RS56793B1

RS56793B1 - Cea antitela

Info

Publication number: RS56793B1
Application number: RS20180098A
Authority: RS
Inventors: Thomas U Hofer; Ralf Hosse; Ekkehard Moessner; Pablo Umana
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2018-04-30
Also published as: EP2681244A1; MX2013009664A; AR085591A1; MX347590B; KR101981342B1; US20140212408A1; TW201249873A; SG192972A1; NZ614125A; EP2681244B1; HK1187056A1; NO2681244T3; US8642742B2; HRP20180147T1; UA115030C2; MA34927B1; US20220002441A1; DK2681244T3; CN103403029A; PH12013501508B1

Description

OPIS

Oblast na koju se pronalazak odnosi

Predmetni pronalazak se odnosi na antigen-vezujuće molekule (ABM). Posebno, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantna monoklonska antitela koja se vezuju za humani karcinoembrioni antigen (CEA).

Osnova

Karcinoembrionalni antigen (CEA) i anti-CEA antitela

Karcinoembrionalni antigen (CEA, takođe poznat kao CEACAM-5 ili CD66e) je glikoprotein koji ima molekularnu težinu od oko 180 kDa. CEA je član superfamilije imunoglobulina i sadrži sedam domena koji su povezani sa ćelijskom membranom preko sidra glikozilfosfatidilinositola (GPI) (Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5: 344–366, 1991). Sedam domena uključuje jedan N-terminalni lg varijabilni domen i šest domena (A1-B1-A2-B2-A3-B3) homologno domenima Ig konstante (Hefta LJ, i sar., Cancer Res . 52:5647-5655, 1992).

Familija humanog CEA sadrži 29 gena, od kojih je 18 izraženo: 7 koji pripadaju podgrupi CEA i 11 podgrupi glikoproteina specifičnih za trudnoću. Smatra se da nekoliko članova podgrupe CEA poseduje osobine adhezije ćelija. Smatra se da CEA ima ulogu u urođenom imunitetu (Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Zbog postojanja proteina koji su blisko povezani sa CEA-om, može se izazvati povećanje anti-CEA antitela koja su specifična za CEA sa minimalnom unakrsnom reaktivnošću na druge blisko povezane proteine.

CEA je dugo identifikovan kao antigen povezan sa tumorom (Gold i Freedman, J Exp Med., 121:439–462,1965; Berinstein N.L., J Clin Oncol., 20:2197–2207,2002). Prvobitno klasifikovan kao protein izražen samo u fetalnom tkivu, CEA je sada identifikovan u nekoliko normalnih tkiva odraslih osoba. Ova tkiva su pre svega epitelnog porekla, uključujući ćelije gastrointestinalnog, respiratornog i urogenitalnog trakta, i ćelije debelog creva, grlića materice, znojnih žlezda i prostate (Nap i sar., Tumour Biol., 9(2-3):145-53,1988; Nap i sar., Cancer Res., 52(8):2329-23339,1992).

Tumori epitelnog porekla, kao i njihove metastaze, sadrže CEA kao antigen vezan za tumor. Iako prisustvo CEA samo po sebi ne ukazuje na transformaciju u kanceroznu ćeliju, distribucija CEA je indikativna. U normalnom tkivu, CEA se generalno izražava na apikalnoj površini ćelije (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)), što ga čini nepristupačnim antitelima u krvi. Za razliku od normalnog tkiva, CEA se naglašava na celoj površini kancerogenih ćelija (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Ova promena uzorka izražavanja čini CEA dostupnom za vezivanje antitela u kancerogenim ćelijama. Pored toga, izražavanje CEA se povećava u kancerogenim ćelijama. Pored toga, povećano izražavanje CEA podstiče povećanje međućelijskih adhezija, što može dovesti do metastaze (Marshall J., Semin Oncol., 30 (Suppl 8): 30-6, 2003).

CEA se lako razdvaja sa površine ćelije i uleva u krvotok od tumora, bilo direktno ili putem limfatike. Zbog ove osobine, nivo serumskog CEA se koristi kao klinički marker za dijagnozu karcinoma i skrining za ponovnu pojavu karcinoma, naročito kolorektalnog karcinoma (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., i sar., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini i sar., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006). Ova osobina takođe predstavlja jedan od izazova za korišćenje CEA kao cilja, s obzirom da serumski CEA vezuje većinu trenutno dostupnih anti-CEA antitela, sprečavajući ih da postignu svoj cilj na površini ćelije i ograničavaju potencijalne kliničke efekte.

Višestruka monoklonska antitela su podignuta protiv CEA u istraživačke svrhe, kao dijagnostička sredstva i za terapeutske svrhe (npr. Nap i sar., Cancer Res., 52(8):2329-23339,1992; Sheahan i sar., Am. J. Clin. Path. 94:157-164, 1990; Sakurai i sar., J. Surg. Oncol., 42:39-46, 1989; Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188,1992; Ledermann J A, Br. J. Cancer, 58:654, 1988; Ledermann J A, Br. J. Cancer, 68:69-73, 1993; Pedley R B, i sar., Br. J. Cancer, 68:69-73, 1993; Boxer GM, i sar., Br. J. Cancer, 65:825-831, 1992). Chester i sar. izolovali su jednocelično anti-CEA antitelo iz biblioteke displeja faga za korišćenje u radioimunodetekciji i radioimunoterapiji (US Pat. No. 5,876,691), a antitelo je naknadno humanizovano (SAD Pat. br. 7.232.888). Anti-CEA antitela su takođe izolovana iz biblioteka prikaza humanog faga (US Pat. No.5.872.215).

Monoklonsko antitelo miša PR1A3 podignuto je fuzijom ćelija mieloma NS1 (P3/NS1/I-Ag-4-1) sa ćelijama slezine od miševa imuniziranih sa normalnim kolorektalnim epitelijem (Richman P. I. i Bodmer W. F., Int. J. Cancer, 39:317-328, 1987). PR1A3 snažno reaguje na dobro i slabo diferencirane kolorektalne karcinome i ima prednosti u odnosu na druga kolorektalna epitel-reaktivna antitela jer se njegov antigen čini fiksiranim na tumor i ne pojavljuje u limfatičkim ili normalnim limfnim čvorovima koji odvode tumor (Granowska M i sar., Eur. J. Nucl. Med., 20:690-698, 1989). Na primer, PR1A3 je reagovao sa 59/60 kolorektalnim tumorima (Richman P. I. i Bodmer W. F., Int. J. Cancer, 39:317-328, 1987), dok je reaktivno antitelo B72.3 CEA reagovalo sa samo 75% kolorektalnih tumora (Mansi L., i sar., Int J Rad Appl Instrum B., 16(2):127-35, 1989).

Epitopno mapiranje PR1A3 pokazuje da antitelo cilja domen B3 i GPI sidro molekula CEA (Durbin H. i sar., Proc. Natl. Scad. Sci. USA, 91:4313-4317, 1994). Shodno tome, PR1A3 antitelo se vezuje samo na CEA vezan za membranu, a ne na rastvorljiv CEA oblik koji se može naći u krvotocima kod pacijenata sa karcinomom. Zbog ovakve osobine vezivanja, nije verovatno da će antitelo PR1A3 biti vezano za serumski CEA; umesto toga, ono može ciljati CEA izražen na kancerogenim ćelijama. Epitop vezan za PR1A3 je konformacioni epitop, a ne linearni epitop, za koji se smatra da doprinosi gubitku vezivanja PR1A3 na rastvorljivi CEA (Stewart i sar., Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999).

Antitelo PR1A3 je prethodno humanizovano graftovanjem CDR-ova matičnog mišjeg antitela u okvirne regione teškog lanca 1-3 humanog antitela RF-TS3'CL (zadržavajući mišji okvir 4 PR1A3) i okvirne regione lakog lanca REI antitela. (Stewart i sar., Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999). Ova humanizovana verzija PR1A3 zadržala je specifičnost i za površinski izraženu CEA sa afinitetom sličnim onom mišjeg antitela (Stewart i sar., Cancer Immunol Immunother, 47:299-06, 1999; SAD Pat. br.5.965.710). Pokazano je da humanizovano PR1A3 (hPR1A3) antitelo indukuje ciljano ubijanje ćelijskih linija kolorektalnih karcinoma. (Conaghhan P. J., i sar., Br. J. Cancer, 98(7):1217-1225). Međutim, afinitet hPR1A3 za CEA je relativno nizak.

Radio-označena anti-CEA antitela korišćena su u kliničkim ispitivanjima kod pacijenata sa kolorektalnim karcinomom. Na primer, u pilot kliničkoj studiji kod pacijenata sa kolorektalnim karcinomom korišćeno je<123>-označeno himerno minitelo T84.66 (cT84.66). Radio-označena minitelo je bilo u stanju da cilja na ćelije raka. (Wong J. Y. i sar., Clin Cancer Res. 10(15):5014-21, (2004)). U drugom primeru,<(131)>I-labetuzumab, radio-označeno humanizovano anti-CEA antitelo, testirano je u adjuvantnoj radioimunoterapiji kod pacijenata sa metastazama jetre kolorektalnog karcinoma i utvrđeno je da obezbeđuje povoljnu prednost preživljavanja. (Liersch T., i sar., Ann. Surg. Oncol.14(9):2577-90, (2007)).

Glikozilacija antitela

Oligosaharidna komponenta može značajno uticati na svojstva relevantna za efikasnost terapeutskog glikoproteina, uključujući fizičku stabilnost, otpornost na napad proteaze, interakcije sa imunim sistemom, farmakokinetiku, kao i specifičnu biološku aktivnost. Ova svojstva mogu zavisiti ne samo od prisustva ili odsustva oligosaharida, već isto tako i od njihovih specifičnih struktura. Mogu se postaviti izvesne generalizacije između strukture oligosaharida i funkcije glikoproteina. Na primer, izvesne oligosaharidne strukture posreduju u brzom klirensu glikoproteina iz krvotoka preko interakcija sa specifičnim proteinima koji vezuju ugljene hidrate, dok druge mogu da se vežu za antitela i otpočnu neželjene imune reakcije. (Jenkins i sar., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996).

Ćelije sisara su bile poželjni domaćini za produkciju terapeutskih glikoproteina, zahvaljujući svojoj mogućnosti da glikoziluju proteine u najkompatibilniji oblik za primenu kod ljudi. (Cumming i sar., Glycobiology 1:115-30, 1991; Jenkins i sar., Nature Biotechnol. 14:975-981, 1996). Bakterije veoma retko glikoziluju proteine i, kao i druge vrste uobičajenih domaćina, kao što su kvasci, filamentozne gljive, insekti i ćelije biljaka, daju glikozilacione profile koji se povezuju sa brzim klirensom iz krvotoka, nepoželjnim imunolološkim interakcijama i, u nekim specifičnim slučajevima, smanjenom biološkom aktivnošću. Od ćelija sisara, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) se najčešće koriste tokom poslednje dve decenije. Osim što proizvode pogodne profile glikozilacije, ove ćelije omogućavaju konzistentno stvaranje genetički stabilnih, visoko produktivnih klonskih ćelijskih linija. Mogu se uzgajati do velikih gustina u jednostavnim bioreaktorima korišćenjem medijuma bez seruma, i omogućiti razvoj bezbednih i reproduktivnih bioprocesa. Druge ćelije životinja koje se obično koriste uključuju bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK), mijeloma ćelije NS0- i SP2/0-miša. Nedavno je testirana i proizvodnja iz transgenih životinja (Jenkins i sar., Nature Biotechnol.14:975-81, 1996).

Sva antitela sadrže ugljenohidratne strukture na konzervisanim položajima u konstantnim regionima teškog lanca, i svaki izotip ima različitu paletu N-vezanih ugljenohidratnih struktura, koje promenljivo utiču na sastav proteina, sekreciju ili funkcionalnu aktivnost. (Wright A. i Morrison S. L., Trends Biotech. 15:26-32, 1997). Struktura povezanih N-vezanih ugljenih hidrata varira značajno, što zavisi od stepena obrade i, može obuhvatiti oligosaharide sa velikim sadržajem manoze, višestruko razgranate kao i biantenarne kompleksne oligosaharide. (Wright, A., i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32, 1997). Uobičajeno, postoji heterogena obrada jezgrenih oligosaharidnih struktura koje su vezane za naročito mesto glikozilacije, tako da čak i monoklonska antitela postoje kao populacija višestrukih glikooblika. Na sličan način, pokazalo se da se glavne razlike u glikozilaciji antitela javljaju među ćelijskim linijama, a manje razlike se viđaju za datu ćelijsku liniju koja je uzgajana pod različitim uslovima kultivacije. (Lifely, M. R. i sar., Glycobiology 5(8):813-22, 1995).

Jedan od načina da se dobije veliki rast potencije, a da se održi jednostavan proizvodni proces i potencijalno izbegnu značajni, neželjeni sporedni efekti, jeste da se uvećaju prirodne, ćelijski posredovane efektorske funkcije monoklonskih antitela konstruisanjem njihove oligosaharidne komponente, kako je opisao Umaña, P. i sar., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) i SAD Pat. br. 6,602,684. Antitela IgG1 tipa, najčešće korišćena antitela u imunoterapiji kancera, su glikoproteini koji imaju očuvano N-vezano mesto glikozilacije na Asn297 u svakom CH2 domenu. Dva kompleksa biantenarnih oligosaharida vezanih za Asn297 su ubačena između CH2 domena, formirajući obimne kontakte sa kičmom polipeptida i, njihovo prisustvo je od suštinskog značaja za antitelo radi posredovanja efektorskih funkcija, kao što je ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC) (Lifely, M. R., i sar., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., i sar., Immunol Rev.163:59-76 (1998); Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)).

Umaña i sar. prethodno su pokazali da je prekomerno izražavanje b(1,4) -N-acetilglucosaminiltransferaze III („GnTIII“), glikoziltransferaze koja katalizuje formiranje prepolovljenog oligosaharida u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO) značajno povećava ADCC aktivnost anti-neuroblastoma himerno monoklonskog antitela (chCE7) proizvedeno od strane inženjeriranih CHO ćelija. (Vidi: Umana, P. i sar., Nature Biotechnol.17:176-180 (1999); i Međunarodna publikacija br. WO 99/54342). Antitelo chCE7 pripada velikoj klasi nekonjugovanih mAbs-a koja imaju veliki afinitet i specifičnost prema tumoru, ali su isuviše slaba da bi bila klinički korisna kada se proizvode u standardnim industrijskim ćelijskim linijama kojima nedostaje GnTIII enzim (Umana, P., i sar., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Ova studija je prva pokazala da veliko povećanje ADCC aktivnosti može da se dobije dizajniranjem ćelija koje proizvode antitela tako da eksprimiraju Gn TIII, što je takođe dovelo do povećanja udela prepolovljenih oligosaharida vezanih za konstantne (Fc) regione, uključujući prepolovljene, nefukozilovane oligosaharide, iznad nivoa nađenih u antitelima koja postoje u prirodi.

Ostaje potreba za pojačanim terapeutskim pristupima koji su usmereni na CEA, naročito na membranski vezani CEA za lečenje karcinoma.

Kratak pregled pronalaska

Jedno rešenje pronalaska obezbeđuje izolovano antitelo koje vezuje membranski vezani CEA, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca od SEQ ID NO:1, CDR2 teškog lanca od SEQ ID NO:13 i CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:223 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca SEQ ID NO:39, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO:49 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:56.

U jednom rešenju, antitelo je vezano za membranu CEA sa Kd od 100 nM ili niže. U jednom rešenju, antitelo je vezano za membranu CEA sa Kd od 10 nM ili niže. U jednom rešenju, antitelo je vezano za membranu CEA sa Kd od 1 nM ili niže.

U daljem rešenju, antitelo sadrži okvirne ostatke CH1A1A (SEQ ID NO: 261) ili CH1A1B (SEQ ID NO: 262). U jednom rešenju varijabilni region teškog lanca antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 239 i SEQ ID NO: 247, a varijabilni region lakog lanca antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209.

U određenim rešenjima, antitelo iz gore navedenih izvođenja vezuje isti epitop kao što je, ili je sposoban da se takmiči za vezivanje sa, mišjim monoklonskim antitelom PR1A3.

U jednom rešenju, antitelo sadrži Fc region koji je glikodizajniran. U jednom rešenju, najmanje 20% do 100% N-povezanih oligosaharida u glikodizajniranom Fc regionu nisu fukolizovane. U jednom rešenju, najmanje 20% do 100% N-povezanih oligosaharida u glikodizajniranom Fc regionu su prepolovljene. U jednom rešenju, najmanje 20% do 50% N-povezanih oligosaharida u glikodizajniranom Fc regionu su prepolovljene, nisu fukolizovane. U jednom rešenju, antitelo koje sadrži glikodizajniran Fc region ima najmanje jednu povećanu efektorsku funkciju. U jednom rešenju, povećana efektorska funkcija je izdvojena iz grupe koja se sastoji od povećanog afiniteta vezivanja Fc receptora, povećane ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelom (ADCC), povećanog vezivanja za NK ćelije, povećanog vezivanja za makrofage, povećanog vezivanja za monocite, povećanog vezivanja za polimorfonuklearne ćelije, direktna signalizacije koja indukuje apoptozu, povećanog sazrevanja dendritičnih ćelija i povećano aktiviranje T ćelija. U jednom rešenju, antitelo koje sadrži glikodizajniran Fc region ima povećanje ADCC od najmanje 40% do 100% u poređenju sa ne-glikodizajniranim matičnim vezujućim molekulom antigena.

Još jedno rešenje pronalaska obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira antitelo bilo kojeg od gore opisanih izvođenja. Još jedno rešenje pronalaska obezbeđuje vektor koji se sastoji od polinukleotida koji kodira antitelo bilo kojeg od gore opisanih izvođenja. Još jedno rešenje pronalaska obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ovaj vektor.

Još jedno rešenje pronalaska obezbeđuje kompoziciju koja sadrži antitelo bilo kojeg od gore opisanih izvođenja i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Još jedno rešenje pronalaska obezbeđuje antitelo ili sastav bilo kojeg od gore opisanih izvođenja za upotrebu u lečenju karcinoma koji abnormalno izražava CEA. U jednom rešenju, kancer je kolorektalni rak, rak pluća ne-malih ćelija (NSCLC), rak želuca, rak pankreasa ili rak dojke.

U određenim rešenjima, antitelo ili sastav se daje u kombinaciji sa hemoterapijom ili radioterapijom.

Kratak opis slika

SLIKA 1 prikazuje shematski dijagram CEA (CEACAM-5, CD66e) antigena. PR1A3 antitelo se specifično vezuje za domen B3 antigena kada je vezano za ćelijsku membranu.

SLIKA 2 pokazuje poboljšanu ADCC aktivnost glikodizajniranog himernog PR1A3 antitela u poređenju sa ne-glikodizajniranim himernim PR1A3 antitelima sa humanim PBMC-ima kao efektorima.

SLIKA 3 pokazuje aktivnost vezivanja antigena humanizovanog PR1A3 antitela koja obuhvata konstrukciju varijabilnog regiona teškog lanca, CH7A i konstrukciju varijabilnog regiona lakog lanca, CL1A, u poređenju sa himernim PR1A3 antitelima.

SLIKA 4 pokazuje mesta randomizacije za generisanje biblioteke antitela za sazrevanje afiniteta humanizovanog lakog lanca PR1A3 antitela. Položaji obeleženi X su randomizovani.

SLIKA 5 pokazuje mesta randomizacije za generisanje biblioteke antitela za sazrevanje afiniteta humanizovanog teškog lanca PR1A3 antitela. Položaji obeleženi X su randomizovani.

SLIKA 6 pokazuje aktivnost vezivanja afiniteta zrelih anti-CEA antitela izvedenih iz humanizovanog PR1A3 antitela koji obuhvata konstrukciju varijabilnog regiona teškog lanca CH7ArF9 i konstrukciju varijabilnog regiona lakog lanca CL1ArH11.

SLIKA 7 pokazuje rezultate studije efikasnosti kod miševa SCID/bg, kojima su date u slezenu LS174T humane ćelije kolorektalnog karcinoma kako bi se dobio ortotopni model tumora. Terapija antitelima započeta je sedam dana kasnije injekcijom antitela u dozi od 25 mg/kg telesne težine, nakon čega su usledile dve dodatne nedeljne injekcije. „CH7A“ predstavlja humanizovano antitelo koje sadrži CDR-ove PR1A3 kao što je ovde opisano. „SM3E“ odnosi se na prethodno generisano anti-CEA antitelo. „GA201“ predstavlja humanizovano anti-EGF antitelo koje se koristi kao pozitivna kontrola. „PBS“ se odnosi na fiziološki pufer sa fosfatom koji se koristi kao negativna kontrola. Preživljavanje je izmereno u skladu sa kriterijumima prekida koji je definisao švajcarski regulatorni organ.

SLIKA 8 pokazuje rezultate studije efikasnosti kod miševa SCID/bg kojima su intravenozno injektirane A549 ćelije karcinoma pluća, gde tumor deluje u plućima životinja. Terapija antitelima započeta je sedam dana kasnije injekcijom antitela u dozi od 25 mg/kg telesne težine, nakon čega su usledile dve dodatne nedeljne injekcije. „CH7A“, „SM3E“ i „GA201“ su kako je prikazano na slici 7 gore. Oznaka „CH7ArF9 CL1ArH11“ predstavlja varijantu CH7A antitela sa afinitetnim zrelim teškim i lakim lancima. Oznaka „ge“ označava da je antitelo glikodizajnirano da ima smanjen broj fukozilovanih oligosaharida u regionu Fc. „Placebo“ se odnosi na negativnu kontrolu. A549 ćelije karcinoma pluća su snažno pozitivne za EGFR izražavanje i slabo pozitivne za CEA izražavanje.

SLIKA 9 pokazuje rezultate studije efikasnosti kod miševa SCID/bg kojima su intravenozno injektirane MKN45 ćelije karcinoma želuca, koji generiše tumorske metastaze u jetri životinja. Oznake „CH7ArF9 CL1A rH11“, „SM3E“, „ge“ i „PBS“ su kako je prikazano na slikama 7 i 8 gore.

SLIKA 10 prikazuje kinetičku analizu klonova sa zrelim afinitetom: (a) pokazuje senzogram anti-CEA fabova sa teškim lancem zrelog afiniteta CH7A H4E9 (SEQ ID NO: 199) zajedno sa neoznačenim lakim lancem CL1A (SEQ ID NO: 105); lakog lanca sa zrelim afinitetom CL1A pAC18 (SEQ ID NO: 209) u kombinaciji sa neoznačenim teškim lancem CH7A; i njihova kombinacija, CH7A H4E9 i CL1A pAC18 (SEQ ID NO: 199 i 209); (b) rezime kinetičke analize klonova sa zrelim afinitetom.

SLIKA 11 prikazuje šematski pregled PCR strategije za CDR1 i CDR2 randomizaciju humanizovanog teškog lanca CH7A anti-CEA antitela.

SLIKA 12 prikazuje šematski pregled PCR strategije za CDR1 i CDR2 randomizaciju humanizovanog lakog lanca CL1A anti-CEA antitela.

SLIKA 13 prikazuje šematski pregled PCR strategije za CDR3 randomizaciju humanizovanog teškog lanca CH7A anti-CEA antitela.

SLIKA 14 prikazuje šematski pregled PCR strategije za CDR3 randomizaciju humanizovanog lakog lanca CL1A anti-CEA antitela.

SLIKA 15 pokazuje afinitet vezivanja anti-CEA antitela za CEA vezane za membrane na MKN45 ciljnim ćelijama. Humanizovana anti-CEA antitela sa lakim lancima zrelog afiniteta (Panel A, CH7A, CL1ArH7 ili CH7A, CL1ArH11) ili teškim i lakim lancima zrelog afiniteta (Panel B, CH7A rB9, CL1A rH11 G2 (1)) koji su konvertovani u IgG pokazuje poboljšano vezivanje u poređenju sa kontrolnim antitelima (CH7A, CL1A).

SLIKA 16 pokazuje rezultate ispitivanja ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) sa antitelima zrelog afiniteta(CH7ArB9, CL1ArH11G2 (1), CH7Arf9, CL1ArH11G2 (1) i CH7A, CL1A rH11 G2 (1)) u poređenju sa kontrolnim antitelima (CH7A, CL1A G2 (R2).

SLIKA 17 pokazuje rezultate ispitivanja vezivanja ćelije za anti-CEA antitelo sa teškim lancem CH1A u poređenju sa mišjem-humanim himernim antitelom chPR1A3.

SLIKA 18 pokazuje rezultate testa vezivanja za anti-CEA antitela sa teškim lancem CH1A1, CH1A2, CH1A3 ili CH1A4 i lakim lancem 2F1.

SLIKA 19 pokazuje rezultate testa stabilnosti za anti-CEA antitela sa teškim lancem CH1A1, CH1A2, CH1A3 ili CH1A4.

SLIKA 20 pokazuje rezultat analize površinske plazmonske rezonance (SPR) za anti-CEA antitela generisana iz CH1A1.

SLIKA 21 pokazuje rezultat testa vezivanja ćelija za anti-CEA antitela generisana iz CH1A1.

SLIKA 22 pokazuje merenja površinske plazmonske rezonance (SPR) afiniteta (mereno u dvovalentnom obliku) anti-CEA antitela konstruisanih u stabilnosti u odnosu na matični 5HFF12 teški lanac.

SLIKE 23 i 24 pokazuju rezultate testa stabilnosti za antitelo 5HFF12 zrelog afiniteta u poređenju sa njegovim matičnim teškim lancem CH7A sa pojedinačnim tačkovnim mutacijama koje su izabrane u 5HFF12.

SLIKA 25 pokazuje analizu površinske plazmonske rezonance kombinovanog okvira i CDR-H3 varijanti.

SLIKA 26 pokazuje aktivnost ADCC-a na osnovu CHA1A baziranih varijanti okvira. SLIKA 27 pokazuje aktivnost ADCC-a na osnovu CHA1A baziranih varijanti okvira. SLIKA 28 pokazuje aktivnost ADCC-a na osnovu kombinovanih okvira i CDR-H3 varijanti.

SLIKA 29 pokazuje aktivnost ADCC-a na osnovu kombinovanih okvira i CDR-H3 varijanti.

SLIKA 30 pokazuje efikasnost glikodizajniranih anti-CEA antitela CH1A1A (Y98A/D99Y) x 2F1 u ksenograftnom modelu kolorektalnog karcinoma kod SCID miševa transgenski za humani CD16.

SLIKA 31 pokazuje efikasnost glikodizajniranih anti-CEA antitela CH1A1A (Y98A/D99Y) x 2F1 u A549 ksenograftnom modelu karcinoma pluća kod SCID miševa transgenski za humani CD16.

SLIKA 32 pokazuje aminokiselinske sekvence CDR-ova za različite anti-CEA ABM-ove. SLIKA 33 pokazuje aminokiselinske sekvence konstrukcija lakih lanaca za različite anti-CEA ABM-ove.

SLIKA 34A-C pokazuje aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca zrelog afiniteta CDR-a i povezanih afiniteta vezivanja.

SLIKA 35 pokazuje konstante afiniteta raznih sekvenci antitela zrelih afiniteta.

SLIKA 36 pokazuje aminokiselinske sekvence CDR-H3-ova raznih anti-CEA ABM-ova. SLIKA 37 A-C pokazuje aminokiselinske sekvence VH regiona raznih anti-CEA ABM-ova.

SLIKA 38 pokazuje poravnanje aminokiselinske sekvence VH regiona raznih stabilnih zrelih anti-CEA antitela.

Detaljan opis pronalaska

Definicije

Termini se ovde koriste kao obično korišćeni u struci, osim ako nije drugačije definisano kako sledi.

Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući molekul“ se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigenu determinantu. Neograničavajući primer molekula koji vezuje antigen je antitelo ili njegov fragment koji zadržava antigen-specifično vezivanje. Preciznije, kako se ovde koristi, molekul koji vezuje antigen koji vezuje humani karcinoembrionski antigen (CEA) vezan za membrane, je ABM koji se specifično vezuje za CEA, posebno na površinu ćelije ili membranu vezanu CEA. Pod „specifično vezivanje“ podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može biti diskriminisano od neželjenih ili nespecifičnih interakcija.

Kao što se ovde koristi, izraz „antitelo“ ima za cilj da uključi cele molekule antitela, uključujući monoklonalna, poliklonalna i multispecifična (npr. bispecifična) antitela, kao i fragmente antitela koji imaju Fc region i zadržavaju vezujuću specifičnost, i fuzione proteine koji uključuju region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina i koji zadržavaju vezujuću specifičnost. Takođe obuhvaćeni su fragmenti antitela koji zadržavaju vezujuću specifičnost, uključujući, ali bez ograničenja, VH fragmente, VL fragmente, Fab fragments, F (ab')2fragmente, scFv fragmente, Fv fragmente, minitela, diatela, tritela i tetratela (videti npr. Hudson i Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)).

Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući domen“ se odnosi na deo molekula koji vezuje antigen koji obuhvata područje koje se specifično vezuje i komplementarno je delu ili celom antigenu. Kada je antigen velik, molekul koji vezuje antigen može se vezati samo za određeni deo antigena, koji se naziva epitop. Domen za vezivanje antigena može se obezbediti, na primer, sa jednim ili više varijabilnih domena antitela. Poželjno, domen za vezivanje antigena sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) antitela i varijabilni region teškog lanca (VH) antitela.

Kako se ovde koristi, termin „sa zrelim afinitetom“ u kontekstu molekula koji vezuju antigen (npr. antitela) odnosi se na molekul koji vezuje antigen koji je izveden iz referentnog molekula koji vezuje antigen, npr. putem mutacije, vezuje se za isti antigen, poželjno vezuje se za isti epitop, kao referentno antitelo; i ima veći afinitet za antigen od onog referentnog molekula koji vezuje antigen. Značenje sazrevanja afiniteta generalno podrazumeva modifikaciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u jednom ili više CDR-ova molekula vezujućeg antigena. Tipično, molekul vezujućeg antigena sazrelog afiniteta vezuje se za isti epitop kao i molekul vezujućeg antigena iz početne reference.

Kao što se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ je generalno izražen u smislu ravnoteže udruživanja ili konstanti disocijacije (Kaili Kd, respektivno), koje su zapravo recipročni odnosi konstanti disocijacije i asocijacije (kaili kd, respektivno). Prema tome, ekvivalentni afiniteti mogu da sadrže različite konstante brzina, sve dok odnos konstanti brzine ostaje isti.

Kako se ovde koristi, termin „Fc region“ odnosi se na C-terminalni region IgG teškog lanca. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region IgG teškog lanca obično se definiše da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cis226 do karboksil-terminusa.

Kako se ovde koristi, pojam „region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina“ ima za cilj da obuhvati prirodne alelne varijante Fc regiona imunoglobulina, kao i varijante koje imaju izmene koje proizvode supstitucije, dodatke ili brisanja, ali koje značajno ne smanjuju sposobnost imunoglobulina da posreduje u efektorskim funkcijama (kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). Na primer, jedna ili više amino kiselina se mogu izbrisati iz N-terminusa ili C-terminusa Fc regiona imunoglobulina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Takve varijante mogu se odabrati prema opštim pravilima poznatim u struci tako da imaju minimalan uticaj na aktivnost. (videti, npr, Bowie, J. U. i sar., Science 247:1306-10 (1990).

Kao što je ovde korišćeno, termin „membranski vezan humani CEA“ odnosi se na humani karcinoembrionski antigen (CEA) koji je vezan za membranski deo ćelije ili na površinu ćelije, a naročito na površinu tumorske ćelije. Termin „membranski vezan humani CEA“ može se, u određenim okolnostima, odnositi na CEA koji nije vezan za membranu ćelije, ali koji je konstruisan tako da sačuva epitop na koji se PR1A3 antitelo vezuje. Termin „rastvorljivi CEA“ se odnosi na humani karcinoembrionski antigen koji nije vezan za ili se odvaja od ćelijske membrane ili površine ćelije (npr. površina tumorskih ćelija) i/ili koji, obično, ne čuva konformacioni epitop koji je vezan PR1A3 antitelom. Rastvorljivi CEA se, na primer, može naći u krvotoku ili limfatici osobe sa karcinomom.

Kao što se ovde koristi, termin „nema značajne unakrsne reaktivnosti u poređenju sa rastvorljivim“ CEA znači da molekul (npr. molekul koji vezuje antigen) ne prepoznaje ili se specifično ne vezuje za rastvorljivi CEA, posebno u poređenju sa CEA vezanim za membrane. Na primer, molekul koji vezuje antigen može se vezati manje od oko 10% na manje od oko 5% rastvorljivog CEA ili može vezati rastvorljiv CEA u količini izabranoj iz grupe koja se sastoji od manje od oko 10%, 9%, 8% 7% , 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ili 0,1%, poželjno manje od oko 2%, 1% ili 0,5% rastvorljivog CEA, a najpoželjnije manje od oko 0,2% ili 0,1% rastvorljivog CEA.

Kako se ovde koriste, termini „fuzija“ i „himerni“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima kao što su ABM, odnose se na polipeptide koji sadrže aminokiselinske sekvence izvedene iz dva ili više heterolognih polipeptida, kao što su delovi antitela različitih vrsta. Za himerne ABM-ove, na primer, komponente koje nisu vezane za antigen mogu biti izvedene iz širokog spektra vrsta, uključujući primate kao što su šimpanze i ljudi. Konstantni region himernog ABM -a je generalno u suštini identičan konstantnom regionu prirodnog humanog antitela; varijabilni region himernog antitela obično sadrži sekvencu koja je izvedena iz rekombinantnog anti-CEA antitela koji ima aminokiselinsku sekvencu mišjeg PR1A3 varijabilnog regiona. Humanizovana antitela su posebno poželjna forma fuzije ili himernog antitela.

Kako se ovde koristi, termin „humanizovani“ se koristi da se odnosi na antigen–vezujući molekul izveden delom od ne-humanog antigen-vezujućeg molekula, na primer mišje antitelo, koje zadržava ili u suštini zadržava antigen-vezujuća svojstva matičnog molekula, ali koja je manje imunogena kod ljudi. Ovo se može postići različitim metodama (ovde se nazivaju „humanizacija“) uključujući, ali ne ograničavajući se na: (a) graftovanje čitavih ne-ljudskih varijabilnih domena na humane konstantne regione za generisanje himernih antitela, (b) graftovanje samo ne-ljudskog (npr. molekul koji vezuje antigene donatora) na ljudski (npr. molekul koji vezuje antigene primaoca) i konstantne regione sa ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. one koje su važne za zadržavanje dobrog afiniteta vezivanja antigena ili funkcija antitela) ili (c) presađivanje čitavih ne-ljudskih varijabilnih domena, ali ih „pokrivaju“ delom nalik na ljudski zamenom površinskih ostataka. Takve metode su otkrivene u Jones i sar., Morrison i sar., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen i sar., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Obično su 3 regiona za određivanje komplementarnosti, ili CDR, (CDR1, CDR2 i CDR3) u svakom varijabilnom domenu antitela teških i lakih lanaca, koji su okruženi sa četiri okvirna podregiona (tj. FR1, FR2, FR3 i FR4 ) u svakom varijabilnom domenu antitela teškog i lakog lanca: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Diskusija o humanizovanim antitelima može se pronaći, između ostalog, u SAD patentu br. 6,632,927 i u objavljenoj SAD aplikaciji br. 2003/0175269. Humanizacija takođe može biti postignuta presađivanjem smanjenih CDR-ova koji sadrže samo ostatke koji određuju specifičnost aminokiselinskih ostataka za datu CDR na izabranom okviru. Pod „ostaci koji određuju specifičnost" podrazumevaju se ostaci koji su direktno uključeni u specifičnu interakciju sa antigenom i/ili koji su neophodni za vezivanje na specifične antigene. Uopšteno, samo oko jedne petine do jedne trećine ostataka u datom CDR-u učestvuju u vezivanju na antigen. Ostaci koji određuju specifičnost u određenom CDR mogu se identifikovati pomoću, na primer, izračunavanja interatomskih kontakata iz trodimenzionalnog modeliranja i određivanja varijabilnosti sekvence na datoj poziciji ostatka u skladu s postupcima opisanim u Padlan i sar., FASEB J.9 (1): 133-139 (1995).

U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovani antigen-vezujući molekuli mogu da sadrže ostatke koji nisu pronađeni u prijemnom antitelu ili u donatorskom antitelu. Ove modifikacije su načinjene kako bi se dalje poboljšale performanse vezivanja antigena na molekulu. Uopšteno, ljudski antigen vezujući molekul će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima bar jedan ili suštinski svi ili svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima ne-ljudskog imunoglobulina i svi ili u suštini svi FR su oni ljudske imunoglobulinske sekvence. Humanizovani antigen-vezujući molekuli će opciono takođe da sadrže najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Videti, npr. Jones i sar., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann i sar., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

Slično tome, kako se ovde koristi, termin „primatizovan“ se koristi za antigen-vezujući molekul izveden iz ne-primatnog antigen-vezujućeg molekula, na primer mišje antitelo, koje zadržava ili u suštini zadržava antigen-vezujuća svojstva matičnog molekula, ali koje je manje imunogeno kod primata.

Kao što se ovde koristi, termin „varijantni“ (ili analogni) polinukleotid ili polipeptid odnosi se na polinukleotid ili polipeptid koji se razlikuje od specifično recitovanog polinukleotida ili polipeptida insertima, brisanjima i supstitucijama, stvorenim korišćenjem, na primer, tehnika rekombinantne DNK. Konkretno, rekombinantne varijante koje kodiraju ove iste ili slične polipeptide mogu se sintetizovati ili odabrati upotrebom „redundance“ u genetskom kodu. Različite zamene kodona, poput tihih promena koje proizvode lokacije različitih restrikcija, mogu se uvesti kako bi se optimizovalo kloniranje u plazmid ili virusni vektor ili ekspresija u određenom prokariotskom ili eukariotskom sistemu. Mutacije u polinukleotidnoj sekvenci mogu se reflektovati u polipeptidima ili domenima drugih peptida dodanih polipeptidu radi modifikovanja svojstava bilo kog dela polipeptida, kako bi se promenile karakteristike kao što su ligand-vezujući afiniteti, afiniteti međulanaca ili stopa degradacije / obrta.

Kako se ovde koristi, termin „varijantni anti-CEA antigen vezujući molekul“ odnosi se na molekul koji se razlikuje u sekvenci aminokiselina od „matičnog“ anti-CEA antigen vezujućeg molekula aminokiselina na osnovu dodavanja, brisanja i / ili zamene jednog ili više amino kiselinskih ostataka u sekvenci matičnog antitela. U specifičnom rešenju, varijanta sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u jednom ili više hipervarijabilnih regiona ili CDR-ova teškog i/ili lakog lanca matičnog antigen vezujućeg molekula. Na primer, varijanta može sadržavati bar jednu, npr. od oko jedne do oko deset (tj. oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10), a poželjno od oko dva do pet, zamena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona ili CDR (tj. 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 hipervarijabilnih regiona ili CDR-ova) antigen vezujućeg matičnog molekula. Varijanta anti-CEA antigen vezujućeg molekula može takođe sadržati jedan ili više dodataka, brisanja i/ili zamena u jednoj ili više regiona okvira bilo teškog ili lakog lanca. Obično, varijanta će imati sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta aminokiselinske sekvence sa sekvencama promenljivih domena teškog ili lakog lanca matičnog antigen-vezujućeg molekula, obično najmanje oko 80%, 90%, 95% ili 99%. Identitet u odnosu na sekvencu definisan je ovde kao procenat amino kiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa ostacima matičnih antitela, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao identitet maksimalnog procenta sekvence. Nijedan od N-terminala, C-terminala ili unutrašnjih ekstenzija, brisanja ili umetanja u sekvencu antitela ne treba tumačiti kao uticaj na identitet ili homologiju sekvence. Varijantski molekul koji vezuje antigen zadržava sposobnost vezivanja humanog CEA, vezanog na membrane. U jednom rešenju, anti-CEA ABM vezuje isti epitop kao i kod matičnog antigen-vezujućeg molekula. U jednom rešenju, anti-CEA ABM se takmiči za vezivanje na humani CEA vezan za membrane sa matičnim antigen-vezujućom molekulom. U jednom rešenju, anti-CEA ABM se vezuje za humani CEA vezan za membranu i ne vezuje se za rastvorljivi ljudski CEA. Anti-CEA ABM ima osobine koje su superiornije od onih kod matične antigen-vezujuće molekule. Na primer, varijanta može imati jači afinitet vezivanja, povećanu stabilnost i/ili povećanu sposobnost indukovanja ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelom in vitro i in vivo. U jednom rešenju, anti-CEA ABM ima povećanu stabilnost i zadržava ili ima poboljšan vezujući afinitet za CEA vezanu za membrane i zadržava ili ima povećanu sposobnost da indukuje ćelijsku citotoksičnost posredovanu antitelom in vitro i in vivo.

Da bi se analizirale takve osobine, treba generalno upoređivati varijantni molekul koji vezuje antigen i matični antigen-vezujući molekul u istom formatu; na primer, oblik faba varijantnog antigen-vezujućeg molekula u fab oblikumatičnog antigen-vezujućeg molekula ili oblik pune dužine varijantnog antigen-vezujućeg molekula do oblika pune dužine matičnog antigen-vezujućeg molekula. U jednom rešenju, varijantni antigen-vezujući molekul ima najmanje oko 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 11 puta, 12 puta, 13 puta, 14 puta, 15 puta, 15 puta, 16 puta, 17 puta, 18 puta, 19 puta ili 20 puta poboljšanja u biološkoj aktivnosti u poređenju sa matičnim antigen-vezujućim molekulom. U jednom rešenju, varijantni antigen-vezujući molekul je varijanta konstruisana za stabilnost koja je povećala stabilnost u poređenju sa matičnim antigen-vezujućim molekulom. Stabilnost se može analizirati bilo kojim postupkom poznatim u struci i postupcima opisanim ovde, posebno u primerima 3-6. U specifičnim rešenjima, varijantni antigen-vezujući molekul ima najmanje oko 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 11 puta, 12 puta, 13 puta, 14 puta, 15 puta, 15 puta, 16 puta, 17 puta, 18 puta, 19 puta, 20 puta, 40 puta, 50 puta, 100 puta povećanje stabilnosti u poređenju sa matičnim antigen-vezujućim molekulom.

U nekim rešenjima, varijantni antigen-vezujući molekul pokazuje povećanje stabilnosti koje se meri kao promena u parametru stabilnosti u poređenju sa matičnim antigen-vezujućim molekulom. U nekim rešenjima, varijantni molekul koji vezuje antigen ima najmanje oko 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 11 puta, 12 puta, 13 puta, 14 puta, 15 puta, 15 puta, 16 puta, 17 puta, 18 puta, 19 puta, 20 puta, 40 puta, 50 puta, 100 puta promena u poređenju sa parametrom stabilnosti matičnog antigen-vezujućeg molekula. Parametar stabilnosti je, na primer, temperatura na kojoj se varijanta molekula koji vezuje antigen razvija ili denaturalizuje, pritisak na koji se varijanta antigen-vezujućeg molekula razvija ili denaturiše ili vreme potrebno za denaturaciju ili raspodelu varijantnog antigen-vezujućeg molekula u uslovima koji su dizajnirani da varijantni antigen-vezujući molekul učine nestabilnim. U jednom rešenju, povećanje stabilnosti određuje se analizom termičke denaturacije, na primer diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). U jednom rešenju, povećanje stabilnosti određuje se hemijskim postupkom denaturacije. U jednom rešenju, povećanje stabilnosti se određuje pomoću ispitivanja visokog pritiska. U drugom rešenju, stabilnost variantnog antigen-vezujućeg molekula se određuje korišćenjem testa polarizacije fluorescencije. U jednom rešenju, stabilnost variantnog antigen-vezujućeg molekula se određuje korišćenjem testa dinamičnog rasipanja svetlosti (DLS). (Videti primere i, na primer, Nobbmann, U. i sar., Biotech. Genetic Eng. Rev. 24:117-128 (2007). DLS prati integritet molekula, kao što je antitelo, gde, uopšte, povećanje rasipanja svetlosti ukazuje na razvoj ili denaturaciju proteina. DLS molekule se mogu ispitati kao funkcija temperature ili hemijski denaturansi za upoređivanje relativne stabilnosti. Ovi molekuli koji ostanu u njihovoj rodnoj konformaciji (sa malo ili bez povećanja DLS osobina) smatraju se stabilnim u uslovima testiranja. U jednom rešenju, varijantni antigen-vezujući molekul je stabilan na temperaturi koja je najmanje 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ili 10,0 stepeni Celzijusa veća od matičnog ABM-a ili drugog odgovarajućeg referentnog molekula, kada se analizira pomoću testa dinamičkog rasipanja svetlosti. U jednom rešenju, varijantni antigen-vezujući molekul je stabilan na 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 stepeni Celzijusa ili više. Termička stabilnost se može meriti, na primer, koristeći DLS, DSC ili polarizaciju fluorescencije. U jednom rešenju, termička stabilnost varijantnog antigen-vezujućeg molekula se meri pomoću DLS-a. U jednom rešenju, DLS test se izvodi korišćenjem 1 mg / ml ABM ili varijante ABM u puferu od 20 mM histidina i 140 mM NaCI pri pH 6,0. DLS test se sprovodi počevši od 25 °C sa povećanjem temperature od 0,05 °C/min.

Termin „matični“ antigen-vezujući molekul se odnosi na ABM koji se koristi kao polazna tačka ili osnova za pripremu varijante. U specifičnom rešenju,matični antigen-vezujući molekul ima humani okvirni region i, ako je prisutan, ima konstantni region(e) ljudskog antitela. Na primer, matično antitelo može biti humanizovano ili ljudsko antitelo.

Aminokiselinske „zamene“ mogu rezultirati zamenom jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima slična strukturna i/ili hemijska svojstva, npr. konzervativne zamene aminokiselina. „Konzervativne“ aminokiselinske zamene se mogu napraviti na osnovu sličnosti u polaritetu, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatskoj prirodi uključenih ostataka. Na primer, nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin; polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju arginin, lizin i histidin; a negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. „Umeci“ ili „brisanja“ su uglavnom u opsegu od oko 1 do oko 20 aminokiselina, konkretno oko 1 do oko 10 aminokiselina, a naročito od oko 2 do oko 5 aminokiselina. Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom. Na primer, supstitucije aminokiselina mogu takođe rezultirati zamenom jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima različite strukturne i/ili hemijske osobine, na primer, zamenu amino kiseline iz jedne grupe (npr. polarna) sa drugom aminokiselinom iz druge grupe (npr. osnovna). Dopuštena varijacija može biti eksperimentalno određena sistematskim pravljenjem umetanja, brisanja ili supstitucije aminokiselina u polipeptidnom molekulu koristeći tehnike rekombinantne DNK i ispitivanja rezultirajućih rekombinantnih varijanti za aktivnost.

Kako se ovde koristi, termin „jednosmerni Fv“ ili „scFv“ se odnosi na fragment antitela koji sadrži VH domen i VL domen kao jedan polipeptidni lanac. Obično se VH i VL domeni pridružuju sekvencom povezivača. Videti, npr. Pluckthun, u: The PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol.113, Rosenburg i Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Kako se ovde koristi, termin „minitelo“ se odnosi na bivalentni, homodimerni scFv derivat koji sadrži konstantni region, obično CH3 region imunoglobulina, poželjno IgG, još poželjnije IgG1, kao region dimerizacije. Generalno, konstantni region je povezan sa scFv preko zglobnog regiona i/ili regiona povezivača. Primeri proteina minitela mogu se naći u Hu i sar. (1996), Cancer Res.56: 3055-61.

Kako se ovde koristi, termin „diatelo“ se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Koristeći povezivač koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena u istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. Diatela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; VO 93/11161; i Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Triatelo je rezultat formiranja trivalentnog trimera od tri scFv-a, dajući tri mesta vezivanja, a tetratelo je tetravalentni tetramer od četiri scFv-a, što rezultira sa četiri mesta vezivanja.

U slučaju da postoje dve ili više definicija termina koji se koristi i/ili je prihvaćen u struci, definicija termina koja se ovde koristi ima za cilj da uključi sva takva značenja, osim ukoliko se eksplicitno ne navodi suprotno. Specifičan primer je upotreba termina „region za određivanje komplementarnosti“ (CDR) kako bi se opisale ne-susedne antigenske mešavine (poznate i kao antigen-vezujući regioni) koji se nalaze unutar varijabilnog regiona polipeptida teških i lakih lanaca. CDR-vi se takođe nazivaju „hipervarijabilni regioni" i taj termin se ovde zamenjuje sa terminom „CDR“ kada su u pitanju delovi varijabilnog regiona koji formiraju regione vezivanja antigena. Ovaj region opisali su Kabat i sar., U.S. Dept, of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i Chothia i sar., J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka upoređene jedni sa drugima. Bez obzira na to, primena bilo koje definicije koja se odnosi na CDR antitela ili njegove varijante namenjena je da bude u okviru termina kao što je definisano i kako se ovde koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci su prikazani dole u tabeli 1 kao poređenje. Tačni brojevi ostataka koji obuhvataju određeni CDR će se razlikovati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR-a. Stručnjaci u struci mogu rutinski odrediti koji ostaci sadrže određeni CDR s obzirom na aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona antitela.

TABELA 1. CDR definicije<1>

<1>Broj svih definicija CDR-a u tabeli 1 je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat i sar. (pogledajte u nastavku).

<2>„AbM“ sa malim slovom „b“ kao što je korišćeno u tabeli 1 odnosi se na CDR-ove kao što je definisano pomoću softvera za modeliranje „AbM“ antitela centra „Oxford Molecular“.

Kabat i sar. su takođe definisali sistem numerisanja sekvenci promenljivih domena koji se primenjuje na bilo koje antitelo. Jedan od stručnjaka u ovoj oblasti može nedvosmisleno dodeliti ovaj sistem „Kabatovog numerisanja“ bilo kojoj sekvencu varijabilnog domena, bez oslanjanja na bilo koji eksperimentalni podatak izvan same sekvence. Kao što se ovde koristi, „Kabat numerisanje“ odnosi se na sistem numeracije koji je postavio Kabat i sar, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Ukoliko nije drugačije naglašeno, reference na numerisanje specifičnih pozicija ostataka amino kiselina u ABM su prema Kabat sistemu numerisanja. Sekvence na liste sekvenci (npr. SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:216) nisu numerisane prema Kabat sistemu numerisanja. Međutim, jedan od stručnjaka u ovoj oblasti je upoznat sa tim kako pretvoriti sekvence iz listi sekvenci u Kabat numerisanje.

Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu bar, na primer, 95% „identičnu’ referentnoj nukleotidnoj sekvenci, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci osim kada polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da se dobije polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu bar 95% identičnu referentnoj nukleotidnoj sekvenci, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci mogu biti uklonjeni ili zamenjeni sa drugim nukleotidima, ili broj nukleotida ne veći od 5% broja svih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu.

Kao praktična stvar, ukoliko je bilo koji poseban molekul nukleinske kiseline ili polipeptid bar 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan nukleotidnoj sekvenci ili polipeptidnoj sekvenci opisanoj ovde može biti određen konvencionalno koristeći poznate računarske programe. Jedan metod određivanja najboljeg poklapanja između upitne sekvence (sekvence ovde opisane) i predmetne sekvence, takođe nazivane i globalna poravnanja sekvenci, može biti određen koristeći FASTDB računarski program zasnovan na algoritmu Brutlag i sar, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). U poravnanju sekvenci upitna i predmetna sekvenca su obe DNK sekvence. RNA sekvenca može biti upoređena pretvanjem U u T. Rezultat spomenutog globalnog poravnaja sekvenci je procenat identičnosti. Poželjni parametri korišćeni u FASTDB poravnanju DNK sekvenci da se izračuna procenat identičnosti su: Matrica=Unitarna, k-tuple=4, Kazna nepoklapanja=1, Kazna udruživanja=30, Dužina grupe randomizacije=0, Granični rezultat=1, Kazna za prazninu=5, Kazna za veličinu praznine 0,05, Veličina prozora=500 ili dužina predmetne nukleotidne sekvence, koje god je kraće.

Ukoliko je predmetna sekvenca kraća od upitne sekvence zbog 5' ili 3' brisanja, a ne zbog unutrašnjih brisanja, ručna ispravka se mora napraviti na rezultatima. Ovo je zbog toga što FASTDB program ne računa 5' i 3' skraćenja predmetne sekvence kada računa procenat identičnosti. Za predmetnu sekvencu skraćenu na 5' ili 3' krajevima, u odnosu na upitnu sekvencu, procenat identičnosti se ispravlja računanjem broja baza na upitnoj sekvenci koji su 5' i 3' na predmetnoj sekvenci, koji se ne poklapaju/poravnavaju, kao procenat svih baza upitne sekvence. Da li se nukleotid poklapa/poravnava je određeno rezultatima FASTDB poravnanja sekvenci. Ovaj procenat se onda oduzima od procenta identičnosti, izračunatim gore navedenim programom FASTDB koristeći predviđene parametre, da se dođe do konačnog procenta identičnosti. Ovaj ispravljeni rezultat je onaj koji se koristi za potrebe podnošenja pronalaska. Jedino baze van 5' i 3' baza predmetne sekvence, kao što je prikazano FASTDB poravnanjem, koje nisu poklopljene/poravnate sa upitnom sekvencom, se računaju za potrebe ručnog prilagođavanja rezultata procenta identičnosti.

Na primer, baza 90 predmetne sekvence je poravnata sa bazom 100 upitne sekvence da bi se odredio procenat identičnosti. Brisanja se dešavaju na 5' kraju predmetne sekvence i samim tim, FASTDB poravnanje ne prikazuje poklapanje/poravnanje na prvih 10 baza na 5' kraju. 10 neuparenih baza predstavlja 10% sekvence (broj baza na 5' i 3' krajevima koje se ne poklapaju/ukupam broj baza upitne sekvence) tako da se 10% oduzima od rezultata procenta identičnosti izračunatog FASTDB programom. Ukoliko se preostalih 90 baza perfektno poklapa, konačni procenat identičnosti bi bio 90%. U drugom primeru, predmetna sekvenca sa 90 baza se upoređuje sa upitnom sekvencom sa 100 baza. Ovog puta brisanja su unutrašnja brisanja tako da nema 5' ili 3' baza koje se ne poklapaju/poravnavaju sa upitnom sekvencom. U ovom slučaju procenat identičnosti izračunat FASTDB-om se ne ispravlja ručno. Još jednom, samo za baze 5' i 3' predmetne sekence koje se ne poklapaju/poravnavaju sa upitnom sekvencom se vrši ručno ispravljanje. Za trenutno otkriće se ne vrše nikakva druga ručna ispravljanja.

Za polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline bar, na primer, 95% „identičnu“ sa upitnom sekvencom amino kiseline opisane ovde, predviđeno je da je sekvenca amino kiseline predmetnog polipeptida identična sa upitnom sekvencom osim što predmetna polipeptidna sekvenca može sadržati do pet promena u amino kiselinama na svakih 100 amino kiselina upitne sekvence amino kiselina. Drugim rečima, da se dobije polipeptid koji ima sekvencu amino kiselina bar 95% identičnu sa upitnom sekvencom amino kiselina, do 5% ostataka amino kiselina u predmetnoj sekvenci može biti ubačeno, izbrisano, ili zamenjeno drugom amino kiselinom. Ove promene referentne sekvence se mogu desiti na amino ili karboksi terminalnim pozicijama referentne sekvence amino kiselina ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, rasutih bilo individualno među ostacima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence.

Kao praktična stvar, ukoliko je bilo koji poseban polipeptid bar 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan referentnom polipeptidu može biti određen konvencionalno koristeći poznate računarske programe. Jedan metod određivanja najboljeg poklapanja između upitne sekvence (sekvence ovde opisane) i predmetne sekvence, takođe nazivane i globalna poravnanja sekvenci, može biti određen koristeći FASTDB računarski program zasnovan na algoritmu Brutlag i sar, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). U poravnanju sekvenci upitna i predmetna sekvenca su ili obe nukleotidne sekvence ili obe sekvence amino kiselina. Rezultat spomenutog globalnog poravnaja sekvenci je procenat identičnosti. Poželjni parametri korišćeni u FASTDB poravnanju amino kiselina su: Matrica=PAM 0, k-tuple=2, Kazna nepoklapanja=1, Kazna udruživanja=20, Dužina grupe randomizacije=0, Granični rezultat=1, Veličina prozora=dužina sekvence, Kazna za prazninu=5, Kazna za veličinu praznine 0,05, Veličina prozora=500 ili dužina predmetne sekvence amino kiselina, koje god je kraće.

Ukoliko je predmetna sekvenca kraća od upitne sekvence zbog N– ili C-terminalnih brisanja, a ne zbog unutrašnjih brisanja, ručna ispravka se mora napraviti na rezultatima. Ovo je zbog toga što FASTDB program ne računa N– ili C-terminalna skraćenja predmetne sekvence kada računa globalni procenat identičnosti. Za predmetnu sekvencu skraćenu na N– i C-terminalima, u odnosu na upitnu sekvencu, procenat identičnosti se ispravlja računanjem broja ostataka upitne sekvence koji su N– i C-terminali na predmetnoj sekvenci, koji se ne poklapaju/poravnavaju sa odgovarajućim predmetnim ostacima, kao procenat svih baza upitne sekvence. Da li se ostatak poklapa/poravnava je određeno rezultatima FASTDB poravnjanja sekvenci. Ovaj procenat se onda oduzima od procenta identičnosti, izračunatim gore navedenim programom FASTDB koristeći predviđene parametre, da se dođe do konačnog procenta identičnosti. Ovaj konačni rezultat procenta identičnosti je onaj koji se koristi za potrebe trenutnog otkrića. Jedino ostaci N– i C-terminala predmetne sekvence, kao što je prikazano FASTDB poravnanjem, koje nisu poklopljene/poravnate sa upitnom sekvencom, se računaju za potrebe ručnog prilagođavanja rezultata procenta identičnosti. Odnosno, samo pozicije ostataka upitne sekvence van najdaljeg N– i C-terminalnog ostatka predmetne sekvence.

Na primer, ostatak amino kiseline 90 predmetne sekvence je poravnata sa ostatkom amino kiseline 100 upitne sekvence da se odredi procenat identičnosti. Brisanje se dešava na N-terminalu predmetne sekvence i samim tim, FASTDB poravnanje ne prikazuje poklapanje/poravnanje na prvih 10 baza na N-terminalu.10 neuparenih ostataka predstavlja 10% sekvence (broj ostataka na N– i C-terminalu koje se ne poklapaju/ukupan broj ostataka upitne sekvence) tako da se 10% oduzima od rezultata procenta identičnosti izračunatog FASTDB programom. Ukoliko se preostalih 90 ostataka perfektno poklapa konačni procenat identičnosti bi bio 90%. U drugom primeru, predmetna sekvenca sa 90 ostataka se upoređuje sa upitnom sekvencom sa 100 baza. Ovog puta brisanja su unutrašnja brisanja tako da nema ostataka na N– ili C-terminalu predmetne sekvence koje se ne poklapaju/poravnavaju sa upitnom sekvencom. U ovom slučaju procenat identičnosti izračunat FASTDB-om se ne ispravlja ručno. Još jednom, samo za pozicije ostatka van N– i C-terminalnih krajeva predmetne sekvence, kao što je prikazano na FASTDB poravnanju, koji nisu poklopljeni/poravnati sa upitnom sekvencom se vrši ručno ispravljanje. Za trenutno otkriće se ne vrše nikakva druga ručna ispravljanja.

Procenat identičnosti polinukleotida i/ili polipeptida može takođe biti određen koristeći BLAST programe dostupne kroz Američki nacionalni centar za informacije o biotehnologiji (NCBI), sa zadanim parametrima uključenim u programe.

Kao što je korišćeno ovde, nukleinska kiselina koja „se ukršta pod strogim uslovima“ u sekvencu nukleinskih kiselina opisanih ovde, se odnosi na polinukleotid koji se ukršta pod određenim uslovima, npr. u inkubaciji preko noći na 42 °C u rastvoru koji uključuje 50% formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natrijum citrata), 50 mM natrijum fosfata (pH 7,6), 5x Denhartovog rastvora, 10% dekstran sulfata, i 20 µg/ml denaturisane, strugane DNK iz sperme lososa, praćeno pranjem filtera u 0,1xSSC na oko 65 °C.

Kao što je korišćen ovde, termin „polipeptid ima GnTIII aktivnost“ se odnosi na polipeptide koji mogu da kataliziraju dodavanje N-acetilglukosamin (GlcNAc) ostatka u b-1-4 vezi u b-povezanu manozidu trimanosilskog jezgra N-povezanog oligosaharida. Ovo uključuje fuziju polipeptida koji pokazuju enzimsku aktivnost sličnu, ali ne nužno identičnu, aktivnosti b(1,4)-N-acetilglukosaminiltransferaze III, takođe poznate kao b-1,4-manozil-glikoprotein 4-beta-N-acetilglukosaminil-transferaza (EC 2.4.1.144), prema Komitetu za nomenklaturu Međunarodnog udruženja za biohemiju i molekularnu biologiju (NC-IUBMB), kao što je mereno u određenim biološkim ispitivanjima, sa ili bez zavisnosti od doze. U slučaju gde zavisnost od doze postoji, ne mora biti identična sa onom koju ima GnTIII, ali mora biti slična zavisnosti od doze u datim aktivnostima kad je upoređeno sa GnTIII (npr. polipeptid kandidat će pokazati veću aktivnost ili ne više od 25 puta manju, i po mogućnosti, ne više od deset puta manju aktivnost, i najpoželjnije, ne više od tri puta manju aktivnost u odnosu na GnTIII.).

Kao što je korišćen ovde, termin „Golgi domen lokalizacije“ se odnosi na sekvencu amino kiselina rezidentnog polipeptida Golgi koji je odgovoran za postavljanje polipeptida na lokaciju unutar Golgi kompleksa. Uopšteno, domeni lokalizacije sadrže amino terminalne „repove“ enzima.

Kao što je korišćen ovde, termin „efektorska funkcija“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se pripisuju Fc regionu (Fc region nativne sekvence ili Fc region varijante aminokiselinske sekvence ) antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, afinitet vezivanja Fc receptora, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), lučenje citokina, imuno-kompleksnoposredno uzimanje antigena ćelijama koje predstavljaju antigen, smanjivanje regulacije receptora na površini ćelije, itd.

Kao što je korišćen ovde, termini „inženjer, dizajnirano, inženjering“ posebno sa prefiksom "gliko-", takođe kao za izraz „glikozilacijski inženjering“ se smatraju da uključuju bilo koju manipulaciju glikozilacijskog oblika polipeptida ili njegovog fragmenta koji se dešava prirodno ili rekombinantno. Glikozilacijski inženjering uključuje metabolički inženjering glikozilacijskog aparata ćelije, uključujući genetičku manipulaciju puteva sinteze oligosaharida da se postigne promenjena glikozilacija glikoproteina prikazanih u ćelijama. Takođe, glikozilacijski inženjering uključuje efekte mutacije i ćelijskog okruženja na glikozilaciji. U jednom rešenju, glikozilacijski inženjering je promena u glikoziltransferaznoj aktivnosti. U određenom rešenju, inženjering daje promenu glikozaminiltransferazne aktivnosti i/ili fukoziltransferazne aktivnosti.

Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin“ pokriva bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi polipeptide i molekule koji vezuju antigene opisane ovde. U jednom rešenju, ćelija domaćin može biti projektovana da dozvoli proizvodnju molekula za vezivanje antigena sa modifikovanim glikoformama. U odgovarajućem rešenju, molekul za vezivanje antigena, ili promenjeni molekul za vezivanje antigena, je antitelo, fragment antitela ili protein fuzije. U određenim rešenjima, ćelije domaćini mogu biti dalje modifikovani da pokazuju povećane nivoe jednog ili više polipeptida koji imaju GnTIII aktivnost. Ćelije domaćini uključuju kultivisane ćelije, npr. kultivisane ćelije sisara, kao CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišijih mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili hibridoma ćelije, ćelije kvasca, ćelije insekata, i ćelije biljaka, da navedemo nekoliko, ali takođe ćelije koje se nalaze unutar transgenskih životinja, transgenskih biljaka ili kultivisano biljno ili životinjsko tkivo.

Kao što je korišćen ovde, termin „Fc-posredovana ćelijska citotoksičnost“ uključuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i ćelijsku citotoksičnost posredovanu rastvorivom Fc-fuzijom proteina koji sadrže ljudski Fc-region. To je imuni mehanizam koji vodi do lize „ciljanih ćelija“ od strane „ljudskih imunih efektorskih ćelija“.

Kao što je korišćen ovde, termin „ljudska imuna efektorska ćelija“ se odnosi na populaciju leukocita koji prikazuju Fc receptore na svojoj površini, kroz koje se oni vežu za Fcregion molekula za vezivanje antigena ili Fc-fuzijskih proteina i obavljaju efektorske funkcije.

Takva populacija može uključivati, ali nije ograničena na, periferne krvne mononuklearne ćelije (PBMC) i/ili ćelije prirodne ubice (NK).

Kao što je korišćen ovde, termin „ciljane ćelije“ se odnosi na ćelije na koje se molekuli za vezivanje antigena koji sadrže Fc region (npr. antitela ili njihovi fragmenti koji sadrže Fc region) ili Fc-fuzijske proteine posebno vežu. Molekuli za vezivanje antigena ili Fc-fuzijski proteini se vežu za ciljane ćelije putem proteinskog dela koji je N-terminalni na Fc regionu.

Kao što je korišćen ovde, termin „povećana Fc-posredovana ćelijska citotoksičnost“ je definisana kao ili povećanje broja „ciljanih ćelija“ koje su lizirale u određenom vremenu, na određenoj koncentraciji molekula za vezivanje antigena ili Fc-fuzisjkog proteina u okruženju ciljanih ćelija, mehanizmom Fc-posredovane ćelijske citotoksičnosti definisanog iznad, i/ili smanjenje koncentracije molekula za vezivanje antigena ili Fc-fuzijskog proteina, u okruženju ciljanih ćelija, potrebne da se postigne liza određenog broja „ciljanih ćelija“, u određenom vremenu, mehanizmom Fc-posredovane ćelijske citotoksičnosti. Povećanje Fc-posredovane ćelijske citotoksičnosti je u odnosu na ćelijsku citotoksičnost posredovanu istim molekulom za vezivanje antigena ili Fc-fuzijskim proteinom proizvedenim od strane iste vrste ćelija domaćina, koristeći iste standardne metode proizvodnje, prečišćavanja, formulacije i skladištenja, (koje su poznate stručnim osobama u ovoj oblasti) ali nije proizvedeno od strane ćelija domaćina projektovanih da imaju promenjen oblik glikozilacije (npr. da pokazuju glikoziltansferazu, GnTIII, ili druge glikoziltrasferaze) metodama opisanim ovde.

Pod „molekulom za vezivanje antigena koji ima povećanu antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC)“ podrazumeva se molekul za vezivanje antigena, na način kako je taj izraz ovde definisan, koje ima povećanu ADCC, određeno ma kojim pogodnim postupkom poznatim stručnoj osobi u ovoj oblasti. Jedan prihvaćeni in vitro ADCC test je sledeći:

1) test koristi ciljne ćelije za koje se zna da eksprimiraju ciljni antigen kog prepoznaje antigen-vezujući region antitela;

2) test koristi humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), izolovane iz krvi nasumično odabranih zdravih donora, kao efektorske ćelije;

3) test se izvodi prema sledećem protokolu:

i) PBMC-i se izoluju korišćenjem standardnih procedura centrifugiranja prema gustini i suspenduju pri 5 x 106 ćelija/ml u RPMI medijumu ćelijske kulture;

ii) ciljane ćelije se uzgajaju standardnim postupcima kulture tkiva, sakupljaju u eksponencijalnoj fazi rasta sa viabilnošću većom od 90%, ispiraju u RPMI medijumu ćelijske kulture, obeležavaju sa 100 mikro-Kirija 51Cr, ispiraju dva puta sa medijumom ćelijske kulture i resuspenduju u medijumu ćelijske kulture pri gustini od 105 ćelija/ml;

iii) 100 mikrolitara finalne gornje suspenzije ciljnih ćelija se prenosi u svaki bazen mikrotitarske ploče sa 96 bazena;

iv) antitelo se serijski razblažuje od 4000 ng/ml do 0,04 ng/ml u medijumu za ćelijske kulture i 50 mikrolitara dobijenih rastvora antitela se dodaje u ciljne ćelije na mikrotitarskoj ploči sa 96 bazena, testirajući u triplikatu različite koncentracije antitela koje pokrivaju celokupni gorenavedeni koncentracioni opseg;

v) za kontrole maksimalnog oslobađanja (MR), u 3 dodatna bazena na ploči koja sadrže obeležene ciljne ćelije, dodato je 50 mikrolitara 2% (V/V) vodenog rastvora nejonskog deterdženta (Nonidet, Sigma, St. Louis), umesto rastvora antitela (gornja tačka iv);

vi) za kontrole spontanog oslobađanja (SR), u 3 dodatna bazena na ploči koja sadrže obeležene ciljne ćelije, dodato je 50 mikrolitara RPMI medijuma za ćelijske kulture umesto rastvora antitela (gornja tačka iv);

vii) mikrotitarska ploča sa 96 bazena se onda centrifugira na 50 x g u toku 1 minuta, i inkubira 1 sat na 4 °C;

viii) 50 mikrolitara PBMC suspenzije (tačka i iznad) se dodaje svakom bazenu da se dobije odnos efektor:ciljana ćelija od 25:1 i ploče su postavljene u inkubator pod 5% CO2 atmospherom na 37<o>C na 4 sata;

ix) supernatant bez ćelija iz svakog bazena se sakupi, i eksperimentalno oslobođena radioaktivnost (ER) se izmeri korišćenjem gama brojača;

x) procenat specifične lize se računa za svaku koncentraciju antitela prema formuli (ER-MR)/(MR-SR) x 100, gde je ER prosečna vrednost izmerene radioaktivnosti (vidi gornju tačku ix) za tu koncentraciju antitela, MR je prosečna izmerena radioaktivnost (vidi gornju tačku ix) za MR kontrole (vidi gornju tačku v), a SR je prosečna izmerena radioaktivnost (vidi gornju tačku ix) za SR kontrole (vidi gornju tačku vi);

4) "povećanje ADCC" je definisano ili kao povećanje maksimalnog procenta specifične lize koje se zapaža unutar koncentracionog opsega antitela testiranog gore i/ili smanjenje koncentracije antitela neophodne da se postigne polovina maksimalnog procenta specifične lize koje se zapaža unutar koncentracionog opsega antitela testiranog gore. Povećanje ADCC je u odnosu na ADCC, mereno gornjim testom, posredovano istim antitelom, koje je proizvedeno istim tipom ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih postupaka proizvodnje, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja, koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, ali koje nije proizvedeno u ćelijama domaćina konstruisanim da prekomerno eksprimiraju GnTIII.

Molekuli za vezivanje anti-CEA antigena, polipeptidi i polinukleotidi

CEA se dugo koristi kao marker za karcinom za dijagnostičke potrebe. Abnormalno je visoko prikazan (npr. previše prisutan i/ili rasprostranjen u različitim oblicima u ćeliji) u mnogim tkivima tumora u poređenju sa ne-tumornim tkivom iste ćelijske vrste. Međutim, zbog toga što je CEA generalno odvojen od površine ćelije tumora i većina dostupnih anti-CEA antitela se takođe veže za rastvorivi CEA, nekonjugovana antitela za CEA se uopšteno ne koriste za terapeutske potrebe. Na primer anti-CEA antitela koja su trenutno u početnim testiranjima se daju kao radiokonjuktori (Wong i sar, 2004, Liersch i sar, 2007). Nekoliko mehanizama je uključeno u terapeutsku efikasnost anti-CEA antitela, uključujući antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADDC) i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC). Povećan CEA izraz predstavlja povećanu međućelijsku adheziju, koja može dovesti do metastaze kancerogenih ćelija (MarshallJ., Semin Oncol. 30(3) Suppl. 8:30-36). Prema tome, anti-CEA molekuli za vezivanje antigena mogu takođe igrati ulogu u nastanjivanju CEA-posredovane ćelijske adhezije i metastaze kancerogenih ćelija.

Iz jednog rešenja, otkriće je usmereno na varijantni molekul za vezivanje antigena (npr. antitelo ili fragment istog) koji sadrži jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) CDR-ova mišijeg PR1A3 antitela, gde bar jedan od CDR-ovaima zamenu za bar jedan ostatak amino kiseline kada se uporedi sa odgovarajućim CDR-om PR1A3, i gde varijantni molekul za vezivanje antigena ima poboljšan afinitet za CEA, poželjno za CEA koji se nalazi pri membrani kada se uporedi sa matičnim PR1A3 molekulom za vezivanje antigena. Međunarodna patent aplikacija WO2011023787 opisuje anti-CEA molekule za vezivanje antigena sa poboljšanim afinitetom za CEA prema poređenju sa vidljivim PR1A3 molekulom za vezivanje antigena. Iz drugog rešenja, otkriće je usmereno na varijantni molekul za vezivanje antigena koji sadrži jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) CDR-ova mišijeg PR1A3 antitela, gde bar jedan od CDR-ova ima zamenu za bar jedan ostatak amino kiseline kada se uporedi sa odgovarajućim CDR-om PR1A3, i gde varijantni molekul za vezivanje antigena ima povećanu stabilnost u poređenju sa matičnim PR1A3 molekulom za vezivanje antigena. U jednom rešenju, matični PR1A3 molekul za vezivanje antigena je humanizirani PR1A3 molekul za vezivanje antigena. U jednom rešenju, matični PR1A3 molekul za vezivanje antigena sadrži težak lanac promenjivog regiona CH7A (SEQ ID NO: 101). U jednom rešenju, matični PR1A3 molekul za vezivanje antigena sadrži težak lanac regiona CH7A (SEQ ID NO: 101) i laki lanac promenjivog regiona 2F1 (SEQ ID NO: 209). Takvi jedan ili više CDR-ova mogu biti skraćeni CDR-ovi i sadržaće, minimalno, posebno određene ostatke (SDR-ove), kao što je izraz opisan ovde, za dati CDR. U jednom rešenju, varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži bar jedan (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) CDR-ova odabranih iz SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 i 217-224 (sl.32 i sl. 36), koji sadrži ostatke CDR-ova koji zadržavaju određenu vezu. U drugom rešenju, varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži bar jedan (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) CDR-ova odabranih iz SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 i 217-224, ili varijantnu ili skraćenu formu istog koji sadrži bar posebno određene ostatke za dati CDR, i sadrži sekvencu izvedenu iz heterolognog polipeptida. U posebnom rešenju, gde varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži teški lanac CDR1 varijante PR1A3, HCDR1 ima glutamat umesto valina na Kabat poziciji 31. U posebnom rešenju, gde varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži teški lanac CDR3 varijante PR1A3, HCDR3 ima alanin umesto tirozina na Kabat poziciji 98 ili tirozin umesto aspartata na Kabat poziciji 99. U posebnom rešenju, gde varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži teški lanac CDR3 varijante PR1A3, HCDR3 ima alanin umesto tirozina na Kabat poziciji 98 i tirozin umesto aspartata na Kabat poziciji 99.

U jednom rešenju, varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži teški lanac CDR3 izabran iz SEQ ID NO: 217-224 (sl. 36) i dva teška lanca CDR-a (npr. HCDR1 i HCDR2) izabranih iz SEQ ID NO: 1-3, 5-10, i 12-24 i/ili tri laka lanca CDR-a (npr. LCDR1, LCDR2, i LCDR3) izabranih iz SEQ ID NO: 36-56, ili varijante ili skraćene forme istih koje sadrže bar posebno određene ostatke za svaki CDR. U specifičnijem rešenju, varijantni molekul za vezivanje antigena sadrži teški lanac CDR3 izabran iz SEQ ID NO: 217-224 i dva teška lanca CDR-a (npr. HCDR1 i HCDR2) izabranih iz SEQ ID NO: 1-3, 5-10, i 12-24 i tri laka lanca CDR-a (npr. LCDR1, LCDR2, i LCDR3) izabranih iz SEQ ID NO: 36-56. U drugom rešenju, varijanta antigena koja vezuje molekul sastoji se od varijabilnog(ih) regiona lakih antitela i/ili teških lanaca, ako je moguće, varijabilnu oblast lakih i teških lanaca. U konkretnijem rešenju, varijabilna oblast teškog lanca i/ili lakog lanca bira se iz varijabilne oblasti teškog i/ili lakog lanca izabrane iz niza sa ID brojevima: 99-108, niz sa ID brojevima: 188-216, i niz sa ID brojevima: 225-248 (slika 33 i slika 37A-C) ili njihovom kombinacijom, gde varijabilna oblast teškog i lakog lanca nije kombinacija nizova sa ID brojem: 99 i SEQ ID NO: 103 ili SEQ ID NO: 100 i SEQ ID NO: 104. U nekim rešenjima, teški lanac sastoji se od okvirnih ostataka CH1A1A (SEQ ID NO: 261) ili CH1A1B (SEQ ID NO: 262) (sl. 37C). U jednom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen sastoji se od varijabilne oblasti teškog lanca izabrane iz SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 ili SEQ ID NO: 247.

U jednom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen je himerno antitelo, konkretno, humanizovano antitelo. U drugom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen nalazi se u Fc oblasti. U sledećem rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen ima sazreli afinitet. U sledećem rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen je napravljen tako da ima povećanu stabilnost (stabilna zrelost). U sledećem rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen ima povećanu ADCC aktivnost u poređenju sa PR1A3. U sledećem rešenju, povećanje ADCC za varijantu molekula koji vezuje antigen nastalo je zbog povećanog afiniteta varijante molekula koji vezuje antigen za membranu CEA, na primer, sazrevanjem afiniteta ili drugim metodama za povećanje afiniteta (pogledajte Tang i sar., J. Immunol. 2007, 179:2815-2823). U drugom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen nalazi se u Fc oblasti koja je napravljena na osnovu glikola. U sledećem rešenju, otkriće je takođe usmereno ka metodama za kreiranje takvih molekula sa varijantama za vezivanje antigena i njihovu upotrebu za lečenje bolesti, posebno u slučajevima poliferacionih poremećaja ćelija kod kojih je izražen CEA, naročito kada je CEA povećan u velikim količinama (npr. previše istaknut ili istaknut u različitim delovima ćelije) u poređenju sa normalnim tkivom ćelije iste vrste. U takve poremećaje spadaju, ali bez ograničenja na, kolorektalni rak, NSCLC (rak pluća ne-malih ćelija), rak želuca, rak pankreasa i rak dojke. Ekspresioni nivoi za CEA mogu biti određeni metodama koje se koriste u struci i metodama koje su ovde opisane (npr. preko imunohistohemijske analize, imunofluoroesencione analize, imunoenzimske analize, ELISA, citometrije toka, radio-imunološke analize, „Western“ mrljom, vezivanjem liganda, aktivnošću kinaze, itd.).

U drugom rešenju, otkriće je usmereno na izolovane polinukleotide koji kreiraju niz koji kodira polipeptide koji se sastoje od jednog ili više (npr, jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) komplementarnih određenih oblasti mišijih antitela PR1A3, ili varijante ili njihovi skraćeni oblici koji sadrže bar posebno određene ostatke za navedenu komplementarnost određujućih oblasti.

Obično tako izolovani polinukleotidi kodiraju jedan ili više fuzionih polipeptida koji kreiraju antigen za vezivanje molekula. U jednom rešenju, polinukleotid kreira niz koji kodira jednu ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) CDR-a izabranih iz niza sa ID brojevima: 1-3, 5-10, 12-56 i 217-224, koji čine ostatke CDR-ova koji zadržavaju posebno vezivanje. U jednom slučaju, polinukleotid se sastoji iz niza u kom se nalaze bar tri teška lanca CDR-a (npr, HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i/ili tri laka lanca CDR-ova (npr. LCDR1, LCDR2 i LCDR3 izabranih iz niza sa ID brojevima: 1-3, 5-10, 12-56 i 217-224, ili varijante ili njihovi skraćeni oblici koji sadrže bar ostatke koji određuju specifičnosti (SDR-ove) za svaku od tri navedene komplementarne odlučujuće oblasti. U specifičnijim rešenjima, polinukleotid se kodira polipeptidom koji se sastoji od jednog teškog lanca CDR3 izabranog iz SEQ ID NO: 217-224 i dva teška lanca CDR-a (npr. HCDR1 i HCDR2) izabranih iz SEQ ID NO: 1-3, 5-10, i 12-24 i tri laka lanca CDR-a (npr. LCDR1, LCDR2, i LCDR3) izabranih iz SEQ ID NO: 36-56. U drugom rešenju, polinukleotid se kodira polipeptidom koji se sastoji od promenljive(ih) oblasti lakog i/ili teškog lanca antitela. Polinukleotid se kodira sa promenljivom oblašću teškog i lakog lanca polipeptida i može se izraziti u jednom ili više vektora za izražavanje. U specifičnijim rešenjima, polinukleotidno kodiranje promenljive oblasti lakog i/ili teškog lanca bira se iz niza sa ID brojevima: 99-108, niz sa ID brojevima: 188-216, i niz sa ID brojevima: 225-248 bira se iz grupe polinukleotida iz niza sa ID brojevima: 159-187, i niz sa ID brojevima: 249-256 ili njihovom kombinacijom, gde varijabilne oblasti teškog i lakog lanca nisu kombinacija nizova sa SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 116. U jednom rešenju, težak i lak lanac promenljive oblasti polipeptida kodiran polinukleotidima kombinuje se i formira himerično antitelo, konkretnije, humanoidno antitelo. U posebnom rešenju, kada polinukleotid kreira niz koji kodira težak lanac CDR1 za PR1A3 ili njegovu varijantu, navedeni polinukleotid kodira glutamat zamenjen za valin u Kabat poziciji 31. U posebnom rešenju, kada polinukleotid kreira niz koji kodira težak lanac CDR3 za PR1A3 ili njegovu varijantu, navedeni polinukleotid kodira glutamat zamenjen za valin u Kabat poziciji 98, ili tirozin zamenjen aspartatom u Kabat poziciji 99. U posebnom rešenju, kada polinukleotid kreira niz koji kodira težak lanac CDR3 za PR1A3 ili njegovu varijantu, navedeni polinukleotid kodira glutamat zamenjen za valin u Kabat poziciji 98 i tirozin zamenjen aspartatom u Kabat poziciji 99. U jednom rešenju, polinukleotid kodira alanin zamenjen tirozinom u Kabat poziciji 98 ili tirozin zamenjen aspartatom u Kabat poziciji 99 u okviru od CH1A1A (SEQ ID NO: 261) ili CH1A1B (SEQ ID NO: 262). U jednom rešenju, polinukleotid se sastoji od niza koji kodira teški lanac odabran iz SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 ili SEQ ID NO: 247. U drugom rešenju, polinukleotid se sastoji od niza koji kodira Fc oblast. Otkriće dalje nastavlja ka polipeptidima kodiranim takvim polinukleotidima.

U jednom rešenju, trenutno otkrće povezano je sa molekulima koji vezuju antigen ili varijantama molekula koji vezuju antigen (npr, antitelo ili njegov deo) i polipeptida koji imaju iste specifikacije za vezivanje sa mišjim antitelom PR1A3 (npr, vezivanje sa istim epitopom sa CEA vezanim za membranu), i koji imaju uporedive ili poboljšane biološke aktivnosti (npr, povećani afinitet prema CEA vezanim za membranu, povećanu stabilnost, i/ili povećani ADCC). U jednom rešenju, varijanta molekula koji se vezuje za antigen vezuje se za isti epitop kao i kod matičnog antigen-vezujućeg molekula. U jednom rešenju, varijanta molekula koja se vezuje za antigen se takmiči za vezivanje na humanu CEA vezanu za membrane sa matičnim antigenvezujućom molekulom. U jednom rešenju, varijanta molekula koji se vezuje za antigen se vezuje za humanu CEA vezanu za membranu i ne vezuje se za rastvorljivi ljudski CEA. U jednom rešenju, otkriće je povezano sa molekulima za vezivanje antigena i varijantu molekula za vezivanje antigena i polipeptide koji imaju povećanu stabilnost u poređenju sa antitelom miša PR1A3 ili njegovoj ljudskoj varijanti. U jednom rešenju, trenutno otkriće povezano je sa molekulima koji vezuju antigen i varijantama molekula koji vezuju antigen (npr, antitelo ili njegov deo) i polipeptida koji vezuju CEA vezan na membrani i imaju povećanu stabilnost u poređenju sa ljudskim PR1A3 antitelom koje se sastoji od promenljive oblasti teškog lanca CH7A (SEQ ID NO:101). U jednom rešenju, trenutno otkriće povezano je sa molekulima koji vezuju antigen i varijantama molekula koji vezuju antigen (npr, antitelo ili njegov deo) i polipeptida koji vezuju CEA vezan na membrani i imaju povećanu stabilnost u poređenju sa ljudskim PR1A3 antitelom koje se sastoji od promenljive oblasti teškog lanca CH7A (niz sa ID brojem:101) i promenljivu oblast lakog lanca 2F1 (SEQ ID NO: 209)

U jednom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigen ili polipeptida kreira niz koji sadrži bar jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest) CDR-a izabranih iz niza sa ID brojevima: 1-3, 5-10, 12-56 i 217-224 (sl. 32 i sl.36). U jednom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigene ili polipeptide sadrži: (a) težak lanac CDR1 niza izabranog iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO: 12; (b) niza sa teškim lancem CDR2 izabran iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24: i (c) niza sa teškim lancem CDR3 izabranog iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 i SEQ ID NO:224. U drugom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigene ili polipeptide sadrži: (a) lagani lanac CDR1 niza izabranog iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 i SEQ ID NO:45; (b) niz sa laganim lancem CDR izabran iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO:46 i SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 i SEQ ID NO:55; i (c) laganog lanca CDR3 za SEQ ID NO:56. U nekim rešenjima, varijanta molekula koji vezuje antigen ili polipeptid sastoji se od CDR-ova koji se takođe sastoje od okvirnih ostataka CH1A1A (SEQ ID NO: 261) ili CH1A1B (SEQ ID NO: 262).

U jednom rešenju, otkriće je usmereno ka varijanti molekula koji vezuje antigen ili polipeptida koji vezuje CEA vezan za membrane, koji se sastoji od promenljive oblasti teških lanaca i/ili promenljive oblasti lakih lanaca. U jednom rešenju, varijabilna oblast teškog lanca i/ili lakog lanca bira se iz varijabilne oblasti lakog i/ili teškog lanca izabrane iz niza sa ID brojevima: 99-108, niz sa ID brojevima: 188-216, i niz sa ID brojevima: 225-248 (sl.33 i sl.37A-C). U jednom rešenju, promenljiva oblast sa teškim lancem koja se sastoji od polipeptida ima niz od bilo kog niza sa ID brojevima: 225-248. Kod drugog namenskog izvođenja, promenljiva oblast sa teškim lancem sastoji se od polipeptida koji ima niz koji je makar 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan nizu bilo kog niza sa ID brojevima: 225-248.

U jednom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigene sastoji se od varijabilne oblasti teškog lanca izabrane iz SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 i SEQ ID NO: 247. U drugom rešenju, promenljiva oblast teškog lanca sastoji se od polipeptida koji ima bar oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 i SEQ ID NO: 247. U jednom rešenju, promenljiva oblast sa lakim lancem sastoji se od polipeptida i ima niz od bilo kog SEQ ID NO: 209. Kod drugog izvođenja, promenljiva oblast teškog lanca sastoji se od polipeptida koji ima bar oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identifikatora za niz iz SEQ ID NO: 209.

U jednom rešenju, molekul za vezivanje antigena, varijanta molekula za vezivanje antigena ili polipeptid koji vezuje CEA vezan za membranu sastoji se od promenljive oblasti teškog lanca i promenljive oblasti lakog lanca. U jednom konkretnom rešenju, promenljiva oblast sa teškim lancem sastoji se od polipeptida i ima niz od bilo kog SEQ ID NO: 4 na sledeći način:

pri čemu je X<1>jednako Y ili F; X<2>je S ili G; X<3>je N ili S; X<4>je W ili Y; X<5>je N, T ili S; X<6>je T ili N; X<7>je V ili I; X<8>je F ili A; X<9>je Y, A, V, F ili S; X<10>je D, H, W, E, ili Y; X<11>je V, L ili F; X<12>je E, K ili Q; X<13>je A ili T; i X<14>je M ili L.

U jednom konkretnom rešenju, promenljiva oblast sa lakim lancem sastoji se od polipeptida i ima niz od bilo kog SEQ ID NO: 11 na sledeći način:

pri čemu je X15 jednako Q, A, K, ili H; X16 je N, A, Y, I, K, T, ili F; X17 je V, A, G, ili M; X18 je G, S, T, ili L; X19 je T, N, P, ili A; X20 je N ili Y; X21 je P ili L; X22 je S, L, ili W; X23 je Y, N, ili H; X24 je R, L, P, ili H; X25 je Y, S, Q, K, E, F, ili P; i X26 je S, G, I, ili R.

U drugom rešenju, otkriće dalje usmerava ka izolovanim polinukleotidima koji kodiraju molekule koji vezuju antigen, varijante molekula koje vezuju antigen ili polipeptide koji vezuju CEA vezan za membranu. U jednom slučaju, polinukleotid se sastoji iz niza u kom se nalaze bar tri teška lanca CDR-a (npr, HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i/ili tri laka lanca CDR-ova (npr. LCDR1, LCDR2 i LCDR3 izabranih iz niza sa ID brojevima: 1-3, 5-10, 12-56 i 217-224, ili varijante ili njihovi skraćeni oblici koji sadrže bar ostatke koji određuju specifičnosti (SDR-ove) za svaku od tri navedene komplementarne odlučujuće oblasti. U specifičnijim rešenjima, polinukleotid se kodira polipeptidom koji se sastoji od jednog teškog lanca CDR3 izabranog iz SEQ ID NO: 217-224 i dva teška lanca CDR-a (npr. HCDR1 i HCDR2) izabranih iz SEQ ID NO: 1-3, 5-10, i 12-24 i tri laka lanca CDR-a (npr. LCDR1, LCDR2, i LCDR3) izabranih iz SEQ ID NO: 36-56. U drugom rešenju, polinukleotid se kodira polipeptidom koji se sastoji od promenljive(ih) oblasti lakog i/ili teškog lanca antitela. Polinukleotidi koji kodiraju promenljivu oblast teškog i lakog lanca polipeptida mogu se izraziti u jednom ili više vektora za izražavanje. U specifičnijim rešenjima, polinukleotidno kodiranje promenljive oblasti lakog i/ili teškog lanca bira se iz niza sa ID brojevima: 99-108, niz sa ID brojevima: 188-216, i niz sa ID brojevima: 225-248 bira se iz grupe polinukleotida iz niza sa ID brojevima: 159-187, i niz sa ID brojevima: 249-256 ili njihovom kombinacijom, gde varijabilne oblasti teškog i lakog lanca nisu kombinacija nizova sa ID brojem: 11 i SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 116. U jednom rešenju, težak i lak lanac promenljive oblasti polipeptida kodiran polinukleotidima kombinuje se i formira himerično antitelo, konkretnije, humanoidno antitelo.

U jednom rešenju, molekul koji vezuje antigen, varijanta molekula koji vezuje antigen ili polipeptid koji vezuje CEA vezan za membranu nalazi se u Fc oblasti. U specifičnijem slučaju, molekul koji vezuje antigen, varijanta molekula koji vezuje antigen ili polipeptid je inženjerski derivat glikola i ima izmenjenu šemu glikozilacije u Fc oblasti. U specifičnom slučaju, afinitet za CEA vezan za membranu varijante molekula koji vezuje antigen ili polipeptid se povećava u poređenju sa matičnim antitelom PR1A3. U drugom slučaju, stabilnost varijante molekula za vezivanje antigena ili polipeptida povećava se u poređenju sa matičnim antitelom PR1A3. U drugom rešenju, varijanta molekula koji vezuje antigene ili polipeptide ima povećanu aktivnost za ADCC. U sledećem rešenju, povećanje ADCC za varijantu molekula koji vezuje antigen ili polipeptida nastalo je zbog povećanog afiniteta vezivanja polipeptida za membranu CEA, na primer, sazrevanjem afiniteta ili drugim metodama za povećanje afiniteta.

U sledećem rešenju, otkriće je takođe usmereno ka metodama upotrebe molekula sa varijantama za vezivanje antigena i polipeptida za lečenje bolesti, posebno u slučajevima poliferacionih poremećaja ćelija kod kojih je izražen CEA, naročito kada je CEA veoma povećan (npr. previše istaknut ili istaknut u različitim delovima ćelije) u poređenju sa normalnim tkivom ćelije iste vrste. U takve poremećaje spadaju, ali bez ograničenja na, kolorektalni rak, NSCLC (rak pluća ne-malih ćelija), rak želuca, rak pankreasa i rak dojke. Ekspresioni nivoi za CEA mogu biti određeni metodama koje se koriste u struci i metodama koje su ovde opisane (npr. preko imunohistohemijske analize, imunofluoroesencione analize, imunoenzimske analize, ELISA, citometrije toka, radio-imunološke analize, „Western“ mrljom, vezivanjem liganda, aktivnošću kinaze, itd.).

U konkretnom slučaju, otkriće je usmereno na ljudski antigen za koji se vezuje molekul ili njegov deo ili fragmenat koji vezuje CEA vezan za membranu i čini varijabilnu oblast teškog lanca koju čini niz iz bilo kog SEQ ID NO: 225-248. U drugom slučaju, otkriće je usmereno na ljudski antigen za koji se vezuje molekul ili njegov deo ili fragmenat koji vezuje CEA vezan za membranu i čini varijabilnu oblast lakog lanca koju čini niz iz bilo kog niza sa ID brojevima: 105, 108 ili 207-216. U konkretnom slučaju, ljudski antigen za koji se vezuje molekul ili njegov deo ili fragmenat koji vezuje CEA vezan za membranu i čini varijabilnu oblast teškog lanca koju čini niz iz bilo kog niza sa ID brojevima: 225-248 i varijabilna oblast sa lakim lancem koju čini niz od bilo kog niza sa ID brojevima: 105, 108 ili 207-216. U jednom slučaju, molekul koji vezuje ljudski antigen kreira konstantnu oblast za ljudski teški lanac i/ili konstantnu oblast za ljudski laki lanac. Takve konstantne oblasti su opisane ovde i poznate u struci. U konkretnijem slučaju, molekul za vezivanje ljudskog antigena nalazi se u Fc oblasti, tačnije, Fc oblasti koja je kreirana inženjerski na bazi glikola.

Metode za humanizaciju antitela koja nisu ljudskog porekla su poznate u struci. Na primer, humanizovani ABM-ovi ovde opisani mogu se pripremiti u skladu sa metodama SAD Pat. br. 5,225,539 za Winter,SAD Pat. br. 6,180,370 za Queen i sar., ili SAD Pat. br. 6,632,927 za Adair i sar.. Ako je moguće, ljudsko antitelo ima jedan ili više ostataka amino kiseline uvedenih iz izvora koji nije ljudskog porekla. Ovi ostaci amino kiselina koje nisu ljudskog porekla često se nazivaju „uveženi“ ostaci, koji se obično uzimaju kao „uveženi“ promenljivi domen. Humanizacija može da se na kraju obavi metodom Vintera i saradnika (Jones i sar., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i sar., Science, 239:1534-1536 (1988)), supstitucijom niza hipervarijabilne oblasti za odgovarajuće nizove ljudskog antitela. U skladu sa tim, ta „humanoidna“ antitela predstavljaju himerična antitela (SADSAD Pat. br. 4,816,567) kod kojih se u značajno manjoj meri netaknuti ljudski promenljivi domen menja odgovarajućim nizom dobijenim od vrsta koje nisu ljudskog porekla. Obično su humanoidna antitela ljudska antitela kod kojih su ostaci određene hipervarijabilne oblasti i verovatno neki FR ostaci zamenjeni ostacima sa analognih lokacija pomoću neljudskih antitela (npr. glodara). Navedena humanizovana anti-CEA antitela opcionalno će se dodati konstantnim oblastima iz ljudskog imunoglobina.

Izbor lakih ili teških lanaca iz ljudskih promenljivih domena za kreiranje humanoidnih antitela je veoma važan zbog sprečavanja antigenizacije. U skladu sa takozvanom metodom „najboljeg poklapanja“, niz promenljivih domena antitela donatora (npr. glodara) upoređuje se sa celom bibliotekom poznatih nizova ljudskih promenljivih domena. Ljudski niz koji je najbliži nizu donatora (npr, glodara) zatim se prihvata kao oblast okvira za ljude (FR) za humanoidno antitelo (Sims i sar., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia i sar., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Još jedna metoda za izbor niza za ljudski okvir je upoređivanje okvira niza svakog pojedinačnog pod-regiona kompletnog donatora (npr, glodara) (npr, FR1, FR2, FR3 i FR4) ili pojedinih kombinacija pojedinačnih pod-regiona (npr, FR1 i FR2) sa bibliotekom poznatih promenljivih nizova kod ljudi koji odgovaraju pod-regijama tog okvira (npr, u skladu sa odredbama Kabat numeracije), i izborom ljudskih nizova za svaku pod-oblast ili kombinaciju koja je najbliža glodaru (Leung U.S. Patent Application Publication br. 2003/0040606A1, objavljeno 27. februara 2003.). Drugi metod koristi određenu oblast konkretnog okvira dobijenog iz konsenzusnog niza svih ljudskih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca (Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta i sar., J. Immunol., 151:2623 (1993)). U jednom slučaju, oblasti sa ljudskim okvirom biraju se iz grupe ljudskih embrionskih nizova. Ovakve kolekcije ljudskih embrionskih nizova mogu se pronaći u bazama podataka kao što je IMGT ili VBase. Okvirne oblasti mogu se izabrati individualno (npr, FR1-3 izabran za prihvatača za promenljive oblasti teških i/ili lakih lanaca humanizovanih anti-CEA ABM-ova mogu se kodirati različitim embrionskim genima) ili kao deo istog embrionskog gena. U konkretnijem rešenju, teški lanac FR1-3 kodira se preko IGHV7_4_1*02 niza ljudskog imunoglobinskog embrionskog gena (Procena br. X62110, SEQ ID NO: 114). U drugom konkretnom rešenju, laki lanac FR1-3 kodira se preko IMGT_hVK_1_39 niza ljudskog imunoglobinskog embrionskog gena (Procena br. X59315, SEQ ID NO: 118). U još jednom specifičnom slučaju, FR4 teški lanac je kodiran JH6 nizom embrionskog gena (Pogledajte GenBank Accession br. M63030). U još jednom specifičnom slučaju, FR4 laki lanac je kodiran JK2 nizom embrionskog gena (Pogledajte GenBank Accession br. X61584). ;Uglavnom je poželjno da molekuli koji vezuju antigen, kao što su antitela i njihovi delovi, budu humanizovani uz zadržavanje visokog afiniteta prema antigenima i drugih povoljnih bioloških svojstava. U skladu sa tim, u jednom slučaju, humanizovana antitela pripremaju se analizom matičnih nizova i različito koncepiranih humanizovanih proizvoda korišćenjem modela u tri dimenzije za matične i humanizovane nizove. Trodimenzonalni imunoglobinski modeli često su dostupni i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Računarski programi dostupni su za ilustraciju i prikaz verovatnih trodimenzionalnih konformacionih struktura izabranih kandidatskih hemoglobinskih nizova. Analiza ovih prikaza pomaže u određivanju odgovarajuće uloge za ostatke u funkcionisanju kandidata za imunoglobinske nizove, npr, analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata za imunoglobin da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu se izabrati i kombinovati od primaoca i uvezenih nizova tako da željene karakteristike antitela, kao što je povećan afinitet za ciljani antigen(e) budu ostvarene. Uopšteno, hipervarijabilni regionalni ostaci su direktno i najneposrednije uključeni u vezivanje antigena. ;U jednom rešenju, otkriće je usmereno na humanizovane, afinitetno sazrele i/ili varijante anti-CEA molekule koji vezuju antigen sa željenim svojstvima i karakteristikama koje uključuju. ali nisu ograničene na: jak afinitet za vezivanje prema CEA antigenu--konkretno, CEA vezan za membranu--uz značajnu nepostojanje unakrsne reaktivnosti sa rastvorljivim CEA; od mogućnosti da izazovu lizu ćelija kod ćelija koje izražavaju CEA vitro i ex vivo, ako je moguće, na način koji je povezan sa dozom; sposobnost za inhibiciju adhezije posrednih CEA ćelija in vitro; sposobnost da spreče rast tkiva tumora i/ili izazovu regresiju tumora (na primer, kao što je prikazano na modelima tumora (npr, ksenograft miša)). ;Kao što je ovde opisano, u nekim slučajevima, varijanta molekula za vezivanje antigena povećala je afinitet za vezivanje, na primer, zbog sazrevanja afiniteta matičnog antitela koje se sastoji od jednog ili više CDR-a iz PR1A3 antitela. Afinitet za molekule za vezivanje antigena i varijante molekula za vezivanje antigena koji je ovde opisan može se odrediti metodama koje su poznate u struci i koje su opisane ovde. U određenom slučaju, humanizovani ili varijacioni molekuli za vezivanje antigena koji su ovde opisani vezuju se za ljudski CEA, ako je moguće, za CEA koji se vezuje za membranu, uz vrednost za monovalentnu konstantu za afinitet (KD) koja nije veća od 1 µM do otprilike 0,001 nM, posebno ne više od 800 nM do otprilike 1 nM, a čak konkretnije, ne više od 550 nM do otprilike 10 nM. U posebnim slučajevima, varijanta molekula za vezivanje antigena predstavljaantitelo sa zrelim afinitetom ili njegovi deo koji se vezuje na CEA vezan za membranu uz vrednost monovalentne konstante za afinitet od (KD) čija vrednost iznosi od 100 nM do otprilike 10 nM. U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena predstavlja antitelo sa zrelim afinitetom ili njegov deo koji se vezuje na CEA vezan za membranu uz vrednost monovalentne konstante za afinitet od (KD) čija vrednost iznosi od 100 nM do otprilike 0,01 nM. U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena predstavlja antitelo sa zrelim afinitetom ili njegovi deo koji se vezuje na CEA vezan za membranu uz vrednost monovalentne konstante za afinitet od (KD) čija vrednost iznosi od 10 nM do otprilike 0,1 nM. U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena predstavlja antitelo sa zrelim afinitetom ili njegovi deo koji se vezuje na CEA vezan za membranu uz vrednost monovalentne konstante za afinitet od (KD) čija vrednost iznosi 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,01 nM ili manje. U nekim slučajevima, varijanta molekula za vezivanje antigena je stabilno sazrelo (kreirana da ima povećanu stabilnost) antitelo ili njegov deo koji zadržava povećani afinitet za vezivanje svog matičnog afinitetski sazrelog prethodnika. U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena vezuje se na CEA vezan za membranu uz veći afinitet od običnog vezivanja na CEA. U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena vezuje se za CEA vezan za membranu uz 1,5 preklapanje, 2 preklapanja, 3 preklapanja, 4 preklapanja, 5 preklapanja, 10 preklapanja, 20 preklapanja, ili još veći afinitet nego prilikom vezivanja za običan CEA. ;U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena koja je opisana ovde obično vezuje iste epitope koje prepoznaje antitelo miša PR1A3, ili ima mogućnost nadmetanja sa antitelom PR1A za vezivanje na CEA koji se vezuje za membranu. Za pretragu antitela koja se vezuju na epitope na ljudskim CEA vezanim od strane antitela koje se posmatra (npr, ona koja blokiraju vezivanje PR1A3 antitela na ljudski CEA), može se obaviti rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je onaj opisan u priručniku ANTITELA, LABORATORIJSKI PRIRUČNIK, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow i Lane eds. (1988). Ili, mapiranje epitopa, npr. kao što je opisano u Champe i sar., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), može se obaviti da bi se odredilo da li se antitelo vezuje na epitope na koje je potrebno obaviti vezivanje. ;U jednom slučaju, varijante molekula koji vezuje antigen za ljudski CEA napravljeni su od matičnog anti-CEA molekula koji vezuje antigen i čine bar jedan CDR monoklonalnog antitela PR1A3, dok matično anti-CEA antitelo vezuje iste epitope kao i antitelo PR1A3 i može da se nadmeće sa PR1A3 u vezivanju antigena. U jednom slučaju, matični molekul za vezivanje antigena sastoji se od bar jednog, dva ili obično tri teška lanca CDR-ova za PR1A3 antitelo; u drugom slučaju, matični molekul za vezivanje antigena sastoji se od bar jednog, dva ili obično tri laka lanca CDR-ova za PR1A3 antitelo; u drugom slučaju, matični molekul za vezivanje antigena sastoji se od tri teška lanca CDR-ova i tri laka lanca CDR-ova za PR1A3 antitelo. Ako je moguće, kada varijanta molekula za vezivanje antigena uključi HCDR1 iz PR1A3, navedeni HCDR1 obavlja supstituciju glutamata za valin na Kabatovom položaju 31. Varijanta ABM-ova obično ima veći afinitet za CEA od matične. U jednom slučaju, varijanta ABMS ima povećanu stabilnost u poređenju sa matičnom. U jednom rešenju, varijanta ABM nalazi se u Fc oblasti. U jednom rešenju, varijanta ABM kreirana je na bazi glikola. U jednom slučaju, varijanta ABM ima povećanu ADCC aktivnost u poređenju sa matičnim ABM-om. U konkretnom slučaju, povećani ADCC je rezultat povećanog afiniteta, koji se ostvaruje, na primer, sazrevanjem afiniteta matičnog ABM-a za kreiranje varijante ABM-a. U češćem slučaju, povećanje ADCC je bar oko 40% do oko 100% u poređenju sa navedenim matičnim molekulom za vezivanje antigena. U drugom konkretnom slučaju, varijanta ABM povećava ADCC za bar otprilike 10% do 100% prilikom in vitro analize citotoksičnosti. U konkretnijem slučaju, varijanta ABM je bar od 10-puta do 1000-puta aktivnija u izazivanju ADCC pri datoj koncentraciji u poređenju sa antitelom miša PR1A3. U drugom konkretnom slučaju, povećana aktivnost ADCC rezultat je inženjerski kreiranog glikola u Fc oblasti. U drugom konkretnom slučaju, povećana aktivnost ADCC rezultat je kombinacije povećanog afiniteta i inženjerski kreiranog glikola. ;U jednom slučaju, varijanta molekula za vezivanje antigena koja je ovde opisana sastoji se od jedne ili više amino kiselinske supstitucije u bar jednom CDR-u. Broj supstitucija amino kiselina može da bude od jedan do deset (npr, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10), a poželjno je da bude od dva do pet (npr, 2, 3, 4 ili 5). U jednom slučaju, bar jedan težak lanac CDR-a kreira jednu ili više supstitucija amino kiselina. U drugom slučaju, bar jedan laki lanac CDR-a kreira jednu ili više supstitucija amino kiselina. U drugom slučaju, bar jedan težak lanac CDR kreira jednu ili više supstitucija i bar jedan laki lanac CDR kreira jednu ili više supstitucija. Ako je moguće, kada varijanta molekula za vezivanje antigena uključi HCDR1 iz PR1A3, navedeni HCDR1 obavlja supstituciju glutamata za valin na Kabatovom položaju 31. ;Značajne modifikacije bioloških svojstava molekula koji vezuje antigen ostvaruju se izborom supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom naporu za održavanje (a) strukture polipeptidne osnove u oblasti supstitucije, na primer, kao list ili spiralne konformacije, (b) napon ili hidrofobnost molekula na ciljanoj lokaciji ili (c) grupa na bočnom lancu. Varijanta molekula koji vezuje antigen i sastoji se od supstituisanih amino kiselina može da ima poboljšane biološke aktivnosti, na primer, poboljšani afinitet za vezivanje antigena i poboljšani ADCC, u poređenju sa matičnim molekulom za vezivanje antigena. Supstitucije amino kiselina mogu se obaviti pomoću različitih tehnika poznatih u struci, uključujući, bez ograničenja na, usmerenu mutagenezu na lokaciju i/ili sazrevanje afiniteta matičnog molekula za vezivanje antigena, npr. prikazom faga. ;Da bi se odredili kandidati za mesta, npr. ostaci hipervarijabilnog regiona, koji će se modifikovati, može da se izvrši alanin skenirajuća mutageneza, kako bi se identifikovali ostaci koji znatno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti od koristi da se analizira kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo, kako bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i ljudskog CEA. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci predstavljaju kandidate za supstituciju u skladu sa metodama poznatim i/ili opisanim ovde. Nakon kreiranja takvih varijanti, tabla varijanti može se skenirati metodama poznatim u struci i/ili ovde opisanim i antitela sa superiornijim svojstvima u jednoj ili više relevantnih analiza mogu se izabrati za dalji razvoj. ;Prikaz faga može se koristiti za kreiranje repertoara nizova hipervarijabilnih oblasti iz matičnog molekula za vezivanje antigena koji sadrži nasumičnu mutaciju(e) amino kiseline. Na primer, nekoliko mesta hipervarijabilnihregiona (npr. 6-7 mesta) je mutirano kako bi se dobile sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Ili, nasumična mutageneza može da se obavi u oblastima teških i/ili lakih varijabilnih lanaca. Mutacije se mogu izazvati tehnikama poznatim u struci, uključujući, ali bez ograničenja na prajmere za mutagenezu, kontrolisanje broja ciklusa i upotrebu mutagenih nukleotida analognih sa 8-oxo-dGTP i dPTP tokom povećanja PCR-a. Tako nastale varijante antitela na monovalentan način se izlažu na česticama sa filamentnim fagom kao fuzije sa gen III proizvodom M13 koji se nalazi u svakoj čestici. Varijante sa prikazanim fagama se zatim proveravaju za biološke aktivnosti (npr. afinitet za vezivanje) kao što je objašnjeno ovde i kandidati koji imaju jednu ili više poboljšanih aktivnosti biće korišćeni za dalji razvoj. Metode za kreiranje biblioteka za prikaz faga mogu se pronaći u Huse i sar., Science, 246:1275-1281 (1989); Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 88:4363-4366 (1991). Alternativna metoda za identifikaciju afiniteta sazrelih molekula za vezivanje antigena može se pronaći, na primer, u SAD Pat. br.7,432,063 do Balint i sar.. ;U nekim slučajevima, molekuli za vezivanje antigena i varijante molekula za vezivanje antigena koje su ovde opisane nalaze se u Fc oblasti, poželjno bi bilo u ljudskoj Fc oblasti. Nizovi i strukture Fc oblasti poznate su u struci i karakterizovane su. U određenom slučaju, konstantna ljudska oblast je IgG1, kao što je ranije navedeno u nizovima sa ID brojevima 121 i 122. ;Ipak, varijante i izoforme ljudske Fc oblasti takođe su obuhvaćene trenutnim otkrićima. Na primer, varijanta Fc oblasti pogodna za upotrebu u trenutnim otkrićima može se kreirati u skladu sa metodama navedenim u SAD Pat. br. 6,737,056 do Presta (varijante Fc oblasti sa izmenjenim funkcijama efektora zbog jedne ili više modifikacija amino kiselina); ili u SAD Pat. Apl. br. 60/439,498; 60/456,041; 60/514,549; ili WO 2004/063351 (varijanta Fc oblasti sa povećanim afinitetima za vezivanje zbog modifikacije amino kiseline); ili u SAD Pat. Apl. br. ;10/672,280 ili WO 2004/099249 (varijante Fc sa izmenjenim vezivanjem na FcγR zbog modifikacija amino kiseline). U konkretnom slučaju, anti-CEA ABM-ovi i varijante ABM-ova kreiraju Fc oblast koja je inženjerski kreirana na bazi glikola u cilju izmene funkcija aktivnosti efektora za ABM (npr, smanjenje fukosilacije, poboljšanje afiniteta za vezivanje Fc receptora, povećanje ADCC, itd.). Metode za inženjersko kreiranje na bazi glikola koje se mogu koristiti opisane su detaljno u nastavku i poznate su u struci. ;U jednom slučaju, molekul za vezivanje antigena ili varijanta molekula za vezivanje antigena koji su ovde opisani delimično se dodatno konjuguju, metodama kao što je radiološko označavanje ili toksin. Tako konjugovani molekuli za vezivanje antigena mogu se kreirati brojnim metodama koje su dobro poznate u struci. Anti-CEA ABM konjugati opisani su detaljno u nastavku u odeljku pod naslovom „Anti-CEA konjugati molekula za vezivanje antigena.“ ;Ekspresioni vektori i ćelije domaćini ;U jednom rešenju, trenutno otkriće je usmereno ka ekspresionom vektoru i/ili ćeliji domaćinu koja kreira jedan ili više izolovanih polinukleotida kao što je ovde opisano. Na primer, ćelija domaćina ili ekspresioni vektor čine bilo koju ili više polinukleotida ili polinukleotida koje kodiraju polipeptide, ABM-ove i/ili varijante ABM-ova opisane u nastavku. U drugom slučaju, trenutno otkriće je usmereno ka metodu za proizvodnju ABM-ova koji vezuju ljudske CEA vezane za membrane, sledećom metodom: uzgajanjem ćelije domaćina koja sadrži jedan ili više izolovanih polinukleotida kao što je opisano ovde ili ekspresionih vektora koji sadrže jedan ili više izolovanih polinukleotida kao što je opisano ovde u medijumu koji obezbeđuje uslove za ekspresiju navedenog jednog ili više polinukleotida, pri čemu on ili oni kodiraju jedan ili više polipeptida koji formiraju deo ABM-a, i vraćanje navedenog ABM-a, gde se navedeni ABM ili njegov deo vezuje za CEA vezan za membranu. ;Uopšteno, bilo koja vrsta kulturisane linije ćelija može se koristiti za izražavanje ovde opisanog ABM-a. U poželjnom rešenju, CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, ćelije SP2/0, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mijeloma miša, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, druge ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata ili biljaka se koriste kao pozadinska ćelijska linija za generisanje projektovanih ćelija domaćina koje su ovde opisane. ;U konkretnom slučaju, ćelije domaćini ili ekspresioni vektori sastoje se od jednog ili više polinukleotida koji kodira anti-CEA ABM-ove na ovde naveden način. U jednom slučaju, antitelo ima sazreli afinitet. Antitelo sa sazrelim afinitetom uopšteno ima poboljšani afinitet za vezivanje od referentnog antitela iz kog je antitelo sa sazrelim afinitetom poteklo. U drugm slučaju, antitelo ima poželjna terapijska svojstva uključujući, ali bez ograničenja na: jak afinitet za vezivanje za CEA antigen, konkretno, za CEA vezan za membranu, uz značajno odsustvo unakrsne reaktivnosti sa rastvorljivim CEA; sposobnost da se izvede ćelijska liza kod CEA-ekspresionih ćelija in vitro i ex-vivo, ako je moguće, na način koji zavisi od doze; sposobnost da se inhibira sposobnost za inhibiciju adhezije posrednih CEA ćelija in vitro; sposobnost da spreče rast tkiva tumora i/ili izazovu regresiju tumora kod modela tumora kod miševa (npr, ksenograft miša).. U drugom slučaju, antitelo ima povećanu stabilnost u poređenju sa matičnim antitelom iz kog se dobija stabilnije antitelo. U drugom slučaju, varijanta antitela ili njegov deo čine ljudski Fc. ;U jednom slučaju, jedan ili nekoliko polinukleotida koji kodiraju ABM na ovde opisan način mogu se izraziti pod kontrolom konstitutivnog promotera ili, alternativno, regulisanog ekspresionog sistema. Pogodni regulisani ekspresioni sistemi sadrže, bez ograničenja na, tetraciklinski regulisan ekspresioni sistem, ekdisonski pokretljiv ekspresioni sistem, lacpokretljivi ekspresioni sistem, glukokortikoidno pokretljivi ekspresioni sistem, temperaturno pokretljivi promotorni sistem i metalotioneinski metalno pokretljivi ekspresioni sistem. U nekoliko različitih kodiranja nukleinske kiseline ABM koji je ovde opisan čini deo sistema ćelija domaćina, neke od njih mogu biti prikazane pod kontrolom konstitutivnog promotera, dok su ostale izražene pod kontrolom regulatornog promotera. Kao maksimalni nivo ekspresije smatra se najveći mogugući nivo stabilne polipeptidne ekspresije koji nema značajan štetni uticaj na rast ćelija, i biće određen rutinskim eksperimentom. Nivoi ekspresije određeni su metodama koje su opšte poznate u struci, uključujući „Western“ analizu pomoću mrlje koristeći određeno antitelo za ABM ili antitelo određeno za peptidnu oznaku u sklopu sa ABM i „Northern“ analize mrlje. Kao dalja alternativa, polinukleotid može biti operativno povezan sa reporterskim genom, nivoi ekspresije za ABM otkriveni ovde određuju se merenjem korelacionog signala sa nivoom ekspresije reporterskog gena. Reporterski gen može biti transkribovan zajedno sa nukleinskom kiselinom(ama) za kodiranje ABM-a kao jednog mRNA molekula, njihove odgovarajuće sekvence za kodiranje mogu biti povezane internom lokacijom za unos ribozoma (IRES) ili pojačivačem prenosa bez poklopca (CITE). Reporterski gen može biti prenet uz bar jednu nukleinsku kiselinu za kodiranje ABM-a otkrivenu ovde, tako da se kreira jedan polipeptidni lanac. Nukleinske kiseline kodiraju ABM kao što je opisano i mogu se operativno povezati sa reporterskim genom pod kontrolom jednog promotera, tako da kodiranje nukleinske kiseline za ABM i za gen reportera bude prenešeno u RNK molekul koji je alternativno podeljen na dva odvojena molekula prenosnika poruka RNK (mRNK); jedan od dobijenih mRNK prevodi se u navedeni reporterski protein, a drugi se prevodi u ABM. ;Metode koje su poznate stručnim osobama u oblasti mogu se upotrebiti za kreiranje ekspresionih vektora koji sadrže nizove za kodiranje za anti-CEA ABM-ove date su ovde uz odgovarajuće transkripcione/translacione kontrolne signale. Ovi metodi uključuju in vitro rekombinacione DNK tehnike, tehnike za sintezu i in vivo rekombinaciju/genetičku rekombinaciju. Pogledajte na primer, tehnike opisane u Maniatis i sar., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) i Ausubel i sar., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates i Wiley Interscience, N.Y (1989). ;Veliki broj domaćina-ekspresionih vektorskih sistema može da bude upotrebljen za ekspresiju niza kodiranja ABM-ova koji su ovde opisani. Poželjno je koristiti ćelije sisara kao sisteme ćelija domaćina prenešenih uz rekombinantni plazmidni DNK ili kozmidni DNK ekspresioni vektori koji sadrže niz za kodiranje proteina koji su u sferi interesovanja i niz za kodiranje fuzionih polipeptida. Najpoželjnije su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mijeloma miša, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili hibridoma ćelije, ćelije drugih sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata ili ćelije biljaka za upotrebu kao ćelije domaćini u sistemu. Neki primeri ekspresionih sistema i metoda za izbor opisani su u sledećim referencama i referencama navedenim u njima: Borth i sar., Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), u Werner i sar., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), u Andersen i Krummen, Curr. Op. Biotechnol.13:117-123 (2002), u Chadd i Chamow, Curr. Op. Biotechnol. ;12:188-194 (2001), i u Giddings, Curr. Op. Biotechnol.12: 450-454 (2001). ;U alternativnim slučajevima, mogu se koristiti drugi eukariotski ćelisjki sistemi kao domaćini, uključujući ćelije kvasca transformisane rekombinacionim ekspresionim vektorima za kvasac koji sadrži nizove za kodiranje ABM-a kao što je ovde opisano, kao ekspresioni sistemi navedeni u SAD Pat. Apl. br.60/344,169 i WO 03/056914 (metode za proizvodnju glikoproteina sličnog ljudskom u eukariotskim ćelijama koje nisu ljudskog porekla); ćelijski sistemi insekata zaraženi rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr, bakulovirus) sadrže nizove za kodiranje za anti-CEA; biljni ćelijski sistemi zaraženi rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr, karfiolski mozaični virus, CaMV; duvanski mozaički virus, TMV) ili transformisani sa rekombinantnim plazmidnim ekspresionim vektorima (npr, Ti plasmid) sadrže niz za kodiranje ABM-a koji je ovde opisan i uključuje, ali nije ograničen na, ekspresione sisteme navedene u SAD Pat. br. 6,815,184 (metode za ekspresiju i sekreciju biološki aktivnih polipeptida iz genetski modifikovane sočivice); WO 2004/057002 (proizvodnja glikoksiliranih proteina u briofitnim ćelijama biljaka uvodom glikozilnog transferzalnog gena) i WO 2004/024927 (metode za kreiranje ekstracelulanog heterolognog proteina koji nije biljnog porekla u protoplazmi mahovine); i SAD Pat. Apl. br. 60/365,769, 60/368,047 i WO 2003/078614 (obrada glikoproteina u transrodnim biljkama uvodom funkcionalnog enzima sisara GnTIII); ili ćelijski sistem životinje inficiran rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr, adenovirus, vacinija virus) uključujući i ćelijske linije kreirane da zadrže višestruke primerke DNK kodiranja himeričnog anti-CEA ABM bilo da je stabilno pojačan (CHO/dhfr) ili nestabilno pojačan u duplo-minutnim hromozomima (npr, ćelijske linije miša). U jednom slučaju, vektor koji sadrži kodiranje za polinukleotid(e) za ABM koji je ovde opisan je policistronični. Takođe, u jednom slučaju za ABM koji je naveden ranije, on predstavlja antitelo ili njegov deo. U jednom slučaju, ABM predstavlja antitelo sa sazrelim afinitetima. U jednom slučaju, ABM predstavlja stabilno sazrelo antitelo. ;Stabilna ekspresija je uglavnom poželjnija za prelaznu ekspresiju jer se obično ostvaruje više reproduktivnih rezultata i takođe je primenljivija na proizvodnju većeg opsega, ipak, u okvir veštine u struci spada određivanje da li je prelazna ekspresija pogodna za upotrebu u datoj situaciji. Umesto korišćenja ekspresionih vektora koji sadrže viralna porekla replikacije, ćelije domaćini mogu se transformisati uz odgovarajuće kodiranje nukleinskih kiselina kontrolisano od strane odgovarajućih kontrolnih elemenata (npr, promoter, pojačivač, nizovi, terminatori prenosa, poliadenilacione lokacije, itd.), i izborna oznaka. Prateći uputstva za inženjering stranih DNK ćelija, može se dozvoliti rast do 1-2 dana u obogaćenom mediju, a zatim se obavlja prenos u selektivni medij. Izborna oznaka u rekombinantnom plazmidu daje otpor selekciji i dozvoljava selekciju ćelija koje imaju stabilan integrisani plazmid u svoje hromozome i rastu do formiranja žiža koje mogu da se kloniraju i ubace u ćelijske linije. ;Može da se upotrebi veći broj selekcionih sistema, uključujući, bez ograničenja na, herpes simplex virus timidin kinaze (Wigler i sar., Cell 11:223 (1977)), hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaza (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), i adenin fosforiboziltransferaza (Lowy i sar., Cell 22:817 (1980)) geni, koji mogu biti aktivirani u tk-, hgprt<->ili aprt<->ćelijama, po potrebi. Takođe, antimetabolitna rezistentnost može se koristiti kao osnova za izbor za dhfr, koji pomaže stvaranje otpornosti na metotreksate (Wigler i sar., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, koji pomaže razvoj otpornosti na mikofenolnu kiselinu (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, koji pomaže stvaranje otpornosti na aminoglikozid G-418 (Colberre-Garapin i sar., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); i higro, koji daje otpornost na gene hidromicina (Santerre i sar., Gene 30:147 (1984). Nedavno su opisani dodatni selektivni geni, naime trpB, koji omogućava ćelijama da koriste indol umesto triptofana; hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol umesto histidina (Hartman i Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85:8047 (1988)); sistem glutamin sintaza; i ODC (ornitin dekarboksilaza) koja daje otpor prema inhibitoru ornitin dekarboksilaze, 2-(difluorometil)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue, u: Aktuelne komunikacije u molekularnoj biologiji, Laboratorija „Cold Spring Harbour“ (1987)). ;Ovo objašnjenje dalje upućuje na postupak za modifikovanje profila glikozilacije ovde opisanih ABM-ova koje proizvodi ćelija domaćina, koji obuhvataju ekspresiju nukleinske kiseline u pomenutoj ćeliji domaćinu koja kodira ABM kao što je ovde opisano i nukleinska kiselina koja kodira polipeptid sa aktivnoću glikoziltransferaze, ili vektor koji sadrži takve nukleinske kiseline. Geni sa glikoziltransferaznom aktivnošću uključuju β(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferazu III (GnTII), α-manozidazu II (ManII), β(1,4)-galaktoziltransferazu (GalT), β(1,2)-N-acetilglukozaminiltransferazu I (GnTI), i β(1,2)-N-acetilglucozaminiltransferazu II (GnTII). U jednom rešenju, kombinacija gena sa aktivnošću glikoziltransferaze izražava se u ćeliji domaćinu (npr. GnTIII i Man II). Isto tako, postupak obuhvata i ekspresiju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju ABM u ćeliji domaćinu u kojoj je gen glikoziltransferaze poremećen ili deaktiviran na neki drugi način (npr. ćelija domaćina u kojoj je aktivnost gena koja kodira α1-6 jezgra fukoziltransferaze izbačena). U drugom rešenju ABM-ovi opisani ovde mogu biti proizvedeni u ćeliji domaćinu koja dalje izražava polinukleotid koji kodira polipeptid sa GnTIII aktivnoću da bi modifikovao oblik glikozilacije. U specifičnom rešenju, polipeptid koji ima GnTIII aktivnost je fuzioni polipeptid koji sadrži Golgiov lokalizacijski domen rezidualnog polipeptida Golgi. U drugom poželjnom rešenju, ekspresija ABM-ova opisanih ovde u ćeliji domaćinu koja izražava polinukleotid koji kodira polipeptid sa GnTIII aktivnošći rezultira u ABM-ovima sa povećanim afinitetom vezivanja Fc receptora i povećanom efektorskom funkcijom. Shodno tome, u jednom rešenju, ovo otkriće je usmereno na ćeliju domaćinu koja sadrži (a) izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu za kodiranje polipeptida sa GnTIII aktivnošću; i (b) izolovani polinukleotid koji kodira ABM kao što je ovde opisano, kao što je himerno, primatizovano ili humanizovano antitelo koje vezuje humanu CEA. U poželjnom rešenju, polipeptid koji ima GnTIII aktivnost je fuzioni polipeptid koji sadrži katalitički domen GnTIII, a domen lokalizacije Golgi je domen lokalizacije manozidaze II. Metode za stvaranje takvih fuzionih polipeptida i njihovo korišćenje za stvaranje antitela sa povećanim efektorskim funkcijama su opisane u privremenom SAD pat. Apl. br. 60/495,142 i SAD Pat. Appl. Publ. br. 2004/0241817. U određenom rešenju, modifikovani ABM koji proizvodi ćelija domaćin ima IgG konstantni region ili njegov fragment koji sadrži Fc region. U drugom određenom rešenju, ABM je humanizovano antitelo ili njegov fragment koji sadrži Fc region. ;ABM-i opisani ovde sa izmenjenim glikozilacijom koje proizvodi ćelija domaćin obično pokazuju povećan afinitet vezivanja Fc receptora i/ili povećanu efektorsku funkciju kao rezultat modifikacije ćelije domaćina (npr.izražavanjem glikoziltransferaznog gena). Poželjno je da je povećani afinitet vezivanja za Fc receptor povećan vezujući se za receptor za aktiviranje Fcγ, kao što je receptor FcγRIIIa. Povećana efektorska funkcija je poželjno povećanje jednog ili više od sledećih: povećana ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, povećana ćelijska fagocitoza (ADCP) zavisna od antitela, povećana sekrecija citokina, povećano uzimanje antigena uz posredovanje imunog kompleksa od strane ćelija koje predstavljaju antigen, povećana ćelijska citotoksičnost posredovana FC-om, povećano vezivanje za NK ćelije, povećano vezivanje za makrofage, povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije (PMN-e), povećano vezivanje za monocite, povećano ukrštanje antitela vezana za cilj, povećana direktna signalizacija koja indukuje apoptozu, povećano sazrevanje dendritičnih ćelija i povećano aktiviranje T ćelija. ;Generisanje i upotreba ABM-ova koji imaju povećanu efektorsku funkciju, uključujući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela ;U jednom rešenju, sadašnje otkriće obezbeđuje glikoforme anti-CEA ABM-ova (npr. ;varijantne ABM-ova) koje imaju povećanu efektorsku funkciju, uključujući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela. Prethodno je opisan inženjering antitela glikozilacije. Pogledajte, npr. SAD patent br. 6.602.684. Takođe su detaljno opisane metode izrade ABM-ova iz ćelija domaćina koje su promenile aktivnost gena uključenih u glikozilaciju (pogledajte, npr. prethodni odeljak pod naslovom „Vektori ekspresije i ćelije domaćina“). Povećanja ADCC-a ABM-ova opisanih ovde se takođe postižu povećanjem afiniteta molekula koji vezuje antigen za CEA vezan za membranu, na primer afinitetom sazrevanja ili drugim metodama poboljšanja afiniteta (pogledajte Tang i sar., J. Imunol. 2007, 179:2815-2823). Kombinacije ovih pristupa takođe su obuhvaćene ovim otkrićem. ;Klinička ispitivanja nekonjugovanih monoklonskih antitela (mAb) za lečenje nekih vrsta karcinoma nedavno su dala ohrabrujuće rezultate. Dillman, Cancer Biother. i Radiopharm. ;12:223-25 (1997); Deo i sar., Imunologija danas 18:127 (1997). Himerni, nekonjugovani IgG1 je odobren za limfom niskog stepena ili folikularni B-ćelijski ne-Hodžkinsov limfom. Dillman, Cancer Biother. i Radiopharm. 12:223-25 (1997), dok je još jedan nekonjugovani mAb, humanizovani IgG1 cilja na čvrste tumore na grudima, takođe je pokazao obećavajuće rezultate u kliničkim studijama III faze. Deo i sar., Imunologija danas 18:127 (1997). Antigeni ova dva mAb-a su visoko izraženi u svojim odgovarajućim tumorskim ćelijama i antitela posreduju jako uništavanje tumora efektornim ćelijama in vitro i in vivo. Nasuprot tome, mnogi drugi nekonjugovani mAb-i sa finim tumorskim specifičnostima ne mogu izazvati efektorske funkcije dovoljne potencije da budu klinički korisne. Frost i sar., Rak 80:317-33 (1997); Surfus i sar, J. Imunoter. 19:184-91 (1996). Za neke od ovih slabijih mAb-ova, trenutno se testira dodatna terapija citokinom. Dodavanje citokina može stimulisati ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) povećanjem aktivnosti i broja cirkulirajućih limfocita. Frost i sar., Rak 80:317-33 (1997); Surfus i sar., J. Imunoter. 19:184-91 (1996). ADCC, ili litički napad na ciljane ćelije, se aktivira nakon vezivanja receptora leukocita u konstantnom regionu (Fc) antitela. Deo i sar., Immunology Today 18:127 (1997). ;Različit, ali komplementaran pristup za povećanje ADCC aktivnosti nekonjugovanih IgG1-ova je da se dizajnira Fc region antitela. Studije proteinskih inžinjeringa su pokazale da FcγRs komunicira sa donjim zglobnim područjem IgG CH2 domena. Lund i sar., J. Imunol. ;157:4963-69 (1996). Međutim, FcγR vezivanje takođe zahteva prisustvo oligosaharida kovalentno vezanih na konzerviranom Asn 297 u regionu CH2. Lund i sar., J. Imunol.157:496369 (1996); Wright i Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), sugerišući da i oligosaharid i polipeptid direktno doprinose mestu interakcije ili da je oligosaharid potreban da održi aktivnu konformaciju CH2 polipeptida. Stoga se modifikovanje strukture oligosaharida može istražiti kao sredstvo za povećanje afiniteta interakcije. ;Molekula IgG nosi dva N-povezana oligosaharida u svom Fc regionu, po jedan na svakom teškom lancu. Kao i svaki glikoprotein, antitelo se proizvodi kao populacija glikoformi koji dele istu polipeptidnu kičmu, ali imaju različite oligosaharide povezane sa mestima glikozilacije. Oligosaharidi koji se obično nalaze u Fc regionu serumskog IgG-a su složenog biantenog tipa (Wormald i sar., Biohemija 36:130-38 (1997), sa niskim nivoom terminalne sijalične kiseline i bisekcijom N-acetilglukozamina (GlcNAc), i varijabilnim stepenom terminalne galaktozilacije i fukozilacije jezgra. Neke studije sugerišu da minimalna struktura ugljenih hidrata koja je potrebna za vezivanje FcγR leži u jezgru oligosaharida. Lund i sar., J. Imunol. 157:4963-69 (1996) ;Ćelijske linije izvedene iz miša ili hrčaka koje se koriste u industriji i akademiji za proizvodnju nekonjugovanih terapeutskih mAb-ova obično pripisuju potrebne determinante oligosaharida na Fc lokacije. Izraženim IgG-ima u ovim ćelijskim linijama nedostaju ukrštajući G1cNAc koji se mogu naći u malim količinama u serumu IgG-ova. Lifely i sar., Glikobiologija 318:813-22 (1995). Nasuprot tome, nedavno je primećeno da humanizovani IgG1 (CAMPATH-1H), proizveden iz mieloma pacova, nosi ukrštajući G1cNAc u nekim od svojih glikoformama. Lifely i sar., Glycobiology 318:813-22 (1995). Antitelo izvedeno iz ćelija pacova dostiglo je sličnu maksimalnu in vitro ADCC aktivnost kao CAMPATH-1H antitela proizvedena u standardnim ćelijskim linijama, ali pri značajno nižim koncentracijama antitela. ;CAMPATH antigen je obično prisutan na visokim nivoima na ćelijama limfoma, a ovaj himerni mAb ima visoku ADCC aktivnost u odsustvu ukrštajućeg GlcNAc. Lifely i sar., Glycobiology 318:813-22 (1995). Na N-povezanom putu glikozilacije, GnTIII dodaje ukrštajući GlcNAc. Schachter, Biochem. Cell Biol.64:163-81 (1986). ;Prethodne studije su koristile jedinstvenu CHO ćelijsku liniju za proizvodnju antitela koja je prethodno bila projektovana tako da na spoljašnjem nivou izražava različite nivoe kloniranog genskog enzima GnTIII (Umaña, P., i sar., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Ovaj pristup prvi put je uspostavio rigoroznu korelaciju između ekspresije glikoziltransferaze (npr. GnTIII) i ADCC aktivnosti modifikovanog antitela. Prema tome, otkriće obuhvata varijantu ABM-a (npr. ;ABM zrelog afiniteta) koja se vezuje sa CEA vezanom za membranu, sadrži Fc region ili region ekvivalentan Fc regionu koji je izmenio glikozilaciju nastalu promenom nivoa ekspresije glikoziltransferaznog gena u ćeliji domaćinu koja proizvodi ABM. U specifičnom rešenju, promena nivoa ekspresije gena je povećanje aktivnosti GnTIII. Povećana aktivnost GnTIII rezultira povećanjem procenta ukrštajućih oligosaharida, kao i smanjenjem procenta ostataka fukoze u Fc regionu ABM-a. Ovo antitelo ili njegov fragment povećavaju afinitet vezivanja Fc receptora i povećavaju efektorsku funkciju ;Sadašnje otkriće takođe je usmereno na postupak proizvodnje anti-CEA ABM-a kao što je ovde opisano sa modifikovanim oligosaharidima, koji obuhvata (a) kultivaciju ćelije domaćina sagrađenu da eksprimira najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji ima aktivnost glikoziltransferaze pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju ABM-a kao što je ovde opisano, pri čemu se navedeni polipeptid koji ima aktivnost glikoziltransferaze iskazuje u količini koja je dovoljna da modifikuje oligosaharide u Fc regionu navedenog ABM-a proizvedenog od strane pomenute ćelije domaćina; i (b) izolovanje navedenog ABM-a. U jednom rešenju, polipeptid koji ima aktivnost glikoziltransferaze je GnTIII. U još jednom rešenju, postoje dva polipeptida koji imaju aktivnost glikoziltransferaze. U posebnom rešenju, dva peptida koja imaju aktivnost glikoziltransferaze su GnTIII i Manll. U drugom rešenju, polipeptid koji ima glikoziltransferaznu aktivnost je fuzioni polipeptid koji sadrži katalitički domen GnTIII. U specifičnijem rešenju, fuzijski polipeptid dalje sadrži Golgijev lokalizacijski domen rezidualnog polipeptida Golgi. Poželjno, domen lokalizacije Golgi je domen lokalizacije manozidaze II ili GnTI. Alternativno, domen lokalizacije Golgi je izabran iz grupe koju čine: domen lokalizacije manozidaze I, domen lokalizacije GnTII i domen lokalizacije α fukoziltransferaze sa 1-6 jezgara. ABM-i proizvedeni metodima opisanim ovde imaju povećan afinitet vezivanja Fc receptora i/ili povećanu efektorsku funkciju. Generalno, povećana efektorska funkcija je jedno ili više od sledećih: povećana ćelijska Fc posredovana citotoksičnost (uključujući povećanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela), povećana ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), povećana sekrecija citokina, povećano uzimanje imunokompleksno-posredovanog antigena od strane ćelija koje predstavljaju antigen, povećanje vezivanja za NK ćelije, povećano vezivanje za makrofage, povećano vezivanje za monocite, povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, povećana direktna signalizacija koja indukuje apoptozu, povećano ukrštanje antitela vezanih za cilj, povećano sazrevanje dendritičnih ćelija ili povećano aktiviranje T ćelija. Povećani afinitet vezivanja za Fc receptor je poželjno povećanje vezivanja za Fc aktivirajuće receptore kao što je FcγRIIIa. U posebno poželjnom rešenju ABM je humanizovano antitelo ili njegov fragment. ;U jednom rešenju, procenat ukrštajućih N-povezanih oligosaharida u Fc regionu ABM-a je najmanje oko 10% do oko 100%, tačnije najmanje oko 50%, konkretno najmanje oko 60%, najmanje oko 70 %, najmanje oko 80% ili bar oko 90-95% ukupnih oligosaharida. U još jednom rešenju, molekul koji vezuje antigen ili varijanta molekula koji vezuje antigen proizvedena metodima opisanim ovde, ima povećan procenat nefukozilovanih oligosaharida u Fc regionu kao rezultat modifikacije njegovih oligosaharida metodima opisanim ovde. U jednom rešenju, procenat nefukozilovanih oligosaharida je najmanje oko 20% do oko 100%, tačnije najmanje oko 50%, najmanje oko 60% do oko 70%, a konkretnije, najmanje oko 75%. Nefukozilovani oligosaharidi mogu biti hibridni ili složeni. U još jednom rešenju, molekul koji vezuje antigen ili varijanta molekula koji vezuje antigen proizvedena metodima opisanim ovde, ima povećan procenat ukrštajućih oligosaharida u Fc regionu kao rezultat modifikacije njegovih oligosaharida metodima opisanim ovde. U jednom rešenju, procenat ukrštajućih oligosaharida je najmanje oko 20% do oko 100%, tačnije najmanje oko 50%, najmanje oko 60% do oko 70%, a konkretnije, najmanje oko 75%. U posebno poželjnom rešenju, ABM proizveden od strane ćelija domaćina i postupaka opisanih ovde ima povećan procenat ukrštajućih, nefukozilovanih oligosaharida u Fc regionu. Ukrštajući, nefukozilovani oligosaharidi mogu biti hibridni ili kompleksni. Konkretno, ovde opisani postupci mogu da se koriste za stvaranje molekula koji povezuju antigen u kojima najmanje oko 10% do oko 100%, tačnije najmanje oko 15%, konkretno najmanje oko 20% do oko 50%, bar oko 20% do oko 25%, najmanje oko 30% do oko 35% oligosaharida u Fc regionu molekula koji vezuju antigen ili varijanta molekula koji vezuje antigen su ukršteni, nefukozilovani. ABM-ovi opisani ovde takođe mogu da sadrže Fc region u kojem je najmanje oko 10% do oko 100%, tačnije najmanje oko 5%, bar oko 20% do oko 25%, bar oko 30% do oko 35% oligosaharida u Fc regionu ABM-a ukrštajući nefukozilovani hibrid. ;U još jednom rešenju, prikazano otkriće je usmereno na anti-CEA molekul koji vezuje antigen (na primer, ABM varijanta)) konstruisan tako da ima povećanu efektorsku funkciju i/ili povećan afinitet vezivanja Fc receptora, proizveden metodama opisanim ovde. Povećana efektorska funkcija može da uključuje, ali nije ograničena na jedno ili više od sledećih: povećana ćelijska Fc posredovana citotoksičnost (uključujući povećanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela), povećana ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), povećana sekrecija citokina, povećano uzimanje imuno-kompleksno-posredovanog antigena od strane ćelija koje predstavljaju antigen, povećanje vezivanja za NK ćelije, povećano vezivanje za makrofage, povećano vezivanje za monocite, povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, povećana direktna signalizacija koja indukuje apoptozu, povećano ukrštanje antitela vezanih za cilj, povećano sazrevanje dendritičnih ćelija ili povećano aktiviranje T ćelija. U poželjnom rešenju, povećani afinitet vezivanja za Fc receptor je povećano vezivanje za Fc receptor za aktivaciju, najpoželjnije FcgRIIIa. U jednom rešenju, molekul koji vezuje antigen ili varijanta molekula koji vezuje antigen je antitelo, fragment antitela koji sadrži Fc region ili fuzioni protein koji uključuje region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina. U posebno poželjnom rešenju, molekul koji vezuje antigen ili varijantna molekula koja vezuje antigen je humanizovano antitelo zrelog afiniteta. ;Sadašnje otkriće dalje daje metode za proizvodnju i upotrebu sistema ćelija domaćina za proizvodnju glikoproizvoda ABM-ova koji su ovde opisani, sa povećanim afinitetom vezivanja Fc receptora, poželjno povećanim vezivanjem za Fc aktivirajuće receptore i/ili sa povećanim efektorskim funkcijama, uključujući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela. Metodologija gliko-inženjeringa koja može da se koristi sa ABM-om opisanim ovde opisana je detaljnije u SAD pat. br. 6.602.684, SAD pat. Apl. Publ. br. 2004/0241817 A1, SAD pat. Apl. Publ. br. ;2003/0175884 A1, privremena američka patentna prijava br. 60/441.307 i WO 2004/065540. ABM-ovi opisani u ovom tekstu mogu alternativno biti glikosintetisani da imaju smanjene ostatke fukoze u Fc regionu prema tehnikama koje su otkrivene u SAD patentu br. Apl. Pub. br. ;2003/0157108 („Genentech“), ili u EP 1176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 i SAD pat. Apl. Pub. br. 2003/0115614,2004/093621,2004/110282,2004/110704,2004/132140 („Kyowa“). ABM proizvedeni gliko-inženjeringom, kao što je ovde opisano, takođe mogu da se proizvedu ekspresionim sistemima koji proizvode modifikovane glikoproteine, kao oni koji su opisani u SAD pat. Apl. Pub. br. 60/344.169 i WO 03/056914 („GlycoFi, Inc.“) ili u WO 2004/057002 i WO 2004/024927 („Greenovation“). ;Generisanje ćelijskih linija za proizvodnju proteina sa promenjenim uzorkom glikozilacije ;U jednom rešenju, ovo otkriće obezbeđuje sisteme ekspresije ćelija domaćina za generisanje ABM-ova koji su ovde opisani sa modifikovanim uzorcima glikozilacije. Posebno, sadašnje otkriće obezbeđuje sisteme ćelija domaćina za generisanje glikoformi ABM-ova koji su ovde opisani sa poboljšanom terapeutskom vrednošću. Prema tome, otkriće obezbeđuje sisteme ekspresije ćelija domaćina koje su izabrane ili proizvedene da eksprimiraju polipeptid koji ima aktivnost glikoziltransferaze. U specifičnom rešenju, aktivnost glikoziltransferaze je GnTIII aktivnost. U jednom rešenju, polipeptid koji ima GnTIII aktivnost je fuzioni polipeptid koji sadrži domen lokalizacije heterolognog Golgi rezidentnog polipeptida. Konkretno, takvi sistemi ekspresije ćelija domaćina mogu biti proizvedeni da sadrže molekul rekombinantne nukleinske kiseline koji kodira polipeptid sa GnTIII, operativno vezan za konstitutivni ili regulisani promotorski sistem. ;U jednom specifičnom rešenju, ovo otkriće obezbeđuje ćeliji domaćini koja je proizvedena da eksprimira najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni polipeptid sa GnTIII aktivnošću i koja sadrži Golgijev domen lokalizacije heterolognog Golgi rezidentnog polipeptida. U jednom rešenju, ćelija domaćina je proizvedena sa molekulom nukleinske kiseline koji sadrži barem jedan gen koji kodira fuzioni polipeptid sa GnTIII aktivnošću i sadrži Golgijev domen lokalizacije heterolognog Golgi rezidentnog polipeptida. ;Generalno, svaka vrsta kultivisane ćelijske linije, uključujući i linije ćelija opisane gore, može da se koristi kao pozadina za proizvodnju linija ćelija domaćina koje su ovde opisane. U poželjnom rešenju, CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, ćelije SP2/0, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mijeloma miša, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, druge ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata ili biljaka se koriste kao pozadinska ćelijska linija za generisanje projektovanih ćelija domaćina koje su ovde opisane. ;Otkriće je posmatrano duže vreme da bi obuhvatilo bilo koje proizvedene ćelije domaćine koje eksprimiraju polipeptid sa aktivnošću glikoziltransferaze, npr. GnTIII aktivnost, uključujući fuzioni polipeptid koji obuhvata Golgijev domen lokalizacije heterolognog Golgi rezidentnog polipeptida, kao što je ovde definisano. ;Jedna ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptid sa aktivnošću glikoziltransferaze, npr. GnTIII aktivnost se mogu izraziti pod kontrolom konstitutivnog promotera ili alternativno, regulisanim sistemom ekspresije. Ovakvi sistemi su dobro poznati u struci i uključuju sisteme o kojima je diskutovano u prethodnom tekstu. Ako nekoliko različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju fuzione polipeptide sa aktivnošću glikoziltransferaze, npr. GnTIII aktivnost, i koje obuhvataju Golgijev domen lokalizacije heterolognog Golgi rezidentnog polipeptida, sastoje se unutar sistema ćelija domaćina, neki od njih se mogu izraziti pod kontrolom konstitutivnog promotera, dok su drugi izraženi pod kontrolom regulisanog promotera. Nivo ekspresije fuzionih polipeptida koji imaju aktivnost glikoziltransferaze, npr. GnTIII aktivnost, određuju se postupcima koji su opšte poznati u struci, uključujući „Western blot“ analizu, „Northern Blot“ analizu, analizu ekspresije reporter gena ili merenje aktivnosti glikoziltransferaze, npr. GnTIII aktivnost. Alternativno, može se koristiti lektin koji se vezuje za biosintetičke GnTIII proizvode, na primer, E4-PHA lektin. Alternativno, može se koristiti funkcionalni test koji meri povećano vezivanje Fc receptora ili povećanu efektorsku funkciju posredovano antitelima proizvedenim od strane ćelija napravljenih nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid sa aktivnošću glikoziltransferaze, npr. GnTIII aktivnost. ;Identifikacija transfektanata ili transformatora koji eksprimiraju protein koji ima modifikovan oblik glikozilacije ;Ćelije domaćini koje sadrže kodirajuću sekvencu varijante anti-CEA ABM-a (npr. humanizovani, zreli afinitet i/ili ABM sa zrelom stabilnošću) i koje izražavaju biološki aktivne proizvode gena mogu da se identifikuju sa najmanje četiri opštih pristupa; (a) DNK-DNK ili DNK-RNK; (b) prisustvo ili odsustvo „marker“ funkcija gena; (c) procenjivanje nivoa transkripcije mereno ekspresijom odgovarajućih transkripta mRNK u ćeliji domaćinu; i (d) otkrivanje proizvoda gena mereno imunološkim testom ili njegovom biološkom aktivnošću. ;U prvom pristupu, prisustvo kodirajuće sekvence varijante anti-CEA i/ili kodirajuće sekvence polipeptida koji ima aktivnost glikoziltransferaze (npr. GnTIII) može se detektovati pomoću DNK-DNK ili DNK-RNK hibridizacije korišćenjem sondi koji sadrže nukleotidne sekvence koje su homologne odgovarajućim kodnim sekvencama, delovima ili njihovih derivata. ;U drugom pristupu rekombinantni ekspresioni vektor/sistem domaćina može da se identifikuje i odabere na osnovu prisustva ili odsustva određenih funkcija genskih markera (npr. aktivnost timidin kinaze, otpornost na antibiotike, otpornost na metotreksat, fenotip transformacije, formiranje okluzijskog tela u bakulovirusu itd.). Na primer, ako je sekvenca kodiranja ABM-a, koja je opisana ovde, ili njegov fragment i/ili kodirajuća sekvenca polipeptida koji ima aktivnost glikoziltransferaze (npr. GnTIII) umetnuti unutar markerske genske sekvence vektora, rekombinanti koji sadrže odgovarajuće kodirajuće sekvence mogu biti identifikovane odsustvom funkcije markerskog gena. Alternativno, markerski gen može da se postavi u tandem sa kodirajućim sekvencama pod kontrolom istog ili različitog promotera koji se koristi za kontrolu ekspresije kodirajućih sekvenci. Izražavanje markera u odgovoru na indukciju ili selekciju označava ekspresiju kodirajuće sekvence ABM-a i/ili kodirajuće sekvence polipeptida koji ima aktivnost glikoziltransferaze (npr. GnTIII). ;U trećem pristupu, transkripciona aktivnost za region kodiranja ABM-a opisanog ovde, ili njegov fragment i/ili kodirajuća sekvenca polipeptida koji ima aktivnost glikoziltransferaze (npr. GnTIII), može da se proceni pomoću hibridizacionih analiza. Na primer, RNK se može izolovati i analizirati pomoću „Northern Blot“ analize, pomoću sonde homologne kodirajućim sekvencama ABM-a opisanog ovde, ili njegovog fragmenta i/ili kodirajuće sekvence polipeptida koji ima aktivnost glikoziltransferaze (npr. GnTIII) ili njenih određenih delova. Alternativno, ukupne nukleinske kiseline ćelije domaćina mogu da se izvuku i analiziraju za hibridizaciju na takvim sondama. ;U četvrtom pristupu, ekspresija proteinskih proizvoda može da se proceni imunološki, na primer „Western Blot“ analizom, imunološkim testovima kao što su radioimuno-precipitacija, imunoanalize vezane za enzim i slično. Međutim, krajnji test uspeha sistema ekspresije uključuje otkrivanje biološki aktivnih proizvoda gena. ;Terapeutske primene i metode upotrebe anti-CEA antigena vezujućih molekula Otkriće je takođe usmereno na metod za ciljanje in vivo ili in vitro ćelija koje izražavaju CEA. Ćelije koje izražavaju CEA mogu biti ciljane u terapeutske svrhe (npr. za lečenje poremećaja ciljanjem ćelija koje izražavaju CEA za uništenje imunološkim sistemom). U jednom rešenju, ovo otkriće je usmereno na metod za ciljanje ćelija koje izražavaju CEA u subjektu koji obuhvata davanje kompozicije subjektu koja sadrži ABM kao što je ovde opisano. Ćelije koje izražavaju CEA takođe mogu biti ciljane u dijagnostičke svrhe (npr. da bi se utvrdilo da li izražavaju CEA, normalno ili neuobičajeno). Prema tome, otkriće je takođe usmereno na metode za otkrivanje prisustva CEA ili ćelije koja eksprimira CEA, in vivo ili in vitro. Jedan od načina otkrivanja CEA izražavanja prema sadašnjem otkriću obuhvata kontaktiranje uzorka koji se testira, opciono sa kontrolnim uzorkom, sa ABM-om kao što je ovde opisano, pod uslovima koji omogućavaju stvaranje kompleksa između ABM i CEA. Zatim se otkriva formacija kompleksa (npr. pomoću ELISA metode ili drugih metoda poznatih u struci). Kada se koristi kontrolni uzorak sa uzorkom za ispitivanje, svaka statistički značajna razlika u formiranju ABM-CEA kompleksa prilikom upoređivanja testnih i kontrolnih uzoraka pokazuje prisustvo CEA u uzorku za test. ;U jednom rešenju, ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova kako je ovde opisano, mogu se koristiti za ciljanje ćelija koje izražavaju CEA in vivo ili in vitro. Ćelije koje izražavaju CEA mogu biti ciljane u dijagnostičke ili terapeutske svrhe. U jednom rešenju, ABM-ovi opisani ovde mogu da se koriste za otkrivanje prisustva CEA u uzorku. CEA je abnormalno izražen (npr. prekomerno izražen) kod mnogih tumora u odnosu na ne-tumorsko tkivo istog ćelijskog tipa. Prema tome, ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova kako je ovde opisano, posebno su korisni u sprečavanju formiranja tumora, eradikaciji tumora i inhibiciji rasta tumora ili metastaze. ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova kako je ovde opisano, takođe deluju da spreče ćelijski ciklus, uzrokuju apoptozu ciljnih ćelija (npr. tumorskih ćelija) i inhibiraju angiogenezu i/ili diferencijaciju ciljanih ćelija. ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova kako je ovde opisano, mogu se koristiti za lečenje bilo kojeg tumora koji eksprimira CEA. Posebne maligne bolesti koje se mogu lečiti ABM-om i/ili varijantama ABM-a kako je ovde opisano uključuju, ali se ne ograničavaju na, kolorektalni rak, rak pluća ne-malih ćelija, rak želuca, rak pankreasa i rak dojke. ;Anti-CEA ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova koji su ovde opisani mogu se koristiti sami za inhibiranje rasta tumora ili ubijanje tumorskih ćelija. Na primer, anti-CEA ABM-ovi se mogu vezati za CEA koji se nalazi na membrani ili ćelijskoj površini kancerogenih ćelija i izaziva, na primer, ADCC ili drugi efektor koji ubija kancerozne ćelije. Anti-CEA ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova mogu biti humanizovani, naročito zreli afinitet i/ili zrela stabilnost, konkretnije, glikozoinženjering, stabilnost i zreli afinitet. ;ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova mogu alternativno da se koriste sami da bi blokirali aktivnost CEA antigena, naročito fizičkim ometanjem njegovog vezivanja sa drugim jedinjenjem. Na primer, molekuli koji vezuju antigen i variante molekula koji vezuju antigen mogu da se koriste za blokiranje CEA posredovane ćelijske adhezije. ;Anti-CEA ABM-ovi i/ili varijante ABM-ova opisanih ovde se primenjuju kod sisara, poželjno kod čoveka, u farmaceutski prihvatljivoj doznoj formi kao što je ona o kojoj se govori u nastavku, uključujući one koje se mogu davati čoveku intravenozno kao bolus ili neprekidnom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerebrospinalnim, subkutanim, intra-artikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, topikalnim ili inhalacionim putem. ABM-ovi su takođe adekvatno primenjeni intra tumorskim, peritumoralnim, intralezionalnim ili perilezionalnim načinima, kako bi se ostvarili lokalni kao i sistemski terapeutski efekti. Očekuje se da će intraperitonealni put biti naročito koristan, na primer u lečenju kolorektalnih tumora. ;Za lečenje bolesti, odgovarajuća doza ABM-ova i/ili varijante ABM-ova zavisiće od vrste bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta, reakcije na antitelo i diskrecionog prava lekara. AVM se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. ;Sadašnje otkriće obezbeđuje metodu selektivnog ubijanja tumorskih ćelija koje izražavaju CEA. Ovaj postupak obuhvata reakciju molekula koji vezuju antigene ili konjugate (npr. imunotoksin) koji su ovde opisani sa pomenutim ćelijama tumora. Ove ćelije tumora mogu biti iz raka čoveka, uključujući kolorektalni rak, rak pluća ne-malih ćelija (NSCLC), rak želuca, rak pankreasa i rak dojke. ;U jednom rešenju, ovo otkriće obezbeđuje postupak koji inhibira CEA posredovanu ćelijsku adheziju ćelija tumora. Ovaj postupak obuhvata kontaktiranje pomenute tumorske ćelije sa molekulima koji vezuju antigen ili varijante molekula koji vezuju antigen koji su ovde opisani ili njihovim konjugatima. Ove tumorske ćelije mogu biti iz ćelija čoveka, uključujući ćelije kolorektalnog raka, ćelije raka pluća ne-malih ćelija (NSCLC), ćelije raka želuca, ćelije raka pankreasa i ćelije raka dojke. ;Pored toga, ovo otkriće obezbeđuje postupak lečenja karcinoma (na primer, karcinoma kod čoveka) in vivo. Ovaj postupak obuhvata davanje subjektu farmaceutski efikasne količine preparata koji sadrži najmanje jedan od molekula koji vezuju antigen ili imunokonjugate (npr. imunotoksin) koji su ovde opisani. ;U sledećem rešenju, otkriće je usmereno na postupak za lečenje karcinoma koji se karakteriše prevelikim izražavanjem CEA, uključujući, ali ne ograničavajući se na kolorektalne ćelije raka, NSCLC (rak pluća ne-malih ćelija), ćelije raka želuca, ćelije raka pankreasa i ćelijama raka dojke, davanjem terapeutski efikasne količine anti-CEA molekula koji vezuju antigene ili varijantni molekula koji vezuju antigene koji su ovde prikazani. ;U daljem rešenju, otkriće je usmereno na metodu za indukovanje regresije tumorskog tkiva kod subjekta koji koristi anti-CEA molekule koji vezuju antigene ili varijante molekula koji vezuju antigene, koji su ovde prikazani. Neograničavajući primeri tumorskog tkiva obuhvataju kolorektalni tumor, rak pluća ne-malih ćelija, tumor želuca, tumor pankreasa i tumor dojke. U određenom rešenju, tkivo tumora je kolorektalni tumor. ;U skladu sa praksom ovog otkrića, subjekt može biti čovek, konj, svinja, govedo, glodar, pas, mačka i ptica. U ovo otkriće su uključene i druge toplokrvne životinje. ;Otkriće dalje daje metode za inhibiranje rasta tumorskih ćelija, lečenje tumora kod subjekta i lečenje bolesti proliferativnog tipa kod subjekta. Ovi postupci obuhvataju davanje subjektu efektivne količine preparata koji je ovde opisan. ;U još jednom rešenju, otkriće je usmereno na upotrebu anti-CEA molekula koji vezuju antigen ili varijante molekula koji vezuju antigen, koji su ovde prikazani, za proizvodnju leka za lečenje bolesti povezane sa abnormalnom CEA ekspresijom. U konkretnom rešenju, bolest je rak koji prekomerno izražava CEA, uključujući, ali ne ograničavajući se na kolorektalni tumor, rak pluća ne-malih ćelija, tumor želuca, tumor pankreasa i tumor dojke. U određenom rešenju, tumor je kolorektalni tumor. ;Konjugati Anti-CEA molekula koji vezuje antigen ;Otkriće takođe daje imunokonjugate koje sadrže anti-CEA ABM ili varijantu ABM-a konjugovanu sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi. ;U jednom rešenju, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na maitansinoid (pogledajte SAD patent br. 5.208.020, 5.416.064 i evropski patent EP 0 425 235 B1); ,kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatin DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte SAD patent br. 5.635.483 i 5.780.588 i 7.498.298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte SAD patent br. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, i 5.877.296; Hinman i sar. Istraživanje kancera. 53:3336-3342 (1993); i Lode i sar., Istraživanje kancera. 58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz i sar., Trenutna med. Hem. 13:477-523 (2006); Jeffrey i sar., Bioorg. i med. Hem. Pisma 16:358-362 (2006); Torgov i sar., Biokonj. Hem. 16:717-721 (2005); Nagy i sar., Prok. Natl. Akad. Sci. SAD 97:829-834 (2000); Dubowchik i sar., Bioorg. i med. Hem. Pisma 12:1529-1532 (2002); King i sar., J. Med. Hem. 45:4336-4343 (2002); i SAD patent br. ;6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065. ;U drugom rešenju, imunokonjugat sadrži anti-CEA ABM ili varijantu ABM-a kao što je ovde opisano, konjugovanu za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPE i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene. ;U drugom rešenju, imunokonjugat uključuje anti-CEA ABM ili varijantu ABM-a kao što je ovde opisano, vezano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>,I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili 1123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. ;Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HC1), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što opisuju Vitetta i sar., Nauka 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za vezivanje radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Povezivač može biti „raskidivi povezivač“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu da se koriste kiselo-labilni povezivač, povezivač osetljiv na peptidazu, fotolabilni povezivač, dimetil povezivač ili povezivač koji sadrži disulfid (Chari i sar., Cancer Res. 52:127-131 (1992); SAD Patent br.5,208,020). ;Imunokonjugati ADC-a koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD). ;Kompozicije, formulacije, doze i načini primene ;U jednom rešenju, sadašnje otkriće je usmereno na farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CEA ABM-ove ili varijantne ABM-ova koje su ovde opisane i farmaceutski prihvatljiv nosač. Sadašnje otkriće dalje je usmereno na upotrebu takvih farmaceutskih kompozicija u postupku lečenja bolesti kao što je rak ili u proizvodnji leka za lečenje bolesti, kao što je rak. Konkretno, sadašnje otkriće je usmereno na postupak za lečenje bolesti, a naročito za lečenje kancera, postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine farmaceutskog preparata koji je ovde opisan. ;U jednom rešenju, sadašnje otkriće obuhvata farmaceutske kompozicije, kombinacije i metode za lečenje ljudskih karcinoma, na primer kolorektalni karcinom. Na primer, otkriće sadrži farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju ljudskih karcinoma koji sadrže farmaceutski efikasnu količinu antitela kako je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač. ;ABM kompozicije opisane ovde mogu se primenjivati koristeći konvencionalne načine administriranja, uključujući ali ne ograničavajući se na, intravenozne, intraperitonealne, oralne, intralimfatske ili administraciju direktno u tumor. Intravenozna administracija je poželjna. ;U jednom rešenju otkrića, terapeutske formulacijekoje sadže ABM-ove, kako je ovde opisano, pripremaju se za skladištenje mešanjem antitela koje poseduje željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remingtonove farmaceutske nauke 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoca u korišćenim dozama i koncentracijama. ;Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. ;Najefikasniji način primene i režim doziranja za farmaceutske kompozicije opisane ovde zavise od težine i toka bolesti, zdravlja pacijenta i reakcije na tretman i procene lekara koji leči. ;Shodno tome, doziranje kompozicija treba titrirati prema pojedinačnom pacijentu. Bez obzira na to, efikasna doza kompozicija opisanih ovde će biti u opsegu od oko 0,01 do oko 2000 mg/kg. ;Ovde opisani molekuli mogu biti u različitim doznim oblicima koji uključuju, ali se ne ograničavaju na, tečne rastvore ili suspenzije, tablete, pilule, prahove, supozitorije, polimerne mikrokapsule ili mikrovezikule, lipozome i injekcione ili infuzibilne rastvore. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapijske primene. ;Kompozicija koji sadrži ABM kao što je ovde opisano biće formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koje u ovom kontekstu treba razmotriti uključuju konkretnu bolest ili poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok bolesti ili poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Terapeutski efikasna količina antagonista koji će se primenjivati će se upravljati takvim razmatranjima. ;Proizvodi izrade ;U još jednom rešenju otkrića, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, sprečavanje i/ili dijagnostikovanje poremećaja opisanih u prethodnom tekstu. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor, ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je antitelo kako je ovde opisano. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo, kao što je ovde opisano; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom rešenju otkrića može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve. ;Podrazumeva se da svaki od proizvoda pomenutih u prethodnom tekstu o izradi može da sadrži imunokonjugat iz pronalaska, kao što je opisano, umesto ili pored anti-CEA ABM-a. ;Primeri ;Osim ako nije drugačije naznačeno, upućivanja na brojanje specifičnih pozicija amino kiselinskih ostataka u sledećim primerima su u skladu sa Kabatovim brojevima. ;Primer 1 ;Generisanje biblioteka za sazrevanje afiniteta ;H1/H2 biblioteka ;Za nasumično generisanje biblioteka za sazrevanje afiniteta u regionu HCDR1 i HCDR2, nasumično su odabrani tripleti koji kodiraju pozicije F32 G33 u CDR1 i položaji W50 N52 T52a K52b T54 E56 T58 u CDR2. U prvom koraku, fragment DNK (fragment 1) je amplificiran korišćenjem pMS22 kao matrice i prajmera MS-43 (SEK ID BR: 123) i EAB-679 (SEK ID BR: 127) koji sadrži nasumične CDR1 pozicije (sl.11). Pomoću istog šablona, prajmeri MS-56 (SEK ID BR: 126) i MS-52 (SEK ID BR: 124) pojačali su drugi fragment (fragment 2) koji ima region preklapanja sa 3'krajem fragmenta 1. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 25 ciklusa, od kojih se svaki sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i elongacije od 20 sek. i 50 sek. na 72°C, redom za fragment 1 i fragment 2. Na kraju je izveden konačni inkubacijski korak od 10 minuta na 72°C. Oba fragmenta su prečišćena agaroznim gelom. Preklapajući produženi PCR sa fragmentom 1 i 2 primenom prajmera MS-43 (SEK ID BR: 123) i EAB-680 (SEK ID BR: 128), koji su štitili nasumične položaje CDR2, generisali su fragment sa oba nasumična CDR-a (fragment 3). Za sastavljanje fragmenata 1 i 2 korišćene su ekvimolarne količine fragmenta 1 i fragmenta 2. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 5 ciklusa bez prajmera, od kojih se svaki ciklus sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i korak elongacije od 40 sek. na 72°C. Nakon dodavanja spoljašnjih prajmera, izvršeno je 20 dodatnih ciklusa korišćenjem istih parametara. Četvrti fragment (fragment 4) koji se preklapa sa 3' regionom fragmenta 3 bio je ponovo PCR-amplifikovan korišćenjem pMS22 kao šablona i prajmera MS-55 (SEK ID BR: 125) i MS-52 (SEK ID BR: 124). Nakon prečišćavanja gelom, konačno PCR prekrivanje proširenja pomoću fragmenta 3 i 4 kao šablona i prajmera MS-43 i MS-52 generisalo je fragment koji sadrži CL i delove VH. Za to su korišćene ekvimolarne količine fragmenta 3 i fragmenta 4. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 5 ciklusa bez prajmera, od kojih se svaki ciklus sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i korak elongacije od 80 sek. na 72°C. Nakon dodavanja spoljašnjih prajmera, izvršeno je 20 dodatnih ciklusa korišćenjem istih parametara. Dobijeni fragment je tada prečišćen gelom i ligiran sa pMS22 posle NcoI/NheI digestije. ;L1/L2 biblioteka ;Za nasumično generisanje biblioteka za sazrevanje afiniteta u regionu LCDR1 i LCDR2, nasumično su odabrani tripleti koji kodiraju pozicije Q27, N28, V29, G30 T31 N32 u CDR1 i položaji Y49 S50 Y53 R54 Y55 S56 u CDR2. U prvom koraku, fragment DNK (fragment 1) je amplificiran korišćenjem pMS22 kao matrice i prajmera EAB-685 (SEK ID BR: 129) i EAB-681 (SEK ID BR: 133) koji sadrži nasumične CDR1 pozicije (sl. 12). Pomoću istog šablona, prajmeri EAB-686 (SEK ID BR: 130) i EAB-687 (SEK ID BR: 131) pojačali su drugi fragment (fragment 2) koji ima region preklapanja sa 3' krajem fragmenta 1. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 25 ciklusa, od kojih se svaki sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i elongacije od 60 sek. na 72°C, redom za fragment 1 i fragment 2. Na kraju je izveden konačni inkubacijski korak od 10 minuta na 72°C. Oba fragmenta su prečišćena agaroznim gelom. Preklapajući produženi PCR sa fragmentom 1 i 2 primenom prajmera EAB-685 (SEK ID BR: 129) i EAB-682 (SEK ID BR: 134), koji su štitili nasumične položaje CDR2, generisali su fragment sa oba nasumična CDR-a (fragment 3). Za sastavljanje fragmenata 1 i 2 korišćene su ekvimolarne količine fragmenta 1 i fragmenta 2. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 5 ciklusa bez prajmera, od kojih se svaki ciklus sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i korak elongacije od 60 sek. na 72°C. Nakon dodavanja spoljašnjih prajmera, izvršeno je 20 dodatnih ciklusa korišćenjem istih parametara. Četvrti fragment (fragment 4) koji se preklapa sa 3' regionom fragmenta 3 bio je ponovo PCR-amplifikovan korišćenjem pMS22 kao šablona i prajmera EAB-688 (SEK ID BR: 132) i EAB-687 (SEK ID BR: 131). Nakon prečišćavanja gelom, konačno PCR prekrivanje proširenja pomoću fragmenta 3 i 4 kao šablona i prajmera EAB-685 (SEK ID BR: 129) i EAB-687 (SEK ID BR: 131) generisalo je fragment koji sadrži VL i delove CL. Za to su korišćene ekvimolarne količine fragmenta 3 i fragmenta 4. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 5 ciklusa bez prajmera, od kojih se svaki ciklus sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i korak elongacije od 80 sek. na 72°C. Nakon dodavanja spoljašnjih prajmera, izvršeno je 20 dodatnih ciklusa korišćenjem istih parametara. Ovaj fragment je tada ligiran sa pMS22 posle HindIII/SacI digestije. ;H3 biblioteke ;Za generisanje nasumičnih biblioteka za sazrevanje afiniteta u regionu HCDR3, tripleti koji kodiraju pozicije W95, D96, F97, Y98, D99, Y100, V100a, E100b, A100c i M100d su nasumični u dva različita pristupa: (1) nasumičnost čitavog segmenta (H3 pune biblioteke) ili (2) individualna nasumičnost svake pozicije koja rezultira u deset podbiblioteka. Podbiblioteke koje sadrže klonove sa pojedinačnim nasumičnim pozicijama zbijeni su nakon transformacije u bakterije (biblioteka H3 sa bazom podataka). Za nasumičnost regiona HCDR3, fragmenti su bili PCR-amplifikovani korišćenjem prajmera koji se preklapa u 3' kraju CL-a i prajmerima koji imaju uzorkovane sekvence HCDR3 (sl. 13). Preklapanje ekstenzije PCR-a je zatim izvedeno sa drugim fragmentom koji se preklapa sa 3 'kraja fragmenta 1 i obuhvata kraj VH-a i 5' region CH1. Sastavljeni fragmenti su zatim ligirani u pMS22 nakon SacI/NheI digestije. Za generisanje biblioteke sa bazom H3, deset DNK fragmenta su pojedinačno PCR-amplificirane pomoću svakog prajmera AC7-AC16 (SEK ID BR: 135; SEK ID BR: 144) u kombinaciji sa prajmerom EAB-749 (SEK ID BR: 146). Za generisanje kompletne L3 biblioteke korišćeni su prajmeri AC17 (SEK ID BR: 145) i EAB-749 (SEK ID BR: 146). Plazmid pMS22 je korišćen kao šablon. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 25 ciklusa, od kojih se svaki sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i elongacije od 36 sek. na 72°C, nakon čega sledi konačni inkubacijski korak od 10 min na 72°C. Ovo je rezultiralo sa oko 580 bp dugih fragmenata koji su prečišćeni agaroznim gelom. Za preklapanje ekstenzije PCR-a, drugi fragment je amplifikovan primenom prajmera EAB-750 (SEK ID BR: 147) ili EAB-751 (SEK ID BR: 148) u kombinaciji sa EAB-752 (SEK ID BR: 149). Dok je prajmer EAB-750 (SEK ID BR: 147) imao preklapajući niz sa nasumičnim prajmerom AC7-11 (SEK ID BR: 139), EAB-751 (SEK ID BR: 148) je delio homologije sekvence sa nasumičnim prajmerom AC12-17 (SEK ID BR: 140-145). Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 25 ciklusa, od kojih se svaki sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i elongacije od 12 sek. na 72°C, nakon čega sledi konačni inkubacijski korak od 10 min. na 72°C. Dobijeni fragmenti su bili dugi oko 180 bp. Za sastavljanje oba fragmenta korišćene su ekvimolarne količine fragmenta 1 i odgovarajućeg fragmenta 2. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 5 ciklusa bez prajmera, od kojih se svaki ciklus sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i korak elongacije od 60 sek. na 72°C. Nakon dodavanja spoljašnjih prajmera EAB-749 (SEK ID BR: 146) i EAB-752 (SEK ID BR: 149), izvršeno je 20 dodatnih ciklusa korišćenjem istih parametara. Na kraju je izvršen konačni korak inkubacije od 10 min. na 72°C. Fragmenti prečišćeni gelom su zatim ligirani u pMS22 nakon SacI/NheI digestije i prečišćene ligacije su transformirane u TG1 bakterije elektroporacijom. ;L3 biblioteke ;Za generisanje nasumičnih biblioteka za sazrevanje afiniteta u regionu CDR3 lakog lanca, tripleti koji kodiraju položaje Y91, Y92, T93, Y94 i L95a bili su ili randomizovani u čitavom segmentu (L3 puno biblioteke) ili pojedinačno rezultirani u pet podbiblioteka. Podbiblioteke koje sadrže klonove sa pojedinačnim nasumičnim pozicijama zbijeni su nakon transformacije u bakterije (biblioteka L3 sa bazom podataka). Za generisanje pet podbiblioteka, pet DNK fragmenata su PCR-amplifikovani pomoću svakog prajmera AC1-AC5 (SEK ID BR: 150-154) u kombinaciji sa prajmerom MS43 (SEK ID BR: 123). Za generisanje celokupne L3 biblioteke korišćene su kombinacije prajmera AC6 (SEK ID BR: 155) i MS43 (SEK ID BR: 123) (sl. 14). Plasmid pMS22 je korišćen kao šablon. Uslovi amplifikacije obuhvatali su početni stepen inkubacije od 5 min. na 94°C, a zatim 25 ciklusa, od kojih se svaki sastojao od denaturacije od 1 min. na 94°C, prekaljivanja od 1 min. na 55°C i elongacije od 25 sek. na 72°C, nakon čega sledi konačni inkubacijski korak od 10 min na 72°C. Dobijeni fragmenti koji obuhvataju pozicije 1-104 VL domena su prečišćeni agaroznim gelom i koriste se kao šablon za dodatnu PCR amplifikaciju. Sve reakcije su izvedene pomoću prajmera EAB-746 (SEK ID BR: 156) koji ima prekrivajuću sekvencu sa nasumičnim prajmerima i MS43 (SEK ID BR: 123) koristeći iste uslove opisane iznad. Pročišćeni fragmenti kao i pMS22 su digestovani pomoću Ncol/Xhol. Za svih pet podbiblioteka, 0,5 µg unosa je ligirano sa 0,5 µg pAC 16. Za kompletnu L3 biblioteku, izvedena je ligacija sa 9,8 µg unosa i 9,8 µg pMS22. Prečišćene ligacije transformisane su u TG1 bakterije elektroporacijom. ;Generisanje antigena ;Budući da i mišja i ljudska PR1A3 antitela prepoznaju samo membranski vezan, ali ne proliven rastvorljiv ljudski CEA, rekombinantni himerni protein koji sadrži epitop PR1A3 je generisan za sazrevanje afiniteta in vitro humanizovanog PR1A3 (SEK ID BR: 7 i 8). Generisanje ovog hibridnog proteina izvršeno je kako je opisano u Stevard i sar. 1999. Ukratko, DNK sekvenca B domena ljudskog bilijarnog glikoproteina (BGP) zamenjena je sekvencom ljudskog CEA-B3 domena, koji sadrži epitop PR1A3. Kao rezultat, sekvenca kodira hibridni protein koji sadrži N i A1 domene BGP, domen B3 CEA i A2 domen BGP (N-A1-B3-A2, huNABA). Ovaj fuzioni proizvod je tada bio povezan sa Fc delom ljudskog IgG1 (huNABA-Fc) (Stevard i sar. Imunološka imunoterapija kancera, 47:299-306, 1999) ili fuzionisan na sekvencu koja kodira precizno proteazno mesto cepanja, avi oznaku i oznaku (His) 6 (huNABA-avi-his) (SEK ID BR: 158). huNABA-Fc je prečišćen supernatantom stabilno transfektirane CHO ćelijske linije koristeći kolonu proteina A. huNABA-avi-his (SEK ID BR: 158) je tranzientno transfektovan u HEK 293 ćelije, stabilno izražavajući EBNA protein dobijen iz EBV. Istovremeno, ko-transfektovani plazmid koji kodira biotin ligazu dozvoljava biotinilaciju in vivo sa specifičnom avi oznakom. Protein je zatim prečišćen imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom (IMAC) praćenu filtracijom gela. ;Sazrevanje afiniteta humanizovanog PR1A3 ;Generisanje humanizovanih PR1A3 Fab-ova zrelog afiniteta izvedeno je fagnim prikazom pomoću standardnih protokola (Silacci i sar, Proteomika, 5 (9): 2340-2350,2005). Selekcije sa svim bibliotekama za sazrevanje afiniteta izvršene su u rastvoru prema sljedećoj proceduri: 1. vezivanje ~ 1012 fagemidnih čestica u svakoj biblioteci za sazrevanje afiniteta do 100 nM biotinilovanog huNABA-avi-his tokom 0,5 h u ukupnoј zapremini od 1 ml, 2. hvatanje biotinilovanih huNABA-avi-his i specifično vezanih faga čestica dodavanjem 5,4 x 10<7>magnetnih perlica obloženih streptavidinom u trajanju od 10 min, 3. pranje perle koristeći 5-10x 1 ml PBS/Tween20 i 5-10x 1 ml PBS, 4. eluiranje čestica faga dodavanjem 1 ml 100 mM TEA (trietilamin) tokom 10 min. i neutralizacija dodavanjem 500 ul 1M Tris/HClpH 7,4 i 5. ponovno inficiranje eksponencijalno rastućih TG1 bakterija „E. coli“, infekcija pomoćnog faga VCSM13 i naknadnih PEG/NaCl taloženja fagemidnih čestica koje će se koristiti u narednim selekcionim krugovima. Selekcije su sprovedene u 3-5 krugova korišćenjem konstantnih ili smanjenih koncentracija antigena (od 10<-7>M do 2x10<-9>M). U drugom krugu, uzimanje antigena: fagni kompleksi obavljeni su korišćenjem neutravidinskih ploča umesto streptavidinskih perlica. ;Specifična veziva identifikuje ELISA na sledeći način: 100 ul 10nM biotinilovanog huNABA-avi-his po bazenu obloženo je na pločama neutravidina. Dodati su bakterijski supernatanti koji sadrže fab i otkriveni su vezujući fabovi preko njihovih oznaka pomoću sekundarnog antitela anti-flag/HRP. ELISA-pozitivni klonovi su bakteriološki izraženi kao rastvorljivi fab fragmenti u obliku 96 bazena, a supernatanti su podvrgnuti eksperimentu kinetičkog skrininga pomoću SPR analize koristeći BIACORE T100. Klonovi koji izražavaju fabove sa najvišim konstantama afiniteta su identifikovani i odgovarajuće fagemide su sekvencirane. ;Prečišćavanje fabova i merenje kinetičkih parametara ;Fabovi se prečišćavaju od bakterijskih kultura za tačnu analizu kinetičkih parametara. Kultura od 500 ml je inokulirana i indukovana sa ImM IPTG na OD600 od 0,9. Bakterije su inkubirane na 25°C preko noći i požete centrifugiranjem. Posle inkubacije resuspendovanog peleta za 20 min u 25 ml PPB pufera (30 mM Tris-HCl pH8, ImM EDTA, 20% saharoze), bakterije se ponovo centrifugiruju i supernatant se sakuplja. Ovaj korak inkubacije jednom se ponavlja sa 25 ml za 5 mM MgSO4rastvora. Supernatanti oba koraka inkubacije su bili udruženi, filtrirani i natovareni na IMAC stupac (His gravitrap, GE zdravstvena zaštita). Zatim, kolona je isprana sa 40 opsega. Nakon elucije (500 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 20 mM NaH2PO4pH 7,4), eluat je ponovo puferisan pomoću PD10 kolona (GE zdravstvena zaštita). Kinetički parametri prečišćenih Fabova zatim su proučavani SPR-analizom u redu razređivanja koji se kretao od 200 nM do 6,25 nM. ;Primer 2 ;PR1A3 antitelo je himerizovano da ima humani IgG1/kapa konstantni region, i izražava se pomoću tehnologije „GilcoMab“ kako bi imalo visok stepen afkozilovanih šećera u Fc. Gliko proizvedena i ne-gliko proizvedena antitela su upoređivana u odnosu na efektore i ciljeve od 25:1. Maksimalna količina ubijanja ciljanih ćelija zavisnih od antitela bila je udvostručena glikomodifikacijom regiona Fc (slika 2). Dodatno povećanje ubijanja ćelija postignuto je povećanjem odnosa efektora i cilja (slika 2). ;PR1A3 je humanizovan korišćenjem okvira identičnih sa ljudskim sekvencama germinalne linije. IMGT sekvenca IGHV7-4-1*02 (pristupni broj X62110) je bila akceptor za VH humanizaciju, a IMGT_hVK_1_39 (pristupni broj X59315) je bio akceptor za VL humanizaciju. Humanizovano PR1 A3 antitelo koje sadrži konstrukciju varijabilnog regiona teškog lanca CH7A i konstrukciju varijabilnog regiona lakog lanca CL1A pokazalo je zadovoljavajuće vezivanje za ćelije karcinoma debelog creva čoveka, mereno protočnom citometrijom (slika 3).

Sazrevanje afiniteta PR1A3 fagnim prikazom obavljeno je korišćenjem standardnih protokola kao što je detaljno opisano u primeru 1, u nastavku. Prvo humanizovano PR1A3 antitelo koje je korišćeno za sazrevanje afiniteta obuhvata konstrukciju varijabilnog regiona teškog lanca CH7A i konstrukciju varijabilnog regiona lakog lanca CL1A. Tabele 3-6 ispod pokazuju biblioteke koje se koriste za sazrevanje afiniteta. Za biblioteku L1/L2, pozicije valina 29, alanina 50 ili serina 51 u okviru CDR-a su bile konstantne. Za biblioteku H1/H2, pozicije izoleucina 51, glicina 55 ili alanina 57 unutar CDR-a su bile konstantne (slike 4 i 5).

Konstrukcija varijabilnog regiona teškog lanca sa sazrelim afinitetom, CH7A rF9, i konstrukcija varijabilnog regiona lakog lanca sa sazrelim afinitetom, CL1A rH11, su upareni sa matičnom konstrukcijom varijabilnog regiona lakog lanca i teškog lanca, po redu i jedna sa drugom. Sva antitela su pretvorena u ljudski IgG1/kapa i vezivanje za CEA-pozitivnu ćelijsku liniju MKN45 je mereno protočnom citometrijom. Antitela koja sadrže bilo koje varijabilne regione teškog lanca sa sazrelim afinitetom ili varijabilne regione teškog i lakog lanca sa sazrelim afinitetom pokazali su poboljšanu karakteristiku vezivanja u poređenju sa humanizovanim matičnim antitelom (slika 6). Slike 6, 10 i 15 pokazuju nekoliko primera gde sazrelo svetlo i teški lanci nezavisno doprinose povećanom afinitetu. Matično antitelo CH7A CL1A ima najmanji intenzitet signala, kao i najvišu vrednost EC50 na slikama 6 i 15. Sazreli laki lanac pomera EC50 vrednosti na niže brojeve, dok sazreli teški lanci (rF9 na slici 6 i rB9 na Slici 15) pomeraju ukupni intenzitet fluorescencijskog signala u merenje protoka citometrije. Na slici 10 prikazan je pojedinačni doprinos teškog i lakog lanca meren pomoću „Biacore“ metodologije. Kombinacija ova dva lanca povećava afinitet čak i dalje. Pored toga, kao što je prikazano na slici 16, poboljšanje afiniteta dovodi do poboljšanja ADCC karakteristika.

Vezujući afiniteti CDR teških i lakih lanaca zrelih afiniteta utvrđeni su Biakorom i prikazani su na slici 34A i B.

Slika 35 sumira konstante afiniteta raznih sekvenci antitela zrelih afiniteta. Matično antitelo PR1A3 navedeno je kao i nekoliko kombinacija lakih lanaca i teških lanaca zrelih i ne zrelih sekvenci. Sve vrednosti su dobijene pomoću Biakor tehnologije merenjem stope konstanti asocijacije (kon) i disocijacije (koff) različitih konstruktivnih rastvornih antitela u Fab formatu na Biakor čipu sa imobilizovanim NABA-avi-njegovim reagensom (SEQ ID NO. 158) kao antigenom. Konstanta afiniteta je označena sa KD.

Primer 3

Okvir akceptora koji se koristi za generisanje anti-CEA antitela zrelog afiniteta opisan u primeru 2, je iz ljudske VH7 klase. Da bi se povećala stabilnost, postojala je stabilnija okvirna sekvenca akceptora kao osnova za inženjering stabilnosti antitela. Na osnovu sekvencijalne homologije mišjeg antitela PR1A3 i pretpostavke da VH1 izvedene sekvence treba da imaju višu unutrašnju stabilnost od VH7, ili parni brojevi ljudskih VH klanova (Evert, S., Huber, T., Honegger, A. i Pluckthun, A. (2003) J. Mol. Biol., 325, 531-553), sekvenca IGHV-1-18; Ace broj: M99641 je korišćena kao novi okvir akceptora. Konvencionalno CDR petlja-graftovanje PR1A3 antitela dovelo je do izgradnje CH1A (SEQ ID NO: 279). Nažalost, ovaj molekul nije pokazao značajnu vezujuću aktivnost prema CEA antigenu. Vezujuća aktivnost ove konstrukcije upoređena je sa vezujućom aktivnošću himernog antitela PR1A3 koja sadrži varijabilne domene izvedene iz miša u različitim koncentracijama. BxPC3 ćelije su korišćene za specifično vezivanje antitela na CEA, a intenzitet vezivanja meren je FACS analizom. Slika 17.

Da bi se povratio vezujući afinitet, u sekvencu CH1A uvedeno je nekoliko povratnih mutacija koje su generisale nove teške lance CH1A1 (SEQ ID NO: 257), CH1A2 (SEQ ID NO: 258), CH1A3 (SEQ ID NO: 259) i CH1A4 (SEQ ID NO: 260). CH1A1 uključuje M69F/T71L mutacije dvostruke tačke. Poslednje tri varijante imaju celokupne okvire 1, 2 ili 3, odnosno zamenjuju se mišjim duplikatima. Slika 18 pokazuje vezivanje onih konstrukcija kada su uparene sa lakim lancem 2F1 (SEQ ID NO: 209). U ovom testu, vezivanje ćelija varijanti antitela baziranog na CH1A na MKN-45 ćelijama koje izražavaju CEA analizirano je u različitim koncentracijama. Laki lanac 2F1 zrelog afiniteta bio je identičan za sva testirana antitela osim komatičnog antitela gde je korišćen originalni laki lanac CL1A. Srednja fluorescencija je određena FACS analizom. Slika 19 pokazuje stabilnost tih konstrukcija kada su uparene sa 2F1 lakim lancem, mereno dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) uzoraka. DLS test je izvršen korišćenjem 1 mg/ml antitela u puferu od 20 mM histidina i 140 mM NaCI pri pH 6,0. Test je sproveden počevši od 25 °C sa postepenim povećanjem temperature od 0,05 °C/min do 70 °C. Sva antitela koja su testirana u ovom testu imala su 2F1 kao laki lanac.

S obzirom da CH1A1 i dalje drži prvobitnu stabilnost, a takođe pokazuje i neke značajne (ali nešto manje od CH1A4, koje su bile najvišeg afiniteta, ali najniže stabilnosti), ova konstrukcija je izabrana za dalju optimizaciju vezivanja. Generisani su novi teški lanci CH1A1A (SEQ ID NO: 261), CH1A1B (SEQ ID NO: 262), CH1A1C (SEQ ID NO: 263), CH1A1D (SEQ ID NO: 264), CH1A1E (SEQ ID NO: 265), CH1A1F (SEQ ID NO: 266) i CH1A1G (SEQ ID NO: 267). Ovo su u suštini varijante CH1A1 sa samo nekoliko povratnih mutacija u FR1 i FR3 regionu. Slika 20 i 21 pokazuju da su svi njihovi afiniteti uporedivi, iako su i dalje neznatno inferiorni sa humaniziranom konstrukcijom CH7A baziranom na VH7. Na slici 20 prikazani su senzorgrami Proteon (Biakor) dobijeni za vezivanje okvirnih varijanti zasnovanih na CH1A1 na CEA antigen-hranljivom himernom proteinu NABA. Biotinilovani NABA je imobilisan na čipu obloženom neutravidinom, a antitela su korišćena kao analiti u koncentracijama od 100, 50, 25, 12,5, 6,25 i 0 nM. Klon prekursora CH1A1 i matično antitelo CH7A uključeni su za direktno poređenje. Laki lanac 2F1 bio je identičan za sva ispitana antitela. Slika 21 prikazuje intenzitet vezivanja sedam varijanti zasnovanih na CH1A1 koje nose dodatne okvirne mutacije. Antitela su inkubirana sa CEA-ekspresivnim MKN45 ćelijama u seriji koncentracija, a intenzitet vezivanja je meren pomoću FACS analize. Klon prekursora CH1A1 uključen je za direktno poređenje. Sva antitela koja su testirana u ovom testu imala su 2F1 kao laki lanac. Varijante CH1A1A i CH1A1B su izabrane kao konačne varijante humanizacije bazirane na VH1 zasnovane na njihovim relativno boljim prinosima prečišćavanja i monomernom ponašanju.

Primer 4

Ostaci CDR-H3 koji su odabrani u procesu sazrevanja afiniteta pojedinačno su uneti u PR1A3 sekvencu kako bi se testirala povećana stabilnost antitela. Slika 36.

Slika 22 prikazuje Merenje plazmonske rezonance (SPR) afiniteta (mereno u bivalentnom obliku) svakog antitela prema CEA antigenu (NABA reagens kao što je opisano u Stevart i sar. Cancer Immunol Immunother (1999) 47:299-306). Na slici 22 prikazani su senzorgrami Proteon (Biakor) dobijeni za vezivanje varijanti antitela CDR-H3 na CEA antigen-hranljivom himernom proteinu NABA. Biotinilovani NABA je imobilisan na čipu obloženom neutravidinom, a antitela su korišćena kao analiti u koncentracijama od 100, 50, 25, 12,5, 6,25 i 0 nM. Klon prekursora zrelog afiniteta 5HFF12 i matično antitelo 7A uključeni su za direktno poređenje. Sva antitela koja su testirana u ovom testu imaju 2F1 kao laki lanac. Varijanta CH7A (W95Y) ne pokazuje nikakvu merljivu aktivnost u ovom testu, sve druge varijante imaju afinitet da ciljaju unutar faktora deset od svakog. Relativni afinitet svakog, meren u bivalentnom obliku, je sledeći: 5HFF12 > CH7A (Y98A/D99Y) > CH7A (Y98A) > CH7A > CH7A (E102Q) > CH7A (D99Y) > CH7A (D99H) > CH7A (A103T) > CH7A (V101F) > CH7A (W95Y).

DLS analiza je izvedena na antitelima u poređenju sa njihovim prethodnikom 5HFF12 i matičnim antitelom koji leži u teškom lancu CH7A. Laki lanac 2F1 bio je identičan za sva ispitana antitela u ovom eksperimentu. Slike 23 i 24. Rezultati ove analize pružili su sledeće rangiranje u stabilnosti: CH7A (D99Y) > CH7A (Y98A/D99Y) > CH7A (V101F) > CH7A (D99H) > CH7A (A103T) > CH7A (W95Y) > CH7Ax2F1 ( = PR1A3) > 5HFF12. DLS test je izvršen korišćenjem 1 mg/ml antitela u puferu od 20 mM histidina i 140 mM NaCI pri pH 6,0. Test je sproveden počevši od 25 °C sa postepenim povećanjem temperature od 0,05 °C/min do 70 °C.

Dvostruki mutant (Y98A/D99Y) (SEQ ID NO: 223) izabran je za dalju inženjersku stabilnost jer je pokazao veliku stabilnost, zadržavajući visok afinitet za CEA cilj.

Primer 5

Dvostruki mutant (Y98A/D99I) humanizovanog PR1A3 derivata CH7A uveden je u konačne varijante humanizacije bazirane na VH1 - konstrukcije CH1A1A i CH1A1B.

Proteon (Biakor) senzogrami su dobijeni za vezivanje kombinovanih okvira i CDR-H3 varijanti sa CEA antigen-hranljivim himernim proteinom NABA. Biotinilovani NABA je imobilisan na čipu obloženom neutravidinom, a antitela su korišćena kao analiti u koncentracijama od 100, 50, 25, 12,5, 6,25 i 0 nM. Klon prekursora 5L1A10 i matično antitelo CH7A uključeni su za direktno poređenje. Sva antitela koja su testirana u ovom testu imala su 2F1 kao laki lanac. Slika 25.

Primer 6

Konstrukcije CH1A1A i CH1A1B su pokazale aktivnost ADCC-a. ADCC posredovan sa varijantama CH1A1A i CH1A1B, njihova prethodna varijanta CH1A1, i matična CH7A varijanta je merena nakon 4 h oslobađanjem laktat dehidrogenaze koristeći MKN45 ćelije kao ciljne ćelije (T) i humani PBMC kao efektorske ćelije (E) kod E:T odnosu 25:1. Oslobađanje laktat dehidrogenaze je srazmerno lizi ciljane ćelije i prikazano je kao procenat citotoksičnosti. Slika 26. ADCC aktivnost za ove varijante je potvrđena merenjem otpuštanjem kalceina koristeći MKN45 ćelije kao ciljne ćelije (T) i humani PBMC kao efektorske ćelije (E) kod odnosa E:T od 25:1. Otpuštanje kalceina je proporcionalno lizi ciljanih ćelija i prikazano je kao procenat citotoksičnosti sa srednjim vrednostima ± standardne devijacije. Slika 27.

ADCC aktivnost je takođe primećena za CH1A1A i CH1A1B konstrukcije koje sadrže CDRH3 sa zrelim afinitetom sa dvostrukom mutacijom Y98A/D99Y. ADCC posredovan kombinovanim okvirom i CDR-H3 varijantama, i matično antitelo sa CH7A je izmereno nakon 24 časa oslobađanjem laktat dehidrogenaze koristeći MKN45 ćelije (slika 28) ili LS174T (slika 29) kao ciljne ćelije i humani PBMC kao efektorske ćelije na E:T sa odnosom 5:1. Dok MKN45 ćelije izražavaju CEA na visokim nivoima, izražavanje CEA je srednje u LS174T ćelijama. Oslobađanje laktat dehidrogenaze je srazmerno lizi ciljane ćelije i prikazano je kao procenat citotoksičnosti. Sva antitela testirana u ovom ADCC testu imala su 2F1 kao laki lanac

Primer 7

Glikodizajnirana verzija anti-CEA antitela koja sadrži CF1A1A (98/99) teški lanac i 2F1 laki lanac je testirana na efikasnost u ksenograftnom modelu kolorektalnog karcinoma kod SCID transgenih miševa za humani CD16. Uslovi testiranja modela su navedeni u nastavku. Rezultati testa ukazuju na to da ova anti-CEA antitela obezbeđuju prednost preživljavanja u odnosu na kontrolu placebom. Slika 30.

Životinje: CD16 Scid transgene ženke miševa; starosti od 7-9 nedelja na početku eksperimenta (Charles River Francuska) su održavane pod uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h mrak prema zavedenim smernicama (GV-Solas, Felasa, TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti. Nakon dolaska, životinje su održavane tokom jedne nedelje za aklimatizaciju i za posmatranje. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.

Kultura ćelija i primena: LS174T ćelije (ćelije karcinoma debelog creva kod ljudi, Evropska kolekcija ćelijske kulture) su kultivisane u DMEM medijumu koji sadrži 10% FCS (PAA Laboratories, Austrija). Ćelije su kultivisane na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom na 5% CO2. In vitro prolaz 24 korišćen je za injekciju u slezenu, pri održivosti od 97%.

Injekcija tumorskih ćelija: Na dan injekcije, tumorske ćelije LS174T su sakupljene pomoću tripsin-EDTA (Gibco, Švajcarska) iz boca za kulturu (Greiner Bio-One) i prenešene u 50 ml medij kulture, oprane jednom i ponovo suspendovane u AIM V (Gibco, Švicarska). Mali rez je napravljen na levoj strani abdomena anesteziranog SCID / bež miša. Otvoreni su koža i mišić, a trideset mikrolitara (3x10<6>LS174T ćelija u Aim V medijumu) suspenzije ćelija su injektirane u vrh slezine. Prvo mišić a zatim i koža abdomena su bile zašivene sa upijajućim šavovima (Monosin® 3-0, Braun).

Tretman: Sva anti-CEA antitela i odgovarajuće placebo su administrirani i.v. jednom nedeljno. Ukupno tri doze. 625 ug antitela je dato po injekciji po mišu. Razređenja antitela su pripremljena sveža iz zaliha pre upotrebe i formulisana u 20 mM histidina, 140 mM NaCl-a, pH 6,0 pri koncentraciji 4,38 mg/ml antitela.

Primer 8

Glikodizajnirana verzija anti-CEA antitela koja sadrži CH1A1A (Y98A/D99Y) teški lanac i 2F1 laki lanac je testirana na efikasnost u ksenograftnom modelu A549 karcinoma pluća kod SCID transgenih miševa za humani CD16. Uslovi testiranja modela su navedeni u nastavku. Rezultati testa ukazuju na to da ova anti-CEA antitela obezbeđuju prednost preživljavanja zavisnu od doze u odnosu na kontrolu placebom. Slika 31.

Životinje: Trideset pet CD16 ženki Scid miševa; starosti 7-9 nedelje pri dolasku (nabavljene od Charles River, Francuska) održavane su pod specifičnim uslovima bez patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla / 12 h tame prema dobijenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti. Nakon dolaska, životinje su održavane tokom jedne nedelje za aklimatizaciju i za posmatranje. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.

Kultura ćelija i primena: A549 ćelije (ljudske ćelije NSCLC, kolekcija američke kulture tkiva) su kultivisane u DMEM medijumu koji sadrži 10% FCS (PAA laboratorije, Austrija). Ćelije su kultivisane na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom na 5% CO2.

Tretman: Miševi su injektirani i.v. 0. dana studije sa 1x10<6>A549 ćelijama. Antitelo je započelo 7. dana studije i nastavljeno sa još 2 nedeljne injekcije.

Tretmanske grupe:

Miševi 35 SCID -CD16Tg miševi, N=7 po grupi.

Ćelije- A549 ćelije 5 Mio/miš

Jedinjenje i raspored terapija

Placebo 3q7d

CH1A1A(Y98A/D99Y) x 2F1 (500 ug) 3q7d (25 mg/kg)

CH1A1A(Y98A/D99Y) x 2F1 (200 ug) 3q7d (10 mg/kg)

CH1A1A(Y98A/D99Y) x 2F1 (100 ug) 3q7d (5 mg/kg)

CH1A1A(Y98A/D99Y) x 2F1 (50 ug) 3q7d (1 mg/kg)

LISTA SEKVENCI

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo koje vezuje karcinoembrionski antigen (CEA) vezan za membranu, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

CDR1 teškog lanca SEQ ID NO:1,

CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 13,

CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:223;

i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

CDR1 lakog lanca SEQ ID NO:39,

CDR2 lakog lanca SEQ ID NO:49, i

CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:56.

2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži okvirne ostatke CH1A1A (SEQ ID NO : 261) ili CH1A1B (SEQ ID NO: 262).

3. Antitelo prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu antitelo vezuje isti epitop kao, ili je sposobno da se takmiči za vezivanje sa mišijim monoklonskim antitelom PR1A3.

4. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je antitelo vezano za membranu CEA sa Kd od 100 nM, 10 nM, 1 nM ili manje.

5. Antitelo koje vezuje humani karcinoembrionski antigen (CEA) vezan za membrane, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 239 i SEQ ID NO: 247 i pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209.

6. Antitelo prema zahtevu 5, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 239, a varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209.

7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo sadrži region Fc koji je glikodizajniran.

8. Antitelo prema zahtevu 7, pri čemu najmanje 20% do 100% N-povezanih oligosaharida u regionu Fc nije fukolizovano.

9. Antitelo prema zahtevu 7, pri čemu najmanje 20% do 100% N-povezanih oligosaharida u regionu Fc je prepolovljeno.

10. Antitelo prema zahtevu 7, pri čemu najmanje 20% do 50% N-povezanih oligosaharida u regionu Fc je prepolovljeno, nije fukolizovano.

11. Antitelo prema bilo kom od zahteva 7-10, pri čemu antitelo ima najmanje jednu povećanu efektorsku funkciju.

12. Antitelo prema zahtevu 11, pri čemu je bar jedna povećana efektorska funkcija odabrana iz grupe koja se sastoji: Fc receptori povećanog afiniteta vezivanja, povećane ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelom (ADCC), povećanog vezivanja za NK ćelije, povećana vezivanja za makrofage, povećana vezivanja za monocite, povećana vezivanja za polimorfonuklearne ćelije, direktna signalizacija koja indukuje apoptozu, povećana sazrevanja dendritičnih ćelija i povećano aktiviranje T ćelija.

13. Antitelo prema zahtevu 12, pri čemu antitelo ima porast ADCC od najmanje 40% do 100% u poređenju sa matičnim antitelom koje nije glikodizajnirano.

14. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1-13.

15. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 14.

16. Ćelija domaćin koja sadrži vektor iz zahteva 15.

17. Kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1-13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

18. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13 ili kompozicije prema zahtevu 17 za upotrebu u lečenju karcinoma koji nekontrolisano eksprimira CEA.

19. Antitelo ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu je karcinom odabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog karcinoma, raka pluća ne-malih ćelija (NSCLC), karcinoma želuca, raka pankreasa i raka dojke.

20. Antitelo ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 18 ili 19, pri čemu je antitelo ili kompozicija dato u kombinaciji sa hemoterapijom ili radioterapijom.