JP2014509200A - Ｃｅａ抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、改善された治療特性を持つＡＢＭを含み、膜結合ＣＥＡに結合する抗原結合分子（ＡＢＭ）、及びその使用の方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１１年３月２日に出願された欧州特許出願第１１１５６６６５．９号の利益を主張し、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、抗原結合分子（ＡＢＭ）に関する。特定の実施態様において、本発明は、ヒト癌胎児性抗原に結合するキメラ抗体、霊長類化抗体、又はヒト化抗体を含む、組換えモノクローナル抗体に関する。
背景
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及び抗ＣＥＡ抗体
癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ−５又はＣＤ６６ｅとしても知られている）は約１８０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質である。ＣＥＡは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜にリンクされている７つのドメインを含む（Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5:344-366, 1991）。７つのドメインは、単一のＮ末端Ｉｇ可変ドメイン及びＩｇ定常領域に相同な６つのドメイン（Ａ１−Ｂ１−Ａ２−Ｂ２−Ａ３−Ｂ３）を含む（Hefta L J,ら、 Cancer Res. 52:5647-5655, 1992）。
ヒトＣＥＡファミリーは、２９の遺伝子を含んでおり、そのうち１８個が発現される：７つはＣＥＡサブグループに、１１個は妊娠特異的糖タンパク質のサブグループに属している。いくつかのＣＥＡサブグループのメンバーは、細胞接着特性を有すると考えられている。ＣＥＡは、自然免疫の役割を持っていると考えられている（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）。ＣＥＡに密接に関連するタンパク質の存在のため、他の密接に関連したタンパク質に対する最小限の交差反応性を持つＣＥＡに特異的な抗ＣＥＡ抗体を産生することは挑戦的であり得る。
ＣＥＡは、腫瘍関連抗原として長らく同定されてきた（Gold 及び Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。胎児の組織においてのみに発現されるタンパク質としてもともと分類されたが、現在ＣＥＡは複数の正常成人組織で同定されている。これらの組織は元々は主に上皮性であり、消化管、呼吸器系の細胞、泌尿生殖器管、及び大腸、子宮頸部、汗腺、前立腺の細胞を含む（Napら、 Tumour Biol., 9(2-3):145-53,1988; Napら、 Cancer Res., 52(8):2329-23339,1992）。
上皮由来の腫瘍、ならびにそれらの転移は、腫瘍関連抗原としてのＣＥＡを含む。ＣＥＡ自体の存在は、癌細胞への転換を示すものではないが、ＣＥＡの分布は指標となる。正常組織では、ＣＥＡは、一般的に細胞の頂端膜側に発現しており（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）、血液中で抗体に近づきにくくしている。正常組織とは対照的に、ＣＥＡは、癌細胞の表面全体に発現する傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）。発現パターンのこの変化は、癌細胞中で抗体の結合にＣＥＡが到達できるようにしている。加えて、ＣＥＡの発現は癌細胞で増加する。更に、増加したＣＥＡの発現は、細胞間接着の増加を促進し、転移につながる可能性がある（Marshall J., Semin Oncol., 30(付録8):30-6, 2003）。
ＣＥＡは、容易に細胞表面から切断されて、直接又はリンパ管を介して、腫瘍からの血流に流される。この特性のため、血清ＣＥＡのレベルは、癌の診断、及び癌、特に結腸直腸癌の再発スクリーニングのための臨床マーカーとして使用されている（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I.,ら、 J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flaminiら、 Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006）。血清ＣＥＡは現在入手可能な抗ＣＥＡ抗体の大部分に結合し、細胞表面上のそれらの標的への到達を妨げ、潜在的な臨床効果を制限するため、この特性は標的としてＣＥＡを使用するための課題の一つを提示している。
複数のモノクローナル抗体が、診断ツールとして研究目的用に、及び治療目的用に、ＣＥＡに対して産生されている（例えば、Napら、 Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992; Sheahanら、 Am. J. Clin. Path. 94:157-164, 1990; Sakuraiら、 J. Surg. Oncol., 42:39-46, 1989; Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Ledermann J A, Br. J. Cancer, 58:654, 1988; Ledermann J A, Br. J. Cancer, 68:69-73, 1993; Pedley R B,ら、 Br. J. Cancer, 68:69-73, 1993; Boxer GM,ら、 Br. J. Cancer, 65:825-831, 1992）。チェスターらは、放射免疫検出及び放射免疫療法に使用されるファージディスプレイライブラリーから単鎖抗ＣＥＡ抗体を単離し（米国特許第５８７６６９１号）、続いて抗体はヒト化された（米国特許第７２３２８８８号）。抗ＣＥＡ抗体はまた、ヒトファージディスプレイライブラリーからも単離されている（米国特許第５８７２２１５号）。
マウスモノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３は、通常の大腸上皮で免疫したマウス由来の脾臓細胞とＮＳ１（Ｐ３／ＮＳ１／Ｉ−Ａｇ−４−１）骨髄腫細胞の融合により産生された（Richman P. I. 及び Bodmer W. F., Int. J. Cancer, 39:317-328, 1987）。ＰＲ１Ａ３は高分化型及び低分化型結腸直腸癌の双方に強く反応し、その抗原は、腫瘍に固定されるように現れ、リンパ管若しくは腫瘍を排出する通常のリンパ節には現れないため、他の大腸上皮反応性抗体に勝る利点を有している（Granowska M.ら、 Eur. J. Nucl. Med., 20:690-698, 1989）。例えば、ＰＲ１Ａ３は、６０分の５９の大腸腫瘍と反応したが、一方ＣＥＡ反応性抗体Ｂ７２．３は、大腸腫瘍の７５％のみと反応した（Mansi L.,ら、 Int J Rad Appl Instrum B., 16(2):127-35, 1989）。
ＰＲ１Ａ３のエピトープマッピングでは、抗体がＢ３ドメイン及びＣＥＡ分子のＧＰＩアンカーをターゲットにすることを示している（Durbin H.ら、 Proc. Natl. Scad. Sci. USA, 91:4313-4317, 1994）。その結果、ＰＲ１Ａ３抗体は膜結合ＣＥＡに対してのみ結合し、癌患者の血流で見つけられる可溶性ＣＥＡ型には結合しない。この結合特性のため、ＰＲ１Ａ３抗体は血清ＣＥＡによって隔絶されることはほとんどなく、その代わりに、癌細胞に発現しているＣＥＡをターゲットにすることができる。ＰＲ１Ａ３に結合されるエピトープは立体構造エピトープではなく、可溶性ＣＥＡに対するＰＲ１Ａ３の結合の損失に寄与すると考えられている直線状エピトープである（Stewartら、 Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999）。
ＰＲ１Ａ３抗体は、以前に、マウス親抗体のＣＤＲを、ヒト抗体ＲＦ−ＴＳ３’ＣＬ（ＰＲ１Ａ３のマウスフレームワーク４を保持する）の重鎖フレームワーク領域１−３、及びＲＥＩ抗体の軽鎖のフレームワーク領域へ移植することでヒト化された（Stewartら、 Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999）。ＰＲ１Ａ３のこのヒト化バージョンは特異性を保持しており、表面に発現したＣＥＡに対してマウス抗体のそれと似た親和性を有する（Stewartら、 Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999; U.S. Pat. No. 5,965,710）。ヒトＰＲ１Ａ３（ｈＰＲ１Ａ３）抗体は結腸直腸癌細胞系の標的化された死滅を誘導することが示された（Conaghhan P. J.，ら、 Br. J. Cancer, 98(7):1217-1225）。しかしながら、ＣＥＡに対するｈＰＲ１Ａ３の親和性は比較的低い。
放射標識された抗ＣＥＡ抗体は結腸直腸癌患者での臨床試験で使用されている。例えば、１２３Ｉ標識キメラミニボディＴ８４．６６（ｃＴ８４．６６）は、結腸直腸癌患者のパイロット臨床試験で使用されている。放射標識されたミニボディは癌細胞を標的とすることができた（Wong J. Y.ら、 Clin Cancer Res. 10(15):5014-21, (2004)）。別の例では、（１３１）Ｉラベツズマブ、放射性標識化ヒト化抗ＣＥＡ抗体が、結腸直腸癌の肝転移患者におけるアジュバント免疫療法で試験され、有望な生存の優位性を与えることが判明した（Liersch T.,ら、 Ann. Surg. Oncol. 14(9):2577-90, (2007)）。
抗体グリコシル化
オリゴ糖成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する抵抗性、免疫系との相互作用、薬物動態学、及び特異的生物学的活性を含む、治療用糖タンパク質の効力に関連する特性に有意に影響を与える。このような特性は、オリゴ糖の存在又は非存在に依存するのみならず、オリゴ糖の特異的構造にもまた依存する可能性がある。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間のある程度の一般化がなされ得る。例えば、特定のオリゴ糖構造は、特異的炭水化物結合タンパク質との相互作用を通して血流からの糖タンパク質の急速なクリアランスを媒介するが、他の構造は、抗体によって結合され得、そして望ましくない免疫反応を誘発し得るJenkinsら、 Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996）。
哺乳動物細胞は、ヒト適用のための大部分の適合性の型においてタンパク質をグリコシル化するそれらの能力に起因して、治療用糖タンパク質の産生のための好ましい宿主である（Cummingら、 Glycobiology 1:115-30, 1991; Jenkinsら、 Nature Biotechnol. 14:975-981, 1996）。細菌は非常にまれに、タンパク質、ならびに酵母、糸状菌、昆虫、及び植物細胞などの一般的な宿主の同様の他の型をグリコシル化し、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、及びある特定の場合においては、減少した生物学的活性と関連したグリコシレーションパターンを生じる。哺乳動物細胞の間で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、過去２０年間の間に最も一般的に使用されてきた。適切なグリコシル化パターンを与えることに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定な、高度に生産的なクローン性細胞系の一貫した生成を可能にする。これらは、無血清培地を使用する単純なバイオリアクター中で高密度で培養され得、安全かつ再生可能なバイオプロセスの開発を可能にする。他の一般的に使用される動物細胞には、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０−及びＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞が含まれる。より最近では、トランスジェニック動物からの産生もまた試験されてきた（Jenkinsら、 Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996）。
全ての抗体は、重鎖定常領域の保存性位置に糖質構造を含み、各アイソタイプがＮ連結糖質構造の独特のアレイを有し、これはタンパク質のアセンブリー、分泌又は機能的な活性に様々に影響を与える（Wright A. 及び Morrison S. L., Trends Biotech. 15:26-32, 1997）。結合したＮ連結糖質の構造は、プロセシングの程度に依存して顕著に変化し、高マンノース、多分枝ならびに二分岐複合体オリゴ糖を含み得る（Wright, A., 及び Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32, 199７）。典型的には、特定のグリコシル化部位に結合されたコアオリゴ糖構造の均質でないプロセシングが存在し、その結果、モノクローナル抗体さえもが複数の糖型で存在する。同様に、抗体のグリコシル化における主要な違いは細胞系間で起こり、そしてマイナーな違いさえもが異なる培養条件下で増殖された所定の細胞系について見られることが示されてきた（Lifely, M. R.ら、 Glycobiology 5(8):813-22, 1995）。
単純な製造プロセスを維持しながら、かつ有意な、望ましくない副作用を回避しながら、効力の大きな増加を得るための１つの方法は、Umana,P.等、Nature Biotechnol.17:176-180(1999）及び米国特許第６６０２６８４号（これらの内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるような、それらのオリゴ糖を操作することによってモノクローナル抗体の天然の、細胞媒介性エフェクター機能を増強することである。癌免疫治療において最も一般的に使用される抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７において保存性Ｎ連結型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合された２つの複合体二分岐状オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に包埋されて、ポリペプチドバックボーンとの広範な接触を形成しており、それらの存在は、抗体が、抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために必須である（Lifely, M. R.,ら、 Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R.,ら、 Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. 及び Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997））。
Ｕｍａｎａらは以前に、チャイニーズハムスター卵巣細胞における、二分枝オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）の過剰発現が、操作されたＣＨＯ細胞によって産生される抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロＡＤＣＣ活性を増加させることを示した（Umana, P.ら、 Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)；及び国際公開番号ＷＯ９９／５４３４２を参照のこと、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）。抗体ｃｈＣＥ７は、結合体化されていないｍＡｂの大きなクラスに属し、これは、高い腫瘍親和性及び特異性を有するが、ＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く標準的な工業用細胞系において産生される場合には、効力が小さすぎて臨床的には有用でない（Umana, P.,ら、 Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)）。この研究は、ＡＤＣＣ活性の大きな増加が、ＧｎＴＩＩＩを発現するために抗体産生細胞を操作することによって得られ得、これはまた、二分枝でフコシル化されていないオリゴ糖を含む、定常領域（Ｆｃ）結合した二分枝性オリゴ糖の割合の増加を、天然に存在する抗体において見いだされるレベルよりも上に導くことを最初に示した。
ＣＥＡ、特に膜結合ＣＥＡを標的化する、増強された治療アプローチについての必要性が残っている。
本発明は、膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する抗体などの、変異型抗原結合分子（ＡＢＭ）を提供する。一実施態様において、ＡＢＭは、その親分子に比較して安定性が増加している。一実施態様において、ＡＢＭは、その親分子に比較して安定性が増加しており、膜結合ＣＥＡに対する結合親和性を維持し、又は改善している。一実施態様において、ＡＢＭは、その親分子よりも少なくとも０．５、１．０、１．５、又は２．０セ氏温度高い温度で安定である。一実施態様において、安定性の増加は、動的光散乱測定法を用いて測定される。幾つかの実施態様において、親の比較分子はＰＲ１Ａ３抗体又はＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型である。一実施態様において、親の比較分子は、重鎖可変領域ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）及び軽鎖可変領域２Ｆ１（配列番号２０９）を含む、ＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型である。一実施態様において、変異型抗原結合分子は、例えば動的光散乱測定法により測定される場合、６７セ氏温度以上で安定である。一実施態様において、変異型抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡにＫｄが１００ｎＭ以下で結合する。一実施態様において、変異型抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡにＫｄが１０ｎＭ以下で結合する。
一実施態様において、ＡＢＭは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む。一実施態様において、ＡＢＭは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、ＡＢＭの重鎖可変領域は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み；ＡＢＭの軽鎖可変領域は、配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＡＢＭはＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワーク残基を含む。
一実施態様において、ＡＢＭの重鎖可変領域は、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡＢＭの軽鎖可変領域は、配列番号２０９の配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＡＢＭの重鎖可変領域は、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＡＢＭの軽鎖可変領域は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、ＡＢＭは、Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む。ある実施態様において、ＡＢＭは、例えば、全抗体、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディなどの、抗体又はその断片である。
本発明の別の態様は、膜結合ＣＥＡに結合する単離された抗体を提供し、その抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様において、抗体は、その親分子に比較して安定性が増加している。一実施態様において、抗体は、その親分子よりも少なくとも０．５、１．０、１．５、又は２．０セ氏温度高い温度で安定である。一実施態様において、安定性の増加は、動的光散乱測定法を用いて測定される。幾つかの実施態様において、親の比較分子はＰＲ１Ａ３抗体又はＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型である。一実施態様において、親の比較分子は、重鎖可変領域ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）及び軽鎖可変領域２Ｆ１（配列番号２０９）を含む、ＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型である。一実施態様において、抗体は、例えば動的光散乱測定法により測定される場合、６７セ氏温度以上で安定である。一実施態様において、抗体は、膜結合ＣＥＡにＫｄが１００ｎＭ以下で結合する。一実施態様において、抗体は、膜結合ＣＥＡにＫｄが１０ｎＭ以下で結合する。
一実施態様において、抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施態様において、抗体の重鎖可変領域は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み；抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、抗体はＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワーク残基を含む。．一実施態様において、抗体の重鎖可変領域は、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２０９の配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、抗体の重鎖可変領域は、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、上記実施態様のＡＢＭ又は抗体は、マウスモノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３と同一のエピトープに結合するか、又は結合を競合することができる。
一実施態様において、ＡＢＭ又は抗体は、糖鎖を操作されているＦｃ領域を含む。一実施態様において、糖鎖を操作された抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％がフコシル化されていない。一実施態様において、糖鎖を操作されたＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が二分されている。一実施態様において、糖鎖を操作されたＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の少なくとも約２０％から約５０％が二分され、フコシル化されていない。一実施態様において、糖鎖を操作されたＡＢＭ又は抗体は、少なくとも一つの増加したエフェクター機能を有する。増加したエフェクター機能とは、例えば、Ｆｃレセプター結合親和性の増加、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシス、樹状細胞の成熟の増加、及びＴ細胞プライミングの増加である。一実施態様において、糖鎖を操作されたＡＢＭ又は抗体は、糖鎖を操作されていない親抗原結合分子と比較した場合、ＡＤＣＣが少なくとも約４０％から約１００％増加している。
本発明の別の態様は、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の別の態様は、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明の別の態様は、このベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の別の態様は、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体を含む組成物、及び薬学的に許容可能な担体を提供する。
本発明の別の態様は、腫瘍細胞を、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体と接触させることを含む、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法を提供する。幾つかの実施態様において、腫瘍細胞は、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌細胞、膵臓癌、及び乳癌である。一実施態様において、細胞溶解は、ＡＢＭ又は抗体の抗体依存性細胞傷害により誘導される。
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常に発現する癌を有する被験体を治療する方法を提供を提供し、該方法は、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体の治療的有効量を被験体に投与することを含む。
本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常に発現する癌を有する被験体の生存時間を増加させる方法を提供を提供し、該方法は、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体の治療的有効量を被験体に投与することを含む。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌、又は乳癌である。
これらの方法のある実施態様において、ＡＢＭ、抗体、又は組成物は、化学療法又は放射線療法との併用で投与される。一実施態様において、被験体はヒトである。
本発明の別の態様は、異常にＣＥＡを発現する癌を有する被験体を治療するための医薬の製造において、上述された実施態様の何れかのＡＢＭ又は抗体の使用を提供する。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌、及び乳癌からなる群から選択される。
図１は、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５、ＣＤ６６ｅ）抗原の模式図を示す。ＰＲ１Ａ３抗体は、細胞膜に結合している場合、抗原のＢ３ドメインに特異的に結合する。 図２は、エフェクターとしてヒトＰＢＭＣを用いる場合、糖鎖を操作されていないキメラＰＲ１Ａ３抗体と比較して、糖鎖を操作されたキメラＰＲ１Ａ３抗体の強化されたＡＤＣＣ活性を示す。 キメラＰＲ１Ａ３抗体と比較して、重鎖可変領域コンストラクト、ＣＨ７Ａ、及び軽鎖可変領域コンストラクト、ＣＬ１Ａを含むヒト化ＰＲ１Ａ３抗体の抗原結合活性を示す。 図４は、ヒト化ＰＲ１Ａ３抗体軽鎖の親和性成熟のために抗体ライブラリーを生成するためのランダム化部位を示す。Ｘが付いている位置が無作為に割り付けられた。 図５は、ヒト化ＰＲ１Ａ３抗体重鎖の親和性成熟のために抗体ライブラリーを生成するためのランダム化部位を示す。Ｘが付いている位置が無作為に割り付けられた。 図６は、重鎖可変領域コンストラクトＣＨ７ＡｒＦ９及び軽鎖可変領域コンストラクトＣＬ１ＡｒＨ１１を含む、ヒト化ＰＲ１Ａ３抗体由来の親和性成熟抗ＣＥＡ抗体の結合活性を示す。 図７は、同所腫瘍モデルを持つためにＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌細胞を脾臓内投与されたＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおける有効性試験の結果を示す。抗体療法は、２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で抗体の注射により７日後に開始され、その後２回追加の毎週の注射が続いた。「ＣＨ７Ａ」は本明細書に記載されるようにＰＲ１Ａ３のＣＤＲを含むヒト化抗体を表している。「ＳＭ３Ｅ」は、以前に生成された抗ＣＥＡ抗体を指す。「ＧＡ２０１」はポジティブコントロールとして使用されたヒト化抗ＥＧＦ抗体を表している。「ＰＢＳ」はネガティブコントロールとして使用されたリン酸緩衝生理食塩水を指す。生存はスイスの規制当局によって定義された終了基準に従って測定された。 図８は、Ａ５４９肺癌細胞を静脈内注射されたＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおける有効性試験の結果を示しており、腫瘍は動物の肺に生着する。抗体療法は、２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で抗体の注射により７日後に開始され、その後２回追加の毎週の注射が続いた。「ＣＨ７Ａ」、「ＳＭ３Ｅ」、及び「ＧＡ２０１」は上記のように、図７に記載されている。「ＣＨ７ＡｒＦ９ ＣＬ１Ａ ｒＨ１１」なる記号は、親和性成熟重鎖及び軽鎖を持つＣＨ７Ａ抗体変異体を表している。「ｇｅ」なる記号は、抗体が糖鎖を操作されて、そのＦｃ領域にフコシル化オリゴ糖の還元数を有していることを示している。「ビークル」はネガティブコントロールを指す。Ａ５４９肺癌細胞ではＥＧＦＲ発現に対して強陽性であり、ＣＥＡ発現に対して弱陽性である。 図９は、ＭＫＮ４５胃癌細胞を脾臓内に投与されたＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおける有効性試験の結果を示しており、動物の肝臓に腫瘍の転移を生成する。「ＣＨ７ＡｒＦ９ ＣＬ１Ａ ｒＨ１１」、「ＳＭ３Ｅ」、「ｇｅ」、及び「ＰＢＳ」は、上記のように、図７及び８に記載されている。 図１０は、親和性成熟したクローンの動態解析を示している。（ａ）は、非成熟軽鎖ＣＬ１Ａ（配列番号１０５）とともに、親和性成熟重鎖のＣＨ７Ａ Ｈ４Ｅ９（配列番号１９９）；非成熟重鎖ＣＨ７Ａと組み合わせた、親和性成熟軽鎖のＣＬ１Ａ ｐＡＣ１８（配列番号２０９）；及びその組合わせの、ＣＨ７Ａ Ｈ４Ｅ９及びＣＬ１Ａ ｐＡＣ１８（配列番号：１９９及び２０９）による抗ＣＥＡ Ｆａｂのセンサーグラムを示す。（ｂ）親和性成熟クローンの動態解析の概要。 図１１は、ヒト化ＣＨ７Ａ抗ＣＥＡ抗体重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２無作為化のためのＰＣＲ戦略の図式的概観を示している。 図１２は、ヒト化ＣＬ１Ａ抗ＣＥＡ抗体軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２無作為化のためのＰＣＲ戦略の図式的概観を示している。 図１３は、ヒト化ＣＨ７Ａ抗ＣＥＡ抗体重鎖のＣＤＲ３無作為化のためのＰＣＲ戦略の図式的概観を示している。 図１４は、ヒト化ＣＬ１Ａ抗ＣＥＡ抗体軽鎖のＣＤＲ３無作為化のためのＰＣＲ戦略の図式的概観を示している。 図１５は、ＭＫＮ４５標的細胞上の膜結合ＣＥＡに対する抗ＣＥＡ抗体の結合親和性を示している。ＩｇＧへ変換された親和性成熟軽鎖（パネルＡ、ＣＨ７Ａ，ＣＬ１ＡｒＨ７、又はＣＨ７Ａ、ＣＬ１ＡｒＨ１１）又は親和性成熟重鎖及び軽鎖（パネルＢ、ＣＨ７Ａ ｒＢ９、ＣＬ１Ａ ｒＨ１１ Ｇ２（１））の何れかを持つヒト化抗ＣＥＡ抗体はコントロール抗体（ＣＨ７Ａ、ＣＬ１Ａ）と比べて結合の向上を示している。 図１６は、コントロール抗体（ＣＨ７Ａ、ＣＬ１Ａ Ｇ２（Ｒ２））に比べた、親和性成熟抗体（ＣＨ７ＡｒＢ９、ＣＬ１Ａ ｒＨ１１Ｇ２（１）、ＣＨ７Ａｒｆ９、ＣＬ１Ａ ｒＨ１１Ｇ２（１）、及びＣＨ７Ａ、ＣＬ１Ａ ｒＨ１１ Ｇ２（１））による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を試験するアッセイの結果を示す。 図１７は、マウス−ヒトキメラ抗体ｃｈＰＲ１Ａ３と比較して、重鎖ＣＨ１Ａを持つ抗ＣＥＡ抗体の細胞結合アッセイの結果を示す。 図１８は、重鎖ＣＨ１Ａ、ＣＨ１Ａ２、ＣＨ１Ａ３，又はＣＨ１Ａ４、及び軽鎖２Ｆ１を持つ抗ＣＥＡ抗体の細胞結合アッセイの結果を示す。 図１９は、重鎖ＣＨ１Ａ、ＣＨ１Ａ２、ＣＨ１Ａ３，又はＣＨ１Ａ４を持つ抗ＣＥＡ抗体の安定性のアッセイの結果を示す。 図２０は、ＣＨ１Ａ１から生成された抗ＣＥＡ抗体についての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析の結果を示す。 図２１は、ＣＨ１Ａ１から生成された抗ＣＥＡ抗体についての細胞結合アッセイの結果を示す。 図２２は、親の５ＨＦＦ１２重鎖と比較して、安定性を操作された抗ＣＥＡ抗体の（二価形態で測定される場合の）親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定の結果を示す。 図２３と２４は、５ＨＦＦ１２において選択され、導入された個々の点変異を持つその親の重鎖ＣＨ７Ａと比較して、親和性成熟抗体５ＨＦＦ１２についての安定性アッセイの結果を示す。 図２５は、フレームワークとＣＤＲ−Ｈ３変異体の組み合わせの面プラズモン共鳴解析を示す。 図２６は、ＣＨＡ１Ａをベースにしたフレームワーク変異体のＡＤＣＣ活性を示す。 図２７は、ＣＨＡ１Ａをベースにしたフレームワーク変異体のＡＤＣＣ活性を示す。 図２８は、フレームワークとＣＤＲ−Ｈ３変異体の組み合わせのＡＤＣＣ活性を示す。 図２９は、フレームワークとＣＤＲ−Ｈ３変異体の組み合わせのＡＤＣＣ活性を示す。 図３０は、ヒトＣＤ１６の遺伝子導入ＳＣＩＤマウスの結腸直腸癌の異種移植モデルにおける、糖鎖を操作された抗ＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）ｘ２Ｆ１の有効性を示す。 図３１は、ヒトＣＤ１６の遺伝子導入ＳＣＩＤマウスのＡ５４９肺癌の異種移植モデルにおける、糖鎖を操作された抗ＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）ｘ２Ｆ１の有効性を示す。 図３２は、様々な抗ＣＥＡ ＡＢＭについてのＣＤＲのアミノ酸配列を示す。 図３３は、様々な抗ＣＥＡ ＡＢＭについての軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示す。 図３４Ａ−Ｃは、親和性成熟重鎖及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、及び関連する結合親和性を示す。 図３５は、様々な親和性成熟抗体配列の親和性定数を示す。 図３６は、様々な抗ＣＥＡ ＡＢＭについてのＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列を示す。 図３７Ａ−Ｃは、様々な抗ＣＥＡ ＡＢＭについてのＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。 図３８は、様々な安定性が成熟した抗ＣＥＡ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。
発明の詳細な記述
定義
本明細書において用いられる用語は、下記に別に定義されていなければ、一般的に当該技術分野で用いられている。
本明細書で使用される場合、用語、抗原結合分子とは、その最も広い意味において、抗原決定基を特異的に結合する分子をいう。抗原結合分子の非限定的な例では、抗原特異的な結合を保持する抗体又はその断片である。より具体的には、膜結合ヒト癌胎児性抗原 (ＣＥＡ) を結合する抗原結合分子は、ＣＥＡに対して、より具体的には細胞表面から切断された可溶性ＣＥＡではなく、細胞表面又は膜結合ＣＥＡに対して特異的に結合するＡＢＭである。「特異的に結合する」によって、結合が抗原について選択的であり、かつ望ましくない又は非特異的な相互作用から区別され得ることが意味される。
本明細書で使用される場合、用語、「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び多特異性（例えば、二特異性）抗体を含む全体の抗体分子、ならびにＦｃ領域を有しかつ結合特異性を保持している抗体断片、及び免疫グロブリンのＦｃ領域に等価である領域を含みかつ結合特異性を保持している融合タンパク質を含むことが意図される。また包含されるのは、限定されないが、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ（minibodies）、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、及びテトラボディ（tetrabodies）を特に含む、結合特異性を保持した抗体断片である(例えば、Hudson 及び Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)を参照)。
本明細書で使用される場合、用語、「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ相補的である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合には、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分に結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体の可変ドメインにより与えられ得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書で使用される場合、用語、「親和性成熟」は、抗原結合分子（例えば抗体）との関連で、例えば突然変異により参照抗原結合分子から由来し、参照抗体と同じ抗原に結合し、好ましくは同じエピトープに結合し、参照抗原結合分子のそれよりも抗原に対して高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は一般的に抗原結合分子の１以上のＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾が含まれる。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、初期の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
本明細書で使用される場合、用語、「結合親和性」は、一般的に会合平衡又は解離定数を単位として表わされ（それぞれＫａ又はＫｄ）、それらは順に解離速度定数及び会合速度定数（それぞれｋｄ及びｋａ）の逆比である。従って、等価な親和性は速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語、「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに異なる可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基からカルボキシル末端までに広がると通常定義される。
本明細書で使用される場合、用語、「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価である領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに置換、付加、又は欠失を生じるが、免疫グロブリンがエフェクター機能を媒介する能力（抗体依存的な細胞傷害性）を実質的に減少しない変化を有する変異体を含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸が、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能の実質的な損失を伴うことなく、欠失され得る。このような変異体は、活性に対して最小限の効果を有するように、当分野において公知である一般的規則に従って選択され得る（例えば、Bowie, J. U.ら、 Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、用語、「膜結合ヒトＣＥＡ」は、細胞の膜の部分に、又は細胞の表面、特に腫瘍細胞の表面に結合するヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を指す。用語、「膜結合ヒトＣＥＡ」は、所定の状況において、細胞の膜に結合しないが、ＰＲ１Ａ３抗体が結合するエピトープを保持するように構築されたＣＥＡを指す場合がある。「可溶性ＣＥＡ」は、細胞膜又は細胞表面（例えば、腫瘍細胞表面）に結合していないか又は切断され、及び／又はＰＲ１Ａ３抗体に結合されたコンフォメーションエピトープを保持しないヒト癌胎児性抗原を指す。可溶性ＣＥＡは、例えば、癌患者の血流又はリンパ管に見いだされる。
本明細書で使用される場合、用語、「可溶性ＣＥＡに対する交差反応性が実質的に無い」とは、分子（例えば、抗原結合分子）が、特に膜結合ＣＥＡと比較した場合に、可溶性ＣＥＡを認識しないか又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗原結合分子が約１０％未満から約５％未満の可溶性ＣＥＡに結合する場合があり、又は約１０％、９％、８％７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％又は０，５％未満の可溶性ＣＥＡに、及び最も好ましくは約０．２％又は０，１％未満の可溶性ＣＥＡから成る群から選択される量において可溶性ＣＥＡに結合しうる。
本明細書で使用される場合、用語、「融合物」又は「キメラ」は、ＡＢＭなどのポリペプチドに関連して使用される場合、異なる種からの抗体の部分などの２つ以上の異種ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。キメラＡＢＭについては、例えば、非抗原結合成分が、チンパンジー及びヒトなどの霊長類を含む広範な種々の種に由来されてもよい。キメラＡＢＭの定常領域は、一般的に、天然のヒト抗体の定常領域と実質的に同一であり；キメラ抗体の可変領域は、一般的に、マウスＰＲ１Ａ３可変領域のアミノ酸配列を有する組換え抗ＣＥＡ抗体に由来する配列を含む。ヒト化抗体は、特に好ましい融合抗体又はキメラ抗体の型である。
本明細書で使用される場合、用語、「ヒト化」は、親の分子の抗原結合特性を保持するか又は実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性が低い非ヒト抗原結合分子、例えば、マウス抗体に一部が由来する抗原結合分子をいうために使用される。これは、(ａ)キメラ抗体を生成するためにヒト定常領域に全体の非ヒト可変ドメインを移植すること、(ｂ)決定的なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要であるもの）の保持を伴うかもしくは伴わない、ヒト（例えば、レシピエント抗原結合分子）フレームワーク及び定常領域に非ヒト（例えば、ドナー抗原結合分子）ＣＤＲのみを移植すること、又は（ｃ）全体の非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分でそれらを「覆う」ことを含む種々の方法によって達成され得る。このような方法は、Jonesら、 Morrisonら、 Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison 及び Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyenら、 Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)において開示されており、これらの全ては、それらの全体が本明細書に参照として組み込まれる。一般的に、３つの相補性決定領域、すなわちＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々に存在し、これらは、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々において４つのフレームワークサブ領域（すわわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）によって隣接されている。ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ヒト化抗体の議論は、とりわけ、米国特許第６，６３２，９２７号及び米国出願公開第２００３／０１７５２６９号に見いだされ得、これらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト化は、また選択したフレームワーク上に与えられたＣＤＲに対する特異性決定アミノ酸残基をのみを含む切断されたＣＤＲを移植することによって達成することができる。「特異性を決定する残基」は、抗原との特異的相互作用に直接関与するか、及び／又は抗原特異的結合に必要な残基を意味する。一般的に、所定のＣＤＲにおける残基の約５分の１から３分の１のみが抗原への結合に関与する。特定のＣＤＲにおける特異性決定残基は、例えば、三次元モデリングからの原子間接触の計算及びPadlanら、 FASEB J. 9(1):133-139 (1995)（この内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従って、所定の残基の位置における配列の変動性の決定によって同定され得る。
いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗原結合分子は、レシピエント抗体又はドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、更に抗原結合分子の性能を洗練するために作られている。一般的に、ヒト化抗原結合分子は、可変ドメインの少なくとも一つ、及び典型的には２つの全てを実質的に含むことができ、そのうち可変領域の少なくとも一つ、又は実質的に全て、又は全ては非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、かつＦＲの全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト抗原結合分子はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含んでなる。例えば、Jonesら、 Nature 321:522-525 (1986); Reichmannら、 Nature 332:323-329 (1988); 及び Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
同様に、本明細書で使用される場合、用語、「霊長類化」は、親の分子の抗原結合特性を保持するか又は実質的に保持するが、霊長類において免疫原性が低い非霊長類抗原結合分子、例えば、マウス抗体に由来する抗原結合分子をいうために使用される。
本明細書で使用される場合、用語、「変異体」（又はアナログ）とは、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された、挿入、欠失、及び置換によって、本発明の特に列挙されるポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。具体的には、これらの同一又は類似のポリペプチドをコードする組換え変異体は、遺伝子コードの 「冗長性」を利用することにより、合成又は選択することができる。種々の制限部位を生成するサイレント変化などの様々なコドン置換が、特定の原核生物又は真核生物システムのプラスミド又はウイルスベクターへのクローニング又は発現を最適化するために導入することができる。ポリヌクレオチド配列の変異は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、又は分解/代謝回転速度などの特性を変更するために、ポリペプチドの任意の部分の特性を改変するためにポリペプチドに追加された他のペプチドのポリペプチド又はドメインに反映され得る。
本明細書で使用される場合、用語、「変異体抗ＣＥＡ抗原結合分子」とは、親抗体配列において、１つ又は複数のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換のために「親」抗ＣＥＡ抗原結合分子のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を意味する。特定の実施態様において、変異体は、１つ又は複数の超可変領域又は親の抗原結合分子の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。例えば、変異体は、親抗原結合分子の１つ又は複数の超可変領域又はＣＤＲ（すなわち、１、２、３、４、５、又は６の超可変領域又はＣＤＲ）において、少なくとも一つ、例えば約１から約１０（すなわち、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、及び好ましくは約２から約５つの置換を含み得る。変異体抗ＣＥＡ抗原結合分子はまた、重鎖又は軽鎖のいずれかの１つ又は複数のフレームワーク領域内に、１つ又は複数の付加、欠失及び／又は置換を含み得る。通常、変異体は、親の抗原結合分子重鎖又は軽鎖可変ドメイン配列と、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を持ち、典型的には少なくとも約８０％、９０％、９５％又は９９％である。本明細書では配列に関する同一性は、最大パーセントの配列同一性を達成するために、必要に応じてギャップを導入し、配列をアラインした後、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。抗体配列のＮ末端、Ｃ末端、又は内部伸張、欠失、又は挿入は、配列同一性又は相同性に影響を及ぼすものと解釈してはならない。変異体抗原結合分子は膜結合ヒトＣＥＡに結合する能力を保持する。一実施態様において、抗ＣＥＡ ＡＢＭは、親抗原結合分子のそれと同じエピトープに結合する。一実施態様において、抗ＣＥＡ ＡＢＭは、親抗原結合分子と、膜結合ヒトＣＥＡに対する結合を競合する。一実施態様において、抗ＣＥＡ ＡＢＭは、膜結合ＣＥＡヒトＣＥＡに結合するが、可溶性ヒトＣＥＡには結合しない。抗ＣＥＡ ＡＢＭは、親抗原結合分子のそれらに対して優れた特性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性、増加した安定性、及び／又はインビトロ、及びインビボで抗体依存性細胞傷害を誘導する強化された能力を有する場合がある。一実施態様において、抗ＣＥＡ ＡＢＭは、安定性が増加し、膜結合ＣＥＡに対する結合親和性を保持する又は改善させており、インビトロ及びインビボにおいて抗体依存性細胞傷害を誘導する強化された能力を保持する又は有する。そのような特性を分析するために、一般に、変異体抗原結合分子と親の抗原結合分子を同じ形態で；例えば、変異体抗原結合分子のＦａｂ形態を親の抗原結合分子に対して、又は変異体抗原結合分子の完全長形態を親の抗原結合分子の完全長形態に対して、比較するべきである。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、親の抗原結合分子に対して比較したとき、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍生物学的活性が増強している。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、親の抗原結合分子に比較して、安定性が増加した、安定性を操作された変異体である。安定性は、当技術分野で公知の任意の方法によって、及び本明細書に記載された方法、具体的には実施例３−６に記載される方法によって、アッセイすることができる特定の実施態様において、変異体抗原結合分子は、親の抗原結合分子に対して比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、４０倍、５０倍又は１００倍、安定性が増加している。
幾つかの実施態様において、変異体抗原結合分子は、親の抗原結合分子に対して比較して、安定性のパラメーターの変化として測定される安定性の増加を示す。幾つかの実施態様において、変異体抗原結合分子は、親の抗原結合に比較した場合、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、４０倍、５０倍又は１００倍、安定性のパラメーターの変化を有する。安定性のパラメーターとは、例えば、変異体抗原結合分子が、変異体抗原結合分子を不安定な状態にするように設計された条件下で、アンフォールドする又は変性する温度、変異体抗原結合分子がアンフォールドする又は変性する圧力、又は変異体抗原結合分子が変性する又アンフォールドするのに要求される時間である。、一実施態様において、安定性が増加は、熱変性アッセイによって、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定される。一実施態様において、安定性の増加は、化学変性アッセイを用いて測定される。一実施態様において、安定性の増加は、高圧アッセイを用いて測定される。別の実施態様において、変異体抗原結合分子の安定性は、蛍光偏光アッセイを用いて決定される。一実施態様において、変異体抗原結合分子の安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）アッセイを用いて決定される。（実施例、及びNobbmann, U. et al., Biotech. Genetic Eng. Rev. 24:117-128 (2007)を参照）。ＤＬＳは、抗体などの分子の完全性を監視し、ここで、一般的には、光散乱の増加は、タンパク質のアンフォールディング又は変性を示している。分子のＤＬＳは、相対的安定性を比較するために、温度又は化学変性剤の関数として調べることができる。天然型コンフォーメーションのままであるそれらの分子（ＤＬＳ特性の増加がほとんど無いか又は全く無い）は、試験条件下で安定であると考えられている。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、動的光散乱測定法を用いて分析すると、親のＡＢＭよりも、又は他の適切な参照分子よりも、少なくとも０．２５，０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，６．０，７．０，８．０，９．０，又は１０．０セ氏温度高い温度で安定である。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０セ氏温度以上で安定である。熱安定性は、例えば、ＤＬＳ、ＤＳＣ、又は蛍光偏光を用いて測定することができる。一実施態様において、変異体抗原結合分子の熱安定性は、ＤＬＳを用いて測定される。一実施態様において、ＤＬＳアッセイは、２０ｍＭのヒスチジンと１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０の緩衝液中で、１ｍｇ／ｍｌのＡＢＭ又は変異体ＡＢＭを用いて実施される。ＤＬＳアッセイは、２５℃で開始し、０．０５℃／分の増分温度上昇を伴い、行われる。
用語「親」抗原結合分子は、変異体の調製のための開始点又は基礎として使用されるＡＢＭを指す。特定の実施態様では、親の抗原結合分子は、ヒトフレームワーク領域及びび、存在する場合には、ヒト抗体定常領域を持つ。例えば、親抗体は、ヒト化又はヒト抗体であり得る。
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、すなわち、保存性アミノ酸置換の結果である。「保存性」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ；正電荷を有する（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ；ならびに負電荷を有するアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「挿入」又は「欠失」は、一般的には、約１から約２０アミノ酸、より明確には約１から約１０アミノ酸、更により明確には約２から約５アミノ酸の範囲である。非保存的置換は、別のクラスのためにこれらのクラスのいずれかのメンバーを交換することを伴う。例えば、アミノ酸置換はまた、一つのアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換える結果となる可能性があり、例えば、一つのグループ（例えば極性）由来のアミノ酸を異なるグループ（例えば、塩基性）由来の別のアミノ酸で置換する。許容されるバリエーションは、組換えＤＮＡ技術を使用して、及び活性について得られる組換え変異体をアッセイして、ポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に作製することによって、実験的に決定され得る。
本明細書で使用される場合、用語、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、単一のポリペプチド鎖としてＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体断片を指す。典型的には、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカー配列によって結合されている。Pluckthun, in: The PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg 及び Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
本明細書で使用される場合、用語、「ミニボディ」とは、二量体化領域として、定常領域、典型的には免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。一般的には、定常領域はヒンジ領域及び／又はリンカー領域を介してｓｃＦｖに連結されている。ミニボディタンパク質の例はHu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-61に見いだすことができる。
本明細書で使用される場合、用語、「ダイアボディ」とは、二つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補ドメインと対を成すよう強制され、２つの抗原結合部位を作成する。ダイアボディは例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号; Hollingerら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により詳細が記載されている。トリアボディは３つのｓｃＦｖの３価のトリマーの形成から生じ、３つの結合部位を与え、テトラボディは４つのｓｃＦｖの４価のテトラマーであり、４つの結合部位をもたらす。
当分野において使用され、及び／又は受容される１つの用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書で使用される用語の定義は、明白に反対のことが言及されない限り、全てのこのような意味を含むことが意図される。特定の例は、重鎖と軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域中に見いだされる不連続抗原組み合わせ部位（抗原結合部位としても知られる）を説明するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。ＣＤＲはまた、「超可変領域」としても言及され、その用語は本明細書では抗原結合領域を形成する可変領域の部分を参照する用語「ＣＤＲ」と同義的に使用される。この特定の領域は、Kabatら、 U.S. Dept. of Health 及び Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 及び Chothiaら、 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によって記載されており、これらは参照により本明細書に援用され、ここでこの定義は、互いに対して比較した場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲをいうためのいずれの定義の適用も、本明細書で定義され、及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記に引用した参考文献の各々によって定義されたＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基は、比較として表１において以下に記載される。特定のＣＤＲを含む正確な残基の番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列についての番号付けを定義した。当業者は、配列それ自体を超えたいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメインに「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを明白に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabatら、 U.S. Dept. of Health 及び Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって示される番号付けシステムをいう。他に特定されない限り、ＡＢＭ中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムに従う。配列表の配列（すなわち、配列番号１から配列番号２１６）は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかし、当業者は、配列表の配列をＫａｂａｔの番号付けに変換する方法に精通している。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸又はヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５個までの点変異を含んでもよいこと以外は、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失されるかもしくは別のヌクレオチドで置換されてもよく、または参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照ヌクレオチドに挿入されてもよい。
実際問題として、任意の特定の核酸分子又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法は、Brutlagら、 Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいては、問い合わせ配列及び対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。前記グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは以下である。マトリックス＝単一、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティー＝１、結合ペナルティー＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。
内部の欠失のためではなく、５’欠失又は３’欠失のために対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対して行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを計算する場合に、対象配列の５’及び３’短縮を計算に入れないからである。５’末端又は３’末端で短縮されている対象配列については、問い合わせ配列と比較して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の全体の塩基のパーセントとして一致／アラインしない、対象配列の５’及び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／アラインされるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージが、同一性パーセントから減算され、特定のパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／アラインしない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示されるような、対象配列の５’塩基及び３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために計算される。
例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基の問い合わせ配列とアラインされる。欠失は対象配列の５’末端で起こり、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端における最初の１０塩基の一致／アラインメントを示さない。この１０個の対合しない塩基は配列の１０％を表し（一致しない５’末端及び３’末端の数／問い合わせ配列における塩基の総数）、従って、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０塩基が完全に一致するならば、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が１００塩基の問い合わせ配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／アラインしない、対象の５’末端又は３’末端上の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手動で補正されない。再度、問い合わせ配列と一致／アラインしない対象配列の塩基の５’及び３’のみが、手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためには行われない。
本発明の問い合わせアミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象のポリペプチドのアミノ酸配列が、対象のポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたりに５個までのアミノ酸の変化を含んでもよいこと以外は、問い合わせ配列と同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中の５％までのアミノ酸残基が挿入、欠失、又は別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で、又は参照配列中の残基間に個々に、もしくは参照配列中の１つ以上の連続する基においてのいずれかで散在して、これらの末端間の任意の位置に存在してもよい。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、参照ポリペプチドに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法は、Brutlagら、 Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントにおいては、問い合わせ配列及び対象配列は両方ともヌクレオチド配列であるか、又は両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは以下である。マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティー＝１、結合ペナルティー＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。
内部の欠失のためではなく、Ｎ末端欠失又はＣ末端欠失のために対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対して行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体同一性パーセントを計算する場合に、対象配列のＮ末端及びＣ末端短縮を計算に入れないからである。Ｎ末端又はＣ末端で短縮されている対象配列については、問い合わせ配列と比較して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の全体の塩基のパーセントとして、対応する対象の残基と一致／アラインしない、対象配列のＮ末端及びＣ末端である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。残基が一致／アラインされるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージが、同一性パーセントから減算され、特定のパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／アラインしない、対象配列のＮ末端及びＣ末端への残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のためのものと見なされる。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端及びＣ末端の残基の外側の位置の問い合わせ残基のみである。
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列とアラインされる。欠失は対象配列のＮ末端で起こり、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。この１０個の対合しない残基は配列の１０％を表し（一致しないＮ末端及びＣ末端の数／問い合わせ配列における残基の総数）、従って、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０残基が完全に一致するならば、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が１００残基の問い合わせ配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／アラインしない、対象配列のＮ末端又はＣ末端上の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手動で補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢによって示されるような、問い合わせ配列と一致／アラインしない、対象配列の残基のＮ末端及びＣ末端のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためには行われない。
ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの同一性パーセントは、プログラムに示されているデフォルトのパラメータで、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を通じて利用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定することができる。
本明細書で使用される場合、本発明の核酸配列に「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」核酸とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ 変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃での一晩インキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でフィルター洗浄が続く、指定された条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。
本明細書で使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性」を有するポリペプチドとは、Ｎ連結オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ連結マンノシドへのβ−１−４結合におけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒することができるポリペプチドをいう。これは、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、用量依存性を伴って又は伴わずに、国際生化学分子生物学連合の命名委員会 (ＮＣ-ＩＵＢＭＢ)に従うβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）としても知られている、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に類似しているが、同一である必要はない酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在する場合において、これは、ＧｎＴＩＩＩのそれと同一である必要はないが、むしろ、ＧｎＴＩＩＩと比較して、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩと比較して、より高い活性又は約２５分の１以下、及び好ましくは、約１０分の１以下の活性、及び最も好ましくは、約３分の１以下の活性を示す）。
本明細書で使用される場合、用語、「ゴルジ局在化ドメイン」とは、ゴルジ複合体中の部位へポリペプチドを固定することに関与する、ゴルジ存在性ポリペプチドのアミノ酸配列をいう。一般的に、局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「テール」を含む。
本明細書で使用される場合、用語、「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異体のＦｃ領域）に起因し得る生物学的活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、Ｆｃレセプター結合親和性、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込み、細胞表面レセプターのダウンレギュレーションなどが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語、「操作する」、「操作された」、「操作すること」、とりわけ、接頭辞の「ｇｌｙｃｏ−」が付いた用語、ならびに「グリコシル化操作」は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと見なされる。グリコシル化操作には、細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変化を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作を含む。さらに、グリコシル化操作は、グリコシル化に対する変異及び細胞環境の影響を含む。一実施態様において、グリコシル化操作は、糖転移酵素活性の変化である。特定の実施態様では、操作が変更されたグルコサミニル転移酵素活性及び／又はフコース転移酵素活性をもたらす。
本明細書で使用される場合、用語、「宿主細胞」は、本発明のポリペプチド及び抗原結合分子を生成するために操作され得る任意の種の細胞系を網羅する。一実施態様において、宿主細胞は、修飾されたグリコフォームを有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作される。好ましい実施態様において、抗原結合分子、又は変異体抗原結合分子は、抗体、抗体断片、又は融合タンパク質である。所定の実施態様において、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する１つ以上のポリペプチドのレベルの増加を発現するようにさらに操作されている。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、ほんの少し例を挙げれば、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞など、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養した植物もしくは動物の組織中に含まれる細胞もまた含まれる。
本明細書で使用される場合、用語、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性」は、抗体依存性細胞毒性、及びヒトＦｃ領域を含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質により媒介される細胞障害を含む。それは 「ヒト免疫エフェクター細胞」による「標的化細胞」の溶解につながる免疫機構である。
本明細書で使用される場合、用語、「ヒト免疫エフェクター細胞」は、それらが抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域にそれを通して結合する、それらの表面上のＦｃレセプターを表示し、及びエフェクター機能を実行する白血球の集団である。このような集団には、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれ得るがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語、「標的化細胞」は、Ｆｃ領域を含む抗原結合分子（例えば、Ｆｃ領域を含む抗体又はその断片）又はＦｃ融合タンパク質によって特異的に結合される細胞である。抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を通して標的細胞に結合する。
本明細書で使用される場合、用語、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加」は、標的細胞を取り囲む培地中で、上に定義されたＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムによって、所定の時間内に、所定の抗原結合分子もしくＦｃ融合タンパク質の濃度で溶解される「標的化細胞」の数の増加、及び／又はＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムによって、所定の時間内に、所定の数の「標的化細胞」の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗原結合分子もしくはＦｃ融合タンパク質の濃度の減少のいずれかとして定義される。Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に公知である）を使用して、同じ抗原結合分子、又は同じ型の宿主細胞によって生産されるＦｃ融合タンパク質により媒介される細胞障害性に比例するが、これは、本明細書に記載される方法によって、改変されたグリコシル化型を有するように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩ又は他のグリコシルトランスフェラーゼを発現するように）操作された宿主細胞によって産生されなかった。
「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する抗体」によって、その用語が本明細書で定義される通り、当業者に公知である任意の適切な方法によって決定される、ＡＤＣＣの増加を有する抗原結合分子が意味される。１つの受容されるインビトロＡＤＣＣアッセイは以下の通りである。
１）このアッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する；
２）このアッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）このアッセイは以下のプロトコールに従って使用される。
ｉ）ＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離手順を使用して単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中、５×１０6細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）標的細胞を、標準的な培養方法によって増殖させ、９０％よりも高い生存度を有する指数増殖期から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの51Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、そして１０5細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に再懸濁する；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終的な標的細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、細胞培養培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで段階希釈し、得られる抗体溶液の５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に加えて、上記の全体の濃度範囲を網羅する種々な抗体濃度を３通りで試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルは、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルの２％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の水溶液を受容する；
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルに、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を受容する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心分離し、そして１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記の要点ｉ）を各ウェルに加えて２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、そしてプレートをインキュベーター中、５％ ＣＯ2大気、３７℃下に４時間配置する；
ｉｘ）各ウェルからの無細胞上清を収集し、実験的に放出された放射能をガンマカウンターを使用して定量する；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、計算式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００に従って各抗体について計算し、ここで、ＥＲは抗体濃度について定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記の要点ｖを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、そしてＳＲはＳＲコントロール（上記の要点ｖｉを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）である；
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増加、及び／又は上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、上記のアッセイを用いて測定される、当業者に公知である同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生される、同じ型の抗体によって媒介されるＡＤＣＣに比例するが、これは、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞によって産生されなかった。
抗ＣＥＡ抗原結合分子、ペプチド及びポリヌクレオチド
ＣＥＡは、長い間診断目的のために癌マーカーとして使用されている。それは同一の細胞型の非腫瘍組織に比べて多くの腫瘍組織内において異常に発現される（例えば、細胞内で異なるパターンで過剰発現されるか及び／又は分布している）。しかしながら、ＣＥＡは、一般的に腫瘍細胞表面から切断され、使用可能な抗ＣＥＡ抗体のほとんどはまた、可溶性ＣＥＡに結合されているので、ＣＥＡに対する非抱合型抗体は一般に、治療目的のために使用されてはいない。たとえば、現在パイロット試験にある抗ＣＥＡ抗体は放射抱合体として投与される (Wongら、2004; Lierschら、 2007)。いくつかのメカニズムは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む抗ＣＥＡ抗体の治療効果に関与している。ＣＥＡの発現の増大は癌細胞の転移につながる細胞間接着の増加を促進する(Marshall J., Semin Oncol. 30(3) 補足 8:30-36)。したがって、抗ＣＥＡ抗原結合分子はまた、ＣＥＡ介在細胞接着及び癌細胞の転移の阻害に重要な役割を果たす可能性がある。
一態様において、本発明は、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、又は６）のマウスＰＲ１Ａ３抗体のＣＤＲを含む変異体抗原結合分子（例えば、抗体又はその断片）に向けられており、そのＣＤＲの少なくとも一つにはＰＲ１Ａ３の対応するＣＤＲに比べて少なくとも一つのアミノ酸残基の置換があり、かつ変異体抗原結合分子は親ＰＲ１Ａ３抗原結合分子に比べて、ＣＥＡ，好ましくは膜結合ＣＥＡに対して向上した親和性を有する。国際特許出願ＷＯ２０１１０２３７８７は、親ＰＲ１Ａ３抗原結合分子に比較して、ＣＥＡに対する親和性が改善した、抗ＣＥＡ抗原結合分子を記述する。
別の態様において、本発明は、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、又は６）のマウスＰＲ１Ａ３抗体のＣＤＲを含む変異体抗原結合分子に向けられており、そのＣＤＲの少なくとも一つにはＰＲ１Ａ３の対応するＣＤＲに比べて少なくとも一つのアミノ酸残基の置換があり、かつ変異体抗原結合分子は親ＰＲ１Ａ３抗原結合分子に比べて、増加した安定性を有する。一実施態様において、親ＰＲ１Ａ３抗原結合分子は、ヒト化ＰＲ１Ａ３抗原結合分子である。一実施態様において、親ＰＲ１Ａ３抗原結合分子は、ＣＨ７Ａの重鎖可変領域（配列番号１０１）を含む。一実施態様において、親ＰＲ１Ａ３抗原結合分子は、重鎖可変領域ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）及び軽鎖可変領域２Ｆ１（配列番号２０９）を含む。そのような一又は複数のＣＤＲは、切断されたＣＤＲであって良く、所与のＣＤＲにおいて、本明細書でその用語が定義される、特異性決定残基（ＳＤＲ）を、最小で含むであろう。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、特異的結合を保持するであろうＣＤＲの残基を含む、配列番号１〜３、５〜１０、１２〜５６及び２１７〜２２４（図３２及び図３６）から選択されるＣＤＲの少なくとも一（例えば、１、２、３、４、５、又は６）を含む。別の実施態様において、変異体抗原結合分子は、前記ＣＤＲの少なくとも特異性決定残基を含み、かつ異種性ポリペプチドに由来する配列を含む、配列番号１〜３、５〜１０、１２〜５６、及び２１７〜２２４から選択される少なくとも一（例えば、１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲ、又は変異体又はその切断型を含む。変異体抗原結合分子がＰＲ１Ａ３の重鎖ＣＤＲ１変異体を含む特定の実施態様において、ＨＣＤＲ１はＫａｂａｔの位置３１にバリンと置換されたグルタミン酸を有する。変異体抗原結合分子がＰＲ１Ａ３の重鎖ＣＤＲ３変異体を含む特定の実施態様において、ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔの位置９８のチロシンと置換されたアラニン、又はＫａｂａｔの位置９９のアスパラギン酸と置換されたチロシンを有する。変異体抗原結合分子がＰＲ１Ａ３の重鎖ＣＤＲ３変異体を含む特定の実施態様において、ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔの位置９８のチロシンと置換されたアラニン、及びＫａｂａｔの位置９９のアスパラギン酸と置換されたチロシンを有する。
一実施態様において、変異体抗原結合分子は、配列番号２１７〜２２４（図３６）から選択される１つの重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１〜３、５〜１０、及び１２〜２４から選択される２つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２）、及び／又は配列番号３６〜５６から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又は各々のＣＤＲの少なくとも特異性決定残基を含む、変異体又はその切断型を含む。より具体的な実施態様において、変異体抗原結合分子は、配列番号２１７〜２２４から選択される１つの重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１〜３、５〜１０、及び１２〜２４から選択される２つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２）、及び配列番号３６〜５６から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む。別の実施態様では、変異体抗原結合分子は、抗体軽鎖及び／又は重鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖可変領域の両方の可変領域を含む。より特定の実施態様においては、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号９９〜１０８、配列番号１８８〜２１６及び配列番号２２５〜２４８（図３３及び図３７Ａ〜Ｃ）から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はそれらの組み合わせから選択され、そこでは重鎖及び軽鎖可変領域は配列番号９９及び配列番号１０３、又は配列番号１００及び配列番号１０４の組合わせではない。幾つかの実施態様において、重鎖はＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワーク残基を含む。．一実施態様において、変異体抗原結合分子は、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２３１，配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、又は配列番号２４７から選択される重鎖可変領域を含む。
一実施態様では、変異体抗原結合分子は、キメラ抗体、より具体的にはヒト化抗体である。別の実施態様では、変異体抗原結合分子は、Ｆｃ領域を含む。別の実施態様では、変異体抗原結合分子は親和性成熟型である。別の実施態様では、変異体抗原結合分子は安定性が増加するように操作されている（安定性成熟型）。別の実施態様では、変異体抗原結合分子はＰＲ１Ａ３に比べ増加したＡＤＣＣ活性を有する。一実施態様では、変異体抗原結合分子の増加したＡＤＣＣは、例えば親和性成熟又は親和性を向上させる他の方法により、膜結合ＣＥＡに対する変異体抗原結合分子の親和性の増加による（Tangら、J. Immunol. 2007, 179:2815-2823を参照、その全体の内容は参照により本明細書に援用される）。別の実施態様では、変異体抗原結合分子は糖鎖を操作されたＦｃ領域を含む。別の態様において、本発明はまた、同じ細胞型の正常組織と比べて、ＣＥＡが発現され、特にＣＥＡが異常に発現される（例えば、細胞内で過剰発現されるかもしくは別のパターンで発現される）疾患、特に細胞増殖障害の治療における、こうした変異体変異体抗原結合分子の製造方法及びその使用方法に向けられる。そのような障害は、限定されないが、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌及び乳癌を含む。ＣＥＡの発現レベルは当該技術分野で公知の方法及び本明細書に記載された方法で決定され得る（例えば、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、リガンド結合、キナーゼ活性、など）。
別の態様において、本発明はまた、一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、又は６）のマウスＰＲ１Ａ３抗体の相補性決定領域を含むポリペプチドをコードする配列又は前記相補性決定領域に対する少なくとも特異性決定残基を含む変異体又はその切断型を含む単離されたポリヌクレオチドに向けられている。典型的にはこのような単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子を形成する１つ又は複数の融合ポリペプチドをコードする。一実施態様において、ポリヌクレオチドは、特異的結合を保持するであろうＣＤＲの残基を含む、配列番号１〜３、５〜１０、１２〜５６及び２１７〜２２４から選択されるＣＤＲの少一又は複数（例えば、１、２、３、４、５、又は６）をコードする配列を含む。一実施態様において、ポリヌクレオチドは、前記３つの相補性決定領域の各々に対する少なくとも特異性決定残基（ＳＤＲ）を含む、配列番号１〜３、５〜１０、１２〜５６及び２１７〜２２４から選択される少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲ（例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又は変異体又はその切断型をコードする配列を含む。より具体的な実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２１７〜２２４から選択される１つの重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１〜３、５〜１０、及び１２〜２４から選択される２つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２）、及び配列番号３６〜５６から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含むポリペプチドをコードする。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、抗体軽鎖及び／又は重鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードする。重鎖可変領域のポリペプチド及び軽鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ又は複数の発現ベクターで発現させることができる。より特定の実施態様において、配列番号９９〜１０８、配列番号１８８〜２１６、及び配列番号２２５〜２４８から選択される、重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５９〜１８７及び配列番号２４９〜２５６のポリヌクレオチドの群又はそれらの組み合わせからから選択され、そこでは重鎖及び軽鎖可変領域は配列番号１１及び配列番号１１５、又は配列番号１１２及び配列番号１１６の組合わせによりコード化されない。一実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされた重鎖可変領域のポリペプチド及び軽鎖可変領域のポリペプチドは結合し、キメラ抗体、より具体的にはヒト化抗体を形成する。ポリヌクレオチドがＰＲ１Ａ３の重鎖ＣＤＲ１又はその変異体をコードする配列を含む特定の実施態様において、前記ポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔの位置３１においてバリンに対して置換されたグルタミン酸をコード化している。ポリヌクレオチドが、ＰＲ１Ａ３の重鎖ＣＤＲ３又はその変異体をコードする配列を含む特定の実施態様において、該ポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔの位置９８のチロシンと置換されたアラニン、又はＫａｂａｔの位置９９のアスパラギン酸と置換されたチロシンをコードする。ポリヌクレオチドが、ＰＲ１Ａ３の重鎖ＣＤＲ３又はその変異体をコードする配列を含む特定の実施態様において、該ポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔの位置９８のチロシンと置換されたアラニン、及びＫａｂａｔの位置９９のアスパラギン酸と置換されたチロシンをコードする。一実施態様において、ポリヌクレオチドは、ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワークにおいて、Ｋａｂａｔの位置９８のチロシンと置換されたアラニン、又はＫａｂａｔの位置９９のアスパラギン酸と置換されたチロシンをコードする。一実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２３１，配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、又は配列番号２４７から選択される重鎖をコードする配列を含む。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、Ｆｃ領域をコードする配列を含む。本発明は更に、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに向けられている。
一態様において、本発明は、マウスＰＲ１Ａ３抗体と同じ結合特異性（例えば膜結合ＣＥＡの同じエピトープに対する結合）を有し、及び匹敵又は改善された生物学的活性（例えば、膜結合ＣＥＡに対する改善された親和性、増加した安定性、及び／又は強化されたＡＤＣＣ）を有する、抗原結合分子又は変異体抗原結合分子（例えば抗体又はその断片）及びポリペプチドに関する。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、親抗原結合分子のそれと同じエピトープに結合する。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、親抗原結合分子と、膜結合ヒトＣＥＡに対する結合を競合する。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡヒトＣＥＡに結合するが、可溶性ヒトＣＥＡには結合しない。一態様において、本発明は、マウスＰＲ１Ａ３抗体、又はそのヒト化変異体に比べて安定性が増加した、抗原結合分子、及び変異体抗原結合分子、及びポリペプチドに関する。一態様において、本発明は、膜結合ＣＥＡに結合し、ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）の重鎖可変領域を含むヒト化ＰＲ１Ａ３抗体と比較して、増加した安定性を有する、抗原結合分子及び変異体抗原結合分子（例えば抗体又はその断片）及びポリペプチドに関する。一態様において、本発明は、膜結合ＣＥＡに結合し、重鎖可変領域ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）と軽鎖可変領域２Ｆ１（配列番号２０９）を含むヒト化ＰＲ１Ａ３抗体と比較して、増加した安定性を有する、抗原結合分子及び変異体抗原結合分子（例えば抗体又はその断片）及びポリペプチドに関する。
一実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドは、配列番号１〜３、５〜１０、１２〜５６及び２１７〜２２４（図３２及び図３６）から選択されるＣＤＲの少なくとも一（例えば、１、２、３、４、５、又は６）を含む。一実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドは、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、（ｂ）配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｃ）配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドは、（ａ）配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、（ｂ）配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。幾つかの実施態様において、ＣＤＲを含む変異体抗原結合分子又はポリペプチドはまた、ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワーク残基を含む。
一態様において、本発明は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む膜結合ＣＥＡに結合する、変異体抗原結合分子又はポリペプチドを対象にする。一実施態様において、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号９９〜１０８、配列番号１８８〜２１６、及び配列番号２２５〜２４８（図３３及び図３７Ａ〜Ｃ）から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変領域から選択される。一実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号２２５〜２４８の何れか一の配列を有するポリペプチドを含む。別の具体的な実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号２２５〜２４８の何れか一の配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有するポリペプチドを含む。
一実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７の配列を有するポリペプチドを含む。別の実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７の配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一実施態様において、軽鎖可変領域は、配列番号２０９の配列を有するポリペプチドを含む。別の実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号２０９の配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。
一実施態様において、膜結合ＣＥＡに結合する、変異体抗原結合分子、変異体抗原結合分子又はポリペプチドは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。具体的な実施態様において、重鎖可変領域は、以下の配列番号４の配列を有するポリペプチドを含み、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＸ１Ｘ２ＭＸ３ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＸ４ＩＮＴＫＸ５ＧＥＡＸ６ＹＸ７ＥＥＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤＸ８Ｘ９Ｘ１０ＹＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１はＹ又はＦ；Ｘ２はＳ又はＧ；Ｘ３はＮ又はＳ；Ｘ４はＷ又はＹ；Ｘ５はＮ，Ｔ又はＳ；Ｘ６はＴ又はＮ；Ｘ７はＶ又はＩ；Ｘ８はＦ又はＡ；Ｘ９はＹ，Ａ，Ｖ，Ｆ又はＳ；Ｘ１０はＤ，Ｈ，Ｗ，Ｅ，又はＹ；Ｘ１１はＶ，Ｌ又はＦ；Ｘ１２はＥ，Ｋ又はＱ；Ｘ１３はＡ又はＴ；及びＸ１４はＭ又はＬである。
具体的な実施態様において、軽鎖可変領域は、以下の配列番号１１の配列を有するポリペプチドを含み、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０ＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＸ２１ＬＩＹＸ２２ＡＳＸ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ここで、Ｘ１５はＱ，Ａ，Ｋ，又はＨ；Ｘ１６はＮ，Ａ，Ｙ，Ｉ，Ｋ，Ｔ，又はＦ；Ｘ１７はＶ，Ａ，Ｇ，又はＭ；Ｘ１８はＧ，Ｓ，Ｔ，又はＬ；Ｘ１９はＴ，Ｎ，Ｐ，又はＡ；Ｘ２０はＮ又はＹ；Ｘ２１はＰ又はＬ；Ｘ２２はＳ，Ｌ，又はＷ；Ｘ２３はＹ，Ｎ，又はＨ；Ｘ２４はＲ，Ｌ，Ｐ，又はＨ；Ｘ２５はＹ，Ｓ，Ｑ，Ｋ，Ｅ，Ｆ，又はＰ；及びＸ２６はＳ，Ｇ，Ｉ，又はＲである。
別の態様において、本発明は、膜結合ＣＥＡに結合する、抗原結合分子、変異体抗原結合分子、又はポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを更に対象とする。一実施態様において、ポリヌクレオチドは、前記３つの相補性決定領域の各々に対する少なくとも特異性決定残基（ＳＤＲ）を含む、配列番号１〜３、５〜１０、１２〜５６及び２１７〜２２４から選択される少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲ（例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又は変異体又はその切断型をコードする配列を含む。より具体的な実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２１７〜２２４から選択される１つの重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１〜３、５〜１０、及び１２〜２４から選択される２つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２）、及び配列番号３６〜５６から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含むポリペプチドをコードする。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、抗体の軽鎖及び／又は重鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードする。重鎖及び軽鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一以上の発現ベクターで発現することができる。より特定の実施態様において、配列番号９９〜１０８、配列番号１８８〜２１６、及び配列番号２２５〜２４８から選択される、重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５９〜１８７及び配列番号２４９〜２５９から選択されるポリヌクレオチドの群又はそれらの組み合わせからから選択され、そこでは重鎖及び軽鎖可変領域は配列番号１１及び配列番号１１５、又は配列番号１１２及び配列番号１１６の組合わせによりコード化されない。一実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされた重鎖可変領域のポリペプチド及び軽鎖可変領域のポリペプチドは結合し、キメラ抗体、より具体的にはヒト化抗体を形成する。
一実施態様において、膜結合ＣＥＡに結合する、抗原結合分子、変異体抗原結合分子、又はポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。より具体的な実施態様において、抗原結合分子、変異体抗原結合分子、又はポリペプチドは、糖鎖が操作され、Ｆｃ領域におけるグリコシル化のパターンが変化している。特定の実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドの膜結合ＣＥＡに対する親和性は、親ＰＲ１Ａ３抗体に比べて増加している。別実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドの安定性は、親ＰＲ１Ａ３抗体に比べて増加している。別の実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドはＡＤＣＣ活性が増加している。一実施態様において、変異体抗原結合分子又はポリペプチドのＡＤＣＣの増加は、膜結合ＣＥＡに対するポリペプチドの親和性の増加に起因し、例えば、親和性成熟による又は親和性を向上する他の方法による。
別の態様において、本発明はまた、同じ細胞型の正常組織と比べて、ＣＥＡが発現され、特にＣＥＡが異常に発現される（例えば、細胞内で過剰発現されるかもしくは別のパターンで発現される）疾患、特に細胞増殖障害の治療における、抗原結合分子、変異体抗原結合分子又はポリペプチドの使用を対象とする。このような疾患としては、限定されないが、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌及び乳癌を含む。ＣＥＡの発現レベルは、当該技術分野で公知であって本明細書に記載された方法（例えば、免疫アッセイ、免疫アッセイ、免疫酵素法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、リガンド結合、キナーゼ活性などを介して）により決定することができる。
特定の実施態様において、本発明は、配列番号２２５−２４８の何れか一の配列を含む重鎖可変領域を含む膜結合ＣＥＡに結合するヒト化抗原結合分子又はその一部分又は断片に向けられている。別の実施態様において、本発明は、配列番号１０５、１０８、又は２０７−２１６の何れか一の配列を含む軽鎖可変領域を膜結合ＣＥＡに結合するヒト化抗原結合分子又はその一部分又は断片に向けられている。特定の実施態様では、膜結合ＣＥＡに結合するヒト化抗原結合分子又はその一部分又はその断片は配列番号２２５−２４８の何れか一の配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０５、１０８、又は２０７−２１６の何れか一の配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施態様では、ヒト化抗原結合分子は更に、ヒト重鎖定常領域及び／又はヒト軽鎖定常領域を含む。このような定常領域は、本明細書に記載されており、当該分野で知られている。より特定の実施態様においては、ヒト化抗原結合分子は、Ｆｃ領域、より具体的には、糖鎖を操作されたＦｃ領域を含む。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野で知られている。例えば、本発明によるヒト化ＡＢＭはＷｉｎｔｅｒに対する米国特許第５２２５５３９号、Ｑｕｅｅｎらに対する米国特許第６１８０３７０号、又はＡｄａｉｒらに対する米国特許第６６３２９２７号に記載の方法に従って調製することができ、それらの各々の全内容は参照によって本明細書に援用される。好ましくは、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からそれに導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には 「移入」可変ドメインから取り込まれる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にWinter及び共同研究者(Jonesら、Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら、Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen ら、Science, 239:1534-1536 (1988))による方法に従い、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって、実行することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）であり、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい配列が非ヒト種由来の対応する配列で置換される。典型的には、ヒト化抗体は、いくつかの超可変領域残基及び恐らくは幾つかのＦＲ残基が、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。対象ヒト化抗ＣＥＡ抗体は必要に応じて、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。
ヒト化抗体を作製するにおいて、軽鎖及び重鎖ヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、ドナー（例えば、げっ歯類）抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。ドナー（例えば、げっ歯類）のそれに最も近いヒト配列は、その後ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる(Sims ら、J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothiaら、J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。ヒトフレームワーク配列を選択する別の方法は、フレームワークサブ領域（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けにより決定される）に対応する既知のヒト可変領域配列のライブラリーに対して、完全なドナー（例えば、げっ歯類）フレームワーク（つまり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）の個々のサブ領域の配列、又は個々のサブ領域（例えばＦＲ１及びＦＲ２）のいくつかの組み合わせを比較し、げっ歯類のそれに最も近い各サブ領域又は組み合わせに対するヒトの配列を選択することである（Ｌｅｕｎｇ 米国特許出願公開第２００３／００４０６０６Ａ１号、２００３年２月２７日公開）。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する(Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaら、 J. Immunol., 151:2623 (1993))。一実施態様では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列のコレクションから選択される。ヒト生殖細胞系列のそのようなコレクションは、ＩＭＧＴ又はＶｂａｓｅ等のデータベースで見つけることができる。フレームワーク領域は、個別に選択でき（例えば、ヒト化抗ＣＥＡ ＡＢＭの重鎖及び／又は軽鎖可変領域のアクセプター用に選択されたＦＲ１-３は異なる生殖細胞系列遺伝子によってコード化することができる）、又は同一の生殖細胞系列遺伝子の一部として選択できる。より具体的な実施態様では、重鎖ＦＲ１−３はＩＧＨＶ７_４_１＊０２ヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列（受入番号Ｘ６２１１０、配列番号１１４）によってコード化されている。別の特定の実施態様において、軽鎖ＦＲ１−３はＩＭＧＴ_ｈＶＫ_１_３９ヒト免疫グロブリン生殖細胞遺伝子配列（受入番号Ｘ５９３１５、配列番号１１８）によってコード化されている。別の特定の実施態様において、重鎖ＦＲ４はＪＨ６生殖細胞系列遺伝子配列によってコード化されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ６３０３０を参照）。別の特定の実施態様では、軽鎖ＦＲ４はＪＫ２生殖細胞系列遺伝子配列によってコード化されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６１５８４を参照）。
抗体及びその断片などの抗原結合分子は、抗原及び他の好ましい生物学的性質に対する高親和性を保持してヒト化されることが一般に望ましい。したがって、一実施態様では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物を分析することによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を例示かつ表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの分析は、例えば、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の解析など、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割を解明するのに役立つ。このようにして、標的抗原に対する増加した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエント及び移入配列からＦＲ残基が選択され、組み合わせることができる。一般的には、超可変領域残基は、直接的に、最も実質的に抗原結合に影響を与えることに関与している。
一態様において、本発明は、ヒト化、親和性成熟し、及び／又はバリアント型の、望ましい特性及び特徴を持つ抗ＣＥＡ抗原結合分子に向けられており、限定されないが、ＣＥＡに対する強い結合親和性−特に膜結合ＣＥＡ−、実質的に可溶性ＣＥＡに対して交差反応性を有しない；インビトロ及びエクスビボでのＣＥＡ発現細胞の溶解を誘導する能力、好ましくは用量依存的に；インビトロでのＣＥＡ媒介細胞接着を阻害する能力；腫瘍組織増殖の阻害及び／又は腫瘍組織退縮を誘導する能力（例えば、腫瘍モデル（例えば、異種移植片マウス）で実証される）を含む。
本明細書に記載するように、幾つかの実施態様において、本発明の変異体抗原結合分子は、例えば、ＰＲ１Ａ３抗体の１つ又は複数のＣＤＲを含む親抗体の親和性成熟に起因して、結合親和性が増加している。本発明の抗原結合分子及び変異体抗原結合分子の親和性は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法によって決定することができる。特定の実施態様では、本発明のヒト化又は変異体抗原結合分子は、ヒトＣＥＡ、好ましくは膜結合ＣＥＡに、一価親和性定数（ＫＤ）値が約１μＭから約０．００１ｎＭを超えない、より具体的には約８００ｎＭから約１ｎＭを超えない、更により具体的には約５５０ｎＭから１０ｎＭを超えない値で、結合する。特定の実施態様において、変異体抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡに、一価親和性定数（ＫＤ）値が約１００ｎＭから約１０ｎＭを越えない値で結合する、親和性成熟型抗体又はその断片である。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡに、一価親和性定数（ＫＤ）値が約１００ｎＭから約０．０１ｎＭを越えない値で結合する、親和性成熟型抗体又はその断片である。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡに、一価親和性定数（ＫＤ）値が約１０ｎＭから約０．１ｎＭを越えない値で結合する、親和性成熟型抗体又はその断片である。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、膜結合ＣＥＡに、一価親和性定数（ＫＤ）値が１００ｎＭ，１０ｎＭ，１ｎＭ，０．１ｎＭ又はそれ以下の値で結合する、親和性成熟型抗体又はその断片である。幾つかの実施態様において、変異体抗原結合分子は、その親和性成熟型の親の増加した結合親和性を保持する、安定性が成熟した（安定性が増加するように操作された）抗体又はその断片である。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、脱落したＣＥＡに結合するよりも高い親和性で膜結合ＣＥＡに結合する。一実施態様において、変異体抗原結合分子は、離脱ＣＥＡに結合するよりも、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍又はそれ以上高い親和性で膜結合ＣＥＡに結合する。
一つの実施態様において、本発明の変異体抗原結合分子は、典型的には、マウス抗体ＰＲ１Ａ３によって認識されるのと同じエピトープに結合する、又は膜結合ＣＥＡへの結合においてＰＲ１Ａ抗体と競合することが可能である。目的の抗体が結合したヒトＣＥＡ上のエピトープに結合する抗体（例えば、ヒトＣＥＡへのＰＲ１Ａ３抗体の結合を阻止するもの）をスクリーニングするために、ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow 及びLane編集. (1988)に記載されたように、所定の交差ブロッキングアッセイが実施可能である。あるいは、Champeら、J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)に記載された通りに、エピトープマッピングが、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを判断するために実行することができる。
一実施態様では、ヒトＣＥＡに特異的な変異体抗原分子は、モノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３の少なくとも一つのＣＤＲを含む親抗ＣＥＡ抗原結合分子から作られ、親抗ＣＥＡ抗体はＰＲ１Ａ３抗体と同じエピトープに結合し、抗原結合に対してＰＲ１Ａ３と競合することが可能である。一実施態様では、親抗原結合分子は、少なくとも１つ、２つ、又は典型的には３つのＰＲ１Ａ３抗体の重鎖ＣＤＲを含む；別の実施態様では、親抗原結合分子は、少なくとも１つ、２つ、又は典型的には３つのＰＲ１Ａ３抗体の軽鎖ＣＤＲを含む；別の実施態様では、親抗原結合分子はＰＲ１Ａ３抗体の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。好ましくは、変異体抗原結合分子はＰＲ１Ａ３のＨＣＤＲ１を含む場合、前記ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔの位置３１でバリンに対するグルタミン酸への置換を含む。一実施態様において、変異体ＡＢＭは、親に比べて増加した安定性を有する。変異体ＡＢＭは、通常、親よりもＣＥＡに対する親和性を有する。一実施態様では、変異体ＡＢＭは、Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、変異体ＡＢＭは、糖鎖を操作されている。一実施態様では、変異体ＡＢＭは、親ＡＢＭに比べてＡＤＣＣ活性を増加させている。特定の実施態様では、増加したＡＤＣＣは、親和性の増加の結果であり、例えば、親ＡＢＭの親和性成熟によって達成され変異体ＡＢＭを生成する。より特定の実施形態では、ＡＤＣＣの増加は、前記親抗原結合分子と比較して少なくとも約４０％から約１００％程度である。別の特定の実施態様では、変異体ＡＢＭは、インビトロ細胞毒性アッセイにおいて少なくとも約１０％から約１００％ＡＤＣＣを増加させる。より特定の実施態様において、変異体ＡＢＭは、マウスＰＲ１Ａ３抗体に比べて所定の濃度でＡＤＣＣを誘導することで少なくとも約１０倍から約１０００倍より強力である。より特定の実施態様では、変異体ＡＢＭは、マウスＰＲ１Ａ３抗体に比べて所定の濃度でＡＤＣＣを誘導することで少なくとも約１０倍から約１０００倍より強力である。別の特定の実施態様では、増加したＡＤＣＣ活性はＦｃ領域の糖鎖操作の結果である。
一実施態様では、本発明の変異抗原結合分子は、少なくとも一つのＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。アミノ酸置換の数は、好ましくは、１から１０の範囲（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）、好ましくは２から５まで（例えば、２、３、４、又は５）、変動し得る。一実施態様では、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。別の実施態様では、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲは、１つ又は複数の置換を含み、かつ少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲは、１つ又は複数の置換を含む。好ましくは、変異体抗原結合分子はＰＲ１Ａ３のＨＣＤＲ１を含む場合、ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔの位置３１におけるバリンに対するグルタミン酸への置換を含む。
抗原結合分子の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えば、シート又はらせん構造として、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ、の維持するうえで、その効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸置換を有する変異体抗原結合分子は、親の抗原結合分子と比較して生物学的活性、例えば、改良された抗原結合親和性及び強化されたＡＤＣＣを改善し得る。アミノ酸置換は、限定されないが、部位特異的突然変異誘発及び／又はファージディスプレイによる親の抗原結合分子等の親和性成熟を含む、当該分野で公知の様々な技術によって導入することができる。
修飾のための候補部位、例えば超可変残基、を同定するために、アラニンスキャン突然変異誘発が、抗原結合に有意に寄与する残基を見つけるために実行され得る。あるいは、又は加えて、抗体及びヒトＣＥＡとの間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することは有益であり得る。そのような接触残基と隣接する残基は、当該技術分野で既知の方法か、及び／又は本明細書に記載の方法に従って置換の候補である。ひとたび、そのような変異体が生成され、変異体のパネルは、当該分野で既知の方法、及び／又は本明細書に記載の方法によりスクリーニングすることができ、１つ又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、更なる開発のために選択することができる。
ファージディスプレイは、ランダムなアミノ酸変異を含む親の抗原結合分子から超可変領域配列のレパートリーを生成するために使用することができる。例えば、幾つかの超可変領域部位（例えば６−７部位）は各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生成させるために変異している。あるいは、ランダム突然変異誘発は、重鎖及び／又は軽鎖可変領域で実行することができる。突然変異は、当該技術分野で公知の技術によって生成することができる。限定されないが、突然変異誘発プライマーを用い、サイクル数を制御し、及びＰＣＲ増幅の間に変異原性ヌクレオチド類似体の８−オキソ−ｄＧＴＰ及びｄＰＴＰを使用する。こうして生成された抗体変異体は、各粒子内のＭ１３のパッケージの遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として繊維状ファージ粒子から一価の様式で表示される。本明細書に開示されたように、ファージ表示された変異体は、その後、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされ、1つ又は複数の改良された活性を有する候補が更なる開発のために使用される。ファージディスプレイライブラリーを作製するための方法は、Huseら、Science, 246:1275-1281 (1989); Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 88:4363-4366 (1991)に見いだすことができ、その各々の内容全体が本明細書中で参照により援用される。親和性成熟した抗原結合分子を同定するための代替方法は、例えば、Ｂａｌｉｎｔらに対する米国特許第７４３２０６３号に見いだすことができ、その内容全体が本明細書中で参照により援用される。
幾つかの実施態様において、本発明の抗原結合分子及び変異体抗原結合分子は、Ｆｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域を含む。Ｆｃ領域の配列及び構造は、当技術分野で知られており特徴づけられている。特定の実施態様では、ヒト定常領域は、配列番号１２１及び１２２に記載されたＩｇＧ１である。
しかしながら、ヒトＦｃ領域の変異体及びアイソフォームもまた、本発明に包含される。例えば、本発明における使用に適した変異体Ｆｃ領域は、Ｐｒｅｓｔａに対する米国特許第６７３７０５６号で教示された方法に従って産生することができる。（１つ又は複数のアミノ酸修飾のために変更されたエフェクター機能を有するＦｃ領域変異体）；又は米国特許出願第６０／４３９４９８号、同第６０／４５６０４１号；同第６０／５１４５４９号；又は国際公開第２００４／０６３３５１号（アミノ酸修飾により増加した結合親和性を有する変異体Ｆｃ領域）；又は米国特許出願第１０／６７２２８０号又は国際公開第２００４／０９９２４９号（アミノ酸修飾によるＦｃγＲへの改変された結合をするＦｃ変異体）、その各々の内容は本明細書においてその全体が参照により援用される。特定の実施態様では、抗ＣＥＡ ＡＢＭ及び変異体ＡＢＭは（例えば、フコシル化を減少させ、Ｆｃレセプター結合親和性を向上させ、ＡＤＣＣを増加させる、など）ＡＢＭのエフェクター機能活性を変更するための糖鎖操作されたＦｃ領域を含んでいる。使用することができる糖鎖操作の方法は、本明細書中以下に詳細に記載されており、及び当該技術分野で知られている。
一実施態様において、本発明の抗原結合分子及び変異体抗原結合分子は、放射標識又は毒素などの追加部分に結合している。そのような抱合された抗原結合分子は、当技術分野でよく知られている多数の方法によって作成することができる。本発明の抗ＣＥＡ ＡＢＭコンジュゲートは、本明細書中の以下に「抗ＣＥＡ抗原結合分子コンジュゲート」と題する節で詳細に記載されている。
発現ベクター及び宿主細胞
一態様において、本発明は、発現ベクター及び／又は本発明の１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞に向けられている。例えば、宿主細胞又は発現ベクターは、本明細書に記載されたＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの何れか一つ又は複数を含む。別の態様において、本発明は、膜結合ヒトＣＥＡに結合するＡＢＭを産生する方法に向けられており、該方法は、前記一又は複数のポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下の培地中で、本発明の一つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド、又は本発明の一つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含み、前記一つ又は複数のポリヌクレオチドはＡＢＭの一部を形成する一又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記ＡＢＭを回復し、前記ＡＢＭ又はその一部が膜結合ＣＥＡに結合する。
一般的に、任意の型の培養細胞系が本発明のＡＢＭを発現するために使用され得る。好ましい実施態様において、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、本発明の操作された宿主細胞を生成するためにバックグラウンド細胞系として使用される。
特定の実施態様において、宿主細胞又は発現ベクターは、本明細書に与えられる抗ＣＥＡ ＡＢＭをコードする一以上のポリヌクレオチドを含む。一実施態様において、抗体は親和性成熟型である。親和性成熟抗体は、一般的に親和性成熟抗体が由来する参照抗体のそれよりも結合親和性を向上させている。別の実施態様において、抗体は、限定されないが、可溶性ＣＥＡに対して実質的に交差反応性を有さずに、ＣＥＡ抗原、特に膜結合ＣＥＡに対する強い結合親和性；好ましくは用量依存的に、インビトロ及びエキソビボでのＣＥＡ発現細胞の細胞溶解を誘導する能力；インビトロでのＣＥＡ媒介細胞接着を阻害する能力；腫瘍組織の増殖を阻害する能力及び／又はマウス（例えば、異種移植片マウス）の腫瘍モデルにおいて腫瘍組織の退縮を誘導する能力、を含む望ましい治療特性を持っている。別の実施態様において、抗体は、より安定な抗体が派生する親抗体に比べて、増加した安定性を有する。別の実施態様では、変異体抗体又はその断片はヒトＦｃを含む。
一実施態様において、本発明のＡＢＭをコードする１個又は数個のポリヌクレオチドが、構成的プロモーター、又は調節された発現系の制御下で発現されてもよい。適切な調節された発現系には、テトラサイクリンで調節される発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃスイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性発現系、及びメタロチオネイン金属誘導性発現系が含まれるがこれらに限定されない。本発明のＡＢＭをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系中に含まれる場合、それらのいくつかが構成的プロモーターの制御下で発現され得るのに対して、その他は調節プロモーターの制御下で発現される。最大発現レベルは、細胞増殖速度に顕著な有害な効果をおよぼさない安定なポリペプチド発現の最高の可能なレベルであると見なされ、日常的な実験を使用して決定される。発現レベルは、ＡＢＭに特異的である抗体又はＡＢＭに融合されたペプチドタグに特異的である抗体を使用するウェスタンブロット分析；及びノーザンブロット分析を含む、当分野において一般的に公知である方法によって決定される。さらなる代替において、このポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子に作動可能に連結され得；本明細書に開示されるＡＢＭの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することによって決定される。このレポーター遺伝子は、単一のｍＲＮＡ分子として前記ＡＢＭをコードする核酸と一緒に転写され得る；それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）によって、又はキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）によってのいずれかで連結され得る。このレポーター遺伝子は、単一のポリペプチド鎖が形成されるように、本明細書に開示されるＡＢＭをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に翻訳され得る。本発明のＡＢＭをコードする核酸は、単一のプロモーターの制御下でレポーター遺伝子に作動可能に連結され得、その結果、ＡＢＭをコードする核酸及びレポーター遺伝子が、２つの別々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に選択的スプライシングされるＲＮＡ分子に転写される；得られるｍＲＮＡの１つは前記レポータータンパク質に翻訳され、そして他方がＡＢＭに翻訳される。
当業者に周知である方法が、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、本明細書に与えられる抗ＣＥＡ ＡＢＭの配列をコードする配列含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら、 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) 及びAusubelら、 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates 及び Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照のこと。
種々の宿主発現ベクター系が本発明のＡＢＭのコード配列を発現するために利用されてもよい。好ましくは、哺乳動物細胞が、目的のタンパク質のコード配列及び融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えプラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞系として使用される。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、宿主細胞系として使用される。発現系及び選択方法のいくつかの例が、以下の参考文献及びその中の引用文献に記載されている。Borthら、 Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001)、Wernerら、 Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998)、Andersen 及び Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002)、Chadd 及び Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), 及びGiddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001)。
代替的な実施態様において、以下を含む、他の真核生物宿主細胞系が使用され得る。本発明のＡＢＭのコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞、例えば、米国特許出願第６０／３４４１６９及び国際公開第０３／０５６９１４号に教示された発現系など（ヒト以外の真核生物宿主細胞におけるヒト型様糖タンパク質の製造方法）（その各々の内容はその全体が参考として援用される）；抗ＣＥＡのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；本発明のＡＢＭのコード配列を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されるか、もしくはこの配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系であって、限定されないが、米国特許出願第６８１５１８４号（遺伝子操作されたウキクサからの生物学的に活性なポリペプチドの発現及び分泌のための方法）、国際公開第２００４／０５７００２号（糖転移酵素遺伝子の導入によるコケ植物細胞における糖タンパク質の生産）及び国際公開第２００４／０２４９２７号（コケ原形質体における細胞外異種非植物タンパク質を生成する方法）、及び米国特許出願第６０／３６５，７６９号、同第６０／３６８０４７号及び国際公開第２００３／０７８６１４号（機能的哺乳類ＧｎＴＩＩＩを酵素を含むトランスジェニック植物中の糖タンパク質プロセシング）（各々の内容はその全体が本明細書において参考として援用される）に教授された発現系を含む；又は安定に増幅されたか（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）もしくは二重微小染色体（例えば、マウス細胞系）中で不安定に増幅されたかのいずれかである、キメラ抗ＣＥＡ ＡＢＭをコードするＤＮＡの複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染された動物細胞系。一実施態様において、本発明のＡＢＭをコードするポリヌクレオチドを含むベクターはポリシストロン性である。一実施態様において、ＡＢＭは親和性成熟型抗体である。一実施態様において、ＡＢＭは安定性成熟型抗体である。
本発明の方法のために、安定な発現が一過性の発現よりも好まれる。なぜなら、これは、典型的には、より再現性のある結果を達成し、及びまた、大規模な産生に対してより受け入れ可能であるからであるが、しかし、それは一過性の発現が特定の状況のためのより良いかどうかを判断する当業者の技術の範囲内にある。ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを使用するよりはむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるそれぞれのコード核酸、及び選択マーカーで形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入後に、操作された細胞は、富化培地中で１−２日間増殖され得、次いで、選択培地に交換される。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、それらの染色体にプラスミドを安定に組み込んだ細胞の選択を可能にし、増殖して増殖巣を形成し、これは次にはクローニングされ得、そして細胞系に拡大され得る。
多数の選択系が使用されてもよく、これには以下が含まれるがこれらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wiglerら、 Cell 11:223 (1977))、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowyら、 Cell 22:817 (1980))、これらは、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、又はａｐｒｔ−細胞中でそれぞれ利用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Wiglerら、 Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hareら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ遺伝子(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子(Colberre-Garapinら、 J. Mol. Biol. 150:1 (1981))；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子(Santerreら、 Gene 30:147 (1984)についての選択の基礎として使用され得る。最近、さらなる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988))；グルタミン合成系；及びオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）(McConlogue,: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987))が記載されている。
本発明は更に、宿主細胞によって産生される本発明のＡＢＭのグリコシル化のプロファイルを修飾するための方法に向けられており、前記宿主細胞中で本発明のＡＢＭをコードする核酸、グリコシルトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸を含むベクターを発現することを含む。グリコシルトランスフェラーゼ活性を持つ遺伝子は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＡＬＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）を含む。一実施態様では、グリコシルトランスフェラーゼ活性を持つ遺伝子の組み合わせは、宿主細胞（例えば、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎＩＩ）で発現される。同様に、この方法はまた、糖転移酵素遺伝子が破壊され、あるいは不活性化されている（例えば、α１−６コアフコース転移酵素をコードする遺伝子の活性がノックアウトされた宿主細胞）宿主細胞内でＡＢＭをコーする１つ又は複数のポリヌクレオチドの発現を包含する。別の実施態様において、本発明のＡＢＭは、グリコシル化パターンを修飾するＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に発現する宿主細胞内で産生することができる。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ゴルジ常在性のポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。別の好ましい実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明のＡＢＭの発現は、増加したＦｃレセプター結合親和性及び、増加したエフェクター機能をを持つＡＢＭをもたらす。したがって、一実施態様では、本発明は、（ａ）ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸；及び（ｂ）例えば、ヒトＣＥＡに結合し、キメラ、霊長類又はヒト化抗体等、本発明のＡＢＭをコードする単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞に向けられている。好ましい実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドであり、及びゴルジ体局在化ドメインはマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを生成し、増加したエフェクター機能を有する抗体を産生するためにそれらを使用するための方法は、米国仮特許出願第６０／４９５１４２号及び米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号に開示されており、その全体の内容が参照により本明細書に明示的に援用される。特定の実施態様では、宿主細胞によって生成された修飾されたＡＢＭは、ＩｇＧ定常領域又はＦｃ領域を含むその断片を有する。別の特定の実施形態ではＡＢＭは、ヒト化抗体又はそのＦｃ領域を含む断片である。
本発明の宿主細胞によって産生される改変されたグリコシル化を持つＡＢＭは、典型的には、宿主細胞の修飾の結果として（例えば、糖転移酵素遺伝子の発現により）、増加したＦｃレセプター結合親和性及び／又は増加したエフェクター機能を示す。好ましくは、増加したＦｃレセプター結合親和性は、ＦｃγＲＩＩＩａレセプター等のＦｃγ活性化レセプターへの結合が増加している。増加したエフェクター機能は、好ましくは、以下の１つ以上の増加である：増加した抗体依存性細胞傷害、増加した抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、増加したサイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体介在性抗原取り込みの増加、FC-依存性細胞傷害の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核白血球（多形核白血球）への結合の増加、単球への結合の増加、標的に結合した抗体の架橋の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、樹状細胞の成熟の増加、及びＴ細胞プライミングの増加。
抗体依存性細胞傷害を含む増加したエフェクター機能を有するＡＢＭＳの生成及び使用
一態様において、本発明は、抗体依存性細胞傷害性を含めて、増加したエフェクター機能を有する抗ＣＥＡ ＡＢＭのグリコフォーム（例えば、変異体ＡＢＭ）を提供する。抗体のグリコシル化の操作は、以前に記載されている。例えば、米国特許第６６０２６８４号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。グリコシル化に関与する遺伝子の活性を改変した宿主細胞由来のＡＢＭの産生方法も詳細に本明細書中に記載される。（例えば、「発現ベクター及び宿主細胞」なる題名の次の節を参照）。本発明のＡＢＭＳのＡＤＣＣの増加はまた、親和性成熟又は親和性を向上させる他の方法で、膜結合ＣＥＡに対する抗原結合分子の親和性を増加させることによって達成される(Tangら、J. Immunol. 2007, 179:2815-2823を参照)。これらのアプローチの組み合わせも本発明に包含される。
いくつかの型の癌の治療のための非結合体化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験が、最近、有望な結果を生じてきている。Dillman、Cancer Biother.& Radiopharm.12:223-25(1997);Deoら、Immunology Today 18:127(1997)。キメラの非結合体化ＩｇＧ１は、軽度又は濾胞性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫のために認可されており(Dillman、Cancer Biother.& Radiopharm.12:223-25(1997))、一方別の非結合体化ｍＡｂである、ヒト化ＩｇＧ１標的化固形胸部腫瘍はまた、フェーズＩＩＩ臨床試験において有望な結果を示している。Deoら、Immunology Today 18:127(1997)。これらの２つのｍＡｂの抗原は、それらのぞれぞれの腫瘍細胞中で高度に発現され、そして抗体は、インビトロ及びインビボにおいてエフェクター細胞による潜在的な腫瘍破壊を媒介する。対照的に、微細な腫瘍特異性を有する多くの他の非結合ｍＡｂは、臨床的に有用であるために十分な効力のエフェクター機能を誘発することができない。Frostら、Cancer 80:317-33(1997);Surfusら、J.Immunother.19:184-91(1996)。これらのより弱いｍＡｂのいくつかについて、補助サイトカイン治療が現在試験されている。サイトカインの付加は、循環しているリンパ球の活性及び数を増加させることによって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激し得る。Frostら、Cancer 80:317-33(1997);Surfusら、J.Immunother.19:184-91(1996)。ＡＤＣＣ、抗体標的化細胞に対する溶解性攻撃は、抗体の定常領域（Ｆｃ）への白血球レセプターの結合の際に誘発される。Deoら、Immunology Today 18:127(1997)。
非結合体化ＩｇＧ１ｓのＡＤＣＣ活性を増加させるための、異なるが補完的なアプローチは、抗体のＦｃ領域を操作することである。タンパク質操作研究は、ＦｃγＲがＩｇＧ ＣＨ２ドメインのより下位のヒンジ領域と相互作用することを示してきた。Lundら、J.Immunol.157:4963-69(1996)。しかし、ＦｃγＲ結合はまた、ＣＨ２領域における保存性Ａｓｎ２９７に共有結合されたオリゴ糖の存在を必要とする。Lundら、J.Immunol.157:4963-69(1996);Wright及びMorrison、Trends Biotech.15:26-31(1997)、いずれかオリゴ糖及びポリペプチドの両方が相互作用部位に直接的に寄与すること、又はオリゴ糖が、活性なＣＨ２ポリペプチドコンホメーションを維持するために必要とされることを示唆する。それゆえに、オリゴ糖構造の修飾は、相互作用の親和性を増加するための手段として探求され得る。
ＩｇＧ分子は、そのＦｃ領域中に２つのＮ連結オリゴ糖を有し、これは各重鎖に１つである。いかなる糖タンパク質とも同様に、抗体は、同じポリペプチドバックボーンを共有するが、グリコシル化部位に結合された異なるオリゴ糖を有する糖型の集団として産生される。血清ＩｇＧのＦｃ領域中に通常見い出されるオリゴ糖は、複合体二分岐型(Wormaldら、Biochemistry 36:130-38(1997))であり、低レベルの末端シアル酸及び二分枝Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ならびに変動する程度の末端ガラクトシル化及びコアフコシル化を有する。いくつかの研究は、ＦｃγＲ結合のために必要とされる最小の炭水化物構造はオリゴ糖コア中に存在することを示唆する。Lundら、J.Immunol.157:4963-69(1996)。
非結合体化治療用ｍＡｂの産生のために産業界及び学術研究において使用されるマウス又はハムスター由来の細胞系は、通常、必要とされるオリゴ糖決定基をＦｃ部位に結合する。しかし、これらの細胞系において発現されるＩｇＧは、血清ＩｇＧにおいて少量見い出される二分枝ＧｌｃＮＡｃを欠いている。Lifelyら、Glycobiology 318:813-22(1995)。対照的に、ラット骨髄腫により産生されるヒト化ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）が、いくつかのその糖型で二分枝ＧｌｃＮＡｃを有したことが最近観察された。Lifelyら、Glycobiology 318:813-22(1995)。ラット細胞由来の抗体は、ＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ抗体が標準的な細胞系において産生されるにつれて、同様の最大インビトロＡＤＣＣ活性に到達したが、有意に低い抗体濃度であった。
ＣＡＭＰＡＴＨ抗原は、通常、リンパ腫細胞上で高レベルで存在し、このキメラｍＡｂは、二分枝ＧｌｃＮＡｃの非存在下で高いＡＤＣＣ活性を有する。Lifelyら、Glycobiology 318:813-22(1995)。Ｎ連結グリコシル化経路において、二分枝ＧｌｃＮＡｃはＧｎＴＩＩＩによって加えられる。Schachter、Biochem.Cell Biol.64:163-81(1986)。
以前の研究は、異なるレベルのクローニングしたＧｎＴ ＩＩＩ遺伝子酵素を、外部から調節される様式で発現するように以前に操作された単一の抗体産生ＣＨＯ細胞系を使用した。(Umana,P.ら、Nature Biotechnol.17:176-180(1999))。このアプローチは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧｎＴＩＩＩ）の発現と、修飾抗体のＡＤＣＣ活性との間の厳格な相関を最初に確立した。従って、本発明は、Ｆｃ領域又はＡＢＭ産生宿主細胞においてグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルを変化させることに由来する改変されたグリコシル化を有するＦｃ領域に等価な領域を含む、膜結合ＣＥＡに結合する変異体ＡＢＭ（例えば親和性成熟ＡＢＭ）を熟考する。特定の実施態様にて、遺伝子発現レベルの変化はＧｎＴＩＩＩ活性の増加である。ＧｎＴＩＩＩ活性の増加は、二分枝オリゴ糖のパーセンテージの増加、ならびにＡＢＭのＦｃ領域中のフコース残基のパーセンテージの減少を生じる。この抗体又はその断片は、Ｆｃレセプター結合親和性の増加及びエフェクター機能の増加を有する。
本発明はまた、宿主細胞中に修飾オリゴ糖を有する、本発明の抗ＣＥＡ ＡＢＭを産生するための方法に向けられ、この方法は、（ａ）本発明に従うＡＢＭの産生を可能にする条件下でグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養し、ここで、このグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、この宿主細胞によって産生されるこのＡＢＭのＦｃ領域においてオリゴ糖を修飾するために十分な量で発現され；及び（ｂ）このＡＢＭを単離することを含む。一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩである。その他の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドがある。特定の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのペプチドは、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎＩＩである。別の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドはＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。より具体的な実施態様において、融合ポリペプチドはさらに、ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。好ましくは、このゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在化ドメインである。代替的には、このゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群より選択される。本発明の方法によって産生されるＡＢＭは、Ｆｃレセプター結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を有する。一般的に、エフェクター機能の増加は、以下の１つ以上である。Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害性の増加を含む）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。Ｆｃレセプター結合親和性の増加は、好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩａなどのＦｃ活性化レセプターへの結合の増加である。特に好ましい実施態様において、ＡＢＭはヒト化抗体又はその断片である。
一実施態様において、ＡＢＭのＦｃ領域における二分枝Ｎ結合オリゴ糖のパーセンテージは、全体のオリゴ糖の、少なくとも約１０％から約１００％、特に少なくとも約５０％、より具体的には、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０−９５％である。さらに別の実施態様において、本発明の方法により産生された抗原結合分子又は変異体抗原結合分子は、本発明の方法により、その糖鎖の修飾の結果として、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。一実施態様において、非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、少なくとも約２０％から約１００％、具体的には少なくとも約５０％、少なくとも約６０％から約７０％、及びより具体的には、少なくとも約７５％である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型又は複合型であり得る。更に別の実施態様において、本発明の方法により産生された抗原結合分子又は変異体抗原結合分子は、本発明の方法により、その糖鎖の修飾の結果として、Ｆｃ領域で二分枝オリゴ糖の割合が増加している。一実施態様において、二分枝糖鎖のパーセンテージは少なくとも約２０％から約１００％、具体的には少なくとも約５０％、少なくとも約６０％から約７０％、及びより具体的には、少なくとも約７５％である。特に好ましい実施態様において、本発明の宿主細胞及び方法により産生されたＡＢＭは、Ｆｃ領域内の二分枝の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。二分枝の、非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体であり得る。具体的には、本発明の方法は、抗原結合分子を産生するために使用され得、抗原結合分子又は変異体抗原結合分子のＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的は少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２０％から約５０％、より具体的には少なくとも約２０％から約２５％、及びより具体的には少なくとも約３０％から約３５％が二分枝され、非フコシル化されている。本発明のＡＢＭＳはまた、ＡＢＭのＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的は少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２０％から約２５％、及びより具体的には少なくとも約３０％から約３５％が二分枝され、非フコシル化されているＦｃ領域を含み得る。
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によって産生される、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃレセプター結合親和性の増加を有するように操作された抗ＣＥＡ抗原結合分子（例えば、変異体ＡＢＭ）に向けられる。エフェクター機能の増加は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害性の増加を含む）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。好ましい実施態様において、Ｆｃレセプター結合親和性の増加は、Ｆｃ活性化レセプター、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。一実施態様において、抗原結合分子又は変異体抗原結合分子は抗体、Ｆｃ領域を含む抗体断片、又は免疫グロブリンのＦｃ領域に対して等価である領域を含む融合タンパク質である。特に好ましい実施態様において、抗原結合分子又は変異体抗原結合分子はヒト化親和性成熟抗体である。
本発明はさらに、抗体依存性細胞傷害を含み、Ｆｃレセプター結合親和性を増加させ、好ましくは、Ｆｃ活性化レセプターへの結合を増加させ、及び／又はエフェクター機能を増加させた、本発明のＡＢＭのグリコフォームの生産のための宿主細胞系の生成及び使用のための方法を提供する。本発明にＡＢＭで使用される糖鎖操作の方法論は、米国特許第６６０２６８４号、米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８８４（Ａ１）号、米国仮特許出願第６０／４４１３０７号、及び国際公開第２００４／０６５５４０号により詳細が記載されており、その各々の内容全体が参照によりその全体が本明細書に援用される。本発明のＡＢＭは、別の方法として米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（ジェネンテック）、又は欧州特許第１１７６１９５（Ａ１）号、国際公開第０３／０８４５７０号、同第０３／０８５１１９号、及び米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、同２００４／０９３６２１号、同２００４／１１０２８２号、同２００４／１１０７０４号、同２００４／１３２１４０号（Ｋｙｏｗａ）に開示された技術に従って、Ｆｃ領域にフコース残基を減少させるように糖鎖を操作することができる。これらの文書の各々の内容は、参考により本明細書にその全体が援用される。本発明の糖鎖を操作されたＡＢＭは、また、米国特許出願公開第６０／３４４１６９号、及び国際公開第０３／０５６９１４号(GlycoFi,Inc.）又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第２００４／０２４９２７号（Greenovation)に教示されたように、修飾された糖タンパク質を生産する発現系において生成することができ、その各々の内容はここにその全体が参考により援用される。
グリコシル化パターンの変化を有するタンパク質の産生のための細胞系の生成
一態様にて、本発明は、グリコシル化パターンの修飾を有する本発明のＡＢＭの生成のための宿主発現系を提供する。特に、本発明は、改善された治療的価値を有する本発明のＡＢＭの糖型の生成のための宿主細胞系を提供する。それゆえに、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するように選択又は操作された宿主細胞発現系を提供する。一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性はＧｎＴＩＩＩ活性である。一実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ存在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。詳細には、このような宿主細胞発現系は、構成的又は調節されるプロモーター系に作動可能に連結された、ＧｎＴＩＩＩを有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むように操作され得る。
１つの特定の実施態様において、本発明は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、かつ異種ゴルジ存在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作されている宿主細胞を提供する。１つの態様において、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、かつ異種ゴルジ存在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子で操作されている。
一般的に、上記に議論される細胞系を含む任意の型の培養細胞系が、本発明の宿主細胞株を操作するためにバックグラウンドとして使用され得る。好ましい実施態様において、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、本発明の操作された宿主細胞を生成するためにバックグラウンド細胞系として使用される。
本発明は、本明細書に定義されるような異種ゴルジ存在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを含む、ＧｎＴＩＩＩ活性などのグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する任意の操作された宿主細胞を含むことを意図する。
グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする１つ又はいくつかの核酸が、構成的プロモーター又は代替的には、調節された発現系の制御下で発現され得る。このような系は当該技術分野において周知であり、これは上記に議論した系を含む。グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩ活性を有し、かつ異種ゴルジ存在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系中に含まれる場合、それらのいくつかは構成的プロモーターの制御下で発現され得るのに対して、その他は調節されるプロモーターの制御下で発現される。グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドの発現レベルは、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、レポーター遺伝子発現分析、又はグリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩ活性の測定を含む、当該技術分野において一般的に公知である方法によって決定される。代替的には、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物に結合するレクチン、例えば、Ｅ４−ＰＨＡレクチンが利用されてもよい。代替的には、グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で操作された細胞によって産生される抗体によって媒介される、Ｆｃレセプター結合の増加又はエフェクター機能の増加を測定する機能的アッセイが使用されてもよい。
グリコシル化パターンの修飾を有するタンパク質を発現するトランスフェクト体又は形質転換体の同定
変異体抗ＣＥＡ ＡＢＭ（例えばヒト化、親和性成熟型及び／又は安定性成熟型ＡＢＭ）のコード配列を含み、かつ生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的アプローチ：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在又は非存在；（ｃ）宿主細胞中のそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現によって測定されるような転写物のレベルを評価すること；及び（ｄ）免疫アッセイによって、又はその生物学的活性によって測定されるような遺伝子産物の検出によって同定されてもよい。
第１のアプローチにおいて、変異体抗ＣＥＡ ＡＢＭのコード配列及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列の存在は、それぞれのコード配列、又はその部分もしくは誘導体それぞれに相同であるヌクレオチド配列を含むプローブを使用するＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出され得る。
第２のアプローチにおいて、組換え発現ベクター／宿主系は、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキサートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける顆粒体形成など）の存在又は欠如に基づいて同定及び選択され得る。例えば、本発明のＡＢＭのコード配列又はその断片、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入される場合、それぞれのコード配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の欠如によって同定され得る。代替的には、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために使用される同じか又は異なるプロモーターの制御下でコード配列とともにタンデムに配置され得る。誘導又は選択に応答したマーカーの発現は、本発明のＡＢＭのコード配列及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列の発現を示す。
第３のアプローチにおいて、本発明のＡＢＭのコード領域、又はその断片、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列についての転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイによって評価され得る。例えば、ＲＮＡは、本発明のＡＢＭのコード配列又はその断片、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列又はその特定の部分に相同であるプローブを使用するノーザンブロットによって単離及び分析され得る。代替的には、宿主細胞の全体の核酸は、抽出され得、及びこのようなプローブへのハイブリダイゼーションについてアッセイされ得る。
第４のアプローチにおいて、タンパク質産物の発現が、例えば、ウェスタンブロット、放射性免疫沈降、酵素結合免疫アッセイなどの免疫アッセイによって、免疫学的に評価され得る。しかし、発現系の成功の究極的な試験は、生物学的に活性な遺伝子産物の検出を含む。
抗原結合分子の抗ＣＥＡを使用する治療への応用と方法
本発明はまた、ＣＥＡを発現する細胞をインビボ又はインビトロで標的とするための方法に向けらている。ＣＥＡを発現する細胞を治療目的のために標的とすることができる（例えば、免疫系による破壊のためＣＥＡ発現細胞を標的とすることで疾患を治療するために）。一実施態様において、本発明は、被験体に、本発明のＡＢＭを含む組成物を投与することを含む、ＣＥＡを発現する細胞を標的とするための方法に向けられている。ＣＥＡを発現する細胞また、診断目的のために標的とされ得る（例えば、それらがＣＥＡを正常又は異常に発現しているかどうかを決定することなど）。従って、本発明はまた、ＣＥＡの存在又はＣＥＡを発現する細胞を検出するための方法に向けられている。本発明によればＣＥＡの発現を検出する一つの方法は、ＡＢＭ及びＣＥＡとの複合体の形成を可能にする条件下で、テストする試料を必要に応じてコントロール試料と、本発明のＡＢＭと、接触させることを含む。複合体形成は、その後（例えば、ＥＬＩＳＡ又は当技術分野で公知の他の方法により）検出される。試験試料とともにコントロール試料を用い、試験試料及びコントロール試料を比較する場合、ＡＢＭ−ＣＥＡ複合体の形成における任意の統計的な有意差は、被験試料中のＣＥＡの存在を示している。
一態様において、本発明のＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、ＣＥＡを発現する標的細胞をインビボ又はインビトロで使用することができる。ＣＥＡを発現する細胞は、診断又は治療目的のために標的することができる。一態様において、本発明のＡＢＭは、試料中のＣＥＡの存在を検出するために使用することができる。ＣＥＡは同一細胞型の非腫瘍組織に比べて多くのヒト腫瘍で異常に発現される（例えば、過剰発現される）。従って、本発明のＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、腫瘍形成の予防、腫瘍の根絶及び腫瘍増殖又は転移の阻害に特に有用である。本発明のＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭはまた、細胞周期を停止し、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）のアポトーシスを引き起こし、血管新生及び／又は標的細胞の分化を阻害することに作用する。本発明のＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、ＣＥＡを発現する任意の腫瘍を治療するために使用することができる。本発明のＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭで治療することができる特定の悪性腫瘍としては、限定されないが、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌及び乳癌を含む。
本明細書に開示された抗ＣＥＡ ＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、腫瘍増殖を阻害又は腫瘍細胞を殺すために単独で使用することができる。例えば、抗ＣＥＡ ＡＢＭＳは、癌細胞の細胞膜又は細胞表面上にあるＣＥＡに結合することができ、癌細胞の、例えば、ＡＤＣＣ又は他のエフェクターが媒介する死滅を誘発する。抗ＣＥＡ ＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、ヒト化することができ、具体的には、親和性及び／又は安定性が成熟し、より具体的には、糖鎖が操作され、安定性及び親和性が成熟され得る。
ＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、代わりに、特に物理的に別の化合物の結合を妨害することにより、ＣＥＡ抗原の活性をブロックするために単独で使用することができる。例えば、抗原結合分子及び変異体抗原結合分子は、ＣＥＡが介在する細胞接着をブロックするために使用することができる。
本発明の抗ＣＥＡ ＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭは、例えば以下に説明する薬学的に許容される剤形で、一定期間のボーラス投与として又は連続注入としてヒト静脈内に投与することができるものを含み、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、又は吸入経路により、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。ＡＢＭも局所的並びに、全身の治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病変部周囲の経路により適切に投与される。腹腔内経路は、例えば、大腸腫瘍の治療に特に有用であることが期待されている。
病気の治療のために、ＡＢＭ及び／又は変異体ＡＢＭの適切な用量は、治療する疾患の種類、疾患の重篤度及び経過、以前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、及び主治医の裁量に依存する。ＡＢＭは、一回、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
本発明は、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させるための方法を提供する。この方法は、本発明の抗原結合分子又は複合体（例えば、免疫毒素）を前記腫瘍細胞と反応させることを含む。これらの腫瘍細胞は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌、及び乳癌を含むヒト癌に由来し得る。
一実施態様において、本発明は、腫瘍細胞のＣＥＡ介在細胞接着を阻害する方法提供する。この方法は、前記腫瘍細胞を本発明の抗原結合分子又は変異体抗原結合分子と、又はそのコンジュゲートと接触させることを含む。これらの腫瘍細胞は、結腸直腸癌細胞、非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ）、胃癌細胞、膵臓癌細胞及び乳癌細胞を含むヒト細胞に由来しうる。
さらに、本発明は、インビボで癌（例えば、ヒト癌）を治療する方法を提供する。この方法は、被験体に本発明の抗原結合分子又は免疫複合体（例えば、免疫毒素）の少なくとも１つを含有する組成物の薬学的有効量を投与することを包含する。
更なる態様において、本発明は、限定されないが、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌細胞、膵臓癌細胞及び乳癌細胞を含む、ＣＥＡの過剰発現によって特徴付けられた癌を、本明細書に開示された抗ＣＥＡ抗原結合分子又はその変異体抗原結合分子の治療有効量を投与することにより、治療するための方法に向けられている。
更なる実施態様において、本発明は、本明細書に開示された、抗ＣＥＡ抗原結合分子又は変異体抗原結合分子を使用して、被検体に腫瘍組織の退縮を誘導するための方法に向けられている。非限定的な腫瘍組織の例としては、大腸腫瘍、非小細胞肺癌の腫瘍、胃腫瘍、膵腫瘍及び乳腺腫瘍が含まれる。特定の実施態様では、腫瘍組織は大腸腫瘍である。
本発明の実施に応じて、被験体は、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ、鳥の被験体であり得る。他の温血動物もまた本発明に含まれる。
本発明はさらに、腫瘍細胞の増殖を阻害し、被験体の腫瘍を治療し、被検体の増殖型の疾患を治療するるための方法を提供する。これらの方法は、被検体に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。
別の態様において、本発明は、異常なＣＥＡの発現に関連した疾患を治療するための医薬の製造のために、本明細書に開示される抗ＣＥＡ抗原結合分子又は変異体抗原結合分子の使用に向けられている。特定の実施態様では、疾患は、限定されないが、大腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、膵腫瘍及び乳腺腫瘍を含む、ＣＥＡを過剰発現する癌である。特定の実施態様では、腫瘍は大腸腫瘍である。
抗ＣＥＡ抗原結合分子複合体
本発明はまた、一つ以上の細胞傷害性薬物、例えば、化学療法剤又は薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はその断片）又は放射性同位体などに結合した本明細書の抗ＣＥＡ ＡＢＭ又は変異体ＡＢＭを含む、免疫複合体を提供する。
一実施態様において、免疫複合体は、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、そこでは、抗体が、限定されないが、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０ ４２５ ２３５ Ｂ１号を参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び第５，７８０，５８８号及び第７，４９８，２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、及び第５，８７７，２９６号； Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）、及びオルタタキセルなどのタキサン；及びＣＣ１０６５を含む、一又は複数の薬物に結合している。
別の実施態様において、免疫複合体は、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素又はその断片に結合した、本明細書に記載の抗ＣＥＡ ＡＢＭ又は変異体ＡＢＭを含む。
別の実施態様において、免疫複合体は、放射性原子に結合し、放射性複合体を形成する、本明細書に記載の抗ＣＥＡ ＡＢＭ又は変異体ＡＢＭを含む。様々な放射性同位体が、放射性複合体の生産用に利用可能である。例として、Ａｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５，Ｙ９０，Ｒｅ１８６，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ２１２，Ｐ３２，Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。検出のために放射性複合体を使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
抗体と細胞傷害性薬物の複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
本明細書において、免疫複合体又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ．， Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製される複合体を明確に考慮する。
組成物、製剤、投与量、及び投与経路
一態様において、本発明は、本発明の抗ＣＥＡ ＡＢＭ又は変異体ＡＢＭを含む薬学的組成物及び薬学的に許容される担体に向けられている。本発明は更に、癌などの疾患の治療法、及び癌などの疾患の治療のための医薬の製造における、そうした薬学的組成物の使用に向けられている。具体的には、本発明は、疾患の治療のための方法、より具体的には、癌の治療のための方法に向けられており、該方法は本発明の薬学的組成物の治療有効量を投与することを含む。
一態様において、本発明は、薬学的組成物、組み合わせ、ヒト癌、例えば、結腸直腸癌を治療するための方法を包含する。例えば、本発明は、本発明の抗体の薬学的有効量、及び薬学的に許容される担体を含むヒト癌の治療に使用するための薬学的組成物を含む。
本発明のＡＢＭ組成物は、限定されないが、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内を含む従来の投与形式、又は直接腫瘍への投与を用いて投与される。静脈内投与が好ましい。
本発明の一態様において、本発明のＡＢＭを含む治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(RemingtonのPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と所望の純度を有する抗体を混合することにより、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性である。
インビボ投与に使用されるべき製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。
本発明の薬学的組成物の投与及び投薬レジメンの最も効果的な機序は、疾患の重症度及び経過、患者の健康及び治療への応答、及び治療にあたる医師の判断に依存する。従って、組成物の投与量は、個々の患者に対して滴定する必要がある。にも関わらず、この発明の組成物の有効用量は通常、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２０００ｍｇ／ｋｇの範囲になり得る。
本明細書に記載の分子は、様々な剤形であり得、限定されないが、液体溶液又は懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、高分子マイクロカプセル又は微小胞、リポソーム、及び注射可能溶液又は注入可能溶液を含む。好ましい形態は、投与方法及び治療への適用に依存する。
本発明のＡＢＭを含む組成物は、処方され、服用され、良好な医療行為の一貫した方法で投与される。この文脈において検討するための要因は、治療される特定の疾患又は障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の病態、疾患又は障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、管理のスケジューリング、及び開業医に知られているその他の要因を含む。投与されるべきアンタゴニストの治療的有効量は、そうした考慮に左右される。
製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
上記の製造品のいずれかは、抗ＣＥＡ ＡＢＭの代わりか又はそれに加えて、本発明の免疫複合体を含み得ることが理解される。
以下の例は、本発明をより詳細に説明する。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられる。本発明は、しかしながら、例示の実施態様による範囲に限定されるものではなく、本発明の単一側面の実例として意図されており、及び機能的に同等な方法は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が前述の説明及び添付図面から当業者に明確になるであろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。
特に指定されない限り、以下の実施例の特定のアミノ酸残基の位置の番号への参照は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従っている。
実施例１
親和性成熟ライブラリの生成
Ｈ１／Ｈ２ライブラリー
ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２領域における無作為化された親和性成熟ライブラリの生成のために、ＣＤＲ１中の位置Ｆ３２ Ｇ３３、ＣＤＲ２中の位置Ｗ５０ Ｎ５２ Ｔ５２ａ Ｋ５２ｂ Ｔ５４ Ｅ５６ Ｔ５８をコード化するトリプレットが無作為に選ばれた。最初の工程で、ＤＮＡ断片（断片１）は、テンプレートとしてｐＭＳ２２及び無作為化ＣＤＲ１の位置を含むプライマーＭＳ−４３（配列番号１２３）とＥＡＢ−６７９（配列番号１２７）を用いて増幅された（図１１）。同じテンプレートを使用して、プライマーＭＳ−５６（配列番号１２６）及びＭＳ−５２（配列番号１２４）は、断片１の３’末端との重複領域を有する第二断片（断片２）を増幅した。増幅条件は、最初の５分間９４℃でのインキュベーション工程が含まれ、その後、断片１及び断片２のそれぞれにおいて、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び２０秒間及び５０秒間の７２℃伸長工程を含む各サイクルが２５サイクル続いた。最後に、最終の１０分間７２℃のインキュベーション工程が実施された。両断片はアガロースゲル上で精製された。プライマーＭＳ−４３（配列番号１２３）とＥＡＢ−６８０（配列番号１２８）を使用して、断片１と２による重複伸長ＰＣＲは、ＣＤＲ２の無作為化位置を含み、無作為化された両方のＣＤＲを持つ断片を生成した（断片３）。断片１及び２のアセンブリに対して、断片１及び断片２の等モル量が使用された。増幅条件は、最初の５分間９４℃のインキュベーション工程を含み、その後プライマー無しで、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び４０秒間７２℃の伸長工程の各サイクルが５サイクル続いた。外側のプライマーを添加した後、さらに２０サイクルが同じパラメータを用いて実施された。断片３の３ '領域と重なった第４断片（断片４）が、テンプレートとして再びｐＭＳ２２、及びプライマーＭＳ−５５（配列番号１２５）及びＭＳ−５２（配列番号１２４）を用いたＰＣＲ増幅された。ゲル精製した後、最終的なオーバーラップ伸長ＰＣＲは、テンプレートとして断片３及び４、及びプライマーＭＳ−４３及びＭＳ−５２を使用して、ＣＬ及びＶＨの一部分を含む断片を生成した。このために、断片３及び断片４の等モル量を用いた。増幅条件は最初の５分間９４℃インキュベーション工程を含み、その後プライマー無しで、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び８０秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが５サイクル続いた。外側のプライマーを添加した後、更に２０サイクルが同じパラメータを用いて実施された。得られた断片は次いでゲル精製及びＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化後にｐＭＳ２２と連結された。
Ｌ１／Ｌ２ライブラリー
LＣＤＲ１及びLＣＤＲ２領域における無作為化された親和性成熟ライブラリの生成のために、ＣＤＲ１中の位置Ｑ２７、Ｎ２８、Ｖ２９、Ｇ３０ Ｔ３１ Ｎ３２、ＣＤＲ２中の位置Ｙ４９ Ｓ５０ Ｙ５３ Ｒ５４ Ｙ５５ Ｓ５６をコード化するトリプレットが無作為に選ばれた。最初の工程で、ＤＮＡ断片（断片１）は、テンプレートとしてｐＭＳ２２及び無作為化ＣＤＲ１の位置を含むプライマーＥＡＢ−６８５（配列番号１２９）及びＥＡＢ−６８１（配列番号１３３）を用いて増幅された（図１２）。同じテンプレートを使用して、プライマーＥＡＢ−６８６（配列番号１３０）及びＥＡＢ−６８７（配列番号１３１）は、断片１の３’末端との重複領域を有する第二断片（断片２）を増幅した。増幅条件は、最初の５分間９４℃でのインキュベーション工程が含まれ、その後、断片１及び断片２のそれぞれにおいて、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び６０秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが２５サイクル続いた。最後に、最終の１０分間７２℃のインキュベーション工程が実施された。両断片はアガロースゲル上で精製された。プライマーＥＡＢ−６８５（配列番号１２９）及びＥＡＢ−６８２（配列番号１３４）を使用して、断片１と２による重複伸長ＰＣＲは、ＣＤＲ２の無作為化位置を含み、無作為化された両方のＣＤＲを持つ断片を生成した（断片３）。断片１及び２のアセンブリに対して、断片１及び断片２の等モル量が使用された。増幅条件は、最初の５分間９４℃のインキュベーション工程を含み、その後プライマー無しで、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び６０秒間７２℃の伸長工程の各サイクルが５サイクル続いた。外側のプライマーを添加した後、さらに２０サイクルが同じパラメータを用いて実施された。断片３の３ '領域と重なった第４断片（断片４）が、テンプレートとして再びｐＭＳ２２、及びプライマーＥＡＢ−６８８（配列番号１３２）及びＥＡＢ−６８７（配列番号１３１）を用いたＰＣＲ増幅された。ゲル精製した後、最終的なオーバーラップ伸長ＰＣＲは、テンプレートとして断片３及び４、及びプライマーＥＡＢ−６８５（配列番号１２９）及びＥＡＢ−６８７（配列番号１３１）を使用して、ＶＬ及びＣＨの一部分を含む断片を生成した。このために、断片3及び断片４の等モル量を用いた。増幅条件は最初の５分間９４℃インキュベーション工程を含み、その後プライマー無しで、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び８０秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが５サイクル続いた。外側のプライマーを添加した後、更に２０サイクルが同じパラメータを用いて実施された。得られた断片は次いでゲル精製及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ消化後にｐＭＳ２２と連結された。
Ｈ３ライブラリー
ＨＣＤＲ３領域内の無作為化された親和性成熟ライブラリーを生成するために、位置Ｗ９５、Ｄ９６、Ｆ９７、Ｙ９８、Ｄ９９、Ｙ１００、Ｖ１００ａ、Ｅ１００ｂ、Ａ１００ｃ、及びＭ１００ｄをコードするトリプレットは、２つの異なるアプローチに無作為化された。：（１）セグメント全体（Ｈ３完全ライブラリー）の無作為化、又は（２）各位置の個々の無作為化は１０個のサブライブラリ−を与えた。個別に無作為化された位置を持つクローンを含むサブライブラリ−は、細菌（Ｈ３プールライブラリ−）への形質転換の後にプールされた。ＨＣＤＲ３領域の無作為化のために、断片は、ＣＬの３’末端でアニールされたプライマー及びＨＣＤＲ３の無作為化配列（図１３）を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。次いで重複伸長ＰＣＲが、断片１の３’末端と重なり、ＶＨの終端及びＣＨ１の５’領域を含む第二の断片を用いて行われた。集合断片はＳａｃＩ／ＮｈｅＩ消化後ｐＭＳ２２へ連結された。Ｈ３プールライブラリを生成するために、１０個のＤＮＡ断片は、プライマーＥＡＢ−７４９（配列番号１４６）と組み合わせてプライマーＡＣ７−ＡＣ１６（配列番号１３５；配列番号１４４）の各々を用いて別個にＰＣＲ増幅された。Ｌ３完全ライブラリを生成するために、プライマーＡＣ１７（配列番号１４５）及びＥＡＢ−７４９（配列番号１４６）が使用された。プラスミドｐＭＳ２２が、テンプレートとして使用された。増幅条件は最初の５分間９４℃インキュベーション工程を含み、その後、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び３６秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが２５サイクル続き、その後最終の１０分間７２℃のインキュベーション工程が続いた。これによりアガロースゲル上で精製した約５８０ｂｐ長の断片を得た。重複伸長ＰＣＲのために、第二の断片はＥＡＢ−７５２（配列番号１４９）と組み合わせて、ＥＡＢ−７５０（配列番号１４７）又はＥＡＢ−７５１（配列番号１４８）の何れかのプライマーを用いて増幅された。プライマーＥＡＢ−７５０（配列番号１４７）は、無作為化プライマーＡＣ７−１１（配列番号１３９）と重複配列を有し、一方ＥＡＢ−７５１（配列番号１４８）は無作為化プライマーＡＣ１２−１７（配列番号１４０−１４５）と配列相同性を共有していた。増幅条件は最初の５分間９４℃インキュベーション工程を含み、その後、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び１２秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが２５サイクル続き、その後最終の１０分間７２℃のインキュベーション工程が続いた。得られた断片はおよそ１８０ｂｐ長であった。両方の断片の集合に対して、断片１及びそれに対応する断片２の等モル量が使用された。増幅条件は最初の５分間９４℃インキュベーション工程を含み、その後、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び６０秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが５サイクル続いた。外側のプライマーＥＡＢ−７４９（配列番号１４６）及びＥＡＢ−７５２（配列番号１４９）を添加した後、更に２０サイクルが同じパラメータを用いて実施された。最後に、最後の１０分間７２℃でのインキュベーション工程が実施された。ゲル精製断片は次いでＳａｃＩ／ＮｈｅＩ消化後にｐＭＳ２２へ連結され、精製されたライゲーションが電気穿孔法によりＴＧ１細菌に形質転換された。
Ｌ３ライブラリー
軽鎖のＣＤＲ３領域内の無作為化された親和性成熟ライブラリーを生成するために、位置Ｙ９１、Ｙ９２、Ｔ９３、Ｙ９４、及びＬ９５ａをコードするトリプレットは、セグメント全体（L３完全ライブラリー）又は各々の何れかで無作為化され、５個のサブライブラリ−を得た。個別に無作為化された位置を持つクローンを含むサブライブラリ−は、細菌（Ｌ３プールライブラリ−）への形質転換の後にプールされた。５個のサブライブラリ−の生成のために、５個のＤＮＡ断片が、プライマーＭＳ４３（配列番号１２３）との組み合わせでプライマーＡＣ１−ＡＣ５（配列番号１５０−１５４）のそれぞれを用いてＰＣＲ増幅された。Ｌ３完全ライブラリ−を生成するために、ＡＣ６（配列番号１５５）及びＭＳ４３（配列番号１２３）のプライマーの組み合わせが使用された（図１４）。プラスミドｐＭＳ２２が、テンプレートとして使用された。増幅条件は最初の５分間９４℃インキュベーション工程を含み、その後、１分間９４℃の変性、１分間５５℃のアニーリング、及び２５秒間７２℃の伸長工程を含む各サイクルが２５サイクル続き、その後最終の１０分間７２℃のインキュベーション工程が続いた。ＶＬドメインの位置１から１０４までを包含する得られた断片はアガロースゲル上で精製され、追加のＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用された。全ての反応は上記と同じ条件を用いて無作為化プライマー及びＭＳ４３（配列番号１２３）との重複配列を有するプライマーＥＡＢ−７４６（配列番号１５６）で実施された。精製断片並びにｐＭＳ２２はＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化された。全５個のサブライブラリについて、０．５μｇの挿入は、０．５μｇのｐＡＣ１６と連結された。Ｌ３完全ライブラリ−について、ライゲーションは９．８μｇの挿入及び９．８μｇのｐＭＳ２２により実施された。精製されたライゲーションは電気穿孔法によってＴＧ１細菌に形質転換された。
抗原の産生
マウス及びヒト化ＰＲ１Ａ３抗体の両方が膜結合ＣＥＡのみを認識するが、離脱した可溶性ヒトＣＥＡを与えないので、ＰＲ１Ａ３のエピトープを含む組換えキメラタンパク質はヒト化ＰＲ１Ａ３のインビトロ親和性成熟のために生成された（配列番号７及び８）。このハイブリッドタンパク質の生成はSteward ら（1999）に記載の通り行われた。簡潔には、ヒトの胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）のＢドメインのＤＮＡ配列が、ＰＲ１Ａ３のエピトープを含むヒトＣＥＡ−Ｂ３ドメインの配列に置き換えられた。その結果、配列は、ＢＧＰのＮ及びＡ１ドメイン、ＣＥＡのＢ３ドメイン及びＢＧＰのＡ２ドメインを含むハイブリッドタンパク質をコードしている（Ｎ−Ａ１−Ｂ３−Ａ２、ｈｕＮＡＢＡ）。この融合産物は、次いでヒトＩｇＧ１のＦｃ部分にリンクされるか（ｈｕＮＡＢＡ−Ｆｃ） (Stewardら、Cancer Immunol Immunother, 47:299-306, 1999)、又は正確なプロテアーゼ切断部位、ａｖｉタグ及び（Ｈｉｓ）６タグをコードする配列に融合するか（ｈｕＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓ) (配列番号１５８)の何れかであった。ｈｕＮＡＢＡ−Ｆｃは、プロテインＡカラムを用いて安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株の培養上清から精製された。ｈｕＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓ（配列番号１５８）は、安定してＥＢＶ由来タンパク質ＥＢＮＡを発現するＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクトした。同時にビオチンリガーゼをコードする同時形質移入されたプラスミドは、インビトロでａｖｉタグ固有のビオチン化を可能とした。タンパク質は、その後、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてゲル濾過により精製された。
ヒト化ＰＲ１Ａ３の親和性成熟
親和性成熟ヒト化ＰＲ１Ａ３ Ｆａｂの生成は、標準プロトコルを使用して、ファージディスプレイによって行われた (Silacci ら、Proteomics, 5(9):2340-2350, 2005)。親和性成熟ライブラリーによる選択は以下の手順に従って溶液中で実施された：[１]．各親和性成熟ライブラリーのおよそ１０１２ファージミド粒子を１００ｎＭのビオチン化ｈｕＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓに１ミリリットルの総体積で０．５時間結合させ、[２]．ビオチン化ｈｕＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓ及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７のストレプトアビジン被覆磁気ビーズの３分間の添加により、捕獲し、[３]．ビーズを５−１０×１ｍｌＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５−１０×１ｍｌＰＢＳを用いて洗浄し、[４]．１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）を１０分間の添加によりファージ粒子を溶出し、及び５００ｕｌの１Ｍトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４を加えることによる中和し、及び、[５]．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３により感染させ、続いて、その後の選択のラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させる。選択は一定又は減少する抗原濃度（１０−７Ｍから２ｘ１０−９Ｍ）のいずれかを使用して、３から５回のラウンドで行われた。ラウンド2において、抗原：ファージ複合体の捕捉が、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて行われた。特異的バインダーは、次のようにＥＬＩＳＡにより同定した：ウエルあたり１０ｎＭのビオチン化ｈｕＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓの１００μｌはニュートラビジンプレート上に被覆された。Ｆａｂを含む細菌の上清が添加され、結合したＦａｂは抗フラグ／ＨＲＰ二次抗体を使用して、フラグ-タグを介して検出された。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを９６穴フォーマットに可溶性Ｆａｂ断片として細菌に発現させ、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を使用して、ＳＰＲ分析により、上清は動力学的スクリーニング実験にかけられた。最も高い親和性定数を持つＦａｂを発現するクローンを同定し、対応するファージミドが配列決定された。
Ｆａｂの精製及び動力学的パラメーターの測定
動力学パラメータの正確な分析のために、Ｆａｂを細菌培養から精製した。５００ｍｌの培養は播種され、ＯＤ６００が０．９にて１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細菌は２５℃で一晩インキュベートし、遠心分離によって回収した。再懸濁したペレットを２５ｍｌのＰＰＢ緩衝液（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ ＰＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％ショ糖）で２０分間のインキュベーションした後、細菌は再び遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーション工程は、５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液２５ｍｌで一回繰り返した。両方のインキュベーション工程の上清をプールし、ろ過し、ＩＭＡＣカラム（His gravitrap、GE Healthcare）にロードされた。その後、カラムを４０体積で洗浄した。溶出した後に（５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４ 、ｐＨ７．４） 、溶出液はＰＤ１０カラム（GE Healthcare）を使用して再バッファリングされた。精製されたＦａｂの速度論的パラメータは、２００ｎｍから６．２５ｎＭの範囲にあった希釈列にてＳＰＲ分析により調べられた。
実施例２
ＰＲ１Ａ３抗体は、ヒトＩｇＧ１／ｋａｐｐａ定常領域を持たせるようにキメラ化され、及びＦｃにおいて高度にフコシル化された糖を持たせるためにＧｙｌｃｏＭａｂ技術を用いて発現された。糖鎖を操作された抗体及び糖鎖は操作されてない抗体は、エフェクターとターゲットの比率が２５：１で比較された。抗体依存性標的細胞死滅の最大量は、Fc領域の糖鎖操作により倍増した（図２）。細胞死滅の更なる増加はエフェクターとターゲットの比を増加させることにより達成された（図２）。
ＰＲ１Ａ３は、ヒト生殖細胞配列と同一のフレームワークを使用してヒト化された。ＩＭＧＴ配列ＩＧＨＶ７−４−１＊０２（受入番号Ｘ６２１１０）は、ヒト化ＶＨに対するアクセプターであり、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿１＿３９（受入番号Ｘ５９３１５）はヒト化ＶＬに対するアクセプターであった。重鎖可変領域コンストラクトＣＨ７Ａを含むヒト化ＰＲ１Ａ３抗体、及び軽鎖可変領域ＣＬ７Ａは、フローサイトメトリーによって測定され、ヒト結腸癌細胞への十分な結合を示した（図３）。
ファージディスプレイによるＰＲ１Ａ３の親和性成熟は、本明細書に、実施例１で詳細に説明されるように標準プロトコルを用いて行われた。親和性成熟のために使用された親ヒトＰＲ１Ａ３抗体は、重鎖可変領域コンストラクトＣＨ７Ａ、及び軽鎖可変領域コンストラクトＣＬ１Ａを含む。以下の表３−６は、親和性成熟のために使用されるライブラリを示している。Ｌ１／Ｌ２ライブラリについては、ＣＤＲ内に位するバリン２９、アラニン５０、又はセリン５１は一定に保たれた。Ｈ１／Ｈ２ライブラリについては、ＣＤＲ内に位置するイソロイシン５１、グリシン５５、又はアラニン５７は一定に保たれた（図４及び図５）。
親和性成熟重鎖可変領域コンストラクトＣＨ７Ａ ｒＦ９、及び親和性成熟軽鎖可変領域コンストラクトＣＬ１Ａ ｒＨ１１は、お互いにそれぞれ親の軽鎖可変領域コンストラクト及び重鎖可変領域の構造とペアをなした。すべての抗体は、ヒトＩｇＧ１／ｋａｐｐａに変換され、ＣＥＡ陽性細胞株ＭＫＮ４５への結合は、フローサイトメトリーで測定された。親和性成熟した重鎖又は軽鎖可変領域の何れか一つ、又は親和性成熟した重鎖又は軽鎖可変領域の両方を含む抗体は、ヒト化親抗体と比べて改善された結合特性を示した（図６）。図６、図１０及び図１５は、成熟軽鎖及び重鎖が独立して親和性増加に寄与するいくつかの例を示している。親抗体ＣＨ７Ａ ＣＬ１Ａは、図６と図１５において最低シグナル強度、並びに最高のＥＣ５０値を有する。成熟軽鎖は、ＥＣ５０値を低い数字にシフトさせ、成熟した重鎖（図６のｒＦ９、及び図１５のｒＢ９）はフローサイトメトリー測定における総蛍光シグナル強度をシフトさせる。図１０は、ビアコア方法で測定した重鎖及び軽鎖の個々の寄与を示す。これら２つの鎖の組み合わせは、さらに親和性を向上させる。更に、図１６に示すように、親和性の改善はＡＤＣＣの特徴の改善へと導く。
親和性成熟重鎖及び軽鎖のＣＤＲの結合親和性はビアコアによって決定され、図３４ＡとＢにリストされた。
図３５は、様々な親和性成熟抗体配列の親和性定数をまとめている。親抗体ＰＲ１Ａ３は、成熟、及び非成熟配列のいくつかの軽鎖及び重鎖の組合わせとともに、記載されている。全ての値は、ビアコア技術により、抗原として固定化ＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓ試薬（配列番号１５８）により、ビアコアチップ上のＦａｂ形態での様々な可溶性抗体コンストラクトの会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を測定することにより、得られた。親和性定数はＫＤのラベルが付される。
実施例３
実施例２に記載の親和性成熟型抗ＣＥＡ抗体の生産に使用されるアクセプターフレームワークは、ヒトＶＨ７クラスのものであった。安定性を増加させるために、より安定なフレームワーク配列が、抗体の安定性操作のための基礎として使用された。マウス抗体ＰＲ１Ａ３の配列相同性、及びＶＨ１由来配列は、ＶＨ７、又はヒトＶＨ族の偶数よりもより高い内因性安定性を有するはずであるという仮説に基づいて、配列ＩＧＨＶ−１−１８； 受託番号Ｍ９９６４１が新しいアクセプターフレームワークとして使用された（Ewert, S., Huber, T., Honegger, A. and Pluckthun, A. (2003) J. Mol.Biol., 325, 531-553）。ＰＲ１Ａ３抗体の通常のＣＤＲループ移植がＣＨ１Ａ（配列番号２７９）の構築につながる。残念なことに、この分子はＣＥＡ抗原に対する有意な結合活性を示さなかった。この構築物の結合活性は、様々な濃度で、マウス由来の可変ドメインを保有するキメラ抗体ＰＲ１Ａ３の結合活性に対して比較した。ＢｘＰＣ３細胞が、ＣＥＡに対する抗体の特異的結合のために使用され、結合強度はＦＡＣＳ解析により測定された（図１７）。
結合親和性を回復するために、複数の逆変異がＣＨ１Ａ配列中に導入され、新しい重鎖ＣＨ１Ａ１（配列番号２５７）、ＣＨ１Ａ２（配列番号２５８）、ＣＨ１Ａ３（配列番号２５９）、及びＣＨ１Ａ４（配列番号２６０）を生成した。ＣＨ１Ａ１は、Ｍ６９Ｆ／Ｔ７１Ｌの二重点変異を含む。後者の３つの変異体は、マウスの対応物により置換された、フレームワーク１、２、又は３の全体をそれぞれ有する。図１８は、２Ｆ１軽鎖（配列番号２０９）と対合したときのそれらの構築物の結合を示す。このアッセイにおいて、ＣＨ１Ａに基づく抗体変異体の、ＣＥＡ発現ＭＫＮ−４５細胞に対する細胞結合が、様々な濃度で解析された。親和性成熟型軽鎖Ｆ２１は、元の軽鎖ＣＬ１Ａが使用される親抗体を除いて、試験された全抗体において同一であった。平均蛍光は、ＦＡＣＳ解析により決定した。図１９は、試料の動的光散乱（ＤＬＳ）により測定される、２Ｆ１軽鎖と都合したときのそれらの構築物の安定性を示す。ＤＬＳアッセイは、２０ｍＭのヒスチジンと１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０の緩衝液中で、１ｍｇ／ｍｌの抗体を用いて実施された。ＤＬＳアッセイは、２５℃で開始し、０．０５℃／分の増分温度上昇を伴い、上限７０℃まで行われた。このアッセイで試験された全抗体は、軽鎖として２Ｆ１を有していた。
ＣＨ１Ａ１はなお元の安定性を保し、いくらか有意な（しかし、最高親和性であるが最低の安定性である、ＣＨ１Ａ４よりも若干弱い）結合を示すので、この構築物が、結合の更なる最適化に選択された。新しい重鎖ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）、ＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）、ＣＨ１Ａ１Ｃ（配列番号２６３）、ＣＨ１Ａ１Ｄ（配列番号２６４）、ＣＨ１Ａ１Ｅ（配列番号２６５）、ＣＨ１Ａ１Ｆ（配列番号２６６）、及びＣＨ１Ａ１Ｇ（配列番号２６７）が生成された。ＦＲ１及びＦＲ３領域にほんのわずかな逆変異を持つＣＨ１Ａ１の本質的な変異体がある。図２０及び２１は、それらの親和性は、ＶＨ７に基づくヒト化構築物ＣＨ７Ａに依然としてやや劣るとはいえ全て同等であることを示している。図２０は、ＣＥＡ抗原を保有するキメラタンパク質ＮＡＢＡに対する、ＣＨ１Ａ１に基づくフレームワーク変異体の結合に関して得られたＰｒｏｔｅｏｎ（ビアコア）センサーグラムを示す。ビオチン化ＮＡＢＡは、ニュートラビジンコーティングされたチップ上に固定化し、抗体は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および０ｎＭにおける濃度で分析物として使用した。前駆体クローンＣＨ１Ａ１と親抗体ＣＨ７Ａは、直接的な比較のために含まれた。軽鎖２Ｆ１は、試験した全ての抗体において同一であった。図２１は、追加のフレームワーク変異を運ぶ７つのＣＨ１Ａ１に基づく変異体の結合強度を示す。抗体は、濃度系列のＣＥＡ発現ＭＫＮ４５細胞でインキュベートされ、結合強度は、ＦＡＣＳ分析によって測定した。前駆体クローンＣＨ１Ａ１が、直接比較のために含まれた。このアッセイで試験した全ての抗体は、軽鎖として２Ｆ１を持っていた。変異体のＣＨ１Ａ１ＡとＣＨ１Ａ１Ｂは、その比較的良好な精製収率と単量体での挙動に基づいて、ＶＨ１に基づくヒト化の最終変異体として選ばれた。
実施例４
親和性成熟の過程で選択されたＣＤＲ−Ｈ３の残基が、抗体の安定性の増加を試験するためにＰＲ１Ａ３配列に個別に導入された（図３６）。
図２２は、ＣＥＡ抗原（Stewart et al. Cancer Immunol Immunother (1999) 47:299-306により記述されるＮＡＢＡ試薬）に対する各抗体の（二価の形態で測定される）親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を示す。図２２に示されるのは、ＣＥＡ抗原を保有するキメラタンパク質ＮＡＢＡに対する、ＣＤＲ−Ｈ３抗体変異体の結合に関して得られたＰｒｏｔｅｏｎ（ビアコア）センサーグラムを示す。ビオチン化ＮＡＢＡは、ニュートラビジンコーティングされたチップ上に固定化し、抗体は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および０ｎＭにおける濃度で分析物として使用した。親和性成熟型前駆体クローン５ＨＦＦ１２と親抗体ＣＨ７Ａは、直接的な比較のために含まれた。このアッセイで試験された全ての抗体は、軽鎖として２Ｆ１を有していた。変異体ＣＨ７Ａ（Ｗ９５Ｙ）は、このアッセイでは測定可能な活性を示さず、他のすべての変異体は、互いの１０倍以内を対象とする親和性を示す。二価の形態で測定されたそれぞれの相対的親和性は、次のとおりである：５ＨＦＦ１２＞ＣＨ７Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）＞ＣＨ７Ａ（Ｙ９８Ａ）＞ＣＨ７Ａ＞ＣＨ７Ａ（Ｅ１０２Ｑ）＞ＣＨ７Ａ（Ｄ９９Ｙ）＞ＣＨ７Ａ（Ｄ９９Ｈ）＞ＣＨ７Ａ（Ａ１０３Ｔ）＞ＣＨ７Ａ（Ｖ１０１Ｆ）＞ＣＨ７Ａ（Ｗ９５Ｙ）。
ＤＬＳ解析が、前駆体５ＨＦＦ１２と重鎖ＣＨ７Ａを保有する親抗体とを比較して、抗体において行われた。軽鎖２Ｆ１は、この実験において試験した全ての抗体において同一であった。図２３及び２４。この分析の結果は、安定性における次のランク付けを提供した：ＣＨ７Ａ（Ｄ９９Ｙ）＞ＣＨ７Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）＞ＣＨ７Ａ（Ｖ１０１Ｆ）＞ＣＨ７Ａ（Ｄ９９Ｈ）＞ＣＨ７Ａ（Ａ１０３Ｔ）＞ＣＨ７Ａ（Ｗ９５Ｙ）＞ＣＨ７Ａｘ２Ｆ１（＝ＰＲ１Ａ３）＞５ＨＦＦ１２．ＤＬＳアッセイは、２０ｍＭのヒスチジンと１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０の緩衝液中で、１ｍｇ／ｍｌの抗体を用いて実施された。ＤＬＳアッセイは、２５℃で開始し、０．０５℃／分の増分温度上昇を伴い、上限７０℃まで行われた。
二重変異（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）（配列番号２２３）が、ＣＥＡ標的に対する高い親和性を保持しつつ高い安定性を示したので、更なる安定性のために選択された。
実施例５
ヒト化ＰＲ１Ａ３誘導体ＣＨ７Ａの二重変異ｔ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）が、ＶＨ１の基づくヒト化−構築物のＣＨ１Ａ１Ａ及びＣＨ１Ａ１Ｂの最終変異体に導入された。
Ｐｒｏｔｅｏｎ（ビアコア）センサーグラムが、ＣＥＡ抗原を保有するキメラタンパク質ＮＡＢＡに対する、フレームワークとＣＤＲ−Ｈ３の変異体の組み合わせの結合に関して得られた。ビオチン化ＮＡＢＡは、ニュートラビジンコーティングされたチップ上に固定化し、抗体は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および０ｎＭにおける濃度で分析物として使用した。前駆体クローン５Ｌ１Ａ１０と親抗体ＣＨ７Ａは、直接的な比較のために含まれた。このアッセイで試験された全抗体は、軽鎖として２Ｆ１を有していた（図２５）。
実施例６
ＣＨ１Ａ１Ａ構築物及びＣＨ１Ａ１Ｂ構築物はＡＤＣＣ活性を示した。ＣＨ１Ａ１Ａ及びＣＨ１Ａ１Ｂ変異体、それらの前駆体変異体ＣＨ１Ａ１、及び親ＣＨ７Ａ変異体により媒介されるＡＤＣＣが、４時間後に、ＭＫＮ４５細胞を標的細胞（Ｔ）として、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞（Ｅ）として、Ｅ：Ｔの比を２５：１で使用して、乳酸脱水素酵素の放出によって測定された。乳酸脱水素酵素の放出は、標的細胞の溶解に比例し、パーセント細胞毒性として示される。図２６これらの変異体のＡＤＣＣは、ＭＫＮ４５細胞を標的細胞（Ｔ）として、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞（Ｅ）として、Ｅ：Ｔの比を２５：１で使用して、カルセインの放出によって測定されて確かめられた。カルセイン放出は、標的細胞の溶解に比例し、パーセント細胞毒性として、平均値±標準偏差値により示される（図２７）。
ＡＤＣＣ活性はまた、二重突然変異Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙを持つ親和性成熟型ＣＤＲＨ３を含有するＣＨ１Ａ１Ａ構築物及びＣＨ１Ａ１Ｂ構築物に対して観察された。
フレームワークとＣＤＲ−Ｈ３の変異体の組み合わせ、及びＣＨ７Ａを保有する親抗体により媒介されるＡＤＣＣが、２４時間後に、ＭＫＮ４５細胞（図２８）又はＬＳ１７４Ｔ（図２９）を標的細胞として、及びヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、Ｅ：Ｔの比を５：１で使用して、乳酸脱水素酵素の放出によって測定された。ＭＫＮ４５細胞はＣＥＡを高レベルで発現するが、一方、ＣＥＡの発現はＬＳ１７４Ｔ細胞では中程度である。乳酸脱水素酵素の放出は、標的細胞の溶解に比例し、パーセント細胞毒性として示される。これらのＡＤＣＣアッセイで試験された全抗体は、軽鎖として２Ｆ１を有していた。
図３８は、様々な安定性が成熟した抗ＣＥＡ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。
実施例７
ＣＨ１Ａ１Ａ（９８／９９）の重鎖と２Ｆ１軽鎖を含む抗ＣＥＡ抗体の糖鎖を操作した型は、ヒトＣＤ１６の遺伝子導入ＳＣＩＤマウスにおける結腸直腸癌の異種移植モデルで、有効性について試験した。モデルのアッセイ条件を以下に記載する。アッセイの結果は、この抗ＣＥＡ抗体は、ビヒクルコントロールに比べて、延命効果を提供することを示している（図３０）。
動物：ＣＤ１６ＳＣＩＤトランスジェニック雌マウス；実験開始時に７〜９週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅ）が、関連するガイドラインに従って、１２時間明るく／１２時間暗い毎日のサイクルを伴い、特定の病原体を含まない条件下で維持された（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）。実験的研究プロトコルは地元政府当局によって審査され、承認された。到着後、動物を、順化及び観察のため、一週間維持した。継続的な健康状態の監視は、定期的に実施した。
細胞培養と応用：ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒト結腸直腸癌細胞；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）が、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養された（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）。細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中で３７℃で培養した。インビトロでの継代２４が、９７％の生存率で脾臓内注入用に用いられた。
腫瘍細胞注入：注入の日に、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞が、トリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）から回収され、５０ｍｌの培養培地中へ移され、１回洗浄し、ＡＩＭ Ｖ（Ｇｉｂｃｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。小切開が、麻酔されたＳＣＩＤ／ベージュマウスの左腹腔部位で行われた。皮膚と筋肉が開かれ、細胞懸濁液の３０マイクロリットル（ＡｉｍＶ培地中に３ｘ１０６ ＬＳ１７４Ｔ細胞）を、脾臓の頂部に注入した。最初に筋肉その後腹部皮膚を、吸収性縫合糸（Ｍｏｎｏｓｙｎ（登録商標）３−０，Ｂｒａｕｎ）で縫合した。
処置：全抗ＣＥＡ抗体と対応するビヒクルが、毎週１回静脈内注射した。全部で３回の投薬。６２５ｕｇの抗体が、マウスあたり１回の注射で投与された。抗体希釈液を、使用前に在庫から新たに調製し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、４．３８ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で処方された。
実施例８
ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）の重鎖と２Ｆ１軽鎖を含む抗ＣＥＡ抗体の糖鎖を操作した型は、ヒトＣＤ１６の遺伝子導入ＳＣＩＤマウスにおけるＡ５４９肺癌の異種移植モデルで、有効性について試験した。モデルのアッセイ条件を以下に記載する。アッセイの結果は、この抗ＣＥＡ抗体は、ビヒクルコントロールに比べて、用量依存性の延命効果を提供することを示している（図３１）。
動物：３５匹のＣＤ１６ＳＣＩＤトランスジェニック雌マウス；実験開始時に７〜９週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅ）が、関連するガイドラインに従って、１２時間明るく／１２時間暗い毎日のサイクルを伴い、特定の病原体を含まない条件下で維持された（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）。実験的研究プロトコルは地元政府当局によって審査され、承認された。到着後、動物を、順化及び観察のため、一週間維持した。継続的な健康状態の監視は、定期的に実施した。
細胞培養と応用：Ａ５４９細胞（ヒトＮＳＣＬＣ細胞；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養された（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）。細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中で３７℃で培養した。
処置：研究の第０日目に、マウスに、１ｘ１０６Ａ５４９細胞を静脈内注射した。抗体は研究の第７日目に開始され、更なる２回の毎週の注射を続けた。
処置群：
マウス ３５匹のＳＣＩＤ−ＣＤ１６Ｔｇマウス，群あたりＮ＝７。
細胞− Ａ５４９細胞 ５ Ｍｉｏ／マウス
化合物と治療スケジュール
ビヒクル ３ｑ７ｄ
ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）ｘ２Ｆ１（５００ｕｇ）３ｑ７ｄ（２５ｍｇ／ｋｇ）
ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）ｘ２Ｆ１（２００ｕｇ）３ｑ７ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）
ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）ｘ２Ｆ１（１００ｕｇ）３ｑ７ｄ（５ｍｇ／ｋｇ）
ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｙ９８Ａ／Ｄ９９Ｙ）ｘ２Ｆ１（５０ｕｇ）３ｑ７ｄ（１ｍｇ／ｋｇ）
前述の発明は、理解を明確にするために説明と実施例によって少し詳細に説明してきたが記述及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照することによりその全体が援用される。

Claims (45)

  1. 膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する変異体抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、該ＡＢＭが、ＰＲ１Ａ３抗体又はＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型よりも、少なくとも０．５、１．０、１．５又は２．０セ氏温度高い温度で安定である、変異体抗原結合分子。
  2. 安定性の増加が、動的光散乱測定法を用いて測定される、請求項１に記載のＡＢＭ。
  3. ＰＲ１Ａ３抗体又はＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型が、重鎖可変領域ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）及び軽鎖可変領域２Ｆ１（配列番号２０９）を含む、ＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型である、請求項１又は２に記載のＡＢＭ。
  4. ＡＢＭが、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３，配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７，配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号２１７，配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、又は配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域を含む、請求項１から３の何れかに記載のＡＢＭ。
  5. ＡＢＭが、
    配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８，配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、又は配列番号４５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号４６、及び配列番号４７、配列番号４８，配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載のＡＢＭ。
  6. 重鎖可変領域が、
    配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、
    配列番号２１７，配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、又は配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、及び
    軽鎖可変領域が、
    配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、
    請求項５に記載のＡＢＭ。
  7. ＡＢＭが、ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワーク残基を含む、請求項４から６の何れかに記載のＡＢＭ。
  8. 重鎖可変領域が、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、及び配列番号２４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２０９の配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＡＢＭ。
  9. 膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する変異体抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、重鎖可変領域が、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む、変異体抗原結合分子。
  10. ＡＢＭがＦｃ領域を含む、請求項１から９の何れか一項に記載のＡＢＭ。
  11. ＡＢＭが、全抗体、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディからなる群から選択される、抗体又はその断片である、請求項１から１０の何れかに記載のＡＢＭ。
  12. ＡＢＭが、マウスモノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３と同一のエピトープに結合するか、又は結合を競合することができる、請求項１から１１の何れかに記載のＡＢＭ。
  13. ＡＢＭが、膜結合ＣＥＡに、Ｋｄが１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ又はそれ以下で結合する、請求項１から１２の何れかに記載のＡＢＭ。
  14. 抗体が、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３，配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７，配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号２１７，配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、又は配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域を含み、
    該抗体が、ＰＲ１Ａ３抗体又はＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型よりも、少なくとも０．５、１．０、１．５又は２．０セ氏温度高い温度で安定である、膜結合ＣＥＡに結合する単離された抗体。
  15. 安定性の増加が、動的光散乱測定法を用いて測定される、請求項１４に記載の抗体。
  16. ＰＲ１４Ａ３抗体又はＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型は、重鎖可変領域ＣＨ７Ａ（配列番号１０１）及び軽鎖可変領域２Ｆ１（配列番号２０９）を含む、ＰＲ１Ａ３抗体のヒト化型である、請求項１４又は１５に記載の抗体。
  17. 抗体が、
    配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８，配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、又は配列番号４５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号４６、及び配列番号４７、配列番号４８，配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１４から１６の何れかに記載の抗体。
  18. 重鎖可変領域が、
    配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
    配列番号１３の重鎖ＣＤＲ２、
    配列番号２１７，配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、又は配列番号２２４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、及び
    軽鎖可変領域が、
    配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ１、
    配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び
    配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ３、を含む、
    請求項１７に記載の抗体。
  19. 抗体が、ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号２６１）又はＣＨ１Ａ１Ｂ（配列番号２６２）のフレームワーク残基を含む、請求項１４から１８の何れか一項に記載の抗体。
  20. 重鎖可変領域が、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２０９の配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４から１９の何れか一項に記載の抗体。
  21. 抗体が、マウスモノクローナル抗体ＰＲ１４Ａ３と同一のエピトープに結合するか、又は結合を競合することができる、請求項１４から２０の何れか一項に記載の抗体。
  22. ＡＢＭが、膜結合ＣＥＡに、Ｋｄが１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ又はそれ以下で結合する、請求項１４から２１の何れか一項に記載の抗体。
  23. 膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する抗体であって、重鎖可変領域が、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、及び配列番号２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む、抗体。
  24. ＡＢＭ又は抗体が、糖鎖を操作されたＦｃ領域を含む、請求項１から１３の何れかに記載のＡＢＭ、又は請求項１４から２３の何れかに記載の抗体。
  25. Ｆｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％がフコシル化されていない、請求項２４に記載のＡＢＭ又は抗体。
  26. Ｆｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が二分されている、請求項２４に記載のＡＢＭ又は抗体。
  27. Ｆｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の少なくとも約２０％から約５０％が二分され、フコシル化されていない、請求項２４に記載のＡＢＭ又は抗体。
  28. ＡＢＭ又は抗体が少なくとも一つの増加したエフェクター機能を有する、請求項２４から２７の何れかに記載のＡＢＭ又は抗体。
  29. 少なくとも一つの増加したエフェクター機能は、Ｆｃレセプター結合親和性の増加、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシス、樹状細胞の成熟の増加、及びＴ細胞プライミングの増加からなる群から選択される、請求項２８に記載のＡＢＭ又は抗体。
  30. ＡＢＭ又は抗体が、糖鎖を操作されていない親抗原結合分子と比較した場合、ＡＤＣＣが少なくとも約４０％から約１００％増加している、請求項２９に記載のＡＢＭ又は抗体。
  31. 請求項１から３０の何れかに記載のＡＢＭ又は抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  32. 請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  33. 請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
  34. 請求項１から３０の何れかに記載のＡＢＭ又は抗体、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
  35. 腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、該腫瘍細胞を、請求項１から３０の何れかに記載のＡＢＭ又は抗体、又は請求項３４記載の組成物と接触させることを含む方法。
  36. 腫瘍細胞が、結腸直腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、胃癌細胞、膵臓癌細胞及び乳癌細胞からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 細胞溶解が、ＡＢＭ又は抗体の抗体依存性細胞傷害により誘導される、請求項３５に記載の方法。
  38. ＣＥＡを異常に発現する癌を有する被験体を治療する方法を提供であって、請求項１から３０の何れか一項に記載のＡＢＭ又は抗体、又は請求項３４に記載の組成物の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
  39. ＣＥＡを異常に発現する癌を有する被験体における生存時間を増加させる方法であって、請求項１から３０の何れか一項に記載のＡＢＭ又は抗体、又は請求項３４に記載の組成物の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
  40. 癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項３８又は３９に記載の方法。
  41. ＡＢＭ又は抗体又は組成物が、化学療法又は放射線療法との併用で投与される、請求項３５から４０の何れかに記載の方法。
  42. 被験体がヒトである、請求項３５から４１の何れかに記載の方法。
  43. ＣＥＡを異常に発現する癌を有する被験体を治療するための医薬の製造における、請求項１から３０の何れかに記載のＡＢＭ又は抗体、又は請求項３４に記載の組成物の使用。
  44. 癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、膵臓癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項４３に記載の使用。
  45. 本明細書に記載された発明。
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