JP2017514916A - 水性点眼液およびドライアイ症候群の治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、担体溶液中に、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたはその薬学的に許容可能な塩を含む滅菌水性点眼液であって、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンの遊離チオール基の含量が、８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである、点眼液に関係する。本発明はまた、前記点眼液を含む容器、ならびにドライアイ症候群またはドライアイの徴候および／もしくは症状の予防または治療におけるその使用に関係する。

Description

本発明は水性点眼液に関する。本発明はまた、水性点眼液を収容する容器に関する。本発明はさらに、新規の水性点眼液を使用した、ドライアイ症候群の治療方法に関する。本方法は、ドライアイの徴候および／または症状の緩和に有用である。本方法は、チオール化キトサンを含む水性点眼液を、それを必要とする対象へ投与することを含む。

ドライアイ症候群（ＤＥＳ）は、ドライアイ疾患とも称されるが、とても一般的な眼表面疾患である。約４０００万人のアメリカ人が何らかの種類のドライアイに罹患し、その大部分である５０歳以上が、中等度〜重度のドライアイを有している（Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、２００３、Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｒｙ ｅｙｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｍｏｎｇ ＵＳ ｗｏｍｅｎ、Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（１３６）：３１８〜３２６ページ；Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｄａｎａら、２００９、Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｒｙ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｍｏｎｇ ＵＳ ｍｅｎ：ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｉｅｓ、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（１２７）：７６３〜７６８ページ）。

概して、ドライアイ疾患は、涙液膜の不安定性および機能不全（涙液蒸発の増加および／または水分分泌の減少など）と関連する任意の症候群とすることができる。一般用語である「ドライアイ疾患」と称される適応症のうちには：乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、加齢関連のドライアイ、スティーヴンズジョンソン症候群、シェーグレン症候群、眼瘢痕性類天疱瘡、角膜損傷、眼表面感染症、ライリーデイ症候群、先天性無涙液症、栄養障害または欠乏症（ビタミン欠乏症を含む）、薬理学的副作用、腺および組織の破壊、自己免疫障害および他の免疫不全障害、ならびに昏睡状態の患者におけるまばたき不能がある。また、浮遊微小粒子、煙、スモッグ、および過度に乾燥した空気への環境曝露、ならびにコンタクトレンズ不耐性およびコンピューター作業またはコンピューターゲームによって引き起こされる眼のストレスによって引き起こされるドライアイ症状も含まれる。

ドライアイ疾患を伴う高度な共存症を含む他の疾患：アレルギー性結膜炎（季節性および慢性）、眼瞼炎およびマイボーム腺機能障害がある。これらの状態は、涙液膜の性質および安定性に影響を与え、ドライアイの徴候および症状をもたらす。

光学的屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー上皮下角膜切除術（ＬＡＳＥＫ）およびレーザー角膜内切削形成術（ＬＡＳＩＫ）などのレーザー視力矯正法もまた、涙液膜機能に悪影響を与え、（一時的な）ドライアイ疾患を頻繁に引き起こす。

現在、ＤＥＳの管理には、環境管理、増悪因子の回避、眼瞼衛生、涙液補給（人工涙液）、分泌促進薬（涙液の生成を増加するために）、涙点プラグ、抗炎症剤（シクロスポリン、ステロイド）、加湿器、さらには唾液腺自家移植（Ｂｅｈｒｅｎｓ、Ｄｏｙｌｅら、２００６、Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ Ｄｅｌｐｈｉ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ、Ｃｏｒｎｅａ（２５）：９００〜９０７ページ）を含む、薬理学的治療および非薬理学的治療の両方が含まれる。現在、ＤＥＳを治療するための利用可能な選択肢は十分ではない。日中、非常に多くの回数での人口涙液の導入を繰り返すことが対象に必要とされるため、涙液補給でさえ、理想的な治療選択肢とはならない。

ＤＥＳ症状を軽減するために、いくつかの利点をもたらす潜在的な助剤として種々のポリマーが開示され、実際、いくつかの人工涙液は、１つまたは複数のポリマーを含み、ＥＵで現在最もよく売れている上位５つのドライアイ用市販（ＯＴＣ）製品（Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ（登録商標）、Ｓｙｓｔａｎｅ（登録商標）、Ｈｙｌｏ−Ｃｏｍｏｄ（登録商標）、Ｏｐｔｉｖｅ（登録商標）およびＡｒｔｅｌａｃ（登録商標））が含まれる。これらのポリマーは、眼粘膜を保護し、眼表面に潤滑性をもたらすことを目的としている。例としては、セルロース誘導体、ヒアルロン酸、液体ポリオール、ポリビニルアルコール、ポビドン、カーボポールおよびヒドロキシプロピルグアーが含まれる。ＤＥＳを治療するための製品中に使用されるポリマーは、眼表面上の滞留時間が比較的短く、頻繁な滴下を必要とする。眼滞留時間を増加させるために、いくつかの製剤は、ワセリンまたは鉱油を含んでいる；しかしながら、著しくかすんだ状態になるため、これらの高粘性製品は夜、就寝前のみに使用することができる。（Ａｂｅｌｓｏｎら、２００８、Ｔｅａｒ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ．Ｉｎ：ＡｌｂｅｒｔおよびＭｉｌｌｅｒ編、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、第３版、１巻、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、２８７〜２９２ページ）。他のすべての涙液代替品は、日中、繰り返し滴下しなければならない。

これらのポリマーに対するいくつかの潜在的な改良が、開示されている。著しくかすんだ状態を引き起こさずに眼表面上の製剤の滞留時間を増加させるために、１つの潜在的な改良を、顕著な粘膜付着特性を有するポリマーに用いるべきであろう。キトサンは、天然ポリマーであるキチンに由来するポリカチオン性ポリマーであるが、その粘膜付着特性がよく知られている。キトサンを含む眼科用製剤の眼滞留時間は、その粘度増強特性のためだけではなく、眼表面上の負に帯電したムチンとのキトサンの相互作用のために、増加させることができる（Ｗａｄｈｗａ、Ｐａｌｉｗａｌら、２００９、Ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｏｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（９）：１６３９〜１６４７ページ）。さらに、キトサンは、種々の病原微生物に対して抗菌活性を有する（Ｆｅｌｔ、Ｃａｒｒｅｌら、２０００、Ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｓ ｔｅａｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ：ａ ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｅｎｄｏｗｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ、Ｊ Ｏｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ （１６）：２６１〜２７０ページ；Ｄａｉ、Ｔａｎａｋａら、２０１１、Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｗｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｂｕｒｎｓ：ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉ Ｉｎｆｅｃｔ Ｔｈｅｒ（９）：８５７〜８７９ページ）。

ポリマーのチオール化が、それらの粘膜付着特性をさらに増加させるために開示されている。ＥＰ１１２６８８１Ｂ１では、少なくとも１つの非末端チオール基を含む粘膜付着性ポリマーが開示されている。組織増強用の埋込体を調製するためのチオール化多糖類の使用は、ＷＯ２００８／０７７１７２で開示され、前記チオール化ポリマーが、ポリマー網目構造の安定化をもたらすジスルフィド結合の形成によって特徴づけられている。ＷＯ２００８／０７７１７２の優先権主張出願であるＡ２１３６／２００６は、チオール化ポリマーのさらなる適用分野を開示している。

チオール基を有する配位子の共有結合によるキトサンの修飾（すなわち、チオール化）が開示されている。チオール化が、キトサンの粘膜付着特性を増加することも開示されている（ＫａｓｔおよびＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ、２００１、Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ−ｔｈｉｏｍｅｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２２）：２３４５〜２３５２ページ；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ、Ｈｏｒｎｏｆら、２００４、Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎｓ、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ（５７）：９〜１７ページ；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ、２００５、Ｔｈｉｏｍｅｒｓ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（５７）：１５６９〜１５８２ページ；Ｓｃｈｍｉｔｚ、Ｇｒａｂｏｖａｃら、２００８、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ（３４７）：７９〜８５ページ）。いくつかのチオール化キトサンの抗菌有効性が同様に評価された（ＷＯ２００９１３２２２６Ａ１；ＷＯ２００９１３２２２７Ａ１；ＷＯ２００９１３２２２８Ａ１；Ｇｅｉｓｂｅｒｇｅｒ、Ｇｙｅｎｇｅら、２０１３、Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１４）：１０１０〜１０１７ページ）。

Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、チオール基を有するアミノ酸Ｌ−システインの誘導体である。ＮＡＣは、抗酸化活性を有する還元剤である。また、ムチンジスルフィド結合を還元することによって、粘液粘度を低下させるその能力もよく知られている。これらの粘液溶解特性のため、ＮＡＣは、過度の粘液産生を伴う気管支肺障害において粘液粘度を低下するために広く使用される。粘液溶解および抗酸化剤であるＮＡＣを含む局所用眼科用製剤は、マイボーム腺機能障害およびＤＥＳなどの角膜疾患の治療に使用される（Ｌｅｍｐ、２００８、Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｒｙ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍ Ｊ Ｍａｎａｇ Ｃａｒｅ（１４）：Ｓ８８〜１０１ページ；Ａｋｙｏｌ−Ｓａｌｍａｎ、Ａｚｉｚｉら、２０１０、Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｉｂｏｍｉａｎ ｇｌａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｊ Ｏｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ（２６）：３２９〜３３３ページ）。ＥＰ０５５１８４８Ｂ１では、３％から５％（ｗ／ｖ）の間の濃度のＮＡＣおよびポリビニルアルコールを含む、ＤＥＳの治療のための眼科用医薬組成物が開示されている。

ＮＡＣを使用してキトサンをチオール化すると、ウサギ眼上のその眼滞留時間が、非チオール化キトサンと比較すると増加することが開示されている（Ｄａｎｇｌ、Ｈｏｒｎｏｆら、２００９、Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｕｌａｒ Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ ¹²⁴Ｉ−ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ Ｕｓｉｎｇ ＭｉｃｒｏＰＥＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＲＶＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（５０）：３６８９ページ）。

Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンＨＣｌが、マウスドライアイモデルにおけるマウス眼の眼表面に対していくつかの有益な効果を有することが開示されている（Ｈｏｎｇｙｏｋ、Ｃｈａｅら、２００９、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ Ｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｒｙ ｅｙｅ、Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（１２７）：５２５〜５３２ページ；Ｈｏｒｎｏｆ、Ｇｏｙａｌら、２００９、Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｒｙ Ｅｙｅ−Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｍｏｄｅｌ、ＡＲＶＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（５０）：３６６３ページ）。

チオール化ポリマーの種々の使用を再検討し、論じているさらなる刊行物を下記に挙げる：

Ｈｏｒｎｏｆら、Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ ｏｃｕｌａｒ ｉｎｓｅｒｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ８９（２００３）４１９〜４２８ページ；Ｈｏｒｎｏｆ，Ｍ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ、２００３；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら、Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｉｏｍｅｒ／ＧＳＨ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌｅａｓｅ ９３（２００３）９５〜１０３ページ；Ｍ．Ｈｏｒｎｏｆら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｐｈｉｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｒｎｅａ ｏｆ Ｒａｂｂｉｔｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９１（１２）２００２、２５８８〜２５９２ページ；およびＣｌａｕｓｅｎら、Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９（５）２００２、６０２〜６０８ページ；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃ．２６（１９８９）、９、１２９１〜１３０４ページ；Ｚｈｅｎｇら、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３（６）２００２、１３０４〜１３１１ページ；Ｗａｎｇら、Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ＮＡＣ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａ Ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ｐａｒｔ Ｂ：Ａｐｐｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒ ８８Ｂ、１５０〜１６１ページ、２００９；ＷＯ２００８／０９４６７５Ａ２；ＵＳ５，４１２，０７６Ａ。

しかしながら、長期安定性、耐容性、安全性、ドライアイ症候群の治療における有効性、および改善された患者の服薬順守の必要条件を満たす、チオール化キトサンを含む製剤はこれまでのところ開示されていない。ドライアイ治療の最新療法の無効性および不便性の結果として、上記の必要条件を満たすドライアイ症候群の治療方法が依然として必要とされている。

本発明は、チオール化キトサンを含む水性点眼液を対象とする。より詳細には、本発明は、担体溶液中に、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたはその薬学的に許容可能な塩を含む滅菌水性点眼液を対象とし、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンの遊離チオール基の含量は、約８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜約２８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである。

本発明はさらに、前記水性点眼液を収容する容器を対象とする。

本発明はまた、ドライアイ症候群、ドライアイの徴候および／または症状の予防または治療における前記水性点眼液の特定の使用も対象とする。したがって、本発明はまた、このような治療を必要とする対象における前記疾患および症状の治療方法も対象とする。本方法は、まずドライアイ症候群またはドライアイ症状を患う対象を特定するステップと、次いで、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたはその薬学的に許容可能な塩を含む有効量の水性点眼液を対象に投与するステップとを含む。

特に、本発明は、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、加齢関連のドライアイ、スティーヴンズジョンソン症候群、シェーグレン症候群、眼瘢痕性類天疱瘡、角膜損傷、感染症、ライリーデイ症候群、先天性無涙液症、ＰＲＫ治療、ＬＡＳＥＫ治療、および／またはＬＡＳＩＫ治療、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎およびマイボーム腺機能障害、栄養障害または欠乏症（ビタミン欠乏症を含む）、薬理学的副作用、腺および組織の破壊、自己免疫障害および他の免疫不全障害、ならびに昏睡状態の患者におけるまばたき不能のうちの１つもしくは複数によって引き起こされる、または１つもしくは複数と関係する、ドライアイの徴候および／または症状の治療に適する。また、浮遊微小粒子、煙、スモッグ、および過度に乾燥した空気への環境曝露、ならびにコンタクトレンズ不耐性およびコンピューター作業またはコンピューターゲームによって引き起こされる眼のストレスによって引き起こされるドライアイ症状も含まれる。

実施例３で記述されるように、２５℃および相対湿度４０％で、異なる包装を使用した長期保存中の、０．１％（ｗ／ｗ）Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンＨＣｌを含む水性点眼液における、遊離チオール基の安定性の比較の図である。灰色棒は、グループ１（酸素吸収剤を含む包装および保存）における保存中の異なる時点（開始点、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、９カ月、および１２カ月）でのチオール基の含量を示し、白色棒は、グループ２（酸素吸収剤を含まない包装および保存）におけるチオール基の安定性を示す。 実施例４で記述されるように、周囲の空気、湿度、および温度条件下で３０日間、単回投与単位で短期保存中の、０．１％（ｗ／ｗ）Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンＨＣｌを含む水性点眼液における、遊離チオール基の安定性の図である。 ）Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンＨＣｌの部分構造の概略図である。 実施例６で記述されるように合成され、実施例７で記述されるように分析された、ポリマー１およびポリマー６のチオール基計測の結果の図である（ＴＣＥＰを用いていない：灰色棒、ＴＣＥＰを用いた還元後：白色棒、３回計測の平均値と標準偏差）。 実施例６で記述されるように合成され、実施例７で記述されるように分析された、ポリマー１およびポリマー６の０．５％（ｗ／ｗ）溶液の動的粘度の測定の結果の図である（ＴＣＥＰを用いていない：灰色棒、ＴＣＥＰを用いた還元後：白色棒）。 Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンＨＣｌ−ムチン網目構造の線形粘弾性範囲の測定を示す図である。 ¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣ、¹²⁴Ｉ−キトサンＨＣｌおよびＮａ¹²⁴Ｉでそれぞれ治療された眼の個々の時間−放射能濃度曲線に由来する、計算された曲線下面積値（０〜９６時間）を示す図である。 ¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣおよび¹²⁴Ｉ−標識チオール化ヒアルロナン（ＨＡ−システアミン）で治療した眼の個々の時間−放射能濃度曲線（％ＡＤ×ｈ／ｇ）より計算された曲線下面積（ＡＵＣ）値（０〜７２時間）を示す図である。

発明者らは、ドライアイ症候群を患う患者における、ドライアイ症候群の治療にまたは１つもしくは複数のドライアイの徴候および／もしくは症状の改善に、ならびに／あるいはドライアイ疾患を患う患者における涙液膜の性質の改善に有効な、安定な点眼液を予想外に見い出した。本発明の滅菌水性点眼液は、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたはその薬学的に許容可能な塩を担体溶液中に含み、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンの遊離チオール基の含量は、約８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜約２８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである。好ましくは、薬学的に許容可能な塩として、塩酸塩が使用される。

下記において、「キトサン−ＮＡＣ」という用語は、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンおよびその薬学的に許容可能な塩の両方を表す。

本発明の方法は、現在最も一般的に使用されるドライアイ疾患の治療−人工涙液（すなわち、生理食塩水またはポリマーを含む溶液）および抗炎症剤（シクロスポリン）を改良することである。

本発明は、任意のドライアイ症候群の治療に適している。概して、本発明に関するドライアイ症候群またはドライアイ疾患は、涙液膜の不安定性および／または機能不全（涙液蒸発の増加および／または水分分泌の減少など）と関連する任意の症候群とすることができる。

特に、本発明は、乾性角結膜炎、加齢関連のドライアイ、スティーヴンズジョンソンズ症候群、シェーグレン症候群、眼瘢痕性類天疱瘡、角膜損傷、感染症、ライリーデイ症候群、先天性無涙液症、ＰＲＫ治療、ＬＡＳＥＫ治療、および／またはＬＡＳＩＫ治療、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎およびマイボーム腺機能障害、栄養障害または欠乏症（ビタミン欠乏症を含む）、薬理学的副作用、腺および組織の破壊、自己免疫障害、免疫不全障害、ならびに昏睡状態の患者におけるまばたき不能のうちの１つもしくは複数によって引き起こされる、または１つもしくは複数と関係する、ドライアイ疾患の治療に適する。また、浮遊微小粒子、煙、スモッグ、および過度に乾燥した空気への環境曝露、ならびにコンタクトレンズ不耐性およびコンピューター作業またはコンピューターゲームによって引き起こされる眼のストレスによって引き起こされるドライアイ症候群も含まれる。

背景技術で述べられているとおり、ドライアイ疾患を伴う高度な共存症を含む他の疾患：アレルギー性結膜炎（季節性および慢性）、眼瞼炎およびマイボーム腺機能障害がある。これらの状態は、涙液膜の性質および安定性に影響を与え、ドライアイの徴候および症状をもたらす。

光学的屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー上皮下角膜切除術（ＬＡＳＥＫ）およびレーザー角膜内切削形成術（ＬＡＳＩＫ）などのレーザー視力矯正法もまた、涙液膜機能性に悪影響を与え、（一時的な）ドライアイ疾患を頻繁に引き起こす。

本治療方法は、（ｉ）ドライアイ疾患を患う対象を特定するステップと、（ｉｉ）キトサン−ＮＡＣを含む水性点眼液を含む水性点眼液を、対象の眼に投与するステップとを含み、前記ドライアイ疾患は、上述の疾患、症候群、およびストレス因子のうちの１つまたは複数によって引き起こされるかまたはそれと関係する。

本発明の製剤の１つの大きな利点は、対象の眼上に１回滴下した後、キトサン−ＮＡＣが、涙液膜の厚さに対する回復効果を最大２４時間有することである。これは、人口涙液を使用するときなどの涙液補充療法で必要になるような、製品を眼に何度も滴下することを対象はしなくてもよいことを意味する。ドライアイ症状を減少させるためおよび／または涙液膜組成物を改良するために有効な、水性キトサン−ＮＡＣ点眼液の局所的な１日用量は、１つまたは複数の単位用量投与に分割することができる。対象は必要に応じて製品を使用することになるが、概してこれは１日２回を超えることはないはずであり、多くの場合、製品は１日１回のみ使用されることになる。本発明のキトサン−ＮＡＣ溶液の好ましい投薬計画は、１日１回、片眼につき０．１％（ｗ／ｗ）溶液を１滴である。そのため、本発明の製剤の大きな利点は、それが１日１回の製品になり、かつより優れた患者の服薬順守を確実にするであろうということである。

本発明の方法による治療後、１つまたは複数のドライアイの徴候および／または症状が対象において減少するかまたは軽減する。ドライアイ症状としては、乾燥感、灼熱感、眼の痒み、眼の不快感、羞明、異物感、かすみ目、ざらつき感、ならびに霧視、読書速度の低下、羞明、および視力消失を含む視覚障害および／または視覚消失が含まれる。ドライアイの徴候は、角膜および／または結膜の染色（フルオレセイン染色、リサミングリーン染色またはローズベンガル染色を使用する）、シルマー試験紙テスト、ゾーンクイック糸、涙液膜の容量オスモル濃度、涙液層破壊時間および涙液メニスカス高などの計測によって評価される。

ＤＥＳの徴候および／または症状が、本発明の製剤を使用して改善される１つの理由は、おそらく眼涙液膜の厚さに対する製剤の回復効果であり、その回復効果は、チオール化キトサンの眼表面ムチンとの化学的相互作用、または眼表面へ適用後にキトサン−ＮＡＣの架橋によって形成される眼表面上の保護被膜の存在、あるいは両効果の組み合わせによって生じる可能性がある。

キトサン−ＮＡＣポリマーを含む水性点眼液の、対象に投与される「有効量」とは、ドライアイ疾患の臨床的な徴候および／または症状の減少に有効な量である。この量としては、担体溶液中、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）のキトサン−ＮＡＣポリマーが含まれる。

０．０５％を下回る量の場合、キトサン−ＮＡＣは、患者において臨床効果が見られなくなるような低濃度となる。０．５％を大きく超える場合、患者の耐容性を超え始め、キトサンの任意の透過促進効果がいっそう顕著になる。水性点眼液中のキトサン−ＮＡＣの濃度は、好ましくは０．０５〜０．３％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．０５〜０．２％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは０．０８〜０．１６％（ｗ／ｗ）である。濃度が０．０５％を大きく下回る場合、粘膜付着特性およびそれによる臨床効果はそれほど顕著ではない。濃度が０．３％を大きく超える場合、キトサン−ＮＡＣ製剤が高粘度なため、眼へ適用後に「凝集塊」が形成され、溶液が、眼表面上にそれほど均等に広がらない。濃度範囲が０．０５％〜０．３％のキトサン−ＮＡＣ溶液は、ヨウ素¹²⁴放射標識キトサン−ＮＡＣを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験（実施例９および１０を参照のこと）によって立証されたように、眼表面上に均一に分布する。水性点眼液中のキトサン−ＮＡＣの濃度は、最も好ましくは、臨床効果および患者耐容性の両方が最適であるため、約０．１％である。

水性点眼液中に存在する、キトサン−ＮＡＣ上に結合したチオール基の大部分は、遊離チオール基、すなわち、下記で定義されるような非架橋チオールの形態であることが必要とされる。これらのチオール基の大部分は、眼表面上へ導入されるときにのみ反応するように遊離したままであることが重要である。場合によっては、遊離チオール基の量がかなり低くてもよく、それでもなお、それを滴下するときに、多少の薬効が眼にもたらされる。しかしながら、好ましくは、本発明の製剤中のキトサン−ＮＡＣポリマーの遊離チオール基の含量は、約８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇであり、好ましくは約１０５μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ、より好ましくは１１０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ、最も好ましくは１４０〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇの範囲の遊離チオール基を有する。

遊離チオール基の濃度が８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇを大きく下回る場合、キトサン−ＮＡＣとムチンの間の相互作用は弱く、未修飾キトサンＨＣｌと同等であるが、遊離チオール基の濃度が３００μｍｏｌ／ｇ以上と非常に高濃度な場合は、コアポリマーキトサンの物理化学的特性が、そのカチオン特性の低下および水中での溶解度の制限のために、ポリマーが水性点眼液の調製に有用ではないような程度に変化する。

キトサン−ＮＡＣ上に固定化されたこの量の遊離チオール基は、本発明の眼科用製剤がドライアイ患者の眼に使用される状態にあるときに、存在することが必要とされる。このことは、本発明の水性点眼液中に存在する遊離チオール基が、比較的長期の保存時間で残存していなければならないことを意味する。したがって、結果として生じるドライアイ製品は、安定でなければならず、かつ上述の遊離チオール基を少なくとも約１２カ月間、より好ましくは少なくとも約１８カ月間、さらにより好ましくは少なくとも約２４カ月間保持しなければならない。

水性点眼液中のキトサン−ＮＡＣ上に固定化された遊離チオール基の量は、当業者によって、エルマン試薬を用いるなどの公知の方法で、測定することができる（実施例１を参照のこと）。

水性点眼液中のキトサン−ＮＡＣポリマー上の遊離チオール基の量が多いことが重要であるという事実に加えて、本発明の溶液中のキトサン−ＮＡＣポリマー上の架橋チオール（ジスルフィド）の量が少ないことも好ましい。水性点眼液の調製および保存中に、キトサン−ＮＡＣ上に固定化されたチオール基の架橋が生じる恐れがある。製剤中に存在する架橋チオールの量が低いことは、本発明のキトサン−ＮＡＣポリマー製剤の好ましいパラメータである。

したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン中の架橋チオール基の量は、その中の全チオール基の３０％以下、好ましくは２５％以下、最も好ましくは１５％以下である。

とりわけ、この好ましい実施形態において、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン中の架橋チオール基の量は、溶液を室温で少なくとも１２カ月間保存した後で、その中の全チオール基の３０％以下、好ましくは２５％以下、最も好ましくは２０％以下である。

製剤中に存在する架橋チオール基の量が高すぎる場合は、水性点眼液の特性は所望のパラメータの範囲を超えて変化することになり、例えば、水性点眼液の粘度が、点眼薬に適切になるには高すぎることになるはずである。

下記でより詳細に説明されるように、そのチオール基は架橋していないか、または架橋チオール基の量が、全チオール基の５％未満、好ましくは４％以下の架橋チオール基の量でなど、最小限に架橋されているのみである、キトサン−ＮＡＣの製造が可能であることが見い出された。とりわけ、もしこのようなキトサン−ＮＡＣが本発明の点眼液の製造に使用される場合、遊離チオール基は、溶液の全ライフサイクル中で、安定な傾向にある。

そのため、製剤の製造中にこのようなキトサン−ＮＡＣを使用すると、架橋チオール基の増加は、キトサン−ＮＡＣ原材料に最初に存在する遊離チオール基の量の１０％未満であることが見い出された。さらに、１２カ月、さらには１８カ月を超える溶液の保存中では、架橋チオール基の増加は、製剤中に最初に存在する遊離チオール基の量の１５％未満である。最終的に、酸素障壁をもたらす溶液の第２の容器（下記に定義されるような）が開封される場合でさえ、開封から３０日後の架橋チオール基の増加は、開封前の製剤中に最初に存在する遊離チオール基の量の１５％未満である。

本質的に、本発明のチオール化キトサン眼科用製剤は、下記のステップに従って作られる：
１．キチンを、小エビまたはズワイガニの殻などの甲殻類の殻より単離するステップ、
２．キトサンを、当技術分野で周知の化学的方法、例えば、アルカリ脱アセチル化によってキチンより調製するステップ；
３．キトサンを、本明細書で記述されるようなＮ−アセチルシステインを使用するなど、チオールを有する配位子の共有結合によってチオール化するステップ；
４．次いで、キトサン−ＮＡＣを、本明細書で記述されるような水性点眼液の形態に配合するステップ；および
５．次いで、キトサン−ＮＡＣを含む水性点眼液を、本明細書で記述されているようなその安定性を保証するはずの適切な容器に入れるステップ。

本明細書で詳細に記述されているように、化学的見地から、キトサンは、高い生体適合性および低毒性などの好ましい生物学的特性を有するポリカチオン性バイオポリマーである。本発明の製剤用のキトサンを製造するための原材料源は、結果として生じるキトサンが非常に純粋で、不純物を含まない限り、重要ではない。例えば、キトサンは、非動物源より製造することもできる。本発明のキトサンは、キトサンが本明細書で必要とされ記述される特性を有する限り、種々の方法によって処理することができる。最も一般的には、キトサンの原材料は、甲殼類の殻中のキチンに由来する。キチンは、ロブスター、カニ、および小エビなどの甲殻類食料源の収穫期間中に得ることができる。本発明による製剤において処理されかつ使用されるキトサンの１つの好ましい原材料源であるキチンは、ズワイガニ（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ）の殻に由来する。甲殻類の種々の供給源が、供給が適切である限り、キチンを得て、キトサンを作ることに使用できる。生物学的原材料源に由来するキトサンの調製は、周知であり、多数の科学刊行物、例えば、（Ｃｈａｎｇ、Ｔｓａｉら、１９９７、Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ（３０３）：３２７〜３３２ページ；Ｄｕｔｔａ、Ｄｕｔｔａら、２００４、Ｃｈｉｔｉｎ ａｎｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ Ｓｃｉ Ｉｎｄ Ｒｅｓ（６３）：２０〜３１ページ）で開示されている。

キトサン−ＮＡＣは、キトサンを、チオール基を有する配位子と反応させることによって合成することができる。チオール化の方法は、多数の科学刊行物、例えば、（Ｓｅｋｉ、Ａｏｉら、１９９９、Ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｉｎ ｏｒ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ ｂｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｈａｖｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ、ＪＰ２０００−３０２８０３；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ、Ｈｏｒｎｏｆら、２００４、Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎｓ、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ（５７）：９〜１７ページ；Ｓｃｈｍｉｔｚ、Ｇｒａｂｏｖａｃら、２００８、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ（３４７）：７９〜８５ページ；Ｚｈｕ、Ｓｕら、２０１２、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｆｏｒ ｏｃｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｍｏｌ Ｖｉｓ（１８）：１９７３〜１９８２ページ）で開示されている。

本発明で使用されるキトサン−ＮＡＣは、水性点眼液の調製に有用な濃度範囲内で水溶性であることが必要であり、結果として生じる溶液は、透明でかつ無色であることが必要である。キトサン−ＮＡＣの有機酸または無機酸との塩の形成は、キトサンの水溶解度を増加させる。本発明のチオール化キトサンの適切な塩としては、酢酸、クエン酸、ギ酸、および酒石酸などの有機酸、ならびにＨＣｌおよびＨ₂ＳＯ₄などの鉱酸との任意の薬学的に許容可能な塩が含まれる。キトサン−ＮＡＣ塩酸塩は、本発明の好ましい実施形態である。

重要なことは、合成および精製の後に、キトサン骨格上に固定化された本質的にすべてのチオール基が、遊離形態で、かつジスルフィドのような架橋されていない形態で、すなわち最小限の架橋のみで存在するような反応経路および反応条件が使用されることである。事実上、本発明のチオール化キトサン中のすべての結合チオールは、遊離チオール基の形態であり、すなわちそれらは架橋していない。合成中の最低量の架橋のみが、チオール化キトサンの粘度が規定のパラメータ内にとどまり、かつその水溶解度が水性点眼液の調製に十分である限り、許容可能である。

その合成後に、例えばチオアセチル部分のアルカリ加水分解後に、キトサン−ＮＡＣを還元剤へ暴露することによって、チオール基の架橋度が非常に低い、さらにはゼロのキトサン−ＮＡＣを製造することが可能であることが見い出された。還元剤は、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはＮａＢＨ₄の群から選択してよく、ＮａＢＨ₄が好ましい。さらに、還元ステップは、３０℃以上または好ましくは４０℃以上などの高温で行われるべきであることが見い出された。さらに、還元剤のキトサン骨格ポリマーに対する化学量論比が２：１以上でなど、大量の還元剤の使用が必要とされる。

架橋チオール基の程度が、全チオール基の５％未満、好ましくは４％以下のキトサン−ＮＡＣポリマーを、本実施形態に従って合成することができる。

本発明の最終的なキトサン−ＮＡＣの水溶液の粘度は、特定の範囲内に収まるのが好ましく、本発明者らは、キトサン−ＮＡＣの製造中に、キトサン−ＮＡＣが特定の条件下および特定のパラメータ内で、特に最小限に架橋されたのみであるポリマーをもたらす上述の還元条件に従って処理される場合、キトサン−ＮＡＣの粘度は、この好ましい範囲内のみに収まることを予想外に見い出した。結果として生じる製品の粘度は、キトサン−ＮＡＣが結果として生じる点眼薬製剤に最も有用になるような、許容可能な範囲内に収まるのが好ましい。そのため、キトサン−ＮＡＣポリマーの動粘度（０．５％水溶液、２５℃）は、好ましくは約１〜１５ｍｍ²／ｓの範囲内、より好ましくは約２〜１０ｍｍ²／ｓの範囲内である。粘度があまりにも高い場合、ポリマーが容器内で不溶性粘性物質として残る恐れがあるため、製剤中に好ましい濃度範囲のキトサン−ＮＡＣを含む有用な点眼薬溶液を作ることができない。

キトサン−ＮＡＣは、本発明の製剤において有用となるために精製される必要がある（上記のステップ３の後、とりわけ、キトサン−ＮＡＣを還元剤で処理した後など）。キトサン−ＮＡＣは、結果として生じる製品が純粋になるような方法で洗浄されるべきである。１つの公知の方法が、ＫａｓｔおよびＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ、２００１、Ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ−ｔｈｉｏｍｅｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２２）：２３４５〜２３５２ページで開示されている。

別の方法は、キトサン−ＮＡＣを極性溶媒で洗浄し、続いて、溶媒を除去するために乾燥することであろう。１つの好ましい溶媒は、それが非毒性であり、容易に入手でき、かつ経済的であるため、イソプロピルアルコールであるが、他の溶媒、およびイソプロピルアルコール以外の他のアルコールでも同じく有効であろう。この洗浄は、必要に応じて繰り返すことができ、その都度使用される溶媒の体積に依存する。洗浄および乾燥のステップは少なくとも１回は繰り返されることが好ましい。

乾燥ステップは、室温でおよび標準湿度で行うことができるが、この方法は非常に時間がかかる恐れがある。したがって、乾燥方法は、高温でおよび／または減圧下で行うことが好ましい。キトサン−ＮＡＣの乾燥は、好ましくは少なくとも約４０℃〜約７０℃の高温で、好ましくは少なくとも約５時間行われる。より好ましくは、乾燥方法は、少なくとも約５０℃〜約６０℃の温度で、約１０〜２４時間行われる。１つの好ましい多ステップ精製方法は、キトサン−ＮＡＣポリマーを、イソプロピルアルコールで３回洗浄し、遠心分離し、続いて約６０℃で約１５〜２０時間乾燥することによって固形物を回収することであろう。

本発明による水性点眼液は、少なくとも１つの眼適合性賦形剤を含むことができる。例えば、溶液の張度、粘度を調整すること、またはｐＨを安定させること、活性成分の溶解度を高めること、適用後の眼快適度を高めること、もしくは概して製剤を安定させることに適した任意の賦形剤を使用することができる。

水性点眼液のｐＨは、約５．５〜約７の範囲内のｐＨを有する、任意の生理的におよび眼科用の許容可能なｐＨ調整酸、ｐＨ調整塩基、またはｐＨ調整緩衝液を添加することによって調整される。ｐＨが約５．５を大きく下回ると、生理学的に許容可能なパラメータの範囲を超えるであろう（溶液によって、刺すようなまたは焼けるような激しい感覚が眼にもたらされるであろう）。ｐＨ７を大きく上回る場合、溶液から析出することがないキトサン−ＮＡＣの安定な溶液を形成することは困難である。したがって、安定な溶液の配合を容易にするため、ｐＨが７を下回るのが好ましい。本発明の水性点眼液の好ましいｐＨは、約５．８から約６．８の間であり、ｐＨ６．０〜６．６が最も好ましい。

本発明の製剤に使用される適切な酸の例としては、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸、および類似のものが含まれ、塩基の例としては、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トロメタミン、ＴＨＡＭ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）、および類似のものが含まれる。本発明の好ましい実施形態は、ホウ酸−ホウ酸ナトリウム緩衝系であり、この緩衝系はまた、最も好ましいｐＨ範囲である６．０〜６．６で緩衝能を高めるようなマンニトールなどのポリオールを含む。

製剤の安定性を高めるために本発明の製剤で使用される適切な賦形剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎａ₂−ＥＤＴＡ）、メタ重亜硫酸ナトリウム、マンニトール、ポリエチレングリコール、および類似のものが含まれる。

本発明の局所用眼科用製剤の容量オスモル濃度は、概して、約１５０〜約４００ミリオスモル（ｍＯｓＭ）であり、より好ましくは約２００〜約３５０ｍＯｓＭであり、約２５０〜約３３０ｍＯｓＭの容量オスモル濃度が最も好ましい。容量オスモル濃度は、適切な量の生理的におよび眼科用の許容可能なイオン性または非イオン性の薬剤を使用することによって調整することができる。塩化ナトリウムは、一般的な浸透圧性薬剤である。カリウム、アンモニウム、および類似のものなどのカチオン、ならびに塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、重硫酸塩、および類似のものなどのアニオンで作られた１つまたは複数の等量の塩を、塩化ナトリウムに加えてまたはその代わりに使用し、上述の範囲内の容量オスモル濃度にすることができる。さらに、マンニトール、デキストロース、ソルビトール、グリセロール、グルコース、および類似のものなどの非イオン性薬剤も、容量オスモル濃度の調整に使用することができる。塩化ナトリウムおよびマンニトールが、浸透圧を調整するための好ましい薬剤である。

眼科用製剤は、ＤＥＳの治療に必要とされる定期的な適用に適した、高度な眼快適度をもたらす潤滑剤を含むことができる。ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、液体ポリオール、ヒアルロン酸、およびそれらの薬学的に許容可能な塩、ラブリシン、ならびにセルロース誘導体などの多くの種類の潤滑化剤がある；しかしながら、好ましい薬剤は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。

好ましい実施形態において、本発明による点眼液は、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩に加えて下記賦形剤を含む：
１．０〜１６．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８〜１６ｍｇ／ｍｌの量のホウ酸；
０．０１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５ｍｇ／ｍｌの量のポリエチレングリコール４００；
０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの量のＮａ₂−ＥＤＴＡ；
０．０１〜５．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｍｌの量のマンニトール；
０．０１〜９ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌの量の塩化ナトリウム；および
０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌの量のヒドロキシプロピルメチルセルロース。

本発明による点眼液は滅菌するべきであり、任意の適切な手法で滅菌することができる。
１つの特定の好ましい滅菌方法は、滅菌ろ過である。本発明による点眼液は、塩化ベンザルコニウムなどの保存料を含むことができるが、これはあまり好ましくはない。

キトサン−ＮＡＣを含む水性点眼液は、局所投与のための任意の適切な手段によって患者の眼に投与することができる。これは、水性点眼薬溶液の形態であることが好ましい。この溶液は、開封するまでは滅菌されている使い捨て容器内に入れることができ、そのため、保存料を有する必要がなく、または開封後も滅菌されたままである多回使用容器の形態もしくは保存料を含む製剤とともに多回使用容器内に入れることができる。

キトサン−ＮＡＣポリマーのチオール基は、水溶液中でジスルフィド結合を形成する傾向があり、そのためキトサン−ＮＡＣの粘膜付着特性が低下する。この傾向は、水性点眼液中の酸素の存在に依存することが見い出された。

無酸素の条件下、または本質的に無酸素の条件下で溶液を保存するとき、本発明に従って使用される水溶液中のキトサン−ＮＡＣの遊離チオール基をさらにいっそう安定させることが可能であることが見い出された。無酸素雰囲気は、窒素雰囲気、真空雰囲気、または希ガスからなる雰囲気とすることができる。

そのため、溶液を容器に入れるときは、そのように酸素非存在下で行われるべきである。さらに、容器を本発明の水性点眼液で充填した後は、無酸素のままにするべきである。そのために、本発明はまた、保存中、酸素から遮断された水性点眼液を維持する容器に関する。したがって、本発明の１つの態様は、水性点眼液を収容する本質的に無酸素の容器を含む。「本質的に無酸素」として、１．５％以下の量の酸素を含む雰囲気が理解されるべきである。製剤の製造中および容器へ充填中の溶液中の溶存酸素濃度は、１．０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは０．１ｍｇ／Ｌの範囲である。

好ましい実施形態において、容器は、充填後に点眼液が長期間本質的に無酸素のままであるような、酸素不浸透性材料から作られている。このような容器は、ガラスまたは内側をガラスで覆ったポリマー、金属または内側を金属で覆ったポリマーであってもよい。別の好ましい実施形態において、容器は、容器の壁を通過して酸素が溶液に侵入することを阻止するであろう酸素吸収剤をそこに含むポリマーから作られている。このような酸素吸収材としては、鉄塩、亜硫酸塩、アスコルビン酸、不飽和脂肪酸塩、金属ポリアミド複合体またはパラジウム／Ｈ₂系システム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ／Ｈ₂ ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）が含まれる。例えば、ＷＯ０９／３２５２６では、実質的にその主鎖中に炭素−炭素二重結合を有する熱可塑性樹脂、遷移金属塩、および酸素障壁特性を有する酸素障壁ポリマーが混合された酸素捕捉組成物を含む、活性酸素障壁層を有する膜が開示されている。

さらに、容器自体は、埋め込まれた酸素捕捉物質およびエアーレス閉塞システムを有する気密性材料から製造することができる。

好ましい実施形態において、点眼液を収容する第１の容器、および前記第１の容器を収容する第２の容器が提供される。

そのため、例えば、本発明の点眼液を保持する容器は、それ自体が気密性の小袋または袋の内側に収容される。詳細には、アルミニウム、アルミニウム積層物またはアルミニウム組成物から作られている小袋または袋は、本発明による点眼液を含む１つまたは複数の副容器（すなわち「第１の容器」）をそこに収容してよい。第２の容器、すなわち小袋または袋はまた、いくつかの標準包装で使用されるようなさらなる酸素吸収剤（例えば、ＰＫＴ ＫＨ−２０ Ｐｈａｒｍａｋｅｅｐ（登録商標）またはＳｔａｂｉｌｏｘ（登録商標）脱酸素剤）を含むこともできる。小袋が真空下または不活性雰囲気下で密封される場合でさえ、副容器から残留酸素を除去するために、酸素吸収剤の添加が必要とされ得る。小袋は、１つまたは複数のいずれかの単回投与容器あるいは多回投与容器、例えば、小袋１つ当たり５個の単回投与容器を収容することができる。多回投与容器の場合、本発明による点眼液を、滅菌条件下および本質的に無酸素の条件下で貯蔵しなければならない。

室温で少なくとも１２カ月保存した後で、本発明による容器内に収容されているキトサン−ＮＡＣの遊離チオール基の含量は、８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇであることが好ましく、好ましくは１０５μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである。本発明によれば、これは、遊離チオール基がキトサン−ＮＡＣ上に残り、しかも結果として生じる製剤は、長期間にわたり安定であることを意味する。この期間は、好ましくは少なくとも約１２カ月、より好ましくは少なくとも１８カ月、さらにより好ましくは少なくとも約２４カ月である。この長時間安定性の好ましさは、許容可能なパラメータから外れて、より不安定な製品になる恐れがある、長期保存時間ならびに商用配送およびサプライチェーンの遅延を、いくつかの製品が有するようになるという事実に起因する。

さらに好ましくは、少なくとも１２カ月、より好ましくは少なくとも１８カ月保存された後の、本発明による容器内に収容されているキトサン−ＮＡＣ中の架橋チオール基の量は、その中の全チオール基の３０％以下、好ましくは２５％以下、最も好ましくは２０％以下である。上述のとおり、最小限度の架橋チオール基のみを有するキトサン−ＮＡＣが溶液の製造に使用される場合に、溶液中の遊離チオール基の安定性はとりわけ優れている。

１つまたは複数の第１の容器、例を挙げるとＬＤＰＥから作られる使い捨て容器を収容する第２の容器、例を挙げると気密性小袋がある上述の実施形態において、第１の容器を開封してから少なくとも３０日後の、溶液中の遊離チオール基の含量は、本発明によって定義されるような範囲内で残存することが好ましい。例を挙げると５つの容器を必要とする治療時間は５日であり、そのため、この安定期間は十分すぎるほどである。

上述のとおり、とりわけ最小限度の架橋チオール基のみを有するキトサン−ＮＡＣが、本発明の点眼液の製造に使用される場合、酸素障壁をもたらす第２の容器を開封した後でさえ、遊離チオール基は安定なままであることが見い出された。すなわち、第２の容器を開封してから３０日後での架橋チオール基の増加は、開封前の溶液中に最初に存在するチオール基の量の１５％未満であることが見い出された。

本発明は主にヒト対象の治療に関するものであるが、イヌおよびネコなどの他の哺乳動物対象の治療に獣医用途で使用することもできる。

本発明は、下記の実施例によってさらに示され、その実施例は、本発明を、本明細書に記述される特定の手順に限定すると解釈するべきではない。

チオール基含量の測定
チオール基の定量化は、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＮＢ、「エルマン試薬」を使用した湿式化学方法に基づく。遊離チオール基が混合ジスルフィドの形成時に試薬と反応する一方で、１等量の２−ニトロ−５−チオ安息香酸が放出される。緩衝アルカリ媒質中（ｐＨ＝８．０５）では、結果として生じるチオラートは、明らかな黄色溶液となり、その吸収は４５０ｎｍで光度測定的に計測することができる。

０．１％のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩を含む試料液１１９．０〜１２１．０ｍｇを、１．５ｍｌのエッペンドルフ管中に秤量した。それぞれの溶液から３つの値が測定された。Ｎ−アセチルシステイン２５．０ｍｇを正確に秤量し、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ６．７５）２５．０ｍｌ中に溶解した。次いで、この溶液を、検量線用にさらに希釈した。ホウ酸塩緩衝液を、ブランク値用に使用した。それぞれの溶液へ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液を添加し、最終体積を６００μｌにした。新たに調製されたエルマン溶液（５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）２０ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌ中に含む）６００μｌを、それぞれの溶液（標準液、試料液およびブランク値）へ添加した。溶液は十分に混合し、ＵＶ防護下で、１．５時間、インキュベートした。その後、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩を含む試料液を、１３４００ｒｐｍで５分、遠心分離した。最終的に、それぞれの溶液（標準液、試料液およびブランク値）１．１ｍｌを、セミマイクロキュベットへ移し、分光光度計において、４５０ｎｍで、ブランク値に対してテストした。

試料液中のチオール化キトサンの遊離チオール基の平均含量は、２．６１％（ｗ／ｖ）と測定されたが、これは１７８．５μＭ遊離チオール基／ポリマー１ｇの値に相当する。

製剤の組成：
遊離チオール基の含量が１５８μＭ／ポリマー１ｇ、かつ動粘度（２５℃、０．５％水溶液）が５．６３ｍｍ²／ｓの、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩を使用して、下記の水性点眼液を調製した。他の成分すべてが、医薬添加物である。溶液は、滅菌ろ過により滅菌された。

点眼薬製剤は、下記の組成を有していた。

製剤の物理化学的特性は、下記の仕様内であった：

この実施例により、キトサン−ＮＡＣは、眼科用調製物の必要条件を満たすために、本発明に従って配合してよいことが示される。

水性点眼液の長期安定性：
グループ１：
Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩１ｍｇ／ｍｌを含む本発明による製剤を、不活性条件下で調製し、続いて、形成同時充填（ｂｌｏｗ−ｆｉｌｌ−ｓｅａｌ）技術を用いて、ＬＤＰＥ（低密度ポリエチレン）から作られる５個の単回投与容器のカード（ｃａｒｄ）中へ無菌的に充填し、０．３ｍｌの体積にした。それぞれのカードを、酸素吸収剤（ＰＫＴ ＫＨ−２０ Ｐｈａｒｍａｋｅｅｐ（登録商標））を含むアルミニウム小袋中に包装した。

グループ２：
Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩１ｍｇ／ｍｌを含む本発明による製剤を調製し、５個の単回投与容器のカード中へ充填し、上述のアルミニウム小袋に包装したが、このグループでは、アルミニウム小袋は酸素吸収剤を含んでいなかった。

グループ１およびグループ２の製造条件下で調製された製剤の試料を、温度２５℃および相対湿度４０％の制御条件下で１８カ月間、保存した。遊離チオール基の含量を、実施例１に記述されるように、一定の時間間隔で計測した。同時に、袋の内側の酸素濃度を、酸素ガス分析計（ＰＢＩ Ｄａｎｓｅｎｓｏｒ ＣｈｅｃｋＰｏｉｎｔ ＩＩ）を用いて計測した。チオール基計測の結果を、図１に示す（グループ１：灰色棒、グループ２：白色棒）。結果より、キトサン−ＮＡＣポリマーを含む本発明の水性眼科用製剤を、最大酸素レベルが（酸素吸収剤によってもたらされるときに）１．５％未満の本質的に無酸素の雰囲気中で保存するとき、遊離チオール含量は高いままであり、少なくとも１８カ月の期間は許容可能なパラメータ内であることが示される。驚くべきことに、酸素吸収剤なしで保存されるときでさえ、溶液のチオール基含量は、約１カ月の期間は安定なままであった。４カ月後の、チオール基含量は依然として許容可能なパラメータ内のままであったが、２０％のチオール基含量の低下が観察された。グループ２の袋中の酸素レベルは、１８カ月の全保存期間中では３．０〜５．７％の範囲だった。

アルミニウム袋から単回投与容器を取り出した後の水性点眼液の短期安定性
Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩１ｍｇ／ｍｌを含む本発明による製剤を、不活性条件下で調製し、続いて、形成同時充填技術を用いて、ＬＤＰＥ（低密度ポリエチレン）から作られる５個の単回投与容器のカード中へ無菌的に充填し、０．３ｍｌの体積にした。それぞれのカードは、酸素吸収剤（ＰＫＴ ＫＨ−２０ Ｐｈａｒｍａｋｅｅｐ（登録商標））を含むアルミニウム小袋中に包装した。製造から１カ月以内に、カードを袋より取り出し、周囲の空気、湿度、および温度条件下で、３０日間、密閉された折り畳み箱中で保存した。製剤中の遊離チオール基の含量を、０日、５日、１２日、１９日および３０日に計測した。

結果を図２に示す（３バッチの平均値と標準偏差）。これらの結果より、酸素存在下、周囲空気条件下、ＬＤＰＥ単回投与単位中で保存するとき、製品は、３０日の期間、所望のパラメータ内のままであることが示される。３０日後の遊離チオール基の減少は、約１０％であった。カードを取り出す前に、カードを収容するアルミニウム小袋を、４０℃で５カ月間、保存したときでさえ、同様の結果が観察された。

Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩の合成
異なるチオール化度を有するＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン塩酸塩ポリマー（図３）を、求核置換、それに続くアルカリ性媒質中での遊離チオール基の放出を経由した、キトサン１級アミンへのＮ，Ｓ−ジアセチルシステインの共有結合によって合成した。異なるキトサンを、合成のための原材料として使用した（表３参照のこと）。供給源および脱アセチル化度のデータは、供給会社によって提供された。分子量は、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ＴＤＡ３０５、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製を使用したトリプル検出を組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定された。試料は５％酢酸に溶解し、ＶｉｓｃｏＧＥＬカラム上で、アイソクラチック的に分離した。

結果として生じるチオール化度は、キトサンおよびＮ’Ｓ−ジアセチルシステイン活性エステルの重量比、ならびに反応条件（求核置換中のｐＨ値および温度）に依存していた。４０μＭ／ポリマー１ｇ〜４００μＭ／ポリマー１ｇの範囲のチオール化（thiolization）度を有するキトサン−ＮＡＣポリマーが合成された。

表４に記載される５個の異なるバッチのキトサン−ＮＡＣポリマーの合成では、下記の反応条件が使用された：１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａの分子量のキトサン（供給会社ＨＭＣ＋）が、出発材料として使用された。キトサンとＮ’Ｓ−ジアセチルシステインの活性エステルの間の重量比は１：１（ｗｔ％）であり、キトサンと還元剤である水素化ホウ素ナトリウムの間の重量比は１：２（ｗｔ％）であった。水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元は、約４０℃の高温で行われた。

表４に記載されるすべてのキトサン−ＮＡＣポリマーが、水溶解度、粘度、およびチオール基含量に関して、本発明による水性点眼液の調製に適していた。

最小限に架橋されたキトサン−ＮＡＣの合成するための反応条件
キトサンの、１級アミンへのＮ，Ｓ−ジアセチルシステインの共有結合に続いて、チオアセチル部分のアルカリ加水分解がｐＨ８±０．２で行われた。次いで、結果として生じる分子内および分子間のジスルフィド結合を、大幅に過剰な水素化ホウ素ナトリウム（キトサン：水素化ホウ素ナトリウム＝１：２（ｗｔ％））を用いて、４０℃の不活性条件下で還元した。続いて、過剰な水素化ホウ素ナトリウムを、５Ｎ ＨＣｌの添加によって破壊し、同時に、キトサン−ＮＡＣ塩酸塩をｐＨ１±０．１で生成させた。オフホワイトの生成物を、２−プロパノールを用いて沈殿させ、定義された手順に従って、遠心分離によって回収し、乾燥した。

多数の実験で示されるように、ジスルフィド架橋キトサン−ＮＡＣポリマーがヒドロゲルを形成するため、または水溶液系において不溶性になるため、高温ならびに思いのほか多量の還元剤が、定量的でかつ再現可能な還元に必須であった（表５参照のこと）。

本発明による水性点眼液の製造にポリマー１〜５を利用する可能性がある唯一の選択肢は、６０℃で４日を超えて（架橋の程度および種類（分子間および分子内）に依存する）これらのジスルフィド架橋誘導体を熱分解し、０．５ｗｔ％水溶液の動粘度に関する仕様を満たすことであったが、その仕様は、好ましくは１〜１５ｍｍ²／ｓの範囲である。さらに、乾燥方法は、非常に時間がかかる。一方、最適な反応条件下で合成され、最小限に架橋された６番のキトサン−ＮＡＣポリマーは、６０℃で２０時間未満の乾燥時間後に、好ましい範囲内の粘度に収まった。

最小限に架橋されたキトサン−ＮＡＣの特性化
実施例６によるキトサン−ＮＡＣポリマー１番および６番を、最終的なポリマー中に存在する任意のジスルフィドの、選択的かつ定量的なトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた還元前後での遊離チオール基の相対含量、分子量、および動的粘度に関して特徴づけた。

相対的なチオール基含量の測定：
１．５％（ｗ／ｗ）の水溶液として可溶化したキトサン−ＮＡＣポリマーを、室温で９０分間、ＴＣＥＰ（３ｍｇ／ｍｌ）とともに／ＴＣＥＰ（３ｍｇ／ｍｌ）を含まずにインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌで酸性化した後、キトサン−ＮＡＣポリマーは、２−プロパノールを用いて繰り返し沈殿させ、遠心分離によって回収した。残渣は、蒸留水中に溶解し、続いて、遊離チオール部分と反応すると、安定なチオンを生成する、２，２’−ジチオジピリジンを添加した。この互変異性物質は、３４３ｎｍでのＵＶ分析によって、容易に定量化され得る。

動的粘度の計測：
０．５％（ｗ／ｗ）の水溶液として可溶化したキトサン−ＮＡＣポリマーを、室温で９０分間、ＴＣＥＰ（２ｍｇ／ｍｌ）とともに／ＴＣＥＰ（２ｍｇ／ｍｌ）を含まずにインキュベートした。レオロジー特性化は、２５℃で、５ｓ^-1の一定のせん断速度で、回転計測によって行われた。

分子量計測（ＳＥＣ分析）：
キトサン骨格の分子量に対する反応条件の影響を測定するために、Ｎ’Ｓ−ジアセチルシステインの活性エステルを添加することを除いて、実施例６に記述されるようなポリマー６の合成と同じ反応条件を用いることによって、未修飾のキトサンＨＣｌ塩を調製した。５％酢酸中に可溶化した０．１％（ｗ／ｗ）の濃度のキトサンおよびキトサン−ＮＡＣポリマーを、室温で９０分間、ＴＣＥＰ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに／ＴＣＥＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を含まずにインキュベートした。分子量を、流速０．７ｍｌ／分でアイソクラチック的に分離し、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ＴＤＡ３０５、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製を使用したトリプル検出によって、測定した。

ポリマー１およびポリマー６のチオール基の計測結果を、図４に示す（ＴＣＥＰを用いていない：灰色棒、ＴＣＥＰを用いた還元後：白色棒、３回計測の平均値と標準偏差）。ポリマー１およびポリマー６の０．５％（ｗ／ｗ）溶液の動的粘度の測定結果を、それぞれ図５に示す（ＴＣＥＰを用いていない：灰色棒、ＴＣＥＰを用いた還元後：白色棒）。

これらの結果より、比較的少量のジスルフィド架橋構造の存在（ＴＣＥＰ処理をしていないポリマー１の場合、ポリマーの上に固定化されたすべてのＮ−アセチルシステイン基の９％）でさえ、水溶液中のキトサン−ＮＡＣポリマーの粘度に非常に大きな影響を有していたのに対して、そのチオール基の約３％のみがジスルフィドとして存在する、最小限に架橋されたキトサン−ＮＡＣは、点眼薬の調製に適する低粘度の水溶液として可溶化されたことが示される。

さらに、ポリマーのレオロジー特性とジスルフィド架橋の含量の間の相関が、ＳＥＣ分析によって確認された。最小限に架橋されたキトサン−ＮＡＣポリマー（ポリマー６）は、ＴＣＥＰによる定量的な還元後に、２０〜３０％のわずかな分子量の減少を示した。定量的な還元後、ポリマー６の分子量は、未修飾キトサンＨＣｌの分子量に匹敵した。しかしながら、部分的に架橋された（９％）キトサン−ＮＡＣ（ポリマー１）の大部分が、カラムの排除限界を越えた分子量を示し、分析可能な分画（約２０％）でさえ、その最初の重量の４倍の分子量となった。ＴＣＥＰを用いた定量的な還元後、ポリマー１の分子量は、未修飾キトサンＨＣｌの分子量と同じ範囲内であった。予想したとおり、ＴＣＥＰを用いて未修飾キトサンＨＣｌを反応させても、分子量は少しも減少しなかった。

粘膜付着テスト
異なる程度の遊離チオール基を有するキトサン−ＮＡＣポリマーの粘膜付着特性を、単離されたムチンとのその相互作用を計測することによって評価した。キトサン−ＮＡＣポリマーを、実施例５で記述されるように合成し、実施例２で記述されるような水性眼科用製剤の調製に使用した。未修飾キトサンＨＣｌを、対照として使用した。

キトサン−ＮＡＣまたはキトサンＨＣｌを含む水性眼科用製剤はそれぞれ、単離され、かつ塩化セシウム勾配で精製されたブタ胃ムチンの水溶液とともに、３２℃で３０分間、インキュベートした。それぞれの試料の最終的なポリマー濃度は、０．１５％（ｗ／ｗ）であった。凝集体を、一晩にわたって形成させ、翌日、遠心分離により溶液から除去した。遠心分離後、レオロジー計測のために、凝集体を蒸留水中に再懸濁した。結果として生じる懸濁液の安定性は、振動振幅掃引テスト（ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｓｗｅｅｐ ｔｅｓｔ）（レオメーター ＭＣＲ １０１、コーンプレート測定システム）により、１０ｒａｄ／ｓの角周波数で評価し、線形粘弾性範囲を測定した。

この実施例の結果より、ポリマー１ｇ当たり約８０μＭ〜２５０μＭの範囲のチオール化度を有するキトサン−ＮＡＣポリマーが、広い線形粘弾性領域ならびに保存弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’の間の大きな差によって立証されるように、ムチンと強く相互作用したことが示された。１つの例を、図８に示す（遊離チオール基の含量８０μｍｏｌ／ｇ）。

上述の効果は、チオール化度に依存した。未修飾キトサンＨＣｌおよび４０μＭチオール基／ポリマー１ｇの修飾度を有するキトサン−ＮＡＣは、存在しない線形粘弾性範囲および非常に狭い線形粘弾性範囲によってそれぞれ立証されるように、ムチンとの弱い相互作用のみを示した。結果を、図６（チオール化されていない、未修飾キトサンＨＣｌ）、図７（遊離チオール基の含量４０μｍｏｌ／ｇ）、および図８に示し、表６に記述する。チオール化度が約８０μＭ／ポリマー１ｇのときのみ、キトサン−ＮＡＣは、ムチンとの強い相互作用によって立証されるように、強い粘膜付着特性を示し始めた。

ウサギにおける単回点眼後の、０．１％放射標識キトサン−ＮＡＣを含む水性点眼液の眼滞留時間の測定
研究の目的は、雌のニュージーランドホワイトウサギの眼中に生理的緩衝液中の被験物質を局所的に１回適用した後の、０．１％（ｗ／ｗ）の濃度の¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣの薬物動態データを得ることであった。この予備研究では、４匹の被験動物すべての右眼中に、０．１％（ｗ／ｗ）¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣを局所的に１回滴下した。対照として、２匹の動物の左眼中に、０．１％（ｗ／ｗ）¹²⁴Ｉ−キトサン−ＨＣｌをさらに局所的に１回適用し、残りの２匹の動物の左眼中には、緩衝¹²⁴Ｉ−ＮａＩを投与した。動的ｍｉｃｒｏＰＥＴ計測（３５０〜６５０ｋｅＶエネルギーウィンドウ、６ｎｓタイミングウィンドウ）を、被験物質を投与してから１時間後に実施した。さらに、被験物質の投与から３、６、および９時間後に１５分の静的スキャンを実施し、２４時間後に３０分の静的スキャンを実施し、４８、７２、および９６時間後に６０分の静的スキャンを実施した。主な転帰パラメータとして、適用部位の放射能濃度を観察した。ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像のユニットを絶対放射能濃度へ変換するための校正係数を、放射能濃度が公知のＮａ¹²⁴Ｉ溶液が充填された校正用円柱ファントムを計測することによって、最初に得た。被験物質の放射能濃度を、画像分析ソフトウェアＡＭＩＤＥ２を使用して、それぞれの画像から定量化した。サジタル透過画像上の眼の端に、楕円形の関心領域（ＲＯＩ）の位置を合わせ、丘（目頭）に位置する高度な活性の取り込みを伴う領域を、ＲＯＩから排除した。定義されたＲＯＩから、ＲＯＩによって定義された組織における時間の関数としての放射能濃度（μＣｉ／ｇ）を意味する、時間−放射能濃度曲線（ＴＡＣ）を計算した。組織１ｇ当たりに適用された用量の百分率（％ＡＤ／ｇ）は、平均組織濃度（μＣｉ／ｇ）を、実験開始時の全適用放射能（μＣｉ）で割って計算した。時間−放射能濃度曲線から、ＰＲＩＳＭ５ソフトフェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、曲線下面積値を計算した。

さらなる品質管理パラメータとして、¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣ溶液中のチオール基含量を投与前に計測した。

結果を、図９に示す。Ｎａ¹²⁴Ｉは、眼から急速に消失し、適用から６時間後にはほとんど検出できなかった。０．１％（ｗ／ｗ）¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣ溶液を単回投与すると、¹²⁴Ｉ−キトサン−ＨＣｌと比較して、投与された眼における活性濃度が増加し、粘膜付着特性の増加が示された。投与から２４時間後、０．１％（ｗ／ｗ）¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣで治療された眼中の活性濃度は、¹²⁴Ｉ−キトサン−ＨＣｌ治療眼と比較して約２．２倍高かった（それぞれ、２．１６±０．３６対１．２１±０．２６％ＡＤ／ｇ）。この差は、次の観察期間中持続され、したがって、投与から４８時間後では、２．３５±０．１５％ＡＤ／ｇ（¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣ）対１．０６±０．３０％ＡＤ／ｇ（¹²⁴Ｉ−キトサン−ＨＣｌ）が見い出された。その後、適用された両被験物質の活性濃度は減少し、投与から９６時間後ではほぼ同等だった。

この研究で使用された、ボルトン−ハンター試薬で放射標識した後の、¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣ溶液（２つの溶液が２つの異なる日に調製された）のチオール基含量の測定によって、約１１０μＭおよび１３０μＭのチオール基／ポリマー１ｇがそれぞれ遊離体、すなわち、未酸化形態で残っていることが示された。

ウサギにおける単回点眼後の、０．１％放射標識キトサン−ＮＡＣまたは０．１％放射標識ＨＡ−システアミンを含む水性点眼液の眼滞留時間の比較
前述の研究に加えて、雌のニュージーランドホワイトウサギの眼中に、０．１％（ｗ／ｗ）の濃度の生理的緩衝液中の被験物質を局所適用した後の、¹²⁴Ｉ−標識キトサン−ＮＡＣおよび¹²⁴Ｉ−標識チオール化ヒアルロナン（ＨＡ−システアミン）の薬物動態データが得られた。この研究では、被検対象の右眼中に、０．１％（ｗ／ｗ）¹²⁴Ｉ−ＨＡ−システアミン（ｎ＝３）または０．１％（ｗ／ｗ）¹²⁴Ｉ−キトサン−ＮＡＣ（ｎ＝２）のいずれかを、局所的に１回滴下し、同時に左眼は未処理を維持した。被験物質を適用した後、最大３日（７２時間）まで、ｍｉｃｒｏＰＥＴ計測を繰り返し実施した。主な研究パラメータとして、適用部位の放射能濃度を観察した。したがって、動的ｍｉｃｒｏＰＥＴ計測（３５０〜６５０ｋｅＶエネルギーウィンドウ、６ｎｓタイミングウィンドウ）を、被験物質の投与から１時間後に実施した。さらに、被験物質の投与から６時間後に１５分の静的スキャンを実施し、２４時間後に３０分の静的スキャンを実施し、４８時間および７２時間後に６０分の静的スキャンを実施した。

得られたｍｉｃｒｏＰＥＴ写真の定量分析を、上述のように実施し、図１０に示される結果が、時間−放射能濃度曲線（％ＡＤ×ｈ／ｇ）から計算された曲線下面積（ＡＵＣ）値として得られる。この研究で使用される、放射標識した後の、¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣ溶液中および¹²⁴Ｉ−ＨＡ−システアミン溶液中のチオール基含量の測定により、約１５４μＭおよび５４μＭのチオール基／ポリマー１ｇがそれぞれ遊離体、すなわち、未酸化形態で残っていることが示された。

ウサギにおける単回点眼後の、¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣ溶液の薬物動態挙動の比較
¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣを、０．０５％、０．１％、０．３％、および０．５％（ｗ／ｗ）の濃度でそれぞれ含む、¹²⁴Ｉ標識キトサン−ＮＡＣ溶液を１回滴下した後の眼分布を、ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャン投影像の要約されたデータの定性的評価により、異なる時点で評価した。結果を、表７に記載する。

４つの異なる放射能標識キトサン−ＮＡＣ溶液の眼表面分布の定性的評価により、０．１％および０．３％の濃度のキトサン−ＮＡＣを含む溶液が、ウサギの眼表面上の均一な分布に関して、最高の結果を２４時間示すことが明らかに示された。０．０５％を含む溶液は、眼表面からより急速に消失した。０．５％キトサン−ＮＡＣを含む溶液は、眼上でそれほど均一には分布せず、また、眼表面からより急速に消失した。

ドライアイ症候群を患う患者における涙液膜の厚さに対するキトサン−ＮＡＣの効果
この研究の目的は、０．１％キトサン−ＮＡＣ（１７１μｍｏｌ／遊離チオール基ｇ）を含む点眼薬の、ドライアイ症候群を患う患者の涙液膜の厚さに対する単回投与後および５日治療した後の効果を調べることであった。この目的のために、２つのコホートが計画された：コホートＩでは、キトサン−Ｎ−アセチルシステイン点眼薬を無作為に選ばれた片眼中に１回滴下するが、反対の眼にはプラセボを投与した。涙液膜の厚さの計測を、光干渉断層法（ＯＣＴ）を用いて、滴下前、および滴下してから１０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、および２４時間後に実施した。結果（涙液膜の厚さの中央値μｍ、括弧内は範囲、ｎ＝１６）を、表８に示す。

コホートＩＩでは、１６名の患者が、０．１％のキトサン−ＮＡＣ点眼薬の１日１回右眼および１日２回左眼の、またはその逆の投与に、無作為に割り付けられた。他方の眼には、２回目の滴下にプラセボを投与した。ＯＣＴを用いた涙液膜の厚さの計測を、毎試験日の朝の滴下前および最後の滴下の翌日に実施した。眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ）を、コホートＩＩにおける有効性の副次評価項目として、スクリーニング時および６日目に評価した。

コホートＩＩにおける涙液膜の厚さの計測結果を、表９（コホートＩＩにおける「１日１回」および「１日２回」のグループの涙液膜の厚さの中央値（μｍ）、括弧内は範囲、ｎ＝１６）に示す。

２４時間の投与後期間全体にわたる回帰分析に基づいて、涙液膜の厚さの増加は、コホートＩの治療グループをプラセボグループと比較した場合に、統計的に有意であった（経時的な治療間の差を特定するための回帰分析、ｐ＜０．０００１）。これらの結果によって、キトサン−ＮＡＣ点眼薬により、２４時間の期間にわたる涙液膜の厚さに統計学的に有意な増加がもたらされることが示され、長期の角膜滞留時間が示唆された。涙液膜の厚さは、健常対象に見られるレベルにまで回復した（Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ、Ａｌｅｘら、２０１３、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｅａｒ ｆｉｌｍ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ（５４）：５５７８〜５５８３ページ）。コホートＩＩにおいて、１日１回の滴下は、涙液膜の厚さを回復するのに十分であり、１日２回の適用に劣らなかった。

コホートＩＩにおいて、スクリーニング時の眼表面疾患指数の中央値は、３８．５であり、６日目では１３．０に改善され、これは６０．５％の減少に相当する。これは、ＯＳＤＩで評価されているＤＥＳの主観的重症度が、０．１％のキトサン−ＮＡＣ点眼薬を用いた５日間の治療後に改善されたことを示す。

Claims (20)

1. 担体溶液中に、０．０５％〜０．５％（ｗ／ｗ）のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたはその薬学的に許容可能な塩を含む滅菌水性点眼液であって、Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンの遊離チオール基の含量が、８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである、点眼液。
2. 前記溶液中のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたは前記その薬学的に許容可能な塩の濃度が、０．０５〜０．３％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５〜０．２％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．０８〜０．１６％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の点眼液。
3. 前記薬学的に許容可能な塩が、酢酸、クエン酸、ギ酸、および酒石酸などの有機酸の塩、ならびにＨＣｌおよびＨ₂ＳＯ₄などの鉱酸の塩からなる群から選択される、請求項１または２に記載の点眼液。
4. Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンの遊離チオール基の含量が、１０５μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ、好ましくは１１０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ、最も好ましくは１４０〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである、請求項１から３のいずれかに記載の点眼液。
5. Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン中の架橋チオール基の量が、その中の全チオール基の３０％以下、好ましくは２５％以下、最も好ましくは１５％以下である、請求項１から４のいずれかに記載の点眼液。
6. ホウ酸およびその塩、クエン酸塩、酢酸塩、ポリエチレングリコール、Ｎａ₂−ＥＤＴＡ、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、塩化ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ラブリシン、ヒアルロン酸およびその薬学的に許容可能な塩、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の点眼液。
7. ０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５％〜０．３％（ｗ／ｗ）のＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンまたはその薬学的に許容可能な塩と、
   １．０〜１６．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８〜１６ｍｇ／ｍｌの量のホウ酸と、
   ０．０１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５ｍｇ／ｍｌの量のポリエチレングリコール４００と、
   ０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの量のＮａ₂−ＥＤＴＡと、
   ０．０１〜５．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｍｌの量のマンニトールと、
   ０．０１〜９ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌの量の塩化ナトリウムと、
   ０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌの量のヒドロキシプロピルメチルセルロースと
   を含む、請求項６に記載の点眼液。
8. 溶液の調製に使用するＮ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンが、２５℃の水中０．５％の濃度で、１〜１５ｍｍ²／ｓ、好ましくは２〜１０ｍｍ²／ｓの範囲内の動粘度を示す、請求項１から７のいずれかに記載の点眼液。
9. １５０〜４００ｍＯｓＭ、好ましくは２００〜３３０ｍＯｓＭ、最も好ましくは２５０〜３３０ｍＯｓＭの浸透圧を示す、請求項１から８のいずれかに記載の点眼液。
10. ５．８〜６．８、好ましくは６．０〜６．６のｐＨ値を示す、請求項１から９のいずれかに記載の点眼液。
11. 本質的に無酸素の雰囲気中で請求項１から１０のいずれかに記載の点眼液を収容する容器。
12. 点眼液を収容する第１の容器、および前記第１の容器を収容する第２の容器を含む、請求項１１に記載の容器。
13. 前記容器ならびに／または前記第１の容器および／もしくは前記第２の容器が気密性小袋の形態であり、詳細には、小袋が、アルミニウム、アルミニウム積層物、またはアルミニウム組成物から作られている、請求項１１または１２に記載の容器。
14. 前記気密性小袋が、前記点眼液を収容する１つまたは複数の単回投与副容器を収容する、請求項１３に記載の容器。
15. 前記容器ならびに／または前記第１の容器および／もしくは前記第２の容器が、酸素吸収材料を収容する、請求項１１から１４のいずれかに記載の容器。
16. 室温で少なくとも１２カ月間保存した後で、容器内に収容されている前記Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサンの遊離チオール基の含量が、約８０μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇであり、好ましくは１０５μｍｏｌ／ポリマー１ｇ〜約２５０μｍｏｌ／ポリマー１ｇである、請求項１１から１５のいずれかに記載の容器。
17. Ｎ−（Ｎ−アセチルシステイニル−）キトサン中の架橋チオール基の量が、室温で少なくとも１２カ月間保存した後で、その中の全チオール基の３０％以下、好ましくは２５％以下、最も好ましくは２０％以下である、請求項１１から１６のいずれかに記載の容器。
18. ドライアイ症候群またはドライアイの徴候および／もしくは症状の予防または治療における特定の使用のための、請求項１から１０のいずれかに記載の滅菌水性点眼液。
19. 前記ドライアイの徴候および／または症状が、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、加齢関連のドライアイ、スティーヴンズジョンソン症候群、シェーグレン症候群、眼瘢痕性類天疱瘡、角膜損傷、感染症、ライリーデイ症候群、先天性無涙液症、ＰＲＫ治療、ＬＡＳＥＫ治療、および／もしくはＬＡＳＩＫ治療、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎およびマイボーム腺機能障害、（ビタミンを含む）栄養障害または欠乏症、薬理学的副作用、腺および組織の破壊、自己免疫障害および他の免疫不全障害、コンタクトレンズ不耐性、浮遊微小粒子への環境暴露、煙への環境暴露、スモッグへの環境暴露、および過度に乾燥した空気への環境曝露、昏睡状態の患者におけるまばたき不能、またはコンピューター作業もしくはコンピューターゲームによって引き起こされる眼のストレスによって引き起こされる、またはそれらと関係する、請求項１８に記載の滅菌水性点眼液。
20. １日２回以下、好ましくは１日１回で投与されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の滅菌水性点眼液。