JP2017002075A - レチノイド代替物およびオプシンアゴニスト、ならびにそれらの使用法 - Google Patents

Abstract

【課題】レチノイド補充物およびオプシンアゴニストとしての合成レチノイド組成物およびその使用法を提供すること。【解決手段】本発明は脊椎動物視覚系の光受容体機能を回復または安定化する方法を提供する。この方法は、有効量の合成レチノイドをヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与して光受容体機能を回復または安定化させ、および／またはレチノイドレベル不足の影響を改善する。この合成レチノイドは脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は２００３年３月１４日出願の米国仮特許出願第６０／４５５，１８２号の利益を主張する。この開示は参考として本明細書に組み込まれる。

（連邦政府が後援する研究または開発の下で行われる発明の権利に関する陳述）
本研究は米国公衆衛生総局基金、およびＮＥＩ、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス基金からのＥＹ０１７３０、ＥＹ０２０４８、ＥＹ０８０６１、ＥＹ０９３３９、ＥＹ１１８５０、ＥＹ１３３８５およびからのＥＹ６６３８８の後援を受けた。政府は本発明にある権利を有する。

（発明の背景）
視力の低下または完全失明は、眼の前方領域および／または眼の後方領域の組織または構造の機能異常によって生ずる多くの眼疾患または眼病によって起きる。眼は解剖学的に前部および後部に分けられる。前部は角膜、前眼房、虹彩および毛様体（前脈絡膜）、後眼房および水晶体を含む。後部は視神経を有する網膜、脈絡膜（後脈絡膜）および硝子体を含む。眼球の後部分は網膜、脈絡膜および関連組織を支持している。

眼の前部構造の病変に起因する眼疾患は例えばドライアイ症候群、角膜炎または角膜ジストロフィー、白内障および緑内障である。眼の後部の疾患または病気は一般に網膜または脈絡膜血管の病気またはレーバー先天性黒内障である。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は眼球の後部に関連する特異的疾患の一つであり、高齢者の失明の主な原因である。ＡＭＤは網膜の中心にある小さい円形領域である黄斑を損傷する。黄斑は人が細部を識別したり読んだり運転することのできる領域であるから、その変質は視力低下をもたらし、失明を引き起こすことさえある。網膜は２種類の光受容細胞、杆体および錐体を含む。それらは光を電気シグナルに変える。その後、脳はこれらのシグナルを画像に変える。黄斑には錐体細胞が豊富にあり、それらが中心視力をもたらす。ＡＭＤ患者では中心視力は低下するが末梢視は維持される。

ＡＭＤには幾つかのタイプがある。「ドライ」（非滲出性）型がＡＭＤ症例の約９０％を占める。「ウェット」（滲出性）型はＡＭＤ患者の約１０％に過ぎない。しかし、ウェット型はドライ型より深刻であり、この症例の約９０％がこの病気に起因して重症の視力喪失をおこす。ウェット型ＡＭＤは、黄斑のすぐ下にＣＮＶ（脈絡膜新生血管）と呼ばれる小さい異常な漏出性血管の発生を伴って突然発症するのが普通である。大部分の患者ではこれは瘢痕となり、ゆがみ、盲点および機能性盲目を含む重症中心視力喪失をおこす。

網膜下の異常な黄色沈着物である結晶腔などのＡＭＤの兆候は、正常視力の患者にも存在することがある。結晶腔は網膜下の黄色物質の小斑点のように見える。それらは網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルーフ膜との間に蓄積する細胞外物質の付着物である。ＲＰＥは杆体および錐体細胞の消耗された先端を取り込み、それらに必要な栄養（ビタミンＡ誘導体など）を与える特殊な細胞層である。ブルーフ膜はＲＰＥを下の脈絡膜循環から隔てる非細胞性構造（大部分がコラーゲンからなる）である。上記脈絡膜循環は杆体、錐体およびＲＰＥ細胞に血液を供給する。通常４０歳以上のヒトの眼には普通、小さい結晶腔がごくわずかに形成される。これに対してＡＭＤではほとんど常に結晶腔が次から次へと形成されている。結晶腔には２種類ある。硬結晶腔は小さい固体の沈着物であり、少数存在する場合には無害であると思われる。軟結晶腔はより大きく、不明瞭な境界を有するようである。軟結晶腔がＲＰＥとブルーフ膜との間に生成すると、それらはＲＰＥを持ち上げ、これら二つの層を分離させる。

結晶腔はウェット型ＡＭＤの異常血管の遥か以前に発生する。軟結晶腔の次の３つの特徴はＣＮＶ発生のリスク因子である：５個以上の結晶腔沈着物；６３マイクロメータより大きい結晶腔（人の毛髪の太さとほぼ同じ）；および結晶腔沈着物の凝集。ある証拠によれば軟結晶腔が異常血管の広がりを促す手段であることが示唆されているが、それらが血管伸長（血管新生）を刺激するのか、または単にＲＰＥを持ち上げることによって血管が伸長するための空間を形成するだけなのかは明らかでない。

血管の２網目構造が網膜に栄養を供給する。一つは網膜表面にあり、他の一つは網膜の深部、ブルーフ膜の外側にある。ＡＭＤの異常血管は脈絡膜循環と呼ばれる下方血管網目構造から発生する。これらの血管はブルーフ膜を通過して、ＲＰＥの下に広がる。血液および体液はこれらから漏出し、光受容体細胞を変性させ、黄斑をその下にある細胞から剥離させる。

視野がわずかにぼやけ、またはよじれるのがＡＭＤの最も一般的な症状である。ドライ型ＡＭＤを伴う視力喪失は徐々に進行するのが普通であり、ウェット型ＡＭＤによる視力喪失はより速く進行し、数日または数週間で発生する。片方の眼がウェット型ＡＭＤになった患者はもう片方の眼にＣＮＶが発生するリスクが増大する。そのリスクの大きさは第二の眼の状態によって種々様々である。多数の大きい結晶腔を有する眼、黄斑に異常な色素変化がある眼、および高血圧の病歴を有する患者ではそのリスクは大きい。

今ではＡＭＤは西欧諸国における法的盲の主因である。ＲＰＥにおいて進む反応は酸化生成物を作り出し、続いてこれが細胞死および新生血管形成をもたらす。この過剰な代謝はＲＰＥ下に結晶腔を形成させる。

その他の眼疾患も眼の光受容体機能に影響を与える。また、多くの異なる遺伝子の欠陥によって生ずる病気に色素性網膜炎がある。それらは全て、最終的に同じ経過を辿る。まず夜盲症および周辺視野の喪失にはじまり、視野狭窄が進行し、結局は完全盲目になる患者が多い。主に杆体光受容体が侵されるのが普通であるが、この病気を起こす遺伝子欠陥の大部分は、杆体細胞に発現する遺伝子に起きるのがほとんどで、その遺伝子にしか起きないこともある。

色素性網膜炎の一つの常染色体優性型はオプシンのアミノ酸置換を含み、言いかえるとアミノ酸２３のプロリンのヒスチジン置換を含む。この欠陥は全ての色素性網膜炎症例の１０−２０％の原因である。この異常オプシン蛋白が蛋白凝集物を形成し、それが結局は細胞死を起こす。

レーバー先天性黒内障は出生時または生後間もなく小児を冒す非常にまれな小児疾患である。それは杆体も錐体も冒す。この病気に関連する二、三の異なる遺伝子欠陥がある。これらにはＲＰ６５およびＬＲＡＴ蛋白をコードする遺伝子が含まれる。いずれの場合も、ヒトは１１−シス−レチナールを十分量作ることが不可能になる。ＲＰ６５欠損のヒトではＲＰＥにレチニルエステルが形成される。ＬＲＡＴ欠損患者はエステル類を作ることができず、したがって余分なレチノイド類を分泌することができない。

白点状網膜炎は杆体に１１−シス−レチナール欠乏を示すもう一つの型の色素性網膜炎である。加齢は１１−シス−レチナールの不足により、夜の視野低下やコントラスト感度の喪失も起こす。過剰の非結合オプシンは視覚変換系を無作為に刺激すると考えられる。これは上記系にノイズを生成し、そのため、さらによく見えるようになるには、多量の光とさらに大きいコントラストが必要になる。

先天性停在性夜盲（ＣＳＮＢ）および白点眼底は夜盲症としてあらわれる疾患の一群であるが、色素性網膜炎におけるような進行性の視力低下はない。ＣＳＮＢの幾つかの型は１１−シス−レチナールの再循環の遅れが原因である。白点眼底は最近までＣＳＮＢの特殊な症例と考えられていた。その際網膜の外観が異常で、網膜に小さい白点が無数にあらわれる。最近、色素性網膜炎より遥かに遅いとはいえ、これも進行性疾患であることが示された。これは１１−シス−レチナールの循環の遅れにつながる遺伝子欠陥によっておきる。

現在のところ、レチノイド欠乏のための治療法はほとんどない。抗酸化性ビタミンと亜鉛とを組み合わせる一方法は、低い回復効果をもたらすに過ぎない。そこで、光受容体機能を回復または安定化し、不十分な内因性レチノイドレベルの影響を改善する組成物および方法が必要である。

（発明の簡単な概要）
本発明は脊椎動物視覚系の光受容体機能を回復または安定化する方法を提供する。合成レチノイドをヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与して光受容体機能を回復または安定化し、および／またはレチノイドレベル不足の影響を改善することができる。

一局面において、脊椎動物の眼の光受容体機能を回復する方法が提供される。一般にこの方法は、眼に内因性欠乏症を有する脊椎動物に有効量の合成レチノイドを薬学的に受容可能なビヒクルと共に投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。この合成レチノイドは点眼、眼内注射または眼周囲注射などによって眼に局所投与することができる。合成レチノイドを脊椎動物に経口投与することもできる。

また別の局面において、脊椎動物の眼の内因性レチノイドの需要をへらす方法も提供される。一般にこの方法は薬学的に受容され得るビヒクル中の合成レチノイドを眼に投与する工程を包含し、その際合成レチノイドは脊椎動物の眼の中でオプシンと結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある種の実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。欠乏している内因性レチノイドは例えば１１−シス−レチナールであり得る。

また別の局面において、脊椎動物の眼の光受容体機能の喪失を改善する方法が提供される。その方法は一般に、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを脊椎動物の眼に予防的に投与する工程を包含する。この合成物は、オプシン蛋白に結合して機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば経口投与または局所投与することができる。合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。

その他の局面において、視力低下を起こした、または視力低下の発生リスクのある被験体のための処置を選択する方法が提供される。その方法は一般的にその被験体が標準的被験体に比較して内因性レチノイドレベルの低下を示すかどうかを確認し、その被験体に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは被験体の眼の中でオプシンに結合する。被験体は例えばレーバー先天性黒内症、白点状網膜炎、先天性停在性夜盲、白点眼底または加齢性黄斑変性を有するヒトであり得る。ある実施形態において、欠乏している内因性レチノイドは１１−シス−レチナールである。

合成レチノイドは、脊椎動物の眼に局所投与するなど、経口的または局所的に脊椎動物に投与できる。合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。

もう一つの局面において、薬学的に受容可能なビヒクル中の合成レチノイドを含む眼科用組成物が提供される。合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。眼科用組成物は例えば点眼剤、眼内注射溶液または眼周囲注射溶液でよい。

その他の関連する局面において、薬学的に受容可能なビヒクル中のオプシン結合合成レチノイドを含む経口投与形態が提供される。この合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、上記合成レチノイドは９−シス−レチナールである。

また別の局面において、脊椎動物のレーバー先天性黒内障を処置する方法が提供される。この方法は一般に被験体に、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼の中でオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。その他の実施形態においては、合成レチノイドが９−シスレチナールでないという条件で、その合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。その他の実施形態においては、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。

合成レチノイドは例えば眼に局所投与できる。ある実施形態において、合成レチノイドは点眼、眼内注射、眼周囲注射などによって局所投与できる。合成レチノイドは被験体に経口投与することもできる。

また別の局面において、脊椎動物被験体の白点状網膜炎（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｕｎｃｔａｔａ Ａｌｂｅｓｃｅｎｓ）、先天性停在性夜盲（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ Ｎｉｇｈｔ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）または白点眼底（Ｆｕｎｄｕｓ Ａｌｂｉｐｕｎｃｔａｔｕｓ）を処置する方法を提供する。一般的にその方法は被験体に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼においてオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。その合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。

合成レチノイドは例えば眼に局所投与できる。合成レチノイドは例えば点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与できる。合成レチノイドを被験体に経口投与することもできる。

もう一つの局面において、脊椎動物被験体の加齢性黄斑変性を処置する方法が提供される。その方法は一般にその被験体に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼においてオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。例えば合成レチノイドはその眼のなかの遊離オプシンに結合することができる。

合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。幾つかの実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。その合成レチノイドは例えば眼に局所適投与され得る。その合成レチノイドは例えば点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与できる。その合成レチノイドは上記被験体に経口投与することもできる。

もう一つの局面において、加齢脊椎動物被験体における夜間視力またはコントラスト感度の喪失を処置または予防する方法が提供される。その方法は一般に、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを上記被験体に投与する工程を包含する。合成レチノイドは上記脊椎動物の眼においてオプシンに結合し、オプシン／合成レチノイド複合体を形成する。例えば合成レチノイドは眼のなかの遊離オプシンに結合することができる。

上記合成レチノイドは例えば式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールである。上記合成レチノイドは例えば眼に局所投与され得る。局所投与の適切な方法は例えば点眼剤、眼内注射または眼周囲注射などを含む。合成レチノイドは被験体に経口投与することもできる。ある実施形態において、合成レチノイドは被験体に予防的に投与される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
脊椎動物の眼の光受容体機能を回復させる方法であって、内因性異常を有する脊椎動物に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含し、ここで、該合成レチノイドは、該脊椎動物の眼の中のオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、方法。
（項目２）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記内因性レチノイド異常が、加齢性黄斑変性、レーバー先天性黒内障、白点状網膜炎、先天性停在性夜盲または白点眼底に関連する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記合成レチノイドが、前記脊椎動物に経口投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
脊椎動物の眼における、内因性レチノイドに対する要求をへらす方法であって、以下：
該眼に、薬学的に受容可能なビヒクル中の合成レチノイドを投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。
（項目９）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記内因性レチノイドが、１１−シス−レチナールである、項目８に記載の方法。
（項目１２）
脊椎動物の眼の光受容体機能の喪失を回復させる方法であって、以下：
薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該脊椎動物の眼に予防的に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドがオプシン蛋白に結合して、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。
（項目１３）
前記合成レチノイドが、前記眼を備える脊椎動物に経口投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記合成レチノイドが、前記脊椎動物の眼に局所投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
低下した視力を有する被験体のための処置を選択する方法であって、以下：
該被験体が、標準被験体と比較した場合に内因性レチノイドレベルの欠乏を示しているか否かを決定する工程；および、
薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは、該被験体の眼のオプシンに結合する、工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記被験体が、レーバー先天性黒内障、白点状網膜症、先天性定常的夜盲、白点眼底または加齢性黄斑変性を有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記内因性レチノイドが、１１−シス−レチナールである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記眼を備える前記脊椎動物に合成レチノイドが経口投与される、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記合成レチノイドが、前記脊椎動物の眼に局所投与される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記合成レチノイドが式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目１７に記載の方法。
（項目２４）
薬学的に受容可能なビヒクル中の合成レチノイドを含む、眼科用組成物。
（項目２５）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）
前記眼科用組成物が、点眼剤、眼内注射溶液または眼周囲注射溶液を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２８）
薬学的に受容可能なビヒクル中にオプシン結合性合成レチノイドを含む、経口投与形態。
（項目２９）
前記オプシン結合性合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
脊椎動物被験体のレーバー先天性黒内障を処置する方法であって、以下：
薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは、該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。
（項目３２）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記合成レチナールが、前記眼に局所投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３７）
脊椎動物被験体の白点状網膜炎、先天性停在性夜盲または白点眼底を処置する方法であって、以下：、
薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは、該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。
（項目３８）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
脊椎動物被験体の加齢性黄斑変性を処置する方法であって、以下：
薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。
（項目４４）
前記合成レチノイドが、前記眼の遊離オプシンに結合する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
加齢脊椎動物被験体における夜間視力またはコントラスト感度の喪失を処置または予防する方法であって、以下：
薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、オプシン／合成レチノイド複合体を形成する、工程、
を包含する、方法。
（項目５１）
前記合成レチノイドが、前記眼の遊離オプシンに結合する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記合成レチノイドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩまたはＸＩＩＩの合成レチノイドを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記合成レチノイドが、９−シス−レチナールである、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目５０に記載の方法。
（項目５７）
前記合成レチノイドが、前記被験体に予防的に投与される、項目５０に記載の方法。
（項目５８）
前記被験体がヒトである、項目５０に記載の方法。

９−シス−レチナールを胃管栄養法により投与したＲｐｅ６５−／−マウスにおけるレチノイドレベルの変化およびＲＰＥとＲＯＳとの界面の変化。図１Ａ、Ｒｐｅ６５−／−マウスの全トランス−レチニルエステルレベル（白丸）と比較したＲｐｅ６５＋／＋の全トランス−レチニルエステル（黒丸）および１１−シス−レチナール（黒四角）のレベル（年齢の関数として）。図１Ｂ、９−シス−レチナール処置および未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスのエステル分析。Ｒｐｅ６５−／−マウスをＰＮＤ７日目から開始して１日おきに、齢１カ月になるまで９−シス−レチナール２５μｇで処置した。ｙ軸の目盛りに注意されたい。図１Ｃ、Ｒｐｅ６５−／−マウス（黒色のデータ点を有する灰色の線）における全トランス−レチニルエステルの齢に関連した蓄積と、９−シス−レチナールをＰＮＤ７日目から（左パネル）（１日おきに２５μｇ、そしてＰＮＤ３０日後に９−シス−レチナールを１週間に１回胃管栄養法により投与（２５０μｇ））またはＰＮＤ３０日目から（右パネル）９−シス−レチナール（２５０μｇ）を１週間に１回胃管栄養法により投与した動物のエステルレベル（丸）とを比較。処置Ｒｐｅ６５−／−マウスのイソ−ロドプシンレベルが、１１−シス−レチニルオキシムとして測定され、三角形によって示される。図１Ｄ、９−シス−レチナールで処置したＲｐｅ６５マウスにおけるＲＰＥ−ＲＯＳ界面の変化。Ｒｐｅ６５−／−マウスをＰＮＤ７、１１および１５に９−シス−レチナール（各２００μｇ）で処置し、それらがＰＮＤ３０（パネルｃおよびｄ）およびＰＮＤ９０（パネルｅおよびｆ）になったときに分析した。Ｒｐｅ６５マウス−／−をＰＮＤ３０において９−シス−レチナール（各２００μｇ）で処置し、それらがＰＮＤ１２０になったときに分析した（パネルｇおよびｈ）。ＰＮＤ７およびＰＮＤ３０の未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスからの対照網膜を最上部に示す（それぞれパネルａおよびｂ）。早期に処置したマウスでは一部にだけ詰まった脂質様小滴があり（左側、パネルｃの矢印）、全ての処置マウスではＲＰＥ−ＲＯＳプロセスのかなりの改善が認められた（右側）。スケール、１μｍ。 ９−シス−レチナールを胃管栄養法により投与したＲｐｅ６５−／−マウスにおけるイソ−ロドプシンレベルに与える光曝露の影響、および９−シス−レチナールでの長期処置後のＥＲＧの反応。図２Ａ、齢１カ月のＲｐｅ６５−／−マウスに９−シス−レチナールの単回用量（２．５ｍｇ）を胃管栄養法により投与し、１２時間 明／暗サイクル下に、または一定の暗所に３７日間保持し、イソ−ロドプシンレベルを比較した（ｎ＝４）。図２Ｂ、齢６カ月のＲｐｅ６５−／−マウスのロドプシンまたはイソ−ロドプシンのレベル。野生型マウスのロドプシンレベル（カラムａ）を、齢１カ月で４日間隔で２回、９−シス−レチナール（各２．５ｍｇ）で処置したＲｐｅ６５−／−マウス（カラムｃ）、および３カ月間隔（カラムｄ）または４カ月間隔（カラムｅ）で２回処置したＲｐｅ６５−／−マウスのイソ−ロドプシンと比較した。未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスではロドプシン、イソロドプシンは検出されなかった（カラムｂ）（ｎ＝４）。図２Ｃ、Ｒｐｅ６５＋／＋マウス、Ｒｐｅ６５−／−マウス、９−シス−レチナールで処置したＲｐｅ６５−／−マウス、およびＲｐｅ６５−／−Ｒｇｒ−／−マウスにおけるフリッカーＥＲＧの強度依存性反応。フリッカー記録は固定周波数（１０Ｈｚ）で０．０００４０−４１ｃｄ・ｓ／ｍ^２の強度範囲で得られた。左パネル：Ｒｐｅ６５＋／＋マウス；右パネル：処置した、または処置しない（それぞれ白丸および黒丸）Ｒｐｅ６５−／−、および処置しないＲｐｅ６５−／−Ｒｇｒ−／−マウス（黒三角形）。 Ｒｐｅ６５＋／＋マウス（四角形）、および２．５（黒丸）、１．２５（白丸）、０．２５（黒三角形）、および０ｍｇ（黒三角形と同じ線上の黒丸）の９−シス−レチナールで処置したＲｐｅ６５−／−マウスの平均刺激反応曲線（ｎ＝５）。光感受性の差は、平均データを指数関数的飽和の方程式にフィットさせて得られるフラッシュ強度（Ｉ０）の半飽和を比較することによって評価した。

上記式中、Ｒは反応のピーク振幅、Ｒｍａｘは最大反応の振幅、ｉはフラッシュ強度をフォトン／μｍ^２であらわしたものである。実線はＩ０を有するデータにフィットさせた指数的飽和関数である（等価な５００ｎｍフォトン／μｍ^２）：２５（Ｒｐｅ６５＋／＋）、１６４（２．５）、１９９５（１．２５）、３９２９（０．２５）、および３７１４（０ｍｇの９−シス−レチナール）。挿入図は、Ｒｐｅ６５＋／＋杆体における定常的バックグラウンド照明（３３６等価的５００ｎｍフォトン／μｍ^２／ｓ、黒色曲線）による反応速度、および９−シス−レチナール１．２５ｍｇで処置したＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体において暗光による（遊離オプシン）反応速度を示す。いずれも同程度（約４倍）順応している。各曲線は単一杆体からのものであり、１０−２０フラッシュの平均値、６．２５（野生型）または９１０（Ｒｐｅ６５−／−１．２５ｍｇ９−シス−レチナール）である（５００ｎｍフォトン／μｍ２／フラッシュ）。
１１−シス−７−環−レチナール異性体の光感受性および眼特異的ＲＤＨの基質特異性。図４Ａ、１１−シス−７−環−レチナール類および１１−シス−７−環−ロドプシンの光感受性。退色研究は「方法および材料」に記載したように行われた（実施例２（下記））。各異性体からのオキシム形成の条件は、以下に図４Ｃについて記載される。１１−シス−ＲＤＨ（界面活性剤で精製したヒト組換え１１−シス−ＲＤＨ−Ｈｉｓ６）および全トランス−ＲＤＨ（Ｓｆ９細胞に発現するｐｒＲＤＨ）の活性を、「方法および材料」の部（実施例２（下記））に記載したように、１１−シス−環−レチナール異性体の還元による対応［１５−^３Ｈ］レチノール同族体の生成およびプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＨ（１１−シス−ＲＤＨに関連）またはプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＰＨ（ｐｒＲＤＨに関連）（３１）をモニターすることによって測定した。生成物を標準相ＨＰＬＣによって分析し、集め、シンチレーション計数によって定量した。図４Ｂ、１１−シス−環−ロドプシン異性体の精製を各工程においてＵＶ分光法によってモニターした。曲線ａ、１１−シス−環−ロドプシン異性体３（１０ｍＭ ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドにより溶解）の７１，７００×ｇ上清；曲線ｂ、上記上清をコンカナバリンＡ−セファロース４Ｂカラムを通過させた後の素通りフラクション（「方法および材料」、実施例２を参照（下記））；曲線ｃ、コンカナバリンＡ−セファロース４Ｂをよく洗浄した後のフラクション：曲線ｄ、精製した１１−シス−７−環−ロドプシン異性体３；曲線ｅ、光により退色した１１−シス−７−環−ロドプシン異性体３。図４Ｃ、溶液中の１１−シス−７−環−レチナール異性体１−４のオキシム誘導体の標準相ＨＰＬＣ分析（ＨＰＬＣ曲線ｉ−ｖｉｉｉ、１’および１”：１１−シス−７−環−レチナール異性体１オキシム、それぞれｓｙｎおよびａｎｔｉ；２’および２”：１１−シス−７−環−レチナール異性体２オキシム、それぞれｓｙｎおよびａｎｔｉ；３’および３”：１１−シス−７−環−レチナール異性体３オキシム、それぞれｓｙｎおよびａｎｔｉ；および４’および４”：１１−シス−７−環−レチナール異性体４オキシム、それぞれｓｙｎおよびａｎｔｉ）およびロドプシン３の標準相ＨＰＬＣ分析（ＨＰＬＣ曲線ｉｘおよびｘ）。これらは光退色を伴わずに（ｉ、ｉｉｉ、ｖ、ｖｉｉ、およびｉｘ）、または光退色を伴って（ｉｉ、ｉｖ、ｖｉ、ｖｉｉｉおよびｘ）行われた。１１−シス−７−環−ロドプシンをｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドで可溶化し、コンカナバリンＡ−セファロース４Ｂカラム上で精製した。精製フラクションを光退色し、発色団（１つまたは複数）をヒドロキシルアミンで誘導体化し、「方法および材料」（実施例２、下記）に記載のようにＨＰＬＣで分析した。対照として、異性体１−４も同じ溶出緩衝液中で、光退色と共にまたは光退色せずに誘導体化した。＊は少量の化合物２を含む（化合物２と化合物３との間に分離されていないピークがあるため）；ｍＡＵ、ミリ吸収単位。 異なるレチノイド類に向かうＬＲＡＴ活性。４種類の１１−シス−環−７−環−レチノール異性体に関するＬＡＲＴ活性の時間的経過、独立的２実験の平均。下方の図はＬＡＲＴの天然基質である全トランス−レチノールに関するＬＡＲＴ活性である。アッセイは「方法および材料」（実施例２（下記））に記載のように行われた。 光散乱法を用いて測定した、ＧＴＰの存在下におけるＧｔの解離。図６Ａ、薄暗いフラッシュ（ｄｉｍ ｆｌａｓｈ）（Ｒｈ^＊／Ｒｈ＝２．４×１０^−４）によって発生させた、ｐＨ７．４および６．４の天然サンプルの解離シグナル。これらのデータは周知のｐＨ／速度プロフィールによって、ｐＨ７．４において、ｐＨ６．４と比較して受容体のより高い活性が認められることを示す。図６Ｂおよび６Ｃ、明るいフラッシュ（Ａと比較して１３５０倍の強度）によって発生させた、ｐＨ６．４および７．４における１１−シス−７−環（異性体１）（Ｂ）または１１−シス−６−環（Ｃ）同族体でそれぞれ再生したＲｈ光生成物の解離シグナル。図６Ｄ、１１−シス−６−環−Ｒｈの、ｐＨ７．４におけるＮＨ_２ＯＨ（２．５ｍＭ）に対する感受性。

（発明の詳細な説明）
本発明は脊椎動物の視覚系における光受容体機能を回復または安定化する方法を提供する。合成レチノイド類を投与して光受容体機能を回復または安定化し、および／またはレチノイドレベル不足の影響を改善することができる。例えば合成レチノイドを１１−シス−レチノイド代替物および／またはオプシンアゴニストとして作用させることによって、光受容体機能を回復または安定化することができる。合成レチノイドは脊椎動物視覚系に対するレチノイド不足の影響を改善することもできる。合成レチノイドを脊椎動物に予防的または治療的に投与することができる。適切な脊椎動物としては例えばヒトおよび非ヒト脊椎動物が含まれる。適切な非ヒト脊椎動物としてはイヌ、ネコ、ウマおよびその他の家畜が含まれる。

合成レチノイド類は１１−シス−レチナールまたは９−シス−レチナールから誘導されるレチナール類であり、または９−シス−レチナールである。幾つかの実施形態において、「合成レチノイド」は「合成シス−レチノイド」である。その他の実施形態において、合成レチノイドは、これら合成レチノイドが９−シス−レチナールでない場合は、１１−シス−レチナールか９−シス−レチナールの誘導体である。また別の実施形態において、合成レチノイドはビタミンＡではない。幾つかの実施形態において、合成レチノイドは例えば内因性レチノイドのレベル度を補充するレチノイド代替物であり得る。その他の実施形態において、合成レチノイドはオプシンに結合し、オプシンアゴニストとして機能し得る。ここに使用する用語「アゴニスト」とはオプシンに結合し、オプシン／合成レチノイド複合体の光反応能力を助長する合成レチノイドをいう。合成レチノイドはオプシンアゴニストとして内因性レチノイドの需要をへらすことができる。合成レチノイドはオプシンに結合し、機能性オプシン／合成レチノイド複合体を形成するというやり方でオプシンに機能（例えば光受容）を回復させることもできる。その際オプシン／合成レチノイド複合体は杆体また錐体膜の部分にある光子に反応することができる。

合成レチノイドは例えば次のような１１−シス−レチナール誘導体または９−シス−レチナール誘導体を含む；非環式化合物；ポリエチレン鎖長が改変されたレチナール類、例えばトリエン−またはテトラエン−レチナールなど；アルキル、ハロゲンまたはヘテロ原子置換ポリエン鎖などの置換ポリエン鎖を有するレチナール類；トランス−またはシス−固定されたポリエチレン鎖のような修飾ポリエン鎖を有するレチナール類、またはアレンまたはアルキレン修飾を有するレチナール類；および複素環、複素芳香環または置換シクロアルカンまたはシクロアルケン環などの環修飾を有するレチナール類。

幾つかの実施形態において、合成レチノイドは下記の式Ｉであらわされるレチナールであり得る：

上記式中、ＲおよびＲ１は線状、ｉｓｏ−、ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−、およびその他の枝分かれアルキル基ならびに置換アルキル基、置換枝分かれアルキル、ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミドなどから独立的に選択され得る。ＲおよびＲ１は独立的に低級アルキルでよい；これは、１−６炭素原子を有する直鎖または枝分かれアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを意味する。適切な置換アルキルおよび置換枝分かれアルキルとしては、例えば酸素、ヒドロキシル、窒素アミド、アミンハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたアルキル類、枝分かれアルキル類およびシクロアルキル類が含まれる。適切なヘテロ原子としては例えば硫黄、珪素、およびフルオロまたはブロモ置換基がある。

その他の実施形態において、ＲまたはＲ１は例えばヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼンならびに置換シクロアルキルなどのシクロアルキルでよい。適切な置換シクロアルキルとしては例えば酸素、ヒドロキシ、窒素、アミド、アミン、ハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたシクロアルキル類が挙げられる。適切なヘテロ原子としては例えば硫黄、珪素、およびフルオロ−またはブロモ−置換基が挙げられる。

合成レチノイドは下記の式ＩＩの改変されたポリエン鎖長を有する１１−シス−レチナールまたは９−シス−レチナールでもよい：

ポリエン鎖長は１、２、または３つのアルキル、アルケンまたはアルキレン基によって伸長できる。式（ＩＩ）により、各ｎおよびｎ_１は、ｎとｎ_１との合計が少なくとも１であるという条件で、１、２、または３つのアルキル、アルケンまたはアルキレン基から独立的に選択できる。

合成レチノイドは下記の式ＩＩＩの置換ポリエン鎖を有する１１−シス−レチナールまたは９−シス−レチナールの誘導体でもよい：

Ｒ１ないしＲ９の各々は水素、アルキル、枝分かれアルキル、シクロアルキル、ハロゲン、ヘテロ原子などから独立的に選択され得る。適切なアルキルとしては例えばメチル、エチル、プロピル、置換アルキル（例えばヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミドを有するアルキル）などが挙げられる。適切な枝分かれアルキルは例えばイソプロピル、イソブチル、置換枝分かれアルキルなどであり得る。適切なシクロアルキルとして例えばシクロヘキサン、シクロヘプタンおよびその他の環状アルカン類、ならびに置換環状アルカン類、例えば置換シクロヘキサンまたは置換シクロヘプタンなどが挙げられ得る。適切なハロゲンとしては例えば臭素、塩素、フッ素などが挙げられる。適切なヘテロ原子としては例えば硫黄、珪素およびフルオロ−またはブロモ−置換基が挙げられる。適切な置換アルキル、適切な枝分かれアルキルおよび置換シクロアルキルとしては例えば酸素、ヒドロキシル、窒素、アミド、アミン、ハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたアルキル類、枝分かれアルキル類およびシクロアルキル類が挙げられる。典型的実施形態において、合成レチノイドは９−エチル−１１−シス−レチナール、７−メチル−１１−シス−レチナール、１３−デスメチル−１１−シス−レチナール、１１−シス−１０−Ｆ−レチナール、１１−シス−１０−Ｃｌ−レチナール、１１−シス−１０−メチル−レチナール、１１−シス−１０−エチル−レチナール、９−シス−１０−Ｆ−レチナール、９−シス−１０−Ｃｌ−レチナール、９−シス−１０−メチル−レチナール、９−シス−１０−エチル−レチナール、１１−シス−１２−Ｆ−レチナール、１１−シス−１２−Ｃｌ−レチナール、１１−シス−１２−メチル−レチナール、１１−シス−１０−エチル−レチナール、９−シス−１２−Ｆ−レチナール、９−シス−１２−Ｃｌ−レチナール、９−シス−１２−メチル−レチナール、１１−シス−１４−Ｆ−レチナール、１１−シス−１４−メチル−レチナール、１１−シス−１４−エチル−レチナール、９−シス−１４−Ｆ−レチナール、９−シス−１４−メチル−レチナール、９−シス−１４−エチル−レチナールなどである。

合成レチノイドはその他に修飾された環状構造を有する１１−シス−レチナールまたは９−シス−レチナールの誘導体でもよい。適切な例は、例えば、下記の式ＩＶ、ＶおよびＶＩそれぞれであらわされる、環修飾を含む誘導体、芳香族同族体およびヘテロ芳香族同族体を含む。

適用される場合、Ｒ１ないしＲ５の各々またはＲ６は、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミド、ハロゲン、ヘテロ原子などから独立的に選択され得る。適切なアルキルとしては例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどが挙げられる。適切なハロゲンとしては例えば臭素、塩素、フッ素などが含まれる。適切なヘテロ原子は例えば硫黄、珪素または窒素などである。式ＶＩにおいて、Ｘは例えば硫黄、珪素、窒素、フルオロ−またはブロモ置換基でよい。

合成レチノイドはその他に、修飾ポリエン鎖を有する１１−シス−レチナールまたは９−シス−レチナールの誘導体でよい。適切な誘導体としては例えば、ポリエン鎖にトランス／シス−固定構造、６ｓ−固定同族体、ならびに修飾アレン、アルケン、アルキンまたはアルキレン基を有するものが含まれる。一実施形態において、誘導体は下記の式ＶＩＩの１１−ｃｉｓ−固定同族体である：

Ｒは例えば水素、メチルまたはその他の低級アルカンまたは枝分かれアルカンであり得る。ｎは０ないし４であり得る。ｍ＋１は１、２または３である。

特定の実施形態において、合成レチノイドは下記の式ＶＩＩＩの１１−シス−固定同族体である：

ｎは１ないし４でよい。

幾つかの典型的実施形態において、合成レチノイドは９，１１，１３−トリ−シス−７−環レチナール、１１，１３−ジ−シス−７−環レチナール、１１−シス−７−環レチナールまたは９，１１−ジ−シス−７−環レチナールである。

また別の例において、合成レチノイドは式ＩＸの６ｓ−固定同族体である。Ｒ１およびＲ２は水素、メチルおよびその他の低級アルキルおよび置換低級アルキルから独立的に選択することができる。Ｒ３は指示されたいずれかの位置のアルケン基から独立的に選択できる。

その他の実施形態において、合成レチノイドは例えば式Ｘ−ＸＩＩに示されるような９−シス−環縮合誘導体でよい。

また別の実施形態において、合成レチノイドは下記の式ＸＩＩＩであらわされる。

Ｒ１ないしＲ１５の各々は水素、アルキル、枝分かれアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミド、ヘテロ原子などから独立的に選択され得る。適切なアルキルとしては例えばメチル、エチル、プロピル、置換アルキル（ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミドを有するアルキルなど）が挙げられる。適切な枝分かれアルキルは例えばイソプロピル、イソブチル、置換枝分かれアルキルなどでよい。適切なハロゲンとしては例えば臭素、塩素、フッ素などが挙げられる。適切なヘテロ原子は例えば硫黄、珪素、およびフルオロ−またはブロモ置換基が挙げられる。適切な置換アルキルおよび置換枝分かれアルキルとしては例えば酸素、ヒドロキシル、窒素、アミド、アミン、ハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたアルキル類および枝分かれアルキル類が含まれる。ｎおよびｎ_１の各々は、ｎとｎ_１との合計が少なくとも１であるという条件で、１、２、または３つのアルキル、アルケンまたはアルキレン基から独立的に選択され得る。その他に、Ｒ１１−Ｒ１２および／またはＲ１３−Ｒ１４は環状炭素環にアルケン基を含むことができる。ある実施形態において、Ｒ５およびＲ７は一緒になって、例えば式ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩに示されるような、例えば５、６、７または８員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルなどのシクロアルキルを形成することができる。

その他の実施形態において、合成レチノイドは９−シス−レチナールでもよい。この代わりに１１−シス−レチナールを使用することができる。

合成レチノイドの製法は例えば下記の文献に開示されている：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７２：２３２−４２（１９９９）；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．３６：２０８９−９３（１９９７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：３９３３−４１（１９７５）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：３８４−９３（１９８２）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：２７３２−３９（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：４０８−１６（１９９４）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：６２５７−６２（１９９６）；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：３７２−８２（１９９９）：Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．５６：３１−３９（１９９５）；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５６：１２５９−６５（１９８９）；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８３：３４６０−６９（２００２）；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７：４１９８−２０４（２００１）；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｕｒｏｐｅ）５：１１７２−７５（１９９９）；ＦＥＢＳ １５８：１（１９８３）；Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：３２１４−１６（１９８２）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：６０７７−７８（１９８６）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：６１６３（１９８７）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７７７９−８２（１９９０）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：５７５８−５９（１９９７）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１−５８０３−０４（１９９９）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１００２４−２９（２００１）；Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７２９４−３０２（２００２）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６１４８−５３（２００１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２３１５−２４（２００４）；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．−Ｐｅｒｋｉｎ Ｔ．１：１７７３−７７（１９９７）；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．−Ｐｅｒｋｉｎ Ｔ．１：２４３０−３９（２００１）；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９：６４９−５２（１９８４）；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：３５３３−３７（１９９３）；Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ １０２：２７８７−８０６（１９９８）；Ｌｉｐｉｄｓ ８：５５８−６５；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１３：２５９−８３（１９８６）；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４４：８０３−０７（１９８６）；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５４：９６９−７６（１９９１）；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６０：６４−６８（１９９４）；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６５：１０４７−５５（１９９１）；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７０：１１１−１５（２００２）；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７６：６０６−６１５（２００２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９４１２−１６（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４０７２−７６（１９９３）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３４４２−４７（１９９７）；およびＰｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ，Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２３３（１２７０）：５５−７６ １９８８）（これらの開示は参考として本明細書に組み込まれる）。

オプシン蛋白については、例えばオプシン蛋白を発現する発現系によって合成レチノイドを確認できる。適切な動物モデルとしては例えばＲＰＥ６５−／−マウスが含まれる（下記参照）。適切な非ヒト動物モデルはその他にラット、マウス、霊長類の系を含む。このような動物モデルは例えば、染色体内の、オプシンをコードする核酸と、突然変異オプシンをコードする外因性核酸との相同組換えを促進することによって作製され得る。一局面において、相同組換えは次のように行われる；胚幹（ＥＳ）細胞を相同組換えが起きるようにオプシン遺伝子を含むベクターで形質転換し、その後そのＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、その胚盤胞をフォスターマザーに移植すると、その後キメラ動物が誕生する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−９２（１９８９））。このキメラ動物を繁殖させ、その他のトランスジェニック動物を生成することができる。

適切な発現系としては例えばインビトロまたはインビボ系が挙げられ得る。適切なインビトロ系には例えば組み合わせ転写−翻訳系が含まれる。適切なインビボ系には例えばオプシン蛋白を発現する細胞が含まれる。例えば脊椎動物の視覚系の細胞をインビトロ培養のために適合させることができ、或いはオプシン蛋白を発現する組換え細胞系を使用できる。これら細胞系はオプシン蛋白を発現する一般的に安定な細胞系である。合成レチノイドを細胞培養培地に加えて適当な期間培養した細胞によってオプシン／ロドプシンを産生することができる。オプシンおよび／またはロドプシンは分離できる（例えばイムノアフィニティによって）。分離した蛋白サンプルを試験し、形成された色素の量および最大吸収を確認することができる。核酸を脊椎動物に導入する方法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）に開示されている。

オプシン蛋白を発現する組換え細胞系は例えば、オプシン蛋白をコードする発現構成物を適切な細胞系に導入することによって作製され得る。発現構成物は一般的には、オプシン蛋白をコードする核酸に操作可能に結合したプロモータおよび任意に終止シグナルを含む。オプシンをコードする核酸は例えば、データベース（ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーなど）からの情報の使用によって、ポリメラーゼ連鎖反応法によって、またはその他の方法によって得ることができる。例えばオプシンをコードする核酸はハイブリダイゼーションによって得ることができる。（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。特殊な実施形態において、オプシンをコードする核酸は低、中程度または高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションによって得ることができる。

ある実施形態において、オプシンをコードする核酸は高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で得られ得る。制限するものではないが、例として、高ストリンジェンシー条件を用いる操作法は次のようである：ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で６５℃で８時間ないし一晩行う。フィルタを、１００μｇ／ｍｌ変性サーモン精子ＤＮＡおよび５−２０×１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中で６５℃で４８時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄を２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール、および０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で６５℃で１時間行う。続いて０．１×ＳＳＣ中で５０℃にて４５分間の洗浄を行い、その後オートラジオグラフィーを行う。使用できる高ストリンジェンシーのその他の条件は当業者には公知である。（一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。

発現構成物は任意に１つ以上の複製起点および／または選択可能マーカーを含むことができる（例：抗生物質耐性遺伝子）。適切な選択可能マーカーは、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、Ｇ４１８などに対する耐性を与えるものなどを含む。適切な細胞系は例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｔ−ＲＥｘ^ＴＭ−２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびその他の細胞または細胞系を含む。

ロドプシン（オプシンおよび合成レチノイドを含む）のＵＶ−可視スペクトルをモニターし、合成レチノイドがオプシン蛋白とシッフ塩基を形成したかどうかを決定し得る。例えば酸変性、精製蛋白を分析し、約４４０ｎｍの最大吸収が存在するかどうかを決定し、合成レチノイドがオプシン蛋白と共にシッフ塩基を形成するという証拠を与えることができる。その他の実施形態において、ヒドロキシルアミン処理し、そのシッフ塩基が外部環境から隔離されることを確認することができる（下記）。

適切な合成レチノイドはロドプシンの分子モデル化によって選択することもできる。ロドプシン結晶構造の座標は蛋白質データバンク（１ＨＺＸ）（Ｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：７７６−７２（２００１））から入手できる。ある実施形態において、ロドプシンの構造に与えるアミノ酸置換の影響、およびオプシンと１１−シス−レチナール、または合成レチノイドとの接触に与えるアミノ酸置換の影響は分子モデル化によって決定できる。

例証的実施形態において、蛋白質データバンク（１ＨＺＸ）（Ｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：７７６−７２（２００１））からのロドプシン結晶構造のための座標を使用してコンピューターモデルを作成する。例えばＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ ｒｅｌｅａｓｅ ２０００，Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｕｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して水素原子の付加および最適化を行うことができる。結晶水を除去し、細胞外領域における接近可能の隙間に水分子を導入することができる。一般的に水の添加前には最小化は行われない。水層（例えば厚さ５Å）を使用して、ロドプシンの細胞外部分、ならびに極性燐脂質ヘッドと接触している残基を被覆することができる。水分子の全ては、ロドプシンの細胞外半分と同様に、レチナールと共に自由に動くことができる。水のキャップがロドプシンの細胞質部分に置かれない場合は、分子のこの部分を凍結してそのモデルの分解を防ぐことができる。

ある実施形態において、水キャップはロドプシンの細胞外部分に置かれる（燐脂質の極性ヘッドと接触する膜に埋め込まれた部分と共に）。水およびロドプシンの細胞外部分を動けるようにすることができ、その動きは任意の適切な頻度でモデル化される。例えばそのモデル化ロドプシンの動きは１００ｐｓ刺激でモデル化され得る。

合成レチノイドを適切な条件下で、オプシン蛋白／合成レチノイド複合体を形成するのに十分な時間、オプシン蛋白と接触させることができる。オプシン／合成レチノイド複合体の安定性は、本明細書に記載の、または当業者に公知の方法によって測定できる。それが安定性の増加を示すときにはオプシン／合成レチノイド複合体中のオプシンは安定する（例えば、合成レチノイドに結合した場合、遊離オプシン（すなわちレチノイドに結合していない）に比較して、半減期は増加し、ヒドロキシルアミンに対する感受性はより低くなり、アグレソーム蓄積はより少なくなる、など）。

合成レチノイドはインビトロまたはインビボでオプシン蛋白と接触することができる。例えば、オプシン蛋白をインビトロ翻訳系において合成し（例えば小麦胚芽または網状赤血球溶解物の発現系）、合成レチノイドをその発現系に加える。その他の実施形態において、オプシン蛋白を生体外でオプシン蛋白と接触させ、その複合体を脊椎動物の眼に投与することができる。

合成レチノイドをレチノイド欠乏（例えば１１−シス−レチナールの欠乏）、遊離オプシンの過剰、全トランス−レチナールの再循環におけるレチノイド老廃物（下記を参照）または中間物質の過剰などを示す脊椎動物の眼に投与することができる。脊椎動物の眼は野生型オプシン蛋白を含むのが普通である。脊椎動物の眼の内因性レチノイドレベルおよびそのようなレチノイド類の不足を決定する方法は、例えば米国暫定特許出願第６０／５３８，０５１号（２００４年２月１２日出願）に開示されている（この開示は参考として本明細書に組み込まれる）。脊椎動物の眼の内因性レチノイドレベルおよびこのようなレチノイド類の不足を決定する他の方法としては、被験体からのサンプル中のレチノイドの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析などが挙げられる。例えば、レチノイドレベルまたはレチノイドレベルの欠乏は被験体からの血液サンプルから決定できる。

典型的実施形態において、血液サンプルは被験体から得られ、サンプル中のレチノイドの型およびレベルは分離され、標準相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えばＨＰ１１００ＨＰＬＣおよびベックマン、ウルトラスフェア−Ｓｉ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍカラムで、１０％酢酸エチル／９０％ヘキサンを用い、流速１．４ｍｌ／ｍｉｎ．）によって分析することができる。これらレチノイドは例えばダイオード−アレー検出器およびＨＰ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ Ａ．０３．０３ソフトウェアによる３２５ｎｍでの検出により検出できる。レチノイドの欠乏は例えばサンプル中のレチノイドのプロフィールを正常被験体からのサンプルと比較することによって決定できる。

ここに使用する、例えば１１−シス−レチナールなどの内因性レチノイドのレベルの喪失、欠乏または消耗とは、同種の脊椎動物の健康な眼に見いだされるレベルより低い内因性レチノイドレベルをいう。合成レチノイドは内因性レチノイドの需要をへらすことができる。

本明細書に使用する「予防的な」および「予防的に」は合成レチノイドを投与されない匹敵する脊椎動物視覚系と比較して、脊椎動物視覚系の悪化または悪化の進行を阻止するために合成レチノイドを投与することを意味する。用語「回復する」は脊椎動物の視覚系の光受容体機能が、合成レチノイドを投与されない匹敵する脊椎動物視覚系に比較して長期的に（例えば数週間または数カ月にわたって測定して）改善することをいう。用語「安定化する」は、合成レチノイドを投与されない匹敵する脊椎動物視覚系と比較して脊椎動物視覚系の付加的分解が最小になることをいう。

一局面において、脊椎動物の眼はレーバー先天性黒内障（「ＬＣＡ」）を有することが特徴である。この疾患は出生時またはその後間もなくの小児を冒す非常に稀な小児疾患である。それは眼の杆体も錐体も両方冒す。例えばＲＰ６５およびＬＲＡＴ蛋白をコードする遺伝子の幾つかの突然変異がＬＣＡに関係している。両遺伝子の突然変異により、人は１１−シス−レチナールを十分量作ることができなくなる。その結果、１１−シス−レチナールは全くまたは少量しか存在しない。ＲＰ６５欠陥患者では、レチニルエステルがＲＰＥに形成される。ＬＲＡＴ欠陥患者はエステル類を作ることができず、したがって過剰のレチノイドを分泌する。ＬＣＡの場合、合成シスレチノイドを使用して、存在しない、または枯渇した１１−シス−レチナールを補充することができる。

また別の局面において、脊椎動物の眼は白点状網膜炎を有することが特徴である。この疾患は杆体中の１１−シス−レチナールの不足を示す色素性網膜炎の一つの型である。合成シス−レチノイドを使用して、存在しないまたは枯渇した１１−シスレチナールを補充することができる。

また別の局面において、脊椎動物の眼は先天性停在性夜盲（「ＣＳＮＢ」）または白点眼底を有することが特徴である。この疾患群は夜盲という症状を示すが、色素性網膜炎の場合のような進行性視力低下はない。ＣＳＮＢの幾つかの型は１１−シス−レチナールの再循環の遅れによる。白点眼底は最近までＣＳＮＢの特殊な症例と考えられていた。すなわち網膜の外観が異常で、網膜に小さい白点が無数にあらわれる。最近これも、色素性網膜炎に比べて進行は遥かに遅いとはいえ、やはり進行性疾患であることが示された。これは１１−シス−レチナールの循環の遅れに導く遺伝子欠陥によって起きる。こうして、合成レチノイドを投与し、レチノイド補充によって光受容体機能を回復することができる。

また別の局面において、脊椎動物の眼は加齢性黄斑変性（「ＡＭＤ」）を有することが特徴である。種々の実施形態において、ＡＭＤはウェット型かドライ型である。ＡＭＤにおいては、疾患後期の合併症が新生血管を網膜下に増殖させるか、または網膜萎縮をおこすかどちらかによって視力喪失が起きる。特定の理論によって縛られるものではないが、光受容体からの老廃物の過剰生産がＲＰＥに過負荷をかけるのかも知れない。これはオプシンに結合するために使用できる１１−シス−レチナールの欠乏による。遊離オプシンは安定な化合物ではなく、光が与えられなくても視カスケードの生化学反応の開始を自発的に起こすことができる。

脊椎動物の眼に合成レチノイドを投与すると、１１−シス−レチナールの欠乏およびオプシンの自発的誤開始を抑制することができる。ある実施形態において、合成レチノイドの投与は老廃物の生成を低減しおよび／またはドルーゼ腔形成を減少させ、視力喪失（例えば脈絡膜血管新生および／または脈絡網膜萎縮など）を軽減し、または遅らせることができる。

また別の局面において、合成レチノイドは中高年者に投与される。本明細書に使用する中高年者被験体とは一般的に最低４５、または最低５０、または最低６０または最低６５歳の人である。被験体は、低下した夜間視力および／または低下したコントラスト感度をもつことを特徴とする加齢眼を有する。過剰の未結合オプシンは視覚伝達系をランダムに励起する。これはその系にノイズを作り出し、その結果、よく見るためにより多い光およびより多いコントラストが必要になる。これらの遊離オプシン分子を合成レチノイドで抑制すると、自発的誤開始が減少し、シグナル対ノイズ比は高まり、それによって夜間視力およびコントラスト感度は改善する。

合成レチノイドはヒトまたはその他の非ヒト脊椎動物に投与できる。合成レチノイドは任意の適切な手段、例えば経口又は局所的投与によって眼に供給することができる。局所的投与の仕方としては点眼、眼内注射または眼周囲注射などが挙げられ得る。眼周囲注射は一般的には合成レチノイドを結膜または腱（眼を覆っている線維組織）に注射することを含む。眼内注射は一般的には合成レチノイドを硝子体に注射することを含む。幾つかの実施形態において、投与は非侵襲的で、点眼または経口投与型によって行われる。

合成レチノイドは薬学的に受容可能なビヒクルならびに当業者にとって日常的な方法を用いて投与するように処方できる。ビヒクルは合成レチノイドの溶解度によって選択される。適切な眼科的組成物は点眼や注射などによって眼に局所的に投与するものを含む。点眼の場合は、処方物は任意に、例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；燐酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝剤；ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエート（ポリソルベート８０ともいう）、ポリオキシステアレート４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油などの界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデンテートナトリウムなどの安定剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン類などの保存料；およびその他の諸成分を含むこともできる。保存料は例えば約０．００１ないし約１．０％重量／容量のレベルで用いられる。処方物のｐＨは、通常、眼科的処方に容認できる範囲内、例えば約ｐＨ４ないし８の範囲内である。

注射の場合、合成レチノイドは、注射用リポソーム溶液などの形で、注射用食塩溶液として提供できる。眼内および眼周囲注射は当業者には知られており、例えばＯｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｄ．，Ｇ．Ｌ．Ｓｐａｅｔｈ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｙｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐ．８５−８７（１９９０）など多くの出版物に記載されている。

適切な経口投与型には例えば硬または軟ゼラチン、メチルセルロースまたは消化管で溶解し易いその他の適切な材料からなる、錠剤、丸薬、サチェット、またはカプセルが含まれる。適切な無毒性固体賦形薬を使用することができ、それらには例えば医薬品級のマンニット、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどがある。（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ 「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１７Ｅｄ，Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８５）を参照されたい）。

合成レチノイドの投与量は被験体の臨床的状態、症状および年齢、投与型などに応じて適切に選択できる。点眼の場合、合成レチノイドは単回量として約０．０１ｍｇから、約０．１ｍｇから、または約１ｍｇから、約２５ｍｇまで、約５０ｍｇまで、または約９０ｍｇまで投与できる。点眼剤は必要に応じて１日に１回以上投与することができる。注射の場合、適切な量は例えば約０．０００１ｍｇ、約０．００１ｍｇ、約０．０１ｍｇ、または約０．１ｍｇから約１０ｍｇまで、約２５ｍｇまで、約５０ｍｇまでまたは約９０ｍｇまでの合成レチノイドを週に１ないし４回投与できる。その他の実施形態において、約１．０ないし約３０ｍｇの合成レチノイドを週に１ないし３回投与できる。

経口投与量は一般的に約１．０ないし約１０００ｍｇを１日１ないし４回以上投与できる。経口投与の典型的投与量は約１０ｍｇから約２５０ｍｇを１日１ないし３回の範囲である。

下記の実施例は単に本発明の種々の局面の説明に過ぎず、本発明を制限するものではない。

（実施例１：）
視プロセスは１１−シス−レチナールの全トランスーレチナールへの光異性化によって開始する。持続的視力を得るためには１１−シス−発色団が全トランス−レチナールから再生しなければならない。これには主要な網膜色素上皮蛋白であるＲＰＥ６５が必要である。ＲＰＥ６５遺伝子の破壊は網膜色素上皮における全トランス−レチニルエステルの大量蓄積、１１−シス−レチナールの欠乏、したがってロドプシンの欠乏、および究極的には失明を起こす。Ｒｐｅ６５−／−マウスにおいて、９−シス−レチナールの経口投与はイソロドプシン（杆体の光色素）を生成し、エレクトロレチノグラムにおいて光感受性を回復することが以前報告された（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８６２３−２８（２０００））。この研究において、９−シス−レチナール投与による早期介入は、レチナールエステル蓄積を著しく減少し、処置後６カ月より長く、杆体網膜機能を維持した。単一細胞の記録において、杆体の光感受性は再生したイソロドプシン量の関数であることが示された；多量は正常な感受性および動態を有する杆体反応を回復した。未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスでは残留杆体機能の著しい低下が認められた。この杆体機能は、レチノイド分析によって示されるように、網膜における全トランス−レチナールの光変換による１１−シス−レチナールの生産が低効率であるためらしい。これらの研究は、薬学的介入により、暗所で飼育されたＲｐｅ６５−／−マウスの視機能の長期持続的保持が引き起こされ、遺伝的早発性盲目および網膜変性の一群であるＲＰＥ６５遺伝子の突然変異による、レーバー先天性黒内障と診断されたヒトの視力を回復させる有用な治療法が得られることを示す。

（序論）
レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、出生時からの盲目または重度視覚障害を起こす一群の疾患である。全ては杆体および錐体両方の機能異常、微弱な（記録不能の）エレクトロレチノグラム（ＥＲＧ）、および眼振を示す。彼らは早発性網膜萎縮を起こし、時が経つにつれて網膜の色素性変化、したがって「黒内障」を伴い得る。ＬＣＡは種々の異なる細胞機能を破壊する少なくとも５つの異なる遺伝子の欠陥によって起きる。

全ＬＣＡ症例の約１２％において、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）の６５−ｋＤａ蛋白（ＲＰＥ６５）遺伝子が無能力である。ＲＰＥ６５はＲＰＥ細胞において顕著に発現し、そこでレチノイドサイクルに重要な役割を演ずる。これは光受容体およびＲＰＥ細胞の両方を含む、密接に関連し合う一組の事象である。視物質の発色団（１１−シス−レチナール）の光異性化は全トランス−レチナールを生成する。それは光受容体において還元され、ＲＰＥに運搬され、再び１１−シス−レチナールに変換され、その後光受容体に戻され、元の視物質を再生する。レチノイド・プロセッシングにおけるＲＰＥ６５の正確な機能は知られていない。

Ｒｐｅ６５のための遺伝子を除去した（Ｒｐｅ６５−／−）遺伝子工学的マウスは、網膜の形態、機能および生化学に変化を示し、それはヒトＬＣＡ患者に見られる変化に酷似している。Ｒｐｅ６５−／−マウスでは杆体および錐体両方の機能はひどく破壊され、ＥＲＧは非常に弱まる。全トランス−レチニルエステルがＲＰＥ細胞に脂質様滴となって劇的過剰に蓄積し、網膜の変性もある。このため、Ｒｐｅ６５−／−マウスはＬＣＡの細胞レベルおよび分子レベルでの起源および結果を洞察する機会を与え、種々の治療法を試験する手段をも与える。

本研究はＲｐｅ６５−／−マウスに起きる生化学および機能の変化の周到な研究の結果を記載し、９−シス−レチナールの供給によってこの疾患の進行を止め、機能的効果を逆転させ得る方法を示すものである。目標は：１）この疾患の進行に対するおよび光受容体機能に対する９−シス−レチナール処置の有益な効果を調べること；２）単一細胞電気生理学およびＥＲＧ記録を用いて、９−シス−レチナール処置が網膜の杆体機能および光駆動シグナルに影響を与える仕方を評価すること；および３）ＬＣＡ患者にもＲｐｅ６５−／−マウスにも存続する低レベルの残留視力の生化学的基礎を研究することである。

９−シス−レチナールをＲｐｅ６５−／−マウスに投与すると、杆体の光色素が生成し、暗所で６カ月よりも長く持続した。９−シス−レチナールによる早期介入は正常な杆体生理機能を回復させ、ＲＰＥにおけるエステル蓄積を著しく減少させる。だが、ＥＲＧによって測定される網膜機能は一部分改善するに過ぎない。これらの研究は、薬理学的介入は暗所に維持されたＲｐｅ６５−／−マウスの視機能の長期持続的保持を生じ、ＬＣＡ患者の視力の回復のための有用な治療であることを証明するものである。

（材料および方法）
動物：動物試験の全ては、ワシントン大学動物保護委員会によって承認され、米国獣医学会安楽死委員会の勧告にしたがう手順を使用した。動物は完全な暗所で飼育され、全操作は全てコダックＮｏ．１セーフライト・フィルタ（透過率、＞５６０ｎｍ）を用いて、暗赤色光のもとで行われた。一般的に全研究に齢２−３カ月のマウスが使用された。ＲＰＥ６５欠乏マウスはＤｒ．Ｍ．Ｒｅｄｍｏｎｄ（ＮＥＩ、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ））から入手し、既述（Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：３４４−５１（１９９８）；Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１６：７０５−２４（２０００））のように遺伝子型を決定した。網膜Ｇ蛋白共役受容体−欠乏マウスを生成し、既述（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：２５６−６０（２００１））のように遺伝子型を決定した。一重Ｒｐｅ６５−／−マウスと一重Ｒｇｒ−／−マウスとを遺伝的に均質になるまで交雑育種させることによって、二重ノックアウト・マウスＲｐｅ６５−／−Ｒｇｒ−／−を作成した。

レチノイドおよび視物質の分析：全ての手順は既述（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８６２３−２８（２０００）；Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２４５６−６５（２００１）；Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１２０１２−１９（１９９９））のように暗赤色光のもとで行われた。既述の方法に加えて、レチノイド分析が、ダイオード・アレー・検出器およびＨＰ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ Ａ．０７．０１ソフトウエアを備えたＨＰ１１００シリーズ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）上で行われ、それらの特異な保持時間および最大吸収によって、レチノイド異性体を同定することができた。標準相カラム（ベックマン・ウルトラスフェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ） Ｓｉ ５μ、４．６×２５０ｍｍ）を用い、ヘキサン中０．５％酢酸エチル（ｖ／ｖ）のアイソクラチック溶媒系で１５分間、その後ヘキサン中４％酢酸エチルで６０分間、流速１．４ｍｌ／分、２０℃（合計７５分）で操作し、３２５ｎｍで検出した結果、１１−シス−、１３−シス−および全トランス−レチニルエステルを分離できた。それに加えて、解剖マウス眼の分析、レチノイド類の誘導体化および分離に関する研究操作の全ては既に詳細に記載されている。（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８６２３−２８（２０００））。ロドプシンおよびイソ−ロドプシンの測定を既述のように行った（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１２０１２−１９（１９９９））。一般的にはアッセイごとに２つのマウス眼を使用し、アッセイを３ないし６回繰り返した。データはＳ．Ｅ．Ｍ．と共に示される。

光および電子顕微鏡検査：前部および硝子体を除去することによってアイキャップを作成した。それらの眼はＰＮＤ１−２８において週単位で氷上に集められた。「薄い」切片（１．０μｍ）をリチャードソン青色溶液（１％）で染色し、光顕微鏡検査を行った。「超薄」切片（０．０５μｍ）を酢酸ウラニル／クエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡検査を行った。

マウスＲＰＥミクロソームの調製：頸部転位またはＣＯ_２による窒息の直後に、新鮮なマウス眼を摘出した。前部、硝子体および網膜を顕微解剖鏡下で注意深く除去した。代表的には、各調製につき３０−４０の眼を切開した。１２の切開アイキャップを、１μＭロイペプチンおよび１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、４００μｌ中に入れ、２０分間激しく撹拌するという方法でＲＰＥ細胞を分離した。それらのアイキャップを細いブラシでしずかにブラッシングし、さらにＲＰＥ細胞を除去した。細胞懸濁液を取り出し、ＭＯＰＳ緩衝液をさらに４００μｌ部分加え、アイキャップを再び２０分間振盪した。細胞懸濁液を合一し、ガラス−ガラス−ホモジナイゼーションを行った。ホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その後上清を２７５，０００×ｇで１時間遠心分離した。そのペレットをＭＯＰＳ緩衝液２００μｌにおいて再構成し、再びガラス−ガラス−ホモジナイゼーションにかけた。総蛋白濃度（典型的には０．５−１ｍｇ／ｍｌ）をブラッドフォード法によって測定した。（例えばＢｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−５４（１９７６）を参照されたい）。

マウスＲＰＥミクロソームを使用した全トランス−レチノールの１１−シス−レチノールへの異性化：１１−シス−レチノールへの異性化を決定するために使用するアッセイは以前（ＭｃＢｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１１３７０−７０（２０００））報告されたものである。手短に述べると、２０μｌのウシ血清アルブミン（最終濃度１％）、１２５μｌの５０ｍＭ １，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン、ｐＨ７．５、１０μｌのＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ）、２５μＭアポ組換え体ＣＲＡＬＢＰ、４０μｌのＲＰＥミクロソーム（一般には総蛋白２５−５０μｇ）、および０．５μｌの４ｍＭ 全トランス−レチノール（ジメチルホルムアミド中）。上記反応物を３７℃で２時間インキュベートした。３００μｌのＭｅＯＨを使用して反応を停止し、レチノイド類を２００μｌのヘキサンで抽出した。混合物を２分間激しく振盪し、その後１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、相分離した。上の有機層を取り、１００μｌ部分を分離し、ＨＰ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウエア（バージョンＡ．０７．０１）を備え付けたＨＰ１１００ＨＰＬＣを使用して分析した（ベックマン・ウルトラスフェアＳｉ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ヘキサン中１０％酢酸エチルを使用、流速１．４ｍｌ／分）。

プロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＨおよびプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＰＨの調製：プロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＨおよびプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＰＨの合成は既述（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２４５６−６５（２００１）；Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２８１２８−３８（２０００））のように、Ｌ−グルタミン脱水素酵素、ＮＡＤ（Ｐ）、およびＬ−［２，３−^３Ｈ］グルタミン酸（パーキンエルマー・ライフ・サイエンシス社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））で行われた。

ＲＤＨアッセイ：これらのアッセイはＮＡＤＨの存在下または不在下でジヌクレオチド基質として１１−シス−レチナールおよびプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用い、［１５−^３Ｈ］レチノールの生成（レチナールの還元）をモニターすることによって行われた（例えばＭｃＢｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０：４６９−５２９（２００１）を参照されたい）。

経口的胃管栄養法による投与：経口的胃管栄養法による投与は既述（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８６２３−２８（２０００））のように行われた。

レチノイド類の静脈内投与：化学物質類は別途記載がない限り、シグマ／アルドリッヒ社（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。溶液Ａは、ラクテート加リンゲル溶液（バクスター社（Ｂａｘｔｅｒ）１ｍｌに懸濁した１０ｍｇの９−シス−レチナール、７５ｍｇのクレモフォアＥＬ、１ｍｇのα−トコフェロール、および０．６ｍｇの安息香酸を含んでいた。この混合物を１０分間渦巻き状に撹拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、９−シス−レチナール濃度（７．７ｍＭ）を分光光学的に測定した。溶液Ｂは、ラクテート加リンゲル溶液（バクスター）１ｍｌ中に懸濁した１３ｍｇの９−シス−レチナール、５０ｍｇのクレモフォアＥＬ、１０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン、および４０ｍｇの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含んでいた。この混合物を１０分間渦巻き状に撹拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、９−シス−レチナール濃度（１０ｍＭ）を分光光度法で測定した。溶液ＡおよびＢ（一般には１００μｌ）は２７ゲージ針および拘束管を備え付けた１ｍｌ注射器を用いてマウス外側尾静脈内に送達された。

単一細胞の記録：マウスを出生時から暗所で飼育し、頸部転位によって殺し、眼を取り出した。網膜を分離し、氷上でＨＥＰＥＳ緩衝エイムス溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節）中で１２時間まで保存した。単離杆体は、溶液の１６０μｌ滴中で細い針で網膜の小片（大体１ｍｍ^２）を切り裂くという方法で得た。その滴を、赤外ビデオ視聴システムを備えた倒立顕微鏡（ニコン・エクリプス（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ））の台上の記録室に注入し、３７℃に温めた炭酸水素塩緩衝エイムス溶液（５％ＣＯ２、９５％Ｏ_２で平衡化した際、ｐＨ７．４）を２−３ｍｌ／分で連続的に注いだ。全切開は赤外−可視画像変換器を備えた解剖顕微鏡を用いて赤外線照明下で行われた。

単離した杆体を、直径１．２−１．５μｍの開口を有する、熱で磨いたシラン化硼珪酸電極に吸引によって引きつけた。その電極はＨＥＰＥＳ緩衝エイムス溶液で満たされていた。浴および吸引電極への電気的接続はカロメル半電池に接触したＮａＣｌ充満−寒天架橋によって行った。浴電圧はアクティブクランプ回路によって接地されていた（Ｂａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５４：２０３−２３（１９８４））。吸引電極によって集められた膜電流をアキソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）２００Ａパッチクランプ増幅器（アキソン・インスツルメント社（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって増幅し、３０Ｈｚ（３ｄＢポイント）で８極ベッセル低周波フィルタを通し、１ｋＨｚでディジタル化した。

４７０、５７０および６４０ｎｍに最大出力を有する発光ダイオードからの光を三叉ファイバーオプチックを使用して合一し、顕微鏡コンデンサーの代わりに水浸レンズを用いて標本上に焦点を合わせた。光刺激は三次元的に均質であり、記録された細胞上に中心をもつ直径０．５７ｍｍの円形領域を照らした。光の強度を上記標本で測定し、ロドプシンの吸収スペクトルおよび測定した発光ダイオードスペクトルを使用して等価的５００−ｎｍ光子（杆体感度に関して最大）に変換した。

マウスのエレクトロレチノグラム：マウスは出生時から暗所で飼育し、麻酔し（ケタジェクト／キシラジェクト、６５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、トロピカミド（１％）で瞳孔を拡大した。コンタクトレンズ電極を１滴のメチルセルロースと共に眼の中に置き、接地電極を耳の中に置いた。ＥＲＧを記録し、ユニバーサル試験および電気生理学的装置３０００（ＵＴＡＳ Ｅ−３０００）（ＬＫＣテクノロジー社（ＬＫＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で分析した。マウスをガンツフィールド・チェンバ（Ｇａｎｚｆｉｅｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ）に入れ、１つの眼のフリッカーを記録した。フリッカー刺激は固定周波数（１０Ｈｚ）である範囲の強度（０．０００４０−４１ｃｄ・ｓ／ｍ^２）を有した。

免疫細胞学：Ｒｐｅ６５マウスを５群に分けた：Ｒｐｅ６５−／−、９−シス−レチナールを胃管栄養法によって投与し、暗所に維持したＲｐｅ６５−／−；９−シス−レチナールを胃管栄養法によって投与し、フラッシュに曝露し、暗所に１５分間保持したＲｐｅ−／−；暗所に保持したＲｐｅ＋／＋；およびフラッシュに曝露し、暗所に１５分間保持したＲｐｅ＋／＋。フラッシュ研究では、暗順応したマウスは２ｃｍの距離からフラッシュ（サンパク（Ｓｕｎｐａｋ）４３３Ｄ、１ｍｓ）に曝露された。網膜を０．１３Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒド中、４℃で１５分間固定し、その組織を０．１３Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中５、１０または１５％スクロースに３０分間ずつ移し、同じ緩衝液中２０％スクロース中、４℃で一晩保存した。組織をその後最適切断温度凍結包埋合成物に移し、１０μｍの切片を作製した。凍結切片を、１：１０に希釈したマウスモノクローナル抗燐酸化Ｒｈ Ａ１１−８２Ｐ抗体中で４℃で一晩インキュベートした。トリトンＸ−１００（０．１％）を全ての燐酸緩衝食塩溶液に加え、抗体を透過し易くした。対照は、インキュベーション緩衝液から一次抗体を削除することによって処理した。一次抗体中でのインキュベーション後、切片を燐酸緩衝食塩液ですすぎ、その後インドカルボシアニン（Ｃｙ３）−結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に（１：２００）インキュベートした。切片を燐酸緩衝食塩液ですすぎ、グリセロール中５％ｎ−プロピルガレートにおいて載せ、カバースリップをかぶせた。

（結果）
９−シス−レチナールによる早期処置はＲｐｅ６５−／−マウスの油様構造を除去する；ＲＯＳとＲＰＥとの間の界面異常である光受容体の喪失に加えて、Ｒｐｅ６５−／−マウスのＲＰＥ細胞は多数の脂質様小滴を含んでいた。若い動物では、Ｒｐｅ６５−／−マウスからのＲＰＥの固定電子顕微鏡切片に空の小胞が認められたが、対照には認められなかった。加齢につれて（＞ＰＮＤ２１）、それらには光回折物質が充満した。それらの物質は電子顕微鏡切片作製中保持された。この考察はＲｐｅ６５−／−マウスにおける全トランス−レチニルエステルの過剰蓄積に関連する（図１Ａ、白丸）。Ｒｐｅ６５−／−マウスより低レベルであったとはいえ、レチニルエステルは加齢につれて、Ｒｐｅ６５＋／＋マウスにも蓄積した。ＰＮＤ２１までに、眼１つにレチニルエステル約８００ｐｍｏｌが蓄積していた。これに対しＲｐｅ６５＋／＋マウスでは約４０ｐｍｏｌであった。Ｒｐｅ６５＋／＋マウスにおいては、ロドプシンレベルは、最初はレチニルエステル量の数倍を超えていた。

ＰＮＤ７マウスを９−シス−レチナール（１０ｍｇ／ｍｌ）の０．２５ｍｇの投与量で１日おきに、齢３０日になるまで処置した場合、エステル蓄積の劇的変化が観察された（図１Ｂ）。年齢の増加、および１週間１回の投与（１．２５ｍｇ）の継続で、全トランス−レチニルエステル量はＲｐｅ６５＋／＋マウスと同様に増加したが、エステル類の全体的量はイソロドプシンの同時増加と共に伴って著しく抑制された（図１Ｃ、左パネル）。ひとたび沈着すると、齢１カ月より後に処置を開始しても、ＲＰＥに蓄積したエステル類は除去されなかった（図１Ｃ、右パネル）。若い動物または若い成動物を９−シス−レチナール処置した場合、ＲＰＥとＲＯＳとの界面の接触は改善し（図１Ｄ、パネルｄ、ｆ、ｈ）、空胞は本研究の数カ月間にわたって一部分だけが詰まっているようにみえた（図１Ｄ、パネルｃおよびｅ）。これらの観察は、再生色素の形成がエステル類の蓄積を著しく緩徐にするが、眼に蓄積した全トランス−レチニルエステルの完全除去は促進されないことを示唆する。

９−シス−レチナール処置の長期効果：マウスを９−シス−レチナールで処置すると、光色素レベルの長期持続的増加および全トランス−レチニルエステルの蓄積の減少が起きた。Ｒｐｅ６５−／−マウス（齢１カ月）を９−シス−レチナールで１回（２．５ｍｇ）処置し、その後１２時間明／暗サイクル、または２４時間暗所いずれかに３７日間保持した。いずれの条件下でも顕著なレチナール減少は認められなかった（図２Ａ）。これらの結果は、９−シス−レチナールの単回投与が通常の実験室的条件下でこれらの動物のイソ−ロドプシンを維持することを示唆する。

研究のもう一つの組において、ロドプシンまたはイソ−ロドプシンレベルを齢６カ月のＲｐｅ６５−／−マウスで測定した（図２Ｂ）。これらの動物では、イソ−ロドプシンレベルは３群のＲｐｅ６５−／−マウスで匹敵していた：ＰＮＤ３０および３４に９−シス−レチナールで２回処置したマウス（１回の投与量２．５ｍｇ）、ＰＮＤ３０および１２０の２回処置したマウス、およびＰＮＤ３０およびＰＮＤ１５０の２回処置したマウス。Ｒｐｅ６５−／−におけるイソ−ロドプシンの５０％減少（図２、ＢとＡとを比較）は、齢の関数としての、Ｒｐｅ６５＋／＋におけるロドプシンの同様な減少と一致する。エステルレベルは５０％減少し（未処置動物と比較して）、９−シス−レチナールの投与頻度および投与量には影響されなかった。ロドプシンまたはイソ−ロドプシンは未処置−暗順応Ｒｐｅ６５−／−マウスには検出されなかった。

９−シス−レチナールは９−シス−レチノールに還元され、眼および肝臓に９−シス−レチニルエステルの形で貯蔵され得る。必要なときに９−シス−レチノールがレチニルヒドロラーゼによって遊離される。眼および肝臓における９−シス−レチノイドの貯蔵庫の大きさを調べるために、１群のマウスを９−シス−レチナール（２．５ｍｇ）で処置し、４８時間後に１時間間隔で複数回フラッシュに曝露した；１回のフラッシュはロドプシンの約３０−３５％を退色させた。イソ−ロドプシンおよび９−シス−レチニルエステルは３回より多くの強力なフラッシュ後に有意に減少した。肝臓およびＲＰＥのレチニルエステルは２４時間間隔の５回のフラッシュ後に完全に枯渇した。ロドプシン含有ＲＯＳディスクの連続的流出および再合成は視物質の長期保存に影響を与えない。そのため、９−シス−レチナールは大部分、食作用を受けたイソ−ロドプシンから新たに生成したオプシン分子へと長期間にわたって再循環されるようである。

９−シス−レチナール処置の生理的影響：Ｒｐｅ６５−／−マウスの９−シス−レチナール処置は網膜機能の長期改善ももたらした。９−シス−レチナール処置の長期生理的影響を、Ｒｐｅ６５＋／＋およびＲｐｅ６５−／−マウスにおける種々強度の単回フラッシュ反応およびフリッカーＥＲＧ測定から決定した。これまでの研究は、経口９−シス−レチナール投与の４８時間後にＥＲＧ感度が一部分回復することを示した。この部分的回復はＰＮＤ３０に１回処置したＲｐｅ６５−／−マウスで１２週より長く持続した。

Ｒｐｅ６５＋／＋マウスにおけるフリッカーＥＲＧは、０．０１５ｃｄ・ｓ／ｍ^２の光レベルではピーク振幅２５４．９±４１．５μＶ、７．５ｃｄ・ｓ／ｍ^２ではピーク振幅９５．１±８．９μＶに達した（図２Ｃ、左パネル）。これらのデータは、それぞれ、杆体および錐体の優勢なＥＲＧ応答に似ている。処置をしないＲｐｅ６５−／−マウスでは、フリッカーＥＲＧは７．５ｃｄ・ｓ／ｍ^２の光レベルで有意に小さいピーク振幅、７６．０±１２．０μＶに達した（図２Ｃ、右パネル）。２．５ｍｇの９−シス−レチナールで１回処置した後８週間目には、フリッカーＥＲＧは０．０５９ｃｄ・ｓ／ｍ^２で１３７．３±２４．４μＶのピーク振幅に、１３ｃｄ・ｓ／ｍ^２では４０．０±７．１μＶのピーク振幅に達した（図２Ｃ、右パネル）。これらのピークはＲｐｅ６５＋／＋マウスにおけるよりも小さく、より高い光レベルで発生した；しかし、処置Ｒｐｅ６５−／−マウスの反応は未処置マウスのそれに比べて２．１対数単位だけより敏感で、より大きい振幅を有した。このように、９−シス−レチナールの投与はＥＲＧの長期間の部分的回復をもたらした。

９−シス−レチナール処置は、構成性オプシンの燐酸化を排除した：Ｒｐｅ６５マウスの酵素プロセスをさらに考察するため、関連酵素活性の数種の直接的測定を行った。オプシンはあるシグナリング能力を有することが一般に認められている。燐酸化オプシンに対するモノクローナル抗体を使用してＲｐｅ６５マウスからの網膜切片を免疫標識化すると、この活性をうまく評価することができるが、９−シス−レチナール処置はこの活性を阻害することが予想される。

Ｒｐｅ６５＋／＋マウスおよびＲｐｅ６５−／−マウスからの網膜を一定の暗所で固定した。Ｒｐｅ６５＋／＋マウスのＲＯＳは標識化を示さず、未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスからのＲＯＳは燐酸化オプシンに対するモノクローナル抗体によって標識化された。この標識化は９−シス−レチナール処置をしたＲｐｅ６５−／−マウス（ＰＮＤ３０に１回胃管栄養法によって投与し、その処置の４８時間後に分析した）では完全に阻止された。この９−シス−処置はオプシンの燐酸化を正常杆体におけるそれらと同等レベルまで減少させた。単回フラッシュの１５分後に暗所で固定したＲＯＳは９−シス−レチナールで処置したＲｐｅ６５＋／＋マウスおよびＲｐｅ６５−／−マウス両方において、免疫標識を示した。これらのデータは、オプシンがＲｐｅ６５−／−マウスにおいて構成的に燐酸化されることを示唆する。これらの研究は、全トランス−レチノールの１１−シス−レチノールへの変換および構成性オプシン燐酸化に特異的欠陥があるが、１１−シス−レチノールから１１−シス−レチナールへの酸化には欠陥はないことを示した。構成性オプシン燐酸化はＬＣＡの病因における重要な要素であり得る。

イソメラーゼ活性を直接測定するために、新規の手順を使用してＲｐｅ６５マウスからＲＰＥミクロソームを分離した。Ｒｐｅ６５＋／＋マウスからのＲＰＥミクロソームを用いた対照試験において、ＲＰＥミクロソームおよびＣＲＡＬＢＰが存在する場合にのみ、外部から加えた全トランス−レチノールから１１−シス−レチノールが生成した。ＣＲＡＬＢＰを削除した場合、ならびにＲＰＥミクロソームまたはＣＲＡＬＢＰが熱で変性した場合には１１−シス−レチノールは存在しなかった。１１−シス−レチノールはＲｐｅ６５−／−マウスからのＲＰＥミクロソームには検出されなかった。

１１−シス−レチノール脱水素酵素（１１−シス−ＲＤＨ）はＲＰＥ６５蛋白との複合体として精製されたので、１１−シス−レチノールの酸化をＲｐｅ６５マウスからのＲＰＥミクロソーム中で研究した。ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨをジヌクレオチド補因子として用い、Ｒｐｅ６５＋／＋マウスおよびＲｐｅ６５−／−マウスに強い活性が検出された。ＮＡＤＰＨ依存性活性とＮＡＤＨ依存性活性とを区別するために、脱水素酵素活性の試験を非放射性ＮＡＤＨおよび［^３Ｈ］ＮＡＤＰＨの存在下で行った。このような条件において、ＮＡＤＰＨ依存性脱水素酵素活性だけが容易に検出され得る。Ｒｐｅ６５＋／＋とＲｐｅ６５−／−との差は些細であった；なぜならばこの活性は、１１−シス−Ｒｄｈ／マウスによって決定したところ、正常なレチノイド流のために必要な活性に比べて遥かに高いからである（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２４５６−６５（２００１））。これらのデータは、Ｒｐｅ６５−／−マウスからのＲＰＥミクロソームが高いＮＡＤＰＨ依存性およびＮＡＤＨ依存性脱水素酵素活性を含むことを示唆する。Ｒｐｅ６５マウスのＲＰＥにおける１１−シス−ＲＤＨの免疫学的局在に差は認められなかったことを付け加える。

９−シス−レチナール処置は正常杆体機能を回復する：ＥＲＧは主として二極性反応を反映するから、９−シス−レチナールが完全回復を提供できないということは、光受容体の残留性欠陥または杆体から二極性細胞へのシグナル伝達における問題に帰せられ得る。９−シスレチナール処置が正常な光受容体機能を回復できるかどうかを決定するために、吸引電極を用いてＲｐｅ６５＋／＋マウスおよび未処置および処置Ｒｐｅ６５−／−マウス（ＰＮＤ３０に１回胃管栄養法によって投与し、その処置の４８時間後に分析した）からの単一杆体の反応を記録した。

循環暗電流の光誘起性変化を、０、０．２５、１．２５、または２．５ｍｇの９−シス−レチナールを胃管栄養法によって投与した（試験に先立って１日１回、連続２日間）Ｒｐｅ６５＋／＋マウスまたはＲｐｅ６５−／−マウスからの単一杆体の外側部分から記録した。レチノイド分析は、２．５ｍｇ投与量の９−シス−レチナールで３００±２５ｐｍｏｌのイソ−ロドプシン／眼 が形成され、１．２５ｍｇ投与量では１０９．８ｐｍｏｌのイソ−ロドプシン／眼、０．２５ｍｇ量では８５．６±６．２ｐｍｏｌ／眼 が形成されることを明らかにした。９−シス−レチナール投与量とイソ−ロドプシン濃度との非直線性関係は肝臓およびその他の組織における蓄積を反映するものと考えられる。表に記載された全ての杆体型は光反応を支持し、光反応はフラッシュ強度の増加につれて増加し、光が全てのｃＧＭＰチャンネルを閉鎖し、細胞の光感受性暗電流を完全に抑制するのに十分な明るさになったときに最大（飽和）振幅に達する。各型の杆体から出る反応群は、飽和反応の振幅が９−シス−レチナールの用量の増加と共に増加することを示す。各群の杆体の平均暗電流と９−シス−レチナール用量との間の関係をプロットする。補充的９−シス−レチナールを受けなかったＲｐｅ６５−／−杆体における光感受性暗電流は２．１±０．３ｐＡで、９−シス−レチナール０．２５ｍｇを受けたＲｐｅ６５−／−杆体（３．６±０．９ｐＡ）とは有意差はなかった。マウスに２．５ｍｇの９−シス−レチナールを与えたとき、杆体暗電流は発色団の投与量が多くなるにつれて増加し、Ｒｐｅ６５＋／＋マウスと本質的に同じ数値に達した。

Ｒｐｅ６５−／−フラッシュ反応のその他の２特性、反応動力学および光感受性、は補充的９−シス−レチナールの量と共に変化した。動力学的差を説明するために平均の薄暗い・フラッシュ反応（細胞内直線範囲）を各杆体型で測定した。５種類のセットの杆体からの平均反応を同じピーク振幅に目盛り、比較した。２．５ｍｇの９−シス−レチナールで処置したマウスからのＲｐｅ６５＋／＋およびＲｐｅ６５−／−杆体で記録した反応は本質的に同じ反応速度を有する。直線範囲の反応を重ね合わせると、２種類の杆体型のディムフラッシュ反応は同じ時間対ピークおよび回復時間を有することが示される。１．２５または０．２５ｍｇの９−シス−レチナールを胃管栄養法によって投与したＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体で記録された反応も実質的に同じで、同様な時間対ピークおよび回復時間を示した；両方共Ｒｐｅ６５＋／＋のそれらより実質的に速い。補充的９−シス−レチナールを受けなかったＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体反応の薄暗いフラッシュ反応速度は中間であった；それらはＲｐｅ６５＋／＋よりは速かったが１．２５または０．２５ｍｇの９−シス−レチナールで処置したマウスからの杆体よりは遅かった。

Ｒｐｅ６５＋／＋杆体と、Ｒｐｅ６５−／−マウスからの杆体との光感受性の差を図３に示す。この図は、５種類の試験条件の各々について（Ｒｐｅ６５＋／＋および、２．５、１．２５、０．２５または０ｍｇの９−シス−レチナールを投与したＲｐｅ６５−／−マウス）刺激反応曲線をプロットしたものである。フラッシュ強度の半飽和はＲｐｅ６５＋／＋杆体において最も低く（約３０フォトン／μｍ^２）、２．５、１．２５、および０．２５ｍｇの９−シス−レチナールを投与したマウスからの杆体ではそれぞれ６倍、６６倍および１３１倍増加した。９−シス−レチナールを受けなかったマウスからの杆体の光感受性は最小量（０．２５ｍｇ）を受けたマウスからの杆体と同じであった。

９−シス−レチナール処置をしない場合、光異性化によって１１−シス−レチナールがＲｐｅ６５−／−マウスに生成する：光に全くさらされなかったＲｐｅ６５−／−マウスはレチノイドの従来の顕微分析では検出レベル以下の１１−シス−レチナール（オキシムと同定された）を有する。しかし、これらのマウスはＥＲＧ研究および単一細胞記録では強い照明に反応する。明るい光への曝露によって１１−シス−レチナールが生成するかどうかを確認するために、２つの眼の代わりに４または８つの眼を使用してレチノイド分析を行った。Ｒｐｅ６５−／−では、暗順応動物に目立った量の１１−シス−レチナールは検出されなかった。より多い眼を分析に用いると、一般的クロマトグラムに０．２ｐｍｏｌ未満／眼の１１−シス−レチナールオキシムが検出された。全トランス−レチナール（４．２±１．１ｐｍｏｌ／眼、ｎ＝８）が存在し、強いフラッシュがこのアルデヒドを２．１±０．６ｐｍｏｌ／眼の１１−シス−レチナールに変換した。レチノイド類が真の標準の保持時間によって同定され、クロマトグラフィー試験中にそれらのＵＶスペクトルを測定した。次に、光異性化が「フォトイソメラーゼ」網膜Ｇ蛋白共役受容体蛋白の作用に起因するかどうかを確認することが重要であった。二重ノックアウトＲｐｅ６５−／−Ｒｇｒ−／−マウスを作成し、レチノイド分析を行った。遊離全トランス−レチナールの顕著な減少が観察されたが（２．２±０．２ｐｍｏｌ／眼）、光フラッシュが同様のフラクション（約５０％）を１１−シス−レチナールに光変換した。ＲＰＥまたは網膜にこれらのレチナールが存在するかどうかを確認するために、網膜およびＲＰＥを分離し、個々に分析した（８つの眼を使用したことに注意）。大多数の全トランス−レチナールが網膜で観察されたのに対し、１１−シス−レチナールはほとんどがＲＰＥに存在した。退色は全トランス−レチナールを１１−シス−レチナール（これも網膜に存在した）に変換した。１１−シス−レチナールがひとたび形成されると、そのレベルは暗所では１５、３０、または１２０分後に変化しない。

Ｒｐｅ６５−／−Ｒｇｒ−／−マウスのＥＲＧ分析はＲｐｅ６５−／−マウスから得た反応と比べて定性的には差がなかった（図２Ｃ、右パネル）。それと共にこれらの結果は、退色前の動物には、１１−シス−レチナールを生成し、ロドプシンを再生するレチナール光異性化経路があることを示す。

９−シス−レチナールの種々の送達法：重要な点はイソロドプシンを再生するだけでなく、シスレチノイド類の貯蔵庫も形成するという目的で、９−シス−レチノイド類の種々の送達法を比較することであった。二方法を試験した：胃管栄養法による投与（既述されている（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８６２３−２８（２０００））および静脈注射。静脈注射はレチノイドを送達する効率的方法であり、シス−レチノイド類のアルデヒドおよびアルコール型またはそれらの異性体組成物（１１−シス−対９−シス−）間に重要な差はなかった。９−シス−レチナールの静脈注射は、シクロデキストリンと共に供給した際もこれを伴わずに供給した際も、イソロドプシンを生成した。レチナールは血中から速やかに除去されたが、シクロデキストリンの存在下ではより長時間循環中で安定であり得た（ｔ１／２＝１２時間対２３時間）。シクロデキストリンの添加は、肝臓またはＲＰＥへの９−シス−レチニルエステル類の蓄積もより高める。これは循環時間の延長によるものと考えられる。血流からの９−シス−レチナールの速やかな排泄により、イソ−Ｒｈを十分再生するためには静脈注射を複数回行うことが必要になる。これは胃管栄養法の場合にはあてはまらない。なぜならば胃管栄養法の場合はレチナールが血流中に４８時間よりも長く存在し続けるからである。胃管栄養法による投与および静脈注射は共に、Ｒｐｅ６５−／−マウスにイソロドプシンを効果的に生成した。両方法の利点および欠点は「考察」の部（下記）に記載される。

（考察）
ＲＰＥ６５の役割およびＬＣＡ：ＬＣＡの動物モデルであるＲｐｅ６５−／−マウスを病的状態に導く事象の因果的連鎖は確立されていないとはいえ、その主な欠陥はレチノイドサイクルの中断であると考えられる。このサイクルは、ＲＰＥにおいて全トランス−レチナールが１１−シス−レチナールへと酵素的に変換されることおよび光受容体細胞へとそれが戻ることによって視物質を再生させる。ＲＰＥと光受容体との間の正常なレチノイド流の破壊が、ＲＰＥにおけるレチナールエステル類の過剰蓄積を説明し得る。さらに、ロドプシン再生の失敗は杆体および錐体の光感受性の低下を説明し得る。１１−シス−レチナールの欠如は光受容体中の遊離オプシンも増加させる。高レベルの遊離オプシンは連続的光曝露の影響に似た光変換カスケードの実質的活性化をもたらす。こうして高まった活性は、ＲＯＳ層の厚さの減少および光受容体の変性を起こし得る。これらは連続的光にさらされた動物にも起こる効果である。この一連の事象は遊離オプシンの燐酸化によってさらに悪化するかも知れない。これは網膜変性に導くことが他の諸研究において証明されている。

９−シス−レチナールによるＲｐｅ６５−／−マウスの早期処置は全トランス−レチナールの蓄積を阻止し、ＲＰＥプロセスとＲＯＳとの間の付着接触を改善し、オプシンの脱燐酸化に導き、網膜変性のさらなる進行を防止した。これらの観察は、ＲＰＥにおけるエステル蓄積および光受容体における高レベル活性オプシンの存在がＲｐｅ６５−／−マウスの網膜変性の主因であり得ることを示唆する。

回復した杆体機能：Ｒｐｅ６５−／−マウスからの杆体の光感受性は９−シス−レチナールの食事性補充によって用量依存的に回復した。最大用量は正常な感受性および反応速度を示す杆体反応を支持した。より少用量の９−シス−レチナールによる処置は、感度は低下しているが、より速い反応速度を有する杆体反応を生成した。この反応は野生型杆体における定常的バックグラウンド照明下で起きる感受性および反応速度の変化によく似ている。より少量の９−シス−レチナールを投与したマウスから記録される杆体反応の光感受性の変化は２因子の組み合わせによって説明できる。感受性低下の一つの原因は、視物質の量およびその量子効率の両方の低下によって起きる杆体の有効収集面積の減少であった；イソ−ロドプシンの量子効率はロドプシンのそれの約３分の１である。感受性のその他の減少は、遊離オプシンによる変換カスケードの定常的活性化によって説明できる；これは野生型杆体における定常的バックグラウンド照明によって起きるものに匹敵する効果をもたらす。

９−シス−レチナールで処置しなかったＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体も強く減感された光反応を生成した。未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスに残留する杆体反応が存在するということは、ＬＣＡの小児において光反応が低下はしたが存在するという以前の報告と一致する。これらの結果から、それらの条件下では強い光のフラッシュによる光反応の生成は十中、八、九、網膜における全トランス−レチナールの光変換による１１−シス−レチナールの生成によることが判明する。全トランス−レチナールが遊離しているか、オプシンに結合（共有結合または非共有結合）しているかどうかは議論の余地がある。発色団とオプシンとがあらかじめ結合していれば、その後、短い（１０ｍｓ）光フラッシュの時間内に十分に速くそれが光異性化され、変換がトリガーされて、光感受性１１−シス−レチナール複合体（すなわちロドプシン）が形成される。

Ｒｐｅ６５マウスの杆体における光変換：処置Ｒｐｅ６５マウスおよび未処置Ｒｐｅ６５マウスからの光感受性杆体の変化は、それだけで作用する（２．５ｍｇの９−シス−レチナール）または「等価的バックグラウンド」による減感と共に作用する杆体の有効収集面積の減少（遊離オプシンによる変換カスケードの定常的活性化が低レベルであるため）に帰することができる。

有効収集面積（ＥＣＡ）は、杆体の幾何学的収集面積（Ａ）、色素の量子効率（ＱＥ）、および色素密度（α）に依存する。

上記式中、１は経路の長さである。９−シス−レチナールを使用して生成する色素はイソ−ロドプシンであり、それはＲｈの量子効率の約１／３（０．２２対０．６７）である。生化学的測定値は、２．５ｍｇの９−シス−レチナールを胃管栄養法により投与したマウスでは色素の全てがイソ−ロドプシンであり（遊離オプシンなし±１０％）、Ｒｐｅ６５＋／＋杆体中のロドプシン量の約５７％である（すなわち３００ｐＭイソ−ロドプシン対５２５ｐＭロドプシン）。量子効率および軸方向の色素密度の減少は、９−シス−レチナールを２．５ｍｇ与えたマウスから得られる杆体の有効収集面積の約５倍の減少を起こすと予想される。これは、Ｒｐｅ６５ｐ＋／＋の杆体と比較して、９−シス−レチナールを２．５ｍｇ与えたＲｐｅ６５−／−マウスから得られる杆体のフラッシュ強度の半飽和の６倍の増加と一致する。９−シス−レチナール１．２５および０．２５ｍｇで処置したマウスからの杆体において、イソ−ロドプシンの軸方向密度はＲｐｅ６５ｐ＋／＋杆体におけるロドプシン量の、それぞれ２１および１６％であった。上と同じ理由によって、これらの変化は、Ｒｐｅ６５ｐ＋／＋と比較してフラッシュ強度の半飽和を１４．５−および１９倍増加すると予想される。これは観察された感受性の変化を説明するには不十分である；１．２５および０．２５ｍｇの９−シス−レチナールを胃管栄養法により投与したマウスからの杆体はその後それぞれ４．５倍および６．８倍減感される。

付加的減感は、「暗光」のように作用してカスケードの定常的活性化をおこす等価なバックグラウンドに帰することができる。Ｒｐｅ６５ｐ＋／＋杆体に関する独立的諸研究において、バックグラウンド照明によるフラッシュ感受性の変化はウエーバー−フェヒナー（Ｗｅｂｅｒ−Ｆｅｃｈｎｅｒ）関係式によって説明された：

上記式中、Ｓ_ｆは定常光におけるフラッシュ感度、Ｓは暗所におけるフラッシュ感度、Ｉ_ｂはバックグラウンド光強度、そしてＩはフラッシュ感度をその暗数値の半分だけ減少させるバックグラウンド強度（１０^８光子／μｍ^２／ｓ）である。したがって、３７８および６４８光子／μｍ^２／ｓのバックグラウンド強度はフラッシュ感度の４．５および７倍の変化を起こすことが期待される。有効収集面積０．５μｍ^２および積分時間０．３秒では、これらのバックグラウンド強度はＲｐｅ６５ｐ＋／＋杆体の等価的活性化、５７および９７Ｒｈ^＊／ｓに相当する。

処置Ｒｐｅ６５−／−杆体において、残留遊離オプシンの等価なバックグラウンドを、遊離オプシン濃度の生化学的測定値と生理学的減感推定値との組み合わせによって決定した。Ｒｐｅ６５ｐ＋／＋杆体のＲｈ分子数は約２×１０^７（すなわち、０．０２ｐｌ中３ｍＭロドプシン）と推定される。Ｒｐｅ６５−／−マウスからの杆体における生化学的測定値から、処置後４８時間目にはそれらがＲｐｅ６５ｐ＋／＋より約４０％少ない色素を作ることが示される。従って、２．５ｍｇの９−シス−レチナールを胃管栄養法により投与したＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体中のイソ−ロドプシン分子数は約１．２×１０^７である。より少ない用量の９−シス−レチナールは、イソ−ロドプシンを形成するために使用できる色素を全ては再生せず、そこは遊離オプシンのプールとなる。レチノイド分析により、１．２５および０．２５ｍｇの９−シス−レチナールを胃管栄養法により投与したＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体中の遊離オプシン量は使用できる色素（すなわち７．５−８．６×１０^６分子）の総量の６３および７２％であることが示唆される。この量の遊離オプシンで、５７および９７Ｒｈ＊／ｓを退色させる定常光によって起きるＲｐｅ６５＋／＋杆体の減感に匹敵する減感をＲｐｅ６５−／−マウスからの杆体に起こすためには、約１×１０^５オプシンがそのカスケードならびに１Ｒｈ^＊を活性化しなければならない（１．３−０．９×１０^５オプシン：Ｒｈ^＊）。この数値は遊離オプシン：Ｒｈ^＊の活性化比のこれまでの推定値（すなわち１０^６：１）と広く一致する。図３の挿入図は、バックグラウンド明順応およびフラッシュ反応を同様な量だけ減感した等価な（遊離オプシン）バックグラウンドによる順応が、薄暗いフラッシュ反応速度に対して同様な効果を有することを示す。これは、順応がバックグラウンド光によるものであれ、暗順応と関連する等価なバックグラウンドによるものであれ、薄暗いフラッシュ反応の反応速度における順応変化は同様であることを示したこれまでの研究とも概ね一致する。

未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスから記録される高度に減感された杆体反応は、処置マウスの杆体に見られるような反応速度の促進を示さなかった。この相違についてはいくつかの説明が可能である。一つの可能性は、遊離オプシンの活性が未処置Ｒｐｅ６５−／−マウスからの杆体では処置マウスのそれより低いことである。これは、おそらく、未処置杆体ではオプシンの燐酸化があるためと考えられる。この説明は、少用量の９−シス−レチナールによる処置が、残っている遊離オプシンの大部分または全てを多分脱燐酸化によってより高い活性状態に変えることを必要とする。もう一つの可能性は、未処置マウスでは光色素の活性化および脱活性化が変化することである。例えば、光変換によって作りだされる光色素が正常ロドプシンと一致するということは明らかでない；例えばオプシンがまだ燐酸化されているかも知れない。

９−シス−レチナール処置後の正常杆体機能の完全またはほぼ完全な回復は、エレクトロレチノグラムの感度の部分的回復と対照的であった。エレクトロレチノグラムは主として二極性細胞の活性を反映するので、この差は、杆体における反応が杆体−二極性シナプスを経て正しく伝達されないことを示す。Ｒｐｅ６５−／−マウスでは、視シグナルの欠乏のためにこのシナプスが正しく生成しないことが考えられる。出生時から連続的９−シス−レチナール処置を行うとこの問題の改善に役立つかも知れない。

９−シス−レチナール処置の利点および欠点：レチナールは次の二方法の一つ（または組み合わせ）によって効果的に眼に送達され得る：胃管栄養法による投与および静脈注射。最も効果的な送達系は胃管栄養法である。それは１−２日以内に視物質を回復し、肝臓およびＲＰＥミクロソーム内の９−シス−レチニルエステルの蓄積をも起こす。それは非常に再現性のある方法である。４８時間にわたって血中レチノイドの一過性上昇があり、その後正常レベルに戻る。唯一の目立った欠点は、レチノイドの多くが貯蔵されるよりむしろ分泌され、そのためその他の送達法より多量を必要とすることである。

静脈注射もレチノイドを眼に送達する効果的方法であるが、この方法はレチノイドが腎臓によって血流から速やかに排泄されるという欠点を有する。これはレチナールをシクロデキストリン・ネットに「閉じ込める」ことによってある程度防ぐことができる。十分に再生するためには多数回または多用量を注射しなければならないが、これは局所的感染と関連する潜在的問題を生ずる。循環する全トランス−レチノイドの量を減らすために、肝臓カルボキルエステラーゼを阻害して、全トランス−レチナールの血流への放出を阻止することが有用かも知れない。このような阻害剤は、それらが強力であれば、非常に有毒である。なぜならばそれらはヒドロラーゼ活性を必要とするその他のプロセスを阻害するからである。ビタミンＫ_１およびＥのような一般的なおよび弱い阻害剤はある程度有効であるが、血流中のシス−レチノイドレベルを高めるにはより特異的阻害剤が必要である。眼内注射は同様な症例に選択できることを付け加えておく。

肝臓およびＲＰＥにはシス−レチノイドの大きい貯蔵庫はない。これは十中、八、九、遊離レチナールまたはレチノールが全トランス異性体に非酵素的に変換するためである。しかし、哺乳動物の視力の効率はすぐれており、シス−レチノイド治療を念頭に置いて考慮する価値がある。例えば、哺乳動物の網膜は約１０^８の光受容体を含む。もしも各光受容体が平均１−２×１０^３フォトン／ｓを量子効率０．６５（または９−シス−レチナールでは０．３）で吸収するならば、１１−シス−レチナールの１日必要量は１μｇ未満に過ぎず、この量はたとえレチノイドの大部分が肝臓に保持され、または分泌されるとしても、食事性補充によって容易に供給できる量である。ビタミンＡの推奨摂取量は男性で０．８ｍｇ／日、女性で０．７ｍｇ／日であり、３ｍｇ／日という安全性の上限は、データ不足のため、推定値に過ぎない。

複数回の胃管栄養法による投与は眼のレチニルエステル量を増やさない。これに対して、早期介入は全トランス−レチニルエステルの蓄積を顕著に低減する（図１）。これは網膜疾患のシス−レチノイド治療の成功する必要条件の一つであり得る。ＲＰＥにおける全トランス−レチニルエステルのレベルは介入の時期によってあらかじめ決まる。もしも治療が出生後非常に早期に開始されるならば、エステルは野生型マウスにおけるように、年齢と共に徐々に増加するに過ぎない。その処置は眼からエステルを除去はしないが、エステルの蓄積を阻止する。考えられる一つの説明は、オプシンが再生しないというシグナルを網膜が送り、これが血液循環からのレチノール捕獲をおこし、レチニルエステルとしてＲＰＥに貯えるというものである。レチニルエステルが１１−シス−レチナールに変換できない場合、「オプシンシグナル」がオンになり、これら二つの要因が最後にはエステル蓄積に導く。このような連絡のメカニズムは分子レベルでは知られていない。

つまり、この研究は、９−シス−レチナールの投与が杆体光色素および杆体網膜機能を６カ月間よりも長く回復し、早期介入がエステル蓄積を著しく低減することを証明するものである。Ｒｐｅ６５−／−マウスのオプシンはＲｐｅ６５−／−マウスの杆体において構成的に燐酸化される。視物質のこの改変はＬＣＡの病理生理学に関係し得る；幸いなことに、９−シス−レチナール処置後、オプシンは脱燐酸化される。Ｒｐｅ６５−／−マウスの１１−シス−レチナールのソースは網膜に存在する全トランス−レチナールの光異性化から生じ、二重Ｒｐｅ６５−／−Ｒｇｒ−／−ノックアウトマウスに示されるように、網膜Ｇ蛋白共役受容体のフォトイソメラーゼに加えて、その他の作用機序がこのプロセスに関係するという証拠も提供されている。単一細胞の記録を使用する電子生理学的データは、１１−シス−レチナールが現場で杆体外側部分に形成されることを示唆する。これらの研究はＬＣＡの病因に関する分子レベルでの情報を提供し、薬理的介入が暗所で飼育されたＲｐｅ６５−／−マウスの視機能の長期保存をもたらすことを証明している。

（実施例２）
光変換はロドプシン（Ｒｈ）発色団１１−シス−レチニリデンの、全トランス−レチニリデンへの光異性化によって開始する。ここで、異なる環サイズを有するレチナール同族体で再生したロドプシン（これはＣ１１＝Ｃ１２二重結合の周りの異性化を阻止する）を使用して、このＧ−蛋白共役受容体の活性化メカニズムを研究した。１１−シス−７−環−ロドプシンはインビボでもインビトロでもＧ−蛋白を活性化しないし、その他の二重結合に沿って異性化しない；これはそれがオプシンの結合部位にきっちりとフィットしていることを示唆する。これに対して、退色１１−シス−６−環−ロドプシンはインビボで、および低ｐＨ、インビトロで光変換を軽度に活性化する。これらの結果は、より硬い６位固定（６−ｌｏｃｋｅｄ）レチナール異性体ではその他の二重結合に沿った異性化によって、および１１−シス−６−環−ロドプシンではｐＨを低くすることによって鍵となる残基のフォトン化によって部分的活性化が起きることを明らかにする。完全な活性化は得られない、なぜならば異性化はロドプシンのコンホメーション再配列の完全な１組を誘発しないからである。６−および７−環−束縛−レチノイドに関するこれらの結果はロドプシン活性化への新しい洞察を与え、固定されたレチナール類、特に１１−シス−７−環−レチナールの利用を示す。

脊椎動物の網膜光受容体細胞において、視物質発色団の異性化、１１−シス−レチナールの全トランス−レチナールへの異性化が、総合的に光変換カスケードと称される１組の反応をトリガーする。光変換事象は活性化ロドプシン（Ｒｈ^＊）によって開始し、究極的にはニューロンのシグナリングに導く典型的Ｇ−蛋白カスケードに沿って進行する。ロドプシン発色団の光異性化によって生成する触媒的活性な中間体であるメタロドプシンＩＩ（またはＭｅｔａＩＩ、Ｒｈ^＊）は、オプシンのＬｙｓ２９６に脱プロトン化したシッフ塩基を介して共有結合した全トランス−レチナールを含む。それに続いて、ＭｅｔａＩＩは再プロトン化を受け、光分解した発色団は加水分解され、オプシンから遊離する。光異性化した発色団によるロドプシン活性化の正確なメカニズムは知られていない。

ロドプシンの光退色プロセスは、レチナールが１１−シス−二重結合の周囲で異性化できないようにする余分の環をＣ１０とＣ１３との間に含むレチナール同族体を使用して研究された。Ｃ９−Ｃ１１の動きが制限されている人工的視物質は正常な光分解中間体を形成する。これはロドプシンの活性化にＣ１１＝Ｃ１２結合異性化が重要であることを示唆する。より最近になって、光異性化後、発色団のβ−イオノン環がＭｅｔａＩＩに移行中に新しい位置に動くことが報告された（Ｂｏｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２２０９−１２（２０００））。Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６１４８−５３（２００１））は、６−環−束縛レチナール異性体および基底状態のロドプシンの結晶構造を使用して、この移動が制限される場合に残留活性だけが認められることを示した。固定されたレチナール同族体を用いてビタミンＡ−欠落ラットにおけるインビボ視伝達も研究された。これらの動物はロドプシンの正常補体の約半分を有した。固定されたレチナールの注射は光受容体に同族体色素を出現させたが、ラット眼から記録されたエレクトロレチノグラフィーｂ−波の応答には顕著な影響を与えなかった。野生型ロドプシンからの妨害のため、結果を十分に説明することができなかった。

光受容体において光でトリガーされる諸事象は二細胞系、すなわち光受容体細胞及び網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を含む再生反応と相互に綿密に関係する。フォトンの吸収によって生ずるあらゆる光異性化はロドプシンの再生によって、新たに合成された１１−シス−レチナールと釣り合う。Ｒｈ^＊から遊離した光異性化生成物、全トランス−レチナールは光受容体において全トランス−レチノールに還元され、その後、ＲＰＥにおいて視サイクルまたはレチノイドサイクルと呼ばれる酵素的過程において１１−シス−レチナールに戻る（ＭｃＢｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０：４６９−５２９（２００１））。レチノイドサイクルの数種の成分が確認されているが、主な酵素的および化学的変換はよくわかっていない。

レチノイドサイクルに含まれる蛋白の一つはＲＰＥ６５である。これは分子量６５ｋＤａを有する高度に発現される膜結合型ＲＰＥ蛋白である。この蛋白は１１−シス−レチノール脱水素酵素（１１−シス−ＲＤＨ）と複合体を形成するようにみえる。ＲＰＥ６５の機能は知られていないが、レチノイドプロセッシングと関係すると考えられている。９５％より多くのＲＰＥ６５を除去する高濃度塩で洗ったＲＰＥミクロソームはまだ大部分の異性化活性を保有していた。しかし予想外に、Ｒｐｅ６５−／−マウスはＲＰＥ中に全トランス−レチニルエステルを脂質様滴の形で過剰蓄積していた。その後のレチノイド分析では、エステルまたはアルコール型のいずれの１１−シス−生成物も検出されなかった。Ｒｐｅ６５−／−マウスのエレクトロレチノグラム（ＥＲＧ）測定は、杆体および錐体機能がひどく衰退していることを明らかにした。少量の１１−シス−レチナールが光受容体細胞において現場で光化学的反応によって生成する。シス−レチノイドによる早期介入がレチニルエステル蓄積を著しく減らすことが証明された（実施例１を参照）。この動物モデルは、１１−シス−レチナールとは異なる、光活性化プロセスを受けた合成レチナール同族体で再生したロドプシンのインビボ特性を野生型ロドプシンからの妨害なしに研究するのに非常に有用である。

本研究において、環−束縛１１−シス−レチナール異性体で再生され、Ｃ１１−Ｃ１２二重結合周囲の異性化を阻止するＣ１０とＣ１３との間の３−炭素架橋を含むロドプシンは、インビボでもインビトロでも顕著な異性化および活性化を受けない。これに対して、１１−シス−６−環−ロドプシンの退色（２−炭素架橋）はその他の二重結合に沿って異性化を起こし、低ｐＨでロドプシンの活性種を生成する；それはＦＴＩＲ分光光度分析によって証明されたように、インビボおよびインビトロの両方において光変換事象をトリガーする。これらの結果はロドプシン活性化への新たな洞察をもたらすものであり、同時に、６−および７−環−束縛レチノイドが網膜病変のレチノイド治療において有用であることを示すものである。

（方法および材料）
１１−シス−７−環−レチナールの合成：１１−シス−７−環−レチナールを公表された手順によって合成した（Ａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：６３７２−６３７６（１９８０）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ １４：３４０−４６（２００２）：Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：３５３３−３７（１９９３））。（異性体１−４（化合物１−４としても記載されている）の同定には図４Ａを参照されたい。）
１１−シス−７−環−レチナールで再生されたロドプシンの光異性化：杆体外側部分、オプシンの調製、レチナールによるロドプシン再生、およびコンカナバリンＡ−セファローズ４Ｂカラム上でのロドプシンの精製を既述（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６１４８−５３（２００１））のように行った。

１１−シス−レチナールおよび１１−シス−７−環−レチナール類で再生したロドプシンの燐酸化：再生したロドプシン（２ｍｇ／ｍｌ）を、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ［^３２Ｐ］ＡＴＰ（約３５，０００ないし約５０，０００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）および精製ロドプシンキナーゼ（約５μｇの蛋白）を含む１００ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、１００μｌに混合し、既述（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２９４９５５（１９９１））のようにアッセイを行った。試験は３回行われた。

１１−シス−７−環−レチナール異性体を用いるＲＤＨのＨＰＬＣ活性アッセイ：１１−シス−ＲＤＨ（レチノール脱水素酵素）および光受容体全トランス−レチナールー特異的ＲＤＨ（ｐｒＲＤＨ）または全トランス−ＲＤＨの活性を、［１５−^３Ｈ］レチノール異性体の生成（レチナール異性体の還元）をモニターすることによって分析試験した（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１１２８−３８（２０００））。反応混合物（１００μｌ）はＭＥＳ（最終的濃度、６６ｍＭ、ｐＨ５．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、精製１１−シス−ＲＤＨ−Ｈｉｓ６（０．３１μｇ）のためのプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＨ（１６μＭ）（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１１２８−３８（２０００））またはｐｒＲＤＨのためのプロ−Ｓ−［４−^３Ｈ］ＮＡＤＰＨ（１２μＭ）（Ｓｆ９細胞に発現され、２０ｍＭ ＢＴＰ、１ｍＭ ジチオスレイトール、１μＭ ロイペプチンに細胞ペレット／緩衝液比１：４９で懸濁された）、および反応を開始するために最後に添加される２μｌの１１−シス−７−環−レチナール異性体（１２０μＭ）サブストレート・ストックを含んでいた。反応液を３３℃で１０−２０分間インキュベートした。

レシチン：レチノール アシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）アッセイ：新鮮ウシ眼をシェンク・パッキング社（Ｓｃｈｅｎｋ Ｐａｃｋｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）から入手した。ウシＲＰＥミクロソームの調製は既に記載された（Ｓｔｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８５７７−８５（１９９９））。このミクロソームを１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１μＭ ロイペプチン、および１ｍＭ ジチオスレイトールに再懸濁した。その際光熱量計によって測定して総蛋白濃度が約５ｍｇ／ｍｌになるようにした（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−５４（１９７６））。部分を８０℃で保存し、調製１カ月以内に使用した。内因性レチノイドを破壊するために、ＲＰＥミクロソームの部分、２００μｌ、を石英キュベットに入れ、クロマトＵＶＥ−トランスイルミネータ（ＴＭ−１５型、ＵＶＰ社）を用いて０℃で５分間照射した。全研究は暗赤色光の条件下で行われた。全トランス−レチノール、１１−シス−レチノール、および１１−シス−７−環レチノールは、分光光度分析によって測定して１ｍＭ濃度になるようにジメチルホルムアミドに溶解した。１３０μｌの１０ｍＭ ＢＴＰ、ｐＨ７．４、２０μｌの１０％ウシ血清アルブミン、および１０μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ（１０ｍＭ ＢＴＰ（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン）、ｐＨ７．４、中）を含む１．５ｍｌのポリプロピレンチューブに、２０μｌのＵＶ処理ウシＲＰＥミクロソーム（約１００μｇの総蛋白）を加えた。その後１１−シス−７−環−レチノールの１ｍＭジメチルホルムアミド溶液（２μｌ）をその混合物に加え、指定された時間、３７℃でインキュベートした。３００μｌのＭｅＯＨおよび３００μｌのヘキサンの添加によって反応を停止した。レチノイドを抽出するために、渦撹拌器上で５分間激しく撹拌し、１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、ヘキサン層と水層とを分離した。ヘキサン抽出物（１００μｌ）を標準相ＨＰＬＣ（４％酢酸エチル／ヘキサン）によって分析した。研究は２回ずつ行った。レチノイドの量は標準化された。

ＬＲＡＴ阻害アッセイ：アッセイは上記のように行われたが、１１−シス−７−環−レチノールと共に３７℃で１５分間プレインキュベーションした後、全トランス−レチノールまたは１１−シス−レチノールの１ｍＭ溶液２μｌを加え、反応液をさらに１０分間インキュベートした。対照として、１１−シス−７−環−レチノールを加えずに、反応液をジメチルホルムアミド２μｌと共にプレインキュベートした。

ＦＴＩＲ分光光度測定：オプシン膜（２４μＭ）（Ｓａｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：６１８９−９４（２０００））をＢＴＰ緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１３０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＢＴＰ、ｐＨ７．５）中で、２４０μＭの１１−シス−レチナールと共に、または１１−シス−６−環−または１１−シス−７−環−レチナール異性体類いずれかの混合物と共に一晩インキュベートした。膜懸濁液を１００，０００×ｇで２５分間遠心分離し、ＢＴＰ緩衝液に再懸濁すると２．２ｍＭロドプシンが得られた（５００ｎｍの吸収から）。トランスデューシンの高親和性同族体（Ｇｔ−３４０−３５０）で測定するために、８ｍＭ ＶＬＥＤＬＫＳＣＧＬＦ（配列番号：１）を使用した。Ｈ_２Ｏ／Ｄ_２Ｏ交換のためにペレットをジューテリウム化緩衝液に３回再懸濁した。緩衝溶液を除去し、ペレットを２つのＢａＦ_２窓と、３μｍポリテトラフルオロエチレン・ガスケットとを有する３０−ｍｍ直径の温度制御−トランスミッション・セルに移した。ブルーカ（Ｂｒｕｋｅｒ）ｉｆｓ ６６−Ｖスペクトロメータを用いてスペクトルを記録した（Ｂａｒｔｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７３：２５９−６４（２０００））。全てのサンプルで、ＭｅｔａＩＩからロドプシンを差し引いた差スペクトルを作成した。

動力学的光散乱：光散乱の変化を既述（Ｈｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１５：３２９４７（２０００））のように測定した。測定は３００μｌ容積を有する１０ｍｍ−パスキュベットで、等張性緩衝液（２０ｍＭ ＢＴＰ、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ６．４（図６に説明されている））中で、２２℃、Ａ／Ｄ変換器（ニコレット４００、マジソン、ＷＩ）を用い、ドエル・タイム５−ｍｓで行われた。膜懸濁液を含むサンプル（３μＭ ロドプシン）を精製Ｇｔ（０．８μＭ）および１ｍＭ ＧＴＰで再構成した。適切なニュートラル濃度フィルタによって減衰させた緑色（５００±２０ｎｍ）フラッシュによるロドプシンのフラッシュ光分解によって反応をトリガーした。フラッシュ強度は、退色し、光励起ロドプシンのモル分率（Ｒｈ^＊／Ｒｈ）としてあらわされるロドプシンの量によって、測光的に定量された。

動物：全ての動物試験はワシントン大学動物ケア委員会によって承認され、米国獣医学会安楽死委員会の勧告にしたがった手順を使用した。全動物は完全な暗所に置かれ、全ての操作はコダックＮｏ．１安全光フィルタ（透過＞５６０ｎｍ）を用いて暗赤色光のもとで行われた。一般的に、齢２−３カ月のマウスを全ての試験に使用した。ＲＰＥ６５−欠乏マウスはＭ．Ｒｅｄｍｏｎｄ（ナショナル・アイ・インスチチュート、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手し、既述（Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：３４４−５１（１９９８）；Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１６：７０５−２４（２０００））のように遺伝子型を決定した。

レチノイドおよび視物質の分析：全ての手順は既述（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８６２３２８（２０００）；Ｊａｎｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２４５６６５（２００１）；Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１２０１２−１９（１９９９））のように暗赤色光のもとで行われた。

ＥＲＧ：マウスを麻酔するために、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．２、で希釈した６ｍｇ／ｍｌケタミンおよび０．４４ｍｇ／ｍｌキシラジンの１５μｌ／ｇ体重を腹腔内注射した。１％トロピカミドで瞳孔を拡大した。コンタクトレンズ電極をメチルセルロースの１滴と共に眼の上に置き、接地電極（照合電極）を耳の中に置いた。ＥＲＧをユニバーサル試験および電気生理学的装置３０００（ユニバーサル・テスティング・アンド・エレクトロフィジオロジック・システム３０００（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍ
３０００））（ＵＴＡＳ Ｅ−３０００）（ＬＫＣ テクノロジー社（ＬＫＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））で記録した。マウスをガンツフィールド・チェンバに入れ、フラッシュ刺激に対する反応を両眼から同時に得た。フラッシュ刺激は強度範囲（０．０００２０−４１ｃａｎｄｅｌａ ｓ／ｍ^２）を有し、白色光フラッシュ持続時間は１０ｍｓであった。２回から４回の記録を１０秒よりも長い間隔で行った。全条件における各点の記録には一般的に４−８匹の動物を使用した。全てのＥＲＧ測定は麻酔後１０−４０分以内に行われた。

イムノサイトケミストリー：切片の作成、および抗燐酸化ロドプシン抗体、Ａ１１８２Ｐ（Ｐ．Ｈａｒｇｒａｖｅ からの贈り物）を用いる免疫標識を既述のように行った（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９１７３−８２（２００２））。

モデリング：ウシ・ロドプシンのためのコーディネートは蛋白データバンクから得た（１ＨＺＸ）。水素原子の付加および全ての最適化はＩｎｓｉｇｈｔＩＩで（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ ｒｅｌｅａｓｅ ２０００、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）既述のように行われた（Ｊａｎｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６１４８−５３（２００１））。

（結果）
１１−シス−７−環−レチナールの合成およびロドプシンの活性部位のモデリング：７員環を組み込んだ１１−シス−固定−レチナール同族体の全体的合成が最近報告された（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ １４：３４０−４６（２００２））。この方法は１１−シス−７−環−レチナールを合成する変法で行われた。化合物は４種類の異性体の混合物として製造された。これらの異性体は標準相ＨＰＬＣによってよく分離され、前に「方法および材料」の部分（上記）に記載されたものと一致するＵＶ−可視および^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを有する（Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：３５３３−３７（１９９３）；Ａｋｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：６３７０−７２（１９８０））。異性体３，１１−シス−７−環−レチナールのコンホメーションは１１−シス−レチナールと高度に重なる。全ての異性体はロドプシンのＸ線構造を使用する分子モデリング（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：７３９−４５（２０００）；Ｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：７７６１−７２（２００１））およびエネルギー最小化アルゴリズムによって示されるように、ロドプシンの結合部位にフィットする。

異性化、還元およびエステル化に対する１１−シス−７−固定−ロドプシンの感受性：１１−シス−７−環−レチナールは６−環−異性体に比べて熱による異性化にはより安定である。溶液中でこれらの７−環−レチノイドを退色させると、最少量の異性体が９，１１，１３−トリシス−レチナール１である異性体混合物が生成する（図４Ａ）。これらの異性体で再生したロドプシンをコンカナバリンＡカラムクロマトグラフィーを使用して精製した（図４Ｂ）。オプシンに結合した際、１１−シス−７−環−レチナール（異性体３）が異性化に対して最も安定であるようにみえる（図４Ｃ）、他方、１１，１３−ジシス−異性体２は暗所においてさえ容易に異性体３に変換し、オプシンがこの異性化を促進することが示唆される。全体的に、７−環−含有レチノイドは６−環−含有レチナールに比較して全ての条件においてより安定で、より低い程度に相互変換を受けるようにみえる。トリ−シス異性体１を除いて、それらは１１−シス−ＲＤＨのためには貧弱な基質である。それらは異なる異性体間の区別なしにｐｒＲＤＨによって利用される。これらのデータはまたしても６−環−レチノイドのデータとは異なる。最良の基質に対する両方の脱水素酵素の活性は天然レチナールの約１０分の１に過ぎず、これらの基質が視覚系に内生する脱水素酵素によってあまり利用されないことを示唆する。これらのレチノイドはＬＲＡＴにとっても貧弱な基質であり、一部だけがエステル化され得るに過ぎない（図５）。全トランス−レチノールまたは１１−シス−レチノールが基質として存在する際に分析試験すると、１１−シス−７−環−レチナール類は効果のないＬＲＡＴインヒビタである。

１１−シス−７−環−ロドプシンのインビトロ活性：１１−シス−７−環−レチナールで再生したロドプシンにおける光誘発性形質転換を評価するために、ＦＴＩＲ分光測定法を用い、オプシンの異なる領域に特異的なスペクトルの変化をモニターした。光活性化すると、異性体１および４で再生したロドプシンは野生型ロドプシンに比較して差スペクトルにわずかな変化をもたらしたが、異性体２および３は不活性であった。１１−シス−結合は固定されているため、これらの変化は固定されたＣ１１＝Ｃ１２二重結合を除いたその他の二重結合の周囲の異性化を反映する。これらのスペクトルの全てはｐＨ非感受性であった。ＦＴＩＲによると、退色で発色団はその幾何学構造を変化しつつあるが、発色団の移動はロドプシンの水素結合にもカルボン酸のプロトン化状態にも顕著な変化を起こさないことが明らかである。スペクトルデータと一致し、Ｇｔ活性化のモニターとしての光散乱変化は、非常に低いが測定可能のｐＨ非依存性活性を与えた。

６−および７−環−異性体によるロドプシンのインビボ再生：インビボ研究のためにレチノイド同族体で再生されるロドプシンを生成するために、Ｒｐｅ６５マウスをレドモンド（Ｒｅｄｍｏｎｄ）らの方法（２４）によって作成した。これらのマウスは１１−シス−レチナールの実質的量を産生することができない（Ｖａｎ Ｈｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８６２３−２８（２０００））。Ｒｐｅ６５＋／＋マウスのロドプシンは光感受性の発色団を有する。しかし、Ｒｐｅ６５−／−マウスを使用してインビボで１１−シス−７−固定−レチナールで再生したロドプシンは、光不感性ロドプシンを生成した。これは１％ＳＤＳの添加によって差スペクトルにおいて検出することができた。レチノイド分析は、予想される量の視物質の存在を明らかにした。７−環異性体類の混合物の注射が唯一の異性体生成物（１１−シス−７−環−レチナール、異性体３）を与えたとはいえ、６−環−含有レチナールの混合物は、これまでの研究（Ｊａｎｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６１４８−５３（２００１））から予想され得るように３種類の異性体を生成した。これらの結果は、１１−シス−レチナールの構造に酷似した１１−シス−７−環−レチナールで、オプシンがインビボで容易かつ優先的に再生されることを示唆する。

インビボにおける１１−シス−７−環−ロドプシンの活性の欠如：アッセイの感度を高めるため、およびインビボで７−固定−異性体で再生するロドプシンの特性を評価するために、Ｒｐｅ６５−／−マウスを異性体３で処置した。活性（ａ−およびｂ−波）はＭｅ_２ＳＯのみで処置したサンプルに比べてこの処置による影響を受けなかった。これに対して、陽性対照において９−シス−レチナールは、強度の低い光であっても処置マウスの感受性を有意に高めた。さらに、１１−シス−７−環−ロドプシンは精製ロドプシンキナーゼを使用するインビトロ燐酸化アッセイにおいて不活性であった。

つまり、これらの結果は、７−環−レチナールは、全ての試験条件においてほとんど不活性であるロドプシンを生成することを示す。この知見はインビボおよびインビトロにおける異なる感度を有する相補的方法、例えばＦＴＩＲ、ＥＲＧ、Ｇｔ活性化、および燐酸化などを検出アッセイとして使用することによって確認された。

１１−シス−６−環−Ｒｈはインビボおよびインビトロにおいて活性である：驚いたことに、６−環−含有レチナールでインビボ再生したロドプシンは、より強い退色において活性である。ａ−およびｂ−波はＭｅ_２ＳＯ対照と比べて明らかに高まった。この結果は、以前に測定したロドプシンの低活性と一致する（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６７６３−６９（１９９２）；Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６７７０−７５（１９９２）；Ｊａｎｇ．ｅｔ ａｌ．，２７６：２６１４８−５３（２００１））。ロドプシンおよび固定同族体を有する色素の相対的活性は次のようである。６−固定同族体で再生したロドプシンを含む膜では、野生型ロドプシンに匹敵するＧｔ活性化速度を誘発するためには１３５０倍強度の活性化光フラッシュが必要である。ＦＴＩＲスペクトルに見られるｐＨ依存性と一致し、この活性は酸性ｐＨでは上昇する。これは天然ロドプシンの周知のｐＨ／速度プロフィール（ｐＨ７．４における活性がｐＨ６．４に比べて高い）とは対照的である。その上、この結果の作用機序関係（「考察」（下記）を参照されたい）と並んで、これらのデータは固定された同族体の活性が単に内因性１１−シス−レチナールの痕跡量に起因するという考え方を排除することができる。さらに、６−固定同族体で再生したロドプシンの活性はヒドロキシルアミンに感受性を有し、光活性化光生成物が天然Ｒｈ^＊と同様な「開いた」コンホメーションを有することを示している。インビボでの知見と一致して、１１−シス−６−環−ロドプシンの活性は７−固定色素の活性より著しく高い。

ＦＴＩＲスペクトルは、１１−シス−６−環−ロドプシンの基礎状態の蛋白−発色団相互作用が退色サンプルとは異なることを示す。ｐＨ７．５では１２０６ｃｍ^−１のバンドによって示される発色団−蛋白相互作用の変化は、蛋白の顕著な変化には導かれず、残留活性だけが検出され得た（１４）。しかし、ｐＨ４．５では、同じ変化が水素結合の再配向および二次構造の変化に導き、Ｇｔ−（３４０−３５０）−由来のペプチドに結合できるＭｅｔａＩＩ様生成物を形成した。この知見は、ｐＨがオプシンの構造変化を誘発し、それが発色団と結合部位の蛋白環境との相互作用を可能にすることを示唆する。この変化のためのｐＫ_ａは５．４であり、ＭｅｔａＩＩ様構造は、１１−シス−レチナールで再生したＭｅｔａＩＩに匹敵する半値幅時間で崩壊する。Ｇｌｕ１１３のプロトン化に帰せられるＲｈｏ／ＭｅｔａＩＩ差スペクトルにおける１７１３ｃｍ^−１のバンドはｐＨ４．５で１１−シス−６−環−異性体で再生するＭｅｔａＩＩ様生成物においては１７０８ｃｍ^−１にシフトするようにみえる。１７１３ｃｍ^−１のＭｅｔａＩＩバンドとは対照的に、サンプルをＤ_２Ｏで処理した際にこのバンドは顕著にはシフトしないが、結合の形がわずかに変化した。興味深いことに、このバンドは１１−シス−６−環−異性体で再生したロドプシンのＥ１１３Ｑ突然変異体のＭｅｔａＩＩ様光生成物にも認められる。

（考察）
本研究の結果から、異なる、ただし関連する２つの論題、すなわちロドプシンの活性化メカニズムおよびレチノイド同族体のインビボ利用、に関する結論が導かれる。

ロドプシンの活性化：レチノイド同族体の研究から得られた新しい教訓：本研究は活性化プロセスに関する新しい重要な情報を明らかにした。明らかに異なる３種類の発色団−蛋白相互作用が１１−シス−７−環−および１１−シス−６−環−含有レチナールおよび１１−シス−レチナールで見いだされた。１）１１−シス−７−環−異性体で再生したロドプシンは野生型活性の０．１％を有するに過ぎない；これは感度の高いＥＲＧおよびＦＴＩＲ研究のいずれにおいても不活性である。この低活性は存在する遊離オプシンが少量である結果であり得、遊離オプシン：Ｒｈ^＊の推定活性化比率、すなわち１０^６：１と一致し得る。こうして１１−シス−７−環−レチナールはオプシン結合ポケットによって安定化され、安定な１１−シス−環−ロドプシンを形成するようにみえる。９，１１−ジシスおよび９，１１，１３−トリシスが退色すると最も安定な異性体である異性体３に変換し、Ｇｔ活性化の欠如と一致するＦＴＩＲスペクトルを生成する。２）これに対して、１１−シス−６−環−レチナールのＣ９＝Ｃ１０およびＣ１３＝Ｃ１４二重結合に沿って起こり得る移動は、ロドプシンの活性化におけるトリガーバリヤを十分に克服する。この活性はインビボにおいて、およびヌクレオチド取り込みおよび燐酸化アッセイを使用するこれまでの測定に比べて進歩した光散乱アッセイにおいて、明らかに検出できる。この活性状態はヒドロキシルアミンに対する感受性、ＦＴＩＲスペクトルの形、およびＧｔペプチドとの相互作用においてＭｅｔａＩＩに似ている。しかし１１−シス−６−環−Ｒｈの退色はｐＨ依存性のＧｔ活性化に導き、一方ＭｅｔａＩＩはｐＨの広範囲にわたる広い高活性を有する。この結果は、Ｃ９−Ｃ１０およびＣ１３−Ｃ１４に沿った異性化がロドプシンの発色団周囲を十分に弛緩させ、発色団−遊離オプシンで認められたような活性化が可能になることを示唆する。しかしロドプシンの活性化は鍵となる残基の正しい「強制」プロトン化では達成されない。完全な活性化が起きるのは、全トランス−レチニリデンが最も伸展したコンホメーションをとり、発色団のβ−イオノン環がその蛋白環境に作用し得る場合だけである。活性化メカニズムはまだ明らかでないとはいえ、もう一つの驚くべき考察との深い関係、すなわちＦＴＩＲスペクトルが活性種を示す一方、対イオンＧｌｕ１１３のプロトン化および塩架橋破壊を示すスペクトルモチーフのスペクトル特性が変化するということが推測される。

ｐＨ依存性活性の最も明快な説明は、Ｈ＋が、部分的に光で活性化され、野生型ロドプシンの光活性化中に発生する状態に類似する仕方で、レチナール結合部位に適合するというものである。もう一つの矛盾しない説明は、６−環−レチナールの制限された光化学が、重要な残基（類）（Ｇｌｕ１１３を含む）のプロトン化および活性コンホメーション（オプシン／オプシン^＊平衡に類似している）の形成を最後には可能にするような仕方で、それら（６−環−レチナール）の逆アゴニスト様特性を一部分除去するのに十分である、というものである。３）天然ＭｅｔａＩＩでは、エネルギー量は、中性ｐＨにおいても塩基性ｐＨ値においてさえも受容体を活性コンホメーションにすることができる程十分大きい。１１−シス−６−環−Ｒｈの光誘発性活性種の見かけｐＫ_ａは５．４で、１ｐＨ単位だけより低く、遊離Ｇｌｕ残基のｐＫ_ａから約１．５ｋｃａｌ離れる。その一方、ＭｅｔａＩＩのプロトン化種は６．７のｐＫ_ａを有する。天然ロドプシンおよび１１−シス−６−環−レチナール再生−ロドプシンにおいて観察された活性種のある残基を、天然ｐＫａより高いｐＨにおいてプロトン化するにはエネルギーが必要である。

結論として、天然または６−固定−レチナールのロドプシン結合ポケットにおけるレチナール異性化は、Ｇｔとのカップリングを可能にするような蛋白のコンホメーション変化を起こすようである。興味深いことに、この特性は特異的であり、しかも非常に類似している６−環−および７−環−含有レチナールを区別する。この相違はおそらく、活性部位における両レチナールのコンホメーション、環によって与えられる固定性、および６−環−含有レチナールの容易な異性化に起因する。

レーバー先天性黒内障における６−および７−環−含有同族体の使用：ＲＰＥ６５遺伝子の突然変異が確認されているのは、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）と診断された患者（Ｌｅｂｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１５：１−２５（１８６９；Ｍａｒｌｈｅｎｓ ｅｒ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１９４−９７（１９９７）））、および常染色体劣性小児期発生性重症網膜ジストロフィー患者（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１９４−９７（１９９７））、および常染色体劣性色素性網膜炎患者（Ｍｏｒｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３０８８−９３（１９９８））である。ＬＣＡの特徴は、先天性盲目、または貧弱な中心視力、軽度の眼底変化、ほとんど存在しないエレクトロレチノグラム・シグナル、眼振、乳頭反応の低下、時には光恐怖症（Ｓｃｈａｐｐｅｒｔ−Ｋｉｍｍｉｊｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ １３７：４２０−２２（１９４９））、場合によっては網膜の色素性変性、杆体光受容体の欠如、錐体のレムナント、ＲＰＥにおける色素の凝集、および網脈絡膜接着の欠如（Ｌｅｂｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１５：１−２５（１８６９）；Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．７１：６８３−６９０（１９６４））である。ＬＣＡの遺伝的異常は、種々の生理学的経路からの遺伝子に関連し（Ｃｒｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：１１６９−７６（２００２））、ＲＰＥ６５遺伝子の突然変異が全てのＬＣＡ症例の約１２％を占める（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４１：４２９３−９９（２０００））。

ＬＣＡを治療するための数種類の治療アプローチが提案されている。これらの方法としては、ＲＰＥ移植、遺伝子代替治療、および薬理的介入が挙げられる。今日まで、動物における遺伝的変性の大部分の実験的治療介入は変性の進行を遅らせることを目的にしている。ＲＰＥ６５遺伝子の突然変異によって起きるレチノイドサイクルのブロックは、有望なことに、９−シス−レチナールの経口添加、およびそれによるイソ−ロドプシンの形成によって薬理的に克服されるらしい。シス−レチノイド投与後４８時間以内に杆体光色素が形成され、杆体の生理的状態は劇的に改善され、ＲＰＥ６５が存在しない場合薬理的介入が視力を回復する可能性が示された。視機能の回復に関する９−シス−レチナール介入の効果に関するこの長期研究は、この考え方をさらに支持するものである。

これまでの実施例は説明のためのものであり、本願発明の範囲を制限するものではない。本発明のその他の変形は当業者には容易に理解されるものであり、添付の請求項に包含される。全ての公報、特許、特許出願およびここに記載されるその他の参考文献は参考として本明細書に組み込まれる。

（配列表）

Claims (1)

1. 本願図面に記載の発明。

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