili njegovim fragmentom. Pogodne ćelije uključuju ćelije izvedene iz srčanog tkiva ili drugih tkiva zahvaćenih TTR amiloidogenezom. Ćelije se mogu skriningovati na smanjene nivoe monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR (npr., Western blot-om ili imunoprecipitacijom ćelijskih ekstrakata ili supernatanata) ili smanjena toksičnost koja se može pripisati monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR. Na primer, antitela se mogu testirati na sposobnost da inhibiraju ili smanje agregaciju TTR, inhibiraju ili smanje formiranje TTR fibrila, smanje TTR naslage, čiste agregirani TTR ili

4

stabilizuju netoksične konformacije TTR.

[0123] Drugi funkcionalni testovi se mogu izvesti u rastvoru, kao što je testiranje da li je antitelo sposobno da poremeti ili smanji formiranje TTR fibrila kada se monomerni TTR ili pogrešno savijeni TTR intermedijeri u rastvoru dovode u kontakt sa antitelom. Stepen formiranja fibrila može se ispitati merenjem zamućenosti, na primer, na 400 nm na UV-vidljivom spektrometru opremljenom jedinicom za kontrolu temperature. Tioflavin-T se takođe može koristiti za procenu obima formiranja amiloidnih fibrila. Na primer, petostruki molarni višak tioflavina-T može se dodati TTR uzorcima i ostaviti na sobnoj temperaturi 30 minuta pre merenja. Fluorescencija tioflavina-T može se pratiti korišćenjem spektrofluorimetra. Videti US 2014/0056904.

[0124] Skrinizi životinjskog modela testiraju sposobnost antitela da terapeutski ili profilaktički leči znakove ili simptome na životinjskom modelu koji simulira humanu bolest povezanu sa akumulacijom TTR ili TTR depozita. Takve bolesti uključuju tipove TTR amiloidoze, kao što su senilna sistemska amiloidoza (SSA), senilna srčana amiloidoza (SCA), porodična amiloidna polineuropatija (FAP), porodična amiloidna kardiomiopatija (FAC) i selektivna amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNSA). Pogodni znaci ili simptomi koji se mogu pratiti uključuju prisustvo i obim naslaga amiloida u različitim tkivima, kao što su gastrointestinalni trakt ili srce. Stepen smanjenja naslaga amiloida može se odrediti poređenjem sa odgovarajućom kontrolom, kao što je nivo TTR amiloidnih naslaga kod kontrolnih životinja koje su primile kontrolno antitelo (npr., kontrolno antitelo podudarnog izotipa), placebo, ili nikakvo lečenje. Primer životinjskog modela za testiranje aktivnosti protiv TTR amiloidoze je mišji model koji nosi nultu mutaciju na endogenom mišjem Ttr lokusu i humani mutantni TTR gen koji sadrži mutaciju V30M koji je povezan sa porodičnom amiloidotskom polineuropatijom. Videti, npr. Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Cardoso and Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). Slični modeli takođe postoje, uključujući druge modele za porodične verzije TTR amiloidoze i modele za sporadične verzije TTR amiloidoze. Videti, npr. Teng et al., Lab. Invest.81(3): 385-396 (2001); Ito and Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, in Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, pp. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Transgene životinje mogu uključiti humani TTR transgen, kao što je TTR transgen sa mutacijom povezanom sa TTR amiloidozom ili divlji tip TTR transgena. Da bi se olakšalo testiranje na životinjskim modelima, mogu se koristiti himerna antitela koja imaju konstantan region prikladan za životinjski model (npr., himere miš-pacov mogu se koristiti za testiranje antitela kod pacova). Može se zaključiti da će humanizovana verzija antitela biti efikasna ako je odgovarajuće mišje antitelo ili himerično antitelo efikasno u odgovarajućem životinjskom modelu i humanizovano antitelo ima sličan afinitet vezivanja (npr., u okviru eksperimentalne greške, kao što je faktor od 1, 5, 2 ili 3).

[0125] Klinička ispitivanja testiraju bezbednost i efikasnost kod ljudi koji imaju bolest povezanu sa TTR amiloidozom.

I. Nukleinske kiseline

[0126] Pronalazak dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od teških i lakih lanaca opisanih gore (npr., SEQ ID NOS:5 i 13). Izborno, takve nukleinske kiseline dalje kodiraju signalni peptid i mogu se eksprimirati sa signalnim peptidom povezanim sa konstantnim regionom (npr., signalni peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NOS:42 (teški lanac) i 44 (laki lanac) koje mogu biti kodirane sa SEQ ID NOS:43, respektivno (teški lanac) i 45, respektivno (laki lanac)). Kodirajuće sekvence nukleinskih kiselina mogu biti operativno povezane sa regulatornim sekvencama da bi se obezbedila ekspresija kodirajućih sekvenci, kao što su promotor, pojačivač, mesto vezivanja ribozoma, signal terminacije transkripcije i slično. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance mogu se pojaviti u izolovanom obliku ili mogu biti klonirane u jedan ili više vektora. Nukleinske kiseline se mogu sintetisati, na primer, sintezom u čvrstom stanju ili PCR-om preklapajućih oligonukleotida. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance mogu se spojiti kao jedna susedna nukleinska kiselina, npr., unutar ekspresionog vektora, ili mogu biti odvojeni, npr., svaki kloniran u svoj sopstveni vektor ekspresije.

J. Konjugovana antitela

[0127] Konjugovana antitela koja se specifično vezuju za antigene izložene u patogenim oblicima TTR, ali ne i u nativnim tetramernim oblicima TTR, kao što su aminokiselinski ostaci 89-97 (SEQ ID NO:35) TTR, korisna su u otkrivanju prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR; praćenje i procenu efikasnosti terapeutskih agenasa koji se koriste za lečenje pacijenata sa dijagnozom TTR amiloidoze; inhibiranje ili smanjenje agregacije TTR; inhibiranje ili smanjenje formiranja TTR fibrila; smanjenje ili čišćenje TTR depozita; stabilizaciju netoksičnih konformacija TTR; ili lečenje ili sprovođenje profilakse TTR amiloidoze kod pacijenta. Na primer, takva antitela mogu biti konjugovana sa drugim terapeutskim delovima, drugim proteinima, drugim antitelima i/ili oznakama koje se mogu detektovati. Videti WO 03/057838; US 8,455,622.

[0128] Konjugovani terapeutski ostaci mogu biti bilo koji agens koji se može koristiti za lečenje, borbu, poboljšanje, sprečavanje ili poboljšanje neželjenog stanja ili bolesti kod pacijenta, kao što je TTR amiloidoza. Terapeutski ostaci mogu da obuhvataju, na primer, imunomodulatore ili bilo koje biološki aktivne agense koji olakšavaju ili pojačavaju aktivnost antitela. Imunomodulator može biti bilo koji agens koji stimuliše ili inhibira razvoj ili održavanje imunološkog odgovora. Ako su takvi terapeutski ostaci spojeni sa antitelom specifičnim za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR, kao što su ovde opisana antitela, spojeni terapeutski ostaci će imati specifičan afinitet za ne-nativne, patogene oblike TTR u odnosu na nativne tetramerne oblike TTR. Shodno tome, primena konjugovanih antitela direktno ciljno deluje na tkiva koja sadrže patogene oblike TTR sa minimalnim oštećenjem okolnog normalnog, zdravog tkiva. Ovo može biti posebno korisno za terapeutske ostatke koji su previše toksični da bi se primenjivali pojedinačno. Pored toga, mogu se koristiti manje količine terapeutskih ostataka.

[0129] Primeri pogodnih terapeutskih ostataka uključuju lekove koji smanjuju nivoe TTR, stabilizuju nativnu tetramernu strukturu TTR, inhibiraju agregaciju TTR, ometaju formiranje TTR fibrila ili amiloida ili se suprotstavljaju ćelijskoj toksičnosti. Videti, npr. Almeida and Saraiva, FEBS pisma 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012.); i Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3):185-203 (2012). Na primer, antitela se mogu konjugovati na tafamidis, diflunisal, ALN-TTR01, ALNTTR02, ISIS-TTRRx, doksiciklin (doksi), tauroursodeoksiholnu kiselinu (TUDCA), doksi-TUDCA, epigalokatehin galat (EGCG), kurkumin ili resveratrol (3,5,4'-trihidroksistilben). Drugi reprezentativni terapeutski ostaci uključuju druge agense za koje se zna da su korisni za lečenje, upravljanje ili poboljšanje TTR amiloidoze ili simptoma TTR amiloidoze. Videti, npr. Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) za uobičajene kliničke simptome TTR amiloidoze i tipične agense koji se koriste za lečenje tih simptoma.

[0130] Antitela se takođe mogu spojiti sa drugim proteinima. Na primer, antitela se mogu spojiti sa Finomerima. Finomeri su mali vezujući proteini (npr., 7 kDa) izvedeni iz humanog Fyn SH3 domena. Mogu biti stabilni i rastvorljivi, a mogu im nedostajati ostaci cisteina i disulfidne veze. Finomeri se mogu konstruisati da se vezuju za ciljne molekule sa istim afinitetom i specifičnošću kao i antitela. Pogodni su za stvaranje multispecifičnih fuzionih proteina zasnovanih na antitelima. Na primer, Finomeri se mogu spojiti sa N-terminalnim i/ili C-terminalnim krajevima antitela da bi se stvorila bi- i tri-specifična FinomAbs sa različitim arhitekturama. Finomeri se mogu odabrati korišćenjem Finomer biblioteka kroz tehnologije skrininga koristeći FACS, Biacore i testove zasnovane na ćelijama koji omogućavaju efikasan izbor Finomera sa optimalnim svojstvima. Primeri finomera su otkriveni u Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Cristallogr. D. Biol. Cristallogr. 69 (Pt6): 1124-1137 (2013.); i Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014).

[0131] Ovde otkrivena antitela takođe mogu biti spojena ili konjugovana sa jednim ili više drugih antitela (npr., za formiranje heterokonjugata antitela). Takva druga antitela mogu da se vežu za različite epitope unutar TTR ili njegovog dela ili se mogu vezati za drugačiji ciljni antigen.

[0132] Antitela se takođe mogu spojiti sa oznakom koja se može detektovati. Takva antitela se mogu koristiti, na primer, za dijagnostikovanje TTR amiloidoze, za praćenje progresije TTR amiloidoze i/ili za procenu efikasnosti lečenja. Takva antitela su posebno korisna za izvođenje takvih određivanja kod subjekata koji imaju ili su podložni TTR amiloidozi, ili u odgovarajućim biološkim uzorcima dobijenim od takvih subjekata. Reprezentativne detektabilne oznake koje mogu biti spojene ili vezane za humanizovano 5A1 antitelo uključuju različite enzime, kao što su peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili acetilholinesteraza; prostetičke grupe, kao što su streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentni materijali, kao što su umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminiscentni materijali, kao što je luminol; bioluminiscentni materijali, kao što su luciferaza, luciferin i ekuorin; radioaktivnih materijala, kao što je itrijum<90>(90Y), radiosrebro-111, radiosrebro-199, bizmut<213>, jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I,), ugljenik (<14>C), sumpor (<5>S), tricijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In,<111>In,), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn, i<117>kalaj; metali koji emituju pozitron korišćenjem različitih pozitronskih emisionih tomografija; neradioaktivni paramagnetni metalni joni; i molekule koji su radioaktivno obeleženi ili konjugovani sa specifičnim radioizotopom.

[0133] Povezivanje radioizotopa sa antitelima može se izvesti sa konvencionalnim bifunkcionalnim helatima. Za povezivanje radiosrebra-111 i radiosrebra-199 mogu se koristiti linkeri na bazi sumpora. Videti Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). Povezivanje radioizotopa srebra može uključivati smanjenje imunoglobulina askorbinskom kiselinom. Za radioizotope kao što su 111In i 90Y, ibritumomab tiuksetan se može koristiti i reagovaće sa takvim izotopima da bi se formirao 111In-ibritumomab tiuksetan i 90Y-ibritumomab tiuksetan, respektivno. Videti Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001).

[0134] Terapeutski ostaci, drugi proteini, druga antitela i/ili oznake koje se mogu detektovati mogu biti spojeni ili konjugovani, direktno ili indirektno preko intermedijera (npr., linker), na mišje, himerno, izmenjene površine ili humanizovano 5A1 antitelo korišćenjem tehnika poznatih u tehnici. Videti npr. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985); i Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Pogodni linkeri uključuju, na primer, linkere koji se mogu odcepiti i koji se ne mogu odcepiti. Mogu se koristiti različiti linkeri koji oslobađaju spojene terapeutske ostatke, proteine, antitela i/ili detektabilne oznake u kiselim ili redukcionim uslovima, pri izlaganju specifičnim proteazama ili pod drugim definisanim uslovima.

V. Terapeutske primene

[0135] Gorenavedena antitela mogu da se koriste za lečenje ili delovanje na profilaksu bolesti kod pacijenata koji imaju ili su u riziku za bolest posredovanu barem delimično transtiretinom (TTR), a posebno monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR. Iako razumevanje mehanizma nije potrebno za izvođenje pronalaska, veruje se da bilo koji ili svi od sledećih mehanizama mogu doprineti lečenju TTR amiloidoze korišćenjem gornjih antitela: inhibicija agregacije TTR i formiranja fibrila posredovana antitelima, stabilizacija posredovana antitelom netoksične konformacije TTR (npr., tetramerni oblici), ili klirens agregiranog TTR, oligomernog TTR ili monomernog TTR posredovan antitelom. Konjugati antitelo-lek mogu imati dodatne mehanizme delovanja određene konjugovanim delom.

[0136] Antitela se primenjuju u efikasnom režimu, što znači dozu, put primene i učestalost primene koja odlaže početak, smanjuje težinu poremećaja, inhibira dalje pogoršanje i/ili ublažava najmanje jedan znak ili simptom poremećaja koji se leči. Ako pacijent već pati od poremećaja, režim se može nazvati terapeutski delotvornim režimom. Ako je pacijent pod povećanim rizikom od poremećaja u odnosu na opštu populaciju, ali još ne doživljava simptome, režim se može nazvati profilaktički efikasan režim. U nekim slučajevima, terapeutska ili profilaktička efikasnost se može primetiti kod pojedinačnog pacijenta u odnosu na prethodne kontrole ili prošlo iskustvo kod istog pacijenta. U drugim slučajevima, terapeutska ili profilaktička efikasnost se može pokazati u pretkliničkom ili kliničkom ispitivanju u populaciji lečenih pacijenata u odnosu na kontrolnu populaciju nelečenih pacijenata.

[0137] Učestalost primene zavisi od poluživota antitela u cirkulaciji, stanja pacijenta i načina primene između ostalih faktora. Učestalost može biti dnevna, nedeljna, mesečna, kvartalna ili u nepravilnim intervalima kao odgovor na promene u pacijentovom stanju ili napredovanje poremećaja koji se leči. Primer učestalosti intravenske primene je između nedeljne i tromesečne primene tokom kontinuiranog lečenja, mada je moguće i manje ili više često doziranje. Za subkutanu primenu, primerna učestalost doziranja je dnevna do mesečna, mada je moguće i manje ili više često doziranje.

[0138] Broj primenjenih doza zavisi od toga da li je poremećaj akutan ili hroničan i odgovora poremećaja na lečenje. Za akutne poremećaje ili akutne egzacerbacije hroničnog poremećaja, često je dovoljno između 1 i 10 doza. Ponekad je jedna bolusna doza, izborno u podeljenom obliku, dovoljna za akutni poremećaj ili akutno pogoršanje hroničnog poremećaja. Tretman se može ponoviti u slučaju recidiva akutnog poremećaja ili akutnog pogoršanja. Za hronične poremećaje, antitela se mogu primenjivati u redovnim intervalima, npr., nedeljno, dvonedeljno, mesečno, tromesečno, svakih šest meseci tokom najmanje 1, 5 ili 10 godina, ili tokom života pacijenta.

VI. Farmaceutske kompozicije i načini upotrebe

[0139] Ovde je dato nekoliko upotreba u dijagnostici, praćenju, lečenju ili delovanju na profilaksu bolesti ili stanja posredovanih barem delimično transtiretinom (TTR), a posebno monomernim, pogrešno savijenim, agregiranim ili fibrilnim oblicima TTR (npr., TTR amiloidoza). Primeri takvih bolesti uključuju porodične TTR amiloidoze, kao što su porodična amiloidna kardiomiopatija (FAC), porodična amiloidna polineuropatija (FAP) ili

4

selektivna amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNSA) i sporadične TTR amiloidoze, kao što je senilna sistemska amiloidoza (SSA) ili senilna srčana amiloidoza (SCA). Gore opisana antitela se mogu ugraditi u farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u takvim postupcima. Generalno, antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo se daje subjektu kome je to potrebno. Pacijenti koji su podložni lečenju uključuju osobe sa rizikom od TTR amiloidoze, ali ne pokazuju simptome, kao i pacijente koji trenutno pokazuju simptome. Neki pacijenti se mogu lečiti tokom prodromalne faze TTR amiloidoze.

[0140] Farmaceutske kompozicije se mogu davati profilaktički pojedincima koji imaju poznati genetski rizik od TTR amiloidoze. Takve osobe uključuju one koji imaju rođake koji su iskusili takvu bolest i one čiji je rizik određen analizom genetskih ili biohemijskih markera (npr. mutacije u TTR povezane sa TTR amiloidozom), uključujući korišćenje dijagnostičkih metoda koje su ovde date. Na primer, postoji preko 100 mutacija u genu koji kodira TTR koje su uključene u TTR amiloidozu. Videti, npr. US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat.

17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwvulet and Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun.114:657-662 (1983).

[0141] Pojedinci koji pate od TTR amiloidoze ponekad se mogu prepoznati po kliničkim manifestacijama TTR amiloidoze, uključujući jedno ili više od sledećeg: (1) porodična istorija neuropatske bolesti, posebno povezana sa srčanom insuficijencijom; (2) neuropatski bol ili progresivni senzorni poremećaji nepoznate etiologije; (3) sindrom karpalnog tunela bez očiglednog uzroka, posebno ako je bilateralni i zahteva hirurško oslobađanje; (4) poremećaji gastrointestinalnog motiliteta ili disfunkcija autonomnog nerva nepoznate etiologije (npr., erektilna disfunkcija, ortostatska hipotenzija, neurogeni glader); (5) srčana bolest koju karakterišu zadebljani zidovi komora u odsustvu hipertenzije; (6) uznapredovali atrio-ventrikularni blok nepoznatog porekla, posebno kada je praćen zadebljanjem srca; i (6) inkluzije staklastog tela tipa vate. Videti Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Međutim, konačna dijagnoza TTR amiloidoze se obično oslanja na biopsiju ciljnog organa, praćenu histološkim bojenjem isečenog tkiva bojom specifičnom za amiloid, Kongo crvenom. Ako je zabeležen pozitivan test na amiloid, naknadno se vrši imunohistohemijsko bojenje za TTR kako bi se osiguralo da je prekursorski protein odgovoran za formiranje amiloida zaista TTR. Za porodične oblike bolesti, demonstracija mutacije u genu koji kodira TTR je tada potrebna pre nego što se može postaviti konačna dijagnoza.

[0142] Identifikacija subjekta se može desiti u kliničkom okruženju, ili negde drugde, kao što je u kući subjekta, na primer, kroz samu upotrebu kompleta za samotestiranje. Na primer, subjekt se može identifikovati na osnovu različitih simptoma kao što su periferna neuropatija (senzorna i motorna), autonomna neuropatija, gastrointestinalno oštećenje, kardiomiopatija, nefropatija ili očna depozicija. Videti Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Subjekat se takođe može identifikovati povećanim nivoima ne-nativnih oblika TTR u uzorcima plazme od subjekta u poređenju sa kontrolnim uzorcima, kao što je otkriveno u primerima.

[0143] Kao što garantuje porodična istorija, genetsko testiranje ili medicinski skrining za TTR amiloidozu, lečenje može početi u bilo kom uzrastu (npr., 20, 30, 40, 50, 60, ili 70 godina života). Tretman obično podrazumeva višestruke doze tokom određenog vremenskog perioda i može se pratiti ispitivanjem odgovora antitela ili aktiviranih T-ćelija ili B-ćelija na terapeutski agens (npr., skraćeni oblik TTR koji sadrži aminokiselinske ostatke 89-97) tokom vremena. Ako odgovor padne, indikovana je buster doza.

[0144] U profilaktičkim primenama, antitelo ili njegova farmaceutska kompozicija se primenjuju na subjekta koji je podložan bolesti ili na drugi način postoji rizik od bolesti (npr., TTR amiloidoza) u režimu (doza, učestalost i način primene) koji je efikasan da smanji rizik, umanji ozbiljnost ili odloži početak najmanje jednog znaka ili simptoma bolesti. U terapijskim primenama, antitelo ili imunogen za indukciju antitela se primenjuje na subjekta za koga se sumnja ili već pati od neke bolesti (npr., TTR amiloidoza) u režimu (doza, učestalost i način primene) koji je efikasan da poboljša ili barem inhibira dalje pogoršanje najmanje jednog znaka ili simptoma bolesti.

[0145] Režim se smatra terapeutski ili profilaktički efikasnim ako pojedinačna lečena osoba postigne ishod koji je povoljniji od srednjeg ishoda u kontrolnoj populaciji uporedivih subjekata koji nisu tretirani postupcima koji su ovde otkriveni, ili ako se pokaže povoljniji ishod za režim kod lečenih subjekata naspram kontrolnih subjekata u kontrolisanom kliničkom ispitivanju (npr., ispitivanje faze II, faze II/III ili faze III) ili životinjskom modelu na nivou p < 0,05 ili 0,01 ili čak 0,001.

[0146] Efikasan režim antitela se može koristiti za, npr., inhibiranje ili smanjenje agregacije TTR kod subjekta koji ima ili postoji rizik od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; inhibiranje ili smanjenje formiranja TTR fibrila kod subjekta koji ima ili postoji rizik od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; smanjenje ili uklanjanje TTR naslaga ili agregiranih TTR kod subjekta koji ima ili je u riziku od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; stabilizacija netoksičnih konformacija TTR kod subjekta koji ima ili je pod rizikom od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; inhibiranje toksičnih efekata TTR agregata, fibrila ili naslaga kod subjekta koji ima ili postoji rizik od stanja povezanog sa akumulacijom TTR; dijagnostikovanje prisustva ili odsustva akumulacije TTR amiloida u tkivu za koje se sumnja da sadrži akumulaciju amiloida; određivanje nivoa TTR naslaga kod subjekta detekcijom prisustva vezanog antitela u subjektu nakon primene antitela; otkrivanje prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR kod subjekta; praćenje i procena efikasnosti terapeutskih agenasa koji se koriste za lečenje pacijenata sa dijagnozom TTR amiloidoze; izazivanje imunog odgovora koji sadrži antitela na TTR kod subjekta; odlaganje početka stanja povezanog sa akumulacijom TTR amiloida kod subjekta; ili lečenje ili sprovođenje profilakse TTR amiloidoze kod pacijenta.

[0147] Efikasne doze variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, kao što su način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje subjekta, da li je subjekt čovek ili životinja, drugi lekovi koji se primenjuju i da li je tretman profilaktički ili terapeutski.

[0148] Primer opsega doze za antitela može biti od oko 0,1-20, ili 0,5-5 mg/kg telesne težine (npr., 0.5, 1, 2, 3, 4 ili 5 mg/kg) ili 10-1500 mg kao fiksna doza. Doziranje zavisi od stanja pacijenta i odgovora na prethodni tretman, ako ga ima, da li je tretman profilaktički ili terapeutski i da li je poremećaj akutni ili hronični, između ostalih faktora.

[0149] Antitelo se može davati u takvim dozama dnevno, alternativnim danima, nedeljno, dvonedeljno, mesečno, tromesečno ili prema bilo kom drugom rasporedu utvrđenom empirijskom analizom. Primer lečenja podrazumeva primenu u više doza tokom dužeg perioda, na primer, od najmanje šest meseci. Dodatni primer režima lečenja podrazumevaju primenu jednom u dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom u 3 do 6 meseci.

[0150] Antitela se mogu primenjivati perifernim putem. Putevi primene uključuju topikalni, intravenski, oralni, subkutani, intraarterijski, intrakranijalni, intratekalni, intraperitonealni, intranazalni ili intramuskularni. Putevi primene antitela mogu biti intravenski ili subkutani. Intravenska primena može biti, na primer, infuzijom tokom perioda kao što je 30-90 min. Ova vrsta injekcije se najčešće izvodi u mišiće ruku ili nogu. U nekim primenama, agensi se ubrizgavaju direktno u određeno tkivo gde su se nakupile naslage, na primer intrakranijalna injekcija.

[0151] Farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu mogu biti sterilne i suštinski izotonične (250-350 mOsm/kg vode) i proizvedene pod GMP uslovima. Farmaceutske kompozicije se mogu obezbediti u obliku jedinične doze (tj. doza za jednokratnu primenu). Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača, ekscipijenasa ili pomoćnih supstanci. Formulacija zavisi od izabranog načina primene. Za injekcije, antitela se mogu formulisati u vodenim rastvorima, npr., u fiziološki kompatibilnim puferima kao što su Hankov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki rastvor ili acetatni pufer (za smanjenje nelagodnosti na mestu injekcije).

4

Rastvor može da sadrži sredstva za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, antitela mogu biti u liofilizovanom obliku za konstituisanje sa odgovarajućim vehikulumom, npr., sterilna voda bez pirogena, pre upotrebe.

[0152] Režimi se mogu primeniti u kombinaciji sa drugim agensom efikasnim u lečenju ili profilaksi bolesti koja se leči. Takvi agensi mogu uključiti siRNA da inhibiraju ekspresiju TTR ili Vyndaqel, stabilizatora TTR u formiranju tetramera.

[0153] Nakon tretmana, stanje subjekta se može proceniti da bi se utvrdio napredak ili efikasnost takvog tretmana. Takvi postupci poželjno testiraju promene u nivoima amiloida TTR ili nivoa ne-nativnih oblika TTR. Na primer, nivoi TTR amiloida se mogu proceniti da bi se utvrdilo poboljšanje u odnosu na nivoe TTR amiloida subjekta pod uporedivim okolnostima pre tretmana. Nivoi TTR amiloida subjekta se takođe mogu uporediti sa kontrolnim populacijama pod uporedivim okolnostima. Kontrolne populacije mogu biti na sličan način obolele, nelečeni subjekti ili normalni nelečeni subjekti (među ostalim kontrolnim subjektima). Poboljšanje u odnosu na slične obolele, nelečene subjekte ili nivoe koji se približavaju ili dostižu nivoe kod nelečenih normalnih subjekata ukazuje na pozitivan odgovor na lečenje.

[0154] Nivoi TTR amiloida mogu se meriti brojnim postupcima, uključujući tehnike imadžinga. Primeri pogodnih tehnika imadžinga uključuju PET skeniranje sa radioaktivno obeleženim TTR njegovih fragmenata, TTR antitela ili njihovih fragmenata, amiloidne agense za imadžing na bazi kongo crvenog, kao što su, npr., PIB (US 2011/0008255), peptid za imadžing amiloida p31 (Biodistribucija peptida p31 za imadžing amiloida je u korelaciji sa kvantitaivnim određivanjem amiloida na osnovu bojenja tkiva Kongo crvenom, Wall et al., Abstract No. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting), i druge PET oznake. Nivoi ne-nativnih oblika TTR mogu se meriti, na primer, izvođenjem SDS-PAGE/Western blot testova ili testova na ploči za otkrivanje mezo skale sa antitelima koja su ovde otkrivena na uzorcima plazme ili uzorcima biopsije subjekta i upoređivanjem sa kontrolnim uzorcima, kao što je opisano u primerima.

A. Postupci dijagnostike i praćenja

[0155] Takođe su obezbeđeni in vitro postupci otkrivanja imunog odgovora na TTR kod pacijenata koji boluju ili su podložni bolestima povezanim sa taloženjem TTR ili patogenim oblicima TTR (npr., monomerni, pogrešno savijeni, agregirani ili fibrilni oblici TTR).

Postupci se mogu koristiti za praćenje toka terapeutskog i profilaktičkog tretmana sa agensima koji su ovde navedeni. Profil antitela posle pasivne imunizacije obično pokazuje trenutni maksimum koncentracije antitela praćen eksponencijalnim raspadanjem. Bez dalje doze, propadanje se približava nivoima pre tretmana u periodu od dana do meseci u zavisnosti od poluživota primenjenog antitela. Na primer, poluživot nekih humanih antitela je reda veličine 20 dana.

[0156] U nekim postupcima, osnovno merenje antitela na TTR kod subjekta se vrši pre primene, drugo merenje se vrši ubrzo nakon toga da bi se odredio vršni nivo antitela, a jedno ili više daljih merenja se vrše u intervalima da bi se pratilo opadanje nivoa antitela. Kada je nivo antitela opao na početnu liniju ili na unapred određeni procenat maksimuma manjeg od početne vrednosti (npr., 50%, 25% ili 10%), primenjuje se dodatna doza antitela. U nekim postupcima, maksimalni ili naknadno izmereni nivoi minus pozadina se upoređuju sa referentnim nivoima za koje je prethodno utvrđeno da predstavljaju koristan profilaktički ili terapeutski režim lečenja kod drugih subjekata. Ako je izmereni nivo antitela značajno manji od referentnog nivoa (npr., manje od srednje vrednosti minus jedna ili, poželjno, dve standardne devijacije referentne vrednosti u populaciji subjekata koji imaju koristi od lečenja) je indikovana primena dodatne doze antitela.

[0157] Takođe su obezbeđeni in vitro postupci za otkrivanje monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR kod subjekta, na primer, merenjem TTR amiloida ili patogenih oblika TTR (npr., monomerni, pogrešno savijeni, agregirani ili fibrilni oblici TTR) u uzorku od subjekta. Takvi postupci su korisni za dijagnozu ili potvrdu dijagnoze bolesti povezanih sa takvim patogenim oblicima TTR (npr., TTR amiloidoza), ili osetljivost na nju. Postupci se takođe mogu koristiti na asimptomatskim subjektima. Prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR ukazuje na podložnost budućoj simptomatskoj bolesti. Postupci su takođe korisni za praćenje napredovanja bolesti i/ili odgovora na lečenje kod subjekata kojima je prethodno dijagnostikovana TTR amiloidoza.

[0158] Biološki uzorci dobijeni od subjekta koji ima TTR amiloidozu, za koga se sumnja da ima ili je pod rizikom da ima TTR amiloidozu, mogu se dovesti u kontakt sa antitelima koja su ovde otkrivena da bi se procenilo prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR. Na primer, nivoi monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR kod takvih subjekata mogu se uporediti sa onima prisutnim kod zdravih subjekata. Alternativno, nivoi TTR amiloida ili patogenih oblika TTR (npr., monomerni, pogrešno savijeni, agregirani ili fibrilni oblici TTR) kod takvih subjekata koji se leče od

4

bolesti mogu se uporediti sa onima kod subjekata koji nisu lečeni od TTR amiloidoze. Neki takvi testovi uključuju biopsiju tkiva dobijenog od takvih subjekata. ELISA testovi takođe mogu biti korisni postupci, na primer, za procenu nivoa monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u uzorcima tečnosti. Neki takvi ELISA testovi uključuju anti-TTR antitela koja prvenstveno vezuju monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR u odnosu na normalne tetramerne oblike TTR.

[0159] Otkriveni in vivo postupci imadžinga mogu funkcionisati primenom reagensa, kao što je antitelo koje se vezuje za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne forme TTR kod subjekta, a zatim detektovanje reagensa nakon što se veže. Takva antitela se tipično vezuju za epitop unutar ostataka 89-97 TTR. Ako se želi, odgovor čišćenja se može izbeći korišćenjem fragmenata antitela kojima nedostaje konstantan region pune dužine, kao što su Fabs. U nekim postupcima, isto antitelo može poslužiti i kao tretman i kao dijagnostički reagens.

[0160] Dijagnostički reagensi se mogu primenjivati intravenskom injekcijom u telo subjekta ili na druge načine koji se smatraju razumnim. Doza reagensa treba da bude u istom opsegu kao i za postupke lečenja. Tipično, reagens je obeležen, iako se u nekim postupcima primarni reagens sa afinitetom za monomerne, pogrešno savijene, agregirane ili fibrilne oblike TTR ne obeležava i sekundarno sredstvo za obeležavanje se koristi za vezivanje za primarni reagens. Izbor oznake zavisi od načina detekcije. Na primer, fluorescentna etiketa je pogodna za optičku detekciju. Upotreba paramagnetnih etiketa je pogodna za tomografsku detekciju bez hirurške intervencije. Radioaktivne oznake se takođe mogu detektovati pomoću PET ili SPECT.

[0161] Dijagnoza se vrši upoređivanjem broja, veličine i/ili intenziteta obeleženih lokusa sa odgovarajućim vrednostima osnovne linije. Osnovne vrednosti mogu predstavljati srednje vrednosti u populaciji neobolelih pojedinaca. Osnovne vrednosti takođe mogu predstavljati prethodne nivoe utvrđene u istom predmetu. Na primer, osnovne vrednosti se mogu odrediti kod subjekta pre početka lečenja, a izmerene vrednosti nakon toga upoređivati sa vrednostima osnovne linije. Smanjenje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju generalno signalizira pozitivan odgovor na lečenje.

IX. Kompleti

[0162] Takođe su otkriveni kompleti (npr., kontejneri) koji sadrže humanizovana 5A1 antitela koja su ovde otkrivena i srodne materijale, kao što su uputstva za upotrebu (npr.,

4

umetak u pakovanju). Uputstva za upotrebu mogu da sadrže, na primer, uputstva za primenu antitela i izborno jedan ili više dodatnih agenasa. Kontejneri antitela mogu biti jedinične doze, rasuti paketi (npr., višedozna pakovanja) ili podjedinične doze.

[0163] Uputstvo za pakovanje se odnosi na uputstva koja su uobičajeno uključena u komercijalna pakovanja terapeutskih proizvoda koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.

[0164] Kompleti takođe mogu uključiti drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Takođe može uključiti druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

X. Ostale primene

[0165] Antitela se mogu koristiti za otkrivanje monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika transtiretina (TTR), ili njegovih fragmenata, u kontekstu kliničke dijagnoze ili lečenja ili u istraživanju. Na primer, antitela se mogu koristiti za otkrivanje prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u biološkom uzorku kao indikacija da biološki uzorak sadrži TTR amiloidne naslage. Vezivanje antitela za biološki uzorak može se uporediti sa vezivanjem antitela za kontrolni uzorak. Kontrolni uzorak i biološki uzorak mogu sadržati ćelije poreklom od istog tkiva. Kontrolni i biološki uzorci mogu se dobiti od iste osobe ili različitih pojedinaca i istom prilikom ili u različitim prilikama. Po želji, višestruki biološki uzorci i višestruki kontrolni uzorci se procenjuju u više navrata da bi se zaštitili od nasumičnih varijacija nezavisno od razlika između uzoraka. Zatim se može napraviti direktno poređenje između biološkog(ih) uzorka(uzoraka) i kontrolnog(ih) uzorka(uzoraka) kako bi se utvrdilo da li se antitelo vezuje (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR) u biološkom uzorku(uzorcima) je povećano, smanjeno ili isto u odnosu na vezivanje antitela za kontrolni uzorak(uzorke). Povećano vezivanje antitela za biološki uzorak(uzorke) u odnosu na kontrolni(e) uzorak(uzorke) ukazuje na prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u biološkom uzorku(uzorcima). U nekim slučajevima, povećano vezivanje antitela je statistički značajno. Izborno, vezivanje antitela za biološki uzorak je najmanje 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta ili 100 puta veće od

4

vezivanja antitela za kontrolni uzorak.

[0166] Pored toga, antitela se mogu koristiti za otkrivanje prisustva monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u biološkom uzorku za praćenje i procenu efikasnosti terapeutskog agensa koji se koristi za lečenje pacijenta sa dijagnozom TTR amiloidoze. Biološki uzorak od pacijenta sa dijagnozom TTR amiloidoze se procenjuje da bi se ustanovila osnova za vezivanje antitela za uzorak (tj., osnovna linija za prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR u uzorku) pre početka terapije terapeutskim agensom. U nekim slučajevima, višestruki biološki uzorci od pacijenta se procenjuju u više navrata da bi se ustanovila i osnovna linija i mera nasumične varijacije nezavisno od tretmana. Terapeutski agens se zatim primenjuje u režimu. Režim može uključivati višestruke primene agensa tokom određenog vremenskog perioda. Izborno, vezivanje antitela (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR) se procenjuje u više navrata u više bioloških uzoraka od pacijenta, kako da se utvrdi mera nasumične varijacije, tako i da se pokaže trend u odgovoru na imunoterapiju. Zatim se porede različite procene vezivanja antitela za biološke uzorke. Ako su napravljene samo dve procene, može se napraviti direktno poređenje između dve procene da bi se utvrdilo da li se antitela vezuju (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR) se povećalo, smanjilo ili ostalo isto između dve procene. Ako se izvrši više od dva merenja, merenja se mogu analizirati kao vremenski tok počevši od tretmana terapeutskim agensom i nastavljajući kroz tok terapije. Kod pacijenata kod kojih je smanjeno vezivanje antitela za biološke uzorke (tj., prisustvo monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR), može se zaključiti da je terapeutski agens bio efikasan u lečenju TTR amiloidoze kod pacijenta. Smanjenje vezivanja antitela može biti statistički značajno. Izborno, vezivanje se smanjuje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. Procena vezivanja antitela može se izvršiti zajedno sa procenom drugih znakova i simptoma TTR amiloidoze.

[0167] Antitela se takođe mogu koristiti kao istraživački reagensi za laboratorijska istraživanja u otkrivanju monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR, ili njihovih fragmenata. U takvim upotrebama, antitela mogu biti obeležena fluorescentnim molekulima, spin-obeleženim molekulima, enzimima ili radioizotopima, i mogu se obezbediti u obliku kompleta sa svim potrebnim reagensima za izvođenje testa detekcije. Antitela se takođe mogu koristiti za prečišćavanje monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR, ili vezujućih partnera monomernih, pogrešno savijenih, agregiranih ili fibrilnih oblika TTR, npr., afinitetnom hromatografijom.

4

[0168] Antitela se takođe mogu koristiti za inhibiciju ili smanjenje agregacije TTR, inhibiranje ili smanjenje formiranja TTR fibrila, smanjenje ili čišćenje TTR naslaga ili TTR agregata, ili stabilizaciju netoksičnih konformacija TTR u biološkom uzorku. Biološki uzorak može da sadrži, na primer, krv, serum, plazmu ili tkivo (npr. tkivo iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta). U nekim slučajevima, agregacija TTR, formiranje TTR fibrila ili depoziti TTR su inhibirani ili smanjeni za najmanje 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ili 75% (npr., 10%-75% ili 30%-70%). Testovi za otkrivanje formiranja fibrila su opisani na drugom mestu. Takođe videti US 2014/0056904.

[0169] Ako su različite verzije sekvence povezane sa pristupnim brojem u različito vreme, podrazumeva se verzija povezana sa pristupnim brojem na datum stupanja na snagu ove prijave. Datum efektivnog podnošenja označava raniji od stvarnog datuma podnošenja ili datuma podnošenja prioritetne prijave koji se odnosi na pristupni broj ako je primenljivo. Isto tako, ako su različite verzije publikacije, veb stranice ili slično objavljene u različito vreme, podrazumeva se verzija koja je poslednja objavljena na datum podnošenja prijave, osim ako nije drugačije naznačeno. Bilo koja karakteristika, korak, element, primer izvođenja ili aspekt pronalaska se može koristiti u kombinaciji sa bilo kojim drugim osim ako nije drugačije naznačeno. Iako je ovaj pronalazak detaljno opisan kao ilustracija i primer radi jasnoće i razumevanja, biće očigledno da se određene promene i modifikacije mogu primeniti u okviru priloženih zahteva.

PRIMERI

Primer 1. Identifikacija mis-TTR monoklonskih antitela

[0170] Konformaciono specifična monoklonska antitela protiv monomernih, pogrešno savijenih, fibrilnih ili agregiranih oblika TTR (mis-TTR) su generisana, pregledana, eksprimirana i prečišćena kao što je opisano u Materijalima i metodama (a-d). Da bi se generisala mis-TTR monoklonska antitela, ispitana je kristalna struktura humanog tetramernog TTR da bi se pronašli regioni proteina koji su zakopani u tetrameru, ali izloženi nakon disocijacije tetramera na njegove monomerne podjedinice. Identifikovani region su ostaci 89-97 (EHAEVVFTA) (SEQ ID NO:35) koji se nalaze unutar F lanca TTR i sekvestriraju na interfejsu dimera tetramernog proteina. BLAST pretraga baze podataka proteina nije otkrila nijedan drugi ljudski protein koji poseduje ovu sekvencu.

4

[0171] Sintetisan je peptid koji sadrži ovu sekvencu (ggEHAEVVFTAggkg) (SEQ ID NO:36). Velika slova predstavljaju ostatke 89-97 TTR. Mala slova predstavljaju dodatne ostatke linkera koji su dodati da bi se povećala rastvorljivost antigenskog peptida i da bi se fragment od 9 aminokiselina uspostavio kao interna sekvenca. Ovaj peptid je vezan za polilizinsko dendritično jezgro, stvarajući višestruki antigenski peptidni imunogen (TTR-MAP) koji sadrži jezgro lizinskih ostataka sa više grana povezanih sa TTR 89-97 peptidom. Antitela navedena u tabeli 2 su stvorena protiv TTR-MAP.

[0172] Pored ovog višestrukog antigenskog peptida, dva druga imunogena koji sadrže isti TTR fragment su generisana kovalentnim povezivanjem sličnih TTR 89-97 peptida (AccggEHAEVVFTA-amid (SEQ ID NO:37) i Ac-EHAEVVFTAcgg-amid) (SEQ ID NO: 38) preko N- i C-terminalnih cisteinskih ostataka do hemocijanina puža prilepka (TTR89-97-N-KLH i TTR89-97-C-KLH).

[0173] Nakon stvaranja antitela, skrininga, ekspresije i prečišćavanja, detaljni kinetički parametri vezivanja (stopa asocijacije (ka), stopa disocijacije (kd) i konstanta afiniteta vezivanja (KD)) određeni su za vodeća mis-TTR antitela pomoću površinske plazmon rezonance (SPR) za rekombinantni humani TTR F87M/L110M, kao što je prikazano u tabeli 2. Anti-mišji IgG (GE Healthcare) je imobilizovan na senzorskom čipu C5 (nedostaju mu lanci dekstrana) preko spajanja amina u skladu sa uputstvima datim u GE Healthcare kompletu protiv miša, a mis-TTR mAb su uhvaćena do nivoa da se obezbedi maksimalno vezivanje analita od 30-50 RU. Različite koncentracije analita (rekombinantni humani TTR F87M/L110M) su propuštene preko uhvaćenog liganda pri 30 µl/min u puferu za analizu (HBS 0,05% P-20, 1 mg/mL BSA) u trostrukim razblaženjima. Za svaku koncentraciju, reakcija se odvijala tokom vremenskog okvira koji omogućava da veće koncentracije analita dostignu ravnotežu tokom asocijacije, kao i najmanje 10% signala da se raspadne tokom disocijacije. Najmanje jedna koncentracija (ne najveća ili najniža) je izvedena u duplikatu. Opsezi koncentracije analita su odabrani na osnovu preliminarnog eksperimentisanja tako da se protežu najmanje 10 puta iznad KDdo 10 puta ispod KD.

[0174] Rezultati SPR analize vodećih mis-TTR mAb prikazani su u tabeli 2 ispod.

Tabela 2

Primer 2. Vezivanje mis-TTR antitela za TTR antigen

[0175] Četiri mis-TTR mAb (9D5, 14G8, 6C1 i 5A1) ispitana su pomoću ELISA u koncentracijama u rasponu od 0,31 do 2,5 µg/ml koristeći i pH4,0 tretirani TTR (pH4-TTR) i prirodni TTR kao antigen za oblaganje. Priprema TTR antigena i protokoli ELISA opisani su na drugom mestu u materijalima i metodama (e-g).

[0176] Dobijene krive vezivanja i tabelarne Kdi Bmaxvrednosti su prikazane na slici 3 i tabeli 3 ispod. Rezultati na slici 3 prikazani su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi. Sva mAb pokazala su značajno vezivanje za pH4-TTR sa Kdvrednosti u rasponu od 16 nM (6C1) do 282 nM (9D5). Bmaxvrednosti za vezivanje za pH4-TTR kretale su se od niskih 0,65 a.u. (14G8) do najviše 2,02 (9D5). Za razliku od vezivanja za pH4-TTR, nijedno od antitela nije pokazalo značajno vezivanje za nativni TTR, što ukazuje da su sva generisana TTR antitela bila specifična za ne-nativne oblike TTR.

Tabela 3

Primer 3. Analiza mis-TTR antitela pomoću SDS-PAGE i nativnog-PAGE

[0177] 9D5 i 14G8 su analizirani pomoću SDS-PAGE/Western da bi se pokazala specifičnost vezivanja za monomerne/denaturisane oblike TTR u odnosu na nativni, nedenaturisani TTR. SDS-PAGE, Nativni-PAGE i Western Blot protokoli su opisani na drugom mestu u Metodama i materijalima (h-j).

[0178] Nedenaturisani TTR ili pH4-TTR je izveden na SDS-PAGE gelu zajedno sa toplotno

1

denaturisanim TTR i toplotno denaturisanim pH4-TTR. Nakon elektroforeze, gel je Western blotovan na nitrocelulozu i obojen sa TTR mAb 9D5 i 14G8. Oba antitela su prepoznala TTR samo kada je tretiran na pH4 ili kada je TTR ili pH4-TTR prvi put denaturisan toplotom pre SDS-PAGE. Ovi 9D5 i 14G8 stoga pokazuju specifičnost za TTR konformere nastale bilo denaturacijom TTR ili tretmanom TTR na pH4.

[0179] 6C1 i 5A1 zajedno sa ukupnim TTR mAb (7G7, 8C3) i komercijalno dostupnim Sigma poliklonskim antitelom su takođe analizirani pomoću SDS-PAGE/Western. Svaka mrlja je sadržala obojene markere molekulske težine, nedenaturisani TTR i pH4-TTR.

[0180] Obojeni SDS-PAGE gel je pokazao da je glavna vrsta prisutna u nedenaturisanom TTR uzorku dimer -38 kDa. Nasuprot tome, glavna komponenta prisutna u uzorku pH4-TTR radila je kao dimer od ~35 kDa sa malom količinom dimera od ~15 kDa monomera. Ovaj dimer je bio nešto manji protein od dimera prisutnog u nedenaturisanom TTR uzorku, što ukazuje na konformacionu razliku između ove dve vrste TTR dimera.

[0181] Western blotovi TTR i pH4-TTR korišćenjem četiri mis-TTR antitela su pokazali da ova mAb ne prepoznaju nedenaturisani TTR, ali se vezuju i za denaturisani monomer i za dimer prisutne u pH4-TTR uzorku. Dakle, četiri mis-TTR mAb (9D5, 14G8, 6C1 i 5A1) pokazuju slične specifičnosti za ne-nativne konformacije TTR kada ih analizira SDS-PAGE/Western.

[0182] Za razliku od četiri mis-TTR mAb, dva TTR kontrolna mAb, 7G7 i 8C3 generisana imunizacijom miševa sa netaknutim TTR prepoznala su sve TTR vrste prisutne u TTR i pH4-TTR uzorcima, uključujući tetramerne TTR vrste. Dakle, za razliku od mis-TTR mAb, ova kontrolna mAb vezuju TTR, ali bez konformacione specifičnosti. Sigma poliklonsko antitelo se ponašalo slično kao 7G7 i 8C3 kontrolna mAb.

[0183] TTR i pH4-TTR su takođe rađeni na nativnom gelu da bi se videlo da li su četiri mis-TTR mAb sposobna da pokažu specifičnost konformacije u uslovima gela bez denaturacije. Na obojenom prirodnom PAGE gelu, TTR je radio kao -35 kDa nativni dimer sa malom količinom tetramera. Nasuprot tome, pH4-TTR je prvenstveno bio razmaz visoke molekularne težine sa količinom u tragovima -35 kDa dimera. Nespecifično Sigma poliklonsko antitelo prepoznalo je sve vrste TTR prisutne u TTR i pH4-TTR uzorku. Nasuprot tome, 9D5 je prepoznao samo TTR vrste visoke molekularne težine prisutne u uzorku pH4-TTR. Kao što je primećeno u SDS-PAGE/Western studiji, 9D5 nije prepoznao nijednu od domaćih TTR vrsta.

[0184] Sva četiri mis-TTR mAb su naknadno analizirana nativnim-PAGE/Western blotom. Kao što se očekivalo i slično 9D5, druga mis-TTR mAb, 14G8, 6C1 i 5A1, specifično su

2

vezana za ne-nativne oblike TTR visoke molekularne težine prisutne u uzorku pH4-TTR. Nijedno od ovih antitela nije prepoznalo ~35 kDa nativni TTR dimer. Ovi rezultati pokazuju da se četiri mis-TTR mAb ponašaju slično i prepoznaju samo ne-nativne TTR vrste koje su konformaciono različite od nativnog TTR.

Primer 4. Inhibicija formiranja TTR vlakana pogrešnim TTR antitelima

[0185] TTR-Y78F je TTR varijanta koja sadrži tačkastu mutaciju na poziciji 78 u sekvenci proteina koja destabilizuje TTR tetramer. Vremenom i pod blago kiselim uslovima, ova TTR varijanta se disocira na svoje monomerne podjedinice koje zatim mogu da se agregiraju i formiraju vlakna sposobna da se vežu za tioflavin-T. Obim formiranja vlakana se stoga može pratiti merenjem fluorescencije tioflavina-T na 480 nm. Uvođenje mis-TTR antitela specifičnog za disocirane TTR monomere ili agregate bi sprečilo sklapanje TTR vlakana što bi rezultiralo smanjenjem fluorescencije tioflavina-T u odnosu na kontrolnu reakciju bez antitela. Protokoli za ispitivanje inhibicije formiranja TTR vlakana opisani su na drugom mestu u Materijalima i metodama (k).

[0186] Sva četiri mis-TTR antitela su snažno inhibirala formiranje tioflavin-T reaktivnih TTR-Y78F vlakana u odnosu na kontrolu izotipa (rezultati su prikazani na slici 4 i predstavljeni su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi). Mis-TTR antitelo 5A1 je skoro u potpunosti inhibiralo formiranje vlakana. Ovi rezultati su u skladu sa idejom da mis-TTR antitela vezuju monomerne i/ili agregirane oblike TTR, čime sprečavaju formiranje TTR vlakana.

[0187] Tabela 4 sumira podatke karakterizacije dobijene za skup od 4 mis-TTR antitela (9D5, 14G8, 6C1 i 5A1) koja su pokazala dobru konformacionu selektivnost za ne-nativne oblike TTR. Ova antitela su imala afinitete (KD) za pH4-TTR u rasponu od 14,5 nM (6C1) do 257 nM (9D5) i Bmaxvrednosti u rasponu od 0,65 a.u. (14G8) do 2,02 (9D5). Nijedno od ovih antitela nije prepoznalo nativni TTR, ali se vezivalo za pH4-TTR na SDS-PAGE/Western i za TTR agregate visoke molekularne težine na nativnom PAGE/Western. Ova antitela su takođe inhibirala formiranje TTR fibrila u testu formiranja fibrila koristeći Thio-T kao očitavanje.

Tabela 4

[0188] TTR-V122I je TTR varijanta koja sadrži mutaciju jedne tačke na poziciji 122 koja destabilizuje tetramer. Formiranje fibrila je bilo povezano sa povećanjem fluorescencije ThT. Povećanje koncentracije 14G8 mAb izazvalo je monotono smanjenje fluorescencije ThT što ukazuje na substehiometrijsku inhibiciju TTR fibrilacije (IC50=0,028±0,009 mg/mL; n=3; Slika 4B i Tabela 4a). mAb kontrolno za izotip nije izazvalo inhibiciju TTR fibrilacije (slika 4C), pokazujući na taj način specifičnost inhibicije posredovane preko 14G8.

[0189] Uporedive substehiometrijske IC50vrednosti određene za 5A1 i 6C1 (Tabela 4a) sugerišu analogne mehanizme inhibicije fibrila za svako od ovih mis-TTR mAb. Nasuprot tome, 9D5 neočekivano nije uspeo da inhibira formiranje TTR-V122I fibrila, uprkos tome što je pokazao sličnu specifičnost i afinitet za ne-nativni TTR. Ostaje da se istraži da li je 9D5 osetljiviji na korišćene uslove analize.

Tabela 4a

Primer 5. Imunohistohemijska (IHC) karakterizacija ATTR tkiva korišćenjem mis-TTR mAb

[0190] Vodeća mis-TTR mAb podignuta na TTR 89-97 fragment proteina transtiretina su

4

imunohistohemijski testirana na sveže zamrznutom i parafinom obrađenom tkivu kod pacijenata sa potvrđenom TTR srčanom amiloidozom. Protokoli za dobijanje i pripremu uzoraka srčanog tkiva, imunohistohemiju (IHC) i analizu slike, dati su na drugom mestu u materijalima i metodama (l-o). Antitela koja se koriste za IHC su opisana u tabeli 5.

Tabela 5

[0191] Uzorci srčanog tkiva su dobijeni od pacijenata sa potvrđenom dijagnozom ATTR mutacija. Demografija za slučajeve ispitane imunohistohemijski bila je sledeća i sažeta je u tabeli 6: FAC = porodična amiloidotična kardiomiopatija; FAP = porodična amiloidotična polineuropatija; 1° AL = amiloidoza lakog lanca; ATTR = transtiretinom posredovana amiloidoza; Unk = nepoznato

Tabela 6

[0192] Mišja monoklonska antitela (mis-TTR mAb) podignuta na 89-97 fragment proteina transtiretina su imunohistohemijski testirana na sveže zamrznutom i parafinom obrađenom tkivu kod pacijenata sa potvrđenom TTR srčanom amiloidozom. Svako mis-TTR antitelo je pokazalo imunoreaktivnost na ATTR srčanom tkivu. Tamno bojenje je primećeno u naslagama širom miokarda i vaskulature. Kada je imunoreaktivnost upoređena sa bojenjem Kongo crvenim od tioflavina-T, većina imunoreaktivnosti u tkivu pokazala je visoku podudarnost sa dvostrukim prelomom u Kongo crvenom i tioflavin T-pozitivnim bojenjem. Ovo potvrđuje prirodu beta nabora TTR amiloida deponovanog u ovom tkivu. Ova mis-TTR antitela su takođe otkrila pre-amiloid TTR, koji su bili lokalizovani na delovima miokarda koji su bili TTR-imunopozitivni, ali Kongo crveni ili tioflavin T-negativni. I kontrolno antitelo IgG-izotipa i delovi izostavljenih primarnih antitela bili su negativni na bojenje u svim testiranim tkivima. Antitela koja reaguju na druge amiloidogene proteine (lambda i kapa laki lanci ili amiloid A) nisu bila reaktivna prema ATTR srčanom tkivu korišćenom u ovoj analizi, što ukazuje da su depoziti specifično TTR po prirodi.

[0193] Obrazac bojenja mis-TTR antitela je upoređen sa onim dobijenim sa dobro okarakterisanim komercijalnim TTR referentnim antitelom (prealbumin, A0002; Dako; Carpinteria, CA). DAKO referentno antitelo je obojilo oboleli miokard u istim oblastima kao i mis-TTR antitela, ali je proizvela difuzniji obrazac bojenja. DAKO referentno antitelo nije obojilo kongofilne TTR amiloidne naslage prisutne na vaskulaturi tako snažno kao mis-TTR antitela.

[0194] Pogrešna TTR antitela nisu obojila normalno tkivo bez bolesti. Štaviše, kao što se očekivalo, bojenje kontrolnim antitelom izotipa, 6F10 je takođe bilo negativno.

[0195] Da bi se utvrdilo da li je reaktivnost mis-TTR antitela bila specifična za TTR depozite, ispitivana je unakrsna reaktivnost ovih antitela prema srčanom tkivu dobijenih od pacijenata sa dijagnostikovanom primarnom AL amiloidozom. Kao što se očekivalo, nije primećeno bojenje AL amiloidnog tkiva, što potvrđuje da TTR antitela reaguju specifično na ATTR obolelo tkivo.

[0196] Srčano tkivo pacijenata sa potvrđenom dijagnozom senilne sistemske amiloidoze ili pacijenata sa potvrđenim FAC, ili FAP uzrokovanim tačkastim mutacijama u TTR genu takođe je pozitivno obojeno sa 14G8, 9D5, 6C1 i 5A1. Ovi rezultati pokazuju da mis-TTR antitela imaju sposobnost da prepoznaju TTR depozite u srčanom tkivu bez obzira na ATTR genotip.

[0197] Druga ne-srčana tkiva za koja je poznato da eksprimiraju TTR takođe su ispitana na bojenje pomoću 14G8, 9D5, 6C1 i 5A1 i upoređena sa bojenjem dobijenim korišćenjem DAKO referentnog antitela. Kao što se očekivalo, jetra, pankreas i horoidni pleksus su obojeni pozitivno na TTR koristeći Dako referentno antitelo. Nasuprot tome, mis-TTR antitela su obojena samo alfa ćelijama pankreasa koje se nalaze na Langerhansovim ostrvima i horoidnom pleksusu, što sugeriše da su neki od TTR lokalizovanih na ovim organima konformaciono različiti od TTR eksprimiranih u jetri. Nedostatak imunoreaktivnosti mis-TTR mAb u jetri sugeriše da je velika količina TTR eksprimiranog tamo prvenstveno tetramerni, nativni TTR i da nema izloženi mis-TTR epitop.

Primer 6. Analiza ATTR naspram normalne ljudske plazme pomoću SDS-PAGE/Western Blota i testa na ploči na mezo skali (MSD)

[0198] Šest uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (uzorak-#21, #22, #23, #24, #25, #27) i 6 uzoraka (uzorak #11, #12, #15, #18, #19, #20) od normalnih subjekata dobijeni su od M. Saraiva (Univerzitet Porto, Portugal). Uzorak #C6 je bio normalan uzorak humanog seruma dobijen iz komercijalnog izvora (BioreclamationIVT). Uzorci su analizirani pomoću SDS-PAGE i Western blot ili pomoću MesoScale Discovery (MSD) testa na ploči. Protokoli za ove testove su opisani na drugom mestu u materijalima i metodama (p-r). Standardna kriva je generisana za test na MSD ploči pomoću 6C1.

[0199] U rezultujućim Western blotovima koji koriste 9D5 ili 5A1 mis-TTR mAb, razlike između normalnih i uzoraka plazme obolelih od TTR-V30M su bile evidentne. Svi uzorci plazme su sadržali -14 kDa TTR traku koja je migrirala sa ne-nativnim TTR monomerom prisutnim u pH4-TTR referentnom uzorku. Generalno, uzorci plazme dobijeni od pacijenata sa TTR-V30M (#21, 22, 23, 24, 25 i 27) imali su više ovih mis-TTR vrsta. Pored toga, uzorci plazme dobijeni od pacijenata sa V30M takođe su sadržali traku od ~30 kDa koja migrira zajedno sa ne-nativnim TTR dimerom prisutnim u referentnom uzorku. Sa izuzetkom uzoraka #12 i #18, uzorci plazme dobijeni od normalnih pojedinaca posedovali su manje ove vrste dimera.

[0200] Dobijeni Western blotovi su skenirani i intenziteti kombinovanih 9D5- ili 5A1-reaktivnih TTR dimera i monomernih traka su upisani u grafikon za svaki uzorak (rezultati su prikazani na Slici 5A (9D5) i 5B (5A1) i predstavljeni su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi). Sa izuzetkom uzoraka plazme #15 i #18, uzorci plazme dobijeni od normalnih osoba (11, 12, 19 i 20) sadržali su manje 9D5 reaktivnog dimera i monomera od uzoraka dobijenih od V30M pacijenata (21-25 i 27).

[0201] 12 uzoraka seruma analiziranih pomoću 9D5 i 5A1 Western blot-a takođe je analizirano MSD testom na ploči koristeći 6C1 kao mis-TTR antitelo za hvatanje i Dako-SulfoTag antitelo kao detekciono antitelo. Rezultati ovih MSD testova su prikazani na slici 6 i predstavljeni su u proizvoljnim jedinicama (a.u.) na y-osi. Uzorci 11, 12, 15, 18, 19 i 20 predstavljaju normalnu plazmu. Uzorci 21-25 i 27 predstavljaju plazmu obolelu od V30M. Sa izuzetkom uzoraka plazme #15 i #18, količina 6C1-reaktivnog TTR prisutnog u uzorcima plazme dobijenim od normalnih osoba bila je niža od one koja je primećena u plazmi obolelih od TTR-V30M fizička lica. Nivoi 6C1 reaktivnosti izmereni MSD testom su veoma dobro korelirali sa količinom 9D5 reaktivnog dimera i monomera koji su gore uočeni pomoću SDS-PAGE/Western.

[0202] Da bi se odredila koncentracija reaktivnih TTR vrsta prisutnih u uzorcima plazme, isti uzorci su ponovo analizirani korišćenjem 6C1 kao antitela za hvatanje i 8C3-SulfoTag kao antitela za detekciju. MSD signali su konvertovani u ng/ml koncentracije reaktivnih TTR vrsta korišćenjem standardne krive TTR F87M/L110M generisane iznad. Na osnovu ove analize, prosečna koncentracija 6C1-reaktivnog TTR prisutnog u kontrolnim uzorcima bila je 271 /- 185 ng/ml. Nasuprot tome, prosečna koncentracija reaktivnog TTR prisutnog u V30M obolelim uzorcima plazme bila je viša, na 331 /- 95 ng/ml. Uzeti zajedno, ovi rezultati MSD sugerišu da su mis-TTR antitela sposobna da razlikuju ATTR bolest od normalne plazme. Ovo garantuje dalji razvoj mis-TTR antitela za upotrebu u dijagnostičkim testovima ATTR bolesti.

Primer 7. Dizajn humanizovanih 5A1 antitela

[0203] Polazna tačka ili donorsko antitelo za humanizaciju bilo je mišje antitelo 5A1. Varijabilna aminokiselinska sekvenca teškog lanca zrelog m5A1 je data kao SEQ ID NO:1. Varijabilna aminokiselinska sekvenca lakog lanca zrelog m5A1 je data kao SEQ ID NO:9. Aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca date su kao SEQ ID NOS: 6, 7 i 8, respektivno (kako je definisao Kabat). Aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca su obezbeđene kao SEQ ID NOS: 14, 15, i 17, respektivno (kao što je definisao Kabat). Kabat numeracija se koristi u celom ovom primeru.

[0204] Varijabli kapa (Vk) od m5A1 pripada podgrupi Kabat miša 1, koja odgovara humanoj Kabat podgrupi 4. Varijablni teški (Vh) od m5A1 pripada podgrupi Kabat miša 3d, koja odgovara Kabat podgrupi 3. Videti Kabat et al. Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje. NIH publikacija br. 91-3242, 1991. CDR-L1 sa 11 ostataka pripada kanonskoj klasi 2, CDR-L2 sa 7 ostataka pripada kanonskoj klasi 1 i CDR-L3 sa 9 ostataka pripada kanonskoj klasi 1 u Vk. Vidi Martin & Thornton, J. Mol. Biol.263:800-15, 1996. CDR-H1 sa 10 ostataka (kompozit Chothia i Kabat CDR-H1, ostaci 26-35 u Tabeli 7) pripada kanonskoj klasi 1 i CDR-H2 sa 17 ostataka pripada kanonskoj klasi 1. Vidi Martin & Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. CDR-H3 nema kanonske klase.

[0205] Ostaci na interfejsu između Vk i Vh domena su oni koji se obično nalaze, osim što je 93V u teškom lancu tipično alanin.

[0206] Izvršena je pretraga proteinskih sekvenci u bazi podataka PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) da pronađe strukture koje bi dale grubi strukturni model 5A1. Kristalna struktura antitela fab (pdb kod 3IU4) (Talavera et al, 2002) korišćena je za Vk strukturu pošto je imala dobru rezoluciju (1,75A), ukupnu sličnost sekvence sa 5A1 Vk, i zadržala istu kanonsku strukturu za petlju kao 5A1. Dimerno antitelo (pdb kod 3LS4) (Niemi et al, 2003) je korišćeno za Vh strukturu jer je imalo dobru sličnost i rezoluciju (2.0A) i sadržalo je iste kanonske strukture za CDR-H1 i CDR-H2 kao i 5A1 VH. Softver BioLuminate (licenciran od Schrodinger Inc.) je korišćen za modeliranje grube strukture 5A1.

[0207] Pretraživanje baze podataka neredundantnih proteinskih sekvenci iz NCBI omogućilo je izbor odgovarajućih humanih okvira u koje bi se graftovali mišji CDR regioni. Za Vh, izabran je humani Ig teški lanac AGP01680.1 (GI: 519674190) (SEQ ID NO:3) (Bovers et al, 2013). On deli kanonske oblike 5A1. Za Vk, izabran je ljudski kapa laki lanac sa NCBI pristupnim kodom BAH04766 (GI: 219566573) (SEQ ID NO:11) (Kurosava et al, 2007). Ima iste kanonske klase za CDR-L1 i L2 kao i za roditeljski Vk.

[0208] Konstruisane su dve humanizovane varijante varijabilnog regiona teškog lanca i dve humanizovane varijante varijabilnog regiona lakog lanca koje sadrže različite permutacije supstitucija (Hu5A1VHv1-2 (SEQ ID NOS: 4 i 5, respektivno) i Hu5A1VLv1-2 (SEQ ID NOS: 12 i 13, respektivno)) (Tabele 7 i 8). Primeri humanizovanih Vh i Vk dizajna, sa povratnim mutacijama i drugim mutacijama zasnovanim na odabranim humanim okvirima, prikazani su u tabelama 7 i 8, respektivno. Sivo osenčene oblasti u prvoj koloni u tabelama 7 i 8 označavaju CDR regione kako ih je definisao Chothia, a sivo osenčene oblasti u preostalim kolonama u tabelama 7 i 8 označavaju CDR regione kako je definisao Kabat. SEQ ID NOS: 4, 5, 12 i 13 sadrže povratne mutacije i druge mutacije kao što je prikazano u tabeli 9. Aminokiseline na pozicijama L55, L85, H29 i H93 u Hu5A1VHv1-2 i Hu5A1VLv1-2 su navedene u tabeli 10.

Tabela 7

Humanizovani 5A1 Vh regioni

1 Tabela 7

Humanizovani 5A1 Vh regioni

2 Tabela 7

Humanizovani 5A1 Vh regioni

Tabela 7

Humanizovani 5A1 Vh regioni

Tabela 8

Humanizovani 5A1 Vk regioni

4 Tabela 8

Humanizovani 5A1 Vk regioni

Tabela 8

Humanizovani 5A1 Vk regioni

Tabela 8

Humanizovani 5A1 Vk regioni

Tabela 9

Tabela 10

Kabat numeracija okvirnih i Kabat CDR ostataka

za povratne mutacije i ostale mutacije u humanizovanim 5A1 antitelima

[0209] Poravnanje mišje 5A1 Vh sekvence (SEQ ID NO:1) sa sekvencom mišjeg modela (3LS4_H_St.pro; SEQ ID NO:2), sekvencom humanog akceptora (AGP01680; SEQ ID NO:3) i Hu5A1VHv1 i Hu5A1VHv2 sekvencama (SEQ ID NOS:4 i 5, respektivno), prikazane su na slici 1. CDR regioni kako ih definiše Kabat su osenčeni. Položaji na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između sekvenci akceptora miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Primeri Vernijeovih/temeljnih interagujućih CDR ostataka uključuju Kabat ostatke 2, 49, 69, 71, 75, 78 i 94 u Tabeli 7. Primeri kanonskih/CDR interagujućih ostataka uključuju Kabat ostatke 24, 48 i 73 u Tabeli 7. Primeri Interfejs/pakujućih (VH+VL) ostataka uključuju Kabat ostatke 37, 39, 45, 47, 91, 93 i 103 u tabeli 7.

[0210] Poravnanje mišje 5A1 Vk sekvence (SEQ ID NO:9) sa sekvencom mišjeg modela (3IU4_L_St.pro; SEQ ID NO:10), sekvencom humanog akceptora (BAH04766; SEQ ID NO:11) i Hu5A1VLv1 i Hu5A1VLv2 sekvencama (SEQ ID NOS:12 i 13, respektivno), prikazane su na slici 2. CDR regioni kako ih je definisao Kabat su osenčeni. Položaji na kojima se kanonski, Vernijeovi ili interfejsni ostaci razlikuju između sekvenci akceptora miša i čoveka su kandidati za supstituciju. Primeri Vernijeovih/CDR temeljnih ostataka uključuju Kabat ostatke 4, 35, 46, 49, 66, 68 i 69 u tabeli 8. Primeri kanonskih/CDR interagujućih ostataka uključuju Kabat ostatke 2, 48, 64 i 71 u tabeli 8. Primeri ostataka interfejsnih/pakujućih (VH+VL) ostataka uključuju Kabat ostatke 39, 44, 47, 87 i 98 u tabeli 8.

[0211] Obrazloženja za izbor gore navedenih pozicija kao kandidata za zamenu su sledeća.

[0212] C55S: Cys je neobičan na ovoj poziciji u humanim antitelima. Ser može zadržati afinitet vezivanja sa smanjenim potencijalom za imunogenost. Ova supstitucija nije povratna mutacija, već pre supstitucija retkog humanog ostatka na poziciji za uobičajeniji ostatak.

[0213] T85V: Iako se ne očekuje da će položaj 85 biti važan za vezivanje, Thr na ovoj poziciji je manje uobičajen od ostatka Val miša u ljudskim antitelima, tako da bi zamena T za V trebalo da smanji potencijal imunogenosti bez uticaja na vezivanje.

[0214] V29F: Ovaj ostatak je povratno mutiran jer se nalazi u Chothia CDR regionu.

[0215] A93V: Ovaj ostatak doprinosi VH-VL interfejsu. Pošto se ostaci akceptora i donora razlikuju na ovoj poziciji, napravljena je povratna mutacija od A do V u humanizovanom dizajnu VHv1.

[0216] Dve humanizovane varijante varijabilnog regiona lakog lanca i dve humanizovane varijante varijabilnog regiona teškog lanca su sledeće:

[0217] Hu5A1VL verzija 1 (supstitucija T85V malim slovima):

[0218] Hu5A1VL verzija 2 (supstitucija C55S i T85V malim slovima):

[0219] Hu5A1VH verzija 1 (V29F i A93V povratne mutacije malim slovima):

[0220] Hu5A1VH verzija 2 (povratna mutacija V29F malim slovima):

Primer 8. Kinetička analiza vezivanja humanizovanih 5A1 antitela

[0221] Kinetiku vezivanja humanizovanih 5A1 antitela koja obuhvataju teški lanac izabran iz verzije 2 i laki lanac izabran iz verzije 2 karakteriše Biacore.

Primer 9. Materijali i metode

a. Protokol generisanja antitela

[0222] Miševi su imunizovani jednom nedeljno sa antigenskim peptidima TTR-MAP, TTR89-97-N-KLH ili TTR89-97-C-KLH u RIBI ađuvansu ili mesečno u TiterMax ađuvansu. Tri do četiri dana pre fuzije, odabranim miševima je dato konačno IV pojačanje sa imunogenom u fiziološkom rastvoru. Slezina je homogenizovana da bi se pripremili splenociti i spojena sa SP2/0 ćelijama mijeloma korišćenjem standardnog protokola elektrofuzije. Fuzionisane ćelije u medijumu za selekciju su postavljene na ploče sa 96 bunarčića i pregledane nakon 7-10 dana.

b. Protokol skrininga antitela

[0223] Selekcija hibridoma je zasnovana na sledećem ELISA testu: ELISA ploče sa 96 bunarčića su obložene pilećim anti-His, 1 µg/mL PBS i inkubirane 1 sat. Ploče su blokirane sa 1% rastvorom BSA/PBS, 200 uL/bunariću tokom 15 minuta, a zatim je dodato 0,5 µg/mL pH4-TTR, 50 µL/bunariću i inkubirano je 1 sat. pH4-TTR je TTR koji je bio podvrgnut niskom pH (50 mM natrijum acetata, pH 4,0) da bi se disocirao/agregirao TTR, izlažući epitop TTR89-97. Ploče su dva puta isprane sa TBS-T. Dodat je supernatant sa fuzionih ploča, 50 µL/bunariću i inkubiran 1 sat. Ploče su dva puta isprane sa TBS-T. Dodato je detekciono antitelo, kozje anti-mišje (IgGl, 2a, 2b, 3 specifičan)-HRP razblaženo 1:5,000 u 0,5% BSA/PBS/TBS-T, 50 µL/bunariću i inkubirano 1 sat. Na kraju, ploče su isprane pet puta sa TBS-T i TMB supstratom, dodato je 100 µL/bunariću. Posle 15 minuta, razvoj supstrata je zaustavljen sa 2N sumpornom kiselinom, 50 µL/bunariću. Ploče su očitane na 450 nm. Bunarčići sa O.D. > 1.0 su odabrani i ćelije su prebačene na ploču sa 24 bunarčića. Posle 3 dana rasta, klonovi su podvrgnuti kontra skriningu sa gornjim testom da bi se potvrdilo vezivanje i zamenom prirodnog TTR za pH4-TTR kao negativnim kontraskriningom, omogućavajući selekciju klonova koji proizvode TTR mAb specifična za nenativne oblike TTR.

c. Protokoli ekspresije antitela

[0224] Plazmidi lakog i teškog lanca vođeni sa CMV koji nose sekvence humanizovanih monoklonskih antitela su transfektovani u CHO-S 1 ćelije (Life Technology). Dvostruki izbor je primenjen da bi se napravio izabrani skup. Kondicionirani medijum je analiziran na titar, vezivanje i analiziran pomoću SDS-PAGE/Western blotinga. Odabrani skupovi su korišćeni za generisanje klonova korišćenjem Clonepix sistema (Molecular Devices). Klonovi su rangirani na osnovu titra antitela. Odabrani klonovi su prošireni i stavljeni u banku.

[0225] Najveći proizvodni klon je proširen u posudama za mućkanje i kultura je korišćena za inokulaciju 10-25L Wave kesa kultura. Mešavina FreeStyle-CHO, CD OptiCHO i FreeStyle F17 ekspresionih medijuma sa dodatkom Glutamax (medijum i Glutamax od Life Technology) korišćena je za protresanje balona, kao i za kulture Wave kese. Šaržna kultura je napravljena korišćenjem Wave Bioreactor (GE Healthcare) na 37°C, 7% CO2pod stalnim mešanjem. Uzorci su uzimani periodično da bi se pratio broj ćelija, održivost i proizvodnja antitela. Po potrebi je napravljena suplementacija sa Cell Boost (HiClone). Šaržna kultura je sakupljena kada vitalnost ćelija počne da opada ispod 90% (5-7 dana).

d. Protokol prečišćavanja antitela

[0226] Ćelijska kultura je sakupljena nakon što se prvo omogućilo da se ćelije u suspenziji slegnu na dno Wave kese gravitacijom na 4°C. Sakupljeni medijum je pročišćen kroz dubinski filter (Millistak Pod COHC, Millipore), koncentrisan 10 puta filtracijom tangencijalnog protoka (Pelicon 2PLC 30K, Millipore) i sterilno filtriran kroz filter od 0,2 µm (Opticap XL, Millipore). Koncentrovani kondicionirani medijum je zatim stavljen na kolonu za brzi protok Protein G Sepharose (GE Lifesciences) prethodno ekvilibrisanu u 1xPBS, pH 7,4 korišćenjem FPLC (Akta Avant, GE Lifesciences). Nevezani proteini su isprani sa kolone sa 5-10 zapremina kolone 1xPBS, pH 7,4 dok je OD280dostigla osnovnu liniju. Vezano antitelo je eluirano iz kolone sa 2 zapremine kolone IgG elucionog pufera (Thermo Scientific). Frakcije za eluiranje su sakupljene i pH neutralizovan sa 2M Tris, pH 9,0 (60 µL po 1ml eluacije).

[0227] Frakcije koje sadrže antitela su sakupljene i dijalizovane preko noći na 4°C protiv 1xPBS, pH 7,4. Dijalizovani uzorak je zatim sterilisan ultrafiltracijom kroz 0,2 µm PES filter i čuvan na 4°C. Konačna koncentracija proteina je određena bicinhoninskom kiselinom (BCA) korišćenjem goveđeg gama-globulina kao standarda proteina (Thermo Scientific).

e. Rekombinantni TTR protokoli ekspresije i prečišćavanja

[0228] Ćelije E. coli (BL21-A1) su transformisane sa pET21a(+) plazmidom koji sadrži TTR

1

insert (Met-hTTR-(His)6ili TTR varijanta koja sadrži dvostruku mutaciju F87M/L110M. Ćelije su uzgajane u 2YT bujonu koji sadrži 100 µg/ml ampicilina. Ekspresija TTR je indukovana preko noći na 20°C u prisustvu 1mM IPTG i 005% arabinoze.

[0229] Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 4000 x g tokom 10 min. i čuvane na -80°C do upotrebe. 10-15 g ćelijskih peleta je odmrznuto i lizirano u 50 ml pufera A (1xPBS koji sadrži 500 mM NaCl, 20 mM imidazola) obradom kroz LV-1 procesor sa visokim smicanjem (Microfluidics, Inc.). Lizirane ćelije su centrifugirane na 12,000 x g tokom 15 minuta, filtrirane kroz 0,2 µm PES filter pre prečišćavanja na His-Trap HP koloni (GE Lifesciences). Nakon punjenja, kolona je isprana sa 10 c.v. pufera A i eluirana sa puferom B (1xPBS sa 500 mM NaCl, 500 mM imidazolom). Frakcije maksimuma koje odgovaraju TTR su sakupljene, dijalizovane protiv 1xPBS i čuvane na -80°C do upotrebe.

f. Priprema antigena TTR

[0230] Nativni TTR antigen je pripremljen razblaživanjem koncentrovane količine rekombinantnog TTR-6His do konačne koncentracije od 2,5 µg/ml u 1xPBS. TTR tretiran pH4 je generisan inkubacijom rekombinantnog TTR u koncentraciji od 0,2 mg/ml u 50 mM natrijum acetatu, pH 3,95 tokom 72 sata na sobnoj temperaturi. Pod ovim uslovima, TTR se disocira u mešavinu TTR monomera i agregiranih oblika koji su strukturno različiti od prirodnog TTR. pH4-TTR je zatim razblažen do konačne koncentracije od 2,5 µg/ml u 1xPBS neposredno pre upotrebe u testu. Ploče sa 96 bunarčića (Costar #3690) su obložene na sobnoj temperaturi sa 50 µl po bunarčiću 1,0 µg/ml pilećeg anti-his poliklonskog antitela (Abcam #Ab9107) u 1xPBS tokom 1 sata. Rastvor za oblaganje je odbačen i ploča je blokirana sa 250 µl/bunarčiću zapremine 1x BSA koji sadrži blok pufer razblažen u 1xPBS (G-Biosciences #786-193) tokom 1 sata.

g. ELISA protokol

[0231] Obložene i blokirane ploče sa 96 bunarčića tretirane su sa 50 µl po bunarčiću 2,5 µg/ml TTR antigena (bilo nativni TTR ili pH4-TTR) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane dva puta sa 250 µl po bunarčiću pufera za ispiranje (1x Tris puferovani slani rastvor koji sadrži 0,05% Tween-20). Oprane ploče su zatim tretirane sa 50 µl po bunarčiću odgovarajućeg anti-TTR monoklonskog antitela u koncentracijama u rasponu od 0,31 do 2,5 µg/ml, tokom 1 sata.

2

[0232] Tretirane ploče su isprane 3 puta sa 250 µl po bunarčiću pufera za ispiranje. Nakon pranja, ploče su tretirane 1 sat sa 50 µl po bunarčiću antitela za detekciju koje sadrži 1:5,000 razblaženje peroksid-konjugovanog kozjeg-anti-mišjeg (Jackson ImmunoResearch #115-035-164) u 1xPBS. Ploča je zatim isprana 3 puta pre dodavanja 100 µl po bunarčiću TMB supstrata (Rockland). HRP reakcija je ostavljena na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta pre gašenja sa zapreminom od 50 µl 1N H2SO4. Spektroskopska apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 450 nm.

h. SDS-PAGE

[0233] Elektroforeza na SDS-poliakrilamidnim gelovima je izvedena na sledeći način. 0,1-1 µg TTR ili pH 4,0-TTR u puferu za uzorke 1xLDS (Life Technologies) je stavljeno na 10% NuPAGE bis-tris gel i podvrgnuto elektroforezi u MES puferu na konstantnih 90V tokom 105 minuta. Nakon elektroforeze, gel je ili obojen u Instant Blue (Expedeon) ili prebačen u nitrocelulozne filtere za Western blot analizu.

i. Nativni-PAGE

[0234] Elektroforeza na prirodnim tris-glicinskim gelovima je izvedena na sledeći način. 0,1-1 µg TTR ili pH 4,0-TTR u puferu za uzorke 1xTris-glicina (Life Technologies) je stavljeno na 10-20% Tris-glicinski gel i podvrgnuto elektroforezi u 1x Nativnog Tris-glicinskom puferu za analizu na konstantnih 120V tokom 105 minuta. Nakon elektroforeze, gel je ili obojen u Instant Blue (Expedeon) ili prebačen u nitrocelulozne filtere za Western blot analizu.

j. Western Blot

[0235] SDS- ili Nativni-PAGE gelovi su blotovani na nitrocelulozni filter papir (iBlot, P7 program) i blokirani puferom za blokiranje (Licor) tokom 30 minuta. Filteri su zatim inkubirani u 0,5 µg/ml primarnog antitela u puferu za blokiranje 1 sat na sobnoj temperaturi (ili preko noći na 4°C), nakon čega su usledila tri, 10 minuta ispiranja sa 1xTBS. Filteri su stavljeni u IRDye 800CV-konjugovani kozji-anti-mišji sekundarno razblažen 1:20,000 u blok puferu. Nakon inkubacije filtera u sekundarnom rastvoru antitela tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, filteri su isprani i zabeleženi na Odissey CLx infracrvenom snimaču (Licor).

k. Protokol za ispitivanje formiranja TTR vlakana

[0236] Rastvor 3,6 µM (0,2 mg/ml) TTR-I78F u 50 mM natrijum acetatu, pH 4,8 je inkubiran na 37°C tokom 72 sata u prisustvu 1,4 µM (0,2 mg/ml) mis-TTR antitela ili kontrole izotipa. Posle inkubacije, u smešu je dodat 5X molarni višak tioflavina-T i ostavljen da se veže 30 minuta. Fluorometrijska merenja su merena na talasnoj dužini emisije od 480nm sa talasnom dužinom ekscitacije postavljenom na 440nm. Inhibicija od 0% je postavljena kao intenzitet fluorescencije u prisustvu kontrolnog antitela izotipa (83 a.u.), a tačka inhibicije od 100% je postavljena kao fluorescencija u odsustvu proteina TTR-Y78F (38 a.u.).

l. Uzorci srčanog tkiva

[0237] Sveže zamrznuti i parafinom obrađeni blokovi srčanog tkiva sa potvrđenom dijagnozom ATTR mutacija dobijeni su od dr Merila Bensona sa Univerziteta Indijana. Uzorci su uključivali osam sveže smrznutih uzoraka i šest uzoraka FFPE i svakom uzorku je dijagnostikovana ili ATTR ili neka druga srčana amiloidoza. Dijagnoza tkiva je dalje potvrđena u Prothena putem IHC bojenja antitelima na kapa i lambda lake lance i amiloida A pre karakterizacije sa TTR antitelima.

m. Imunohistohemija

[0238] Imunohistohemija je izvedena na lagano paraformaldehidom fiksiranim, 10 µm krioisečcima postavljenim na pločicu i na 5 µm parafinskim presecima. Postupak imunoperoksidaze je bila glavni sistem detekcije, koji je izveden na Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) koristeći Bond Polimer Refine Detection Kit (DS980, Leica Biosystems). Primarna antitela su inkubirana jedan sat (prema koncentracijama u Tabeli 2) nakon čega je usledila inkubacija sa konjugatima anti-mišjeg i anti-zečjeg polimernog HRP-linker antitela. Bojenje je vizuelizovano sa DAB hromogenom, koji je dao braon talog. Pločice su kontra obojene hematoksilinom, dehidratisane u rastućoj seriji alkohola, očišćene u ksilenima i prekrivene CytoSeal 60 (Richard Allen Scientific; Kalamazoo, MI). Negativna kontrola se sastojala u sprovođenju celokupne imunohistohemijske procedure na susednim presecima sa kontrolom izotipa neimunog IgG ili izostavljanjem primarnog antitela.

4

n. Demonstracija amiloida: Bojenje Kongo crvenom i tioflavinom T

[0239] Bojenje Kongo crvenom je izvedeno da bi se demonstrirao TTR amiloid u tkivu korišćenjem kompleta američke MasterTech (Lodi, Kalifornija). Bojenje je obavljeno prema proceduri proizvođača. Ploče su obojene u rastvoru Kongo crvene tokom 1 sata, nakon čega je usledila diferencijacija u 1% natrijum hidroksidu tokom približno 15 sekundi. Pločice su zatim isprane tekućom vodom, dehidrirane kroz seriju alkohola u rastućim koncentracijama i očišćene kroz tri promene ksilena, i prekrivene sa CytoSeal 60.

[0240] Za određivanje prisustva TTR amiloida u tkivu korišćen je modifikovani protokol bojenja tioflavinom T (Schmidt et al 1995.). Ukratko, pločice su kontra obojene Mayers hematoksilinom, isprane tekućom vodom i obojene filtriranim rastvorom 0,015% tioflavina T (T3516-25G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u 50% etanolu tokom deset minuta. Pločice su zatim isprane tekućom vodom i diferencirane u 1% (zapr./zapr.) sirćetnoj kiselini tokom 10 minuta i isprane tri puta u vodi. Pločice su ostavljene da se osuše na vazduhu pre nego što su prekrivene sa ProLong Gold (Life Technologies).

o. Analiza slike

[0241] Pločice su snimljene pomoću bilo Olympus BX61 mikroskopa, Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT digitalnim skenerom pločica ili Leica SPE spektralnim konfokalnim sistemom. Slike su prikupljene i uskladištene kao TIFF fajlovi.

p. Analiza uzoraka humane plazme pomoću SDS-PAGE/Western

[0242] Šest uzoraka plazme pacijenata potvrđenih za V30M ATTR (uzorak #21, #22, #23, #24, #25, #27) i 6 uzoraka (uzorak #11, #12, #15, #18, #19, #20) od normalnih subjekata dobijeni su od M. Saraiva (Univerzitet Porto, Portugal). Uzorak #C6 je bio normalan uzorak humanog seruma dobijenog iz komercijalnog izvora (BioreclamationIVT). Ovi uzorci plazme su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i Western blot sa 9D5 kao što sledi. Zapremina plazme od 1,4 µl je razblažena 1:8 u 1xLDS puferu za uzorke u odsustvu redukcionog agensa (Life Technologies). Uzorci su podvrgnuti SDS-PAGE razdvajanju i Western blotu sa 0,5 µg/ml 9D5 kao što je prethodno opisano.

q. Analiza uzoraka humane plazme pomoću MesoScale Discovery (MSD) testa ploča

[0243] 96MSD ploče su obložene monoklonskim antitelom 6C1 u koncentraciji od 4 µg/mL u PBS i inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje ili preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta sa 1xTBST pre nego što su blokirane sa 3% rastvorom MSD blokatora A, 150 µL po bunarčiću tokom 1 sata mućkanja. Zapremina od 30 µl po bunarčiću uzoraka humane plazme razblaženih 1:10 u puferu za uzorke koji se sastoji od 0,6% goveđeg serumskog albumina bez globulina, 1,5 mM monobaznog natrijum fosfata, 8 mM dvobaznog natrijum fosfata, 145 mM natrijum hlorida, 0,05% Tritona X-405 i 0,05% timerosala je dodato u blokirane MSD ploče tokom 1 sata. Ploče su isprane 3 puta sa 1xTBST. 50 µl po bunarčiću zapremine 1 µg/ml sulfo-obeleženog antitela za detekciju (bilo kog 8C3 ukupnog TTR antitela od Dako poliklonalnog antitela) u puferu za uzorke je dodato za 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su isprane tri puta sa 1×TBST nakon čega je usledilo dodavanje 150 µl po bunarčiću 1× Read Buffer T rastvora (Meso Scale Discovery). Ploče su zatim očitane u snimaču MSD Sector.

r. Generisanje MSD standardne krive

[0244] Da bi se kvantitativno odredila količina ne-nativnog, 6C1-reaktivnog TTR proteina prisutnog u uzorcima humane plazme, generisana je MSD standardna kriva korišćenjem rekombinantnog TTR-F87M/L110M kao 6Cl-reaktivnog TTR standarda. Ova TTR varijanta sadrži dve aminokiselinske supstitucije koje sprečavaju stvaranje tetramera i održavaju protein u monomernom stanju (Jiang et al. (2001) Biochemistry 40, 11442-11452). Kao takva, ova TTR varijanta je prepoznata od strane svih mis-TTR mAb i stoga je dobro prilagođena za upotrebu kao referentni standard u MSD testu.

[0245] Da bi se napravila standardna kriva, MSD ploče sa 96 bunarčića su obložene mis-TTR antitelom 6C1 u koncentraciji od 4 µg/mL u PBS i inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje ili preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta sa 1xTBST pre nego što su blokirane sa 3% rastvorom MSD blokatora A, 150 µL po bunarčiću tokom 1 sata mućkanja. Blokirane ploče su zatim tretirane 1 sat sa 50 µl po bunarčiću 25 µg/mL TTR-F87M/L110M serijski razblaženog 1:5, pri čemu je poslednje razblaživanje bilo slepi pufer. Ploče su isprane 3 puta sa 1xTBST pre dodavanja zapremine od 50 µl po bunarčiću od 1 µg/ml SulfoTagdetekcionog antitela (8C3-SulfoTag ili Dako pAb-SulfoTag) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Oba, 8C3 mAb i Dako antitelo su spojeni na SulfoTag i mogli su da se koriste za detekciju antitela pošto su se vezali za ukupni TTR i nisu bili specifični za konformaciju.

[0246] Posle tretmana sa detekcionim antitelom, ploče su isprane tri puta sa zapreminom od 150 µl po bunarčiću 1xTBST, nakon čega je dodato 150 µl po bunarčiću 1x pufer za očitavanje T (MSD). Ploče su očitane u uređaju za snimanje MSD Sector i dobijena je kalibraciona kriva TTR F87M/L110M.

Primer 10. Procena mis-TTR antitela u modelu transgenog miša

[0247] In vivo studije su sprovedene na humanizovanom modelu transgenog miša V30M hTTR (Inoue et al., (2008) Specifični uslovi bez patogena sprečavaju transtiretinsku amiloidozu na modelima miša. Transgenic Research 17:817-826) za procenu efikasnosti anti-TTR antitela u vezivanju i uklanjanju agregiranog hTTR.

[0248] Transgeni miševi se uzgajaju korišćenjem standardnih procedura i njihovi cirkulišući nivoi hTTR se procenjuju pomoću ELISA. Miševi sa serumskim nivoom od 200-400 µg/ml hTTR su korišćeni za naredne studije efikasnosti. Prvi set studija ispituje prirodno taloženje hTTR kod transgenih miševa. Detekcija hTTR naslaga počinje sa 12 meseci starosti i ponavlja se svakih 3-6 meseci nakon toga. Jednom kada se uoči prihvatljiv nivo agregata kod transgenih miševa, pokreću se studije efikasnosti. Životinje su podeljene u tri grupe za tretman (n=10/grupa) i tretirane nedeljno tokom četiri nedelje sa IP dozom vehikuluma, kontrolnim antitelom (kontrola izotipa, 10 mpk) ili anti-hTRR antitelom (10 mpk). Nedelju dana nakon poslednjeg tretmana, miševi su eutanazirani, tkiva sakupljena i obrađena, a zatim obojena da bi se procenio broj i veličina preostalih TTR naslaga. Kvantitativne metode i statistike se koriste da bi se odredio stepen klirensa koji se vidi među grupama.

[0249] U alternativnom pristupu pripremaju se hTTR agregati in vitro i zatim se ubrizgava u bubreg transgenih miševa da bi se započelo taloženje novih agregata. Podnosilac prijave je utvrdio da ubrizgavanje ovih preparata može ubrzati taloženje novih agregata na predvidljiv način. Na osnovu ovih nalaza, životinje se sediraju, levi bubreg je izložen i prethodno agregirani hTTR materijal se ubrizgava u korteks bubrega. Nakon odgovarajućeg perioda oporavka, miševi su podeljeni u tri grupe za tretman (n=10/grupa) i tretirani nedeljno četiriosam nedelja sa IP dozom vehikuluma, kontrolnim antitelom (kontrola izotipa, 10 mpk) ili anti-hTRR antitelom (10 mpk). Nedelju dana nakon poslednjeg tretmana, miševi su eutanazirani, bubrezi su sakupljeni i obrađeni, a zatim obojeni da bi se procenio broj i veličina TTR depozita. Kvantitativne metode i statistike se koriste da bi se odredio stepen promene uočene među grupama.

Primer 11. Procena mis-TTR antitela u modelu Matrigel implantata

[0250] Podnosilac prijave je utvrdio da se prethodno agregirani hTTR može suspendovati u Matrigel-u (BD Bioscience, kat #354263), ostaviti da se stvrdne i zatim staviti subkutano u miševe. Četiri nedelje nakon implantacije, Matrigel implant je zadržao svoju strukturu i agregirani hTTR je i dalje bio prisutan unutar implantata. Štaviše, miševi su dobro tolerisali implant i anti-hTTR antitela su bila u stanju da prodru i vežu se za agregate suspendovane u Matrigelu. Na osnovu ovih nalaza, sprovodi se studija efikasnosti antitela. Životinje se sediraju i miševima se subkutano stavlja implantat koji sadrži prethodno agregirani hTTR suspendovan u Matrigelu. Nakon odgovarajućeg perioda oporavka, miševi se dele u tri grupe za tretman (n=10/grupa) i tretiraju se svake nedelje, tokom dve-četiri nedelje, IP dozom vehikuluma, kontrolnim antitelom (kontrola izotipa, 10 mpk) ili anti-hTRR antitelom (10 mpk). Nakon poslednjeg tretmana, miševi se eutanaziraju, koža koja sadrži implantat je sakupljena i obrađena, a zatim se procenjuje količina preostalih TTR depozita pomoću histoloških i/ili biohemijskih metoda. Kvantitativna analiza i statistika se koriste da bi se odredio stepen klirensa koji se vidi među grupama.

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje specifično vezuje transtiretin koje sadrži zreli varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:5 i zreli varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO:13.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje ima izotip humanog IgG1.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje ima humani IgG2 ili IgG4 izotip.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje je vezujući fragment; izborno naznačeno time da je vezujući fragment jednolančano antitelo, Fab ili F(ab')2fragment.

5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je zreli varijabilni region lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca, a zreli varijabilni region teškog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca.

6. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da je konstantni region teškog lanca mutantni oblik prirodnog humanog konstantnog regiona teškog lanca koji ima smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u odnosu na prirodni humani konstantni region teškog lanca.

7. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da konstantni region teškog lanca je IgG1 izotip.

8. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je zreli varijabilni region teškog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO:23 sa ili bez C-terminalnog lizina i/ili zreli varijabilni region lakog lanca je fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca koji ima sekvencu SEQ ID NO:25.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.

10. Nukleinska kiselina koja kodira teški lanac i laki lanac antitela, ili nukleinske kiseline respektivno koje kodiraju teški lanac i laki lanac antitela, naznačena time da je antitelo kao što je opisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-8.

11. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 10 ili rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10.

12. Ćelija domaćin transformisana sa rekombinantnim ekspresionim vektorom(ima) prema patentnom zahtevu 11.

13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 za upotrebu u lečenju ili postizanje profilakse amiloidoze posredovane transtiretinom, ili odlaganju početka amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, naznačeno time da upotreba sadrži primenu na subjekta efikasnog režima antitela.

14. In vitro postupak dijagnostikovanja amiloidoze posredovane transtiretinom kod subjekta, koji sadrži dovođenje u kontakt biološkog uzorka iz subjekta sa efikasnom količinom antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8.

15. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što biološki uzorak je krv, serum, plazma ili čvrsto tkivo; izborno iz srca, perifernog nervnog sistema, autonomnog nervnog sistema, bubrega, očiju ili gastrointestinalnog trakta.

1