JP2017509651A

JP2017509651A - 安定化したフィブロネクチンベーススキャフォールド分子

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Publication number: JP2017509651A
Application number: JP2016558059A
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Inventors: ダーサ・リポブセク
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2017-04-06
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: EP3647322A1; KR102494646B1; US11407815B2; US12529165B2; IL247826A0; CN106795214B; ES2898273T3; JP6644701B2; MX371403B; EP3119803B1; US10450363B2; ES2750563T3; WO2015143156A1; SG11201607818WA; AU2015231210B2; EP3119803A1; US20170183393A1; US20200062824A1; CN115322253A; CA2943228A1

Abstract

標的に特異的に結合する、フィブロネクチンベースのスキャフォールド(ＦＢＳ)ドメイン、例えば１０Ｆｎ３分子を含むタンパク質を提供し、ここで、該ＦＢＳドメインは、ＰｍＸｎ(Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは０または少なくとも１である整数であり、ｍは少なくとも１である整数である)からなる領域に、Ｃ末端で連結し、該ＰｍＸｎ部分は、該ＰｍＸｎ部分に連結していないタンパク質と比較して、ＦＢＳドメインの性質の増強、例えば安定性の向上をもたらす。

Description

関連出願への相互引用
本出願は、２０１４年３月２０日出願の米国仮出願第61/955,975号および、２０１４年１１月２５日出願の米国仮出願第62/084,270号に基づく優先権を主張し、当該文献の内容は、引用により、本明細書に具体的に包含される。

アドネクチンは、１０番目のヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン(^１０Ｆｎ３)由来である、高親和性および特異的な標的結合特性を有する治療用タンパク質のクラスである。野生型^１０Ｆｎ３がきわめて安定であり可溶性を示すのに対し、野生型配列から、順番に４〜３１個の変異を含む、標的結合性の^１０Ｆｎ３バリアントは、その安定性および溶解度が幅広く変動する。言い換えれば、野生型^１０Ｆｎ３配列のいずれの変異も、標的結合に必要なものであっても、タンパク質の安定性を低下させる危険性を含んでいる。結果として、好ましくは、アドネクチンの治療標的への結合に介在する残基の特性によらず、野生型^１０Ｆｎ３配列になし得る修飾であって、該配列を安定化させる修飾を決定することが望ましい。

本明細書では、安定化したフィブロネクチンベーススキャフォールド(ＦＢＳ)タンパク質、例えばＦｎ３、例えば、ＰｍＸｎ(Ｐがプロリンであり、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｍが少なくとも１である整数であり、ｎが０または少なくとも１である整数である)からなる部分にＣ末端で結合している^１０Ｆｎ３分子(例えばヒト^１０Ｆｎ３分子)を提供し、ここで、該ＰｍＸｎ部分は、ＦＢＳタンパク質の少なくとも１つの特徴、例えば熱安定性を増強させる。

ヒト^１０Ｆｎ３ドメインの結晶構造(ＰＤＢＩＤ：１ＦＮＡ)および、該構造中で見えるポリペプチドのタンパク質配列を示す。該構造の最後の２残基である、Ｃ末端βストランドＧのすぐ下流の、目的の配列中の「ＥＩ」を黒色の球形で示す。

定義
「アミノ酸残基」は、ペプチド結合の形成の際に水分子が失われた(窒素側からのＨ＋および炭素側からのＯＨ−)後に残っているアミノ酸の部分である。

本明細書において、「^１０Ｆｎ３ドメイン」または「^１０Ｆｎ３部分」または「^１０Ｆｎ３分子」は、野生型の^１０Ｆｎ３およびその生物学的に活性なバリアント、例えば、標的、例えば標的タンパク質に特異的に結合する生物学的に活性なバリアントを指す。野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１〜８に示すアミノ酸配列のうちの１つを含んでいてよい。野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメインの生物学的に活性なバリアントとしては、配列番号１〜８のいずれかを含む^１０Ｆｎ３ドメインと比較して、少なくとも、または最大で、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０または４５個のアミノ酸変化、すなわち、置換、付加または欠失を含む^１０Ｆｎ３ドメインが挙げられる。野生型^１０Ｆｎ３ドメインの生物学的に活性なバリアントはまた、配列番号１〜８のいずれかを含む^１０Ｆｎ３ドメインと比較して、最大１〜３、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０または１〜４５個のアミノ酸の変化を含んでいてよい。特定の態様において、野生型^１０Ｆｎ３ドメインの生物学的に活性なバリアントは、配列番号１〜８のいずれかを含む^１０Ｆｎ３ドメインと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０または４５個以下のアミノ酸の変化、すなわち、置換、付加または欠失を含む。アミノ酸の変化は、ループ領域内、ストランド内またはＮ末端もしくはＣ末端領域内であってよい。アミノ酸変化を許容する例示的な変性^１０Ｆｎ３アミノ酸配列を、本明細書中で、配列番号９〜１６として記載する。

「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾、または機能を問わず、２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,559,126号明細書に記載されているものを含むことができる。ポリペプチドは種々の標準的な化学的方法のいずれかで修飾することもできる(例えばアミノ酸は保護基で修飾することができ；カルボキシ末端アミノ酸は末端アミド基にすることができ；アミノ末端残基は、例えば親油性を強化するための基などで修飾することができ；または、ポリペプチドを化学的にグリコシル化するか、他の方法で修飾して、安定性またはインビボ半減期を延長することができる)。ポリペプチド修飾は、該ポリペプチドに他の構造、例えば環状化合物または他の分子を結合させることを含んでよく、立体配置(すなわちＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ)が変化している１つ以上のアミノ酸を含有するポリペプチドも含み得る。

本明細書における^１０Ｆｎ３ドメイン(または部分または分子)の「領域」は、ループ(ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ)、βストランド(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ)、Ｎ末端(配列番号１のアミノ酸残基第１番〜第７番に対応)、またはＣ末端(配列番号１のアミノ酸残基第９３番〜第１０１番に対応)のいずれかを指す。

^１０Ｆｎ３ドメイン(または部分)の「ノースポールループ」は、^１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのいずれか１つを指す。

^１０Ｆｎ３ドメイン(または部分)の「サウスポールループ」は、^１０Ｆｎ３ドメインのＡＢ、ＣＤおよびＥＦループのいずれか１つを指す。

「スキャフォールド領域」は、ヒト^１０Ｆｎ３ドメインの任意の非ループ領域を指す。スキャフォールド領域には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧβストランドならびにＮ末端領域(配列番号１の１番目〜７番目の残基に対応するアミノ酸)およびＣ末端領域(配列番号１の９３番目〜９４番目の残基に対応するアミノ酸)が含まれる。

「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、本明細書では、最大のパーセント配列同一性が得られるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、保存的置換をいずれも配列同一性の一部であるとはみなさずに、選択した配列中のアミノ酸残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内にある種々の方法で、例えばBLAST^SM、BLAST^SM-２、ALIGN、ALIGN-２またはMegalign(DNASTAR(登録商標))ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて行うことができる。当業者は、アラインメントを測定するための適当なパラメータを、比較される配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、決定することができる。

本明細書での目的には、アミノ酸配列Ａの、アミノ酸配列Ｂへの、またはアミノ酸配列Ｂとの、またはアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性(これは、所与のアミノ酸配列Ｂに、または所与のアミノ酸配列Ｂと、または所与のアミノ酸配列Ｂに対して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Ａと、言い換えることもできる)は、以下のように算出される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
(ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラム、例えばBLAST^SM、BLAST^SM-２、ALIGN、ALIGN-２またはMegalign(DNASTAR(登録商標))が、そのプログラムによるＡとＢのアラインメントにおいて、完全一致(identical match)とスコアリングしたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性が、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくなくなることは、理解されるであろう。

本明細書において、ポリペプチドのアミノ酸残基は、(１)該残基の側鎖または主鎖の非水素原子のいずれかが、複合体の実験的に決定された三次元構造に基づいて、結合標的の任意の原子から５オングストローム以内に見いだされ、かつ／または(２)該残基を、野生型^１０Ｆｎ３(例えば配列番号１)におけるその等価物、アラニン、または問題の残基と類似するサイズの側鎖または問題の残基より小さい側鎖を有する残基に変異させることにより、標的に対する平衡解離定数の測定値が上昇(例えばｋ_ｏｎの上昇)する場合、標的の「結合に寄与する」とみなす。

ポリペプチドの血清または血漿「半減期」は、一般に、該ポリペプチドの血清中濃度が、インビボで、例えばポリペプチドの分解および／または自然の機序によるポリペプチドのクリアランスもしくは隔離などによって、５０％減少するのに要する時間と定義することができる。半減期は、例えば薬物動態分析によるなど、自体公知の任意の方法で決定し得る。好適な技術は当業者には明らかであるが、例えば一般的には、霊長類に適切な用量のポリペプチドを投与する工程；前記霊長類から血液試料または他の試料を定期的な間隔で採取する工程；前記血液試料中のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのように得たデータ(のプロット)から、ポリペプチドのレベルまたは濃度が投薬時の初期レベルと比較して５０％低減するまでの時間を算出する工程を伴い得る。半減期を決定するための方法は、例えば、Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists (1986); Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996); およびGibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, Second Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)に見出すことができる。

血清半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積(ＡＵＣ)などのパラメータを使って表現することができる。「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、これらのパラメータのいずれか２つ、またはこれら３つのパラメータの全ての上昇を指す。特定の実施形態において、半減期の増大は、ｔ１／２−βの増大を指し、ｔ１／２−αおよび／もしくはＡＵＣまたはその両者の増大を伴う場合も、伴わない場合もある。

医薬品、例えばＦＢＳ部分およびＨＳＡ部分を含むタンパク質の「有効期間」は、該製品が、分解を起こさずに保存されている時間の長さである。例えば、有効期間は、該製品の０.１％、０.５％、１％、５％または１０％が分解する時間と定義し得る。

概要
本明細書では、標的に特異的に結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールド(ＦＢＳ)ドメイン、例えば^１０Ｆｎ３分子のようなＦｎ３を含むタンパク質を提供し、該ＦＢＳドメインは、ＰｍＸｎ(Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは０または少なくとも１である整数であり、ｍは少なくとも１である整数である)からなる領域にＣ末端で結合している。本願は、少なくとも一部には、プロリンおよび、所望により１つ以上のアミノ酸を、^１０Ｆｎ３分子のＣ末端に付加することにより、該^１０Ｆｎ３分子の少なくとも１つの特徴、例えば熱安定性または溶解度が、非修飾^１０Ｆｎ３分子と比較して向上することに基づく。

本明細書に記載する^１０Ｆｎ３分子は、任意の目的の標的に結合するように設計し得る。例示的な態様では、標的は、抗原、ポリペプチドまたは目的の治療用タンパク質標的である。治療上望ましい標的の例としては、腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ−α)、ＶＥＧＦＲ２、ＰＣＳＫ９、ＩＬ−２３、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒが挙げられる。

フィブロネクチンベースのスキャフォールド
本明細書において、「フィブロネクチンベースのスキャフォールド」または「ＦＢＳ」タンパク質または部分は、フィブロネクチンタイプＩＩＩ(「Ｆｎ３」)リピートに基づくタンパク質または部分を指す。Ｆｎ３は、免疫グロブリン(Ｉｇ)フォールド(すなわち、７つのβストランドおよび６つのループからなる、Ｉｇ様βサンドウィッチ構造)を有する小さい(約１０kDa)ドメインである。フィブロネクチンは１８個のＦｎ３リピートを有し、該リピート間の配列相同性は低いが、それらは全て三次構造において高い類似性を示す。Ｆｎ３ドメインはまた、フィブロネクチンの他の多くのタンパク質、例えば接着分子、細胞表面分子、例えばサイトカイン受容体および糖結合ドメインにも存在する。概説としては、Bork et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(19):8990-8994 (1992); Bork et al., J. Mol. Biol., 242(4):309-320 (1994); Campbell et al., Structure, 2(5):333-337 (1994); Harpez et al., J. Mol. Biol., 238(4):528-539 (1994))を参照のこと。「ＦＢＳ」タンパク質または部分という語は、これらの他のタンパク質(すなわち非フィブロネクチン分子)由来のＦｎ３ドメインに基づくスキャフォールドを含むことを意図している。

Ｆｎ３ドメインは、小さく、単量体であり、溶解性かつ安定である。該ドメインはジスルフィド結合を欠くため、還元条件下で安定である。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、βまたはβ様ストランドＡ；ループＡＢ；βまたはβ様ストランドＢ；ループＢＣ；βまたはβ様ストランドＣ；ループＣＤ；βまたはβ様ストランドＤ；ループＤＥ；βまたはβ様ストランドＥ；ループＥＦ；βまたはβ様ストランドＦ；ループＦＧ；およびβまたはβ様ストランドＧを含む。７本の逆平行βストランドが２つのβシートとして配置され、それが安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループから構成される２つの「面」を作り出している。ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦが一つの面(「サウスポール」)に位置し、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧが反対の面(「ノースポール」)上に位置する。

Ｆｎ３分子中のループは、構造的に、抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)と類似しており、変更がある場合は、Ｆｎ３分子の標的、例えば標的タンパク質への結合に関与していてよい。Ｆｎ３分子の他の領域、例えばβまたはβ様ストランドおよびＮ末端またはＣ末端領域もまた、変更がある場合、標的への結合に関与していてよい。ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループのいずれかまたは全てが、標的への結合に関与していてよい。任意のβストランドまたはβ様ストランドが、標的への結合に関与していてよい。Ｆｎ３ドメインはまた、１つ以上のループまたは１つ以上のβストランドまたはβ様ストランドを介して標的に結合してよい。結合には、Ｎ末端またはＣ末端領域が必要であってもよい。タンパク質で用いるためのＦＢＳドメインは、全てのループ、全てのβストランドまたはβ様ストランドおよび／またはそれらの一部のみを含んでいてよく、ここで、ＦＢＳドメインが標的に特異的に結合するのが好ましい場合、特定のループおよび／または特定のβストランドもしくはβ様ストランドおよび／またはＮまたはＣ末端領域は修飾(または変更)されている。例えば、ＦＢＳドメインは、１、２、３、４、５または６個のループ、１、２、３、４、５、６、７または８個のβストランドを含んでいてよく、場合によって、Ｎ末端および／またはＣ末端領域を含んでいてよく、ここで、１つ以上のループ、１つ以上のβストランド、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領域は、野生型のＦＢＳドメインと比較して修飾されている。

例示的な態様において、本明細書に記載する、リガンド(または標的)結合性のＦＢＳ部分は、１０番目のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、すなわち、Ｆｎ３の１０番目のモジュール(^１０Ｆｎ３)に基づくものである。野生型ヒト^１０Ｆｎ３部分のアミノ酸配列は次の通りである:
(ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループに下線を付し; ＢＣ、ＦＧおよびＤＥループは太字で強調しており;βストランドは、各ループ領域の間または各ループ領域に隣接して位置し; Ｎ末端領域は斜体で示す)。配列番号１の最後の２つのアミノ酸残基は、Ｃ末端領域の一部である。

野生型ヒト^１０Ｆｎ３分子はまた、Ｎ末端領域またはその一部を欠失しているものを含む。例えば、野生型^１０Ｆｎ３分子は、１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目または１〜７番目のアミノ酸残基が欠失している配列番号１を含んでいてよい(それぞれ配列番号２〜８)。表１は、これらの野生型ヒト^１０Ｆｎ３部分のアミノ酸配列を示す:

いくつかの態様において、ＡＢループは配列番号１の１４番目〜第１７番目の残基に対応し、ＢＣループが２３番目〜３１番目の残基に対応し、ＣＤループが３７番目〜４７番目の残基に対応し、ＤＥループが５１番目〜５６番目の残基に対応し、ＥＦループが６３番目〜６７番目の残基に対応し、ＦＧループが７５番目〜８７番目の残基に対応する。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは分子の一面(すなわち「ノースポール」)に沿って並び、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループは、分子の反対の面(すなわち「サウスポール」)に沿って並ぶ。配列番号１において、βストランドＡは８番目〜１３番目の残基に対応し、βストランドＢは１８番目〜２２番目の残基に対応し、βストランドＣは３２番目〜３６番目の残基に対応し、βストランドＤは４８番目〜５０番目の残基に対応し、βストランドＥは５７番目〜６２番目の残基に対応し、βストランドＦは６８番目〜７４番目の残基に対応し、βストランドＧは８８番目〜９２番目の残基に対応する。例えば、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ等の形成において、ストランドＡとストランドＢが、ループＡＢを介して結合しているように、βストランドは、対応するループによって互いに結合している。

ヒト^１０Ｆｎ３ドメインに基づくＦＢＳタンパク質の例は、アドネクチン(Adnexus、Bristol-Myers Squibbの全額出資子会社)である。アドネクチンは、^１０Ｆｎ３ドメインのＣＤＲ様ループ領域、βストランド、Ｎ末端および／またはＣ末端領域が、所望の化合物に結合できるタンパク質を得るために修飾されている、^１０Ｆｎ３分子である。例えば、米国特許第7,115,396号明細書は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化によって、高親和性ＴＮＦα結合剤となっている^１０Ｆｎ３ドメインタンパク質を記載している。米国特許第７,８５８,７３９号明細書は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化により、高親和性ＶＥＧＦＲ２結合剤となっているＦｎ３ドメインタンパク質を記載している。

特定の態様において、ＦＢＳ部分は、一般的に、次の変性配列により定義される:
か、または、それぞれＮ末端のアミノ酸を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個欠失する点を除いて配列番号９と同一である配列番号１０〜１６の群から選択される配列により定義される^１０Ｆｎ３部分を含む。表２は、これらの変性ヒト^１０Ｆｎ３分子のアミノ酸配列を示す。

配列番号２５〜３２および５０において、ＡＢループは(Ｘ)_ｕによって表され、ＢＣループは(Ｘ)_ｖによって表され、ＣＤループは(Ｘ)_ｗによって表され、ＤＥループは(Ｘ)_ｘによって表され、ＥＦループは(Ｘ)_ｙによって表され、ＦＧループはＸ_ｚによって表される。Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付き文字はアミノ酸の数の整数を表す。特に、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７、または６〜７アミノ酸のいずれであってもよい。βストランドの配列(配列番号９における下線部)は、配列番号９〜１６に示す対応するアミノ酸との比較で、７つ全てのスキャフォールド領域にわたって、０個〜１０個、０個〜８個、０個〜６個、０個〜５個、０個〜４個、０個〜３個、０個〜２個、または０個〜１個のいずれかの置換、欠失または付加を有し得る。いくつかの態様において、βストランドの配列は、配列番号９〜１６に示す対応するアミノ酸との比較で、７つ全てのスキャフォールド領域にわたって、０個〜１０個、０個〜８個、０個〜６個、０個〜５個、０個〜４個、０個〜３個、０個〜２個、または０個〜１個のいずれかの置換、例えば保存的置換を有し得る。

特定の実施形態では、疎水性コアアミノ酸残基(上記配列番号９における太字の残基)が固定され、置換、保存的置換、欠失または付加はいずれも、疎水性コアアミノ酸残基以外の残基で起こる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に提供するポリペプチドの疎水性コア残基は、野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(例えば配列番号１)との比較で、修飾されていない。

いくつかの態様において、ＦＢＳ部分は^１０Ｆｎ３ドメインを含み、該^１０Ｆｎ３ドメインは、ループＡＢ；ループＢＣ；ループＣＤ；ループＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み、野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメインの対応するループ配列と比較して、アミノ酸配列が変化しているループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する。いくつかの態様において、単一のループが変化している。いくつかの態様において、最大で２つのループが変化している。いくつかの態様において、最大で３つのループが変化している。いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよび／またはＦＧループが変化している。特定の態様において、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループが変化している。特定の態様において、該ＦＧループのみが、変化しているループである。特定の態様において、ＣＤループのみが変化しているループである。他の態様において、ＣＤループおよびＦＧループは共に変化しており、場合によっては、他のループは全く変化していなくてよい。特定の態様において、ＣＤループおよびＥＦループは共に変化しており、場合によっては、他のループは全く変化していなくてよい。いくつかの態様において、１つ以上の特定のスキャフォールドの変化を、１つ以上のループの変化と組み合わせる。「変化する」という語は、鋳型配列(すなわち、対応する野生型ヒトフィブロネクチンドメイン)と比較した、１以上のアミノ酸の変化を意味し、アミノ酸の付加、欠失および置換を含む。変化したループおよび／またはスキャフォールド領域(例えばβストランド、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領域)の特定の組合せを含む例示的な^１０Ｆｎ３分子を本明細書中にさらに記載する。

所望の標的に対して強い親和性を有する^１０Ｆｎ３結合ドメインを得るために、ループ領域の全ての残基が修飾される必要はないということは、理解されるべきである。さらに、ループ領域の挿入および欠失があっても、高親和性^１０Ｆｎ３結合ドメインを作製し得る。

いくつかの態様において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される１つ以上のループを、野生型ヒト^１０Ｆｎ３中の対応するループと比較して長さを延長または短縮してよい。任意の特定のポリペプチドにおいて、１つ以上のループの長さを延長しても、１つ以上のループの長さを低下させても、またはそれらを組み合わせてもよい。いくつかの態様において、特定のループの長さを、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜２５、１０〜２０または１０〜１５アミノ酸延長してよい。いくつかの態様において、特定のループの長さを、１〜１５、１〜１１、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２、２〜１０または２〜５アミノ酸低下させてよい。特に、^１０Ｆｎ３のＦＧループは、１３残基の長さであり、抗体重鎖の対応するループは、４〜２８残基の範囲にある。したがって、標的結合のためのＦＧによって、ポリペプチド中の抗原結合を最適化するために、^１０Ｆｎ３のＦＧループの長さをおよび配列を、可能な限り最大の可動性および標的結合における親和性を得るために変化させてよい。

いくつかの態様において、該ＦＢＳ部分は、非ループ領域が、配列番号１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変化している、^１０Ｆｎ３ドメインを含む。例えば、特定の態様において、該ＡＢループは、最大で４アミノ酸の置換、最大で１０アミノ酸の挿入、最大３アミノ酸の欠失またはその組合せを有していてよく; ＢＣループは、最大１０アミノ酸の置換、最大４アミノ酸の欠失、最大１０アミノ酸の挿入、またはその組合せを有していてよく; ＣＤループは、最大６アミノ酸の置換、最大１０アミノ酸の挿入、最大４アミノ酸の欠失またはその組合せを有していてよく; ＤＥループは最大６アミノ酸の置換、最大４アミノ酸の欠失、最大１３アミノ酸の挿入またはその組合せを有していてよく; ＥＦループは、最大５アミノ酸の置換、最大１０アミノ酸の挿入、最大３アミノ酸の欠失またはその組合せを有していてよく、および／またはＦＧループは最大１２アミノ酸の置換、最大１１アミノ酸の欠失、最大２５アミノ酸の挿入またはその組合せを有していてよい。

いくつかの態様において、ＦＢＳ部分は、配列番号１〜１６を含む配列群から選択されるアミノ酸配列を有するヒト^１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の同一性を示す^１０Ｆｎ３ドメインを含む。特定の態様において、本明細書で提供するＦＢＳ部分は、配列番号１〜１６を含むアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を示す。他の態様において、ＦＢＳ部分は、配列番号１〜１６を含むアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を示す。特定の態様において、ループの１以上は、野生型の配列の対応するループの配列と比較して修飾されていないか、および／または、βストランドの１つ以上は、野生型配列のβストランドに相当する配列と比較して修飾されていないか、および／または、Ｎ末端またはＣ末端領域は修飾されていない。特定の態様において、ＦＢＳ部分の^１０Ｆｎ３ドメインのβストランドまたはβ様ストランドは、それぞれ、配列番号１の対応するβストランドまたはβ様ストランドの配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、実質的に該配列からなるか、または該配列からなる。βストランド領域のバリエーションは、生理学的な条件でポリペプチドの安定性を妨げないものであることが好ましい。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインの非ループ領域を、１つ以上の保存的置換で修飾し得る。^１０Ｆｎ３ドメイン中のアミノ酸の５％、１０％、２０％、さらには３０％またはそれより多くを、リガンドに対する^１０Ｆｎ３のアフィニティを実質的に変化させることなく、保存的置換によって改変してよい。特定の態様において、非ループ領域、例えばβストランドが、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２〜１５、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、５〜１５、または５〜１０個のいずれかの保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的な態様において、スキャフォールド修飾が、リガンドに対する^１０Ｆｎ３結合物質の結合親和性を、１００分の１未満、５０分の１未満、２５分の１未満、１０分の１未満、５分の１未満、または２分の１未満に低減し得る。このような変化は、インビボでの^１０Ｆｎ３の免疫原性を変化させ得るものであり、免疫原性が低下する場合には、そのような変化は望ましいものであり得る。本明細書における「保存的置換」は、対応する対照残基と物理的または機能的に類似する残基である。すなわち、保存的置換とその対照残基とは、類似するサイズ、形状、電荷、化学的性質、例えば、共有結合または水素結合を形成する能力を含む、を有する。例示的な保存的置換としては、Dayhoee et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352 (1978 & Supp.)に記載の、許容される点突然変異について定義された基準を満たすものが挙げられる。保存的置換の例としては、以下の群に含まれる置換が挙げられる：(ａ)バリン、グリシン；(ｂ)グリシン、アラニン；(ｃ)バリン、イソロイシン、ロイシン；(ｄ)アスパラギン酸、グルタミン酸；(ｅ)アスパラギン、グルタミン；(ｆ)セリン、スレオニン；(ｇ)リジン、アルギニン、メチオニン；および(ｈ)フェニルアラニン、チロシン。

本明細書において、また、ループ修飾とスキャフォールド修飾との組み合わせを有する^１０Ｆｎ３ドメインを提供する。結合体は、(ｉ)ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、またはＦＧの少なくとも１つのアミノ酸配列中の修飾と、(ｉｉ)少なくとも１つのスキャフォールド領域のアミノ酸配列中の修飾(すなわち、少なくとも１つのβストランド、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端領域中の修飾)とを含み、修飾ループと修飾スキャフォールド領域とがともに、同一標的への結合に寄与する、^１０Ｆｎ３ドメインを含んでいてよい。例示的な態様において、スキャフォールド領域修飾がループ領域中の修飾に隣接して位置する。例えば、ＡＢループが修飾されている場合、スキャフォールド変異は、^１０Ｆｎ３ドメインの直鎖配列においてＡＢループに隣接するβストランドＡおよび／またはβストランドＢ中に位置する傾向があり得る。他の態様において、修飾のクラスターを、^１０Ｆｎ３ドメインの直鎖配列において互いに隣接するループ領域およびスキャフォールド領域中に、共に見出すことができる。例えば、ループ修飾とスキャフォールド修飾の両方を有する^１０Ｆｎ３結合物質は、Ｆｎ３ドメインの直鎖配列において互いに隣接する次の組み合わせのループ領域とスキャフォールド領域に、アミノ酸修飾のクラスターを有し得る：βストランド／ループ／βストランド、ループ／βストランド／ループ、ループ／βストランド／ループ／βストランド、末端領域／βストランド／ループ、またはループ／βストランド／末端領域など。例えば、ループ修飾とスキャフォールド修飾との新規な組み合わせを有するＦｎ３ドメインは、２０個の連続したアミノ酸の区間においてｍ該アミノ酸のうちの少なくとも１５個が野生型と比較して修飾されているような、修飾クラスターを有し得る。他の態様において、連続的な区間において、２０残基のうちの少なくとも１７残基、２０残基のうちの少なくとも１８残基、２５残基のうちの少なくとも１７残基、２５残基のうちの少なくとも２０残基、または３０残基のうちの少なくとも２５残基が、対応するアミノ酸の区間における野生型Ｆｎ３ドメイン配列と比較して修飾されている。特定の態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、無修飾(すなわち野生型)配列の区分によって分離された、２つまたは３つの修飾クラスターを有し得る。修飾されるいずれの領域(すなわちループ、βストランドまたは末端領域)についても、その領域の全体または一部分だけが、野生型配列と比較して、修飾されていてよい。βストランド領域が修飾される場合、疎水性コア残基は無修飾(すなわち、野生型)のままであり、βストランド中の非コア残基の１つ以上が修飾されているのが好ましい。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、分子の「ウエストサイド」に沿った結合面を含む(「ウエストサイド結合物質」または「ＷＳ結合物質」)。ＷＳ結合物質は、配列番号１に示す、対応するＣＤおよびＦＧループ配列と比較して、修飾されたＣＤループおよび修飾されたＦＧループを有する^１０Ｆｎ３ドメインを含み得る。ＣＤループとＦＧループはともに、同一の標的への結合に寄与する。特定の態様において、ＷＳ結合物質は、Ｆｎ３ドメイン内の１つ以上の領域にさらに修飾を含み得る。例えば、ＷＳ結合物質は、ＣＤおよび／またはＦＧループに隣接するβストランド領域の１つ以上に、スキャフォールド修飾を含み得る。特に、ＷＳ結合物質は、βストランドＣ、βストランドＤ、βストランドＦ、および／またはβストランドＧの１つ以上に配列修飾を含み得る。例示的スキャフォールド修飾としては、配列番号１のアミノ酸位置：３３、３５、４９、６９、７１、７３、８９および／または９１に対応する１つ以上のスキャフォールド領域位置における修飾が挙げられる。ＷＳ結合物質は、ＢＣループ、特にＢＣループのＣ末端側部分にも、修飾を含み得る。一の態様において、ＢＣループの最後の２残基(すなわち、野生型^１０Ｆｎ３ドメイン中のアミノ酸３０および３１に対応する残基)が、野生型配列との比較で、修飾されている。追加のループ修飾およびスキャフォールド修飾の全部または一部が、修飾ＣＤループおよび修飾ＦＧループとの組合せで、標的への結合に寄与し得る。疎水性コア残基は、野生型配列と比較して、修飾されていないことが好ましい。

例示的なＷＳ結合剤としては、３０、３１、３３、３５、３７、３８、４６、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、８４、８５、８６、８７、８９または９１の位置に、野生型または変異したアミノ酸を有するものが挙げられる。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、ＣＤループ、ＤＥループ、そして場合によってはＥＦループに修飾を含み、ループ修飾は全て標的結合に寄与する。これらのポリペプチドを「フロント結合物質」と呼ぶ。フロント結合物質はさらに、１つ以上のスキャフォールド領域、特に修飾ループ領域に隣接または近接するスキャフォールド領域にも、修飾を含み得る。例えば、フロント結合物質は、野生型Ｆｎ３ドメイン、例えばヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)の対応するβストランドの配列と比較して、βストランドＣ、βストランドＤ、および／またはβストランドＥの１つ以上にスキャフォールド修飾を含み得る。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列と比較して、修飾されていない。フロント結合物質中に存在し得る例示的なスキャフォールド修飾としては、配列番号１のアミノ酸位置３６、４９、５８および／または５０に対応する１つ以上の位置における修飾が挙げられる。そのようなスキャフォールド修飾は、修飾ループと共に、標的の結合に寄与し得る。特定の態様において、フロント結合物質は、Ｆｎ３、例えば^１０Ｆｎ３ドメインの数個のループ領域とストランド領域とにまたがる修飾のクラスターを含み得る。特に、フロント結合物質は、野生型Ｆｎ３、例えばヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)の残基３６〜６６に対応するアミノ酸間の３１残基のうちの、少なくとも１５、２０、２４、２５、または２７残基に、修飾を含み得る。ループ修飾および／またはストランド修飾は、アミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入、またはそれらの組み合わせを含み得る。例示的な態様において、ＣＤループは、Ｆｎ３、例えば野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)のＣＤループと比較して、長さが延長されているか、または短縮されている。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、ＥＦおよびＦＧループに修飾を含み、それらのループ修飾は同一の標的への結合に寄与する。これらのポリペプチドを本明細書では「バック結合物質」と称する。バック結合物質は、他のループ領域および／またはスキャフォールド領域にさらなる修飾を含み得る。例えば、バック結合物質は、ＡＢループの少なくとも一部分、好ましくはＡＢループのＮ末端側部分に、修飾を含み得る。例示的な態様において、ＡＢループの最初の２アミノ酸(すなわち、野生型^１０Ｆｎ３ドメインのアミノ酸残基１４および１５に対応)が、野生型配列と比較して、修飾されている。特定の態様において、バック結合物質は、１つ以上のスキャフォールド修飾、特に修飾ループ領域に隣接する１つ以上のスキャフォールド領域中に修飾を含み得る。例えば、バック結合物質は、βストランドＡ、βストランドＧ、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端領域の１つに、１つ以上の修飾を含有し得る。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列と比較して、修飾されていない。例示的なスキャフォールド修飾としては、配列番号１または６のアミノ酸位置１〜７、９〜１３、８９、９１、９３および／または９４に対応する１つ以上の位置における修飾が挙げられる。追加のループ修飾および／またはスキャフォールド修飾の１つ以上は、修飾ＥＦおよびＦＧループと共に、ターゲットへの結合に寄与し得る。好適なループ領域および／またはスキャフォールド領域の修飾としては、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一定の実施形態では、ＦＧループのアミノ酸配列が、野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)のＦＧループと比較して、長さが延長されているか、または短縮されている。

特定の態様において、バック結合物質は、^１０Ｆｎ３ドメイン中の数個の領域の連続スパンにわたって、修飾アミノ酸残基のクラスターを含み得る。例えば、Ｆｎ３、例えば^１０Ｆｎ３ドメインの最初の１５アミノ酸残基のうちの少なくとも１４残基は、野生型Ｆｎ３、例えばヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１)中の対応する残基と比較して、修飾されていてもよく、かつ／または野生型、Ｆｎ３、例えばヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１または２３)の残基８０〜９７(または９４)に対応するアミノ酸の１８残基の少なくとも１５残基は、野生型配列中の対応する残基と比較して修飾されていてもよい。^１０Ｆｎ３分子において、９４番目よりもさらにＣ末端側の位置のアミノ酸について言及するときは、^１０Ｆｎ３分子は、Ｆｎ３ドメインの１０番目と１１番目のリピートの間の可動性のリンカー、すなわちEIDKPSQを含むため、１０１アミノ酸の長さのタンパク質を形成する状態にある(したがって、Ｃ末端でEIDKPSQに結合している配列番号１を配列番号２３により表す)。

一定の実施形態において、^１０Ｆｎ３ドメインは、野生型配列の対応する領域の配列との比較で、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＥ、ループＥＦ、およびβストランドＦのアミノ酸配列に修飾を含む。これらのポリペプチドを本明細書では「サウスポール結合物質」または「ＳＰ結合物質」と称する。修飾ループおよび修飾ストランドは、同一標的への結合に寄与する。ＣＤループのアミノ酸配列は、野生型Ｆｎ３、例えばヒト^１０Ｆｎ３ドメイン(配列番号１または２３)のＣＤループと比較して、長さが延長されていても、または長さが短縮されていてもよい。サウスポール結合物質は、野生型配列の対応する領域の配列と比較して、βストランドＧおよび／またはＣ末端領域にさらに修飾を含み得る。例示的な態様において、サウスポール結合物質は、野生型配列の位置１１、１２、１９、６０、６１、６９、９１、９３および９５〜９７に対応するアミノ酸に、１つ以上の修飾を含み得る。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１または２３に示す、対応するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列と比較して修飾されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループならびに、βストランドＣ、βストランドＤ、βストランドＦおよびβストランドＧストランド残基の１つ以上のさらなる修飾を含む。βストランド領域修飾とループ領域の修飾は共に標的への結合に寄与する。これらのタンパク質を本明細書では「ノースウエスト結合物質」または「ＮＷ結合物質」と称する。例示的な態様において、ＮＷ結合物質は、配列番号１または２３のスキャフォールド領域位置Ｒ３３、Ｔ４９、Ｙ７３およびＳ８９に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたはその組み合わせに、１つ以上のスキャフォールド修飾を含む。ループ領域およびスキャフォールド領域中の好適な修飾には、アミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入、またはそれらの組み合わせが含まれる。一の態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの１つ以上は、野生型配列と比較して、長さが延長されているか、または短縮されているか、またはその組み合わせである。特定の態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのそれぞれは、野生型配列(例えば配列番号１または２３)と比較して、長さが延長されているか、短縮されているか、またはその組み合わせである。特定の態様において、ＢＣループの一部分のみ、特にＣ末端部分のみが、野生型配列と比較して修飾されている。例えば、ＢＣループは、野生型ＢＣループのアミノ酸２７〜３１に対応するアミノ酸残基のみが修飾されていて、ＢＣループの残りの部分(すなわち、野生型ループの残基２３〜２６に対応する部分)が無修飾のままであってもよい。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、修飾ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループと、Ｎ末端領域、βストランドＡ、βストランドＢおよび／またはβストランドＥのいずれか１つまたはその組み合わせに１つ以上の追加の修飾とを含む。これらのタンパク質を本明細書では「ノースイースト結合物質」または「ＮＥ結合物質」と呼ぶ。例示的実施形態において、ＮＥ結合物質は、野生型配列(配列番号１または２３)のスキャフォールド領域位置１〜７、Ｅ９、Ｌ１９、Ｓ２１および／またはＴ５８に対応するアミノ酸のいずれか１つまたはその組み合わせが修飾されている。修飾ループ領域および修飾スキャフォールド領域の組み合わせがターゲットへの結合に寄与する。

いくつかの態様において、^１０Ｆｎ３ドメインは、ＡＢ、ＣＤ、ＤＥおよびＥＦループの１つ以上の中の修飾および、βストランドＢ、βストランドＤおよび／またはβストランドＥの１つ以上におけるさらなる修飾を含む。これらのタンパク質を本明細書では「サウスフロント結合物質」と称する。修飾ループ残基と修飾ストランド残基の組み合わせが、標的への結合に寄与する。例示的な態様において、サウスフロント結合物質は、配列番号１または２３のスキャフォールド領域位置Ｌ１９、Ｔ４９、Ｔ５８、Ｓ６０、および／またはＧ６１に対応する１つ以上のアミノ酸位置および／または配列番号１または２３のループ領域位置Ｔ１４〜Ｓ１７、Ｐ５１、Ｔ５６、Ｇ４０〜Ｅ４７、および／またはＫ６３〜Ｇ６５に対応する１つ以上のアミノ酸位置が、修飾され得る。例示的な態様において、サウスフロント結合物質は、野生型配列の残基１８および２０に対応するアミノ酸間のＡＢループおよび／またはＣＤループにおいて、長さが延長されているか、または短縮されていてもよい。

いくつかの実施形態において、^１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１または２３の対応するストランドと比較して修飾されたβストランドＡおよびβストランドＧを含む。これらのタンパク質を本明細書では「ＡＧ結合物質」または「ＡＧストランド」結合物質という。一定の実施形態では、ＡＧストランド結合物質が、Ｆｎ３、例えば^１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端およびＣ末端部分に修飾のクラスターを含み、一方、Ｆｎ３の中央部分は無修飾のままである。例えば、ＡＧストランド結合物質は、^１０Ｆｎ３ドメインの最初の１９アミノ酸(すなわち、配列番号１または２３のアミノ酸位置１〜１９に対応するもの)のうちの１９アミノ酸中１６アミノ酸における修飾、および^１０Ｆｎ３ドメインの最後の１８アミノ酸(すなわち、配列番号９のアミノ酸位置８４〜１０１に対応するもの)のうちの１８アミノ酸中１３〜１７アミノ酸または^１０Ｆｎ３ドメインの最後の２２アミノ酸(すなわち、配列番号９のアミノ酸位置８０〜１０１に対応するもの)のうちの２２アミノ酸中１４〜１８アミノ酸における修飾を含み得る。例示的実施形態において、ＡＧ結合物質は、配列番号９の位置１〜７、９、１１〜１７、１９、８４〜８９および９１〜９７に対応する１つ以上の位置に修飾を含み得る。好ましくは、ＡＧ結合物質中の修飾領域は、同じターゲットへの結合に寄与する。

いくつかの実施形態において、^１０Ｆｎ３ドメインは、修飾されたＣＤおよびＥＦループと、配列番号１または２３の位置６９または９１〜９７に対応する残基のいずれか１つまたはその組み合わせにおける追加の修飾とを含む。これらのタンパク質を本明細書では「サウスウエスト結合物質」または「ＳＷ結合物質」と呼ぶ。修飾ループ領域と修飾スキャフォールド領域は、ターゲットへの結合に寄与する。

特定の態様において、タンパク質は、ＢＣループの一部が野生型のままである、免疫原性が低下した^１０Ｆｎ３ドメインを含む。好ましくは、該ポリペプチドは、ＢＣループの大部分に修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、免疫原性が低いことが好ましい。例示的な態様において、ＢＣループのＮ末端部分は野生型のままである。例えば、ＢＣループの最初のまたは１、２、３、４、５もしくは５残基が野生型のままであり、ＢＣループの残りのＣ末端残基が修飾されていてよい。ＢＣループのＮ末端領域の少なくとも一部が野生型であるＦｎ３デザインにおいて、ＢＣループに隣接している、βストランドＢおよび／またはβストランドＣの全体または一部(すなわち、βストランドＢのＣ末端領域および／またはβストランドＣのＮ末端領域)を、野生型配列と比較して非修飾状態にすることが望ましい場合もある。例示的な態様において、ＢＣループのＮ末端領域に野生型配列を有し、免疫原性が低下しているＦｎ３ドメインは、Ｎ末端領域、βストランドＡ、ＡＢループ、およびβストランドＢに全く修飾を有していなくてよい。ＢＣループの一部を野生型として有するＦｎ３設計において、ＢＣループの修飾されている部分が、^１０Ｆｎ３ドメインの他の領域の修飾とともに、標的結合に寄与していてもよい。

特定の態様において、タンパク質は、免疫原性が低下した^１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここで、βストランドＢ/ＢＣループ/βストランドＣ中の強力なＨＬＡアンカー(「ＢＣアンカー」)は、除去または破壊されている(例えば、１以上のＨＬＡ配列への結合親和性を低下させる方法により、野生型配列と比較して修飾されている)。例えば、ＢＣアンカーは、Ｆｎ３、例えば^１０Ｆｎ３のドメインを、配列番号１のL１９、S２１、R３３および／またはT３５に対応する１つ以上の位置で修飾することにより除去または破壊し得る。ＢＣアンカーを除去または破壊したとき、ＢＣ領域の潜在的な免疫原性を有意に上昇させることなく、ＢＣループの配列を修飾することが可能である。したがって、該Ｆｎ３設計の多くは、βストランドＢおよび／またはβストランドＣにおける修飾に加えて、ＢＣループに修飾を有する。ＢＣループは、場合によってはＦｎ３ドメインの他の領域中の修飾と組み合わせて、標的結合に寄与し得る。βストランドＢおよび／またはβストランドＣにおける修飾は、標的結合に寄与してもしなくてもよい。

例示的な態様において、ＦＢＳ部分、例えば^１０Ｆｎ３ドメインは、所望の標的に、５００nM未満、１００nM未満、５０nM未満、１０nM未満、５nM未満、１nM未満、５００pM未満または１００pM未満のＫ_ｄで結合する。いくつかの態様において、ＦＢＳ部分、例えば^１０Ｆｎ３ドメインは、所望の標的に、１pM〜１μM、１００pM〜５００nM、１nM〜５００nMまたは１nM〜１００nMのＫ_ｄで結合する。例示的な態様において、^１０Ｆｎ３部は、野生型^１０Ｆｎ３ドメイン、特に、例えば配列番号１〜８を有する野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメインが結合しない標的に特異的に結合する。

特定の態様において、ＦＢＳ部分は、配列番号１〜１６からなる配列群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＦＢＳ部分は標的に特異的、例えば５００nM未満、１００nM未満、５０nM未満、１０nM未満、５nM未満、１nM未満、５００pM未満、１００pM未満、またはそれより小さいＫ_ｄで結合する。該ＦＢＳ部分は、１以上のループおよび１以上のスキャホールド領域にアミノ酸の変化(または変更)を含んでいてよい。

いくつかの態様において、インテグリン結合モチーフの「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」(ＲＧＤ)(配列番号１の第７８番〜第８０番のアミノ酸)の１つ以上の残基が、インテグリン結合を妨げるために置換されていてよい。いくつかの態様において、本明細書で提供するポリペプチドのＦＧループは、ＲＧＤインテグリン結合部位を含まない。一の態様において、該ＲＧＤ配列は、(Ｎ末端からＣ末端の方向で)極性アミノ酸−中性アミノ酸−産生アミノ酸配列により置換されている。特定の態様において、該ＲＧＤ配列は、ＳＧＥまたはＲＧＥで置換されている。

いくつかの態様において、ＦＢＳ部分のＮ末端および／またはＣ末端領域のアミノ酸配列は、^１０Ｆｎ３ドメインの相当する領域、例えば配列番号１と比較して、欠失、置換または挿入により修飾されている。

特定の態様において、配列番号１の最初の１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸配列は、配列番号１を有する野生型ヒト^１０Ｆｎ３ドメインの相当するアミノ酸配列と比較して、本明細書で提供するポリペプチドにおいて修飾または欠失していてよい。例示的な態様において、配列番号１〜１６のいずれかの１〜７、８または９個のアミノ酸に相当するアミノ酸は、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸の長さの代替Ｎ末端領域で置換されている。例示的な代替となるN末端領域としては(アミノ酸一文字表記で表す)M、MG、G、MGVSDVPRDL(配列番号２４)およびGVSDVPRDL(配列番号２５)または配列番号２４または２５のいずれかのＮ末端短縮型が挙げられる。他の適当な代替となるＮ末端領域としては、例えば、X_nSDVPRDL(配列番号２６)、X_nDVPRDL(配列番号２７)、X_nVPRDL(配列番号２８)、X_nPRDL(配列番号２９)、X_nRDL(配列番号３０)、X_nDL(配列番号３１)またはX_nL(n＝０、１または２個のアミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、n＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである)が挙げられる。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列を、^１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に付加する場合、Ｍは通常切断され、ＧがＮ末端に残る。他の態様において、代替となるＮ末端領域は、アミノ酸配列MASTSG(配列番号３２)を含む。

本明細書にさらに記載するように、いくつかの態様において、配列番号１の最初の７個または８個の残基(即ち第１〜７番または第１〜８番の残基)を欠失し、例えば配列番号８のアミノ酸配列を有する^１０Ｆｎ３ドメインを作製する。付加的な配列を、配列番号１〜１６のいずれかのアミノ酸配列を有する^１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端またはＣ末端に付加してもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｎ末端の延長部分は、Ｍ、ＭＧおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。例えば、配列番号１〜１６のいずれかの前に、Ｍ、ＭＧまたはＧがあってよい。

特定の態様において、ＦＢＳ部分は、フィブロネクチン、例えばヒトフィブロネクチンのタイプＩＩＩドメインの１０番目のリピート以外のＦｎ３リピートに基づいていてよい。例えば、ＦＢＳ部分は、他のフィブロネクチンタイプＩＩＩリピート、例えば１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目および１８番目のＦｎ３リピートのいずれかに類似していてよい。さらに他の態様において、ＦＢＳ部分は、フィブロネクチン以外の分子由来であってよい。例示的なＦＢＳ部は、フィブロネクチン中で見られるものと互いに類似した配列を有する、１５個のＦｎ３ドメインから構成されるタンパク質である、テネイシン由来であってよい。これらのリピートは、例えば、Jacobs et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25:107 (2012)に記載されている。フィブロネクチン分子およびテネイシン分子のリピートの相同性に基づいて、これらの相同性に基づく人工分子を作製した。フィブロネクチン分子のドメインの相同性に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含むタンパク質をFibconおよびFibconB(国際公開第２０１０/０９３６２７号およびJacobs et al. (2012)、上掲)と称し、テネイシン分子のドメインの相同性に基づくものをTenconと称する。例示的なFibconアミノ酸配列は、次のアミノ酸配列を含む:
(ループＡＢはアミノ酸１３〜１６(TPSS; 配列番号３４)からなり、ループＢＣは、アミノ酸２２〜２８(TPPRVQI; 配列番号３５)からなり、ループＣＤは、アミノ酸３８〜４３(VGSDGR; 配列番号３６)からなり、ループＤＥはアミノ酸５１〜５４(PSVS; 配列番号３７)からなり、ループＥＦはアミノ酸６０〜６４(GLKPG; 配列番号３８)からなり、ループＦＧはアミノ酸７５〜８１(KDNQESEP; 配列番号３９)からなる。他のFibconアミノ酸配列は、次のアミノ酸配列:
を含む。

テネイシン由来のＦｎ３タンパク質としては、Tencons(国際公開第2010/051274号、国際公開第2010/051310号および国際公開第2011/137319号、当該文献は、引用により具体的に本明細書中に包含される)。例示的なTenconタンパク質は次のアミノ酸配列を有する:
(ループＡＢは、アミノ酸１３〜１６(TEDS; 配列番号４２)からなり、ループＢＣは、アミノ酸２２〜２８(TAPDAAF; 配列番号４３)からなり、ループＣＤは、アミノ酸３８〜４３(SEKVGE; 配列番号４４)からなり、ループＤＥはアミノ酸５１〜５４(GSER; 配列番号４５)からなり、ループＥＦはアミノ酸６０〜６４(GLKPG; 配列番号４６)からなり、ループＦＧはアミノ酸７５〜８１(KGGHRSN; 配列番号４７)からなる。

Fibcon、FibconBまたはTencon部分またはその標的結合性バリアントは、それ自体によって、または異種性部分に結合するかのいずれかによって、本明細書に記載するように融合することができる。他のタンパク質由来のＦｎ３ドメイン、例えば細胞表面ホルモンおよびサイトカインレセプター、シャペロンおよび糖結合ドメインを、本明細書に記載するように結合させてよい。

ＦＢＳタンパク質または部分は、例えば、国際公開第2010/093627号、国際公開第2011/130324号、国際公開第2009/083804号、国際公開第2009/133208号、国際公開第02/04523号、国際公開第2012/016245号、国際公開第2009/023184号、国際公開第2010/051310号、国際公開第2011/020033号、国際公開第2011/051333号、国際公開第2011/051466号、国際公開第2011/092233号、国際公開第2011/100700号、国際公開第2011/130324号、国際公開第2011/130328号、国際公開第2011/137319号、国際公開第2010/051274号、国際公開第2009/086116号、国際公開第09/058379号、国際公開第2013/067029号、国際公開第2012/016245号、国際公開第2014/120891号および国際公開第2014/043344号(これらの文献は全て、参照により、具体的に本明細書に包含される)に記載されており: これらの出版物に記載されているＦＢＳタンパク質または部分は、いずれも、本明細書に記載するように使用してよい。

特定の態様において、タンパク質は、少なくとも２つのＦＢＳ部分を含む。例えば、該タンパク質は、多価のＦＢＳ部分を含む。例えば、多価のＦＢＳは、２個、３個またはそれ以上のＦＢＳ部分、例えば、共有結合している^１０Ｆｎ３ドメインを含んでいてよい。例示的な態様において、該ＦＢＳ部分は、２つの^１０Ｆｎ３ドメインを含む、二重特異性または二量体のタンパク質である。

多価のタンパク質中のＦＢＳ部分、例えば^１０Ｆｎ３ドメインは、ポリペプチドリンカーにより結合していてよい。例示的なポリペプチドリンカーとしては、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。^１０Ｆｎ３ドメインの結合に適当なリンカーは、分離しているドメインが、互いに独立してフォールディングし、標的分子への親和性の高い結合を可能にする三次元構造を可能にするものである。適当なリンカーの具体例としては、グリシン−セリンベースリンカー、グリシン−プロリンベースリンカー、プロリン−アラニンベースリンカーならびに他の任意の本明細書に記載のリンカーが挙げられる。いくつかの態様において、該リンカーは、グリシン−プロリンをベースとするリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０および３〜２０アミノ酸の長さであってよい。該リンカーの例としては、GPG、GPGPGPG(配列番号４８)およびGPGPGPGPGPG(配列番号４９)が挙げられる。いくつかの態様において、該リンカーはプロリン−アラニンベースのリンカーである。これらのリンカーは、プロリンおよびアラニン残基を含み、３〜３０、１０〜３０、３〜２０および６〜１８アミノ酸の長さであってよい。該リンカーの例としては、PAPAPA(配列番号５０)、PAPAPAPAPAPA(配列番号５１) およびPAPAPAPAPAPAPAPAPA(配列番号５２)が挙げられる。いくつかの態様において、該リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０および１０〜２０アミノ酸の長さであってよい。該リンカーの例としては、GSGSGSGSGS((GS)_５; 配列番号５３)、GSGSGSGSGSGS((GS)_６; 配列番号５４)、GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS((GS)_１０; 配列番号５５)、GGGGSGGGGSGGGGS((G₄S)_４; 配列番号５６)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS((G₄S)_５; 配列番号５７)およびGGGGSGGGGSGGGSG(配列番号５８)が挙げられる。例示的な態様において、該リンカーは、Ａｓｐ−Ｌｙｓ(ＤＫ)ペアを全く含まない。

ＰｍＸｎ部分、例えば安定化部分
特定の態様において、ＦＢＳ、例えば^１０Ｆｎ３部分は、ＰｍＸｎ(Pがプロリンである、Xが任意のアミノ酸であり、ｍが少なくとも１である整数であり、nが０または少なくとも１である整数であり、PがＸのN末端側である)からなる部分にＣ末端で連結している。該ＰｍＸｎ部分は、^１０Ｆｎ３部分のＣ末端アミノ酸、例えば(配列番号１の番号付けに基づいて)９４番目のアミノ酸に直接結合していてよい。該ＰｍＸｎ部分は、ペプチド結合を介して、^１０Ｆｎ３部分の９４番目のアミノ酸に結合していてよい。ＰｍＸｎ部分は、配列番号１のアミノ酸配列に相同であるか、または、表１もしくは２に示すアミノ酸配列を含むか、または、実質的に該配列からなるアミノ酸配列を有する^１０Ｆｎ３部分に結合していてよい。配列番号１の末端の単一のプロリンを、「９５Ｐｒｏ」または「Ｐｒｏ９５」または「Ｐ９５」または「９５Ｐ」と称する。

ＰｍＸｎ部分に連結している例示的な^１０Ｆｎ３部分としては:
が挙げられる。

ＰｍＸｎにおいて、ｍは、１、２、３またはそれより大きくてよい。例えば、ｍは、１〜３であるか、または、ｍは、１〜２であってよい。「ｎ」は、０、１、２、３またはそれ以上であってよく、例えば、ｎは、１〜３または１〜２であってよい。

本明細書にさらに記載するように、これらの^１０Ｆｎ３部分を、１以上のループおよび／または１以上のβストランドのアミノ酸配列を修飾することによって、標的に結合(し、ＦＢＳ部分を形成)するように修飾してよい。ＰｍＸｎに連結しているＦＢＳ部分は、「修飾ＦＢＳ部」と称する。したがって、本明細書では、配列番号５９または６０に少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を含むＦＢＳ部分を含むタンパク質であって、ＰｍＸｎを含み、該ＦＢＳが標的に(ＲＧＤドメインを介するのとは異なる方法で)特異的に結合する、タンパク質を提供する。

ＰｍＸｎにおいて、ｎは０であってよく、この場合、該タンパク質のＣ末端アミノ酸は、Ｐｍ、例えばＰである。特定の態様において、ｎは０ではなく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であってよい。例えば、ｎは、０〜１０、０〜５、０〜３、１〜１０、１〜５、１〜３または１〜２であってよい。しかし、１０を超えるアミノ酸が該プロリンに結合していてよい。例えば、タンデムＦＢＳ部分または他のポリペプチドに融合したＦＢＳ部分において、ＦＢＳ部分のＣ末端アミノ酸は、１以上のプロリンに結合していてよく、最後のプロリンは、第二のＦＢＳ部分または、異種性部分に結合している。したがって、特定の態様において、ｎは、０〜１００、０〜２００、０〜３００、０〜４００、０〜５００またはそれ以上の範囲の整数であってよい。

特定の態様において、ＰｍＸｎはシステインを含む。例えば、プロリンの後の最初のアミノ酸はシステインであってよく、該システインは、該分子中の最後のアミノ酸であっても、または、該システインの後に１以上のアミノ酸が続いていてもよい。システインの存在により、異種性部分がＦＢＳ部分、例えば化学部分、例えばＰＥＧに結合することが可能になる。システインを含む例示的なＰｍＸｎ部分としては: ＰｍＣＸｎ(Ｃはシステインである)が挙げられる。他の例は、ＰｍＸｎ_１ＣＸｎ_２(ｎ_１およびｎ_２は独立して０または少なくとも１である整数である)である。例えば、ｎ_１は１であってよく、ｎ_２は１、２、３、４または５であってよい。

例示的なＰｍＸｎ部分としては、表３に記載のものが挙げられる。

任意のＰｍＸｎ部分、例えば表３に記載のものの後に、ヒスチジンテイル、例えば６xHisタグ、または他のタグが続いていてよい。これは、ヒスチジンテイルが、ＰｍＸｎに含まれていてよいことを排除するものではない。

ＰｍＸｎ部分のＦＢＳ部分への付加により、ＦＢＳ部分の１つ以上の特性が増強する。例えば、実施例に示すように、^１０Ｆｎ３部分の熱安定性が、ＰｍＸｎ部分に連結していない部分に比較して向上する。熱安定性の改善は、他の望ましい性質、例えば溶解度、適切なフォールディングおよび発現レベルを改善することが予期される。例えば、実施例に示すように、ＰｍＸｎ部分がＦＢＳのＣ末端に存在することにより、ＦＢＳの溶解度が、ＰｍＸｎ部分に連結していないＦＢＳに比較して上昇する。

したがって、特定の態様において、ＦＢＳ、例えば^１０Ｆｎ３部分のＴｍは、ＰｍＸｎ部に結合していないＦＢＳ部分と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５℃上昇する。例えば、該Ｔｍは、ＰｍＸｎ部に結合していないＦＢＳ部と比較して、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０または１〜５℃上昇していてよい。Ｔｍは、例えば次のように、熱スキャン蛍光法 (ＴＳＦ)により測定し得る。タンパク質サンプル、例えばHTPPアンプルを、ＰＢＳ中で、０.２mg/mlに規準化する。PBSで１:４０に希釈したSYPRO(登録商標)橙色の色素１μlを各サンプル２５μlに添加し、プレートを、透明９６ウェルマイクロプレートの接着性シールで密封する。サンプルを、BioRad RT-PCR機器を用いて、温度を２５℃から９５℃に、一分あたり２℃の速度で上昇させてスキャンする。データをBioRad CFX manager ２.０ softwareを用いて解析する。Ｔｍはまた、次のように、示差走査測定(ＤＳＣ)によっても測定し得る。０.５mg/mlの溶液を、７０p.s.iの圧力下で１分あたり１℃の速度で、１５℃から１１０℃に上昇させることにより、VP-Capillary Differential Scanning calorimeter (GE Microcal)でスキャンする。データを、Origin Software (OriginLab Corp)を用いた最良適合を用いて、適当なバッファーの対照試行と比較して解析する。

特定の態様において、ＦＢＳ部分の溶解度は、ＰｍＸｎ部分に連結することにより上昇する。該分子は、少なくとも１０mg/ml、２０mg/ml、３０mg/ml、４０mg/ml、５０mg/ml、６０mg/ml、７０mg/ml、８０mg/ml、９０mg/mlまたは１００mg/mlの濃度で存在してよい。

ＰＫＥ部分
ＦＢＳ部分は、ＰＫＥ部分に連結し、ＦＢＳ部分の半減期を延長させてよい。例示的なＰＫＥ部分としては、ヒト血清アルブミン; ヒト血清アルブミンに結合するタンパク質(例えばＨＳＡまたはＡＢＤに結合するＦＢＳ); Ｆｃ; またはその任意の部分またはバリアント; およびＰＥＧがあげられる。これらの部分は、ＰｍＸｎ部分および／またはＦＢＳのＮ末端またはＣ末端に連結し得る。

システイン結合標識および治療剤
特定の態様において、ＰｍＸｎ部分(アミノ酸「Ｘ」の少なくとも１つ以上はシステインである)に連結したＦＢＳ部分(「修飾ＦＢＳ部」と称する)は、１つ以上のシステインを介して、異種性部分、例えば標識化部分、生物活性部分(例えば治療剤)または結合部分に連結している。

本明細書に記載のＦＢＳ部分は、Ｃ末端のシステインを介して治療剤に結合し、免疫結合体、例えばＦＢＳ−薬物結合体(ＦＢＳ−ＤＣ;「アデクチン−薬物結合体」とも称する)を形成していてよい。

ＦＢＳ−ＤＣでは、ＦＢＳは、薬物に結合しており、該ＦＢＳは、ＦＢＳ−ＤＣを、該抗原を発現する標的細胞、例えばがん細胞に向かわせるための標的化剤として機能している。好ましくは、該抗原は腫瘍関連抗原、すなわち、がん細胞に特有に発現するか、または過剰発現する抗原である。そこに至ると、薬物は、該標的細胞内か、または、その近傍のいずれかで放出され、治療剤として作用する。抗体とともに、例えばがん利用で用いられる、薬物結合体の薬物作用機序および使用については、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc., 5:147 (2006)を参照のこと。

薬物結合体において使用するための適当な治療剤としては、代謝拮抗薬、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡクロスリンカー、ヒストンジアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が挙げられる。ＦＢＳ−ＤＣでは、該ＦＢＳと治療剤は、好ましくは、切断可能なリンカー、例えばペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーを介して結合している。より好ましくは、該リンカーは、ペプチジルリンカー、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Gly−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号８９)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕである。ＦＢＳ−ＤＣは、米国特許第7,087,600号; 第6,989,452号;および第7,129,261号明細書; 国際公開第02/096910号; 国際公開第07/038658号; 国際公開第07/051081号; 国際公開第07/059404号; 国際公開第08/083312号; および国際公開第08/103693号; 米国特許出願公開第2006/0024317号; 第2006/0004081号; および第2006/0247295号明細書に記載の方法と同様の方法により製造でき、当該文献の記載は、引用により本明細書に包含される。リンカーは、それ自体が、例えば、マレイミド化学を用いて、ＰｍＸｎ部分(式中、少なくとも１つのＸはシステインである)に結合、例えば共有結合していてよい。例えば、リンカーは、ＦＢＳ-ＰｍＸｎ(少なくとも１つのＸはシステインである)に共有結合していてよい。例えば、リンカーは、ＦＢＳ-ＰｍＣｎ(式中、Ｐはプロリンであり、Ｃはシステインであり、ｍおよびｎは、少なくとも１である整数、例えば１〜３である)に結合していてよい。システインへのライゲーションは、マレイミド化学を用いて、当該分野で知られているように行ってよい(例えば、Imperiali, B. et al., Protein Engineering: Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 22, pp. 65-96, Gross, H.J., ed. (2009))。リンカーをＦＢＳ上のシステインに結合させるためには、該リンカーは、例えば、マレインイミド部分を含んでいてよく、該部分は、システインと反応して、共有結合を形成する。特定の態様において、システインの周囲のアミノ酸は、化学反応を促進するように最適化されている。例えば、システインは、一連の正に荷電したアミノ酸に囲まれたシステインと比較して、より反応が速くなるために、負に荷電したアミノ酸に囲まれていてよい(欧州特許第1074563号明細書)。

がんの処置のためには、該薬物は、標的がん細胞の死を引き起こす細胞傷害性の薬物であるのが好ましい。ＦＢＳ−ＤＣで用い得る細胞傷害性薬物としては、次の種類の化合物およびその類似体および誘導体が挙げられる:
(a) エンジイン、例えばカリチアマイシン(例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc., 109:3464, 3466 (1987)参照) およびウンシアラマイシン(例えばDavies et al., 国際公開第2007/038868号 (2007)およびChowdari et al., 米国特許第8,709,431号明細書(2012)参照);
(b) ツブリシン(例えば、Domling et al., 米国特許第7,778,814号明細書 B2 (2010); Cheng et al., 米国特許第8,394,922号明細書 B2 (2013); およびCong et al., 米国特許出願公開第2014/0227295号明細書 A１参照;
(c) ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン(例えば、Boger, 米国特許第6,5458,530号明細書 B1 (2003); Sufi et al., 米国特許第8,461,117号明細書 B2 (2013); およびZhang et al., 米国特許出願公開第2012/0301490号 A1 (2012)参照);
(d) エポチロン(例えば、Vite et al., 米国特許出願公開第2007/0275904号明細書A1 (2007) および米国特許RE42,930 E (2011)参照);
(e) オーリスタチン(例えば、Senter et al., 米国特許第6,844,869号明細書 B2 (2005)およびDoronina et al., 米国特許第7,498,298号明細書B2 (2009)参照);
(f) ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体(例えばHoward et al., 米国特許出願公開第2013/0059800号 A1 (2013)および第2013/0028919号明細書 A1 (2013);および国際公開第2013/041606号 A1 (2013)参照); および
(g) マイタンシノイド、例えばＤＭ１およびＤＭ４(例えばChari et al., 米国特許第5,208,020号明細書 (1993)およびAmphlett et al., 米国特許第7,374,762号明細書B2 (2008)参照)。

特定の態様において、ＦＢＳ-ＰｍＸｎ(式中、少なくとも１つのＸはシステインである)は、例えば、インビトロまたはインビボ検出またはイメージングに用いるための、標識部分または検出可能な部分に連結していてよい。

検出可能な標識は、インビトロ診断の分野で現在用いられている種々の種類の任意のもの、例えば、粒子状標識、例えばコロイド金のような金属ゲル、例えば、Ｎ_２Ｓ_２、Ｎ_３ＳまたはＮ_４タイプのペプチドキレート剤とともに提示される、I^１２５またはＴｃ^９９のような同位体、蛍光マーカーを含む発色団、ビオチン、発光性マーカー、リン光マーカー等、ならびに、特定の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識および、例えばポリメラーゼ連鎖反応による増幅後に明らかになる、ポリヌクレオチドタグが挙げられる。ビオチン化固体は、アビジンまたはストレプトアビジン結合により検出可能になる。適当な酵素標識としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ等が挙げられる。例えば、該標識は、１,２ジオキセタン基質、例えばアダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(AMPPD)、３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１３,７}デカン}−４−イル)フェニルリン酸二ナトリウム(CSPD)ならびにCDPおよびCDP-STAR(登録商標)または当該分野で公知の他の発光性基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)のような適当なランタニドのキレートの変換後に、化学発光の存在または形成を測定することにより検出される、アルカリンホスファターゼ酵素であってよい。

使用してよい検出可能な部分としては、放射活性剤、例えば放射活性重金属、例えば、鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射活性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽子放射体、^１８Ｆ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^１２４Ｉ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^４４Ｓｃ、^４７Sｃ、^１１Ｃ、^１１１Ｉｎ、^１１４mＩｎ、^１１４Ｉn、^１２５Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^３２Ｃl、^３３Ｃl、^３４Ｃl、^７４Ｂｒ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^７８Ｂｒ、^８９Ｚｒ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、^９９Ｔｃ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２２５Ａｃまたは^１５３Ｓｍが挙げられる。

検出方法は、選択した標識により決定される。ラベルまたはその反応産物の出現は、該標識が粒子状であり、適当なレベルで集積する場合、裸眼で、または、分光光度計、ルミノメーターおよび、蛍光光度計のような機器を全て、標準の方法に準じて用いることにより検出する。

検出可能な部分を、当該分野で公知の方法によりシステインに連結していてよい。検出可能な部位が、例えば本明細書にさらに記載するような、放射活性剤である場合、前記の検出可能な部分は、システインと反応性であるキレート剤、例えば、キレート剤を含むマレイミド、例えばマレイミド-ＮＯＤＡＧＡまたはマレイミド-ＤＢＣＯを介してＦＢＳに連結する。マレイミド-ＮＯＤＡＧＡまたはマレイミド-ＤＢＣＯを、ＦＢＳのＣ末端上のシステインと反応させて(例えば、ＰｍＸｎ部分(式中、少なくとも１つのＸはシステインである)を介して)、それぞれ、ＦＢＳ−ＮＯＤＡＧＡまたはＦＢＳ−ＤＢＣＯを得てよい。次のキレート剤のいずれか１つを、用いてよい、ただし、該キレート剤は、システインと反応する反応基を含むか、または含むように修飾されていてよい: ＤＦＯ、ＤＯＴＡおよびその誘導体 (ＣＢ-ＤＯ２Ａ、３ｐ-Ｃ-ＤＥＰＡ、ＴＣＭＣ、Ｏｘｏ-ＤＯ３Ａ)、ＴＥ２Ａ、ＣＢ-ＴＥ２Ａ、ＣＢ-ＴＥ１Ａ１Ｐ、ＣＢ-ＴＥ２Ｐ、ＭＭ-ＴＥ２Ａ、ＤＭ-ＴＥ２Ａ、diamsarおよび誘導体、ＮＯＤＡＳＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ-ＴＭ、ＤＴＰＡ、１Ｂ４Ｍ-ＤＴＰＡ、ＣＨＸ-Ａ”-ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ(ＰＲＰ９)、ＮＯＰＯ、ＡＡZＴＡおよび誘導体(ＤＡＴＡ)、Ｈ_２dedpa、Ｈ_４オクタパ、Ｈ_２アザパ、Ｈ_５デカパ、Ｈ_６ホスパ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＲＩＴＡベースのキレート剤、および近縁の類似体および誘導体。

特定の態様において、ＦＢＳを、ＰＥＴトレーサーを用いて標識し、インビボイメージング剤として使用する。例えば、ＦＢＳを、ＰＥＴトレーサー^６４Ｃｕで標識してよい。^６４Ｃｕは、キレート剤、例えばマレイミド−ＮＯＤＡＧＡを用いて、Ｃ末端システイン残基に結合してよい。

例示的な分子
特定の態様において、タンパク質は、(i) 配列番号１〜１６のいずれか１つと少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＦＢＳ部分; および(ii) ＰｍＸｎ(Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０であるか、または少なくとも１である整数である)を含み、該タンパク質は、標的に特異的に(例えば、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)、例えばBiacoreによって決定される、５００nM未満、１００nM未満、５０nM未満、１０nM未満、５nM未満、１nM未満、５００pM未満、１００pM未満のＫ_ｄで)結合し、該ＰｍＸｎ部分は、非修飾ＦＢＳ部分からなるタンパク質と比較して、ＦＢＳ部分の性質を少なくとも１つ改善する。

特定の態様において、ＰｍＸｎ部分により増強した性質は、増大したタンパク質安定性、例えば、融解温度の、少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１〜１５℃、２〜１５℃、３〜１５℃、５〜１５℃、５〜１５℃、１〜１０℃、２〜１０℃、３〜１０℃、４〜１０℃または５〜１０℃の上昇である。Ｔｍは、例えば、熱スキャン蛍光法(ＴＳＦ)示差走査熱量測定(ＤＳＣ)により決定し得る。「上昇Ｔｍ」は、Ｔｍの統計学的に有意な上昇を指す。

特定の態様において、ＦＢＳ部分およびＰｍＸｎ部分を含むタンパク質は、組成物、例えば医薬組成物に、少なくとも１０mg/ml、２０mg/ml、３０mg/ml、４０mg/ml、５０mg/ml、６０mg/ml、７０mg/ml、８０mg/ml、９０mg/mlまたは１００mg/mlの濃度で存在する。

特定の態様において、ＦＢＳ部分およびＰｍＸｎ部分を含むタンパク質は、組成物、例えば医薬組成物に、殆どの場合は単量体として存在し、例えば、該組成物中の該タンパク質の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が単量体形態で存在する。タンパク質溶液の単量体の程度は、例えば、Ａ２１４nmおよびＡ２８０nm ＵＶの検出および、蛍光検出(励起＝２８０nm、放出＝３５０nm)を伴う、Agilent 1100または1200 HPLC systemにおけるSuperdex column(GE Healthcare)の使用により、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により決定し得る。１００mM 硫酸ナトリウム、１００mM リン酸ナトリウム、１５０mM 塩化ナトリウムのバッファー(例えばｐＨ６.８)をＳＥＣカラムの適当な流速で使用し得る。ゲル濾過の標準(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) を、分子量の較正のために用いる。

特定の態様において、ＦＢＳ部分およびＰｍＸｎ部分を含むタンパク質は、非修飾ＦＢＳ部分と少なくとも同等の強度の生物学的活性を有する。生物学的活性は、標的への結合親和性またはアッセイにおける生物学的活性、例えば腫瘍の破壊能であってよい。特定の態様において、該タンパク質の生物学的活性は、非修飾ＦＢＳ部分の活性の５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２倍またはそれ以上の範囲にある。

ＦＢＳおよびＰｍＸｎ部分を含むタンパク質はまた、上述の特性の組合せを含んでいてよい。例えば、タンパク質は、最大５０mg/mlの濃度で可溶性であり、少なくとも９０％が単量体形態で存在し、および／または、少なくとも非修飾ＦＢＳと同程度の強度の生物学的活性を有していてよい。

増強活性について言及する場合、該増強は、統計学的に有意な増強である。

核酸−タンパク質技術
特定の結合特性を有するＦＢＳドメインを迅速に作製し、試験する１つの方法は、Adnexus, a Bristol-Myers Squibb Companyの核酸−タンパク質技術である。Profusionと称する、核酸−タンパク質融合(ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合)を利用する該インビトロ発現およびタグ技術は、タンパク質への結合に重要な新規のポリペプチドおよびアミノ酸モチーフの特定に使用し得る。核酸−タンパク質技術は、タンパク質を、それをコードする遺伝情報に共有結合させる技術である。ＲＮＡ−タンパク質技術およびフィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法についての詳細な記載については、Szostak et al., 米国特許第6,258,558号; 第6,261,804号; 第6,214,553号; 第6,281,344号; 第6,207,446号; 第6,518,018号明細書; 国際公開第00/34784号; 第01/64942号; 第02/032925号; およびRoberts et al., Proc Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)を参照のこと(当該文献は引用により本明細書に包含される)。

ベクターおよびポリヌクレオチドの実施態様
ＦＢＳ部分、本明細書に記載のＰｍＸｎ部分を含む種々のタンパク質の任意のものをコードする核酸を、化学的、酵素によってまたは組換えによって合成してよい。コドン使用は、細胞中での発現を改善するように選択してよい。該コドン使用は、選択する細胞種に依存する。大腸菌および他の細菌ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞についての特化したコドン使用パターンが開発されている。例えばMayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(1):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996);およびSharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)を参照のこと。

核酸操作の一般的な技術は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)または、Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) およびその定期的な更新に記載されており、これらは、引用により本明細書に包含される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結している。該調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写を調節するための付加的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。通常複製基点により付与される、ホストにおける複製能、および、形質転換体の認識を促進する選択遺伝子をさらに組み込んでよい。

本明細書に記載のタンパク質は、直接的だけではなく、例えば、異種性ポリペプチドとして産生してよく、該異種性ポリペプチドは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであるのが好ましい。選択される異種性シグナル配列は、好ましくは、ホスト細胞により認識およびプロセシング(すなわちシグナルペプチダーゼにより切断)されるものである。未変性のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核ホスト細胞については、該シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換する。酵母の分泌については、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ファクターリーダー(サッカロミセスおよびクリベロマイセスのα−ファクターリーダー配列を含む)、または酸性ホスファターゼ、C. albicansグルコアミラーゼリーダーまたは国際公開第９０/１３６４６号に記載のシグナルで置換してよい。哺乳類細胞の発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。該前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム中で、該タンパク質をコードするＤＮＡにライゲーションしてもよい。

発現ベクターおよびクローニングベクターはともに、該ベクターが１種以上の選択したホスト細胞で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいて、この配列は、該ベクターが、ホスト染色第ＤＮＡからは独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または、自己複製配列を含む。該配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。ｐＢＲ３２２の複製起点は、殆どのグラム陰性細菌に適当であり、２μプラスミドの複製起点は、酵母に適当であり、種々のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)は、哺乳類細胞中のクローニングベクターに適当である。一般的に、複製起点要素は、哺乳類発現ベクターには必要ではない(ＳＶ４０起点を典型的に使用してよいのは、初期プロモーターを含むからという理由にのみよるものである)。

発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子を含んでいてよい。典型的な選択遺伝子は、(ａ) 抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンへの耐性を与えるタンパク質をコードするか、(ｂ) 栄養要求性の欠損を補完するか、または、(ｃ) 複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、例えばバチルス菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。

酵母で用いるのに適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能を各酵母の変異株、例えば、ATCC(登録商標)No. 44076またはPEP４-１の選択マーカーとなる(Jones, Genetics, 85:12 (1977))。酵母ホスト細胞ゲノム中にｔｒｐ１破壊が存在することにより、トリプトファンの非存在下における増殖による形質転換の検出のために有効な環境がもたらされる。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株 (ATCC(登録商標) 20,622または38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドにより補完される。

発現およびクローニングベクターは、通常、ホスト生物により認識されるプロモーターを含み、該タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結している。真核ホストに用いるのが適当であるプロモーターとしては、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリンホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適当である。細菌系に用いるプロモーターはまた、該タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したShine-Dalgarno (S.D.)配列を含む。

真核生物についてのプロモーター配列は知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始する部位の約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴリッチ領域を有する。転写開始点の７０〜８０塩基上流に見られる他の配列は、CNCAAT(配列番号１０９)であり、Nは任意のヌクレオチドであってよい。殆どの真核遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテイル付加シグナルであり得るAATAAA(配列番号１１０)が存在する。これらの配列は全て、真核発現ベクターへの挿入に適当である。

酵母ホストで用いるための適当なプロモーター配列の例としては、３-ホスホリグリセートキナーゼまたは他の解糖酵素、例えばエノレース、グリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。

成長条件により転写制御されるという付加的な利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用に重要である酵素のプロモーター領域である。酵母発現に用いる適当なベクターおよびプロモーターは、さらに、欧州特許出願公開73,657および国際公開第2011/124718号および国際公開第2012/059486号に記載されている。また、酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと共に用いるのが有利である。

哺乳類ホスト細胞のベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、サルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスより得たプロモーター、異種性の哺乳類プロモーター、例えばACTIN(登録商標)プロモーター、熱ショックプロモーターにより調節し得る。ただし、該プロモーターは、ホスト細胞系と適合するものである。

ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含む、ＳＶ４０制限断片として得るのが好都合である。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として得るのが好都合である。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて、哺乳類ホストのＤＮＡを発現させる系が米国特許第4,419,446号明細書に記載されている。この系の修飾は、米国特許第4,601,978号明細書に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下の、マウス細胞における、ヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) を参照のこと。あるいは、プロモーターとして、ラウスサルコーマウイルスの末端反復配列を用いてよい。

タンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより上昇する。哺乳類遺伝子(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながた、当業者が典型的に用いるのは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーである。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー (bp １００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) on enhancing elements for activation of eukaryotic promotersを参照のこと。該エンハンサーは、ベクター中にポリペプチドコード配列の５’または３’で、分かれて入れてよいが、プロモーターの５’部位に位置するのが好ましい。

真核ホスト細胞(例えば、酵母、真核、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞)で用いられる発現ベクターはまた、転写およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。該配列は、一般的に、真核またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの、５’および、場合によっては３’、非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分に、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド区分を含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４/１１０２６号および本明細書に記載の発現ベクターを参照のこと。

組換えＤＮＡは、また、タンパク質の精製に有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含んでいてよい。タンパク質タグの種類としては、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ(登録商標)タグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞ホストに用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)に記載されており、当該文献の関連する開示は、引用により本明細書に包含される。

発現コンストラクトは、ホスト細胞に適当な方法を用いて、ホスト細胞に導入してよく、これは当業者には明らかなことである。核酸のホスト細胞の導入については、種々の方法が当該分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは他の物質を用いた形質導入; 微粒子銃; リポフェクション; および(該ベクターが感染性物質である場合)感染が挙げられるが、これらに限定されない。

適当なホスト細胞としては、原核細胞、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。適当な細菌としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス菌種が挙げられる。好ましくは、サッカロマイセス種、例えば出芽酵母である、酵母もまた、ポリペプチドの作製に使用し得る。種々の哺乳類または昆虫細胞培養系もまた、組換えタンパク質の発現に用い得る。昆虫細胞における異種性タンパク質の作製のためのバキュロウイルス系が、Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988))に概説されている。適当な哺乳類ホスト細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製タンパク質は、適当なホスト/ベクター系を組換えタンパク質を発現するように培養することにより作製される。次いで、該ＦＢＳタンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。

タンパク質作製
ホスト細胞は、本明細書に記載の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換対の選択または、所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適当なように改変した慣用される栄養培地中で培養する。

タンパク質の作製に用いられるホスト細胞は、種々の培地で培養してよい。市販の培地、例えばHam's F10 (Sigma)、Minimal Essential Medium ((MEM)、(Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地 ((DMEM)、(Sigma))がホスト細胞の培養に適当である。さらに、Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 米国特許第4,767,704号; 第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；または第5,122,469号明細書；国際公開第90/03430号；第87/00195号；または米国特許第RE30,985号明細書に記載の任意の培地を、ホスト細胞の培養培地として用いてよい。これらの培地にうち任意のものに、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞成長因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびリン酸塩)、緩衝剤(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシン薬剤)、トレース要素(通常、μモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される)およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してよい。他の任意の補助物質も、当業者に公知である適当な濃度で含まれていてよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、以前に発現のために該ホスト細胞に用いたものであり、当業者には明らかである。

本明細書に記載のタンパク質は、無細胞翻訳系を用いて製造し得る。かかる目的のために、該タンパク質をコードする核酸を、ｍＲＮＡを産生するためのインビトロでの翻訳および、該ｍＲＮＡの、使用する特定の無細胞系(真核生物、例えば哺乳類または酵母の無細胞翻訳系または原核、例えば細菌の無細胞翻訳系)における無細胞翻訳を可能にするために、修飾する必要がある。

タンパク質は、化学合成 (例えばSolid Phase Peptide Synthesis, Second Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)に記載の方法)によっても製造し得る。該タンパク質への修飾もまた、化学合成により作製し得る。

本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般的に知られている単離/精製方法により精製し得る。非限定的な例としては、抽出、再結晶化、(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いた)塩析、遠心分離、透析、超遠心分離、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル透過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、タンパク質を当該分野で公知の種々の任意の方法により異なるバッファーへの交換および／または濃縮を行ってよく、該方法としては、濾過および透析が挙げられるが、これらに限定されない。

精製タンパク質は、好ましくは少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度であり、最も好ましくは少なくとも９８％または９９％の純度である。厳密な純度の数値に関わらず、医薬製品として使用するための該タンパク質は十分に純粋である。

例示的な使用
修飾ＦＢＳタンパク質を、ＰｍＸｎ成分の添加により修飾される該ＦＢＳタンパク質を使用し得る任意の目的に使用することができる。

一の局面において、本出願は、障害の処置に有用である修飾ＦＢＳ成分を含む、タンパク質を提供する。処置し得る疾患または障害は、ＦＢＳ成分の結合特異性により指示される。本明細書に記載するように、修飾ＦＢＳ成分は、所望の任意の標的に結合するように設計されていてよい。例示的な標的としては、例えば、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦＲ２、ＰＣＳＫ９、ＩＬ−２３、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒが挙げられる。単なる例示であるが、ＴＮＦ−αに結合する修飾ＦＢＳ成分を、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、炎症性腸疾患、感染および喘息の処置に使用してよい。本明細書に記載の修飾ＦＢＳは、がんの処置にも使用し得る。

特定の態様において、疾患、例えばがんに罹患している対象を処置する方法は、該対象に、修飾ＦＢＳ薬物結合体を投与することを含む。

本明細書において、対象に薬物を投与する方法を提供する。いくつかの態様において、該対象はヒトである。いくつかの態様において、タンパク質は、哺乳類、特にヒトにとって薬学的に許容される。「薬学的に許容される」組成物は、有意な有害な医学的結果を伴わずに、動物に投与される組成物を指す。薬学的に許容される組成物の例としては、インテグリン結合ドメイン(ＲＧＤ)を含む組成物、および、本質的にエンドトキシンまたは発熱物質を含まないか、または、エンドトキシンまたは発熱物質のレベルが非常に低い組成物が挙げられる。

本明細書に記載する修飾ＦＢＳタンパク質の他の用途としては、インビトロまたはインビボでの検出アッセイにおける使用が挙げられる。例えば、それらを、サンプル中の標的分子の検出に使用してよい。方法は、該サンプルを、本明細書に記載の修飾ＦＢＳと接触させることを含んでいてよく、ここで、該接触は、ＦＢＳ標的複合体形成、および、該複合体の検出による、該サンプル中の該標的の検出が可能である条件下で行う。検出は、当該分野で認識されている任意の技術、例えば、Ｘ線検出、免疫学アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴を用いて行ってよい。該サンプルは、ヒトまたは他の哺乳類由来であってよい。診断目的のために適当な剤は、全身のイメージングのための放射性同位体、サンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能な標識である。

特定の態様において、本明細書に記載の修飾ＦＢＳは、種々の診断およびイメージング適用に有用である。特定の態様において、修飾ＦＢＳを、インビボで検出可能である部分で標識し、該標識ＦＢＳは、例えば、全身のイメージングのための、インビボイメージング剤として使用してよい。例えば、一の態様において、対象における、特定の抗原を含む腫瘍を検出する方法は、該対象に、検出可能な標識に連結した修飾ＦＢＳを投与し、適当な時間の経過後、該対象における該標識を検出することを含む。

ＦＢＳイメージング剤は、特定の抗原、特定の抗原のレベルの上昇を伴う障害または疾患、例えば、腫瘍が選択的に該抗原を過剰発現するがんの診断に使用し得る。同様に、特定の抗原に特異的に結合する修飾ＦＢＳは、該抗原に関連する症状について処置されている対象における抗原レベルのモニターに使用し得る。修飾ＦＢＳは、修飾の有無に関わらず使用可能であり、検出可能な成分の共有または非共有結合により標識されていてよい。

製剤および投与
本出願は、さらに、本明細書に記載のタンパク質を含む、薬学的に許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンおよび／または発熱物質を含まない、組成物を提供する。

タンパク質を含む治療用組成物は、所望の純度を有する本明細書に記載のタンパク質を、所望により、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、水性液剤、凍結乾燥または他の乾燥製剤の形態で、保存用に調製される(Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980))。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸のようなバッファー; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存料 (例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド; 塩化ヘキサメトニウム; 塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム; フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール; アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン; カテコール; レゾルシノール; シクロヘキサノール; ３−ペンタノール; およびm-クレゾール); 低分子量(約１０残基未満) ポリペプチド; タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン; 親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン; アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン; 単糖、二糖および、グルコース、マンノースまたはデキストランを含む他の炭水化物; キレート剤、例えばＥＤＴＡ; スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールを含む糖; 塩形成対イオン、例えばナトリウムイオン; 金属錯体(例えばＺｎ−タンパク質複合体); および／または非イオン界面活性剤、例えばTween、PLURONIC(登録商標)またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。

本明細書において、該製剤は、また、処置する特定の適応症について必要であれば、２つ以上の有効成分、好ましくは、互いに悪性の影響を及ぼさない、相補的な活性を有する有効成分を含んでいてもよい。該分子は、意図する目的に有効な量での組合せで存在するのが適当である。

該タンパク質は、また、例えば、それぞれ、コロイド薬物伝達系(例えばリポソーム、アルブミンマイクロカプセル、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって製造されたマイクロカプセル、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート) マイクロカプセルに封入されていてよい。該技術は、Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, １６th Edition (１９８０)に記載されている。

インビボ投与に用いる製剤は、無菌である必要がある。これは、無菌フィルターメンブレンを通して濾過することにより容易に達成される。

徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の適当な例としては、本明細書に記載のタンパク質を含む固体疎水ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、該マトリクスは、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号明細書)、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される、注入可能な微粒子)およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたって、分子を放出させることが可能であるのに対し、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化されたタンパク質が体内に長期間残る場合、該タンパク質は、３７℃において水分に暴露された結果として、変性または凝集し、生物活性の損失および免疫原性の変化を起こす可能性がある。関連する機構によって、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構が、チオジスルフィドの交換を介する分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが明らかになっている場合、安定化は、適当な添加剤を用いた、スルフィドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の調節および特定のポリマーマトリクス組成物の展開により達成し得る。

各タンパク質の用量が、該タンパク質の特性に依存するものであることは、当業者が理解することであるが、好ましい用量は、約１０mg/m^２〜約２０００mg/m^２、より好ましくは約５０mg/m^２〜約１０００mg/m^２の範囲であってよい。

治療適用のためには、薬学的に許容される剤形で、該タンパク質を対象に投与する。該タンパク質は、急速投与で、または連続的に一定期間、静脈内投与しても、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所または吸入経路により投与してよい。該タンパク質はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病変周囲経路によって、局所的または全身性の治療効果を発揮するように投与してよい。適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者には、臨床条件を保証するものとしてよく知られており、当業者が決定し得るものである。適当な担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては: (１) ダルベッコリン酸緩衝食塩水(ｐＨ約７.４、ヒト血清アルブミン約１mg/ml〜約２５mg/ml含有)、(２) ０.９％生理食塩水(０.９％ w/v ＮａＣｌ)および(３) ５％ (w/v) デキストロースが挙げられる。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで実施し得る。

タンパク質および１種以上の付加的な治療剤の投与は、共投与するか、または連続的に投与するいずれの場合であっても、治療適用のために、上述のように行ってよい。共投与に適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、共投与する具体的な治療剤の特性によるものであることは、当業者が理解することである。

該タンパク質は、凍結乾燥よりもむしろ水性の剤形で存在する場合、典型的に、約０.１mg/ml〜１００mg/mlの濃度で製剤されるが、これらの範囲を超えた広範囲の変動が許容される。疾患の処置のために、適当なタンパク質の用量は、処置する疾患の種類、該疾患の重度および経過、該タンパク質が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前の治療の過程、該患者の病歴および、融合物に対する応答、および担当医の決定に依存する。該タンパク質は、１回で、または一連の処置にわたって患者に投与するのが適当である。

例示的な態様
１．標的に特異的に結合する、単離されたフィブロネクチンベースのスキャフォールド(ＦＢＳ)タンパク質であって、該ＦＢＳが非天然起源のＦＢＳであり、該ＦＢＳがＣ末端において、アミノ酸配列ＰｍＸｎ(Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１である整数である)からなる部分に連結しており、該ＰｍＸｎ部分が、ＰｍＸｎ部分に連結していないＦＢＳタンパク質と比較して、ＦＢＳタンパク質の性質を増強させる、ＦＢＳタンパク質。
２．該部分がＰからなる(ｍは１であり、ｎは０である)、態様１記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
３．該部分がＰＰからなる(ｍは２であり、ｎは０である)、態様１に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
４．該部分がＰｍＸｎからなる(ｎは１〜１５０である)、態様１に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
５．該部分がＰｍＸｎからなる(ｎは１〜１０である)、態様１に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
６．該部分がＰｍＸｎからなる(ｎは１〜５である)、態様１に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
７．該部分が、PI、PC、PID、PIE、PIDK(配列番号６１)、PIEK(配列番号６３)、PIDKP(配列番号６５)、PIEKP(配列番号６７)、PIDKPS(配列番号６９)、PIEKPS(配列番号７１)、PIDKPC(配列番号７３)、PIEKPC(配列番号７５)、PIDKPSQ(配列番号７７)、PIEKPSQ(配列番号７９)、PIDKPCQ(配列番号８１)、PIEKPCQ(配列番号８３)、PHHHHHH(配列番号８７)またはPCHHHHHH(配列番号８６)からなる、態様１に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
８．ＦＢＳタンパク質が、Ｆｎ３タンパク質である、態様１〜７のいずれか記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
９．Ｆｎ３タンパク質が、^１０Ｆｎ３タンパク質である、態様８に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１０．^１０Ｆｎ３タンパク質がヒト^１０Ｆｎ３タンパク質である、態様９に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１１．配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１０のいずれか記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１２．少なくとも１つのループまたは１つのスキャフォールド領域に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、態様１〜１１のいずれかに記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。

１３．アミノ酸配列
((X)_u、(X)_v、(X)_w、(X)_x、(X)_yおよび(X)_zは、野生型アミノ酸配列(配列番号１)からなるか、対応する野生型配列に少なくとも１つのアミノ酸の差異を含み、該配列は、１〜１０個のスキャフォールド、Ｎ末端および／またはＣ末端変異を含んでいてよい)
を含む、態様１〜１２のいずれかに記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１４．配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１〜１３のいずれかに記載の単離されたＦＢＳタンパク質であって、該ＦＢＳタンパク質のＣ末端アミノ酸残基が、ＰｍＸｎからなる部分に融合しており、該ＦＢＳタンパク質が、５００nM未満のＫ_ｄで標的に特異的に結合し、該標的には、配列番号１を含む、野生型^１０Ｆｎ３分子は結合しない、単離されたＦＢＳタンパク質。
１５．配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１４に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１６．ＰｍＸｎからなる部分が、ＦＢＳタンパク質のＣ末端アミノ酸残基に、ペプチド結合を介して結合している、態様１〜１５のいずれか記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１７.ＰｍＸｎがＰまたはＰＣである、態様１〜１６のいずれか記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
１８．配列番号１に少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含む態様１〜１７のいずれか記載の、単離されたＦＢＳタンパク質であって、ＦＢＳタンパク質のＣ末端アミノ酸残基が、ペプチド結合を介してプロリンに結合しており、該ＦＢＳタンパク質が、５００nM未満のＫ_ｄで標的に特異的に結合し、該標的には、配列番号１を含む野生型^１０Ｆｎ３分子は結合しない、単離されたＦＢＳタンパク質。
１９．ＰｍＸｎの少なくとも１つのＸがシステインである、態様１〜１８のいずれかに記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
２０．該システインが異種性部分に結合している、態様１９記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
２１．該異種性分子が検出可能な部分である、態様２０記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
２２.該異種性分子が薬物部分であり、該薬物部分とＦＢＳが、ＦＢＳ−薬物結合体を形成する、態様２０または２１に記載の、単離されたＦＢＳタンパク質。
２３．ＰｍＸｎによりもたらされる性質の増強が、安定性の上昇である、態様１〜２２のいずれかに記載の、単離されたタンパク質。
２４．安定性の上昇が、少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃またはそれ以上の、Ｔｍの上昇である、態様２３記載の単離されたＦＢＳタンパク質。

次の代表的な実施例は、重要な付加的な情報、例示および、種々の態様において、本発明の実施に適用し得る指示およびその等価物を含むものである。これらの実施例は、本発明の説明を手助けすることを意図するものであり、その範囲を限定することを意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。

実施例１: ^１０Ｆｎ３分子のＣ末端にプロリンを付加することによる、熱安定性の向上
天然では、^１０Ｆｎ３は、一連の長いフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの一部であり; ^１０Ｆｎ３の直接下流にあるドメインは、^１１Ｆｎ３と名付けられている。下記の配列は、^１０Ｆｎ３(斜体)および^１１Ｆｎ３(太字)ドメインおよびその間の接合部(下線部)の野生型配列を示す。

^１０Ｆｎ３の結晶およびＮＭＲ構造および、^１０Ｆｎ３と^１１Ｆｎ３の配列比較に基づけば(Dickinson et al., “Crystal structure of the tenth type III cell adhesion module of human fibronectin”, J. Mol. Biol., 36:1079-1092 (1994))、この配列の最初の二残基である、RTは、^１０Ｆｎ３の最終βストランド(「ストランドＧ」)の一部であり、該配列の残りの部分であるEIDKPSQは、構造化した１０番目および１１番目のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの間の可動性のリンカーである。

^１０Ｆｎ３に基づいて操作されたタンパク質ドメインのＣ末端は、クローニング、発現および精製を促進するために、野生型配列から修飾されていることがしばしばである。アドネクチンの操作された異なるＣ末端の調査により、RTEからRTPへの変異により、いくつかの異なるアドネクチンの熱安定性が向上したことが明らかになった。表４には、この試験で用いた異なるＣ末端を記載する。

RTEからRTPへの変異の、アドネクチンの熱安定性に対する影響を、そのＣ末端が異なる何対かのアドネクチンを比較することにより試験した。表５は、この試験に用いた、アドネクチンの対をその名称、標的および熱力学的性質とともに示す。アドネクチン１は、標的Ｘに結合するアドネクチンである。記載するアドネクチンは全て、PROfusion(ｍＲＮＡディスプレイ)技術を用いて、高複雑度ライブラリより選択し、部位特異的な変異導入により再操作したＣ末端を有していた。タンパク質の全長配列を下記に示す。

この実施例で用いたタンパク質のアミノ酸配列：
ADX_2382_D09:
ADX_5484_A03:
ADX_2987_H07:
ADX_5484_A04:
PRD−1414:
PRD−1417:
上記の各配列中の「^＊」は停止コドンおよび各アドネクチンのＣ末端を示す。

Ｎ末端のＭを各タンパク質の細菌による発現の間に除いた。精製PRD−1414およびPRD−1417タンパク質のＣ残基を、各タンパク質の特徴付けの前にＰＥＧに結合させた。

表５に示すように、Ｃ末端に野生型グルタミン酸の代わりにプロリンを含むＣ末端を有するアドネクチン(RTEからRTPへの変異) は、より高い熱安定性を示す。ヒト^１０Ｆｎ３と
^１１Ｆｎ３の間の天然のリンカー上でモデリングされたより長いＣ末端を、プロリンおよびヘキサヒスチジン精製タグのみを含むより短い操作Ｃ末端で置換したときに、いくつかの例において安定性の上昇が観察された。より短い操作Ｃ末端およびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を有する^１０Ｆｎ３タンパク質において、Ｃ末端プロリンの付加時にも、熱安定性の向上が見られた。安定性の向上は、この特定の位置におけるプロリンの存在によるものということができる。

実施例２: Ｃ末端プロリンによる、第二のＰＣＳＫ９アドネクチンの安定化
本実施例は、他のＰＣＳＫ９アドネクチン分子の熱安定性もまた、Ｃ末端プロリンの添加により向上することを示す。

この実施例において、ＰＥＧ化(４０kDa分枝ＰＥＧ)ＰＣＳＫ９アドネクチンADX_2013_E01のＣ末端を、NYRTEIEKPCQ(配列番号１０１) からNYRTPC(配列番号１０２)に変異させ、熱安定性をＴＳＦにより測定した。このアドネクチンのアミノ酸配列は、国際公開第２０１１/１３０３５４号に記載されている。結果から、NYRTEIEKPCQ(配列番号１０１)Ｃ末端を有するＰＥＧ化アドネクチンは、７０℃のＴｍを有し、NYRTPC(配列番号１０２)Ｃ末端を有するＰＥＧ化アドネクチンは、７６℃のＴｍを有することが示された。

したがって、このＰＣＳＫ９アドネクチンの熱安定性は、Ｃ末端プロリンの存在により６℃上昇する。

実施例３: 種々のＣ末端の熱安定性についての比較
この実施例は、Ｃ末端にプロリンを有する、または有さないアドネクチンならびにＣ末端に２つのプロリンを有するアドネクチンの熱安定性についての比較を示す。

実施例１に記載するアドネクチンの２つ(ＰＣＳＫ９に結合するADX_2392_D09およびミオスタチンに結合するADX_2987_H07) および１つの付加的な、異なる標的に結合するアドネクチン(アドネクチン１、標的Ｘに結合)を、表６に記載するようにＮ末端において修飾し、その熱安定性および単量体％を決定した。異なる標的(Ｘ)に対するアドネクチン(「アドネクチン１」)もまた、同じＣ末端配列を用いて修飾した。熱安定性をＴＳＦにより決定し、単量体％をＳＥＣにより決定した。

表６に記載する結果は、Ｃ末端の特性は、単量体％には有意な影響を全く及ぼさないが、融解温度(Ｔｍ)には影響を及ぼすことを示す。実施例１に記載するように、両方のアドネクチンについて、NYRTPH_６(配列番号１０５)は、NYRTH_６(配列番号１０４)と比較して、ＰＣＳＫ９アドネクチンについては４℃、およびミオスタチンアドネクチンについては６℃熱安定性を上昇させる。さらに、第二のプロリンの存在により、単一のプロリンによるのと同等の安定化効果がもたらされる。
したがって、１または２個のＣ末端プロリンの存在により、Ｃ末端プロリンを有さない同じ分子と比較して、アドネクチンの熱安定性が向上する。

実施例４: Ｃ末端プロリンの付加により溶解度が上昇する
この実施例は、Ｃ末端プロリンの存在が、Ｃ末端プロリンを持たない同じタンデムアドネクチンと比較して、タンデムアドネクチンの溶解度を上昇させることを示す。

タンデムアドネクチン、すなわち、リンカーで結合した、互いに異なる標的に結合する、NYRTE(配列番号１０７) Ｃ末端またはNYRTP(配列番号１０８) Ｃ末端のいずれかを含む２つのアドネクチンを大腸菌ＢＬＲ細胞で発現させ、３０℃で発酵させた。プロリンを有さないタンデムの力価は、１.２g/L 溶解タンパク質および総タンパク質２.８g/Lであり、これにより、発現されているタンパク質は、４３％が可溶性であることが示された。プロリンを有する該タンデムの力価は溶解性タンパク質２.５６g/Lおよび総タンパク質２.６１g/Lであった。プロリンを有さないタンデムの不溶画分を復元し、９８％純粋であり、２.５mg/mLが単量体である溶液を得た後であっても、このタンパク質組成物は、標的に対する有意な結合を示さず、このことから、該タンパク質組成物は、適切に再フォールディングし得ないことが示された。

したがって、２つのタンパク質間の差異は、Ｃ末端にＥ対Ｐが存在すること似すぎないことを考慮すると、結果は、プロリンの存在がタンデムの溶解度を上昇させることを示すものである。

背景技術、発明の詳細な説明、図面の簡単な説明および実施例で引用する各文献(特許、特許出願、雑誌の記事、アブストラクト、研究室マニュアル、書籍、GENBANK(登録商標)アクセス番号、SWISS-PROT(登録商標)アクセス番号または他の開示を含む)は、その全体の記載が、引用により本明細書中に包含される。

本発明は、本明細書に記載の態様により範囲が限定されるものではなく、該態様は、本発明の個々の態様の１個の例示であることを意図するものであり、機能的に等価なものは、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。本発明のモデルおよび方法への種々の改変は、本明細書に記載のものに加えて、前述の記載から当業者には明らかなものであり、これらも同様に、本明細書の範囲内に含まれることが意図されている。該改変または他の態様は、本発明の範囲および精神から離れなければ、実施することができる。

Claims

標的に特異的に結合する、単離されたフィブロネクチンベースのスキャフォールド(ＦＢＳ)タンパク質であって、該ＦＢＳが非天然起源のＦＢＳであり、該ＦＢＳがＣ末端において、アミノ酸配列ＰｍＸｎ(Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１である整数である)からなる部分に連結しており、該ＰｍＸｎ部分が、ＰｍＸｎ部分に連結していないＦＢＳタンパク質と比較して、ＦＢＳタンパク質の性質を増強させる、単離されたＦＢＳタンパク質。
該部分がＰからなる(ｍは１であり、ｎは０である)、請求項１記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該部分がＰＰからなる(ｍは２であり、ｎは０である)、請求項１に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該部分がＰｍＸｎからなる(ｎは１〜１５０である)、請求項１に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該部分がＰｍＸｎからなる(ｎは１〜１０である)、請求項１に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該部分がＰｍＸｎからなる(ｎは１〜５である)、請求項１に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該部分が、PI、PC、PID、PIE、PIDK(配列番号６１)、PIEK(配列番号６３)、PIDKP(配列番号６５)、PIEKP(配列番号６７)、PIDKPS(配列番号６９)、PIEKPS(配列番号７１)、PIDKPC(配列番号７３)、PIEKPC(配列番号７５)、PIDKPSQ(配列番号７７)、PIEKPSQ(配列番号７９)、PIDKPCQ(配列番号８１)、PIEKPCQ(配列番号８３)、PHHHHHH(配列番号８７)またはPCHHHHHH(配列番号８６)からなる、請求項１に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
ＦＢＳタンパク質が、Ｆｎ３タンパク質である、請求項１〜７のいずれか記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
Ｆｎ３タンパク質が、^１０Ｆｎ３タンパク質である、請求項８に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
^１０Ｆｎ３タンパク質がヒト^１０Ｆｎ３タンパク質である、請求項９に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
少なくとも１つのループまたは１つのスキャフォールド領域に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
アミノ酸配列
((X)_u、(X)_v、(X)_w、(X)_x、(X)_yおよび(X)_zは、野生型アミノ酸配列(配列番号１)からなるか、対応する野生型配列に少なくとも１つのアミノ酸の差異を含み、該配列は、１〜１０個のスキャフォールド、Ｎ末端および／またはＣ末端変異を含んでいてよい)
を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
配列番号１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離されたＦＢＳタンパク質であって、該ＦＢＳタンパク質のＣ末端アミノ酸残基が、ＰｍＸｎからなる部分に融合しており、該ＦＢＳタンパク質が、５００nM未満のＫ_ｄで標的に特異的に結合し、該標的には、配列番号１を含む、野生型^１０Ｆｎ３分子は結合しない、単離されたＦＢＳタンパク質。
配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
ＰｍＸｎからなる部分が、ＦＢＳタンパク質のＣ末端アミノ酸残基に、ペプチド結合を介して結合している、請求項１〜１５のいずれか記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
ＰｍＸｎがＰまたはＰＣである、請求項１〜１６のいずれか記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
配列番号１に少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか記載の、単離されたＦＢＳタンパク質であって、ＦＢＳタンパク質のＣ末端アミノ酸残基が、ペプチド結合を介してプロリンに結合しており、該ＦＢＳタンパク質が、５００nM未満のＫ_ｄで標的に特異的に結合し、該標的には、配列番号１を含む野生型^１０Ｆｎ３分子が結合しない、単離されたＦＢＳタンパク質。
ＰｍＸｎの少なくとも１つのＸがシステインである、請求項１〜１８のいずれかに記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該システインが異種性部分に結合している、請求項１９記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該異種性分子が検出可能な部位である、請求項２０記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
該異種性分子が薬物部分であり、該薬物部分とＦＢＳが、ＦＢＳ−薬物結合体を形成する、請求項２０または２１に記載の単離されたＦＢＳタンパク質。
ＰｍＸｎによりもたらされる性質の増強が、安定性の上昇である、請求項１〜２２のいずれかに記載の単離されたタンパク質。
安定性の上昇が、少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃またはそれ以上のＴｍの上昇である、請求項２３記載の単離されたＦＢＳタンパク質。