JP2017008100A - 迅速かつ持続的な免疫学的治療法 - Google Patents

迅速かつ持続的な免疫学的治療法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明の目的は、様々な疾患状況において病原体に対して迅速で持続的かつ広範な保護的応答を誘発できる組成物を提供することである。【解決手段】本発明が解決しようとする課題は、E1/E3欠損アデノウイルス粒子の鼻腔内投与によって解決できることが見出された。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、2011年3月21日に出願された米国仮特許出願第61/454,819号および2011年12月8日に出願された米国仮特許出願第61/568,054号に対する優先権を主張するものである。
米国特許第6,348,450号、第6,706,693号、第6,716,823号および第7,524,510号、米国特許出願公開第20030045492号、第20030125278号、第20040009936号、第20050271689号、第20070178115号、第20090175897号および第20110268762号ならびに米国特許出願第12/959,791号について参照する。
先述の出願と、そこに引用されているまたは審査中のあらゆる文書(「出願に(appln)引用されている文書」)と、出願に引用されている文書に引用または参照されているあらゆる文書と、本明細書に引用または参照されているあらゆる文書(「本明細書に引用されている文書」)と、本明細書に引用されている文書に引用または参照されているあらゆる文書は、本明細書または本明細書に援用されているいずれかの文書において言及されているいずれかの製品のいずれかのメーカー説明書、明細、製品仕様書および製品規格書と共に、これによりここに本明細書の一部を構成するものとしてそれらの内容が援用されており、本発明の実施において利用することができる。より具体的には、参照されているあらゆる文書は、あたかも個々の文書それぞれが参照により援用されていると明確かつ個々に示されるのと同じ程度まで、参照により援用されている。
本発明は、一般に、免疫学および治療技術の分野に関する。本発明はまた、迅速で持続的な自然免疫応答を誘発する方法と、その使用に関する。
連邦政府補助金に関する説明文(FEDERAL FUNDING LEGEND)
本発明は、一部には、国立衛生研究所(National Institutes of Health)助成金2-R44-AI-068285-02、1-UC1-AI-067198-01および1-UC1-AI-067205-1;国立衛生研究所契約N01-AI-30063;ならびに国立アレルギー感染症研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)非臨床的評価協定(Non-Clinical Evaluation Agreement)の支援を受けている。連邦政府は、本発明に対し一定の権利を有し得る。
免疫(例えば、ワクチン)および治療法(例えば、薬物)がもたらす病気と闘う力は、世界的な死亡率および罹患率低下をもたらしたので、公衆衛生の観点から非常に有用なものであった。医療介入の力をさらに増幅させるための目標は、低コストで大量生産し、非医療従事者により大量投与することができる新世代の迅速応答免疫と共に、好ましくは薬剤耐性により損なわれることのない、持続的な保護を付与することができる新世代の治療法の開発を必要とする。新たな免疫および治療法には、従来のワクチンおよび薬物よりも高い安全範囲が付与されている必要もある。
微生物は、突然変異圧下で絶えず進化し続けるため、微生物病原体に対する従来の薬物の使用は多くの場合、経時的に薬剤耐性を誘導する。本発明は、E1/E3欠損(ΔE1E3)アデノウイルス粒子の鼻腔内投与後に、気道における生息環境を変化させて病原体の増殖を妨害することにより、抗ウイルスまたは抗細菌状態が、動物において迅速に誘導され得ることを例証する。アデノウイルス粒子は、病原体を直接的に攻撃しないため、この新規治療法が薬剤耐性を誘導する可能性はほとんどない。さらに、病原体に由来する抗原がワクチンとしてアデノウイルスゲノムに挿入されている場合、アデノウイルスに誘導される抗病原体状態は、アデノウイルスから発現された病原体に由来する抗原により誘発された防御免疫の誘導と重複するのに十分な長さで動物において何週間も持続し得る。非複製的アデノウイルス粒子は、治療補助剤として他の粘膜ワクチンと同時投与してよいと考え得る。
非複製的アデノウイルスベクター化(vectored)ワクチンは、ワクチン適用範囲の強化において有望であるが、その理由として、このベクターは、需要の変動に応じて無血清浮遊細胞において迅速に製造することができるからである。さらに、先在のアデノウイルス免疫は、アデノウイルスベクター化経鼻ワクチンの効力に感知できるほどには干渉しない。人間へのワクチン接種に加えて、このクラスのベクター化ワクチンにより動物も大量免疫化することができる。
より優れたワクチンに対する非常に大きな需要がある。ワクチン接種は、疾患予防における最も対費用効果の高い方法であることが分かっているが、ワクチン適用範囲を強化するための広範囲の攻撃的姿勢は、依然として世界的な公衆衛生改善に向けた動きにおける切実な目標である。流通が認可された現在のワクチンとして、死滅した微生物全体、生きた弱毒化微生物、微生物抽出物、精製または組換えタンパク質、DNAワクチンおよびウイルス様粒子が挙げられる。これらワクチンを広く配布することにより多くの疾患を打ち負かしてきたが、多種多様な疾患状況において共同体(集団)免疫を生じるための目標は、現在のワクチン接種プログラムにおける数多くの問題のために、依然として到達しがたい。
特に、ワクチン関連の有害な副作用は、局所および全身性炎症応答、発熱、血小板活性化、心臓性自律神経障害、アナフィラキシー反応(特定のワクチンの針注射により誘導)[Salomon ME、Halperin R、Yee J. Evaluation of the two-needle strategy for reducing reactions to DPT vaccination. Am. J. Dis. Child. 141、796〜798(1987)、Lanza GA、Barone L、Scalone Gら、Inflammation-related effects of adjuvant influenza A vaccination on platelet activation and cardiac autonomic function. J. Intern. Med. 269、118〜125 (2011)、Jae SY、Heffernan KS、Park SHら、Does an acute inflammatory response temporarily attenuate parasympathetic reactivation? Clin. Auton. Res. 20、229〜233(2010)およびSever JL、Brenner Al, Gale ADら、Safety of anthrax vaccine: an expanded review and evaluation of adverse events reported to the Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS). Pharmacoepidemiol. Drug Saf. 13、825〜840(2004)]から、滅多に発生しない麻痺性灰白髄炎(経口ポリオワクチンの経口摂取による)[Minor P. Vaccine-derived poliovirus (VDPV): impact on poliomyelitis eradication. Vaccine 27、2649〜2652(2009)]、心筋心膜炎(Dryvax天然痘ワクチンの接種により誘導)[Poland GA、Grabenstein JD、Neff JM. The US smallpox vaccination program: a review of a large modern era smallpox vaccination implementation program. Vaccine 23、2078〜2081(2005)]およびベル麻痺(細菌毒素経鼻アジュバントにより誘導)[Lewis DJ、Huo Z、Barnett Sら、Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS ONE 4、e6999(2009)およびCouch RB. Nasal vaccination, Escherichia coli enterotoxin, and Bell's palsy. N. Engl. J. Med. 350、860〜861(2004)]に及ぶ。
2010年、スクアレンアジュバントを含有するH1N1汎発性インフルエンザワクチンの針注射後に、ワクチン接種者におけるナルコレプシーの突然の発生が数か国で報告された。スクアレン単独の注射は、動物において関節リウマチを誘導し得る[Carlson BC, Jansson AM, Larsson A, Bucht A, Lorentzen JC. The endogenous adjuvant squalene can induce a chronic T-cell-mediated arthritis in rats. Am. J. Pathol. 156, 2057〜2065(2000)]。新たな証拠は、慢性、低悪性度の炎症が、心血管疾患[Finch CE、Crimmins EM. Inflammatory exposure and historical changes in human life-spans. Science 305、1736〜1739(2004)]、肥満[Gregor MF、Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29、415〜445(2011)]、糖尿病[Gregor MF、Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29、415〜445(2011)]、癌[O'Callaghan DS、O'Donnell D、O'Connell F、O'Byrne KJ. The role of inflammation in the pathogenesis of non-small cell lung cancer. J. Thorac. Oncol. 5、2024〜2036(2010)]および神経障害[Witte ME、Geurts JJ、de Vries HE、van der Valk P、van Horssen J. Mitochondrial dysfunction: a potential link between neuroinflammation and neurodegeneration? Mitochondrion 10、411〜418(2010)]を伴うことを示すため、そこでワクチン誘導性炎症に着目する必要がある。
免疫刺激用ワクチンアジュバント複合体の注射により誘導された急性炎症反応[Salomon ME、Halperin R、Yee J. Evaluation of the two-needle strategy for reducing reactions to DPT vaccination. Am. J. Dis. Child. 141、796〜798(1987)、Lanza GA、Barone L、Scalone Gら、Inflammation-related effects of adjuvant influenza A vaccination on platelet activation and cardiac autonomic function. J. Intern. Med. 269、118〜125(2011)およびJae SY、Heffernan KS、Park SHら、Does an acute inflammatory response temporarily attenuate parasympathetic reactivation? Clin. Auton. Res. 20、229〜233(2010)]が、慢性、低悪性度の炎症へと進展し、ワクチン接種者のサブセットにおいてこれらの病気のいずれかを経時的に引き起こし得るか否かは、公衆衛生において極めて重要である。しかし、このような潜在的危険性は、厳密に調査されていない。ワクチン安全性の概念は、「病原体に誘導される疾患からの保護」から「有害な結果を誘導する可能性なし」へと進化しているため、いかなる公知の外来性薬剤、毒性および残存病原性もワクチンに存在することを許されず、未知の副作用(例えば、重要臓器における炎症)を誘導するいかなる可能性も回避する必要がある。
粘膜および全身性免疫応答は、かなりの独立性をもって誘発および調節されており、多くのワクチンは、筋肉内注射により侵襲的に投与され、筋肉内注射は、優れた全身性免疫を誘導するが、多くの場合、粘膜病原体(例えば、インフルエンザウイルス、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)およびHIV)に対する防御において決定的な粘膜免疫が弱い[Gallichan WS、Rosenthal KL. Long-lived cytotoxic T lymphocyte memory in mucosal tissues after mucosal but not systemic immunization. J. Exp. Med. 184、1879〜1890(1996)およびSaurer L、McCullough KC、Summerfield A. In vitro induction of mucosa-type dendritic cells by all-trans retinoic acid. J. Immunol. 179、3504〜3514(2007)]。IgAスイッチを誘導し、リンパ球における粘膜特異的ホーミング受容体(例えば、CCR9およびα4β7インテグリン)をインプリントする常在性粘膜樹状細胞(DC)特有の能力のため、粘膜免疫の効率的な誘導には通常、経鼻または経口ワクチン接種を利用する[Saurer L、McCullough KC、Summerfield A. In vitro induction of mucosa-type dendritic cells by all-trans retinoic acid. J. Immunol. 179、3504〜3514(2007)およびMolenaar R、Greuter M、van der Marel APら、Lymph node stromal cells support dendritic cell-induced gut-homing of T cells. J. Immunol. 183、6395〜6402(2009)]。
注射用ワクチンにより誘導される弱い粘膜免疫に加えて、ワクチン投与装置としての注射器針も、故意または不注意の非滅菌的再利用、針刺し損傷、不適切な廃棄物処理、および急性発症時における免許を持つ医療従事者に限定された注射施術による重大な問題を提起する[Tang DC、Van Kampen KR. Toward the development of vectored vaccines in compliance with evolutionary medicine. Expert Rev. Vaccines 7(4)、399〜402(2008)]。先のとがった針に対する一般市民の不安(尖鋭恐怖症)は、ワクチン適用範囲阻害において別の役割を果たす。このように、一部の人達は、全身性ワクチン接種により痛み、損傷または死を迎える確率よりも罹病の確率を選ぶ可能性がある。ワクチン接種プログラムの目的は、共同体(集団)免疫を生じることにより感染の全体的な確率を低下させることであるため、リスクに対する一般市民の不安のためワクチン接種が控えられることにより、この使命が損なわれるであろう。現在までに、安全、有効、無痛性かつ経済的な新世代の迅速応答ワクチンを開発することにより否定的な見方を逆転させるための実現技術が、現れつつある。
本願におけるいかなる文書の引用または特定も、このような文書が本発明に対する先行技術として利用できることの承認ではない。
米国特許第5,990,091号 WO99/60164 PCT/US99/11066 WO98/00166 PCT/US97/11486 米国特許第6,004,777号 米国特許第5,997,878号 米国特許第5,989,561号 米国特許第5,976,552号 米国特許第5,972,597号 米国特許第5,858,368号 米国特許第5,863,542号 米国特許第5,833,975号 米国特許第5,863,542号 米国特許第5,843,456号 米国特許第5,766,598号 米国特許第5,766,597号 米国特許第5,762,939号 米国特許第5,756,102号 米国特許第5,756,101号 米国特許第5,494,807号
Salomon ME、Halperin R、Yee J. Evaluation of the two-needle strategy for reducing reactions to DPT vaccination. Am. J. Dis. Child. 141、796〜798(1987) Lanza GA、Barone L、Scalone Gら、Inflammation-related effects of adjuvant influenza A vaccination on platelet activation and cardiac autonomic function. J. Intern. Med. 269、118〜125 (2011) Jae SY、Heffernan KS、Park SHら、Does an acute inflammatory response temporarily attenuate parasympathetic reactivation? Clin. Auton. Res. 20、229〜233(2010) Sever JL、Brenner Al, Gale ADら、Safety of anthrax vaccine: an expanded review and evaluation of adverse events reported to the Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS). Pharmacoepidemiol. Drug Saf. 13、825〜840(2004) Minor P. Vaccine-derived poliovirus (VDPV): impact on poliomyelitis eradication. Vaccine 27、2649〜2652(2009) Poland GA、Grabenstein JD、Neff JM. The US smallpox vaccination program: a review of a large modern era smallpox vaccination implementation program. Vaccine 23、2078〜2081(2005) Lewis DJ、Huo Z、Barnett Sら、Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS ONE 4、e6999(2009) Couch RB. Nasal vaccination, Escherichia coli enterotoxin, and Bell's palsy. N. Engl. J. Med. 350、860〜861(2004) Carlson BC, Jansson AM, Larsson A, Bucht A, Lorentzen JC. The endogenous adjuvant squalene can induce a chronic T-cell-mediated arthritis in rats. Am. J. Pathol. 156, 2057〜2065(2000) Finch CE、Crimmins EM. Inflammatory exposure and historical changes in human life-spans. Science 305、1736〜1739(2004) Gregor MF、Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29、415〜445(2011) O'Callaghan DS、O'Donnell D、O'Connell F、O'Byrne KJ. The role of inflammation in the pathogenesis of non-small cell lung cancer. J. Thorac. Oncol. 5、2024〜2036(2010) Witte ME、Geurts JJ、de Vries HE、van der Valk P、van Horssen J. Mitochondrial dysfunction: a potential link between neuroinflammation and neurodegeneration? Mitochondrion 10、411〜418(2010) Gallichan WS、Rosenthal KL. Long-lived cytotoxic T lymphocyte memory in mucosal tissues after mucosal but not systemic immunization. J. Exp. Med. 184、1879〜1890(1996) Saurer L、McCullough KC、Summerfield A. In vitro induction of mucosa-type dendritic cells by all-trans retinoic acid. J. Immunol. 179、3504〜3514(2007) Molenaar R、Greuter M、van der Marel APら、Lymph node stromal cells support dendritic cell-induced gut-homing of T cells. J. Immunol. 183、6395〜6402(2009) Tang DC、Van Kampen KR. Toward the development of vectored vaccines in compliance with evolutionary medicine. Expert Rev. Vaccines 7(4)、399〜402(2008) Zhangら、PLoS ONE 6、e22605(2011) Boyerら、Hum. Gene Ther. 16、157〜168(2005) Tang DC、Zhang J、Toro H、Shi Z、Van Kampen KR(2009) Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert Rev Vaccines 8:469〜481 Fieldsら、Virology 2, Ch. 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers) van Ginkelら、J. Immunol 159(2):685〜93(1997)(「Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene」) Osterhausら、Immunobiology 184(2〜3):180〜92(1992)(「Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man」) Van Kampen KR、Shi Z、Gao Pら、Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in human. Vaccine 23、1029〜1036(2005) Toro H、Tang DC、Suarez DL、Sylte MJ、Pfeiffer J、Van Kampen KR. Protective avian influenza in ovo vaccination with nonreplicating human adenovirus vector. Vaccine 25、2886〜2891(2007) Zhang J、Tarbet EB、Feng T、Shi Z、Van Kampen KR、Tang DC. Adenovirus-vectored drug-vaccine duo as a rapid-response tool for conferring seamless protection against influenza. PLoS ONE 6、e22605(2011) Shi Zら、J. Virol. 75: 11474、2001 Hoelscher MAら、Lancet 367: 475、2006 Croyle MAら、PLoS ONE 3: e3548、2008 Song Kら、PNAS 107: 22213、2010
本発明は、導入遺伝子を含まないΔE1E3アデノウイルスの空の粒子または病原体に由来する抗原をコードするアデノウイルスベクターが鼻腔内投与されると、様々な疾患状況において病原体に対して迅速で持続的かつ広範な保護的応答を誘発し得るという、本発明者の思いがけない発見に基づく。
制約に縛られることなく、本出願人は、アデノウイルスが、呼吸粘膜病原体の増殖を妨害する自然免疫の特異的な武器(arm)の活性化に関与し得ると仮定する。
本発明は、E1および/またはE3領域が欠損または欠失したアデノウイルスを、応答の誘導に有効な量で患者に投与するステップを含み得る、それを必要としている患者における応答を誘導する方法に関する。有利な一実施形態において、患者は、哺乳類となり得る。
一実施形態において、アデノウイルスは、導入遺伝子を含有せずこれを発現しない。
別の一実施形態において、アデノウイルスは、遺伝子産物をコードする核酸分子を含有しこれを発現し得る。特に、アデノウイルスは、防御免疫を誘発する、病原体に由来する遺伝子産物をコードする外因性または異種核酸分子を含み得る。外因性または異種核酸分子は、対象のエピトープをコードし得る。特に、外因性または異種核酸分子は、1もしくは複数種のインフルエンザウイルス;呼吸器多核体ウイルス(RSV);炭疽菌(Bacillus anthracis);もしくは他の病原体に由来する対象のエピトープおよび/または1もしくは複数種のインフルエンザ抗原をコードし得る。
有利な一実施形態において、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスとなり得る。別の一実施形態において、免疫応答は、24時間以内に誘発され得る。別の一実施形態において、投与は、約1日間から約47日間の保護的応答をもたらす。
そこで、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、これにより以前より公知のいかなる製品、プロセスまたは方法の放棄も開示するように、以前より公知のいかなる製品、該製品を作製するプロセスまたは該製品を使用する方法も本発明の範囲内に網羅しないことである。本出願人らが権利を留保し、これにより以前に記載されたいかなる製品、該製品を作製するプロセスまたは該製品を使用する方法の放棄も開示するように、本発明が、米国特許商標庁(USPTO)(米国特許法第112条、第1段落)または欧州特許庁(EPO)(欧州特許条約第83条)の明細書記載要件および実施可能要件を満たさない、いかなる製品、該製品を作製するプロセスまたは該製品を使用する方法も本発明の範囲内に網羅することを企図しないことにさらに留意されたい。
本開示、特に、特許請求の範囲および/または段落において、「含む(comprises)」、「含んだ(comprised)」、「含んでいる(comprising)」その他の用語が、米国特許法における該用語に帰属する意味を有し得ること、例えば、これらの用語は、「包含する(includes)」、「包含した(included)」、「包含している(including)」その他を意味し得ることに留意されたい。また、「から実質的になっている(consisting essentially of)」および「から実質的になる(consists essentially of)」等の用語が、米国特許法における該用語に帰する意味を有すること、例えば、これらの用語は、明示的に列挙されていない構成要素を認めるが、先行技術に見いだされる構成要素、あるいは本発明の基礎的特徴または新規特徴に影響を与える構成要素を除外することに留意されたい。
上述および他の実施形態は、次の詳細な説明に開示されている、あるいは次の詳細な説明から明らかであり、これに網羅されている。
次の詳細な説明は、例として挙げるものであり、記載されている特定の実施形態のみに本発明を限定するようには企図されておらず、添付の図面と併せて読むことにより最もよく理解することができる。
アデノウイルス粒子の鼻腔内投与による、インフルエンザウイルスチャレンジに対するマウスの迅速な保護を示す図である。 アデノウイルス粒子の鼻腔内投与による、炭疽菌に対するマウスの迅速な保護を示す図である。 マウスにおけるA/PR/8/34(PR8)による致死的チャレンジに対する予防療法を描写する図である。PR8チャレンジ直前にAd5粒子をi.n.投与することにより予防療法を行った。AdE/in/-2およびAdE*/in/-2、-2日目におけるAdEのi.n.投与;AdE/in/+1、PR8チャレンジ1日後におけるAdEのi.n.投与;AdE/im/-2、-2日目におけるAdEのi.m.注射; 1.7×6106ifu用量を与えたAdE*/in/-2およびAdNC*/in/-2群以外の全群に、1.7×6106ifu用量のAdEまたはAdNC.H1.1を接種した;4×LD50のPR8のi.n.滴下注入により0日目に全群をチャレンジした;チャレンジ後18日間毎日体重を記録し、30%体重減少を疾患エンドポイントと考慮した;括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。 マウスにおけるA/PR/8/34(PR8)による致死的チャレンジに対する予防療法を描写する図である。PR8チャレンジ直前にAd5粒子をi.n.投与することにより予防療法を行った。AdNC/in/-2およびAdNC*/in/-2、-2日目におけるAdNC.H1.1のi.n.投与;AdNC/im/-2、-2日目におけるAdNC.H1.1のi.m.注射;未処理対照、PR8チャレンジに先立つ処理なしBalb/cマウス; 1.7×6106ifu用量を与えたAdE*/in/-2およびAdNC*/in/-2群以外の全群に、1.7×6106ifu用量のAdEまたはAdNC.H1.1を接種した;4×LD50のPR8のi.n.滴下注入により0日目に全群をチャレンジした;チャレンジ後18日間毎日体重を記録し、30%体重減少を疾患エンドポイントと考慮した;括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。 より高用量のPR8チャレンジに対する、Ad5を介した予防療法およびワクチン接種によるマウスの保護を描写する図である。AdNC/in/-47、-47日目におけるAdNC.H1.1のi.n.投与;AdE/in/-47、-47日目におけるAdEのi.n.投与;AdE/in/-47-2、-47日目におけるAdEのi.n.投与と、続く-2日目の追加免疫適用;全群に1.2×108ifu用量のAd5粒子を接種し、続いて0日目に10×LD50のPR8をチャレンジした;チャレンジ後14日間毎日体重を記録した;他の記号およびプロトコールは、図3の説明文の記載と同一である。 より高用量のPR8チャレンジに対する、Ad5を介した予防療法およびワクチン接種によるマウスの保護を描写する図である。AdE/in/-1、-1日目におけるAdEのi.n.投与;wtAd/in/-1、-1日目におけるE1+/E3+野生型Ad5粒子のi.n.投与;全群に1.2×108ifu用量のAd5粒子を接種し、続いて0日目に10×LD50のPR8をチャレンジした;チャレンジ後14日間毎日体重を記録した;他の記号およびプロトコールは、図3の説明文の記載と同一である。 体重減少により示される、PR8をチャレンジした動物の健康状態を描写する図である。チャレンジ後の体重は、1日目における個々のマウスの体重を100%として、平均%体重として表示する。記号およびチャレンジプロトコールは、図3および図4の説明文の記載と同一である。AdE/in/-47-2およびAdNC/in/-47動物は、他の群におけるマウスよりも少ない体重減少であったが、この差は統計学的有意性(チューキー(Turkey)の多重比較ポストテストを用いた一元配置ANOVAによる;データ点の初期終結のため、統計解析において未処理対照群は除外した)に達しなかった。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。PR8チャレンジ19日後の未処理対照マウス(図3)から切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。2×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。対照としての正常Balb/cマウスから切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。2×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。PR8チャレンジ19日後のAdE/in/-2マウス(図3)から切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。2×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。PR8チャレンジ19日後のAdNC/in/-2マウス(図3)から切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。2×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。PR8チャレンジ19日後の未処理対照マウス(図3)から切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。10×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。対照としての正常Balb/cマウスから切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。10×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。PR8チャレンジ19日後のAdE/in/-2マウス(図3)から切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。10×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 PR8感染により誘導した肺病理組織診断を描写する図である。PR8チャレンジ19日後のAdNC/in/-2マウス(図3)から切除した肺。各切片は、3匹のマウスの代表である。10×対物レンズを用いたZeiss Axioskop2 plus顕微鏡において、Axiocamデジタルカメラと併せて肺切片を検査した。 チャレンジ後の肺におけるPR8力価を描写する図である。-2日目にAdE粒子(50ml当たり1.2×108ifu)をマウスにi.n.滴下注入し、続いて対照およびAdE曝露したマウスを、0日目に4.6×106pfuのPR8でチャレンジした。5日目、PR8チャレンジ5日後の対照マウスから切除した肺におけるPR8力価;AdE・5日目、PR8チャレンジ5日後のAdE曝露したマウスから切除した肺におけるPR8力価;7日目、PR8チャレンジ7日後の対照マウスから切除した肺におけるPR8力価;AdE・7日目、PR8チャレンジ7日後のAdE曝露したマウスから切除した肺におけるPR8力価;三角形および丸、個々のマウスにおけるlog2(PR8のpfu)/g肺;バー、肺におけるPR8力価の幾何平均。PR8をチャレンジしていない対照マウスから切除された肺において、PR8力価は検出されなかった。7日目およびAdE・7日目の間の差は、統計学的有意性(チューキーの多重比較ポストテストを用いた一元配置ANOVAによる)に達した。 マウスにおけるパンデミックCA04による致死的チャレンジに対する保護を描写する図である。AdEまたはAdNC.H1.1粒子(50μl当たり2.5×108ifu)を、変動する時点においてマウスにi.n.滴下注入し、続いてCA04チャレンジした。AdE/in/-22、-22日目におけるAdEのi.n.投与;AdNC/in/-22、-22日目におけるAdNC.H1.1のi.n.投与;プラセボ対照、-22日目における50μl生理食塩水のi.n.投与;3×LD50のパンデミックCA04のi.n.滴下注入により動物を0日目にチャレンジした;他の記号およびプロトコールは、図3の説明文の記載と同一である。 アデノウイルスの構築を描写する図である。(A)Ad粒子の構造。Adは、正二十面体の無エンベロープDNAウイルスである。そのしっかりとコイルしたDNAゲノムは、六方晶系タンパク質カプシド内部にパッケージングされている。(B)ΔE1E3 Ad5ベクターのレイアウト。ΔE1E3 Ad5ベクターは、多数の遺伝子療法やワクチン治験において広く用いられてきた。その高い免疫原性は、再投与のハードルであると考慮されてきた。しかし、ΔE1E3 Ad5ベクター化経鼻ワクチンが、先在のAd5免疫を迂回することができることを示す近年の証拠により、この問題は軽減された。Ad:アデノウイルス; LITR:左逆位末端配列;プロモーター:導入遺伝子発現を促す一般的なプロモーターは、サイトメガロウイルス初期プロモーターである;ポリA+:一般的なポリアデニル化部位は、SV40ポリアデニル化シグナルである;RITR:右逆位末端配列。 生物工学によって作られた非複製的アデノウイルスベクターの系統図を描写する図である。ヒトおよび動物のAdは両者共に、動物およびヒト対象への外因性遺伝子の送達のための多種多様な非複製Adベクターへと生物工学によって作られた。Ad:アデノウイルス。 Ad5ベクター化薬物・ワクチンデュオ(drug-vaccine duo)の鼻腔内投与により付与される完璧な保護を描写する図である。AdE(導入遺伝子なしの空のΔE1E3 Ad5粒子)またはAdNC.H1.1(A/New Caledonia/20/99 HA1ドメインをコードするΔE1E3 Ad5ベクター)の鼻腔内滴下注入が、生きたインフルエンザウイルスチャレンジに対するほとんど即時のマウス保護を付与し得ることが近年実証された[Zhangら、PLoS ONE 6、e22605(2011)]。AdEに誘導された予防療法は、マウスにおいて少なくとも22日間持続し、部分的な効力減退がAdE投与47日後に観察された。AdNC.H1.1に誘導された保護は、47日後に堅実であった。実線:堅実な保護の時間枠;破線:部分的保護の時間枠。AdEに誘導された完全な保護は22日間観察されたが、一方、部分的な保護は投与後47日間観察されたため、実線に続く破線により示す通り、DVDの薬物効果が22日後に減退開始したことが想定された。Ad5粒子を0日目に接種した場合の14日目に開始するDVDのワクチン効果の実線により示す通り、Ad5ベクター化ワクチンが、免疫化後早くも2週間で防御免疫を誘発できることが報告された[Boyerら、Hum. Gene Ther. 16、157〜168(2005)]。薬物効果が減退する前に防御免疫をワクチンにより誘発できるため、結果は、インフルエンザに対する完璧な保護が、Ad5ベクター化DVDの鼻腔内投与によりマウスにおいて達成され得ることを示す。Ad:アデノウイルス;DVD:薬物・ワクチンデュオ。 A/VN/1203/04(H5N1)トリインフルエンザウイルスから、Ad5ベクター化経鼻ワクチンにより保護されたマウスを描写する図である。マウスを0日目にi.n.免疫化し、63日目にSRIにおける10×MLD50(104.4EID50)用量のA/VN/1203/04(H5N1)でチャレンジした。HA、HA1+HA2をコードするAd;HA1、HA1をコードするAd;E7、107vp;E10、1010vp;HI、49日目における血清HI力価のGMT。 A/VN/1203/04(H5N1)トリインフルエンザウイルスに対して、Ad5ベクター化経鼻ワクチンにより保護されたフェレットを描写する図である。フェレットを0日目にi.n.免疫化し、56日目にSRIにおける10FLD50(102EID50)用量のA/VN/1203/04でチャレンジした。HA、HA1+HA2をコードするAd;HA1、HA1をコードするAd;E10、1010vp;HI、51日目における血清HI力価のGMT。 胞子チャレンジ直前のアデノウイルス粒子の鼻腔内滴下注入による予防的炭疽菌療法を描写する図である。AdVAV/-2、チャレンジ2日前にi.n.滴下注入した1.3×108ifu用量のAdVAV粒子;AdE/-2、チャレンジ2日前にi.n.滴下注入した1.3×108ifu用量のAdE粒子;AdE*/-2、チャレンジ2日前にi.n.滴下注入した1.3×106ifu用量(PBSに100倍希釈)のAdE粒子;AdE/-1、チャレンジ1日前にi.n.滴下注入した1.3×108ifu用量のAdE粒子;対照、未処理対照マウス;括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。 AdVAV粒子のi.n.滴下注入による曝露後炭疽菌療法を描写する図である。AdVAV/D-2、チャレンジ2日前にi.n.滴下注入した1.3×108ifu用量のAdVAV粒子;AdVAV/D0、チャレンジ1時間後にi.n.滴下注入した1.3×108ifu用量のAdVAV粒子;AdVAV/Cipro/D0、シプロフロキサシンのi.p.注射と併せたチャレンジ1時間後にi.n.滴下注入した1.3×108ifu用量のAdVAV粒子;Cipro/D0、シプロフロキサシンのi.p.注射;対照、チャレンジに先立つ処理なしの未処理対照マウス;括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。 +4日目のRSV-Tracy鼻洗浄液および肺洗浄ウイルス力価における、鼻腔内投与されたAdEの効果を描写する図である。群1:賦形剤(A195バッファー)で予防的(-2日目)に鼻腔内処理した6匹のCR、群2:2.4×108ifuのAdEで予防的(-30日目)に鼻腔内処理した6匹のCR、群3:2.4×108ifuのAdEで予防的(-2日目)に鼻腔内処理した6匹のCR、群4:各処理サイクル(予備刺激/追加免疫)において2.4×108ifuのAdEで予防的(-30日目および-2日目)に鼻腔内処理した6匹のCR、ならびに群5:2.4×108ifuのAdEで予防的(-5時間目)に鼻腔内処理した6匹のCR。
本発明は、一部には、空のAdベクター(挿入なしのE1/E3欠失)の投与1日後もの迅速さで、マウスがインフルエンザチャレンジから保護されるという本発明者の発見に基づく。この保護の機序は、現在不明であるが、非常に広範囲にわたる保護である。季節性インフルエンザチャレンジ、ブタインフルエンザチャレンジ、鳥インフルエンザチャレンジ、RSVチャレンジ、さらには炭疽菌チャレンジからマウスを保護した。この保護は、約1日間から約47日間持続する。野生型Ad対照は、いかなる保護ももたらさず、筋肉内投与したワクチンは、いかなる保護ももたらさなかった。遺伝子がE1領域に挿入された場合であっても保護は生じたが、遺伝子がインフルエンザHA遺伝子である場合、若干の干渉が存在したと考えられ、興味深いことに、遺伝子が炭疽菌感染防御抗原遺伝子である場合、増強された保護が存在した。マウスに加えて、チャレンジの2日前または30日前いずれかのAdE粒子の鼻腔内投与後に、RSVチャレンジからコットンラットを保護した。
アデノウイルス組換え体を用いる本発明の実施形態は、E1欠損、E3欠損および/またはE4欠損アデノウイルスベクターを包含し得る。E1欠損アデノウイルス変異体は、非許容的細胞において複製無能力であるため、E1変異は、ベクターの安全域を生じる。E3変異は、アデノウイルスがMHCクラスI分子を下方制御する機序を破壊する(disrupting)ことにより、抗原の免疫原性を増強する。E4変異は、後期遺伝子発現を抑制することにより、アデノウイルスベクターの免疫原性を低下させる。RGDモチーフ等、特異的な配列モチーフをアデノウイルスベクターのH-Iループに挿入して、その感染力を増強させることができる。アデノウイルス組換え体は、特異的な導入遺伝子または導入遺伝子の断片を上述等のいずれかのアデノウイルスベクターにクローニングすることにより構築される。
導入遺伝子を含まないΔE1E3 Ad5の空の粒子の作製は、Tang DC、Zhang J、Toro H、Shi Z、Van Kampen KR(2009) Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert Rev Vaccines 8:469〜481に記載されている通りに行うことができる。
本明細書における用語「ウイルスベクター」として、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルスおよび単純ヘルペスウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
アデノウイルスは、ウシアデノウイルス、イヌアデノウイルス、非ヒト霊長類アデノウイルス、ニワトリアデノウイルスまたは豚もしくはブタアデノウイルス等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのアデノウイルスとなり得る。
本明細書における用語「ヒトアデノウイルス」は、マストアデノウイルス(Mastadenovirus)属のメンバーを包含する、アデノウイルス(Adenoviridae)科のあらゆるヒトアデノウイルスを網羅することを目的とする。今日まで、アデノウイルスの51種を超えるヒト血清型が同定されている(例えば、Fieldsら、Virology 2, Ch. 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照)。アデノウイルスは、血清群(serogroup)A、B、C、D、EまたはFのものとなり得る。ヒトアデノウイルスは、血清型1(Ad1)、血清型2(Ad2)、血清型3(Ad3)、血清型4(Ad4)、血清型6(Ad6)、血清型7(Ad7)、血清型8(Ad8)、血清型9(Ad9)、血清型10(Adl0)、血清型11(Adl1)、血清型12(Ad12)、血清型13(Ad13)、血清型14(Ad14)、血清型15(Ad15)、血清型16(Ad16)、血清型17(Ad17)、血清型18(Ad18)、血清型19(Ad19)、血清型19a(Adl9a)、血清型19p(Adl9p)、血清型20(Ad20)、血清型21(Ad21)、血清型22(Ad22)、血清型23(Ad23)、血清型24(Ad24)、血清型25(Ad25)、血清型26(Ad26)、血清型27(Ad27)、血清型28(Ad28)、血清型29(Ad29)、血清型30(Ad30)、血清型31(Ad31)、血清型32(Ad32)、血清型33(Ad33)、血清型34(Ad34)、血清型35(Ad35)、血清型36(Ad36)、血清型37(Ad37)、血清型38(Ad38)、血清型39(Ad39)、血清型40(Ad40)、血清型41(Ad41)、血清型42(Ad42)、血清型43(Ad43)、血清型44(Ad44)、血清型45(Ad45)、血清型46(Ad46)、血清型47(Ad47)、血清型48(Ad48)、血清型49(Ad49)、血清型50(Ad50)、血清型51(Ad51)、または好ましくは、血清型5(Ad5)となり得るが、これらの例に限定されない。
本発明により、受容体結合リガンド、組換えベクター、薬物・ワクチン組成物および2種以上のアデノウイルス血清型由来のウイルス構成(subvirus)粒子を含み得る組換えアデノウイルスも企図される。例えば、アデノウイルスベクターは、特異的な組織または細胞型の指向性の変化を表示することができ(Havenga、M.J.E.ら、2002)、従って、様々なアデノウイルス血清型由来の異なるアデノウイルスカプシド、即ち、繊維またはペントンタンパク質の混合およびマッチングが有利となる場合があることが知られている。繊維およびペントン等、アデノウイルスカプシドの改変は、未改変のアデノウイルスとは異なる指向性を有するアデノウイルスベクターを生じ得る。標的細胞に感染するその能力が改変および最適化されたアデノウイルスベクターは、治療的または予防的用量の有意な低下を可能にし、局所および散在性毒性の低下をもたらす。
ウイルスベクター遺伝子送達系は、遺伝子移入および遺伝子療法用途において一般に用いられる。異なるウイルスベクター系は、それ独自の利点および不利益を有する。本発明の病原体に由来するリガンドの発現に用いることのできるウイルスベクターとして、より詳細に後述するアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
アデノウイルスベクターは、遺伝子送達、特に、呼吸器への送達に理想的な多くの特徴を備える。これらの特徴の例として、
(a)有糸分裂細胞および有糸分裂後の細胞の両方をin situで形質導入するアデノウイルスベクターの能力、
(b)高い感染効率(MOI)で細胞をin situで形質導入するための、高力価のウイルス[1ml当たり1012ifu(感染単位)を超える]を含有するストックを調製する既存の技術、
(c)アデノウイルスの吸入が、進化的医学(Tang and Van Kampen、2008)に準拠すること、
(d)鼻腔内投与したアデノウイルスベクターの効力が、アデノウイルスに対する先在の免疫に干渉されないと思われること(Hoelscherら、2006;Shiら、2001;Van Kampenら、2005)。理論に制約されることは望まないが、これは、呼吸器における粘膜関門に沿った高効率の遺伝子送達、高レベルの導入遺伝子発現および高度の抗原提示が原因となり得る、
(e)高レベルの導入遺伝子発現(少なくとも、初期バーストとして)を誘導するアデノウイルスの能力ならびに
(f)複製欠損アデノウイルスベクターを生物工学によって作ることができる容易さ
が挙げられる。
アデノウイルスの追加的な一般特色は、アデノウイルスの生物学的側面が、詳細に特徴づけられていることである。アデノウイルスは、重度のヒト疾病を伴わない。アデノウイルスは、そのDNAを宿主細胞へ導入するのに非常に効率的である。アデノウイルスは、多種多様な細胞に感染することができ、広範な宿主範囲を有する。アデノウイルスは、比較的に容易に大量生産することができる。アデノウイルスは、ウイルスゲノムの初期領域1(「E1」)における欠失により複製欠損および/または非複製的にすることができる。
とりわけ本発明の実施において用いることのできる、発現された遺伝子産物、抗体およびそれらの使用、外因性核酸分子のin vivoおよびin vitro発現のためのベクター、発現を促すためまたは発現させようとする核酸分子に作動可能に連結するためのプロモーター、このようなベクターを作製するための方法および文書、このようなベクターもしくは核酸分子もしくは抗体を含む組成物、投薬量ならびに投与の様式および/または経路(経鼻投与のための組成物を包含)に関する情報のために、1999年11月23日に公表された米国特許第5,990,091号、EinatらまたはQuark Biotech, Inc.、1999年11月25日に発表されたWO99/60164、1999年5月14日に出願されたPCT/US99/11066から、FischerまたはRhone Merieux, Inc.、1998年1月8日に発表されたWO98/00166、1997年6月30日に出願されたPCT/US97/11486から(米国特許出願第08/675,556号および第08/675,566号に対する優先権を主張)、van Ginkelら、J. Immunol 159(2):685〜93(1997)(「Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene」)およびOsterhausら、Immunobiology 184(2〜3):180〜92(1992)(「Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man」)、を参照されたい。よって、1999年11月23日に公表された米国特許第5,990,091号、EinatらまたはQuark Biotech, Inc.、1999年11月25日に発表されたWO99/60164、1999年5月14日に出願されたPCT/US99/11066から、FischerまたはRhone Merieux, Inc.、1998年1月8日に発表されたWO98/00166、1997年6月30日に出願されたPCT/US97/11486から(米国特許出願第08/675,556号および第08/675,566号に対する優先権を主張)、van Ginkelら、J. Immunol 159(2):685〜93(1997)(「Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene」)およびOsterhausら、Immunobiology 184(2〜3):180〜92(1992)(「Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man」)ならびにそこに引用または参照されているあらゆる文書、ならびに1999年11月23日に公表された米国特許第5,990,091号、EinatらまたはQuark Biotech, Inc.、1999年11月25日に発表されたWO99/60164、1999年5月14日に出願されたPCT/US99/11066から、FischerまたはRhone Merieux, Inc.、1998年1月8日に発表されたWO98/00166、1997年6月30日に出願されたPCT/US97/11486から(米国特許出願第08/675,556号および第08/675,566号に対する優先権を主張)、van Ginkelら、J. Immunol 159(2):685〜93(1997)(「Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene」)およびOsterhausら、Immunobiology 184(2〜3):180〜92(1992)(「Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man」)のそれぞれに引用されている文書に引用または参照されているあらゆる文書は、これによりここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。1999年11月23日に公表された米国特許第5,990,091号、WO99/60164、WO98/00166、van Ginkelら、J. Immunol 159(2):685〜93(1997)およびOsterhausら、Immunobiology 184(2〜3):180〜92(1992)における情報に依存して、本発明の実施(例えば、とりわけ発現された産物、抗体およびそれらの使用、外因性核酸分子のin vivoおよびin vitro発現のためのベクター、対象のエピトープもしくは抗原または治療薬その他をコードする外因性核酸分子、プロモーター、このようなベクターもしくは核酸分子または発現された産物もしくは抗体を含む組成物、投薬量)は為され得る。
本発明により得られる免疫学的産物および/または抗体および/または発現された産物をin vitroで発現させて、このような免疫学的および/または発現された産物および/または抗体が通常用いられる様式で用いてよいこと、また、このような免疫学的および/または発現された産物および/または抗体を発現する細胞をin vitroおよび/またはex vivo用途に利用できること、例えば、このような使用および適用が、診断、アッセイ、ex vivo療法(例えば、遺伝子産物および/または免疫学的応答を発現する細胞をin vitroで増殖させて、宿主または動物に再導入させる)等を包含し得ることに留意されたい。米国特許第5,990,091号、WO99/60164およびWO98/00166ならびにそれらに引用されている文書を参照されたい。
さらに、本明細書における方法から単離された、あるいは本明細書における投与方法に従ってin vitroで増殖した細胞から単離された、発現された抗体または遺伝子産物は、免疫を誘導、治療応答を刺激および/または受動免疫を刺激するためのサブユニットエピトープまたは抗原または治療法または抗体の投与と同じく、組成物において投与することができる。投与すべき含量は、患者(宿主)および治療している状態に応じて変動し、1または数マイクログラムから数百または数千マイクログラム、例えば、1μgから1mg、1日当たり約100ng/kg体重から100mg/kg体重、好ましくは、1日当たり10pg/kgから10mg/kgに変動するであろう。
ベクターは、遺伝子産物(例えば、エピトープ、抗原、治療法および/または抗体)組成物に関して記載されている量を達成するような量で患者または宿主に投与することができる。当然ながら、本発明は、本明細書において例証されている投薬量を下回るまたは上回る投薬量を想定しており、動物またはヒトに投与しようとするいかなる組成物(その構成成分を包含する)に関して、また、いかなる特定の投与方法に関しても、適切な動物モデル、例えば、マウス等の齧歯類における致死量(LD)およびLD50を決定すること等により、その毒性を決定し、ならびに血清の力価測定(titration)およびその解析等、例えばELISAおよび/または血清中和(seroneutralization)解析により、適切な応答を誘発する組成物(複数可)の投薬量、その構成成分の濃度および組成物(複数可)投与のタイミングを決定することが好ましい。当業者、本開示および本明細書に引用されている文書の知識があれば、このような決定に過度の実験法は必要とされない。また、本発明は、本発明の組成物の連続的投与または本明細書の方法の連続的実施、例えば、状態の治療法または処置の経過および/または免疫学的組成物の追加免疫投与および/または予備刺激・追加免疫レジメン等における、本発明の組成物の定期的投与も包含し、連続的投与の時間および様式は、過度の実験法を用いずに確認することができる。
本発明のアデノウイルスの投薬量は、約106ifu〜約1010ifuとなり得る。投薬量は、約106ifu、約107ifu、約108ifu、約109ifuまたは約1010ifuとなり得る。有利な一実施形態において、投薬量は、約106ifu、約107ifuまたは約108ifuである。
特に有利な一実施形態において、本発明のアデノウイルスの複数投薬量が提供される。特に有利な一実施形態において、約2用量が投与される。有利な一実施形態において、各用量は、約20日間置いて、約25日間置いて、約30日間置いて、約35日間置いて、約40日間置いて、約45日間置いて、約50日間置いて、約55日間置いて、約60日間置いてまたは約65日間置いて投与される。有利には、各用量は、約40日間置いて、約41日間置いて、約42日間置いて、約43日間置いて、約44日間置いて、約45日間置いて、約46日間置いて、約47日間置いて、約48日間置いて、約49日間置いてまたは約50日間置いて投与される。
さらに、本発明は、組成物と、遺伝子産物および/または免疫学的産物および/または抗体をin vivoおよび/またはin vitroおよび/またはex vivo(例えば、後者2つは、例えば、このような細胞を必要に応じて増殖した後に、例えば、本発明に従って非侵襲的に投与した宿主の細胞から単離した後のものである)で産生するための方法等、ベクターを作製および使用するための方法と、診断、アッセイ、治療法、処置等における、このような遺伝子および/または免疫学的産物および/または抗体その他の使用とを包含する。ベクター組成物は、ベクターを適切な担体または希釈液と混合することにより処方され、遺伝子産物および/または免疫学的産物および/または抗体の組成物は、遺伝子および/または免疫学的産物および/または抗体を適切な担体または希釈液と混合することにより同様に処方される。例えば、米国特許第5,990,091号、WO99/60164、WO98/00166、それらに引用されている文書ならびに本明細書に引用されている他の文書および本明細書における他の教示(例えば、担体、希釈液その他に関する)を参照されたい。
有利な一実施形態において、ベクターは、インフルエンザ抗原、RSV抗原、HIV抗原、SIV抗原、HPV抗原、HCV抗原、HBV抗原、CMV抗原またはブドウ球菌(Staphylococcus)抗原をコードする遺伝子を発現する。インフルエンザは、ブタインフルエンザ、季節性インフルエンザ、トリインフルエンザ、H1N1インフルエンザまたはH5N1インフルエンザとなり得る。
別の有利な一実施形態において、ベクターは、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザM2、破傷風毒素C断片、炭疽菌感染防御抗原、炭疽菌致死的因子、狂犬病糖タンパク質、HBV表面抗原、HIV gp120、HW gp160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアCSP、マラリアSSP、マラリアMSP、マラリアpfg、結核菌HSPまたはこれらの変異体をコードする遺伝子を発現する。
本発明の一実施形態において、動物における免疫応答は、動物の細胞において対象の抗原をコードする遺伝子を発現する遺伝子ベクターにより誘導される。対象の抗原は、本明細書に記載されている抗原のいずれから選択してもよい。
方法の別の一実施形態において、動物の細胞は、上皮細胞である。方法の別の一実施形態において、免疫応答は、病原体または新生物に対するものである。方法の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、予防用ワクチンまたは治療用ワクチンとして用いられる。本発明の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、動物の細胞において対象の抗原を発現することができる遺伝子ベクターを含む。方法のさらに別の一実施形態において、動物は、脊椎動物である。
ベクター(例えば、対象のエピトープおよび/または抗原および/または治療法をコードする)における発現のための外因性DNAおよびこのような外因性DNAを提供する文書に関して、また、核酸分子の発現を増強するための転写および/または翻訳因子の発現に関して、そしてとりわけ「対象のエピトープ」、「治療法」、「免疫応答」、「免疫学的応答」、「防御免疫応答」、「免疫学的組成物」、「免疫原性組成物」および「ワクチン組成物」等の用語について、その全てをここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、1999年11月23日に公表された米国特許第5,990,091号およびWO98/00166およびWO99/60164、ならびにそれらに引用されている文書ならびに該特許および該PCT出願の審査における記録の文書を参照する。よって、米国特許第5,990,091号およびWO98/00166およびWO99/60164、ならびにそれらに引用されている文書ならびに該特許および該PCT出願の審査における記録の文書、ならびに本明細書に引用されている他の文書またはそれ以外のここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する他の文書は、本発明の実施において閲覧することができ、それらに引用されているあらゆる外因性核酸分子、プロモーターおよびベクターは、本発明の実施において用いることができる。この点について、米国特許第6,004,777号、第5,997,878号、第5,989,561号、第5,976,552号、第5,972,597号、第5,858,368号、第5,863,542号、第5,833,975号、第5,863,542号、第5,843,456号、第5,766,598号、第5,766,597号、第5,762,939号、第5,756,102号、第5,756,101号、第5,494,807号について言及する。
本発明の別の一実施形態において、動物は、有利には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類または魚類等、脊椎動物であり、より有利には、ヒトまたはウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタもしくはウマ等、コンパニオンアニマルまたは飼育動物または食料生産動物または飼料生産動物または家畜またはゲーム用もしくは競走用もしくはスポーツ用動物であり、あるいはシチメンチョウ、アヒルまたはニワトリ等、家禽である。本発明の特に有利な別の一実施形態において、脊椎動物はヒトである。
本発明の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、レトロトランスポゾン、トランスポゾン、ウイルス殻またはDNAベクターである。本発明の別の一実施形態において、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクターおよびDNAベクターは、組換えベクターである。本発明の別の一実施形態において、免疫応答は、A型インフルエンザに対するものである。本発明の別の一実施形態において、A型インフルエンザに対する免疫応答は、動物の細胞においてインフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザM2またはこれらの断片をコードする遺伝子を発現する遺伝子ベクターにより誘導される。本発明の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、ウイルスベクターおよびプラスミドDNAからなる群から選択される。
本発明の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、アデノウイルスである。本発明の別の一実施形態において、アデノウイルスベクターは、そのE1領域が欠損している。本発明の別の一実施形態において、アデノウイルスベクターは、そのE3領域が欠損している。本発明の別の一実施形態において、アデノウイルスベクターは、そのE1および/またはE3領域が欠損している。本発明の別の一実施形態において、DNAは、プラスミド形態である。本発明の別の一実施形態において、接触ステップは、対象の遺伝子を含有する遺伝子ベクターを送達装置に配置し、その中に対象の遺伝子を含有する遺伝子ベクターが入った装置を動物の皮膚に適用するステップをさらに含む。本発明の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、同時刺激遺伝子またはサイトカイン遺伝子として免疫調節性遺伝子をコードする。本発明の別の一実施形態において、ベクターは、全ウイルス遺伝子が欠失している。本発明の別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、動物における抗腫瘍効果を誘導する。本発明のさらに別の一実施形態において、遺伝子ベクターは、癌遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子または腫瘍関連遺伝子を発現する。
本発明の方法を用いて免疫応答の発生に用いることのできる抗原の代表例として、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザM2、破傷風毒素C断片、炭疽菌感染防御抗原、炭疽菌致死的因子、狂犬病糖タンパク質、HBV表面抗原、HIV gp120、HIV gp160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアCSP、マラリアSSP、マラリアMSP、マラリアpfgおよび結核菌HSP等が挙げられる。最も好ましくは、免疫応答は、新生物または感染性病原体に対する保護的効果を生じる。
本発明の別の一実施形態において、ベクターは、同時刺激遺伝子およびサイトカイン遺伝子からなる群から選択される遺伝子をさらに含有する。本方法において、遺伝子は、GM-CSF遺伝子、B7-1遺伝子、B7-2遺伝子、インターロイキン-2遺伝子、インターロイキン-12遺伝子およびインターフェロン遺伝子からなる群から選択される。
本発明の組換えベクターおよび方法は、様々な呼吸病原体の治療または予防において用いることができる。このような病原体として、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS-CoV)、ヒトライノウイルス(HRV)および呼吸器多核体ウイルス(RSV)が挙げられるがこれらに限定されない。
その上、本発明は、1または複数種のインフルエンザ株および/またはハイブリッドに対する免疫原性応答を刺激またはモジュレートする多価ワクチンまたは免疫原性組成物を提供できるように、別々の組換えベクターにおいてまたは1種の組換えベクターにおいて共に送達される、本明細書に開示されているベクターおよび方法における2種以上の治療用リガンド、免疫原または抗原の使用を包含する。さらに、本発明は、別々の組換えベクターにおいてまたは1種の組換えベクターにおいて共に送達される、本明細書に開示されているベクターおよび方法における、2種以上の病原体由来の治療用リガンド、免疫原または抗原の使用を網羅する。
DNA/アデノウイルス複合体を用いる本発明の実施形態は、PEI(ポリエチレンイミン)またはポリリジンのいずれか等、その適切な薬剤を利用するアデノウイルスベクターと複合化されるプラスミドDNAを有することができる。複合体内のアデノウイルスベクターは、「生きて」いても、UV照射により「死滅して」いてもよい。DNAを介したトランスフェクションを容易にするための受容体結合リガンドおよびエンドソーム溶解(endosomolysis)剤としてのUV不活性化アデノウイルスベクター(Cottenら、1992)は、ワクチン担体の安全域を生じ得る。DNA/アデノウイルス複合体は、免疫化剤として用いるために非侵襲的様式で脊椎動物の上皮細胞のトランスフェクトに用いられる。
本発明により提供される遺伝子ベクターは、アジュバントとして作用し得る免疫調節性分子をコードして、体液性および/または細胞性免疫応答を誘発することもできる。このような分子は、サイトカイン、同時刺激分子または免疫応答の過程を変化させ得るいずれかの分子を包含する。本技術を改変して、抗原の免疫原性をさらにより増強する仕方を考案することができよう。
本明細書に用いられている用語法の観点から、免疫学的有効量とは、動物に投与されると対象の遺伝子産物に対する免疫応答を生じる、対象の遺伝子をコードする遺伝子ベクターの量または濃度である。
様々なエピトープ、抗原または治療法は、異なる濃度でそれを発現することにより、局所的に送達することができる。一般に、有用な量は、アデノウイルスベクターでは少なくともおよそ100pfuであり、プラスミドDNAでは少なくともおよそ1ngのDNAである。本開示ならびにここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容が引用および援用されている文書等の本技術分野における知識から、過度の実験法を用いずに他の量を確認することができる。
本発明の方法は、予防的ワクチン接種として疾患の予防または治療的ワクチン接種として疾患の治療に適切に適用することができる。
本発明のワクチンは、単独で、あるいは免疫学的組成物の一部として動物に投与することができる。
記載されているヒトワクチン以外にも、本発明の方法を用いて、動物の系統を免疫化することができる。用語、動物は、ヒトを包含するあらゆる動物を意味する。動物の例として、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シチメンチョウ、アヒルおよびニワトリ等が挙げられる。あらゆる脊椎動物の免疫系は、同様に作動するため、記載されている適用は、あらゆる脊椎動物系において実行することができる。
本発明は、ベクター、特にアデノウイルスベクターの組合せも網羅する。例えば、空のアデノベクター(E1/E3欠失・挿入なし)は、E1/E3欠失・本明細書に記載されている外因性遺伝子等の挿入ありであってよいアデノベクター等、別のベクターと共に、それを必要としている患者に連続的にまたは同時に投与することができる。理論に制約されることはないが、空のアデノベクター(E1/E3欠失・挿入なし)は、迅速な免疫応答を最初に誘発することができ、抗原またはエピトープ等の外因性遺伝子を発現するベクターは、追加的な保護的応答を誘発することができる。
本発明およびその利点を詳細に説明してきたが、本明細書においては、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化、置き換えおよび変更を為し得ることを理解されたい。
次の実施例において本発明をさらに例証するが、これらの実施例は、単に例証目的のために提示されており、決して本発明の限定を目的とするものではない。
(実施例)
(実施例1)
呼吸病原体に対する広域スペクトル薬物としてのアデノウイルス粒子
ワクチン接種は、数週間または数ヶ月前に投与された場合、感染性疾患を予防するための有効なアプローチであるが、これは、即時のリスク下にある動物または人間を保護するには緩慢過ぎる。感染の直前または直後に摂取した場合に感染症の重症度を低下させることのできる薬剤は、公衆衛生において極めて重要である。タミフル(オセルタミビルリン酸塩)およびリレンザ(ザナミビル)は、インフルエンザウイルス感染の予防における有効性を立証した。しかし、これらのノイラミニダーゼ阻害剤は、経時的に薬物耐性インフルエンザウイルス株を生じ得る(Polandら、2009)。ウイルスと同様に、一般に、薬物耐性細菌も薬物の過使用により生じる(Davies and Davies、2010)。よって、使用中のある薬物が薬剤耐性により損なわれた場合、医療従事者は、病原体を抑止するためにパイプライン下の別の薬物を使用するオプションを有するため、追加的な薬物の開発が急がれる。
本出願人は、致死量のインフルエンザウイルスで鼻腔内チャレンジする1〜2日前にE1/E3欠損アデノウイルス(Ad)粒子を鼻腔内滴下注入すると、マウスにおいてインフルエンザに対する迅速な保護を付与することができることを実証した(図1)。本出願人は、致死量の炭疽菌Sterne株胞子で鼻腔内チャレンジする1〜2日前にAdを鼻腔内投与すると、炭疽菌からマウスを保護することができることも示した(図2)。Adの鼻腔内投与は、呼吸器における他の微生物の増殖を妨害する一連の反応を迅速に誘導することが考え得る。
Adは、動物およびヒトにおける優れた安全性プロファイルを有する非複製的ワクチン担体へと生物工学により作製されているため(Tangら、2009)、病原体に由来する抗原をコードするAdベクターは、単一パッケージにおける薬物・ワクチンデュオ(DVD)へと開発できると考え得るが、このDVDは、獲得免疫が誘導される前に様々な病原体に対する迅速かつ広範な保護を付与し、続いて病原体特異的な防御免疫をワクチンとして誘発することができる。図1および図2は、導入遺伝子を含まないAd骨格(AdE)のみが、薬物としてウイルスおよび細菌に対し迅速な保護を付与することができるのではなく、病原体由来の抗原をコードするその対応物も、薬物として病原体を抑止することができることを示す。
図1の方法。記載されている通り(Shiら、2001)、チャレンジに先立ち、A/NC/20/99(H1N1)インフルエンザウイルスのHA1をコードする精製したAdNC.H1.1ベクターおよびその導入遺伝子を含まない対応物(AdE)を0.05mlの容量で、機械的ピペットを用いて若いBALB/cマウス(2ヶ月齢)それぞれの鼻孔内に滴下して投与した。Ad投与1または2日後に、致死量(0.2HA単位)のA/PR/8/34(H1N1)インフルエンザウイルスでマウスを鼻腔内チャレンジし、生存を毎日モニターした。
図1の結果。チャレンジ2日前における1.7×108感染単位(ifu)用量のAdNC.H1.1ベクターの鼻腔内滴下注入(AdEin-2)により、70パーセントのマウス(7/10)が致死量の生きたA/PR/8/34インフルエンザウイルスから保護された。チャレンジ2日前における1.7×106ifu用量のAdEベクターの鼻腔内滴下注入(AdEin-2)により、100%のマウス(10/10)がインフルエンザから保護された。チャレンジ2日前における1.7×106ifu用量のAdEベクターの鼻腔内滴下注入(AdE*in-2)により、20%のマウス(2/10)がインフルエンザから保護された。チャレンジ1日前における1.7×108ifu用量のAdEベクターの鼻腔内滴下注入(AdEin-1)により、90%のマウス(9/10)がインフルエンザから保護された。全対照マウス(無処置対照)は、チャレンジ後10日以内に死亡した。データを%生存対チャレンジ後日数としてプロットした。括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。
図1の意義。生きたインフルエンザウイルスチャレンジ1または2日前におけるAdベクターの鼻腔内投与によるインフルエンザからの動物の保護は、Ad粒子が、呼吸器における抗ウイルス状態を迅速に誘導できることを示す。インフルエンザウイルスHAをコードするAdベクターは、インフルエンザワクチンへと開発され(Hoelscherら、2006;Tangら、2009;Van Kampenら、2005)、A/NC/20/99 HAをコードするAdNC.H1.1ベクターは、獲得免疫が誘発される前にインフルエンザ薬物として迅速な保護を依然として付与したため、このレジメンが、単一パッケージにおいて、抗ウイルス薬として広範かつ迅速な保護を付与し、続いて抗ウイルスワクチンとして防御免疫を誘発し得る薬物・ワクチンデュオ(DVD)を表す説得力のある証拠がある。
図2の方法。記載されている通り(Shiら、2001)チャレンジに先立ち、炭疽菌(Baciflus anthracis)感染防御抗原をコードする精製されたAdPA83ベクターおよび導入遺伝子を含まないその対応物(AdE)を0.05mlの容量で、機械的ピペットを用いて若いA/J マウス(2ヶ月齢)それぞれの鼻孔内に滴下して投与した。Ad投与1または2日後に、致死量[1×105コロニー形成単位(cfu)]の炭疽菌(B. anthracis)Sterne株胞子でマウスを鼻腔内チャレンジし、生存を毎日モニターした。
図2の結果。チャレンジ2日前における1.3×108ifu用量のAdPA83ベクターの鼻腔内滴下注入(AdPAin-2)により、67パーセントのマウス(6/9)が致死量の炭疽菌胞子から保護された。チャレンジ2日前における1.3×108ifu用量のAdEベクターの鼻腔内滴下注入(AdEin-2)により、30%のマウス(3/10)が炭疽菌から保護された。チャレンジ2日前における1.3×106ifu用量のAdEベクターの鼻腔内滴下注入(AdE*in-2)により、マウス(0/9)は炭疽菌から保護されなかった。チャレンジ1日前における1.3×108ifu用量のAdEベクターの鼻腔内滴下注入(AdEin-1)により、22%のマウス(2/9)が炭疽菌から保護された。全対照マウス(無処置対照)は、チャレンジ後4日以内に死亡した。データを%生存対チャレンジ後日数としてプロットした。括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。
図2の意義。炭疽菌胞子チャレンジ1または2日前におけるAdベクターの鼻腔内投与による炭疽菌からの動物の保護は、Ad粒子が、呼吸器における抗細菌状態を迅速に誘導できることを示す。PAをコードするAdベクターが、炭疽菌ワクチンに開発され(McConnellら、2007)、PAをコードするAdPA83ベクターが、獲得免疫が誘発される前に炭疽菌薬として迅速な保護を依然として付与したため、このレジメンが、単一パッケージにおいて抗細菌薬として迅速な保護を付与し、続いて抗細菌ワクチンとして防御免疫を誘発し得る薬物・ワクチンデュオ(DVD)を表す説得力のある証拠がある。
(参考文献)
(実施例2)
インフルエンザに対する完璧な保護を付与するための迅速応答ツールとしてのアデノウイルスベクター化薬物・ワクチンデュオ
インフルエンザほどの莫大な損害(toll)を与える他の疾患はほとんどない。本出願人は、本明細書において、E1/E3欠損(ΔE1E3)アデノウイルス血清型5(Ad5)粒子の鼻腔内(i.n.)投与が、マウスにおいて数週間持続する予防療法の手段として抗インフルエンザ状態を迅速に誘導したことを報告する。インフルエンザウイルス(IFV)赤血球凝集素(HA)HA1ドメインをコードすることにより、Ad5-HA1ベクターは、単一パッケージにおける薬物・ワクチンデュオ(DVD)として、予防的薬物として迅速な保護を付与し、続いて、インフルエンザに対して完璧な保護を誘導するためのワクチンとして持続性の防御免疫を誘発した。Ad5粒子は、気道におけるIFV増殖を妨害するための自然免疫の特異的な武器を活性化することによりインフルエンザを抑止することができる、宿主応答の複雑な網(web)を誘導するため、この多方向性の(multi-pronged)インフルエンザDVDは、現在のインフルエンザ薬物を損なう薬剤耐性の運命を回避できると考え得る。
インフルエンザは、季節性および汎発性インフルエンザを引き起こす原因ウイルスを根絶する可能性が実質的にない、再流行および新興する疾患である。動物およびヒトの両方を発病させる可能性のある人獣共通感染性(zoonotic)疾患として[1]、デザイナーIFVを逆遺伝学[2]により迅速に作製し、テロリストにより広められて、標的領域内の農業、公衆衛生および経済を荒廃させることができる。この高度に伝染性で潜在的に致命的な疾患は、ワクチン接種により部分的に制御されているとはいえ、認可されたインフルエンザワクチンは、大量生産[1]が困難であり、時宜を得ることができず、ヘテロサブタイプ(heterosubtypic)IFV株[3]に対する広範な保護を与えることができない。インフルエンザに対する別の防衛線は、インフルエンザ薬[例えば、オセルタミビル(タミフル);ザナミビル(リレンザ)]の使用である。しかし、このオプションは、突然変異圧下の淘汰による薬物耐性IFVの出現により制限される[4、5]。
迅速応答抗インフルエンザ剤を開発するために、本出願人らは、Ad5ベクター化経鼻インフルエンザワクチンが、薬物様様式でインフルエンザに対する迅速な保護を付与できることを思いがけず実証した。よって、病原体抗原をコードし複製能を有するアデノウイルス(RCA)フリーAd5ベクターは、多種多様な臨床設定におけるDVDとして粘膜病原体に対する完璧な保護を付与できる可能性がある。RCAフリーAd5ベクターは、無血清PER.C6浮遊細胞において迅速に大量生産し、鼻内噴霧により無痛的に大量投与し[1]、続いて先在のAd5免疫に直面しながら自然および獲得免疫応答を誘発することができる。インフルエンザDVDの場合、Ad5粒子は、IFVを直接的に攻撃することなく抗インフルエンザ状態を恐らく誘導するため、薬物耐性IFVを生じる機会は最小である。弱毒生IFVワクチン(LAIV)とは対照的に、Ad5ベクター化DVDは非複製的であり、野生のIFVと再集合しない。Ad5ベクター化インフルエンザDVDの鼻内噴霧が、予防的薬物としてヘテロサブタイプIFV株に対し数週間広範な保護を付与し、続いて薬物誘導性保護が減退する前にワクチンとして数ヶ月または数年間も株特異的な防御免疫を誘発し得ることが予想される。DVDの保護的効果が、ヒト対象において再現される必要がある場合、この新規レジメンは、インフルエンザおよび他の疾患に対する公衆衛生の武器庫に迅速応答ツールを加え得る。
抗インフルエンザ剤としてのΔE1E3 Ad5粒子。導入遺伝子を含まないΔE1E3 Ad5空(AdE)粒子およびA/New Caledonia/20/99 H1N1 IFV(NC20)HA1ドメインをコードするその対応するAdNC.H1.1を、記載されている通りにPER.C6細胞において作製した[1]。図3に示す通り、チャレンジ2日前(-2日目)における1.7×108感染単位(ifu)のAdEのi.n.滴下注入は、致死量の生きたA/Puerto Rico/8/34 H1N1 IFV(PR8)から100%(10/10)のマウスを保護した。AdEの用量が1.7×106ifuへと100分の1に低下した場合、20%(2/10)の動物しか保護されなかった。PR8チャレンジ1日後のi.n.滴下注入または-2日目におけるi.m.注射により1.7×108ifuのAdEをマウスに投与した場合、保護は観察されなかった。-2日目に1.7×108ifuのAdNC.H1.1をマウスにi.n.投与した場合、70%(7/10)の動物しか保護されなかったため、AdEゲノムへのNC20 HA1ドメインの挿入は、ΔE1E3 Ad5の抗インフルエンザ状態誘導能にやや干渉した。AdEと同様に、-2日目に投与した場合、1.7×106ifuのi.n.滴下注入も、1.7×108ifuのAdNC.H1.1のi.m.注射も、PR8に対するいかなる保護も付与しなかった(図3)。-2日目における1.7×108ifu用量のAdE(P、0.0001)またはAdNC.H1.1(P=0.0077)のi.n.投与により付与された保護は、未処理対照群による保護と比較して、統計学的有意性に達した(ログランク検定による)。
-47日目(PR8チャレンジの47日前)におけるAdEの鼻腔内投与は、70%の動物(7/10)を保護し、AdE誘導性の抗インフルエンザ状態が、数週間持続し得ることを示す(図4)。-47日目におけるAdNC.H1.1の鼻腔内滴下注入は、PR8に対する血清赤血球凝集抑制(HI)抗体が検出不能であったとしても(Table 1(表1))、恐らくPR8と交差反応したNC20 HA1誘導性獲得免疫のため、100%(10/10)のマウスを保護した(図4)。NC20に対する高いHI抗体力価およびPR8に対する検出不能の力価を誘発した、-47日目におけるAdNC.H1.1による免疫化とは異なり、PR8によるチャレンジは、生存者におけるPR8に対する高いHI抗体力価およびNC20に対する低い力価を誘導し、-2日目におけるAdEまたはAdNC.H1.1いずれかの投与は、NC20とPR8どちらに対してもHI力価を誘導しなかった(Table 1(表1))。1.2×108ifu用量における、-47日目におけるAdNC.H1.1(P、0.0001)、-47日目におけるAdE(P=0.0032)、AdE2用量(double-dose)レジメン(-47日目、続いて-2日目に追加免疫適用)(P、0.0001)、-1日目(P、0.0001)または-2日目(P=0.0005)におけるAdEのi.n.投与により付与された保護は全て、未処理対照群による保護と比較して統計学的有意性に達した。
いくつかのレジメンは、インフルエンザによる死亡率からマウスを保護したが、AdE2用量レジメンは、その差が統計学的有意性に達しなかったとはいえ、PR8チャレンジ後のより少ない体重減少により示される通り、その単一用量(-47日目または-2日目)の対応物よりも堅実な保護を付与する傾向があった(図5)。抗インフルエンザ状態を誘導するため、E1+/E3+野生型Ad5は、同一条件下におけるマウスへのi.n.投与後にインフルエンザを抑止することができなかったため、E1および/またはE3を欠失することが重要である(図4)。
インフルエンザに対するAd5誘導性の肺保護。PR8チャレンジ後の肺病理組織診断により示される通り、-2日目におけるAdEまたはAdNC.H1.1のi.n.投与は、重度の肺損傷の発生を予防することにより、インフルエンザからマウスを保護した。Ad5保護なしのPR8の鼻腔内滴下注入は、チャレンジ19日後に大規模肺炎症を誘導した(チューキーの多重比較ポストテストによる一元配置ANOVA)。PR8チャレンジ7日後。
パンデミックIFV株に対する保護。ΔE1E3 Ad5粒子が、PR8のみならず、より臨床的に関連するIFV株からマウスを保護できることを実証するため、2.5×108ifuのAdEまたはAdNC.H1.1をマウスにi.n.投与し、続いて致死量のパンデミック2009 H1N1ブタインフルエンザ単離株A/California/04/2009(CA04)を動物にチャレンジした。図8に示す通り、100%(10/10)の動物が、-2日目におけるAdEまたはAdNC.H1.1および-22日目におけるAdNC.H1.1のi.n.滴下注入により保護された。90%(9/10)が、-22日目におけるAdEのi.n.投与により保護された。これらAd5曝露群の全てにおけるCA04に対して付与された保護は、プラセボ対照群の保護と比較して統計学的有意性に達した(P、0.0001)。
非複製的ΔE1E3 Ad5ベクターは、高い効力および優れた安全性プロファイルを有する経鼻インフルエンザワクチン担体へと生物工学によって作られた[1]。ワクチンとしての防御免疫の誘発に加えて、本出願人らは、このクラスのワクチンが、獲得免疫が誘発される前にインフルエンザに対する予防療法も付与できることを本明細書において示す。マウスへのΔE1E3 Ad5粒子の投与が、I型インターフェロン(IFN-aおよびIFN-b)[7]等、多様な炎症性サイトカインおよびケモカイン[6]の産生を迅速に誘導し; 肺樹状細胞を損ない[8];ナチュラルキラー細胞を活性化し[9];抗ウイルス一酸化窒素の産生を誘導し[10];Ad5と、血液タンパク質、血小板、マクロファージ、内皮細胞およびそれぞれの実質細胞との間に多面的な相互作用を引き起こす[6]ことが実証された。ΔE1E3 Ad5粒子は多くの免疫と共に非免疫応答を誘導し、動物における一部の反応は未だ定義されていないため他の機序を除外することはできないが、Ad5 E1A、E1BおよびE3タンパク質によるAd5関連炎症の阻害[11]が、抗インフルエンザ状態を誘導するE1+/E3+ Ad5の機能不全(図4)は、炎症の抑制に帰する可能性があることを示唆する[12]。ΔE1E3 Ad5粒子により誘導された複数の反応は、気道における抗インフルエンザ状態を確立するために統合することができる、よって、IFVによりほぼ迂回することができない多次元的な防御障壁を生じ得ることが考え得る。この仮説は、IFN-α/β受容体が、インフルエンザに対する不必要な様式の保護をもたらすという知見により支持され、動物がインフルエンザに対し応答するために重複する機序を進化してきたことを示す[13]。さらに、これらの研究においてチャレンジしたBalb/cマウスは、IFN-α/β誘導性インフルエンザ耐性因子Mx1の欠損アレルを保有し[14]、ΔE1E3 Ad5誘導性I型IFN産生[7]が、このマウス系統において抗インフルエンザ状態の確立において主要な役割を果たさない可能性があることを暗示する。
PR8チャレンジ1日後のAdEのi.n.投与が、インフルエンザを抑止することができなかったという知見(図3)は、IFVが、ΔE1E3 Ad5粒子に先立ち気道に進入する場合、IFVが、ΔE1E3 Ad5粒子により破壊されないプロインフルエンザ(pro-influenza)状態を誘導し得ることを示唆し、これは、AdE粒子がPR8またはCA04に先立ちi.n.投与された場合の、IFVにより逆行できないAd5誘導性抗インフルエンザ状態と同様である(図3〜図9)。ΔE1E3 Ad5に基づく予防的薬物を曝露後インフルエンザ薬物へとさらに発達させるため、気道における2種のウイルスにより誘導されたアンタゴニスト反応を特徴づけることが重大である。
このベクターがi.m.注射される場合、Ad5への前曝露は、Ad5の効力減少と関連してきた[15]。しかし、新たに見出された証拠はほぼ確実に、この免疫適格性界面組織に関連する強力な抗原提示と併せた、粘膜関門に沿った浅層における細胞への高効率の遺伝子送達のため、Ad5ベクター化経鼻ワクチンが、マウス[15]、マカク[16]およびヒト[17]において先在のAd5免疫を迂回することができることを示す。AdE2用量レジメンにより誘導される一次および追加免疫適用間の相乗作用(図4および図5)は、AdEにより誘導される迅速な抗インフルエンザ応答が、先在のAd5免疫の存在下で相加的であったことを示す。これらの知見は、この経鼻インフルエンザDVDが、単一用量レジメンにおいてインフルエンザからの迅速かつ持続性の保護を誘導することができるだけではなく、効力を失うことなく繰り返し投与(例えば、異なるHAが、そのワクチン構成成分に必要とされる場合)することもできることが期待できる。
予防的インフルエンザ療法は、複合的細菌ライセート[18]または細菌毒素[19]のi.n.投与により行うことができるが、細菌構成成分により誘導される抗インフルエンザ状態は、非常に一過的であり、その保護的効果は、療法後数日以内に減退した[18、19]。AdE誘導性保護的効果が、単一用量レジメンにおいて少なくとも3週間(図6)、最大47日間(図4)持続し得るという知見は、細菌構成成分およびAd5により誘導される抗インフルエンザ状態の間で根底をなす機序が異なる可能性があることを示唆する。加えて、後者のみが、DVDのワクチン構成成分がその薬物効果が減退する前に獲得免疫を誘発するのに十分な時間を達成できるであろう。さらに、複製する野生型Ad5は、良性呼吸ウイルスであり、本研究において用いられるその非複製的対応物は、さらにより安全となる筈であり、特に、ヒト対象におけるAd5ベクター化経鼻インフルエンザワクチンの安全性プロファイルが示された[17]。一般的な呼吸ウイルスであるため、ヒト粘膜免疫系はAd5粒子に精通し、Ad5特異的な保護的機序を進化させているに違いない。対照的に、インフルエンザ薬物として呼吸器に消化管関連の細菌毒素を投与したとこと[19]は、免疫系を驚かし、この不自然なレジメンは、ヒト対象におけるベル麻痺の誘導を伴った[20]。
IFVは、インフルエンザ薬[例えば、M2イオンチャネル遮断薬(アマンタジン;リマンタジン)またはノイラミニダーゼ阻害剤(オセルタミビル;ザナミビル)]により攻撃された場合、薬物耐性株への変異において潜行性である[5]。現在のインフルエンザ薬とは異なり、Ad5ベクター化DVDは恐らく、IFVを直接的に攻撃せずに呼吸器における生息環境を変化させる。従って、DVDは、薬剤耐性を誘導する突然変異圧を付与しない。その後の粘膜病原体感染に対する脆弱性を増強するリスクを有するオセルタミビル誘導性の粘膜免疫抑制とは対照的に[21]、Ad5ベクター化DVDは、粘膜病原体の少なくともサブセットに対する粘膜自然免疫を増強する。DVDの有効性は、その薬物効果が完全に消滅する前に持続性の獲得免疫を誘発するそのワクチン構成成分によりさらに強化される(図2〜図8)。認可されたLAIV(例えば、米国におけるFluMistH)は、生きたIFVを含有するため[1]、薬物は、生きたIFVを死滅させることによりワクチンを無能化することがあるので、インフルエンザ薬とLAIVの同時投与は、逆効果(counter-productive)となり得る。Ad5ベクター化DVDは、認可されたインフルエンザ薬と適合性であるのみならず、そのワクチン能力に加えてそれ自体薬物として予防療法も付与する。
新たに見出された証拠は、経鼻ワクチンが、より強力な粘膜獲得免疫応答を誘発することにより、呼吸粘膜病原体に対するより頑強な保護を付与するとしても[22、25]、数多くの経鼻ワクチンは、それらの非経口対応物よりも弱い全身性獲得免疫応答を誘導する[22〜26]ことを示す。本出願人は、それぞれi.n.およびi.m.経路により得られる%生存により示す通り(図3)、ΔE1E3 Ad5粒子が、i.m.ではなくi.n.投与される場合、粘膜病原体に対する呼吸器への集中により、獲得免疫のみならず自然免疫も誘導され得ることの証拠を提供する。Ad5ベクター化経鼻DVDが、他の経路(例えば、経口感染)により誘導されたインフルエンザからの保護を付与し得るかは、未だ不明である。
-47日目におけるAdNC.H1.1のi.n.投与が、PR8チャレンジに対して、-2日目に接種したその対応物または-47日目に投与したAdEよりも頑強な保護を誘導した(図3および図4)という知見は、AdNC/in/-47群における動物が、PR8に対する検出可能な血清HI抗体の非存在下で、免疫化47日後にPR8と交差反応するNC20 HA1による獲得免疫応答により保護され得ることを示唆する(Table 1(表1))。データは、血清HI抗体力価が、経鼻インフルエンザワクチンにより誘導される防御免疫を予測するための不適切な代替マーカーである[24、26]という他の報告を実証する。
Ad5ベクター化DVDが、単一パッケージにおいてワクチン接種と併せて予防療法を付与することができるという知見は、培養細胞において大量生産することのできる、鼻内噴霧により無痛的に投与し、先在のAd5免疫を迂回してインフルエンザに対し迅速かつ持続性の有益な応答に向けて自然および獲得免疫レパートリーを動員する能力を有し、薬物耐性IFV株を生じる可能性がない新規抗インフルエンザ剤の開発の根拠を提供する。
アデノウイルス。AdE粒子を作製するため、記載されている通り、シャトルpAdHighおよびAd5骨格pAdEasy-1プラスミドの間の相同組換えを大腸菌(Escherichia coli)BJ5183細胞において行い、続いてPER.C6細胞(Crucell Holland BVから提供;オランダ、ライデン)においてRCAフリーAdE粒子を作製した[1]。よって、AdEは、いかなる導入遺伝子もコードしない、そのE1領域に発現カセットを有するΔE1E3 Ad5[1]である。AdNC.H1.1ベクターを作製するため、開始ATGコドンの直ぐ上流への真核生物リボソーム結合部位の挿入と併せて、ヒト細胞に見出されたtRNAプールとマッチするよう最適化したコドンを有するNC20 HA遺伝子をGENEART(ドイツ、レーゲンスブルク)において合成した[27]。合成HA鋳型から、プライマー5'-CACAGGTACCGCCACCATGAAGGCCAAGCTG-3'および5'-GAGTCTAGATTATCAGCCGAACAGGCCTCTGCTCTGG-3'を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、347アミノ酸を含有するNC20 HA1断片を増幅した。終止コドンをインフレームに付加した増幅HA1断片を含有するKpnI-XbaI断片を、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターの転写制御下で、pAdHighのKpnI-XbaI部位に正確な配向性で挿入した。その後、NC20 HA1(AdNC.H1.1)をコードするRCAフリーAd5ベクターを、上述の通りPER.C6細胞において作製した。AdEおよびAdNC.H1.1の両方をDNA配列決定により検証し、PER.C6細胞において大量生産し、記載されている通りに塩化セシウム勾配における超遠心分離[27]により精製し、A195バッファー[28]に透析し、Ad5感染した単層を西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートした抗Ad5ヘキソン(hexon)抗体および3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)基質(Clontech Laboratories, Inc.;カリフォルニア州マウンテンビュー)で染色した後に、Spearman-Karber方法[29]により293細胞[17]における力価(1ml当たりのifu)を決定した。アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC;バージニア州マナサス)からE1+/E3+野生型Ad5(VR-1516)を入手した。
インフルエンザウイルス。ATCCからPR8(VR-95)を入手し、記載されている通り[17]にTPCK-トリプシンの存在下でメイディンダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞において増殖させ、プラークアッセイ[30]により力価を決定した。Natalia A. Ilyushinaによりマウスに適応したCA04が作製され、セントジュードチルドレンズリサーチ病院(St. Jude Children's Research Hospital)(テネシー州メンフィス)のElena Govorkovaにより提供された。マウス肺による9連続継代により、CA04ウイルスをBalb/cマウスの肺における複製に適応させた。MDCK細胞においてウイルスをプラーク精製し、記載されている通り[31]に10日齢の発育鶏卵、続いてMDCK細胞において増殖させることによりウイルスストックを調製し、記載されている通り[32]に力価を細胞培養感染性用量(CCID50)として表す。NC20は、疾病管理センター(Center for Disease Control)(CDC;ジョージア州アトランタ)により提供された。
チャレンジ試験。記載されている通り[27]に、若い(およそ2ヶ月齢)雌Balb/cマウスへの50μlのAd5粒子の鼻腔内投与およびi.m.注射を行った。アラバマ大学バーミングハム校(University of Alabama at Birmingham)(UAB)においては1.4×106プラーク形成単位(pfu)[およそ4×LD50(50%致死量)に相当]または3.5×106pfu(およそ10×LD50に相当)のいずれかを含有する50μlのPR8の、ユタ州立大学(Utah State University)(USU)においては26105 CCID50(およそ3×LD50に相当)を含有する90μlのCA04のi.n.滴下注入によりマウスをチャレンジした。マウスを用いた全実験は、UABおよびUSUの施設内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committees)の承認に従って行った(UAB承認ID、#7705;UAB動物福祉保証番号(Animal Welfare Assurance Number)、A3255-01;USU承認ID、#552;USU動物福祉保証番号、A3801-01)。UABおよびUSUの両方における動物施設は、AAALAC認定されている。
チャレンジ後の肺におけるPR8力価。-2日目に1.2×108ifu用量のAdE粒子を50μl容量で若い雌Balb/cマウスにi.n.投与した。0日目に4.6×106pfuのPR8をi.n.滴下注入した5〜7日後に、対照およびAdE曝露マウスの肺を切除した後にドライアイス上で直ちに凍結し、解析まで280uCで保存した。解凍後に、各肺の画分を秤量し、冷リン酸緩衝食塩水(PBS)中で10%(w/v)懸濁液としてホモジナイズした。遠心分離により組織デブリを除去し、ウイルス力価測定のために上清を別の無菌チューブに移した。記載されている通り[30]にIFVのプラークアッセイを行った。
赤血球凝集抑制アッセイ。記載されている通り[17]に標準HIアッセイにより、受容体破壊酵素による血清の前処理後にPR8またはNC20に対する活性に関して血清を検査した。1:10希釈から始めて、各血清試料を検査した。コードラベルし、マッチした免疫化前後の試料において盲検方式で全血清を検査した。その血清検体が<10のHI力価を有する場合、動物は血清陰性と考慮され、5(log2スケールにおいて2.3)のHI抗体力価を割り当てた。
肺病理組織学アッセイ。気管を通して10%緩衝ホルマリン灌流することにより、マウス肺を固定した。パラフィン包埋組織を5μm厚の切片にスライスし、続いて切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
統計解析。GraphPad Prismバージョン5.04(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて全統計解析を行った。Kaplan-Meier生存曲線を比較するためにログランク検定を行い、体重減少および肺におけるPR8力価を比較するためにチューキーの多重比較ポストテストによる一元配置ANOVAを行った。統計学的有意性をP、0.05に設定した。
(参考文献)
(実施例3)
感染性疾患に対する大規模な保護を付与するための潜在的な伝達機構(driver)としてのアデノウイルスベクター化薬物・ワクチンデュオ
ワクチンの病気と闘う力は、世界的な死亡率および罹患率低下に高い評価を得る公衆衛生の宝庫であった。ワクチンの適用範囲を強化することによりその威力をさらに増幅するための目標には、低コストで大量生産し、非医療従事者により大量投与することのできる新世代の迅速応答ワクチンの開発が必要とされる。新たなワクチンはまた、従来のワクチンよりも高い安全域に恵まれる必要がある。ベクターは、需要変動に応じて無血清浮遊細胞において迅速に製造し、進化的医学に準拠して鼻内噴霧によりヒト対象に非侵襲的に投与することができるため、非複製的アデノウイルスベクター化ワクチンは、ワクチン適用範囲の強化において期待できる。非経口注射とは対照的に、非侵襲的粘膜ワクチン接種は、全身性炎症を最小化する。さらに、先在のアデノウイルス免疫は、アデノウイルスベクター化経鼻ワクチンの効力に認め得るほど干渉しない。病原体抗原をコードするアデノウイルスベクターの経鼻投与は、恐怖がなく無痛性であるのみならず、導入遺伝子発現なしのアデノウイルス粒子単独は、気道における抗インフルエンザ状態を誘導することができるため、薬物・ワクチンデュオとして粘膜病原体に対する迅速かつ持続性の保護も付与する。人間へのワクチン接種に加えて、このクラスのベクター化ワクチンにより動物を大量免疫化することもできる。
より優れたワクチンに対する非常に大きな需要。ワクチン接種は、疾患予防における最も対費用効果の高い方法であることが分かっているが、ワクチン適用範囲を強化するための攻撃性の一掃は、依然として世界的な公衆衛生改善に向けた動きにおける切実な目標である。流通が認可された現在のワクチンとして、死滅した微生物全体、生きた弱毒化微生物、微生物抽出物、精製または組換えタンパク質、DNAワクチンおよびウイルス様粒子が挙げられる。このようなワクチンを広く配布することにより、多くの疾患を打ち負かしてきたが、多種多様な疾患状況において共同体(集団)免疫を生じる目標は、現在のワクチン接種プログラムにおける数多くの問題のために、依然として捕えどころがない。特に、ワクチン関連の有害な副作用は、局所および全身性炎症応答、発熱、血小板活性化、心臓性自律神経障害、アナフィラキシー反応(特定のワクチンの針注射により誘導)[1〜4]から、滅多に発生しない麻痺性灰白髄炎(経口ポリオワクチンの経口摂取による)[5]、心筋心膜炎(Dryvax天然痘ワクチンの接種により誘導)[6]およびベル麻痺(細菌毒素経鼻アジュバントにより誘導)[7、8]に及ぶ。2010年、スクアレンアジュバントを含有するH1N1汎発性インフルエンザワクチンの針注射後に、ワクチン接種者におけるナルコレプシーの突然の発生が数か国で報告された[201]。スクアレン単独の注射は、動物における関節リウマチを誘導し得る[9]。新たな証拠は、慢性、低悪性度炎症が、心血管疾患[10]、肥満[11]、糖尿病[11]、癌[12]および神経障害[13]を伴うことを示すことから、そこで、ワクチン誘導性炎症に着目する必要がある。免疫刺激ワクチンアジュバント複合体[1〜3]の注射により誘導される急性炎症反応が、慢性、低悪性度炎症へと進展し、ワクチン接種者のサブセットにおいてこれら病気のいずれかを経時的に引き起こし得るか否かは、公衆衛生において極めて重要である。しかし、この潜在的危険性は、厳密に調査されていない。ワクチン安全性の概念は、「病原体に誘導される疾患からの保護」から「有害な結果を誘導する可能性なし」へと進化しているため、いかなる公知の外来性薬剤、毒性および残存病原性もワクチンに存在することを許されず、未知の副作用(例えば、重要臓器における炎症)を誘導するいかな
る可能性も回避する必要がある。
粘膜および全身性免疫応答は、かなりの独立性をもって誘発および調節されており、多くのワクチンは、筋肉内注射により侵襲的に投与され、筋肉内注射は、優れた全身性免疫を誘導するが、多くの場合、粘膜病原体(例えば、インフルエンザウイルス、結核菌およびHIV)に対する防御において決定的な粘膜免疫が弱い[14、15]。IgAスイッチを誘導し、リンパ球における粘膜特異的ホーミング受容体(例えば、CCR9およびa4b7インテグリン)をインプリントする常在性粘膜樹状細胞(DC)特有の能力のため、粘膜免疫の効率的な誘導は通常、経鼻または経口ワクチン接種を利用する[15、16]。注射用ワクチンにより誘導される弱い粘膜免疫に加えて、ワクチン投与装置としての注射器針も、故意または不注意の非滅菌的再利用、針刺し損傷、不適切な廃棄物処理と共に、急性発症時における免許を持つ医療従事者に限定された注射施術による重大な問題を提起する[17]。先のとがった針に対する一般市民の不安(尖鋭恐怖症)は、ワクチン適用範囲の阻害において別の役割を果たす。よって、一部の人々は、全身性ワクチン接種により痛み、損傷または死を迎える確率よりも罹病の確率を選ぶ可能性がある。ワクチン接種プログラムの目的は、共同体(集団)免疫の生じることにより感染の全体的な確率を低下させることであるため、この使命は、リスクに対する一般市民の不安のせいでワクチン接種が控えられることにより、台無しとなるであろう。現在までに、安全、有効、無痛性かつ経済的な新世代の迅速応答ワクチンを開発することにより、否定的な見方を逆転させるための実現技術が現れつつある。
ワクチン適用範囲を強化するための手段としての非侵襲的ワクチン接種。注射針を用いない非侵襲的ワクチン接種は、「仕方なく注射針を打たれる」から「恐怖のないワクチン接種法を率先して探す」へと大衆の姿勢が変化することが期待できる。ワクチンは、無痛性様式での経口摂取[5]、鼻内噴霧[18、19]および皮膚パッチの局所的な塗布[19〜23]により、非侵襲的に投与することができる。体内および外部環境間の界面へのワクチンの投与による非侵襲的ワクチン接種は、ワクチン接種者に高度の快適性を与えるのみならず、従来の全身性ワクチン接種と比較して質的により優れた免疫応答をもたらすこともできる。皮膚粘膜表面は、物理的障壁として機能し、浅層に浸透する抗原が効率的に捕捉されて免疫系に提示されるのを確実にする高度に免疫適格性の上皮によって覆われている。論理によると、これらの「プロフェッショナルの免疫兵士」を、侵入病原体と稀にしか遭遇しない深部組織に保持するのは逆効果となるため、動物およびヒトは、感染を撃退するために表面障壁に沿って最も適格性の免疫細胞を配置する必要がある。複数のDCサブセット[24、25]、gdT細胞[26]その他等、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)は、皮膚粘膜表面に沿って高密度で存在し得る。レチノイン酸合成酵素を発現するマウス骨髄細胞のサブセットは、Foxp3+調節性T細胞、IgA分泌B細胞および粘膜特異的ホーミング受容体[27]の産生等、粘膜DC機能を誘導するためにDC前駆体にレチノイン酸を提供することができる。ワクチン接種の経路が、マウスにおける抗原特異的なCD8+Tリンパ球の規模のみならず、表現型および輸送にも決定的に影響することが示された。アデノウイルス(Ad)ベクター化ワクチンの筋肉内注射は、頑強な局所的導入遺伝子発現を誘導し、全身および粘膜区画の両方に広範に輸送する高頻度、多機能性のCD8+Tリンパ球を誘発した。それに反して、Adベクター化ワクチンの鼻腔内滴下注入は、同様に頑強な局所的導入遺伝子発現をもたらしたが、解剖学的輸送パターンが制限された低頻度、単機能性のCD8+Tリンパ球を生成した[28]。よって、非侵襲的ワクチン接種は、表在性だが皮膚粘膜表面に沿った免疫適格性組織部位に応答する免疫系の能力をてこ入れする既存の生物学的経路を活用して、過剰反応性全身性
免疫応答を誘導することなく、門脈において粘膜病原体に対する局在化された防御免疫を誘発する。
医薬品適正製造基準において、ワクチンを無菌的に製造することが必要とされるが、未知の微生物による汚染または現代の機器およびハイスループットアッセイでは検出できない汚染が生じる可能性は依然としてある。界面は微生物と定常的に接触しているせいで、皮膚粘膜免疫系は常に微生物侵入との対抗に十分に精通しているため、皮膚粘膜表面への非侵襲的ワクチンとこれら汚染物質の同時投与は、ワクチン接種者にほとんど危険を生じない。それに反して、深部組織への汚染したワクチンの注射は、理論的には、時宜を得た免疫応答の非存在下で、体内における微生物の指数増殖を引き起こし得る、あるいは逆に、過剰反応性の免疫系により誘導された「免疫性急性発症(immune storm)」を引き起こし得る。全体的に見て、皮膚粘膜表面に沿った防御免疫の誘発は、日々のルーチンである。動物およびヒトは、戦争(健康全般)に敗北せずに日々の戦闘(日々の微生物侵入)に勝利するために適切な機序で進化した。非侵襲的ワクチン接種は、免疫適格性が低い深部組織への免疫刺激性ワクチンアジュバント複合体の身体送達により免疫系を驚かすことなく、界面に沿った日々の免疫系の働きを利用する。
アデノウイルスをワクチン担体に開発するジグザグ経路。アデノウイルスは、逆位末端配列に囲まれた30〜38kb(群毎に変動するサイズ)の直鎖DNAゲノムを有する正二十面体無エンベロープDNAウイルスのファミリーに属する。Ad粒子は、六方晶系タンパク質カプシド内にパッケージングされたしっかりとコイルしたDNAゲノムを含有する(図9A)。Adゲノムは、調節タンパク質をコードする初期遺伝子と構造タンパク質をコードする後期遺伝子の両方を含有する[29]。一般に、動物およびヒトにおいて、複数のAd血清型が存在し、異なる血清型の間には病原性および疾患経過に有意な差が存在し得る。一部は、免疫適格性ヒト宿主において極めて良性であり(例えば、ヒトAd血清型5[30])、一方、他のものは、通常軽度で自己限定性の疾患を生じ得る。数多くの注目に値する根拠は、Adのワクチン担体への開発を保証する。特に、ヒトAd4およびAd7に基づく経口ワクチン(非侵襲的ワクチンの一種)は、新兵(military recruits)の大量免疫化において安全かつ有効であることを立証した[31]。潜在的には、複製Ad4またはAd7は、さらに、他の病原体に由来する抗原に対する免疫を誘発するための経口ワクチン担体へと生物工学によって作ることができる。しかし、制御された様式の遺伝子組換え生物を表す、複製性の生物工学的ベクターを定量的に公開することは困難である。一般通念において、遺伝子組換え生物の生態系への導入も望ましくない。よって、非複製的ベクターは、その複製的対応物よりも安全で許容できよう。非複製Ad5ベクターは、そのE1領域を切断することによりほとんど30年前に開発されたが(図9B)[32]、ヒト293細胞において産生されるE1欠損(ΔE1)Ad5ベクターの決定的な問題点は、トランスフェクトした293細胞により示されるE1遺伝子座を構成する重複配列とベクター骨格との間の相同組換えにより生じる、複製能を有するAd(RCA)による内因性汚染である[33]。RCAは、ウイルス排出により居合わせた者へと水平伝播する能力により感染した宿主において複製することができるため、バイオハザードを表す[30]。RCAの問題を回避するため、ヒトPER.C6細胞において、PER.C6ゲノムとの重複配列を含有しないPER.C6適合性シャトルベクターを用いてRCAフリーAdベクターが作製された[34、35]。複製Ad4およびAd7とは異なり、非複製Ad5は、ウイルス増幅を起こす能力がないため、また、低pH、胃および膵臓プロテアーゼならびに細胞外ムチンに対し感受性であるため、経口投与された場合効率的に動物を免疫化しない[36]。
経口経路による投与後に観察される問題にもかかわらず、非複製的E1/E3欠損(ΔE1E3)Ad5(図9B)が開発され、導入遺伝子の収容、高力価産生、高効率遺伝子送達および高レベル導入遺伝子発現(少なくとも初期バーストとして)のためのその高い能力から、多数の治療試験において非経口遺伝子療法ベクターとして用いた[35]。しかし、Ad5は、導入遺伝子発現が一過性であるため、古典的遺伝子療法に理想的なベクターではない[35]。従って、Ad5ベクターの使用は通常、持続性の導入遺伝子発現を必要とする遺伝子療法の主要目標を満たすことはできない。さらに、ヒト集団における先在のAd5免疫の共通の存在[37〜39]およびベクターによる最初の接種後の抗Ad5免疫応答の速やかな発生[40、41]は、遺伝子移入効率を限定することによりその臨床用途を妨害した。最初のAdベクターが先在のAd免疫により無能化される場合、別のAdベクターが代用できると想定し、これらの弱点を回避するための戦略は、血清型スイッチ、カプシド改変および非ヒトAdベクターの開発を包含する。Ad11またはAd35繊維を含有するヒトAd3、Ad4、Ad35、Ad41またはキメラAd5は、生物工学によって非複製的Adベクターにされたが(図10)、Ad5は、依然として前臨床動物モデルにおいて他の血清型よりも強力で安全である[42]。ウシAd[43]、豚Ad[43]および非ヒト霊長類Ad[44]等、数多くの非ヒトAdも開発されて、Adベクターのレパートリーを拡大した(図10)。豚Adベクター化ワクチンは、少なくともマウスにおけるそのAd5対応物と同程度に強力となり得る[45]にもかかわらず、ヒトAd5は、非ヒトAdによる予測不可能なヒトの病気を誘導するリスクのため、依然として最初の遺伝子移入ベクターである[46]。ヒトAd5のゲノムは、他のAd血清型との同時感染後であっても、本分野において著しく安定的である[47]。さらに、Ad5ベクターは、そのDNAゲノムにおける病原体抗原のコード化に加えて、病原体エピトープとpIX[48]またはヘキソンカプシドタンパク質[49]の融合後に、表面に外来抗原を提示するようさらに開発された(図10)。E2bの欠失[50、51]または逆位末端配列およびパッケージングシグナル以外のほぼ全Ad5配列(ガットレス(gutless)Ad)(図10)[52]の欠失により、免疫原性がより低いAd5ベクターが開発された。今日まで、これらの洗練された戦略は、重大な臨床改善をもたらしてはいない。
Ad5の筋肉内または静脈内注射とは対照的に、鼻腔内投与(Ad5感染の天然経路)が、マウス[41、53]、非ヒト霊長類[54]およびヒト[19]において効力を目に見えて失うことなくΔE1E3 Ad5ベクター化ワクチンに先在のAd5免疫を迂回させることができることが示された。これらの観察は、恐らく、高効率の遺伝子送達、頑強な導入遺伝子発現および呼吸器における粘膜関門に沿った強力な抗原提示に帰する。よって、抗Ad5免疫は、もはや打ち勝ちがたい限定要因ではなく、生物工学によって作られるAdベクターの精密化は、もはやAdベクター化ワクチンのさらなる開発の必須条件ではない可能性がある。
Ad5ベクターの評判は、その開発において何度も失墜した。先在のAd5免疫に加えて、ヒト遺伝子療法治験において肝動脈に高用量のAd5-OTCベクターを注入した後に部分的オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症患者が死亡[55]したことから、Ad5は一般通念において危険なベクターとして認識されるようになった。Ad粒子が注射後に全身性炎症を速やかに誘導し[56、57]、恐らく血小板との相互作用により様々なAd血清型が凝血の活性化の原因となる[42]ため、証拠は、循環器系(Ad感染の非天然経路)へのAd粒子の注射が危険なアプローチであることを示す。Ad5ベクター化HIVワクチンの大規模ヒト治験(Step Study)において、筋肉内注射による投与は、HIVウイルスチャレンジ量を低下させず、ワクチン接種は、Ad5血清陽性対象におけるヒトHIV感染のリスク増加を伴った[58、59]。Ad5ベクター化ワクチンの効力は、細胞性免疫の誘発において他のウイルスおよび非ウイルスに基づくワクチンプラットフォームの効力に勝るため、この直感に反した結果もまた、ベクターの誤用が原因である可能性がある[60]。結果的に、CD4+T細胞は、HIV感染の特異的な標的であるため、Ad5に誘導されたCD4+T細胞の増殖は、この特有の疾患を悪化させるであろう[61]。その上、Step Studyにおいてヒト対象は、HIV等、粘膜病原体に対する粘膜免疫の誘発において非常に強力という訳ではない[14、62、63]、Ad5粒子の筋肉内注射により免疫化された[58、59]。
現在のアデノウイルスベクター化ワクチンの現実性チェック。安全かつ有効な次世代のワクチンを開発するため、高い損益比で速やかに防御免疫を誘導することがワクチンにとって重大である。ワクチンの製造、流通および投与は、容易、高速かつ経済的でなければならない。その上、処方されたワクチンおよび最終的な充填した産物の固有の安定性は、低温流通体系(cold chain)なしでの長期貯蔵を可能にする必要がある。
Table 2(表2)に示す通り、Adベクター化ワクチンによる免疫化後に、マウス、モルモット、ニワトリ、ハムスター、コットンラット、アライグマ、スカンク、ブタおよび非ヒト霊長類において多種多様な病原体に対する防御免疫が誘発された。全体的に見て、Adベクター化ワクチンは、動物モデルにおいて生きた病原体に対する迅速かつ他の種類のワクチンよりも頑強な保護を付与することができる。
Adベクター化ワクチンの複数のヒト臨床治験が為されてきたが、免疫化されたヒト対象は、病原性のある生きた病原体でほとんどチャレンジされなかった(Table 3(表3))。特に、DNAおよびAd5ベクター化マラリアワクチン(DNA-予備刺激/Ad5-追加免疫)の筋肉内注射により免疫化されたヒト志願者のサブセットは、Ad5血清陰性ヒト対象において蚊に刺された後の生きたマラリアスポロゾイトチャレンジから保護された。Ad5追加免疫なしのDNAワクチン接種単独は、マラリアに対するヒトの保護に失敗したことが示された。Ad5ワクチン接種単独が保護を付与することができるかについては、現時点では不明である[64]。多くのヒト治験における免疫化されたヒトは、生きた病原体でチャレンジされていなかったとしても(Table 3(表3))、ヒトにおけるAdベクターの使用の広範な安全性データベースを提供した。
アデノウイルスベクター化経鼻ワクチンの効力&安全性。先に記載した通り、経鼻ワクチン接種は、注射針を用いない様式で強力な粘膜免疫を誘導する。呼吸器DCは、自然および獲得免疫を架橋する鼻呼吸路(nasorespiratory tract)内に近接する上皮下ネットワークを形成する。呼吸器内のDCの密度は、より大量の吸入抗原に曝露された部位で最高である[65]。ヒトにおけるワルダイヤー輪を構成する鼻咽頭関連のリンパ系組織は、B細胞応答および形質細胞生成の独特な誘導性部位である。よって、経鼻ワクチン接種は、呼吸器内の分泌性IgA抗体の形成等、体液性免疫誘発の伝達機構である[66]。局所的体液性免疫応答が、非ヒト霊長類へのAdベクター化ワクチンの鼻腔内投与後に鼻、膣および唾液分泌物において誘導された[67]。Ad5ベクター化経鼻ワクチンは、マウスにおける粘膜分泌物および血清において、その注射用対応物よりも優れた抗原特異的なIgA応答を誘導した[68]。接種経路に関係なく、Adベクター化ヘルペスワクチンでマウスを免疫化した直後、体液性免疫に加えて、全身性および粘膜免疫区画において細胞性免疫応答が観察された。しかし、既往の細胞傷害性Tリンパ球応答は、それぞれ粘膜または全身性免疫化後、免疫化数ヶ月後に粘膜または全身のリンパ系組織に排他的に区画化された[14]。
DNA-予備刺激/Ad5-追加免疫マラリアワクチンは、Ad5血清陰性ヒト対象における生きたマラリアスポロゾイトチャレンジに対する保護を誘導したが、5名のAd5血清陽性ヒト志願者の保護失敗[64]は、先在のAd5免疫に帰する可能性がある[37、38、40、41]。先に記載した通り、このハードルを回避するためのアプローチの一つは、その後のAd5再投与の有効性を低下させることなく、注射用ワクチンの不利益を活用して非侵襲的粘膜ワクチンの利点とすることにより、経鼻投与によりAdベクター化ワクチンを接種することである[19、41、53、54]。Ad5ベクター化経鼻ワクチンは、全身性免疫化ではなく鼻腔内免疫化が、粘膜組織において長命の細胞傷害性Tリンパ球を誘導するとの知見により示される通り、気道において集中的な粘膜免疫を誘導し得る[14]。その上、全身性免疫化が、より頑強な全身性免疫応答を誘導するとしても、Ad5ベクター化経鼻ワクチンは、全身性免疫化が失敗しても粘膜病原体から動物を保護することができる[63、69、70]。経鼻ワクチン接種により誘導される集中的な粘膜免疫応答が、罹患していない内部組織および臓器への全身性の負担(例えば、全身性炎症)を大幅に低下し得るという仮説は、CD103+粘膜DCが、ナイーブT細胞からFoxp3+調節性T細胞への転換を助成することにより炎症応答の勢いを弱め得るとの知見によって裏付けられた[71]。
全身的に送達されたAd粒子により誘導される共通の有害効果は、注射後に多数のAd粒子が肝臓に隔離されるために、肝臓損傷および全身性毒性である[72]。非経口注射とは対照的に、Adの体内分布は、鼻腔内投与後に肺に限定され[73]、いかなる内臓にも炎症は観察されなかった[68]。
脳と鼻腔の近接のため、Ad5粒子が、鼻内噴霧後に脳における炎症および毒性を誘導し得るか決定することが重大である。ヒト神経障害[74]を伴うインフルエンザとは異なり、Ad5による自然感染は、ヒトにおいて脳炎を誘導することは報告されていない。マウスへのΔE1E3 Ad5ベクターの鼻腔内投与は、嗅球を越えて導入遺伝子発現を媒介せず、脳における炎症の誘導も行わなかった[68]。よって、相当量のAd5が、経鼻送達後に脳に進入できないことが考え得る。時に少数のAd5粒子が脳に浸潤できたとしても、非複製的Ad5は、複製および後期遺伝子発現により有害な効果を増幅する能力がないため、その複製的野生型対応物よりも損害が少ない可能性がある。弱毒生インフルエンザウイルスワクチン(LAIV;米国ではFluMist(登録商標)として公知)の安全性プロファイル[75]は、LAIVは、温度がより低い気道においてのみ複製し、寒冷適応LAIVには高温すぎる脳内では複製できないため、インフルエンザウイルス誘導性脳炎[74]が、脳におけるウイルス複製に帰する可能性があるという仮説を実証する。TLR-3欠乏性患者における単純ヘルペス脳炎の誘導[76]は、これが、嗅索を通って脳に浸透する少量のウイルスに共通の事象である可能性と、免疫適格性の人々に有効な防御機序が存在して、脳内で制御不能に複製する前にウイルスを抑止することを示唆する。複製的野生型Ad5による自然感染は、脳炎を伴わないため、非複製的Ad5ベクターの鼻内噴霧は、ワクチン送達の安全な担体の探求における伝達機構を表す。
Ad5ベクター化HIVワクチンの筋肉内注射によりヒトを免疫化することが誤りであったとしても[58、59]、CD4+T細胞レパートリーを動員するAd5の能力は、一部には、他の病原体に対する強力な防御免疫を誘発するための伝達機構となり得る[41、53、63、77〜79]。今日まで、Ad5ベクター化インフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、先在のAd5免疫の存在下で重篤な副作用を引き起こすことなく、ヒト対象において血清転換を誘導した[19]。ヒトにおけるマラリアに対する無菌の(sterile)免疫[64]およびインフルエンザに対する血清転換[19]の誘導(Table 2(表2))は、複数の動物モデルにおいて誘導される堅実な防御免疫と(Table 2(表2))併せて、疾患予防におけるAdベクター化ワクチンの価値を総合的に立証する。
LAIVは、ヒト集団のサブセット(米国における2〜49歳)を免疫化するために認可された[75]。LAIVと同様に、大規模な野外試験によりその安全性プロファイルが十分に確立される前の少なくとも初期においては、Adベクター化経鼻ワクチンは、極端な若齢者および高齢者の免疫化に許可できないと考え得る。さらに、経鼻ワクチン接種は、呼吸器疾患(例えば、喘息)の患者には推奨されない。非複製Ad粒子を用いた経鼻ワクチン接種に妊婦を受け入れてよいかは、現時点では不明である。
Adベクター化ワクチン&他の組換えDNAに基づくワクチンの商業化の見通し。RCA汚染のない非複製ΔE1E3 Ad5ベクター化ワクチン[35]は、非許容的細胞において複製能力のない、タンパク質カプシドに包埋された直鎖DNAゲノムからなるため(図9A)、DNAワクチンの変種として分類することができる。訓練された人材により、遺伝子銃[80、81]、注射器針[82]またはエレクトロポレーション装置(electroporator)[83]等の浸透装置を用いて接種される必要のあるネイキッドDNAワクチンとは異なり、Ad粒子は、経鼻送達後に粘膜関門に沿って自律的に細胞に浸透することができる[35]。DNAワクチンが、現代のワクチンに関する潜在的な安全性の懸念の多くの先を行き、組換えDNA技術が新たなワクチンを迅速かつ創造的に低コストで作製することができるにもかかわらず[80、82]、ほんの10年前には、DNAワクチンは、科学界における許容性が限定的な立証されていない目新しいものであった。今日まで、4種のネイキッドDNAワクチンが、商業規模の動物用途に認可された[84]。293細胞において産生されるp53をコードするRCA汚染されたAd5ベクターが、中国において2004年から多数の癌患者の治療に認可された[85]。数年間の利用増加および注意深い患者経過観察の結果、臨床像が展開し始めているため、有望なデータは、感染性疾患に対する公衆衛生の武器庫における不可欠のツールの一種としてのAdベクター化ワクチンにより、組換えDNAに基づくワクチンの時代を導き得ることが考え得る。
保存の際のAdベクター生存率の維持。安全性および有効性に加えて、次世代のワクチンは、世界中の最も貧しい人々にまでワクチンを広範に普及させることを確実にするため、一連の冷却設備(a chain of cold facilities)への依存が低い必要がある。今日まで、新規処方によりAdベクターを、液体バッファーにおいて4℃で少なくとも1年間[86];炭水化物ガラス(carbohydrate glass)において45℃で少なくとも6ヶ月間[87];または凍結乾燥した乾燥粉末として4℃で少なくとも1年間[88]保存することが可能になった。液体または凍結乾燥形態のいずれかにおいてAd粒子を室温で保存するための専有技術もStabilitechにおいて開発された[202]。要約すると、RCAフリーAd5ベクターは、無血清PER.C6浮遊細胞において迅速に製造し、カラムクロマトグラフィーにより容易に精製し、低温流通体系を用いずに保存および出荷してよい最終的な充填した産物として処方することができる(図5)。
病原体に対する迅速&持続性の完璧な保護を付与するためのアデノウイルスベクター化薬物・ワクチンデュオ。本出願人は近年、Ad5ゲノム内にコードされた病原体抗原ありまたはなしのΔE1E3 Ad5粒子の筋肉内注射ではなく鼻腔内投与が、獲得免疫が誘発される前にインフルエンザに対する予防療法を付与し得ることを実証した[89]。よって、病原体抗原をコードするAd5ベクターは、薬物・ワクチンデュオ(DVD)として、病原体に対する迅速かつ持続性の完璧な保護を誘導し得る。Ad5ベクター化インフルエンザDVDは、認可されたインフルエンザワクチン(Table 3(表3))および薬物(Table 5(表6))と比較して、数多くの利点を付与する。マウスへのΔE1E3 Ad5粒子の投与が、I型インターフェロン(IFN-αおよびIFN-β)等、多様な炎症性サイトカインおよびケモカイン[56]の産生を迅速に誘導し[90]、肺DCを損ない[91]、ナチュラルキラー細胞を活性化し[92]、抗ウイルス一酸化窒素の産生を誘導し[57]、Ad5と、血液タンパク質、血小板、マクロファージ、内皮細胞およびそれぞれの実質細胞との間に多面的な相互作用を引き起こす[56]ことが実証された。ΔE1E3 Ad5粒子により誘導される複数の反応が組み合わされて、気道における抗インフルエンザ状態を確立し、これにより、インフルエンザウイルスが容易に迂回することができない多次元的な防御障壁を作製することができると考え得る。
予防的インフルエンザ療法は、複合的な細菌ライセート[93]または細菌毒素[94]の鼻腔内投与により行うことができるが、細菌構成成分に誘導された抗インフルエンザ状態は非常に一過的であり、その保護的効果は療法後数日間以内に減退した[93、94]。Ad5誘導性の保護的効果が、単一用量レジメンで少なくとも3週間持続でき、47日目にほんの部分的な減退しか観察されなかったとの知見[89]は、細菌構成成分およびΔE1E3-Ad5に誘導される抗インフルエンザ状態間の根底をなす機序が異なっている可能性を示唆する。特に、Ad5による療法のみが、DVDのワクチン構成成分が、その薬物効果が減退する前に獲得免疫を誘発するのに十分な時間を可能にする(図11)。さらに、インフルエンザ薬として呼吸器へ消化管関連の細菌毒素を投与することは[94]、免疫系を驚かすことにより進化的医学における中核原理を侵害し、この非天然レジメンは、ヒト対象におけるベル麻痺の誘導を伴った[7、8]。
インフルエンザウイルスは、インフルエンザ薬(例えば、M2イオンチャネル遮断薬[アマンタジン、リマンタジン]またはノイラミニダーゼ阻害剤[オセルタミビル、ザナミビル])により阻害される場合、薬物耐性株への変異において潜行性である[95]。現代のインフルエンザ薬とは異なり、Ad5ベクター化DVDは恐らく、インフルエンザウイルスに直接的に影響することなく、呼吸器における生息環境を変化させる。従って、Ad5粒子は、インフルエンザウイルスに薬剤耐性を誘導するような突然変異圧を付与しない。薬物を投与した動物におけるその後の粘膜病原体感染に対する脆弱性を増強させるリスクを有する、オセルタミビル誘導性の粘膜免疫抑制[96]とは対照的に、Ad5ベクター化DVDは、少なくともインフルエンザ設定において保護的粘膜自然免疫を増強する[89]。認可された経鼻LAIV(例えば、FluMist)は、生きたインフルエンザウイルスを含有するため[35]、インフルエンザ薬とLAIVの同時投与は、薬物が生きたインフルエンザウイルスを死滅させることによりワクチンを無能にするため逆効果である。Ad5ベクター化DVDは、薬物標的(例えば、イオンチャネルまたはノイラミニダーゼ)を欠くため認可されたインフルエンザ薬と適合性であるのみならず(Table 4(表4))、そのワクチン能力に加えてそれ自体薬物としての予防療法も付与する(Table 5(表6))[89]。
インフルエンザが、Ad5粒子により抑止され得る唯一の疾患である可能性は低い。Ad5が、万能薬としてあらゆる疾患に対抗できる可能性も低い。知見は単に、前臨床動物モデルにおけるAd5ベクター化DVDの単一の鼻腔内投与が、粘膜呼吸病原体の少なくともサブセットに対する予防療法を何週間も付与し得ること、DVDの使用が、薬剤耐性を誘導できない筈であることを示す。DVDのワクチン構成成分によるその後の持続性の防御免疫誘発は、有効性を強化する。DVDプラットフォームの開発は恐らく、多種多様な疾患状況における新規臨床戦略の開発を助成するであろう。
アデノウイルスベクター化ワクチンによる動物の大量免疫化。Table 2(表2)に示す通り、家畜と共に野生生物を大量免疫化するためのAdベクター化ワクチンが開発された。特に、ニワトリは、トリインフルエンザウイルス赤血球凝集素をコードするヒトAd5ベクターの筋肉内注射[78]、in ovo投与[97〜101]またはエアロゾル噴霧[102、103]により、トリインフルエンザ(恐らく他の家禽疾患も同様)に対して免疫化することができる。よって、家禽の大量免疫化におけるAd5ベクター化ワクチンの多用途性は、他の家禽ワクチンよりも優れている。ブタも、Ad5ベクター化ワクチンによる免疫化に成功した[104、105]。野生生物を大量免疫化するための餌として経口イヌAdベクター化狂犬病ワクチンが開発された[106]。全体的に見て、Adベクター化ワクチンは、大量免疫化プログラムにおける有望なツールとして現れつつある。
結論。証拠は、Adベクター化ワクチンおよび新たなDVDが、他のアプローチに見られる副作用プロファイル、常温保存不能性(shelf instability)または製造課題を生じない、正確に設計され、容易に製造される、高度に有効なDVDを可能にして、多種多様な疾患状況におけるヒトおよび動物の迅速かつ持続性の完璧な保護を付与する潜在的に革命的なアプローチを提供することを示す。
専門家の解説。世界的なワクチン適用範囲をさらに強化するため、低温流通体系の必要がない、低コストで迅速に製造し、非医療従事者により大量投与することのできる新世代のワクチンの開発が急を要する。Ad5ベクター化ワクチンは、これらの判断基準に準拠する。DVDプラットフォームの開発は、ワクチンおよび薬物を薬剤耐性により損なわれることのない単一パッケージに統合することにより、医学的見地を潜在的に変化させ得る。
5年間の見解。Ad5ベクター化経鼻インフルエンザワクチンの2回のヒトフェーズI臨床治験が、有望な結果をもたらしつつ完了した。Ad5ベクター化DVDの鼻内噴霧後の生きたインフルエンザウイルスによるヒト対象のチャレンジは、5年以内に実施されると予想される。Ad5ベクター化家禽ワクチンは、5年以内に商業市場に進出すると予想される。
主要な問題点。迅速に製造し、急性発症の際に非医療従事者により大量投与することができる新世代のワクチンの開発は、緊急の必要がある。複製能を有するアデノウイルス(RCA)フリーアデノウイルス(Ad)5ベクター化ワクチンは、需要増大に応じて、無血清培地におけるPER.C6浮遊細胞から迅速に低コストで生産することができる。RCAフリーAd5ベクター化ワクチンは、鼻内噴霧により人々に大量投与することができると共に、自動化in ovo投与およびエアロゾル噴霧により家禽に大量投与することができる。野生生物は、イヌAdベクター化経口ワクチンを含有する餌により大量免疫化することができる。Adベクター化ワクチンは、特異的な免疫反応性の焦点である十分に定義された抗原に基づき、高度に特異的な免疫介入を誘導することができる。ベクターは非複製的であり、手順は進化的医学に準拠するため、人間へのRCAフリーAd5ベクターの経鼻投与に対するいかなる安全性の懸念も存在しない筈である。ニワトリ細胞はヒトAd5の複製を支持しないため、Ad5ベクターによる家禽の大量免疫化に対するいかなる安全性の懸念も存在しない筈である。ワクチン接種後に有益な免疫保護に向けて免疫レパートリーが動員された後に、ニワトリはAd5を迅速に排出すると考え得る。DNA-予備刺激/Ad5-追加免疫したマラリアワクチンは、蚊に刺された後の生きたマラリアスポロゾイトチャレンジからのヒト対象の保護に成功した。Ad5ベクター化経鼻ワクチンは、薬物様様式でインフルエンザに対する迅速な保護を付与することが思いがけず示された。薬物およびワクチンを薬剤耐性により損なわれない単一パッケージに統合する薬物・ワクチンデュオの開発は、インフルエンザ薬およびワクチンが調製される仕方を根本的に変化させるであろう。全体的に見て、全身性ワクチン接種により誘導される有害な効果がますます同定された。非侵襲的粘膜免疫化は、粘膜病原体からの保護付与において、その全身性対応物よりも安全で有効である。
表
情報資源
Van Kampen KR、Shi Z、Gao Pら、Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in human. Vaccine 23、1029〜1036(2005)。
Toro H、Tang DC、Suarez DL、Sylte MJ、Pfeiffer J、Van Kampen KR. Protective avian influenza in ovo vaccination with nonreplicating human adenovirus vector. Vaccine 25、2886〜2891(2007)。
Zhang J、Tarbet EB、Feng T、Shi Z、Van Kampen KR、Tang DC. Adenovirus-vectored drug-vaccine duo as a rapid-response tool for conferring seamless protection against influenza. PLoS ONE 6、e22605(2011)。
(参考文献)
(実施例4)
アデノウイルスベクター化インフルエンザの迅速かつ持続的な免疫学的治療法
Ad5ベクター化インフルエンザRAPITの目標は、低コストで大量生産して、非医療従事者により大量投与することができ、インフルエンザに対する迅速/持続性の保護を付与する能力を有するが、薬剤耐性を誘導する可能性および野生のインフルエンザウイルスとの再集合の可能性のない、インフルエンザの迅速かつ持続的な免疫学的治療法(RAPIT)を開発することである。インフルエンザウイルスを繁殖させる必要性はなく、免許を持つ医療従事者による針注射の必要性もない。
インフルエンザウイルスを増殖させることなく、Ad5ベクター化インフルエンザワクチンを迅速に作製することができる。インフルエンザウイルスにおいて、増殖は株毎に変動し、一部の株は致死性であり、再集合および変異現象を行う傾向があり、卵における低力価の産生が見られる。インフルエンザHAをコードするAdベクターにおいては、より一貫した増殖速度が見られ、ベクターは良性であり、再集合現象は見られず、PER.C6細胞において高力価の産生が見られ、新たなRCAフリーAdは、AdHighシステムにより1ヶ月以内で作製することができる。
培養浮遊細胞におけるAd5ベクター化インフルエンザワクチンは、大量生産することができる。Adベクター化インフルエンザワクチンに関して、AdへのインフルエンザHAのクローニングは、インフルエンザウイルスの増殖を必要とせず、500リットルのウェーブ(wave)バイオリアクターは、無血清培地におけるPER.C6浮遊細胞から一度に1016Ad粒子を産生することができ、Ad粒子は、カラムクロマトグラフィーにより精製することができ、Adベクター化インフルエンザワクチンの産生は、需要増大に迅速に応答して能率化することができる。従来のインフルエンザワクチンに関して、一部のインフルエンザウイルス株は、卵において十分に増殖せず、平均収量は、卵1個当たりおよそ1用量であり、汚染の同定は、細胞培養物よりも卵においてより困難であり、卵関連のアレルギーの可能性があり、加工が面倒である。
Ad5による遺伝子療法および経鼻ワクチン接種は、次の通りに比較することができる。遺伝子療法において、治療タンパク質が、Adから発現され、形質導入された細胞においてAdから発現された正確な用量の治療タンパク質により、生物学的効果が直接的に誘導される。経鼻ワクチン接種において、抗原タンパク質がAdから発現され、抗原が提示され、形質導入された細胞においてAdから発現された抗原により引き起こされる反応カスケードにより免疫応答が誘導される。Adに対し先在の免疫が、Adベクター化経鼻ワクチンの効力に干渉しないという仮説を支持する報告として、Shi Zら、J. Virol. 75: 11474、2001(マウス)、Hoelscher MAら、Lancet 367: 475、2006(マウス)、Croyle MAら、PLoS ONE 3: e3548、2008(マウス)、Song Kら、PNAS 107: 22213、2010(マカク)およびVan Kampen KRら、Vaccine 23: 1029、2005(ヒト)が挙げられる。
Ad5ベクター化経鼻トリインフルエンザワクチンのヒトフェーズI臨床治験の試験計画を次に記す。AdhVN1203/04.H5ベクターは、A/VN/1203/04(H5N1)トリインフルエンザウイルスのHA1+HA2をコードした。試験は、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、単一施設試験であった。増大する用量、108、109および1010vpの3コホートが存在した。鼻内噴霧によりこの用量を投与し、0日目および28日目に2用量を投与した。総計48名の健康な志願者、19〜49歳が存在した。用量コホート当たり16名のヒト対象が存在し、コホートにつき4名のプラセボ対照を包含した。細胞培養はRCAフリーであり、細胞培養に基づき、無血清培地においてPER.C6浮遊細胞における製造を行った。30%以上の対象における呼吸器系における有害事象は、鼻漏、鼻の炎症(irritation)、鼻閉、咳および/または咽頭炎を包含した。
(実施例5)
呼吸病原体に対する広域スペクトルで迅速かつ持続的な免疫学的治療法(RAPIT)としてのアデノウイルス粒子
図14は、胞子チャレンジ直前のアデノウイルス粒子の鼻腔内滴下注入による予防的炭疽菌療法を描写する。
方法。AdE(E1/E3欠損Ad5空のベクター、導入遺伝子なし)およびAdVAV(E1/E3欠損Ad5ベクター、炭疽菌感染防御抗原をコードする)粒子を、1×105cfu(ほぼ25×LD50)の炭疽菌Sterne株胞子でi.n.チャレンジする直前に、単一用量レジメンにおいて0.05mlの容量で若い(2ヶ月齢)雌A/Jマウスの鼻孔に滴下して鼻腔内(i.n.)投与した。チャレンジされた動物の生存を14日間毎日モニターした。
結果。チャレンジ2日前に投与されたAdVAV粒子は、炭疽菌から67%のマウスを保護した。チャレンジ2日前に投与されたAdE粒子は、炭疽菌から30%のマウスを保護した。チャレンジ1日前に投与されたAdE粒子は、炭疽菌から22%のマウスを保護した。未処理対照マウスおよび希釈したAdE粒子を投与したマウスは全て5日以内に炭疽菌で死んだ。AdVAV/-2、1.3×108ifu用量でチャレンジ2日前にi.n.滴下注入されたAdVAV粒子。AdE/-2、1.3×108ifu用量でチャレンジ2日前にi.n.滴下注入されたAdE粒子。AdE*/-2、1.3×106ifu(PBSに100倍希釈)用量でチャレンジ2日前にi.n.滴下注入されたAdE粒子。AdE/-1、1.3×108ifu用量でチャレンジ1日前にi.n.滴下注入されたAdE粒子。対照、未処理対照マウス;括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。
意義。データは、AdEまたはAdVAV粒子が、恐らくは、感染した動物における炭疽菌の増殖を妨害する自然免疫の特異的な武器を活性化することにより、薬物様様式の予防的炭疽菌療法を付与し得ることを示唆する。データは、AdVAVから発現されるPA遺伝子が、AdEによる炭疽菌からの保護との相乗作用を付与し得ることを示唆する。AdVAV粒子の鼻内噴霧が、急性発症において他の炭疽菌ワクチンよりも迅速な炭疽菌に対する保護を付与し得ることが考え得る。
図15は、AdVAV粒子のi.n.滴下注入による曝露後の炭疽菌療法を描写する。
方法。4×105cfu(ほぼ100×LD50)の炭疽菌Sterne株胞子でi.n.チャレンジする前または後に、単一用量レジメンにおいて0.05mlの容量で若い(2ヶ月齢)雌A/Jマウスの鼻孔に滴下してAdVAV粒子をi.n.投与した。30mg/kg(1日1注射を2日間;チャレンジ1および24時間後に注射)用量のシプロフロキサシンをi.p.注射により投与した。チャレンジされた動物の生存を14日間毎日モニターした。
結果。チャレンジ2日前に投与されたAdVAV粒子は、炭疽菌から40%のマウスを保護した(図1の結果の確認)。チャレンジ1時間後に投与されたAdVAV粒子は、死亡を遅延させたが、生存率を改善できなかった。チャレンジ1時間後に注射されたシプロフロキサシンも死亡を遅延させたが、生存率の改善は達成できなかった。チャレンジ1時間後にシプロフロキサシン注射と併せて投与されたAdVAV粒子は、炭疽菌から56%のマウスを保護した。全未処理対照マウスは、5日以内に死亡した。AdVAV/D-2、1.3×108ifu用量でチャレンジ2日前にi.n.滴下注入されたAdVAV粒子。AdVAV/D0、1.3×108ifu用量でチャレンジ1時間後にi.n.滴下注入されたAdVAV粒子。AdVAV/Cipro/D0、シプロフロキサシンのi.p.注射と併せて1.3×108ifu用量でチャレンジ1時間後にi.n.滴下注入されたAdVAV粒子。Cipro/D0、シプロフロキサシンのi.p.注射。対照、チャレンジに先立つ処理なしの未処理対照マウス。括弧内の数値は、各群における動物の数を表す。
意義。データは、抗生物質処理と併せたAdVAV粒子が、曝露後の炭疽菌療法を付与し得ることを示唆する。本実験においてAdVAVおよび抗生物質の間の相乗作用が明らかにされた。AdVAV粒子の鼻内噴霧が、曝露後設定において抗生物質使用の必要性を低下させ得る可能性があると考え得る。
(実施例6)
呼吸病原体に対する広域スペクトルの迅速かつ持続的な免疫学的治療法(RAPIT)としてのアデノウイルス粒子
近年、Ad5ゲノムにコードされた病原体抗原ありまたはなしのΔE1E3アデノウイルス5型(Ad5)粒子の鼻腔内(i.n.)投与が、獲得免疫が誘発される前にインフルエンザに対する予防療法を付与できることが実証された。よって、病原体抗原をコードするAd5ベクターは、薬物・ワクチンデュオ(DVD)として、病原体に対する迅速かつ持続性の完璧な保護を誘導し得る。マウスへのΔE1E3 Ad5粒子の投与が、I型インターフェロン(IFN-αおよびIFN-β)等、多様な炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を迅速に誘導し、肺樹状細胞を損ない、ナチュラルキラー細胞を活性化し、抗ウイルス一酸化窒素の産生を誘導し、Ad5と、血液タンパク質、血小板、マクロファージ、内皮細胞およびそれぞれの実質細胞との間に多面的な相互作用を引き起こすことが実証された。ΔE1E3 Ad5粒子により誘導される複数の反応が組み合わされて、気道における抗インフルエンザ状態を確立し、これによりインフルエンザウイルスがほぼ迂回できない多次元的な防御障壁を生じることができることが考え得る。インフルエンザが、Ad5粒子により抑止され得る唯一の疾患である可能性は低い。Ad5粒子が、万能薬としてあらゆる疾患に対抗できる可能性も低い。この知見は、AdE粒子の単一のi.n.投与が、粘膜呼吸病原体の少なくともサブセットに対する予防療法をマウスにおいて何週間も付与でき、AdE粒子は、他のウイルスに突然変異圧を直接的に付与することなく気道における生息環境を変化させるため、DVDの使用が、薬剤耐性を誘導できない筈であることを単に示すものである。DVDのワクチン構成成分によるその後の持続性の防御免疫誘発は、有効性を強化する。DVDプラットフォームの開発は恐らく、多種多様な疾患状況における新規臨床戦略の開発を助成するであろう。
本実施例の目標は、呼吸器多核体ウイルス(RSV)に感染したコットンラット(CR)における、VaxinのAdE(Ad5空のベクター、RSV導入遺伝子なし)による予防的鼻腔内処理を評価することである。本試験のエンドポイントは、未処理コットンラットと比較した、感染したコットンラット(体重約60〜125gm)の肺洗浄液(3mL)および鼻洗浄液(2mL)におけるウイルス力価低下の実証である。ウイルス定量化は、プラーク低下アッセイにより行う。
RSV-コットンラットモデルにおける予防的有効性:コットンラット(60〜125gm体重):
群1:賦形剤(A195バッファー)で予防的(-2日目)に鼻腔内処理した6匹のCR。
群2:2.4×108ifuのAdEで予防的(-30日目)に鼻腔内処理した6匹のCR。
群3:2.4×108ifuのAdEで予防的(-2日目)に鼻腔内処理した6匹のCR。
群4:各処理サイクル(予備刺激/追加免疫)において2.4×108ifuのAdEで予防的(-30日目および-2日目)に鼻腔内処理した6匹のCR。
群5:2.4×108ifuのAdEで予防的(-5時間目)に鼻腔内処理した6匹のCR。
チャレンジウイルス:RSV-Tracy(P3w.p.1/20/12、HEp-2細胞において増殖)、2.25×105PFU鼻腔内(100μL)を、イソフルランで軽く麻酔(anesthesized)したコットンラット(60〜125gm)にチャレンジ。ストック:2.25×106PFU/mL。
AdEベクター:賦形剤(A195バッファー)および2.4×109濃度のAdEは、-80℃で保存する。使用直前に、材料を室温に温める。各群につき各処理に少なくとも0.8mL(6匹のCR/群×0.1mLの接種材料)が必要とされる。未使用の材料は-80℃で維持する。
臓器および試料の採取。CO2で安楽死させた後、各コットンラットを秤量し、性別および齢を記録する。肺の左葉と、大きな右葉一枚を除去し、滅菌水でリンスして外部血液汚染を除去し、秤量する。26g3/8針を付けた3mL注射器内の2%FBS-MEM(1:1、v:v)と混合した15%グリセリンを含有するIscoveの培地3mLを用いて、葉を全体的に膨張させるよう複数の部位に注射し、胸膜を通過して(transpleurally)左葉を灌流する。膨張した葉を平らになるよう穏やかに押圧することにより灌流液を回収し、同じ技法に従って胸膜を通過した右葉の灌流に用いた。灌流液を採取し、力価測定するまで氷上に保存する。上気道の鼻洗浄液に関しては、下顎を離断する。次に、頭部を取り外し、2%FBS-MEM(1:1、v:v)と混合した15%グリセリンを含有するIscoveの培地1mLを、各鼻孔に押し入れた(総計2mL)。パレット(pallet)の後方の開口から流出液を採取し、力価測定するまで氷上に保存する。試料は力価測定前に凍結しないこと。力価測定は試料採取の終わりに行う。
RSV Tracy肺洗浄力価(PFU/gm肺)および鼻洗浄液力価(総PFU)。アッセイ開始24時間前に10%FCSに調製された、HEp-2細胞のほとんどコンフルエントな単層(20〜40×104細胞/ウェル)を含有する24ウェル組織培養プレートを用いてプラークアッセイを行う。各アッセイ開始時に、被験試料の希釈液(通常、系列log10)を作製する。次に、それぞれの0.2mL試料をウェルに2連で加え、時々穏やかに撹拌しつつ90分間吸着させた。接種材料を除去した後、続いて、抗生物質、ビタミンおよび他の栄養素を含有する2%FBS-MEMにおける0.75%メチルセルロースを単層に重層する。組織培養物および陽性ウイルス対照は、各アッセイに包含されている。36℃、5%CO2インキュベーター内にプレートを置く。6±1日後に、0.1%クリスタルバイオレット/10%ホルマリン溶液(1.5mL/ウェル)でプレートを染色し、24〜48時間、室温で静置する。ウェルを水でリンスする。プラークは、存在していれば、容易に目視できる(暗い濃青色の背景における明るい丸)。20〜80個の間のプラークを含有するウェル内のプラークを全て数え上げる。平均化し、鼻洗浄液は総log10PFUとして、あるいは肺または他の臓器はlog10PFU/g組織として、ウイルス力価を計算する。この方法による検出下限は、およそ1.5log10PFU/g組織である。
AdEに対する抗体応答:-30日目に群2および群4(3匹のCR/群)、-2日目に群2および群4(6匹のCR/群)から、眼窩神経叢から採血する。+4日目に群1〜群5から採血を行う。血清を-20℃で保存する。
貯蔵試料。鼻洗浄液および肺洗浄液(群1〜群5)のアリコートを取り分け、-80℃で保存する。+4日目の血清試料を取り分け、-80℃で保存する。
略語:i.n.、鼻腔内;PFU、プラーク形成単位。1N=6動物/群;総計30動物。20日目にRSV-Tracy(約2.25×105PFU)でi.n.チャレンジされる(100μL)全動物。
略語:i.n.、鼻腔内;PFU、プラーク形成単位;gp、群。
時系列0日目:
9am=>群5をi.n.AdE処理
2pm=>全群を感染
+4日目における投薬量および肺重量および体重:
1群1v3、4、5の間に統計学的有意差が存在した;それぞれP=0.41、0.011および0.004。
2群1v5の間に統計学的有意差が存在した;P=0.047。
RSV-Tracy鼻洗浄液および肺洗浄プラーク低下力価:
*最小検出=0.7log10総PFU。統計解析(スチューデントt検定、両側)のため、最小検出(0プラーク)を0.35log10総PFUとしてカウントした。追加的な有意なP値:群5v2、4、P<0.02。
*最小検出=1.3log10/g肺。**経鼻液にはウイルスが存在したが、プラークが存在しなかった。従って、肺が感染していなかった、あるいは技術的エラーであることが想定された。解析のためこれらのデータを包含しなかった。統計解析(スチューデントt検定、両側)のため、最小検出(0プラーク)を1.1log10/g肺としてカウントした。追加的な有意なP値は存在しなかった。
このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、本発明の精神または範囲から逸脱しないその多くの明らかな変種が可能であるため、上述の段落により定義される本発明は、上述の記載に説明されている特定の詳細に限定されるべきではないことを理解されたい。

Claims (19)

  1. 呼吸病原体に対する迅速かつ持続的な保護的応答を、それを必要としている哺乳類対象において誘導するための方法であって、病原体に由来する抗原をコードするまたはそれをコードしないE1および/またはE3欠失アデノウイルスを少なくとも107感染単位(ifu)の有効量で鼻腔内投与するステップを含み、インフルエンザウイルス由来の抗原が包含されていない場合、保護的免疫応答が、投与の約5時間以内に始まり、少なくとも45日間持続する方法。
  2. 呼吸病原体がウイルスである、請求項1に記載の方法。
  3. ウイルスが、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、風邪ウイルスまたは麻疹ウイルスである、請求項2に記載の方法。
  4. 風邪ウイルスが、ライノウイルスまたはコロナウイルスである、請求項3に記載の方法。
  5. 呼吸病原体が細菌である、請求項1に記載の方法。
  6. 細菌が、バチルス属(Bacillus)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、連鎖球菌属(Streptococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ヘモフィルス属(Haemophilus)およびマイコプラズマ属(Mycoplasma)からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
  7. 細菌が炭疽菌である、請求項6に記載の方法。
  8. 呼吸病原体が真菌である、請求項1に記載の方法。
  9. 真菌が、アスペルギルス属(Aspergillus)である、請求項8に記載の方法。
  10. 有効量が、少なくとも107感染単位(ifu)のE1および/またはE3欠失アデノウイルスである、請求項1に記載の方法。
  11. 有効量が、少なくとも108感染単位(ifu)の、E1およびE3が欠失または破壊された空のアデノウイルスである、請求項1に記載の方法。
  12. 有効量が、少なくとも109感染単位(ifu)の、E1およびE3が欠失または破壊された空のアデノウイルスである、請求項1に記載の方法。
  13. それを必要としている対象が、成体である、請求項1に記載の方法。
  14. それを必要としている対象が、幼体である、請求項1に記載の方法。
  15. それを必要としている対象が、免疫力がないの患者である、請求項1に記載の方法。
  16. 少なくとも2ステップの投与を含む、請求項1に記載の方法。
  17. 投与ステップが、約40日間置いて、約41日間置いて、約42日間置いて、約43日間置いて、約44日間置いて、約45日間置いて、約46日間置いて、約47日間置いて、約48日間置いて、約49日間置いて、あるいは約50日間置いて為される、請求項16に記載の方法。
  18. アデノウイルスが、ヒトアデノウイルスである、請求項1に記載の方法。
  19. アデノウイルスが、ウシアデノウイルス、イヌアデノウイルス、非ヒト霊長類アデノウイルス、ニワトリアデノウイルスまたはブタアデノウイルスである、請求項1に記載の方法。
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