CZ304169B6 - Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, zpusob jeho prípravy a lécivo, imunogenní kompozice a vakcína obsahující rekombinantní adenovirus - Google Patents

Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, zpusob jeho prípravy a lécivo, imunogenní kompozice a vakcína obsahující rekombinantní adenovirus Download PDF

Info

Publication number
CZ304169B6
CZ304169B6 CZ20033438A CZ20033438A CZ304169B6 CZ 304169 B6 CZ304169 B6 CZ 304169B6 CZ 20033438 A CZ20033438 A CZ 20033438A CZ 20033438 A CZ20033438 A CZ 20033438A CZ 304169 B6 CZ304169 B6 CZ 304169B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
virus
adenovirus
recombinant
gly
thr
Prior art date
Application number
CZ20033438A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20033438A3 (cs
Inventor
C. J. Ertl@Hildegund
M. Wilson@James
Original Assignee
The Wistar Institute Of Anatomy And Biology
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Wistar Institute Of Anatomy And Biology
Publication of CZ20033438A3 publication Critical patent/CZ20033438A3/cs
Publication of CZ304169B6 publication Critical patent/CZ304169B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, který v kapside opicího adenoviru obsahuje cis-elementy opicího adenoviru a heterologní gen operativne navázaný na sekvence rídící expresi, kde kapsida opicího adenoviru je odvozena z simpanzího adenoviru vybraného ze skupiny sestávající z Pan 5, Pan 6 a Pan 7. Zpusob prípravy tohoto vektoru, který zahrnuje spojení heterologního genu a ITR sekvence cis elementu opicího adenoviru. Lécivo, imunogenní kompozice a vakcína, zejména pro indukci cytotoxické imunitní reakce, obsahující výse uvedený rekombinantní adenovirus.

Description

Oblast vynálezu
Vynález se týká replikačně defektního opičího adenovirového vektoru, způsobu jeho přípravy a léčiva, imunogenní kompozice a vakcíny, zejména pro indukci cytotoxické imunitní reakce, obsahující rekombinantní adenovirus. Popsán je také způsob indukce CD8+ T reakce proti vybrané molekule tím, že se dodá molekula pomocí rekombinantního opičího adenoviru, způsob indukce interferonu-α a interferonu-β u jedince pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru jedinci. Vynález je možný uplatnit při profylaxi a léčbě infekcí virem lidské imunodeficience a lidským papilloma virem, a též v protinádorové terapii.
Dosavadní stav techniky
Rekombinantní adenoviry lidského serotypu 5 byly testovány jako nosiče ve vakcínách pro různé antigeny z virů, parazitů nebo nádorových buněk. Výsledky byly povzbudivé, protože rekombinantní adenoviry s deletovaným El vyvolávaly imunitní reakce k produktům transgenu. Adenovirus lidského serotypu 5 (Ad5) je všudypřítomným nepatogenním virem, který infikuje většinu lidí během prvního roku jejich života. Překladatelé vynálezu zjistili, že pre-existující imunita k běžným lidským serotypům redukuje účinnost adenovirové rekombinantní vakcíny na bázi homologního serotypu viru. V některých případech může být tato redukce účinnosti překonána podáním vyšších dávek rekombinantního lidského adenoviru. Nicméně, tyto vyšší dávky mohou být asociované s dalšími nežádoucími vedlejšími účinky.
Existuje tedy potřeba prostředků použitelných pro indukci imunitní reakce na vybranou molekulu, které by neměly nedostatky spojené se současnými způsoby podání.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález umožňuje přednostní indukci cytotoxické imunitní reakce a heterologní molekulu, při kterém je molekula podána hostiteli pomocí rekombinantního opičího adenoviru. Předkladatelé vynálezu neočekávaně zjistili, že rekombinantní opičí adenoviry, použité podle předkládaného vynálezu, prezentují imunogen způsobem, který indukuje významně silnější CD8+ T-lymfocytární reakci, než když je imunogen dodán srovnatelným lidským virem typu 5. Dále předkladatelé vynálezu zjistili, že rekombinantní šimpanzí adenoviry indukují přibližně 5 krát vyšší hladiny interfcronu-a a interferon uP než lidské adenoviry.
Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je replikačně defektní opičí adenovirový vektor, který v kapsidě opičího adenoviru obsahuje cis-elementy opičího adenoviru a heterologní gen operativně navázaný na sekvence řídící expresi, kde kapsida opičího adenoviru je odvozena z šimpanzího adenoviru vybraného ze skupiny sestávající z Pan 5, Pan 6 a Pan 7.
Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména ii) opičí adenovirový vektor podle provedení 1, který je replikačně defektní v důsledku absence schopnosti exprimovat adenovirové Ela a Elb;
iii) opičí adenovirový vektor podle provedení i) nebo ii), ve kterém je eliminován zpožděný časný gen E3.
- 1 CZ 304169 B6 iv) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až iii), který vykazuje funkční deleci v E4 genu;
v) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až iv), který obsahuje deleci ve zpožděném časném genu E2a;
vi) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až v), který obsahuje deleci v kterémkoliv z pozdních genů LI až L5 genomu opičího adenoviru;
vii) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z viru vybraným ze skupiny sestávající z viru lidské imunodeficience, viru opičí imunodeficience, respiračně-syncytiálního viru, viru opičí imunodeficience, rcspiračně-syncytiálního viru, viru parainfluenzy typu 1-3, chřipkového viru, viru herpes simplex, lidského cytomegalovirů, virů hepatitidy, lidského papillomaviru, polioviru, rotaviru, calicivirů, viru spalniček, viru příušnic, viru zarděnek, adenoviru, viru vztekliny, viru psinky, viru dobytčího moru, koronaviru, parvoviru, virů infekční rhinotracheitidy, viru kočičí leukemie, viru kočičí infekční peritonitidy, viru ptačí infekční bursitidy, viru nemoci Newcastle, viru Marekovy nemoci, viru prasečího respiračního a reprodukčního syndromu, viru koňské arteritidy a virů encephalitidy;
viii) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z bakterie vybrané ze skupiny sestávající z Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, 1’ibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare complex, Próteus mirabilis, Próteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacilus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum;
ix) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt zhouby vybrané ze skupiny sestávající zAspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus a Histoplasma;
x) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z parazita vybraného ze skupiny sestávající zLeishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii;
xi) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), ve kterém je heterologní gen je určen k vyvolání protinádorové reakce s využitím nádorového antigenu nebo antigenu asociovaného s nádory vybraného ze skupiny sestávající z prostatického specifického antigenu, karcinoembryonálního antigenu, MUC-1, Her2, CA-125 a MAGE-3;
Předmětem vynálezuje také (provedení vynálezu xii)) způsob přípravy vektoru podle kteréhokoliv z provedení i) až xi), který zahrnuje spojení heterologního genu a ITR sekvence cis elementu opičího adenoviru.
Dále je předmětem vynálezu také použití rekombinantního adenoviru podle kteréhokoliv z provedení i) až xi) pro výrobu léčiva pro xiii) indukci odpovědi T-buněk na imunogen u pacienta,
-2CZ 304169 B6 kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus předmětně indukuje odpověď CD8+ T-buněk na imunogen, když je podán podkožně, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolu regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta; a xiv) indukci protilátkové odpovědi na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenoviru přednostně indukuje protilátkovou odpověď na antigen v nízkých dávkách, když je aplikován na sliznici, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta.
V provedeních vynálezu xiii) a/nebo xiv) je uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně formulován pro podkožní podání (provedení vynálezu xv)).
V provedeních vynálezu xiii) až xv) je uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně formulován pro podání v nízké dávce (provedení vynálezu xvi)).
V provedeních vynálezu xiii) až xvi) je uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně formulován pro podání v účinné dávce v rozmezí od 104 do 106 pfu (provedení vynálezu xvii)).
V provedeních vynálezu xiii) až xvii) je imunogen přednostně vybrán ze skupiny sestávající z peptidů, polypeptidu nebo proteinu odvozeného z patogenního viru vybraného ze skupiny sestávající z viru lidské imunodeficience 1, lidského papilloma viru a viru vztekliny (provedení vynálezu xviii)).
Dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xix)) je imunogenní kompozice použitelná pro indukci cytolytické imunitní odpovědi na virus lidské imunodeficience, která obsahuje (a) rekombinantní opičí adenovirus podle kteréhokoliv z provedení 1 až 7 obsahující optimalizovanou sekvenci nukleové kyseliny kódující modifikovaný gag protein viru lidské imunodeficience-1 a (b) fyziologicky kompatibilní nosič.
Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xx) je použití imunogenní kompozice podle provedení xix) pro výrobu léčiva pro indukci odpovědi CD8+ T-buněk proti viru lidské imunodeficience u savců.
Do rozsahu vynálezu spadá také xxi) použití rekombinantního opičího adenoviru podle kteréhokoliv z provedení i) až vii) kódujícího imunogenní protein odvozený od papilloma viru pro výrobu léčiva pro indukci odpovědi CD8+ T-buněk proti papilloma viru u savců;
a xxii) použití rekombinantního opičího adenoviru podle kteréhokoliv z provedení i) až vii) kódujícího imunogenní protein odvozený od viru vztekliny pro výrobu léčiva pro indukci neutralizační protilátkové odpovědi proti viru vztekliny u savců.
Jiné provedené vynálezu (xxiii) zahrnuje vakcínu proti viru lidské imunodeficience, která obsahuje rekombinantní opičí replikačně defektní adenovirus podle kteréhokoliv z provedení 1 až 7 obsahující antigen viru lidské imunodeficience-1 (HfV-1).
-3CZ 304169 B6
Ve vakcíně podle provedení xxiii) je antigen přednostně vybrán ze skupiny sestávající z obalové, pol nebo gag oblasti HIV-1 (provedení xxiv), kterým je zvláště výhodně přirozený antigen, ze kterého byly odstraněny elementy genetické nestability (provedení xxv)).
Ve vakcíně podle provedení xxiv) je dále přednostním antigenem HIV-1 gag cDNA obsahující sekvence SEQ ID NO:6.
Do rozsahu vynálezu spadá také xxvii) vakcína proti vzteklině, která obsahuje rekombinantní opičí replikačně defektní adenovirus podle kteréhokoliv z provedení i) až vii) obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující antigen viru vztekliny pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi antigenu vztekliny.
Konečně je předmětem vynálezu i xxviii) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z provedení i) až xi) pro použití pro indukci odpovědi T-buněk na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje odpověď CD8+ T-buněk na imunogen, když je podán podkožně, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu a pacienta; a xxix) opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv v provedení i) až xi) pro použití pro indukci protilátkové odpovědi na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje protilátkovou odpověď na antigen v nízkých dávkách, když je aplikován na sliznici, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta.
V dalším provedení je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen provedení vynálezu i) až xxix) explicitně uvedená výše, a jen ta jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.
Vynález umožňuje přednostní indukci CD8+ T-lymfocytární reakce na heterologní molekulu ujedince, při kterém je jedinci podán rekombinantní opičí adenovirus nesoucí molekulu. Ve výhodném provedení je rekombinantním opičím adenovirem rekombinantní šimpanzí adenovirus.
Vynález také umožňuje indukci produkce interferonu-α a/nebo interferonu-β u jedince, při kterém je jedinci podán rekombinantní opičí adenovirus.
Vynález je proveditelný jako imunogenní prostředek použitelný pro indukci CD8+ T-lymfocytární reakce proti viru lidské imunodeficience. Tento prostředek obsahuje rekombinantní opičí adenovirus obsahující optimalizovanou sekvenci nukleové kyseliny kódující modifikovaný gag protein viru lidské imunodeficience-1 a fyziologicky kompatibilní nosič.
Při podání imunogenního prostředku podle vynálezu savcům je také možno dosáhnout indukce CD8+ T-lymfocytární reakce proti viru lidské imunodefícience.
-4CZ 304169 B6
Při podání rekombinantního opičího adenoviru kódujícího imunogenní protein z lidského papi Horná viru je také možno dosáhnout indukce CD8+ T-lyfocytární reakce proti lidskému papilloma viru.
Popis obrázků na výkresech
Obr. 1 shrnuje genetickou organizaci genomu šimpanzího adenoviru C68. Na obr. IA je genom C68 šimpanzího adenoviru schematicky znázorněn horní rámečkem. Invertované terminální repetitivní sekvence jsou černě a časné regiony jsou šedě. Šipky nad rámečkem ukazují směr exprese časných genů. Čára pod boxem představuje rozdělení genomu na 100 mapových jednotek. Šipky dole ukazují pět pozdních genových regionů a proteinů kódovaných v každém regionu. Čísla pod rámečkem nebo šipky ukazují start (promotor nebo iniciační kodon) a konec (kanonický PolyA signál) pro každý region. * označuje E2A pozdní promotor. Obr. 1B ilustruje Pstl klony; Obr. 1C ilustruje BamHI klony. Obr. ID ilustruje Hindlll klony. Pro části 1B-1D ukazují nestínované regiony, že fragment byl klonován do plasmidového vektoru, jak je uvedeno v tabulce 1, zatímco stínované regiony ukazují, že restrikění fragment nebyl klonovaný. Pro každou část je pod rámečkem uvedeno jméno fragmentu, alfabeticky s tím, že Aje největší fragment, a velikost fragmentu, a konce fragmentů jsou označeny pod rámečkem.
Obr. 2 ukazuje srovnání několika sekvencí hexonových proteinů. Odvozené aminokyselinové sekvence vysoce podobných lidských adenovirových hexonů byly srovnávány s šimpanzím adenovirem za použití CLUSTAL X. Serotypy a podskupiny jsou uvedeny na levém okraji a po nich je uvedeno číslo zbytku. Číslice označují pozici aminokyseliny vzhledem ke startu translace. Aminokyseliny jsou označené s ohledem na C86, aby byly zvýrazněny podobnosti sekvence (šedě) a identity sekvence (černě). Zespoda je označeno sedm hypervariabilních regionů se smyčkovými doménami DE1 a FG1 a tyto odpovídají následujícím Ad2 sekvencím v seřazení: HVR1, 137-188; HVR2, 194-204; HVR3, 222-229; HVR4, 258-271; HVR5, 278-294; HVR6, 316327; a HVR7, 433-465. GanBank přírůstková číslo pro sekvence jsou následující: AA03657 (Ad4), S37216 (Ad 16), S39298 (Ad3), AAdO3663 (Ad7) a Np040525 (Ad2).
Podrobný popis předkládaného vynálezu
Při srovnání imunogenity rekombinantních adenovirů lidského kmene 5 a šimpanzího adenoviru kmene 68, která oba exprimují zkrácené sekvence gag, bylo prokázáno, že šimpanzí adenovirus je účinnější. Podobné výsledky byly pozorovány pro rekombinantní šimpanzí adenoviry exprimující zelený fluorescentní protein a glykoprotein viru vztekliny. Tato vyšší účinnost rekombinantní šimpanzího adenoviru není s největší pravděpodobností vázána na vyšší expresi transgenu, protože pokusy byly provedeny jak s Ad, tak s šimpanzími rekombinantními nesoucími podobné expresní kazety, ve kterých je transgen řízen časným cytomegalovirovým promotorem. Zde uvedená data také naznačují, že je nepravděpodobné, aby byly rozdíly v důsledku tropismu, protože jak šimpanzí adenovirus, použitý způsobem podle předkládaného vynálezu, má neočekávaně vyšší účinnost v adjuvanci než lidský adenovirus. Tato lepší adjuvantní účinnost má výrazný vliv na velikost a kinetiku imunitní reakce specifické pro transgen, která je indukována šimpanzím adenovirem.
Výhodné je, že tato vyšší účinnost umožňuje použití nižších dávek šimpanzího adenoviru, než jsou dávky, které by byly nutné pro lidský adenovirový transportní systém. Dále předkladatelé vynálezu zjistili, že rekombinantní šimpanzí adenoviry indukují přibližně 5krát vyšší koncentrace interferonu-α a interferonu-β než lidské adenoviry.
Dále bylo zjištěno, že rekombinantní šimpanzí adenoviry mají přibližně stejný vliv na dendritické buňky jako lidský adenovirus typu 5. Tento vliv, stejně jako neočekávaná účinnost opičích adenovirů, poskytuje významné výhody v indukci cytotoxické imunitní reakce na vybraný antigen a v léčbě stavů, u kterých je žádoucí zvýšená indukce interferonu-α a/nebo interferonu-β.
-5CZ 304169 B6
I. Rekombinantní opičí adenovirus
A. Zdroje
Různé sekvence šimpanzího adenoviru jsou dostupné z American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, a zjiných zdrojů. Požadovanými šimpanzími kmeny jsou Pan 5 [ATCC VR-5911], Pan 6 [ATCC VR-592] a Pan 7 [ATCC VR593], Nej vhodnějším i jsou šimpanzí adenovirové kmeny Bertha nebo Cl [ATCC přírůstkové č. VR-20] a šimpanzí adenovirus kmene Pan 9 nebo CV68 [ATCC VR-594]. Virus CV68 je pro zjednodušení označován v předkládaném vynálezu jako „C68“. Viry byly původně izolovány ze stolice [Cl, Rowe et al, Proč. Soc. Exp. Med., 91:260 (1956)] nebo z mesenteriálních mízních uzlin [C68, Basnight et al., Am. J. Epidemiol., 94:166 (1971)] infikovaných šimpanzů. Sekvence těchto kmenů a lokalizace adenovirových genů Ela, Elb, E2a, E2b, E3, E4, LI, L2, L3, L4 a L5 jsou uvedeny v US Patentu 6,083,716, který je zde uveden jako odkaz. Volitelně mohou být nonšimpanzí opičí adenovirové sekvence použity při přípravě rekombinantních vektorů podle předkládaného vynálezu. Takové non-šimpanzí adenoviry zahrnují ty, které jsou získány z paviáních adenovirových kmenů [např., ATCC VR275], adenovirových kmenů izolovaných od makaků rhesus [např., ATCC VR-209, ATCC VR-275, ATCC VR-353, ATCC VR-355], a adenovirových kmenů izolovaných z afrických makaků [např., ATCC VR-541; ATCC VR-941; ATCC VR-942; ATCC VR-943],
Rekombinantní šimpanzí (nebo jiné opičí) adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat adenovirové sekvence získané zjednoho nebo více opičích adenovirových kmenů. Tyto sekvence mohou být získané z přirozených zdrojů, mohou být produkovány rekombinantně, synteticky nebo jinými chemickými metodami nebo technikami genetického inženýrství.
B. Rekombinantní opičí adenoviry
Rekombinantní opičí adenoviry použitelné v předkládaném vynálezu jsou virové částice, které se skládají z rekombinantních opičích adenovirových sekvencí nesoucích heterologní molekulu a/nebo kapsidové proteiny opičího adenoviru. Tyto opičí adenoviry, a zejména šimpanzí C68 a Cl sekvence, jsou také vhodné pro přípravu hybridních vektorů sjinými opičími nebo neopičími adenoviry, a při přípravě pseudotypovaných rekombinantních virů, tj. rekombinantních virů s adenovirovým vektorem nesoucím heterologní molekulu, která je sbalena v heterologním kapsidovém proteinu opičího původu.
1. Rekombinantní opičí adenovirus
Minimálně rekombinantní opičí adenovirus použitelný v předkládaném vynálezu obsahuje cis— elementy opičího adenoviru nutné pro replikaci a enkapsidaci viru, kde tyto cis-elementy obklopují heterologní gen. To znamená, že vektor obsahuje cis—působící 5‘ invertované terminální repetitivní (1TR) sekvence adenovirů, které účinkují jako sekvence rozpoznávající počátek replikace), přirozené 5‘ balicí domény/zesilovače transkripce (které obsahují sekvence nutné pro balení lineárních Ad genomů a zesilovací prvky pro El promotor), heterologní molekulu, a 5‘ ITR sekvenci. Viz, například, techniky pro přípravu „minimálního“ lidského Ad vektoru v US Patentu 6,203,975, který je zde uveden jako odkaz, a které mohou být snadno upraveny pro rekombinantní opičí adenovirus.
Volitelně rekombinantní opičí adenoviry použitelné v předkládaném vynálezu obsahují více než minimální opičí adenovirovou sekvenci definovanou výše. Tyto další Ad vektory mohou být charakterizovány jako vektory mající modifikace, které destruují schopnost adenoviru exprimovat jeden nebo více vybraných genových produktů. Výraz „funkční delece“ je zde použit pro popsání takových modifikací. Takové „funkční delece“ mají typicky formu delece celého genu
-6CZ 304169 B6 nebo části genu viru. Nicméně, takové funkční delece mohou mít také formu mutace spočívající v posunu čtecího rámce. Odborníkům v oboru budou jasné i další modifikace, které mohou být použity pro dosažení funkčních deleci.
V konkrétním požadovaném provedení jsou opičí adenoviry defektní v replikaci v důsledku absence schopnosti exprimovat adenovirové Ela a Elb, tj. tyto viry jsou funkčně deletované v Ela a Elb. Tyto rekombinantní opičí adenoviry mohou také nést funkční delece vjiných genech.
Například může být adenovirový opožděný časný gen E3 eliminován ze sekvence opičího adenoviru, která tvoří část rekombinantního viru. Funkce E3 není nutná pro produkci rekombinantních adenovirových částic. Tak není nutné nahrazovat funkci tohoto genového produktu pro sbalení rekombinantního opičího adenoviru použitelného v předkládaném vynálezu.
Rekombinantní opičí adenoviry mohou být také konstruovány tak, že mají funkční delece v E4 genu, ačkoliv může být žádoucí zachovat funkci E4 ORF6. Ještě jiný vektor použitelný v předkládaném vynálezu obsahuje deleci v opožděném časném genu E2a. Delece může být také provedena v jakémkoliv z pozdních genů LI až L5 genomu opičího adenoviru. Delece ve vmezeřených genech XI a IVa2 mohou být také užitečné pro některé účely. Jiné delece mohou být provedeny v dalších strukturálních i nestrukturálních genech. Výše uvedené delece mohou být použity samostatně, tj. adenovirové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat delece pouze v El. Alternativně mohou být delece v celých genech nebo v jejich částech, účinné pro destrukci jejich biologické aktivity, použity v jakékoliv kombinaci. Například, v jednom příkladném vektoru mohou mít adenovirové sekvence delece v El genu a v E4 genu, nebo v El, E2a a E3 genech, nebo v El a E3 genech, nebo v El, E2a a E4 genech, s nebo bez delece E3, a tak dále. Takové delece mohou být použity v kombinaci s dalšími mutacemi, jako jsou teplotně sensitivní mutace, pro dosažení požadovaného výsledku.
Transgen může být insertován do jakéhokoliv deletovaného regionu opičí adenoviru. Alternativně může být transgen insertován do existujícího genového regionu za účelem narušení funkce tohoto regionu, pokud je to žádoucí.
Bez ohledu na to, zda rekombinantní opičí adenovirus obsahuje pouze minimální Ad sekvenci nebo celý Ad genom pouze s funkčními delecemi v El a/nebo E3 regionech, obsahuje rekombinantní virus opičí adenovirovou kapsidu. Alternativně mohou být ve způsobech podle předkládaného vynálezu použity rekombinantní pseudotypované adenoviry. Takové pseudotypované adenoviry využívají kapsidové proteiny opičího adenoviru, ve kterých je sbalena molekula nukleové kyseliny nesoucí heterologní sekvence opičího adenoviru, nebo sekvence z jiného než opičího adenoviru. Tyto rekombinantní opičí adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány způsoby, které jsou známé odborníkům v oboru.
C. Produkce rekombinantních virových částic
Způsoby pro produkci rekombinantních opičích adenovirů využívají techniky, které jsou dobře známé odborníkům v oboru, např. techniky popsané v US Patentu 6,083,716. Při konstrukci rekombinantních opičích adenovirů pro transport heterologní molekuly do jedince (např. člověka, psa, kočky nebo jiného savce) může být sekvence adenovirové nukleové kyseliny použitá ve vektorech získána z různých opičích zdrojů.
Vektor obsahující sekvence opičího (např. šimpanzího) adenoviru, kterým chybí opičí adenovirové sekvence nutné pro produkci infekčních rekombinantních virových částic, mohou být použity společně s pomocným virem nebo vektorem. Pomocný virus poskytuje základní genové produkty nutné pro infektivitu a propagaci opičího adenoviru. Když je jedna nebo více deleci provedena v genech opičího adenoviru v jinak funkčním virovém vektoru, tak mohou být deletované genové
-7CZ 304169 B6 produkty doplněny v procesu produkce virového vektoru propagací vektoru ve vybraných balicích buňkách.
Tyto funkce mohou být poskytnuty v permanentně transformované buněčné linii, která poskytuje jednu nebo všechny funkce adenoviru, které jsou nutné pro balení, například jakoukoliv z Ela, Elb, E2a, E4 ORF6, VA RNA, které chybí ve vektoru. Pokud je to nutné nebo vhodné, mohou být balicí buňkou poskytnuty další adenovirové funkce, pomocí transfekce nebo infekce konstruktem obsahujícím tyto funkce. Volitelně může být adenovirová funkce vybrána tak, aby umožňovala balení virového vektoru nesoucího minigen do heterologního opičího adenovirového kapsidového proteinu. Vhodné metody pro „pseudotypování“ za použití opičího (např., C68) kapsidového proteinu budou jasné na základě skutečností známých v oboru týkajících se pseudotypování lidského adenoviru. Viz. např. US Patent 6,203,975.
Sestavení vybraných DNA sekvencí adenoviru a transgenu a dalších vektorových elementů do různých plasmidů a přenosových vektorů, a použití plasmidů a vektorů pro produkci rekombinantních virových částic, se provede za použití běžných technik. Mezi takové techniky patří běžné techniky klonování cDNA, které jsou popsané v učebnicích [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)], použití překrývajících se oligonukleotidových sekvencí adenovirových genomů, polymerasové řetězové reakce, jakékoliv techniky, které vedou k zisku požadované nukleotidové sekvence. Použijí se standardní techniky transfekce a ko-transfekce, např. CaPO4 srážení. Mezi další běžně používané techniky patří homologní rekombinace virových genům, plakování virů v agarové krycí vrstvě, způsobu měření generování signálů a podobně.
Například, po konstrukci a sestavení požadovaného člunkového vektoru obsahujícího transgen se člunkový vektor transfektuje in vitro do hostitelské buňky pro balení. Hostitelská buňka má nebo jí je dodána jakákoliv chybějící adenovirová funkce. Homologní rekombinace probíhá mezi pomocnou a vektorovou sekvencí, což umožňuje replikování sekvence adenovirus-transgen ve vektoru a její sbalení do virionových kapsid, což vede ke vzniku rekombinantních adenovirových částic.
Předkladatelé vynálezu zjistili, že El proteiny lidského adenoviru transkomplementují Eldefektní opičí adenovirus a tím umožňují jeho balení do opičích adenovirových částic. Nicméně, vzhledem k nízkému stupni homologie mezi lidským Ad El a sekvencí obklopující deletovanou opičí Ad El sekvenci, existuje minimální riziko, že bude opičí Ad El homologně rekombinovat za produkce replikace-kompetentního opičího adenoviru.
Rekombinantní opičí adenovirové částice produkované tímto způsobem mohou být izolovány a přečištěny za použití jakékoliv metody známé v oboru.
II. Heterologní molekuly pro transport do hostitele
A. Imunogeny
Heterologní molekula nesená na opičím adenoviru pro transport do hostitelské buňky může být jakákoliv substance, včetně například polypeptidu, proteinu, enzymu, karbohydrátu, chemické skupiny nebo molekuly nukleové kyseliny, kterou může být oligonukleotid, RNA, DNA a/nebo RNA/DNA hybrid. V jednom výhodném provedení je molekulou nesenou na opičím adenoviru transgen. Transgen a molekula nukleové kyseliny obsahují sekvenci nukleové kyseliny, heterologní k adenovirové sekvenci, která kóduje protein, peptid, polypeptid, enzym nebo jiný požadovaný produkt a regulační sekvenci řídící transkripci a/nebo translaci kódovaného produktu v hostitelské buňce, a která umožňuje expresi kódovaného produktu v hostitelské buňce nebo jedinci. Složená transgenu závisí na požadovaném použití opičího adenoviru.
-8CZ 304169 B6
Například, jeden typ transgenu obsahuje reportérovou nebo markerovou sekvenci, která po expresi produkuje detekovatelný signál. Nicméně, nejdůležitější jsou genové produkty a jiné molekuly, proti kterým je indukována protilátková nebo - ješté lépe - buněčná imunitní reakce.
Tyto imunogenní genové produkty a molekuly mohou být z různých patogenních organizmů, včetně virů, bakterií, hub nebo parazitů, které infikují člověka ajiné obratlovce, nebo mohou být z nádorových buněk. Imunogen může obsahovat peptidy nebo polypeptidy odvozené z proteinů. V některých případech obsahuje prostředek více než jeden imunogen. Požadované imunogenní prostředky obsahující tyto genové produkty ajiné molekuly zahrnují ty, které jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených viry, jako je virus lidské imunodeficience, virus opičí imunodeficience, respiračně syncytiální virus, virus parainfluenzy typu 1-3, chřipkový virus (např. virus chřipky A a B), Herpes simplex virus, lidský cytomegalovirus, viry hepatitidy (včetně viru hepatitid A, hepatitidy B a viru hepatitidy C), lidský papillomavirus, poliovirus, rotaviry, calicivirusy, virus spalniček, planých neštovic, zarděnek, adenovirus, virus vztekliny, virus psinky, virus dobytčího moru, coronavirus, parvovirus, viry infekční rhionotracheitidy, virus kočičí leukemie, virus kočičí infekční peritonitidy, virus ptačí infekční bursitidy, Newcastle virus, virus Marekovi nemoci, virus prasečího respiračního a reprodukčního syndromu, virus koňské arteritidy a různé encephalitické viry.
Další imunogeny jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených například bakteriemi, jako je Haemophilus influenzae (typovatelný a netypovatelný), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella cholereausuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare complex, Próteus mirabilis, Próteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorfeni, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacilus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum.
Další imunogeny jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených například houbami, jako je Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus a Histoplasma.
Další imunogeny jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených například parazity, jako je Leishmania major, Ascaris, Trichunis, Giardia, Schistosoma, Cryptosponidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii.
Mezi další výhodné imunogeny patří imunogeny určené pro vyvolání terapeutického nebo profylaktického protinádorového účinku obratlovců, a mezi takové patří nádorové antigeny nebo antigeny asociované s nádory, jako je například prostatický specifický antigen, karcinoembryonální antigen, MUC-1, Her2, Ca-125 a MAGE-3.
Příklady uvedené dále specificky ilustrují výhody způsobů a prostředků podle předkládaného vynálezu využívajících rekombinantní opičí adenovirový vektor, ze kterého je exprimován imunogenní peptid vztekliny (glykoprotein G nebo modifikovaný gag protein viru lidské imunodeficience-1. Jiné výhodné provedení využívá opičí adenoviru nesoucí imunogenní peptid z lidského papilloma viru. Nicméně, vynález není omezen na tyto imunogeny.
B. Regulační prvky
Transgen nebo jiná sekvence nukleové kyseliny, která vyžadují transkripci, translaci a/nebo expresi pro získání požadovaného genového produktu v buňkách a hostitelích, může obsahovat vhodné sekvence, které jsou operabilně navázané na kódující sekvenci pro navození exprese kódovaného produktu. Termín „operativně navázaná“ sekvence označuje jak sekvence řídící
-9CZ 304169 B6 expresi, které navazují na požadovanou sekvenci nukleové kyseliny, tak sekvence řídící expresi, které působí v trans nebo v určité vzdálenosti od dané sekvence nukleové kyseliny.
Mezi sekvence řídící expresi patří vhodné transkripční iniciační, terminační, promotorové a zesilovací sekvence; účinné signály pro zpracování mRNA, jako jsou sestřihové a polyadenylační signály; sekvence, které stabilizují cytoplasmatickou mRNA; sekvence, které zesilují účinnost translace (tj. Kozákovi konvenční sekvence); sekvence, které zvyšují stabilitu proteinu; a pokud je to žádoucí, tak sekvence, které zvyšují sekrece proteinu. V oboru je známo mnoho sekvencí řídících expresi - přirozených, konvenčních, indukovatelných a/nebo tkáňově specifických a tyto sekvence mohou být použity pro řízení exprese genu, v závislosti na požadovaném typu exprese. Pro eukaryotické buňky obsahují sekvence řídící expresi typicky promotor, zesilovač transkripce, například z imunoglobulinového genu, SV40, cytomegaloviru, atd., a polyadenylační sekvence, které mohou obsahovat sestřihová donorová a akceptorová místa. Polyadenylační (polyA) sekvence je obvykle insertována po sekvenci transgenu a před 3' adenovirovou ITR sekvencí. V jednom provedení je vybrána polyA hovězího růstového hormonu. Opičí adenovirus podle předkládaného vynálezu může také obsahovat intron, výhodně umístěný mezi sekvencí promotoru/zesilovače transkripce a transgenem. Jednou možnou intronovou sekvencí je sekvence z SV-40, a je zde označována jako SV-40 T intronová sekvence. Jiný element, který může být také použit ve vektoru, je interní místo pro vstup ribosomu (1RES). IRES sekvence je použita pro produkci více než jednoho polypeptidů z jediného genového transkriptu. IRES sekvence může být použita pro produkci proteinu, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec. Výběr těchto a dalších běžných vektorových elementů je snadný a je k dispozici mnoho takových sekvencí (viz, např., Sambrook et al., a odkazy zde citované, například na stranách 3.18-3.26 a 16.17-16.27; a Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1989).
V jednom provedení může být žádoucí vysoká úroveň konstitutivní exprese. Příklady takových konstitutivních promotorů jsou, například, LTR promotor (volitelně s RSV zesilovačem transkripce) viru Rousova sarkomu, cytomegalovirový (CMV) promotor (volitelně s CMV zesilovačem transkripce) (viz., např., Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)), SV40 promotor, dihydrofolat-reduktasový promotor, β-aktinový promotor, fosfoglycerol-kinasový (PGK) promotor, a EFlot promotor (Invitrogen). Indukovatelné promotory, regulované exogenně dodanými sloučeninami, jsou také použitelné a zahrnují zinkem-indukovatelný ovčí metallothioninový (MY) promotor, dexamethasonem (Dex)-indukovatelný promotor viru myších mammárních nádorů (MMTV), T7 polymerasový promotorový systém (WO 98/10088); promotor pro svlékání hmyzu (No et al., Proč. Nati. Acad Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), tetracyklinemreprimovatelný systém (Gossen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551(1992)), tetracyklinem-indukovatelný systém (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), viz též Uarvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), RU486-indukovatelný systém (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) a Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) a rapamycinem indukovatelný systém (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Dalším typem indukovatelných promotorů, které mohou být použity v tomto kontextu, jsou ty, které jsou regulované specifickým fyziologickým stavem, jako je například teplota, akutní fáze, konkrétní diferenciační stadium buňky nebo replikace buňky.
V jiném provedení se použije přirozený promotor pro transgen. Přirozený promotor může být výhodný tehdy, když má požadovaná exprese transgenu napodobovat přirozenou expresi. Přirozený promotor může být použit tehdy, když musí být exprese transgenu regulována okamžitě nebo vývojově, nebo ve specifické tkáni, nebo v reakci na specifické transkripční stimuly.
V jiném provedení mohou být pro napodobení přirozené exprese použity jiné přirozené elementy řídící expresi, jako jsou zesilovače transkripce, polyadenylační místa nebo Kozákovi konvenční sekvence.
Jiným provedením transgenu je transgen operativně navázaný na tkáňově-specifický promotor. Například, pokud je žádoucí exprese v kosterním svalu, může být použit promotor aktivní ve
- 10CZ 304169 B6 svalech. Sem patří promotory z genů kódujících skeletový α-aktin, myosinový lehký řetězec 2A, dystrofin, svalovou kreatinin kinasu, stejně jako syntetické svalové promotory s aktivitami vyššími než mají přirozené promotory (vize Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999). Příklady promotorů, které jsou tkáňově specifické, jsou známé pro játra (albumin, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotor jádra viru hepatitidy B, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); α-fetoprotein (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), kostní osteokalcin (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); kostní sialoprotein (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), lymfocyty (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); imunoglobulinový těžký řetězec; T-lymfocytámí receptor a řetězec), neuronální produkty, jako je promotor neuron-specifické enolasy (NSE) (Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), gen pro lehký řetězec neurofdament (Piccioli et al., Proč. Nati. Acad. Scí. USA, 88:5611-5 (1991)), a gen pro neuron-specifický vgf (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), a další.
Je jasné, že ne všechny sekvence řídící expresi účinkují stejně dobře v expresi všech transgenů podle předkládaného vynálezu. Nicméně, odborník v oboru může provést výběr mezi takovými sekvencemi řídícími expresi bez toho, že by se odchýlil od rozsahu předkládaného vynálezu. Vhodné promotorové sekvence/zesilovače transkripce mohou být vybrány odborníkem v oboru podle návodu uvedeného v předkládaném vynálezu. Takový výběr je rutinní záležitostí a není omezen na určité molekuly nebo konstrukty. Například je možné vybrat jednu nebo více sekvencí řídících expresi, které mohou být operativně navázané na požadovanou kódující sekvenci, a tyto sekvence mohou být insertovány do transgenu, minigenu a přenosového viru podle předkládaného vynálezu. Za použití jedné z metod pro balení opičího adenoviru uvedených v předkládaném vynálezu, nebo jak jsou známé v oboru, je možné infikovat vhodné buňky in vitro nebo in vivo. Počet kopií minigenu v buňce může být sledován Southernovou hybridizaci nebo kvantitativní PCR. Úroveň exprese RNA může být sledována Northernovou hybridizaci nebo kvantitativní RT-PCR. Úroveň exprese může být sledována Westernovou hybridizaci, imunohistochemicky, ELISA, RIA, nebo testováním biologické aktivity genových produktů. Tak je možné snadno testovat to, zda je konkrétní sekvence řídící expresi vhodná pro specifický produkt kódovaný transgenem, a podle toho vybrat vhodnou sekvencí řídící expresi. Alternativně, když přenášená molekula nevyžaduje expresi, například se jedná o karbohydrát, polypeptid, peptid, atd., tak sekvence řídící expresi nemusí tvořit součást rekombinantního opičího adenoviru nebo jiné molekuly.
III. Příprava viru pro podání
Rekombinantní opičí adenoviry, výhodně suspendované ve fyziologicky kompatibilním nosiči, mohou být podány člověku nebo jinému subjektu. Vhodné nosiče může vybrat odborník v oboru podle indikace, pro kterou je přenosový virus určen. Například je jedním vhodným nosičem salinický roztok, který může být formulován s různými pufrovacími roztoky (např. fosfátem pufrovaný salinický roztok). Dalšími nosiči jsou sterilní salinický roztok, laktosa, sacharosa, fosforečnan vápenatý, želatina, dextran, agar, pektin, podzemnicový olej, sezamový olej a voda. Výběr nosiče nijak neomezuje předkládaný vynález.
Volitelně mohou prostředky podle předkládaného vynálezu obsahovat kromě rekombinantního opičího adenoviru a nosiče další běžné farmaceutické přísady, jako jsou konzervační činidla, chemické stabilizátory, nebo - pro vakcíny - adjuvans. Mezi vhodná konzervační činidla patří chlorbutanol, kalium-sorbát, kyselina sorbová, oxid siřičitý, propylgallát, parabeny, ethyl— vanillin, glycerin, fenol a parachlorofenol. Mezi vhodná chemická stabilizační činidla patří želatina a albumin. Mezi vhodná adjuvans patří, mimo jiné, imunostimulační komplexy (ISCOMS), LPS analogy, včetně 3-O-deacylovaného monofosforyl lipidu A (Ribi Immunochem Research, lne.; Hamilton, MY), minerální olej a voda, hydroxid hlinitý, Amphigen, Avirdine, L121/skvalen, muramyl-peptidy a saponiny, jako je Quil A.
- 11 CZ 304169 B6
IV. Podání rekombinantních virů pro léčbu a/nebo profylaxi
Rekombinantní, replikace defektní adenoviry, jsou podány ve „farmaceuticky účinném množství“, což znamená, že je podáno takové množství rekombinantního adenoviru, které je při daném způsobu podání účinné v transfekci požadovaných buněk a vede k dostatečné úrovni exprese daného genu, která indukuje terapeutickou nebo vakcinační imunitní reakci, např., vede k dosažení měřitelné hladiny protektivní imunity.
Mezi běžné a farmaceuticky přijatelné způsoby podání patří například intranasální, intramuskulární, intratracheální, podkožní, intradermální, rektální, orální a jiné slizniční a parenterální způsoby podání. Termín slizniční podání označuje podání přes sliznice, například inhalačně, orálně, intranasálně, vaginálně nebo rektálně. Způsoby podání mohou být kombinovány, pokud je to potřebné, nebo mohou být upraveny podle imunogenu nebo onemocnění. Například při profylaxi vztekliny je výhodné podkožní, intratracheální, intranasální a orální způsob podání. Způsob podání primárně závisí na vlastnostech léčeného onemocnění.
Dávky nebo účinná množství rekombinantního replikace-defektního Ad viru závisí primárně na faktorech, jako jsou podmínky, vybraný gen, věk, hmotnost a zdravotní stav živočicha, a mohou být proto pro různé živočichy různé.
Dávky virového vektoru závisí primárně na faktorech, jako jsou typ léčeného onemocnění, vybraný gen, věk, hmotnost a zdravotní stav léčeného pacienta, a mohou být proto pro různé jedince (včetně člověka) různé. Neočekávaná účinnost rekombinantního opičího (např., šimpanzího) adenoviru podle předkládaného vynálezu umožňuje použití významně nižších dávek rekombinantního šimpanzího adenoviru pro dosažení dávky dostatečné pro indukci požadovaného imunogenního účinku (např. indukci předem určené hladiny CD8+ T-lymfocytů). Účinnou dávkou rekombinantního opičího adenoviru může být například dávky 104 pfu a 106 pfu šimpanzího adenoviru. Nicméně, mohou být použity i vyšší dávky, například v závislosti na způsobu podání. Virový vektor může být podán v dávce, například, od přibližně 100 μΐ do přibližně 100 ml, lépe od přibližně 1 ml do přibližně 10 ml, nosného roztoku, který obsahuje koncentrace v rozmezí od přibližně 1 x 104 jednotek vytvářejících plaky (pfu) od přibližně 1 x 1013 pfu viru/ml, a přibližně 1 x 109 až přibližně lxlO11 pfu/ml viru, pro dospělého o hmotnosti 80 kg. Výhodná dávka je přibližně 50 ml salinického roztoku s koncentrací 2x1010 pfu/ml. Výhodná dávka je přibližně 1 až 10 ml nosiče (například salinického roztoku) s výše uvedenou koncentrací. Terapeutické koncentrace, nebo hladiny imunity, vybraného genu mohou být sledovány, aby se určila potřeba dosycovacích imunizací. Podle stavu CD8+ T-lymfocytámí reakce, nebo případně titrů protilátek, mohou být žádoucí další imunizace. Volitelně mohou být rekombinantní opičí adenoviry podávány za použití režimu primární-dosycovací imunizace. V oboru byly popsány různé takové režimy a ty mohou být použity. Jedna vhodná metoda je popsána ve WO 00/11140, publikované 2.3.2000, která je zde uvedena jako odkaz.
V jednom výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na virus lidské imunodeficience u jedince pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího modifikovaný gag protein. Modifikovaný gag protein ilustrovaný v následujících příkladech byl optimalizovaný, například způsobem popsaným v US Patentu 5,972,596. Kódující a proteinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:7. Viz též G. Meyers et al., Eds., Human retroviruses and AIDS. A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 1991). Nicméně, v oboru jsou známé různé metody pro zlepšení exprese gag proteinu nebo jakéhokoliv jiného imunogenu nebo antigenu a tyto mohou být použity, příkladem je humanizace HIV-I gag kodonové sekvence, odstranění HIV-1 gag sestřihového místa, inserce další vedoucí sekvence před gag sekvenci HIV-1, inserce Kozákovi sekvence před gag sekvenci HIV-1. Volba metody pro optimalizaci není nijakým omezením předkládaného vynálezu. Alternativně může být způsob podle předkládaného vynálezu použit pro podání rekombinantního
- 12CZ 304169 B6 opičího adenoviru nesoucího HIV obalový protein nebo HIV pol. Jedním vhodným HIV obalovým proteinem je HIV glykoprotein 120, jehož sekvence jsou dostupné z GenBank. Nicméně, mohou být použity i jiné vhodné virové obalové proteiny. Sekvence pro HIV-1 pol je známá, stejně jako různé modifikované pol sekvence. Viz, například, US Patent 5,972,596 a R. Scheider et al, J. Virol, 71(7):4892-4903 (July 1997).
V jiném výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na proteiny asociované s nádory specifické pro určitou malignitu pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího protein asociovaný s nádory jedinci. Mezi takové proteiny patří buněčné onkogeny, jako je mutovaný ras nebo p53.
V jiném výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na proteiny asociované s nádory specifické pro určitou malignitu pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího protein asociovaný s nádory jedinci.
Ještě další výhodné provedení zahrnuje podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího protein odvozený z lidského papilloma viru za účelem prevence a léčby a profylaxe onemocnění způsobených tímto virem. Protein může být vybrán ze skupiny zahrnující E6 E7 a/nebo LI (Seeclorf, K. et al., J. Virol., 145:181-185 (1985). Když je onemocněním infekce respiračně syncytiálním virem, tak je protein vybrán ze skupiny zahrnující glyko- (G) protein a fúzní (F) protein, pro které jsou sekvence dostupné od GenBank.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustrativní předkládaného vynálezu a nijak neomezují jeho rozsah. Odborníkům v oboru bude jasné, že ačkoliv jsou popsány specifické podmínky a reakční činidla, existují různé další modifikace, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - Příprava vektoru na bázi šimpanzího adenoviru C68 s deletovaným El
Replikace-defektní verze C68 se izolovala pro použití v genovém přenosu. Použila se klasická strategie pro přípravu rekombinantního viru s deletovaným El, za použití homologní rekombinace v buněčné linii exprimující El. Prvním krokem bylo vytvoření plazmidu obsahujícího m.u. 0 až 1.3 a potom se přidal minigen exprimující zesílený zelený fluorescentní protein (GFP) z CMV promotoru a C68 sekvenci od 9 do 16.7 m.u. Tento linearizovaný plazmid se kotransfekoval do El exprimující buněčné linie s SSpI—tráveným C68 plazmidem (SspI štěpí v 3.6 m.u. a ponechává 4644 bp pro homologní rekombinaci). Experimenty se nejprve provedly s 293 buňkami nesoucími El z lidského Ad5 s nadějí, že toto bude dostatečné pro transkomplementaci. Vznikly plaky, které představovaly požadované rekombinanty. Vzniklý vektor se označil C68CMV-GFP.
Strategie pro generování rekombinantů se modifikovala tak, aby umožnila účinnou a rychlou izolaci rekombinantů. Nejprve se DNA pro alkalickou fosfatasu v prvotním přenosovém vektoru nahradila prokaryotickým promotorem z lacZ. Toto umožnilo účinný skríning bakteriálních transformací při pokusu o inkorporaci požadované eukaryotické RNA pol II transkripční jednotky do přenosového vektoru. Vzniklé transformace mohou být testovány na expresi GFP; bílé kolonie jsou rekombinantní, zatímco zelené kolonie jsou reziduální původní plazmidy.
Selekce mezi bílými a zelenými koloniemi se použila pro testování produktů kotransfekce pro izolování lidských Ad5 rekombinantů (A. R. Davis et al., Gene Thera., 5:1147-1152 (1998)); tento postup se adaptoval na C68 systém. Prvotní přenosový vektor byl upraven tak, aby obsaho- 13 CZ 304169 B6 val prodlouženou 3‘ sekvenci od 9 do 26 MU. Tento vektor byl kontransfektován s virovou DNA z původního C68-CMV-GFP izolátu, který byl restrikčně tráven Xba I, který štěpí v MU 16.5 a ponechává přesah 9,5 Kb pro homologní rekombinaci. Vzniklé plaky se prohlížely pod mikroskopem s fázovým kontrastem za účelem vyhledání nefluoreskujících izolátů, které představují požadované rekombinanty. Toto značně zjednodušilo skríning ve srovnání se standardními metodami založenými na struktuře nebo expresi transgenu.
A. Přenosový plazmid
Pro konstrukci plazmidového přenosového vektoru pro přípravu rekombinantního C68 viru se plasmid pSP72 (Promega, Madison, WI) modifikoval trávením Bgl II a potom doplněním konců Klenow enzymem (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a ligací se syntetickým 12 bp Pac I linkerem (New England Biolabs, Baverly, MA) za zisku pSP72-Pac. 456 bp Pac I/SnaB 1 fragment velikosti mapové jednotky (m.u. nebo MU) 0-1,3 C68 genomu se izoloval z pNEB-BamE plasmidu obsahujícího BamHI E fragment C68 genomu a klonoval se do Pac I a EcoR V zpracovaného pSP72-Pac za zisku pSP-C68-MU 0-1,3. Minigenová kazeta skládající se z cytomegalovirového časného promotoru řídícího lacZ s SV40 póly A signálem se separovala z pCMVP (Clontech, Palo Alto, CA) jako 4,5 kb EcoRI/SalI fragment a ligovala se do pSP-C6 8-MU 0-1,3 restrikčně tráveného stejnou sadou enzymů, za zisku pSP-C68-MU 0-1,3-CMVLacZ.
V prvním kroku izolace 9-16,7 MU regionu C68 se pGEM-3Z (Promega, Madison, MI) a pBSC68-BamF dvakrát trávily BamHI a Sph I enzymy. Potom se 293 bp fragment z pBS-C68BamF ligoval se pGEM-3Z skeletem za zisku pGEM-C68-MU 9-9,8. 2,4 kb fragment obsahující C68 MU 9,8-16,7 se získal z pBS-C68 BamRB klonu po trávení Xbal, doplnění v reakci s následným zpracováním BamHI a klonoval se do BamHI/Smal dvojitě tráveného pGEM-C68MU 9-9,8 za zisku pGEM-C68-MU 9-16,7. C68 9-16,7 m.u. region se izoloval z pGEM-C68MU 9-16,7 trávením EcoRl, doplněním na koncích Klenow enzymem (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), ligací se syntetickým 12 bp HindlII linkerem (NEB) a potom trávením HindlII. Tenzo 2,7 kb fragment v rozsahu C68 MU 9-16,7 se klonoval do HindlII místa pSP-C68-MU 0I, 3-CMVlacZ za zisku konečného přenosového plazmidu pC68-CMV-LacZ. Dále se 820 bp cDNA fragment pro alkalickou fosfatasu (AP) izoloval z pAdCMVALP (K. J. Fisher, et al., L Virol., 70:520-532 (1996)) a zaměnil se za lacZ v Not I místech pC68-CMV-lacZ, za zisku pC68-CMV-AP.
B. Konstrukce rekombinantního viru
Pro přípravu rekombinantního C68-CMVEGFP vektoru s deletovaným El se nejprve připravil pC6S-CMV-EGFP přenosový plazmid, pomocí nahrazení lacZ transgenu v pCG8-CMV-lacZ genem pro zesílený zelený fluorescentní protein (EGFP). Nahrazení se provedlo následujícím způsobem. Další Notl restrikční místo se vložilo na 5' konec EGFP kódující sekvence v pEGFP— 1 (Clontech, Palo Alto, CA) pomocí BamHI trávení, doplnění v reakci a ligace s 8 bp syntetickým Notl linkerem (NEB). Po restrikčním trávení obou konstruktů Notl se EGFP sekvence izolovala z modifikovaného pEGFP-Ι a použila se pro nahrazení lacZ genu v pC68-CMV-lacZ. pC68-CMVEGFP konstrukt (3 pg) se kontransfektoval se Ssp I-trávenou C68 genomovou DNA (1 pg) do 293 buněk za účelem homologní rekombinace, jak byla popsána dříve (G. Gao, et al,
J. Virol, 70:8934-8943 (1996)). Zelené plaky vizualizované fluorescentní mikrokopií se izolovaly pro dvě kola přečištění plaků, expanzi a přečištění CsCl gradientovou sedimentací (G. Gao, et al, výše).
Ve snaze o použití běžného procesu selekce bílých/zelených plaků (A. R. Davis, et al., Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)) pro konstrukci rekombinantních C68 vektorů se 7,2 kb fragment v rozsahu 9 až 36 MU izoloval z pBSC68-BamB plasmidu reakcí s Agel a Bsiwl restrikčními endonukleasami a klonoval se do Asp718 a Agel míst pC68-CMV-AP přenosového plasmidu, což vedlo k zisku nového plazmidu označeného jako pC68CMV-AP-MU36. Další modifikace se provedla pro odstranění 26 až 36 m.u. z pC68CMV—AP—MU36 pomocí trávení Eco47III a Nrul.
- 14CZ 304169 B6
Nový přenosový plazmid označený jako pC68cMV-AP-MU26 měl kratší region pro homologní rekombinaci (tj., 16,7-26 MU) 3' k minigenu. Pro přípravu rekombinantního C68 vektoru se alkalická fosfatasa (AP) nahradila požadovaným genem. Vzniklý pC68CMV-Nugene-MU26 konstrukt se ko-transfektoval s Xba I (16,5 MU) restrikčně trávenou C68-CMVGFP virovou DNA do 293 buněk a potom se buňky překryly agarem. Plaky rekombinantního viru (bílé) se generovaly homologní rekombinaci v regionu 16,7-26 MU, který je společný pro pC6SCMVNugene konstrukt a C68 virový skelet; rekombinanty, které tvořily bílé plaky, se odlišovaly od zelených plaků naštěpeného C68-CMVGFP viru.
Selekce podle bílých/zelených plaků se také použila v procesu klonování požadovaného genu do pC68 přenosového plazmidu. AP gen v pC68CMV-AP-MU36 a pC68CMV-AP-MU26 se nahradil kazetou prokaryotického GFP genu řízeného lacZ promotorem izolovaným z PGFPMU31 (Clontech, Palo Alto, CA). Tak bílé kolonie bakteriálních transformantů obsahovaly rekombinantní plasmid. Tento proces selekce bílých/zelených plaků pro bakteriální kolonie eliminuje potřebu přípravy a charakterizace velkého počtu minipřípravků DNA a tak dále zvyšuje účinnost konstrukce rekombinantních DNA a tak dále zvyšuje účinnost konstrukce rekombinantních C68 vektorů.
Příklad 2 - Exprese antigenů (Gag sekvence) v TK buňkách infikovaných vakcinačními konstrukty opičího adenoviru
Adenovirové rekombinanty šimpanzího kmene 68 (Adchimp68) a lidského kmene 5 (Adhu5) nesoucí nukleotidovou sekvenci modifikované verze zkrácené formy gag genu HIV-1 clade B se připravily již popsaným způsobem (v příkladu 1 a Z.Q. Xiang, et al., Virol. 219, 200 (1996)). Transkripty strukturálních proteinů HIV-1, včetně gag, obsahují geneticky nestabilní elementy, které vyžadují přítomnost rev proteinu pro jaderný export a účinnou expresi vcytoplazmě (S. Schwartz et al., J Virol 66, 7176 (1992); S. Schwartz, et al., J Virol 66, 150-159 (1992); G. Nasioulas et al., J. Virol. 68, 2986 (1994)). Adenoviry působí na základě jaderné transkripce, a proto vyžadují rev pro expresi HIV-1 proteinů. Pro překonání závislosti na Rev se sekvence s modifikovanými kodony, ze které byly elementy s genetickou nestabilitou odstraněny místně cílenou mutagenesí (R. Schneider et al., J Virol 71, 4892 (1997) S. Schwartz et al., J Virol 66, 7176 (1992); S. Schwartz, et al., J. Virol 66, 150 (1992)), insertovala do adenovirového vektoru. Vložený gen kodoval zkrácený p37gag protein (pl 7 a p24 regiony). Zkrácený gag protein netvořil virové částice a byl částečně secernován do supernatantu transfektovaných lidských buněk (R. Schneider et al., J Virol 71, 4892 (1997)). Mutované gag konstrukty se použily pro vakcinační experimenty a způsobovaly indukci buněčné a protilátkové imunitní reakce u myší a u primátů (J. T. Qiu et al., J Virol 73, 9145, (1999)).
Adchimp68 a Adhu5 rekombinanty se generovaly a propagovaly na 293 buňkách transfektovaných El adenoviru lidského kmene 5. Předkladatelé vynálezu zjistili, že tento heterologní El je vhodný pro komplementování Adchimp68 rekombinantních virů s deletovaným El, za snížení rizika rekombinace a reverze na replikace-kompetentní přirozený virus.
Přítomnost gag proteinu v supernatantu TK kultur se analyzovala westernovou hybridizací za použití myších monoklonálních protilátek kgag. TK buňky (lxlO6) se infikovaly po dobu 48 hodin Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 virem (10 pfu na buňku). Další TK buňky se infikovaly Adhu5 nebo Adchimp68 konstruktem exprimujícím glykoprotein viru vztekliny. Proteiny v supernatantech kultur se separovaly na 12% denaturujícím polyakrylamidovém gelu a přenesly se elektrohybridizací na PVDF membránu. Skvrna se barvila monoklonální protilátkou 183— H12-SC k HIV-1 p24 (B. Chelsebro, etal. J. Virol. 66: 6547 (1992).
Dva adenovirové rekombinantní klony (Adhu5gag37, Adchimp68gag37) nesoucí tuto modifikovanou sekvencí gag exprimovaly transgen ve srovnatelných koncentracích, jak bylo zjištěno analýzou westernovým přenosem. Protein očekávané velikosti (37 kDa), který se vázal na mono- 15 CZ 304169 B6 klonální protilátku proti gag HIV-1, byl detekován v supernatantech TK buněk infikovaných 10 jednotkami vytvářejícími plaky (pfu) každého rekombinantu s adenovirovým gag. Kontrolní buňky infikované Ahu5 nebo Adchimp68 rekombínanty exprimujícími glykoprotein viru vztekliny (Adhu5rab.gp a Adchimp68.gp) neprodukovaly tento protein.
Příklad 3 - Indukce CD8* T-lymfocytární reakce na gag u savců pomocí opičího adenoviru
Následující pokus ukazuje, že splenocyty myší, kterým byl injekčně intramuskulárně (i.m.) aplikován Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 rekombinantní virus, reagovaly na imunodominantní epitop (B. Doe and C. M. Walker, AIDS 10, 793 (1996)) gag proteinu uvolňováním cytokinů, tj. interferonu (IFN)-y, stejně jako lýzou cílových buněk.
A. Test uvolňování cytokinů
Skupiny 3 Balb/c myší se imunizovaly i.m. 2x105, 2x106 nebo 2x107 pfu Adchimp68gag37 viru, 2xl06 pfu Adhu5Ll viru (H. C. J. Ertl, et al., J. Virol, 63:2885 (1989)), 2xl06 pfu Adhu5gag37 viru nebo 2x107 pfu VVgag viru. Splenocyty se o deset dnů později testovaly na CD8+ T-lymfocytární reakci. Pro testování produkce cytokinů (IFN-γ) se splenocyty (lxl06/vzorek) kultivovaly po dobu 5 hodin při 37 °C s 3 pg/ml AMQMILKET1 peptidu (SEQ 1DNO:1), který obsahuje imunodominantní CD8+ T-lymfocytární epitop pro H-2d haplotyp, a s 1 pg/ml Brefeldinu A (GolgiPlug, PharMingen, San Diego, CA), v 96jamkové kultivační plotně s kulatým dnem v Dulbecco modifikovaném Eagle mediu (DMEM) doplněném 2% fetálním hovězím sérem (FBS) a 10 6 M 2-merkaptoethanolu. Buňky se promyly PBS a inkubovaly se po dobu 30 minut při 4 OC s FITC značenou protilátkou k myším CD8. Buňky se promyly a permeabilizovaly se v IX Cytofix/Cytoperm (PharMingen) po dobu 20 minut při 4 °C. Buňky se třikrát promyly v Perm/Wash (PharMingen) a inkubovaly se po dobu 30 minut při 4 °C s PE značenou protilátkou k myšímu IFN-γ. Po promytí se buňky vyšetřovaly dvoubarevnou průtokovou cytometrií a analyzovaly se za použití WinmDi softwaru. Čísla v pravém horním rohu ukazují procento CD8+ buněk barvících se pozitivně na IFN-γ vzhledem k celkovému počtu CD8+ buněk.
Sedm až deset dní po jediné imunizaci produkovala měřitelná frakce celé populace slezinných CD8+ T-lymfocytů IFN-γ v reakci na gag peptid. Primární splenocyty byly testované bez další in vitro expanze lyžovaných H-2 kompatibilních cílových buněk předem ošetřených gag peptidem. Gag-specifická aktivita CD8 T-lymfocytů byla vyšší po imunizaci Adchimp68 konstruktem, kdy bylo dosaženo 16 až 19% CD8+ T-lymfocytů specifických pro gag z celé populace slezinných CD8+ T-lymfocytů. Reakce byla závislá na dávce Adchimp68gag37 vir, kdy dávky pouze 2x105 pfu viru stále vyvolávaly frekvence okolo 10%. Adhu5gag37 rekombínanty indukovaly optimální frekvence 9% při 2x106 pfu. Tyto frekvence nebyly významněji vyšší při vyšší dávce této vakcíny (data nejsou uvedena). Rekombinantní virus vakcinie exprimující kompletní gag (VVgag, označený jako vDKl v S. Chacarabarti et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3403 (1985)), stimuloval významně nižší frekvence CD8+ T-lymfocytů podle intracelulárního barvení na cytokiny.
B. Lýza cílových T-lymfocytů
Splenocty od myší imunizovaných o deset dní dříve jednou dávkou adenovirových rekombinantů (jak je popsáno v oddíle A) nebo dvěmi dávkami VVgag rekombinantů, kdy první dávka byla aplikována i.m. a druhá o 2 týdny později intraperitoneální injekcí, byly testovány v 5-hodinovém testu uvolňování 5lCr s různými poměry efektorových a cílových buněk na lxlO4 P815 buňkách, které byly ošetřeny během 16-24 hodin při teplotě místnosti buď peptidem pro gag (plné čtverečky) nebo kontrolním peptidem 31D (X) odděleným ze sekvence nukleoproteinu viru vztekliny (H. C. J. Ertl et al., J. Virol. 63 : 2885 (1989)). Dvě imunizace VVgag vakcínou byly nutné pro indukci detekovatelné T-lymfocyty zprostředkované gag-specifícké primární cytolýzy.
- 16CZ 304169 B6
C. Kinetiky CD8+ T-lymfocytární reakce na gag
Skupiny 4 Balb/c myší se imunizovaly 5x106 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 virů. Splenocyty se odebraly o 6 až 12 dnů později a testovaly se na produkci IFN-γ a na lýzu cílových buněk, jak bylo popsáno výše. Kinetiky CD8+ T-lymfocytární reakce na gag vyvolané dvěma adenovirovými rekombinanty byly odlišné. Odpověď na gag u Adhu5gag37 viru vrcholila o 2 až 4 dny dříve než CD8+ T-lymfocytární reakce na Adchimp68gag37 rekombinanty.
Příklad 4 - Efekt předchozí expozice lidskému adenoviru na opičí adenovirovou vakcínu
Pro výzkum vlivu předchozí expozice běžnému lidskému kmenu 5 adenoviru se myši imunizovaly jednou dávkou Adhu5 rekombinantu exprimujícího irelevantní antigen (lidský papilloma virus LI). O dva týdny později se myši vakcinovaly buď Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 vakcínou.
Přesněji, myši se imunizovaly i.m. 108pfu Adhu5Ll vakcíny. O dva týdny později se Adhu5imunním, stejně jako naivním myším injekčně podalo 2xl06 nebo 2xl07 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 rekombinantů (4 až 5 myší na skupinu). Další skupiny Adhu5Ll imunních nebo naivních myší se imunizovaly 2x106 pfu Adhu5gag31 nebo Adchimp68gag37 viru. O devět dnů později se myším intraperitoneálně podalo 106 pfu rekombinantního viru vakcinie exprimujícího kompletní gag. Myši se utratily za 5 dnů po injekci viru vakcinie.
Myši předem imunní k Adhu5 viru neodpovídaly na gag po vakcinaci Adhu5gag37 vakcínou. Tyto myši vykazovaly frekvence CD8 gag-specifických T-lymfocytů podobnou jako kontrolní myši a v souladu stím jejich splenocyty nelyžovaly gag exprimující cílové T-lymfocyty. Naopak, CD8+ T-lymfocytární reakce na gag byla pouze mírně snížena u Adhu5-imunních myší vakcinovaných Adchimp68gag37 konstruktem. Frekvence CD8 T-lymfocytů namířených proti gag byla redukována o pouze 30% a cytolytická aktivita splenocytů byla snížena o 50% při různých poměrech efektorových a cílových buněk.
Tak oba adenovirové rekombinanty indukují frekvence CD8* T-lymfocytů specifických pro gag, které jsou lepší než frekvence popisované pro předešlé vakcíny, jako jsou vakcíny využívající holé DNA nebo poxvirových rekombinantů (S. Schwartz, et al., J. Viral 66, 150-159 (1992)). Frekvence byly také vyšší než frekvence pozorované u chronicky infikovaných jedinců (D. H. Barouch et al. Proč. Nati. Acad. Sci USA. 97, 4192 (2000); T. U. Vogel et al. J. Immunol. 164, 4968 (2000); P. A. Goepfert et al. J. Virol. 74, 10249 (2000); C. R. Rinaldo Jr. et al. AIDS Res. & Hum. Retr., 14:1423 (1998)). Tyto výsledky ukazují na potenciál adenovirových rekombinantních vakcín.
Příklad 5 - Efekt primární imunizace a dosycovací imunizace antigenem na CD8+ T-lymfocyty
Primární splenocyty z buněk naivních nebo Adhu5-imunních myší imunizovaných 2x107 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 viru se srovnávaly se splenocyty od naivních nebo Adhu5 imunních myší vakcinovaných 2x106 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 viru a potom dosycených 106 pfu VVgag viru. Splenocyty se analyzovaly o 5 dnů později na CD8 a intracelulámí IFN-γ. Tyto testy se provedly v podstatě způsobem popsaným výše, s tou výjimkou, že se neprovedla žádná kultivace in vitro pro lýzu P815 buněk ošetřených gag peptidem nebo kontrolním peptidem 31D v 5 hodinovém testu uvolňováni 5lCr.
Primární nebo dosycovací imunizace heterologním vakcínačním konstruktem, VVgag rekombinantem, selhala v obnovení CD8 T-lymfocytární reakce na gag present Adhu5 rekombinantní vakcínou. Ačkoliv Adhu5 vakcinovaná zvířata dosycená Adhu5gag37 a VVgag měla až 7,1%
- 17CZ 304169 B6 splenických CD8+ T-lymfocytů produkujících IFN-γ v reakci na gag, byly tyto CD8+ Tlymfocyty zcela bez cytolické aktivity proti cílovým T-lymfocytům prezentujícím gag. Tyto výsledky naznačují, že preexpozice antigenům nosiče vakcíny nemají pouze kvantitativní, ale též kvalitativní vliv na CD8+ T-lymfocytární reakci na produkt transgenu adenovirového rekombinantu. CD8+ T-lymfocytární reakce na gag u Adhu5 imunních myší vakcinovaných Adchimp68gag37 vykazovala efekt dosycovací dávky po Wgag imunizací podobný efektu pozorovanému u naivních myší.
Frekvence CD8+ T-lymfocytů specifických pro gag, stejně jako lýza primárních cílových buněk, může být dále zvýšena (není uvedeno) další primární imunizací nebo dosycením heterologním vakcinačním nosičem, jako je Wgag rekombinant. Po i.m. primární imunizaci adenovirovými rekombinanty následovně o 9 dnů později i.p. dosycovací imunizací Wgag, tvořily CDS^ gagspecifické T-lymfocyty analyzované za 5 dnů po primární imunizaci 40 % celé splenické populace CD8+ T-lymfocytů.
Pre-existující imunita k Adhu5 výrazně snižuje účinnost Adhu5gag37 vakcíny, ale pouze mírně snižuje CD8+ T-lymfocytární reakci na Adchimp68gag37 virus. Již dříve bylo popsáno, že myši imunizované kAdhu5 viru mají redukovanou B-lymfocytární odpověď na vakcinaci Adhu5 vakcínou proti viru vztekliny. Vyšší dávky vakcíny nebo použití DNA vakcíny exprimující stejný antigen viru vztekliny mohou překonat škodlivý vliv preexistující expozice Adhu5 viru (Z.Q. Xiang, et al., J. Immunol. 162, 6716 (1999)).
Naopak, CD8* T-lymfocytární reakce na gag prezentovaný Adhu5 rekombinantní vakcínou byla zrušena u Adhu5 imunních myší a mohla být pouze částečně obnovena dalšími imunizacemi heteiologní vakcínou proti gag. Toto může ukazovat na indukci CD8+ T-lymfocytů citlivějších na cirkulující virus-neutralizační protilátky, ve srovnání se stimulací B-lymfocytů.
Příklad 6 - Produkce rekombinantních adenovirů obsahujících glykoprotein viru vztekliny
Adenoviry lidských serotypů 2, 4, 5, 7, 12 a šimpanzího serotypu 68 se propagovaly a titrovaly na lidských 293 buňkách. Rekombinantní adenoviry na bázi lidského serotypu 5 exprimující glykoprotein ERA serotypu viru vztekliny nebo LI protein lidského papilloma viru (HPV)-16 byly popsány dříve (Z. Q. Xiang, et al, Virology 219: 220-227 (1996); D. W. Kowalcyk, et al, (2001) Vaccine regimen for prevention of sexually transmitted infections with human papillomavirus type 16, Vaccine). Byl vyvinut expresní systém na bázi adenovirů šimpanzího serotypu 68, jak je popsáno v příkladu 1.
Adenoviry se propagovaly na El (z lidského serotypu 5)-transfektovaných 293 buňkách (F. L. Graham, et. al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)). Viry se získávaly lyofilizací buněk. Pro některé pokusy se virus přečistil CsCl gradientovým přečištěním. Pro jiné pokusy se použil přečištěný supernatant infikovaných buněk nekrotizovaných třemi koly lyofdizace. Viry se titrovaly na 293 buňkách pro stanovení jednotek tvořících plaky (pfu).
Adenovirový rekombinant šimpanzího 68 serotypu exprimující glykoprotein viru vztekliny, označený jako Adchimp68rab.gp, se připravil ve 293 buňkách transfektovaných El adenoviru lidského serotypu 5, jak je podrobně popsáno v tomto příkladu. Virové klony se nejprve testovaly nepřímou imunofluorescencí za použití monoklonální protilátky 509-6 namířené proti konformace-dependentnímu epitopu glykoproteinu viru vztekliny. Po selekci stabilního adenovirového subklonu se exprese kompletního glykoproteinu viru vztekliny v Ad.chimp68rab.gp viru v infikovaných TK buňkách potvrdila imunoprecipitací, jakje popsáno v následujícím příkladu.
- 18CZ 304169 B6
Příklad 7 - Exprese produktu transgenu adenovirovými rekombinanty
Tento příklad ukazuje, že Adhu5 virus dosahuje znatelně vyšších hodnot exprese glykoproteinu viru vztekliny v TK buňkách ve srovnání s Adchimp68 konstruktem. Koncentrace transkriptu pro tento transgen kopírovaly expresi proteinu, což naznačuje, že rozdíl nesouvisel s post-translační modifikací. TK-buňky jsou CAR pozitivní a stupeň transdukce virovými serotypy by proto měl být srovnatelný.
Pro tyto pokusy se svačí buňky, tj. fetální ledvinné křeččí buňky (BHK)-21, El-transfektované 293 buňky a TK buňky, propagovaly v Dulbecco modifikovaném Eagle mediu (DMEM) doplněném glutaminem, Na-pyruvátem, non-esenciálními aminokyselinami, HEPES pufrem, antibiotiky a 10% fetálním hovězím sérem (FBS).
A. Imunoprecipitace
TK” buňky (106 na vzorek) se infikovaly 5 pfu na buňku adenovirových rekombinantů exprimuj ících glykoprotein viru vztekliny nebo kontrolními konstrukty exprimujícími nepříbuzný virový antigen. Po 48 hodinách se buňky promyly dvakrát sterilním fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) a potom se inkubovaly po dobu 90 minut v bezsérovém mediu před přidáním 20 μΐ 35S-značeného cysteinu a methioninu (Promix, NEN, Boston, MA). Po 4 hodinové inkubaci se buňky promyty PBS a potom se ošetřily během 20 minut 1 ml inhibitorů proteasy obsahujících RIPA pufr. Buňky a buněčná drť se odstranily z jamek, krátce se promísily a odstředily se během 2 minut při 12000 rpm. Supematant se inkuboval po dobu 90 minut při 4 °C s 15 μΐ/ml ascitické kapaliny obsahující 509-6 monoklonální protilátku ke glykoproteinu viru vztekliny. Protein Sepharose G se přidala v dávce 75 μΐ na vzorek a inkubovala se při 4 °C za mírného míšení po dobu 30 minut. Vzorky se peletovaly odstředěním a promyly se 4-krát RIPA pufrem. Pelety se resuspendovaly v 80 μΐ zaváděcího pufru a provedl se var po dobu 4 minut. Vzorky (20 μΐ) se potom separovaly na 12% SDS-polyakrylamidovém (PAGE) gelu a srovnávaly se se standardy molekulové hmotnosti. Gely se sušily na filtračních papírech, které se exponovaly po dobu 48 hodin na Kodak Scientific Imaging Film (X-Omat Blue XB-1).
Adchimp68rab.gp rekombinant exprimoval protein předpokládaného velikosti, který se vázal na 509-6 protilátku. Sraženina z TK-buněk infikovaných Adhu5rab.gp virem vykazovala proužek identické velikosti, který nebyl přítomen v lyzátech z buněk infikovaných adenovirovými rekombinanty exprimujícími produkt nepříbuzného transgenu. Exprese glykoproteinu viru vztekliny byla výraznější v buňkách infikovaných Adhu5rab.gp konstruktem. Odlišnosti v expresi transgenu mohou být důsledkem post-translačních dějů, jako jsou rozdíly ve vychytávání viru, rychlosti transkripce nebo stability transkriptu. Alternativně, translační nebo posttranslační odlišnosti, jako jsou různé modifikace vedlejšího řetězce, mohou vést ke kvantitativním odlišnostem v serologicky detekovatelném proteinu.
Pro další odlišení mezi těmito dvěmi možnostmi se celková RNA izolovala z TK buněk infikovaných jedním z adenovirových rekombinantů. Reversně transkribovaná mRNA glykoproteinu viru vztekliny a „housekeeping“ genu se amplifikovala real-time PCR provedeným způsobem popsaným v oddíle B.
B. Reál time reversní transkripční polymerasová řetězová reakce (PCR)
Konfluentní monovrstvy TK buněk se infikovaly ve dvojích vzorcích 10 pfu jednoho z adenovirových rekombinantů. Buňky se izolovaly o 24 hodin později a RNA se extrahovala TRI činidlem podle návodu výrobce (Mol. Res. Center, Cincinnati, OH). RNA se zpracovala DNAsou bez RNAsy, přečistila se fenolovou extrakcí a upravila se na 50 ng RNA na vzorek. RNA se reverzně transkribovala a amplifikovala se pomocí Light Cycler-RNA amplifikačního kitu SYBR green (Roche, Mannheim, Germany; Z. He, et al, Virology 270: 146-1617 (2000)) za použití
- 19CZ 304169 B6 primerů pro glykoprotein viru vztekliny (SEQ ID NO:2: 5' AA GCA TTT CCG CCC AAC AC; SEQ ID NO:3: 3' GGT TAG TGO AGC AGT AGO TAG A) a „housekeeping“ gen glutaraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu (GAPDH) (SEQ ID NO:4: 5' GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG ATT T; SEQ ID NO:5: 3' AAT GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC C).
Data v tabulce 1 uvádějí výsledky. Uvedená data jsou průměrné hodnoty pro dvojí měření ± SD.
Tabulka 1
Zdroj RNA Relativní kvalita transkriptu
GAPDH Rab.gp Poměr (GAPDH/rab.gp)
TK~, Adhu5rab. gp 3,2 ± 0,2 3494 ± 18 1082
TK-,Adchimp6 8 rab.gp 0,52 ’± 0,01111 64 ± 6 64
Jak ukazují tato data, vykazují transgenové transkripty upravené na transkripty housekeeping genu kvantitativní rozdíly srovnatelné s rozdíly pozorovanými pro serologicky detekovatelný protein.
V datech neuvedených v tomto příkladu se další dva Adchimp68 rekombinanty exprimující zelený fluorescentní protein a zkrácený gag protein viru lidské imunodeficience 1 s modifikovanými kodony srovnávaly s Adhu5 rekombinanty exprimujícími stejné transgenové produkty a prokázala se ekvivalentní exprese proteinu v TK buňkách. Z tohoto výsledku lze usoudit, že redukovaná exprese glykoproteinu viru vztekliny Adchimp68 virem není důsledkem vychytávání viru ani rychlosti transkripce, a oba konstrukty jsou regulovány stejnými kontrolními elementy.
Příklad 8 - Imunizace myší za použití antigenu viru Vztekliny
Protilátkové reakce specifická k viru vztekliny na Ad.chimp68rab.gp virus se srovnávala s reakcí na Adhu5rab.gp virus u inbredních a outbredních kmenů myší. Myším se injikovaly sériová ředění rekombinantů podaných s.c. nebo i.n. Sérum se odebíralo o 14 dnů později a testovalo se na protilátky proti glykoproteinu viru vztekliny ELISA a testem na neutralizaci viru. Adenovirové rekombinanty exprimující nepříbuzný transgen, tj. gag HIV-1 (popsané ve výše uvedených příkladech) se použily jako kontroly. Tyto rekombinanty selhaly v indukci protilátkové reakce k viru vztekliny detekovatelné jedním z těchto testů. Podrobnější popis tohoto pokusů a výsledků je uveden dále.
Samice CH3/He a C57B1/6 myší staré 6 až 8 týdnů se zakoupily od Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine. Outbrední ICR myši se zakoupily od Charles River (Wilmington, MA).
Myším se injekčně podaly různé dávky adenovirových rekombinantů, které se aplikovaly ve 100 μΐ salinického roztoku podkožně (s.c.) nebo v 50 μΐ intranasálně (i.n.). Myši se infikovaly virem vztekliny kmene CVS-11 podaným v dávce 10 průměrných letálních dávek (LD5o) intracerebrálně (i.c.). Virus vztekliny Evelyn Rokitniki-Abelseth (ERA) a Challenge Virus Standard (CVS)-l 1 se propagovaly na BHK-21 buňkách. ERA virus se přečistil přes sacharosový gradient, inaktivoval se ošetřením betapropionolaktonem a upravil se na koncentraci proteinu 0,1 mg/ml. CVS-11 virus se titroval na BHK-21 buňkách a pomocí intracerebrální injekce dospělým ICR myším (Z. Q. Xiang, Z. Q. & H. C. Ertl. J. Virol. Meth, 47:103-16 (1994)).
-20CZ 304169 B6
Po infekci se myši kontrolovaly každých 24 až 43 hodin po dobu nejméně 21 dnů. Myši se utratily poté, co se vyvinula paralýza zadních tlapek, která ukazuje na terminální stadium encephalitidy způsobené virem vztekliny.
Serologická analýza zahrnovala enzymově vázaný imunoadsorbentní test (ELISA), isotypový profil protilátek a test na neutralizaci viru.
A. ELISA
Myším se odebírala krev v různých intervalech po imunizaci punkcí retroorbitální žíly. Připravila se séra a ta se testovala na protilátky proti viru vztekliny na plotnách potažených 0,1 pg/jamku inaktivovaného viru vztekliny. Séra se testovala na protilátky k adenoviru na plotnách potažených 0,1 pg/jamku přečištěným El-deletovaným adenovirovým rekombinantem s GFP lidského serotypu 5 nebo šimpanzího serotypu 68. ELISA se provedly v podstatě způsobem popsaným dříve (Z. Q. Xiang, et al., Virology 219, 220-227 (1996)). Plotny se potáhly přes noc. Potom se plotny blokovaly po dobu 24 hodin PBS obsahujícím 3% hovězí sérový albumin (BSA). Po promytí se séra naředěná v PBS-3% BSA přidala na dobu 60 minut. Po promytí se na jednu hodinu na ledu přidalo ředění 1:100 kozí anti-myší Ig protilátky konjugované s alkalickou fosfatasou (Cappel). Po promytí se na 20 až 30 minut při teplotě místnosti přidal substrát. Optická densita se odečítala při 405 nm.
B. Isotypy protilátek
Isotypy protilátek kviru vztekliny se stanovily na ELISA plotnách potažených ERA virem za použití Calbiochem Hybridoma Subisotyping (La Jolla, CA) kitu s určitými drobnými dříve popsanými modifikacemi (Xiang, Virol, 1996, citováno výše).
Izotypový profil protilátek se lišil při s.c. imunizaci, ale byl srovnatelný při i.n. aplikaci dvou adenovirových vakcín. Oba rekombinanty, po podání jakýmkoliv způsobem, indukovaly IgG2a protilátky k antigenu viru vztekliny.
Oba rekombinanty po i.n. imunizaci a Adhu5rab.gp vakcína po s.c. podání indukovaly výraznou IgGl odpověď, což ukazuje na aktivaci Th2 buněk, která chybí v reakci na Ad.chimp68rab.gp konstrukt podaný s.c.
C. Neutralizační protilátky
Séra se testovala na neutralizační protilátky kviru vztekliny kmene CVS-11, který je antigenně blízce příbuzný ERA kmenu (Z. Q. Xiang, et al, Virology. 214: 398-404 (1996)). WHO referenční sérum se použilo pro srovnání. Titry se uvedly v mezinárodních jednotkách.
Adchimp68rab.gp virus podaný s.c. indukoval slabší B-lymfocytární reakci na transgenní produkt ve srovnání s Adhu5rab.gp konstruktem. Rozdíly ve velikosti protilátkové reakce, které byly pozorovány ve všech testovaných bodech, závisely na kmenu myší a was less pronounced byly menší u outbredních ICR než u inbredních C3H/He myší. Naopak, při i.n. imunizaci indukovaly obě vakcíny srovnatelné titry protilátek, jak bylo stanoveno ELISA a testy na neutralizaci viru.
Zvýrazněná Thl reakce na Adchimp68rab.gp rekombinanty po s.c. imunizaci kontrastující sThl/Th2 reakcí po injekci Adhu5rab.gp svědčí pro odlišnosti v adjuvanticitě. Po aplikaci do dýchacích cest přirozený způsob infekce pro Adhu5 virus a patrně též pro Adchimp68 rekombinantní viry indukuje protilátkové titry k transgenovému produktu, které jsou srovnatelné ve velikosti a izotypovém profilu. Toto naznačuje, že předpokládané rozdíly v tropismu a/nebo adjuvanticitě jsou závislé na tkáních, tj. chybí nebojsou méně výrazné v dýchacích cestách ve srovnání s podkožím.
-21 CZ 304169 Β6
Příklad 9 - Přednostní indukce cytotoxické T-lymfocytární reakce při použití rekombinantního šimpanzího adenoviru
Vakcínou indukovaná ochrana proti viru vztekliny koreluje s protilátkami neutralizujícími virus (VNAs, F. L. Graham, et. al., J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977)). Pokusy s proteinem vztekliny se zaměřily na toto rameno imunitního systému. Ve všech pokusech se myši imunizovaly Adchimp68rab.gp virem a - paralelně - dříve popsaným Adrab.gp virem na bázi lidského serotypu 5. V této přihlášce je tento rekombinant označován jako Adhu5rab.gp virus.
Oba adenovirové rekombinanty indukovaly ochranu proti infekci virem vztekliny. C3H/He myši imunizované 5 x 106pfu jednoho z adenovirových rekombinantů podaných s.c. zůstávaly bez známek nemoci, když byly za 3 měsíce infikovány 10 průměrnými letálními dávkami (LD50) viru vztekliny kmene CVS. Tento virus vztekliny je antigenně blízce příbuzný ERA kmeni, ale u hlodavců je virulentnější. Při nižší dávce vakcíny (5x105 pfu) poskytoval Adhu5rab.gp virus stále ještě kompletní ochranu, zatímco malé procento myší imunizovaných Adchimp68rab.gp skonalo na infekci. Další redukce dávky vakcíny vedla ke ztrátě účinnosti Adchimp68rab.gp vakcíny. Po i.n. imunizaci poskytovaly obě vakcíny kompletní ochranu, když byly podány v dávce 5x105 pfu. Při nižší dávce 5x104 pfu se u 50% myší vakcinovaných Adhu5rab.gp vakcínou rozvinulo progresivní onemocnění, zatímco myši vakcinované stejnou dávkou Adchimp68rab.gp rekombinantů byly chráněné. U všech myší imunizovaných adenovirovými rekombinanty jakéhokoliv serotypu exprimujícími nepříbuzný antigen nebo 5x103 pfu jednoho z adenovirových rekombinantů pro glykoprotein viru vztekliny se rozvinula fatální encephalitida způsobená virem vztekliny.
Příklad 10 - Efekt pre-existující imunity k různým serotypům lidských adenovirů na protilátkovou reakci na virus vztekliny
Pro testování toho, zda předcházející infekce jakýmkoliv z běžných serotypů lidského adenoviru (např. lidskými serotypy 2, 4, 5, 7 a 12) bude inhibovat protilátkovou reakci na Adchimp68rab.gp vakcínu se skupiny C3H/He myší imunizovaly 4x108 pfu replikace-kompetentními adenoviry lidského serotypu 2, 4, 5, 7 nebo 12 nebo šimpanzího serotypu 68 (kde poslední serotyp má deletovaný El). O dva týdny později se myši vakcinovaly s.c. buď Adhu5rab.gp nebo Adchimp68rab.gp virem. Adhu5rab.gp rekombinant se použil v dávce 2x105 pfu na myš, Adchimp68rab.gp rekombinant, který při podání s.c. v této dávce indukuje pouze marginální protilátkovou reakci u C3/He myší, se injikoval v dávce 2x107 pfu na myš. Sérum se odebíralo o dva týdny později a testovalo se na protilátky ke glykoproteinu viru vztekliny ELISA. Reakce specifická pro virus vztekliny na Adhu5rab.gp byla u naivních myší o něco lepší než reakce na Adchimp68 virus. Reakce na Adhu5rab.gp virus byla u Adhu5 pre—imunních myší zcela inhibována. Určitá redukce byla také pozorována u myší preimunních k adenoviru lidského serotypu 4, 2, 7 a 12. Reakce nebyla ovlivněna u myší, které byly předem infikované Adchimp68 virem. Reakce na Adchimp68rab.gp virus byla výrazně inhibována u myší, které byly pre-imunní k homolognímu viru. Myši, které se dříve setkaly s adenovirem lidského serotypu 2 vykazovaly mírnou redukci protilátkové reakce na antigen viru vztekliny prezentovaný Adchimp68 vakcínou. Myši očkované jakýmkoliv jiným serotypem lidského adenoviru měly titry protilátek k viru vztekliny po vakcinaci Adchinip68rab.gp virem, které byly buď podobné velikosti, nebo vyšší než u myší, které byly naivní před vakcinaci. Konkrétně, u myší pre-imunních k Adhu5 viru se vyvinuly vyšší titry protilátek při vakcinaci Adchimp68rab.gp konstruktem, což může odrážet přítomnost T-helper Iymfocytů, které podporují reakcí B-lymfocytů na produkt transgenu.
Pro další stanovení toho, zda stejné dávky Adchimp68rab.gp vakcíny indukují lepší titry protilátek ve srovnání s Adhu5rab.gp virem u myší preimunních na Adhu5 virus se provedl pokus stitrací vakcíny. Skupiny C3H/He myší se imunizovaly s.c. 4x108 pfu adenovirového rekombinantu s deletovaným El kLl antigenu HPV-16. Myši se vakcinovaly o 2 týdny později buď
-22CZ 304169 B6
Adhu5rab.gp nebo Adchimp68rab.gp virem podaným s.c. v různých dávkách. Myším se odebrala krev o dva týdny později a titry sérových protilátek k viru vztekliny se stanovily ELISA (není uvedeno) a testem na neutralizaci viru. Ani jeden test neukázal významnější redukci protilátkové reakce na Adchimp68rab.gp konstrukt u Adhu5-imunních myší. Závažnost snížení titrů protilátek k viru vztekliny prezentovaný Adhu5 konstruktem u myší preimunních k homolognímu viru závisela na dávce vakcíny. Protilátková reakce na nižší dávky vakcíny byla ovlivněna více než reakce na vyšší dávky vakcíny. VNA titry byly sníženy významně více než ELISA titry. Titry VNA při nejvyšší dávce vakcíny byly poloviční u myší preimunních k Adhu5 viru, zatímco při dvou nižších dávkách vakcíny byly titry sníženy více než 20krát. Při jakékoliv testované dávce indukoval Adchimp68rab.gp rekombinant vyšší VNA titry k vzteklině u Adhu5 preimunních myší než jsou titry dosažené při stejné dávce Adhu5rab.gp vakcíny. Škodlivý efekt preexístující imunity k Adhu5 na účinnost Adhu5 vakcíny byl dále prokázán v pokusu s ochranou před infekcí. Naivní myši imunizované 2xl05pfu Adhu5rab.gp nebo Adchimp68rab.gp viru byly plně chráněné před infekcí CVS-11 virem. Většina (65%) Adhu5 pre-imunních myší imunizovaných touto dávkou Adhu5rab.gp vakcíny podlehla infekci virem vztekliny, zatímco myši vakcinované stejnou dávkou Adchimp68rab.gp viru zůstaly ochráněné. Dávka Adhu5rab.gp viru zvýšená na 2x106 pfu na myš obnovila účinnost vakcíny.
Protilátková odpověď na produkt transgenu exprimovaný Adchimp68 rekombinanty nebyla ovlivněna pre-existující imunitou k běžným lidským serotypům adenovirů, která inhibuje odpověď na odpovídající rekombinantní lidský serotyp 5. Po preimunizaci replikace-kompetentními viry byla imunitní reakce na Adhu5rab.gp vakcínu eliminována u Adhu5 pre-imunních myší a snížena u myší pre-imunních k jiným lidským serotypům adenoviru, jako je serotyp 2 a 4. Odpověď na Adchimp68 rekombinant byla, jak se předpokládalo, inhibována u myší preimunních k homolognímu viru. Toto nemá klinický význam, protože Adchimp68 virus necirkuluje v lidské populaci a běžné lidské serotypy nemají společné neutralizační epitopy s AdchimpóS virem.
Pre-infekce replikace-defektním Adhu5 virem také redukuje protilátkovou odpověď na glykoprotein viru vztekliny prezentovaný Adhu5 rekombinanty, ačkoliv tento vliv není tak významný jako u myší dříve infikovaných replikace-kompetentním virem. Sérum od myší pre-imunních k replikace-defektnímu Adhu5 viru měla snížené, ale snadno detekovatelné koncentrace protilátek k viru vztekliny po imunizaci Adhuárab.gp vakcínou. Zvýšené dávky Adhu5rab.gp Konstruktu mohou částečně překonat vliv pre-existující imunity. Vakcínou indukovaná ochrana proti viru vztekliny vyžaduje VNA, které nejsou indukovány tak účinně u preimunních myší Adhu5 vakcínou, zejména při použití nižších dávek. U Adhu5 pre-imunních myší byla VNA reakce na Adchimp68rab.gp konstrukt lepší při všech testovaných dávkách než na Adh5 vakcínu, což více než kompenzuje o něco nižší účinnost této vakcíny při s.c. imunizaci.
Adchimp68 rekombinanty tak jsou atraktivními alternativními nosiči pro vakcíny pro použití u člověka. Jak je zde uvedeno, jsou účinné i při použití dávek 2xl05 pfu při neinvazivních způsobech podání, jako je aplikace do horních cest dýchacích. Slizniční imunizace i.n. aplikací má další výhodu v tom, že usnadňuje indukci odpovědi slizničního imunitního systému, která je odlišná od reakce centrálního imunitního systému indukované injekčně podávaným· vakcínami, i když je s centrální reakcí spojená.
Příklad 11 - Zdroj šimpanzího C68 viru a jeho replikace
Následující příklady 11 až 5 dále charakterizují šimpanzí C68. Je třeba si uvědomit, že odborník v oboru tyto informace může snadno použít ke konstrukci nových rekombinantních šimpanzích adenovirových konstruktů. Zdroj C68 viru byl získán z ATCC (Rockville, MD) a virus se propagoval na 293 buňkách (ATCC) kultivovaných v DMEM (Sigma, St. Louis, MO) doplněném 10% fetálním telecím sérem (FCS; Sigma nebo Hyklon, Logan, UT) a 1% Penicillinem-Streptomycinem (Sigma). Infekce 293 buněk se provedla v DMEM doplněném 2% FCS během prvních
-23CZ 304169 B6 hodin, a potom se přidalo FCS na konečnou koncentraci 10%. Infikované buňky se odebraly tehdy, když 100 % buněk vykazovalo virem-indukovaný cytopatický efekt (CPE), buňky se odebraly a koncentrovaly se odstředěním. Buněčné pelety se resuspendovaly v 10 mM Tris (pH 8,0) a lyžovaly se 3 cykly zmrazení a rozmražení. Přípravky viru se získaly po 2 cyklech ultraodstře5 dění na densitních gradientech chloridu cesia a zásoba viru se naředila na lxl O12 částic/ml v 10 mM Tris/100 mM NaCl/50% glycerol a uskladnila se při teplotě -70 °C.
Příklad 12 - Klonování a sekvenování virové genomové DNA io
Genomová DNA se izolovala z přečištěných virových přípravků za použití standardních metod a trávila se panelem 16 restrikčních enzymů podle návodu výrobce. Pokud není uvedeno jinak, byly všechny restrikční a modifikační enzymy získány od Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN. Genomová DNA se trávila BamHI, Pstl, Sáli, HindlII nebo Xbal a fragmenty se subklono15 vály do plasmidů (K. L. Berkner and P. A. Sharp, Nucl. Acids res., 11:6003-20 (1983)). Po deproteinaci se syntetické 10 bp Pad linkery (New England Biolabs, Beverly, MA) dvojitě trávily Pacl a BamHI nebo Pstl.
Pstl, BamHI a HindlII klony získané ze C68 jsou zobrazeny na obr. 1, oddílech C, D a E, v pří20 slušném pořadí. Fragmenty v šrafovaných boxech nebyly klonované, ale sekvence celého genomu byla určena pomocí sekvenování překrývajících se klonů a přímo virové DNA (nešrafované rámečky). Klonované fragmenty jsou popsány v tabulce 2.
-24CZ 304169 B6
Tabulka 2: C68 plazmidové klony a velikost insertů
Název konstruktu Velikost insertu (bp) 5 konec fragmentu 3' konec fragmentu 5' mapová ! jednotka 3' mapová jednotka
Pst-I fragmenty
C68-Pst-A 6768 24784 31551 67.9% 86.4%
pBS:C6S-Pst-B 6713 4838 11550 13.2% 31.6%
pBS:C68-Pst-C 5228 14811 20038 40.6% 54.9%
pBS:C68-Pst-D 2739 12072 14810 33.1% 40.6%
pBS:C68-Pst-E 2647 20039 22685 54.9% 32.1%
pBS:C68-Pst-F 1951 32046 33996 87.8% 93.1%
pNEB:C68-Pst-G 1874 1 1874 0.0% 5.1%
pBS:C68-Pst-H 1690 23094 24783 63.2% 67.9%
pBS:C68-Pst-I 1343 33997 35339 93.1% 96.8%
pNEB:C68-Pst-J 1180 35340 36519 96.8% 100.0%
pBS:C6S-Pst-K 1111 2763 3873 7.6% 10.6%
pBS:C68-Pst-L 964 3874 4837 10.6% 13.2%
pBS:C68-Pst-M 888 1875 2762 5.1% 7.6%
pBS:C68-Pst-N 408 22686 23093 62.1% 63.2%
C68-Pst-O 380 31666 32045 86.7% 87.7%
pBS:C68-Pst-P 285 11551 11835 31.6% 32.4%
C68-Pst-Q 236 11836 12071 32.4% 33.1%
pBS:C68-Pst-R 114 31552 31665 86.4% 86.7%
BamHI fragmenty;
C6S-Bam~A 16684 19836 36519 54.3% 100.0%
pBS:C68-Bam-B 8858 3582 12439 9.8% 34.1%
pBS:C68-Bam-C 4410 12440 16849 34.1% 46.1%
pBS:C68-Bam-D 2986 16850 19835 46.1% 543%
pNEB:C68-Bam-E 2041 1 2041 0.0% 5.6%
pBS:C68-Bam-F 1540 2042 3581 5.6% 9.8%
Hind EU fragmenty
pBR:C68-Hind-B 9150 23471 32620 643% 893%
pBS = pBluescript SK+ klon pNEB = pNEB 193 klon pBR = pBR322 klon bez předpony = neklonovaný fragment
Šimpanzí adenovirus, C68, byl získán z ATCC a byl propagován v lidských 293 buňkách. Virová genomová DNA se izolovala z přečištěných virionů za použití zavedených postupů (A. R. Davis, et al., Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)) a trávila se panelem restrikčních enzymů; data byla v souladu s předchozími pokusy (data nejsou uvedena) (G. R. Kitchingman, Gene, 20:205-210
-25 CZ 304169 B6 (1982); Q. Li a G. Wadell, Arch Virol. 101:65-77 (1998); R. Wigand, et al., Intervirology. 30:19 (1989)). Restrikční fragmenty pokrývající celý genom C68 se subklonovaly do plazmidu. Schématické znázornění C68 genomu je uvedeno na obr. 1A a Pst-I, BamHl a HindlII fragmenty, které byly klonovány do plazmidových vektorů, jsou uvedeny v nešrafovaných rámečcích, na obr. 1B, 1C a ID, v příslušném pořadí. Klonované fragmenty, velikost fragmentů a genomová pozice jsou také uvedeny v tabulce 2. Oba plazmidové klony a genomová DNA se použily jako templáty pro sekvenování. Genom se sekvenoval nejprve procházením v obou směrech a každá báze byla průměrem čtyřech reakcí.
C68 genom má délku 36521 bp [viz US Patent 6,083,716]. Předběžné srovnání s GenBank sekvencemi ukázalo různý stupeň podobnosti s dalšími lidskými a zvířecími adenoviry v celé délce virového genomu. V C68 genomu byly nalezeny regiony s homologii ke všem dříve popsaným adenovirovým genetickým jednotkám, časné regiony 1—4 a hlavní pozdní geny (Obr. 1A). DNA homologie mezi C68 a lidskými adenoviry, které byly kompletně sekvenovány, Ad2 (NC001405), AdS (NC001405), Ad 12 (NC001460), Ad 17 (NC002067) a Ad40 (NC01464), se použila pro seřazení klonů. Určily se otevřené čtecí rámce (ORF) a identifikovaly se geny na základě homologie s jinými lidskými adenoviry. Všechny hlavní adenovirové časné a pozdní geny jsou přítomné v C68. Invertované terminální repetitivní sekvence (ITR=s) mají délku 130 bp.
Příklad 13 - Analýza C68 sekvence
Kompletní nukleotidové sekvence všech členů Mastadenovirové čeledi dostupné z GenBank, včetně izolátů z různých druhů, se testovaly na identitu s C68. Ad4 minigenom se sestavil z následující GenBank sekvence: Levostranný ITR (J01964); E1A region (M14918); DNA pol a pTP (X74508, 74672); VA RNA-I, II (U10682); 52, 55K (U52535); pVll (U70921); hexon (X84646); endoproteasa (Ml6692); DNA-vazebný protein (Ml2407); fiber (X76547); pravostranný ITR (J01965). Ad7 kompozitní genom se vytvořil z dat pro následující sekvence: Mu 321 (X03000); VA RNA-I, II, pTP & 52, 55K (U52574); penton (AD001675); pVI, hexon a endoproteasa (AF065065); DNA-vazebný protein (K02530); E3 a fiber region (AFI 04384); pravostranný ITR (V00037).
Seřazení aminokyselinové sekvence se provedlo za použití Clustal X, editované s Jalview (http://www.ebi.ac.uk/michele/jalview/), a analýza se provedla za použití Boxshade (http://www.ch.ebnet.org/software/BOX fonn.html). Veřejně dostupné sekvence hexonových proteinů od všech lidských adenovirových serotypů se nejprve seřadily pro to, aby se identifikovala sada vykazující nejvyšší homologii s C68.
Nukleotidová sekvence a předpokládaná aminokyselinová sekvence všech významných otevřených čtecích rámců v C68 genomu se srovnávaly se známými DNA a proteinovými sekvencemi. Nukleotidová sekvence C68 se srovnávala se sekvencí Ad 2, 4, 5, 7, 12, 17 a 40. V souladu s předešlou restrikční analýzou (Kitcbhingman, viz výše; Li and Wadell, viz výše) je C68 nejvíce podobný lidskému Ad4 (podskupina E).
El A region C68 se rozkládá od TATA boxu v nt 480 do póly A adičního místa v nt 1521, konvenční sestřihová donorová a akceptorová místa jsou v analogických pozicích jako místa lidského Ad, a 28.2K a 24.8K proteiny mají podobnou velikost jako proteiny lidského Ad. ORF pro nejmenší E1A protein C68 kóduje 101 zbytků, oproti přibližně 60 aminokyselinám pro jiné adenoviry. U C68 je TTA kodon ve zbytku 60, kde mají ostatní adenoviry často TGA stop kodon. Prvních 60 zbytků C68 El A 100R proteinu má 85% identitu s Ad4 homologem.
C68 genom kóduje čtyři E1B proteiny, 20.5K, 54.7K, 10.1K a 18.5K, stejně jako pIX. Všech pět C68 kódovaných proteinů má podobnou velikosti jako E1B a pIX proteiny jiných adenoviru. Ad4 homolog E1B 21K proteinu je tvořen pouze 142 aminokyselinami, zatímco C68 má 186 zbytků
-26CZ 304169 B6 a další lidské adenoviry mají 163 až 178 zbytků. C68 a Ad4 proteiny vykazují 95% identitu s prvními 134 aminokyselinami, potom podobnost končí a Ad4 protein končí ve 142 aminokyselině.
C68 genom kóduje homolog E2A 55K DNA vazebného proteinu a lva2 maturačního proteinu, stejně jako E2B terminální protein a DNA polymerasu. Všechny proteiny E2 regionu mají podobnou velikost jako jejich protějšky u lidského Ad, a E2B proteiny jsou zejména dobře konzervovány. C68 E2B 123.6K DNA polymerasa má předpokládanou velikost 1124 zbytků, Ad4 má předpokládanou velikost 1193, ačkoliv jiné lidské adenoviry mají menší polymerasy. Zbytky 171 Ad4 polymerasy nemají žádnou podobnost s jakoukoliv jinou Ad polymerasou, aje možné, že tento protein ve skutečnosti začíná na vnitřním ATG kodonu. V aminokyselinách 72-1193 mají Ad4 a C68 polymerasy 96% aminokyselinovou identitu.
Dosud sekvenované E3 regiony lidského adenoviry vykazují významnou variabilitu sekvence a kódovací kapacity. Ad40 obsahuje pět genů E3 regionu, Adl2 šest, C68 a AdS sedm, Ad38 osm a Ad3, stejně jako Ad7 (podskupina B lidského adenoviru) mají devět domnělých genů E3 regionu. Ad4 E3 region nebyl dosud sekvenován. Ve srovnání s E3 regionem Ad35 byly v C68 genomu identifikováno všech 7 homologů E3 genu (C. F. Basler and M. S. Horwitz, J Virology, 215:165-177(1996)).
C68 E4 region má 6 ORF a každý je homologní s proteiny v lidském Ad5, 12 a 40 E4 regionech. E4 nomenklatura je zmatená, protože ORF2 homology C68, Ad 12 a Ad40, mají přibližně 130 zbytků, zatímco v Ad5 jsou dva ORF kódující proteiny o 64 a 67 zbytcích s homologií, v příslušném pořadí, s amino a karboxy konci větších ORF2 proteinů. ORF5 byl v naší nomenklatuře vynechán, protože 5. ORF v E4 regionu je homologní s rozsáhle studovaným ORF6 proteinem lidského Ad5.
Hlavní pozdní promotor a trojdílná vedoucí sekvence C68 genomu byly lokalizované. ORF s potenciálem ke kódování 15 hlavních pozdních proteinů byly lokalizované. Všechny C68 pozdní proteiny mají podobnou velikost jako jejich protějšky v lidském Ad. Procento aminokyselinové identity mezi šimpanzími a lidskými Ad pozdními proteiny se značně lišilo. C68 fiber protein má předpokládané 90% aminokyselinovou identitu s Ad4 proteinem, ale mnohem menší podobnost s fiber proteiny jiných lidských Ad. CAR vazebné místo v kulovitém zakončení fiber proteinu je přítomné v C68.
Příklad 14 - Test na protilátky neutralizující virus
Několik pokusů bylo provedeno pro stanovení toho, zda existuje zkřížená reaktivita mezi typově specifickým antisérem C68 a lidským adenovirem. Neutralizační aktivita séra se testovala následujícím způsobem. Panely séra od normálních jedinců (N=50), makaků rhesus (N=52) a šimpanzů (N=20) se hodnotily na neutralizační protilátky k vektorům na bázi Ad5 a C68 za použití 293 buněk jako indikátorové buněčné linie. Séra odebraná od jednotlivých lidí, makaků rhesus nebo šimpanzů se inaktivovala při 56 °C na dobu 30 minut. Sériová ředění každého vzorku (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 v 100 μΐ DMEM obsahujícím 10% FCS) se přidala do stejných množství H5.010CMVEGFP (1000 PFU/jamku) nebo C68CMVEGFP viru a provedla se inkubace při 4 °C po dobu 2 hodin. 150 μΐ směsi se přeneslo na 2 x 10 293 buněk v 96 jamkové plotně s plochým dnem. Kontrolní jamky se infikovaly stejnou dávkou viru (bez přidání séra). Vzorky se inkubovaly při 37 °C v 5% CCT po dobu 48 hodin a vyšetřovaly se ve fluorescenčním mikroskopu. Ředění vzorků, která vykazovala >50% redukci ložisek zelené fluorescence ve srovnání s infikovanými kontrolami se považovala za pozitivní na neutralizační protilátky.
Jak se předpokládalo, přibližně 35 % normálních lidí mělo neutralizační protilátky k Ad5, což je frekvence mnohem vyšší než frekvence pozorovaná v sérech makaků rhesus a šimpanzů. Neutralizační protilátky k C68 byly pozorovány u 80 % šimpanzů a pouze u 2 % normálních lidí
-27CZ 304169 B6 nebo makaků rhesus. Titry neutralizačních protilátek u jiných než cílových druhů byly obecně nízké.
Pro další hodnocení zkřížené reaktivity C68 s lidskými adenovirovými vektory se myši imunizovaly 2 x 107 plaky tvořících jednotek (pfu) Ad 2, 4, 5, 7 a 12, stejně jako C68. Sérum se odebralo o dva týdny později a testovalo se na protilátky, které neutralizují Ad5 nebo C68 vektory. Neutralizační protilátky k Ad5 vektoru byly detekovány pouze u zvířat imunizovaných Ad5. Důležité je to, že jedinými zvířaty s neutralizačními protilátkami k C68 vektoru byla ta zvířata, která byla imunizovaná C68 vektorem; žádné testované lidské serotypy, včetně Ad4, negenerovaly u myší protilátky, které by neutralizovaly C68 in vitro.
Pro použití C68 vektoru u člověka je důležitá absence neutralizačních protilátek v lidské populaci. V naší studii vyšetření 50 normálních lidí nedetekovalo žádné významné neutralizační protilátky (>1:10) při použití stejného testu, který detekoval neutralizační protilátky u >50 % šimpanzů. Dále, sérum od myší imunizovaných více serotypy lidského Ad, včetně Ad4, neneutralizovalo infekci C68.
V jiném pokusu se skupiny 10 až 12 ICR myší vakcinovaly různými dávkami Adhu5rab.gp nebo AdC68rap.gp vakcíny podanými podkožně (s.c.), intranasálně (i.n.) nebo orálně (per os). Myším se odebrala krev o 21 dnů později a určily se titry protilátek neutralizujících virus (VNA) v mezinárodních jednotkách. Myši se za 4 týdny po vakcinaci infikovaly 10 průměrnými letálními dávkami CVS-24 viru, které se aplikovaly přímo do centrálního nervového systému.
Titry VNA (% přežití po infekci)
Dávka vakcíny 5xl07 5xl06 5xl35 5xl04
Adhu5rab. gp, s . c. 972(100) 324 (100) 108(100) 12 (100)
AdC6Srab.gp, s.c. 240 (100) 36 (100) 12 (30) 8 (80)
Adhu5rab.gp, i.n. nt 162 (100) 162 (100) 18 (50)
AdC68rab.gp, i.n. nt 54 (100) 162 (100) 18 (50)
2xl07 2xl06 2xl05 2xl04
Adhu5rab.gp, per os 108 (100) 54(88) 18 (80) 4(30)
AdC68rab.gp, per os 108 (100) 36 (78) 12 (55) 0,2(0)
Tato data ukazují, že AdC68 konstrukt neočekávaně indukuje lepší protektivní protilátkovou odpověď při nižší intranasální dávce než lidský typ 5.
Příklad 15 - Strukturální analýza hexonových proteinů
Absence neutralizačních protilátek mezi C68 a lidskými serotypy nás donutila opatrněji hodnotit strukturální odlišnosti v regionech hexonu, o kterých se předpokládá, že nesou typově specifické epitopy. Předešlé pokusy naznačily, že tyto epitopy jsou lokalizované v 7 hypervariabilních regionech hexonu, které určily Crawford-Miksza a Schnurr (J. Virol, 70:1836-1844 (1996)). Srovnání aminokyselinových sekvencí hexonových proteinů mezi C68 a několika lidskými adenoviry je uvedeno na obr. 2. Dále, C68 je významně odlišný ve významných regionech těchto
-28CZ 304169 B6 hypervariabilních sekvencí. Přesnější modelování trojrozměrné struktury hexonu C68 se provedlo pro mapování jedinečné sekvence. Modely struktury hexonu z C68 a Ad4 se připravily na základě rentgenové krystalové struktury hexonů pro Ad2 a Ad5.
Rentgenové krystalové struktury Ad5 hexonu (Protein Data Bank identifikační označení 1RUX) (J. J. Rux a R. M. Bumett, Mol. Ther. 1:18-30 (2000)), a struktury Ad2 hexonu (F. K. Athappilly, et al., J. Mol. Biol., 242: 430 455 (1994)), byly dále upraveny tak, aby se získaly současné modely hexonů (Rux a Burnett, bude publikováno jinde). Modely homologních C68 aAd4 hexonů byly nejprve produkovány za použití Swiss-Pdb Viewer protein-modelovacího prostředí (N. Guez and M. C. Peitsch, Electrophoresis, 18:2714-2723 (1997)). Tento automatizovaný postup se použil pro seřazení aminokyselinových sekvencí C68 a Ad4 hexonů s krystalovou strukturou Ad2 a Ad5 hexonů. Seřazení sekvencí se použilo pro dosažení modelové sekvence do známých molekulárních struktur. Pozice zbytků ve vedlejších řetězcích nenalezené ve známých strukturách se vybraly z knihovny protomerů vedlejších řetězců. Tyto počáteční molekulové modely se potom manuálně upravily tak, aby se zlepšilo automatické seřazení, pomocí přesunu mezer do exponovaných variabilních regionů a optimalizaci sbalení vedlejších řetězců. Pozice externích smyček nepozorovaných v Ad2 a Ad5 templátových strukturách se buď vybraly z knihovny známých smyček, nebo se upravily manuálně. Konformace každého modelu byla dále upravena minimalizací energie za použití programu pro molekulární mechaniku CHARMM (B. R. Brooks, et al., J. Comp. Chem., 4:187-217 (1983)). Struktury těchto C68 a Ad4 hexonových modelů se potom porovnaly a vypočetlo se nové seřazení sekvence. Odlišnosti mezi dvěma strukturálně seřazenými sekvencemi se použily pro barevné zobrazení modelů homologie. Grafické znázornění připravené v Swiss-PdbViewer programu se exportovalo a převedlo se do Persistance of Vision Ray Tracer programu (POV-Ray 2000, Version 3,lg).
Ačkoliv je celková C68 sekvence velmi podobná sekvenci Ad4 hexonu, jsou odlišnosti mezi těmito dvěma sekvencemi primárně přítomné v DE1 a FG1 smyčkách a tyto smyčky obsahují všech sedm hypervariabilních regionů. DE1, FG1 a FG2 smyčky, každá zjiné podjednotky, intimně asociují a tvoří věžovitou doménu na vrcholu trimerické molekuly. Hexonová věž tvoří značnou část zevního povrchu virionu a vytváří místa pro navázání protilátek. Strany a báze hexonů jsou v kontaktu s kapsidou a tak jsou tyto regiony chráněny před vazbou protilátky a jejich sekvence jsou konzervované. Naopak, sekvence C68 a Ad4 jsou dosti odlišné od v různých hexonových věžích. Toto vysvětluje, proč nejsou protilátky proti těmto virům zkříženě reaktivní.
Všechny publikace citované v této přihlášce a seznam sekvencí jsou zde uvedeny jako odkazy. Ačkoliv byl vynález popsán na konkrétních provedeních, je jasné, že existují modifikace uvedených provedení, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích.
Seznam sekvencí
<110> The Wistar Institute of Anatomy and Biology The Trustees of The University of Pennsylvania Ertl, Hildegund C. J. Wilson, James M.
<120> Způsoby pro indukování cytotoxické imunitní reakce a přípravky rekombinantního opičího adenoviru použitelné v těchto způsobech
<130> WST104A/UPNN2628A
<150> US 60/300,131
<151> 2001-06-22
<150> US 60/304,843
-29CZ 304169 B6
<151> 2001-07-12
<160> 13
<170> Patentln version 3.1
<210> <211> <212> <213> 1 9 PRT Artifíciální sekvence
<220> <223> Syntetický peptid nesoucí imunodominantní CD8+ T-lymfocytámí epitop pro H-2d haplotyp
<400> 1
Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile
1 5
<210> <211> <212> <213> 2 19 DNA Artifíciální sekvence
<220> <223> 5' primer pro glykoprotein viru vztekliny
<400> 2
aagcatttcc gcceaacac
<210> <211> <212> <213> 3 22 DNA Artifíciální sekvence
<220> <223> 3' primer pro glykoprotein viru vztekliny
<400> 3
ggttagtgga gcagtaggta ga
<210> <211> <212> <213> 4 25 DNA Artifíciální sekvence
<220> <223> 5' primer pro glutaraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasu (GAPDH)
<400> 4
ggtgaaggtc ggtgtgaacg gattt <210> 5 <211> 25
-30CZ 304169 B6 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<223> 3' primer pro GAPDH <400> 5 aatgccaaag ttgtcatgga tgacc <210> 6 <211> 7228 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<223> Modifikovaná HIV-1 gag sekvence <220>
<221> CDS <222> (729)..(1820) <223>
<400> 6
tggaagggct aatttggter- caaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgcttc aagttagtac cagttgaacc ag&gcaagta gaagaggcca 180
aataaggaga gaagaacagc ttgttacacc ctatgagcea gcatgggatg gaggacccgg 240
agggagaagt attagtgtgg aagtttgaca gcctcctagc atttcgtcac atggcccgag 300
agctgcatcc ggagtactac aaagactgct gacatcgagc tttctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg tgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
gctacatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgctca aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagtaaa gccagaggag atctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcgtcg 720
acagagag atg ggt gcg i aga gcg tca gta tta age ggg gga gaa tta gat 770
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp
1 5 10
ega tgg gaa aaa att cgg tta agg cca ggg gga aag aag aag tac aag
Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys
15 20 25 30
cta aag cac atc gta tgg gca age agg gag cta gaa ega ttc gca gtt
Leu Lys Bis Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val
35 40 45
-31 CZ 304169 B6
aat cct ggc ctg tta gaa aca tea gaa ggc tgt aga caa ata ctg gga 914
Asn Pro Gly Leu 50 Leu Glu Thr Ser Glu 55 Gly Cys Arg Gin Ile 60 Leu Gly
cag cta caa cca tcc ctt cag aca gga tea gag gag ctt ega tea cta 962
Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu
65 70 75
tac aac aca gta gca acc ctc tat tgt gtg cac cag cgg atc gag atc 1010
Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg Ile Glu Ile
80 85 90
aag gao acc aag gaa gct tta gac aag ata gag gaa gag caa aac aag 1058
Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gin Asn Lys
95 100 105 110
tcc aag aag aag gcc cag cag gca gca gct gac aca gga cac age aat 1106
Ser Lys Lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn
115 120 125
cag gtc age caa aat tac cct ata gtg cag aac atc cag ggg caa atg 1154
Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile Val Gin Asn Ile Gin Gly Gin Met
130 135 140
gta cat cag gcc ata tea cct aga act tta aat gca tgg gta aaa gta 1202
Val His Gin Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val
145 150 155
gta gaa gag aag gct ttc age cca gaa gtg ata ccc atg ttt tea gca 1250
Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala
160 165 170
tta tea gaa gga gcc acc cca cag gac ctg aac acg atg ttg aac acc 1298
Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr
175 180 185 190
gtg ggg gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat 1346
Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn
195 200 205
gag gaa gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct 1394
Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro
210 215 220
att gca cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga 1442
Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly
225 230 235
act act agt acc ctt cag gaa caa ata gga tgg atg aca aat aat cca 1490
Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro
240 245 250
cct atc cca gta gga gag atc tac aag agg tgg ata atc ctg gga ttg 1538
Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu
255 260 265 270
aac aag atc gtg agg atg tat age cct acc age att ctg gac ata aga 1586
Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg
275 280 285
caa gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gac cgg ttc tat aaa 1634
Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys
290 295 300
-32CZ 304169 B6
act Thr cta aga gct gag caa gct tea cag gag gta aaa aat tgg atg aca
Leu Arg 305· Ala Glu Gin Ala Ser 310 Gin Glu Val Lys Asn 315 Trp Met Thr
gaa acc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gat tgt aag acc atc ctg
Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu
320 325 330
aag gct ctc ggc cca gcg gct aca cta gaa gaa atg atg aca gca tgt
Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys
335 340 345 350
cag gga gta gga gga cqc ggc cat aag gca aga gtt ttg tag
Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
355 360
ggatccacta ggcagctgta ctcccaaaga tgattggcag ctacaagcta cagcttgtta gttctágact gatcttagcc agacaagata aactacacac gtaccagttg caccctgtga cgaggggggg actttttaaa tccttgatct cagggccagg agccagataa gcctgcatgg cccggtacct agaaaagggg gtggatctac ggtcagatat ggtagaagag aatggatgac ttaagaccaa ggactggaag cacacacaag ccactgacct gccaataaag cctgagagag tgacttacaa ggctaattca gctacttccc ttggatggtg gagagaacac aagtgttaga gtggaggttt cttcaagaac gaggcgtggc tgctttttgc gctaactagg tgtgtgcccg tgtggaaaat ctgcattcca tattaaatat gctcacacct gttccagacc tattttatgt tctgatacca agggaggttt cggttcagtt ccccaagaca ggcagagccg ggctgtgcgg atcagagttt gacagccgcc tgctgacatc ctgggcggga ctgtactggg gaacccactg tctgttgtgt ctctagcacc gcctgggcaa atttatacat gcgcccggcc agcctgacca gtattttatt caagaatcat tcaccagcac ccaacaccgc taaacaccca attcaccaag gagaacggag ttaaggataa tagcatttca gagcttgcca ctggggagtg tctctctggt cttaagcctc gactctggta ccccaggagg gaaaacaaga ggaggtcata ctttgggagg acatggagaa cacaggtatt cagcacagag atgagcagte ctgcctggag agacataaac acgggaatta ttctattatg cttagtgtgt tcacgtggcc caagggactt gcgagccctc tagaccaaat aataaagctt actagagatc tagaggttgc ctgtctaaaa aaaatatata ccgaggcagg accccttctc tctggaaaac gaagacttct agttctgecg agaggtcaga acccaacagg ggatagagaa actcaaatca agggggccag cgagagctgc tccgctgggg agatgctgca
Ctgagcctgg gccttgagtg cctcagaccc agtgagccaa taataataat tatttgggct tggatcacct tgtgtatttt tgaaactgtt gtgatcaaat cagactcggc ccacagggtg tccaccccgc agagtaagtc gtctccccaa tgagttggag atccggagta actttccagg tataagcagc gagctctctg cttcaagtag ttttagtcag gatcgcgcca aagttaaggg gggcgcagtg gagtttggga tagtagattt tttcctctac gtggtgggag gggtgtcctt agggctcagt ctgctgccca acacagagcc gcattcgggg atgaaagcgt
1682
1730
1778
1820
1880
1940
2000
2060
2120
2180
2240
2300
2360
2420
2480
2540
2600
2660
2720
2780
2840
2900
2960
3020
3080
3140
3200
3260
3320
-33 CZ 304169 B6 agggagtcga aggtgtcctt ttgcgccgag tcagttcctg ggtgggggcc acaagatcgg 3380 atgagccagt ttatcaatcc gggggtgcca gctgatccat ggagtgcagg gtctgcaaaa 3440 tatctcaagc actgattgat cttaggtttt acaatagtga tgttacccca ggaacaattt 3500 ggggaaggtc agaatcttgt agcctgtagc tgcatgactc ctaaaccata atttcttttt 3560 tgtttttttt tttttatttt tgagacaggg tctcactctg tcacctaggc tggagtgcag 3620 tggtgcaatc acagctcact gcagccccta gagcggccgc caccgcggtg gagctccaat 3680 tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 3740 gaaaaccctg gcgfctaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 3800 cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 3860 gaatggcgcg aaattgtaaa cgttaatatt .ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 3920 atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 3980 tagaccgaga tagggttgag tgtfcgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 4040 gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaácc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 4100 ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 4160 aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 4220 gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 4280 gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ggtggcactt 4340 ttcggggaaa tgfcgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 4400 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atatfcgaaaa aggaagagta 4460 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 4520 tttttgetca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 4580 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 4640 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 4700 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca cpáttetcag aatgacttgg 4760 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4820 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 4880 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 4940 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 5000 ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactaett actctagctt 5060 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 5120 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 5180 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 5240 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 5300 cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 5360 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagafc cctttttgafc aatcfccatga 5420
-34CZ 304169 B6 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 5480 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 5540 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 5600 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtccfc tctagtgtag ccgtagttag 5660 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 5720 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 5780 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 5840 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 5900 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagage 5960 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 6020 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 6080 acgccagcaa cgcggccfcfct ttacggfctcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 6140 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 6200 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 6260 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggo 6320 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 6380 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggcfccgtatg ttgtgtggaa 6440 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg 6500 gaattaaccc-tcactaaagg gaacaaaagc tgcfcgcaggg tccctaactg ccaagcccca 6560 cagtgtgccc tgaggctgcc ccttccttct agcggctgcc cccactcggc tttgctttcc 6620 etagfcttcag ttacttgcgt tcagccaagg tctgaaacta ggtgcgcaca gagcggtaag 6680 actgcgagag aaagagacca gctttacagg gggtttatca cagtgcaccc tgacagtcgt 6740 cagcctcaca gggggtttat cacattgcac cctgacagtc gtcagcctca cagggggttt 6800 atcacagtgc acccttacaa tcattccatt tgattcacaa tttttfctagt ctctactgtg 6860 cctaacttgt aagttaaatt tgatcagagg tgtgttccca gaggggaaaa cagtatatac 6920 agggttcagt actatcgcat ttqaggcctc cacctgggtc ttggaatgtg tcccccgagg 6980 ggtgatgact acctcagtfcg gatctccaca ggtcacagtg acacaagata accaaijacac 7040 ctcccaaggc taccacaatg ggccgccctc cacgtggaca tggccggagg aactgccatg 7100 tcggaggtgc aagcacacct gcgcatcaga gtccttggtg tggagggagg gaccagcgca 7160 gcttccagcc atccaccfcga tgaacagaac ctagggaaag ccccagttct acttacacca 7220 ggaaaggc 7228 <210> 7 <211> 363 <212> PRT <213> Artificiální sekvence
-35 CZ 304169 B6 <220>
<223> Modifikovaná HIV-1 gag sekvence <400> 7
Met 1 Gly Ala Arg Ala 5 Ser Val Leu Ser Gly 10 Gly Glu Leu Asp Arg 15 Trp
Glu Lys Ile Arg 20 Leu Arg Pro Gly Gly Lys 25 Lys Lys Tyr Lys 30 Leu Lys
His Ile Val 35 Trp Ala Ser Arg Glu 40 Leu Glu Arg Phe Ala 45 Val Asn Pro
Gly Leu 50 Leu Glu Thr Ser Glu 55 Gly Cys Arg Gin Ile 60 Leu Gly Gin Leu
Gin 65 Pro Ser Leu Gin Thr 70 Gly Ser Glu Glu Leu 75 Arg Ser Leu Tyr Asn 80
Thr Val Ala Thr Leu 85 Tyr Cys Val His Gin 90 Arg Ile Glu Ile Lys 95 Asp
Thr Lys Glu Ala 100 Leu Asp Lys Ile Glu Glu 105 Glu Gin Asn Lys 110 Ser Lys
Lys Lys Ala 115 Gin Gin Ala Ala Ala 120 Asp Thr Gly His Ser 125 Asn Gin Val
Ser Gin 130 Asn Tyr Pro Ile Val 135 Gin Asn Ile Gin Gly 140 Gin Met Val His
Gin 145 Ala ile Ser Pro Arg 150 Thr Leu Asn. Ala Trp 155 Val' Lys Val Vál Glu 160
Glu Lys Ala Phe Ser 165 Pro Glu Val Ile Pro 170 Met Phe Ser Ala Leu 175 Ser
Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
1Θ0 185 190
Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu 195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pró Ile Ala 210 215 220
Pro Gly Gin Met Axg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile 245 250 255
-36CZ 304169 B6
Pro Val Gly Glu lle Tyr lys Arg Trp lle lle Leu Gly Leu Asn Lys
260 265 270
lle Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser lle Leu Asp lle Arg Gin Gly
275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Arg Ala Glu Gin Ála Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305 310 315 320
Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr lle Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly
340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
355 360
<210> 8
<211> 31 1
<212> PRT
<213> Šimpanzí typ adenoviru
<400> 8
Asn Thr Cys Gin Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Thr Ala Thr Glu
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Thr Tyr Gly Asn Ala Pro Val Gin Gly lle Asn lle Thr
20 25 30
Lys Asp .Gly lle Gin Leu Gly Thr Asp Thr Asp Asp Gin Pro lle Tyr
35 40 45
Ala Asp Lys Thr Tyr Gin Pro Glu Pro Gin Val Gly Asp Ala Glu Trp
50 55 60
His Asp lle Thr Gly Thr Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys
65 70 75 80
Pro Asp Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr
85 90 95
Asn Lys Glu Gly Gly Gin Ala Asn Val Lys Thr Gly Thr Gly Thr Thr
100 105 110
Lys Glu Tyr Asp lle Asp Met Ala Phe Phe Asp Asn Arg Ser Ala Ala
115 120 125
-37CZ 304169 B6
Ala Ala Gly Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asp 130 135 140
Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Ala Gly Thr Asp Asp 145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Ile Asn Leu Gly Gin Gin Ala Met Pro Asn Arg Pro 165 170 175
Val Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn 180 185 190
Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn 195 200 205
Ala Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu 210 215 220
Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn 225 230 235 240
Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His
245 250 255
Gly Val Glu Asp 260 Glu Leu Pro Asn Tyr 265 Cys Phe Pro Leu Asp 27 Q Ala Val
Gly Arg Thr 275 Asp Thr Tyr Gin Gly 280 Ile Lys Ala Asn Gly 285 Thr Asp Gin
Thr Thr Trp 290 Thr Lys Asp Asp 295 Ser Val Asn Asp Ala 300 Asn Glu Ile cly
Lys 305 Gly Asn Pro Phe Ala Met 310
<210> 9
<211> 314
<212> PRT
<213> Lidský adenovirus typu 4
<400> 9
Asn 1 Thr Cys Gin Trp 5 Lys Asp Ser Asp Ser 10 Lys Met His Thr Phe 15 Gly
Ala . Ala Ala Met 20 Pro Gly Val Thr Gly 25 Lys Lys Ile Glu Ala 30 Asp Gly
Leu Pro Ile 35 Arg Ile Asp Ser Thr 40 Ser Gly Thr Asp Thr 45 Val Ile Tyr
38CZ 304169 B6
Ala Asp 50 Lys Thr Phe Gin Pro 55 Glu Pro Gin Val Gly Asn Asp 60 Ser Trp
Val 65 Asp Thr Asn Gly Ala 70 Glu Glu Lys Tyr Gly 75 Gly Arg Ala Leu Lys 80
Asp Thr Thr Lys Met 85 Asn Pro Cys Tyr Gly 90 Ser. Phe Ala Lys Pro 95 Thr
Asn Lys Glu Gly 100 Gly Gin Ala Asn Leu 105 Lys Asp Ser Glu Pro 110 Ala Ala
Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Ser Lys Thr
115 120 125
Ile Val Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val
130 135 140
Asp Leu Gin Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu
145 150 155 160
Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gin Gin Ala Met Pro Asn Arg
165 170 175
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gita Ala Ser Gin Leu
195 200 205
Asn Ala Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gin
210 215 220
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp
225 230 235 240
Asn Gin Ala Val- Asp ..Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn
245 250 255
His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly
260 265 270
Val Gly Leu Thr Asp Thr Tyr Gin Gly Val Lys Val Lys Thr Asp Ala
275 280 285
Gly Ser Glu Lys Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val Ser Asn Ala Asn
290 295 300
Glu Ile His Val Gly Asn Pro Phe Ala Met
305 310
<210> 10 <211> 318 <212> PRT <213> Lidský adenovirus typu 16 <400> 10
Asn Thr Cys Gin Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly
1 5 10 15
Val Ala Ala Met 20 Pro· Gly Val Thr Gly 25 LVS Lys Ile Glu Ala 30 Asp Gly
Leu Pro Ile 35 Gly Ile Asp Ser Thr 40 Ser Gly Thr Asp Thr 45 Val Ile Tyr
Ala Asp 50 Lys Thr Phe Gin Pro 55 Glu Pro Gin Val Gly 60 Ash Ala Ser Trp
Val 65 Asp Ala Asn Gly Thr 70 Glu Glu Lys Tyr Gly 75 Gly Arg Ala Leu Lys 80
Asp Thr Thr Lys Met 85 Lys Pro Cys Tyr Gly 90 Ser Phe Ala Lys Pro 95 Thr
Asn Lys Glu Gly 100 Gly Gin Ala Asn Leu 105 Lys Asp Ser Glu Thr 110 Ala Ala
Thr Thr Pro 115 Asn Tyr Asp Ile Asp 120 Leu Ala Phe Phe Asp 125 Asn Lys Asn
ile Ala 130 Ala Asn Tyr Asp Pro 135 Asp Ile Val Met Tyr 140 Thr Glu Asn Val
Asp 145 Leu Gin Thr Pro Asp 150 Thr His Ile Val Tyr 155 Lys Pro Gly Thr Glu 160
Asp Thr Ser Ser Glu 165 Ser Asn Leu Gly Gin 170 Gin Ala Met Pro Asn. 175 Arg
Pro Asn Tyr Ile 180 Gly Phe Arg Asp Asn 185 Phe Ile Gly Leu Met 190 Tyr Tyr
Asn Ser Thr 195 Gly Asn Met Gly Val 200 Leu Ala Gly Gin Ala 205 Ser Gin Leu
Asn Ala 210 Val Val Asp Leu Gin 215 Asp Arg Asn Thr Glu 220 Leu Ser Tyr Gin
Leu 225 Leu Leu Asp Ser Leu 230 Gly Asp Arg Thr Arg 235 Tyr Phe Ser Met Trp 240
-40CZ 304169 B6
Asn Gin Ala Val Asp 24< Ser Tyr Asp Pro Asp 250 Val Arg Ile Ile Glu 255 Asn
His Gly Val Glu 260 Asp Glu Leu Pro Asn 265 Tyr Cys Phe Pro Leu 270 Asn Gly
Val Gly Phe 275 Thr Asp Thr Tyr Gin 280 Gly Val Lys Val Lys 285 Thr Asp Ala
Val Ala 290 Gly Thr Ser Gly Thr 295 Gin Trp Asp Lys Asp Asp 300 Thr Thr Val
Ser Thr Ala Asn Glu Ile His Gly Gly Asn Pro Phe Ala Met
305 310 315 <210> 11 <211> 323 <212> PRT <213> Lidský adenovirus typu 3 <400> 11
Ašn Thr Ser Gin Trp Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr
1 5 10 15
Thr Thr Thr Asn 20 Thr Phe Gly Ile Ala 25 Ser Met Lys Gly Gly 30 Asn Ile
Thr Lys Glu 35 Gly Leu Gin Ile Gly 40 Lys Asp Ile Thr Thr 45 Thr Glu Gly
Glu Glu 50 Lys Pro Ile Tyr Ala 55 Asp Lys Thr Tyr Gin 60 Pro Glu Pro Gin
Val 65 Gly Glu Glu Ser Trp 70 Thr Asp Thr Asp Gly 75 Thr Asn Glu Lys Phe 80
Gly Gly Arg Ala Leu 85 Lys Pro Ala Thr Asn 90 Met Lys Pro Cys Tyr 95 Gly
Ser Phe Ala Arg 100 Pro Thr Asn Ile Lys 105 Gly Gly Gin Ala Lys 110 Asn Arg
-41 CZ 304169 B6
Lys Val Lys 115 Pro Thr Thr Glu Gly 120 Gly Val Glu Thr Glu 125 Glu Pro Asp
Ile Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Aso Ala. Val Ala. Gly Ala Leu
130 135 140
Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
Asp Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn Ser His Ala
165 170 175
Asn Leu Gly Gin Gin Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe
180 185 190
Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met
195 200 205
Gly Val Leu Ala Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn Ala Val Val Asp Leu
210 215 220
Gin Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp Ser Leu
225 230 235 240
Gly Asp Arg Thr Axg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gin Ala Val Asp Ser
245 250 255
Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu
260 265 270
Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly Ile Gly Pro Gly His Thr
275 280 285
Tyr Gin Gly Ile Lys Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu
290 295 300
Lys Asp Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn Asn
305 310 315 320
Leu Ala Met
<210> 12
<211> 315
<212> PRT
<213> Lidský adenovirus typu 7
-42CZ 304169 B6
<400> 12
Asn 1 Thr Ser Gin Trp Ile Val Thr Ala Gly Glu Glu Arg Ala Val Thr 5 10 15
Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Asp Asn Ile 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys 35 40 45
Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gin Pro Glu Pro Gin Val Gly Glu 50 55 60
Glu 65 Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn Glu Lys Phe Gly Gly Arg 70 75 80
Ala Leu Lys Pro Ala Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala 85 90 95
Arg Pro Thr“ Asn Ile Lys Gly Gly Gin Ala Lys Asn Arg Lys Val Lys 100 105 HO
Pro Thr Glu Gly Asp Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp Ile Asp Met Glu 115 120 125
Phe Phe Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val 130 135 140
Leu 145 Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val 150 155 160
Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Asp Asp Asn Ser His Ala Asn Leu Gly Gin 165 170 175
Gin Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe 180 185 190
Val Gly Leu Met Tyr Týr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala 195 200 205
Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn 210 215 220
Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Tht 225 230 235 240
Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp 245 250 255
Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr 260 265 270
Cys Phe Pro Leu Asp Gly Ile Gly Pro Ala Lys Thr Tyr Gin Gly Ile 275 280 285
Lys Ser Lys Asp Asn Gly Trp Glu Lys Asp Asp Asn Val Ser Lys Ser 290 295 300
Asn Glu Ile Ala Ile Gly Asn Asn Gin Ala Met 305 310 315 <210> 13 <211> 345 <212> PRT <213> Lidský adenovirus typu 2 <400 13
Asn 1 Ser Cys Glu Trp 5 Glu Gin Thr Glu Asp 10 Ser Gly Arg Ala Val 15 Ala
Glu Asp Glu Glu 20 Glu Glu Asp Glu Asp 25 Glu Glu Glu Glu Glu 30 Glu Glu
Gin Asn Ala 35 Arg Asp Gin Ala Thr 40 Lys Lys Thr His Val 45 Tyr Ala Gin
Ala Pro 50 Leu Ser Gly Glu Thr 55 Leu Thr Lys Ser Gly 60 Leu Gin Ile Gly
Ser 65 Lys Asn Ala Glu Thr 70 Gin Ala Lys Pro Val 75 Tyr Ala Asp Pro Ser 80.
Tyr Gin Pro Glu Pro Gin Ile Gly Glu Ser Gin Trp Asn Glu Ala Asp
44CZ 304169 B6
90 95
Ala Asn Ala Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys
100 105 110
Pro Tyr Gly Ser Tyr 115 Ala Arg Pro Thr 120 Asn Pro Phe Gly Gly 125 Gin Ser
Val Leu Val Pro Asp 130 Glu Lys Gly Val 135 Pro Leu Pro Lys Val 140 Asp Leu
Gin 145 Phe Phe Ser Asn Thr Thr Ser Leu 150 Asn Asp Arg Gin Gly 155 Asn Ala 160
Thr Lys Pro Lys Val 165 Val LeU Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met 170 Glu 175 Thr
Pro Asp Thr His Leu 180 Ser Tyr Lys Pro 185 Gly Lys Gly Asp Glu 190 Asn Ser
Lys Ala Met Leu Gly 195 Gin Gin Ser Met 200 Pro Asn Arg Pro Asn 205 Tyr Xle
Ala Phe Arg Asp Asn 210 Phe Xle Gly Leu 215 Met Tyr Tyr Asn Ser 220 Thr Gly
Asn 225 Met Gly Val Leu Ala Gly Gin Ala 230 Ser Gin Leu Asn Ala 235 Val Val 240
Asp Leu Gin Asp Arg 245 Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu Leu 250 Leu 255 Asp
Šer lle Gly Asp Arg 260 Thr Arg Tyr Phe 265 Ser Met Trp Asn Gin 270 Ala Val
Asp Ser Tyr Asp Pro 275 Asp Val Ařg Xle 280 lle Glu Asn His Gly 285 Thr Glu
Asp Glu Leu Pro Asn 290 Tyr Cys Phe Pro 295 Leu Gly Gly lle Gly 300 Val Thr
Asp 305 Thr Tyr Gin Ala lle Lys Ala Asn 310 Gly Asn Gly Ser Gly Asp 315 Asn 320
Gly Asp Thr Thr Trp Thr Lys Asp Glu Thr Phe Ala Thr Arg Asn Glu 325 330 335 lle Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met 340 345
-45 CZ 304169 B6

Claims (29)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Replikačně defektní opičí adenovirový vektor, který v kapsidě opičího adenoviru obsahuje cis-elementy opičího adenoviru a heterologní gen operativně navázaný na sekvence řídící expresi, kde kapsida opičího adenoviru je odvozena z šimpanzího adenoviru vybraného ze skupiny sestávající z Pan 5, Pan 6 a Pan 7.
  2. 2. Opičí adenovirový vektor podle nároku 1, kterýje replikačně defektní v důsledku absence schopnosti exprimovat adenovirové Ε1 a a Ε1 b.
  3. 3. Opičí adenovirový vektor podle nároku 1 nebo 2, ve kterém je eliminován zpožděný časný gen E3.
  4. 4. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kteiý vykazuje funkční deleci v E4 genu.
  5. 5. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který obsahuje deleci ve zpožděném časném genu E2a.
  6. 6. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, který obsahuje deleci v kterémkoliv z pozdních genů LI až L5 genomu opičího adenoviru.
  7. 7. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z viru vybraným ze skupiny sestávající z viru lidské imunodeficience, viru opičí imunodeficience, respiračně-syncytiálního viru, viru parainfluenzy typu 1-3, chřipkového viru, viru herpes simplex, lidského cytomegaloviru, virů hepatitidy, lidského papillomaviru, polioviru, rotaviru, calicivirů, viru spalniček, viru příušnic, viru zarděnek, adenoviru, viru vztekliny, viru psinky, viru dobytčího moru, koronaviru, parvoviru, virů infekční rhinotracheitidy, viru kočičí leukemie, viru kočičí infekční peritonitidy, viru ptačí infekční bursitidy, viru nemoci Newcastle, viru Marekovy nemoci, viru prasečího respiračního a reprodukčního syndromu, viru koňské arteritidy a virů encephalitidy.
  8. 8. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z bakterie vybrané ze skupiny sestávající z Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare complex, Próteus mirabilis, Próteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacilus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum.
  9. 9. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z houby vybrané ze skupiny sestávající z Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus a Histoplasma.
  10. 10. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterém heterologní gen kóduje imunogenní produkt z parazita vybraného ze skupiny sestávající z Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii.
    -46CZ 304169 B6
  11. 11. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterém heterologní gen je určen k vyvolání protinádorové reakce s využitím nádorového antigenu nebo antigenu asociovaného s nádory vybraného ze skupiny sestávající z prostatického specifického antigenu, karcinoembryonálního antigenu, MUC-1, Her2, CA-125 a MAGE-3.
  12. 12. Způsob přípravy vektoru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že zahrnuje spojení heterologního genu a ITR sekvence cis elementu opičího adenoviru.
  13. 13. Použití rekombinantního adenoviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pro indukci odpovědi T-buněk na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje odpověď CD8+ T-buněk na imunogen, když je podán podkožně, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta.
  14. 14. Použití rekombinantního adenoviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pro indukci protilátkové odpovědi na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje protilátkovou odpověď na antigen v nízkých dávkách, když je aplikován na sliznici, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta.
  15. 15. Použití podle nároku 13 anebo 14, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus je formulován pro podkožní podání.
  16. 16. Použití podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus je formulován pro podání v nízké dávce.
  17. 17. Použití podle kteréhokoliv z nároků 13 až 16, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus je formulován pro podání v účinné dávce v rozmezí od 104 do 106 pfu.
  18. 18. Použití podle kteréhokoliv z nároků 13 až 17, kde imunogen je vybrán ze skupiny sestávající z peptidu, polypeptidu nebo proteinu odvozeného z patogenního viru vybraného ze skupiny sestávající z viru lidské imunodeficience-1, lidského papilloma viru a viru vztekliny.
  19. 19. Imunogenní kompozice použitelná pro indukci cytolytické imunitní odpovědi na virus lidské imunodeficience, vyznačující se tím, že obsahuje (a) rekombinantní opičí adenovirus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 obsahující optimalizovanou sekvenci nukleové kyseliny kódující modifikovaný gag protein viru lidské imunodeficience-1 a (b) fyziologicky kompatibilní nosič.
  20. 20. Použití imunogenní kompozice podle nároku 19 pro výrobu léčiva pro indukci odpovědi CD8+ T-buněk proti viru lidské imunodeficience u savců.
  21. 21. Použití rekombinantního opičího adenoviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 kódujícího imunogenní protein odvozený od papilloma viru pro výrobu léčiva pro indukci odpovědi CD8+ T-buněk proti papilloma viru u savců.
  22. 22. Použití rekombinantního opičího adenoviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 kódujícího imunogenní protein odvozený od viru vztekliny pro výrobu léčiva pro indukci neutralizační protilátkové odpovědi proti viru vztekliny u savců.
    -47CZ 304169 B6
  23. 23. Vakcína proti viru lidské imunodeficience, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní opičí replikačně defektní adenovirus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 obsahující antigen viru lidské imunodeficience-1 (HIV-1).
  24. 24. Vakcína podle nároku 23, vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze skupiny sestávající z obalové, pol nebo gag oblasti HIV-1.
  25. 25. Vakcína podle nároku 24, vyznačující se tím, že antigenem je přirozený antigen, ze kterého byly odstraněny elementy genetické nestability.
  26. 26. Vakcína podle nároku 24, v y z n a č uj í c í se tím, že antigenem je HIV-1 gag cDNA obsahující sekvence SEQ ID NO:6.
  27. 27. Vakcína proti vzteklině, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní opičí replikačně defektní adenovirus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující antigen viru vztekliny pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi antigenu vztekliny.
  28. 28. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro použití pro indukci odpovědi T-buněk na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje odpověď CD8+ T-buněk na imunogen, když je podán podkožně, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta.
  29. 29. Opičí adenovirový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro použití pro indukci protilátkové odpovědi na imunogen u pacienta, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje protilátkovou odpověď na antigen v nízkých dávkách, když je aplikován na sliznici, a kde dále uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulačních sekvencí, které řídí expresi imunogenu u pacienta.
CZ20033438A 2001-06-22 2002-05-13 Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, zpusob jeho prípravy a lécivo, imunogenní kompozice a vakcína obsahující rekombinantní adenovirus CZ304169B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30013101P 2001-06-22 2001-06-22
US30484301P 2001-07-12 2001-07-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20033438A3 CZ20033438A3 (cs) 2004-04-14
CZ304169B6 true CZ304169B6 (cs) 2013-12-04

Family

ID=26971607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033438A CZ304169B6 (cs) 2001-06-22 2002-05-13 Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, zpusob jeho prípravy a lécivo, imunogenní kompozice a vakcína obsahující rekombinantní adenovirus

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20040241181A1 (cs)
EP (1) EP1409012B1 (cs)
JP (1) JP2005523233A (cs)
KR (1) KR20040043129A (cs)
CN (1) CN1518457A (cs)
AT (1) ATE422365T1 (cs)
AU (1) AU2002308713B2 (cs)
BR (1) BR0210586A (cs)
CA (1) CA2451864C (cs)
CY (1) CY1109059T1 (cs)
CZ (1) CZ304169B6 (cs)
DE (1) DE60231123D1 (cs)
DK (1) DK1409012T3 (cs)
ES (1) ES2322043T3 (cs)
HU (1) HU228327B1 (cs)
IL (2) IL159454A0 (cs)
MX (1) MXPA04000024A (cs)
NO (1) NO333252B1 (cs)
NZ (1) NZ530245A (cs)
PL (1) PL216200B1 (cs)
PT (1) PT1409012E (cs)
SG (1) SG153649A1 (cs)
SI (1) SI1409012T1 (cs)
WO (1) WO2003000283A1 (cs)
ZA (1) ZA200309360B (cs)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
HU230364B1 (hu) 2001-11-21 2016-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
US7491508B2 (en) 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
SI2163260T1 (sl) 2004-01-23 2017-07-31 Msd Italia S.R.L. Nosilci šimpanzjih adenovirusnih cepiv
BRPI0516048A (pt) 2004-10-13 2008-08-19 Crucell Holland B V E Beth Isr batelada de um adenovìrus recombinante defectivo em replicação baseado em um sorotipo do subgrupo c
EA200702190A1 (ru) * 2005-05-12 2008-04-28 Глаксо Груп Лимитед Вакцинная композиция
CA2657353A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines for malaria
CA2679410C (en) 2007-03-02 2017-01-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method and compositions
CN101622008A (zh) * 2007-03-09 2010-01-06 默克公司 乳头瘤病毒疫苗组合物
PT2220242T (pt) * 2007-11-28 2017-04-03 Univ Pennsylvania Adenovírus símio da subfamília b sadv-28,27,-29,-32,-33 e -35 e suas utilizações
CA2749325C (en) * 2009-02-02 2021-03-30 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011133870A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Andrea Amalfitano Vaccines comprising adenovirus vectors and signaling lymphocyte activating molecule-associated protein (sap)
CN102060915A (zh) * 2010-10-29 2011-05-18 广州呼吸疾病研究所 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用
WO2012129295A1 (en) * 2011-03-21 2012-09-27 Vaxin Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN103468743B (zh) * 2013-08-19 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种狂犬病疫苗及其制备方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
HUE043042T2 (hu) 2013-11-01 2019-07-29 Pfizer Vektorok prosztatához kapcsolódó antigének expressziójára
JP6705755B2 (ja) 2014-05-19 2020-06-03 バロ セラピューティクス オイＶａｌｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｏｙ 癌ワクチン開発のための改変アデノウイルス
US11571472B2 (en) 2014-06-13 2023-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
KR102535670B1 (ko) 2015-06-12 2023-05-22 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
EP3504230A1 (en) 2016-08-23 2019-07-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
EP3518966A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
CN110036020A (zh) * 2016-12-09 2019-07-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体
GB201701239D0 (en) * 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
EP3655539A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Chikungunya virus antigen constructs
JP7366014B2 (ja) 2017-10-31 2023-10-20 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー アデノウイルス及びその用途
EP3704139A1 (en) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
SG11202003200VA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus and uses thereof
EP3704256A1 (en) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
MX2020006225A (es) 2017-12-20 2020-12-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Constructos antigenicos del virus de epstein-barr.
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
CN113573730A (zh) 2019-03-05 2021-10-29 葛兰素史密斯克莱生物公司 乙型肝炎免疫方案和组合物
CN116322740A (zh) 2020-07-13 2023-06-23 特兰斯吉恩股份有限公司 免疫抑制的治疗
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN117089577B (zh) * 2023-08-21 2024-06-25 暨南大学 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
IL113817A (en) * 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccne for papillomavirus
AU6261696A (en) * 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
WO2000011140A1 (en) * 1998-08-20 2000-03-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US6083716A (en) * 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors

Also Published As

Publication number Publication date
CN1518457A (zh) 2004-08-04
PL216200B1 (pl) 2014-03-31
BR0210586A (pt) 2005-07-12
EP1409012A1 (en) 2004-04-21
NO20035740L (no) 2004-02-16
CA2451864A1 (en) 2003-01-03
NZ530245A (en) 2007-04-27
DE60231123D1 (de) 2009-03-26
CY1109059T1 (el) 2014-07-02
HK1061511A1 (en) 2004-09-24
ZA200309360B (en) 2005-07-27
IL159454A0 (en) 2004-06-01
WO2003000283A1 (en) 2003-01-03
NO333252B1 (no) 2013-04-22
ATE422365T1 (de) 2009-02-15
AU2002308713A2 (en) 2003-01-08
SI1409012T1 (sl) 2009-08-31
AU2002308713B2 (en) 2008-05-15
NO20035740D0 (no) 2003-12-19
JP2005523233A (ja) 2005-08-04
HU228327B1 (en) 2013-03-28
PL372294A1 (en) 2005-07-11
MXPA04000024A (es) 2004-05-21
KR20040043129A (ko) 2004-05-22
SG153649A1 (en) 2009-07-29
CZ20033438A3 (cs) 2004-04-14
DK1409012T3 (da) 2009-05-18
IL159454A (en) 2009-09-01
US20040241181A1 (en) 2004-12-02
EP1409012A4 (en) 2005-08-03
HUP0400297A2 (en) 2007-05-02
CA2451864C (en) 2013-01-15
PT1409012E (pt) 2009-05-11
EP1409012B1 (en) 2009-02-11
ES2322043T3 (es) 2009-06-16
HUP0400297A3 (en) 2010-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2451864C (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
JP7113924B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）フィロウイルスワクチン
US12365920B2 (en) Adenoviral vector
DK2714916T3 (en) ABEADENOVIRUS AND HYBRID ADENOVIRUS VECTORS
EP3385387B1 (en) Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
DK2402451T3 (en) Method for Stabilizing a DNA Insert in a Recombinant Vaccine Vector
AU2002308713A1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
HUP0500987A2 (en) Simian adeniovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
CA2519207A1 (en) Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
US20040253210A1 (en) Adenovirus type7 vectors
HK40068020A (en) Adenoviral vector
HK1061511B (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
HK40006989B (en) Adenoviral vector
BR112017003908B1 (pt) Vacina contra filovírus de vírus de vaccinia modificado recombinante ankara (mva)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180513