JP2023123766A - アルファウイルス新生抗原ベクター - Google Patents

アルファウイルス新生抗原ベクター Download PDF

Info

Publication number
JP2023123766A
JP2023123766A JP2023108263A JP2023108263A JP2023123766A JP 2023123766 A JP2023123766 A JP 2023123766A JP 2023108263 A JP2023108263 A JP 2023108263A JP 2023108263 A JP2023108263 A JP 2023108263A JP 2023123766 A JP2023123766 A JP 2023123766A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
composition
nucleic acid
neoantigen
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023108263A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023123766A5 (ja
Inventor
ウェイド ブレア
Blair Wade
カリン ヨース
Jooss Karin
エイミー レイチェル ラパポート
Rachel Rappaport Amy
キアラン ダニエル スカラン
Daniel Scallan Ciaran
レオニード ギトリン
Gitlin Leonid
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gritstone Bio Inc
Original Assignee
Gritstone Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gritstone Bio Inc filed Critical Gritstone Bio Inc
Publication of JP2023123766A publication Critical patent/JP2023123766A/ja
Publication of JP2023123766A5 publication Critical patent/JP2023123766A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001188—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001191—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4201—Neoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K40/4269—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4271—Melanoma antigens
    • A61K40/4272—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
    • C12N2740/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Figure 2023123766000001
【課題】対象の腫瘍に由来する新生抗原コード核酸配列を含むアルファウイルスベクターを提供する。
【解決手段】新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、前記新生抗原発現系が、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物：（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列とを含む前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに（ｂ）新生抗原カセットであって、（ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列を含む、前記新生抗原カセット。
【選択図】図２Ａ

Description

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名前が付けられており、そのサイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
腫瘍特異的な新生抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である。１～３非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である。４，５初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がＴ細胞応答を誘発し６、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こしうる７ことが示されている。
新生抗原ワクチンの設計に関する１つの疑問は、対象とする腫瘍に存在する多数のコーディング変異のうちのどれが「最良の」治療用新生抗原（例えば、抗腫瘍免疫を誘発し、腫瘍退縮を引き起こすことができる抗原）を生じることができるか、ということである。
次世代のシークエンシング、ＲＮＡ遺伝子発現、及び新生抗原ペプチドのＭＨＣ結合親和性の予測を用いた、変異に基づいた分析を取り入れた初期の方法が提案されている８。しかしながら、これらの提案されている方法では、遺伝子発現及びＭＨＣ結合以外の多くの段階（例えば、ＴＡＰ輸送、プロテアソーム切断、及び／またはＴＣＲ認識）を含む９エピトープ生成プロセスの全体をモデル化することはできない。したがって、既存の方法は、陽性適中率（ＰＰＶ）が低くなるという問題を有する傾向にある（図１Ａ）。
実際、複数の群によって実施された、腫瘍細胞により提示されるペプチドの分析は、遺伝子発現及びＭＨＣ結合親和性を用いて提示されることが予測されたペプチドの５％未満しか腫瘍表面のＭＨＣ上に見られないことを示している１０，１１（図１Ｂ）。結合予測とＭＨＣ提示との間のこのような低い相関は、変異の数単独に対してチェックポイント阻害剤反応について結合に制限された新生抗原の予測精度の向上が認められないことによってさらに指示されている１２。
提示を予測するための既存の方法のこのような低い陽性適中率（ＰＰＶ）は、新生抗原に基づいたワクチンの設計において問題を提示する。ＰＰＶの低い予測を用いてワクチンが設計される場合、大部分の患者で治療用新生抗原が投与される可能性は低くなり、複数の新生抗原が投与される患者はさらに少なくなるものと考えられる（提示されるペプチドのすべてが免疫原性であると仮定したとしても）。したがって、現行の方法による新生抗原ワクチン接種は、腫瘍を有する対象の相当数において奏功する可能性は低い（図１Ｃ）。
さらに、これまでのアプローチは、シス作用性の変異のみを用いて候補新生抗原を生成するものであり、複数の腫瘍タイプで生じ、多くの遺伝子で異常スプライシングにつながるスプライシング因子の変異１３、及びプロテアーゼ切断部位を生じるかまたは除去する変異を含む、新生ＯＲＦのさらなる由来源をほとんどの場合で考慮していなかった。
最後に、腫瘍ゲノム及びトランスクリプトーム解析に対する標準的アプローチは、ライブラリ構築、エクソーム及びトランスクリプトームの捕捉、シークエンシング、またはデータ分析における最適に満たない条件のために、候補新生抗原を生ずる体細胞突然変異を見逃す可能性がある。同様に、標準的な腫瘍分析のアプローチでは、配列アーチファクトまたは生殖系列多型を新生抗原として誤って助長してしまう場合があり、それぞれワクチン容量の非効率的な利用または自己免疫のリスクにつながりうる。
現行の新生抗原予測法の課題に加えて、その多くがヒト由来のものである、ヒトにおける新生抗原送達に使用することができる既存のベクター系にもやはり特定の課題が存在する。例えば、多くのヒトは、過去の自然の曝露の結果としてヒトウイルスに対する既存の免疫を有しており、この免疫ががん治療を行うために新生抗原を送達するための組換えヒトウイルスの使用にとって大きな障害となりうる。
本明細書では、新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、前記新生抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物を開示する：
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに
（ｂ）新生抗原カセットであって、
（ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）前記腫瘍に由来する、少なくとも１つの腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列と、
（Ｂ）任意で５’リンカー配列と、
（Ｃ）任意で３’リンカー配列と
を含む、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、少なくとも１つのＧＰＧＰＧリンカー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）と、
（ｖ）任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ（Ａ）配列または外来性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
本明細書ではまた、新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、前記新生抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物も開示される：
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の核酸配列を含み、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格の配列が２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、前記２６Ｓプロモーター配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ（Ａ）配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに
（ｂ）前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
（ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列であって、
(Ｉ)互いに直鎖状に連結された、少なくとも１０個の腫瘍特異的及び対象特異的ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
（Ａ）コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応する核酸配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有し、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列と、
（Ｂ）前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、５’リンカー配列と、
（Ｃ）前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端酸配列をコードし、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、３’リンカー配列と、
を含む、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列
を含み、
ここで、前記新生抗原カセットが前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３～２５個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列の各３’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列の５’末端に連結されている、
前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）と、
（ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）と、
（ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）をコードする、第１の核酸配列と、
（ＩＶ）前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の５’末端と前記少なくとも２０個の腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）をコードする、第２の核酸配列と、
（Ｖ）任意で、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の３’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）をコードする、第３の核酸配列と
を含む、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
いくつかの態様では、新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列は、５’から３’に向かって、
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
を含む式で示され、式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｃ＝１であり、Ｌ５は、前記５’リンカー配列を含み、ここで、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は、前記３’リンカー配列を含み、ここで、ｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｇ＝０または１であり、Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、ここで、各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である。
いくつかの態様では、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、Ｌ５は、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｌ３は、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の配列であり、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、アミノ酸１３個～２５個の長さのポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であってよい。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは新生抗原発現系を封入する。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、新生抗原発現系と、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質とを含み、前記複数のＬＮＰのうち、少なくとも約９５％のＬＮＰは、非ラメラ形態を有するか、または高電子密度である。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、（１）リン脂質及び（２）コレステロールまたはコレステロール誘導体、の混合物である。
いくつかの態様では、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体である。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ－リン脂質複合体、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである。
いくつかの態様では、新生抗原発現系は、ＬＮＰ中に完全に封入される。
いくつかの態様では、ＬＮＰの非ラメラ形態は、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む。
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１．５ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、非ラメラ形態を有する。いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、高電子密度である。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、非カチオン性脂質であって、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、または、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４９．５ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記コレステロールまたはその誘導体が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％を構成するもの、のいずれかを含む、前記非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１３ｍｏｌ％～４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む。
いくつかの態様では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、複合体のＰＥＧ部分は、約２０００ダルトンの平均分子量を有する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式Ｉの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む：
Figure 2023123766000002
式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ ＲａＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接的結合であり、Ｇ１は、Ｃｉ～Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、または直接的結合であり、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、または直接的結合であり、Ｇは、Ｃｉ～Ｃ６アルキレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、Ｒ７は、Ｃ４～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合する窒素原子と共に、５、６、または７員の複素環を形成し、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、それぞれ独立して１～２４の整数であり、ｘは０、１、または２である。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式ＩＩの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む：
Figure 2023123766000003
式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または炭素－炭素二重結合であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ３ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、Ｒ７は、各出現時に、独立してＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換のＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合する窒素原子と共に、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成し、ａ及びｄは、それぞれ独立して０～２４の整数であり、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１～２４の整数であり、ｅは１または２であり、ただし、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、もしくはＲ４ａのうちの少なくとも１つが、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１もしくはＬ２の少なくとも一方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、ａが８である場合にはｎ－ブチルでない。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、中性脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質を含む１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの態様では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。
いくつかの態様では、化合物と中性脂質とのモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
いくつかの態様では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様では、化合物とコレステロールとのモル比は、約２：１～1：１の範囲である。
いくつかの態様では、ポリマーコンジュゲート脂質はＰＥＧ化脂質である。いくつかの態様では、化合物とＰＥＧ化脂質とのモル比は、約１００：１～約２５：１の範囲である。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－スクシノイル－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキオキシプロピルカルバメートである。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、下記構造ＩＩＩ、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体を有する：
Figure 2023123766000004
式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で１つ以上のエステル結合によって中断され、ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する。いくつかの態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、平均ｚは、約４５である。
ここから開始
いくつかの態様では、ＬＮＰは、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する。いくつかの態様では、非二重層構造は、６０ｎｍ～１２０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、非二重層構造は、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、約１００ｎｍの直径を有する。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、新生抗原コード核酸配列と機能的に連結される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、５’７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、インビトロ転写によって生成される。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、哺乳動物細胞内で自己複製する。
いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、非構造タンパク質媒介増幅のための配列は、アルファウイルス５’ ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない。いくつかの態様では、新生抗原カセットは、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。
いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）は、ＴＣ－８３株を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、塩基対７５４４と１１１７５との間の欠失をさらに含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載の配列である。いくつかの態様では、新生抗原カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の前記欠失を置換するように挿入される。
いくつかの態様では、新生抗原カセットの挿入は、ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列は別々のオープンリーディングフレーム内にある。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、外来性のＲＮＡプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす。
いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ２ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列内の各抗原コード核酸配列は互いに直接連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている。いくつかの態様では、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する。いくつかの態様において、リンカーは、（１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基、（２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２～２０個の長さの１つ以上の天然配列、からなる群から選択される。いくつかの態様では、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する。いくつかの態様では、リンカーは、配列ＧＰＧＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つの配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続的な配列に機能的または直接的に連結される。いくつかの態様では、分離したまたは連続的な配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、このユビキチン配列は７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含む）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様において、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示の尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つの変異は、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライスされた抗原を含む。
いくつかの態様では、腫瘍は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は少なくとも２～４００個の核酸配列を含み、新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個は、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも１つは抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす。いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ新生抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現は、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される。
いくつかの態様では、各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、アミノ酸８～１５個の長さ、任意で、アミノ酸９～１７個、９～２５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個の長さのポリペプチド配列をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在する。いくつかの態様において、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、それを対応する野生型の親核酸配列とは異なるものとする少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列は、アミノ酸１２～２０個、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０～４０個の長さである。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、非誘導性である。
いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、アルファウイルスに天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、アルファウイルスに対して外来性のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドである。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている５’もしくは３’末端非コード領域内の配列、のうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列を更に含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異的もしくは互いに連結された多重特異性の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、フレキシブルリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列は、２Ａなどの自己切断配列もしくはＩＲＥＳによって分けられた連続的配列であるか、または抗体の重鎖配列と軽鎖配列は、連続したグリシン残基などのフレキシブルリンカーによって連結されている。
いくつかの態様では、免疫調節物質はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、またはそれぞれのその変異体のうちの少なくとも１つである。
本明細書ではまた、新生抗原カセットを含むアデノウイルスベクターであって、前記新生抗原カセットが、対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を対応する野生型の親核酸配列とは異なるものとする少なくとも１つの変異をそれぞれが含む少なくとも２個のＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列と、任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、複数の新生抗原コード核酸のうちの少なくとも１つの配列に機能的に連結された少なくとも１つのプロモーター配列と、を含む、前記複数の新生抗原コード核酸配列を含む、アデノウイルスベクターも開示される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクター、任意で、Ｃ６８ベクターである。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が配列から完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を含み、任意で、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列の（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３、または（３）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、及びＥ４が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、任意で、遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される。
いくつかの態様において、新生抗原カセットは、Ｅ１領域、Ｅ３領域、及び／または、新生抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたＡｄＶ領域においてアデノウイルスベクターに挿入される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、誘導性である。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、非誘導性である。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＲＳＶ、ＰＧＫ、またはＥＢＶプロモーター配列である。
いくつかの態様では、アデノウイルスの新生抗原カセットは、複数の新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された少なくとも１つのポリＡ配列をさらに含み、任意で、前記ポリＡ配列は、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの配列の３’側に位置する。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、第１世代、第２世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターの１つから生成される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列の塩基対番号５７７～３４０７の間に１つ以上の欠失を有し、任意で、アデノウイルスベクターは、塩基対２７１４１～３２０２２の間、または塩基対２７８１６～３１３３２の間に１つ以上の欠失をさらに有する。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列の塩基対番号３９５７～１０３４６、塩基対番号２１７８７～２３３７０、及び塩基対番号３３４８６～３６１９３の間に１つ以上の欠失をさらに有する。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、（ａ）腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、（ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、（ａ）腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、（ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットの数は、２～２０である。
いくつかの態様では、提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、該ペアのＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表す。
いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様において、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータは、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得される。いくつかの態様において、シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである。
いくつかの態様において、新生抗原カセットは、新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列は、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する。いくつかの態様において、各ジャンクショナルエピトープ配列は、非自己である。いくつかの態様において、新生抗原カセットは、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、非治療的エピトープが対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される。いくつかの態様において、非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列は、新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である。いくつかの態様において、予測は、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである。いくつかの態様において、新生抗原カセット内の少なくとも１つの抗原コード核酸配列の順序は、（ａ）前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程、（ｂ）前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程、及び（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程、を含む一連の工程によって決定される。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれか（本明細書に開示されるアルファウイルスに基づく、またはＣｈＡｄに基づくベクターなど）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も開示される。いくつかの態様において、医薬組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、免疫調節物質をさらに含む。いくつかの態様において、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
本明細書でははた、先行の組成物の請求項のいずれかに記載の新生抗原カセットと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列から得られる１つ以上の要素とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記１つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載の配列のｎｓＰ１～４遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットも開示される。いくつかの態様では、配列または単離ヌクレオチド配列のセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載の配列の７５４４位に挿入された、本明細書に開示される新生抗原カセットを含む。いくつかの態様では、単離ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列から得られた前記１つ以上の要素の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、任意で、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と、をさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される新生抗原カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の７５６３位に挿入される。別の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載の配列は、１７位に挿入されたさらなるアデニンヌクレオチドをさらに含む。
本明細書では、本明細書に開示される新生抗原カセットと、本明細書に開示される少なくとも１つのプロモーターとを含む単離ヌクレオチド配列も開示される。いくつかの態様において、単離ヌクレオチド配列は、ＣｈＡｄに基づく遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、ＣｈＡｄに基づく遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列から得られ、任意で、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスのＩＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。
本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で前記細胞が、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはその変異体、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である、単離細胞も提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含むベクターも開示される。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターまたは組成物と、使用説明書とを含む、キットも開示される。
本明細書ではまた、がんを有する対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む方法も開示される。いくつかの態様では、腫瘍に由来する前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来しない。
本明細書ではまた、対象に免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、本明細書に記載される組成物、ベクター、または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法も開示される。
いくつかの態様では、組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、１つ以上の免疫調節物質の投与をさらに含み、任意で、免疫調節物質は、組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される。いくつかの態様では、１つ以上の免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。いくつかの態様において、免疫調節物質は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）投与される。いくつかの態様において、皮下投与は、組成物または医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物と同じものである。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物と異なる。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、上記の組成物またはベクターのいずれかの少なくとも１つの抗原コード核酸配列と同じである。
本明細書では、上記の組成物のいずれかの１つ以上のベクターを製造する方法であって、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての構成要素を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ７ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離することと、を含む方法も開示される。いくつかの態様では、直線化ＤＮＡ配列は、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される。いくつかの態様では、プラスミド配列は、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様では、１つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することは、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれかを製造する方法であって、ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、新生抗原発現系を提供することと、前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと、を含む方法も開示される。いくつかの態様では、かかる条件は、マイクロ流体混合によって提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるアデノウイルスベクターを製造する方法であって、前記少なくとも１つのプロモーター配列と前記新生抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、前記プラスミド配列を１つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、前記１つ以上の宿主細胞から前記アデノウイルスベクターを単離することと、を含む方法も開示される。
いくつかの態様において、単離することは、宿主細胞を溶解してアデノウイルスベクターを含む細胞ライセートを得ることと、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することと、を含む。
いくつかの態様では、プラスミド配列は、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様において、前記１つ以上の宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはその変異体、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、及びＡＥ１－２ａ細胞のうちの少なくとも１つである。いくつかの態様において、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することは、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの１つ以上を行う。
[本発明1001]
新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記新生抗原発現系が、1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物：
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、
（ｉ）少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも1つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに
（ｂ）新生抗原カセットであって、
（ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）前記腫瘍に由来する、少なくとも1つの腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列と、
（Ｂ）任意で5’リンカー配列と、
（Ｃ）任意で3’リンカー配列と
を含む、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：56）をコードする少なくとも1つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ（Ａ）配列または外来性のポリ（Ａ）配列である少なくとも1つの第2のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
[本発明1002]
新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記新生抗原発現系が、1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物：
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6に記載の核酸配列を含み、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格の配列が26Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、前記26Ｓプロモーター配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ（Ａ）配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに
（ｂ）前記26Ｓプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
（ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
（Ａ）コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7～15個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列と、
（Ｂ）前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
（Ｃ）前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含む、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列
を含み、
ここで、前記新生抗原カセットが前記26Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13～25個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列の各3’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：48）と、
（ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：46）と、
（ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする、第1の核酸配列と、
（ＩＶ）前記少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の5’末端と前記少なくとも20個の腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする、第2の核酸配列と、
（Ｖ）任意で、前記少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の3’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする、第3の核酸配列と
を含む、前記少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
[本発明1003]
前記新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’に向かって、
Ｐａ－（Ｌ5ｂ－Ｎｃ－Ｌ3ｄ）Ｘ－（Ｇ5ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ3ｇ
を含む式で示され、
式中、Ｐは、前記第2のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝0または1であり、
Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、ｃ＝1であり、
Ｌ5は、前記5’リンカー配列を含み、ここで、ｂ＝0または1であり、
Ｌ3は、前記3’リンカー配列を含み、ここで、ｄ＝0または1であり、
Ｇ5は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、ｅ＝0または1であり、
Ｇ3は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、ｇ＝0または1であり、
Ｕは、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、ｆ＝1であり、
Ｘ＝1～400であり、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
Ｙ＝0、1、または2であり、ここで、各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である、
本発明1001の組成物。
[本発明1004]
各Ｘについて、対応するＮｃが、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
各Ｙについて、対応するＵｆが、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である、本発明1003または1004の組成物。
[本発明1006]
ａ＝0、ｂ＝1、ｄ＝1、ｅ＝1、ｇ＝1、ｈ＝1、Ｘ＝20、Ｙ＝2であり、
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる単一の26Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、
前記少なくとも1つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも100個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、
各Ｎが、アミノ酸7～15個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
Ｌ5が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の5’リンカー配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Ｌ3が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の3’リンカー配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6に記載の配列であり、
前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13個～25個の長さのポリペプチドをコードする、
本発明1003～1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1008]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ3様（ジリノレイルメチル－4－ジメチルアミノブチレート）分子を含む、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが新生抗原発現系を封入する、本発明1007～1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰが、
新生抗原発現系と、
カチオン性脂質と、
非カチオン性脂質と、
ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と
を含み、前記複数のＬＮＰのうち、少なくとも約95％のＬＮＰが、
（ａ）非ラメラ形態を有するか、または、
（ｂ）高電子密度である、
本発明1008の組成物。
[本発明1013]
前記非カチオン性脂質が、
（1）リン脂質、及び
（2）コレステロールまたはコレステロール誘導体
の混合物である、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
前記ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体である、本発明1012または1013の組成物。
[本発明1015]
前記ＰＥＧ－脂質複合体が、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ－リン脂質複合体、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される、本発明1014の組成物。
[本発明1016]
前記ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体が、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ10）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ12）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ14）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ16）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ18）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
前記ＬＮＰの非ラメラ形態が、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む、本発明1012～1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
前記カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約10ｍｏｌ％～約50ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
前記カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約20ｍｏｌ％～約50ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1017のいずれかの組成物。
[本発明1020]
前記カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約20ｍｏｌ％～約40ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1017のいずれかの組成物。
[本発明1021]
前記非カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約10ｍｏｌ％～約60ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
前記非カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約20ｍｏｌ％～約55ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1020のいずれかの組成物。
[本発明1023]
前記非カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約25ｍｏｌ％～約50ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1020のいずれかの組成物。
[本発明1024]
前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約0．5ｍｏｌ％～約20ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1023のいずれかの組成物。
[本発明1025]
前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約2ｍｏｌ％～約20ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1023のいずれかの組成物。
[本発明1026]
前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約1．5ｍｏｌ％～約18ｍｏｌ％を構成する、本発明1012～1023のいずれかの組成物。
[本発明1027]
前記ＬＮＰの95％超が非ラメラ形態を有する、本発明1012～1026のいずれかの組成物。
[本発明1028]
前記ＬＮＰの95％超が高電子密度である、本発明1012～1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰが、
前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の50ｍｏｌ％～65ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、
前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の0．5ｍｏｌ％～2ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、
（ａ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の4ｍｏｌ％～10ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の30ｍｏｌ％～40ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、
（ｂ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の3ｍｏｌ％～15ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の30ｍｏｌ％～40ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、または、
（ｃ）前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の49．5ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記コレステロールまたはその誘導体が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の30ｍｏｌ％から40ｍｏｌ％を構成するもの
のいずれかを含む、非カチオン性脂質と
を含む、本発明1008～1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰが、
前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の50ｍｏｌ％～85ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、
前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の0．5ｍｏｌ％～2ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、
前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の13ｍｏｌ％～49．5ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と
を含む、本発明1008～1028のいずれかの組成物。
[本発明1031]
前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む、本発明1029の組成物。
[本発明1032]
前記複合脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体を含む、本発明1029または1030の組成物。
[本発明1033]
前記ＰＥＧ－脂質複合体が、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体が、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
前記複合体のＰＥＧ部分が、約2000ダルトンの平均分子量を有する、本発明1032～1034のいずれかの組成物。
[本発明1036]
前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の1ｍｏｌ％～2ｍｏｌ％を構成する、本発明1029～1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
前記ＬＮＰが、式Ｉの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、本発明1008～1036のいずれかの組成物：
Figure 2023123766000005
式中、
Ｌ1及びＬ2は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接的結合であり、
Ｇ1は、Ｃｉ～Ｃ2アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、または直接的結合であり、
－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、または直接的結合であり、
Ｇは、Ｃｉ～Ｃ6アルキレンであり、
Ｒａは、ＨまたはＣ1～Ｃ12アルキルであり、
Ｒ1ａ及びＲ1ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ1ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ1ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ1ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ2ａ及びＲ2ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ2ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ2ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ2ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ3ａ及びＲ3ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ3ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ3ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ4ａ及びＲ4ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ4ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ4ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ4ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、
Ｒ7は、Ｃ4～Ｃ20アルキルであり、
Ｒ8及びＲ9は、それぞれ独立してＣ1～Ｃ12アルキルであるか、またはＲ8及びＲ9は、それらが結合する窒素原子と共に、5、6、または7員の複素環を形成し、
ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、それぞれ独立して1～24の整数であり、ｘは0、1、または2である。
[本発明1038]
前記ＬＮＰが、式ＩＩの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、本発明1008～1036のいずれかの組成物：
Figure 2023123766000006
式中、
Ｌ1及びＬ2は、それぞれ独立して－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または炭素－炭素二重結合であり、
Ｒ1ａ及びＲ1ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ1ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ1ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ1ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ2ａ及びＲ2ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ2ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ2ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ2ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ3ａ及びＲ3ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ3ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ3ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ3ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ4ａ及びＲ4ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ4ａは、ＨもしくはＣ1～Ｃ12アルキルであり、Ｒ4ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ4ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ7は、各出現時に、独立してＨまたはＣ1～Ｃ12アルキルであり、
Ｒ8及びＲ9は、それぞれ独立して、非置換のＣ1～Ｃ12アルキルであるか、またはＲ8及びＲ9は、それらが結合する窒素原子と共に、1個の窒素原子を含む5、6、または7員の複素環を形成し、
ａ及びｄは、それぞれ独立して0～24の整数であり、ｂ及びｃはそれぞれ独立して1～24の整数であり、ｅは1または2であり、
ただし、
Ｒ1ａ、Ｒ2ａ、Ｒ3ａ、もしくはＲ4ａのうちの少なくとも1つが、Ｃ1～Ｃ12アルキルであるか、またはＬ1もしくはＬ2の少なくとも一方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、
Ｒ1ａ及びＲ1ｂは、ａが6である場合にはイソプロピルでなく、ａが8である場合にはｎ－ブチルでない。
[本発明1039]
中性脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質を含む1つ以上の賦形剤をさらに含む、本発明1037または1039の組成物。
[本発明1040]
前記中性脂質が、1，2－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－3－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、1，2－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－3－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、1，2－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－3－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、1－パルミトイル－2－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－3－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、1，2－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－3－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び 1，2－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－3－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも1つを含む、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
前記中性脂質がＤＳＰＣである、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
前記化合物と前記中性脂質とのモル比が、約2：1～約8：1の範囲である、本発明1039～1041のいずれかの組成物。
[本発明1043]
前記ステロイドがコレステロールである、本発明1039～1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
前記化合物と前記コレステロールとのモル比が、約2：1～1：1の範囲である、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
前記ポリマーコンジュゲート脂質がＰＥＧ化脂質である、本発明1039～1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
前記化合物と前記ＰＥＧ化脂質とのモル比が、約100：1～約25：1の範囲である、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
前記ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－スクシノイル－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキオキシプロピルカルバメートである、本発明1045または1046の組成物。
[本発明1048]
前記ＰＥＧ化脂質が、下記構造ＩＩＩを有する、本発明1045または1046の組成物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体：
Figure 2023123766000007
式中、
Ｒ10及びＲ11は、それぞれ独立して、10～30個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で1つ以上のエステル結合によって中断され、
ｚは、30～60の範囲の平均値を有する。
[本発明1049]
Ｒ10及びＲ11が、それぞれ独立して、12～16個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である、本発明1048の組成物。
[本発明1050]
前記平均ｚが、約45である、本発明1048または1049の組成物。
[本発明1051]
前記ＬＮＰが、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する、本発明1008～1050のいずれかの組成物。
[本発明1052]
前記非二重層構造が、60ｎｍ～120ｎｍの直径を有する、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
前記非二重層構造が、約70ｎｍ、約80ｎｍ、約90ｎｍ、または約100ｎｍの直径を有する、本発明1051の組成物。
[本発明1054]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、約100ｎｍの直径を有する、本発明1007～1053のいずれかの組成物。
[本発明1055]
前記新生抗原カセットが、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれている、本発明1001、1003～1005、または1007～1054のいずれかの組成物。
[本発明1056]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記新生抗原コード核酸配列と機能的に連結されている、本発明1001、1003～1005、または1007～1055のいずれかの組成物。
[本発明1057]
前記1つ以上のベクターが、1つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1056のいずれかの組成物。
[本発明1058]
前記1つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、5’7－メチルグアノシン（ｍ7ｇ）キャップを含む、本発明1057の組成物。
[本発明1059]
前記1つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、インビトロ転写によって生成される、本発明1057または1058の組成物。
[本発明1060]
前記1つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、本発明1001、1003～1005、または1007～1059のいずれかの組成物。
[本発明1061]
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1060のいずれかの組成物。
[本発明1062]
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1060のいずれかの組成物。
[本発明1063]
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質1（ｎｓＰ1）遺伝子、ｎｓＰ2遺伝子、ｎｓＰ3遺伝子、及びｎｓＰ4遺伝子を含む、本発明1061または1062の組成物。
[本発明1064]
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む、本発明1061または1062の組成物。
[本発明1065]
前記非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス5’ ＵＴＲ、51ｎｔのＣＳＥ、24ｎｔのＣＳＥ、26Ｓサブゲノミックプロモーター配列、19ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス3’ ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1063または1064の組成物。
[本発明1066]
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドＥ2及びＥ1をコードしていない、本発明1063～1065のいずれかの組成物。
[本発明1067]
前記新生抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、本発明1066の組成物。
[本発明1068]
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5に記載の配列を含む、本発明1061または1062の組成物。
[本発明1069]
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対7544と11175との間の欠失をさらに含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5の配列を含む、本発明1061または1062のの組成物。
[本発明1070]
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7に記載の配列を含む、本発明1069の組成物。
[本発明1071]
前記新生抗原カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5の配列に記載される塩基対7544と11175との間の前記欠失を置換するように7544位に挿入されている、本発明1069または1070の組成物。
[本発明1072]
前記新生抗原カセットの挿入が、ｎｓＰ1～4遺伝子及び少なくとも1つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、前記ｎｓＰ1～4遺伝子及び前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内にある、本発明1067～1071のいずれかの組成物。
[本発明1073]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされた天然の26Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、本発明1001、1003～1005、または1007～1072のいずれかの組成物。
[本発明1074]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、外来性のＲＮＡプロモーターである、本発明1001、1003～1005、または1007～1072のいずれかの組成物。
[本発明1075]
前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が、26Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、本発明1001、1003～1005、または1007～1074のいずれかの組成物。
[本発明1076]
前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が複数の26Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各26Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの1つ以上の転写をもたらす、本発明1001、1003～1005、または1007～1074のいずれかの組成物。
[本発明1077]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも300ｎｔのサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1078]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも1ｋｂのサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1079]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ2ｋｂのサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1080]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ5ｋｂ未満のサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1081]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1082]
各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、本発明1001、1003～1005、または1007～1081のいずれかの組成物。
[本発明1083]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている、本発明1001、1003～1005、または1007～1082のいずれかの組成物。
[本発明1084]
前記リンカーが、2個のＭＨＣクラスＩ配列または1個のＭＨＣクラスＩ配列を1個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する、本発明1083の組成物。
[本発明1085]
前記リンカーが、
（1）少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
（2）少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
（3）2個のアルギニン残基（ＲＲ）、
（4）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、
（5）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
（6）元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または2～20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、本発明1084の組成物。
[本発明1086]
前記リンカーが、2個のＭＨＣクラスＩＩ配列または1個のＭＨＣクラスＩＩ配列を1個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する、本発明1083の組成物。
[本発明1087]
前記リンカーが、配列ＧＰＧＰＧを含む、本発明1086の組成物。
[本発明1088]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つの配列が、
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続的な配列
に機能的または直接的に連結されている、本発明1001、1003～1005、または1007～1087のいずれかの組成物。
[本発明1089]
前記分離したまたは連続的な配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、76位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－1、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも1つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ76である、本発明1088の組成物。
[本発明1090]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1091]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1092]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示の尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1093]
前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライスされた抗原を含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1094]
前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1095]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも2～10個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の核酸配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1094のいずれかの組成物。
[本発明1096]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも11～20個、15～20個、11～100個、11～200個、11～300個、11～400個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または最大で400個の核酸配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1094のいずれかの組成物。
[本発明1097]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が少なくとも2～400個の核酸配列を含み、前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1001、1003～1005、または1007～1094のいずれかの組成物。
[本発明1098]
前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2つが、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1002または1006の組成物。
[本発明1099]
対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1100]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1101]
各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、アミノ酸8～35個の長さ、任意で、アミノ酸9～17個、9～25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個のポリペプチド配列をコードする、本発明1001、1003～1005、または1007～1100のいずれかの組成物。
[本発明1102]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在する、本発明1001、1003～1005、または1007～1101のいずれかの組成物。
[本発明1103]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1101のいずれかの組成物。
[本発明1104]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が、アミノ酸12～20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または20～40個の長さである、本発明1001、1003～1005、または1007～1103のいずれかの組成物。
[本発明1105]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも1つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1104のいずれかの組成物。
[本発明1106]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、本発明1001、1003～1005、または1007～1105のいずれかの組成物。
[本発明1107]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、本発明1001、1003～1005、または1007～1105のいずれかの組成物。
[本発明1108]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスに天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1107のいずれかの組成物。
[本発明1109]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスに対して外来性のポリ（Ａ）配列を含む、本発明1001、1003～1005、または1007～1107のいずれかの組成物。
[本発明1110]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つと機能的に連結されている、本発明1001、1003～1005、または1007～1109のいずれかの組成物。
[本発明1111]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、または少なくとも90個の連続したＡヌクレオチドである、本発明1001、1003～1005、または1007～1110のいずれかの組成物。
[本発明1112]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも100個の連続したＡヌクレオチドである、本発明1001、1003～1005、または1007～1110のいずれかの組成物。
[本発明1113]
前記新生抗原カセットが、
イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、2Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている5’もしくは3’末端非コード領域内の配列
のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1114]
前記新生抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1115]
前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ5タグからなる群から選択される、本発明1114の組成物。
[本発明1116]
前記1つ以上のベクターが、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする1つ以上の核酸配列をさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1117]
前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4－1ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1116の組成物。
[本発明1118]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異的もしくは互いに連結された多重特異性の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、フレキシブルリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である、本発明1117の組成物。
[本発明1119]
前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、2Ａなどの自己切断配列もしくはＩＲＥＳによって分けられた連続的配列であるか、または前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、連続したグリシン残基などのフレキシブルリンカーによって連結されている、本発明1117または1118の組成物。
[本発明1120]
前記免疫調節物質がサイトカインである、本発明1116の組成物。
[本発明1121]
前記サイトカインが、ＩＬ－2、ＩＬ－7、ＩＬ－12、ＩＬ－15、もしくはＩＬ－21、またはそれぞれのその変異体のうちの1つである、本発明1120の組成物。
[本発明1122]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、
（ａ）腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
（ｃ）新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、本発明1001、1003～1005、または1007～1121のいずれかの組成物。
[本発明1123]
前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
（ａ）腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
（ｃ）前記少なくとも20個のＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される、本発明1002または1006の組成物。
[本発明1124]
前記選択された新生抗原のセットの数が、2～20である、本発明1122の組成物。
[本発明1125]
前記提示モデルが、
（ａ）前記ＭＨＣアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
（ｂ）前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と
の間の依存性を表す、本発明1122～1124のいずれかの組成物。
[本発明1126]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1122～1125のいずれかの組成物。
[本発明1127]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1122～1126のいずれかの組成物。
[本発明1128]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、本発明1122～1127のいずれかの組成物。
[本発明1129]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1122～1128のいずれかの組成物。
[本発明1130]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1122～1129のいずれかの組成物。
[本発明1131]
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得される、本発明1122～1130のいずれかの組成物。
[本発明1132]
前記シークエンシングが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである、本発明1131の組成物。
[本発明1133]
前記新生抗原カセットが、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1134]
少なくとも1つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、ＭＨＣに対して500ｎＭよりも高い親和性を有する、本発明1133の組成物。
[本発明1135]
各ジャンクショナルエピトープ配列が非自己である、本発明1133または1134の組成物。
[本発明1136]
前記新生抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1137]
前記非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列が、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、本発明1136の組成物。
[本発明1138]
前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、本発明1133～1137のいずれかの組成物。
[本発明1139]
前記新生抗原カセット内における少なくとも1つの抗原コード核酸配列の順序が、
（ａ）前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程、
（ｂ）前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程、及び
（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程
を含む一連の工程によって決定される、本発明1133～1138のいずれかの組成物。
[本発明1140]
先行本発明のいずれかの組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1141]
アジュバントをさらに含む、本発明1140の組成物。
[本発明1142]
免疫調節物質をさらに含む、本発明1140または1141の医薬組成物。
[本発明1143]
前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4－1ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1142の医薬組成物。
[本発明1144]
先行の組成物の発明のいずれかの新生抗原カセットと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5の配列から得られる1つ以上の要素とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記1つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、26Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5に記載の配列のｎｓＰ1～4遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
[本発明1145]
前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7に記載の配列の7544位に挿入された先行の組成物の発明のいずれかの新生抗原カセットを含む、本発明1144の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1146]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5の配列から得られた前記1つ以上の要素の5’側に位置するＴ7またはＳＰ6 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
任意で、前記ポリ（Ａ）配列の3’側に位置する1つ以上の制限部位と
をさらに含む、本発明1144または1145の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1147]
先行の組成物の発明のいずれかの新生抗原カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9の7563位に挿入されている、本発明1144の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1148]
本発明1144～1147のいずれかのヌクレオチド配列を含む、ベクターまたはベクターのセット。
[本発明1149]
本発明1144～1148のいずれかのヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、ＢＨＫ－21、ＣＨＯ、ＨＥＫ293もしくはその変異体、911、ＨｅＬａ、Ａ549、ＬＰ－293、ＰＥＲ．Ｃ6、またはＡＥ1－2ａ細胞である、前記単離細胞。
[本発明1150]
先行の組成物の発明のいずれかの組成物と、使用説明書とを含む、キット。
[本発明1151]
がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の発明のいずれかの組成物、または本発明1140～1143のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1152]
腫瘍に由来する少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、本発明1151の方法。
[本発明1153]
少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来しない、本発明1151の方法。
[本発明1154]
対象に免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の発明のいずれかの組成物、または本発明1140～1143のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1155]
前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与される、本発明1151～1154のいずれかの方法。
[本発明1156]
前記組成物が筋肉内投与される、本発明1151～1154のいずれかの方法。
[本発明1157]
1つ以上の免疫調節物質の投与をさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、本発明1151～1156のいずれかの方法。
[本発明1158]
前記1つ以上の免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4－1ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－40抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、本発明1157の方法。
[本発明1159]
前記免疫調節物質が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）投与される、本発明1157または1158の方法。
[本発明1160]
前記皮下投与が、前記組成物または医薬組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、本発明1159の方法。
[本発明1161]
前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、本発明1151～1160のいずれかの方法。
[本発明1162]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151～1160のいずれかの組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、本発明1161の方法。
[本発明1163]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151～1160のいずれかの組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、本発明1161の方法。
[本発明1164]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151～1160のいずれかの組成物または医薬組成物と同じである、本発明1162または1163の方法。
[本発明1165]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151～1160のいずれかの組成物または医薬組成物と異なる、本発明1162または1163の方法。
[本発明1166]
前記第2のワクチン組成物が、少なくとも1つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、本発明1165の方法。
[本発明1167]
前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、先行の組成物の発明のいずれかの少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じである、本発明1166の方法。
[本発明1168]
先行の組成物の発明のいずれかの1つ以上のベクターを製造する方法であって、
（ａ）前記ＲＮＡアルファウイルス骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、
（ｂ）前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての構成要素を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ7ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、
（ｃ）前記インビトロ転写反応から前記1つ以上のベクターを単離することと
を含む、前記方法。
[本発明1169]
前記直線化ＤＮＡ配列が、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される、本発明1168の製造する方法。
[本発明1170]
前記ＤＮＡプラスミド配列が、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの1つを用いて生成される、本発明1169の製造方法。
[本発明1171]
前記1つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することが、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの1つ以上を含む、本発明1168の製造する方法。
[本発明1172]
前記新生抗原発現系を送達するための先行の組成物の発明のいずれかの組成物を製造する方法であって、
（ａ）ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、
（ｂ）前記新生抗原発現系を提供することと、
（ｃ）前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が前記新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと
を含む、前記方法。
[本発明1173]
前記条件がマイクロ流体混合によって提供される、本発明1172の製造する方法。
本発明のこれらの、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文、及び添付図面を参照することでより深い理解がなされるであろう。
新生抗原の特定に対する現在の臨床的アプローチを示す。 予測された結合ペプチドのうち、腫瘍細胞上に提示されるものは５％未満であることを示す。 新生抗原予測の特異性の問題の影響を示す。 結合予測が、新生抗原の特定に充分ではないことを示す。 ペプチド長の関数としてのＭＨＣ－Ｉ提示の確率を示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。図は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を開示する。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 特性の追加が、いかにモデルの陽性適中率を増大させるかを示す。 一実施形態による、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境の概略である。 一実施形態による、提示情報を取得する方法を説明する。図２Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２を開示する。 一実施形態による、提示情報を取得する方法を説明する。図２Ｃは、出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～６７を開示する。 図２ＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７を開示する。 図２Ｅは、出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～６５、６８、及びおよび６７を開示する。 一実施形態による、提示特定システムのコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。 ＭＨＣクラスＩアレルに関する一実施形態による、訓練データの例示的なセットを説明する。図４Ａは、出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０～７３としてペプチド配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、１５８、１５９、及び１５９としてＣ末端フランキング配列を開示する。 ＭＨＣクラスＩＩアレルに関する一実施形態による、訓練データの例示的なセットを説明する。図４Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５を開示する。 ＭＨＣアレルに関連した例示的なネットワークモデルを説明する。 一実施形態による、ＭＨＣアレルによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・）を示す。 別の実施形態による、ＭＨＣアレルによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・）を示す。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 図１３Ａは、異なるペプチド提示モデルを比較した、質量分析によって決定されたペプチド提示についての性能結果を示す。アフィン依存性関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を用いて等式（１２）に示される、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についての質量分析データのサブセットで訓練された、アレルごと提示モデルの最大値の結果が示されている（「ＭＳ」）。親和性予測ＮＥＴＭＨＣｐａｎに基づいた（親和性）、また、安定性予測ＮＥＴＭＨＣｓｔａｂに基づいた（安定性）従来の技術水準のモデルも示されている。データは、１０％リコール率での陽性適中率（ＰＰＶ）を示し、エラーバー（実線で示す）は、９５％信頼区間を示す。 図１３Ｂは、異なるペプチド提示モデルを比較した、Ｔ細胞エピトープによって決定されたペプチド提示についての性能結果を示す。アフィン依存性関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を用いて等式（１２）に示される、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての質量分析データのサブセットで訓練された、アレルごと提示モデルの最大値の結果が示されている。親和性予測ＮＥＴＭＨＣｐａｎに基づいた（親和性）、また、安定性予測ＮＥＴＭＨＣｓｔａｂに基づいた（安定性）従来の技術水準のモデルも示されている。データは、１０％リコール率での陽性適中率（ＰＰＶ）を示し、エラーバー（実線で示す）は、９５％信頼区間を示す。 図１３Ｃは、ペプチド提示を予測するための、例示的な和の関数モデル（等式（１３））、例示的な関数の和モデル（等式（１９））、及び例示的な二次モデル（等式（２３））の質量分析によって決定されたペプチド提示の性能結果を示す。第１列は、各提示モデルを試験セットに適用した時の受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を指し、第２列は、負のｌｏｇ尤度損失の値を指し、第３列は、１０％リコール率での陽性適中率（ＰＰＶ）を指す。 図１３Ｄは、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練された２つの例示的な提示モデルについて質量分析によって決定されたペプチド提示の性能結果を示す。第１列は、各提示モデルを試験セットに適用した時の受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を指し、第２列は、負のｌｏｇ尤度損失の値を指し、第３列は、１０％リコール率での陽性適中率（ＰＰＶ）を指す。 図１３Ｅは、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練された２つの例示的な提示モデルについて質量分析によって決定されたペプチド提示の性能結果を示す。「相関」は、ペプチドが試験データ中の対応するアレル上に提示されたかどうかを示す実際のラベルと、予測についてのラベルとの間の相関を指す。 図１３Ｆは、単一アレル質量分析データを伴わずに訓練された提示モデルによって予測された、ノナマー間で２位（Ｐ２）及び９位（Ｐ９）に共通のアンカー残基の頻度を示す。 図１３Ｇは、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとについて、質量分析によって決定されたペプチド提示の性能結果を示す。第１列は、各提示モデルを試験セットに適用した時の受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を指し、第２列は、負のｌｏｇ尤度損失の値を指し、第３列は、１０％リコール率での陽性適中率（ＰＰＶ）を指す。 図１３Ｈは、質量分析によって決定された、ｍＲＮＡ存在量と腫瘍細胞上に提示されたペプチドの頻度との間の依存性を示す。横軸は、１００万あたりの転写産物（ＴＰＭ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）四分位に換算したｍＲＮＡ発現を示す。縦軸は、対応するｍＲＮＡ発現四分位における、各遺伝子からの提示されたエピトープの割合を示す。各実線は、対応する質量分析データ及びｍＲＮＡ発現測定値に関連する、腫瘍試料からの２つの測定値に関するプロットである。 図１３Ｉは、３．２ＦＰＫＭ未満であったｍＲＮＡ定量測定値を有するすべてのペプチドをタンパク質から除去した標準的な遺伝子発現フィルターを用いて、親和性予測に基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の技術水準モデルに類似したモデルである「ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ＋ＲＮＡフィルター」について、質量分析によって決定されたペプチド提示の性能結果を示す。「例示的なモデル、ＲＮＡなし」モデルは、等式（２１）に示す「シグモイドの和」の例示的な提示モデルである。「例示的なモデル、ＲＮＡあり」モデルは、ｌｏｇ関数によってｍＲＮＡ定量データを組み入れる等式（１９）に示す「シグモイドの和」提示モデルである。データは、２０％リコール率での陽性適中率（ＰＰＶ）を示す。 図１３Ｊは、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上する提示モデルと、ペプチド長を計上しない従来の技術水準モデルとについて、異なるペプチド長のペプチド提示の確率を示す。「真（盲検データ）」のプロットは、試料試験データセット中のペプチドの長さに応じた、提示されるペプチドの割合を示した。「長さを無視するモデル」のプロットは、ペプチド長を無視する従来の技術水準モデルが、提示予測のために同じ試験データセットに適用された場合の、予測された測定値を示した。「例示的なモデル、ＲＮＡあり」モデルは、ｌｏｇ関数によってｍＲＮＡ定量データを組み入れる等式（１９）に示す「シグモイドの和」提示モデルである。 図１３Ｋは、質量分析を用いたヒト腫瘍細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上のクラスＩＩ ＭＨＣアレルから溶出されたペプチドの長さのヒストグラムである。 図１３Ｌは、２つの例示的なデータセットについてｍＲＮＡ定量化と残基当たりの提示ペプチドとの依存性を示す。 図１３Ｍは、２つの例示的なデータセットを用いて訓練及び試験した例示的な提示モデルの性能結果を比較したものである。 図１３Ｎは、ＨＬＡクラスＩＩ分子を含む合計３９種の試料の各試料について質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示すヒストグラムである。 図１３Ｏは、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子のアレルが同定された試料の量を示すヒストグラムである。 図１３Ｐは、合計で３９種の試料中でＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの割合を、一定範囲のペプチド長の各ペプチド長について示したヒストグラムである。 図１３Ｑは、３９種の試料中に存在する遺伝子について、遺伝子発現とＭＨＣクラスＩＩ分子による遺伝子発現産物の提示の出現率との間の関係を示す線グラフである。 図１３Ｒは、ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの入力の異なる同じモデルの性能を比較した線グラフである。 図１３Ｓは、ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの４つの異なる提示モデルの性能を比較した線グラフである。 図１３Ｔは、２つの異なる基準を用いたベスト・イン・クラスの従来モデルと、２つの異なる入力を有する本明細書に開示される提示モデルの、ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの性能を比較した線グラフである。 図１及び３に示した実体を実施するための例示的なコンピュータを説明する。 インビトロＴ細胞活性化合物アッセイの開発を説明する。抗原提示細胞へのワクチンカセットの送達が、異なるペプチド抗原の発現、プロセシング、及びＭＨＣ制限提示につながるアッセイの概略。特異的なペプチド－ＭＨＣの組み合わせに一致するＴ細胞受容体を有するように操作されたレポーターＴ細胞が活性化され、ルシフェラーゼが発現される。 （Ａ）短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、互いに対して同じ位置で連結された５個のクラスＩ ＭＨＣクラス制限エピトープ（エピトープ１～５）に２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープ（ＭＨＣ－ＩＩ）が繋げられたものを示す。異なるリンカーを用いて種々の繰り返しが生成された。場合によっては、Ｔ細胞エピトープは互いに直接連結される。他の場合では、Ｔ細胞エピトープの片側または両側にその天然配列が隣接する。他の繰り返しでは、Ｔ細胞エピトープは、非天然配列ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰにより連結される。（Ｂ）短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、短いカセット内に埋め込まれたＴ細胞エピトープの配列情報を示す。図は、出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２、１３３、１３６、１３５、１３４、１６０、及び１６１を開示する。 モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価を説明する。ターゲティングカセットは、短いカセット設計を、ユビキチン（Ｕｂ）、シグナルペプチド（ＳＰ）及び膜貫通（ＴＭ）ドメインによって延長し、５個のマーカーヒトＴ細胞エピトープ（エピトープ１～５）の隣に２個のマウスＴ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＩＩ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）及びＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（Ａ５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）をさらに有し、Ｔ細胞エピトープの両側に隣接する非天然リンカーＡＡＹ－または天然リンカー配列を用いている（２５マー）。 短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価を説明する。Ａ）ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスを使用したワクチンカセットのインビボ評価の実験計画。 長い２１ｍｅｒカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、長いカセットの設計が、それらの２５マー天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる５個のマーカークラスＩエピトープ（エピトープ１～５）であって、それらの２５マー天然配列に含まれるさらなる周知のＴ細胞クラスＩエピトープ（エピトープ６～２１）によって隔てられたマーカークラスＩエピトープと、２個のユニバーサルクラスＩＩエピトープ（ＭＨＣ－ＩＩ０）とを含み、各クラスＩエピトープの相対位置のみが異なることを示す。 長い２１ｍｅｒカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報を示す。図は、出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２、１３３、１３６、１３５、１３４、１６２～１６４、１３７、及び１６５～１７６を開示する。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、最終カセットの設計が、それらの２５マー天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる２０個のＭＨＣ Ｉエピトープを含み、６個の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）エピトープ、５個のヒトエピトープ、９個のマウスエピトープ、及び２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープで構成されることを示す。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、非ヒト霊長類（出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７７～１８２）、マウス（出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、５８、及び１８３～１８９）、及びヒト由来（出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４～１３６、１３２、及び１３３）のクラスＩ ＭＨＣ上に提示される、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報、ならびに２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイド（出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０及び１９０）の配列を示す。 （Ａ）トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。（Ｂ）トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトする。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。（Ｃ）トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトする。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡を使用して倍率１００倍で可視化した。 （Ａ）トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して３日後に撮影した。（Ｂ）トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡を倍率４０倍で使用して３日後に撮影した。（Ｃ）トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡を倍率１００倍で使用して３日後に撮影した。 ウイルス粒子の生成スキームを説明する。 アルファウイルス由来ＶＥＥ自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターを説明する。 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを接種した後のインビボのレポーター発現を説明する。異なる時点でＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを免疫した（ＭＣ３に封入したものを１０ｕｇ／マウスで両側性に筋肉内注射）後のルシフェラーゼシグナルの代表的イメージを示す。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０ｕｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（コントロール）、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）、またはＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）を注射した。さらに、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ－１ ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答（「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７として開示される）をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０ｕｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（コントロール）、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）、またはＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）を注射した。さらに、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答（「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７として開示される）をＭＨＣＩペンタマー染色により評価し、ペンタマー陽性細胞としてＣＤ８陽性細胞の割合（％）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５－ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５－ＧＦＰ／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（ａ抗ＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５－ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５－ＧＦＰ／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（ａ抗ＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの６日後（プライムの２１日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 マウスにおけるマウス腫瘍抗原に対するＣｈＡｄＶ６８誘発Ｔ細胞応答を説明する。マウスをＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫し、ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）に対するＴ細胞応答をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１－Ａ５をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された脾細胞１０６個当たりの平均のスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示した。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ－１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答を説明する。抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、ＥＬＩＳｐｏｔを用い、各グループから６匹のマウスの脾細胞で測定した。結果を、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）で示す。各グループの中央値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ－１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を説明する。ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的ＩＦＮ－γ産生をＩＣＳを用いて測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞として全ＣＤ８ Ｔ細胞の割合（％）として示す。各グループの中間値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ－１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。腫瘍体積を週２回測定し、平均腫瘍体積を実験の最初の２１日間について示す。実験開始時に各グループは２２～２８匹のマウスで構成された。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。Ｐ値は、ダネット検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける生存率を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ－１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。Ｐ値は、ログランク検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０１。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、最初のブースト免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３０μｇ）（図３４Ａ）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（１００μｇ） （図３４Ｂ）、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）（図３４Ｃ）による同種プライム／ブースト、またはＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブースト群（図３４Ｄ）について、ＰＢＭＣ中で測定した（各群６匹のアカゲザル）。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープについて、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。各動物の値は、プレブリード（０週目）のレベルに対して正規化した。 図34Aの説明を参照のこと。 図34Aの説明を参照のこと。 図34Aの説明を参照のこと。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ２による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ１による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ２つの例示的なカセット配列について距離行列を決定する様子を示す。図は、出現順にそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１及び１９２を開示する。
詳細な説明
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書で使用するところの「抗原」という用語は、免疫反応を誘導する物質のことである。
本明細書で使用するところの「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞の変異、または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾によって、抗原を対応する野生型抗原とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する抗原のことである。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含んでよい。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化を含むことができる。変異はまた、スプライス変異体も含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常リン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームによって生成されるスプライスされた抗原も含むことができる。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆＨＬＡｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｏｃｔ ２１；３５４（６３１０）：３５４－３５８を参照されたい。
本明細書で使用するところの「腫瘍新生抗原」という用語は、対象の腫瘍細胞または組織中に存在するが、対象の対応する正常細胞または組織中には存在しない新生抗原のことである。
本明細書において使用される場合、「新生抗原ベースのワクチン」という用語は、１つ以上の新生抗原、例えば複数の新生抗原に基づいたワクチンコンストラクトのことである。
本明細書において使用される場合、「候補新生抗原」という用語は、新生抗原を表しうる新たな配列を生じる変異、または他の異常のことである。
本明細書において使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分のことである。
本明細書において使用される場合、「コード変異」という用語は、コード領域で生じる変異のことである。
本明細書において使用される場合、「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用される場合、「新生ＯＲＦ」という用語は、変異またはスプライシングなどの他の異常により生じる腫瘍特異的なＯＲＦのことである。
本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、または基準開始コドンの除去を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「挿入欠失」という用語は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較し、整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）が同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一率（％）を算出する。あるいは、配列の類似性または相違性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における特定のヌクレオチドの、または翻訳後の配列ではアミノ酸の有無の組み合わせによって確立することもできる。
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）。
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に入手可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異のことである。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体が一般的に結合する、抗原の特異的な部分のことである。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその両方を介して免疫応答を誘発する能力のことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なＭＨＣアレルとの結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブのことである。
本明細書において使用される場合、「変異」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの差である。
本明細書において使用される場合、「変異コール」という用語は、典型的にはシークエンシングからの、変異の存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列変異、すなわち、個体のすべてのＤＮＡ保有細胞において見出される変異である。
本明細書において使用される場合、「体細胞変異」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じる変異である。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子の１つのバージョンまたは遺伝子配列の１つのバージョンまたはタンパク質の１つのバージョンのことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ型」という用語は、ＨＬＡ遺伝子アレルの相補体のことである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」という用語は、未成熟な終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解のことである。
本明細書において使用される場合、「トランカル変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、腫瘍の発生の初期に生じ、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「サブクローナル変異」という用語は、腫瘍の発生において後期に生じ、腫瘍の細胞の一部のみに存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンでありうる。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が１に等しい確率のロジットが従属変数の線形関数としてモデル化される、統計からのバイナリデータ用の回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、多層の線形変換に続いて一般的に確率的勾配降下法及び逆伝搬により訓練された要素ごとの非線形変換を行うことからなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、及び／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットのことである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上のＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩによって提示されるすべてのペプチドのセットのことである。ペプチドームは、細胞または細胞の集合の性質を指す場合もある（例えば、腫瘍ペプチドームは、腫瘍を含むすべての細胞のペプチドームの和集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＰＯＴ」という用語は、ヒト及び動物において免疫応答を観察するための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド－ＭＨＣマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答の状態のことである。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性Ｔ細胞クローンを欠失させること、または自己反応性Ｔ細胞クローンの免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を促進することのいずれかにより、胸腺において与えられる寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を促進することにより、末梢系において与えられる寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、ならびに／または、非限定的に年齢及び性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または所定の条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、腫瘍タイプ、腫瘍サブタイプ、及び喫煙歴を含むことができる。
「腫瘍由来の抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲによって腫瘍から直接抽出された核酸配列、または、腫瘍をシークエンシングした後、例えば当該技術分野では周知の様々な合成法もしくはＰＣＲに基づく方法によりシークエンシングデータを利用して核酸配列を合成することによって得られた配列データのことを指す。
「アルファウイルス」という用語は、トガウイルス科のメンバーのことを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される。アルファウイルスは一般的には自己複製ＲＮＡウイルスである。
「アルファウイルス骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とするアルファウイルスの最小配列（複数可）のことを指す。最小配列としては、非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびに、２６Ｓプロモーター因子をはじめとするサブゲノミックウイルスＲＮＡの発現用の配列を挙げることができる。
「非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列」という用語には、当該技術分野では周知のアルファウイルス保存配列因子（ＣＳＥ）が含まれる。ＣＳＥとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１－ｎｔ ＣＳＥ、２４－ｎｔ ＣＳＥ、または他の２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９－ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられる。
「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語には、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリヌクレオチドの生成を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６を含むバクテリオファージ由来ポリメラーゼが挙げられる。
「脂質」という用語には、疎水性及び／または両親媒性分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。脂質は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンを含みうる。脂質には、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれうる。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語には、リポソームとも呼ばれる、水性の内部を包囲する脂質含有膜を用いて形成された小胞様構造が含まれる。脂質ナノ粒子は、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベースの組成物を含む。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であってよい。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸（タウロコール酸）、及びステロール類（コレステロール）のような生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１種類以上のカチオン性、アニオン性、または中性脂質の規定の比率を含む（ただし、これに限定されない）、規定の比率の異なる脂質分子を用いて形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を封入することができ、その後、標的細胞と接触させて封入分子を宿主細胞のサイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面などを非脂質分子で修飾または官能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層）または多層（複層）とすることができる。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体化することができる。単層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となる。複層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となるか、またはその間を形成するかまたはその間に挟まれる。
略語：ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、またはヒトＭＨＣ遺伝子座；ＮＧＳ：次世代シークエンシング；ＰＰＶ：陽性適中率；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的新生抗原；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌；ＤＣ：樹状細胞。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含む点に留意されたい。
特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「約」という用語は、例えば、平均から標準偏差２つ分以内など、当該技術分野における公称公差の範囲内にあるものとして理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書に示される全ての数値は「約」という語によって修飾されている。
本明細書において直接定義されていない用語は、本発明の技術分野の範囲内で理解されるような、一般的にそれらに付随する意味を有するものとして理解されるべきである。本発明の態様の組成物、装置、方法など、ならびにそれらの製造または使用法を説明するうえで実施者にさらなる手引きを与える目的で特定の用語が本明細書で検討される。同じものについて複数の言い方がなされうる点は認識されるであろう。したがって、代替的な語及び同義語が、本明細書で検討される用語の任意の１つ以上について用いられる場合がある。本明細書においてある用語が詳述または検討されているか否かに重きが置かれるべきではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料などが提供される。１つまたは数個の同義語または均等物の記載は、明確に述べられない限り、他の同義語または均等物の使用を除外しない。用語の例を含む例の使用は、あくまで説明を目的としたものにすぎず、本明細書における発明の態様の範囲及び意味を限定しない。
本明細書の本文において引用されるすべての参照文献、発行特許、及び特許出願は、あらゆる目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＩＩ．新生抗原を特定する方法
本明細書では、腫瘍細胞、または樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞表面上に提示される可能性が高い、及び／または免疫原性を有する可能性が高い、対象の腫瘍由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。例として、かかる１つの方法は、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを得る工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含む、工程と、対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって新生抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程と、選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を含む方法を開示する。
提示モデルは、対応するラベルのセットを含む参照データのセット（訓練データセットとも呼ばれる）で訓練された、統計学的回帰または機械学習（例えば、ディープラーニング）モデルを含むことができ、前記参照データのセットは、任意で一部の対象が腫瘍を有しうる複数の別個の対象の各々から取得され、また、前記参照データのセットは、腫瘍組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、正常組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のトランスクリプトームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のプロテオーム配列を表すデータ、及び腫瘍組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータ、及び正常組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータのうちの少なくとも１つを含む。参照データは、合成タンパク質、正常及び腫瘍ヒト細胞株、ならびに新鮮な及び凍結された初代試料に対してその後曝露される所定のＭＨＣアレルを発現するように操作された単一アレル細胞株の質量分析データ、シークエンシングデータ、ＲＮＡシークエンシングデータ、及びプロテオミクスデータ、ならびにＴ細胞アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ）をさらに含むことができる。特定の態様では、参照データのセットは、参照データの各形態を含む。
提示モデルは、参照データのセットに少なくとも一部由来する特性のセットを含むことができ、前記特性のセットは、アレル依存的特性及びアレル非依存的特性のうちの少なくとも１つを含む。特定の態様では、各特性が含まれる。
本明細書ではまた、腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の１つ以上の腫瘍細胞に由来する１つ以上の新生抗原を特定することによって個別化がんワクチンを構築するための出力を生成するための方法も開示される。例として、かかる１つの方法は、前記対象の前記腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞由来の前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞由来の前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定された対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する、工程と、前記新生抗原のそれぞれの前記ペプチド配列を対応する数値ベクトルにコード化する工程であって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸及び前記ペプチド配列内における前記アミノ酸の位置のセットに関する情報を含む、工程と、コンピュータのプロセッサを使用して、前記数値ベクトルをディープラーニング提示モデルに入力して前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成する工程であって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記ディープラーニング提示モデルが、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択することにより、選択された新生抗原のセットを生成する工程と、前記選択された新生抗原のセットに基づいて前記個別化されたがんワクチンを構築するための前記出力を生成する工程と、を含むことができる。
いくつかの実施形態では、提示モデルは、訓練データセット、及び入力として受け取られた数値ベクトルと数値ベクトル及び前記パラメータに基づいた出力として生成される提示尤度との間の関係を表す関数に少なくとも基づいて特定される複数のパラメータを含む。特定の実施形態では、訓練データセットは、複数の試料のうちの少なくとも１つに存在するものとして特定された少なくとも１つのクラスＩＩ ＭＨＣアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識と、ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸及びペプチド配列内におけるアミノ酸の位置のセットに関する情報を含む数値ベクトルとしてコードされた訓練ペプチド配列と、訓練ペプチド配列に関連付けられた少なくとも１つのＨＬＡアレルと、を含む。
ナイーブＴ細胞に対する樹状細胞提示の特性は、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる。すなわち、上記の特性。ワクチン中の抗原の用量及び種類（例えば、ペプチド、ｍＲＮＡ、ウイルスなど）：（１）樹状細胞（ＤＣ）が抗原タイプを取り込む経路（例えば、エンドサイトーシス、マイクロピノサイトーシス）；及び／または（２）抗原がＤＣにより取り込まれる効率。ワクチン中のアジュバントの用量及び種類。ワクチン抗原配列の長さ。ワクチン投与の回数及び部位。ベースラインの患者の免疫機能（例えば、最近の感染の既往歴、血球数などによって測定される）。ＲＮＡワクチンについては、（１）樹状細胞内のｍＲＮＡタンパク質産物の代謝回転速度、（２）インビトロまたはインビボ実験により測定される、樹状細胞による取り込み後のｍＲＮＡの翻訳速度、ならびに／または（３）インビボまたはインビトロ実験により測定される、樹状細胞による取り込み後のｍＲＮＡの翻訳の数またはラウンド。任意で、樹状細胞で典型的に発現しているプロテアーゼ（例えばＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）にさらなる重みを与える、ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在。典型的な活性化樹状細胞におけるプロテアソーム及びイムノプロテアソームの発現のレベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、質量分析、免疫組織化学、または他の標準的な技法によって測定することができる）。任意で活性化樹状細胞または他の免疫細胞で具体的に測定される、対象とされる個体における特定のＭＨＣアレルの発現レベル（例えばＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）。任意で活性化樹状細胞または他の免疫細胞で具体的に測定される、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体における特定のＭＨＣアレルによるペプチド提示の確率。任意で活性化樹状細胞または他の免疫細胞で具体的に測定される、他の個体内の同じ分子のファミリー（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のＭＨＣアレルによるペプチド提示の確率。
免疫寛容逃避特性は、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる。すなわち、１つまたはいくつかの細胞タイプに対して行われるタンパク質質量分析による自己ペプチドームの直接測定。自己タンパク質の全ｋマー（例えば、５～２５）の部分文字列の和集合を取ることによる、自己ペプチドームの推定。任意で生殖細胞系列変異を説明する、すべての非変異自己タンパク質に適用された上記の提示モデルに類似した提示のモデルを用いた、自己ペプチドームの推定。
ランク付けは、数値的尤度に少なくとも一部基づく少なくとも１つのモデルによって与えられる複数の新生抗原を用いて行うことができる。ランク付けの後に、選択を行ってランク付けされた新生抗原のサブセットを選択基準にしたがって選択することができる。選択後に、ランク付けされたペプチドのサブセットを出力として与えることができる。
選択された新生抗原のセットの数は、２０個とすることができる。
提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、ペアのＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むかかるペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表すことができる。
本明細書に開示される方法はまた、前記１つ以上の提示モデルを、前記対応する新生抗原のペプチド配列に適用することによって、前記１つ以上のＭＨＣアレルのそれぞれについて、前記対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、前記ＭＨＣアレルが前記対応する新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを生成することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、依存性スコアを変換することによって、各ＭＨＣアレルについて、前記対応するＭＨＣアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す、対応するアレルごと尤度を生成することと、アレルごと尤度を組み合わせて数値的尤度を生成することと、を含んでもよい。
依存性スコアを変換する工程は、対応する新生抗原のペプチド配列の提示を相互排他的としてモデル化することができる。
本明細書に開示される方法はまた、依存性スコアの組み合わせを変換して数値的尤度を生成することをさらに含んでもよい。
依存性スコアの組み合わせを変換する工程は、対応する新生抗原のペプチド配列の提示をＭＨＣアレル間の干渉としてモデル化することができる。
数値的尤度のセットは、少なくともアレル非相互作用特性によってさらに特定することができ、本明細書に開示する方法はまた、アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、１つ以上の提示モデルのうちのアレル非相互作用モデルをアレル非相互作用特性に適用することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、１つ以上のＭＨＣアレルの各ＭＨＣアレルについての依存性スコアを、アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、対応するＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示する尤度を示す、ＭＨＣアレルについての対応するアレルごと尤度を生成するために、各ＭＨＣアレルについての組み合わされた依存性スコアを変換することと、アレルごと尤度を組み合わせて数値的尤度を生成することと、を含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、ＭＨＣアレルの各々についての依存性スコアと、アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換することにより、数値的尤度を生成することを含んでもよい。
提示モデルについての数値的パラメータのセットは、複数の試料中に存在すると特定された訓練ペプチド配列のセット、及び各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレルを少なくとも含む訓練データセットに基づいて訓練することができ、訓練ペプチド配列は、複数の試料に由来するＭＨＣアレルから溶出された単離ペプチドの質量分析により特定される。
試料はまた、単一のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含んでもよい。
試料はまた、複数のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含んでもよい。
試料はまた、複数の患者から得られた、または複数の患者に由来するヒト細胞株を含んでもよい。
試料はまた、複数の患者から得られた新鮮な、または凍結された腫瘍試料を含んでもよい。
試料はまた、複数の患者から得られた新鮮な、または凍結された組織試料を含んでもよい。
試料はまた、Ｔ細胞アッセイを用いて特定されたペプチドも含んでもよい。
訓練データセットは、試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含むことができる。
訓練データセットは、既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって生成することができ、訓練タンパク質配列のセットは、訓練ペプチド配列よりも長く、かつ訓練ペプチド配列を含む。
訓練データセットは、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得するために細胞株に対してヌクレオチドシークエンシングを行うか、またはヌクレオチドシークエンシングがこれまでに行われていることに基づいて生成されてもよく、シークエンシングデータは、変化を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
訓練データセットは、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得することに基づいて生成されてもよい。
訓練データセットは、試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するＭＨＣペプチドーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練ペプチド配列は、ｋマー（ｋは、ＭＨＣクラスＩでは８以上１５以下、または、ＭＨＣクラスＩＩでは６以上３０以下である）の範囲内の長さとすることができる。
本明細書に開示する方法はまた、ワン・ホット（ｏｎｅ－ｈｏｔ）エンコーディングスキームを用いてペプチド配列をコードすることを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、レフトパディング（ｌｅｆｔ－ｐａｄｄｅｄ）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコードすることを含んでもよい。
本明細書に記載される新生抗原の特定方法のいずれかの工程を行うことを含み、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを得る工程と、腫瘍ワクチンを対象に投与する工程と、をさらに含む、腫瘍を有する対象を治療する方法。
本明細書に開示される方法はまた、サブセットの中の新生抗原のうちの少なくとも１つに対して抗原特異的な１つ以上のＴ細胞を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、同定は、１つ以上の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる条件下で１つ以上のＴ細胞をサブセットの中の新生抗原のうちの１つ以上と共培養することを含む。さらなる実施形態では、同定は、１つ以上のＴ細胞を、サブセットの中の新生抗原のうちの１つ以上を含むテトラマーと、Ｔ細胞とテトラマーとの結合が可能な条件下で接触させることを含む。いっそうさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法はまた、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定することをさらに含むことができる。特定の実施形態では、１つ以上のＴ細胞受容体を同定することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞のＴ細胞受容体配列をシークエンシングすることを含む。本明細書に開示される方法は、前記１つ以上の同定されたＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することと、前記複数のＴ細胞を増殖させる条件下で前記複数のＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の同定されたＴ細胞受容体の少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の前記Ｔ細胞受容体配列を発現ベクターにクローニングすることと、前記複数のＴ細胞のそれぞれに発現ベクターをトランスフェクトすることと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、さらに、前記１つ以上のＴ細胞を増殖させる条件下で前記１つ以上の同定されたＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含む。
本明細書ではまた、前記サブセットの中の少なくとも１つの選択された新生抗原に対して抗原特異的である単離Ｔ細胞も開示される。
本明細書ではまた、腫瘍ワクチンを製造するための方法であって、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含む、工程と、前記新生抗原のそれぞれが前記対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、前記選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するか、またはこれまでに生産している工程と、を含む方法も開示される。
本明細書ではまた、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含む、工程と、前記新生抗原のそれぞれが前記対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、前記選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するか、またはこれまでに生産している工程と、を含む方法を実行することによって選択された、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンも提供される。
腫瘍ワクチンは、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの１つ以上を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞表面上に提示された１つ以上の新生抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において免疫原性を示す１つ以上の新生抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する、１つ以上の新生抗原を含まなくともよい。
腫瘍ワクチンは、アジュバントを含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、賦形剤を含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含んでもよく、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含んでもよい。
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータは、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得することができる。
シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチであってもよい。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル相互作用特性によってさらに特定することができる。すなわち、ＭＨＣアレルと新生抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性；新生抗原コード化ペプチド－ＭＨＣ複合体の予測安定性；新生抗原コード化ペプチドの配列及び長さ；質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率；対象とされる対象の特定のＭＨＣアレルの発現レベル（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；特定のＭＨＣアレルを発現する他の別個の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率；他の別個の対象における、同じ分子のファミリー（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル非相互作用特性によってさらに特定される。すなわち、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端及びＮ末端配列；任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在；適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度；ＲＮＡ－ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライス変異体（「アイソフォーム」）を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ；腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる）；新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現；例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏにみることができるような、由来源タンパク質及び／またはそのドメインの特性の包括的なカタログ；ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、βシートに対するαヘリックス）；選択的スプライシング；他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率；ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率；腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑによって測定される、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない）；腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数；ペプチドがＴＡＰに結合する確率、またはＴＡＰに対するペプチドの測定または予測される結合親和性；腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる）；以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無：ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、及び抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における変異。その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い；以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における多型；腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ）；臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）；喫煙歴；任意でドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
少なくとも１つの変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化であってよい。
腫瘍細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択することができる。
本明細書に開示される方法はまた、選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを得ることを含んでもよく、任意で腫瘍ワクチンを対象に投与することをさらに含む。
選択された新生抗原のセット内の新生抗原の少なくとも１つは、ポリペプチド形態である場合、以下のうちの少なくとも１つを含んでもよい：ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満のＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩのポリペプチドではアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドではアミノ酸６～３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩでは、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
本明細書ではまた、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法であって、複数の試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット及び各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、前記訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法も開示される。
提示モデルは、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、特定の位置に特定のアミノ酸を有するペプチド配列の、腫瘍細胞上のＭＨＣアレルのうちの１つによる提示の尤度との間の依存性を表すことができる。
試料はまた、単一のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含んでもよい。
試料はまた、複数のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含んでもよい。
試料はまた、複数の患者から得られた、または複数の患者に由来するヒト細胞株を含んでもよい。
試料はまた、複数の患者から得られた新鮮な、または凍結された腫瘍試料を含んでもよい。
試料はまた、Ｔ細胞アッセイを用いて特定されたペプチドも含んでもよい。
訓練データセットは、試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；試料中の訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含むことができる。
本明細書に開示される方法はまた、既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、訓練ペプチド配列に基づいて、訓練ペプチド配列よりも長くかつ訓練ペプチド配列を含む訓練タンパク質配列のセットを取得することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析がこれまでに行われていることを含んでもよく、前記ヌクレオチドシークエンシングデータは、変異を含む少なくとも１つのタンパク質配列を含む。
本明細書に開示される方法はまた、ワン・ホット（ｏｎｅ－ｈｏｔ）エンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコードすることを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得することと、前記正常ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて、提示モデルのパラメータのセットを訓練することと、を含むことができる。
訓練データセットは、試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するＭＨＣペプチドーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含んでもよい。
訓練ペプチド配列は、ｋマー（ｋは、ＭＨＣクラスＩでは８以上１５以下、または、ＭＨＣクラスＩＩでは６以上３０以下である）の範囲内の長さとすることができる。
本明細書に開示される方法はまた、レフトパディング（ｌｅｆｔ－ｐａｄｄｅｄ）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコードすることを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、ディープラーニングアルゴリズムを用いてパラメータのセットについて値を決定することを含んでもよい。
本明細書では、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を特定するための方法であって、複数の新鮮なまたは凍結得様試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法が開示される。
提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表すことができる。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、腫瘍の細胞表面上に提示される尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、中枢性寛容または末梢性寛容により阻害される尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれがＡＰＣに対して腫瘍細胞において差次的に翻訳後修飾される尤度が減少していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書における方法の実施においては、特に断らない限り、当該技術分野における技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。かかる技術は文献に充分な説明がなされている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
ＩＩＩ．新生抗原における腫瘍特異的変異の特定
また、ある特定の変異（例えば、がん細胞中に存在する変異またはアレル）の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍において排他的にタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらす場合、腫瘍の免疫学的ターゲティングに有用と考えることができる。有用な変異は、以下を含む：（１）タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異；（２）Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、より長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されているかまたは欠失しているリードスルー変異；（３）成熟ｍＲＮＡにおけるイントロンの包含、したがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；（４）２種類のタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異または欠失。変異はまた、非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含むことができる。
例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、または遺伝子融合の変異から生じた、変異を有するペプチドまたは変異したポリペプチドは、腫瘍対正常細胞において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をシークエンシングすることによって特定することができる。
また、変異は、以前に特定された腫瘍特異的変異を含むことができる。公知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースで見出すことができる。
様々な方法を、個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて特定の変異またはアレルの存在を検出するために利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易な、かつ安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型判定を提供している。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップなどの種々のＤＮＡ「チップ」技術を含むいくつかの技法が、記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。さらに他の方法は、侵襲性切断による小さなシグナル分子の生成及びその後の質量分析、または、固定化されたパッドロックプローブ及びローリングサークル増幅に基づく。特異的な変異を検出するための、当技術分野において公知の方法のいくつかを、下記に要約する。
ＰＣＲベースの検出手段は、多数のマーカーの多重増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズがオーバーラップせず、同時に解析することができるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野において周知である。あるいは、差次的にラベル化され、したがって、各々を差次的に検出することができるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、試料における複数のＰＣＲ産物の差次的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重解析を可能にする他の技法が、当技術分野において公知である。
いくつかの方法が、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために開発されている。例えば、一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）において開示されているような、特化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。この方法にしたがって、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから取得された標的分子に対してハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含有する場合、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みのために、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になり、それによりその検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ抵抗性誘導体の同一性は既知であるため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応において使用されたヌクレオチド誘導体のものに対して相補的であることが明らかになる。この方法は、多量の外来性配列データの決定を必要としないという利点を有する。
多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液ベースの方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法におけるように、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的であるプライマーを使用する。この方法は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合は、プライマーの末端上に組み込まれるようになる、ラベル化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして公知である代替的な方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）により記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される、不均一相アッセイであることができる。
ＤＮＡにおいて多型部位をアッセイするための、いくつかのプライマーガイドヌクレオチド組み込み手順が、記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９－７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４－６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３－１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９－１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７－１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１－１７５（１９９３））。これらの方法は、それらが、多型部位で塩基間を識別するためにラベル化デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、ＧＢＡとは異なる。そのような形式において、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランにおいて起こる多型は、ランの長さに比例するシグナルを結果としてもたらすことができる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６－５９（１９９３））。
数多くのイニシアティブは、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。リアルタイムの単一分子の合成によるシークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に対して相補的であるＤＮＡの新生鎖の中に組み込まれる際の、蛍光ヌクレオチドの検出に依拠する。１つの方法において、長さが３０～５０塩基のオリゴヌクレオチドを、ガラスのカバーガラスに、５’端で共有結合性に固着させる。これらの固着した鎖は、２つの機能を果たす。第１に、それらは、鋳型が、表面結合オリゴヌクレオチドに対して相補的な捕捉尾部を有して構成されている場合に、標的鋳型鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成する、鋳型指向性プライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの合成、検出、及び、色素を除去するための色素－リンカーの化学的切断を用いた、配列決定のための、固定された位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／ラベル化ヌクレオチド混合物の添加、リンス、画像化、及び色素の切断からなる。代替的な方法において、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、他方、各ヌクレオチドは、γ－ホスファートに付着したアクセプター蛍光部分で色分けされている。ヌクレオチドが、新規の鎖の中に組み込まれるようになる際に、システムが、蛍光タグ付加されたポリメラーゼと蛍光修飾されたヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他の合成によるシークエンシング技術もまた、存在する。
任意の適している合成によるシークエンシングプラットフォームを、変異を特定するために使用することができる。上記のように、４種類の主要な合成によるシークエンシングプラットフォームを、現在利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａより販売される１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓより販売されるＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより販売されるＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成によるシークエンシングプラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても記載されている。いくつかの実施形態において、シークエンシングされる多数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体上に固定化するために、捕捉配列／万能プライミング部位を、鋳型の３’端及び／または５’端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合性に付着した相補的配列に対して捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（万能捕捉配列とも呼ばれる）は、万能プライマーとして二重に働き得る、支持体に付着した配列に対して相補的な核酸配列である。
捕捉配列に対する代替物として、カップリングペア（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または、例えば米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン－ビオチンペアなど）のメンバーを、各断片に連結させて、そのカップリングペアのそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面上に捕捉させることができる。
捕捉に続いて、配列を、例えば、鋳型依存性の合成によるシークエンシングを含む、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているような、単一分子検出／シークエンシングによって解析することができる。合成によるシークエンシングにおいて、表面に結合した分子は、ポリメラーゼの存在下で、多数のラベル化ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の３’端の中に組み込まれるラベル化ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで行うことができ、ステップ・アンド・リピートモードで行うことができる。リアルタイム解析のために、各ヌクレオチドに対して異なる光ラベルを組み込むことができ、複数のレーザーを、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために利用することができる。
シークエンシングはまた、他の大規模並列処理シークエンシング、または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法及びプラットフォームも含むことができる。大規模並列処理シークエンシング技法及びプラットフォームの追加的な例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、ＴｈｅｒｍｏＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加的な類似した現在の大規模並列処理シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来世代を、使用することができる。
任意の細胞タイプまたは組織を利用して、本明細書に記載した方法における使用のための核酸試料を取得することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を、腫瘍または体液、例えば、公知の技法（例えば、静脈穿刺）によって取得された血液、もしくは唾液から取得することができる。あるいは、核酸試験を、乾燥試料（例えば、髪または皮膚）に対して行うことができる。加えて、試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常試料が腫瘍とは別個の組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。
腫瘍は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌のうちの１つ以上を含むことができる。
あるいは、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異したペプチドの存在を特定または実証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸溶出することができ、次いで、質量分析を用いて特定することができる。
ＩＶ．新生抗原
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
本明細書に開示する方法によって特定された腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、公知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び、本明細書に開示する方法によって特定された変異ポリペプチドまたはその断片を、本明細書に開示する。新生抗原ペプチドは、新生抗原が関連するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む場合に、それらのコード配列の文脈において記載することができる。
新生抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる：１０００ｎＭ未満のＩＣ５０値でのＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドについてはアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドについてはアミノ酸６～３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
１つ以上の新生抗原は、腫瘍の表面上に存在することができる。
１つ以上の新生抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてＴ細胞応答またはＢ細胞応答を惹起することができ得る。
対象において自己免疫応答を誘導する１つ以上の新生抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン生成の文脈において、考察から排除することができる。
少なくとも１つの新生抗原性ペプチド分子のサイズは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、またはそれよりも多いアミノ分子残基、及びこれらの範囲から導出される任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な実施形態において、新生抗原性ペプチド分子は、アミノ酸５０個以下である。
新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩについては長さが１５残基以下で、通常約８～約１１残基の間からなり、特に９または１０残基であることができ；ＭＨＣクラスＩＩについては、６～３０残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。１つの例において、ＨＬＡアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２～５アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（２）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の例において、シークエンシングにより、腫瘍中に存在する長い（１０残基より長い）新生エピトープ配列（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー、またはイントロンの包含による）が明らかになる場合、より長いペプチドは、（３）新規の腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなることになり、したがって、最強のＨＬＡに提示されるより短いペプチドの計算的なまたはインビトロ試験ベースの選択の必要を回避する。いずれの例においても、より長いペプチドの使用によって、患者細胞による内因性のプロセシングが可能になり、より有効な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導がもたらされ得る。
新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示されることができる。いくつかの態様において、新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様において、新生抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれよりも小さいＩＣ５０を有することができる。
いくつかの態様において、新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を誘導せず、及び／または免疫寛容を引き起こさない。
また、少なくとも２種類以上の新生抗原性ペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２種類の異なるペプチドを含有する。少なくとも２種類の異なるペプチドは、同じポリペプチドに由来することができる。異なるポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方において異なることを意味する。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが知られているか、または見出されている任意のポリペプチドに由来する。新生抗原性ペプチドが由来することができる、適しているポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースにおいて見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトがんにおける体細胞性変異についての総合的な情報の管理を行う。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの態様において、腫瘍特異的変異は、特定のがんタイプについてのドライバー変異である。
望ましい活性または性質を有する新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、望ましいＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞を活性化する非改変ペプチドの生物学的活性を増大させるかまたは実質的にそのすべてを少なくとも保持しつつ、特定の望ましい属性、例えば、改善された薬理学的特徴を与えるように改変することができる。例として、新生抗原性ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の改変にさらに供することができ、そのような改変は、改善されたＭＨＣ結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のもので、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような改変は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボでのペプチド及びポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は多くの方法でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿及び血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照されたい。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようなものである。プールしたヒト血清（タイプＡＢ、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相ＨＰＬＣによって決定する。
ペプチド及びポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１または２残基、より通常は、３～６残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
新生抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでＴヘルパーペプチドに連結することができる。新生抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なＴヘルパーペプチドは、破傷風トキソイドの８３０～８４３、インフルエンザの３０７～３１９、マラリアスポロゾイトの周囲３８２～３９８及び３７８～３８９を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然由来源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。１つのそのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイトに位置する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
さらなる態様において、新生抗原は、新生抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖及び／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。またさらなる態様は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、ＤＮＡを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向及び正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
Ｖ．ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、１～３０種類のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０種類の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。ワクチンは、１～１００種類もしくはそれよりも多いヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１～３０種類の新生抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なる新生抗原配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なる新生抗原配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なる新生抗原配列を含有することができる。
一実施形態では、異なるペプチド及び／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と結合することができるように選択される。いくつかの態様において、１つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチド及び／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２種類の好ましい、少なくとも３種類の好ましい、または少なくとも４種類の好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答、及び／または特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じることができる。
ワクチン組成物は、アジュバント及び／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を、本明細書の下記に示す。組成物は、例えば、タンパク質などの担体、または、例えば、Ｔ細胞に対してペプチドを提示することができる樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と結合することができる。
アジュバントは、ワクチン組成物中へのその混合が、新生抗原に対する免疫応答を増大させるか、または別の方法で修飾する任意の物質である。担体は、新生抗原がそれに結合することができる足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖であることができる。任意で、アジュバントは、共有結合性または非共有結合性にコンジュゲートされる。
抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントの能力は、典型的に、免疫媒介性反応の有意なもしくは実質的な増大、または疾患症候の低減によって明示される。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して生じた抗体の力価の有意な増大によって明示され、Ｔ細胞活性の増大は、典型的に、細胞増殖、または細胞性細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増大において明示される。アジュバントはまた、例えば、主として体液性またはＴｈ応答を、主として細胞性またはＴｈ応答へと変更することによって、免疫応答を変化させ得る。
適しているアジュバントは、１０１８ ＩＳＳ、アラム、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクターシステム、ＰＬＧマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、及びＲｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどの他の専売アジュバントを含むが、それらに限定されない。不完全フロインドまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが、有用である。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物が、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。また、サイトカインを使用することもできる。いくつかのサイトカインは、リンパ組織に対する樹状細胞の遊走への影響（例えば、ＴＮＦ－α）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速化（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、及びＩＬ－４）（具体的にその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとしての作用（例えば、ＩＬ－１２）に直接結び付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＥｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン設定においてアジュバントの効果を増強することが報告されている。ＴＬＲ ７、ＴＬＲ ８、及び／またはＴＬＲ ９に結合するＲＮＡなどの他のＴＬＲ結合分子がまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントの他の例は、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに、治療的に及び／またはアジュバントとして作用し得る、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５などの免疫活性小分子及び抗体を含むが、それらに限定されない。アジュバント及び添加物の量及び濃度は、当業者が過度の実験なしで容易に決定することができる。追加的なアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
ワクチン組成物は、１種類よりも多い異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記の任意またはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチン及びアジュバントを、任意の適切な配列において、一緒にまたは別々に投与できることもまた、企図される。
担体（または賦形剤）は、アジュバントから独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるため、安定性を与えるため、生物学的活性を増大させるため、または血清半減期を増大させるために、特に変異体の分子量を増大させることであり得る。さらに、担体は、Ｔ細胞に対してペプチドを提示するのを助けることができる。担体は、当業者に公知の任意の適している担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であることができる。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリンなどの血清タンパク質、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン、またはインスリンなどのホルモン、またはパルミチン酸であることができるが、それらに限定されない。ヒトの免疫化のためには、担体は概して、ヒトに許容されかつ安全な、生理学的に許容される担体である。しかし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは、適している担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであることができる。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来抗原自体よりも、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態において抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣのトリマー複合体が存在する場合に可能である。対応して、ペプチドがＣＴＬの活性化のために使用される場合だけではなく、追加的にそれぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣが添加される場合に、それは免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、追加的に、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有する。
新生抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（ １３）：３４０１－１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、新生抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。新生抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
Ｖ．Ａ．新生抗原カセット
１つ以上の新生抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「新生抗原カセット」とは、選択された新生抗原または複数の新生抗原と、ネオアンチゲン（複数可）を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。新生抗原または複数の新生抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で新生抗原（複数可）の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、新生抗原カセットは、新生抗原（複数可）に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。
有用なプロモーターは、構成性プロモーター、または発現させる新生抗原（複数可）の量を制御することが可能な調節された（誘導性）プロモーターであってよい。例えば、望ましいプロモーターとして、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのものがある［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照］。別の望ましいプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーが挙げられる。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリβアクチンプロモーターである［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］。当業者であれば、他の適当な、または望ましいプロモーターも選択することができる。
新生抗原カセットは、転写産物の効率的なポリアデニル化（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）のためのシグナルを与える配列ならびに機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を含むイントロンを含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列も含みうる。本明細書の例示的なベクターに用いられる一般的なポリＡ配列は、パポバウイルスＳＶ－４０由来のものである。ポリＡ配列は、新生抗原ベースの配列の後で、ウイルスベクター配列の前にカセットに挿入することができる。一般的なイントロン配列もまたＳＶ－４０由来のものでよく、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。新生抗原カセットは、プロモーター／エンハンサー配列と新生抗原（複数可）との間に位置するイントロンを含んでもよい。これら及び他の一般的なベクターエレメントの選択は従来のものであり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及び本明細書に引用される参照文献を参照］、多くのかかる配列が商業的及び産業的供給元、ならびにＧｅｎｂａｎｋより入手可能である。
新生抗原カセットは１つ以上の新生抗原を有することができる。例えば個、特定のカセットは、１～１０個、１～２０個、１～３０個、１０～２０個、１５～２５個、１５～２０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの新生抗原を含むことができる。新生抗原は互いに直接連結されてもよい。新生抗原はリンカーによって互いに連結されてもよい。新生抗原は、Ｎ～ＣまたはＣ～Ｎを含む、互いに対して任意の方向とすることができる。
上記に述べたように、新生抗原カセットは、選択することができるものの中でもとりわけ、例えばＥ１遺伝子領域の欠失、またはＥ３遺伝子領域の欠失などのウイルスベクター内の任意の選択された欠失部位内に配置することができる。
新生抗原カセットは、５’から３’に向かって、各要素の順序付けられた配列を記述する下式：
（Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ）Ｚ－（Ｐ２ｈ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ）Ｗ－Ｇ３ｇ
を用いて記述することができる。式中、Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。組成物及び順序付けられた配列は、存在する要素の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１である場合、ｂ＝０または１である場合、ｃ＝１である場合、ｄ＝０または１である場合、ｅ＝０または１である場合、ｆ＝１である場合、ｇ＝０または１である場合、ｈ＝０または１である場合、Ｘ＝１～４００であり、Ｙ＝０、１、２、３、４または５であり、Ｚ＝１～４００であり、かつＷ＝０、１、２、３、４または５である。
１つの例では、存在する要素は、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、かつＷ＝１であり、さらなるプロモーターが存在しない場合が記述される場合（すなわち、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、２０個のＭＨＣクラスＩエピトープが存在し、各Ｎについて５’リンカーが存在し、各Ｎについて３’リンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最後のＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をＲＮＡアルファウイルス骨格に連結するリンカーが存在する。新生抗原カセットの３’末端の、ＲＮＡアルファウイルス骨格との連結の例としては、３’の１９ｎｔのＣＳＥのような、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる３’ＵＴＲ要素に直接連結することが挙げられる。新生抗原カセットの５’末端の、ＲＮＡアルファウイルス骨格との連結の例としては、２６Ｓプロモーター配列、アルファウイルスの５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、または２４ｎｔのＣＳＥに直接連結することが挙げられる。
他の例としては、ａ＝１であり、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在する場合が記述される場合；ａ＝１かつＺが１よりも大きく、それぞれが１つ以上の異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の発現をもたらす、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在する場合；ｈ＝１であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の発現をもたらす別のプロモーターが存在することが記述される場合；及び、ｇ＝０であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列（存在する場合）がＲＮＡアルファウイルス骨格に直接連結される場合などが挙げられる。
他の例としては、存在する各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有する、３’リンカーを有する、どちらも有さない、または両方を有する場合が挙げられる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ新生抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ新生抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ新生抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ新生抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と同じであってよい。例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２が、それぞれ２６Ｓのサブゲノミックプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と異なっていてもよく、また、互いと異なっていてもよい。
５’リンカーＬ５は、天然配列または非天然配列であってよい。非天然配列としては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが挙げられる。３’リンカーＬ３もまた、天然配列または非天然配列であってよい。さらに、Ｌ５及びＬ３は、いずれも天然配列であってよく、いずれも非天然配列であってよく、または一方が天然で他方が非天然であってもよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｙについて、アミノ酸リンカーＧ５は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
アミノ酸リンカーＧ３は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。Ｇ３はまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。各Ｘについて、各Ｎはまた、アミノ酸が少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。
Ｖ．Ｂ．免疫チェックポイント
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるＣ６８ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも１つの新生抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも１つの免疫調節因子（例えばｓｃＦｖなどの抗体）をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、新生抗原と、チェックポイント阻害剤をコードする１つ以上の核酸分子とを含むことができる。
遮断または阻害するための標的となりうる例示的な免疫チェックポイント分子としては、これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ（γδ）及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ－１５０４９が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ－１５０４９の１つ以上に結合してその活性を遮断または阻害する抗体、またはその抗原結合フラグメント、または他の結合タンパク質が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１ｂｌｏｃｋｅｒ）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤）が挙げられる。抗体をコードする配列は、当該技術分野における通常の技能を用いてベクターに操作により組み込むことができる。例示的な方法の１つが、あらゆる目的で参照により本明細書に援用する、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｙ；２３（５）：５８４－９０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ １７；に記載されている。
Ｖ．Ｃ．ワクチン設計及び製造のさらなる考慮事項
Ｖ．Ｃ．１．すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド（ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）が、ワクチン中への包含について優先される５３。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる５４。
Ｖ．Ｃ．２．新生抗原の優先順位決定
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１． 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２． シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３． 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４． 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５． 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６． ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、腫瘍が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある）
７．ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある）
さらに、場合によっては、新生抗原が患者の腫瘍のすべてまたは一部において喪失するかまたは不活性化されたＨＬＡアレルによって提示されることが予想される場合には、これらの新生抗原のワクチン接種における優先順位を下げる（例えば除外）することができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の喪失、または遺伝子座のホモ接合欠失のいずれかによって生じうる。ＨＬＡアレルの体細胞変異の検出方法は当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ及びホモ接合欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出方法についても同様に述べられている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
Ｖ．Ｄ．アルファウイルス
Ｖ．Ｄ．１．アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは、自己複製型ＲＮＡまたはｓｒＲＮＡと呼ぶこともできる。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約１２ｋｂであり、その最初の２／３は、ウイルスゲノムを自己複製するためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子を含んでおり、最後の１／３は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。
アルファウイルスのモデル生活環は、複数の異なるステップを含む（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞にウイルスが吸着した後、ビリオンが細胞内区画内の膜と融合し、最終的にゲノムＲＮＡをサイトゾル中に放出する。プラス鎖の向きを有し、５’末端のメチルグアニル酸キャップ及び３’末端のポリＡテールを有するゲノムＲＮＡは、翻訳されて非構造タンパク質ｎｓＰ１－４を生成し、これが複製複合体を形成する。感染初期には、プラス鎖はこの複合体によってマイナス鎖の鋳型に複製される。現在のモデルでは、複製複合体は感染が進行するにつれてさらにプロセシングされ、生じたプロセス後の複合体はマイナス鎖の完全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ及び構造遺伝子を含む２６Ｓのサブゲノムプラス鎖ＲＮＡへの転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）が、マイナス鎖鋳型からのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補体、ゲノム鋳型からのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔのＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡとのジャンクション領域内の２４ｎｔのＣＳＥ、及び、プラス鎖鋳型からのマイナス鎖合成における３’末端の１９ｎｔのＣＳＥを含む様々なＲＮＡ合成ステップにおいて潜在的に一定の役割を担っているものとして同定されている。
ウイルスの自然の生活環では、異なるＲＮＡ種の複製後、ウイルス粒子が通常、アセンブルされる。２６Ｓ ＲＮＡは翻訳され、生じたタンパク質はさらにプロセシングされて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２種類の小ポリペプチドＥ３及び６Ｋを含む構造タンパク質を生成する（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルス粒子のカプシド形成が生じ、通常はゲノムＲＮＡのみに特異的なカプシドタンパク質がパッケージングされた後、ビリオンがアセンブルされ、膜表面に出芽する。
Ｖ．Ｄ．２．送達ベクターとしてのアルファウイルス
アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、ＶＥＥのＴＣ－８３株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される新生抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの新生抗原発現を可能とし、新生抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、新生抗原発現カセットは、ベクターが、ＶＥＥまたはその弱毒化誘導株ＴＣ－８３に由来する配列を含む（ただしこれらに限定されない）どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス配列を用いたいくつかの発現ベクターの設計戦略が開発されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。１つの戦略では、アルファウイルスベクターの設計は、構造タンパク質遺伝子の下流に２６Ｓプロモーター配列因子の第２のコピーを挿入した後、異種遺伝子を挿入することを含む（Ｆｒｏｌｏｖ １９９３）。これにより、天然の非構造及び構造タンパク質以外に、さらなる異種タンパク質を発現するサブゲノムＲＮＡが産生される。このシステムでは、感染性ビリオンを産生するためのすべての因子が存在し、したがって、非感染細胞において発現ベクターの繰り返しの感染のラウンドが行われうる。
別の発現ベクターの設計では、ヘルパーウイルスシステムを利用する（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。この戦略では、構造タンパク質は異種遺伝子によって置換される。したがって、依然としてインタクトな非構造遺伝子によって媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製の後、２６ＳサブゲノムＲＮＡが異種タンパク質の発現をもたらす。従来、構造タンパク質を発現するさらなるベクターが、例えば、細胞株の同時トランスフェクションなどによってイン・トランスで与えられることで感染性ウイルスを生じる。１つのシステムが米国特許第８，０９３，０２１号に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。ヘルパーベクターシステムは、感染性粒子を形成する可能性を制限するという長所をもたらし、したがってバイオセーフティーを改善する。さらに、ヘルパーベクターシステムは、全ベクター長を短縮し、複製及び発現の効率を改善する可能性がある。したがって、本明細書に記載されるシステム発現ベクターの一例では、構造タンパク質が新生抗原カセットで置換されたアルファウイルス骨格を用いることができ、得られるベクターはバイオセーフティーの問題が低減されるのと同時に全体的な発現ベクターのサイズの減少により、効率的な発現を促進する。
Ｖ．Ｄ．３．インビトロでのアルファウイルスの生成
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のＲＮＡポリヌクレオチドである。ＲＮＡ生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳ＩＶＴがある。この方法では、所望のベクターのＤＮＡ鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡに転写されることが望ましい配列の５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、ＤＮＡ鋳型は、適当なＲＮＡポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）とインキュベートされる。得られたＲＮＡポリヌクレオチドは、７－メチルグアノシンまたは関連する構造などの５’キャップ構造の付加、及び任意でポリアデニル化（ポリＡ）テールを有するように３’末端を改変することを含む（ただしこれらに限定されない）方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
Ｖ．Ｄ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の１つとして、ベクター自体に対する免疫がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる新生抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
アルファウイルスベクターの場合では、標準的な送達方法は、カプシド、Ｅ１、及びＥ２タンパク質をイン・トランスで与えることによって感染性のウイルス粒子を生じる上記に述べたヘルパーウイルスシステムである。しかしながら、Ｅ１及びＥ２タンパク質は、しばしば中和抗体の主要な標的である点に留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。したがって、対象とする新生抗原を標的細胞に送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性は、感染性粒子が中和抗体の標的とされる場合に低下する可能性がある。
ウイルス粒子を媒介とする遺伝子送達に代わる代替的手法として、ナノ粒子を用いた発現ベクターの送達がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。重要な点として、ナノ材料担体は、非免疫原性材料で形成することができ、送達ベクター自体に対する免疫の誘発を一般的に回避することができる。これらの材料としては、これらに限定されるものではないが、脂質、無機ナノ材料、及び他のポリマー材料を挙げることができる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。かかる材料は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含みうる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、膜及び小胞状構造の形成を可能とする脂質の両親媒性の性質のために魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般的にこれらの小胞は、標的細胞の膜内に吸収され、サイトゾル中に核酸を放出することによって発現ベクターを送達する。さらに、ＬＮＰは特定の細胞種のターゲティングを促すようにさらに改変または官能化することができる。ＬＮＰの設計における別の考慮事項は、ターゲティングの効率と細胞毒性との間のバランスである。脂質の組成は一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の規定の混合物を含む。いくつかの例では、ＬＮＰの凝集を防止するか、脂質の酸化を防止するか、またはさらなる部分の付着を促す化学官能基を与えるために特定の脂質が含まれる。脂質の組成は、全体のＬＮＰのサイズ及び安定性に影響しうる。１つの例では、脂質の組成は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質の組成物は、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ複合化脂質、ステロール、または中性脂質などの１種類以上の他の脂質を含むように製剤化することができる。
血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解、または遊離核酸による免疫系のオフターゲットの刺激を含むいくつかの望ましくない影響を有しうる。したがって、アルファウイルスベクターの封入を利用して分解を防止する一方で、潜在的なオフターゲット効果も防止することができる。特定の例では、アルファウイルスベクターは、ＬＮＰの水性の内部など、送達担体内に完全に封入される。ＬＮＰ内へのアルファウイルスベクターの封入は、微小流体液滴生成装置で行われる微小流体混合及び液滴生成などの当該技術分野では周知の方法によって実施することができる。かかる装置としては、これらに限定されるものではないが、標準的なＴジャンクション装置またはフローフォーカシング装置が挙げられる。１つの例では、ＭＣ３またはＭＣ３様分子含有組成物などの所望の脂質製剤を、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成装置に供給することで、送達ベクター及び所望の物質がＭＣ３またはＭＣ３様分子ベースのＬＮＰの内部に完全に封入される。１つの例では、液滴生成装置は、生成されたＬＮＰの粒径範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１～１０００ｎｍの範囲の粒径、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ｎｍの粒径を有することができる。液滴生成の後、発現ベクターを封入した送達ベクターを、投与に備えてさらに処理または改変することができる。
Ｖ．Ｅ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｅ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることによって１種類以上の新生抗原を送達する（例えば新生抗原カセットにより）ためのワクチン組成物を調製することができる。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ぶ）のヌクレオチド配列を、新生抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を参照）。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第６，０８３，７１６号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
さらなる態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列と、発現を誘導する調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含む組換えアデノウイルスが提供される。この組換えウイルスは、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞に感染させることが可能であり、細胞内で新生抗原カセットの産物を発現することが可能である。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。新生抗原カセットを、これらの遺伝子欠失部位のいずれに挿入することもできる。新生抗原カセットは、それに対するプライミングされた免疫応答が望ましい新生抗原を含むことができる。
別の態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスを感染させた哺乳動物細胞が提供される。
さらなる別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＣ６８由来の）またはその機能的フラグメントを発現する新規な哺乳動物細胞株が提供される。
いっそうさらなる態様において、本明細書では、哺乳動物細胞内に新生抗原カセットを送達するための方法であって、細胞内に、新生抗原カセットを発現するように操作された、有効量のＣ６８などのチンパンジーアデノウイルスを導入する工程を含む方法が提供される。
さらなる別の態様は、哺乳動物宿主に免疫応答を誘発してがんを治療するための方法を提供する。この方法は、免疫応答が標的とする腫瘍に由来する１種類以上の新生抗原をコードする新生抗原カセットを含む、有効量のＣ６８などの組換えチンパンジーアデノウイルスを宿主に投与する工程を含むことができる。
さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳動物細胞も開示される。この遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択することができる。
さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示される。この遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失した、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を含む。
さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、異種宿主細胞内でカセットの発現を誘導する１つ以上の調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含むベクターであって、任意で、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列が、複製及びカプシド形成に必要とされる少なくともシスエレメントを含み、シスエレメントが新生抗原カセット及び調節配列に隣接している、ベクターも開示される。いくつかの態様において、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子配列から選択される遺伝子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠失していてもよい。
さらに、新生抗原カセットを発現するように操作されたＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトした宿主細胞も開示される。さらに、細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することによって細胞内に導入された選択された遺伝子を発現するヒト細胞も開示される。
さらに、哺乳動物細胞に新生抗原カセットを送達するための方法であって、前記細胞内に、新生抗原カセットを発現するように操作された有効量のＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターを導入することを含む方法も提供される。
さらに、哺乳動物細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することと、適当な条件下で細胞を培養することと、新生抗原を産生することと、を含む、新生抗原を産生するための方法も開示される。
Ｖ．Ｅ．２．Ｅ１を発現する相補性細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能（ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合）をヘルパーウイルスまたは細胞株（すなわち、相補性またはパッケージング細胞株）によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはＨＥＫ２９３またはその変異体が含まれうる。チンパンジーＥ１遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール（米国特許第６，０８３，７１６号の実施例３及び４）にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
ＡＡＶ強化アッセイを用いてチンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定することができる。このアッセイは、他の特性評価されていないアデノウイルス（例えば他の種由来）のＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株においてＥ１の機能を同定するうえで有用である。このアッセイは米国特許第６，０８３，７１６号の実施例４Ｂに記載されている。
選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＥ１）は、選択された親細胞株で発現するためのプロモーターの転写制御下にある可能性がある。この目的で誘導性または構成性プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターには、亜鉛によって誘導されるヒツジメタロチオニンプロモーター、または糖質コルチコイド、特にデキサメタゾンによって誘導されるマウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。本明細書に参照により援用するところの国際出願第ＷＯ９５／１３３９２号において特定されるものなどの他の誘導性プロモーターもパッケージング細胞株の作製に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現を制御する構成性プロモーターも用いることができる。
任意の所望のＣ６８遺伝子を発現する新規な細胞株を作製するために親細胞を選択することができる。限定されることなく、かかる親細胞株は、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］、及びＷＩ－３８［ＣＣＬ７５］細胞であってよい。他の適当な親細胞株を他の供給元から入手することができる。親細胞株としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはその変異体、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａを挙げることができる。
Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製において有用となりうる。１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルス遺伝子産物を発現する基本的に同じ手順を用いて構築された細胞株は、これらの産物をコードする遺伝子に欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。さらに、他のヒトＡｄＥ１遺伝子産物を発現する細胞株も、チンパンジー組換えＡｄを作製するうえで有用である。
Ｖ．Ｅ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種類の新生抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、Ｃ６８のようなチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含む。Ｃ６８ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。Ｃ６８ベクターは１つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。新生抗原カセットは、プロモーターなどの１つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも１つの新生抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
「機能的に欠失された」という用語は、その遺伝子領域の充分な量が除去または例えば変異もしくは改変により他の形で変化させられていることにより、その遺伝子領域が遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を産生できなくなっていることを意味する。機能的欠失につながりうる変異または改変としては、これらに限定されるものではないが、未成熟終止コドンの導入及び基準及び非基準開始コドンの除去のようなナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングまたは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはこれらの組み合わせが挙げられる。必要な場合、遺伝子領域全体を除去することができる。
配列の欠失、挿入、及び他の変異を含む、本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学的手法を用いて生成することができるものであり、本明細書の範囲内である。
Ｖ．Ｅ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子に機能的欠失を有し、任意で例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている［例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照］。
新生抗原カセットをヒト（または他の哺乳動物）細胞に送達するための有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築において、広範囲のアデノウイルス核酸配列をベクターに用いることができる。最小のチンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスとともに使用して感染性の組換えウイルス粒子を作製することができる。ヘルパーウイルスは、最小のチンパンジーアデノウイルスベクターのウイルス感染性及び増殖に必要な基本的な遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択された欠失のみが、欠失がなければ機能性のウイルスベクターに導入される場合、欠失された遺伝子産物は、欠失された遺伝子機能をイン・トランスで与えるウイルスを選択されたパッケージング細胞株内で増殖させることによるウイルスベクター作製プロセスで供給することができる。
Ｖ．Ｅ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）と、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状のＡｄのゲノム及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）とを含む。例えば、国際出願第ＷＯ９６／１３５９７号において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
Ｖ．Ｅ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
１つの例として、適当なベクターは、Ｃ６８アデノウイルスの最初期遺伝子Ｅ１ａ及び後初期遺伝子Ｅ１ｂの全体または充分な部分を欠失させることにより、それらの正常な生物学的機能を失わせることによって形成することができる。複製不全Ｅ１欠失ウイルスは、対応する遺伝子産物をイン・トランスで与える機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含むチンパンジーのアデノウイルス形質転換相補性細胞株で増殖させた場合に感染性のウイルスを複製及び生成することが可能である。既知のアデノウイルス配列に対する相同性に基づけば、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは、当該技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスでそうであるように多くの細胞種に感染することが可能であり、新生抗原（複数可）を発現することができるが、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを有していない多くの細胞では、細胞が極めて高い感染多重度で感染していないかぎりは複製できないものと予想される。
別の例として、Ｃ６８アデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全体または一部を、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から除去することができる。
チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターは、Ｅ４遺伝子の欠失を有するように構築することもできる。さらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を有することができる。
欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１～Ｌ５のいずれに導入することもできる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２内の欠失も特定の目的では有用となりうる。他の欠失を他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子に導入することもできる。
上記に述べた欠失は、個々に用いることもできる。すなわち、アデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を有してもよい。また、それらの生物学的活性を破壊または低減するうえで効果的な遺伝子全体またはその一部を任意の組み合わせで用いることもできる。例えば、１つの例示的なベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ３遺伝子、またはＥ１及びＥ３遺伝子、または、Ｅ３の欠失をともなうかまたはともなわない、Ｅ１、Ｅ２ａ、及びＥ４遺伝子の欠失を有することができる。上記に述べたように、かかる欠失は、所望の結果を得るために温度感受性変異などの他の変異と組み合わせて用いることができる。
新生抗原（複数可）を含むカセットを任意でチンパンジーＣ６８Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入することができる。また、必要に応じて既存の遺伝子領域内にカセットを挿入することでその領域の機能を破壊することもできる。
Ｖ．Ｅ．７．ヘルパーウイルス
新生抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターをトランスフェクトしたパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。ヘルパーウイルスは複製不全であってよく、上記に述べた配列以外の様々なアデノウイルス遺伝子を含むことができる。ヘルパーウイルスは、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて用いることができる。
Ｃ６８では、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端を、ウイルスの左端から約１３００ｂｐを除去するＳｓｐＩによって短縮することによって形成されるフラグメントとすることができる。次に、この短縮されたウイルスをプラスミドＤＮＡとともにＥ１発現細胞株内に同時トランスフェクトすることにより、プラスミド内のＣ６８配列との相同組み換えによって組換えウイルスを形成する。
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５－１６９８７ （１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されるようなポリカチオン複合体として形成することもできる。ヘルパーウイルスは、任意でレポーター遺伝子を含んでもよい。多くのかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の新生抗原カセットとは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在によって、Ａｄベクターとヘルパーウイルスを独立して観察することが可能となる。この第２のレポーター遺伝子を用いることで、精製時に得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスとを分離することが可能である。
Ｖ．Ｅ．８．ウイルス粒子のアセンブリと細胞株の感染
アデノウイルス、新生抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたＤＮＡ配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のｃＤＮＡのクローニング法、インビトロ組換え法（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
例えば、所望の新生抗原を含むウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ベクターをインビトロでヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列との間で相同組み換えが起こり、これによりベクター内のアデノウイルス－新生抗原配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされ、組換えウイルスベクター粒子が得られる。
得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、新生抗原カセットを選択された細胞に導入するうえで有用である。パッケージング細胞株内で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ実験において、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスが、カセットを非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞に導入するうえで実用性を有することが実証されている。
Ｖ．Ｅ．９．組換えウイルスベクターの使用
したがって、新生抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される）は、新生抗原（複数可）をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
上記に述べた組換えベクターは、遺伝子治療について公開されている方法にしたがってヒトに投与される。新生抗原カセットを有するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは生体適合性溶液または薬学的に許容される送達溶媒中に懸濁させて患者に投与することができる。適当な溶媒としては滅菌生理食塩水が挙げられる。薬学的に許容される担体として知られ、当業者には周知のものである他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的で使用することもできる。
チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞を形質転換し、医療分野の当業者によって判定することが可能な有害作用をともなわずに、または医学的に許容される生理学的作用をともなって、治療効果を与えるうえで充分なレベルの新生抗原の導入及び発現をもたらすのに充分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、肝臓、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
ウイルスベクターの用量は、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの因子に主として依存し、したがって患者間で異なりうる。用量は、あらゆる副作用に対して治療効果のバランスが取れるように調節され、かかる用量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なりうる。新生抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、投与頻度を決定することができる。
組換え複製不全アデノウイルスは、「薬学的有効量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクトし、ワクチン効果、すなわち一定の測定可能なレベルの防御免疫をもたらすような選択された遺伝子の充分な発現レベルを与えるのにある投与経路で有効な組換えアデノウイルスの量で投与することができる。新生抗原を含むＣ６８ベクターは、アジュバントと同時投与することができる。アジュバントは、ベクターとは別のモノマーの出会ってもよく（例えばミョウバン）または特にアジュバントがタンパク質である場合にはベクター内にコードされてもよい。アジュバントは当該技術分野では周知のものである。
従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせるか、または免疫原もしくは疾患に応じて調節することができる。例えば、狂犬病の予防では、皮下、気管内、及び鼻腔内経路が好ましい。投与経路は、主として治療される疾患の性質によって決められる。
新生抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、ブースターの必要性（ある場合）を決定することができる。例えば、血清中の抗体力価の評価の後、必要に応じてブースター免疫が望ましい場合がある。
ＶＩ．治療及び製造方法
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの１つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び／または緩和する方法も提供される。
いくつかの態様において、対象は、がんと診断されているか、またはがんを発症するリスクにある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または、腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であることができる。腫瘍は、乳、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び他の組織器官の腫瘍などの、任意の固形腫瘍、ならびに、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫及び白血病などの、血液腫瘍であることができる。
新生抗原は、ＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。
新生抗原は、単独で、または他の治療用物質との組み合わせで投与することができる。治療用物質は、例えば、化学療法剤、放射線、または免疫療法である。特定のがんのための任意の適している治療的処置を、施すことができる。
加えて、対象に、チェックポイント阻害因子などの抗免疫抑制性／免疫刺激性物質をさらに投与することができる。例えば、対象に、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１をさらに投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。特に、ＣＴＬＡ－４遮断は、ワクチン接種プロトコールを採用した場合に有効であることが示されている。
ワクチン組成物に含まれるべき各新生抗原の最適量、及び最適投薬レジメンを、決定することができる。例えば、新生抗原またはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調製することができる。注射の方法は、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、及びｉ．ｖ．を含む。ワクチン組成物の投与の他の方法は、当業者に公知である。
ワクチンは、組成物中に存在する新生抗原の選択、数、及び／または量が、組織、がん、及び／または患者に特異的であるように編集することができる。例として、ペプチドの厳密な選択は、所定の組織における親タンパク質の発現パターンによって手引きされ得る。選択は、がんの特異的なタイプ、疾患の状態、より早期の処置レジメン、患者の免疫状態、及び当然、患者のＨＬＡハロタイプに依存し得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的な必要にしたがって、個別化された構成要素を含有することができる。例は、特定の患者における新生抗原の発現にしたがって新生抗原の選択を変えること、または、処置の第１のラウンドまたはスキームの後の二次的処置についての調整を含む。
がんのためのワクチンとして使用されるべき組成物について、正常組織において多量に発現している類似した正常な自己ペプチドを有する新生抗原は、本明細書に記載した組成物において、避けられるか、または少量で存在することができる。他方で、患者の腫瘍が、多量のある特定の新生抗原を発現することが公知である場合、このがんの処置のためのそれぞれの薬学的組成物は、多量に存在することができ、及び／または、この特定の新生抗原もしくはこの新生抗原の経路に特異的な１種類よりも多い新生抗原を含めることができる。
新生抗原を含む組成物を、既にがんを患っている個体に投与することができる。治療的適用において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を惹起し、かつ、症候及び／または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに妥当な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のために有効な量は、例えば、組成物、投与の様式、処置される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び健康の全身状態、ならびに処方医の判断に依存するであろう。組成物は、概して、重篤な疾患状態、すなわち、命に関わるか、または潜在的に命に関わる状況、特にがんが転移している場合に使用できることを、心に留めるべきである。そのような例において、外来性物質の最小化、及び新生抗原の相対的な非毒性の性質を考慮して、実質的過剰量のこれらの組成物を投与することが、可能であり、かつ処置する医師が望ましいと感じることができる。
治療的用途のために、投与は、腫瘍の検出または外科的除去時に始めることができる。これに、少なくとも症候が実質的に減ずるまで、及びその後ある期間にわたって、ブースト用量が続く。
治療的処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局部、経鼻、経口、または局所投与について意図される。薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与することができる。新生抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を、本明細書に開示し、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。結果として生じた水溶液を、そのままで使用のためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどのような、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
新生抗原はまた、それらをリンパ組織などの特定の細胞組織にターゲティングする、リポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増大させるのにも有用である。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるべき新生抗原は、単独で、または、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などの、例えば、リンパ系細胞の間で優性な受容体に結合する分子、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と共に、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の新生抗原で満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位へ方向付けられることができ、そこで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、概して、中性及び負電荷を有するリン脂質、及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は、概して、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性、及び血流におけるリポソームの安定性の考慮により手引きされる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７ （１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、様々な方法を、リポソームを調製するために利用可能である。
免疫細胞へのターゲティングのために、リポソーム中に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、及び処置される疾患の病期にしたがって変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。
治療目的または免疫化目的で、本明細書に記載したペプチド、及び任意でペプチドの１つ以上をコードする核酸をまた、患者に投与することもできる。数多くの方法が、核酸を患者に送達するために好都合に使用される。例として、核酸を、「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例として、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８ （１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例として、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているような弾道送達を用いて投与することもできる。単にＤＮＡからなる粒子を、投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子などの粒子に接着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションを伴うかまたは伴わない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターを含むことができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化させて送達することもできる。脂質媒介性遺伝子送達法は、例として、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ ９６／１８３７２；９３２４６４０ＷＯＡＷＯ ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）： ６８２－６９１ （１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号 Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；９１０６３０９ＷＯＡＷＯ ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４： ７４１３－７４１４ （１９８７）に記載されている。
新生抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００４） １０， ６１６－６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１） ２３９（１）： ４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２） ４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５） ４３ （１）： ６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８） ７２ （１２）： ９８７３－９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６） ２２ （４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６） ３５２ （６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４） ２０（ １３）：３４０１－１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、新生抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０ （１９９１））に記載されている。新生抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
核酸を投与する手段は、１つ以上のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のための、選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸に対するコドン選択を手引きするために、ヒトコドン使用頻度表を使用する。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列を、直接隣り合わせて、連続的なポリペプチド配列を作製する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素を、ミニ遺伝子設計中に組み入れることができる。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例は、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保持シグナルを含む。加えて、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、ＣＴＬエピトープに近接した合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって、改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって、ＤＮＡに変換される。オーバーラップするオリゴヌクレオチド（３０～１００塩基長）を、周知の技法を用いて適切な条件下で、合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの端は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで、望ましい発現ベクター中にクローニングすることができる。
精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を用いて、注射のために調製することができる。これらのうちでもっとも単純なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）における凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が記載されており、新たな技法が利用可能になり得る。上記で言及したように、核酸は、カチオン性脂質で好都合に製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、及び保護的、相互作用的、非縮合性（ＰＩＮＣ）と集合的に呼ばれる化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体化させて、安定性、筋肉内分散、または特異的な器官もしくは細胞タイプへの輸送などの変数に影響を及ぼすことができる。
また、本明細書に開示する方法の工程を行うこと；及び、多数の新生抗原または多数の新生抗原のサブセットを含む腫瘍ワクチンを生産する工程を含む、腫瘍ワクチンを製造する方法も、本明細書に開示する。
本明細書に開示する新生抗原は、当技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示する新生抗原またはベクター（例えば、１つ以上の新生抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生産する方法は、新生抗原またはベクターを発現するのに適している条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞が、新生抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む工程、及び、新生抗原またはベクターを精製する工程を含むことができる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技法、電気泳動技法、免疫学的技法、沈降技法、透析技法、濾過技法、濃縮技法、及びクロマトフォーカシング技法を含む。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞を含むことができる。宿主細胞は、本明細書に開示する新生抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換することができ、任意で、単離されたポリヌクレオチドは、新生抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであることができる。
ＶＩＩ．新生抗原の使用及び投与
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に１つ以上の新生抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、Ｃ６８（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または４に示される配列）に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、Ｃ６８（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または４に示される配列）に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、新生抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはＡＡＹなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約２０個の新生抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのＭＨＣＩＩ抗原、及びユニバーサルなクラスＩＩ抗原とみなされるＰＡＤＲＥ抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）と組み合わせて（例えば、同時、その前、またはその後で）対象に投与することができる。ＣＰＩは、抗体またはその抗原結合部分など、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及び／またはＰＤＬ１を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
プライミングワクチンは、対象に注射（例えば筋肉内に）することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ(例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１～１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１ｕｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１～１００ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００ｕｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
プライムワクチン接種後に、ワクチンブースト（ブースターワクチン）を注射（例えば筋肉内に）することができる。ブースターワクチンは、プライム後の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間ごと、例えば、４週間ごと、及び／または８週間ごとに投与することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ(例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１～１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１ｕｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１～１００ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００ｕｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
抗ＣＴＬＡ－４（例えばトレメリムマブ）を対象に投与することもできる。例えば、抗ＣＴＬＡ４を筋肉内ワクチン注射（ＣｈＡｄＶ６８プライムまたはｓｒＲＮＡ低用量）の部位の近くに皮下投与することで同じリンパ節内に確実に送り込むことができる。トレメリムマブは、ＣＴＬＡ－４の選択的ヒトＩｇＧ２ｍＡｂ阻害剤である。標的抗ＣＴＬＡ－４（トレメリムマブ）皮下用量は、通常、７０～７５ｍｇ（詳細には７５ｍｇ）であり、例えば、１～１００ｍｇまたは５～４２０ｍｇの用量範囲である。
特定の場合では、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）などの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用することができる。デュルバルマブは、ＰＤ－１及びＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する選択的な高親和性のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。デュルバルマブは一般的に４週間ごとに２０ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。
免疫モニタリングを、ワクチン投与の前、その間、及び／またはその後に行うことができる。かかるモニタリングは、他のパラメータの中でもとりわけ、安全性及び有効性についての情報を与えることができる。
免疫モニタリングを行うには、ＰＢＭＣが一般的に用いられる。ＰＢＭＣは、プライムワクチン接種の前、及びプライムワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に単離することができる。ＰＢＭＣは、ブーストワクチン接種の直前、及び各ブーストワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に採取することができる。
Ｔ細胞応答を、免疫モニタリングプロトコールの一環として評価することができる。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌、及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイなどの当業者には周知の１つ以上の方法を用いて測定することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮ－γなどの細胞内または細胞外で捕捉されたサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を用い、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、３Ｈチミジン、ブロモデオキシウリジン、及びカルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の取り込み後に、Ｔ細胞集団のエクスビボ増殖を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム放出アッセイまたは代替的な比色細胞毒性アッセイにより機能的に評価することができる。
ＶＩＩＩ．新生抗原の特定
ＶＩＩＩ．Ａ．新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している６，１４，１５。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びＮＧＳデータ解析に関連するものの、２つの区域にグループ化することができる。
ＶＩＩＩ．Ａ．１．実験室プロセスの最適化
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念１６を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む：
１．低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い（５００ｘよりも大きい）固有の平均カバレッジのターゲティング。
２．可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、１００ｘ未満でカバーされる塩基が５％未満である、例として、
ａ． 個々のプローブＱＣを有するＤＮＡベースの捕捉プローブの使用１７
ｂ．十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
３．可能性のある新生抗原が体細胞性／生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである（したがってＴＳＮＡとして使用可能ではない）ことが最も少ないように、２０ｘ未満でカバーされる塩基が５％未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
４．必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードＲＮＡは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む：
ａ．ＧＣリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないＨＬＡ遺伝子についての補充的プローブ１８。
ｂ．不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
５．変異検出、遺伝子及びスプライス変異体（「アイソフォーム」）発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍ＲＮＡが同様に、高深度（１００Ｍリードよりも大きい）でシークエンシングされる。ＦＦＰＥ試料由来のＲＮＡは、ＤＮＡにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮１９を用いて抽出される。
ＶＩＩＩ．Ａ．２．ＮＧＳデータ解析の最適化
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む：
１．アラインメントのための、ＨＧ３８参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用（それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のＭＨＣ領域アセンブリーを含有するため）。
２．様々なプログラム５からの結果をマージすることによる、単一変異コーラー２０の限界の克服。
ａ．単一ヌクレオチド変異及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍ＤＮＡ、腫瘍ＲＮＡ、及び正常ＤＮＡから検出される：Ｓｔｒｅｌｋａ２１及びＭｕｔｅｃｔ２２などの、腫瘍及び正常ＤＮＡの比較に基づくプログラム；ならびに、低純度の試料において特に有利である２３、ＵＮＣｅｑＲなどの、腫瘍ＤＮＡ、腫瘍ＲＮＡ、及び正常ＤＮＡを組み入れるプログラム。
ｂ．挿入欠失は、Ｓｔｒｅｌｋａ及びＡＢＲＡ２４などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
ｃ．構造的再編成は、Ｐｉｎｄｅｌ２５またはＢｒｅａｋｓｅｑ２６などの専用のツールを用いて決定される。
３．試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来の変異コールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
４．例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる：
ａ．潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常ＤＮＡにおいて見出される変異の除去。
ｂ．低いマッピング品質または低い塩基品質による変異の除去２７。
ｃ．たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じる変異の除去２７。例は、主として１本の鎖上に検出される変異を含む。
ｄ．無関連の対照のセットにおいて検出される変異の除去２７。
５．ｓｅｑ２ＨＬＡ２８、ＡＴＨＬＡＴＥＳ２９、またはＯｐｔｉｔｙｐｅのうちの１つを使用する、かつまた、エクソーム及びＲＮＡシークエンシングデータを組み合わせる２８、正常エクソームからの正確なＨＬＡコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードＤＮＡシークエンシングなどの、ＨＬＡタイピングのための専用アッセイの採用３０、または、ＲＮＡ断片を連結して連続性を保持するための方法の適応３１を含む。
６．腫瘍特異的スプライス変異体から生じた新生ＯＲＦの堅牢な検出は、ＣＬＡＳＳ３２、Ｂａｙｅｓｅｍｂｌｅｒ３３、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ３４、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム（すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる）を用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ３５が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライス変異体を産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、ＳｐｌｉｃｅＲ３６及びＭＡＭＢＡ３７などのツールで決定される。遺伝子発現は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ３５またはＥｘｐｒｅｓｓ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｐａｃｈｔｅｒ，２０１３）などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び／または相対レベルは、ＡＳＥ３８またはＨＴＳｅｑ３９などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む：
ａ．不十分に発現されていると考えられる候補新生ＯＲＦの除去。
ｂ．ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を引き起こすと予測される候補新生ＯＲＦの除去。
７．腫瘍特異的と直接検証することができない、ＲＮＡにおいてのみ観察される候補新生抗原（例えば、新生ＯＲＦ）は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される：
ａ．腫瘍ＤＮＡのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
ｂ．スプライシング因子における腫瘍ＤＮＡのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、Ｒ６２５変異体ＳＦ３Ｂ１での３つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、１つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し４０、第２の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し４１、及び第３の実験が乳がん患者を検討した４２にもかかわらず、一致していた。
ｃ．新規のスプライシングアイソフォームについては、ＲＮＡＳｅｑデータにおける「新規の」スプライス－ジャンクションリードの確証の存在。
ｄ．新規の再編成については、正常ＤＮＡには存在しない腫瘍ＤＮＡにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
ｅ．ＧＴＥｘ４３などの遺伝子発現大要からの欠如（すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする）。
８．アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたＤＮＡの腫瘍及び正常リード（またはそのようなリード由来のｋマー）を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完（例えば、生殖細胞系列変異またはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性変異について）。
ポリアデニル化ＲＮＡを有する試料において、ＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるウイルスＲＮＡ及び微生物ＲＮＡの存在は、患者の応答を予測し得る追加的因子の特定に向かって、ＲＮＡ ＣｏＭＰＡＳＳ４４または類似した方法を用いて評価される。
ＶＩＩＩ．Ｂ．ペプチドの単離及び検出
ＨＬＡペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った（５５～５８）。清澄化した溶解物を、ＨＬＡ特異的ＩＰに使用した。
免疫沈降は、抗体がＨＬＡ分子に特異的である、ビーズにカップリングした抗体を用いて行った。汎クラスＩ ＨＬＡ免疫沈降のためには、汎クラスＩ ＣＲ抗体を使用し、クラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲのためには、ＨＬＡ－ＤＲ抗体を使用する。抗体を、一晩インキュベーション中に、ＮＨＳ－セファロースビーズに共有結合で付着させる。共有結合性の付着後、ビーズを洗浄して、ＩＰのために等分した（５９、６０）。
免疫沈降は、ビーズに共有結合されていない抗体を用いて行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにＰｒｏｔｅｉｎＡ及び／またはＰｒｏｔｅｉｎＧでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。ＭＨＣ／ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
Figure 2023123766000008
清澄化した組織溶解物を、免疫沈降のために抗体ビーズに添加する。免疫沈降後、ビーズを溶解物から除去し、追加的なＩＰを含む追加的な実験のために、溶解物を保存する。標準的な技法を用いて、ＩＰビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、ＨＬＡ／ペプチド複合体をビーズから溶出する。分子量スピンカラムまたはＣ１８分画を用いて、タンパク質構成要素をペプチドから除去する。結果として生じたペプチドを、ＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発によって乾燥させ、いくつかの場合には、ＭＳ解析の前に－２０℃で保存する。
乾燥したペプチドを、逆相クロマトグラフィーに適しているＨＰＬＣ緩衝液において再構成し、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）における勾配溶出のために、Ｃ－１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラム上にロードする。ペプチド質量／電荷（ｍ／ｚ）のＭＳ１スペクトルを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度で収集し、その後、ＭＳ２低解像度スキャンを、選択イオンのＨＣＤフラグメンテーション後にイオントラップ検出器において収集した。追加的に、ＭＳ２スペクトルは、ＣＩＤもしくはＥＴＤフラグメンテーション法、または、ペプチドのより大きなアミノ酸カバレッジを獲得するための３つの技法の任意の組み合わせのいずれかを用いて、取得することができる。ＭＳ２スペクトルはまた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度質量精度で測定することもできる。
各解析由来のＭＳ２スペクトルを、Ｃｏｍｅｔ（６１、６２）を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド特定を、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ（６３～６５）を用いてスコア化する。ＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）及び他のサーチエンジンを用いてさらなるシークエンシングを行うか、またはスペクトルマッチング及びデノボシークエンシング（９７）を含むシークエンシング法を用いることができる。
ＶＩＩＩ．Ｂ．１．総合的ＨＬＡペプチドシークエンシングのためのＭＳ検出限界の研究
ペプチドＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）を用いて、何が検出の限界かを、ＬＣカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、及び１００ａｍｏｌであった。（表１）結果を図１Ｆに示す。これらの結果は、検出の最低限界（ＬｏＤ）がアトモルの範囲（１０－１８）にあること、ダイナミックレンジが５桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲（１０－１５）でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
（表１）
Figure 2023123766000009
ＩＸ．提示モデル
ＩＸ．Ａ．システムの概要
図２Ａは、１つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境１００の概要である。環境１００は、それ自体が提示情報記憶装置１６５を含む提示特定システム１６０を導入するコンテクストを提供する。
提示特定システム１６０は、図１４に関して下記で議論されるようなコンピュータ計算システムにおいて具現化された、１つまたはコンピュータモデルであり、ＭＨＣアレルのセットに関連するペプチド配列を受け取り、ペプチド配列が、関連するＭＨＣアレルのセットの１つ以上によって提示されるであろう尤度を決定する。提示特定システム１６０はクラスＩ及び／またはクラスＩＩ ＭＨＣアレルの両方に適用することができる。これは、様々なコンテクストにおいて有用である。提示特定システム１６０の１つの具体的な用途の例は、患者１１０の腫瘍細胞由来のＭＨＣアレルのセットに関連する候補新生抗原のヌクレオチド配列を受け取り、候補新生抗原が、腫瘍の関連するＭＨＣアレルの１つ以上によって提示され、及び／または患者１１０の免疫系において免疫原性応答を誘導するであろう尤度を決定することができることである。システム１６０によって決定された際に高い尤度を有するそれらの候補新生抗原を、ワクチン１１８における包含のために選択することができ、そのような抗腫瘍免疫応答が、腫瘍細胞を提供する患者１１０の免疫系から惹起され得る。
提示特定システム１６０は、１つ以上の提示モデルを通して提示尤度を決定する。具体的には、提示モデルは、所定のペプチド配列が、関連するＭＨＣアレルのセットについて提示されるかどうかの尤度を生成し、尤度は、記憶装置１６５に保存された提示情報に基づいて生成される。例えば、提示モデルは、ペプチド配列「ＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）」が、試料の細胞表面上のアレルのセットＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０６：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊０１：０４について提示されるかどうかの尤度を生成し得る。提示情報１６５は、ＭＨＣアレルによってペプチドが提示されるようにこれらのペプチドが様々なタイプのＭＨＣアレルに結合するかどうかについての情報を含有し、これは、モデルにおいて、ペプチド配列中のアミノ酸の位置に応じて決定される。提示モデルは、提示情報１６５に基づいて、認識されていないペプチド配列が、ＭＨＣアレルの関連するセットと結合して提示されるかどうかを予測することができる。上記に述べたように、提示モデルはクラスＩ及び／またはクラスＩＩ ＭＨＣアレルの両方に適用することができる。
ＩＸ．Ｂ．提示情報
図２は、１つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報１６５は、２つの一般的部類の情報：アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、ＭＨＣアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、ＭＨＣアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
ＩＸ．Ｂ．１．アレル相互作用情報
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の１つ以上の特定されたＭＨＣ分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたＭＨＣアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。ＭＨＣアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図２Ｂは、あらかじめ決定されたＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０１：０１上に提示された例示的なペプチドＹＥＭＦＮＤＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）が単離され、質量分析により特定される、この例を示す。図２Ｄは、この別の例を示し、あらかじめ決定されたＭＨＣアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１上に提示された例示的ペプチド
Figure 2023123766000010
が単離され、質量分析によって特定されている。これらの状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたＭＨＣタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したＭＨＣタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
提示されたペプチド配列はまた、複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から収集されてもよい。典型的にヒトにおいては、６種類の異なるタイプのＭＨＣ－Ｉ及び最大で１２種類の異なるタイプのＭＨＣ－ＩＩ分子が、細胞について発現している。そのような提示されたペプチド配列は、複数のあらかじめ決定されたＭＨＣアレルを発現するように操作されている複数アレル細胞株から特定されてもよい。そのような提示されたペプチド配列はまた、正常組織試料または腫瘍組織試料のいずれかの、組織試料から特定されてもよい。この例において特に、ＭＨＣ分子は、正常組織または腫瘍組織から免疫沈降させることができる。複数のＭＨＣアレル上に提示されたペプチドは、同様に、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定されることができる。図２Ｃは、６種類の例示的なペプチド
Figure 2023123766000011
が、特定されたＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３、及びＨＬＡ－Ｃ＊０１：０４上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。別の例において、図２Ｃは、６種類の例示的なペプチド
Figure 2023123766000012
が、特定されたクラスＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、及びクラスＩＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１上に提示され、単離され、質量分析によって特定される場合を示している。単一アレル細胞株とは対照的に、これらの例においては、結合したペプチドが、特定される前のＭＨＣ分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したＭＨＣタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
アレル相互作用情報はまた、ペプチド－ＭＨＣ分子複合体の濃度、及びペプチドのイオン化効率の両方に依存する、質量分析イオン電流も含むことができる。イオン化効率は、配列依存性様式で、ペプチドごとに変動する。概して、イオン効率は、およそ２桁にわたってペプチドごとに変動し、他方、ペプチド－ＭＨＣ複合体の濃度は、それよりも大きい範囲にわたって変動する。
アレル相互作用情報はまた、所定のＭＨＣアレルと所定のペプチドとの間の結合親和性の測定値または予測値も含むことができる（９４，９５，９６）。１つ以上の親和性モデルが、そのような予測値を生成することができる。例えば、図１Ｄに示した例に戻ると、提示情報１６５は、ペプチドＹＥＭＦＮＤＫＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）とクラスＩアレルＨＬＡ－Ａ＊０１：０１との間の１０００ｎＭの結合親和性予測値を含み得る。ＩＣ５０＞１０００ｎｍであるペプチドはわずかしか、ＭＨＣによって提示されず、より低いＩＣ５０値が、提示の確率を増大させる。提示情報１６５は、ペプチド
Figure 2023123766000013
とクラスＩＩアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１との間の結合親和性予測値を含み得る。
アレル相互作用情報はまた、ＭＨＣ複合体の安定性の測定値または予測値も含むことができる。１つ以上の安定性モデルが、そのような予測値を生成することができる。より安定なペプチド－ＭＨＣ複合体（すなわち、より長い半減期を有する複合体）は、腫瘍細胞上、及びワクチン抗原に遭遇する抗原提示細胞上に高コピー数で提示される可能性がより高い。例えば、図２Ｃに示した例に戻ると、提示情報１６５は、クラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１について１時間の半減期の安定性予測値を含み得る。提示情報１６５はクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１の半減期の安定性予測値も含み得る。
アレル相互作用情報はまた、ペプチド－ＭＨＣ複合体の形成反応の、測定されたかまたは予測された速度も含むことができる。より速い速度で形成する複合体は、高濃度で細胞表面上に提示される可能性がより高い。
アレル相互作用情報はまた、ペプチドの配列及び長さも含むことができる。ＭＨＣクラスＩ分子は典型的に、８～１５ペプチドの長さを有するペプチドを提示することを好む。提示されたペプチドの６０～８０％は、長さ９を有する。いくつかの細胞株由来の提示されたペプチドの長さのヒストグラムを、図５に示す。ＭＨＣクラスＩＩ分子は一般的にペプチド６～３０個の長さを有するペプチドを提示する傾向にある。
アレル相互作用情報はまた、新生抗原コード化ペプチド上のキナーゼ配列モチーフの存在、及び新生抗原コード化ペプチド上の特異的な翻訳後修飾の有無も含むことができる。キナーゼモチーフの存在は、ＭＨＣ結合を増強または干渉し得る、翻訳後修飾の確率に影響を及ぼす。
アレル相互作用情報はまた、（ＲＮＡ ｓｅｑ、質量分析、または他の方法によって測定されたかまたは予測された際の）翻訳後修飾のプロセスに関与するタンパク質、例えば、キナーゼの発現または活性レベルも含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価された際の、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞における、類似した配列を有するペプチドの提示の確率も含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定された際の）問題の個体における特定のＭＨＣアレルの発現レベルも含むことができる。高レベルで発現しているＭＨＣアレルに最も強く結合するペプチドは、低レベルで発現しているＭＨＣアレルに最も強く結合するペプチドよりも、提示される可能性がより高い。
アレル相互作用情報はまた、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率も含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、他の個体における同じファミリーの分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的なペプチド配列に非依存的な確率も含むことができる。例えば、ＨＬＡ－Ｃ分子は典型的に、ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｂ分子よりも低いレベルで発現しており、したがって、ＨＬＡ－Ｃによるペプチドの提示は、ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｂ ＩＩによる提示よりも先験的に確率が低い。別の例として、ＨＬＡ－ＤＰは一般的にＨＬＡ－ＤＲまたはＨＬＡ－ＤＱよりも低いレベルで発現されることから、ＨＬＡ－ＤＰによるペプチドの提示はＨＬＡ－ＤＲまたはＨＬＡ－ＤＱによる提示よりもより確率が低いものと推測される。
アレル相互作用情報はまた、特定のＭＨＣアレルのタンパク質配列も含むことができる。
下記のセクションに列挙される任意のＭＨＣアレル非相互作用情報もまた、ＭＨＣアレル相互作用情報としてモデル化することができる。
ＩＸ．Ｂ．２．アレル非相互作用情報
アレル非相互作用情報は、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端配列を含むことができる。ＭＨＣ－Ｉでは、Ｃ末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、Ｃ末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のＭＨＣアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、ＭＨＣ分子は、Ｃ末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、Ｃ末端フランキング配列の効果は、ＭＨＣアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図２Ｃに示した例に戻ると、提示情報１６５は、ペプチドの由来源タンパク質から特定された、提示されたペプチドＦＪＩＥＪＦＯＥＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４）のＣ末端フランキング配列ＦＯＥＩＦＮＤＫＳＬＤＫＦＪＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）を含み得る。
アレル非相互作用情報はまた、ｍＲＮＡ定量測定値も含むことができる。例えば、ｍＲＮＡ定量データは、質量分析訓練データを提供する同じ試料について取得することができる。図１３Ｈに関して後に記載するように、ＲＮＡ発現は、ペプチド提示の強い予測因子であると特定された。一実施形態では、ｍＲＮＡ定量測定値は、ソフトウェアツールＲＳＥＭから特定される。ＲＳＥＭソフトウェアツールの詳細な実行は、Ｂｏ Ｌｉ ａｎｄ Ｃｏｌｉｎ Ｎ．Ｄｅｗｅｙ．ＲＳＥＭ： ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１２：３２３，Ａｕｇｕｓｔ ２０１１で見出すことができる。一実施形態では、ｍＲＮＡ定量は、１００万個のマップされたリードあたりの転写産物のキロ塩基あたりの断片の単位（ＦＰＫＭ）で測定される。
アレル非相互作用情報はまた、その由来源タンパク質配列内の、ペプチドに隣接するＮ末端配列も含むことができる。
アレル非相互作用情報はペプチド配列のソース遺伝子も含むことができる。ソース遺伝子はペプチド配列のＥｎｓｅｍｂｌタンパク質ファミリーとして定義することができる。他の例では、ソース遺伝子はペプチド配列のソースＤＮＡまたはソースＲＮＡとして定義することができる。ソース遺伝子は、例えば、タンパク質をコードするヌクレオチドのストリングとして表すか、またはその代わりに、特定のタンパク質をコードしていることが知られている既知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の命名されたセットに基づいてよりカテゴリー化された形で表すことができる。別の例では、アレル非相互作用情報は、ＥｎｓｅｍｂｌまたはＲｅｆＳｅｑのようなデータベースから抽出されたペプチド配列のソース転写産物もしくはアイソフォームまたは潜在的なソース転写産物もしくはアイソフォームのセットも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定された際の）任意で、腫瘍細胞における対応するプロテアーゼの発現にしたがって重み付けされる、ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在も含むことができる。プロテアーゼ切断モチーフを含有するペプチドは、プロテアーゼによってより容易に分解され、したがって細胞内で安定性がより低いことになるため、提示される可能性がより低い。
アレル非相互作用情報はまた、適切な細胞タイプにおいて測定された際の、由来源タンパク質の代謝回転速度も含むことができる。より速い代謝回転速度（すなわち、より低い半減期）は提示の確率を増大させるが、類似していない細胞タイプにおいて測定された場合、この特性の予測力は低い。
アレル非相互作用情報はまた、ＲＮＡ－ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定された際、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞性スプライシング変異のアノテーションから予測された際の、任意で、腫瘍細胞において最も高発現している特異的なスプライス変異体（「アイソフォーム」）を考慮する、由来源タンパク質の長さも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベルも含むことができる。異なるプロテアソームは、異なる切断部位の好みを有する。より大きい重みが、その発現レベルに比例して、プロテアソームの各タイプの切断の好みに与えられる。
アレル非相互作用情報はまた、（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定された際の）ペプチドの由来源遺伝子の発現も含むことができる。可能な最適化は、腫瘍試料内の間質細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の存在を説明する、測定された発現を調整することを含む。より高発現している遺伝子由来のペプチドは、提示される可能性がより高い。検出不可能なレベルの発現を有する遺伝子由来のペプチドは、考察から排除することができる。
アレル非相互作用情報はまた、新生抗原コード化ペプチドの由来源ｍＲＮＡが、ナンセンス変異依存分解機構のモデル、例えば、Ｒｉｖａｓ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５からのモデルによって予測されるようなナンセンス変異依存分解機構に供されるであろう確率も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、細胞周期の種々の段階の最中の、ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現も含むことができる。（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは試料分析プロテオミクスによって測定された際に）全体的に低いレベルで発現しているが、細胞周期の特異的な段階の最中に高レベルで発現していることが公知である遺伝子は、非常に低いレベルで安定に発現している遺伝子よりも、より提示されるペプチドを産生する可能性が高い。
アレル非相互作用情報はまた、例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにおいて与えられるような、由来源タンパク質の特性の総合的なカタログも含むことができる。これらの特性は、とりわけ、タンパク質の二次構造及び三次構造、細胞内局在化１１、遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語を含み得る。具体的には、この情報は、タンパク質のレベルで作用するアノテーション、例えば、５’ＵＴＲ長、及び特異的残基のレベルで作用するアノテーション、例えば、残基３００～３１０のヘリックスモチーフを含有し得る。これらの特性はまた、ターンモチーフ、シートモチーフ、及び無秩序残基も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドを含有する由来源タンパク質のドメインの性状を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、αヘリックス対βシート）；選択的スプライシングも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドの由来源タンパク質におけるペプチドの位置での提示ホットスポットの有無を説明する特性も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、他の個体における問題のペプチドの由来源タンパク質由来のペプチドの提示の確率（それらの個体における由来源タンパク質の発現レベル、及びそれらの個体の様々なＨＬＡタイプの影響を調整した後）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表されるであろう確率も含むことができる。
腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑ、マイクロアレイ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇなどの標的化パネルなどの、遺伝子発現アッセイ、または、ＲＴ－ＰＣＲなどのアッセイによって測定される遺伝子モジュールを代表する単一／複数遺伝子によって測定された際の、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの由来源タンパク質を含有する必要はない）。
アレル非相互作用情報はまた、腫瘍細胞におけるペプチドの由来源遺伝子のコピー数も含むことができる。例えば、腫瘍細胞においてホモ接合性欠失に供される遺伝子由来のペプチドは、ゼロの提示確率を割り当てることができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドがＴＡＰに結合する確率、または、測定されたかもしくは予測された、ＴＡＰに対するペプチドの結合親和性も含むことができる。ＴＡＰに結合する可能性がより高いペプチド、またはより高い親和性でＴＡＰに結合するペプチドは、ＭＨＣ－Ｉによって提示される可能性がより高い。
アレル非相互作用情報はまた、（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベルも含むことができる。ＭＨＣ－Ｉでは、より高いＴＡＰ発現レベルは、すべてのペプチドの提示の確率を増大させる。
アレル非相互作用情報はまた、以下を含むがそれらに限定されない、腫瘍変異の有無も含むことができる：
ｉ．ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ｉｉ．抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
以下を含むがそれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：
ｉ．抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。
アレル非相互作用情報はまた、腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、黒色腫）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、例としてＨＬＡアレル接尾辞によって反映されるような、ＨＬＡアレルの公知の機能性も含むことができる。例えば、アレル名ＨＬＡ－Ａ＊２４：０９ＮにおけるＮの接尾辞は、発現せず、したがってエピトープを提示する可能性が低いヌルアレルを示し；完全なＨＬＡアレル接尾辞の命名法は、https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/suffixes.htmlに記載されている。
アレル非相互作用情報はまた、臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、喫煙歴も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、日焼け、日光曝露、または他の変異原に対する曝露の経歴も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、任意でドライバー変異によって層別化される、関連性のある腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の局部的発現も含むことができる。関連性のある腫瘍タイプにおいて典型的に高レベルで発現している遺伝子は、提示される可能性がより高い。
アレル非相互作用情報はまた、すべての腫瘍における、または同じタイプの腫瘍における、または少なくとも１つの共有されたＭＨＣアレルを有する個体由来の腫瘍における、または少なくとも１つの共有されたＭＨＣアレルを有する個体中の同じタイプの腫瘍における、変異の頻度も含むことができる。
変異した腫瘍特異的ペプチドの例において、提示の確率を予測するために使用される特性の一覧はまた、変異のアノテーション（例えば、ミスセンス、リードスルー、フレームシフト、融合など）、または、変異がナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を結果としてもたらすと予測されるかどうかも含み得る。例えば、ホモ接合性早期終止変異のために腫瘍細胞において翻訳されないタンパク質セグメント由来のペプチドは、ゼロの提示確率を割り当てることができる。ＮＭＤは、提示の確率を減少させる、ｍＲＮＡ翻訳の減少を結果としてもたらす。
ＩＸ．Ｃ．提示特定システム
図３は、１つの実施形態による、提示特定システム１６０のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム１６０は、データ管理モジュール３１２、コード化モジュール３１４、訓練モジュール３１６、及び予測モジュール３２０を含む。提示特定システム１６０はまた、訓練データ記憶装置１７０及び提示モデル記憶装置１７５から構成される。モデル管理システム１６０のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
ＩＸ．Ｃ．１．データ管理モジュール
データ管理モジュール３１２は、提示情報１６５から訓練データ１７０のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例ｉは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列ｐｉと、ペプチド配列ｐｉと結合した１つ以上の関連するＭＨＣアレルａｉと、提示特定システム１６０が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数ｙｉとを含む、独立変数ｚｉのセットを含有する。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、従属変数ｙｉは、ペプチドｐｉが、１つ以上の関連するＭＨＣアレルａｉによって提示されたかどうかを示す、バイナリーラベルである。しかし、他の実現形態において、従属変数ｙｉは、提示特定システム１６０が、独立変数ｚｉに依存して予測することに関心があるという任意の他の種類の情報を表し得ることが、認識される。例えば、別の実現形態において、従属変数ｙｉはまた、データ例について特定された質量分析イオン電流を示す数値であってもよい。
データ例ｉについてのペプチド配列ｐｉは、ｋｉ個のアミノ酸の配列であり、ｋｉは、データ例ｉの間で、ある範囲内で変動し得る。例えば、その範囲は、ＭＨＣクラスＩについては８～１５、またはＭＨＣクラスＩＩについては６～３０であり得る。システム１６０の１つの具体的な実現形態において、訓練データセット中のすべてのペプチド配列ｐｉは、同じ長さ、例えば９を有し得る。ペプチド配列中のアミノ酸の数は、ＭＨＣアレルのタイプ（例えば、ヒトにおけるＭＨＣアレルなど）に応じて変動し得る。データ例ｉについてのＭＨＣアレルａｉは、どのＭＨＣアレルが対応するペプチド配列ｐｉと結合して存在したかを示す。
データ管理モジュール３１２はまた、訓練データ１７０に含有されるペプチド配列ｐｉ及び結合したＭＨＣアレルａｉと共に、結合親和性ｂｉ及び安定性ｓｉの予測値などの追加的なアレル相互作用変数も含み得る。例えば、訓練データ１７０は、ペプチドｐｉと、ａｉにおいて示される結合したＭＨＣ分子の各々との間の結合親和性予測値ｂｉを含有し得る。別の例として、訓練データ１７０は、ａｉにおいて示されるＭＨＣアレルの各々についての安定性予測値ｓｉを含有し得る。
データ管理モジュール３１２はまた、ペプチド配列ｐｉと共に、Ｃ末端隣接配列及びｍＲＮＡ定量測定値などのアレル非相互作用変数ｗｉも含み得る。
データ管理モジュール３１２はまた、ＭＨＣアレルによって提示されないペプチド配列も特定して、訓練データ１７０を生成する。概して、これは、提示の前に、提示されるペプチド配列を含む由来源タンパク質の「より長い」配列を特定することを含む。提示情報が、操作された細胞株を含有する場合、データ管理モジュール３１２は、細胞のＭＨＣアレル上に提示されなかった、細胞がそれに対して曝露された合成タンパク質における一連のペプチド配列を特定する。提示情報が、組織試料を含有する場合、データ管理モジュール３１２は、提示されたペプチド配列の起源である由来源タンパク質を特定して、組織試料細胞のＭＨＣアレル上に提示されなかった、由来源タンパク質における一連のペプチド配列を特定する。
データ管理モジュール３１２はまた、ランダム配列のアミノ酸を有するペプチドを人工的に生成し、生成された配列を、ＭＨＣアレル上に提示されないペプチドとして特定する。これは、ペプチド配列をランダムに生成することによって達成することができ、ＭＨＣアレル上に提示されないペプチドについての多量の合成データをデータ管理モジュール３１２が容易に生成することを可能にする。実際には、小さなパーセンテージのペプチド配列がＭＨＣアレルによって提示されるため、合成で生成されたペプチド配列は、たとえそれらが細胞によってプロセシングされたタンパク質に含まれたとしても、ＭＨＣアレルによって提示されていない可能性が非常に高い。
図４Ａは、１つの実施形態による、訓練データ１７０Ａの例示的なセットを説明する。具体的には、訓練データ１７０Ａ中の最初の３つのデータ例は、アレルＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３を含む単一アレル細胞株、ならびに３種類のペプチド配列
Figure 2023123766000014
からのペプチド提示情報を示す。訓練データ１７０Ａ中の４番目のデータ例は、アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を含む複数アレル細胞株、及びペプチド配列ＱＩＥＪＯＥＩＪＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）からのペプチド情報を示す。最初のデータ例は、ペプチド配列ＱＣＥＩＯＷＡＲＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）が、アレルＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３によって提示されなかったことを示す。前の２つの段落において議論したように、ペプチド配列は、データ管理モジュール３１２によってランダムに生成されてもよく、または提示されるペプチドの由来源タンパク質から特定されてもよい。訓練データ１７０Ａはまた、ペプチド配列－アレルペアについて、１０００ｎＭの結合親和性予測値及び１時間の半減期の安定性予測値も含む。訓練データ１７０Ａはまた、ペプチド
Figure 2023123766000015
のＣ末端フランキング配列、及び１０２ＴＰＭのｍＲＮＡ定量測定値などの、アレル非相互作用変数も含む。４番目のデータ例は、ペプチド配列ＱＩＥＪＯＥＩＪＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）が、アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３、またはＨＬＡ－Ａ＊０１：０１のうちの１つによって提示されたことを示す。訓練データ１７０Ａはまた、アレルの各々についての結合親和性予測値及び安定性予測値、ならびに、ペプチドのＣ末端フランキング配列及びペプチドについてのｍＲＮＡ定量測定値も含む。
図４Ｂは、一実施形態による、訓練データ１７０Ａの別の例示的なセットを説明する。具体的には、訓練データ１７０Ａ中の１番目のデータ例は、クラスＩＩアレルＨＬＡ－ＤＲＢ３：０１：０１及びペプチド配列
Figure 2023123766000016
を含む、単一アレル細胞株からのペプチド提示情報を示す。１番目のデータ例は、ペプチド配列
Figure 2023123766000017
がアレルＨＬＡ－ＤＲＢ３：０１：０１によって提示されなかったことを示す。
ＩＸ．Ｃ．２．コード化モジュール
コード化モジュール３１４は、訓練データ１７０に含有される情報を、１つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール３１４は、配列（例えば、ペプチド配列またはＣ末端隣接配列）を、あらかじめ決定された２０文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ｋｉ個のアミノ酸を有するペプチド配列ｐｉは、２０・ｋｉ要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のｊ番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するｐｉ ２０・（ｊ－１）＋１，ｐｉ ２０・（ｊ－１）＋２，．．．，ｐｉ ２０・ｊの中の単一要素は、１の値を有する。その以外の、残りの要素は、０の値を有する。例として、所定のアルファベット｛Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ｝について、データ例ｉの３個のアミノ酸のペプチド配列ＥＡＦは、６０個の要素の行ベクトル
Figure 2023123766000018
によって表され得る。Ｃ末端隣接配列ｃｉ、ならびに、ＭＨＣアレルについてのタンパク質配列ｄｈ、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
訓練データ１７０が、異なる長さのアミノ酸の配列を含有する場合、コード化モジュール３１４は、さらに、あらかじめ決定されたアルファベットを拡張するようにＰＡＤ文字を追加することによって、ペプチドを同等の長さのベクトルへとコード化し得る。例えば、これは、ペプチド配列の長さが、訓練データ１７０において最大の長さを有するペプチド配列に達するまで、ペプチド配列をＰＡＤ文字でレフトパディングすることによって行われ得る。したがって、最大の長さを有するペプチド配列がｋ最大個のアミノ酸を有する場合、コード化モジュール３１４は、各配列を、（２０＋１）・ｋ最大個の要素の行ベクトルとして数値的に表す。例として、拡張されたアルファベット｛ＰＡＤ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ｝及びｋ最大＝５の最大アミノ酸長について、３個のアミノ酸の同じ例示的なペプチド配列ＥＡＦは、１０５要素の行ベクトル
Figure 2023123766000019
によって表され得る。Ｃ末端隣接配列ｃｉまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列ｐｉまたはｃｉにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
配列データをコード化する上記の方法は、アミノ酸配列を有する配列に関して記載したが、方法を、同様に、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列データなどの、他のタイプの配列データに拡張することができる。
コード化モジュール３１４はまた、データ例ｉについての１つ以上のＭＨＣアレルａｉを、ｍ要素の行ベクトルへとコード化し、各要素ｈ＝１，２，．．．，ｍは、固有の特定されたＭＨＣアレルに対応する。データ例ｉについて特定されたＭＨＣアレルに対応する要素は、１の値を有する。その以外の、残りの要素は、０の値を有する。例として、ｍ＝４の固有の特定されたＭＨＣアレルタイプ｛ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１，ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０８，ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２，ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３｝の中の、複数アレル細胞株に対応するデータ例ｉについてのアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３は、４要素の行ベクトルａｉ＝［０ ０ １ １］によって表され得、ａ３ ｉ＝１及びａ４ ｉ＝１である。別の例として、データ例ｉについて特定された各ＭＨＣアレルに対応する要素は１の値を有する。それ以外の、残りの要素は０の値を有する。例として、ｍ＝４の固有の特定されたＭＨＣアレルタイプ｛ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１， ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０８， ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２， ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１ ｝の中の複数アレル細胞株に対応するデータ例ｉについてのアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１は、４要素の列ベクトルａｉ＝［０ ０ １ １］によって表され得、ａ３ ｉ＝１及びａ４ ｉ＝１である。４種類の特定されたＭＨＣアレルタイプでの例を、本明細書に記載するが、ＭＨＣアレルタイプの数は、実施において数百または数千であることができる。以前に議論したように、各データ例ｉは、典型的に、ペプチド配列ｐｉに関連した最大で６種類の異なるＭＨＣクラスＩアレルタイプ、及び／またはペプチド配列ｐｉに関連した最大で４種類の異なるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアレルタイプ、及び／またはペプチド配列ｐｉに関連した最大で１２種類の異なるＭＨＣクラスＩＩアレルタイプを含有する。
コード化モジュール３１４はまた、各データ例ｉについてのラベルｙｉを、｛０，１｝のセットからの値を有するバイナリー変数としてコード化し、１の値は、ペプチドｘｉが、関連するＭＨＣアレルａｉのうちの１つによって提示されたことを示し、０の値は、ペプチドｘｉが、関連するＭＨＣアレルａｉのいずれによっても提示されなかったことを示す。従属変数ｙｉが、質量分析イオン電流を表す場合、コード化モジュール３１４は、［０，∞］の間のイオン電流値について［－∞，∞］の範囲を有するｌｏｇ関数などの種々の関数を用いて、値を追加的にスケール調整し得る。
コード化モジュール３１４は、ペプチドｐｉ及び関連するＭＨＣアレルｈについてのアレル相互作用変数ｘｈ ｉのペアを、アレル相互作用変数の数値的表示が次々に連結されている行ベクトルとして表し得る。例えば、コード化モジュール３１４は、ｘｈ ｉを、
Figure 2023123766000020
と同等の行ベクトルとして表し得、ｂｈ ｉは、ペプチドｐｉ及び関連するＭＨＣアレルｈについての結合親和性予測値であり、同様に、ｓｈ ｉは、安定性についてのものである。あるいは、アレル相互作用変数の１つ以上の組み合わせは、個々に（例えば、個々のベクトルまたは行列として）保存されてもよい。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、結合親和性について測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、結合親和性情報を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、結合安定性について測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、結合安定性情報を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、結合オンレートについて測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、結合オンレート情報を表す。
１つの例において、クラスＩ ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール３１４は、ペプチド長を、ベクトル
Figure 2023123766000021
（ただし、
Figure 2023123766000022
はインジケータ関数であり、Ｌｋはペプチドｐｋの長さを意味する）として表す。ベクトルＴｋは、アレル相互作用変数ｘｈ ｉに含まれうる。別の例では、クラスＩＩＭＨＣ分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール３１４は、ペプチド長をベクトル
Figure 2023123766000023
（ただし、
Figure 2023123766000024
は、インジケータ関数であり、Ｌｋは、ペプチドpkの長さを示す）として表す。ベクトルＴｋを、アレル相互作用変数ｘｈ ｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＭＨＣアレルのＲＮＡ－ｓｅｑベースの発現レベルをアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、ＭＨＣアレルのＲＮＡ発現情報を表す。
同様に、コード化モジュール３１４は、アレル非相互作用変数ｗｉを、アレル非相互作用変数の数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとして表し得る。例えば、ｗｉは、［ｃｉ］または［ｃｉｍｉｗｉ］と同等の行ベクトルであってもよく、ｗｉは、ペプチドｐｉのＣ末端隣接配列及びペプチドに関連するｍＲＮＡ定量測定値ｍｉに加えて任意の他のアレル非相互作用変数を表す、行ベクトルである。あるいは、アレル非相互作用変数の１つ以上の組み合わせは、個々に（例えば、個々のベクトルまたは行列として）保存されてもよい。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、代謝回転速度または半減期をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって、ペプチド配列についての由来源タンパク質の代謝回転速度を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、タンパク質長をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって、由来源タンパク質またはアイソフォームの長さを表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、β１ｉ、β２ｉ、β５ｉサブユニットを含むイムノプロテアソーム特異的プロテアソームサブユニットの平均発現を、アレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって、イムノプロテアソームの活性化を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、（ＲＳＥＭなどの技法によってＦＰＫＭ、ＴＰＭの単位で定量された）ペプチド、またはペプチドの遺伝子もしくは転写産物の由来源タンパク質のＲＮＡ－ｓｅｑ存在量を、由来源タンパク質の存在量をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、例えば、Ｒｉｖａｓ ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５におけるモデルによって推定されるような、ペプチドの起源の転写産物がナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を受けるであろう確率を、この確率をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＲＮＡ－ｓｅｑを介して評価された遺伝子モジュールまたは経路の活性化状況を、例えば、経路における遺伝子の各々について、例えばＲＳＥＭを用いてＴＰＭの単位で、経路における遺伝子の発現を定量すること、次いで、経路における遺伝子にわたる要約統計量、例えば平均値をコンピュータ計算することによって表す。平均を、アレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、由来源遺伝子のコピー数を、コピー数をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、（例えば、ナノモル単位での）測定されたかまたは予測されたＴＡＰ結合親和性をアレル非相互作用変数ｗｉに含むことによって、ＴＡＰ結合親和性を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＲＮＡ－ｓｅｑによって測定され（かつ、例えばＲＳＥＭによってＴＰＭの単位で定量された）ＴＡＰ発現レベルをアレル非相互作用変数ｗｉに含むことによって、ＴＡＰ発現レベルを表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、腫瘍変異を、アレル非相互作用変数ｗｉにおける指標変数のベクトル（すなわち、ペプチドｐｋがＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異を有する試料に由来するならばｄｋ＝１、それ以外は０）として表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、抗原提示遺伝子における生殖細胞系列多型を、指標変数のベクトル（すなわち、ペプチドｐｋがＴＡＰにおいて特異的な生殖細胞系列多型を有する試料に由来するならばｄｋ＝１）として表す。これらの指標変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、腫瘍タイプを、腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、大腸癌など）のアルファベットについての長さ１のワン・ホットコード化ベクトルとして表す。これらのワン・ホットコード化変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＭＨＣアレル接尾辞を、４桁のＨＬＡアレルを様々な接尾辞で処理することによって表す。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０９Ｎは、モデルの目的で、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０９とは異なるアレルと考えられる。あるいは、Ｎ接尾辞で終わるＨＬＡアレルは発現しないため、Ｎ接尾辞のＭＨＣアレルによる提示の確率は、すべてのペプチドについてゼロに設定することができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、腫瘍サブタイプを、腫瘍サブタイプ（例えば、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌など）のアルファベットについての長さ１のワン・ホットコード化ベクトルとして表す。これらのワン・ホットコード化変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、喫煙歴を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる、バイナリー指標変数（患者が喫煙歴を有するならばｄｋ＝１、それ以外は０）として表す。あるいは、喫煙歴を、喫煙の重症度のアルファベットについての長さ１のワン・ホットコード化変数としてコード化することができる。例えば、喫煙状況を、１が非喫煙者を示し、５が現在の大量喫煙者を示す、１～５のスケールに査定することができる。喫煙歴は、主として肺腫瘍と関連性があるため、複数の腫瘍タイプに対するモデルを訓練する場合、この変数は、患者が喫煙の経歴を有し、かつ腫瘍タイプが肺腫瘍であるならば１と同等であり、それ以外はゼロであると定義することもできる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、日焼け歴を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる、バイナリー指標変数（患者が重症の日焼けの経歴を有するならばｄｋ＝１、それ以外は０）として表す。重症の日焼けは、主として黒色腫と関連性があるため、複数の腫瘍タイプに対するモデルを訓練する場合、この変数は、患者が重症の日焼けの経歴を有し、かつ腫瘍タイプが黒色腫であるならば１と同等であり、それ以外はゼロであると定義することもできる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ヒトゲノムにおける各遺伝子または転写産物についての特定の遺伝子または転写産物の発現レベルの分布を、ＴＣＧＡなどの参照データベースを用いることによって、発現レベルの分布の要約統計量（例えば、平均値、中央値）として表す。具体的には、腫瘍タイプ黒色腫を有する試料におけるペプチドｐｋについて、ペプチドｐｋの起源の遺伝子または転写産物の、測定された遺伝子または転写産物の発現レベルをアレル非相互作用変数ｗｉに含めることができるだけでなく、ＴＣＧＡによって測定された際の、黒色腫におけるペプチドｐｋの起源の遺伝子または転写産物の、平均値及び／または中央値の遺伝子または転写産物発現も含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、変異タイプを、変異タイプ（例えば、ミスセンス、フレームシフト、ＮＭＤ誘導性など）のアルファベットについての長さ１のワン・ホットコード化変数として表す。これらのワン・ホットコード化変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、タンパク質のタンパク質レベルの特性を、由来源タンパク質のアノテーション（例えば、５’ＵＴＲ長）の値として、アレル非相互作用変数ｗｉにおいて表す。別の例において、コード化モジュール３１４は、ペプチドｐｉについての由来源タンパク質の残基レベルのアノテーションを、ペプチドｐｉがヘリックスモチーフとオーバーラップするならば１と同等であり、それ以外は０であるか、または、ペプチドｐｉがヘリックスモチーフ内に完全に含有されるならば１と同等である指標変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含むことによって表す。別の例において、ヘリックスモチーフアノテーション内に含有されるペプチドｐｉにおける残基の割合を表す特性を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ヒトプロテオームにおけるタンパク質またはアイソフォームのタイプを、ヒトプロテオームにおけるタンパク質またはアイソフォームの数と同等の長さを有する指標ベクトルｏｋとして表し、対応する要素ｏｋ ｉは、ペプチドｐｋがタンパク質ｉに由来するならば１であり、それ以外は０である。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ペプチドｐｉのソース遺伝子Ｇ＝ｇｅｎｅ（ｐｉ）をＬ個の可能なカテゴリーを有するカテゴリー変数として表す（ただし、Ｌは添え字を付したソース遺伝子の数の上限１、２、．．．、Ｌを示す）。
コード化モジュール３１４はまた、ペプチドｐｉ及び関連するＭＨＣアレルｈについての変数ｚｉの全体的なセットを、アレル相互作用変数ｘｉ及びアレル非相互作用変数ｗｉの数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとしても表し得る。例えば、コード化モジュール３１４は、ｚｈ ｉを、［ｘｈ ｉｗｉ］または［ｗｉｘｈ ｉ］と同等の行ベクトルとして表し得る。
Ｘ．訓練モジュール
訓練モジュール３１６は、ペプチド配列に関連するＭＨＣアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、１つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列ｐｋ及びペプチド配列ｐｋに関連するＭＨＣアレルａｋのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列ｐｋが、関連するＭＨＣアレルａｋのうちの１つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ｕｋを生成する。
Ｘ．Ａ．概要
訓練モジュール３１６は、１６５に保存された提示情報から生成された、記憶装置１７０に保存された訓練データセットに基づいて、１つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ１７０における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
Figure 2023123766000025
は、訓練データ１７０における１つ以上のデータ例Ｓについての従属変数ｙｉ∈Ｓの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Ｓについての推定された尤度ｕｉ∈Ｓとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、損失関数
Figure 2023123766000026
は、以下のような等式（１ａ）によって与えられる負のｌｏｇ尤度関数である。
Figure 2023123766000027
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式１ｂによって与えられる平均二乗損失である。
Figure 2023123766000028
提示モデルは、１つ以上のパラメータθが、独立変数と従属変数との間の依存性を数学的に明記する、パラメトリックモデルであり得る。典型的に、損失関数
Figure 2023123766000029
を最小化するパラメトリックタイプの提示モデルの種々のパラメータは、例えば、バッチ勾配アルゴリズム、確率的勾配アルゴリズムなどの、勾配ベースの数値的最適化アルゴリズムを通して決定される。あるいは、提示モデルは、モデル構造が、訓練データ１７０から決定され、固定されたパラメータのセットに厳密には基づかない、ノンパラメトリックモデルであり得る。
Ｘ．Ｂ．アレルごとモデル
訓練モジュール３１６は、アレルごとベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール３１６は、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０におけるデータ例Ｓに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、
Figure 2023123766000030
によって、特定のアレルｈについてのペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋをモデル化し、ただし、ペプチド配列ｘｈ ｋは、ペプチドｐｋ及び対応するＭＨＣアレルｈについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、ｆ（・）は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、ｇｈ（・）は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、ＭＨＣアレルｈについて決定されたパラメータθｈのセットに基づいて、アレル相互作用変数ｘｈ ｋについての依存性スコアを生成する。各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセットの値は、θｈに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでｉは、単一のＭＨＣアレルｈを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。
依存性関数ｇｈ（ｘｈ ｋ；θｈ）の出力は、ＭＨＣアレルｈが、少なくともアレル相互作用特性ｘｈ ｋに基づいて、及び特に、ペプチドｐｋのペプチド配列のアミノ酸の位置に基づいて、対応する新生抗原を提示するかどうかを示す、ＭＨＣアレルｈについての依存性スコアを表す。例えば、ＭＨＣアレルｈについての依存性スコアは、ＭＨＣアレルｈが、ペプチドｐｋを提示する可能性が高い場合に、高い値を有し得、提示の可能性が高くない場合に、低い値を有し得る。変換関数ｆ（・）は、入力を変換し、より具体的には、この例においてｇｈ（ｘｈ ｋ；θｈ）によって生成された依存性スコアを、ペプチドｐｋがＭＨＣアレルによって提示されるであろう尤度を示す適切な値に変換する。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、ｆ（・）は、適切なドメイン範囲について［０，１］内の範囲を有する関数である。１つの例において、ｆ（・）は、
Figure 2023123766000031
によって与えられるｅｘｐｉｔ関数である。
別の例として、ｆ（・）はまた、ドメインｚの値が０以上である場合、
Figure 2023123766000032
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲［０，１］の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、ｆ（・）は、例えば、恒等関数、指数関数、ｌｏｇ関数などの任意の関数であることができる。
したがって、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルｈによって提示されるであろうアレルごと尤度は、ＭＨＣアレルｈについての依存性関数ｇｈ（・）をペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。依存性スコアは、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルｈによって提示されるであろうアレルごと尤度を生成するように、変換関数ｆ（・）によって変換されてもよい。
Ｘ．Ｂ．１ アレル相互作用変数についての依存性関数 本明細書を通して言及される１つの特定の実現形態において、依存性関数ｇｈ（・）は、ｘｈ ｋにおける各アレル相互作用変数を、関連するＭＨＣアレルｈについて決定されたパラメータθｈのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
Figure 2023123766000033
によって与えられるアフィン関数である。
本明細書を通して言及される別の特定の実現形態において、依存性関数ｇｈ（・）は、１つ以上の層において配置された一連のノードを有するネットワークモデルＮＮｈ（・）によって表される、
Figure 2023123766000034
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθｈのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。１つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
概して、ネットワークモデルＮＮｈ（・）は、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、深層ニューラルネットワーク（ＤＮＮ）などのフィードフォワードネットワーク、及び／または、長・短期記憶ネットワーク（ＬＳＴＭ）、双方向再帰型ネットワーク、深層双方向再帰型ネットワークなどの再帰型ネットワークなどとして、構造化され得る。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの例において、ｈ＝１，２，．．．，ｍにおける各ＭＨＣアレルは、別々のネットワークモデルに関連し、ＮＮｈ（・）は、ＭＨＣアレルｈに関連するネットワークモデルからの出力を意味する。
図５は、任意のＭＨＣアレルｈ＝３に関連した例示的なネットワークモデルＮＮ３（・）を説明する。図５に示すように、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのネットワークモデルＮＮ３（・）は、層ｌ＝１での３種類の入力ノード、層ｌ＝２での４種類のノード、層ｌ＝３での２種類のノード、及び層ｌ＝４での１種類の出力ノードを含む。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、１０種類のパラメータθ３（１），θ３（２），．．．，θ３（１０）のセットに関連している。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についての３種類のアレル相互作用変数ｘ３ ｋ（１）、ｘ３ ｋ（２）、及びｘ３ ｋ（３）についての入力値（コード化されたポリペプチド配列データ及び使用される任意の他の訓練データを含む、個々のデータ例）を受け取り、値ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を出力する。ネットワーク関数は、異なるアレル相互作用変数をそれぞれが入力として取る１つ以上のネットワークモデルを含んでもよい。
別の例において、特定されたＭＨＣアレルｈ＝１，２，．．．，ｍは、単一ネットワークモデルＮＮＨ（・）に関連しており、ＮＮｈ（・）は、ＭＨＣアレルｈに関連する単一ネットワークモデルの１つ以上の出力を意味する。そのような例において、パラメータθｈのセットは、単一ネットワークモデルについてのパラメータのセットに対応し得、したがって、パラメータθｈのセットは、すべてのＭＨＣアレルによって共有され得る。
図６Ａは、ＭＨＣアレルｈ＝１，２，．．．，ｍによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・）を説明する。図６Ａに示すように、ネットワークモデルＮＮＨ（・）は、ＭＨＣアレルに各々対応する、ｍ個の出力ノードを含む。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、ＭＨＣアレルｈ＝３に対応する値ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を含む、ｍ個の値を出力する。
さらに別の例において、単一ネットワークモデルＮＮＨ（・）は、ＭＨＣアレルｈのアレル相互作用変数ｘｈ ｋ及びコード化されたタンパク質配列ｄｈを与えられて依存性スコアを出力する、ネットワークモデルであり得る。そのような例において、パラメータθｈのセットは、再び、単一ネットワークモデルについてのパラメータのセットに対応し得、したがって、パラメータθｈのセットは、すべてのＭＨＣアレルによって共有され得る。したがって、そのような例において、ＮＮｈ（・）は、単一ネットワークモデルに対して入力［ｘｈ ｋｄｈ］を与えられた、単一ネットワークモデルＮＮＨ（・）の出力を意味する。そのようなネットワークモデルは、訓練データにおいて未知であったＭＨＣアレルについてのペプチド提示確率を、単にそれらのタンパク質配列を特定することによって正しく予測することができるため、有利である。
図６Ｂは、ＭＨＣアレルによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・）を説明する。図６Ｂに示すように、ネットワークモデルＮＮＨ（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３のアレル相互作用変数及びタンパク質配列を入力として受け取り、ＭＨＣアレルｈ＝３に対応する依存性スコアＮＮ３（ｘ３ ｋ）を出力する。
さらに別の例において、依存性関数ｇｈ（・）は、
Figure 2023123766000035
として表すことができ、式中、ｇ’ｈ（ｘｈ ｋ；θ’ｈ）は、パラメータθ’ｈのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、ＭＨＣアレルｈについての提示のベースライン確率を表す、ＭＨＣアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθｈ ０を伴う。
別の実現形態において、バイアスパラメータθｈ ０は、ＭＨＣアレルｈの遺伝子ファミリーにしたがって共有されてもよい。すなわち、ＭＨＣアレルｈについてのバイアスパラメータθｈ ０はθ遺伝子（ｈ） ０と同等であり得、遺伝子（ｈ）は、ＭＨＣアレルｈの遺伝子ファミリーである。例えば、クラスＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０３は、「ＨＬＡ－Ａ」の遺伝子ファミリーに割り当てられてもよく、これらのＭＨＣアレルの各々についてのバイアスパラメータθｈ ０が共有されてもよい。別の例として、クラスＩＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１：１０：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１、及びＨＬＡ－ＤＲＢ３：０１：０１を「ＨＬＡ－ＤＲＢ」の遺伝子ファミリーに割り当て、これらのＭＨＣアレルのそれぞれのバイアスパラメータθｈ ０を共有することができる。
例として、等式（２）に戻ると、アフィン依存性関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000036
によって生成することができ、式中、ｘ３ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ３は、損失関数最小化を通してＭＨＣアレルｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、別々のネットワーク変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000037
によって生成することができ、式中、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝３に関連するネットワークモデルＮＮ３（・）について決定されたパラメータのセットである。
図７は、例示的なネットワークモデルＮＮ３（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図７に示すように、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。出力は、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
Ｘ．Ｂ．２．アレル非相互作用変数を伴うアレルごと
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
Figure 2023123766000038
によって、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋをモデル化し、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、ｇｗ（・）は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθｗのセットに基づく、アレル非相互作用変数ｗｋについての関数である。具体的には、各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθｗのセットの値を、θｈ及びθｗに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。
依存性関数ｇｗ（ｗｋ；θｗ）の出力は、アレル非相互作用変数の影響に基づいて、１つ以上のＭＨＣアレルによってペプチドｐｋが提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを表す。例えば、アレル非相互作用変数についての依存性スコアは、ペプチドｐｋの提示に正の影響を及ぼすことが公知であるＣ末端隣接配列とペプチドｐｋが結合している場合は、高い値を有し得、ペプチドｐｋの提示に負の影響を及ぼすことが公知であるＣ末端隣接配列とペプチドｐｋが結合している場合は、低い値を有し得る。
等式（８）によると、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルｈによって提示されるであろうアレルごと尤度は、ＭＨＣアレルｈについての関数ｇｈ（・）を、ペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数ｇｗ（・）もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。両方のスコアが組み合わされ、組み合わされたスコアが、ＭＨＣアレルｈによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろうアレルごと尤度を生成するように、変換関数ｆ（・）によって変換される。
あるいは、訓練モジュール３１６は、等式（２）においてアレル非相互作用変数ｗｋをアレル相互作用変数ｘｈ ｋに付加することにより、予測におけるアレル非相互作用変数ｗｋを含んでもよい。したがって、提示尤度は、
Figure 2023123766000039
によって与えられ得る。
Ｘ．Ｂ．３ アレル非相互作用変数についての依存性関数
アレル相互作用変数についての依存性関数ｇｈ（・）と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数ｇｗ（・）は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数ｗｋに関連しているネットワーク関数であり得る。
具体的には、依存性関数ｇｗ（・）は、ｗｋにおけるアレル非相互作用変数を、パラメータθｗのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
Figure 2023123766000040
によって与えられるアフィン関数である。
依存性関数ｇｗ（・）はまた、パラメータθｗのセットにおける関連するパラメータを有するネットワークモデルＮＮｗ（・）によって表される、
Figure 2023123766000041
によって与えられるネットワーク関数であってもよい。このネットワーク関数は、異なるアレル完全非相互作用変数を入力としてそれぞれ取る１つ以上のネットワークモデルも含み得る。
別の例において、アレル非相互作用変数についての依存性関数ｇｗ（・）は、
Figure 2023123766000042
によって与えられ得、式中、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、ｍｋは、ペプチドｐｋについてのｍＲＮＡ定量測定値であり、ｈ（・）は、定量測定値を変換する関数であり、かつθｗ ｍは、ｍＲＮＡ定量測定値についての依存性スコアを生成するようにｍＲＮＡ定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実施形態において、ｈ（・）はｌｏｇ関数であるが、実際には、ｈ（・）は、様々な異なる関数のうちのいずれか１つであり得る。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数についての依存性関数ｇｗ（・）は、
Figure 2023123766000043
によって与えられ、式中、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、ｏｋは、ペプチドｐｋについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す上記の指標ベクトルであり、かつθｗ ｏは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。１つのバリエーションにおいて、ｏｋ及びパラメータθｗ ｏのセットの次元が有意に高い場合、
Figure 2023123766000044
（
Figure 2023123766000045
は、Ｌ１ノルム、Ｌ２ノルム、組み合わせなどを表す）などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数に対する依存性関数ｇｗ（・）は下式により与えられる。すなわち、
Figure 2023123766000046
ただし、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
Figure 2023123766000047
は、ペプチドｐｋがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子ｌに由来するものである場合に１に等しいインジケータ関数であり、θｗ ｌはソース遺伝子ｌの「抗原性」を示すパラメータである。１つのバリエーションにおいて、Ｌが充分に大きく、したがって、パラメータの数θｗ ｌ＝１， ２，．．．，Ｌが充分に大きい場合、
Figure 2023123766000048
のようなパラメータ正則化項（ただし、
Figure 2023123766000049
は、Ｌ１ノルム、Ｌ２ノルム、組み合わせなど）をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。
実際には、式（１０）、（１１）、及び（１２）のいずれかの追加項を組み合わせることによってアレル非相互作用変数に関する依存性関数ｇｗ（・）を生成することができる。例えば、式（１０）のｍＲＮＡ定量測定値を示す項ｈ（・）と式（１２）のソース遺伝子の抗原性を示す項とを他の任意のアフィン関数またはネットワーク関数とともに互いに加え合わせることにより、アレル非相互作用変数に関する依存性関数を生成することができる。
例として、等式（８）に戻ると、アフィン変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000050
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000051
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図８は、例示的なネットワークモデルＮＮ３（・）及びＮＮｗ（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図８に示すように、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮｗ（・）は、ペプチドｐｋについてのアレル非相互作用変数ｗｋを受け取り、出力ＮＮｗ（ｗｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
Ｘ．Ｃ．複数アレルモデル
訓練モジュール３１６はまた、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール３１６は、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞、複数のＭＨＣアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ１７０におけるデータ例Ｓに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
Ｘ．Ｃ．１．実施例１：アレルごとモデルの最大値
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、複数のＭＨＣアレルＨのセットに関連したペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋを、等式（２）～（１１）と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットＨにおけるＭＨＣアレルｈの各々について決定された提示尤度ｕｋ ｈ∈Ｈの関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ｕｋは、ｕｋ ｈ∈Ｈの任意の関数であることができる。一実現形態では、等式（１２）に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ｕｋは、セットＨにおける各ＭＨＣアレルｈについての提示尤度の最大値として決定することができる。
Figure 2023123766000052
Ｘ．Ｃ．２．実施例２．１：和の関数モデル
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋを、
Figure 2023123766000053
によってモデル化し、式中、要素ａｈ ｋは、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルＨについて１であり、ｘｈ ｋは、ペプチドｐｋ及び対応するＭＨＣアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセットの値は、θｈに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。依存性関数ｇｈは、セクションＸ．Ｂ．１．において上記で導入された依存性関数ｇｈのいずれかの形態であり得る。
等式（１３）によると、ペプチド配列ｐｋが１つ以上のＭＨＣアレルｈによって提示されるであろう提示尤度は、依存性関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数についての対応するスコアを生成することによって、生成することができる。各ＭＨＣアレルｈについてのスコアが組み合わされて、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルＨのセットによって提示されるであろう提示尤度を生成するように変換関数ｆ（・）によって変換される。
等式（１３）の提示モデルは、各ペプチドｐｋについての関連するアレルの数が１よりも大きいことができる点で、等式（２）のアレルごとモデルとは異なる。換言すると、ａｈ ｋにおける１つよりも多い要素が、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルＨについて１の値を有することができる。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000054
によって生成することができ、式中、ｘ２ ｋ、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000055
によって生成することができ、式中、ＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたネットワークモデルであり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
図９は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）及びＮＮ３（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図９に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成し、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
Ｘ．Ｃ．３．実施例２．２：アレル非相互作用変数を伴う和の関数モデル
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
Figure 2023123766000056
によって、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋをモデル化し、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθｗのセットの値を、θｈ及びθｗに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。依存性関数ｇｗは、セクションＸ．Ｂ．３．において上記で導入された依存性関数ｇｗのいずれかの形態であり得る。
したがって、等式（１４）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、各ＭＨＣアレルｈのアレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数ｇｗ（・）もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。スコアが組み合わされ、組み合わされたスコアが、ＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度を生成するように、変換関数ｆ（・）によって変換される。
等式（１４）の提示モデルにおいて、各ペプチドｐｋについての関連するアレルの数は、１よりも大きいことができる。換言すると、ａｈ ｋにおける１つよりも多い要素が、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルＨについて１の値を有することができる。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000057
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000058
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図１０は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）、及びＮＮｗ（・）を用いたＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３と関連するペプチドｐｋの推定提示尤度の生成を示す。図１０に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮｗ（・）は、ペプチドｐｋについてのアレル非相互作用変数ｗｋを受け取り、出力ＮＮｗ（ｗｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
あるいは、訓練モジュール３１６は、等式（１５）においてアレル非相互作用変数ｗｋをアレル相互作用変数ｘｈ ｋに付加することにより、予測におけるアレル非相互作用変数ｗｋを含んでもよい。したがって、提示尤度は、
Figure 2023123766000059
によって与えられ得る。
Ｘ．Ｃ．４．実施例３．１：暗黙のアレルごと尤度を用いたモデル
別の実現形態において、訓練モジュール３１６は、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋを、
Figure 2023123766000060
によってモデル化し、式中、要素ａｈ ｋは、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルｈ∈Ｈについて１であり、ｕ’ｋ ｈは、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレルごと提示尤度であり、ベクトルｖは、要素ｖｈが、ａｈ ｋ・・・ｕ’ｋ ｈに対応するベクトルであり、ｓ（・）は、ｖの要素をマッピングする関数であり、かつｒ（・）は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、ｓ（・）は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、ｓ（・）は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。
等式（１７）の提示モデルにおける提示尤度は、各々が、個々のＭＨＣアレルｈによってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度に対応する、暗黙のアレルごと提示尤度ｕ’ｋ ｈの関数としてモデル化される。暗黙のアレルごと尤度は、暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータが、単一アレル設定に加えて、提示されるペプチドと対応するＭＨＣアレルとの間の直接の関連が未知である複数アレル設定から学習され得る点で、セクションＸ．Ｂのアレルごと提示尤度とは異なる。したがって、複数アレル設定において、提示モデルは、ペプチドｐｋが全体としてＭＨＣアレルＨのセットによって提示されるかどうかを推定できるだけではなく、どのＭＨＣアレルｈがペプチドｐｋを提示した可能性が最も高いかを示す個々の尤度ｕ’ｋ ｈ∈Ｈも提供することもできる。これの利点は、提示モデルが、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞についての訓練データを伴わずに暗黙の尤度を生成できることである。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、ｒ（・）は、範囲［０，１］を有する関数である。例えば、ｒ（・）は、クリップ関数：
r(z)＝min(max(z,0)，1)
であってもよく、ｚと１の間の最小値が、提示尤度ｕｋとして選ばれる。別の実現形態において、ｒ（・）は、
r(z)＝tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインｚの値は、０以上である。
Ｘ．Ｃ．５．実施例３．２：関数の和モデル
１つの特定の実現形態において、ｓ（・）は、総和関数であり、提示尤度は、暗黙のアレルごと提示尤度を総和することによって与えられる。
Figure 2023123766000061
１つの実現形態では、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレルごと提示尤度を、
Figure 2023123766000062
によって生成して、提示尤度が、
Figure 2023123766000063
によって推定されるようにする。
等式（１９）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数についての対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。各依存性スコアは、最初に、暗黙のアレルごと提示尤度ｕ’ｋ ｈを生成するように、関数ｆ（・）によって変換される。アレルごと尤度ｕ’ｋ ｈが組み合わされ、組み合わされた尤度にクリッピング関数が、値を範囲［０，１］中にクリップするために適用されて、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルＨのセットによって提示されるであろう提示尤度が生成され得る。依存性関数ｇｈは、セクションＸ．Ｂ．１．において上記で導入された依存性関数ｇｈのいずれかの形態であり得る。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000064
によって生成することができ、式中、ｘ２ ｋ、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000065
によって生成することができ、式中、ＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたネットワークモデルであり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
図１１は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）及びＮＮ３（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図９に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成し、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。各出力は、関数ｆ（・）によってマッピングされ、組み合わされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
別の実現形態において、予測が、質量分析イオン電流のｌｏｇについてなされる場合、ｒ（・）はｌｏｇ関数であり、ｆ（・）は指数関数である。
Ｘ．Ｃ．６．実施例３．３：アレル非相互作用変数を伴う関数の和モデル
１つの実現形態では、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレルごと提示尤度を、
Figure 2023123766000066
によって生成して、提示尤度が、
Figure 2023123766000067
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
等式（２１）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、各ＭＨＣアレルｈのアレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数ｇｗ（・）もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。アレル非相互作用変数のスコアが、アレル相互作用変数の依存性スコアの各々に組み合わされる。組み合わされたスコアの各々が、暗黙のアレルごと提示尤度を生成するように、関数ｆ（・）によって変換される。暗黙の尤度が組み合わされ、組み合わされた出力にクリッピング関数が、値を範囲［０，１］中にクリップするために適用されて、ＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度が生成され得る。依存性関数ｇｗは、セクションＸ．Ｂ．３．において上記で導入された依存性関数ｇｗのいずれかの形態であり得る。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000068
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000069
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図１２は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）、及びＮＮｗ（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図１２に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮｗ（・）は、ペプチドｐｋについてのアレル非相互作用変数ｗｋを受け取り、出力ＮＮｗ（ｗｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされる。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成し、これも、同じネットワークモデルＮＮｗ（・）の出力ＮＮｗ（ｗｋ）と組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされる。両方の出力が組み合わされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
別の実現形態では、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレルごと提示尤度を、
Figure 2023123766000070
によって生成して、提示尤度が、
Figure 2023123766000071
によって生成されるようにする。
Ｘ．Ｃ．７．実施例４：二次モデル
一実現形態では、ｓ（・）は、二次関数であり、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋは、
Figure 2023123766000072
によって与えられ、式中、要素ｕ’ｋ ｈは、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレルごと提示尤度である。暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。暗黙のアレルごと提示尤度は、上記の等式（１８）、（２０）、及び（２２）において示すいずれかの形態であり得る。
一態様において、等式（２３）のモデルは、ペプチド配列ｐｋが、２つのＭＨＣアレルによって同時に提示されるであろう可能性が存在し、２つのＨＬＡアレルによる提示は統計学的に独立していることを含意し得る。
等式（２３）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、暗黙のアレルごと提示尤度を組み合わせること、及び、ＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度を生成するように、ＭＨＣアレルの各ペアがペプチドｐｋを同時に提示するであろう尤度を総和から差し引くことによって、生成することができる。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＨＬＡアレルの中でＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000073
によって生成することができ、式中、ｘ２ ｋ、ｘ３ ｋは、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ２、θ３は、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＨＬＡアレルの中でＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 2023123766000074
によって生成することができ、式中、ＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）は、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたネットワークモデルであり、θ２、θ３は、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
ＸＩ．Ａ 実施例５：予測モジュール
予測モジュール３２０は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール３２０は、配列データを、ＭＨＣ－Ｉについては８～１５個のアミノ酸またはＭＨＣ－ＩＩについては６～３０個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列ｐｋに処理する。例えば、予測モジュール３２０は、所定の配列「ＩＥＦＲＯＥＩＦＪＥＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）」を、９個のアミノ酸を有する３種類のペプチド配列「ＩＥＦＲＯＥＩＦＪ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）」、「ＥＦＲＯＥＩＦＪＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）」、及び「ＦＲＯＥＩＦＪＥＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）」に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール３２０は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
提示モジュール３２０は、提示モデルの１つ以上を処理されたペプチド配列に適用してペプチド配列の提示尤度を推定する。具体的には、予測モジュール３２０は、提示モデルを候補新生抗原に適用することによって、腫瘍ＨＬＡ分子上に提示される可能性が高い１つ以上の候補新生抗原ペプチド配列を選択することができる。一実現形態では、提示モジュール３２０は、あらかじめ決定された閾値を上回る推定提示尤度を有する候補新生抗原配列を選択する。別の実現形態では、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するＮ個の候補新生抗原配列を選択する（Ｎは、一般的に、ワクチン中で送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者について選択された候補新生抗原を含むワクチンを患者に注射して免疫応答を誘導することができる。
ＸＩ．Ｂ．実施例６：カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１ 概要
カセット設計モジュール３２４は、患者に注射するためのｖ種類の選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成する。具体的には、容量ｖのワクチンに含まれる選択されたペプチドのセットｐｋ，ｋ＝１，２，…，ｖについて、カセット配列は、それぞれが対応するペプチドｐｋの配列を含む一連の治療エピトープ配列ｐ’ｋ，ｋ＝１，２，…，ｖの連結鎖によって与えられる。一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、各エピトープを互いに対して直接隣接するように連結することができる。例えば、あるワクチンカセットＣは、
Figure 2023123766000075
で表すことができる（式中、ｐ’ｔｉは、カセットのｉ番目のエピトープを示す）。したがって、ｔｉは、カセットのｉ番目の位置の選択されたペプチドの添え字ｋ＝１，２，…，ｖに対応する。別の実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、隣接するエピトープ間に１つ以上の任意選択的なリンカー配列を有するように各エピトープを連結することができる。例えば、あるワクチンカセットＣは、
Figure 2023123766000076
で表すことができる（式中、ｌ（ｔｉ，ｔｊ）は、カセットのｉ番目のエピトープｐ’ｔｉとｊ＝ｉ＋１番目のエピトープｐ’ｊ＝ｉ＋１との間に配置されたリンカー配列を示す）。カセット設計モジュール３２４は、選択されたエピトープｐ’ｋ，ｋ＝１，２，…，ｖのどれがカセットの異なる位置に配置されるか、及び、各エピトープ間に配置されるすべてのリンカー配列を決定する。カセット配列Ｃは、本明細書に記載される方法のいずれかに基づいたワクチンとしてロードすることができる。
一実施形態では、治療エピトープのセットは、所定の閾値を上回る提示尤度（提示尤度は、提示モデルにより決定される）に関連付けられた予測モジュール３２０によって決定された選択されたペプチドに基づいて生成することができる。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープのセットは、多くの方法の任意の１つ以上（単独または組み合わせ）に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合親和性もしくは予測される結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合安定性もしくは予測される結合安定性、ランダムサンプリングなどに基づいて、生成することができる。
一実施形態では、治療エピトープｐ’ｋは、選択されたペプチドｐｋ自体に対応してもよい。別の実施形態では、治療エピトープｐ’ｋは、選択されたペプチド以外にＣ及び／またはＮ末端フランキング配列を有してもよい。例えば、カセットに含まれるエピトープｐ’ｋは、配列［ｎｋｐｋｃｋ］（ただし、ｃｋは、選択されたペプチドｐｋのＣ末端に結合したＣ末端フランキング配列であり、ｎｋは、選択されたペプチドｐｋのＮ末端に結合したＮ末端フランキング配列である）として表すことができる。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの例では、Ｎ及びＣ末端フランキング配列は、その由来源タンパク質との関連において治療ワクチンエピトープの天然のＮ及びＣ末端フランキング配列である。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの例では、治療エピトープｐ’ｋは、固定長のエピトープを表す。別の例では、治療エピトープｐ’ｋは可変長のエピトープを表してもよく、エピトープの長さは例えばＣまたはＮ末端フランキング配列の長さによって異なりうる。例えば、Ｃ末端フランキング配列ｃｋ及びＮ末端フランキング配列ｎｋは、それぞれ２～５残基の異なる長さを有してよく、これによりエピトープｐ’ｋの１６種類の可能な選択肢が与えられる。
一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、カセット内の２個の治療エピトープ間の連結部にまたがるジャンクションエピトープの提示を考慮することによってカセット配列を生成する。ジャンクションエピトープは、カセット内で治療エピトープ及びリンカー配列を連結するプロセスによってカセット内に生じる新規な非自己であるが無関係なエピトープ配列である。ジャンクションエピトープの新規な配列は、カセットの治療エピトープ自体とは異なる。エピトープｐ’ｔｉとｐ’ｔｊとの間にまたがるジャンクションエピトープには、治療エピトープｐ’ｔｊ及びｐ’ｔｊ自体の配列とは異なるｐ’ｔｉまたはｐ’ｔｊの両方と重複する任意のエピトープが含まれうる。具体的には、任意選択的なリンカー配列ｌ（ｔｉ，ｔｊ）を含むかまたは含まないカセットのエピトープｐ’ｔｉと隣のエピトープｐ’ｔｊとの間の各連結部には、ｎ（ｔｉ，ｔｊ）個のジャンクションエピトープｅｎ （ｔｉ，ｔｊ），ｎ＝１，２，…，ｎ（ｔｉ，ｔｊ）を関連付けることができる。ジャンクションエピトープは、エピトープｐ’ｔｉ及びｐ’ｔｊの両方と少なくとも部分的に重複する配列であってもよく、またはエピトープｐ’ｔｉとｐ’ｔｊとの間に配置されたリンカー配列と少なくとも部分的に重複する配列であってもよい。ジャンクションエピトープは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはその両方によって提示されうる。
図３８は、２個の例示的なカセット配列としてカセット１（Ｃ１）及びカセット２（Ｃ２）を示している。各カセットは、ワクチン容量ｖ＝２を有し、治療エピトープｐ’ｔ１＝ｐ１＝ＳＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）及びｐ’ｔ２＝ｐ２＝ＬＬＬＬＬＶＶＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ならびに２個のエピトープ間のリンカー配列ｌ（ｔ１，ｔ２）＝ＡＡＹを有している。具体的には、カセットＣ１の配列が［ｐ１ ｌ（ｔ１，ｔ２） ｐ２］によって与えられるのに対してカセットＣ２の配列は［ｐ２ ｌ（ｔ１，ｔ２） ｐ１］によって与えられる。カセットＣ１の例示的なジャンクションエピトープｅｎ （１，２）は、カセット内のｐ’１及びｐ’２の両方にまたがるＥＫＬＡＡＹＬＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、ＫＬＡＡＹＬＬＬＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）、及びＦＥＫＬＡＡＹＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）などの配列であってよく、カセット内のリンカー配列と１つの選択されたエピトープとにまたがるＡＡＹＬＬＬＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）及びＹＬＬＬＬＬＶＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）などの配列であってもよい。同様に、カセットＣ２の例示的なジャンクションエピトープｅｍ（２，１）は、ＶＶＶＶＡＡＹＳＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）、ＶＶＶＶＡＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）、及びＡＹＳＩＮＦＥＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）などの配列であってよい。両方のカセットは同じ配列のセットｐ１、ｌ（ｃ１，ｃ２）、及びｐ２を含んでいるが、特定されるジャンクションエピトープのセットは、カセット内の治療エピトープの順序付けられた配列によって異なる。
一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、ジャンクションエピトープがその患者において提示される尤度を低下させるカセット配列を生成する。具体的には、カセットが患者に注射される際、ジャンクションエピトープは、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルによって提示される可能性を有し、それぞれＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する。かかる応答は、ジャンクションエピトープに対する反応性を有するＴ細胞は治療効果を有さないことから望ましくなく、抗原競合によりカセット内の選択された治療エピトープに対する免疫応答を消失させる可能性がある７６。
一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、１つ以上の候補カセットについて繰り返し処理を行って、そのカセット配列に関連付けられたジャンクションエピトープの提示スコアが数値閾値を下回るカセット配列を決定する。ジャンクションエピトープ提示スコアは、カセット内のジャンクションエピトープの提示尤度に関連付けられた量であり、ジャンクションエピトープ提示スコアの値が高いほど、カセットのジャンクションエピトープがＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩまたはその両方によって提示されやすいことを示す。
一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、候補カセット配列間で最も低いジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられたカセット配列を決定することができる。１つの例では、所定のカセット配列Ｃの提示スコアは、それぞれがカセット配列Ｃ内のジャンクションに関連付けられた距離関数ｄ（ｅｎ （ｔｉ，ｔｊ），ｎ＝１，２，…，ｎ（ｔｉ，ｔｊ）） ＝ ｄ（ｔｉ，ｔｊ）のセットに基づいて決定される。具体的には、距離関数ｄ（ｔｉ，ｔｊ）は、隣接する治療エピトープｐ’ｔｉとｐ’ｔｊとの間にまたがるジャンクションエピトープの１つ以上が提示される尤度を特定する。次に、カセットＣのジャンクションエピトープ提示スコアを、カセットＣの距離関数のセットに関数（例えば、総和、統計学的関数）を適用することにより決定することができる。数学的には、提示スコアは、
Figure 2023123766000077
により与えられる（ただし、ｈ（・）は、各ジャンクションの距離関数をあるスコアにマッピングする特定の関数である）。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の例では、関数ｈ（・）は、カセットの距離関数にわたった総和である。
カセット設計モジュール３２４は、１つ以上の候補カセット配列について繰り返し処理を行い、各候補カセットのジャンクションエピトープ提示スコアを決定し、閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた最適なカセット配列を特定することができる。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の例では、所定の距離関数ｄ（・）は、本明細書のセクションＶＩＩ及びＶＩＩＩで述べた提示モデルによって決定される提示尤度または提示されるジャンクションエピトープの期待数の総和によって与えることができる。しかしながら、他の実施形態では、距離関数は、他の因子単独から、または上記に例示したもののようなモデルと組み合わせて導出することができ、これらの因子には、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩのＨＬＡ結合親和性または安定性の測定値もしくは予測値、及びＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩについて、ＨＬＡ質量分析またはＴ細胞エピトープデータで訓練された提示モデルまたは免疫原性モデルのいずれか１つ以上（単独または組み合わせ）から距離関数を導出することが含まれうる。一実施形態では、距離関数は、ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩの提示についての情報を組み合わせることができる。例えば、距離関数は、所定の閾値を下回る結合親和性で患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルのいずれかに結合することが予測されるジャンクションエピトープの数とすることができる。別の例では、距離関数は、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルのいずれかによって提示されることが予測されるジャンクションエピトープの期待数とすることができる。
カセット設計モジュール３２４は、候補カセット配列内のジャンクションエピトープのいずれかが、ワクチンを設計しようとする特定の患者の自己エピトープであるかどうかを識別するために１つ以上の候補カセット配列をさらに確認することができる。これを行うには、カセット設計モジュール３２４は、ＢＬＡＳＴなどの既知のデータベースに対してジャンクションエピトープを確認する。一実施形態では、カセット設計モジュールは、エピトープｔｉのエピトープｔｊのＮ末端への連結がジャンクション自己エピトープの形成につながる場合にエピトープのペアｔｉ，ｔｊについて、距離関数ｄ（ｔｉ，ｔｊ）を極めて大きい値（例えば１００）に設定することによってジャンクション自己エピトープを防止するカセットを設計するように構成することができる。
図３８の例に戻り、カセット設計モジュール３２４は、例えば、ＭＨＣクラスＩでアミノ酸８～１５個、またはＭＨＣクラスＩＩでアミノ酸９～３０個の長さを有するすべての可能なジャンクションエピトープｅｎ （ｔ１，ｔ２）＝ｅｎ （１，２）の提示尤度の総和によって与えられるカセットＣ１内の１個のジャンクション（ｔ１，ｔ２）について（例えば）距離関数ｄ（ｔ１，ｔ２）＝ｄ（１，２）＝０．３９を決定する。カセットＣ１内に他のジャンクションは存在していないため、カセットＣ１の距離関数にわたった総和であるジャンクションエピトープ提示スコアもやはり０．３９により与えられる。カセット設計モジュール３２４はまた、ＭＨＣクラスＩでアミノ酸８～１５個、またはＭＨＣクラスＩＩではアミノ酸９～３０個の長さを有するすべての可能なジャンクションエピトープｅｎ （ｔ１，ｔ２）＝ｅｎ （２，１）の提示尤度の総和によって与えられるカセットＣ２内の１個のジャンクションについて距離関数ｄ（ｔ１，ｔ２）＝ｄ（２，１）＝０．０６８も決定する。この例では、カセットＣ２のジャンクションエピトープ提示スコアはやはり、１個のジャンクションの距離関数０．０６８によって与えられる。カセット設計モジュール３２４は、ジャンクションエピトープ提示スコアがＣ１のカセット配列よりも低いことから、Ｃ２のカセット配列を最適カセットとして出力する。
場合によっては、カセット設計モジュール３２４は、ブルートフォースアプローチを実行して、すべての、または大部分の可能な候補カセット配列について繰り返し処理を行うことで最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する配列を選択することができる。しかしながら、かかる候補カセットの数は、ワクチンの容量ｖが大きくなるにしたがって途方もなく大きくなりうる。例えば、ｖ＝２０個のエピトープのワクチン容量では、カセット設計モジュール３２４は、最小のエピトープ提示スコアを有するカセットを決定するために約１０１８個の可能な候補カセットについて繰り返し処理を行わなければならない。この決定は、カセット設計モジュール３２４が妥当な長さの時間内で患者に対するワクチンを生成するには計算の負荷（必要とされる計算処理リソースの点で）が大きくなり、時として処理不能となりうる。さらに、各候補カセットについて可能なジャンクションエピトープを処理することはよりいっそうの負荷となりうる。したがって、カセット設計モジュール３２４は、ブルートフォースアプローチにおける候補カセット配列の数よりも大幅に小さい候補カセット配列の数について繰り返し処理を行う方法に基づいてカセット配列を選択することができる。
一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、ランダムに、または少なくとも疑似ランダムに生成された候補カセットを生成し、所定の閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた候補カセットをカセット配列として選択する。さらに、カセット設計モジュール３２４は、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有するサブセットからの候補カセットをカセット配列として選択することができる。例えば、カセット設計モジュール３２４は、ｖ＝２０個の選択されたエピトープのセットについて約１００万の候補カセットのサブセットを生成し、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する候補カセットを選択することができる。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、このサブセットからジャンクションエピトープ提示スコアの低いカセット配列を選択することはブルートフォースアプローチと比べて最適とはいえないが、これは、必要な計算リソースが大幅に少なく、そのため、その実施が技術的に可能である。さらに、このより効率的な手法に対してブルートフォース法を行うことは、ジャンクションエピトープ提示スコアのわずかな、またはさらには無視される程度の改善しかもたらされない可能性があるため、リソースの配分の観点からはあまり価値がない。
別の実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、カセットのエピトープ配列を非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）として定式化することにより、改善されたカセット構成を決定する。ノードのリスト、及び各ノードのペア間の距離が与えられた場合、ＴＳＰは、各ノードをちょうど１回ずつ訪問して元のノードに戻るための最小の総距離に関連付けられたノードの配列を決定する。例えば、互いの間の距離が既知である都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられた場合、ＴＳＰの解は、可能な巡回路のうちで各都市をちょうど１回ずつ訪問するのに移動する総距離が最小となるような都市の閉じた配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンは、ノードのペア間の距離が非対象である場合の最適なノードの配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢに移動するための「距離」は、ノードＢからノードＡに移動するための「距離」と異なる場合がある。
カセット設計モジュール３２４は、非対称ＴＳＰを解くことにより、各ノードが治療エピトープｐ’ｋに対応した改善されたカセット配列を決定する。エピトープｐ’ｋに対応したあるノードからエピトープｐ’ｍに対応した別のノードまでの距離がジャンクションエピトープ距離関数ｄ（ｋ，ｍ）によって与えられるのに対して、エピトープｐ’ｍに対応したノードからエピトープｐ’ｋに対応したノードまでの距離は、距離関数ｄ（ｋ，ｍ）とは異なりうる距離関数ｄ（ｍ，ｋ）によって与えられる。非対称ＴＳＰを用いて改善された最適カセットについて解くことにより、カセット設計モジュール３２４は、カセットの各エピトープ間のジャンクションにわたって低い提示スコアを与えるカセット配列を見つけることができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの各ジャンクションにわたったジャンクションエピトープ提示スコアを最小とするために各エピトープが連結されなければならない順序に対応した治療エピトープの配列を示す。具体的には、治療エピトープｋ＝１，２，…，ｖ，が与えられた場合、カセット設計モジュール３２４は、カセット内の治療エピトープのそれぞれの可能な順序付けられたペアについて、距離関数ｄ（ｋ，ｍ），ｋ，ｍ＝１，２，…，ｖを決定する。換言すれば、所定のエピトープのペアｋ，ｍについて、治療エピトープｐ’ｋの後にエピトープｐ’ｍを連結するための距離関数ｄ（ｋ，ｍ）と、治療エピトープｐ’ｍの後にエピトープｐ’ｋを連結するための距離関数ｄ（ｍ，ｋ）とは互いに異なりうることから、これらの両方が決定される。
一実施形態では、カセット設計モジュール３２４は、整数線形計画問題によって非対称ＴＳＰを解く。具体的には、カセット設計モジュール３２４は、以下によって与えられる（ｖ＋１）×（ｖ＋１）の経路行列Ｐを生成する。すなわち、
Figure 2023123766000078
ｖ×ｖの行列Ｄは、非対称距離行列であり、各要素Ｄ（ｋ，ｍ），ｋ＝１，２，…，ｖ；ｍ＝１，２，…，ｖは、エピトープｐ’ｋからエピトープｐ’ｍまでのジャンクションの距離関数に対応している。Ｐの列ｋ＝２，…，ｖは元のエピトープの各ノードに対応し、列１及び行１は、他のすべてのノードからの距離が０である「ゴーストノード」に対応する。行列への「ゴーストノード」の追加は、ワクチンカセットが環状ではなく直鎖状であり、したがって最初のエピトープと最後のエピトープとの間にジャンクションがないという概念を記号化するものである。換言すれば、配列は環状ではなく、最初のエピトープは配列内の最後のエピトープの後に連結されると仮定されない。エピトープｐ’ｋがエピトープｐ’ｍのＮ末端に連結され、そうでない場合には０である、方向付けられた経路（すなわち、カセット内のエピトープ－エピトープジャンクション）が存在する場合にｘｋｍがバイナリー変数を示すものとする。さらに、Ｅが、すべてｖの治療ワクチンエピトープのセットを示し、Ｓ⊂Ｅがエピトープのサブセットを示すものとする。任意のかかるサブセットＳにおいて、ｏｕｔ（Ｓ）が、エピトープ－エピトープジャンクションｘｋｍ＝１の数を示すものとする（ただし、ｋはＳ内のエピトープであり、ｍはＥ＼Ｓ内のエピトープである）。既知の経路行列Ｐが与えられたものとして、カセット設計モジュール３２４は、以下の整数線形計画問題を解く経路行列Ｘを見つける。すなわち、
Figure 2023123766000079
ただし、Ｐｋｍは、以下の制約条件の下で、経路行列Ｐの要素Ｐ（ｋ，ｍ）を示す。すなわち、
Figure 2023123766000080
最初の２つの制約条件は、各エピトープがカセット内にちょうど１回現れることを保証するものである。最後の制約条件は、カセットが連結されていることを保証するものである。換言すれば、ｘで記号化されたカセットは連結された直鎖状タンパク質配列である。
等式（２７）の整数線形計画問題内のｘｋｍ，ｋ，ｍ＝１，２，…，ｖ＋１に対する解は、ジャンクションエピトープの提示スコアを低くするカセットの治療エピトープの１つ以上の配列を推測するために使用することができるノード及びゴーストノードの閉じた配列を示す。具体的には、ｘｋｍ＝１の値は、ノードｋからノードｍまでの「経路」が存在する、すなわち換言すれば、改良されたカセット配列内では治療エピトープｐ’ｍが治療エピトープｐ’ｋの後に連結されなければならないことを示す。ｘｋｍ＝０の解は、かかる経路が存在しない、すなわち換言すれば、改良されたカセット配列内では治療エピトープｐ’ｍが治療エピトープｐ’ｋの後に連結されてはならないことを示す。以上をまとめると、等式（２７）の整数線形計画問題内のｘｋｍの値は、経路が各ノードにちょうど１回入って出て行くようなノード及びゴーストノードの配列を表している。例えば、ｘゴースト，１＝１，ｘ１３＝１，ｘ３２＝１，及びｘ２，ゴースト＝１（そうでない場合には０）の値は、ノード及びゴーストノードの配列：ゴースト→１→３→２→ゴーストを示しうる。
配列が解かれた時点で、ゴーストノードが配列から除去されて、カセット内の最初のノードのみが治療エピトープに対応している改良配列が生成される。改良配列は、提示スコアを改善するために選択されたエピトープがカセット内で連結されるべき順序を示す。例えば、前の段落の例から引き続き、ゴーストノードノードを除去することで改良配列１→３→２を生成することができる。改良配列は、カセット内で各エピトープを連結する１つの可能な形、すなわち、ｐ１→ｐ３→ｐ２を示している。
一実施形態では、治療エピトープｐ’ｋが可変長さのエピトープである場合、カセット設計モジュール３２４は、治療エピトープｐ’ｋ及びｐ’ｍの異なる長さに対応した候補距離関数を決定し、距離関数ｄ（ｋ，ｍ）を最小の候補距離関数として特定する。例えば、エピトープｐ’ｋ＝［ｎｋｐｋｃｋ］及びｐ’ｍ＝［ｎｍｐｍｃｍ］は、それぞれ、（一実施形態において）アミノ酸２～５個異なりうる対応するＮ及びＣ末端フランキング配列をそれぞれ含むことができる。したがって、エピトープｐ’ｋとｐ’ｍとの間のジャンクションには、ジャンクション内に配置されるｎｋの４つの可能な長さの値及びｃｍの４つの可能な長さの値に基づいてジャンクションエピトープの１６個の異なるセットが関連付けられる。カセット設計モジュール３２４は、ジャンクションエピトープの各セットについて候補距離関数を決定し、距離関数ｄ（ｋ，ｍ）を最小の値として決定することができる。次に、カセット設計モジュール３２４は、経路行列Ｐを構築し、等式（２７）において整数線形計画問題について解くことによってカセット配列を決定することができる。
ランダムサンプリングアプローチと比較して、整数線形計画問題を用いてカセット配列について解くことは、ワクチン内の２個の治療エピトープにそれぞれ対応したｖ× （ｖ－１）の距離関数を求めることが必要である。このアプローチによって決定されたカセット配列は、ジャンクションエピトープの提示が大幅に低い配列を与える一方で、特に生成される候補カセット配列の数が大きい場合に、必要とされる計算リソースがランダムサンプリングアプローチよりも大幅に少なくなる可能性がある。
ＸＩ．Ｂ．２．非対象ＴＳＰに対する、ランダムサンプリングによって生成されたカセット配列におけるジャンクションエピトープ提示の比較
ｖ＝２０個の治療エピトープを含む２個のカセット配列を、１，０００，０００通りの順列のランダムサンプリングにより（カセット配列Ｃ１）、また、等式（２７）において整数線形計画問題を解くことにより（カセット配列Ｃ２）生成した。距離関数、したがって提示スコアを、等式（１４）で記述される提示モデルに基づいて求めた（式中、ｆは、シグモイド関数であり、ｘｈ ｉは、ペプチドｐｉの配列であり、ｇｈ（・）は、ニューラルネットワーク関数であり、ｗは、フランキング配列、ペプチドｐｉのｌｏｇＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｍｉｌｌｉｏｎ）、ペプチドｐｉのタンパク質の抗原性、及びペプチドｐｉの由来源の試料ＩＤを含み、フランキング配列のｇｗ（・）及びｌｏｇＴＰＭは、それぞれニューラルネットワーク関数である）。ｇｈ（・）のニューラルネットワーク関数のそれぞれは、単一隠れ層の多層パーセプトロン（ＭＬＰ）の１つの出力ノードを含み、入力次元２３１（１１残基×残基ごとに２１文字（ｐａｄ文字を含む））の幅２５６、隠れ層での正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化、出力層での線形活性化、及び、訓練データセット内のＨＬＡアレルごとに１個の出力ノードのものであった。フランキング配列のニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層ＭＬＰで、入力次元２１０（Ｎ末端フランキング配列の５残基＋Ｃ末端フランキング配列の５残基×残基ごとに２１文字（ｐａｄ文字を含む））、幅３２、隠れ層でのＲｅＬＵ活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。ＲＮＡ ｌｏｇＴＰＭのニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層ＭＬＰで、入力次元１、幅１６、隠れ層でのＲｅＬＵ活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０２、及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０４のＨＬＡアレルについて提示モデルを構築した。２個のカセット配列の提示されるジャンクションエピトープの期待数を示す提示スコアを比較した。結果は、等式（２７）を解くことによって生成されたカセット配列の提示スコアが、ランダムサンプリングによって生成されたカセット配列の提示スコアよりも約４倍の改善をともなったことを示した。
具体的には、ｖ＝２０個のエピトープは以下により与えられる。
Figure 2023123766000081
第１の例では、２０個の治療エピトープによって１，０００，０００通りの異なる候補カセット配列がランダムに生成された。候補カセット配列のそれぞれについて提示スコアが生成された。最も低い提示スコアを有するものとして特定された候補カセット配列は以下のものである。
Figure 2023123766000082
これは、提示されるジャンクションエピトープの期待数の提示スコアは６．１であった。１，０００，０００通りのランダム配列の提示スコアの中央値は、１８．３であった。実験は、提示されるジャンクションエピトープの期待数が、ランダムにサンプリングされたカセット間でカセット配列を特定することによって大幅に低減されたことを示している。
第２の例では、カセット配列Ｃ２が、等式（２７）において整数線形計画問題を解くことによって特定された。具体的には、２個の治療エピトープ間の可能性のある各ジャンクションの距離関数が求められた。この距離関数を用いて、整数線形計画問題に対する解を解いた。この手法によって特定されたカセット配列は以下のものであった。
Figure 2023123766000083
これは提示スコア１．７であった。カセット配列Ｃ２の提示スコアは、カセット配列Ｃ１の提示スコアと比較して約４倍の改善を示し、ランダムに生成された１，０００，０００通りの候補カセットの提示スコアの中央値と比較して約１１倍の改善を示した。カセットＣ１を生成するためのランタイムは、２．３０ＧＨｚのＩｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ Ｅ５－２６５０ ＣＰＵのシングルスレッド上で２０秒であった。カセットＣ２を生成するためのランタイムは、同じＣＰＵのシングルスレッド上で１秒であった。したがって、この例では、等式（２７）の整数線形計画問題を解くことによって特定されたカセット配列は、２０倍低減された計算コストで約４倍良好な解を生成している。
これらの結果は、整数線形計画問題が、潜在的により少ない計算リソースを用いて、ランダムサンプリングから特定されるものよりも提示されるジャンクションエピトープの数が低いカセット配列を与えることができる可能性を示すものである。
ＸＩ．Ｂ．３．ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ及び提示モデルによって生成されたカセット配列セレクションにおけるジャンクションエピトープ提示の比較
この例では、腫瘍／正常エクソームのシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームのシークエンシング、及び肺癌試料のＨＬＡタイピングに基づいて選択されたｖ＝２０個の治療エピトープを含むカセット配列を、１，０００，０００通りの順列のランダムサンプリングにより、さらに等式（２７）で整数線形計画問題を解くことによって生成した。距離関数、したがって提示スコアを、ＨＬＡペプチドの結合親和性の予測プログラムであるＭＨＣｆｌｕｒｒｙによって予測された、様々な閾値（例えば、５０～１０００ｎＭ、またはこれよりも高いかもしくは低い値）を下回る親和性で患者のＨＬＡに結合するジャンクションエピトープの数に基づいて求めた。この例では、治療エピトープとして選択される２０個の非同義体細胞変異を、上記のセクションＸＩ．Ｂの提示モデルにしたがって変異をランク付けすることによって腫瘍試料で特定された９８個の体細胞変異間から選択した。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープは、安定性に基づくものなど、または提示スコア、親和性といった基準の組み合わせなどの他の基準に基づいて選択することもできる点は理解されよう。さらに、ワクチンに含めるための治療エピトープを優先順位付けするために用いられる基準は、カセット設計モジュール３２４で使用される距離関数Ｄ（ｋ，ｍ）を決定するために用いられる基準と同じである必要はない点は理解されよう。
患者のＨＬＡクラスＩアレルは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２であった。
具体的には、この例では、ｖ＝２０個の治療エピトープは以下のものであった。
Figure 2023123766000084
下記表のこの例の結果は、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙによって予測した、３つの例示的方法によって見いだされた、閾値の列に示された値（ｎＭはナノモルを意味する）を下回る親和性で患者のＨＬＡに結合するジャンクションエピトープの数と比較したものである。第１の方法では、上記に述べた巡回セールスマン問題（ＡＴＳＰ）定式化によって１秒のランタイムで見つけられた最適カセット。第２の方法では、１００万個のランダムな試料後に見つけられた最良のカセットを取ることによって決定された最適カセット。第３の方法では、ジャンクションエピトープの数の中央値が１００万個のランダム試料において見つけられた。
Figure 2023123766000085
この例の結果は、多くの基準のうちのいずれか１つを用いて、特定のカセット設計が設計の要件を満たしているか否かを判定することができることを示している。具体的には、上記の例によって示されるように、多くの候補から選択されたカセット配列を、最も低いジャンクションエピトープの提示スコアを有するか、または特定された閾値を下回るそのようなスコアを少なくとも有するカセット配列によって特定することができる。この例の結果は、結合親和性のような別の基準も、与えられたカセット設計が設計の要件を満たしているか否かを判定するために使用できることを示している。この基準では、結合親和性の閾値(例えば、５０～１０００、またはこれよりも高いかまたは低い値)を、カセット設計配列が閾値（例えば０）を上回るジャンクションエピトープの特定の閾値数よりも少ないジャンクションエピトープを有することを指定するように設定することができ、多くの方法のうちのいずれか１つを用いて（表に示される方法１～３）、特定の候補カセット配列がこれらの要件を満たすか否かを判定することができる。これらの例示的方法は、使用される方法に応じて、閾値は異なる形で設定する必要がありうることを示している。安定性に基づくもの、または提示スコア、親和性などの基準の組み合わせに基づいたものなどの他の基準も考えられる。
別の例では、このセクション（ＸＩ．Ｃ）において先に述べた同じＨＬＡタイプ及び２０個の治療エピトープを使用して同じカセットを生成したが、結合親和性予測に基づいた距離関数を使用する代わりに、エピトープｍ，ｋについての距離関数は、一連の閾値を上回る提示の確率（０．００５～０．５の間の確率、またはこれよりも高いかもしくは低い確率）で患者のＨＬＡクラスＩアレルによって提示されることが予測されるｍからｋまでのジャンクションにまたがるペプチドの数とした（ここで、提示の確率は上記のセクションＸＩ．Ｂの提示モデルによって求めた）。この例は、特定の候補カセット配列がワクチンで使用するための設計要件を満たしているか否かを判定するうえで考慮することができる基準の幅広さをさらに示している。
Figure 2023123766000086
上記の例は、ある候補カセット配列が実施態様によって異なりうるかどうかを判定するための基準を特定している。これらの例のそれぞれは、基準を上回るかまたは下回るジャンクションエピトープの数のカウントは、候補カセット配列がその基準を満たすか否かを判定するうえで用いられるカウントとすることができることを示している。例えば、基準が、ＨＬＡの結合親和性閾値を満たすかまたはこれを上回るエピトープの数である場合、候補カセット配列がその数よりも多いエピトープを有するかまたは少ないエピトープを有するかによって、候補カセット配列がワクチンの選択されたカセットとして使用するための基準を満たすかどうかを判定することができる。同様に、基準が提示尤度の閾値を上回るジャンクションエピトープの数である場合。
しかしながら、他の実施形態では、カウンティング以外の計算を行って候補カセット配列が設計基準を満たすかどうかを判定することもできる。例えば、特定の閾値を上回る／下回るエピトープのカウントの代わりに、ジャンクションエピトープのどのくらいの割合が閾値を上回る、または下回るか、例えば、ジャンクションエピトープの上位Ｘ％が特定の閾値Ｙを上回る提示尤度を有するかどうか、またはジャンクションエピトープのＸ％がＺ（ｎＭ）よりも低い、または高いＨＬＡ結合親和性を有するか、を判定することもできる。これらはあくまで例であり、一般的に基準は個々のジャンクションエピトープの任意の属性、またはジャンクションエピトープの一部もしくは全部の集合から導出される統計に基づいたものとすることができる。この場合、Ｘは、一般的に０～１００％の間の任意の数値（例えば７５％以下）であってよく、Ｙは、０～１の間の任意の値であってよく、Ｚは、問題とされる基準に適した任意の数値であってよい。これらの値は、経験的に決定することができ、使用されるモデル及び基準、ならびに使用される訓練データの質によって決まる。
このため、特定の態様では、高い提示の確率を有するジャンクションエピトープを除外することができ、低い提示の確率を有するジャンクションエピトープを残すことができ、強く結合するジャンクションエピトープ、すなわち、１０００ｎＭもしくは５００ｎＭまたは特定の他の閾値を下回る結合親和性を有するジャンクションエピトープを除外することができ、及び／または弱く結合するジャンクションエピトープ、すなわち、１０００ｎＭもしくは５００ｎＭまたは特定の他の閾値を上回る結合親和性を有するジャンクションエピトープを残すことができる。
上記の例は、上記に述べた提示モデルの実施を用いて候補配列を特定したものであるが、これらの原理は、カセット配列中に配列するためのエピトープが、親和性、安定性などに基づいたものなど、他のタイプのモデルに同様に基づいて特定されるような実施にも同様に適用される。
ＸＩＩ．実施例７：例示的な提示モデルの性能を示す実験結果
上記の種々の提示モデルの妥当性を、提示モデルを訓練するために使用されなかった訓練データ１７０のサブセット、または、訓練データ１７０と類似した変数及びデータ構造を有する訓練データ１７０とは別々のデータセットであった、試験データＴに対して試験した。
提示モデルの性能を示す関連性のある測定基準は、
Figure 2023123766000087
であり、これは、ＨＬＡアレル上に提示されると予測されたペプチド例の数に対する、関連するＨＬＡアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。一実現形態では、試験データＴにおけるペプチドｐｉは、対応する尤度推定値ｕｉが、所定の閾値ｔ以上である場合に、１つ以上の関連するＨＬＡアレル上に提示されると予測された。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、
Figure 2023123766000088
であり、これは、ＨＬＡアレル上に提示されることが公知であったペプチド例の数に対する、関連するＨＬＡアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）である。ＲＯＣは、
Figure 2023123766000089
によって与えられる、偽陽性率（ＦＰＲ）に対するリコールをプロットする。
ＸＩＩ．Ａ．従来の技術水準（ｓｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－ａｒｔ）モデルに対する、質量分析データに基づく提示モデルの性能の比較
図１３Ａは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。結果は、例示的な提示モデルが、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、ペプチド提示の予測において機能したことを示した。
具体的には、図１３Ａに「ＭＳ」として示す例示的な提示モデルは、アフィン依存性関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を用いた、等式（１２）に示すアレルごと提示モデルの最大値であった。例示的な提示モデルは、ＩＥＤＢデータセット由来の単一アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１質量分析データ（データセット「Ｄ１」）（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）のサブセット、及びＩＥＤＢデータセット由来の単一アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２質量分析（データセット「Ｄ２」）（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）のサブセットに基づいて訓練した。例示的な提示モデルが、提示された抗原の配列を単に記憶できないように、試験セットにおける提示されたペプチドを含有する由来源タンパク質由来のすべてのペプチドを、訓練データから削除した。
図１３Ａに「親和性」として示すモデルは、親和性予測ＮＥＴＭＨＣｐａｎに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の技術水準モデルに類似したモデルであった。ＮＥＴＭＨＣｐａｎの実現形態は、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/に詳細に提供される。図１３Ａに「安定性」として示すモデルは、安定性予測ＮＥＴＭＨＣｓｔａｂに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の技術水準モデルに類似したモデルであった。ＮＥＴＭＨＣｓｔａｂの実現形態は、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstab-1.0/に詳細に提供される。試験データは、Ｂａｓｓａｎｉ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇデータセット由来の複数アレルＪＹ細胞株ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２質量分析データ（データセット「Ｄ３」）（データは、www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD000394で見出すことができる）のサブセットである。エラーバー（実線で示す）は、９５％信頼区間を示す。
図１３Ａの結果に示すように、質量分析データに基づいて訓練された例示的な提示モデルは、ＭＨＣ結合親和性予測またはＭＨＣ結合安定性予測に基づいてペプチド提示を予測する従来の技術水準モデルに比べて有意により高い、１０％リコール率でのＰＰＶ値を有していた。具体的には、例示的な提示モデルは、親和性予測に基づくモデルよりもおよそ１４％高いＰＰＶを有し、安定性予測に基づくモデルよりもおよそ１２％高いＰＰＶを有していた。
これらの結果により、例示的な提示モデルは、たとえ提示されたペプチドを含有したタンパク質配列に基づいて訓練されなかったとしても、ＭＨＣ結合親和性またはＭＨＣ結合安定性の予測に基づいてペプチド提示を予測する従来の技術水準モデルよりも、有意により良好な性能を有していたことが証明される。
ＸＩＩ．Ｂ．従来の技術水準モデルに対する、Ｔ細胞エピトープデータに基づく提示モデルの性能の比較
図１３Ｂは、Ｔ細胞エピトープデータに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような別の例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。Ｔ細胞エピトープデータは、細胞表面上のＭＨＣアレルによって提示されＴ細胞によって認識されたペプチド配列を含有する。結果は、例示的な提示モデルが、たとえ質量分析データに基づいて訓練されているとしても、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、Ｔ細胞エピトープの予測において機能したことを示した。換言すると、図１３Ｂの結果は、例示的な提示モデルが、質量分析試験データに基づくペプチド提示の予測において従来の技術水準モデルよりも良好に機能しただけではなく、Ｔ細胞によって実際に認識されたエピトープの予測においても、従来の技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことを示した。これは、本明細書において提示するような様々な提示モデルが、免疫系において免疫原性応答を誘導する可能性が高い抗原の、改善された特定を提供できることのしるしである。
具体的には、図１３Ｂに「ＭＳ」として示す例示的な提示モデルは、データセットＤ１のサブセットに基づいて訓練された、アフィン変換関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を用いた、等式（２）に示すアレルごと提示モデルであった。提示モデルが、提示された抗原の配列を単に記憶できないように、試験セットにおける提示されたペプチドを含有する由来源タンパク質由来のすべてのペプチドを、訓練データから削除した。
モデルの各々を、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１Ｔ細胞エピトープデータに関する質量分析データ（データセット「Ｄ４」）（データは、www.iedb.org/doc/tcell full v3.zipで見出すことができる）のサブセットである試験データに適用した。図１３Ｂに「親和性」として示すモデルは、親和性予測ＮＥＴＭＨＣｐａｎに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の技術水準モデルに類似したモデルであり、図１３Ｂに「安定性」として示すモデルは、安定性予測ＮＥＴＭＨＣｓｔａｂに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の技術水準モデルに類似したモデルであった。エラーバー（実線で示す）は、９５％信頼区間を示す。
図１３Ａの結果に示すように、質量分析データに基づいて訓練されたアレルごと提示モデルは、たとえ提示モデルが、提示されたペプチドを含有したタンパク質配列に基づいて訓練されなかったとしても、ＭＨＣ結合親和性またはＭＨＣ結合安定性の予測に基づいてペプチド提示を予測する従来の技術水準モデルよりも有意に高い、１０％リコール率でのＰＰＶ値を有していた。具体的には、アレルごと提示モデルは、親和性予測に基づくモデルよりもおよそ９％高いＰＰＶを有し、安定性予測に基づくモデルよりもおよそ８％高いＰＰＶを有していた。
これらの結果により、質量分析データに基づいて訓練された例示的な提示モデルは、Ｔ細胞によって認識されたエピトープの予測に対して、従来の技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことが証明された。
ＸＩＩ．Ｃ．質量分析データに基づく様々な提示モデルの性能の比較
図１３Ｃは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、例示的な和の関数モデル（等式（１３））、例示的な関数の和モデル（等式（１９））、及び例示的な二次モデル（等式（２３））の性能結果を比較する。結果は、関数の和モデル及び二次モデルが、和の関数モデルよりも良好に機能したことを示した。これは、和の関数モデルが、実際にはペプチドの提示が有効に独立している場合、複数アレル設定におけるアレルが、ペプチド提示について互いに干渉し得ることを含意するためである。
具体的には、図１３Ｃにおいて「和のシグモイド」とラベルした例示的な提示モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、恒等関数ｆ（・）、及びｅｘｐｉｔ関数ｒ（・）を用いた、和の関数モデルであった。「シグモイドの和」とラベルした例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）、及び恒等関数ｒ（・）を伴う等式（１９）における関数の和モデルであった。「双曲線正接」とラベルした例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）、及び双曲線正接関数ｒ（・）を伴う等式（１９）における関数の和モデルであった。「二次」とラベルした例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を伴う等式（１８）において示す暗黙のアレルごと提示尤度形態を用いる、等式（２３）における二次モデルであった。各モデルを、データセットＤ１、Ｄ２、及びＤ３のサブセットに基づいて訓練した。例示的な提示モデルを、訓練データとオーバーラップしなかったデータセットＤ３のランダムサブセットである試験データに適用した。
図１３Ｃに示すように、第１列は、各提示モデルを試験セットに適用した時のＲＯＣのＡＵＣを指し、第２列は、負のｌｏｇ尤度損失の値を指し、第３列は、１０％リコール率でのＰＰＶを指す。図１３Ｃに示すように、提示モデル「シグモイドの和」、「双曲線正接」、及び「二次」の性能は、およそ１５～１６％の１０％リコールでのＰＰＶでほぼ引き分けであり、他方、モデル「和のシグモイド」の性能は、およそ１１％でわずかにより低かった。
セクションＸ．Ｃ．４．において以前に議論したように、結果は、提示モデル「シグモイドの和」、「双曲線正接」、及び「二次」が、「和のシグモイド」モデルと比較して高いＰＰＶの値を有することを示し、これは、いかにペプチドが複数アレル設定において各ＭＨＣアレルによって独立して提示されるかを、モデルが正確に説明するためである。
ＸＩＩ．Ｄ．単一アレル質量分析データに基づく訓練を伴う及び伴わない提示モデルの性能の比較
図１３Ｄは、複数アレル質量分析データについて、ペプチド提示予測に関して、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練される２つの例示的な提示モデルの性能結果を比較する。結果は、単一アレルデータを伴わずに訓練される例示的な提示モデルが、単一アレルデータを伴って訓練される例示的な提示モデルのものに匹敵する性能を達成することを示した。
「Ａ２／Ｂ７単一アレルデータを伴う」例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）、及び同一性関数ｒ（・）を伴う、等式（１９）における「シグモイドの和」提示モデルであった。モデルを、データセットＤ３のサブセット、及びＩＥＤＢデータベース由来の様々なＭＨＣアレルについての単一アレル質量分析データ（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）に基づいて訓練した。「Ａ２／Ｂ７単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルは、同じモデルであったが、アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についての単一アレル質量分析データを伴わないものの、他のアレルについての単一アレル質量分析データを伴う、複数アレルＤ３データセットのサブセットに基づいて訓練した。複数アレル訓練データ内で、細胞株ＨＣＣ１９３７は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２を発現していたがＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を発現しておらず、細胞株ＨＣＴ１１６は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を発現していたがＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２を発現していなかった。例示的な提示モデルを、データセットＤ３のランダムサブセットであったが訓練データとオーバーラップしなかった、試験データに適用した。
図１３Ｄに示すように、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての暗黙のアレルごと提示尤度に基づく予測は、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についてよりもむしろＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての単一アレル試験データに対して、有意により良好に機能した。類似した結果が、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２について示される。
これらの結果は、たとえペプチドと各個々のＭＨＣアレルとの間の直接の関連が、訓練データにおいて既知でなかったとしても、提示モデルの暗黙のアレルごと提示尤度は、個々のＭＨＣアレルに対する結合モチーフを正確に予測して識別できることを示す。
ＸＩＩ．Ｅ．単一アレル質量分析データに基づく訓練を伴わないアレルごと予測の性能の比較
図１３Ｅは、図１３Ｄに示す解析において提供されたアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についての単一アレル質量分析データに基づく、図１３Ｄに示す「Ａ２／Ｂ７単一アレルデータを伴わない」及び「Ａ２／Ｂ７単一アレルデータを伴う」例示的なモデルの性能を示す。結果は、たとえ例示的な提示モデルがこれらの２つのアレルについての単一アレル質量分析データを伴わずに訓練されるとしても、モデルが各ＭＨＣアレルについての結合モチーフを学習できることを示す。
「相関」の列は、ペプチドが試験データ中の対応するアレル上に提示されたかどうかを示す実際のラベルと、予測についてのラベルとの間の相関を指す。図１３Ｅに示すように、「Ｂ７を予測するＡ２モデル」は、ペプチド提示が、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての暗黙のアレルごと提示尤度推定値に基づいて、単一アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２について予測される場合のモデルの性能を示す。同様に、「Ａ２を予測するＡ２モデル」は、ペプチド提示が、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての暗黙のアレルごと提示尤度推定値に基づいて、単一アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１について予測される場合のモデルの性能を示す。「Ｂ７を予測するＢ７モデル」は、ペプチド提示が、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についての暗黙のアレルごと提示尤度推定値に基づいて、単一アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２データについて予測される場合のモデルの性能を示す。「Ａ２を予測するＢ７モデル」は、ペプチド提示が、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についての暗黙のアレルごと提示尤度推定値に基づいて、単一アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１について予測される場合のモデルの性能を示す。
図１３Ｅに示すように、ＨＬＡアレルについての暗黙のアレルごと尤度の予測能力は、意図されるアレルについて有意により高く、他のＨＬＡアレルについて有意により低い。図１３Ｄに示す結果と同様に、たとえペプチド提示とこれらのアレルとの間の直接の関連が、複数アレル訓練データ中に存在しなかったとしても、例示的な提示モデルは、個々のアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２のペプチド提示を差別化するように正確に学習した。
ＸＩＩ．Ｆ．アレルごと予測において頻繁に起こるアンカー残基は、公知の標準的なアンカーモチーフと一致する
図１３Ｆは、図１３Ｄに示す「Ａ２／Ｂ７単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルによって予測される、ノナマー間で２位及び９位に共通したアンカー残基を示す。ペプチドは、推定尤度が５％よりも上であった場合に、提示されることが予測された。結果は、ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２上での提示について特定されたペプチドにおける最も一般的なアンカー残基が、これらのＭＨＣアレルについて既知のアンカーモチーフと一致したことを示す。これは、例示的な提示モデルが、期待されたように、ペプチド配列のアミノ酸の特定の位置に基づいて、ペプチド結合を正確に学習したことを示す。
図１３Ｆに示すように、２位のアミノ酸Ｌ／Ｍ及び９位のアミノ酸Ｖ／Ｌは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１について（https://link.springer.com/article/10.1186/1745-7580-4-2の表４に示されるような）標準的なアンカー残基モチーフであることが公知であり、２位のアミノ酸Ｐ及び９位のアミノ酸Ｌ／Ｖは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２について標準的なアンカー残基モチーフであることが公知であった。モデルによって特定されたペプチドについての２位及び９位の最も一般的なアンカー残基モチーフは、両方のＨＬＡアレルについて公知の標準的なアンカー残基モチーフと一致した。
ＸＩＩ．Ｇ．アレル非相互作用変数を伴う及び伴わない提示モデルの性能の比較
図１３Ｇは、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとの間の性能結果を比較する。結果は、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列のアレル非相互作用変数としての組み入れが、モデル性能を有意に改善したことを示した。より具体的には、様々なＭＨＣアレルにわたって共通である、ペプチド提示に適切な特性を特定し、これらのアレル非相互作用変数についての統計学的強度が、提示モデルの性能を改善するためにＭＨＣアレルにわたって共有されるように、それらをモデル化することが、価値を有する。
例示的な「アレル相互作用」モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を伴う、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた等式（２２）における暗黙のアレルごと提示尤度の形態を用いた、関数の和モデルであった。例示的な「アレル非相互作用」モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を伴う、Ｃ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた等式（２１）に示す、関数の和モデルであった。アレル非相互作用変数は、別々のネットワーク依存性関数ｇｗ（・）を通してモデル化した。両方のモデルを、データセットＤ３のサブセット、及びＩＥＤＢデータベース由来の様々なＭＨＣアレルについての単一アレル質量分析データ（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）に基づいて訓練した。提示モデルの各々を、訓練データとオーバーラップしなかったデータセットＤ３のランダムサブセットである試験データセットに適用した。
図１３Ｇに示すように、例示的な提示モデルにおけるＣ末端隣接配列及びＮ末端隣接配列のアレル非相互作用変数としての組み入れは、それらのアレル相互作用変数としてのモデル化と比べて、ＰＰＶ値においておよそ３％の改善を達成した。これは、概して、「アレル非相互作用」の例示的な提示モデルが、別々のネットワーク依存性関数での効果を、コンピュータ計算力における非常に少ない付加しか伴わずにモデル化することによって、ＭＨＣアレルにわたるアレル非相互作用変数の統計学的強度を共有できたためである。
ＸＩＩ．Ｈ．提示されるペプチドとｍＲＮＡ定量との間の依存性
図１３（Ｈ）は、質量分析によって決定された、ｍＲＮＡ存在量と腫瘍細胞上に提示されたペプチドの頻度との間の依存性を示す。結果は、ｍＲＮＡ発現とペプチド提示との間に強い依存性があることを示す。
具体的には、図１３Ｈにおける横軸は、１００万あたりの転写産物（ＴＰＭ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）四分位に換算したｍＲＮＡ発現を示す。図１３Ｈにおける縦軸は、対応するｍＲＮＡ発現四分位における、各遺伝子由来からの提示されたエピトープの割合を示す。各実線は、対応する質量分析データ及びｍＲＮＡ発現測定値に関連する、腫瘍試料からの２つの測定値に関するプロットである。図１３Ｈに示すように、ｍＲＮＡ発現と、対応する遺伝子におけるペプチドの割合との間には、強い正の相関がある。具体的には、ＲＮＡ発現の最上位の四分位点における遺伝子由来のペプチドは、最下位の四分位点よりも、提示される可能性が２０倍を超えて高い。さらに、本質的に０個のペプチドが、ＲＮＡを通して検出されない遺伝子から提示される。
結果は、ｍＲＮＡ定量測定値がペプチド提示を強く予測するため、これらの測定値を組み入れることによって提示モデルの性能を大きく改善できることを示す。
ＸＩＩ．Ｉ．ＲＮＡ定量データの組み入れを伴う提示モデルの性能の比較
図１３Ｉは、２つの例示的な提示モデルの性能を示し、そのうち１つは、質量分析腫瘍細胞データに基づいて訓練されており、もう１つは、ｍＲＮＡ定量データ及び質量分析腫瘍細胞データを組み入れている。図１３Ｈから期待されるように、ｍＲＮＡ発現はペプチド提示の強い指標であるため、結果は、ｍＲＮＡ定量測定値を例示的な提示モデルに組み入れることによって、性能の有意な改善があることを示した。
「ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ＋ＲＮＡフィルター」は、親和性予測に基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の技術水準モデルに類似したモデルであった。それは、３．２ ＦＰＫＭ未満であったｍＲＮＡ定量測定値を有するすべてのペプチドをタンパク質から除去した標準的な遺伝子発現フィルターと共にＭＨＣｆｌｕｒｒｙを用いて、実施した。ＭＨＣｆｌｕｒｒｙの実現形態は、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈａｍｍｅｒｌａｂ／ｍｈｃｆｌｕｒｒｙ／及びｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１６／０５／２２／０５４７７５に詳細に提供されている。「例示的なモデル、ＲＮＡなし」モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ネットワーク依存性関数ｇｗ（・）、及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を伴う、等式（２１）に示す「シグモイドの和」の例示的な提示モデルであった。「例示的なモデル、ＲＮＡなし」モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｗ（・）を通して、Ｃ末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた。
「例示的なモデル、ＲＮＡあり」モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ｌｏｇ関数を通してｍＲＮＡ定量データを組み入れる等式（１０）におけるネットワーク依存性関数ｇｗ（・）、及びｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）を伴う、等式（１９）に示す「シグモイドの和」提示モデルであった。「例示的なモデル、ＲＮＡあり」モデルは、ネットワーク依存性関数ｇｗ（・）を通してＣ末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れ、ｌｏｇ関数を通してｍＲＮＡ定量測定値を組み入れた。
各モデルを、ＩＥＤＢデータセット由来の単一アレル質量分析データ、Ｂａｓｓａｎｉ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇデータセット由来の複数アレル質量分析データからの７細胞株、及び２０種類の質量分析腫瘍試料の組み合わせに基づいて訓練した。各モデルを、合計５２，１５６，８４０種類のペプチド由来の９，８３０種類の提示されたペプチドを構成した、７腫瘍試料由来の５，０００種類の提供されたタンパク質を含む試験セットに適用した。
図１３Ｉの最初の２つの棒グラフに示すように、「例示的なモデル、ＲＮＡなし」モデルは、２１％の、２０％リコールでのＰＰＶ値を有するが、従来の技術水準モデルのものはおよそ３％である。これは、ｍＲＮＡ定量測定値の組み入れを伴わないにもかかわらず、ＰＰＶ値における１８％の最初の性能の改善を示す。図１３Ｉの３番目の棒グラフに示すように、ｍＲＮＡ定量データを提示モデル中に組み入れる「例示的なモデル、ＲＮＡあり」モデルは、およそ３０％のＰＰＶ値を示し、これは、ｍＲＮＡ定量測定値を伴わない例示的な提示モデルと比較して、ほぼ１０％の性能の増大である。
したがって、結果は、図１３Ｈにおける知見から期待されるように、ｍＲＮＡ発現は、実際にペプチド予測の強い予測因子であり、それにより、計算的複雑性の非常に少ない付加しか伴わずに提示モデルの性能の有意な改善が可能になることを示す。
ＸＩＩ．Ｊ．ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｃ ＊ １６：０４について決定されたパラメータの例
図１３Ｊは、図１３Ｉに関して説明した「例示的なモデル、ＲＮＡあり」提示モデルによって生成された結果と、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上しない従来の技術水準モデルによって予測された結果との間で、異なるペプチド長についてのペプチド提示の確率を比較する。結果は、図１３Ｉからの「例示的なモデル、ＲＮＡあり」の例示的な提示モデルが、異なる長さのペプチドにわたって尤度の変動を捕捉したことを示した。
横軸は、長さ８、９、１０、及び１１を有するペプチドの試料を意味した。縦軸は、ペプチドの長さに条件付けられたペプチド提示の確率を意味した。「真（盲検データ）」のプロットは、試料試験データセット中のペプチドの長さに応じた、提示されるペプチドの割合を示した。提示尤度は、ペプチドの長さと共に変動した。例えば、図１３Ｊに示すように、標準的なＨＬＡ－Ａ２ Ｌ／Ｖアンカーモチーフを有する１０マーペプチドは、同じアンカー残基を有する９マーよりも、提示される可能性がおよそ３倍低かった。「長さを無視するモデル」のプロットは、ペプチド長を無視する従来の技術水準モデルが、提示予測のために同じ試験データセットに適用された場合の、予測された測定値を示した。これらのモデルは、ペプチド長に応じたペプチド提示における変動を考慮に入れない、バージョン４．０の前のＮｅｔＭＨＣバージョン、バージョン３．０の前のＮｅｔＭＨＣｐａｎバージョン、及びＭＨＣｆｌｕｒｒｙであってもよい。図１３Ｊに示すように、提示されるペプチドの割合は、ペプチド長の異なる値にわたって一定であることになり、これらのモデルは、長さに応じたペプチド提示における変動を捕捉できないであろうことが示される。「実施例モデル、ＲＮＡあり」のプロットは、「実施例モデル、ＲＮＡあり」提示モデルから生成された測定値を示した。図１３Ｊに示すように、「実施例モデル、ＲＮＡあり」モデルによって生成された測定値は、「真（盲検データ）」に示すものに密接に追従し、長さ８、９、１０、及び１１についてのペプチド提示の異なる程度を正確に説明した。
したがって、結果は、本明細書に提示したような例示的な提示モデルが、９マーペプチドについてだけではなく、ＨＬＡクラスＩアレルにおいて提示されるペプチドの最大４０％を占める、８～１５の他の長さのペプチドについても、改善された予測を生成したことを示した。
ＸＩＩ．Ｋ．ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｃ＊１６：０４について決定されたパラメータの例
以下は、ｈによって意味されるＭＨＣアレルＨＬＡ－Ｃ＊１６：０４について、アレルごと提示モデル（等式（２））のバリエーションについて決定されたパラメータのセットを示し：
Figure 2023123766000090
式中、ｒｅｌｕ（・）は、正規化線形ユニット（ＲＥＬＵ：ｒｅｃｔｉｆｉｅｄｌｉｎｅａｒｕｎｉｔ）関数であり、Ｗｈ １、ｂｈ １、Ｗｈ ２、及びｂｈ ２は、モデルについて決定されたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数ｘｈ ｋは、ペプチド配列からなる。Ｗｈ １の次元は（２３１ｘ２５６）であり、ｂｈ １の次元は（１ｘ２５６）であり、Ｗｈ ２の次元は（２５６ｘ１）であり、かつｂｈ ２はスカラーである。証明の目的で、ｂｈ １、ｂｈ ２、Ｗｈ １、及びＷｈ ２の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する国際公開第ＷＯ２０１７１０６６３８号に詳細に記載されている。
ＸＩＩ．Ｌ．ＭＨＣ ＩＩ 実施例１
ＭＨＣクラスＩＩ新生抗原を決定するための方法については、その教示するところのすべてを本明細書に援用する、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８４３８号により詳細に記載されている。
図１３Ｋは、質量分析を用いたヒト腫瘍細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上のクラスＩＩ ＭＨＣアレルから溶出されたペプチドの長さのヒストグラムである。具体的には、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１ホモ接合体アレル（「データセット１」）及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１の複数アレル試料（「データセット２」）に対して質量分析ペプチドミクスを行った。結果は、クラスＩＩ ＭＨＣアレルから溶出されたペプチドの長さは、アミノ酸６～３０個の範囲であることを示している。図１３Ｋに示される頻度分布は、参考文献９１の図１Ｃに示される、最新の質量分析法を用いてクラスＩＩ ＭＨＣから溶出されたペプチドの長さと同様である。
図１３Ｌは、データセット１及びデータセット２についてｍＲＮＡ定量化と残基当たりの提示ペプチドとの依存関係を示す。結果は、ｍＲＮＡの発現とクラスＩＩ ＭＨＣアレルのペプチド提示との間には強い依存関係があることを示している。
具体的には、図１３Ｂの横軸は、ｌｏｇ１０（ビン１００万個当たりの転写物（ＴＰＭ））で表したｍＲＮＡの発現を示す。図１３Ｌの縦軸は、残基当たりのペプチド提示量を、１０－２＜ｌｏｇ１０ＴＰＭ＜１０－１の間のｍＲＮＡ発現量に対応した最も低いビンの倍数として示したものである。一方の実線は、データセット１のｍＲＮＡ定量化及びペプチド提示に関連したプロットであり、別の実線はデータセット２のものである。図１３Ｌに示されるように、ｍＲＮＡ発現量と対応する遺伝子内の残基当たりのペプチド提示量との間には強い相関がある。具体的には、ＲＮＡ発現量が１０１＜ｌｏｇ１０ＴＰＭ＜１０２の範囲である遺伝子からのペプチドは、最低のビンと比較して提示される可能性が５倍以上高い。
これらの結果は、ｍＲＮＡ定量の測定値がペプチド提示を強く予測することから、これらの測定値を取り入れることにより、提示モデルの性能が大幅に改善されうることを示す。
図１３Ｍは、データセット１及びデータセット２を用いて訓練及び試験した例示的な提示モデルの性能結果を比較したものである。例示的な提示モデルのモデル特性の各セットについて、図１３Ｍは、そのモデル特性のセットの中の特性がアレル相互作用特性として分類される場合、あるいはそのモデル特性のセットの中の特性がアレル非相互作用特性変数として分類される場合の１０％リコールでのＰＰＶ値を示している図１３Ｍにみられるように、例示的な提示モデルのモデル特性の各セットについて、そのモデル特性のセットの中の特性がアレル相互作用特性として分類される場合に特定された１０％リコールでのＰＰＶ値が左側に示され、そのモデル特性のセットの中の特性がアレル非相互作用特性として分類される場合に特定された１０％リコールでのＰＰＶ値が右側に示されている。ペプチド配列の特性は、図１３Ｍの目的では常にアレル相互作用特性として分類された点に注目されたい。結果は、この提示モデルによって１４％～２９％の範囲の１０％リコールでのＰＰＶ値が実現され、この値はランダム予想におけるＰＰＶよりも有意に高い（およそ５００倍）ことを示している。
この実験では、９～２０個の長さのペプチド配列を検討した。データを、訓練、検証、及び試験セットに分けた。データセット１及びデータセット２の両方からの５０個の残基のペプチドのブロックを訓練セット及び試験セットに割り当てた。プロテオーム内のどこかで複製されたペプチドを除去し、訓練セットと試験セットの両方に現れるペプチド配列がないようにした。訓練セット及び試験セットにおけるペプチド提示の出現率は、非提示ペプチドを除去することにより５０倍増加した。これは、データセット１及びデータセット２が、細胞の一部のみがクラスＩＩ ＨＬＡアレルであるヒト腫瘍試料由来のものであり、クラスＩＩ ＨＬＡアレルの純粋な試料よりもおよそ１０倍低いペプチド収率となり、それでもなお、不完全な質量分析の感度による過小評価であることによる。訓練セットは、１０６４個の提示ペプチド及び３，８１０，０７０個の非提示ペプチドを含んでいた。試験セットは、３１４個の提示ペプチド及び８０７，４００個の非提示ペプチドを含んでいた。
実施例モデル１は、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）、及びアイデンティティー関数ｒ（・）を用いた式（２２）の関数の総和モデルとした。ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）は、２５６個の隠れノード及び正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化を伴う多層パーセプトロン（ＭＬＰ）として構造化した。ペプチド配列以外に、アレル相互作用変数ｗは、ワン・ホットコード化されたＣ末端及びＮ末端フランキング配列、ペプチドｐｉのソース遺伝子の添え字Ｇ＝ｇｅｎｅ（ｐｉ）を示すカテゴリー変数、及びｍＲＮＡ定量測定値を示す変数を含んでいた。実施例モデル２は、Ｃ末端及びＮ末端フランキング配列をアレル相互作用変数から省略した点以外は、実施例モデル１と同じものとした。実施例モデル３は、ソース遺伝子の添え字をアレル相互作用変数から省略した点以外は、実施例モデル１と同じものとした。実施例モデル４は、ｍＲＮＡ測定値をアレル相互作用変数から省略した点以外は、実施例モデル１と同じものとした。
実施例モデル５は、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）、ｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）、アイデンティティー関数ｒ（・）、及び式（１２）の依存性関数ｇｗ（・）を用いた式（２０）の関数の総和モデルとした。依存性関数ｇｗ（・）は、ｍＲＮＡ定量測定値を入力とし、１６個の隠れノード及び正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化を伴うＭＬＰとして構造化したネットワークモデル、及びＣ末端フランキング配列を入力とし、３２個の隠れノード及び正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化を伴うＭＬＰとして構造化したネットワークモデルも含んでいた。ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）は、２５６個の隠れノード及び正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化を伴う多層パーセプトロンとして構造化した。実施例モデル６は、Ｃ末端及びＮ末端フランキング配列のネットワークモデルを省略した点以外は、実施例モデル５と同じものとした。実施例モデル７は、ソース遺伝子の添え字をアレル非相互作用変数から省略した点以外は、実施例モデル５と同じものとした。実施例モデル８は、ｍＲＮＡ定量測定値のネットワークモデルを省略した点以外は、実施例モデル５と同じものとした。
試験セット内の提示ペプチドの出現率はおよそ１／２４００であり、したがって、ランダム予想のＰＰＶもおよそ１／２４００＝０．０００４２となるであろう。図１３Ｍに示されるように、最も精度のよい提示モデルではおよそ２９％のＰＰＶ値が実現され、この値はランダム予想のＰＰＶ値よりもおよそ５００倍良好である。
ＸＩＩ．Ｍ．ＭＨＣ ＩＩ 実施例２
図１３Ｎは、ＨＬＡクラスＩＩ分子を含む合計３９種の試料の各試料について質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示すヒストグラムである。さらに、複数の試料の各試料について、図１３Ｎに示されるヒストグラムは、異なるｑ値の閾値で質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示している。具体的には、複数の試料の各試料について、図１３Ｎは、０．０１未満のｑ値、０．０５未満のｑ値、及び０．２未満のｑ値で質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示している。
上記に述べたように、図１３Ｎの３９種の試料の各試料は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を含んでいた。より具体的には、図１３Ｎの３９種の試料の各試料はＨＬＡ－ＤＲ分子を含んでいた。ＨＬＡ－ＤＲ分子は、ＨＬＡクラスＩＩ分子の一種である。さらにより具体的には、図１３Ｎの３９種の試料の各試料は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４分子、及び／またはＨＬＡ－ＤＲＢ５分子を含んでいた。ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４分子、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５分子は、ＨＬＡ－ＤＲ分子の種類である。
この特定の実験は、ＨＬＡ－ＤＲ分子、特にＨＬＡ－ＤＲＢ１分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４分子、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５分子を含む試料を用いて行ったが、代替的な実施形態では、この実験はＨＬＡクラスＩＩ分子の任意の種類（複数可）のうちの１つ以上を含む試料を用いて行うことができる。例えば、代替的な実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰ及び／またはＨＬＡ－ＤＱ分子を含む試料を用いて同じ実験を行うことができる。同じ方法を用いて任意の種類（複数可）のＭＨＣクラスＩＩ分子をモデル化し、なおも信頼性の高い結果を得ることが可能であることは、当業者には周知である。例えば、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｋａｍｉｌｌａ Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．７６は、ＨＬＡ－ＤＲ分子に対する、ならびにＨＬＡ－ＤＰ及びＨＬＡ－ＤＱ分子に対する結合親和性をモデル化するために同じ方法を用いている最近の科学論文の一例である。したがって、当業者であれば、本明細書に記載される実験及びモデルを用いることで、ＨＬＡ－ＤＲ分子のみでなく、他の任意のＭＨＣクラスＩＩ分子を別々または同時にモデル化し、なおも信頼性の高い結果を得ることができる点は理解されよう。
合計３９種の試料の各試料のペプチドをシークエンシングすため、各試料について質量分析を行った。試料について得られた質量スペクトルをＣｏｍｅｔで検索し、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒでスコアリングしてペプチドをシークエンシングした。次いで、試料中でシークエンシングされたペプチドの量を複数の異なるＰｅｒｃｏｌａｔｏｒのｑ値の閾値について特定した。具体的には、その試料について、０．０１未満のＰｅｒｃｏｌａｔｏｒのｑ値、０．０５未満のＰｅｒｃｏｌａｔｏｒのｑ値、及び０．２未満のＰｅｒｃｏｌａｔｏｒのｑ値を用いてシークエンシングしたペプチドの量を決定した。
３９種の試料の各試料について、異なるＰｅｒｃｏｌａｔｏｒのｑ値の閾値のそれぞれでシークエンシングしたペプチドの量を図１３Ｎに示す。例えば、図１３Ｎにみられるように、第１の試料では、０．２未満のｑ値で、質量分析を用いておよそ４０００種のペプチドがシークエンシングされ、０．０５未満のｑ値で、質量分析を用いておよそ２８００種のペプチドがシークエンシングされ、０．０１未満のｑ値で、質量分析を用いておよそ２３００種のペプチドがシークエンシングされた。
全体として、図１３Ｎは、質量分析を用いてＭＨＣクラスＩＩ分子を含有する試料から大量のペプチドを、低いｑ値でシークエンシングすることができることを示している。換言すると、図１３Ｎに示されるデータは、質量分析を用いて、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されうるペプチドを高い信頼度でシークエンシングすることができることを実証するものである。
図１３Ｏは、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子のアレルが同定された試料の量を示すヒストグラムである。より具体的には、図１３Ｏは、ＨＬＡクラスＩＩ分子を含む合計で３９種の試料について、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子が同定された試料の量を示している。
図１３Ｎに関して上記に述べたように、図１３Ｎの３９種の試料の各試料は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４分子、及び／またはＨＬＡ－ＤＲＢ５分子を含んでいた。したがって、図１３Ｏは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３分子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４分子、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５分子について特定のアレルが同定された試料の量を示している。試料中に存在するＨＬＡアレルを同定するには、その試料についてＨＬＡクラスＩＩ ＤＲのタイピングを行う。次いで、特定のＨＬＡアレルが同定された試料の量を特定するには、ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲのタイピングを用いてＨＬＡアレルが同定された試料の数を単純に合計する。例えば、図１３Ｏに示されるように、合計で３９種の試料のうちの１９種の試料が、ＨＬＡクラスＩＩ分子のアレルＨＬＡ－ＤＲＢ４＊０１：０３を含んでいた。換言すると、合計で３９種の試料のうちの１９種の試料がＨＬＡ－ＤＲＢ４分子についてアレルＨＬＡ－ＤＲＢ４＊０１：０３を含んでいた。全体として、図１３Ｏは、ＨＬＡクラスＩＩ分子を含む３９種の試料から広範囲のＨＬＡクラスＩＩ分子のアレルを同定することができることを示している。
図１３Ｐは、合計で３９種の試料中でＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの割合を、一定範囲のペプチド長の各ペプチド長について示したヒストグラムである。合計で３９種の試料の各試料中の各ペプチドの長さを決定するため、各ペプチドを図１３Ｎに関して上記に述べたような質量分析を用いてシークエンシングし、次いでシークエンシングしたペプチド中の残基の数を単純に定量した。
上記に述べたように、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、一般的にはアミノ酸９～２０個の長さを有するペプチドを提示する。したがって、図１３Ｐは、アミノ酸９～２０個の各ペプチド長について３９種の試料中のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの割合を示している。例えば、図１３Ｐに示されるように、３９種の試料中のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドのおよそ２２％がアミノ酸１４個の長さを有している。
図１３Ｐに示されるデータに基づけば、３９種の試料中のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの最頻長は、アミノ酸１４個及び１５個の長さと特定された。３９種の試料中のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドについて特定されたこれらの最頻長は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの最頻長についての以前の報告と一致する。さらに、やはり以前の報告と一致するように、図１３Ｐのデータは、３９種の試料に由来するＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの６０％超がアミノ酸１４個及び１５個以外の長さを有することを示している。換言すれば、図１３Ｐは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドは最も高頻度でアミノ酸１４個または１５個の長さであるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドの大きな割合がアミノ酸１４個でも１５個でもない長さであることを示している。したがって、すべての長さのペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される等しい確率を有する、またはアミノ酸１４個または１５個の長さを有するペプチドのみがＭＨＣＩＩクラス分子によって提示されると仮定することは正確でない仮定である。図１３Ｔに関して下記に詳細に述べるように、これらの誤った仮定は、ＭＨＣクラスＩＩ分子による提示を予測するための多くの最新のモデルで現在用いられており、したがって、これらのモデルにより予想される提示尤度はしばしば信頼性が低い。
図１３Ｑは、３９種の試料中に存在する遺伝子について、遺伝子発現とＭＨＣクラスＩＩ分子による遺伝子発現産物の提示の出現率との間の関係を示す線グラフである。より具体的には、図１３Ｑは、遺伝子発現と、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドのＮ末端を形成する、その遺伝子発現より生ずる残基の割合との間の関係を示している。合計で３９種の試料の各試料中の遺伝子発現を定量化するため、各試料中に含まれるＲＮＡにＲＮＡシークエンシングを行う。図１３Ｑでは、遺伝子発現は、１００万当たりの転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＴＰＭ）の単位でＲＮＡシークエンシングによって測定されている。３９種の試料の各試料について遺伝子発現の提示の出現率を特定するため、ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲペプチドプチドームデータの同定を各試料について行った。
図１３Ｑに示されるように、３９種の試料について、遺伝子発現レベルと、ＭＨＣクラスＩＩ分子による発現遺伝子産物の残基の提示との間には強い相関が認められる。具体的には、図１３Ｑに示されるように、発現レベルの最も低い遺伝子の発現から生じるペプチドは、発現レベルの最も高い遺伝子の発現から生じるペプチドと比較して、１００倍以上、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されにくい。より簡単に言えば、より高度に発現される遺伝子の産物はＭＨＣクラスＩＩ分子によってより高頻度で提示される。
図１３Ｈ～Ｊは、ペプチドの試験データセット内のペプチドが、試験データセット内に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも１つによって提示される尤度を予想するうえでの異なる提示モデルの性能を比較した線グラフである。図１３Ｈ～Ｊに示されるように、あるペプチドが試験データセット内に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも１つによって提示される尤度を予想するうえでのモデルの性能は、そのモデルによって生成される各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を特定することにより決定される。所定のモデルについて特定されたこれらの比は、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（受信者動作特性）曲線として、ｘ軸が偽陽性率を定量化し、ｙ軸が真の陽性率を定量化した線グラフにおいて可視化することが可能である。曲線下面積（ＡＵＣ）を用いてモデルの性能を定量化する。具体的には、ＡＵＣが大きいモデルほど、ＡＵＣが小さいモデルと比較してより高い性能（すなわちより高い精度）を有する。図１３Ｈ～Ｊにおいて、傾き１の黒い破線（偽陽性率に対する真の陽性率の比が１）は、ランダムに推定されたペプチド提示の尤度の予想曲線を示す。破線のＡＵＣは０．５である。ＲＯＣ曲線及びＡＵＣの計測については、上記のセクションＸＩＩの前半部分に関して詳細な考察がなされている。
図１３Ｒは、アレル相互作用及びアレル非相互作用変数の異なるセットが与えられた場合に、ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの５つの実施例モデルの性能を比較した線グラフである。換言すれば、図１３Ｒは、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの異なるアレル相互作用及びアレル非相互作用変数の相対的な重要度を定量化するものである。
図１３Ｒの線グラフのＲＯＣ曲線を作成するために用いた５つの例示的モデルの各例示的提示モデルのモデルアーキテクチャは、５つのシグモイド総和モデルの集合からなる。集合内の各シグモイド総和モデルは、試料当たり最大で４つの固有のＨＬＡ－ＤＲアレルについてペプチド提示をモデル化するように構成した。さらに、集合内の各シグモイド総和モデルは、以下のアレル相互作用及びアレル非相互作用変数、すなわち、ペプチド配列、フランキング配列、ＴＰＭ単位のＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を行うように構成した。集合内の各シグモイド総和モデルのアレル相互作用成分は、２５６個の隠れユニットとしてＲｅＬＵ活性化を伴う１隠れ層のＭＬＰであった。
ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を例示的モデルを用いて予想するのに先立って、例示的モデルを訓練及び検証した。例示的モデルを訓練、検証、及び最終的に試験するため、３９種の試料について上記に述べたデータを訓練、検証、及び試験データセットに分けた。
訓練、検証、及び試験データセットのうちの複数のデータセットにペプチドが現れないようにするため、以下の手順を行った。最初に、プロテオーム内の複数の位置に現れた、合計３９種の試料に由来するすべてのペプチドを除去した。次いで、合計３９種の試料に由来するペプチドを１０個の隣接するペプチドのブロックに分割した。合計３９種の試料に由来するペプチドの各ブロックを、訓練データセット、検証データセット、または試験データセットに個々に割り当てた。これにより、訓練、検証、及び試験データセットの複数のデータセットに現れるペプチドはなくなった。
合計３９種の試料中の２８，０８１，９４４種のペプチドのうち、訓練データセットは、合計３９種の試料のうちの３８種に由来するＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示された２１，０７７種のペプチドで構成されていた。訓練データセットに含まれる２１，０７７種のペプチドは、アミノ酸９～２０個の長さであった。図１３ＲのＲＯＣカーブを作成するために用いた実施例モデルを、ＡＤＡＭ ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ及び早期終了（ｅａｒｌｙ ｓｔｏｐｐｉｎｇ）を用いて訓練データセット上で訓練した。
検証データセットは、訓練データセットで用いられた同じ３８種の試料に由来するＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示された２，３４６種のペプチドで構成されていた。検証セットは、早期停止のためだけに用いた。
試験データセットは、質量分析を用いて腫瘍試料から同定されたＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されたペプチドで構成されていた。具体的には、試験データセットは、腫瘍試料から同定されたＭＨＣクラスＩＩ分子、具体的には、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ４＊０１：０３、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１：０１分子によって提示された２０３種のペプチドで構成されていた。試験データセットに含まれるペプチドは、上記に述べた訓練データセットからは除外されていた。
上記に述べたように、図１３Ｒは、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの異なるアレル相互作用変数及びアレル非相互作用変数の相対的な重要度を定量化するものである。やはり上記に述べたように、図１３Ｒの線グラフのＲＯＣ曲線を作成するために用いた例示的モデルは、以下のアレル相互作用及びアレル非相互作用変数、すなわち、ペプチド配列、フランキング配列、ＴＰＭ単位のＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を行うように構成した。ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するためにこれら５つの変数（ペプチド配列、フランキング配列、ＲＮＡ発現、及び遺伝子識別子）のうちの４つの変数の相対的な重要度を定量化するため、上記に述べた５つの例示的モデルの各例示的モデルを、４つの変数の異なる組み合わせを用いて、試験データセットからのデータを用いて試験した。具体的には、試験データセットの各ペプチドについて、例示的モデル１は、ＲＮＡ発現を除いた、ペプチド配列、フランキング配列、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。同様に、試験データセットの各ペプチドについて、例示的モデル２は、フランキング配列を除いた、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。同様に、試験データセットの各ペプチドについて、例示的モデル３は、ペプチド配列を除いた、フランキング配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。同様に、試験データセットの各ペプチドについて、例示的モデル４は、遺伝子識別子を除いた、フランキング配列、ＲＮＡ発現、ペプチド配列、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。最後に、試験データセットの各ペプチドについて、例示的モデル５は、フランキング配列、ＲＮＡ発現、ペプチド配列、遺伝子識別子、及び試料識別子の５つの変数のすべてに基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。
これら５つの実施例モデルのそれぞれの性能を図１３Ｒの線グラフに示す。具体的には、５つの実施例モデルのそれぞれは、モデルによって生成された各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を示すＲＯＣ曲線に関連付けられる。例えば、図１３Ｒは、ＲＮＡ発現を除いた、ペプチド配列、フランキング配列、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル１の曲線を示している。図１３Ｒは、フランキング配列を除いた、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル２の曲線を示している。図１３Ｒはまた、ペプチド配列を除いた、フランキング配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル３の曲線も示している。図１３Ｒはまた、遺伝子識別子を除いた、フランキング配列、ＲＮＡ発現、ペプチド配列、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル４の曲線も示している。そして最後に、図１３Ｒは、フランキング配列、ＲＮＡ発現、ペプチド配列、試料識別子、及び遺伝子識別子の５つの変数のすべてに基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル５の曲線を示している。
上記に述べたように、あるペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでのモデルの性能は、そのモデルによって生成された各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を示すＲＯＣ曲線のＡＵＣを特定することによって定量化される。ＡＵＣが大きいモデルほど、ＡＵＣが小さいモデルと比較してより高い性能（すなわちより高い精度）を有する。図１３Ｒに示されるように、フランキング配列、ＲＮＡ発現、ペプチド配列、試料識別子、及び遺伝子識別子の５つの変数のすべてに基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル５の曲線は０．９８と最も高いＡＵＣを実現した。したがって、ペプチド提示の予想を生成するために５つの変数すべてを用いた実施例モデル５は、最良の性能を実現した。フランキング配列を除いた、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル２の曲線は、０．９７と２番目に高いＡＵＣを実現した。したがって、フランキング配列は、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえで最も重要度の低い変数として特定することができる。遺伝子識別子を除いた、フランキング配列、ＲＮＡ発現、ペプチド配列、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル４の曲線は、０．９６と３番目に高いＡＵＣを実現した。したがって、遺伝子識別子は、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえで２番目に重要度の低い変数として特定することができる。ペプチド配列を除いた、フランキング配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル３の曲線は、０．８８と最も低いＡＵＣを実現した。したがって、ペプチド配列は、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえで最も重要な変数として特定することができる。ＲＮＡ発現を除いた、ペプチド配列、フランキング配列、遺伝子識別子、及び試料識別子に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した実施例モデル１の曲線は、０．９５と２番目に低いＡＵＣを実現した。したがって、ＲＮＡ発現は、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえで２番目に重要な変数として特定することができる。
図１３Ｓは、ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの４つの異なる提示モデルの性能を比較した線グラフである。
図１３Ｓで試験される第１のモデルは、本明細書では「完全非相互作用モデル」と呼ばれる。完全非相互作用モデルは、アレル非相互作用変数ｗｋ及びアレル相互作用変数ｘｈ ｋが例えばニューラルネットワークのような別々の依存性関数に入力された後、これらの別々の依存性関数の出力が加え合わされる、上記に述べた提示モデルの一実施形態である。具体的には、完全非相互作用モデルは、アレル非相互作用変数ｗｋが依存性関数ｇｗに入力され、アレル相互作用変数ｘｈ ｋが別の依存性関数ｇｈに入力され、依存性関数ｇｗと依存性関数ｇｈの出力が互いに加え合わされる、上記に述べた提示モデルの一実施形態である。したがって、いくつかの実施形態では、完全非相互作用モデルは、上記に示した式８を用いてペプチド提示の尤度を決定する。さらに、アレル非相互作用変数ｗｋが依存性関数ｇｗに入力され、アレル相互作用変数ｘｈ ｋが別の依存性関数ｇｈに入力され、依存性関数ｇｗと依存性関数ｇｈの出力が加え合わされる完全非相互作用モデルの実施形態は、セクションＸ．Ｂ．２．の前半部分、セクションＸ．Ｂ．３．の後半部分、セクションＸ．Ｃ．３．の前半部分、及びセクションＸ．Ｃ．６．の前半部分に関して上記に詳細に述べられている。
図１３Ｓで試験される第２のモデルは、本明細書では「完全相互作用モデル」と呼ばれる。完全相互作用モデルは、例えばニューラルネットワークのような別々の依存性関数に入力される前にアレル非相互作用変数ｗｋがアレル相互作用変数ｘｈ ｋと直接連結される、上記に述べた提示モデルの一実施形態である。したがって、いくつかの実施形態では、完全相互作用モデルは、上記に示した式９を用いてペプチド提示の尤度を決定する。さらに、変数が依存性関数に入力される前にアレル非相互作用変数ｗｋがアレル相互作用変数ｘｈ ｋと連結される完全相互作用モデルの実施形態は、セクションＸ．Ｂ．２．の後半部分、セクションＸ．Ｃ．２．の後半部分、及びセクションＸ．Ｃ．５．の後半部分に関して上記に詳細に述べられている。
図１３Ｓで試験される第３のモデルは、本明細書では「ＣＮＮモデル」と呼ばれる。ＣＮＮモデルは、畳み込みニューラルネットワークで構成され、上記に述べた完全非相互作用モデルと類似している。しかしながら、ＣＮＮモデルの畳み込みニューラルネットワークの層は、完全非相互作用モデルのニューラルネットワークの層とは異なっている。具体的には、ＣＮＮモデルの畳み込みニューラルネットワークの入力層は、２０マーペプチドストリングを受け入れ、続いてこの２０マーペプチドストリングを（ｎ，２０，２１）テンソルとして埋め込む。ＣＮＮモデルの畳み込みニューラルネットワークの次の各層は、ストライドが１でサイズ５の１Ｄ畳み込みカーネル層、グローバル最大プーリング層、ｐ＝０．２のドロップアウト層、及び最後にＲｅＬｕ活性化を伴う全結合３４ノード層からなる。
図１３Ｓで試験される第４及び最後のモデルは、本明細書では「ＬＳＴＭモデル」と呼ばれる。ＬＳＴＭモデルは、長期短期記憶ニューラルネットワークで構成される。ＬＳＴＭモデルの長期短期記憶ニューラルネットワークの入力層は、２０マーペプチドストリングを受け入れ、続いてこの２０マーペプチドストリングを（ｎ，２０，２１）テンソルとして埋め込む。ＬＳＴＭモデルの長期短期記憶ニューラルネットワークの次の各層は、１２８個のノードを有する長期短期記憶層、ｐ＝０．２のドロップアウト層、及び最後にＲｅＬｕ活性化を伴う全結合３４ノード層からなる。
ペプチドのデータセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するために図１３Ｓの４つのモデルのそれぞれを使用するのに先立って、各モデルを上記に述べた３８種の試料の訓練データセットを用いて訓練し、上記に述べた検証データセットを用いて検証した。各モデルのこの訓練及び検証に続き、４つのモデルのそれぞれを上記に述べた除外された３９番目の試料の試験データセットを用いて試験した。具体的には、４つのモデルのそれぞれについて、試験データセットの各ペプチドをモデルに入力し、続いてモデルがそのペプチドの提示尤度を出力した。
これら４つのモデルのそれぞれの性能を図１３Ｓの線グラフに示す。具体的には、４つのモデルのそれぞれは、モデルによって生成された各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を示すＲＯＣ曲線に関連付けられる。例えば、図１３Ｓは、ＣＮＮモデルのＲＯＣ曲線、完全相互作用モデルのＲＯＣ曲線、ＬＳＴＭモデルのＲＯＣ曲線、及び完全非相互作用モデルのＲＯＣ曲線を示している。
上記に述べたように、あるペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでのモデルの性能は、そのモデルによって生成された各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を示すＲＯＣ曲線のＡＵＣを特定することによって定量化される。ＡＵＣが大きいモデルほど、ＡＵＣが小さいモデルと比較してより高い性能（すなわちより高い精度）を有する。図１３Ｓに示されるように、完全相互作用モデルの曲線は０．９８２と最も高いＡＵＣを実現した。したがって、完全相互作用モデルは最良の性能を実現した。完全非相互作用モデルの曲線は、０．９７７と２番目に高いＡＵＣを実現した。したがって、完全非相互作用モデルは２番目に良好な性能を実現した。ＣＮＮモデルの曲線は、０．９４７と最も低いＡＵＣを実現した。したがって、ＣＮＮモデルは最も悪い性能となった。ＬＳＴＭモデルの曲線は、０．９５２と２番目に低いＡＵＣを実現した。したがって、ＬＳＴＭモデルは２番目に悪い性能となった。しかしながら、図１３Ｓで試験したすべてのモデルが０．９よりも大きいＡＵＣを有している点に注目されたい。したがって、モデル間のアーキテクチャの相違にもよらず、図１３Ｓで試験したすべてのモデルは、ペプチド提示の比較的正確な予想を実現することが可能である。
図１３Ｔは、２つの異なる基準が与えられた２つの例示的なベスト・イン・クラスの従来モデル、ならびにアレル相互作用変数及びアレル非相互作用変数の２つの異なるセットが与えられた２つの実施例提示モデルの、ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでの性能を比較した線グラフである。具体的には、図１３Ｔは、予想を生成するうえで最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３で予想された結合親和性を基準として用いる実施例のベスト・イン・クラス従来モデル（実施例モデル１）、予想を生成するうえで最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３で予想された結合ランクを基準として用いる実施例のベスト・イン・クラス従来モデル（実施例モデル２）、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成する実施例モデル（実施例モデル４）、ならびに、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成する実施例モデル（実施例モデル３）の性能を比較した線グラフである。
図１３Ｔにおいて実施例モデル１及び実施例モデル２として用いられているベスト・イン・クラス従来モデルは、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルである。ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成する。ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３のウェブサイト（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／， ＰＭＩＤ ２９３１５５９８）７６を用いて試験した。
上記に述べたように、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは２つの基準にしたがって試験した。具体的には、実施例モデル１は、最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３で予想された結合親和性にしたがってペプチド提示尤度の予想を生成し、実施例モデル２は、最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３で予想された結合ランクにしたがってペプチド提示尤度の予想を生成した。
実施例モデル３及び実施例モデル４として用いられている提示モデルは、質量分析によって得られたデータを用いて訓練される、本明細書に開示される提示モデルの実施形態である。上記に述べたように、提示モデルは、アレル相互作用及びアレル非相互作用変数の２つの異なるセットに基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。具体的には、実施例モデル４は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列（ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルで用いたものと同じ変数）に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成し、実施例モデル３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてペプチド提示尤度の予想を生成した。
ペプチドの試験データセット内のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を図１３Ｔの例示的モデルを用いて予想するのに先立って、各モデルを訓練及び検証した。ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデル（実施例モデル１及び実施例モデル２）は、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ， www.iedb.org）に蓄積されたＨＬＡペプチド結合親和性アッセイに基づいてそれ自体の訓練及び検証データセットを用いて訓練及び検証した。ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルを訓練するために使用される訓練データセットは、ほとんど１５マーペプチドのみで構成されることが知られている。これに対して、実施例モデル３及び４は、図１３Ｒに関して上記に述べた訓練データセットを用いて訓練し、図１３Ｒに関して上記に述べた検証データセットを用いて検証した。
各モデルの訓練及び検証に続き、モデルのそれぞれを試験データセットを用いて試験した。上記に述べたように、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルはほとんど１５マーペプチドのみで構成されたデータセットで訓練されるが、これはＮｅｔＭＨＣＩＩ３．２が異なる重さのペプチドに異なる優先順位を与えることができないことを意味し、これにより、すべての長さのペプチドを含むＨＬＡクラスＩＩの提示の質量分析データに対するＮｅｔＭＨＣＩＩ３．２の予想性能が低下する。したがって、変動するペプチド長によって影響されないモデル間の適正な比較を与えるため、試験データセットは１５マーペプチドのみを含むものとした。具体的には、試験データセットは、９３３種の１５マーペプチドで構成されるものとした。試験データセット内の９３３種のペプチドのうちの４０種は、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、具体的には、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ４＊０１：０３、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１：０１分子により提示された。試験データセットに含まれるペプチドは、上記に述べた訓練データセットからは除外されていた。
試験データセットを用いて各実施例モデルを試験するため、実施例モデルのそれぞれについて、試験データセット内の９３３種のペプチドの各ペプチドについて、モデル によってペプチドの提示尤度の予想を生成した。具体的には、試験データセット内の各ペプチドについて、実施例１のモデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるそのペプチドの提示スコアを、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列を用い、試験データセット内の４つのＨＬＡクラスＩＩ ＤＲアレルにわたって最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想された結合親和性によってペプチドをランク付けすることにより生成した。同様に、試験データセット内の各ペプチドについて、実施例２のモデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるそのペプチドの提示スコアを、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列を用い、試験データセット内の４つのＨＬＡクラスＩＩ ＤＲアレルにわたって最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想された結合ランク（すなわち、ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化した結合親和性）によってペプチドをランキングすることにより生成した。試験データセット内の各ペプチドについて、実施例４のモデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列に基づいてＭＨＣクラスＩＩ分子によるそのペプチドの提示尤度を生成した。同様に、試験データセット内の各ペプチドについて、実施例３のモデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてＭＨＣクラスＩＩ分子によるそのペプチドの提示尤度を生成した。
これら４つの実施例モデルのそれぞれの性能を図１３Ｔの線グラフに示す。具体的には、４つの実施例モデルのそれぞれは、モデルによって生成された各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を示すＲＯＣ曲線に関連付けられる。例えば、図１３Ｔは、予想を生成するために最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想された結合親和性を用いた実施例１のモデルのＲＯＣ曲線、予想を生成するために最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想された結合ランクを用いた実施例２のモデルのＲＯＣ曲線、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列に基づいてペプチド提示尤度を生成した実施例４のモデルのＲＯＣ曲線、ならびに、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてペプチド提示尤度を生成した実施例３のモデルのＲＯＣ曲線を示している。
上記に述べたように、あるペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される尤度を予想するうえでのモデルの性能は、そのモデルによって生成された各予想について偽陽性率に対する真の陽性率の比を示すＲＯＣ曲線のＡＵＣを特定することによって定量化される。ＡＵＣが大きいモデルほど、ＡＵＣが小さいモデルと比較してより高い性能（すなわちより高い精度）を有する。図１３Ｔに示されるように、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてペプチド提示尤度を生成した実施例３のモデルの曲線は、０．９５と最も高いＡＵＣを実現した。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてペプチド提示尤度を生成した実施例３のモデルは、最も良好な性能を実現した。ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列に基づいてペプチド提示尤度を生成した実施例４のモデルの曲線は、０．９１と２番目に高いＡＵＣを実現した。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子のタイプ及びペプチド配列に基づいてペプチド提示尤度を生成した実施例４のモデルは、２番目に良好な性能を実現した。予想を生成するために最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想した結合親和性を用いた実施例１のモデルの曲線は、０．７５と最も低いＡＵＣとなった。したがって、予想を生成するために最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想した結合親和性を用いた実施例１のモデルの曲線は、最も悪い性能となった。予想を生成するために最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想した結合ランクを用いた実施例２のモデルの曲線は、０．７６と２番目に低いＡＵＣとなった。したがって、予想を生成するために最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想した結合ランクを用いた実施例２のモデルの曲線は、２番目に悪い性能となった。
図１３Ｔに示されるように、実施例モデル１及び２と実施例モデル３及び４との間の性能の隔たりは大きい。具体的には、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデル（最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想した結合親和性、または最小ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３により予想した結合ランクのいずれかの基準を用いるもの）の性能は、本明細書に開示される提示モデル（ＭＨＣクラスＩＩ分子の種類及びペプチド配列、またはＭＨＣクラスＩＩ分子の種類、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、遺伝子識別子、及びフランキング配列に基づいてペプチド提示尤度を生成するもの）の性能よりもほぼ２５％低い。したがって、図１３Ｔは、本明細書に開示される提示モデルは、現在のベスト・イン・クラスの従来モデルであるＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルよりも大幅に正確な提示予想を実現することが可能であることを示すものである。
いっそうさらには、上記で述べたように、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、ほとんど１５マーペプチドのみで構成された訓練データセットで訓練される。その結果、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、どのペプチド長がＭＨＣクラスＩＩ分子によってより提示されやすいかを学習するようには訓練されない。したがって、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチド提示の尤度のその予想を、ペプチドの長さにしたがって重み付けしない。換言すれば、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチド提示の尤度のその予想をアミノ酸１５個の最頻ペプチド長の外側の長さを有するペプチドについては変更しない。その結果、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルは、アミノ酸１５個よりも長いかまたは短い長さを有するペプチドの提示の尤度を過剰に予想する。
これに対して、本明細書に開示される提示モデルは、質量分析によって得られたペプチドデータを用いて訓練されることから、すべての異なる長さのペプチドを含む訓練データセットで訓練することができる。その結果、本明細書に開示される開示モデルは、どのペプチド長がＭＨＣクラスＩＩ分子によってより提示されやすいかを学習することができる。したがって、本明細書に開示される提示モデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチド提示の尤度のその予想を、ペプチドの長さにしたがって重み付けすることができる。換言すれば、本明細書に開示される提示モデルは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチド提示の尤度のそれらの予想をアミノ酸１５個の最頻ペプチド長の外側の長さを有するペプチドについて変更することができる。その結果、本明細書に開示される提示モデルは、現在のベスト・イン・クラスの従来モデルであるＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３モデルと比較して、アミノ酸１５個よりも長いかまたは短い長さを有するペプチドについて、大幅に正確な提示予想を実現することが可能である。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチド提示の尤度を予想するために本明細書に開示される提示モデルを用いることの利点の１つである。
ＸＩＩ．Ｎ． ＭＨＣアレルについて求められるパラメータの例
以下は、クラスＩＩ ＭＨＣアレルであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１の暗黙のアレルごと提示尤度を生成する複数アレル提示モデル（式（１６））のバリエーションについて求められるパラメータのセットを示す。
ｕ＝ｅｘｐｉｔ（ｒｅｌｕ（Ｘ・Ｗ１＋ｂ１）・Ｗ２＋ｂ２）
式中、ｒｅｌｕ（・）は、正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）関数、Ｗ１、ｂ１、Ｗ２、及びｂ２は、モデルについて求められたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数Ｘは、入力ペプチド当たり１行のワン・ホットコード化され、中間パッド化された（ｍｉｄｄｌｅ－ｐａｄｄｅｄ）ペプチド配列からなる１×３９９行列に含まれる。Ｗ１の次元は（３９９×２５６）、ｂ１の次元は（１×２５６）、Ｗ２の次元は（２５６×２）、ｂ２の次元は（１×２）である。出力の第１の行は、アレルＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１によるそのペプチド配列の暗黙のアレルごとの提示の確率を示し、出力の第２の行は、アレルＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１によるそのペプチド配列の暗黙のアレルごとの提示の確率を示す。例示の目的で、Ｗ１、ｂ１、Ｗ２、及びｂ２の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８４３８号に詳細に記載されている。
ＸＩＩＩ．例示的なコンピュータ
図１４は、図１及び図３に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ１４００を説明する。コンピュータ１４００は、チップセット１４０４に連結された少なくとも１つのプロセッサ１４０２を含む。チップセット１４０４は、メモリコントローラハブ１４２０及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラハブ１４２２を含む。メモリ１４０６及びグラフィックスアダプタ１４１２は、メモリコントローラハブ１４２０に連結されており、ディスプレイ１４１８は、グラフィックスアダプタ１４１２に連結されている。記憶デバイス１４０８、入力装置１４１４、及びネットワークアダプタ１４１６は、Ｉ／Ｏコントローラハブ１４２２に連結されている。コンピュータ１４００の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
記憶デバイス１４０８は、ハードドライブ、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、ＤＶＤ、またはソリッドステートメモリ装置などの、非一時的なコンピュータ可読の記憶媒体である。メモリ１４０６は、プロセッサ１４０２によって使用される命令及びデータを保持する。入力インターフェイス１４１４は、タッチスクリーンインターフェイス、マウス、トラックボール、もしくは他のタイプのポインティングデバイス、キーボード、またはそれらのいくつかの組み合わせであり、データをコンピュータ１４００中に入力するために使用される。いくつかの実施形態において、コンピュータ１４００は、ユーザーからのジェスチャーを介して、入力インターフェイス１４１４からの入力（例えば、コマンド）を受け取るように構成されていてもよい。グラフィックスアダプタ１４１２は、ディスプレイ１４１８上に画像及び他の情報を表示する。ネットワークアダプタ１４１６は、コンピュータ１４００を、１つ以上のコンピュータネットワークに連結する。
コンピュータ１４００は、本明細書に記載した機能性を提供するためのコンピュータプログラムモジュールを遂行するように適合している。本明細書において使用される場合、「モジュール」という用語は、特定の機能性を提供するために使用されるコンピュータプログラム論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアにおいて実行されることができる。一実施形態では、プログラムモジュールは、記憶デバイス１４０８に保存され、メモリ１４０６中にロードされ、プロセッサ１４０２によって遂行される。
図１の実体によって使用されるコンピュータ１４００のタイプは、実体によって必要とされる実施形態及びプロセシングパワーに応じて変動することができる。例えば、提示特定システム１６０は、単一のコンピュータ１４００、または、例えばサーバーファームにおいてネットワークを通して互いに通信する複数のコンピュータ１４００において、起動することができる。コンピュータ１４００は、グラフィックスアダプタ１４１２及びディスプレイ１４１８などの、上記の構成要素のうちのいくつかを欠いてもよい。
ＸＩＶ．新生抗原送達ベクターの例
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に完全に説明されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい）。
ＸＩＶ．Ａ．新生抗原カセットの設計
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答（複数可）を刺激するクラスＩ ＭＨＣに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原（ＴＳＮＡ）を送達することができる。１つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはＴＳＮＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、（１）１個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いＴ細胞応答を生じることができるかどうか、（２）どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のＴＳＮＡ間に配置される最適リンカーを作るか、（３）カセット内の各エピトープの相対位置がＴ細胞応答に影響するか、（４）カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するＴ細胞応答の程度または質に影響するかどうか、（５）細胞ターゲティング配列の付加がＴ細胞応答を向上させるか。
抗原提示及びモデルカセット内のマーカーエピトープに特異的なＴ細胞応答を評価するために以下の２つの指標が開発された。すなわち、（１）特殊な操作を行ったレポーターＴ細胞の活性化によって測定される抗原提示の評価を可能としたインビトロ細胞ベーススクリーン（Ａａｒｎｏｕｄｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、及び（２）対応するエピトープ特異的Ｔ細胞応答によるヒト由来のカセットから誘導されたエピトープのワクチン接種後の免疫原性を評価するためにＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウス（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）を使用したインビボアッセイ（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
ＸＩＶ．Ｂ．新生抗原カセット設計の評価
ＸＩＶ．Ｂ．１．方法及び材料
ＴＣＲ及びカセット設計及びクローニング
選択されたＴＣＲは、Ａ＊０２０１により提示される場合にペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）（ＰＤＢ番号５Ｄ２Ｎ）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）（ＰＤＢ番号３ＲＥＶ）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）（ＰＤＢ番号１ＯＧＡ）ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）（ＰＤＢ番号１ＡＯ７）を認識する。２Ａペプチド連結ＴＣＲサブユニット（βに続きα）、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及び２Ａ連結ＣＤ８サブユニット（βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子）を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ社により合成されたものである。
インビトロエピトーププロセシング及び提示実験用の細胞株の作製
ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社より購入し、水／ＤＭＳＯ（２：８，ｖ／ｖ）に加えた１０ｍＭ ｔｒｉｓ（２－カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはＧｉｂｃｏ社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳｈｉ）はＳｅｒａｄｉｇｍ社より入手した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ基質、ゼオシン、及びプロマイシンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社より入手した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を１０％ ＦＢＳｈｉ、ピルビン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬのゼオシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに０．３μｇ／ｍＬのプロマイシンを加えた。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９２）をＩｓｃｏｖｅ培地（ＩＭＤＭ）＋２０％ＦＢＳｈｉ中で培養した。Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）細胞を、１０％ＦＢＳｈｉを添加したＭＥＭ Ｅａｇｌｅｓ培地中で維持した。
Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞は、ＮＦＡＴ誘導性Ｌｕｃｉａレポーターコンストラクトを含んでいる。Ｌｕｃｉａ遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合によって活性化されると、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを培地中に分泌させる。このルシフェラーゼは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃルシフェラーゼ検出試薬を用いて測定することができる。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ細胞をレンチウイルスで形質導入して抗原特異的ＴＣＲを発現させた。ＨＩＶ由来レンチウイルストランスファーベクターをＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社より入手し、ＶＳＶ－Ｇ（ｐＣＭＶ－ＶｓｖＧ）、Ｒｅｖ（ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ）及びＧａｇ－ｐｏｌ（ｐＣｇｐＶ）を発現するレンチウイルス支持プラスミドをＣｅｌｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ社より入手した。
レンチウイルスを、４０μＬのリポフェクタミン及び２０μｇのＤＮＡミクスチャー（重量比４：２：１：１のトランスファープラスミドｐＣｇｐＶ：ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ：ｐＣＭＶ－ＶｓｖＧ）を使用し、ＨＥＫ２９３細胞の５０～８０％コンフルエンスにあるＴ７５フラスコをリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でトランスフェクトすることにより調製した。８～１０ｍＬのウイルス含有培地をＬｅｎｔｉ－Ｘシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて濃縮し、ウイルスを１００～２００μｌの新鮮培地中に再懸濁した。この体積を用いて等しい体積のＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ細胞（５×１０Ｅ４～１×１０Ｅ６個の細胞を異なる実験で使用した）にオーバーレイした。０．３μｇ／ｍｌのプロマイシン含有培地中での培養後、細胞をソートしてクロナリティーを得た。これらのＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンを、ペプチドを取り込ませたＴ２細胞を用いて活性及び選択性について試験した。
インビトロエピトーププロセシング及び提示アッセイ
Ｔ２細胞はＴＣＲによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。Ｔ２細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており（ＴＡＰ欠損）、内在性のペプチドをＭＨＣ上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、Ｔ２細胞には外来性のペプチドを容易に取り込ませることができる。５種類のマーカーペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４））及び２種類の無関係のペプチド（ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）、ＦＬＬＴＲＩＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８））をＴ２細胞に取り込ませた。簡単に述べると、Ｔ２細胞をカウントし、ＩＭＤＭ ＋１％ＦＢＳｈｉで１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。各ペプチドは１０μｇペプチド／１×１０６細胞となるように加えた。次いで細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。細胞をＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳｈｉで２回洗浄し、５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬを９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレートにプレーティングした。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬをＴ２細胞に加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いでプレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
アデノウイルスカセットによるマーカーエピトープ提示を試験するため、Ｕ－８７ ＭＧ細胞を代理抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用い、アデノウイルスベクターで形質導入した。Ｕ－８７ ＭＧ細胞を収穫し、９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレート中で培地中に５×１０Ｅ５細胞／１００ μｌでプレーティングした。プレートを３７℃で約２時間インキュベートした。アデノウイルスカセットをＭＥＭ＋１０％ＦＢＳｈｉでＭＯＩ１００、５０、１０、５、１及び０に希釈し、Ｕ－８７ ＭＧ細胞に５μｌ／ウェルで加えた。プレートを再び３７℃で約２時間インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ－８７ ＭＧ細胞に１００μＬ／ウェルで加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートした。プレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
免疫原性実験用のマウス系統
トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２．１（ＨＬＡ－Ａ２ Ｔｇ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ社より入手した。これらのマウスは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１リーダードメイン、α１ドメイン、及びα２ドメインと、マウスＨ２－Ｋｂ α３ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる導入遺伝子を有するものである（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらの実験で使用したマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドの野生型ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃの雌及びホモ接合型ＨＬＡ－Ａ２．１Ｔｇの雌の第１世代子孫（Ｆ１）である。
アデノウイルスベクター（Ａｄ５ｖ）による免疫化
ＨＬＡ－Ａ２ Ｔｇマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により１×１０１０～１×１０６ 個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の１２日後に測定した。
リンパ球の単離
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、１０％ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ）中で組織を解離させた。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（Ｊａｎｅｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。１×１０５個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
エクスビボ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー分析
新しく単離したリンパ球を２～５×１０６細胞／ｍＬの密度で１０ｕＭの示したペプチドと２時間インキュベートした。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色した。細胞内染色には抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を１：１００で使用した。試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で収集した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、ＣＤ８＋細胞のＩＦＮｇ＋の割合（％）及び全ＩＦＮｇ＋細胞数／１×１０６個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
ＸＩＶ．Ｂ．２．新生抗原カセット設計のインビトロ評価
新生抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した（図１５）。認識後、特性がよく知られているペプチド－ＨＬＡの組み合わせに特異的な５種類のＴＣＲのうちの１つを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ－ＬｕｃｉａレポーターＴ細胞が活性化され、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターＣＤ８ Ｔ細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
個々のＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａレポーター株は、等モル量の翻訳産物が得られるようにＰ２Ａリボソームスキップ配列によって分離された抗原特異的ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖を含む発現コンストラクトによるレンチウイルス形質導入によって改変されたものである（Ｂａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。細胞表面上のＣＤ８は標的ｐＭＨＣ分子に対する結合親和性にとって重要であり、その細胞質テールの結合を介してシグナル伝達を促進する（Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｙａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）ことから、レンチウイルスコンストラクトへの第２のＣＤ８β－Ｐ２Ａ－ＣＤ８α因子の付加によって、親レポーター細胞株に欠損しているＣＤ８共受容体の発現がもたらされる。
レンチウイルスによる形質導入の後、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａレポーターをプロマイシン選択下で増殖させ、ＦＡＣＳ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（単一細胞蛍光支援細胞選別）に供し、モノクローナル集団をルシフェラーゼ発現について試験した。これにより、機能的細胞応答を有する特異的ペプチド抗原１、２、４、及び５について安定的に形質導入されたレポーター細胞株が得られた（表２）。
（表２）インビトロＴ細胞活性化アッセイの開発
ルシフェラーゼの誘導によって測定されるペプチド特異的Ｔ細胞認識は、ワクチンカセット抗原の効果的なプロセシング及び提示を示す。
Figure 2023123766000091
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、一連の短いカセットにおいて、すべてのマーカーエピトープを同じ位置に組み込み（図１６Ａ）、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限エピトープ（図１６Ｂ）を分離するリンカーのみを変えた。レポーターＴ細胞を、これらの短いカセットを発現するアデノウイルスコンストラクトを感染させたＵ－８７抗原提示細胞（ＡＰＣ）と個々に混合し、ルシフェラーゼ発現を非感染コントロールに対して測定した。モデルカセット内の４つすべての抗原が、一致するレポーターＴ細胞により認識され、複数の抗原が効率的にプロセシング及び提示されていることが示された。Ｔ細胞応答の程度は、天然及びＡＡＹリンカーについて概ね同様の傾向にしたがった。ＲＲリンカーベースのカセットから放出された抗原は、低いルシフェラーゼの誘導を示す（表３）。抗原プロセシングを阻害するように設計されたＤＰＰリンカーは、エピトープ提示が低いワクチンカセットを生じた（表３）。
（表３）短いカセット内のリンカー配列の評価
インビトロＴ細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、ＤＰＰベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。Ｔ細胞エピトープのみ（リンカー無し）＝９ＡＡ、片側に天然リンカー＝１７ＡＡ、両側に天然リンカー＝２５ＡＡ、非天然リンカー＝ＡＡＹ，ＲＲ，ＤＰＰ
Figure 2023123766000092
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、ヒト及びマウスのエピトープ以外に、カセットのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置された、ユビキチン（Ｕｂ）、ＭＨＣ及びＩｇ－κシグナルペプチド（ＳＰ）、及び／またはＭＨＣ膜貫通（ＴＭ）モチーフなどのターゲティング配列を含むさらなる一連の短いカセットを構築した（図１７）。アデノウイルスベクターによってＵ－８７ ＡＰＣに送達されると、レポーターＴ細胞は、複数のカセット由来の抗原の効率的なプロセシング及び提示を示した。しかしながら、Ｔ細胞応答の程度は、異なるターゲティング機構によって大きく影響されなかった（表４）。
（表４）モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価
インビトロＴ細胞活性化アッセイを用いることにより、４つのＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がＴ細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
Figure 2023123766000093
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
ＸＩＶ．Ｂ．３．新生抗原カセット設計のインビボ評価
新生抗原カセット設計の評価の別の例として、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に制限された形でＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた５つのヒトクラスＩ ＭＨＣエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した（図１６Ａ、１７、１９Ａ）。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した（図１８）。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０２０１及びマウスＨ２－Ｋｂから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のリーダー、マウスα３に連結されたα１及びα２ドメイン、膜貫通及び細胞質Ｈ２－Ｋｂドメインで構成されたキメラクラスＩ ＭＨＣ分子をコードしている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。このキメラ分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に制限された抗原提示を可能とする一方で、ＣＤ８共受容体とＭＨＣ上のα３ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
短いカセットでは、すべてのマーカーエピトープが、一般的に報告されているもの（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）よりも約１０～５０倍強い、Ｔ細胞応答を生じた。評価を行ったすべてのリンカーのうち、それぞれにその天然のアミノ酸配列が隣接した最小エピトープを含む２５マー配列のコンカテマーが、最大かつ最も広いＴ細胞応答を生じた（表５）。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーにより、抗原特異的Ｔ細胞応答がＣＤ８ Ｔ細胞から誘導されることが示された。
（表５）短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価
ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスが１×ｅ１１個のアデノウイルス粒子による感染１７日後にカセット内のすべてのクラスＩ ＭＨＣ制限エピトープに対してＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2023123766000094
別の例では、元の５つのマーカーエピトープの隣に、既知のＣＤ８ Ｔ細胞反応性を有するさらに１６個のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１及びＢ＊４４：０５エピトープを含む一連の長いワクチンカセットを構築し、アデノウイルスベクターに組み込んだ（図１９Ａ、Ｂ）。これらの長いカセットのサイズは、最終的な臨床用のカセット設計によく似たものとし、各エピトープの互いに対する位置のみを変えた。ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方でその程度及び幅において同等であり、（ａ）さらなるエピトープの追加が元のエピトープのセットに対する免疫応答の程度に大きく影響せず、また、（ｂ）カセット内のエピトープの位置はそれに続くＴ細胞応答に大きく影響しないことを示すものである（表６）。
（表６）長いカセット内のエピトープの位置の影響のインビボ評価
ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスが５ｅ１０アデノウイルス粒子による感染１７日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2023123766000095
＊ 技術的なエラーによりＴ細胞応答が見られなかったと疑われる。
ＸＩＶ．Ｂ．４．免疫原性及び毒性試験用の新生抗原カセットの設計
要約すると、モデルカセット評価による知見（図１６～１９、表２～６）によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約２０個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列（例えば、両側に８個のアミノ酸残基）が隣接した最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ（例えば、９個のアミノ酸残基）をそれぞれが埋め込んだ２５マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのＮ末端及び／またはＣ末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、ＨＣＭＶ ｐｐ６５ ＭＨＣ ＩのエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）は、その５’末端側に天然の５’配列ＷＱＡＧＩＬＡＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）が、その３’末端側に天然の３’配列ＱＧＱＮＬＫＹＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）が隣接し、それによりＨＣＭＶ ｐｐ６５由来源タンパク質内にみられる
Figure 2023123766000096
という２５マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列（複数可）が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各２５マー配列は、それに続く２５マー配列に直接連結される。最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープがアミノ酸９個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然２５マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸１０個のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープには、アミノ酸８個とアミノ酸７個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に含ませた２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた。これらのクラスＩＩエピトープは、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）によって最後のクラスＩエピトープに連結した。２個のクラスＩＩエピトープは、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）によって互いに対しても連結し、さらにＣ末端側にＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）を連結させた。エピトープの位置もその数もＴ細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
さらなる例として、モデルカセットにより得られたインビトロ及びインビボデータ（図１６～１９、表２～６）に基づき、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、マウス及びヒトで免疫原性を示すことが知られている、特性のよく知られたＴ細胞エピトープを交互に配したカセット設計を生成した。いずれもそれらの天然の２５マー配列に埋め込まれた２０個のエピトープの後に、評価を行ったすべてのモデルカセットに存在する２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた（図２０）。この設計を用いて、複数種における免疫原性を調べ、ならびに薬理学的及び毒物学的研究を行った。
ＸＶ．ＣｈＡｄ新生抗原カセット送達ベクター
ＸＶ．Ａ．ＣｈＡｄ新生抗原カセット送達ベクターの構築
１つの例では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）を操作して新生抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１（米国特許第６０８３７１６号に記載の配列２）に基づいて合成し、Ｅ１（ｎｔ４５７～３０１４）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列を欠失させた。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。このクローンをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型Ｃ６８ウイルスの配列を確認するため、単離ＶＲ－５９４をＡＴＣＣより入手して継代した後、個々に配列決定した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。ＡＣ＿００００１１．１配列を野生型ＣｈＡｄＶ６８ウイルスのＡＴＣＣ ＶＲ－５９４配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と比較したところ、６個のヌクレオチドの相違が特定された。１つの例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を、欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
Figure 2023123766000097
Figure 2023123766000098
Figure 2023123766000099
Figure 2023123766000100
Figure 2023123766000101
Figure 2023123766000102
Figure 2023123766000103
Figure 2023123766000104
Figure 2023123766000105
Figure 2023123766000106
Figure 2023123766000107
Figure 2023123766000108
Figure 2023123766000109
Figure 2023123766000110
Figure 2023123766000111
Figure 2023123766000112
Figure 2023123766000113
Figure 2023123766000114
Figure 2023123766000115
Figure 2023123766000116
Figure 2023123766000117
Figure 2023123766000118
Figure 2023123766000119
Figure 2023123766000120
Figure 2023123766000121
Figure 2023123766000122
Figure 2023123766000123
Figure 2023123766000124
Figure 2023123766000125
Figure 2023123766000126
Figure 2023123766000127
Figure 2023123766000128
Figure 2023123766000129
Figure 2023123766000130
Figure 2023123766000131
Figure 2023123766000132
Figure 2023123766000133
Figure 2023123766000134
ＸＶ．Ｂ．ＣｈＡｄ新生抗原カセット送達ベクターの試験
ＸＶ．Ｂ．１．ＣｈＡｄベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞のトランスフェクション
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
１０ｕｇのプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化してウイルスゲノムを遊離させた。次いでＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を製造者の指示にしたがって使用してＤＮＡを長いＤＮＡフラグメントについて精製し、２０ｕｌの予め加熱した水中に溶出した。溶出工程の前にカラムを３７℃で０．５～１時間放置した。
トランスフェクションの１４～１８時間前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を１０６細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに導入した。各ウェルごとに細胞に新鮮な培地（ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタミン酸を含む１ｍｌのＤＭＥＭ－１０％ｈｉＦＢＳ）を被せた。トランスフェクションでは、各ウェル当たり１～２ｕｇの精製したＤＮＡを製造者のプロトコールにしたがってｕｌ体積の２倍（２～４ｕｌ）のリポフェクタミン２０００とともに用いた。トランスフェクションミックスを含む０．５ｍｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地を、各ウェル内で１ｍｌの通常の培地に加え、細胞上で一晩放置した。
トランスフェクトした細胞培養物を３７℃で少なくとも５～７日間インキュベートした。ウイルスプラークがトランスフェクションの７日後に視認されなかった場合、細胞を１：４または１：６に分割し、３７℃でインキュベートしてプラーク生成について監視した。あるいは、トランスフェクトした細胞を収穫し、３サイクルの凍結と解凍に供し、細胞ライセートを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞に感染させ、ウイルスプラークが観察されるまで細胞をインキュベートしてもよい。
リン酸カルシウムを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞へのＣｈＡｄＶ６８ベクターのトランスフェクション及び三次ウイルスストックの生成
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの１日前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を５％ＢＳ／ＤＭＥＭ／１ＸＰ／Ｓ，１×Ｇｌｕｔａｍａｘ中で、６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で播種した。トランスフェクション当たり２個のウェルが必要とされる。トランスフェクションの２～４時間前に培地を新鮮な培地に交換した。ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰプラスミドをＰａｃＩで直鎖状とした。次いで、直鎖状とされたＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出し、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、及び２体積の１００％エタノールを用いて沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１２，０００×ｇで５分間遠心することによってペレット化した後、７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを風乾し、５０μＬの滅菌水に再懸濁した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用してＤＮＡ濃度を決定し、体積を５μｇのＤＮＡ／５０μＬに調整した。
１６９μＬの滅菌水をマイクロチューブに加えた。次いで５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２をこの水に加え、ピペッティングして静かに混合した。５０μＬのＤＮＡをＣａＣｌ２溶液に滴下した。次いで２６μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加えてμピペッターで２回ピペッティングして静かに混合した。この最終溶液は、２５０μＬの０．２５Ｍ ＣａＣｌ２中の５μｇのＤＮＡからなるはずである。次いで２５０μＬの２×ＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）の入った第２のチューブを用意した。ピペットエイドに取り付けた２ｍＬ滅菌ピペットを使用して２×ＨＢＳ溶液に空気を徐々にバブリングした。同時に、０．２５Ｍ ＣａＣｌ２溶液中のＤＮＡ溶液を滴下した。最後のＤＮＡの液滴の滴下後、約５秒間、バブリングを継続した。次いで溶液を室温で最大２０分間インキュベートした後、２９３Ａ細胞に加えた。６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で１日前に播種した２９３Ａ細胞の単層に２５０μｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム溶液を滴下した。細胞をインキュベーターに戻して一晩インキュベートした。２４時間後に培地を交換した。７２時間後に細胞を６ウェルプレート内に１：６に分割した。単層を細胞変性効果（ＣＰＥ）の証拠について光学顕微鏡によって毎日監視した。トランスフェクションの７～１０日後にウイルスプラークを観察し、ウェル内の培地をピペッティングして細胞を浮かせることにより単層を収穫した。収穫した細胞及び培地を５０ｍＬの遠心チューブに移した後、凍結解凍を３ラウンド行った（－８０℃及び３７℃）。その後得られた、一次ウイルスストックと呼ばれるライセートを、ベンチトップ遠心分離器上で最大速度（４３００×ｇ）で遠心することにより清澄化させ、ライセートの一定の割合（１０～５０％）を使用してＴ２５フラスコ中で２９３Ａ細胞に感染させた。感染細胞を４８時間インキュベートした後、細胞及び培地を完全なＣＰＥで収穫した。細胞を再び収穫し、凍結解凍して清澄化した後、この二次ウイルスストックを使用して、フラスコ当たり１．５×１０７細胞で播種されたＴ１５０フラスコに感染させた。７２時間後に完全ＣＰＥが得られた時点で細胞を収穫し、上記のウイルスストックと同様に処理して三次ストックを生成した。
２９３Ｆ細胞内での生成
８％ＣＯ２のインキュベーター内の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞内でＣｈＡｄＶ６８ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率９８％で１ｍＬ当たり１０６細胞に希釈し、１ＬのＳｈａｋｅフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中、１回の生成操作当たり４００ｍＬを使用した。１回の感染当たり目標ＭＯＩが３．３よりも高い４ｍＬの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が７０％を下回るまで４８～７２時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、再び遠心してから２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を３回行って溶解し、４，３００×ｇで５分間遠心して清澄化した。
ＣｓＣｌ遠心分離による精製
ウイルスＤＮＡをＣｓＣｌ遠心分離により精製した。２つの不連続な勾配の操作を行った。第１の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第２の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
１０ｍＬの１．２（２６．８ｇのＣｓＣｌを９２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）ＣｓＣｌをポリアロマー製チューブに加えた。次いで、８ｍＬの１．４ＣｓＣｌ（５３ｇのＣｓＣｌを８７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）をピペットを用いてチューブの底に届けるように慎重に加えた。清澄化したウイルスをこの１．２の層の上に層をなすように慎重に加えた。必要な場合、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓを加えてチューブのバランスを取った。次いでチューブをＳＷ－３２Ｔｉローターに入れて、１０℃で２時間３０分遠心した。次いでチューブを層流キャビネットに取り出して、１８ゲージの針と１０ｍＬの注射器を使用してウイルスバンドを引き抜いた。夾雑した宿主細胞ＤＮＡ及びタンパク質を除去しないように注意を払った。次いでバンドを少なくとも１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で希釈し、上記に述べた不連続勾配で上記と同様に層をなすように加えた。今回は操作を一晩行った以外は上記と同様にして遠心操作を行った。翌日、機能不全の粒子バンドを引き抜かないように注意しながらバンドを引き抜いた。次いでカセット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用してＡＲＭバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）ｐＨ８．０，２５ｍＭ ＮａＣｌ，２．５％グリセロール）に対してウイルスを透析した。これをバッファーを１回交換するごとに３回、１時間行った。次いでウイルスを一定分量に分けて－８０℃で保存した。
ウイルスアッセイ
１．１×１０１２個のウイルス粒子（ＶＰ）の消光係数はＯＤ２６０ｎｍの吸光度の値＝１に相当することに基づき、ＯＤ２６０アッセイを用いてＶＰ濃縮を行った。アデノウイルスの２つの希釈度（１：５と１：１０）をウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で作った。両方の希釈度でＯＤを２重に測定し、ＯＤ２６０値×希釈係数×１．１×１０１２ＶＰを掛けることによりＶＰ濃度／ｍＬを測定した。
感染単位（ＩＵ）力価を、ウイルスストックの限界希釈アッセイによって計算した。ウイルスを最初にＤＭＥＭ／５％ＮＳ／１×ＰＳ中で１００倍に希釈した後、１０倍希釈率を用いて１×１０－７にまで希釈した。次いで１００μＬのこれらの希釈液を、２４ウェルプレートのウェル当たり３ｅ５細胞で少なくとも１時間前に播種した２９３Ａ細胞に加えた。これを２重に行った。プレートを４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。次いで細胞を、１×ＰＢＳで洗浄した後、１００％の冷却メタノール（－２０℃）で固定した。次いでプレートは最小で２０分間にわたって－２０℃でインキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳで洗浄した後、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で１時間、室温でブロッキングした。ウサギ抗Ａｄ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をブロッキングバッファー（ウェル当たり０．２５ｍＬ）中に１：８，０００の希釈率で加え、室温で１時間インキュベートした。各ウェルをウェル当たり０．５ｍＬのＰＢＳで４回洗浄した。１０００倍に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｔｅｘａｓ）を各ウェルに加え、最終回の洗浄の１時間前にインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を５回行い、０．０１％Ｈ２Ｏ２を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中、ＤＡＢ（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）基質を使用して現像した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．６７ｍｇ／ｍＬ ＤＡＢ）。各ウェルをカウントの５分前に現像した。視野当たり４～４０個の染色された細胞を与えるような希釈率を用いて１０倍の対物レンズ下で細胞をカウントした。使用した視野は０．３２ｍｍ２の格子とし、２４ウェルプレート上の視野当たり６２５個に相当した。１ｍＬ当たりの感染性ウイルスの数は、格子１個当たりの染色細胞の数×視野当たりの格子の数×希釈係数１０によって求めることができる。同様に、ＧＦＰ発現細胞を扱う場合には、カプシド染色の代わりに蛍光を用いて１ｍＬ当たりのＧＦＰ発現ビリオンの数を決定することができる。
免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌性マウス及びＢａｌｂ／ｃ系の雌性マウスに、１×１０８個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーのウイルス粒子（ＶＰ）を、１００ｕＬ体積中で両側性の筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ＸＶ．Ｂ．２．ＤＮＡトランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図２１）及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図２２）のＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製（ウイルスプラーク）をトランスフェクションの７～１０日後に観察した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルスプラークを光学（図２１Ａ及び２２Ａ）及び蛍光顕微鏡法（図２１Ｂ～Ｃ、及び図２２Ｂ～Ｃ）を使用して可視化した。ＧＦＰは、増殖性ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成を示す。
ＸＶ．Ｂ．３．ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の増殖
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルスをＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの１８日後に生成した（図２３）。精製ＣｈＡｄＶ６８ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス５型（Ａｄ５）及びＣｈＡｄＶＹ２５（近縁のＣｈＡｄＶ；Ｄｉｃｋｓ，２０１２，ＰｌｏＳ ＯＮＥ７，ｅ４０３８５）ウイルスストックと比較した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルス力価は、Ａｄ５及びＣｈＡｄＶＹ２５と同等であった（表７）。
（表７）２９３Ｆ懸濁細胞内でのアデノウイルスベクターの生成
Figure 2023123766000135
＊ＳＤは、複数回の生成工程が行われた場合にのみ報告している。
ＸＶ．Ｂ．４．腫瘍モデルにおける免疫原性の評価
マウス腫瘍抗原を発現するＣ６８ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、Ｃ６８ベクターがＴ細胞応答を誘発することを実証する。ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）に対するＴ細胞応答Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１－Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：５２９－５３８）に対するＴ細胞応答をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。図２９に示されるように、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるマウスの免疫後にコントロールに対して強いＴ細胞応答が測定された。脾細胞１０６個当たり、８９５７個及び４０１９個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均の細胞性免疫応答が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系またはＢａｌｂ／ｃ系マウスをそれぞれＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫した場合に免疫の１０日後に観察された。
ＸＶＩ．アルファウイルス新生抗原送達ベクター
ＸＶＩ．Ａ．アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
ＲＮＡを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドＤＮＡをＰｍｅＩによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し（ＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ社）、テンプレートとして使用した。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をｍ７Ｇキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造者の指示にしがって使用してｍＲＮＡを精製した。
インビボ実験を行うには、ＴｒｉＬＩｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって生成され、精製されたＲＮＡをＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃａｐ１でキャップした。
ＲＮＡのトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、９６ウェルのウェル当たり６ｅ４細胞で、２４ウェルのウェル当たり２ｅ５細胞で、トランスフェクションの約１６時間前に播種した。細胞にＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造者のプロトコールにしたがって使用してｍＲＮＡをトランスフェクションした。９６ウェルでは、ウェル当たり０．１５ｕＬのリポフェクタミン及び１０ ｎｇ のｍＲＮＡを使用し、２４ウェルでは、ウェル当たり０．７５ｕＬのリポフェクタミン及び１５０ｎｇのｍＲＮＡを使用した。ＧＦＰを発現するｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をトランスフェクションのコントロールとして使用した。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の９６ウェルプレートで、ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して測定した。
ｑＲＴ－ＰＣＲ
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの２時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったｍＲＮＡをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でＲＬＴ ｐｌｕｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して全ＲＮＡを定量した。製造者のプロトコールにしたがってｑＴｏｗｅｒ３ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、反応当たり２０ｎｇの全ＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ＡｃｔｉｎまたはＧｕｓＢを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー／プローブはＩＤＴ社により生成されたものである（表８）。
（表８）ｑＰＣＲプライマー／プローブ
Figure 2023123766000136
Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの左下脇腹に１０５個のＢ１６－ＯＶＡ細胞／動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、３日間にわたって増殖させた。
ＣＴ２６腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個／動物のＣＴ２６細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中、１０ｕｇのＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。Ａｄ５ワクチンについては、マウスに５×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を、１００ｕＬ体積中で両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。各動物に、抗ＣＴＬＡ－４（クローン９Ｄ９，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ－１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を、用量２５０ｕｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
インビボ生物発光イメージング
各時点においてマウスに腹腔内注射により１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を注射し、注射の１０～１５分後にＩＶＩＳインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して生物発光を測定した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ＸＶＩ．Ｂ．アルファウイルスベクター
ＸＶＩ．Ｂ．１．アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、新生抗原発現システム用のＲＮＡアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＶＥＥ）（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００－４１３）ベースの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターから生成した。１つの例では、２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’側に位置するＶＥＥの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ（ＶＥＥ配列の７５４４～１１，１７５を欠失させた。番号付けはＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、抗原配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）またはルシフェラーゼレポーター（例えばＶＥＥ－ルシフェラーゼ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）に置き換えた（図２４）。ＲＮＡをインビトロでｓｒＲＮＡ ＤＮＡベクターから転写させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする（非複製）ｍＲＮＡを比較のためにトランスフェクトした。ＶＥＥ－ルシフェラーゼのｓｒＲＮＡでは、２時間の測定値を２３時間の測定値と比較した場合にｓｒＲＮＡレポーターシグナルの約３０，０００倍の増大が観察された（表９）。これに対して、同じ時間でのｍＲＮＡレポーターのシグナルの増大は１０倍未満であった（表９）。
（表９）ＶＥＥ自己複製ベクターからのルシフェラーゼの発現は経時的に増大する
９６ウェル中、ウェル当たり１０ｎｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡまたは１０ｎｇの非複製ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｌ－６３０７）をＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位（ＲＬＵ）として報告する。各データポイントは、３つのトランスフェクトしたウェルの平均±ＳＤである。
Figure 2023123766000137
別の例では、ｓｒＲＮＡの複製を、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、ルシフェラーゼをコードしたｓｒＲＮＡ（ＶＥＥ－ルシフェラーゼ）または複数のエピトープカセット（ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー）をコードしたｓｒＲＮＡのいずれかのトランスフェクション後のＲＮＡレベルを測定することにより確認した。ＲＮＡにおける約１５０倍の増大が、ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡで観察された（表１０）のに対して、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡでは３０～５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１１）。これらのデータは、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターが細胞にトランスフェクトされると複製されることを示すものである。
（表１０）ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定
ＨＥＫ２９３Ａ細胞にＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する倍率変化を示す。
Figure 2023123766000138
（表１１）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定
ＨＥＫ２９３細胞にＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はＧｕｓＢ参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する倍率変化を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもｓｒＲＮＡのエピトープカセット領域を検出する２つの異なるｑＰＣＲプライマー／プローブのセットを表す。
Figure 2023123766000139
ＸＶＩ．Ｂ．２．アルファウイルスベクターのインビボ評価
別の例において、ＶＥＥ－ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された１０ｕｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを注射し、注射の２４及び４８時間後、ならびに７及び１４日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の２４時間後に検出され、時間とともに増大し、ｓｒＲＮＡ注射の７日後にピークとなった（図２５）。
ＸＶＩ．Ｂ．３．アルファウイルスベクター腫瘍モデルの評価
１つの実現形態において、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、２つの異なるＭＨＣクラスＩマウス腫瘍エピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）及びＡＨ１－Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９－５３８）を発現するＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターを作製した（ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。ＳＦＬ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７））エピトープは、Ｂ１６－ＯＶＡメラノーマ細胞株によって発現され、ＡＨ１－Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）；Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）エピトープは、ＣＴ２６結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするＴ細胞を誘導する（ＡＨ１／ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：９７３０－９７３５）。１つの例では、インビボ実験において、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ が、Ｔ７ポリメラーゼ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された。
ＳＦＬを標的とした、コントロールに対して強い抗原特異的Ｔ細胞応答が、ＭＣ３で製剤化したＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによる、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの免疫化の２週間後に観察された。１つの例では、脾細胞１０６個当たり中央値で３８３５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＳＦＬペプチドによる刺激後に測定され（図２６Ａ、表１２）、ペンタマー染色により測定した場合に、ＣＤ８ Ｔ細胞の１．８％（中央値）がＳＦＬ抗原特異的であった（図２６Ｂ、表１２）。別の例では、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＶＥＥ ｓｒＲＮＡワクチンとの同時投与によって、全体のＴ細胞応答の中度の増大が認められ、脾細胞１０６個当たり中央値で４７９４．５個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図２６Ａ、表１２）。
（表１２）Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにおけるＶＥＥ ｓｒＲＮＡ免疫化の１４日後のＥＬＩＳＰＯＴ及びＭＨＣＩペンタマー染色アッセイの結果
Figure 2023123766000140
*Ｖａｘ群のマウス＃６からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
別の実現形態では、臨床アプローチを反映するため、Ｂ１６－ＯＶＡ及びＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて異種プライム／ブーストを行い、腫瘍を有するマウスを、同じ抗原カセット（Ａｄ５－ＵｂＡＡＹ）を発現するアデノウイルスベクターで最初に免疫した後、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライムの１４日後にＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡワクチンでブースト免疫を行った。１つの例では、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹワクチンによって抗原特異的免疫応答が誘導され、脾細胞１０６個当たり７３３０個（中央値）のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図２７Ａ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の２．９％（中央値）がＳＦＬ抗原を標的化していた（図２７Ｃ、表１３）。別の例では、Ｔ細胞応答は、Ｂ１６－ＯＶＡモデルにおいてＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブーストの２週間後に維持され、脾細胞１０６個当たり３９６０個（中央値）のＳＦＬ特異的ＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図２７Ｂ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の３．１％（中央値）がＳＦＬ抗原を標的化していた（図２７Ｄ、表１３）。
（表１３）Ａｄ５ワクチンプライム及びｓｒＲＮＡブーストによる異種プライム／ブースト後のＢ１６－ＯＶＡマウスの免疫モニタリング
Figure 2023123766000141
別の実現形態では、同様の結果が、ＣＴ２６マウスモデルにおけるＡｄ５－ＵｂＡＡＹによるプライム及びＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後に観察された。１つの例では、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹによるプライム後（１４日目）にＡＨ１抗原特異的応答が観察され、脾細胞１０６個当たり平均で５１８７個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図２８Ａ、表１４）、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後（２８日目）には脾細胞１０６個当たり３７９９個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図２８Ｂ、表１４）。
（表１４）ＣＴ２６腫瘍マウスモデルにおける異種プライム／ブースト後の免疫モニタリング
Figure 2023123766000142
ＸＶＩＩ．ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、マウスＣＴ２６腫瘍モデルで評価した。
ＸＶＩＩ．Ａ ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の方法及び材料
腫瘍の注入
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アーム（各群当たりマウス２８～４０匹）をランダムカセット配列し、処置を開始した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個／動物のＣＴ２６細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。各実験アームは表１５に詳細に記載したとおりである。
（表１５）ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の実験アーム
Figure 2023123766000143
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中、１０ｕｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。Ｃ６８ワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーのウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。各動物に、抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ－１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を、用量２５０ｕｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ＸＶＩＩ．Ｂ ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの評価
ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡの異種プライム／ブースト、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡの同種プライム／ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をＣＴ２６マウス腫瘍モデルで評価した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表１５に詳細に、また表１６により一般的に記載したとおりである。
（表１６）プライム／ブースト実験アーム
Figure 2023123766000144
脾臓をプライムワクチン接種の１４日後に収穫して免疫モニタリングを行った。腫瘍及び体重測定値を週２回測定し、生存率を監視した。すべての活性ワクチン群でコントロールに対する強い免疫応答が観察された。
それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ－１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ－１／グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ－１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、最初の免疫の１４日後に、脾細胞１０６個当たり、中央値で１０，６３０個、１２，９７６個、３３１９個、または３７４５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の細胞性免疫応答が観察された（図３０及び表１７）。これに対して、ワクチンコントロール（グループ１）または抗ＰＤ－１をともなうワクチンコントロール（グループ２）は、それぞれ、脾細胞１０６個当たり中央値で２９６個または２８５個のＳＦＣの細胞性免疫応答を示した。
（表１７）ＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答
Figure 2023123766000145
ＥＬＩＳｐｏｔのデータと一致して、それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ－１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ－１／グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ－１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析において、最初の免疫の１４日後にＣＤ８ Ｔ細胞の５．６、７．８、１．８、または１．９％（中央値）が抗原特異的応答を示した（図３１及び表１８）。ワクチンコントロール、またはワクチンコントロールと抗ＰＤ－１との組み合わせで免疫したマウスは、それぞれ、０．２及び０．１％の抗原特異的ＣＤ８応答を示した。
（表１８）ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答
Figure 2023123766000146
ＣＴ２６結腸腫瘍モデルのすべてのグループで腫瘍増殖が測定され、腫瘍増殖は処置開始の２１日後（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射の２８日後）までみられる。大きな腫瘍サイズ（＞２５００ｍｍ３）に基づいて処置開始の２１日後にマウスを屠殺したため、分析のバイアスを避けるために最初の２１日間のみを示している。２１日目における平均腫瘍体積は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ－１（グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト（グループ５）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト＋抗ＰＤ－１（グループ６）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ７）、及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ－１（グループ８）でそれぞれ、１１２９、８４８、２１４２、１４１８、２１９８及び１６０６ ｍｍ３であった（図３２及び表１９）。ワクチンコントロール、またはワクチンコントロールと抗ＰＤ－１との組み合わせにおける平均腫瘍体積は、それぞれ、２３６１または２０６７ｍｍ３であった。これらのデータに基づけば、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ－１（グループ６）、及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（グループ８）は、コントロール（グループ１）と有意に異なる腫瘍増殖の低下を２１日目にもたらした。
（表１９）ＣＴ２６モデルで測定された２日目の腫瘍サイズ
Figure 2023123766000147
ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて処置開始後３５日間（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射後４２日間）にわたって生存率を監視した。改善された生存率が、試験した組み合わせのうちの４つでマウスをワクチン接種した後に観察された。ワクチン接種後、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ－１との組み合わせ（グループ４；コントロールグループ１に対してＰ＜０．０００１）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ－１との組み合わせ（グループ８；コントロールグループ１に対してＰ＝０．０００６）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ３；コントロールグループ１に対してＰ＝０．０００３）、及び、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブーストと抗ＰＤ－１との組み合わせ（グループ６；コントロールグループ１に対してＰ＝０．００１６）を用いたマウスの、それぞれ、６４％，４６％，４１％及び３６％が生存した（図３３及び表２０）。生存率は、残りの処置群［ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト（グループ５）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（グループ７）、及び抗ＰＤ－１単独（グループ２）］ではコントロールグループ１（≦１４％）と有意差は認められなかった。
（表２０）ＣＴ２６モデルにおける生存率
Figure 2023123766000148
結論として、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡは、コントロールに対して、各ワクチンによりコードされたマウス腫瘍抗原に対する強いＴ細胞応答を誘発した。腫瘍を有するマウスへの、抗ＰＤ－１の同時投与をともなう、もしくはともなわないＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストの投与、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーと抗ＰＤ－１との組み合わせの投与、または、同種プライムブースト免疫としてのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡと抗ＰＤ－１との組み合わせの投与は、高い生存率につながった。
ＸＶＩＩＩ．非ヒト霊長類実験
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で評価した。
材料及び方法
プライミングワクチンを各ＮＨＰで筋肉内（ＩＭ）注射して実験を開始した（ワクチンプライム）。１回以上のブースターワクチン（ワクチンブースト）も各ＮＨＰに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
免疫化
Ｍａｍｕ Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＬＮＰ－１またはＬＮＰ－２中で製剤化した１×１０１２個のウイルス粒子（注射１回当たり５×１０１１個のウイルス粒子）のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、３０ｕｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ、１００ｕｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ、または３００ｕｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡで両側性に免疫した。３０ｕｇ、１００ｕｇまたは３００ｕｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
免疫モニタリング
ＰＢＭＣを、プライムワクチン接種後の示した時間にＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）及びＬｅｕｃｏＳｅｐ分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社）を使用して単離し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリー法を用いてＴ細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ－Ａ＊０１クラスＩエピトープに対するＴ細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔ（ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（エクスビボ酵素結合免疫スポット）分析を用いてＩＦＮ－γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。サルＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。２００，０００個のＰＢＭＣを、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ－Ａ＊０１クラスＩエピトープに対する特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーを用いてＩＦＮ－γなどの細胞内サイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。いずれの方法の結果も、サイトカインが、エピトープに対して抗原特異的な形で誘導したことを示している。
アカゲザルにおける免疫原性
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの３０μｇ及び１００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、（ｂ）ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕ－Ａ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各群６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーまたはＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡベクターのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
（表２１）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2023123766000149
免疫化の前及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った。
結果
６種類の異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後に測定した。表２１に示すように、各動物に、４及び８週目に、ＬＮＰ１またはＬＮＰ２のいずれかと製剤化した用量３０μｇまたは１００μｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによるブースト免疫を行った。６種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした（図３４Ａ～Ｄ及び表２２～２５）。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３０μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７０、１４、１５、１１、７、８、１４、１７、１２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図３４Ａ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１０８、－３、１４、１、３７、４、１０５、１７、２５ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図３４Ｂ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり－１７、３８、１４、－２、８７、２１、１０４、１２９、８９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図３４Ｃ）。負の値は、各エピトープ／動物のプレブリード値に対して正規化した結果である。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１２１８、１７８４、１８６６、９７３、１８１３、７４７、７９７、１２４９、及び５４７ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図３４Ｄ）。免疫応答は、予想されたプロファイルを示し、ピーク免疫応答がプライム免疫化の約２～３週後に測定され、４週後に免疫応答が退縮した。ＰＢＭＣ１０６個当たり１８１３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる最初の免疫化の５週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後（５週目）に測定された免疫応答は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるプライム免疫化（３週目）について測定されたピーク免疫応答と同等であった（図３４Ｄ）。ＰＢＭＣ１０６個当たり１２４９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答がそれぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる最初の免疫化の９週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後（９週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前に測定された免疫応答よりも約２倍高かった（図３４Ｄ）。
（表２２）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３０μｇ）（グループ１）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000150
（表２３）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（１００μｇ）（グループ２）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000151
（表２４）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）（グループ３）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000152
（表２５）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー プライムについての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000153
インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験（より高い用量）
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの３００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーとの組み合わせの免疫原性を評価し、（ｂ）用量３００μｇで、ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。アカゲザルなどの非ヒト霊長類におけるワクチン免疫原性は、ヒトにおけるワクチン効力の最良の予測因子である。さらに、この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕＡ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各グループ６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ－Ａ＊０１制限抗原を含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ６８．５－ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーまたはＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
グループ１については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（異種のプライム／ブースト）。グループ２及び３については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（同種のプライム／ブースト）。
（表２６）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2023123766000154
結果
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＣｈＡｄＶ６８．５－ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４週後に測定した（図３５及び表２７）。動物に、４、１２、及び２０週目にＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７５０、４２２５、１１００、２５２９、３２１８、１９１５、１７０８、１５６１、５０７７、４５４３、４９２０、５８２０、３３９５、２７２８、１９９６、１４６５、４７３０、２９８４、２８２８、または３０４３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図３５）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブースト免疫化の１週後（１３週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前（１２週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる３度目のブースト免疫化の１週後（２１週目）に測定された免疫応答は、２度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前（２０週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを、さらに、２種類の異なるＬＮＰ製剤（ＬＮＰ１及びＬＮＰ２）を用いてＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後に測定した（図３６及び３７、表２８及び２９）。動物に、４及び１２週目にＬＮＰ１またはＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。複合的な抗原特異的免疫応答が、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１５週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１６８、２０４、１０３、１２６、１４０、１４５、３３０、２０３、及び１６２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図３６）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１８９、１８５、３４９、４３７、４９２、５７０、２３３、８８６、３６９、及び３８１ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図３７）。
（表２７）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（グループ１）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000155
（表２８）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（３００μｇ）（グループ２）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000156
（表２９）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３００μｇ）（グループ３）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2023123766000157
ｓｒＲＮＡの用量範囲実験
本発明の一実現形態では、ｓｒＲＮＡの用量範囲実験を、ｍａｍｕ Ａ０１インドアカゲザルで実施することによって、どのｓｒＲＮＡ用量をＮＨＰ免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。１つの例では、ｍａｍｕ Ａ０１インドアカゲザルに、複数のｍａｍｕ Ａ０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたｓｒＲＮＡベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで１つの動物群でワクチン流入領域のリンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、２週間ごとにＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する（表３０）。
（表３０）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験
Figure 2023123766000158
*ｓｒＲＮＡの用量範囲は３００μｇ以下の高用量で決定される。
インドアカゲザルにおける免疫原性の実験
本発明の一実施形態では、免疫原性を実証するためにｍａｍｕ Ａ０１インドアカゲザルでワクチン実験を行うことができる。１つの例では、ｍａｍｕ Ａ０１インドアカゲザルに、複数のｍａｍｕ Ａ０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ及び／またはｓｒＲＮＡベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、一部のグループに対して、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与する。最初の免疫化後、２週間ごとにＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する（表３１）。
（表３１）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2023123766000159
＊ｓｒＲＮＡ用量は、ｓｒＲＮＡ用量範囲実験に基づいて決定される。
ＸＩＸ．ＭＨＣ／ペプチド標的反応性Ｔ細胞及びＴＣＲの同定
Ｔ細胞は、患者の血液、リンパ節、または腫瘍から単離することができる。Ｔ細胞は、例えば、抗原－ＭＨＣテトラマー結合細胞を分取することにより、またはＴ細胞と抗原でパルスした抗原提示細胞とのインビトロ共培養物中で刺激した活性化された細胞を分取することにより、抗原特異的Ｔ細胞について濃縮することができる。抗原ロードテトラマー及び他のＭＨＣベースの試薬をはじめとする、抗原特異的Ｔ細胞の同定のためのさまざまな試薬が当該技術分野で知られている。
抗原関連αβ（またはγδ）ＴＣＲダイマーを、抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲのシングルセルシークエンシングによって同定することができる。また、抗原特異的Ｔ細胞のバルクＴＣＲシークエンシングを行ってもよく、マッチングの確率が高いαβのペアを当該技術分野では周知のＴＣＲペアリング法を用いて決定することができる。
これに代えるかまたはこれに加えて、健康なドナーから得たナイーブＴ細胞のインビトロプライミングによって抗原特異的Ｔ細胞を得ることもできる。ＰＢＭＣ、リンパ節、または臍帯血から得られたＴ細胞を抗原でパルスした抗原提示細胞によって繰り返し刺激することにより、抗原経験Ｔ細胞の分化を開始させることができる。この後、ＴＣＲを患者からの抗原特異的Ｔ細胞について上記に述べたのと同様にして同定することができる。
特定の配列
ベクター、カセット、及び抗体の配列を以下に示す。
Figure 2023123766000160
Figure 2023123766000161
Figure 2023123766000162
Figure 2023123766000163
Figure 2023123766000164
Figure 2023123766000165
Figure 2023123766000166
Figure 2023123766000167
Figure 2023123766000168
Figure 2023123766000169
Figure 2023123766000170
Figure 2023123766000171
Figure 2023123766000172
Figure 2023123766000173
Figure 2023123766000174
Figure 2023123766000175
Figure 2023123766000176
Figure 2023123766000177
Figure 2023123766000178
Figure 2023123766000179
Figure 2023123766000180
Figure 2023123766000181
Figure 2023123766000182
Figure 2023123766000183
Figure 2023123766000184
Figure 2023123766000185
Figure 2023123766000186
Figure 2023123766000187
Figure 2023123766000188
Figure 2023123766000189
Figure 2023123766000190
Figure 2023123766000191
Figure 2023123766000192
Figure 2023123766000193
参考文献
Figure 2023123766000194
Figure 2023123766000195
Figure 2023123766000196
Figure 2023123766000197
Figure 2023123766000198
Figure 2023123766000199
様々な実施形態
１．本明細書では、新生抗原または複数の新生抗原を含むウイルスベクターを開示する。特定の実施形態では、例えば以下のような本明細書に開示される方法を用いて新生抗原が特定される。特定の実施形態では、新生抗原は、例えば以下のような本明細書に開示される少なくとも１つの特性または性質を有する。
２．本明細書では、腫瘍細胞表面に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を対象の腫瘍細胞から特定するための方法であって、
前記対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する、工程と、
前記新生抗原のそれぞれが前記対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を含む方法を開示する。
３．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセットの数は、２０である。
４．特定の実施形態では、提示モデルは、
ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表す。
５．特定の実施形態では、前記ペプチド配列を入力する工程は、
前記１つ以上の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用することによって、前記１つ以上のＭＨＣアレルのそれぞれについて、前記対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、前記ＭＨＣアレルが前記対応する新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを生成することを含む。
６．特定の実施形態では、前記方法は、さらに、
前記依存性スコアを変換することによって、各ＭＨＣアレルについて、前記対応するＭＨＣアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す対応するアレルごと尤度を生成することと、
前記アレルごと尤度を組み合わせて前記数値的尤度を生成することと、をさらに含む。
７．特定の実施形態では、前記依存性スコアを変換することは、前記対応する新生抗原の前記ペプチド配列の提示を相互排他的としてモデル化する。
８．特定の実施形態では、前記方法は、さらに、
前記依存性スコアの組み合わせを変換して前記数値的尤度を生成することを含む。
９．特定の実施形態では、前記依存性スコアの組み合わせを変換する工程は、前記対応する新生抗原のペプチド配列の提示をＭＨＣアレル間の干渉としてモデル化する。
１０．特定の実施形態では、前記数値的尤度のセットは、少なくともアレル非相互作用特性によってさらに特定され、さらに、
前記アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、１つ以上の提示モデルのうちのアレル非相互作用モデルを前記アレル非相互作用特性に適用することを含む。
１１．特定の実施形態では、前記方法は、さらに、
１つ以上のＭＨＣアレルの各ＭＨＣアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、
前記対応するＭＨＣアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す、前記ＭＨＣアレルについての対応するアレルごと尤度を生成するために、各ＭＨＣアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記アレルごと尤度を組み合わせて前記数値的尤度を生成することと、をさらに含む。
１２．特定の実施形態では、前記方法は、さらに、
前記ＭＨＣアレルの各々についての依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換することにより、前記数値的尤度を生成することを含む。
１３．特定の実施形態では、提示モデルについての数値的パラメータのセットは、複数の試料中に存在すると特定された訓練ペプチド配列のセット、及び各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレルを少なくとも含む訓練データセットに基づいて訓練され、前記訓練ペプチド配列は、複数の試料に由来するＭＨＣアレルから溶出された単離ペプチドの質量分析により特定される。
１４．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、腫瘍細胞のｍＲＮＡ発現レベルについてのデータをさらに含む。
１５．特定の実施形態では、前記試料は、単一のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含む。
１６．特定の実施形態では、前記試料は、複数のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含む。
１７．特定の実施形態では、前記試料は、複数の患者から得られた、または複数の患者に由来するヒト細胞株を含む。
１８．特定の実施形態では、前記試料は、複数の患者から得られた新鮮な、または凍結された腫瘍試料を含む。
１９．特定の実施形態では、前記試料は、複数の患者から得られた新鮮な、または凍結された組織試料を含む。
２０．特定の実施形態では、前記試料は、Ｔ細胞アッセイを用いて特定されたペプチドを含む。
２１．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含む。
２２．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより前記訓練ペプチド配列のセットを比較することによって生成され、前記訓練タンパク質配列のセットは、前記訓練ペプチド配列よりも長く、かつ前記訓練ペプチド配列を含む。
２３．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのペプチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得するために細胞株に対して質量分析を行うか、または質量分析がこれまでに行われていることに基づいて生成され、前記ペプチドシークエンシングデータは、変化を含む少なくとも１つのタンパク質配列を含む。
２４．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得することに基づいて生成される。
２５．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含む。
２６．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するＭＨＣペプチドーム配列に関連するデータをさらに含む。
２７．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連するデータをさらに含む。
２８．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連するデータをさらに含む。
２９．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含む。
３０．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含む。
３１．特定の実施形態では、前記訓練ペプチド配列は、ｋマーの範囲の長さのものであり、ただしｋは８～１５である。
３２．特定の実施形態では、前記方法は、ワン・ホット（ｏｎｅ－ｈｏｔ）エンコーディングスキームを用いて前記ペプチド配列をコードすることをさらに含む。
３３．特定の実施形態では、前記方法は、レフトパディング（ｌｅｆｔ－ｐａｄｄｅｄ）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることをさらに含む。
３４．本明細書ではまた、腫瘍を有する対象を治療する方法であって、本明細書に開示される方法の工程のいずれかを行うことを含み、前記選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを得ることと、前記腫瘍ワクチンを前記対象に投与することと、をさらに含む方法も開示される。
３５．本明細書ではまた、腫瘍ワクチンを製造する方法であって、本明細書に開示される方法の工程のいずれかを行うことを含み、前記選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産すること、またはこれまでに生産していることと、をさらに含む方法も提供される。
３６．本明細書ではまた、本明細書に開示される方法を実施することにより選択される、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンも開示される。
３７．特定の実施形態では、前記腫瘍ワクチンは、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの１つ以上を含む。
３８．特定の実施形態では、前記腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞表面上に提示された１つ以上の新生抗原を含む。
３９．特定の実施形態では、前記腫瘍ワクチンは、対象において免疫原性を示す１つ以上の新生抗原を含む。
４０．特定の実施形態では、前記腫瘍ワクチンは、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する、１つ以上の新生抗原を含まない。
４１．特定の実施形態では、前記腫瘍ワクチンは、アジュバントをさらに含む。
４２．特定の実施形態では、前記腫瘍ワクチンは、賦形剤をさらに含む。
４３．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセットを選択することは、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。
４４．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセットを選択することは、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。
４５．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセットを選択することは、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
４６．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセットを選択することは、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。
４７．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセットを選択することは、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。
４８．特定の実施形態では、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータは、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得される。
４９．特定の実施形態では、シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである。
５０．特定の実施形態では、数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル相互作用特性によってさらに特定される：
ａ．ＭＨＣアレルと新生抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性；
ｂ．新生抗原コード化ペプチド－ＭＨＣ複合体の予測安定性；
ｃ．新生抗原コード化ペプチドの配列及び長さ；
ｄ．質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率；
ｅ．対象とされる対象の特定のＭＨＣアレルの発現レベル（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；
ｆ．特定のＭＨＣアレルを発現する他の別個の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率；
ｇ．他の別個の対象における、同じ分子のファミリー（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
５１．特定の実施形態では、数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル非相互作用特性によってさらに特定される：
ａ．その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端及びＮ末端配列；
ｂ．任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在；
ｃ．適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度；
ｄ．ＲＮＡ－ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライス変異体（「アイソフォーム」）を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ；
ｅ．腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる）；
ｆ．新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；
ｇ．細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現；
ｈ．例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにみることができるような、由来源タンパク質及び／またはそのドメインの特性の包括的なカタログ；
ｉ．ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、βシートに対するαヘリックス）；選択的スプライシング；
ｊ．他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率；
ｋ．ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率；
ｌ．腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑによって測定される、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない）；
ｍ．腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数；
ｎ．ペプチドがＴＡＰに結合する確率、またはＴＡＰに対するペプチドの測定または予測される結合親和性；
ｏ．腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる）；
ｐ．以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無：
ｉ．ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
ｉｉ．抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における変異；その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い；
ｑ．以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：
ｉ．抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における多型；
ｒ．腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ）；
ｓ．臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）；
ｔ．喫煙歴；
ｕ．任意でドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
５２．特定の実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化である。
５３．特定の実施形態では、腫瘍細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
５４．特定の実施形態では、前記方法は、選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを得ることをさらに含み、任意で腫瘍ワクチンを対象に投与することをさらに含む。
５５．特定の実施形態では、前記選択された新生抗原のセット内の新生抗原の少なくとも１つは、ポリペプチド形態である場合、以下のうちの少なくとも１つを含む：ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満のＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラス１のポリペプチドではアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在。
５６．本明細書ではまた、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法であって、
複数の試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット及び各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を実行することを含む方法も開示される。
５７．特定の実施形態では、提示モデルは、
ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を有する前記ペプチド配列の、腫瘍細胞上のＭＨＣアレルのうちの１つによる提示の尤度との間の依存性を表す。
５８．特定の実施形態では、前記試料は、単一のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含む。
５９．特定の実施形態では、前記試料は、複数のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩアレルを発現するように操作された細胞株を含む。
６０．特定の実施形態では、前記試料は、複数の患者から得られた、または複数の患者に由来するヒト細胞株を含む。
６１．特定の実施形態では、前記試料は、複数の患者から得られた新鮮な、または凍結された腫瘍試料を含む。
６２．特定の実施形態では、前記試料は、Ｔ細胞アッセイを用いて特定されたペプチドを含む。
６３．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含む。
６４．特定の実施形態では、前記訓練データセットを取得することは、
既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、前記訓練ペプチド配列に基づいて、前記訓練ペプチド配列よりも長くかつ前記訓練ペプチド配列を含む前記訓練タンパク質配列のセットを取得することを含む。
６５．特定の実施形態では、前記訓練データセットを取得することは、
細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析がこれまでに行われていることを含んでもよく、前記ヌクレオチドシークエンシングデータは、変異を含む少なくとも１つのタンパク質配列を含む。
６６．特定の実施形態では、前記提示モデルのパラメータのセットを訓練することは、
ワン・ホット（ｏｎｅ－ｈｏｔ）エンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
６７．特定の実施形態では、前記方法は、さらに、
正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得することと、
前記正常ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて、前記提示モデルの前記パラメータのセットを訓練することと、を含む。
６８．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含む。
６９．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するＭＨＣペプチドーム配列に関連するデータをさらに含む。
７０．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連するデータをさらに含む。
７１．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記単離されたペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連するデータをさらに含む。
７２．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含む。
７３．特定の実施形態では、前記訓練データセットは、前記試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含む。
７４．特定の実施形態では、前記数値パラメータのセットを訓練することは、さらに、
前記パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含む。
７５．特定の実施形態では、前記訓練ペプチド配列は、ｋマーの範囲の長さのものであり、ただしｋは８～１５である。
７６．特定の実施形態では、前記提示モデルの前記数値パラメータのセットを訓練することは、
レフトパディング（ｌｅｆｔ－ｐａｄｄｅｄ）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
７７．特定の実施形態では、前記数値パラメータのセットを訓練することは、さらに、
ディープラーニングアルゴリズムを用いて前記パラメータのセットについて値を決定することを含む。
７８．本明細書ではまた、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法であって、
複数の新鮮なまたは凍結腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、
前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法が開示される。
７９．特定の実施形態では、前記提示モデルは、
ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表す。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> GRITSTONE BIO, INC.
<120> ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
<150> US 62/590,163
<151> 2017-11-22
<150> US 62/523,201
<151> 2017-06-21
<150> US 62/503,283
<151> 2017-05-08
<160> 193
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 36519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 1
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagatga ggcacctgag agacctgccc 600
gatgagaaaa tcatcatcgc ttccgggaac gagattctgg aactggtggt aaatgccatg 660
atgggcgacg accctccgga gccccccacc ccatttgaga caccttcgct gcacgatttg 720
tatgatctgg aggtggatgt gcccgaggac gatcccaatg aggaggcggt aaatgatttt 780
tttagcgatg ccgcgctgct agctgccgag gaggcttcga gctctagctc agacagcgac 840
tcttcactgc atacccctag acccggcaga ggtgagaaaa agatccccga gcttaaaggg 900
gaagagatgg acttgcgctg ctatgaggaa tgcttgcccc cgagcgatga tgaggacgag 960
caggcgatcc agaacgcagc gagccaggga gtgcaagccg ccagcgagag ctttgcgctg 1020
gactgcccgc ctctgcccgg acacggctgt aagtcttgtg aatttcatcg catgaatact 1080
ggagataaag ctgtgttgtg tgcactttgc tatatgagag cttacaacca ttgtgtttac 1140
agtaagtgtg attaagttga actttagagg gaggcagaga gcagggtgac tgggcgatga 1200
ctggtttatt tatgtatata tgttctttat ataggtcccg tctctgacgc agatgatgag 1260
acccccacta caaagtccac ttcgtcaccc ccagaaattg gcacatctcc acctgagaat 1320
attgttagac cagttcctgt tagagccact gggaggagag cagctgtgga atgtttggat 1380
gacttgctac agggtggggt tgaacctttg gacttgtgta cccggaaacg ccccaggcac 1440
taagtgccac acatgtgtgt ttacttgagg tgatgtcagt atttataggg tgtggagtgc 1500
aataaaaaat gtgttgactt taagtgcgtg gtttatgact caggggtggg gactgtgagt 1560
atataagcag gtgcagacct gtgtggttag ctcagagcgg catggagatt tggacggtct 1620
tggaagactt tcacaagact agacagctgc tagagaacgc ctcgaacgga gtctcttacc 1680
tgtggagatt ctgcttcggt ggcgacctag ctaggctagt ctacagggcc aaacaggatt 1740
atagtgaaca atttgaggtt attttgagag agtgttctgg tctttttgac gctcttaact 1800
tgggccatca gtctcacttt aaccagagga tttcgagagc ccttgatttt actactcctg 1860
gcagaaccac tgcagcagta gccttttttg cttttattct tgacaaatgg agtcaagaaa 1920
cccatttcag cagggattac cagctggatt tcttagcagt agctttgtgg agaacatgga 1980
agtgccagcg cctgaatgca atctccggct acttgccggt acagccgcta gacactctga 2040
ggatcctgaa tctccaggag agtcccaggg cacgccaacg tcgccagcag cagcagcagg 2100
aggaggatca agaagagaac ccgagagccg gcctggaccc tccggcggag gaggaggagt 2160
agctgacctg tttcctgaac tgcgccgggt gctgactagg tcttcgagtg gtcgggagag 2220
ggggattaag cgggagaggc atgatgagac taatcacaga actgaactga ctgtgggtct 2280
gatgagtcgc aagcgcccag aaacagtgtg gtggcatgag gtgcagtcga ctggcacaga 2340
tgaggtgtcg gtgatgcatg agaggttttc tctagaacaa gtcaagactt gttggttaga 2400
gcctgaggat gattgggagg tagccatcag gaattatgcc aagctggctc tgaggccaga 2460
caagaagtac aagattacta agctgataaa tatcagaaat gcctgctaca tctcagggaa 2520
tggggctgaa gtggagatct gtctccagga aagggtggct ttcagatgct gcatgatgaa 2580
tatgtacccg ggagtggtgg gcatggatgg ggttaccttt atgaacatga ggttcagggg 2640
agatgggtat aatggcacgg tctttatggc caataccaag ctgacagtcc atggctgctc 2700
cttctttggg tttaataaca cctgcatcga ggcctggggt caggtcggtg tgaggggctg 2760
cagtttttca gccaactgga tgggggtcgt gggcaggacc aagagtatgc tgtccgtgaa 2820
gaaatgcttg tttgagaggt gccacctggg ggtgatgagc gagggcgaag ccagaatccg 2880
ccactgcgcc tctaccgaga cgggctgctt tgtgctgtgc aagggcaatg ctaagatcaa 2940
gcataatatg atctgtggag cctcggacga gcgcggctac cagatgctga cctgcgccgg 3000
cgggaacagc catatgctgg ccaccgtaca tgtggcttcc catgctcgca agccctggcc 3060
cgagttcgag cacaatgtca tgaccaggtg caatatgcat ctggggtccc gccgaggcat 3120
gttcatgccc taccagtgca acctgaatta tgtgaaggtg ctgctggagc ccgatgccat 3180
gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gaggtgtgga agattctgag 3240
atatgatgaa tccaagacca ggtgccgagc ctgcgagtgc ggagggaagc atgccaggtt 3300
ccagcccgtg tgtgtggatg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg tgttgccctg 3360
caccgggacg gagttcggtt ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt agtgttctgg 3420
ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat ctgtgctttt ctgtgtgttg 3480
cagcagcatg agcggaagcg gctcctttga gggaggggta ttcagccctt atctgacggg 3540
gcgtctcccc tcctgggcgg gagtgcgtca gaatgtgatg ggatccacgg tggacggccg 3600
gcccgtgcag cccgcgaact cttcaaccct gacctatgca accctgagct cttcgtcgtt 3660
ggacgcagct gccgccgcag ctgctgcatc tgccgccagc gccgtgcgcg gaatggccat 3720
gggcgccggc tactacggca ctctggtggc caactcgagt tccaccaata atcccgccag 3780
cctgaacgag gagaagctgt tgctgctgat ggcccagctc gaggccttga cccagcgcct 3840
gggcgagctg acccagcagg tggctcagct gcaggagcag acgcgggccg cggttgccac 3900
ggtgaaatcc aaataaaaaa tgaatcaata aataaacgga gacggttgtt gattttaaca 3960
cagagtctga atctttattt gatttttcgc gcgcggtagg ccctggacca ccggtctcga 4020
tcattgagca cccggtggat cttttccagg acccggtaga ggtgggcttg gatgttgagg 4080
tacatgggca tgagcccgtc ccgggggtgg aggtagctcc attgcagggc ctcgtgctcg 4140
ggggtggtgt tgtaaatcac ccagtcatag caggggcgca gggcatggtg ttgcacaata 4200
tctttgagga ggagactgat ggccacgggc agccctttgg tgtaggtgtt tacaaatctg 4260
ttgagctggg agggatgcat gcggggggag atgaggtgca tcttggcctg gatcttgaga 4320
ttggcgatgt taccgcccag atcccgcctg gggttcatgt tgtgcaggac caccagcacg 4380
gtgtatccgg tgcacttggg gaatttatca tgcaacttgg aagggaaggc gtgaaagaat 4440
ttggcgacgc ctttgtgccc gcccaggttt tccatgcact catccatgat gatggcgatg 4500
ggcccgtggg cggcggcctg ggcaaagacg tttcgggggt cggacacatc atagttgtgg 4560
tcctgggtga ggtcatcata ggccatttta atgaatttgg ggcggagggt gccggactgg 4620
gggacaaagg taccctcgat cccgggggcg tagttcccct cacagatctg catctcccag 4680
gctttgagct cggagggggg gatcatgtcc acctgcgggg cgataaagaa cacggtttcc 4740
ggggcggggg agatgagctg ggccgaaagc aagttccgga gcagctggga cttgccgcag 4800
ccggtggggc cgtagatgac cccgatgacc ggctgcaggt ggtagttgag ggagagacag 4860
ctgccgtcct cccggaggag gggggccacc tcgttcatca tctcgcgcac gtgcatgttc 4920
tcgcgcacca gttccgccag gaggcgctct ccccccaggg ataggagctc ctggagcgag 4980
gcgaagtttt tcagcggctt gagtccgtcg gccatgggca ttttggagag ggtttgttgc 5040
aagagttcca ggcggtccca gagctcggtg atgtgctcta cggcatctcg atccagcaga 5100
cctcctcgtt tcgcgggttg ggacggctgc gggagtaggg caccagacga tgggcgtcca 5160
gcgcagccag ggtccggtcc ttccagggtc gcagcgtccg cgtcagggtg gtctccgtca 5220
cggtgaaggg gtgcgcgccg ggctgggcgc ttgcgagggt gcgcttcagg ctcatccggc 5280
tggtcgaaaa ccgctcccga tcggcgccct gcgcgtcggc caggtagcaa ttgaccatga 5340
gttcgtagtt gagcgcctcg gccgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagtct 5400
gcccgcaggc gggacagagg agggacttga gggcgtagag cttgggggcg aggaagacgg 5460
actcgggggc gtaggcgtcc gcgccgcagt gggcgcagac ggtctcgcac tccacgagcc 5520
aggtgaggtc gggctggtcg gggtcaaaaa ccagtttccc gccgttcttt ttgatgcgtt 5580
tcttaccttt ggtctccatg agctcgtgtc cccgctgggt gacaaagagg ctgtccgtgt 5640
ccccgtagac cgactttatg ggccggtcct cgagcggtgt gccgcggtcc tcctcgtaga 5700
ggaaccccgc ccactccgag acgaaagccc gggtccaggc cagcacgaag gaggccacgt 5760
gggacgggta gcggtcgttg tccaccagcg ggtccacctt ttccagggta tgcaaacaca 5820
tgtccccctc gtccacatcc aggaaggtga ttggcttgta agtgtaggcc acgtgaccgg 5880
gggtcccggc cgggggggta taaaagggtg cgggtccctg ctcgtcctca ctgtcttccg 5940
gatcgctgtc caggagcgcc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga 6000
cctcggcact caggttgtca gtttctagaa acgaggagga tttgatattg acggtgccgg 6060
cggagatgcc tttcaagagc ccctcgtcca tctggtcaga aaagacgatc tttttgttgt 6120
cgagcttggt ggcgaaggag ccgtagaggg cgttggagag gagcttggcg atggagcgca 6180
tggtctggtt tttttccttg tcggcgcgct ccttggcggc gatgttgagc tgcacgtact 6240
cgcgcgccac gcacttccat tcggggaaga cggtggtcag ctcgtcgggc acgattctga 6300
cctgccagcc ccgattatgc agggtgatga ggtccacact ggtggccacc tcgccgcgca 6360
ggggctcatt agtccagcag aggcgtccgc ccttgcgcga gcagaagggg ggcagggggt 6420
ccagcatgac ctcgtcgggg gggtcggcat cgatggtgaa gatgccgggc aggaggtcgg 6480
ggtcaaagta gctgatggaa gtggccagat cgtccagggc agcttgccat tcgcgcacgg 6540
ccagcgcgcg ctcgtaggga ctgaggggcg tgccccaggg catgggatgg gtaagcgcgg 6600
aggcgtacat gccgcagatg tcgtagacgt agaggggctc ctcgaggatg ccgatgtagg 6660
tggggtagca gcgccccccg cggatgctgg cgcgcacgta gtcatacagc tcgtgcgagg 6720
gggcgaggag ccccgggccc aggttggtgc gactgggctt ttcggcgcgg tagacgatct 6780
ggcggaaaat ggcatgcgag ttggaggaga tggtgggcct ttggaagatg ttgaagtggg 6840
cgtggggcag tccgaccgag tcgcggatga agtgggcgta ggagtcttgc agcttggcga 6900
cgagctcggc ggtgactagg acgtccagag cgcagtagtc gagggtctcc tggatgatgt 6960
catacttgag ctgtcccttt tgtttccaca gctcgcggtt gagaaggaac tcttcgcggt 7020
ccttccagta ctcttcgagg gggaacccgt cctgatctgc acggtaagag cctagcatgt 7080
agaactggtt gacggccttg taggcgcagc agcccttctc cacggggagg gcgtaggcct 7140
gggcggcctt gcgcagggag gtgtgcgtga gggcgaaagt gtccctgacc atgaccttga 7200
ggaactggtg cttgaagtcg atatcgtcgc agcccccctg ctcccagagc tggaagtccg 7260
tgcgcttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac atcgttgaag aggatcttgc 7320
ccgcgcgggg cataaagttg cgagtgatgc ggaaaggttg gggcacctcg gcccggttgt 7380
tgatgacctg ggcggcgagc acgatctcgt cgaagccgtt gatgttgtgg cccacgatgt 7440
agagttccac gaatcgcgga cggcccttga cgtggggcag tttcttgagc tcctcgtagg 7500
tgagctcgtc ggggtcgctg agcccgtgct gctcgagcgc ccagtcggcg agatgggggt 7560
tggcgcggag gaaggaagtc cagagatcca cggccagggc ggtttgcaga cggtcccggt 7620
actgacggaa ctgctgcccg acggccattt tttcgggggt gacgcagtag aaggtgcggg 7680
ggtccccgtg ccagcgatcc catttgagct ggagggcgag atcgagggcg agctcgacga 7740
gccggtcgtc cccggagagt ttcatgacca gcatgaaggg gacgagctgc ttgccgaagg 7800
accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgaggaa gagcctttcg gtgcgaggat 7860
gcgagccgat ggggaagaac tggatctcct gccaccaatt ggaggaatgg ctgttgatgt 7920
gatggaagta gaaatgccga cggcgcgccg aacactcgtg cttgtgttta tacaagcggc 7980
cacagtgctc gcaacgctgc acgggatgca cgtgctgcac gagctgtacc tgagttcctt 8040
tgacgaggaa tttcagtggg aagtggagtc gtggcgcctg catctcgtgc tgtactacgt 8100
cgtggtggtc ggcctggccc tcttctgcct cgatggtggt catgctgacg agcccgcgcg 8160
ggaggcaggt ccagacctcg gcgcgagcgg gtcggagagc gaggacgagg gcgcgcaggc 8220
cggagctgtc cagggtcctg agacgctgcg gagtcaggtc agtgggcagc ggcggcgcgc 8280
ggttgacttg caggagtttt tccagggcgc gcgggaggtc cagatggtac ttgatctcca 8340
ccgcgccatt ggtggcgacg tcgatggctt gcagggtccc gtgcccctgg ggtgtgacca 8400
ccgtcccccg tttcttcttg ggcggctggg gcgacggggg cggtgcctct tccatggtta 8460
gaagcggcgg cgaggacgcg cgccgggcgg caggggcggc tcggggcccg gaggcagggg 8520
cggcaggggc acgtcggcgc cgcgcgcggg taggttctgg tactgcgccc ggagaagact 8580
ggcgtgagcg acgacgcgac ggttgacgtc ctggatctga cgcctctggg tgaaggccac 8640
gggacccgtg agtttgaacc tgaaagagag ttcgacagaa tcaatctcgg tatcgttgac 8700
ggcggcctgc cgcaggatct cttgcacgtc gcccgagttg tcctggtagg cgatctcggt 8760
catgaactgc tcgatctcct cctcttgaag gtctccgcgg ccggcgcgct ccacggtggc 8820
cgcgaggtcg ttggagatgc ggcccatgag ctgcgagaag gcgttcatgc ccgcctcgtt 8880
ccagacgcgg ctgtagacca cgacgccctc gggatcgcgg gcgcgcatga ccacctgggc 8940
gaggttgagc tccacgtggc gcgtgaagac cgcgtagttg cagaggcgct ggtagaggta 9000
gttgagcgtg gtggcgatgt gctcggtgac gaagaaatac atgatccagc ggcggagcgg 9060
catctcgctg acgtcgccca gcgcctccaa acgttccatg gcctcgtaaa agtccacggc 9120
gaagttgaaa aactgggagt tgcgcgccga gacggtcaac tcctcctcca gaagacggat 9180
gagctcggcg atggtggcgc gcacctcgcg ctcgaaggcc cccgggagtt cctccacttc 9240
ctcttcttcc tcctccacta acatctcttc tacttcctcc tcaggcggca gtggtggcgg 9300
gggagggggc ctgcgtcgcc ggcggcgcac gggcagacgg tcgatgaagc gctcgatggt 9360
ctcgccgcgc cggcgtcgca tggtctcggt gacggcgcgc ccgtcctcgc ggggccgcag 9420
cgtgaagacg ccgccgcgca tctccaggtg gccggggggg tccccgttgg gcagggagag 9480
ggcgctgacg atgcatctta tcaattgccc cgtagggact ccgcgcaagg acctgagcgt 9540
ctcgagatcc acgggatctg aaaaccgctg aacgaaggct tcgagccagt cgcagtcgca 9600
aggtaggctg agcacggttt cttctggcgg gtcatgttgg ttgggagcgg ggcgggcgat 9660
gctgctggtg atgaagttga aataggcggt tctgagacgg cggatggtgg cgaggagcac 9720
caggtctttg ggcccggctt gctggatgcg cagacggtcg gccatgcccc aggcgtggtc 9780
ctgacacctg gccaggtcct tgtagtagtc ctgcatgagc cgctccacgg gcacctcctc 9840
ctcgcccgcg cggccgtgca tgcgcgtgag cccgaagccg cgctggggct ggacgagcgc 9900
caggtcggcg acgacgcgct cggcgaggat ggcttgctgg atctgggtga gggtggtctg 9960
gaagtcatca aagtcgacga agcggtggta ggctccggtg ttgatggtgt aggagcagtt 10020
ggccatgacg gaccagttga cggtctggtg gcccggacgc acgagctcgt ggtacttgag 10080
gcgcgagtag gcgcgcgtgt cgaagatgta gtcgttgcag gtgcgcacca ggtactggta 10140
gccgatgagg aagtgcggcg gcggctggcg gtagagcggc catcgctcgg tggcgggggc 10200
gccgggcgcg aggtcctcga gcatggtgcg gtggtagccg tagatgtacc tggacatcca 10260
ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cgggaactcg cggacgcggt tccagatgtt 10320
gcgcagcggc aggaagtagt tcatggtggg cacggtctgg cccgtgaggc gcgcgcagtc 10380
gtggatgctc tatacgggca aaaacgaaag cggtcagcgg ctcgactccg tggcctggag 10440
gctaagcgaa cgggttgggc tgcgcgtgta ccccggttcg aatctcgaat caggctggag 10500
ccgcagctaa cgtggtattg gcactcccgt ctcgacccaa gcctgcacca accctccagg 10560
atacggaggc gggtcgtttt gcaacttttt tttggaggcc ggatgagact agtaagcgcg 10620
gaaagcggcc gaccgcgatg gctcgctgcc gtagtctgga gaagaatcgc cagggttgcg 10680
ttgcggtgtg ccccggttcg aggccggccg gattccgcgg ctaacgaggg cgtggctgcc 10740
ccgtcgtttc caagacccca tagccagccg acttctccag ttacggagcg agcccctctt 10800
ttgttttgtt tgtttttgcc agatgcatcc cgtactgcgg cagatgcgcc cccaccaccc 10860
tccaccgcaa caacagcccc ctccacagcc ggcgcttctg cccccgcccc agcagcaact 10920
tccagccacg accgccgcgg ccgccgtgag cggggctgga cagagttatg atcaccagct 10980
ggccttggaa gagggcgagg ggctggcgcg cctgggggcg tcgtcgccgg agcggcaccc 11040
gcgcgtgcag atgaaaaggg acgctcgcga ggcctacgtg cccaagcaga acctgttcag 11100
agacaggagc ggcgaggagc ccgaggagat gcgcgcggcc cggttccacg cggggcggga 11160
gctgcggcgc ggcctggacc gaaagagggt gctgagggac gaggatttcg aggcggacga 11220
gctgacgggg atcagccccg cgcgcgcgca cgtggccgcg gccaacctgg tcacggcgta 11280
cgagcagacc gtgaaggagg agagcaactt ccaaaaatcc ttcaacaacc acgtgcgcac 11340
cctgatcgcg cgcgaggagg tgaccctggg cctgatgcac ctgtgggacc tgctggaggc 11400
catcgtgcag aaccccacca gcaagccgct gacggcgcag ctgttcctgg tggtgcagca 11460
tagtcgggac aacgaagcgt tcagggaggc gctgctgaat atcaccgagc ccgagggccg 11520
ctggctcctg gacctggtga acattctgca gagcatcgtg gtgcaggagc gcgggctgcc 11580
gctgtccgag aagctggcgg ccatcaactt ctcggtgctg agtttgggca agtactacgc 11640
taggaagatc tacaagaccc cgtacgtgcc catagacaag gaggtgaaga tcgacgggtt 11700
ttacatgcgc atgaccctga aagtgctgac cctgagcgac gatctggggg tgtaccgcaa 11760
cgacaggatg caccgtgcgg tgagcgccag caggcggcgc gagctgagcg accaggagct 11820
gatgcatagt ctgcagcggg ccctgaccgg ggccgggacc gagggggaga gctactttga 11880
catgggcgcg gacctgcact ggcagcccag ccgccgggcc ttggaggcgg cggcaggacc 11940
ctacgtagaa gaggtggacg atgaggtgga cgaggagggc gagtacctgg aagactgatg 12000
gcgcgaccgt atttttgcta gatgcaacaa caacagccac ctcctgatcc cgcgatgcgg 12060
gcggcgctgc agagccagcc gtccggcatt aactcctcgg acgattggac ccaggccatg 12120
caacgcatca tggcgctgac gacccgcaac cccgaagcct ttagacagca gccccaggcc 12180
aaccggctct cggccatcct ggaggccgtg gtgccctcgc gctccaaccc cacgcacgag 12240
aaggtcctgg ccatcgtgaa cgcgctggtg gagaacaagg ccatccgcgg cgacgaggcc 12300
ggcctggtgt acaacgcgct gctggagcgc gtggcccgct acaacagcac caacgtgcag 12360
accaacctgg accgcatggt gaccgacgtg cgcgaggccg tggcccagcg cgagcggttc 12420
caccgcgagt ccaacctggg atccatggtg gcgctgaacg ccttcctcag cacccagccc 12480
gccaacgtgc cccggggcca ggaggactac accaacttca tcagcgccct gcgcctgatg 12540
gtgaccgagg tgccccagag cgaggtgtac cagtccgggc cggactactt cttccagacc 12600
agtcgccagg gcttgcagac cgtgaacctg agccaggctt tcaagaactt gcagggcctg 12660
tggggcgtgc aggccccggt cggggaccgc gcgacggtgt cgagcctgct gacgccgaac 12720
tcgcgcctgc tgctgctgct ggtggccccc ttcacggaca gcggcagcat caaccgcaac 12780
tcgtacctgg gctacctgat taacctgtac cgcgaggcca tcggccaggc gcacgtggac 12840
gagcagacct accaggagat cacccacgtg agccgcgccc tgggccagga cgacccgggc 12900
aacctggaag ccaccctgaa ctttttgctg accaaccggt cgcagaagat cccgccccag 12960
tacgcgctca gcaccgagga ggagcgcatc ctgcgttacg tgcagcagag cgtgggcctg 13020
ttcctgatgc aggagggggc cacccccagc gccgcgctcg acatgaccgc gcgcaacatg 13080
gagcccagca tgtacgccag caaccgcccg ttcatcaata aactgatgga ctacttgcat 13140
cgggcggccg ccatgaactc tgactatttc accaacgcca tcctgaatcc ccactggctc 13200
ccgccgccgg ggttctacac gggcgagtac gacatgcccg accccaatga cgggttcctg 13260
tgggacgatg tggacagcag cgtgttctcc ccccgaccgg gtgctaacga gcgccccttg 13320
tggaagaagg aaggcagcga ccgacgcccg tcctcggcgc tgtccggccg cgagggtgct 13380
gccgcggcgg tgcccgaggc cgccagtcct ttcccgagct tgcccttctc gctgaacagt 13440
atccgcagca gcgagctggg caggatcacg cgcccgcgct tgctgggcga agaggagtac 13500
ttgaatgact cgctgttgag acccgagcgg gagaagaact tccccaataa cgggatagaa 13560
agcctggtgg acaagatgag ccgctggaag acgtatgcgc aggagcacag ggacgatccc 13620
cgggcgtcgc agggggccac gagccggggc agcgccgccc gtaaacgccg gtggcacgac 13680
aggcagcggg gacagatgtg ggacgatgag gactccgccg acgacagcag cgtgttggac 13740
ttgggtggga gtggtaaccc gttcgctcac ctgcgccccc gtatcgggcg catgatgtaa 13800
gagaaaccga aaataaatga tactcaccaa ggccatggcg accagcgtgc gttcgtttct 13860
tctctgttgt tgttgtatct agtatgatga ggcgtgcgta cccggagggt cctcctccct 13920
cgtacgagag cgtgatgcag caggcgatgg cggcggcggc gatgcagccc ccgctggagg 13980
ctccttacgt gcccccgcgg tacctggcgc ctacggaggg gcggaacagc attcgttact 14040
cggagctggc acccttgtac gataccaccc ggttgtacct ggtggacaac aagtcggcgg 14100
acatcgcctc gctgaactac cagaacgacc acagcaactt cctgaccacc gtggtgcaga 14160
acaatgactt cacccccacg gaggccagca cccagaccat caactttgac gagcgctcgc 14220
ggtggggcgg ccagctgaaa accatcatgc acaccaacat gcccaacgtg aacgagttca 14280
tgtacagcaa caagttcaag gcgcgggtga tggtctcccg caagaccccc aatggggtga 14340
cagtgacaga ggattatgat ggtagtcagg atgagctgaa gtatgaatgg gtggaatttg 14400
agctgcccga aggcaacttc tcggtgacca tgaccatcga cctgatgaac aacgccatca 14460
tcgacaatta cttggcggtg gggcggcaga acggggtgct ggagagcgac atcggcgtga 14520
agttcgacac taggaacttc aggctgggct gggaccccgt gaccgagctg gtcatgcccg 14580
gggtgtacac caacgaggct ttccatcccg atattgtctt gctgcccggc tgcggggtgg 14640
acttcaccga gagccgcctc agcaacctgc tgggcattcg caagaggcag cccttccagg 14700
aaggcttcca gatcatgtac gaggatctgg aggggggcaa catccccgcg ctcctggatg 14760
tcgacgccta tgagaaaagc aaggaggatg cagcagctga agcaactgca gccgtagcta 14820
ccgcctctac cgaggtcagg ggcgataatt ttgcaagcgc cgcagcagtg gcagcggccg 14880
aggcggctga aaccgaaagt aagatagtca ttcagccggt ggagaaggat agcaagaaca 14940
ggagctacaa cgtactaccg gacaagataa acaccgccta ccgcagctgg tacctagcct 15000
acaactatgg cgaccccgag aagggcgtgc gctcctggac gctgctcacc acctcggacg 15060
tcacctgcgg cgtggagcaa gtctactggt cgctgcccga catgatgcaa gacccggtca 15120
ccttccgctc cacgcgtcaa gttagcaact acccggtggt gggcgccgag ctcctgcccg 15180
tctactccaa gagcttcttc aacgagcagg ccgtctactc gcagcagctg cgcgccttca 15240
cctcgcttac gcacgtcttc aaccgcttcc ccgagaacca gatcctcgtc cgcccgcccg 15300
cgcccaccat taccaccgtc agtgaaaacg ttcctgctct cacagatcac gggaccctgc 15360
cgctgcgcag cagtatccgg ggagtccagc gcgtgaccgt tactgacgcc agacgccgca 15420
cctgccccta cgtctacaag gccctgggca tagtcgcgcc gcgcgtcctc tcgagccgca 15480
ccttctaaat gtccattctc atctcgccca gtaataacac cggttggggc ctgcgcgcgc 15540
ccagcaagat gtacggaggc gctcgccaac gctccacgca acaccccgtg cgcgtgcgcg 15600
ggcacttccg cgctccctgg ggcgccctca agggccgcgt gcggtcgcgc accaccgtcg 15660
acgacgtgat cgaccaggtg gtggccgacg cgcgcaacta cacccccgcc gccgcgcccg 15720
tctccaccgt ggacgccgtc atcgacagcg tggtggccga cgcgcgccgg tacgcccgcg 15780
ccaagagccg gcggcggcgc atcgcccggc ggcaccggag cacccccgcc atgcgcgcgg 15840
cgcgagcctt gctgcgcagg gccaggcgca cgggacgcag ggccatgctc agggcggcca 15900
gacgcgcggc ttcaggcgcc agcgccggca ggacccggag acgcgcggcc acggcggcgg 15960
cagcggccat cgccagcatg tcccgcccgc ggcgagggaa cgtgtactgg gtgcgcgacg 16020
ccgccaccgg tgtgcgcgtg cccgtgcgca cccgcccccc tcgcacttga agatgttcac 16080
ttcgcgatgt tgatgtgtcc cagcggcgag gaggatgtcc aagcgcaaat tcaaggaaga 16140
gatgctccag gtcatcgcgc ctgagatcta cggccctgcg gtggtgaagg aggaaagaaa 16200
gccccgcaaa atcaagcggg tcaaaaagga caaaaaggaa gaagaaagtg atgtggacgg 16260
attggtggag tttgtgcgcg agttcgcccc ccggcggcgc gtgcagtggc gcgggcggaa 16320
ggtgcaaccg gtgctgagac ccggcaccac cgtggtcttc acgcccggcg agcgctccgg 16380
caccgcttcc aagcgctcct acgacgaggt gtacggggat gatgatattc tggagcaggc 16440
ggccgagcgc ctgggcgagt ttgcttacgg caagcgcagc cgttccgcac cgaaggaaga 16500
ggcggtgtcc atcccgctgg accacggcaa ccccacgccg agcctcaagc ccgtgacctt 16560
gcagcaggtg ctgccgaccg cggcgccgcg ccgggggttc aagcgcgagg gcgaggatct 16620
gtaccccacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag ctggaagacg tgctggagac 16680
catgaaggtg gacccggacg tgcagcccga ggtcaaggtg cggcccatca agcaggtggc 16740
cccgggcctg ggcgtgcaga ccgtggacat caagattccc acggagccca tggaaacgca 16800
gaccgagccc atgatcaagc ccagcaccag caccatggag gtgcagacgg atccctggat 16860
gccatcggct cctagtcgaa gaccccggcg caagtacggc gcggccagcc tgctgatgcc 16920
caactacgcg ctgcatcctt ccatcatccc cacgccgggc taccgcggca cgcgcttcta 16980
ccgcggtcat accagcagcc gccgccgcaa gaccaccact cgccgccgcc gtcgccgcac 17040
cgccgctgca accacccctg ccgccctggt gcggagagtg taccgccgcg gccgcgcacc 17100
tctgaccctg ccgcgcgcgc gctaccaccc gagcatcgcc atttaaactt tcgcctgctt 17160
tgcagatcaa tggccctcac atgccgcctt cgcgttccca ttacgggcta ccgaggaaga 17220
aaaccgcgcc gtagaaggct ggcggggaac gggatgcgtc gccaccacca ccggcggcgg 17280
cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc 17340
gcggcgatcg gggcgatccc cggcattgct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac 17400
tgagacacac ttggaaacat cttgtaataa accaatggac tctgacgctc ctggtcctgt 17460
gatgtgtttt cgtagacaga tggaagacat caatttttcg tccctggctc cgcgacacgg 17520
cacgcggccg ttcatgggca cctggagcga catcggcacc agccaactga acgggggcgc 17580
cttcaattgg agcagtctct ggagcgggct taagaatttc gggtccacgc ttaaaaccta 17640
tggcagcaag gcgtggaaca gcaccacagg gcaggcgctg agggataagc tgaaagagca 17700
gaacttccag cagaaggtgg tcgatgggct cgcctcgggc atcaacgggg tggtggacct 17760
ggccaaccag gccgtgcagc ggcagatcaa cagccgcctg gacccggtgc cgcccgccgg 17820
ctccgtggag atgccgcagg tggaggagga gctgcctccc ctggacaagc ggggcgagaa 17880
gcgaccccgc cccgatgcgg aggagacgct gctgacgcac acggacgagc cgcccccgta 17940
cgaggaggcg gtgaaactgg gtctgcccac cacgcggccc atcgcgcccc tggccaccgg 18000
ggtgctgaaa cccgaaaagc ccgcgaccct ggacttgcct cctccccagc cttcccgccc 18060
ctctacagtg gctaagcccc tgccgccggt ggccgtggcc cgcgcgcgac ccgggggcac 18120
cgcccgccct catgcgaact ggcagagcac tctgaacagc atcgtgggtc tgggagtgca 18180
gagtgtgaag cgccgccgct gctattaaac ctaccgtagc gcttaacttg cttgtctgtg 18240
tgtgtatgta ttatgtcgcc gccgccgctg tccaccagaa ggaggagtga agaggcgcgt 18300
cgccgagttg caagatggcc accccatcga tgctgcccca gtgggcgtac atgcacatcg 18360
ccggacagga cgcttcggag tacctgagtc cgggtctggt gcagtttgcc cgcgccacag 18420
acacctactt cagtctgggg aacaagttta ggaaccccac ggtggcgccc acgcacgatg 18480
tgaccaccga ccgcagccag cggctgacgc tgcgcttcgt gcccgtggac cgcgaggaca 18540
acacctactc gtacaaagtg cgctacacgc tggccgtggg cgacaaccgc gtgctggaca 18600
tggccagcac ctactttgac atccgcggcg tgctggatcg gggccctagc ttcaaaccct 18660
actccggcac cgcctacaac agtctggccc ccaagggagc acccaacact tgtcagtgga 18720
catataaagc cgatggtgaa actgccacag aaaaaaccta tacatatgga aatgcacccg 18780
tgcagggcat taacatcaca aaagatggta ttcaacttgg aactgacacc gatgatcagc 18840
caatctacgc agataaaacc tatcagcctg aacctcaagt gggtgatgct gaatggcatg 18900
acatcactgg tactgatgaa aagtatggag gcagagctct taagcctgat accaaaatga 18960
agccttgtta tggttctttt gccaagccta ctaataaaga aggaggtcag gcaaatgtga 19020
aaacaggaac aggcactact aaagaatatg acatagacat ggctttcttt gacaacagaa 19080
gtgcggctgc tgctggccta gctccagaaa ttgttttgta tactgaaaat gtggatttgg 19140
aaactccaga tacccatatt gtatacaaag caggcacaga tgacagcagc tcttctatta 19200
atttgggtca gcaagccatg cccaacagac ctaactacat tggtttcaga gacaacttta 19260
tcgggctcat gtactacaac agcactggca atatgggggt gctggccggt caggcttctc 19320
agctgaatgc tgtggttgac ttgcaagaca gaaacaccga gctgtcctac cagctcttgc 19380
ttgactctct gggtgacaga acccggtatt tcagtatgtg gaatcaggcg gtggacagct 19440
atgatcctga tgtgcgcatt attgaaaatc atggtgtgga ggatgaactt cccaactatt 19500
gtttccctct ggatgctgtt ggcagaacag atacttatca gggaattaag gctaatggaa 19560
ctgatcaaac cacatggacc aaagatgaca gtgtcaatga tgctaatgag ataggcaagg 19620
gtaatccatt cgccatggaa atcaacatcc aagccaacct gtggaggaac ttcctctacg 19680
ccaacgtggc cctgtacctg cccgactctt acaagtacac gccggccaat gttaccctgc 19740
ccaccaacac caacacctac gattacatga acggccgggt ggtggcgccc tcgctggtgg 19800
actcctacat caacatcggg gcgcgctggt cgctggatcc catggacaac gtgaacccct 19860
tcaaccacca ccgcaatgcg gggctgcgct accgctccat gctcctgggc aacgggcgct 19920
acgtgccctt ccacatccag gtgccccaga aatttttcgc catcaagagc ctcctgctcc 19980
tgcccgggtc ctacacctac gagtggaact tccgcaagga cgtcaacatg atcctgcaga 20040
gctccctcgg caacgacctg cgcacggacg gggcctccat ctccttcacc agcatcaacc 20100
tctacgccac cttcttcccc atggcgcaca acacggcctc cacgctcgag gccatgctgc 20160
gcaacgacac caacgaccag tccttcaacg actacctctc ggcggccaac atgctctacc 20220
ccatcccggc caacgccacc aacgtgccca tctccatccc ctcgcgcaac tgggccgcct 20280
tccgcggctg gtccttcacg cgtctcaaga ccaaggagac gccctcgctg ggctccgggt 20340
tcgaccccta cttcgtctac tcgggctcca tcccctacct cgacggcacc ttctacctca 20400
accacacctt caagaaggtc tccatcacct tcgactcctc cgtcagctgg cccggcaacg 20460
accggctcct gacgcccaac gagttcgaaa tcaagcgcac cgtcgacggc gagggctaca 20520
acgtggccca gtgcaacatg accaaggact ggttcctggt ccagatgctg gcccactaca 20580
acatcggcta ccagggcttc tacgtgcccg agggctacaa ggaccgcatg tactccttct 20640
tccgcaactt ccagcccatg agccgccagg tggtggacga ggtcaactac aaggactacc 20700
aggccgtcac cctggcctac cagcacaaca actcgggctt cgtcggctac ctcgcgccca 20760
ccatgcgcca gggccagccc taccccgcca actaccccta cccgctcatc ggcaagagcg 20820
ccgtcaccag cgtcacccag aaaaagttcc tctgcgacag ggtcatgtgg cgcatcccct 20880
tctccagcaa cttcatgtcc atgggcgcgc tcaccgacct cggccagaac atgctctatg 20940
ccaactccgc ccacgcgcta gacatgaatt tcgaagtcga ccccatggat gagtccaccc 21000
ttctctatgt tgtcttcgaa gtcttcgacg tcgtccgagt gcaccagccc caccgcggcg 21060
tcatcgaggc cgtctacctg cgcaccccct tctcggccgg taacgccacc acctaagctc 21120
ttgcttcttg caagccatgg ccgcgggctc cggcgagcag gagctcaggg ccatcatccg 21180
cgacctgggc tgcgggccct acttcctggg caccttcgat aagcgcttcc cgggattcat 21240
ggccccgcac aagctggcct gcgccatcgt caacacggcc ggccgcgaga ccgggggcga 21300
gcactggctg gccttcgcct ggaacccgcg ctcgaacacc tgctacctct tcgacccctt 21360
cgggttctcg gacgagcgcc tcaagcagat ctaccagttc gagtacgagg gcctgctgcg 21420
ccgcagcgcc ctggccaccg aggaccgctg cgtcaccctg gaaaagtcca cccagaccgt 21480
gcagggtccg cgctcggccg cctgcgggct cttctgctgc atgttcctgc acgccttcgt 21540
gcactggccc gaccgcccca tggacaagaa ccccaccatg aacttgctga cgggggtgcc 21600
caacggcatg ctccagtcgc cccaggtgga acccaccctg cgccgcaacc aggaggcgct 21660
ctaccgcttc ctcaactccc actccgccta ctttcgctcc caccgcgcgc gcatcgagaa 21720
ggccaccgcc ttcgaccgca tgaatcaaga catgtaaacc gtgtgtgtat gttaaatgtc 21780
tttaataaac agcactttca tgttacacat gcatctgaga tgatttattt agaaatcgaa 21840
agggttctgc cgggtctcgg catggcccgc gggcagggac acgttgcgga actggtactt 21900
ggccagccac ttgaactcgg ggatcagcag tttgggcagc ggggtgtcgg ggaaggagtc 21960
ggtccacagc ttccgcgtca gttgcagggc gcccagcagg tcgggcgcgg agatcttgaa 22020
atcgcagttg ggacccgcgt tctgcgcgcg ggagttgcgg tacacggggt tgcagcactg 22080
gaacaccatc agggccgggt gcttcacgct cgccagcacc gtcgcgtcgg tgatgctctc 22140
cacgtcgagg tcctcggcgt tggccatccc gaagggggtc atcttgcagg tctgccttcc 22200
catggtgggc acgcacccgg gcttgtggtt gcaatcgcag tgcaggggga tcagcatcat 22260
ctgggcctgg tcggcgttca tccccgggta catggccttc atgaaagcct ccaattgcct 22320
gaacgcctgc tgggccttgg ctccctcggt gaagaagacc ccgcaggact tgctagagaa 22380
ctggttggtg gcgcacccgg cgtcgtgcac gcagcagcgc gcgtcgttgt tggccagctg 22440
caccacgctg cgcccccagc ggttctgggt gatcttggcc cggtcggggt tctccttcag 22500
cgcgcgctgc ccgttctcgc tcgccacatc catctcgatc atgtgctcct tctggatcat 22560
ggtggtcccg tgcaggcacc gcagcttgcc ctcggcctcg gtgcacccgt gcagccacag 22620
cgcgcacccg gtgcactccc agttcttgtg ggcgatctgg gaatgcgcgt gcacgaagcc 22680
ctgcaggaag cggcccatca tggtggtcag ggtcttgttg ctagtgaagg tcagcggaat 22740
gccgcggtgc tcctcgttga tgtacaggtg gcagatgcgg cggtacacct cgccctgctc 22800
gggcatcagc tggaagttgg ctttcaggtc ggtctccacg cggtagcggt ccatcagcat 22860
agtcatgatt tccataccct tctcccaggc cgagacgatg ggcaggctca tagggttctt 22920
caccatcatc ttagcgctag cagccgcggc cagggggtcg ctctcgtcca gggtctcaaa 22980
gctccgcttg ccgtccttct cggtgatccg caccgggggg tagctgaagc ccacggccgc 23040
cagctcctcc tcggcctgtc tttcgtcctc gctgtcctgg ctgacgtcct gcaggaccac 23100
atgcttggtc ttgcggggtt tcttcttggg cggcagcggc ggcggagatg ttggagatgg 23160
cgagggggag cgcgagttct cgctcaccac tactatctct tcctcttctt ggtccgaggc 23220
cacgcggcgg taggtatgtc tcttcggggg cagaggcgga ggcgacgggc tctcgccgcc 23280
gcgacttggc ggatggctgg cagagcccct tccgcgttcg ggggtgcgct cccggcggcg 23340
ctctgactga cttcctccgc ggccggccat tgtgttctcc tagggaggaa caacaagcat 23400
ggagactcag ccatcgccaa cctcgccatc tgcccccacc gccgacgaga agcagcagca 23460
gcagaatgaa agcttaaccg ccccgccgcc cagccccgcc acctccgacg cggccgtccc 23520
agacatgcaa gagatggagg aatccatcga gattgacctg ggctatgtga cgcccgcgga 23580
gcacgaggag gagctggcag tgcgcttttc acaagaagag atacaccaag aacagccaga 23640
gcaggaagca gagaatgagc agagtcaggc tgggctcgag catgacggcg actacctcca 23700
cctgagcggg ggggaggacg cgctcatcaa gcatctggcc cggcaggcca ccatcgtcaa 23760
ggatgcgctg ctcgaccgca ccgaggtgcc cctcagcgtg gaggagctca gccgcgccta 23820
cgagttgaac ctcttctcgc cgcgcgtgcc ccccaagcgc cagcccaatg gcacctgcga 23880
gcccaacccg cgcctcaact tctacccggt cttcgcggtg cccgaggccc tggccaccta 23940
ccacatcttt ttcaagaacc aaaagatccc cgtctcctgc cgcgccaacc gcacccgcgc 24000
cgacgccctt ttcaacctgg gtcccggcgc ccgcctacct gatatcgcct ccttggaaga 24060
ggttcccaag atcttcgagg gtctgggcag cgacgagact cgggccgcga acgctctgca 24120
aggagaagga ggagagcatg agcaccacag cgccctggtc gagttggaag gcgacaacgc 24180
gcggctggcg gtgctcaaac gcacggtcga gctgacccat ttcgcctacc cggctctgaa 24240
cctgcccccc aaagtcatga gcgcggtcat ggaccaggtg ctcatcaagc gcgcgtcgcc 24300
catctccgag gacgagggca tgcaagactc cgaggagggc aagcccgtgg tcagcgacga 24360
gcagctggcc cggtggctgg gtcctaatgc tagtccccag agtttggaag agcggcgcaa 24420
actcatgatg gccgtggtcc tggtgaccgt ggagctggag tgcctgcgcc gcttcttcgc 24480
cgacgcggag accctgcgca aggtcgagga gaacctgcac tacctcttca ggcacgggtt 24540
cgtgcgccag gcctgcaaga tctccaacgt ggagctgacc aacctggtct cctacatggg 24600
catcttgcac gagaaccgcc tggggcagaa cgtgctgcac accaccctgc gcggggaggc 24660
ccggcgcgac tacatccgcg actgcgtcta cctctacctc tgccacacct ggcagacggg 24720
catgggcgtg tggcagcagt gtctggagga gcagaacctg aaagagctct gcaagctcct 24780
gcagaagaac ctcaagggtc tgtggaccgg gttcgacgag cgcaccaccg cctcggacct 24840
ggccgacctc attttccccg agcgcctcag gctgacgctg cgcaacggcc tgcccgactt 24900
tatgagccaa agcatgttgc aaaactttcg ctctttcatc ctcgaacgct ccggaatcct 24960
gcccgccacc tgctccgcgc tgccctcgga cttcgtgccg ctgaccttcc gcgagtgccc 25020
cccgccgctg tggagccact gctacctgct gcgcctggcc aactacctgg cctaccactc 25080
ggacgtgatc gaggacgtca gcggcgaggg cctgctcgag tgccactgcc gctgcaacct 25140
ctgcacgccg caccgctccc tggcctgcaa cccccagctg ctgagcgaga cccagatcat 25200
cggcaccttc gagttgcaag ggcccagcga aggcgagggt tcagccgcca aggggggtct 25260
gaaactcacc ccggggctgt ggacctcggc ctacttgcgc aagttcgtgc ccgaggacta 25320
ccatcccttc gagatcaggt tctacgagga ccaatcccat ccgcccaagg ccgagctgtc 25380
ggcctgcgtc atcacccagg gggcgatcct ggcccaattg caagccatcc agaaatcccg 25440
ccaagaattc ttgctgaaaa agggccgcgg ggtctacctc gacccccaga ccggtgagga 25500
gctcaacccc ggcttccccc aggatgcccc gaggaaacaa gaagctgaaa gtggagctgc 25560
cgcccgtgga ggatttggag gaagactggg agaacagcag tcaggcagag gaggaggaga 25620
tggaggaaga ctgggacagc actcaggcag aggaggacag cctgcaagac agtctggagg 25680
aagacgagga ggaggcagag gaggaggtgg aagaagcagc cgccgccaga ccgtcgtcct 25740
cggcggggga gaaagcaagc agcacggata ccatctccgc tccgggtcgg ggtcccgctc 25800
gaccacacag tagatgggac gagaccggac gattcccgaa ccccaccacc cagaccggta 25860
agaaggagcg gcagggatac aagtcctggc gggggcacaa aaacgccatc gtctcctgct 25920
tgcaggcctg cgggggcaac atctccttca cccggcgcta cctgctcttc caccgcgggg 25980
tgaactttcc ccgcaacatc ttgcattact accgtcacct ccacagcccc tactacttcc 26040
aagaagaggc agcagcagca gaaaaagacc agcagaaaac cagcagctag aaaatccaca 26100
gcggcggcag caggtggact gaggatcgcg gcgaacgagc cggcgcaaac ccgggagctg 26160
aggaaccgga tctttcccac cctctatgcc atcttccagc agagtcgggg gcaggagcag 26220
gaactgaaag tcaagaaccg ttctctgcgc tcgctcaccc gcagttgtct gtatcacaag 26280
agcgaagacc aacttcagcg cactctcgag gacgccgagg ctctcttcaa caagtactgc 26340
gcgctcactc ttaaagagta gcccgcgccc gcccagtcgc agaaaaaggc gggaattacg 26400
tcacctgtgc ccttcgccct agccgcctcc acccatcatc atgagcaaag agattcccac 26460
gccttacatg tggagctacc agccccagat gggcctggcc gccggtgccg cccaggacta 26520
ctccacccgc atgaattggc tcagcgccgg gcccgcgatg atctcacggg tgaatgacat 26580
ccgcgcccac cgaaaccaga tactcctaga acagtcagcg ctcaccgcca cgccccgcaa 26640
tcacctcaat ccgcgtaatt ggcccgccgc cctggtgtac caggaaattc cccagcccac 26700
gaccgtacta cttccgcgag acgcccaggc cgaagtccag ctgactaact caggtgtcca 26760
gctggcgggc ggcgccaccc tgtgtcgtca ccgccccgct cagggtataa agcggctggt 26820
gatccggggc agaggcacac agctcaacga cgaggtggtg agctcttcgc tgggtctgcg 26880
acctgacgga gtcttccaac tcgccggatc ggggagatct tccttcacgc ctcgtcaggc 26940
cgtcctgact ttggagagtt cgtcctcgca gccccgctcg ggtggcatcg gcactctcca 27000
gttcgtggag gagttcactc cctcggtcta cttcaacccc ttctccggct cccccggcca 27060
ctacccggac gagttcatcc cgaacttcga cgccatcagc gagtcggtgg acggctacga 27120
ttgaatgtcc catggtggcg cagctgacct agctcggctt cgacacctgg accactgccg 27180
ccgcttccgc tgcttcgctc gggatctcgc cgagtttgcc tactttgagc tgcccgagga 27240
gcaccctcag ggcccggccc acggagtgcg gatcgtcgtc gaagggggcc tcgactccca 27300
cctgcttcgg atcttcagcc agcgtccgat cctggtcgag cgcgagcaag gacagaccct 27360
tctgactctg tactgcatct gcaaccaccc cggcctgcat gaaagtcttt gttgtctgct 27420
gtgtactgag tataataaaa gctgagatca gcgactactc cggacttccg tgtgttcctg 27480
aatccatcaa ccagtctttg ttcttcaccg ggaacgagac cgagctccag ctccagtgta 27540
agccccacaa gaagtacctc acctggctgt tccagggctc cccgatcgcc gttgtcaacc 27600
actgcgacaa cgacggagtc ctgctgagcg gccctgccaa ccttactttt tccacccgca 27660
gaagcaagct ccagctcttc caacccttcc tccccgggac ctatcagtgc gtctcgggac 27720
cctgccatca caccttccac ctgatcccga ataccacagc gtcgctcccc gctactaaca 27780
accaaactaa cctccaccaa cgccaccgtc gcgacctttc tgaatctaat actaccaccc 27840
acaccggagg tgagctccga ggtcaaccaa cctctgggat ttactacggc ccctgggagg 27900
tggttgggtt aatagcgcta ggcctagttg cgggtgggct tttggttctc tgctacctat 27960
acctcccttg ctgttcgtac ttagtggtgc tgtgttgctg gtttaagaaa tggggaagat 28020
caccctagtg agctgcggtg cgctggtggc ggtgttgctt tcgattgtgg gactgggcgg 28080
tgcggctgta gtgaaggaga aggccgatcc ctgcttgcat ttcaatccca acaaatgcca 28140
gctgagtttt cagcccgatg gcaatcggtg cgcggtactg atcaagtgcg gatgggaatg 28200
cgagaacgtg agaatcgagt acaataacaa gactcggaac aatactctcg cgtccgtgtg 28260
gcagcccggg gaccccgagt ggtacaccgt ctctgtcccc ggtgctgacg gctccccgcg 28320
caccgtgaat aatactttca tttttgcgca catgtgcgac acggtcatgt ggatgagcaa 28380
gcagtacgat atgtggcccc ccacgaagga gaacatcgtg gtcttctcca tcgcttacag 28440
cctgtgcacg gcgctaatca ccgctatcgt gtgcctgagc attcacatgc tcatcgctat 28500
tcgccccaga aataatgccg aaaaagaaaa acagccataa cgtttttttt cacacctttt 28560
tcagaccatg gcctctgtta aatttttgct tttatttgcc agtctcattg ccgtcattca 28620
tggaatgagt aatgagaaaa ttactattta cactggcact aatcacacat tgaaaggtcc 28680
agaaaaagcc acagaagttt catggtattg ttattttaat gaatcagatg tatctactga 28740
actctgtgga aacaataaca aaaaaaatga gagcattact ctcatcaagt ttcaatgtgg 28800
atctgactta accctaatta acatcactag agactatgta ggtatgtatt atggaactac 28860
agcaggcatt tcggacatgg aattttatca agtttctgtg tctgaaccca ccacgcctag 28920
aatgaccaca accacaaaaa ctacacctgt taccactatg cagctcacta ccaataacat 28980
ttttgccatg cgtcaaatgg tcaacaatag cactcaaccc accccaccca gtgaggaaat 29040
tcccaaatcc atgattggca ttattgttgc tgtagtggtg tgcatgttga tcatcgcctt 29100
gtgcatggtg tactatgcct tctgctacag aaagcacaga ctgaacgaca agctggaaca 29160
cttactaagt gttgaatttt aattttttag aaccatgaag atcctaggcc ttttaatttt 29220
ttctatcatt acctctgctc tatgcaattc tgacaatgag gacgttactg tcgttgtcgg 29280
atcaaattat acactgaaag gtccagcgaa gggtatgctt tcgtggtatt gctattttgg 29340
atctgacact acagaaactg aattatgcaa tcttaagaat ggcaaaattc aaaattctaa 29400
aattaacaat tatatatgca atggtactga tctgatactc ctcaatatca cgaaatcata 29460
tgctggcagt tacacctgcc ctggagatga tgctgacagt atgatttttt acaaagtaac 29520
tgttgttgat cccactactc cacctccacc caccacaact actcacacca cacacacaga 29580
tcaaaccgca gcagaggagg cagcaaagtt agccttgcag gtccaagaca gttcatttgt 29640
tggcattacc cctacacctg atcagcggtg tccggggctg ctagtcagcg gcattgtcgg 29700
tgtgctttcg ggattagcag tcataatcat ctgcatgttc atttttgctt gctgctatag 29760
aaggctttac cgacaaaaat cagacccact gctgaacctc tatgtttaat tttttccaga 29820
gtcatgaagg cagttagcgc tctagttttt tgttctttga ttggcattgt tttttgcaat 29880
cctattccta aagttagctt tattaaagat gtgaatgtta ctgagggggg caatgtgaca 29940
ctggtaggtg tagagggtgc tgaaaacacc acctggacaa aataccacct caatgggtgg 30000
aaagatattt gcaattggag tgtattagtt tatacatgtg agggagttaa tcttaccatt 30060
gtcaatgcca cctcagctca aaatggtaga attcaaggac aaagtgtcag tgtatctaat 30120
gggtatttta cccaacatac ttttatctat gacgttaaag tcataccact gcctacgcct 30180
agcccaccta gcactaccac acagacaacc cacactacac agacaaccac atacagtaca 30240
ttaaatcagc ctaccaccac tacagcagca gaggttgcca gctcgtctgg ggtccgagtg 30300
gcatttttga tgtgggcccc atctagcagt cccactgcta gtaccaatga gcagactact 30360
gaatttttgt ccactgtcga gagccacacc acagctacct ccagtgcctt ctctagcacc 30420
gccaatctct cctcgctttc ctctacacca atcagtcccg ctactactcc tagccccgct 30480
cctcttccca ctcccctgaa gcaaacagac ggcggcatgc aatggcagat caccctgctc 30540
attgtgatcg ggttggtcat cctggccgtg ttgctctact acatcttctg ccgccgcatt 30600
cccaacgcgc accgcaagcc ggtctacaag cccatcattg tcgggcagcc ggagccgctt 30660
caggtggaag ggggtctaag gaatcttctc ttctctttta cagtatggtg attgaactat 30720
gattcctaga caattcttga tcactattct tatctgcctc ctccaagtct gtgccaccct 30780
cgctctggtg gccaacgcca gtccagactg tattgggccc ttcgcctcct acgtgctctt 30840
tgccttcacc acctgcatct gctgctgtag catagtctgc ctgcttatca ccttcttcca 30900
gttcattgac tggatctttg tgcgcatcgc ctacctgcgc caccaccccc agtaccgcga 30960
ccagcgagtg gcgcggctgc tcaggctcct ctgataagca tgcgggctct gctacttctc 31020
gcgcttctgc tgttagtgct cccccgtccc gtcgaccccc ggtcccccac ccagtccccc 31080
gaggaggtcc gcaaatgcaa attccaagaa ccctggaaat tcctcaaatg ctaccgccaa 31140
aaatcagaca tgcatcccag ctggatcatg atcattggga tcgtgaacat tctggcctgc 31200
accctcatct cctttgtgat ttacccctgc tttgactttg gttggaactc gccagaggcg 31260
ctctatctcc cgcctgaacc tgacacacca ccacagcaac ctcaggcaca cgcactacca 31320
ccactacagc ctaggccaca atacatgccc atattagact atgaggccga gccacagcga 31380
cccatgctcc ccgctattag ttacttcaat ctaaccggcg gagatgactg acccactggc 31440
caacaacaac gtcaacgacc ttctcctgga catggacggc cgcgcctcgg agcagcgact 31500
cgcccaactt cgcattcgcc agcagcagga gagagccgtc aaggagctgc aggatgcggt 31560
ggccatccac cagtgcaaga gaggcatctt ctgcctggtg aaacaggcca agatctccta 31620
cgaggtcact ccaaacgacc atcgcctctc ctacgagctc ctgcagcagc gccagaagtt 31680
cacctgcctg gtcggagtca accccatcgt catcacccag cagtctggcg ataccaaggg 31740
gtgcatccac tgctcctgcg actcccccga ctgcgtccac actctgatca agaccctctg 31800
cggcctccgc gacctcctcc ccatgaacta atcaccccct tatccagtga aataaagatc 31860
atattgatga tgattttaca gaaataaaaa ataatcattt gatttgaaat aaagatacaa 31920
tcatattgat gatttgagtt taacaaaaaa ataaagaatc acttacttga aatctgatac 31980
caggtctctg tccatgtttt ctgccaacac cacttcactc ccctcttccc agctctggta 32040
ctgcaggccc cggcgggctg caaacttcct ccacacgctg aaggggatgt caaattcctc 32100
ctgtccctca atcttcattt tatcttctat cagatgtcca aaaagcgcgt ccgggtggat 32160
gatgacttcg accccgtcta cccctacgat gcagacaacg caccgaccgt gcccttcatc 32220
aaccccccct tcgtctcttc agatggattc caagagaagc ccctgggggt gttgtccctg 32280
cgactggccg accccgtcac caccaagaac ggggaaatca ccctcaagct gggagagggg 32340
gtggacctcg attcctcggg aaaactcatc tccaacacgg ccaccaaggc cgccgcccct 32400
ctcagttttt ccaacaacac catttccctt aacatggatc acccctttta cactaaagat 32460
ggaaaattat ccttacaagt ttctccacca ttaaatatac tgagaacaag cattctaaac 32520
acactagctt taggttttgg atcaggttta ggactccgtg gctctgcctt ggcagtacag 32580
ttagtctctc cacttacatt tgatactgat ggaaacataa agcttacctt agacagaggt 32640
ttgcatgtta caacaggaga tgcaattgaa agcaacataa gctgggctaa aggtttaaaa 32700
tttgaagatg gagccatagc aaccaacatt ggaaatgggt tagagtttgg aagcagtagt 32760
acagaaacag gtgttgatga tgcttaccca atccaagtta aacttggatc tggccttagc 32820
tttgacagta caggagccat aatggctggt aacaaagaag acgataaact cactttgtgg 32880
acaacacctg atccatcacc aaactgtcaa atactcgcag aaaatgatgc aaaactaaca 32940
ctttgcttga ctaaatgtgg tagtcaaata ctggccactg tgtcagtctt agttgtagga 33000
agtggaaacc taaaccccat tactggcacc gtaagcagtg ctcaggtgtt tctacgtttt 33060
gatgcaaacg gtgttctttt aacagaacat tctacactaa aaaaatactg ggggtatagg 33120
cagggagata gcatagatgg cactccatat accaatgctg taggattcat gcccaattta 33180
aaagcttatc caaagtcaca aagttctact actaaaaata atatagtagg gcaagtatac 33240
atgaatggag atgtttcaaa acctatgctt ctcactataa ccctcaatgg tactgatgac 33300
agcaacagta catattcaat gtcattttca tacacctgga ctaatggaag ctatgttgga 33360
gcaacatttg gggctaactc ttataccttc tcatacatcg cccaagaatg aacactgtat 33420
cccaccctgc atgccaaccc ttcccacccc actctgtgga acaaactctg aaacacaaaa 33480
taaaataaag ttcaagtgtt ttattgattc aacagtttta caggattcga gcagttattt 33540
ttcctccacc ctcccaggac atggaataca ccaccctctc cccccgcaca gccttgaaca 33600
tctgaatgcc attggtgatg gacatgcttt tggtctccac gttccacaca gtttcagagc 33660
gagccagtct cgggtcggtc agggagatga aaccctccgg gcactcccgc atctgcacct 33720
cacagctcaa cagctgagga ttgtcctcgg tggtcgggat cacggttatc tggaagaagc 33780
agaagagcgg cggtgggaat catagtccgc gaacgggatc ggccggtggt gtcgcatcag 33840
gccccgcagc agtcgctgcc gccgccgctc cgtcaagctg ctgctcaggg ggtccgggtc 33900
cagggactcc ctcagcatga tgcccacggc cctcagcatc agtcgtctgg tgcggcgggc 33960
gcagcagcgc atgcggatct cgctcaggtc gctgcagtac gtgcaacaca gaaccaccag 34020
gttgttcaac agtccatagt tcaacacgct ccagccgaaa ctcatcgcgg gaaggatgct 34080
acccacgtgg ccgtcgtacc agatcctcag gtaaatcaag tggtgccccc tccagaacac 34140
gctgcccacg tacatgatct ccttgggcat gtggcggttc accacctccc ggtaccacat 34200
caccctctgg ttgaacatgc agccccggat gatcctgcgg aaccacaggg ccagcaccgc 34260
cccgcccgcc atgcagcgaa gagaccccgg gtcccggcaa tggcaatgga ggacccaccg 34320
ctcgtacccg tggatcatct gggagctgaa caagtctatg ttggcacagc acaggcatat 34380
gctcatgcat ctcttcagca ctctcaactc ctcgggggtc aaaaccatat cccagggcac 34440
ggggaactct tgcaggacag cgaaccccgc agaacagggc aatcctcgca cagaacttac 34500
attgtgcatg gacagggtat cgcaatcagg cagcaccggg tgatcctcca ccagagaagc 34560
gcgggtctcg gtctcctcac agcgtggtaa gggggccggc cgatacgggt gatggcggga 34620
cgcggctgat cgtgttcgcg accgtgtcat gatgcagttg ctttcggaca ttttcgtact 34680
tgctgtagca gaacctggtc cgggcgctgc acaccgatcg ccggcggcgg tctcggcgct 34740
tggaacgctc ggtgttgaaa ttgtaaaaca gccactctct cagaccgtgc agcagatcta 34800
gggcctcagg agtgatgaag atcccatcat gcctgatggc tctgatcaca tcgaccaccg 34860
tggaatgggc cagacccagc cagatgatgc aattttgttg ggtttcggtg acggcggggg 34920
agggaagaac aggaagaacc atgattaact tttaatccaa acggtctcgg agtacttcaa 34980
aatgaagatc gcggagatgg cacctctcgc ccccgctgtg ttggtggaaa ataacagcca 35040
ggtcaaaggt gatacggttc tcgagatgtt ccacggtggc ttccagcaaa gcctccacgc 35100
gcacatccag aaacaagaca atagcgaaag cgggagggtt ctctaattcc tcaatcatca 35160
tgttacactc ctgcaccatc cccagataat tttcattttt ccagccttga atgattcgaa 35220
ctagttcctg aggtaaatcc aagccagcca tgataaagag ctcgcgcaga gcgccctcca 35280
ccggcattct taagcacacc ctcataattc caagatattc tgctcctggt tcacctgcag 35340
cagattgaca agcggaatat caaaatctct gccgcgatcc ctgagctcct ccctcagcaa 35400
taactgtaag tactctttca tatcctctcc gaaattttta gccataggac caccaggaat 35460
aagattaggg caagccacag tacagataaa ccgaagtcct ccccagtgag cattgccaaa 35520
tgcaagactg ctataagcat gctggctaga cccggtgata tcttccagat aactggacag 35580
aaaatcgccc aggcaatttt taagaaaatc aacaaaagaa aaatcctcca ggtggacgtt 35640
tagagcctcg ggaacaacga tgaagtaaat gcaagcggtg cgttccagca tggttagtta 35700
gctgatctgt agaaaaaaca aaaatgaaca ttaaaccatg ctagcctggc gaacaggtgg 35760
gtaaatcgtt ctctccagca ccaggcaggc cacggggtct ccggcgcgac cctcgtaaaa 35820
attgtcgcta tgattgaaaa ccatcacaga gagacgttcc cggtggccgg cgtgaatgat 35880
tcgacaagat gaatacaccc ccggaacatt ggcgtccgcg agtgaaaaaa agcgcccgag 35940
gaagcaataa ggcactacaa tgctcagtct caagtccagc aaagcgatgc catgcggatg 36000
aagcacaaaa ttctcaggtg cgtacaaaat gtaattactc ccctcctgca caggcagcaa 36060
agcccccgat ccctccaggt acacatacaa agcctcagcg tccatagctt accgagcagc 36120
agcacacaac aggcgcaaga gtcagagaaa ggctgagctc taacctgtcc acccgctctc 36180
tgctcaatat atagcccaga tctacactga cgtaaaggcc aaagtctaaa aatacccgcc 36240
aaataatcac acacgcccag cacacgccca gaaaccggtg acacactcaa aaaaatacgc 36300
gcacttcctc aaacgcccaa aactgccgtc atttccgggt tcccacgcta cgtcatcaaa 36360
acacgacttt caaattccgt cgaccgttaa aaacgtcacc cgccccgccc ctaacggtcg 36420
cccgtctctc agccaatcag cgccccgcat ccccaaattc aaacacctca tttgcatatt 36480
aacgcgcaca aaaagtttga ggtatattat tgatgatgg 36519

<210> 2
<211> 31588
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 2
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagtagg gataacaggg taatgacatt 600
gattattgac tagttgttaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 660
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 720
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 780
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 840
atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 900
atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 960
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg 1020
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 1080
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg 1140
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 1200
cctggaacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga cagcgatcgc gccaccatgg 1260
ccgggatgtt ccaggcactg tccgaaggct gcacacccta tgatattaac cagatgctga 1320
atgtcctggg agaccaccag gtctctggcc tggagcagct ggagagcatc atcaacttcg 1380
agaagctgac cgagtggaca agctccaatg tgatgcctat cctgtcccca ctgaccaagg 1440
gcatcctggg cttcgtgttt accctgacag tgccttctga gcggggcctg tcttgcatca 1500
gcgaggcaga cgcaaccaca ccagagtccg ccaatctggg cgaggagatc ctgtctcagc 1560
tgtacctgtg gccccgggtg acatatcact ccccttctta cgcctatcac cagttcgagc 1620
ggagagccaa gtacaagaga cacttcccag gctttggcca gtctctgctg ttcggctacc 1680
ccgtgtacgt gttcggcgat tgcgtgcagg gcgactggga tgccatccgg tttagatact 1740
gcgcaccacc tggatatgca ctgctgaggt gtaacgacac caattattcc gccctgctgg 1800
cagtgggcgc cctggagggc cctcgcaatc aggattggct gggcgtgcca aggcagctgg 1860
tgacacgcat gcaggccatc cagaacgcag gcctgtgcac cctggtggca atgctggagg 1920
agacaatctt ctggctgcag gcctttctga tggccctgac cgacagcggc cccaagacaa 1980
acatcatcgt ggattcccag tacgtgatgg gcatctccaa gccttctttc caggagtttg 2040
tggactggga gaacgtgagc ccagagctga attccaccga tcagccattc tggcaggcag 2100
gaatcctggc aaggaacctg gtgcctatgg tggccacagt gcagggccag aatctgaagt 2160
accagggcca gagcctggtc atcagcgcct ccatcatcgt gtttaacctg ctggagctgg 2220
agggcgacta tcgggacgat ggcaacgtgt gggtgcacac cccactgagc cccagaacac 2280
tgaacgcctg ggtgaaggcc gtggaggaga agaagggcat cccagtgcac ctggagctgg 2340
cctccatgac caatatggag ctgatgtcta gcatcgtgca ccagcaggtg aggacatacg 2400
gacccgtgtt catgtgcctg ggaggcctgc tgaccatggt ggcaggagcc gtgtggctga 2460
cagtgcgggt gctggagctg ttcagagccg cccagctggc caacgatgtg gtgctgcaga 2520
tcatggagct gtgcggagca gcctttcgcc aggtgtgcca caccacagtg ccatggccca 2580
atgcctccct gacccccaag tggaacaatg agacaacaca gcctcagatc gccaactgta 2640
gcgtgtacga cttcttcgtg tggctgcact actatagcgt gagggatacc ctgtggcccc 2700
gcgtgacata ccacatgaat aagtacgcct atcacatgct ggagaggcgc gccaagtata 2760
agagaggccc tggcccaggc gcaaagtttg tggcagcatg gaccctgaag gccgccgccg 2820
gccccggccc cggccagtat atcaaggcta acagtaagtt cattggaatc acagagctgg 2880
gacccggacc tggataatga gtttaaactc ccatttaaat gtgagggtta atgcttcgag 2940
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 3000
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 3060
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 3120
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaataact ataacggtcc 3180
taaggtagcg agtgagtagt gttctggggc gggggaggac ctgcatgagg gccagaataa 3240
ctgaaatctg tgcttttctg tgtgttgcag cagcatgagc ggaagcggct cctttgaggg 3300
aggggtattc agcccttatc tgacggggcg tctcccctcc tgggcgggag tgcgtcagaa 3360
tgtgatggga tccacggtgg acggccggcc cgtgcagccc gcgaactctt caaccctgac 3420
ctatgcaacc ctgagctctt cgtcgttgga cgcagctgcc gccgcagctg ctgcatctgc 3480
cgccagcgcc gtgcgcggaa tggccatggg cgccggctac tacggcactc tggtggccaa 3540
ctcgagttcc accaataatc ccgccagcct gaacgaggag aagctgttgc tgctgatggc 3600
ccagctcgag gccttgaccc agcgcctggg cgagctgacc cagcaggtgg ctcagctgca 3660
ggagcagacg cgggccgcgg ttgccacggt gaaatccaaa taaaaaatga atcaataaat 3720
aaacggagac ggttgttgat tttaacacag agtctgaatc tttatttgat ttttcgcgcg 3780
cggtaggccc tggaccaccg gtctcgatca ttgagcaccc ggtggatctt ttccaggacc 3840
cggtagaggt gggcttggat gttgaggtac atgggcatga gcccgtcccg ggggtggagg 3900
tagctccatt gcagggcctc gtgctcgggg gtggtgttgt aaatcaccca gtcatagcag 3960
gggcgcaggg catggtgttg cacaatatct ttgaggagga gactgatggc cacgggcagc 4020
cctttggtgt aggtgtttac aaatctgttg agctgggagg gatgcatgcg gggggagatg 4080
aggtgcatct tggcctggat cttgagattg gcgatgttac cgcccagatc ccgcctgggg 4140
ttcatgttgt gcaggaccac cagcacggtg tatccggtgc acttggggaa tttatcatgc 4200
aacttggaag ggaaggcgtg aaagaatttg gcgacgcctt tgtgcccgcc caggttttcc 4260
atgcactcat ccatgatgat ggcgatgggc ccgtgggcgg cggcctgggc aaagacgttt 4320
cgggggtcgg acacatcata gttgtggtcc tgggtgaggt catcataggc cattttaatg 4380
aatttggggc ggagggtgcc ggactggggg acaaaggtac cctcgatccc gggggcgtag 4440
ttcccctcac agatctgcat ctcccaggct ttgagctcgg agggggggat catgtccacc 4500
tgcggggcga taaagaacac ggtttccggg gcgggggaga tgagctgggc cgaaagcaag 4560
ttccggagca gctgggactt gccgcagccg gtggggccgt agatgacccc gatgaccggc 4620
tgcaggtggt agttgaggga gagacagctg ccgtcctccc ggaggagggg ggccacctcg 4680
ttcatcatct cgcgcacgtg catgttctcg cgcaccagtt ccgccaggag gcgctctccc 4740
cccagggata ggagctcctg gagcgaggcg aagtttttca gcggcttgag tccgtcggcc 4800
atgggcattt tggagagggt ttgttgcaag agttccaggc ggtcccagag ctcggtgatg 4860
tgctctacgg catctcgatc cagcagacct cctcgtttcg cgggttggga cggctgcggg 4920
agtagggcac cagacgatgg gcgtccagcg cagccagggt ccggtccttc cagggtcgca 4980
gcgtccgcgt cagggtggtc tccgtcacgg tgaaggggtg cgcgccgggc tgggcgcttg 5040
cgagggtgcg cttcaggctc atccggctgg tcgaaaaccg ctcccgatcg gcgccctgcg 5100
cgtcggccag gtagcaattg accatgagtt cgtagttgag cgcctcggcc gcgtggcctt 5160
tggcgcggag cttacctttg gaagtctgcc cgcaggcggg acagaggagg gacttgaggg 5220
cgtagagctt gggggcgagg aagacggact cgggggcgta ggcgtccgcg ccgcagtggg 5280
cgcagacggt ctcgcactcc acgagccagg tgaggtcggg ctggtcgggg tcaaaaacca 5340
gtttcccgcc gttctttttg atgcgtttct tacctttggt ctccatgagc tcgtgtcccc 5400
gctgggtgac aaagaggctg tccgtgtccc cgtagaccga ctttatgggc cggtcctcga 5460
gcggtgtgcc gcggtcctcc tcgtagagga accccgccca ctccgagacg aaagcccggg 5520
tccaggccag cacgaaggag gccacgtggg acgggtagcg gtcgttgtcc accagcgggt 5580
ccaccttttc cagggtatgc aaacacatgt ccccctcgtc cacatccagg aaggtgattg 5640
gcttgtaagt gtaggccacg tgaccggggg tcccggccgg gggggtataa aagggtgcgg 5700
gtccctgctc gtcctcactg tcttccggat cgctgtccag gagcgccagc tgttggggta 5760
ggtattccct ctcgaaggcg ggcatgacct cggcactcag gttgtcagtt tctagaaacg 5820
aggaggattt gatattgacg gtgccggcgg agatgccttt caagagcccc tcgtccatct 5880
ggtcagaaaa gacgatcttt ttgttgtcga gcttggtggc gaaggagccg tagagggcgt 5940
tggagaggag cttggcgatg gagcgcatgg tctggttttt ttccttgtcg gcgcgctcct 6000
tggcggcgat gttgagctgc acgtactcgc gcgccacgca cttccattcg gggaagacgg 6060
tggtcagctc gtcgggcacg attctgacct gccagccccg attatgcagg gtgatgaggt 6120
ccacactggt ggccacctcg ccgcgcaggg gctcattagt ccagcagagg cgtccgccct 6180
tgcgcgagca gaaggggggc agggggtcca gcatgacctc gtcggggggg tcggcatcga 6240
tggtgaagat gccgggcagg aggtcggggt caaagtagct gatggaagtg gccagatcgt 6300
ccagggcagc ttgccattcg cgcacggcca gcgcgcgctc gtagggactg aggggcgtgc 6360
cccagggcat gggatgggta agcgcggagg cgtacatgcc gcagatgtcg tagacgtaga 6420
ggggctcctc gaggatgccg atgtaggtgg ggtagcagcg ccccccgcgg atgctggcgc 6480
gcacgtagtc atacagctcg tgcgaggggg cgaggagccc cgggcccagg ttggtgcgac 6540
tgggcttttc ggcgcggtag acgatctggc ggaaaatggc atgcgagttg gaggagatgg 6600
tgggcctttg gaagatgttg aagtgggcgt ggggcagtcc gaccgagtcg cggatgaagt 6660
gggcgtagga gtcttgcagc ttggcgacga gctcggcggt gactaggacg tccagagcgc 6720
agtagtcgag ggtctcctgg atgatgtcat acttgagctg tcccttttgt ttccacagct 6780
cgcggttgag aaggaactct tcgcggtcct tccagtactc ttcgaggggg aacccgtcct 6840
gatctgcacg gtaagagcct agcatgtaga actggttgac ggccttgtag gcgcagcagc 6900
ccttctccac ggggagggcg taggcctggg cggccttgcg cagggaggtg tgcgtgaggg 6960
cgaaagtgtc cctgaccatg accttgagga actggtgctt gaagtcgata tcgtcgcagc 7020
ccccctgctc ccagagctgg aagtccgtgc gcttcttgta ggcggggttg ggcaaagcga 7080
aagtaacatc gttgaagagg atcttgcccg cgcggggcat aaagttgcga gtgatgcgga 7140
aaggttgggg cacctcggcc cggttgttga tgacctgggc ggcgagcacg atctcgtcga 7200
agccgttgat gttgtggccc acgatgtaga gttccacgaa tcgcggacgg cccttgacgt 7260
ggggcagttt cttgagctcc tcgtaggtga gctcgtcggg gtcgctgagc ccgtgctgct 7320
cgagcgccca gtcggcgaga tgggggttgg cgcggaggaa ggaagtccag agatccacgg 7380
ccagggcggt ttgcagacgg tcccggtact gacggaactg ctgcccgacg gccatttttt 7440
cgggggtgac gcagtagaag gtgcgggggt ccccgtgcca gcgatcccat ttgagctgga 7500
gggcgagatc gagggcgagc tcgacgagcc ggtcgtcccc ggagagtttc atgaccagca 7560
tgaaggggac gagctgcttg ccgaaggacc ccatccaggt gtaggtttcc acatcgtagg 7620
tgaggaagag cctttcggtg cgaggatgcg agccgatggg gaagaactgg atctcctgcc 7680
accaattgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa atgccgacgg cgcgccgaac 7740
actcgtgctt gtgtttatac aagcggccac agtgctcgca acgctgcacg ggatgcacgt 7800
gctgcacgag ctgtacctga gttcctttga cgaggaattt cagtgggaag tggagtcgtg 7860
gcgcctgcat ctcgtgctgt actacgtcgt ggtggtcggc ctggccctct tctgcctcga 7920
tggtggtcat gctgacgagc ccgcgcggga ggcaggtcca gacctcggcg cgagcgggtc 7980
ggagagcgag gacgagggcg cgcaggccgg agctgtccag ggtcctgaga cgctgcggag 8040
tcaggtcagt gggcagcggc ggcgcgcggt tgacttgcag gagtttttcc agggcgcgcg 8100
ggaggtccag atggtacttg atctccaccg cgccattggt ggcgacgtcg atggcttgca 8160
gggtcccgtg cccctggggt gtgaccaccg tcccccgttt cttcttgggc ggctggggcg 8220
acgggggcgg tgcctcttcc atggttagaa gcggcggcga ggacgcgcgc cgggcggcag 8280
gggcggctcg gggcccggag gcaggggcgg caggggcacg tcggcgccgc gcgcgggtag 8340
gttctggtac tgcgcccgga gaagactggc gtgagcgacg acgcgacggt tgacgtcctg 8400
gatctgacgc ctctgggtga aggccacggg acccgtgagt ttgaacctga aagagagttc 8460
gacagaatca atctcggtat cgttgacggc ggcctgccgc aggatctctt gcacgtcgcc 8520
cgagttgtcc tggtaggcga tctcggtcat gaactgctcg atctcctcct cttgaaggtc 8580
tccgcggccg gcgcgctcca cggtggccgc gaggtcgttg gagatgcggc ccatgagctg 8640
cgagaaggcg ttcatgcccg cctcgttcca gacgcggctg tagaccacga cgccctcggg 8700
atcgcgggcg cgcatgacca cctgggcgag gttgagctcc acgtggcgcg tgaagaccgc 8760
gtagttgcag aggcgctggt agaggtagtt gagcgtggtg gcgatgtgct cggtgacgaa 8820
gaaatacatg atccagcggc ggagcggcat ctcgctgacg tcgcccagcg cctccaaacg 8880
ttccatggcc tcgtaaaagt ccacggcgaa gttgaaaaac tgggagttgc gcgccgagac 8940
ggtcaactcc tcctccagaa gacggatgag ctcggcgatg gtggcgcgca cctcgcgctc 9000
gaaggccccc gggagttcct ccacttcctc ttcttcctcc tccactaaca tctcttctac 9060
ttcctcctca ggcggcagtg gtggcggggg agggggcctg cgtcgccggc ggcgcacggg 9120
cagacggtcg atgaagcgct cgatggtctc gccgcgccgg cgtcgcatgg tctcggtgac 9180
ggcgcgcccg tcctcgcggg gccgcagcgt gaagacgccg ccgcgcatct ccaggtggcc 9240
gggggggtcc ccgttgggca gggagagggc gctgacgatg catcttatca attgccccgt 9300
agggactccg cgcaaggacc tgagcgtctc gagatccacg ggatctgaaa accgctgaac 9360
gaaggcttcg agccagtcgc agtcgcaagg taggctgagc acggtttctt ctggcgggtc 9420
atgttggttg ggagcggggc gggcgatgct gctggtgatg aagttgaaat aggcggttct 9480
gagacggcgg atggtggcga ggagcaccag gtctttgggc ccggcttgct ggatgcgcag 9540
acggtcggcc atgccccagg cgtggtcctg acacctggcc aggtccttgt agtagtcctg 9600
catgagccgc tccacgggca cctcctcctc gcccgcgcgg ccgtgcatgc gcgtgagccc 9660
gaagccgcgc tggggctgga cgagcgccag gtcggcgacg acgcgctcgg cgaggatggc 9720
ttgctggatc tgggtgaggg tggtctggaa gtcatcaaag tcgacgaagc ggtggtaggc 9780
tccggtgttg atggtgtagg agcagttggc catgacggac cagttgacgg tctggtggcc 9840
cggacgcacg agctcgtggt acttgaggcg cgagtaggcg cgcgtgtcga agatgtagtc 9900
gttgcaggtg cgcaccaggt actggtagcc gatgaggaag tgcggcggcg gctggcggta 9960
gagcggccat cgctcggtgg cgggggcgcc gggcgcgagg tcctcgagca tggtgcggtg 10020
gtagccgtag atgtacctgg acatccaggt gatgccggcg gcggtggtgg aggcgcgcgg 10080
gaactcgcgg acgcggttcc agatgttgcg cagcggcagg aagtagttca tggtgggcac 10140
ggtctggccc gtgaggcgcg cgcagtcgtg gatgctctat acgggcaaaa acgaaagcgg 10200
tcagcggctc gactccgtgg cctggaggct aagcgaacgg gttgggctgc gcgtgtaccc 10260
cggttcgaat ctcgaatcag gctggagccg cagctaacgt ggtattggca ctcccgtctc 10320
gacccaagcc tgcaccaacc ctccaggata cggaggcggg tcgttttgca actttttttt 10380
ggaggccgga tgagactagt aagcgcggaa agcggccgac cgcgatggct cgctgccgta 10440
gtctggagaa gaatcgccag ggttgcgttg cggtgtgccc cggttcgagg ccggccggat 10500
tccgcggcta acgagggcgt ggctgccccg tcgtttccaa gaccccatag ccagccgact 10560
tctccagtta cggagcgagc ccctcttttg ttttgtttgt ttttgccaga tgcatcccgt 10620
actgcggcag atgcgccccc accaccctcc accgcaacaa cagccccctc cacagccggc 10680
gcttctgccc ccgccccagc agcaacttcc agccacgacc gccgcggccg ccgtgagcgg 10740
ggctggacag agttatgatc accagctggc cttggaagag ggcgaggggc tggcgcgcct 10800
gggggcgtcg tcgccggagc ggcacccgcg cgtgcagatg aaaagggacg ctcgcgaggc 10860
ctacgtgccc aagcagaacc tgttcagaga caggagcggc gaggagcccg aggagatgcg 10920
cgcggcccgg ttccacgcgg ggcgggagct gcggcgcggc ctggaccgaa agagggtgct 10980
gagggacgag gatttcgagg cggacgagct gacggggatc agccccgcgc gcgcgcacgt 11040
ggccgcggcc aacctggtca cggcgtacga gcagaccgtg aaggaggaga gcaacttcca 11100
aaaatccttc aacaaccacg tgcgcaccct gatcgcgcgc gaggaggtga ccctgggcct 11160
gatgcacctg tgggacctgc tggaggccat cgtgcagaac cccaccagca agccgctgac 11220
ggcgcagctg ttcctggtgg tgcagcatag tcgggacaac gaagcgttca gggaggcgct 11280
gctgaatatc accgagcccg agggccgctg gctcctggac ctggtgaaca ttctgcagag 11340
catcgtggtg caggagcgcg ggctgccgct gtccgagaag ctggcggcca tcaacttctc 11400
ggtgctgagt ttgggcaagt actacgctag gaagatctac aagaccccgt acgtgcccat 11460
agacaaggag gtgaagatcg acgggtttta catgcgcatg accctgaaag tgctgaccct 11520
gagcgacgat ctgggggtgt accgcaacga caggatgcac cgtgcggtga gcgccagcag 11580
gcggcgcgag ctgagcgacc aggagctgat gcatagtctg cagcgggccc tgaccggggc 11640
cgggaccgag ggggagagct actttgacat gggcgcggac ctgcactggc agcccagccg 11700
ccgggccttg gaggcggcgg caggacccta cgtagaagag gtggacgatg aggtggacga 11760
ggagggcgag tacctggaag actgatggcg cgaccgtatt tttgctagat gcaacaacaa 11820
cagccacctc ctgatcccgc gatgcgggcg gcgctgcaga gccagccgtc cggcattaac 11880
tcctcggacg attggaccca ggccatgcaa cgcatcatgg cgctgacgac ccgcaacccc 11940
gaagccttta gacagcagcc ccaggccaac cggctctcgg ccatcctgga ggccgtggtg 12000
ccctcgcgct ccaaccccac gcacgagaag gtcctggcca tcgtgaacgc gctggtggag 12060
aacaaggcca tccgcggcga cgaggccggc ctggtgtaca acgcgctgct ggagcgcgtg 12120
gcccgctaca acagcaccaa cgtgcagacc aacctggacc gcatggtgac cgacgtgcgc 12180
gaggccgtgg cccagcgcga gcggttccac cgcgagtcca acctgggatc catggtggcg 12240
ctgaacgcct tcctcagcac ccagcccgcc aacgtgcccc ggggccagga ggactacacc 12300
aacttcatca gcgccctgcg cctgatggtg accgaggtgc cccagagcga ggtgtaccag 12360
tccgggccgg actacttctt ccagaccagt cgccagggct tgcagaccgt gaacctgagc 12420
caggctttca agaacttgca gggcctgtgg ggcgtgcagg ccccggtcgg ggaccgcgcg 12480
acggtgtcga gcctgctgac gccgaactcg cgcctgctgc tgctgctggt ggcccccttc 12540
acggacagcg gcagcatcaa ccgcaactcg tacctgggct acctgattaa cctgtaccgc 12600
gaggccatcg gccaggcgca cgtggacgag cagacctacc aggagatcac ccacgtgagc 12660
cgcgccctgg gccaggacga cccgggcaac ctggaagcca ccctgaactt tttgctgacc 12720
aaccggtcgc agaagatccc gccccagtac gcgctcagca ccgaggagga gcgcatcctg 12780
cgttacgtgc agcagagcgt gggcctgttc ctgatgcagg agggggccac ccccagcgcc 12840
gcgctcgaca tgaccgcgcg caacatggag cccagcatgt acgccagcaa ccgcccgttc 12900
atcaataaac tgatggacta cttgcatcgg gcggccgcca tgaactctga ctatttcacc 12960
aacgccatcc tgaatcccca ctggctcccg ccgccggggt tctacacggg cgagtacgac 13020
atgcccgacc ccaatgacgg gttcctgtgg gacgatgtgg acagcagcgt gttctccccc 13080
cgaccgggtg ctaacgagcg ccccttgtgg aagaaggaag gcagcgaccg acgcccgtcc 13140
tcggcgctgt ccggccgcga gggtgctgcc gcggcggtgc ccgaggccgc cagtcctttc 13200
ccgagcttgc ccttctcgct gaacagtatc cgcagcagcg agctgggcag gatcacgcgc 13260
ccgcgcttgc tgggcgaaga ggagtacttg aatgactcgc tgttgagacc cgagcgggag 13320
aagaacttcc ccaataacgg gatagaaagc ctggtggaca agatgagccg ctggaagacg 13380
tatgcgcagg agcacaggga cgatccccgg gcgtcgcagg gggccacgag ccggggcagc 13440
gccgcccgta aacgccggtg gcacgacagg cagcggggac agatgtggga cgatgaggac 13500
tccgccgacg acagcagcgt gttggacttg ggtgggagtg gtaacccgtt cgctcacctg 13560
cgcccccgta tcgggcgcat gatgtaagag aaaccgaaaa taaatgatac tcaccaaggc 13620
catggcgacc agcgtgcgtt cgtttcttct ctgttgttgt tgtatctagt atgatgaggc 13680
gtgcgtaccc ggagggtcct cctccctcgt acgagagcgt gatgcagcag gcgatggcgg 13740
cggcggcgat gcagcccccg ctggaggctc cttacgtgcc cccgcggtac ctggcgccta 13800
cggaggggcg gaacagcatt cgttactcgg agctggcacc cttgtacgat accacccggt 13860
tgtacctggt ggacaacaag tcggcggaca tcgcctcgct gaactaccag aacgaccaca 13920
gcaacttcct gaccaccgtg gtgcagaaca atgacttcac ccccacggag gccagcaccc 13980
agaccatcaa ctttgacgag cgctcgcggt ggggcggcca gctgaaaacc atcatgcaca 14040
ccaacatgcc caacgtgaac gagttcatgt acagcaacaa gttcaaggcg cgggtgatgg 14100
tctcccgcaa gacccccaat ggggtgacag tgacagagga ttatgatggt agtcaggatg 14160
agctgaagta tgaatgggtg gaatttgagc tgcccgaagg caacttctcg gtgaccatga 14220
ccatcgacct gatgaacaac gccatcatcg acaattactt ggcggtgggg cggcagaacg 14280
gggtgctgga gagcgacatc ggcgtgaagt tcgacactag gaacttcagg ctgggctggg 14340
accccgtgac cgagctggtc atgcccgggg tgtacaccaa cgaggctttc catcccgata 14400
ttgtcttgct gcccggctgc ggggtggact tcaccgagag ccgcctcagc aacctgctgg 14460
gcattcgcaa gaggcagccc ttccaggaag gcttccagat catgtacgag gatctggagg 14520
ggggcaacat ccccgcgctc ctggatgtcg acgcctatga gaaaagcaag gaggatgcag 14580
cagctgaagc aactgcagcc gtagctaccg cctctaccga ggtcaggggc gataattttg 14640
caagcgccgc agcagtggca gcggccgagg cggctgaaac cgaaagtaag atagtcattc 14700
agccggtgga gaaggatagc aagaacagga gctacaacgt actaccggac aagataaaca 14760
ccgcctaccg cagctggtac ctagcctaca actatggcga ccccgagaag ggcgtgcgct 14820
cctggacgct gctcaccacc tcggacgtca cctgcggcgt ggagcaagtc tactggtcgc 14880
tgcccgacat gatgcaagac ccggtcacct tccgctccac gcgtcaagtt agcaactacc 14940
cggtggtggg cgccgagctc ctgcccgtct actccaagag cttcttcaac gagcaggccg 15000
tctactcgca gcagctgcgc gccttcacct cgcttacgca cgtcttcaac cgcttccccg 15060
agaaccagat cctcgtccgc ccgcccgcgc ccaccattac caccgtcagt gaaaacgttc 15120
ctgctctcac agatcacggg accctgccgc tgcgcagcag tatccgggga gtccagcgcg 15180
tgaccgttac tgacgccaga cgccgcacct gcccctacgt ctacaaggcc ctgggcatag 15240
tcgcgccgcg cgtcctctcg agccgcacct tctaaatgtc cattctcatc tcgcccagta 15300
ataacaccgg ttggggcctg cgcgcgccca gcaagatgta cggaggcgct cgccaacgct 15360
ccacgcaaca ccccgtgcgc gtgcgcgggc acttccgcgc tccctggggc gccctcaagg 15420
gccgcgtgcg gtcgcgcacc accgtcgacg acgtgatcga ccaggtggtg gccgacgcgc 15480
gcaactacac ccccgccgcc gcgcccgtct ccaccgtgga cgccgtcatc gacagcgtgg 15540
tggccgacgc gcgccggtac gcccgcgcca agagccggcg gcggcgcatc gcccggcggc 15600
accggagcac ccccgccatg cgcgcggcgc gagccttgct gcgcagggcc aggcgcacgg 15660
gacgcagggc catgctcagg gcggccagac gcgcggcttc aggcgccagc gccggcagga 15720
cccggagacg cgcggccacg gcggcggcag cggccatcgc cagcatgtcc cgcccgcggc 15780
gagggaacgt gtactgggtg cgcgacgccg ccaccggtgt gcgcgtgccc gtgcgcaccc 15840
gcccccctcg cacttgaaga tgttcacttc gcgatgttga tgtgtcccag cggcgaggag 15900
gatgtccaag cgcaaattca aggaagagat gctccaggtc atcgcgcctg agatctacgg 15960
ccctgcggtg gtgaaggagg aaagaaagcc ccgcaaaatc aagcgggtca aaaaggacaa 16020
aaaggaagaa gaaagtgatg tggacggatt ggtggagttt gtgcgcgagt tcgccccccg 16080
gcggcgcgtg cagtggcgcg ggcggaaggt gcaaccggtg ctgagacccg gcaccaccgt 16140
ggtcttcacg cccggcgagc gctccggcac cgcttccaag cgctcctacg acgaggtgta 16200
cggggatgat gatattctgg agcaggcggc cgagcgcctg ggcgagtttg cttacggcaa 16260
gcgcagccgt tccgcaccga aggaagaggc ggtgtccatc ccgctggacc acggcaaccc 16320
cacgccgagc ctcaagcccg tgaccttgca gcaggtgctg ccgaccgcgg cgccgcgccg 16380
ggggttcaag cgcgagggcg aggatctgta ccccaccatg cagctgatgg tgcccaagcg 16440
ccagaagctg gaagacgtgc tggagaccat gaaggtggac ccggacgtgc agcccgaggt 16500
caaggtgcgg cccatcaagc aggtggcccc gggcctgggc gtgcagaccg tggacatcaa 16560
gattcccacg gagcccatgg aaacgcagac cgagcccatg atcaagccca gcaccagcac 16620
catggaggtg cagacggatc cctggatgcc atcggctcct agtcgaagac cccggcgcaa 16680
gtacggcgcg gccagcctgc tgatgcccaa ctacgcgctg catccttcca tcatccccac 16740
gccgggctac cgcggcacgc gcttctaccg cggtcatacc agcagccgcc gccgcaagac 16800
caccactcgc cgccgccgtc gccgcaccgc cgctgcaacc acccctgccg ccctggtgcg 16860
gagagtgtac cgccgcggcc gcgcacctct gaccctgccg cgcgcgcgct accacccgag 16920
catcgccatt taaactttcg cctgctttgc agatcaatgg ccctcacatg ccgccttcgc 16980
gttcccatta cgggctaccg aggaagaaaa ccgcgccgta gaaggctggc ggggaacggg 17040
atgcgtcgcc accaccaccg gcggcggcgc gccatcagca agcggttggg gggaggcttc 17100
ctgcccgcgc tgatccccat catcgccgcg gcgatcgggg cgatccccgg cattgcttcc 17160
gtggcggtgc aggcctctca gcgccactga gacacacttg gaaacatctt gtaataaacc 17220
aatggactct gacgctcctg gtcctgtgat gtgttttcgt agacagatgg aagacatcaa 17280
tttttcgtcc ctggctccgc gacacggcac gcggccgttc atgggcacct ggagcgacat 17340
cggcaccagc caactgaacg ggggcgcctt caattggagc agtctctgga gcgggcttaa 17400
gaatttcggg tccacgctta aaacctatgg cagcaaggcg tggaacagca ccacagggca 17460
ggcgctgagg gataagctga aagagcagaa cttccagcag aaggtggtcg atgggctcgc 17520
ctcgggcatc aacggggtgg tggacctggc caaccaggcc gtgcagcggc agatcaacag 17580
ccgcctggac ccggtgccgc ccgccggctc cgtggagatg ccgcaggtgg aggaggagct 17640
gcctcccctg gacaagcggg gcgagaagcg accccgcccc gatgcggagg agacgctgct 17700
gacgcacacg gacgagccgc ccccgtacga ggaggcggtg aaactgggtc tgcccaccac 17760
gcggcccatc gcgcccctgg ccaccggggt gctgaaaccc gaaaagcccg cgaccctgga 17820
cttgcctcct ccccagcctt cccgcccctc tacagtggct aagcccctgc cgccggtggc 17880
cgtggcccgc gcgcgacccg ggggcaccgc ccgccctcat gcgaactggc agagcactct 17940
gaacagcatc gtgggtctgg gagtgcagag tgtgaagcgc cgccgctgct attaaaccta 18000
ccgtagcgct taacttgctt gtctgtgtgt gtatgtatta tgtcgccgcc gccgctgtcc 18060
accagaagga ggagtgaaga ggcgcgtcgc cgagttgcaa gatggccacc ccatcgatgc 18120
tgccccagtg ggcgtacatg cacatcgccg gacaggacgc ttcggagtac ctgagtccgg 18180
gtctggtgca gtttgcccgc gccacagaca cctacttcag tctggggaac aagtttagga 18240
accccacggt ggcgcccacg cacgatgtga ccaccgaccg cagccagcgg ctgacgctgc 18300
gcttcgtgcc cgtggaccgc gaggacaaca cctactcgta caaagtgcgc tacacgctgg 18360
ccgtgggcga caaccgcgtg ctggacatgg ccagcaccta ctttgacatc cgcggcgtgc 18420
tggatcgggg ccctagcttc aaaccctact ccggcaccgc ctacaacagt ctggccccca 18480
agggagcacc caacacttgt cagtggacat ataaagccga tggtgaaact gccacagaaa 18540
aaacctatac atatggaaat gcacccgtgc agggcattaa catcacaaaa gatggtattc 18600
aacttggaac tgacaccgat gatcagccaa tctacgcaga taaaacctat cagcctgaac 18660
ctcaagtggg tgatgctgaa tggcatgaca tcactggtac tgatgaaaag tatggaggca 18720
gagctcttaa gcctgatacc aaaatgaagc cttgttatgg ttcttttgcc aagcctacta 18780
ataaagaagg aggtcaggca aatgtgaaaa caggaacagg cactactaaa gaatatgaca 18840
tagacatggc tttctttgac aacagaagtg cggctgctgc tggcctagct ccagaaattg 18900
ttttgtatac tgaaaatgtg gatttggaaa ctccagatac ccatattgta tacaaagcag 18960
gcacagatga cagcagctct tctattaatt tgggtcagca agccatgccc aacagaccta 19020
actacattgg tttcagagac aactttatcg ggctcatgta ctacaacagc actggcaata 19080
tgggggtgct ggccggtcag gcttctcagc tgaatgctgt ggttgacttg caagacagaa 19140
acaccgagct gtcctaccag ctcttgcttg actctctggg tgacagaacc cggtatttca 19200
gtatgtggaa tcaggcggtg gacagctatg atcctgatgt gcgcattatt gaaaatcatg 19260
gtgtggagga tgaacttccc aactattgtt tccctctgga tgctgttggc agaacagata 19320
cttatcaggg aattaaggct aatggaactg atcaaaccac atggaccaaa gatgacagtg 19380
tcaatgatgc taatgagata ggcaagggta atccattcgc catggaaatc aacatccaag 19440
ccaacctgtg gaggaacttc ctctacgcca acgtggccct gtacctgccc gactcttaca 19500
agtacacgcc ggccaatgtt accctgccca ccaacaccaa cacctacgat tacatgaacg 19560
gccgggtggt ggcgccctcg ctggtggact cctacatcaa catcggggcg cgctggtcgc 19620
tggatcccat ggacaacgtg aaccccttca accaccaccg caatgcgggg ctgcgctacc 19680
gctccatgct cctgggcaac gggcgctacg tgcccttcca catccaggtg ccccagaaat 19740
ttttcgccat caagagcctc ctgctcctgc ccgggtccta cacctacgag tggaacttcc 19800
gcaaggacgt caacatgatc ctgcagagct ccctcggcaa cgacctgcgc acggacgggg 19860
cctccatctc cttcaccagc atcaacctct acgccacctt cttccccatg gcgcacaaca 19920
cggcctccac gctcgaggcc atgctgcgca acgacaccaa cgaccagtcc ttcaacgact 19980
acctctcggc ggccaacatg ctctacccca tcccggccaa cgccaccaac gtgcccatct 20040
ccatcccctc gcgcaactgg gccgccttcc gcggctggtc cttcacgcgt ctcaagacca 20100
aggagacgcc ctcgctgggc tccgggttcg acccctactt cgtctactcg ggctccatcc 20160
cctacctcga cggcaccttc tacctcaacc acaccttcaa gaaggtctcc atcaccttcg 20220
actcctccgt cagctggccc ggcaacgacc ggctcctgac gcccaacgag ttcgaaatca 20280
agcgcaccgt cgacggcgag ggctacaacg tggcccagtg caacatgacc aaggactggt 20340
tcctggtcca gatgctggcc cactacaaca tcggctacca gggcttctac gtgcccgagg 20400
gctacaagga ccgcatgtac tccttcttcc gcaacttcca gcccatgagc cgccaggtgg 20460
tggacgaggt caactacaag gactaccagg ccgtcaccct ggcctaccag cacaacaact 20520
cgggcttcgt cggctacctc gcgcccacca tgcgccaggg ccagccctac cccgccaact 20580
acccctaccc gctcatcggc aagagcgccg tcaccagcgt cacccagaaa aagttcctct 20640
gcgacagggt catgtggcgc atccccttct ccagcaactt catgtccatg ggcgcgctca 20700
ccgacctcgg ccagaacatg ctctatgcca actccgccca cgcgctagac atgaatttcg 20760
aagtcgaccc catggatgag tccacccttc tctatgttgt cttcgaagtc ttcgacgtcg 20820
tccgagtgca ccagccccac cgcggcgtca tcgaggccgt ctacctgcgc acccccttct 20880
cggccggtaa cgccaccacc taagctcttg cttcttgcaa gccatggccg cgggctccgg 20940
cgagcaggag ctcagggcca tcatccgcga cctgggctgc gggccctact tcctgggcac 21000
cttcgataag cgcttcccgg gattcatggc cccgcacaag ctggcctgcg ccatcgtcaa 21060
cacggccggc cgcgagaccg ggggcgagca ctggctggcc ttcgcctgga acccgcgctc 21120
gaacacctgc tacctcttcg accccttcgg gttctcggac gagcgcctca agcagatcta 21180
ccagttcgag tacgagggcc tgctgcgccg cagcgccctg gccaccgagg accgctgcgt 21240
caccctggaa aagtccaccc agaccgtgca gggtccgcgc tcggccgcct gcgggctctt 21300
ctgctgcatg ttcctgcacg ccttcgtgca ctggcccgac cgccccatgg acaagaaccc 21360
caccatgaac ttgctgacgg gggtgcccaa cggcatgctc cagtcgcccc aggtggaacc 21420
caccctgcgc cgcaaccagg aggcgctcta ccgcttcctc aactcccact ccgcctactt 21480
tcgctcccac cgcgcgcgca tcgagaaggc caccgccttc gaccgcatga atcaagacat 21540
gtaaaccgtg tgtgtatgtt aaatgtcttt aataaacagc actttcatgt tacacatgca 21600
tctgagatga tttatttaga aatcgaaagg gttctgccgg gtctcggcat ggcccgcggg 21660
cagggacacg ttgcggaact ggtacttggc cagccacttg aactcgggga tcagcagttt 21720
gggcagcggg gtgtcgggga aggagtcggt ccacagcttc cgcgtcagtt gcagggcgcc 21780
cagcaggtcg ggcgcggaga tcttgaaatc gcagttggga cccgcgttct gcgcgcggga 21840
gttgcggtac acggggttgc agcactggaa caccatcagg gccgggtgct tcacgctcgc 21900
cagcaccgtc gcgtcggtga tgctctccac gtcgaggtcc tcggcgttgg ccatcccgaa 21960
gggggtcatc ttgcaggtct gccttcccat ggtgggcacg cacccgggct tgtggttgca 22020
atcgcagtgc agggggatca gcatcatctg ggcctggtcg gcgttcatcc ccgggtacat 22080
ggccttcatg aaagcctcca attgcctgaa cgcctgctgg gccttggctc cctcggtgaa 22140
gaagaccccg caggacttgc tagagaactg gttggtggcg cacccggcgt cgtgcacgca 22200
gcagcgcgcg tcgttgttgg ccagctgcac cacgctgcgc ccccagcggt tctgggtgat 22260
cttggcccgg tcggggttct ccttcagcgc gcgctgcccg ttctcgctcg ccacatccat 22320
ctcgatcatg tgctccttct ggatcatggt ggtcccgtgc aggcaccgca gcttgccctc 22380
ggcctcggtg cacccgtgca gccacagcgc gcacccggtg cactcccagt tcttgtgggc 22440
gatctgggaa tgcgcgtgca cgaagccctg caggaagcgg cccatcatgg tggtcagggt 22500
cttgttgcta gtgaaggtca gcggaatgcc gcggtgctcc tcgttgatgt acaggtggca 22560
gatgcggcgg tacacctcgc cctgctcggg catcagctgg aagttggctt tcaggtcggt 22620
ctccacgcgg tagcggtcca tcagcatagt catgatttcc atacccttct cccaggccga 22680
gacgatgggc aggctcatag ggttcttcac catcatctta gcgctagcag ccgcggccag 22740
ggggtcgctc tcgtccaggg tctcaaagct ccgcttgccg tccttctcgg tgatccgcac 22800
cggggggtag ctgaagccca cggccgccag ctcctcctcg gcctgtcttt cgtcctcgct 22860
gtcctggctg acgtcctgca ggaccacatg cttggtcttg cggggtttct tcttgggcgg 22920
cagcggcggc ggagatgttg gagatggcga gggggagcgc gagttctcgc tcaccactac 22980
tatctcttcc tcttcttggt ccgaggccac gcggcggtag gtatgtctct tcgggggcag 23040
aggcggaggc gacgggctct cgccgccgcg acttggcgga tggctggcag agccccttcc 23100
gcgttcgggg gtgcgctccc ggcggcgctc tgactgactt cctccgcggc cggccattgt 23160
gttctcctag ggaggaacaa caagcatgga gactcagcca tcgccaacct cgccatctgc 23220
ccccaccgcc gacgagaagc agcagcagca gaatgaaagc ttaaccgccc cgccgcccag 23280
ccccgccacc tccgacgcgg ccgtcccaga catgcaagag atggaggaat ccatcgagat 23340
tgacctgggc tatgtgacgc ccgcggagca cgaggaggag ctggcagtgc gcttttcaca 23400
agaagagata caccaagaac agccagagca ggaagcagag aatgagcaga gtcaggctgg 23460
gctcgagcat gacggcgact acctccacct gagcgggggg gaggacgcgc tcatcaagca 23520
tctggcccgg caggccacca tcgtcaagga tgcgctgctc gaccgcaccg aggtgcccct 23580
cagcgtggag gagctcagcc gcgcctacga gttgaacctc ttctcgccgc gcgtgccccc 23640
caagcgccag cccaatggca cctgcgagcc caacccgcgc ctcaacttct acccggtctt 23700
cgcggtgccc gaggccctgg ccacctacca catctttttc aagaaccaaa agatccccgt 23760
ctcctgccgc gccaaccgca cccgcgccga cgcccttttc aacctgggtc ccggcgcccg 23820
cctacctgat atcgcctcct tggaagaggt tcccaagatc ttcgagggtc tgggcagcga 23880
cgagactcgg gccgcgaacg ctctgcaagg agaaggagga gagcatgagc accacagcgc 23940
cctggtcgag ttggaaggcg acaacgcgcg gctggcggtg ctcaaacgca cggtcgagct 24000
gacccatttc gcctacccgg ctctgaacct gccccccaaa gtcatgagcg cggtcatgga 24060
ccaggtgctc atcaagcgcg cgtcgcccat ctccgaggac gagggcatgc aagactccga 24120
ggagggcaag cccgtggtca gcgacgagca gctggcccgg tggctgggtc ctaatgctag 24180
tccccagagt ttggaagagc ggcgcaaact catgatggcc gtggtcctgg tgaccgtgga 24240
gctggagtgc ctgcgccgct tcttcgccga cgcggagacc ctgcgcaagg tcgaggagaa 24300
cctgcactac ctcttcaggc acgggttcgt gcgccaggcc tgcaagatct ccaacgtgga 24360
gctgaccaac ctggtctcct acatgggcat cttgcacgag aaccgcctgg ggcagaacgt 24420
gctgcacacc accctgcgcg gggaggcccg gcgcgactac atccgcgact gcgtctacct 24480
ctacctctgc cacacctggc agacgggcat gggcgtgtgg cagcagtgtc tggaggagca 24540
gaacctgaaa gagctctgca agctcctgca gaagaacctc aagggtctgt ggaccgggtt 24600
cgacgagcgc accaccgcct cggacctggc cgacctcatt ttccccgagc gcctcaggct 24660
gacgctgcgc aacggcctgc ccgactttat gagccaaagc atgttgcaaa actttcgctc 24720
tttcatcctc gaacgctccg gaatcctgcc cgccacctgc tccgcgctgc cctcggactt 24780
cgtgccgctg accttccgcg agtgcccccc gccgctgtgg agccactgct acctgctgcg 24840
cctggccaac tacctggcct accactcgga cgtgatcgag gacgtcagcg gcgagggcct 24900
gctcgagtgc cactgccgct gcaacctctg cacgccgcac cgctccctgg cctgcaaccc 24960
ccagctgctg agcgagaccc agatcatcgg caccttcgag ttgcaagggc ccagcgaagg 25020
cgagggttca gccgccaagg ggggtctgaa actcaccccg gggctgtgga cctcggccta 25080
cttgcgcaag ttcgtgcccg aggactacca tcccttcgag atcaggttct acgaggacca 25140
atcccatccg cccaaggccg agctgtcggc ctgcgtcatc acccaggggg cgatcctggc 25200
ccaattgcaa gccatccaga aatcccgcca agaattcttg ctgaaaaagg gccgcggggt 25260
ctacctcgac ccccagaccg gtgaggagct caaccccggc ttcccccagg atgccccgag 25320
gaaacaagaa gctgaaagtg gagctgccgc ccgtggagga tttggaggaa gactgggaga 25380
acagcagtca ggcagaggag gaggagatgg aggaagactg ggacagcact caggcagagg 25440
aggacagcct gcaagacagt ctggaggaag acgaggagga ggcagaggag gaggtggaag 25500
aagcagccgc cgccagaccg tcgtcctcgg cgggggagaa agcaagcagc acggatacca 25560
tctccgctcc gggtcggggt cccgctcgac cacacagtag atgggacgag accggacgat 25620
tcccgaaccc caccacccag accggtaaga aggagcggca gggatacaag tcctggcggg 25680
ggcacaaaaa cgccatcgtc tcctgcttgc aggcctgcgg gggcaacatc tccttcaccc 25740
ggcgctacct gctcttccac cgcggggtga actttccccg caacatcttg cattactacc 25800
gtcacctcca cagcccctac tacttccaag aagaggcagc agcagcagaa aaagaccagc 25860
agaaaaccag cagctagaaa atccacagcg gcggcagcag gtggactgag gatcgcggcg 25920
aacgagccgg cgcaaacccg ggagctgagg aaccggatct ttcccaccct ctatgccatc 25980
ttccagcaga gtcgggggca ggagcaggaa ctgaaagtca agaaccgttc tctgcgctcg 26040
ctcacccgca gttgtctgta tcacaagagc gaagaccaac ttcagcgcac tctcgaggac 26100
gccgaggctc tcttcaacaa gtactgcgcg ctcactctta aagagtagcc cgcgcccgcc 26160
cagtcgcaga aaaaggcggg aattacgtca cctgtgccct tcgccctagc cgcctccacc 26220
catcatcatg agcaaagaga ttcccacgcc ttacatgtgg agctaccagc cccagatggg 26280
cctggccgcc ggtgccgccc aggactactc cacccgcatg aattggctca gcgccgggcc 26340
cgcgatgatc tcacgggtga atgacatccg cgcccaccga aaccagatac tcctagaaca 26400
gtcagcgctc accgccacgc cccgcaatca cctcaatccg cgtaattggc ccgccgccct 26460
ggtgtaccag gaaattcccc agcccacgac cgtactactt ccgcgagacg cccaggccga 26520
agtccagctg actaactcag gtgtccagct ggcgggcggc gccaccctgt gtcgtcaccg 26580
ccccgctcag ggtataaagc ggctggtgat ccggggcaga ggcacacagc tcaacgacga 26640
ggtggtgagc tcttcgctgg gtctgcgacc tgacggagtc ttccaactcg ccggatcggg 26700
gagatcttcc ttcacgcctc gtcaggccgt cctgactttg gagagttcgt cctcgcagcc 26760
ccgctcgggt ggcatcggca ctctccagtt cgtggaggag ttcactccct cggtctactt 26820
caaccccttc tccggctccc ccggccacta cccggacgag ttcatcccga acttcgacgc 26880
catcagcgag tcggtggacg gctacgattg aaactaatca cccccttatc cagtgaaata 26940
aagatcatat tgatgatgat tttacagaaa taaaaaataa tcatttgatt tgaaataaag 27000
atacaatcat attgatgatt tgagtttaac aaaaaaataa agaatcactt acttgaaatc 27060
tgataccagg tctctgtcca tgttttctgc caacaccact tcactcccct cttcccagct 27120
ctggtactgc aggccccggc gggctgcaaa cttcctccac acgctgaagg ggatgtcaaa 27180
ttcctcctgt ccctcaatct tcattttatc ttctatcaga tgtccaaaaa gcgcgtccgg 27240
gtggatgatg acttcgaccc cgtctacccc tacgatgcag acaacgcacc gaccgtgccc 27300
ttcatcaacc cccccttcgt ctcttcagat ggattccaag agaagcccct gggggtgttg 27360
tccctgcgac tggccgaccc cgtcaccacc aagaacgggg aaatcaccct caagctggga 27420
gagggggtgg acctcgattc ctcgggaaaa ctcatctcca acacggccac caaggccgcc 27480
gcccctctca gtttttccaa caacaccatt tcccttaaca tggatcaccc cttttacact 27540
aaagatggaa aattatcctt acaagtttct ccaccattaa atatactgag aacaagcatt 27600
ctaaacacac tagctttagg ttttggatca ggtttaggac tccgtggctc tgccttggca 27660
gtacagttag tctctccact tacatttgat actgatggaa acataaagct taccttagac 27720
agaggtttgc atgttacaac aggagatgca attgaaagca acataagctg ggctaaaggt 27780
ttaaaatttg aagatggagc catagcaacc aacattggaa atgggttaga gtttggaagc 27840
agtagtacag aaacaggtgt tgatgatgct tacccaatcc aagttaaact tggatctggc 27900
cttagctttg acagtacagg agccataatg gctggtaaca aagaagacga taaactcact 27960
ttgtggacaa cacctgatcc atcaccaaac tgtcaaatac tcgcagaaaa tgatgcaaaa 28020
ctaacacttt gcttgactaa atgtggtagt caaatactgg ccactgtgtc agtcttagtt 28080
gtaggaagtg gaaacctaaa ccccattact ggcaccgtaa gcagtgctca ggtgtttcta 28140
cgttttgatg caaacggtgt tcttttaaca gaacattcta cactaaaaaa atactggggg 28200
tataggcagg gagatagcat agatggcact ccatatacca atgctgtagg attcatgccc 28260
aatttaaaag cttatccaaa gtcacaaagt tctactacta aaaataatat agtagggcaa 28320
gtatacatga atggagatgt ttcaaaacct atgcttctca ctataaccct caatggtact 28380
gatgacagca acagtacata ttcaatgtca ttttcataca cctggactaa tggaagctat 28440
gttggagcaa catttggggc taactcttat accttctcat acatcgccca agaatgaaca 28500
ctgtatccca ccctgcatgc caacccttcc caccccactc tgtggaacaa actctgaaac 28560
acaaaataaa ataaagttca agtgttttat tgattcaaca gttttacagg attcgagcag 28620
ttatttttcc tccaccctcc caggacatgg aatacaccac cctctccccc cgcacagcct 28680
tgaacatctg aatgccattg gtgatggaca tgcttttggt ctccacgttc cacacagttt 28740
cagagcgagc cagtctcggg tcggtcaggg agatgaaacc ctccgggcac tcccgcatct 28800
gcacctcaca gctcaacagc tgaggattgt cctcggtggt cgggatcacg gttatctgga 28860
agaagcagaa gagcggcggt gggaatcata gtccgcgaac gggatcggcc ggtggtgtcg 28920
catcaggccc cgcagcagtc gctgccgccg ccgctccgtc aagctgctgc tcagggggtc 28980
cgggtccagg gactccctca gcatgatgcc cacggccctc agcatcagtc gtctggtgcg 29040
gcgggcgcag cagcgcatgc ggatctcgct caggtcgctg cagtacgtgc aacacagaac 29100
caccaggttg ttcaacagtc catagttcaa cacgctccag ccgaaactca tcgcgggaag 29160
gatgctaccc acgtggccgt cgtaccagat cctcaggtaa atcaagtggt gccccctcca 29220
gaacacgctg cccacgtaca tgatctcctt gggcatgtgg cggttcacca cctcccggta 29280
ccacatcacc ctctggttga acatgcagcc ccggatgatc ctgcggaacc acagggccag 29340
caccgccccg cccgccatgc agcgaagaga ccccgggtcc cggcaatggc aatggaggac 29400
ccaccgctcg tacccgtgga tcatctggga gctgaacaag tctatgttgg cacagcacag 29460
gcatatgctc atgcatctct tcagcactct caactcctcg ggggtcaaaa ccatatccca 29520
gggcacgggg aactcttgca ggacagcgaa ccccgcagaa cagggcaatc ctcgcacaga 29580
acttacattg tgcatggaca gggtatcgca atcaggcagc accgggtgat cctccaccag 29640
agaagcgcgg gtctcggtct cctcacagcg tggtaagggg gccggccgat acgggtgatg 29700
gcgggacgcg gctgatcgtg ttcgcgaccg tgtcatgatg cagttgcttt cggacatttt 29760
cgtacttgct gtagcagaac ctggtccggg cgctgcacac cgatcgccgg cggcggtctc 29820
ggcgcttgga acgctcggtg ttgaaattgt aaaacagcca ctctctcaga ccgtgcagca 29880
gatctagggc ctcaggagtg atgaagatcc catcatgcct gatggctctg atcacatcga 29940
ccaccgtgga atgggccaga cccagccaga tgatgcaatt ttgttgggtt tcggtgacgg 30000
cgggggaggg aagaacagga agaaccatga ttaactttta atccaaacgg tctcggagta 30060
cttcaaaatg aagatcgcgg agatggcacc tctcgccccc gctgtgttgg tggaaaataa 30120
cagccaggtc aaaggtgata cggttctcga gatgttccac ggtggcttcc agcaaagcct 30180
ccacgcgcac atccagaaac aagacaatag cgaaagcggg agggttctct aattcctcaa 30240
tcatcatgtt acactcctgc accatcccca gataattttc atttttccag ccttgaatga 30300
ttcgaactag ttcctgaggt aaatccaagc cagccatgat aaagagctcg cgcagagcgc 30360
cctccaccgg cattcttaag cacaccctca taattccaag atattctgct cctggttcac 30420
ctgcagcaga ttgacaagcg gaatatcaaa atctctgccg cgatccctga gctcctccct 30480
cagcaataac tgtaagtact ctttcatatc ctctccgaaa tttttagcca taggaccacc 30540
aggaataaga ttagggcaag ccacagtaca gataaaccga agtcctcccc agtgagcatt 30600
gccaaatgca agactgctat aagcatgctg gctagacccg gtgatatctt ccagataact 30660
ggacagaaaa tcgcccaggc aatttttaag aaaatcaaca aaagaaaaat cctccaggtg 30720
gacgtttaga gcctcgggaa caacgatgaa gtaaatgcaa gcggtgcgtt ccagcatggt 30780
tagttagctg atctgtagaa aaaacaaaaa tgaacattaa accatgctag cctggcgaac 30840
aggtgggtaa atcgttctct ccagcaccag gcaggccacg gggtctccgg cgcgaccctc 30900
gtaaaaattg tcgctatgat tgaaaaccat cacagagaga cgttcccggt ggccggcgtg 30960
aatgattcga caagatgaat acacccccgg aacattggcg tccgcgagtg aaaaaaagcg 31020
cccgaggaag caataaggca ctacaatgct cagtctcaag tccagcaaag cgatgccatg 31080
cggatgaagc acaaaattct caggtgcgta caaaatgtaa ttactcccct cctgcacagg 31140
cagcaaagcc cccgatccct ccaggtacac atacaaagcc tcagcgtcca tagcttaccg 31200
agcagcagca cacaacaggc gcaagagtca gagaaaggct gagctctaac ctgtccaccc 31260
gctctctgct caatatatag cccagatcta cactgacgta aaggccaaag tctaaaaata 31320
cccgccaaat aatcacacac gcccagcaca cgcccagaaa ccggtgacac actcaaaaaa 31380
atacgcgcac ttcctcaaac gcccaaaact gccgtcattt ccgggttccc acgctacgtc 31440
atcaaaacac gactttcaaa ttccgtcgac cgttaaaaac gtcacccgcc ccgcccctaa 31500
cggtcgcccg tctctcagcc aatcagcgcc ccgcatcccc aaattcaaac acctcatttg 31560
catattaacg cgcacaaaaa gtttgagg 31588

<210> 3
<211> 11447
<212> DNA
<213> Venezuelan equine encephalitis virus
<400> 3
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa 7560
gatgttcccg ttccagccaa tgtatccgat gcagccaatg ccctatcgca acccgttcgc 7620
ggccccgcgc aggccctggt tccccagaac cgaccctttt ctggcgatgc aggtgcagga 7680
attaacccgc tcgatggcta acctgacgtt caagcaacgc cgggacgcgc cacctgaggg 7740
gccatccgct aagaaaccga agaaggaggc ctcgcaaaaa cagaaagggg gaggccaagg 7800
gaagaagaag aagaaccaag ggaagaagaa ggctaagaca gggccgccta atccgaaggc 7860
acagaatgga aacaagaaga agaccaacaa gaaaccaggc aagagacagc gcatggtcat 7920
gaaattggaa tctgacaaga cgttcccaat catgttggaa gggaagataa acggctacgc 7980
ttgtgtggtc ggagggaagt tattcaggcc gatgcatgtg gaaggcaaga tcgacaacga 8040
cgttctggcc gcgcttaaga cgaagaaagc atccaaatac gatcttgagt atgcagatgt 8100
gccacagaac atgcgggccg atacattcaa atacacccat gagaaacccc aaggctatta 8160
cagctggcat catggagcag tccaatatga aaatgggcgt ttcacggtgc cgaaaggagt 8220
tggggccaag ggagacagcg gacgacccat tctggataac cagggacggg tggtcgctat 8280
tgtgctggga ggtgtgaatg aaggatctag gacagccctt tcagtcgtca tgtggaacga 8340
gaagggagtt accgtgaagt atactccgga gaactgcgag caatggtcac tagtgaccac 8400
catgtgtctg ctcgccaatg tgacgttccc atgtgctcaa ccaccaattt gctacgacag 8460
aaaaccagca gagactttgg ccatgctcag cgttaacgtt gacaacccgg gctacgatga 8520
gctgctggaa gcagctgtta agtgccccgg aaggaaaagg agatccaccg aggagctgtt 8580
taaggagtat aagctaacgc gcccttacat ggccagatgc atcagatgtg cagttgggag 8640
ctgccatagt ccaatagcaa tcgaggcagt aaagagcgac gggcacgacg gttatgttag 8700
acttcagact tcctcgcagt atggcctgga ttcctccggc aacttaaagg gcaggaccat 8760
gcggtatgac atgcacggga ccattaaaga gataccacta catcaagtgt cactccatac 8820
atctcgcccg tgtcacattg tggatgggca cggttatttc ctgcttgcca ggtgcccggc 8880
aggggactcc atcaccatgg aatttaagaa agattccgtc acacactcct gctcggtgcc 8940
gtatgaagtg aaatttaatc ctgtaggcag agaactctat actcatcccc cagaacacgg 9000
agtagagcaa gcgtgccaag tctacgcaca tgatgcacag aacagaggag cttatgtcga 9060
gatgcacctc ccgggctcag aagtggacag cagtttggtt tccttgagcg gcagttcagt 9120
caccgtgaca cctcctgttg ggactagcgc cctggtggaa tgcgagtgtg gcggcacaaa 9180
gatctccgag accatcaaca agacaaaaca gttcagccag tgcacaaaga aggagcagtg 9240
cagagcatat cggctgcaga acgataagtg ggtgtataat tctgacaaac tgcccaaagc 9300
agcgggagcc accttaaaag gaaaactgca tgtcccattc ttgctggcag acggcaaatg 9360
caccgtgcct ctagcaccag aacctatgat aacctttggt ttcagatcag tgtcactgaa 9420
actgcaccct aagaatccca catatctaac cacccgccaa cttgctgatg agcctcacta 9480
cacgcacgag ctcatatctg aaccagctgt taggaatttt accgtcaccg aaaaagggtg 9540
ggagtttgta tggggaaacc acccgccgaa aaggttttgg gcacaggaaa cagcacccgg 9600
aaatccacat gggctaccgc acgaggtgat aactcattat taccacagat accctatgtc 9660
caccatcctg ggtttgtcaa tttgtgccgc cattgcaacc gtttccgttg cagcgtctac 9720
ctggctgttt tgcagatcta gagttgcgtg cctaactcct taccggctaa cacctaacgc 9780
taggatacca ttttgtctgg ctgtgctttg ctgcgcccgc actgcccggg ccgagaccac 9840
ctgggagtcc ttggatcacc tatggaacaa taaccaacag atgttctgga ttcaattgct 9900
gatccctctg gccgccttga tcgtagtgac tcgcctgctc aggtgcgtgt gctgtgtcgt 9960
gcctttttta gtcatggccg gcgccgcagg cgccggcgcc tacgagcacg cgaccacgat 10020
gccgagccaa gcgggaatct cgtataacac tatagtcaac agagcaggct acgcaccact 10080
ccctatcagc ataacaccaa caaagatcaa gctgatacct acagtgaact tggagtacgt 10140
cacctgccac tacaaaacag gaatggattc accagccatc aaatgctgcg gatctcagga 10200
atgcactcca acttacaggc ctgatgaaca gtgcaaagtc ttcacagggg tttacccgtt 10260
catgtggggt ggtgcatatt gcttttgcga cactgagaac acccaagtca gcaaggccta 10320
cgtaatgaaa tctgacgact gccttgcgga tcatgctgaa gcatataaag cgcacacagc 10380
ctcagtgcag gcgttcctca acatcacagt gggagaacac tctattgtga ctaccgtgta 10440
tgtgaatgga gaaactcctg tgaatttcaa tggggtcaaa ttaactgcag gtccgctttc 10500
cacagcttgg acaccctttg atcgcaaaat cgtgcagtat gccggggaga tctataatta 10560
tgattttcct gagtatgggg caggacaacc aggagcattt ggagatatac aatccagaac 10620
agtctcaagc tcagatctgt atgccaatac caacctagtg ctgcagagac ccaaagcagg 10680
agcgatccac gtgccataca ctcaggcacc ttcgggtttt gagcaatgga agaaagataa 10740
agctccatca ttgaaattta ccgccccttt cggatgcgaa atatatacaa accccattcg 10800
cgccgaaaac tgtgctgtag ggtcaattcc attagccttt gacattcccg acgccttgtt 10860
caccagggtg tcagaaacac cgacactttc agcggccgaa tgcactctta acgagtgcgt 10920
gtattcttcc gactttggtg ggatcgccac ggtcaagtac tcggccagca agtcaggcaa 10980
gtgcgcagtc catgtgccat cagggactgc taccctaaaa gaagcagcag tcgagctaac 11040
cgagcaaggg tcggcgacta tccatttctc gaccgcaaat atccacccgg agttcaggct 11100
ccaaatatgc acatcatatg ttacgtgcaa aggtgattgt caccccccga aagaccatat 11160
tgtgacacac cctcagtatc acgcccaaac atttacagcc gcggtgtcaa aaaccgcgtg 11220
gacgtggtta acatccctgc tgggaggatc agccgtaatt attataattg gcttggtgct 11280
ggctactatt gtggccatgt acgtgctgac caaccagaaa cataattgaa tacagcagca 11340
attggcaagc tgcttacata gaactcgcgg cgattggcat gccgccttaa aatttttatt 11400
ttattttttc ttttcttttc cgaatcggat tttgttttta atatttc 11447

<210> 4
<211> 9577
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 4
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gactctagaa tagtctttaa 7560
ttaagccacc atggcaggca tgtttcaggc gctgagcgaa ggctgcaccc cgtatgatat 7620
taaccagatg ctgaacgtgc tgggcgatca tcaggtctca ggccttgagc agcttgagag 7680
tataatcaac tttgaaaaac tgactgaatg gaccagttct aatgttatgc ctatcctgtc 7740
tcctctgaca aagggcatcc tgggcttcgt gtttaccctg accgtgcctt ctgagagagg 7800
acttagctgc attagcgaag cggatgcgac caccccggaa agcgcgaacc tgggcgaaga 7860
aattctgagc cagctgtatc tttggccaag ggtgacctac cattccccta gttatgctta 7920
ccaccaattt gaaagacgag ccaaatataa aagacacttc cccggctttg gccagagcct 7980
gctgtttggc taccctgtgt acgtgttcgg cgattgcgtg cagggcgatt gggatgcgat 8040
tcgctttcgc tattgcgcgc cgccgggcta tgcgctgctg cgctgcaacg ataccaacta 8100
tagcgctctg ctggctgtgg gggccctaga aggacccagg aatcaggact ggcttggtgt 8160
cccaagacaa cttgtaactc ggatgcaggc tattcagaat gccggcctgt gtaccctggt 8220
ggccatgctg gaagagacaa tcttctggct gcaagcgttt ctgatggcgc tgaccgatag 8280
cggcccgaaa accaacatta ttgtggatag ccagtatgtg atgggcatta gcaaaccgag 8340
ctttcaggaa tttgtggatt gggaaaacgt gagcccggaa ctgaacagca ccgatcagcc 8400
gttttggcaa gccggaatcc tggccagaaa tctggtgcct atggtggcca cagtgcaggg 8460
ccagaacctg aagtaccagg gtcagtcact agtcatctct gcttctatca ttgtcttcaa 8520
cctgctggaa ctggaaggtg attatcgaga tgatggcaac gtgtgggtgc ataccccgct 8580
gagcccgcgc accctgaacg cgtgggtgaa agcggtggaa gaaaaaaaag gtattccagt 8640
tcacctagag ctggccagta tgaccaacat ggagctcatg agcagtattg tgcatcagca 8700
ggtcagaaca tacggccccg tgttcatgtg tctcggcgga ctgcttacaa tggtggctgg 8760
tgctgtgtgg ctgacagtgc gagtgctcga gctgttccgg gccgcgcagc tggccaacga 8820
cgtggtcctc cagatcatgg agctttgtgg tgcagcgttt cgccaggtgt gccataccac 8880
cgtgccgtgg ccgaacgcga gcctgacccc gaaatggaac aacgaaacca cccagcccca 8940
gatcgccaac tgcagcgtgt atgacttttt tgtgtggctc cattattatt ctgttcgaga 9000
cacactttgg ccaagggtga cctaccatat gaacaaatat gcgtatcata tgctggaaag 9060
acgagccaaa tataaaagag gaccaggacc tggcgctaaa tttgtggccg cctggacact 9120
gaaagccgct gctggtcctg gacctggcca gtacatcaag gccaacagca agttcatcgg 9180
catcaccgaa ctcggacccg gaccaggctg atgattcgaa cggccgtatc acgcccaaac 9240
atttacagcc gcggtgtcaa aaaccgcgtg gacgtggtta acatccctgc tgggaggatc 9300
agccgtaatt attataattg gcttggtgct ggctactatt gtggccatgt acgtgctgac 9360
caaccagaaa cataattgaa tacagcagca attggcaagc tgcttacata gaactcgcgg 9420
cgattggcat gccgccttaa aatttttatt ttattttttc ttttcttttc cgaatcggat 9480
tttgttttta atatttcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 9577

<210> 5
<211> 11447
<212> DNA
<213> Venezuelan equine encephalitis virus
<400> 5
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa 7560
gatgttcccg ttccagccaa tgtatccgat gcagccaatg ccctatcgca acccgttcgc 7620
ggccccgcgc aggccctggt tccccagaac cgaccctttt ctggcgatgc aggtgcagga 7680
attaacccgc tcgatggcta acctgacgtt caagcaacgc cgggacgcgc cacctgaggg 7740
gccatccgct aagaaaccga agaaggaggc ctcgcaaaaa cagaaagggg gaggccaagg 7800
gaagaagaag aagaaccaag ggaagaagaa ggctaagaca gggccgccta atccgaaggc 7860
acagaatgga aacaagaaga agaccaacaa gaaaccaggc aagagacagc gcatggtcat 7920
gaaattggaa tctgacaaga cgttcccaat catgttggaa gggaagataa acggctacgc 7980
ttgtgtggtc ggagggaagt tattcaggcc gatgcatgtg gaaggcaaga tcgacaacga 8040
cgttctggcc gcgcttaaga cgaagaaagc atccaaatac gatcttgagt atgcagatgt 8100
gccacagaac atgcgggccg atacattcaa atacacccat gagaaacccc aaggctatta 8160
cagctggcat catggagcag tccaatatga aaatgggcgt ttcacggtgc cgaaaggagt 8220
tggggccaag ggagacagcg gacgacccat tctggataac cagggacggg tggtcgctat 8280
tgtgctggga ggtgtgaatg aaggatctag gacagccctt tcagtcgtca tgtggaacga 8340
gaagggagtt accgtgaagt atactccgga gaactgcgag caatggtcac tagtgaccac 8400
catgtgtctg ctcgccaatg tgacgttccc atgtgctcaa ccaccaattt gctacgacag 8460
aaaaccagca gagactttgg ccatgctcag cgttaacgtt gacaacccgg gctacgatga 8520
gctgctggaa gcagctgtta agtgccccgg aaggaaaagg agatccaccg aggagctgtt 8580
taaggagtat aagctaacgc gcccttacat ggccagatgc atcagatgtg cagttgggag 8640
ctgccatagt ccaatagcaa tcgaggcagt aaagagcgac gggcacgacg gttatgttag 8700
acttcagact tcctcgcagt atggcctgga ttcctccggc aacttaaagg gcaggaccat 8760
gcggtatgac atgcacggga ccattaaaga gataccacta catcaagtgt cactccatac 8820
atctcgcccg tgtcacattg tggatgggca cggttatttc ctgcttgcca ggtgcccggc 8880
aggggactcc atcaccatgg aatttaagaa agattccgtc acacactcct gctcggtgcc 8940
gtatgaagtg aaatttaatc ctgtaggcag agaactctat actcatcccc cagaacacgg 9000
agtagagcaa gcgtgccaag tctacgcaca tgatgcacag aacagaggag cttatgtcga 9060
gatgcacctc ccgggctcag aagtggacag cagtttggtt tccttgagcg gcagttcagt 9120
caccgtgaca cctcctgttg ggactagcgc cctggtggaa tgcgagtgtg gcggcacaaa 9180
gatctccgag accatcaaca agacaaaaca gttcagccag tgcacaaaga aggagcagtg 9240
cagagcatat cggctgcaga acgataagtg ggtgtataat tctgacaaac tgcccaaagc 9300
agcgggagcc accttaaaag gaaaactgca tgtcccattc ttgctggcag acggcaaatg 9360
caccgtgcct ctagcaccag aacctatgat aacctttggt ttcagatcag tgtcactgaa 9420
actgcaccct aagaatccca catatctaac cacccgccaa cttgctgatg agcctcacta 9480
cacgcacgag ctcatatctg aaccagctgt taggaatttt accgtcaccg aaaaagggtg 9540
ggagtttgta tggggaaacc acccgccgaa aaggttttgg gcacaggaaa cagcacccgg 9600
aaatccacat gggctaccgc acgaggtgat aactcattat taccacagat accctatgtc 9660
caccatcctg ggtttgtcaa tttgtgccgc cattgcaacc gtttccgttg cagcgtctac 9720
ctggctgttt tgcagatcta gagttgcgtg cctaactcct taccggctaa cacctaacgc 9780
taggatacca ttttgtctgg ctgtgctttg ctgcgcccgc actgcccggg ccgagaccac 9840
ctgggagtcc ttggatcacc tatggaacaa taaccaacag atgttctgga ttcaattgct 9900
gatccctctg gccgccttga tcgtagtgac tcgcctgctc aggtgcgtgt gctgtgtcgt 9960
gcctttttta gtcatggccg gcgccgcagg cgccggcgcc tacgagcacg cgaccacgat 10020
gccgagccaa gcgggaatct cgtataacac tatagtcaac agagcaggct acgcaccact 10080
ccctatcagc ataacaccaa caaagatcaa gctgatacct acagtgaact tggagtacgt 10140
cacctgccac tacaaaacag gaatggattc accagccatc aaatgctgcg gatctcagga 10200
atgcactcca acttacaggc ctgatgaaca gtgcaaagtc ttcacagggg tttacccgtt 10260
catgtggggt ggtgcatatt gcttttgcga cactgagaac acccaagtca gcaaggccta 10320
cgtaatgaaa tctgacgact gccttgcgga tcatgctgaa gcatataaag cgcacacagc 10380
ctcagtgcag gcgttcctca acatcacagt gggagaacac tctattgtga ctaccgtgta 10440
tgtgaatgga gaaactcctg tgaatttcaa tggggtcaaa ttaactgcag gtccgctttc 10500
cacagcttgg acaccctttg atcgcaaaat cgtgcagtat gccggggaga tctataatta 10560
tgattttcct gagtatgggg caggacaacc aggagcattt ggagatatac aatccagaac 10620
agtctcaagc tcagatctgt atgccaatac caacctagtg ctgcagagac ccaaagcagg 10680
agcgatccac gtgccataca ctcaggcacc ttcgggtttt gagcaatgga agaaagataa 10740
agctccatca ttgaaattta ccgccccttt cggatgcgaa atatatacaa accccattcg 10800
cgccgaaaac tgtgctgtag ggtcaattcc attagccttt gacattcccg acgccttgtt 10860
caccagggtg tcagaaacac cgacactttc agcggccgaa tgcactctta acgagtgcgt 10920
gtattcttcc gactttggtg ggatcgccac ggtcaagtac tcggccagca agtcaggcaa 10980
gtgcgcagtc catgtgccat cagggactgc taccctaaaa gaagcagcag tcgagctaac 11040
cgagcaaggg tcggcgacta tccatttctc gaccgcaaat atccacccgg agttcaggct 11100
ccaaatatgc acatcatatg ttacgtgcaa aggtgattgt caccccccga aagaccatat 11160
tgtgacacac cctcagtatc acgcccaaac atttacagcc gcggtgtcaa aaaccgcgtg 11220
gacgtggtta acatccctgc tgggaggatc agccgtaatt attataattg gcttggtgct 11280
ggctactatt gtggccatgt acgtgctgac caaccagaaa cataattgaa tacagcagca 11340
attggcaagc tgcttacata gaactcgcgg cgattggcat gccgccttaa aatttttatt 11400
ttattttttc ttttcttttc cgaatcggat tttgttttta atatttc 11447

<210> 6
<211> 7894
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 6
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gactatcacg cccaaacatt 7560
tacagccgcg gtgtcaaaaa ccgcgtggac gtggttaaca tccctgctgg gaggatcagc 7620
cgtaattatt ataattggct tggtgctggc tactattgtg gccatgtacg tgctgaccaa 7680
ccagaaacat aattgaatac agcagcaatt ggcaagctgc ttacatagaa ctcgcggcga 7740
ttggcatgcc gccttaaaat ttttatttta ttttttcttt tcttttccga atcggatttt 7800
gtttttaata tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 7894

<210> 7
<211> 7893
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
ataggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gactatcacg cccaaacatt 7560
tacagccgcg gtgtcaaaaa ccgcgtggac gtggttaaca tccctgctgg gaggatcagc 7620
cgtaattatt ataattggct tggtgctggc tactattgtg gccatgtacg tgctgaccaa 7680
ccagaaacat aattgaatac agcagcaatt ggcaagctgc ttacatagaa ctcgcggcga 7740
ttggcatgcc gccttaaaat ttttatttta tttttctttt cttttccgaa tcggattttg 7800
tttttaatat ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 7893

<210> 8
<211> 7927
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 8
taatacgact cactatagga tgggcggcgc atgagagaag cccagaccaa ttacctaccc 60
aaaatggaga aagttcacgt tgacatcgag gaagacagcc cattcctcag agctttgcag 120
cggagcttcc cgcagtttga ggtagaagcc aagcaggtca ctgataatga ccatgctaat 180
gccagagcgt tttcgcatct ggcttcaaaa ctgatcgaaa cggaggtgga cccatccgac 240
acgatccttg acattggaag tgcgcccgcc cgcagaatgt attctaagca caagtatcat 300
tgtatctgtc cgatgagatg tgcggaagat ccggacagat tgtataagta tgcaactaag 360
ctgaagaaaa actgtaagga aataactgat aaggaattgg acaagaaaat gaaggagctc 420
gccgccgtca tgagcgaccc tgacctggaa actgagacta tgtgcctcca cgacgacgag 480
tcgtgtcgct acgaagggca agtcgctgtt taccaggatg tatacgcggt tgacggaccg 540
acaagtctct atcaccaagc caataaggga gttagagtcg cctactggat aggctttgac 600
accacccctt ttatgtttaa gaacttggct ggagcatatc catcatactc taccaactgg 660
gccgacgaaa ccgtgttaac ggctcgtaac ataggcctat gcagctctga cgttatggag 720
cggtcacgta gagggatgtc cattcttaga aagaagtatt tgaaaccatc caacaatgtt 780
ctattctctg ttggctcgac catctaccac gagaagaggg acttactgag gagctggcac 840
ctgccgtctg tatttcactt acgtggcaag caaaattaca catgtcggtg tgagactata 900
gttagttgcg acgggtacgt cgttaaaaga atagctatca gtccaggcct gtatgggaag 960
ccttcaggct atgctgctac gatgcaccgc gagggattct tgtgctgcaa agtgacagac 1020
acattgaacg gggagagggt ctcttttccc gtgtgcacgt atgtgccagc tacattgtgt 1080
gaccaaatga ctggcatact ggcaacagat gtcagtgcgg acgacgcgca aaaactgctg 1140
gttgggctca accagcgtat agtcgtcaac ggtcgcaccc agagaaacac caataccatg 1200
aaaaattacc ttttgcccgt agtggcccag gcatttgcta ggtgggcaaa ggaatataag 1260
gaagatcaag aagatgaaag gccactagga ctacgagata gacagttagt catggggtgt 1320
tgttgggctt ttagaaggca caagataaca tctatttata agcgcccgga tacccaaacc 1380
atcatcaaag tgaacagcga tttccactca ttcgtgctgc ccaggatagg cagtaacaca 1440
ttggagatcg ggctgagaac aagaatcagg aaaatgttag aggagcacaa ggagccgtca 1500
cctctcatta ccgccgagga cgtacaagaa gctaagtgcg cagccgatga ggctaaggag 1560
gtgcgtgaag ccgaggagtt gcgcgcagct ctaccacctt tggcagctga tgttgaggag 1620
cccactctgg aagccgatgt cgacttgatg ttacaagagg ctggggccgg ctcagtggag 1680
acacctcgtg gcttgataaa ggttaccagc tacgctggcg aggacaagat cggctcttac 1740
gctgtgcttt ctccgcaggc tgtactcaag agtgaaaaat tatcttgcat ccaccctctc 1800
gctgaacaag tcatagtgat aacacactct ggccgaaaag ggcgttatgc cgtggaacca 1860
taccatggta aagtagtggt gccagaggga catgcaatac ccgtccagga ctttcaagct 1920
ctgagtgaaa gtgccaccat tgtgtacaac gaacgtgagt tcgtaaacag gtacctgcac 1980
catattgcca cacatggagg agcgctgaac actgatgaag aatattacaa aactgtcaag 2040
cccagcgagc acgacggcga atacctgtac gacatcgaca ggaaacagtg cgtcaagaaa 2100
gaactagtca ctgggctagg gctcacaggc gagctggtgg atcctccctt ccatgaattc 2160
gcctacgaga gtctgagaac acgaccagcc gctccttacc aagtaccaac cataggggtg 2220
tatggcgtgc caggatcagg caagtctggc atcattaaaa gcgcagtcac caaaaaagat 2280
ctagtggtga gcgccaagaa agaaaactgt gcagaaatta taagggacgt caagaaaatg 2340
aaagggctgg acgtcaatgc cagaactgtg gactcagtgc tcttgaatgg atgcaaacac 2400
cccgtagaga ccctgtatat tgacgaagct tttgcttgtc atgcaggtac tctcagagcg 2460
ctcatagcca ttataagacc taaaaaggca gtgctctgcg gggatcccaa acagtgcggt 2520
ttttttaaca tgatgtgcct gaaagtgcat tttaaccacg agatttgcac acaagtcttc 2580
cacaaaagca tctctcgccg ttgcactaaa tctgtgactt cggtcgtctc aaccttgttt 2640
tacgacaaaa aaatgagaac gacgaatccg aaagagacta agattgtgat tgacactacc 2700
ggcagtacca aacctaagca ggacgatctc attctcactt gtttcagagg gtgggtgaag 2760
cagttgcaaa tagattacaa aggcaacgaa ataatgacgg cagctgcctc tcaagggctg 2820
acccgtaaag gtgtgtatgc cgttcggtac aaggtgaatg aaaatcctct gtacgcaccc 2880
acctcagaac atgtgaacgt cctactgacc cgcacggagg accgcatcgt gtggaaaaca 2940
ctagccggcg acccatggat aaaaacactg actgccaagt accctgggaa tttcactgcc 3000
acgatagagg agtggcaagc agagcatgat gccatcatga ggcacatctt ggagagaccg 3060
gaccctaccg acgtcttcca gaataaggca aacgtgtgtt gggccaaggc tttagtgccg 3120
gtgctgaaga ccgctggcat agacatgacc actgaacaat ggaacactgt ggattatttt 3180
gaaacggaca aagctcactc agcagagata gtattgaacc aactatgcgt gaggttcttt 3240
ggactcgatc tggactccgg tctattttct gcacccactg ttccgttatc cattaggaat 3300
aatcactggg ataactcccc gtcgcctaac atgtacgggc tgaataaaga agtggtccgt 3360
cagctctctc gcaggtaccc acaactgcct cgggcagttg ccactggaag agtctatgac 3420
atgaacactg gtacactgcg caattatgat ccgcgcataa acctagtacc tgtaaacaga 3480
agactgcctc atgctttagt cctccaccat aatgaacacc cacagagtga cttttcttca 3540
ttcgtcagca aattgaaggg cagaactgtc ctggtggtcg gggaaaagtt gtccgtccca 3600
ggcaaaatgg ttgactggtt gtcagaccgg cctgaggcta ccttcagagc tcggctggat 3660
ttaggcatcc caggtgatgt gcccaaatat gacataatat ttgttaatgt gaggacccca 3720
tataaatacc atcactatca gcagtgtgaa gaccatgcca ttaagcttag catgttgacc 3780
aagaaagctt gtctgcatct gaatcccggc ggaacctgtg tcagcatagg ttatggttac 3840
gctgacaggg ccagcgaaag catcattggt gctatagcgc ggcagttcaa gttttcccgg 3900
gtatgcaaac cgaaatcctc acttgaagag acggaagttc tgtttgtatt cattgggtac 3960
gatcgcaagg cccgtacgca caatccttac aagctttcat caaccttgac caacatttat 4020
acaggttcca gactccacga agccggatgt gcaccctcat atcatgtggt gcgaggggat 4080
attgccacgg ccaccgaagg agtgattata aatgctgcta acagcaaagg acaacctggc 4140
ggaggggtgt gcggagcgct gtataagaaa ttcccggaaa gcttcgattt acagccgatc 4200
gaagtaggaa aagcgcgact ggtcaaaggt gcagctaaac atatcattca tgccgtagga 4260
ccaaacttca acaaagtttc ggaggttgaa ggtgacaaac agttggcaga ggcttatgag 4320
tccatcgcta agattgtcaa cgataacaat tacaagtcag tagcgattcc actgttgtcc 4380
accggcatct tttccgggaa caaagatcga ctaacccaat cattgaacca tttgctgaca 4440
gctttagaca ccactgatgc agatgtagcc atatactgca gggacaagaa atgggaaatg 4500
actctcaagg aagcagtggc taggagagaa gcagtggagg agatatgcat atccgacgac 4560
tcttcagtga cagaacctga tgcagagctg gtgagggtgc atccgaagag ttctttggct 4620
ggaaggaagg gctacagcac aagcgatggc aaaactttct catatttgga agggaccaag 4680
tttcaccagg cggccaagga tatagcagaa attaatgcca tgtggcccgt tgcaacggag 4740
gccaatgagc aggtatgcat gtatatcctc ggagaaagca tgagcagtat taggtcgaaa 4800
tgccccgtcg aagagtcgga agcctccaca ccacctagca cgctgccttg cttgtgcatc 4860
catgccatga ctccagaaag agtacagcgc ctaaaagcct cacgtccaga acaaattact 4920
gtgtgctcat cctttccatt gccgaagtat agaatcactg gtgtgcagaa gatccaatgc 4980
tcccagccta tattgttctc accgaaagtg cctgcgtata ttcatccaag gaagtatctc 5040
gtggaaacac caccggtaga cgagactccg gagccatcgg cagagaacca atccacagag 5100
gggacacctg aacaaccacc acttataacc gaggatgaga ccaggactag aacgcctgag 5160
ccgatcatca tcgaagagga agaagaggat agcataagtt tgctgtcaga tggcccgacc 5220
caccaggtgc tgcaagtcga ggcagacatt cacgggccgc cctctgtatc tagctcatcc 5280
tggtccattc ctcatgcatc cgactttgat gtggacagtt tatccatact tgacaccctg 5340
gagggagcta gcgtgaccag cggggcaacg tcagccgaga ctaactctta cttcgcaaag 5400
agtatggagt ttctggcgcg accggtgcct gcgcctcgaa cagtattcag gaaccctcca 5460
catcccgctc cgcgcacaag aacaccgtca cttgcaccca gcagggcctg ctcgagaacc 5520
agcctagttt ccaccccgcc aggcgtgaat agggtgatca ctagagagga gctcgaggcg 5580
cttaccccgt cacgcactcc tagcaggtcg gtctcgagaa ccagcctggt ctccaacccg 5640
ccaggcgtaa atagggtgat tacaagagag gagtttgagg cgttcgtagc acaacaacaa 5700
tgacggtttg atgcgggtgc atacatcttt tcctccgaca ccggtcaagg gcatttacaa 5760
caaaaatcag taaggcaaac ggtgctatcc gaagtggtgt tggagaggac cgaattggag 5820
atttcgtatg ccccgcgcct cgaccaagaa aaagaagaat tactacgcaa gaaattacag 5880
ttaaatccca cacctgctaa cagaagcaga taccagtcca ggaaggtgga gaacatgaaa 5940
gccataacag ctagacgtat tctgcaaggc ctagggcatt atttgaaggc agaaggaaaa 6000
gtggagtgct accgaaccct gcatcctgtt cctttgtatt catctagtgt gaaccgtgcc 6060
ttttcaagcc ccaaggtcgc agtggaagcc tgtaacgcca tgttgaaaga gaactttccg 6120
actgtggctt cttactgtat tattccagag tacgatgcct atttggacat ggttgacgga 6180
gcttcatgct gcttagacac tgccagtttt tgccctgcaa agctgcgcag ctttccaaag 6240
aaacactcct atttggaacc cacaatacga tcggcagtgc cttcagcgat ccagaacacg 6300
ctccagaacg tcctggcagc tgccacaaaa agaaattgca atgtcacgca aatgagagaa 6360
ttgcccgtat tggattcggc ggcctttaat gtggaatgct tcaagaaata tgcgtgtaat 6420
aatgaatatt gggaaacgtt taaagaaaac cccatcaggc ttactgaaga aaacgtggta 6480
aattacatta ccaaattaaa aggaccaaaa gctgctgctc tttttgcgaa gacacataat 6540
ttgaatatgt tgcaggacat accaatggac aggtttgtaa tggacttaaa gagagacgtg 6600
aaagtgactc caggaacaaa acatactgaa gaacggccca aggtacaggt gatccaggct 6660
gccgatccgc tagcaacagc gtatctgtgc ggaatccacc gagagctggt taggagatta 6720
aatgcggtcc tgcttccgaa cattcataca ctgtttgata tgtcggctga agactttgac 6780
gctattatag ccgagcactt ccagcctggg gattgtgttc tggaaactga catcgcgtcg 6840
tttgataaaa gtgaggacga cgccatggct ctgaccgcgt taatgattct ggaagactta 6900
ggtgtggacg cagagctgtt gacgctgatt gaggcggctt tcggcgaaat ttcatcaata 6960
catttgccca ctaaaactaa atttaaattc ggagccatga tgaaatctgg aatgttcctc 7020
acactgtttg tgaacacagt cattaacatt gtaatcgcaa gcagagtgtt gagagaacgg 7080
ctaaccggat caccatgtgc agcattcatt ggagatgaca atatcgtgaa aggagtcaaa 7140
tcggacaaat taatggcaga caggtgcgcc acctggttga atatggaagt caagattata 7200
gatgctgtgg tgggcgagaa agcgccttat ttctgtggag ggtttatttt gtgtgactcc 7260
gtgaccggca cagcgtgccg tgtggcagac cccctaaaaa ggctgtttaa gcttggcaaa 7320
cctctggcag cagacgatga acatgatgat gacaggagaa gggcattgca tgaagagtca 7380
acacgctgga accgagtggg tattctttca gagctgtgca aggcagtaga atcaaggtat 7440
gaaaccgtag gaacttccat catagttatg gccatgacta ctctagctag cagtgttaaa 7500
tcattcagct acctgagagg ggcccctata actctctacg gctaacctga atggactacg 7560
actatcacgc ccaaacattt acagccgcgg tgtcaaaaac cgcgtggacg tggttaacat 7620
ccctgctggg aggatcagcc gtaattatta taattggctt ggtgctggct actattgtgg 7680
ccatgtacgt gctgaccaac cagaaacata attgaataca gcagcaattg gcaagctgct 7740
tacatagaac tcgcggcgat tggcatgccg ccttaaaatt tttattttat tttttctttt 7800
cttttccgaa tcggattttg tttttaatat ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaatacgtag 7920
tttaaac 7927

<210> 9
<211> 7926
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 9
taatacgact cactatagga taggcggcgc atgagagaag cccagaccaa ttacctaccc 60
aaaatggaga aagttcacgt tgacatcgag gaagacagcc cattcctcag agctttgcag 120
cggagcttcc cgcagtttga ggtagaagcc aagcaggtca ctgataatga ccatgctaat 180
gccagagcgt tttcgcatct ggcttcaaaa ctgatcgaaa cggaggtgga cccatccgac 240
acgatccttg acattggaag tgcgcccgcc cgcagaatgt attctaagca caagtatcat 300
tgtatctgtc cgatgagatg tgcggaagat ccggacagat tgtataagta tgcaactaag 360
ctgaagaaaa actgtaagga aataactgat aaggaattgg acaagaaaat gaaggagctc 420
gccgccgtca tgagcgaccc tgacctggaa actgagacta tgtgcctcca cgacgacgag 480
tcgtgtcgct acgaagggca agtcgctgtt taccaggatg tatacgcggt tgacggaccg 540
acaagtctct atcaccaagc caataaggga gttagagtcg cctactggat aggctttgac 600
accacccctt ttatgtttaa gaacttggct ggagcatatc catcatactc taccaactgg 660
gccgacgaaa ccgtgttaac ggctcgtaac ataggcctat gcagctctga cgttatggag 720
cggtcacgta gagggatgtc cattcttaga aagaagtatt tgaaaccatc caacaatgtt 780
ctattctctg ttggctcgac catctaccac gagaagaggg acttactgag gagctggcac 840
ctgccgtctg tatttcactt acgtggcaag caaaattaca catgtcggtg tgagactata 900
gttagttgcg acgggtacgt cgttaaaaga atagctatca gtccaggcct gtatgggaag 960
ccttcaggct atgctgctac gatgcaccgc gagggattct tgtgctgcaa agtgacagac 1020
acattgaacg gggagagggt ctcttttccc gtgtgcacgt atgtgccagc tacattgtgt 1080
gaccaaatga ctggcatact ggcaacagat gtcagtgcgg acgacgcgca aaaactgctg 1140
gttgggctca accagcgtat agtcgtcaac ggtcgcaccc agagaaacac caataccatg 1200
aaaaattacc ttttgcccgt agtggcccag gcatttgcta ggtgggcaaa ggaatataag 1260
gaagatcaag aagatgaaag gccactagga ctacgagata gacagttagt catggggtgt 1320
tgttgggctt ttagaaggca caagataaca tctatttata agcgcccgga tacccaaacc 1380
atcatcaaag tgaacagcga tttccactca ttcgtgctgc ccaggatagg cagtaacaca 1440
ttggagatcg ggctgagaac aagaatcagg aaaatgttag aggagcacaa ggagccgtca 1500
cctctcatta ccgccgagga cgtacaagaa gctaagtgcg cagccgatga ggctaaggag 1560
gtgcgtgaag ccgaggagtt gcgcgcagct ctaccacctt tggcagctga tgttgaggag 1620
cccactctgg aagccgatgt cgacttgatg ttacaagagg ctggggccgg ctcagtggag 1680
acacctcgtg gcttgataaa ggttaccagc tacgatggcg aggacaagat cggctcttac 1740
gctgtgcttt ctccgcaggc tgtactcaag agtgaaaaat tatcttgcat ccaccctctc 1800
gctgaacaag tcatagtgat aacacactct ggccgaaaag ggcgttatgc cgtggaacca 1860
taccatggta aagtagtggt gccagaggga catgcaatac ccgtccagga ctttcaagct 1920
ctgagtgaaa gtgccaccat tgtgtacaac gaacgtgagt tcgtaaacag gtacctgcac 1980
catattgcca cacatggagg agcgctgaac actgatgaag aatattacaa aactgtcaag 2040
cccagcgagc acgacggcga atacctgtac gacatcgaca ggaaacagtg cgtcaagaaa 2100
gaactagtca ctgggctagg gctcacaggc gagctggtgg atcctccctt ccatgaattc 2160
gcctacgaga gtctgagaac acgaccagcc gctccttacc aagtaccaac cataggggtg 2220
tatggcgtgc caggatcagg caagtctggc atcattaaaa gcgcagtcac caaaaaagat 2280
ctagtggtga gcgccaagaa agaaaactgt gcagaaatta taagggacgt caagaaaatg 2340
aaagggctgg acgtcaatgc cagaactgtg gactcagtgc tcttgaatgg atgcaaacac 2400
cccgtagaga ccctgtatat tgacgaagct tttgcttgtc atgcaggtac tctcagagcg 2460
ctcatagcca ttataagacc taaaaaggca gtgctctgcg gggatcccaa acagtgcggt 2520
ttttttaaca tgatgtgcct gaaagtgcat tttaaccacg agatttgcac acaagtcttc 2580
cacaaaagca tctctcgccg ttgcactaaa tctgtgactt cggtcgtctc aaccttgttt 2640
tacgacaaaa aaatgagaac gacgaatccg aaagagacta agattgtgat tgacactacc 2700
ggcagtacca aacctaagca ggacgatctc attctcactt gtttcagagg gtgggtgaag 2760
cagttgcaaa tagattacaa aggcaacgaa ataatgacgg cagctgcctc tcaagggctg 2820
acccgtaaag gtgtgtatgc cgttcggtac aaggtgaatg aaaatcctct gtacgcaccc 2880
acctcagaac atgtgaacgt cctactgacc cgcacggagg accgcatcgt gtggaaaaca 2940
ctagccggcg acccatggat aaaaacactg actgccaagt accctgggaa tttcactgcc 3000
acgatagagg agtggcaagc agagcatgat gccatcatga ggcacatctt ggagagaccg 3060
gaccctaccg acgtcttcca gaataaggca aacgtgtgtt gggccaaggc tttagtgccg 3120
gtgctgaaga ccgctggcat agacatgacc actgaacaat ggaacactgt ggattatttt 3180
gaaacggaca aagctcactc agcagagata gtattgaacc aactatgcgt gaggttcttt 3240
ggactcgatc tggactccgg tctattttct gcacccactg ttccgttatc cattaggaat 3300
aatcactggg ataactcccc gtcgcctaac atgtacgggc tgaataaaga agtggtccgt 3360
cagctctctc gcaggtaccc acaactgcct cgggcagttg ccactggaag agtctatgac 3420
atgaacactg gtacactgcg caattatgat ccgcgcataa acctagtacc tgtaaacaga 3480
agactgcctc atgctttagt cctccaccat aatgaacacc cacagagtga cttttcttca 3540
ttcgtcagca aattgaaggg cagaactgtc ctggtggtcg gggaaaagtt gtccgtccca 3600
ggcaaaatgg ttgactggtt gtcagaccgg cctgaggcta ccttcagagc tcggctggat 3660
ttaggcatcc caggtgatgt gcccaaatat gacataatat ttgttaatgt gaggacccca 3720
tataaatacc atcactatca gcagtgtgaa gaccatgcca ttaagcttag catgttgacc 3780
aagaaagctt gtctgcatct gaatcccggc ggaacctgtg tcagcatagg ttatggttac 3840
gctgacaggg ccagcgaaag catcattggt gctatagcgc ggcagttcaa gttttcccgg 3900
gtatgcaaac cgaaatcctc acttgaagag acggaagttc tgtttgtatt cattgggtac 3960
gatcgcaagg cccgtacgca caatccttac aagctttcat caaccttgac caacatttat 4020
acaggttcca gactccacga agccggatgt gcaccctcat atcatgtggt gcgaggggat 4080
attgccacgg ccaccgaagg agtgattata aatgctgcta acagcaaagg acaacctggc 4140
ggaggggtgt gcggagcgct gtataagaaa ttcccggaaa gcttcgattt acagccgatc 4200
gaagtaggaa aagcgcgact ggtcaaaggt gcagctaaac atatcattca tgccgtagga 4260
ccaaacttca acaaagtttc ggaggttgaa ggtgacaaac agttggcaga ggcttatgag 4320
tccatcgcta agattgtcaa cgataacaat tacaagtcag tagcgattcc actgttgtcc 4380
accggcatct tttccgggaa caaagatcga ctaacccaat cattgaacca tttgctgaca 4440
gctttagaca ccactgatgc agatgtagcc atatactgca gggacaagaa atgggaaatg 4500
actctcaagg aagcagtggc taggagagaa gcagtggagg agatatgcat atccgacgac 4560
tcttcagtga cagaacctga tgcagagctg gtgagggtgc atccgaagag ttctttggct 4620
ggaaggaagg gctacagcac aagcgatggc aaaactttct catatttgga agggaccaag 4680
tttcaccagg cggccaagga tatagcagaa attaatgcca tgtggcccgt tgcaacggag 4740
gccaatgagc aggtatgcat gtatatcctc ggagaaagca tgagcagtat taggtcgaaa 4800
tgccccgtcg aagagtcgga agcctccaca ccacctagca cgctgccttg cttgtgcatc 4860
catgccatga ctccagaaag agtacagcgc ctaaaagcct cacgtccaga acaaattact 4920
gtgtgctcat cctttccatt gccgaagtat agaatcactg gtgtgcagaa gatccaatgc 4980
tcccagccta tattgttctc accgaaagtg cctgcgtata ttcatccaag gaagtatctc 5040
gtggaaacac caccggtaga cgagactccg gagccatcgg cagagaacca atccacagag 5100
gggacacctg aacaaccacc acttataacc gaggatgaga ccaggactag aacgcctgag 5160
ccgatcatca tcgaagagga agaagaggat agcataagtt tgctgtcaga tggcccgacc 5220
caccaggtgc tgcaagtcga ggcagacatt cacgggccgc cctctgtatc tagctcatcc 5280
tggtccattc ctcatgcatc cgactttgat gtggacagtt tatccatact tgacaccctg 5340
gagggagcta gcgtgaccag cggggcaacg tcagccgaga ctaactctta cttcgcaaag 5400
agtatggagt ttctggcgcg accggtgcct gcgcctcgaa cagtattcag gaaccctcca 5460
catcccgctc cgcgcacaag aacaccgtca cttgcaccca gcagggcctg ctcgagaacc 5520
agcctagttt ccaccccgcc aggcgtgaat agggtgatca ctagagagga gctcgaggcg 5580
cttaccccgt cacgcactcc tagcaggtcg gtctcgagaa ccagcctggt ctccaacccg 5640
ccaggcgtaa atagggtgat tacaagagag gagtttgagg cgttcgtagc acaacaacaa 5700
tgacggtttg atgcgggtgc atacatcttt tcctccgaca ccggtcaagg gcatttacaa 5760
caaaaatcag taaggcaaac ggtgctatcc gaagtggtgt tggagaggac cgaattggag 5820
atttcgtatg ccccgcgcct cgaccaagaa aaagaagaat tactacgcaa gaaattacag 5880
ttaaatccca cacctgctaa cagaagcaga taccagtcca ggaaggtgga gaacatgaaa 5940
gccataacag ctagacgtat tctgcaaggc ctagggcatt atttgaaggc agaaggaaaa 6000
gtggagtgct accgaaccct gcatcctgtt cctttgtatt catctagtgt gaaccgtgcc 6060
ttttcaagcc ccaaggtcgc agtggaagcc tgtaacgcca tgttgaaaga gaactttccg 6120
actgtggctt cttactgtat tattccagag tacgatgcct atttggacat ggttgacgga 6180
gcttcatgct gcttagacac tgccagtttt tgccctgcaa agctgcgcag ctttccaaag 6240
aaacactcct atttggaacc cacaatacga tcggcagtgc cttcagcgat ccagaacacg 6300
ctccagaacg tcctggcagc tgccacaaaa agaaattgca atgtcacgca aatgagagaa 6360
ttgcccgtat tggattcggc ggcctttaat gtggaatgct tcaagaaata tgcgtgtaat 6420
aatgaatatt gggaaacgtt taaagaaaac cccatcaggc ttactgaaga aaacgtggta 6480
aattacatta ccaaattaaa aggaccaaaa gctgctgctc tttttgcgaa gacacataat 6540
ttgaatatgt tgcaggacat accaatggac aggtttgtaa tggacttaaa gagagacgtg 6600
aaagtgactc caggaacaaa acatactgaa gaacggccca aggtacaggt gatccaggct 6660
gccgatccgc tagcaacagc gtatctgtgc ggaatccacc gagagctggt taggagatta 6720
aatgcggtcc tgcttccgaa cattcataca ctgtttgata tgtcggctga agactttgac 6780
gctattatag ccgagcactt ccagcctggg gattgtgttc tggaaactga catcgcgtcg 6840
tttgataaaa gtgaggacga cgccatggct ctgaccgcgt taatgattct ggaagactta 6900
ggtgtggacg cagagctgtt gacgctgatt gaggcggctt tcggcgaaat ttcatcaata 6960
catttgccca ctaaaactaa atttaaattc ggagccatga tgaaatctgg aatgttcctc 7020
acactgtttg tgaacacagt cattaacatt gtaatcgcaa gcagagtgtt gagagaacgg 7080
ctaaccggat caccatgtgc agcattcatt ggagatgaca atatcgtgaa aggagtcaaa 7140
tcggacaaat taatggcaga caggtgcgcc acctggttga atatggaagt caagattata 7200
gatgctgtgg tgggcgagaa agcgccttat ttctgtggag ggtttatttt gtgtgactcc 7260
gtgaccggca cagcgtgccg tgtggcagac cccctaaaaa ggctgtttaa gcttggcaaa 7320
cctctggcag cagacgatga acatgatgat gacaggagaa gggcattgca tgaagagtca 7380
acacgctgga accgagtggg tattctttca gagctgtgca aggcagtaga atcaaggtat 7440
gaaaccgtag gaacttccat catagttatg gccatgacta ctctagctag cagtgttaaa 7500
tcattcagct acctgagagg ggcccctata actctctacg gctaacctga atggactacg 7560
actatcacgc ccaaacattt acagccgcgg tgtcaaaaac cgcgtggacg tggttaacat 7620
ccctgctggg aggatcagcc gtaattatta taattggctt ggtgctggct actattgtgg 7680
ccatgtacgt gctgaccaac cagaaacata attgaataca gcagcaattg gcaagctgct 7740
tacatagaac tcgcggcgat tggcatgccg ccttaaaatt tttattttat ttttcttttc 7800
ttttccgaat cggattttgt ttttaatatt tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatacgtagt 7920
ttaaac 7926

<210> 10
<211> 36519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 10
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagatga ggcacctgag agacctgccc 600
gatgagaaaa tcatcatcgc ttccgggaac gagattctgg aactggtggt aaatgccatg 660
atgggcgacg accctccgga gccccccacc ccatttgaga caccttcgct gcacgatttg 720
tatgatctgg aggtggatgt gcccgaggac gatcccaatg aggaggcggt aaatgatttt 780
tttagcgatg ccgcgctgct agctgccgag gaggcttcga gctctagctc agacagcgac 840
tcttcactgc atacccctag acccggcaga ggtgagaaaa agatccccga gcttaaaggg 900
gaagagatgg acttgcgctg ctatgaggaa tgcttgcccc cgagcgatga tgaggacgag 960
caggcgatcc agaacgcagc gagccaggga gtgcaagccg ccagcgagag ctttgcgctg 1020
gactgcccgc ctctgcccgg acacggctgt aagtcttgtg aatttcatcg catgaatact 1080
ggagataaag ctgtgttgtg tgcactttgc tatatgagag cttacaacca ttgtgtttac 1140
agtaagtgtg attaagttga actttagagg gaggcagaga gcagggtgac tgggcgatga 1200
ctggtttatt tatgtatata tgttctttat ataggtcccg tctctgacgc agatgatgag 1260
acccccacta caaagtccac ttcgtcaccc ccagaaattg gcacatctcc acctgagaat 1320
attgttagac cagttcctgt tagagccact gggaggagag cagctgtgga atgtttggat 1380
gacttgctac agggtggggt tgaacctttg gacttgtgta cccggaaacg ccccaggcac 1440
taagtgccac acatgtgtgt ttacttgagg tgatgtcagt atttataggg tgtggagtgc 1500
aataaaaaat gtgttgactt taagtgcgtg gtttatgact caggggtggg gactgtgagt 1560
atataagcag gtgcagacct gtgtggttag ctcagagcgg catggagatt tggacggtct 1620
tggaagactt tcacaagact agacagctgc tagagaacgc ctcgaacgga gtctcttacc 1680
tgtggagatt ctgcttcggt ggcgacctag ctaggctagt ctacagggcc aaacaggatt 1740
atagtgaaca atttgaggtt attttgagag agtgttctgg tctttttgac gctcttaact 1800
tgggccatca gtctcacttt aaccagagga tttcgagagc ccttgatttt actactcctg 1860
gcagaaccac tgcagcagta gccttttttg cttttattct tgacaaatgg agtcaagaaa 1920
cccatttcag cagggattac cagctggatt tcttagcagt agctttgtgg agaacatgga 1980
agtgccagcg cctgaatgca atctccggct acttgccggt acagccgcta gacactctga 2040
ggatcctgaa tctccaggag agtcccaggg cacgccaacg tcgccagcag cagcagcagg 2100
aggaggatca agaagagaac ccgagagccg gcctggaccc tccggcggag gaggaggagt 2160
agctgacctg tttcctgaac tgcgccgggt gctgactagg tcttcgagtg gtcgggagag 2220
ggggattaag cgggagaggc atgatgagac taatcacaga actgaactga ctgtgggtct 2280
gatgagtcgc aagcgcccag aaacagtgtg gtggcatgag gtgcagtcga ctggcacaga 2340
tgaggtgtcg gtgatgcatg agaggttttc tctagaacaa gtcaagactt gttggttaga 2400
gcctgaggat gattgggagg tagccatcag gaattatgcc aagctggctc tgaggccaga 2460
caagaagtac aagattacta agctgataaa tatcagaaat gcctgctaca tctcagggaa 2520
tggggctgaa gtggagatct gtctccagga aagggtggct ttcagatgct gcatgatgaa 2580
tatgtacccg ggagtggtgg gcatggatgg ggttaccttt atgaacatga ggttcagggg 2640
agatgggtat aatggcacgg tctttatggc caataccaag ctgacagtcc atggctgctc 2700
cttctttggg tttaataaca cctgcatcga ggcctggggt caggtcggtg tgaggggctg 2760
cagtttttca gccaactgga tgggggtcgt gggcaggacc aagagtatgc tgtccgtgaa 2820
gaaatgcttg tttgagaggt gccacctggg ggtgatgagc gagggcgaag ccagaatccg 2880
ccactgcgcc tctaccgaga cgggctgctt tgtgctgtgc aagggcaatg ctaagatcaa 2940
gcataatatg atctgtggag cctcggacga gcgcggctac cagatgctga cctgcgccgg 3000
cgggaacagc catatgctgg ccaccgtaca tgtggcttcc catgctcgca agccctggcc 3060
cgagttcgag cacaatgtca tgaccaggtg caatatgcat ctggggtccc gccgaggcat 3120
gttcatgccc taccagtgca acctgaatta tgtgaaggtg ctgctggagc ccgatgccat 3180
gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gaggtgtgga agattctgag 3240
atatgatgaa tccaagacca ggtgccgagc ctgcgagtgc ggagggaagc atgccaggtt 3300
ccagcccgtg tgtgtggatg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg tgttgccctg 3360
caccgggacg gagttcggtt ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt agtgttctgg 3420
ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat ctgtgctttt ctgtgtgttg 3480
cagcagcatg agcggaagcg gctcctttga gggaggggta ttcagccctt atctgacggg 3540
gcgtctcccc tcctgggcgg gagtgcgtca gaatgtgatg ggatccacgg tggacggccg 3600
gcccgtgcag cccgcgaact cttcaaccct gacctatgca accctgagct cttcgtcgtt 3660
ggacgcagct gccgccgcag ctgctgcatc tgccgccagc gccgtgcgcg gaatggccat 3720
gggcgccggc tactacggca ctctggtggc caactcgagt tccaccaata atcccgccag 3780
cctgaacgag gagaagctgt tgctgctgat ggcccagctc gaggccttga cccagcgcct 3840
gggcgagctg acccagcagg tggctcagct gcaggagcag acgcgggccg cggttgccac 3900
ggtgaaatcc aaataaaaaa tgaatcaata aataaacgga gacggttgtt gattttaaca 3960
cagagtctga atctttattt gatttttcgc gcgcggtagg ccctggacca ccggtctcga 4020
tcattgagca cccggtggat cttttccagg acccggtaga ggtgggcttg gatgttgagg 4080
tacatgggca tgagcccgtc ccgggggtgg aggtagctcc attgcagggc ctcgtgctcg 4140
ggggtggtgt tgtaaatcac ccagtcatag caggggcgca gggcatggtg ttgcacaata 4200
tctttgagga ggagactgat ggccacgggc agccctttgg tgtaggtgtt tacaaatctg 4260
ttgagctggg agggatgcat gcggggggag atgaggtgca tcttggcctg gatcttgaga 4320
ttggcgatgt taccgcccag atcccgcctg gggttcatgt tgtgcaggac caccagcacg 4380
gtgtatccgg tgcacttggg gaatttatca tgcaacttgg aagggaaggc gtgaaagaat 4440
ttggcgacgc ctttgtgccc gcccaggttt tccatgcact catccatgat gatggcgatg 4500
ggcccgtggg cggcggcctg ggcaaagacg tttcgggggt cggacacatc atagttgtgg 4560
tcctgggtga ggtcatcata ggccatttta atgaatttgg ggcggagggt gccggactgg 4620
gggacaaagg taccctcgat cccgggggcg tagttcccct cacagatctg catctcccag 4680
gctttgagct cggagggggg gatcatgtcc acctgcgggg cgataaagaa cacggtttcc 4740
ggggcggggg agatgagctg ggccgaaagc aagttccgga gcagctggga cttgccgcag 4800
ccggtggggc cgtagatgac cccgatgacc ggctgcaggt ggtagttgag ggagagacag 4860
ctgccgtcct cccggaggag gggggccacc tcgttcatca tctcgcgcac gtgcatgttc 4920
tcgcgcacca gttccgccag gaggcgctct ccccccaggg ataggagctc ctggagcgag 4980
gcgaagtttt tcagcggctt gagtccgtcg gccatgggca ttttggagag ggtttgttgc 5040
aagagttcca ggcggtccca gagctcggtg atgtgctcta cggcatctcg atccagcaga 5100
cctcctcgtt tcgcgggttg ggacggctgc gggagtaggg caccagacga tgggcgtcca 5160
gcgcagccag ggtccggtcc ttccagggtc gcagcgtccg cgtcagggtg gtctccgtca 5220
cggtgaaggg gtgcgcgccg ggctgggcgc ttgcgagggt gcgcttcagg ctcatccggc 5280
tggtcgaaaa ccgctcccga tcggcgccct gcgcgtcggc caggtagcaa ttgaccatga 5340
gttcgtagtt gagcgcctcg gccgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagtct 5400
gcccgcaggc gggacagagg agggacttga gggcgtagag cttgggggcg aggaagacgg 5460
actcgggggc gtaggcgtcc gcgccgcagt gggcgcagac ggtctcgcac tccacgagcc 5520
aggtgaggtc gggctggtcg gggtcaaaaa ccagtttccc gccgttcttt ttgatgcgtt 5580
tcttaccttt ggtctccatg agctcgtgtc cccgctgggt gacaaagagg ctgtccgtgt 5640
ccccgtagac cgactttatg ggccggtcct cgagcggtgt gccgcggtcc tcctcgtaga 5700
ggaaccccgc ccactccgag acgaaagccc gggtccaggc cagcacgaag gaggccacgt 5760
gggacgggta gcggtcgttg tccaccagcg ggtccacctt ttccagggta tgcaaacaca 5820
tgtccccctc gtccacatcc aggaaggtga ttggcttgta agtgtaggcc acgtgaccgg 5880
gggtcccggc cgggggggta taaaagggtg cgggtccctg ctcgtcctca ctgtcttccg 5940
gatcgctgtc caggagcgcc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga 6000
cctcggcact caggttgtca gtttctagaa acgaggagga tttgatattg acggtgccgg 6060
cggagatgcc tttcaagagc ccctcgtcca tctggtcaga aaagacgatc tttttgttgt 6120
cgagcttggt ggcgaaggag ccgtagaggg cgttggagag gagcttggcg atggagcgca 6180
tggtctggtt tttttccttg tcggcgcgct ccttggcggc gatgttgagc tgcacgtact 6240
cgcgcgccac gcacttccat tcggggaaga cggtggtcag ctcgtcgggc acgattctga 6300
cctgccagcc ccgattatgc agggtgatga ggtccacact ggtggccacc tcgccgcgca 6360
ggggctcatt agtccagcag aggcgtccgc ccttgcgcga gcagaagggg ggcagggggt 6420
ccagcatgac ctcgtcgggg gggtcggcat cgatggtgaa gatgccgggc aggaggtcgg 6480
ggtcaaagta gctgatggaa gtggccagat cgtccagggc agcttgccat tcgcgcacgg 6540
ccagcgcgcg ctcgtaggga ctgaggggcg tgccccaggg catgggatgg gtaagcgcgg 6600
aggcgtacat gccgcagatg tcgtagacgt agaggggctc ctcgaggatg ccgatgtagg 6660
tggggtagca gcgccccccg cggatgctgg cgcgcacgta gtcatacagc tcgtgcgagg 6720
gggcgaggag ccccgggccc aggttggtgc gactgggctt ttcggcgcgg tagacgatct 6780
ggcggaaaat ggcatgcgag ttggaggaga tggtgggcct ttggaagatg ttgaagtggg 6840
cgtggggcag tccgaccgag tcgcggatga agtgggcgta ggagtcttgc agcttggcga 6900
cgagctcggc ggtgactagg acgtccagag cgcagtagtc gagggtctcc tggatgatgt 6960
catacttgag ctgtcccttt tgtttccaca gctcgcggtt gagaaggaac tcttcgcggt 7020
ccttccagta ctcttcgagg gggaacccgt cctgatctgc acggtaagag cctagcatgt 7080
agaactggtt gacggccttg taggcgcagc agcccttctc cacggggagg gcgtaggcct 7140
gggcggcctt gcgcagggag gtgtgcgtga gggcgaaagt gtccctgacc atgaccttga 7200
ggaactggtg cttgaagtcg atatcgtcgc agcccccctg ctcccagagc tggaagtccg 7260
tgcgcttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac atcgttgaag aggatcttgc 7320
ccgcgcgggg cataaagttg cgagtgatgc ggaaaggttg gggcacctcg gcccggttgt 7380
tgatgacctg ggcggcgagc acgatctcgt cgaagccgtt gatgttgtgg cccacgatgt 7440
agagttccac gaatcgcgga cggcccttga cgtggggcag tttcttgagc tcctcgtagg 7500
tgagctcgtc ggggtcgctg agcccgtgct gctcgagcgc ccagtcggcg agatgggggt 7560
tggcgcggag gaaggaagtc cagagatcca cggccagggc ggtttgcaga cggtcccggt 7620
actgacggaa ctgctgcccg acggccattt tttcgggggt gacgcagtag aaggtgcggg 7680
ggtccccgtg ccagcgatcc catttgagct ggagggcgag atcgagggcg agctcgacga 7740
gccggtcgtc cccggagagt ttcatgacca gcatgaaggg gacgagctgc ttgccgaagg 7800
accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgaggaa gagcctttcg gtgcgaggat 7860
gcgagccgat ggggaagaac tggatctcct gccaccaatt ggaggaatgg ctgttgatgt 7920
gatggaagta gaaatgccga cggcgcgccg aacactcgtg cttgtgttta tacaagcggc 7980
cacagtgctc gcaacgctgc acgggatgca cgtgctgcac gagctgtacc tgagttcctt 8040
tgacgaggaa tttcagtggg aagtggagtc gtggcgcctg catctcgtgc tgtactacgt 8100
cgtggtggtc ggcctggccc tcttctgcct cgatggtggt catgctgacg agcccgcgcg 8160
ggaggcaggt ccagacctcg gcgcgagcgg gtcggagagc gaggacgagg gcgcgcaggc 8220
cggagctgtc cagggtcctg agacgctgcg gagtcaggtc agtgggcagc ggcggcgcgc 8280
ggttgacttg caggagtttt tccagggcgc gcgggaggtc cagatggtac ttgatctcca 8340
ccgcgccatt ggtggcgacg tcgatggctt gcagggtccc gtgcccctgg ggtgtgacca 8400
ccgtcccccg tttcttcttg ggcggctggg gcgacggggg cggtgcctct tccatggtta 8460
gaagcggcgg cgaggacgcg cgccgggcgg caggggcggc tcggggcccg gaggcagggg 8520
cggcaggggc acgtcggcgc cgcgcgcggg taggttctgg tactgcgccc ggagaagact 8580
ggcgtgagcg acgacgcgac ggttgacgtc ctggatctga cgcctctggg tgaaggccac 8640
gggacccgtg agtttgaacc tgaaagagag ttcgacagaa tcaatctcgg tatcgttgac 8700
ggcggcctgc cgcaggatct cttgcacgtc gcccgagttg tcctggtagg cgatctcggt 8760
catgaactgc tcgatctcct cctcttgaag gtctccgcgg ccggcgcgct ccacggtggc 8820
cgcgaggtcg ttggagatgc ggcccatgag ctgcgagaag gcgttcatgc ccgcctcgtt 8880
ccagacgcgg ctgtagacca cgacgccctc gggatcgcgg gcgcgcatga ccacctgggc 8940
gaggttgagc tccacgtggc gcgtgaagac cgcgtagttg cagaggcgct ggtagaggta 9000
gttgagcgtg gtggcgatgt gctcggtgac gaagaaatac atgatccagc ggcggagcgg 9060
catctcgctg acgtcgccca gcgcctccaa acgttccatg gcctcgtaaa agtccacggc 9120
gaagttgaaa aactgggagt tgcgcgccga gacggtcaac tcctcctcca gaagacggat 9180
gagctcggcg atggtggcgc gcacctcgcg ctcgaaggcc cccgggagtt cctccacttc 9240
ctcttcttcc tcctccacta acatctcttc tacttcctcc tcaggcggca gtggtggcgg 9300
gggagggggc ctgcgtcgcc ggcggcgcac gggcagacgg tcgatgaagc gctcgatggt 9360
ctcgccgcgc cggcgtcgca tggtctcggt gacggcgcgc ccgtcctcgc ggggccgcag 9420
cgtgaagacg ccgccgcgca tctccaggtg gccggggggg tccccgttgg gcagggagag 9480
ggcgctgacg atgcatctta tcaattgccc cgtagggact ccgcgcaagg acctgagcgt 9540
ctcgagatcc acgggatctg aaaaccgctg aacgaaggct tcgagccagt cgcagtcgca 9600
aggtaggctg agcacggttt cttctggcgg gtcatgttgg ttgggagcgg ggcgggcgat 9660
gctgctggtg atgaagttga aataggcggt tctgagacgg cggatggtgg cgaggagcac 9720
caggtctttg ggcccggctt gctggatgcg cagacggtcg gccatgcccc aggcgtggtc 9780
ctgacacctg gccaggtcct tgtagtagtc ctgcatgagc cgctccacgg gcacctcctc 9840
ctcgcccgcg cggccgtgca tgcgcgtgag cccgaagccg cgctggggct ggacgagcgc 9900
caggtcggcg acgacgcgct cggcgaggat ggcttgctgg atctgggtga gggtggtctg 9960
gaagtcatca aagtcgacga agcggtggta ggctccggtg ttgatggtgt aggagcagtt 10020
ggccatgacg gaccagttga cggtctggtg gcccggacgc acgagctcgt ggtacttgag 10080
gcgcgagtag gcgcgcgtgt cgaagatgta gtcgttgcag gtgcgcacca ggtactggta 10140
gccgatgagg aagtgcggcg gcggctggcg gtagagcggc catcgctcgg tggcgggggc 10200
gccgggcgcg aggtcctcga gcatggtgcg gtggtagccg tagatgtacc tggacatcca 10260
ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cgggaactcg cggacgcggt tccagatgtt 10320
gcgcagcggc aggaagtagt tcatggtggg cacggtctgg cccgtgaggc gcgcgcagtc 10380
gtggatgctc tatacgggca aaaacgaaag cggtcagcgg ctcgactccg tggcctggag 10440
gctaagcgaa cgggttgggc tgcgcgtgta ccccggttcg aatctcgaat caggctggag 10500
ccgcagctaa cgtggtattg gcactcccgt ctcgacccaa gcctgcacca accctccagg 10560
atacggaggc gggtcgtttt gcaacttttt tttggaggcc ggatgagact agtaagcgcg 10620
gaaagcggcc gaccgcgatg gctcgctgcc gtagtctgga gaagaatcgc cagggttgcg 10680
ttgcggtgtg ccccggttcg aggccggccg gattccgcgg ctaacgaggg cgtggctgcc 10740
ccgtcgtttc caagacccca tagccagccg acttctccag ttacggagcg agcccctctt 10800
ttgttttgtt tgtttttgcc agatgcatcc cgtactgcgg cagatgcgcc cccaccaccc 10860
tccaccgcaa caacagcccc ctccacagcc ggcgcttctg cccccgcccc agcagcaact 10920
tccagccacg accgccgcgg ccgccgtgag cggggctgga cagagttatg atcaccagct 10980
ggccttggaa gagggcgagg ggctggcgcg cctgggggcg tcgtcgccgg agcggcaccc 11040
gcgcgtgcag atgaaaaggg acgctcgcga ggcctacgtg cccaagcaga acctgttcag 11100
agacaggagc ggcgaggagc ccgaggagat gcgcgcggcc cggttccacg cggggcggga 11160
gctgcggcgc ggcctggacc gaaagagggt gctgagggac gaggatttcg aggcggacga 11220
gctgacgggg atcagccccg cgcgcgcgca cgtggccgcg gccaacctgg tcacggcgta 11280
cgagcagacc gtgaaggagg agagcaactt ccaaaaatcc ttcaacaacc acgtgcgcac 11340
cctgatcgcg cgcgaggagg tgaccctggg cctgatgcac ctgtgggacc tgctggaggc 11400
catcgtgcag aaccccacca gcaagccgct gacggcgcag ctgttcctgg tggtgcagca 11460
tagtcgggac aacgaagcgt tcagggaggc gctgctgaat atcaccgagc ccgagggccg 11520
ctggctcctg gacctggtga acattctgca gagcatcgtg gtgcaggagc gcgggctgcc 11580
gctgtccgag aagctggcgg ccatcaactt ctcggtgctg agtttgggca agtactacgc 11640
taggaagatc tacaagaccc cgtacgtgcc catagacaag gaggtgaaga tcgacgggtt 11700
ttacatgcgc atgaccctga aagtgctgac cctgagcgac gatctggggg tgtaccgcaa 11760
cgacaggatg caccgtgcgg tgagcgccag caggcggcgc gagctgagcg accaggagct 11820
gatgcatagt ctgcagcggg ccctgaccgg ggccgggacc gagggggaga gctactttga 11880
catgggcgcg gacctgcact ggcagcccag ccgccgggcc ttggaggcgg cggcaggacc 11940
ctacgtagaa gaggtggacg atgaggtgga cgaggagggc gagtacctgg aagactgatg 12000
gcgcgaccgt atttttgcta gatgcaacaa caacagccac ctcctgatcc cgcgatgcgg 12060
gcggcgctgc agagccagcc gtccggcatt aactcctcgg acgattggac ccaggccatg 12120
caacgcatca tggcgctgac gacccgcaac cccgaagcct ttagacagca gccccaggcc 12180
aaccggctct cggccatcct ggaggccgtg gtgccctcgc gctccaaccc cacgcacgag 12240
aaggtcctgg ccatcgtgaa cgcgctggtg gagaacaagg ccatccgcgg cgacgaggcc 12300
ggcctggtgt acaacgcgct gctggagcgc gtggcccgct acaacagcac caacgtgcag 12360
accaacctgg accgcatggt gaccgacgtg cgcgaggccg tggcccagcg cgagcggttc 12420
caccgcgagt ccaacctggg atccatggtg gcgctgaacg ccttcctcag cacccagccc 12480
gccaacgtgc cccggggcca ggaggactac accaacttca tcagcgccct gcgcctgatg 12540
gtgaccgagg tgccccagag cgaggtgtac cagtccgggc cggactactt cttccagacc 12600
agtcgccagg gcttgcagac cgtgaacctg agccaggctt tcaagaactt gcagggcctg 12660
tggggcgtgc aggccccggt cggggaccgc gcgacggtgt cgagcctgct gacgccgaac 12720
tcgcgcctgc tgctgctgct ggtggccccc ttcacggaca gcggcagcat caaccgcaac 12780
tcgtacctgg gctacctgat taacctgtac cgcgaggcca tcggccaggc gcacgtggac 12840
gagcagacct accaggagat cacccacgtg agccgcgccc tgggccagga cgacccgggc 12900
aacctggaag ccaccctgaa ctttttgctg accaaccggt cgcagaagat cccgccccag 12960
tacgcgctca gcaccgagga ggagcgcatc ctgcgttacg tgcagcagag cgtgggcctg 13020
ttcctgatgc aggagggggc cacccccagc gccgcgctcg acatgaccgc gcgcaacatg 13080
gagcccagca tgtacgccag caaccgcccg ttcatcaata aactgatgga ctacttgcat 13140
cgggcggccg ccatgaactc tgactatttc accaacgcca tcctgaatcc ccactggctc 13200
ccgccgccgg ggttctacac gggcgagtac gacatgcccg accccaatga cgggttcctg 13260
tgggacgatg tggacagcag cgtgttctcc ccccgaccgg gtgctaacga gcgccccttg 13320
tggaagaagg aaggcagcga ccgacgcccg tcctcggcgc tgtccggccg cgagggtgct 13380
gccgcggcgg tgcccgaggc cgccagtcct ttcccgagct tgcccttctc gctgaacagt 13440
atccgcagca gcgagctggg caggatcacg cgcccgcgct tgctgggcga agaggagtac 13500
ttgaatgact cgctgttgag acccgagcgg gagaagaact tccccaataa cgggatagaa 13560
agcctggtgg acaagatgag ccgctggaag acgtatgcgc aggagcacag ggacgatccc 13620
cgggcgtcgc agggggccac gagccggggc agcgccgccc gtaaacgccg gtggcacgac 13680
aggcagcggg gacagatgtg ggacgatgag gactccgccg acgacagcag cgtgttggac 13740
ttgggtggga gtggtaaccc gttcgctcac ctgcgccccc gtatcgggcg catgatgtaa 13800
gagaaaccga aaataaatga tactcaccaa ggccatggcg accagcgtgc gttcgtttct 13860
tctctgttgt tgttgtatct agtatgatga ggcgtgcgta cccggagggt cctcctccct 13920
cgtacgagag cgtgatgcag caggcgatgg cggcggcggc gatgcagccc ccgctggagg 13980
ctccttacgt gcccccgcgg tacctggcgc ctacggaggg gcggaacagc attcgttact 14040
cggagctggc acccttgtac gataccaccc ggttgtacct ggtggacaac aagtcggcgg 14100
acatcgcctc gctgaactac cagaacgacc acagcaactt cctgaccacc gtggtgcaga 14160
acaatgactt cacccccacg gaggccagca cccagaccat caactttgac gagcgctcgc 14220
ggtggggcgg ccagctgaaa accatcatgc acaccaacat gcccaacgtg aacgagttca 14280
tgtacagcaa caagttcaag gcgcgggtga tggtctcccg caagaccccc aatggggtga 14340
cagtgacaga ggattatgat ggtagtcagg atgagctgaa gtatgaatgg gtggaatttg 14400
agctgcccga aggcaacttc tcggtgacca tgaccatcga cctgatgaac aacgccatca 14460
tcgacaatta cttggcggtg gggcggcaga acggggtgct ggagagcgac atcggcgtga 14520
agttcgacac taggaacttc aggctgggct gggaccccgt gaccgagctg gtcatgcccg 14580
gggtgtacac caacgaggct ttccatcccg atattgtctt gctgcccggc tgcggggtgg 14640
acttcaccga gagccgcctc agcaacctgc tgggcattcg caagaggcag cccttccagg 14700
aaggcttcca gatcatgtac gaggatctgg aggggggcaa catccccgcg ctcctggatg 14760
tcgacgccta tgagaaaagc aaggaggatg cagcagctga agcaactgca gccgtagcta 14820
ccgcctctac cgaggtcagg ggcgataatt ttgcaagcgc cgcagcagtg gcagcggccg 14880
aggcggctga aaccgaaagt aagatagtca ttcagccggt ggagaaggat agcaagaaca 14940
ggagctacaa cgtactaccg gacaagataa acaccgccta ccgcagctgg tacctagcct 15000
acaactatgg cgaccccgag aagggcgtgc gctcctggac gctgctcacc acctcggacg 15060
tcacctgcgg cgtggagcaa gtctactggt cgctgcccga catgatgcaa gacccggtca 15120
ccttccgctc cacgcgtcaa gttagcaact acccggtggt gggcgccgag ctcctgcccg 15180
tctactccaa gagcttcttc aacgagcagg ccgtctactc gcagcagctg cgcgccttca 15240
cctcgcttac gcacgtcttc aaccgcttcc ccgagaacca gatcctcgtc cgcccgcccg 15300
cgcccaccat taccaccgtc agtgaaaacg ttcctgctct cacagatcac gggaccctgc 15360
cgctgcgcag cagtatccgg ggagtccagc gcgtgaccgt tactgacgcc agacgccgca 15420
cctgccccta cgtctacaag gccctgggca tagtcgcgcc gcgcgtcctc tcgagccgca 15480
ccttctaaat gtccattctc atctcgccca gtaataacac cggttggggc ctgcgcgcgc 15540
ccagcaagat gtacggaggc gctcgccaac gctccacgca acaccccgtg cgcgtgcgcg 15600
ggcacttccg cgctccctgg ggcgccctca agggccgcgt gcggtcgcgc accaccgtcg 15660
acgacgtgat cgaccaggtg gtggccgacg cgcgcaacta cacccccgcc gccgcgcccg 15720
tctccaccgt ggacgccgtc atcgacagcg tggtggccga cgcgcgccgg tacgcccgcg 15780
ccaagagccg gcggcggcgc atcgcccggc ggcaccggag cacccccgcc atgcgcgcgg 15840
cgcgagcctt gctgcgcagg gccaggcgca cgggacgcag ggccatgctc agggcggcca 15900
gacgcgcggc ttcaggcgcc agcgccggca ggacccggag acgcgcggcc acggcggcgg 15960
cagcggccat cgccagcatg tcccgcccgc ggcgagggaa cgtgtactgg gtgcgcgacg 16020
ccgccaccgg tgtgcgcgtg cccgtgcgca cccgcccccc tcgcacttga agatgttcac 16080
ttcgcgatgt tgatgtgtcc cagcggcgag gaggatgtcc aagcgcaaat tcaaggaaga 16140
gatgctccag gtcatcgcgc ctgagatcta cggccctgcg gtggtgaagg aggaaagaaa 16200
gccccgcaaa atcaagcggg tcaaaaagga caaaaaggaa gaagaaagtg atgtggacgg 16260
attggtggag tttgtgcgcg agttcgcccc ccggcggcgc gtgcagtggc gcgggcggaa 16320
ggtgcaaccg gtgctgagac ccggcaccac cgtggtcttc acgcccggcg agcgctccgg 16380
caccgcttcc aagcgctcct acgacgaggt gtacggggat gatgatattc tggagcaggc 16440
ggccgagcgc ctgggcgagt ttgcttacgg caagcgcagc cgttccgcac cgaaggaaga 16500
ggcggtgtcc atcccgctgg accacggcaa ccccacgccg agcctcaagc ccgtgacctt 16560
gcagcaggtg ctgccgaccg cggcgccgcg ccgggggttc aagcgcgagg gcgaggatct 16620
gtaccccacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag ctggaagacg tgctggagac 16680
catgaaggtg gacccggacg tgcagcccga ggtcaaggtg cggcccatca agcaggtggc 16740
cccgggcctg ggcgtgcaga ccgtggacat caagattccc acggagccca tggaaacgca 16800
gaccgagccc atgatcaagc ccagcaccag caccatggag gtgcagacgg atccctggat 16860
gccatcggct cctagtcgaa gaccccggcg caagtacggc gcggccagcc tgctgatgcc 16920
caactacgcg ctgcatcctt ccatcatccc cacgccgggc taccgcggca cgcgcttcta 16980
ccgcggtcat accagcagcc gccgccgcaa gaccaccact cgccgccgcc gtcgccgcac 17040
cgccgctgca accacccctg ccgccctggt gcggagagtg taccgccgcg gccgcgcacc 17100
tctgaccctg ccgcgcgcgc gctaccaccc gagcatcgcc atttaaactt tcgcctgctt 17160
tgcagatcaa tggccctcac atgccgcctt cgcgttccca ttacgggcta ccgaggaaga 17220
aaaccgcgcc gtagaaggct ggcggggaac gggatgcgtc gccaccacca ccggcggcgg 17280
cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc 17340
gcggcgatcg gggcgatccc cggcattgct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac 17400
tgagacacac ttggaaacat cttgtaataa accaatggac tctgacgctc ctggtcctgt 17460
gatgtgtttt cgtagacaga tggaagacat caatttttcg tccctggctc cgcgacacgg 17520
cacgcggccg ttcatgggca cctggagcga catcggcacc agccaactga acgggggcgc 17580
cttcaattgg agcagtctct ggagcgggct taagaatttc gggtccacgc ttaaaaccta 17640
tggcagcaag gcgtggaaca gcaccacagg gcaggcgctg agggataagc tgaaagagca 17700
gaacttccag cagaaggtgg tcgatgggct cgcctcgggc atcaacgggg tggtggacct 17760
ggccaaccag gccgtgcagc ggcagatcaa cagccgcctg gacccggtgc cgcccgccgg 17820
ctccgtggag atgccgcagg tggaggagga gctgcctccc ctggacaagc ggggcgagaa 17880
gcgaccccgc cccgatgcgg aggagacgct gctgacgcac acggacgagc cgcccccgta 17940
cgaggaggcg gtgaaactgg gtctgcccac cacgcggccc atcgcgcccc tggccaccgg 18000
ggtgctgaaa cccgaaaagc ccgcgaccct ggacttgcct cctccccagc cttcccgccc 18060
ctctacagtg gctaagcccc tgccgccggt ggccgtggcc cgcgcgcgac ccgggggcac 18120
cgcccgccct catgcgaact ggcagagcac tctgaacagc atcgtgggtc tgggagtgca 18180
gagtgtgaag cgccgccgct gctattaaac ctaccgtagc gcttaacttg cttgtctgtg 18240
tgtgtatgta ttatgtcgcc gccgccgctg tccaccagaa ggaggagtga agaggcgcgt 18300
cgccgagttg caagatggcc accccatcga tgctgcccca gtgggcgtac atgcacatcg 18360
ccggacagga cgcttcggag tacctgagtc cgggtctggt gcagtttgcc cgcgccacag 18420
acacctactt cagtctgggg aacaagttta ggaaccccac ggtggcgccc acgcacgatg 18480
tgaccaccga ccgcagccag cggctgacgc tgcgcttcgt gcccgtggac cgcgaggaca 18540
acacctactc gtacaaagtg cgctacacgc tggccgtggg cgacaaccgc gtgctggaca 18600
tggccagcac ctactttgac atccgcggcg tgctggatcg gggccctagc ttcaaaccct 18660
actccggcac cgcctacaac agtctggccc ccaagggagc acccaacact tgtcagtgga 18720
catataaagc cgatggtgaa actgccacag aaaaaaccta tacatatgga aatgcacccg 18780
tgcagggcat taacatcaca aaagatggta ttcaacttgg aactgacacc gatgatcagc 18840
caatctacgc agataaaacc tatcagcctg aacctcaagt gggtgatgct gaatggcatg 18900
acatcactgg tactgatgaa aagtatggag gcagagctct taagcctgat accaaaatga 18960
agccttgtta tggttctttt gccaagccta ctaataaaga aggaggtcag gcaaatgtga 19020
aaacaggaac aggcactact aaagaatatg acatagacat ggctttcttt gacaacagaa 19080
gtgcggctgc tgctggccta gctccagaaa ttgttttgta tactgaaaat gtggatttgg 19140
aaactccaga tacccatatt gtatacaaag caggcacaga tgacagcagc tcttctatta 19200
atttgggtca gcaagccatg cccaacagac ctaactacat tggtttcaga gacaacttta 19260
tcgggctcat gtactacaac agcactggca atatgggggt gctggccggt caggcttctc 19320
agctgaatgc tgtggttgac ttgcaagaca gaaacaccga gctgtcctac cagctcttgc 19380
ttgactctct gggtgacaga acccggtatt tcagtatgtg gaatcaggcg gtggacagct 19440
atgatcctga tgtgcgcatt attgaaaatc atggtgtgga ggatgaactt cccaactatt 19500
gtttccctct ggatgctgtt ggcagaacag atacttatca gggaattaag gctaatggaa 19560
ctgatcaaac cacatggacc aaagatgaca gtgtcaatga tgctaatgag ataggcaagg 19620
gtaatccatt cgccatggaa atcaacatcc aagccaacct gtggaggaac ttcctctacg 19680
ccaacgtggc cctgtacctg cccgactctt acaagtacac gccggccaat gttaccctgc 19740
ccaccaacac caacacctac gattacatga acggccgggt ggtggcgccc tcgctggtgg 19800
actcctacat caacatcggg gcgcgctggt cgctggatcc catggacaac gtgaacccct 19860
tcaaccacca ccgcaatgcg gggctgcgct accgctccat gctcctgggc aacgggcgct 19920
acgtgccctt ccacatccag gtgccccaga aatttttcgc catcaagagc ctcctgctcc 19980
tgcccgggtc ctacacctac gagtggaact tccgcaagga cgtcaacatg atcctgcaga 20040
gctccctcgg caacgacctg cgcacggacg gggcctccat ctccttcacc agcatcaacc 20100
tctacgccac cttcttcccc atggcgcaca acacggcctc cacgctcgag gccatgctgc 20160
gcaacgacac caacgaccag tccttcaacg actacctctc ggcggccaac atgctctacc 20220
ccatcccggc caacgccacc aacgtgccca tctccatccc ctcgcgcaac tgggccgcct 20280
tccgcggctg gtccttcacg cgtctcaaga ccaaggagac gccctcgctg ggctccgggt 20340
tcgaccccta cttcgtctac tcgggctcca tcccctacct cgacggcacc ttctacctca 20400
accacacctt caagaaggtc tccatcacct tcgactcctc cgtcagctgg cccggcaacg 20460
accggctcct gacgcccaac gagttcgaaa tcaagcgcac cgtcgacggc gagggctaca 20520
acgtggccca gtgcaacatg accaaggact ggttcctggt ccagatgctg gcccactaca 20580
acatcggcta ccagggcttc tacgtgcccg agggctacaa ggaccgcatg tactccttct 20640
tccgcaactt ccagcccatg agccgccagg tggtggacga ggtcaactac aaggactacc 20700
aggccgtcac cctggcctac cagcacaaca actcgggctt cgtcggctac ctcgcgccca 20760
ccatgcgcca gggccagccc taccccgcca actaccccta cccgctcatc ggcaagagcg 20820
ccgtcaccag cgtcacccag aaaaagttcc tctgcgacag ggtcatgtgg cgcatcccct 20880
tctccagcaa cttcatgtcc atgggcgcgc tcaccgacct cggccagaac atgctctatg 20940
ccaactccgc ccacgcgcta gacatgaatt tcgaagtcga ccccatggat gagtccaccc 21000
ttctctatgt tgtcttcgaa gtcttcgacg tcgtccgagt gcaccagccc caccgcggcg 21060
tcatcgaggc cgtctacctg cgcaccccct tctcggccgg taacgccacc acctaagctc 21120
ttgcttcttg caagccatgg ccgcgggctc cggcgagcag gagctcaggg ccatcatccg 21180
cgacctgggc tgcgggccct acttcctggg caccttcgat aagcgcttcc cgggattcat 21240
ggccccgcac aagctggcct gcgccatcgt caacacggcc ggccgcgaga ccgggggcga 21300
gcactggctg gccttcgcct ggaacccgcg ctcgaacacc tgctacctct tcgacccctt 21360
cgggttctcg gacgagcgcc tcaagcagat ctaccagttc gagtacgagg gcctgctgcg 21420
ccgcagcgcc ctggccaccg aggaccgctg cgtcaccctg gaaaagtcca cccagaccgt 21480
gcagggtccg cgctcggccg cctgcgggct cttctgctgc atgttcctgc acgccttcgt 21540
gcactggccc gaccgcccca tggacaagaa ccccaccatg aacttgctga cgggggtgcc 21600
caacggcatg ctccagtcgc cccaggtgga acccaccctg cgccgcaacc aggaggcgct 21660
ctaccgcttc ctcaactccc actccgccta ctttcgctcc caccgcgcgc gcatcgagaa 21720
ggccaccgcc ttcgaccgca tgaatcaaga catgtaaacc gtgtgtgtat gttaaatgtc 21780
tttaataaac agcactttca tgttacacat gcatctgaga tgatttattt agaaatcgaa 21840
agggttctgc cgggtctcgg catggcccgc gggcagggac acgttgcgga actggtactt 21900
ggccagccac ttgaactcgg ggatcagcag tttgggcagc ggggtgtcgg ggaaggagtc 21960
ggtccacagc ttccgcgtca gttgcagggc gcccagcagg tcgggcgcgg agatcttgaa 22020
atcgcagttg ggacccgcgt tctgcgcgcg ggagttgcgg tacacggggt tgcagcactg 22080
gaacaccatc agggccgggt gcttcacgct cgccagcacc gtcgcgtcgg tgatgctctc 22140
cacgtcgagg tcctcggcgt tggccatccc gaagggggtc atcttgcagg tctgccttcc 22200
catggtgggc acgcacccgg gcttgtggtt gcaatcgcag tgcaggggga tcagcatcat 22260
ctgggcctgg tcggcgttca tccccgggta catggccttc atgaaagcct ccaattgcct 22320
gaacgcctgc tgggccttgg ctccctcggt gaagaagacc ccgcaggact tgctagagaa 22380
ctggttggtg gcgcacccgg cgtcgtgcac gcagcagcgc gcgtcgttgt tggccagctg 22440
caccacgctg cgcccccagc ggttctgggt gatcttggcc cggtcggggt tctccttcag 22500
cgcgcgctgc ccgttctcgc tcgccacatc catctcgatc atgtgctcct tctggatcat 22560
ggtggtcccg tgcaggcacc gcagcttgcc ctcggcctcg gtgcacccgt gcagccacag 22620
cgcgcacccg gtgcactccc agttcttgtg ggcgatctgg gaatgcgcgt gcacgaagcc 22680
ctgcaggaag cggcccatca tggtggtcag ggtcttgttg ctagtgaagg tcagcggaat 22740
gccgcggtgc tcctcgttga tgtacaggtg gcagatgcgg cggtacacct cgccctgctc 22800
gggcatcagc tggaagttgg ctttcaggtc ggtctccacg cggtagcggt ccatcagcat 22860
agtcatgatt tccataccct tctcccaggc cgagacgatg ggcaggctca tagggttctt 22920
caccatcatc ttagcgctag cagccgcggc cagggggtcg ctctcgtcca gggtctcaaa 22980
gctccgcttg ccgtccttct cggtgatccg caccgggggg tagctgaagc ccacggccgc 23040
cagctcctcc tcggcctgtc tttcgtcctc gctgtcctgg ctgacgtcct gcaggaccac 23100
atgcttggtc ttgcggggtt tcttcttggg cggcagcggc ggcggagatg ttggagatgg 23160
cgagggggag cgcgagttct cgctcaccac tactatctct tcctcttctt ggtccgaggc 23220
cacgcggcgg taggtatgtc tcttcggggg cagaggcgga ggcgacgggc tctcgccgcc 23280
gcgacttggc ggatggctgg cagagcccct tccgcgttcg ggggtgcgct cccggcggcg 23340
ctctgactga cttcctccgc ggccggccat tgtgttctcc tagggaggaa caacaagcat 23400
ggagactcag ccatcgccaa cctcgccatc tgcccccacc gccgacgaga agcagcagca 23460
gcagaatgaa agcttaaccg ccccgccgcc cagccccgcc acctccgacg cggccgtccc 23520
agacatgcaa gagatggagg aatccatcga gattgacctg ggctatgtga cgcccgcgga 23580
gcacgaggag gagctggcag tgcgcttttc acaagaagag atacaccaag aacagccaga 23640
gcaggaagca gagaatgagc agagtcaggc tgggctcgag catgacggcg actacctcca 23700
cctgagcggg ggggaggacg cgctcatcaa gcatctggcc cggcaggcca ccatcgtcaa 23760
ggatgcgctg ctcgaccgca ccgaggtgcc cctcagcgtg gaggagctca gccgcgccta 23820
cgagttgaac ctcttctcgc cgcgcgtgcc ccccaagcgc cagcccaatg gcacctgcga 23880
gcccaacccg cgcctcaact tctacccggt cttcgcggtg cccgaggccc tggccaccta 23940
ccacatcttt ttcaagaacc aaaagatccc cgtctcctgc cgcgccaacc gcacccgcgc 24000
cgacgccctt ttcaacctgg gtcccggcgc ccgcctacct gatatcgcct ccttggaaga 24060
ggttcccaag atcttcgagg gtctgggcag cgacgagact cgggccgcga acgctctgca 24120
aggagaagga ggagagcatg agcaccacag cgccctggtc gagttggaag gcgacaacgc 24180
gcggctggcg gtgctcaaac gcacggtcga gctgacccat ttcgcctacc cggctctgaa 24240
cctgcccccc aaagtcatga gcgcggtcat ggaccaggtg ctcatcaagc gcgcgtcgcc 24300
catctccgag gacgagggca tgcaagactc cgaggagggc aagcccgtgg tcagcgacga 24360
gcagctggcc cggtggctgg gtcctaatgc tagtccccag agtttggaag agcggcgcaa 24420
actcatgatg gccgtggtcc tggtgaccgt ggagctggag tgcctgcgcc gcttcttcgc 24480
cgacgcggag accctgcgca aggtcgagga gaacctgcac tacctcttca ggcacgggtt 24540
cgtgcgccag gcctgcaaga tctccaacgt ggagctgacc aacctggtct cctacatggg 24600
catcttgcac gagaaccgcc tggggcagaa cgtgctgcac accaccctgc gcggggaggc 24660
ccggcgcgac tacatccgcg actgcgtcta cctctacctc tgccacacct ggcagacggg 24720
catgggcgtg tggcagcagt gtctggagga gcagaacctg aaagagctct gcaagctcct 24780
gcagaagaac ctcaagggtc tgtggaccgg gttcgacgag cgcaccaccg cctcggacct 24840
ggccgacctc attttccccg agcgcctcag gctgacgctg cgcaacggcc tgcccgactt 24900
tatgagccaa agcatgttgc aaaactttcg ctctttcatc ctcgaacgct ccggaatcct 24960
gcccgccacc tgctccgcgc tgccctcgga cttcgtgccg ctgaccttcc gcgagtgccc 25020
cccgccgctg tggagccact gctacctgct gcgcctggcc aactacctgg cctaccactc 25080
ggacgtgatc gaggacgtca gcggcgaggg cctgctcgag tgccactgcc gctgcaacct 25140
ctgcacgccg caccgctccc tggcctgcaa cccccagctg ctgagcgaga cccagatcat 25200
cggcaccttc gagttgcaag ggcccagcga aggcgagggt tcagccgcca aggggggtct 25260
gaaactcacc ccggggctgt ggacctcggc ctacttgcgc aagttcgtgc ccgaggacta 25320
ccatcccttc gagatcaggt tctacgagga ccaatcccat ccgcccaagg ccgagctgtc 25380
ggcctgcgtc atcacccagg gggcgatcct ggcccaattg caagccatcc agaaatcccg 25440
ccaagaattc ttgctgaaaa agggccgcgg ggtctacctc gacccccaga ccggtgagga 25500
gctcaacccc ggcttccccc aggatgcccc gaggaaacaa gaagctgaaa gtggagctgc 25560
cgcccgtgga ggatttggag gaagactggg agaacagcag tcaggcagag gaggaggaga 25620
tggaggaaga ctgggacagc actcaggcag aggaggacag cctgcaagac agtctggagg 25680
aagacgagga ggaggcagag gaggaggtgg aagaagcagc cgccgccaga ccgtcgtcct 25740
cggcggggga gaaagcaagc agcacggata ccatctccgc tccgggtcgg ggtcccgctc 25800
gaccacacag tagatgggac gagaccggac gattcccgaa ccccaccacc cagaccggta 25860
agaaggagcg gcagggatac aagtcctggc gggggcacaa aaacgccatc gtctcctgct 25920
tgcaggcctg cgggggcaac atctccttca cccggcgcta cctgctcttc caccgcgggg 25980
tgaactttcc ccgcaacatc ttgcattact accgtcacct ccacagcccc tactacttcc 26040
aagaagaggc agcagcagca gaaaaagacc agcagaaaac cagcagctag aaaatccaca 26100
gcggcggcag caggtggact gaggatcgcg gcgaacgagc cggcgcaaac ccgggagctg 26160
aggaaccgga tctttcccac cctctatgcc atcttccagc agagtcgggg gcaggagcag 26220
gaactgaaag tcaagaaccg ttctctgcgc tcgctcaccc gcagttgtct gtatcacaag 26280
agcgaagacc aacttcagcg cactctcgag gacgccgagg ctctcttcaa caagtactgc 26340
gcgctcactc ttaaagagta gcccgcgccc gcccagtcgc agaaaaaggc gggaattacg 26400
tcacctgtgc ccttcgccct agccgcctcc acccatcatc atgagcaaag agattcccac 26460
gccttacatg tggagctacc agccccagat gggcctggcc gccggtgccg cccaggacta 26520
ctccacccgc atgaattggc tcagcgccgg gcccgcgatg atctcacggg tgaatgacat 26580
ccgcgcccac cgaaaccaga tactcctaga acagtcagcg ctcaccgcca cgccccgcaa 26640
tcacctcaat ccgcgtaatt ggcccgccgc cctggtgtac caggaaattc cccagcccac 26700
gaccgtacta cttccgcgag acgcccaggc cgaagtccag ctgactaact caggtgtcca 26760
gctggcgggc ggcgccaccc tgtgtcgtca ccgccccgct cagggtataa agcggctggt 26820
gatccggggc agaggcacac agctcaacga cgaggtggtg agctcttcgc tgggtctgcg 26880
acctgacgga gtcttccaac tcgccggatc ggggagatct tccttcacgc ctcgtcaggc 26940
cgtcctgact ttggagagtt cgtcctcgca gccccgctcg ggtggcatcg gcactctcca 27000
gttcgtggag gagttcactc cctcggtcta cttcaacccc ttctccggct cccccggcca 27060
ctacccggac gagttcatcc cgaacttcga cgccatcagc gagtcggtgg acggctacga 27120
ttgaatgtcc catggtggcg cagctgacct agctcggctt cgacacctgg accactgccg 27180
ccgcttccgc tgcttcgctc gggatctcgc cgagtttgcc tactttgagc tgcccgagga 27240
gcaccctcag ggcccggccc acggagtgcg gatcgtcgtc gaagggggcc tcgactccca 27300
cctgcttcgg atcttcagcc agcgtccgat cctggtcgag cgcgagcaag gacagaccct 27360
tctgactctg tactgcatct gcaaccaccc cggcctgcat gaaagtcttt gttgtctgct 27420
gtgtactgag tataataaaa gctgagatca gcgactactc cggacttccg tgtgttcctg 27480
aatccatcaa ccagtctttg ttcttcaccg ggaacgagac cgagctccag ctccagtgta 27540
agccccacaa gaagtacctc acctggctgt tccagggctc cccgatcgcc gttgtcaacc 27600
actgcgacaa cgacggagtc ctgctgagcg gccctgccaa ccttactttt tccacccgca 27660
gaagcaagct ccagctcttc caacccttcc tccccgggac ctatcagtgc gtctcgggac 27720
cctgccatca caccttccac ctgatcccga ataccacagc gtcgctcccc gctactaaca 27780
accaaactaa cctccaccaa cgccaccgtc gcgacctttc tgaatctaat actaccaccc 27840
acaccggagg tgagctccga ggtcaaccaa cctctgggat ttactacggc ccctgggagg 27900
tggttgggtt aatagcgcta ggcctagttg cgggtgggct tttggttctc tgctacctat 27960
acctcccttg ctgttcgtac ttagtggtgc tgtgttgctg gtttaagaaa tggggaagat 28020
caccctagtg agctgcggtg cgctggtggc ggtgttgctt tcgattgtgg gactgggcgg 28080
tgcggctgta gtgaaggaga aggccgatcc ctgcttgcat ttcaatccca acaaatgcca 28140
gctgagtttt cagcccgatg gcaatcggtg cgcggtactg atcaagtgcg gatgggaatg 28200
cgagaacgtg agaatcgagt acaataacaa gactcggaac aatactctcg cgtccgtgtg 28260
gcagcccggg gaccccgagt ggtacaccgt ctctgtcccc ggtgctgacg gctccccgcg 28320
caccgtgaat aatactttca tttttgcgca catgtgcgac acggtcatgt ggatgagcaa 28380
gcagtacgat atgtggcccc ccacgaagga gaacatcgtg gtcttctcca tcgcttacag 28440
cctgtgcacg gcgctaatca ccgctatcgt gtgcctgagc attcacatgc tcatcgctat 28500
tcgccccaga aataatgccg aaaaagaaaa acagccataa cgtttttttt cacacctttt 28560
tcagaccatg gcctctgtta aatttttgct tttatttgcc agtctcattg ccgtcattca 28620
tggaatgagt aatgagaaaa ttactattta cactggcact aatcacacat tgaaaggtcc 28680
agaaaaagcc acagaagttt catggtattg ttattttaat gaatcagatg tatctactga 28740
actctgtgga aacaataaca aaaaaaatga gagcattact ctcatcaagt ttcaatgtgg 28800
atctgactta accctaatta acatcactag agactatgta ggtatgtatt atggaactac 28860
agcaggcatt tcggacatgg aattttatca agtttctgtg tctgaaccca ccacgcctag 28920
aatgaccaca accacaaaaa ctacacctgt taccactatg cagctcacta ccaataacat 28980
ttttgccatg cgtcaaatgg tcaacaatag cactcaaccc accccaccca gtgaggaaat 29040
tcccaaatcc atgattggca ttattgttgc tgtagtggtg tgcatgttga tcatcgcctt 29100
gtgcatggtg tactatgcct tctgctacag aaagcacaga ctgaacgaca agctggaaca 29160
cttactaagt gttgaatttt aattttttag aaccatgaag atcctaggcc ttttaatttt 29220
ttctatcatt acctctgctc tatgcaattc tgacaatgag gacgttactg tcgttgtcgg 29280
atcaaattat acactgaaag gtccagcgaa gggtatgctt tcgtggtatt gctattttgg 29340
atctgacact acagaaactg aattatgcaa tcttaagaat ggcaaaattc aaaattctaa 29400
aattaacaat tatatatgca atggtactga tctgatactc ctcaatatca cgaaatcata 29460
tgctggcagt tacacctgcc ctggagatga tgctgacagt atgatttttt acaaagtaac 29520
tgttgttgat cccactactc cacctccacc caccacaact actcacacca cacacacaga 29580
tcaaaccgca gcagaggagg cagcaaagtt agccttgcag gtccaagaca gttcatttgt 29640
tggcattacc cctacacctg atcagcggtg tccggggctg ctagtcagcg gcattgtcgg 29700
tgtgctttcg ggattagcag tcataatcat ctgcatgttc atttttgctt gctgctatag 29760
aaggctttac cgacaaaaat cagacccact gctgaacctc tatgtttaat tttttccaga 29820
gtcatgaagg cagttagcgc tctagttttt tgttctttga ttggcattgt tttttgcaat 29880
cctattccta aagttagctt tattaaagat gtgaatgtta ctgagggggg caatgtgaca 29940
ctggtaggtg tagagggtgc tgaaaacacc acctggacaa aataccacct caatgggtgg 30000
aaagatattt gcaattggag tgtattagtt tatacatgtg agggagttaa tcttaccatt 30060
gtcaatgcca cctcagctca aaatggtaga attcaaggac aaagtgtcag tgtatctaat 30120
gggtatttta cccaacatac ttttatctat gacgttaaag tcataccact gcctacgcct 30180
agcccaccta gcactaccac acagacaacc cacactacac agacaaccac atacagtaca 30240
ttaaatcagc ctaccaccac tacagcagca gaggttgcca gctcgtctgg ggtccgagtg 30300
gcatttttga tgttggcccc atctagcagt cccactgcta gtaccaatga gcagactact 30360
gaatttttgt ccactgtcga gagccacacc acagctacct ccagtgcctt ctctagcacc 30420
gccaatctct cctcgctttc ctctacacca atcagtcccg ctactactcc tagccccgct 30480
cctcttccca ctcccctgaa gcaaacagac ggcggcatgc aatggcagat caccctgctc 30540
attgtgatcg ggttggtcat cctggccgtg ttgctctact acatcttctg ccgccgcatt 30600
cccaacgcgc accgcaagcc ggtctacaag cccatcattg tcgggcagcc ggagccgctt 30660
caggtggaag ggggtctaag gaatcttctc ttctctttta cagtatggtg attgaactat 30720
gattcctaga caattcttga tcactattct tatctgcctc ctccaagtct gtgccaccct 30780
cgctctggtg gccaacgcca gtccagactg tattgggccc ttcgcctcct acgtgctctt 30840
tgccttcacc acctgcatct gctgctgtag catagtctgc ctgcttatca ccttcttcca 30900
gttcattgac tggatctttg tgcgcatcgc ctacctgcgc caccaccccc agtaccgcga 30960
ccagcgagtg gcgcggctgc tcaggctcct ctgataagca tgcgggctct gctacttctc 31020
gcgcttctgc tgttagtgct cccccgtccc gtcgaccccc ggtcccccac ccagtccccc 31080
gaggaggtcc gcaaatgcaa attccaagaa ccctggaaat tcctcaaatg ctaccgccaa 31140
aaatcagaca tgcatcccag ctggatcatg atcattggga tcgtgaacat tctggcctgc 31200
accctcatct cctttgtgat ttacccctgc tttgactttg gttggaactc gccagaggcg 31260
ctctatctcc cgcctgaacc tgacacacca ccacagcaac ctcaggcaca cgcactacca 31320
ccactacagc ctaggccaca atacatgccc atattagact atgaggccga gccacagcga 31380
cccatgctcc ccgctattag ttacttcaat ctaaccggcg gagatgactg acccactggc 31440
caacaacaac gtcaacgacc ttctcctgga catggacggc cgcgcctcgg agcagcgact 31500
cgcccaactt cgcattcgcc agcagcagga gagagccgtc aaggagctgc aggatgcggt 31560
ggccatccac cagtgcaaga gaggcatctt ctgcctggtg aaacaggcca agatctccta 31620
cgaggtcact ccaaacgacc atcgcctctc ctacgagctc ctgcagcagc gccagaagtt 31680
cacctgcctg gtcggagtca accccatcgt catcacccag cagtctggcg ataccaaggg 31740
gtgcatccac tgctcctgcg actcccccga ctgcgtccac actctgatca agaccctctg 31800
cggcctccgc gacctcctcc ccatgaacta atcaccccct tatccagtga aataaagatc 31860
atattgatga tgattttaca gaaataaaaa ataatcattt gatttgaaat aaagatacaa 31920
tcatattgat gatttgagtt taacaaaaaa ataaagaatc acttacttga aatctgatac 31980
caggtctctg tccatgtttt ctgccaacac cacttcactc ccctcttccc agctctggta 32040
ctgcaggccc cggcgggctg caaacttcct ccacacgctg aaggggatgt caaattcctc 32100
ctgtccctca atcttcattt tatcttctat cagatgtcca aaaagcgcgt ccgggtggat 32160
gatgacttcg accccgtcta cccctacgat gcagacaacg caccgaccgt gcccttcatc 32220
aaccccccct tcgtctcttc agatggattc caagagaagc ccctgggggt gttgtccctg 32280
cgactggccg accccgtcac caccaagaac ggggaaatca ccctcaagct gggagagggg 32340
gtggacctcg attcctcggg aaaactcatc tccaacacgg ccaccaaggc cgccgcccct 32400
ctcagttttt ccaacaacac catttccctt aacatggatc acccctttta cactaaagat 32460
ggaaaattat ccttacaagt ttctccacca ttaaatatac tgagaacaag cattctaaac 32520
acactagctt taggttttgg atcaggttta ggactccgtg gctctgcctt ggcagtacag 32580
ttagtctctc cacttacatt tgatactgat ggaaacataa agcttacctt agacagaggt 32640
ttgcatgtta caacaggaga tgcaattgaa agcaacataa gctgggctaa aggtttaaaa 32700
tttgaagatg gagccatagc aaccaacatt ggaaatgggt tagagtttgg aagcagtagt 32760
acagaaacag gtgttgatga tgcttaccca atccaagtta aacttggatc tggccttagc 32820
tttgacagta caggagccat aatggctggt aacaaagaag acgataaact cactttgtgg 32880
acaacacctg atccatcacc aaactgtcaa atactcgcag aaaatgatgc aaaactaaca 32940
ctttgcttga ctaaatgtgg tagtcaaata ctggccactg tgtcagtctt agttgtagga 33000
agtggaaacc taaaccccat tactggcacc gtaagcagtg ctcaggtgtt tctacgtttt 33060
gatgcaaacg gtgttctttt aacagaacat tctacactaa aaaaatactg ggggtatagg 33120
cagggagata gcatagatgg cactccatat accaatgctg taggattcat gcccaattta 33180
aaagcttatc caaagtcaca aagttctact actaaaaata atatagtagg gcaagtatac 33240
atgaatggag atgtttcaaa acctatgctt ctcactataa ccctcaatgg tactgatgac 33300
agcaacagta catattcaat gtcattttca tacacctgga ctaatggaag ctatgttgga 33360
gcaacatttg gggctaactc ttataccttc tcatacatcg cccaagaatg aacactgtat 33420
cccaccctgc atgccaaccc ttcccacccc actctgtgga acaaactctg aaacacaaaa 33480
taaaataaag ttcaagtgtt ttattgattc aacagtttta caggattcga gcagttattt 33540
ttcctccacc ctcccaggac atggaataca ccaccctctc cccccgcaca gccttgaaca 33600
tctgaatgcc attggtgatg gacatgcttt tggtctccac gttccacaca gtttcagagc 33660
gagccagtct cgggtcggtc agggagatga aaccctccgg gcactcccgc atctgcacct 33720
cacagctcaa cagctgagga ttgtcctcgg tggtcgggat cacggttatc tggaagaagc 33780
agaagagcgg cggtgggaat catagtccgc gaacgggatc ggccggtggt gtcgcatcag 33840
gccccgcagc agtcgctgcc gccgccgctc cgtcaagctg ctgctcaggg ggtccgggtc 33900
cagggactcc ctcagcatga tgcccacggc cctcagcatc agtcgtctgg tgcggcgggc 33960
gcagcagcgc atgcggatct cgctcaggtc gctgcagtac gtgcaacaca gaaccaccag 34020
gttgttcaac agtccatagt tcaacacgct ccagccgaaa ctcatcgcgg gaaggatgct 34080
acccacgtgg ccgtcgtacc agatcctcag gtaaatcaag tggtgccccc tccagaacac 34140
gctgcccacg tacatgatct ccttgggcat gtggcggttc accacctccc ggtaccacat 34200
caccctctgg ttgaacatgc agccccggat gatcctgcgg aaccacaggg ccagcaccgc 34260
cccgcccgcc atgcagcgaa gagaccccgg gtcccggcaa tggcaatgga ggacccaccg 34320
ctcgtacccg tggatcatct gggagctgaa caagtctatg ttggcacagc acaggcatat 34380
gctcatgcat ctcttcagca ctctcaactc ctcgggggtc aaaaccatat cccagggcac 34440
ggggaactct tgcaggacag cgaaccccgc agaacagggc aatcctcgca cagaacttac 34500
attgtgcatg gacagggtat cgcaatcagg cagcaccggg tgatcctcca ccagagaagc 34560
gcgggtctcg gtctcctcac agcgtggtaa gggggccggc cgatacgggt gatggcggga 34620
cgcggctgat cgtgttcgcg accgtgtcat gatgcagttg ctttcggaca ttttcgtact 34680
tgctgtagca gaacctggtc cgggcgctgc acaccgatcg ccggcggcgg tctcggcgct 34740
tggaacgctc ggtgttgaaa ttgtaaaaca gccactctct cagaccgtgc agcagatcta 34800
gggcctcagg agtgatgaag atcccatcat gcctgatggc tctgatcaca tcgaccaccg 34860
tggaatgggc cagacccagc cagatgatgc aattttgttg ggtttcggtg acggcggggg 34920
agggaagaac aggaagaacc atgattaact tttaatccaa acggtctcgg agtacttcaa 34980
aatgaagatc gcggagatgg cacctctcgc ccccgctgtg ttggtggaaa ataacagcca 35040
ggtcaaaggt gatacggttc tcgagatgtt ccacggtggc ttccagcaaa gcctccacgc 35100
gcacatccag aaacaagaca atagcgaaag cgggagggtt ctctaattcc tcaatcatca 35160
tgttacactc ctgcaccatc cccagataat tttcattttt ccagccttga atgattcgaa 35220
ctagttcctg aggtaaatcc aagccagcca tgataaagag ctcgcgcaga gcgccctcca 35280
ccggcattct taagcacacc ctcataattc caagatattc tgctcctggt tcacctgcag 35340
cagattgaca agcggaatat caaaatctct gccgcgatcc ctgagctcct ccctcagcaa 35400
taactgtaag tactctttca tatcctctcc gaaattttta gccataggac caccaggaat 35460
aagattaggg caagccacag tacagataaa ccgaagtcct ccccagtgag cattgccaaa 35520
tgcaagactg ctataagcat gctggctaga cccggtgata tcttccagat aactggacag 35580
aaaatcgccc aggcaatttt taagaaaatc aacaaaagaa aaatcctcca ggtggacgtt 35640
tagagcctcg ggaacaacga tgaagtaaat gcaagcggtg cgttccagca tggttagtta 35700
gctgatctgt agaaaaaaca aaaatgaaca ttaaaccatg ctagcctggc gaacaggtgg 35760
gtaaatcgtt ctctccagca ccaggcaggc cacggggtct ccggcgcgac cctcgtaaaa 35820
attgtcgcta tgattgaaaa ccatcacaga gagacgttcc cggtggccgg cgtgaatgat 35880
tcgacaagat gaatacaccc ccggaacatt ggcgtccgcg agtgaaaaaa agcgcccgag 35940
gaagcaataa ggcactacaa tgctcagtct caagtccagc aaagcgatgc catgcggatg 36000
aagcacaaaa ttctcaggtg cgtacaaaat gtaattactc ccctcctgca caggcagcaa 36060
agcccccgat ccctccaggt acacatacaa agcctcagcg tccatagctt accgagcagc 36120
agcacacaac aggcgcaaga gtcagagaaa ggctgagctc taacctgtcc acccgctctc 36180
tgctcaatat atagcccaga tctacactga cgtaaaggcc aaagtctaaa aatacccgcc 36240
aaataatcac acacgcccag cacacgccca gaaaccggtg acacactcaa aaaaatacgc 36300
gcacttcctc aaacgcccaa aactgccgtc atttccgggt tcccacgcta cgtcatcaaa 36360
acacgacttt caaattccgt cgaccgttaa aaacgtcacc cgccccgccc ctaacggtcg 36420
cccgtctctc agccaatcag cgccccgcat ccccaaattc aaacacctca tttgcatatt 36480
aacgcgcaca aaaagtttga ggtatattat tgatgatgg 36519

<210> 11
<211> 31867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 11
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagtagg gataacaggg taatgacatt 600
gattattgac tagttgttaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 660
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 720
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 780
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 840
atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 900
atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 960
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg 1020
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 1080
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg 1140
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 1200
cctggaacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga cagcgatcgc gccaccatgg 1260
tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 1320
acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 1380
agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 1440
tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 1500
acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 1560
aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 1620
accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 1680
tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 1740
tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 1800
actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 1860
tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 1920
tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctttac aagtagtgag 1980
tttaaactcc catttaaatg tgagggttaa tgcttcgagc agacatgata agatacattg 2040
atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 2100
gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 2160
attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg ggaggttttt taaagcaagt 2220
aaaacctcta caaatgtggt aaaataacta taacggtcct aaggtagcga gtgagtagtg 2280
ttctggggcg ggggaggacc tgcatgaggg ccagaataac tgaaatctgt gcttttctgt 2340
gtgttgcagc agcatgagcg gaagcggctc ctttgaggga ggggtattca gcccttatct 2400
gacggggcgt ctcccctcct gggcgggagt gcgtcagaat gtgatgggat ccacggtgga 2460
cggccggccc gtgcagcccg cgaactcttc aaccctgacc tatgcaaccc tgagctcttc 2520
gtcgttggac gcagctgccg ccgcagctgc tgcatctgcc gccagcgccg tgcgcggaat 2580
ggccatgggc gccggctact acggcactct ggtggccaac tcgagttcca ccaataatcc 2640
cgccagcctg aacgaggaga agctgttgct gctgatggcc cagctcgagg ccttgaccca 2700
gcgcctgggc gagctgaccc agcaggtggc tcagctgcag gagcagacgc gggccgcggt 2760
tgccacggtg aaatccaaat aaaaaatgaa tcaataaata aacggagacg gttgttgatt 2820
ttaacacaga gtctgaatct ttatttgatt tttcgcgcgc ggtaggccct ggaccaccgg 2880
tctcgatcat tgagcacccg gtggatcttt tccaggaccc ggtagaggtg ggcttggatg 2940
ttgaggtaca tgggcatgag cccgtcccgg gggtggaggt agctccattg cagggcctcg 3000
tgctcggggg tggtgttgta aatcacccag tcatagcagg ggcgcagggc atggtgttgc 3060
acaatatctt tgaggaggag actgatggcc acgggcagcc ctttggtgta ggtgtttaca 3120
aatctgttga gctgggaggg atgcatgcgg ggggagatga ggtgcatctt ggcctggatc 3180
ttgagattgg cgatgttacc gcccagatcc cgcctggggt tcatgttgtg caggaccacc 3240
agcacggtgt atccggtgca cttggggaat ttatcatgca acttggaagg gaaggcgtga 3300
aagaatttgg cgacgccttt gtgcccgccc aggttttcca tgcactcatc catgatgatg 3360
gcgatgggcc cgtgggcggc ggcctgggca aagacgtttc gggggtcgga cacatcatag 3420
ttgtggtcct gggtgaggtc atcataggcc attttaatga atttggggcg gagggtgccg 3480
gactggggga caaaggtacc ctcgatcccg ggggcgtagt tcccctcaca gatctgcatc 3540
tcccaggctt tgagctcgga gggggggatc atgtccacct gcggggcgat aaagaacacg 3600
gtttccgggg cgggggagat gagctgggcc gaaagcaagt tccggagcag ctgggacttg 3660
ccgcagccgg tggggccgta gatgaccccg atgaccggct gcaggtggta gttgagggag 3720
agacagctgc cgtcctcccg gaggaggggg gccacctcgt tcatcatctc gcgcacgtgc 3780
atgttctcgc gcaccagttc cgccaggagg cgctctcccc ccagggatag gagctcctgg 3840
agcgaggcga agtttttcag cggcttgagt ccgtcggcca tgggcatttt ggagagggtt 3900
tgttgcaaga gttccaggcg gtcccagagc tcggtgatgt gctctacggc atctcgatcc 3960
agcagacctc ctcgtttcgc gggttgggac ggctgcggga gtagggcacc agacgatggg 4020
cgtccagcgc agccagggtc cggtccttcc agggtcgcag cgtccgcgtc agggtggtct 4080
ccgtcacggt gaaggggtgc gcgccgggct gggcgcttgc gagggtgcgc ttcaggctca 4140
tccggctggt cgaaaaccgc tcccgatcgg cgccctgcgc gtcggccagg tagcaattga 4200
ccatgagttc gtagttgagc gcctcggccg cgtggccttt ggcgcggagc ttacctttgg 4260
aagtctgccc gcaggcggga cagaggaggg acttgagggc gtagagcttg ggggcgagga 4320
agacggactc gggggcgtag gcgtccgcgc cgcagtgggc gcagacggtc tcgcactcca 4380
cgagccaggt gaggtcgggc tggtcggggt caaaaaccag tttcccgccg ttctttttga 4440
tgcgtttctt acctttggtc tccatgagct cgtgtccccg ctgggtgaca aagaggctgt 4500
ccgtgtcccc gtagaccgac tttatgggcc ggtcctcgag cggtgtgccg cggtcctcct 4560
cgtagaggaa ccccgcccac tccgagacga aagcccgggt ccaggccagc acgaaggagg 4620
ccacgtggga cgggtagcgg tcgttgtcca ccagcgggtc caccttttcc agggtatgca 4680
aacacatgtc cccctcgtcc acatccagga aggtgattgg cttgtaagtg taggccacgt 4740
gaccgggggt cccggccggg ggggtataaa agggtgcggg tccctgctcg tcctcactgt 4800
cttccggatc gctgtccagg agcgccagct gttggggtag gtattccctc tcgaaggcgg 4860
gcatgacctc ggcactcagg ttgtcagttt ctagaaacga ggaggatttg atattgacgg 4920
tgccggcgga gatgcctttc aagagcccct cgtccatctg gtcagaaaag acgatctttt 4980
tgttgtcgag cttggtggcg aaggagccgt agagggcgtt ggagaggagc ttggcgatgg 5040
agcgcatggt ctggtttttt tccttgtcgg cgcgctcctt ggcggcgatg ttgagctgca 5100
cgtactcgcg cgccacgcac ttccattcgg ggaagacggt ggtcagctcg tcgggcacga 5160
ttctgacctg ccagccccga ttatgcaggg tgatgaggtc cacactggtg gccacctcgc 5220
cgcgcagggg ctcattagtc cagcagaggc gtccgccctt gcgcgagcag aaggggggca 5280
gggggtccag catgacctcg tcgggggggt cggcatcgat ggtgaagatg ccgggcagga 5340
ggtcggggtc aaagtagctg atggaagtgg ccagatcgtc cagggcagct tgccattcgc 5400
gcacggccag cgcgctctcg tagggactga ggggcgtgcc ccagggcatg ggatgggtaa 5460
gcgcggaggc gtacatgccg cagatgtcgt agacgtagag gggctcctcg aggatgccga 5520
tgtaggtggg gtagcagcgc cccccgcgga tgctggcgcg cacgtagtca tacagctcgt 5580
gcgagggggc gaggagcccc gggcccaggt tggtgcgact gggcttttcg gcgcggtaga 5640
cgatctggcg gaaaatggca tgcgagttgg aggagatggt gggcctttgg aagatgttga 5700
agtgggcgtg gggcagtccg accgagtcgc ggatgaagtg ggcgtaggag tcttgcagct 5760
tggcgacgag ctcggcggtg actaggacgt ccagagcgca gtagtcgagg gtctcctgga 5820
tgatgtcata cttgagctgt cccttttgtt tccacagctc gcggttgaga aggaactctt 5880
cgcggtcctt ccagtactct tcgaggggga acccgtcctg atctgcacgg taagagccta 5940
gcatgtagaa ctggttgacg gccttgtagg cgcagcagcc cttctccacg gggagggcgt 6000
aggcctgggc ggccttgcgc agggaggtgt gcgtgagggc gaaagtgtcc ctgaccatga 6060
ccttgaggaa ctggtgcttg aagtcgatat cgtcgcagcc cccctgctcc cagagctgga 6120
agtccgtgcg cttcttgtag gcggggttgg gcaaagcgaa agtaacatcg ttgaagagga 6180
tcttgcccgc gcggggcata aagttgcgag tgatgcggaa aggttggggc acctcggccc 6240
ggttgttgat gacctgggcg gcgagcacga tctcgtcgaa gccgttgatg ttgtggccca 6300
cgatgtagag ttccacgaat cgcggacggc ccttgacgtg gggcagtttc ttgagctcct 6360
cgtaggtgag ctcgtcgggg tcgctgagcc cgtgctgctc gagcgcccag tcggcgagat 6420
gggggttggc gcggaggaag gaagtccaga gatccacggc cagggcggtt tgcagacggt 6480
cccggtactg acggaactgc tgcccgacgg ccattttttc gggggtgacg cagtagaagg 6540
tgcgggggtc cccgtgccag cgatcccatt tgagctggag ggcgagatcg agggcgagct 6600
cgacgagccg gtcgtccccg gagagtttca tgaccagcat gaaggggacg agctgcttgc 6660
cgaaggaccc catccaggtg taggtttcca catcgtaggt gaggaagagc ctttcggtgc 6720
gaggatgcga gccgatgggg aagaactgga tctcctgcca ccaattggag gaatggctgt 6780
tgatgtgatg gaagtagaaa tgccgacggc gcgccgaaca ctcgtgcttg tgtttataca 6840
agcggccaca gtgctcgcaa cgctgcacgg gatgcacgtg ctgcacgagc tgtacctgag 6900
ttcctttgac gaggaatttc agtgggaagt ggagtcgtgg cgcctgcatc tcgtgctgta 6960
ctacgtcgtg gtggtcggcc tggccctctt ctgcctcgat ggtggtcatg ctgacgagcc 7020
cgcgcgggag gcaggtccag acctcggcgc gagcgggtcg gagagcgagg acgagggcgc 7080
gcaggccgga gctgtccagg gtcctgagac gctgcggagt caggtcagtg ggcagcggcg 7140
gcgcgcggtt gacttgcagg agtttttcca gggcgcgcgg gaggtccaga tggtacttga 7200
tctccaccgc gccattggtg gcgacgtcga tggcttgcag ggtcccgtgc ccctggggtg 7260
tgaccaccgt cccccgtttc ttcttgggcg gctggggcga cgggggcggt gcctcttcca 7320
tggttagaag cggcggcgag gacgcgcgcc gggcggcagg ggcggctcgg ggcccggagg 7380
caggggcggc aggggcacgt cggcgccgcg cgcgggtagg ttctggtact gcgcccggag 7440
aagactggcg tgagcgacga cgcgacggtt gacgtcctgg atctgacgcc tctgggtgaa 7500
ggccacggga cccgtgagtt tgaacctgaa agagagttcg acagaatcaa tctcggtatc 7560
gttgacggcg gcctgccgca ggatctcttg cacgtcgccc gagttgtcct ggtaggcgat 7620
ctcggtcatg aactgctcga tctcctcctc ttgaaggtct ccgcggccgg cgcgctccac 7680
ggtggccgcg aggtcgttgg agatgcggcc catgagctgc gagaaggcgt tcatgcccgc 7740
ctcgttccag acgcggctgt agaccacgac gccctcggga tcgcgggcgc gcatgaccac 7800
ctgggcgagg ttgagctcca cgtggcgcgt gaagaccgcg tagttgcaga ggcgctggta 7860
gaggtagttg agcgtggtgg cgatgtgctc ggtgacgaag aaatacatga tccagcggcg 7920
gagcggcatc tcgctgacgt cgcccagcgc ctccaaacgt tccatggcct cgtaaaagtc 7980
cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg cgccgagacg gtcaactcct cctccagaag 8040
acggatgagc tcggcgatgg tggcgcgcac ctcgcgctcg aaggcccccg ggagttcctc 8100
cacttcctct tcttcctcct ccactaacat ctcttctact tcctcctcag gcggcagtgg 8160
tggcggggga gggggcctgc gtcgccggcg gcgcacgggc agacggtcga tgaagcgctc 8220
gatggtctcg ccgcgccggc gtcgcatggt ctcggtgacg gcgcgcccgt cctcgcgggg 8280
ccgcagcgtg aagacgccgc cgcgcatctc caggtggccg ggggggtccc cgttgggcag 8340
ggagagggcg ctgacgatgc atcttatcaa ttgccccgta gggactccgc gcaaggacct 8400
gagcgtctcg agatccacgg gatctgaaaa ccgctgaacg aaggcttcga gccagtcgca 8460
gtcgcaaggt aggctgagca cggtttcttc tggcgggtca tgttggttgg gagcggggcg 8520
ggcgatgctg ctggtgatga agttgaaata ggcggttctg agacggcgga tggtggcgag 8580
gagcaccagg tctttgggcc cggcttgctg gatgcgcaga cggtcggcca tgccccaggc 8640
gtggtcctga cacctggcca ggtccttgta gtagtcctgc atgagccgct ccacgggcac 8700
ctcctcctcg cccgcgcggc cgtgcatgcg cgtgagcccg aagccgcgct ggggctggac 8760
gagcgccagg tcggcgacga cgcgctcggc gaggatggct tgctggatct gggtgagggt 8820
ggtctggaag tcatcaaagt cgacgaagcg gtggtaggct ccggtgttga tggtgtagga 8880
gcagttggcc atgacggacc agttgacggt ctggtggccc ggacgcacga gctcgtggta 8940
cttgaggcgc gagtaggcgc gcgtgtcgaa gatgtagtcg ttgcaggtgc gcaccaggta 9000
ctggtagccg atgaggaagt gcggcggcgg ctggcggtag agcggccatc gctcggtggc 9060
gggggcgccg ggcgcgaggt cctcgagcat ggtgcggtgg tagccgtaga tgtacctgga 9120
catccaggtg atgccggcgg cggtggtgga ggcgcgcggg aactcgcgga cgcggttcca 9180
gatgttgcgc agcggcagga agtagttcat ggtgggcacg gtctggcccg tgaggcgcgc 9240
gcagtcgtgg atgctctata cgggcaaaaa cgaaagcggt cagcggctcg actccgtggc 9300
ctggaggcta agcgaacggg ttgggctgcg cgtgtacccc ggttcgaatc tcgaatcagg 9360
ctggagccgc agctaacgtg gtattggcac tcccgtctcg acccaagcct gcaccaaccc 9420
tccaggatac ggaggcgggt cgttttgcaa cttttttttg gaggccggat gagactagta 9480
agcgcggaaa gcggccgacc gcgatggctc gctgccgtag tctggagaag aatcgccagg 9540
gttgcgttgc ggtgtgcccc ggttcgaggc cggccggatt ccgcggctaa cgagggcgtg 9600
gctgccccgt cgtttccaag accccatagc cagccgactt ctccagttac ggagcgagcc 9660
cctcttttgt tttgtttgtt tttgccagat gcatcccgta ctgcggcaga tgcgccccca 9720
ccaccctcca ccgcaacaac agccccctcc acagccggcg cttctgcccc cgccccagca 9780
gcaacttcca gccacgaccg ccgcggccgc cgtgagcggg gctggacaga gttatgatca 9840
ccagctggcc ttggaagagg gcgaggggct ggcgcgcctg ggggcgtcgt cgccggagcg 9900
gcacccgcgc gtgcagatga aaagggacgc tcgcgaggcc tacgtgccca agcagaacct 9960
gttcagagac aggagcggcg aggagcccga ggagatgcgc gcggcccggt tccacgcggg 10020
gcgggagctg cggcgcggcc tggaccgaaa gagggtgctg agggacgagg atttcgaggc 10080
ggacgagctg acggggatca gccccgcgcg cgcgcacgtg gccgcggcca acctggtcac 10140
ggcgtacgag cagaccgtga aggaggagag caacttccaa aaatccttca acaaccacgt 10200
gcgcaccctg atcgcgcgcg aggaggtgac cctgggcctg atgcacctgt gggacctgct 10260
ggaggccatc gtgcagaacc ccaccagcaa gccgctgacg gcgcagctgt tcctggtggt 10320
gcagcatagt cgggacaacg aagcgttcag ggaggcgctg ctgaatatca ccgagcccga 10380
gggccgctgg ctcctggacc tggtgaacat tctgcagagc atcgtggtgc aggagcgcgg 10440
gctgccgctg tccgagaagc tggcggccat caacttctcg gtgctgagtt tgggcaagta 10500
ctacgctagg aagatctaca agaccccgta cgtgcccata gacaaggagg tgaagatcga 10560
cgggttttac atgcgcatga ccctgaaagt gctgaccctg agcgacgatc tgggggtgta 10620
ccgcaacgac aggatgcacc gtgcggtgag cgccagcagg cggcgcgagc tgagcgacca 10680
ggagctgatg catagtctgc agcgggccct gaccggggcc gggaccgagg gggagagcta 10740
ctttgacatg ggcgcggacc tgcactggca gcccagccgc cgggccttgg aggcggcggc 10800
aggaccctac gtagaagagg tggacgatga ggtggacgag gagggcgagt acctggaaga 10860
ctgatggcgc gaccgtattt ttgctagatg caacaacaac agccacctcc tgatcccgcg 10920
atgcgggcgg cgctgcagag ccagccgtcc ggcattaact cctcggacga ttggacccag 10980
gccatgcaac gcatcatggc gctgacgacc cgcaaccccg aagcctttag acagcagccc 11040
caggccaacc ggctctcggc catcctggag gccgtggtgc cctcgcgctc caaccccacg 11100
cacgagaagg tcctggccat cgtgaacgcg ctggtggaga acaaggccat ccgcggcgac 11160
gaggccggcc tggtgtacaa cgcgctgctg gagcgcgtgg cccgctacaa cagcaccaac 11220
gtgcagacca acctggaccg catggtgacc gacgtgcgcg aggccgtggc ccagcgcgag 11280
cggttccacc gcgagtccaa cctgggatcc atggtggcgc tgaacgcctt cctcagcacc 11340
cagcccgcca acgtgccccg gggccaggag gactacacca acttcatcag cgccctgcgc 11400
ctgatggtga ccgaggtgcc ccagagcgag gtgtaccagt ccgggccgga ctacttcttc 11460
cagaccagtc gccagggctt gcagaccgtg aacctgagcc aggctttcaa gaacttgcag 11520
ggcctgtggg gcgtgcaggc cccggtcggg gaccgcgcga cggtgtcgag cctgctgacg 11580
ccgaactcgc gcctgctgct gctgctggtg gcccccttca cggacagcgg cagcatcaac 11640
cgcaactcgt acctgggcta cctgattaac ctgtaccgcg aggccatcgg ccaggcgcac 11700
gtggacgagc agacctacca ggagatcacc cacgtgagcc gcgccctggg ccaggacgac 11760
ccgggcaacc tggaagccac cctgaacttt ttgctgacca accggtcgca gaagatcccg 11820
ccccagtacg cgctcagcac cgaggaggag cgcatcctgc gttacgtgca gcagagcgtg 11880
ggcctgttcc tgatgcagga gggggccacc cccagcgccg cgctcgacat gaccgcgcgc 11940
aacatggagc ccagcatgta cgccagcaac cgcccgttca tcaataaact gatggactac 12000
ttgcatcggg cggccgccat gaactctgac tatttcacca acgccatcct gaatccccac 12060
tggctcccgc cgccggggtt ctacacgggc gagtacgaca tgcccgaccc caatgacggg 12120
ttcctgtggg acgatgtgga cagcagcgtg ttctcccccc gaccgggtgc taacgagcgc 12180
cccttgtgga agaaggaagg cagcgaccga cgcccgtcct cggcgctgtc cggccgcgag 12240
ggtgctgccg cggcggtgcc cgaggccgcc agtcctttcc cgagcttgcc cttctcgctg 12300
aacagtatcc gcagcagcga gctgggcagg atcacgcgcc cgcgcttgct gggcgaagag 12360
gagtacttga atgactcgct gttgagaccc gagcgggaga agaacttccc caataacggg 12420
atagaaagcc tggtggacaa gatgagccgc tggaagacgt atgcgcagga gcacagggac 12480
gatccccggg cgtcgcaggg ggccacgagc cggggcagcg ccgcccgtaa acgccggtgg 12540
cacgacaggc agcggggaca gatgtgggac gatgaggact ccgccgacga cagcagcgtg 12600
ttggacttgg gtgggagtgg taacccgttc gctcacctgc gcccccgtat cgggcgcatg 12660
atgtaagaga aaccgaaaat aaatgatact caccaaggcc atggcgacca gcgtgcgttc 12720
gtttcttctc tgttgttgtt gtatctagta tgatgaggcg tgcgtacccg gagggtcctc 12780
ctccctcgta cgagagcgtg atgcagcagg cgatggcggc ggcggcgatg cagcccccgc 12840
tggaggctcc ttacgtgccc ccgcggtacc tggcgcctac ggaggggcgg aacagcattc 12900
gttactcgga gctggcaccc ttgtacgata ccacccggtt gtacctggtg gacaacaagt 12960
cggcggacat cgcctcgctg aactaccaga acgaccacag caacttcctg accaccgtgg 13020
tgcagaacaa tgacttcacc cccacggagg ccagcaccca gaccatcaac tttgacgagc 13080
gctcgcggtg gggcggccag ctgaaaacca tcatgcacac caacatgccc aacgtgaacg 13140
agttcatgta cagcaacaag ttcaaggcgc gggtgatggt ctcccgcaag acccccaatg 13200
gggtgacagt gacagaggat tatgatggta gtcaggatga gctgaagtat gaatgggtgg 13260
aatttgagct gcccgaaggc aacttctcgg tgaccatgac catcgacctg atgaacaacg 13320
ccatcatcga caattacttg gcggtggggc ggcagaacgg ggtgctggag agcgacatcg 13380
gcgtgaagtt cgacactagg aacttcaggc tgggctggga ccccgtgacc gagctggtca 13440
tgcccggggt gtacaccaac gaggctttcc atcccgatat tgtcttgctg cccggctgcg 13500
gggtggactt caccgagagc cgcctcagca acctgctggg cattcgcaag aggcagccct 13560
tccaggaagg cttccagatc atgtacgagg atctggaggg gggcaacatc cccgcgctcc 13620
tggatgtcga cgcctatgag aaaagcaagg aggatgcagc agctgaagca actgcagccg 13680
tagctaccgc ctctaccgag gtcaggggcg ataattttgc aagcgccgca gcagtggcag 13740
cggccgaggc ggctgaaacc gaaagtaaga tagtcattca gccggtggag aaggatagca 13800
agaacaggag ctacaacgta ctaccggaca agataaacac cgcctaccgc agctggtacc 13860
tagcctacaa ctatggcgac cccgagaagg gcgtgcgctc ctggacgctg ctcaccacct 13920
cggacgtcac ctgcggcgtg gagcaagtct actggtcgct gcccgacatg atgcaagacc 13980
cggtcacctt ccgctccacg cgtcaagtta gcaactaccc ggtggtgggc gccgagctcc 14040
tgcccgtcta ctccaagagc ttcttcaacg agcaggccgt ctactcgcag cagctgcgcg 14100
ccttcacctc gcttacgcac gtcttcaacc gcttccccga gaaccagatc ctcgtccgcc 14160
cgcccgcgcc caccattacc accgtcagtg aaaacgttcc tgctctcaca gatcacggga 14220
ccctgccgct gcgcagcagt atccggggag tccagcgcgt gaccgttact gacgccagac 14280
gccgcacctg cccctacgtc tacaaggccc tgggcatagt cgcgccgcgc gtcctctcga 14340
gccgcacctt ctaaatgtcc attctcatct cgcccagtaa taacaccggt tggggcctgc 14400
gcgcgcccag caagatgtac ggaggcgctc gccaacgctc cacgcaacac cccgtgcgcg 14460
tgcgcgggca cttccgcgct ccctggggcg ccctcaaggg ccgcgtgcgg tcgcgcacca 14520
ccgtcgacga cgtgatcgac caggtggtgg ccgacgcgcg caactacacc cccgccgccg 14580
cgcccgtctc caccgtggac gccgtcatcg acagcgtggt ggccgacgcg cgccggtacg 14640
cccgcgccaa gagccggcgg cggcgcatcg cccggcggca ccggagcacc cccgccatgc 14700
gcgcggcgcg agccttgctg cgcagggcca ggcgcacggg acgcagggcc atgctcaggg 14760
cggccagacg cgcggcttca ggcgccagcg ccggcaggac ccggagacgc gcggccacgg 14820
cggcggcagc ggccatcgcc agcatgtccc gcccgcggcg agggaacgtg tactgggtgc 14880
gcgacgccgc caccggtgtg cgcgtgcccg tgcgcacccg cccccctcgc acttgaagat 14940
gttcacttcg cgatgttgat gtgtcccagc ggcgaggagg atgtccaagc gcaaattcaa 15000
ggaagagatg ctccaggtca tcgcgcctga gatctacggc cctgcggtgg tgaaggagga 15060
aagaaagccc cgcaaaatca agcgggtcaa aaaggacaaa aaggaagaag aaagtgatgt 15120
ggacggattg gtggagtttg tgcgcgagtt cgccccccgg cggcgcgtgc agtggcgcgg 15180
gcggaaggtg caaccggtgc tgagacccgg caccaccgtg gtcttcacgc ccggcgagcg 15240
ctccggcacc gcttccaagc gctcctacga cgaggtgtac ggggatgatg atattctgga 15300
gcaggcggcc gagcgcctgg gcgagtttgc ttacggcaag cgcagccgtt ccgcaccgaa 15360
ggaagaggcg gtgtccatcc cgctggacca cggcaacccc acgccgagcc tcaagcccgt 15420
gaccttgcag caggtgctgc cgaccgcggc gccgcgccgg gggttcaagc gcgagggcga 15480
ggatctgtac cccaccatgc agctgatggt gcccaagcgc cagaagctgg aagacgtgct 15540
ggagaccatg aaggtggacc cggacgtgca gcccgaggtc aaggtgcggc ccatcaagca 15600
ggtggccccg ggcctgggcg tgcagaccgt ggacatcaag attcccacgg agcccatgga 15660
aacgcagacc gagcccatga tcaagcccag caccagcacc atggaggtgc agacggatcc 15720
ctggatgcca tcggctccta gtcgaagacc ccggcgcaag tacggcgcgg ccagcctgct 15780
gatgcccaac tacgcgctgc atccttccat catccccacg ccgggctacc gcggcacgcg 15840
cttctaccgc ggtcatacca gcagccgccg ccgcaagacc accactcgcc gccgccgtcg 15900
ccgcaccgcc gctgcaacca cccctgccgc cctggtgcgg agagtgtacc gccgcggccg 15960
cgcacctctg accctgccgc gcgcgcgcta ccacccgagc atcgccattt aaactttcgc 16020
ctgctttgca gatcaatggc cctcacatgc cgccttcgcg ttcccattac gggctaccga 16080
ggaagaaaac cgcgccgtag aaggctggcg gggaacggga tgcgtcgcca ccaccaccgg 16140
cggcggcgcg ccatcagcaa gcggttgggg ggaggcttcc tgcccgcgct gatccccatc 16200
atcgccgcgg cgatcggggc gatccccggc attgcttccg tggcggtgca ggcctctcag 16260
cgccactgag acacacttgg aaacatcttg taataaacca atggactctg acgctcctgg 16320
tcctgtgatg tgttttcgta gacagatgga agacatcaat ttttcgtccc tggctccgcg 16380
acacggcacg cggccgttca tgggcacctg gagcgacatc ggcaccagcc aactgaacgg 16440
gggcgccttc aattggagca gtctctggag cgggcttaag aatttcgggt ccacgcttaa 16500
aacctatggc agcaaggcgt ggaacagcac cacagggcag gcgctgaggg ataagctgaa 16560
agagcagaac ttccagcaga aggtggtcga tgggctcgcc tcgggcatca acggggtggt 16620
ggacctggcc aaccaggccg tgcagcggca gatcaacagc cgcctggacc cggtgccgcc 16680
cgccggctcc gtggagatgc cgcaggtgga ggaggagctg cctcccctgg acaagcgggg 16740
cgagaagcga ccccgccccg atgcggagga gacgctgctg acgcacacgg acgagccgcc 16800
cccgtacgag gaggcggtga aactgggtct gcccaccacg cggcccatcg cgcccctggc 16860
caccggggtg ctgaaacccg aaaagcccgc gaccctggac ttgcctcctc cccagccttc 16920
ccgcccctct acagtggcta agcccctgcc gccggtggcc gtggcccgcg cgcgacccgg 16980
gggcaccgcc cgccctcatg cgaactggca gagcactctg aacagcatcg tgggtctggg 17040
agtgcagagt gtgaagcgcc gccgctgcta ttaaacctac cgtagcgctt aacttgcttg 17100
tctgtgtgtg tatgtattat gtcgccgccg ccgctgtcca ccagaaggag gagtgaagag 17160
gcgcgtcgcc gagttgcaag atggccaccc catcgatgct gccccagtgg gcgtacatgc 17220
acatcgccgg acaggacgct tcggagtacc tgagtccggg tctggtgcag tttgcccgcg 17280
ccacagacac ctacttcagt ctggggaaca agtttaggaa ccccacggtg gcgcccacgc 17340
acgatgtgac caccgaccgc agccagcggc tgacgctgcg cttcgtgccc gtggaccgcg 17400
aggacaacac ctactcgtac aaagtgcgct acacgctggc cgtgggcgac aaccgcgtgc 17460
tggacatggc cagcacctac tttgacatcc gcggcgtgct ggatcggggc cctagcttca 17520
aaccctactc cggcaccgcc tacaacagtc tggcccccaa gggagcaccc aacacttgtc 17580
agtggacata taaagccgat ggtgaaactg ccacagaaaa aacctataca tatggaaatg 17640
cacccgtgca gggcattaac atcacaaaag atggtattca acttggaact gacaccgatg 17700
atcagccaat ctacgcagat aaaacctatc agcctgaacc tcaagtgggt gatgctgaat 17760
ggcatgacat cactggtact gatgaaaagt atggaggcag agctcttaag cctgatacca 17820
aaatgaagcc ttgttatggt tcttttgcca agcctactaa taaagaagga ggtcaggcaa 17880
atgtgaaaac aggaacaggc actactaaag aatatgacat agacatggct ttctttgaca 17940
acagaagtgc ggctgctgct ggcctagctc cagaaattgt tttgtatact gaaaatgtgg 18000
atttggaaac tccagatacc catattgtat acaaagcagg cacagatgac agcagctctt 18060
ctattaattt gggtcagcaa gccatgccca acagacctaa ctacattggt ttcagagaca 18120
actttatcgg gctcatgtac tacaacagca ctggcaatat gggggtgctg gccggtcagg 18180
cttctcagct gaatgctgtg gttgacttgc aagacagaaa caccgagctg tcctaccagc 18240
tcttgcttga ctctctgggt gacagaaccc ggtatttcag tatgtggaat caggcggtgg 18300
acagctatga tcctgatgtg cgcattattg aaaatcatgg tgtggaggat gaacttccca 18360
actattgttt ccctctggat gctgttggca gaacagatac ttatcaggga attaaggcta 18420
atggaactga tcaaaccaca tggaccaaag atgacagtgt caatgatgct aatgagatag 18480
gcaagggtaa tccattcgcc atggaaatca acatccaagc caacctgtgg aggaacttcc 18540
tctacgccaa cgtggccctg tacctgcccg actcttacaa gtacacgccg gccaatgtta 18600
ccctgcccac caacaccaac acctacgatt acatgaacgg ccgggtggtg gcgccctcgc 18660
tggtggactc ctacatcaac atcggggcgc gctggtcgct ggatcccatg gacaacgtga 18720
accccttcaa ccaccaccgc aatgcggggc tgcgctaccg ctccatgctc ctgggcaacg 18780
ggcgctacgt gcccttccac atccaggtgc cccagaaatt tttcgccatc aagagcctcc 18840
tgctcctgcc cgggtcctac acctacgagt ggaacttccg caaggacgtc aacatgatcc 18900
tgcagagctc cctcggcaac gacctgcgca cggacggggc ctccatctcc ttcaccagca 18960
tcaacctcta cgccaccttc ttccccatgg cgcacaacac ggcctccacg ctcgaggcca 19020
tgctgcgcaa cgacaccaac gaccagtcct tcaacgacta cctctcggcg gccaacatgc 19080
tctaccccat cccggccaac gccaccaacg tgcccatctc catcccctcg cgcaactggg 19140
ccgccttccg cggctggtcc ttcacgcgtc tcaagaccaa ggagacgccc tcgctgggct 19200
ccgggttcga cccctacttc gtctactcgg gctccatccc ctacctcgac ggcaccttct 19260
acctcaacca caccttcaag aaggtctcca tcaccttcga ctcctccgtc agctggcccg 19320
gcaacgaccg gctcctgacg cccaacgagt tcgaaatcaa gcgcaccgtc gacggcgagg 19380
gctacaacgt ggcccagtgc aacatgacca aggactggtt cctggtccag atgctggccc 19440
actacaacat cggctaccag ggcttctacg tgcccgaggg ctacaaggac cgcatgtact 19500
ccttcttccg caacttccag cccatgagcc gccaggtggt ggacgaggtc aactacaagg 19560
actaccaggc cgtcaccctg gcctaccagc acaacaactc gggcttcgtc ggctacctcg 19620
cgcccaccat gcgccagggc cagccctacc ccgccaacta cccctacccg ctcatcggca 19680
agagcgccgt caccagcgtc acccagaaaa agttcctctg cgacagggtc atgtggcgca 19740
tccccttctc cagcaacttc atgtccatgg gcgcgctcac cgacctcggc cagaacatgc 19800
tctatgccaa ctccgcccac gcgctagaca tgaatttcga agtcgacccc atggatgagt 19860
ccacccttct ctatgttgtc ttcgaagtct tcgacgtcgt ccgagtgcac cagccccacc 19920
gcggcgtcat cgaggccgtc tacctgcgca cccccttctc ggccggtaac gccaccacct 19980
aagctcttgc ttcttgcaag ccatggccgc gggctccggc gagcaggagc tcagggccat 20040
catccgcgac ctgggctgcg ggccctactt cctgggcacc ttcgataagc gcttcccggg 20100
attcatggcc ccgcacaagc tggcctgcgc catcgtcaac acggccggcc gcgagaccgg 20160
gggcgagcac tggctggcct tcgcctggaa cccgcgctcg aacacctgct acctcttcga 20220
ccccttcggg ttctcggacg agcgcctcaa gcagatctac cagttcgagt acgagggcct 20280
gctgcgccgc agcgccctgg ccaccgagga ccgctgcgtc accctggaaa agtccaccca 20340
gaccgtgcag ggtccgcgct cggccgcctg cgggctcttc tgctgcatgt tcctgcacgc 20400
cttcgtgcac tggcccgacc gccccatgga caagaacccc accatgaact tgctgacggg 20460
ggtgcccaac ggcatgctcc agtcgcccca ggtggaaccc accctgcgcc gcaaccagga 20520
ggcgctctac cgcttcctca actcccactc cgcctacttt cgctcccacc gcgcgcgcat 20580
cgagaaggcc accgccttcg accgcatgaa tcaagacatg taaaccgtgt gtgtatgtta 20640
aatgtcttta ataaacagca ctttcatgtt acacatgcat ctgagatgat ttatttagaa 20700
atcgaaaggg ttctgccggg tctcggcatg gcccgcgggc agggacacgt tgcggaactg 20760
gtacttggcc agccacttga actcggggat cagcagtttg ggcagcgggg tgtcggggaa 20820
ggagtcggtc cacagcttcc gcgtcagttg cagggcgccc agcaggtcgg gcgcggagat 20880
cttgaaatcg cagttgggac ccgcgttctg cgcgcgggag ttgcggtaca cggggttgca 20940
gcactggaac accatcaggg ccgggtgctt cacgctcgcc agcaccgtcg cgtcggtgat 21000
gctctccacg tcgaggtcct cggcgttggc catcccgaag ggggtcatct tgcaggtctg 21060
ccttcccatg gtgggcacgc acccgggctt gtggttgcaa tcgcagtgca gggggatcag 21120
catcatctgg gcctggtcgg cgttcatccc cgggtacatg gccttcatga aagcctccaa 21180
ttgcctgaac gcctgctggg ccttggctcc ctcggtgaag aagaccccgc aggacttgct 21240
agagaactgg ttggtggcgc acccggcgtc gtgcacgcag cagcgcgcgt cgttgttggc 21300
cagctgcacc acgctgcgcc cccagcggtt ctgggtgatc ttggcccggt cggggttctc 21360
cttcagcgcg cgctgcccgt tctcgctcgc cacatccatc tcgatcatgt gctccttctg 21420
gatcatggtg gtcccgtgca ggcaccgcag cttgccctcg gcctcggtgc acccgtgcag 21480
ccacagcgcg cacccggtgc actcccagtt cttgtgggcg atctgggaat gcgcgtgcac 21540
gaagccctgc aggaagcggc ccatcatggt ggtcagggtc ttgttgctag tgaaggtcag 21600
cggaatgccg cggtgctcct cgttgatgta caggtggcag atgcggcggt acacctcgcc 21660
ctgctcgggc atcagctgga agttggcttt caggtcggtc tccacgcggt agcggtccat 21720
cagcatagtc atgatttcca tacccttctc ccaggccgag acgatgggca ggctcatagg 21780
gttcttcacc atcatcttag cgctagcagc cgcggccagg gggtcgctct cgtccagggt 21840
ctcaaagctc cgcttgccgt ccttctcggt gatccgcacc ggggggtagc tgaagcccac 21900
ggccgccagc tcctcctcgg cctgtctttc gtcctcgctg tcctggctga cgtcctgcag 21960
gaccacatgc ttggtcttgc ggggtttctt cttgggcggc agcggcggcg gagatgttgg 22020
agatggcgag ggggagcgcg agttctcgct caccactact atctcttcct cttcttggtc 22080
cgaggccacg cggcggtagg tatgtctctt cgggggcaga ggcggaggcg acgggctctc 22140
gccgccgcga cttggcggat ggctggcaga gccccttccg cgttcggggg tgcgctcccg 22200
gcggcgctct gactgacttc ctccgcggcc ggccattgtg ttctcctagg gaggaacaac 22260
aagcatggag actcagccat cgccaacctc gccatctgcc cccaccgccg acgagaagca 22320
gcagcagcag aatgaaagct taaccgcccc gccgcccagc cccgccacct ccgacgcggc 22380
cgtcccagac atgcaagaga tggaggaatc catcgagatt gacctgggct atgtgacgcc 22440
cgcggagcac gaggaggagc tggcagtgcg cttttcacaa gaagagatac accaagaaca 22500
gccagagcag gaagcagaga atgagcagag tcaggctggg ctcgagcatg acggcgacta 22560
cctccacctg agcggggggg aggacgcgct catcaagcat ctggcccggc aggccaccat 22620
cgtcaaggat gcgctgctcg accgcaccga ggtgcccctc agcgtggagg agctcagccg 22680
cgcctacgag ttgaacctct tctcgccgcg cgtgcccccc aagcgccagc ccaatggcac 22740
ctgcgagccc aacccgcgcc tcaacttcta cccggtcttc gcggtgcccg aggccctggc 22800
cacctaccac atctttttca agaaccaaaa gatccccgtc tcctgccgcg ccaaccgcac 22860
ccgcgccgac gcccttttca acctgggtcc cggcgcccgc ctacctgata tcgcctcctt 22920
ggaagaggtt cccaagatct tcgagggtct gggcagcgac gagactcggg ccgcgaacgc 22980
tctgcaagga gaaggaggag agcatgagca ccacagcgcc ctggtcgagt tggaaggcga 23040
caacgcgcgg ctggcggtgc tcaaacgcac ggtcgagctg acccatttcg cctacccggc 23100
tctgaacctg ccccccaaag tcatgagcgc ggtcatggac caggtgctca tcaagcgcgc 23160
gtcgcccatc tccgaggacg agggcatgca agactccgag gagggcaagc ccgtggtcag 23220
cgacgagcag ctggcccggt ggctgggtcc taatgctagt ccccagagtt tggaagagcg 23280
gcgcaaactc atgatggccg tggtcctggt gaccgtggag ctggagtgcc tgcgccgctt 23340
cttcgccgac gcggagaccc tgcgcaaggt cgaggagaac ctgcactacc tcttcaggca 23400
cgggttcgtg cgccaggcct gcaagatctc caacgtggag ctgaccaacc tggtctccta 23460
catgggcatc ttgcacgaga accgcctggg gcagaacgtg ctgcacacca ccctgcgcgg 23520
ggaggcccgg cgcgactaca tccgcgactg cgtctacctc tacctctgcc acacctggca 23580
gacgggcatg ggcgtgtggc agcagtgtct ggaggagcag aacctgaaag agctctgcaa 23640
gctcctgcag aagaacctca agggtctgtg gaccgggttc gacgagcgca ccaccgcctc 23700
ggacctggcc gacctcattt tccccgagcg cctcaggctg acgctgcgca acggcctgcc 23760
cgactttatg agccaaagca tgttgcaaaa ctttcgctct ttcatcctcg aacgctccgg 23820
aatcctgccc gccacctgct ccgcgctgcc ctcggacttc gtgccgctga ccttccgcga 23880
gtgccccccg ccgctgtgga gccactgcta cctgctgcgc ctggccaact acctggccta 23940
ccactcggac gtgatcgagg acgtcagcgg cgagggcctg ctcgagtgcc actgccgctg 24000
caacctctgc acgccgcacc gctccctggc ctgcaacccc cagctgctga gcgagaccca 24060
gatcatcggc accttcgagt tgcaagggcc cagcgaaggc gagggttcag ccgccaaggg 24120
gggtctgaaa ctcaccccgg ggctgtggac ctcggcctac ttgcgcaagt tcgtgcccga 24180
ggactaccat cccttcgaga tcaggttcta cgaggaccaa tcccatccgc ccaaggccga 24240
gctgtcggcc tgcgtcatca cccagggggc gatcctggcc caattgcaag ccatccagaa 24300
atcccgccaa gaattcttgc tgaaaaaggg ccgcggggtc tacctcgacc cccagaccgg 24360
tgaggagctc aaccccggct tcccccagga tgccccgagg aaacaagaag ctgaaagtgg 24420
agctgccgcc cgtggaggat ttggaggaag actgggagaa cagcagtcag gcagaggagg 24480
aggagatgga ggaagactgg gacagcactc aggcagagga ggacagcctg caagacagtc 24540
tggaggaaga cgaggaggag gcagaggagg aggtggaaga agcagccgcc gccagaccgt 24600
cgtcctcggc gggggagaaa gcaagcagca cggataccat ctccgctccg ggtcggggtc 24660
ccgctcgacc acacagtaga tgggacgaga ccggacgatt cccgaacccc accacccaga 24720
ccggtaagaa ggagcggcag ggatacaagt cctggcgggg gcacaaaaac gccatcgtct 24780
cctgcttgca ggcctgcggg ggcaacatct ccttcacccg gcgctacctg ctcttccacc 24840
gcggggtgaa ctttccccgc aacatcttgc attactaccg tcacctccac agcccctact 24900
acttccaaga agaggcagca gcagcagaaa aagaccagca gaaaaccagc agctagaaaa 24960
tccacagcgg cggcagcagg tggactgagg atcgcggcga acgagccggc gcaaacccgg 25020
gagctgagga accggatctt tcccaccctc tatgccatct tccagcagag tcgggggcag 25080
gagcaggaac tgaaagtcaa gaaccgttct ctgcgctcgc tcacccgcag ttgtctgtat 25140
cacaagagcg aagaccaact tcagcgcact ctcgaggacg ccgaggctct cttcaacaag 25200
tactgcgcgc tcactcttaa agagtagccc gcgcccgccc agtcgcagaa aaaggcggga 25260
attacgtcac ctgtgccctt cgccctagcc gcctccaccc atcatcatga gcaaagagat 25320
tcccacgcct tacatgtgga gctaccagcc ccagatgggc ctggccgccg gtgccgccca 25380
ggactactcc acccgcatga attggctcag cgccgggccc gcgatgatct cacgggtgaa 25440
tgacatccgc gcccaccgaa accagatact cctagaacag tcagcgctca ccgccacgcc 25500
ccgcaatcac ctcaatccgc gtaattggcc cgccgccctg gtgtaccagg aaattcccca 25560
gcccacgacc gtactacttc cgcgagacgc ccaggccgaa gtccagctga ctaactcagg 25620
tgtccagctg gcgggcggcg ccaccctgtg tcgtcaccgc cccgctcagg gtataaagcg 25680
gctggtgatc cggggcagag gcacacagct caacgacgag gtggtgagct cttcgctggg 25740
tctgcgacct gacggagtct tccaactcgc cggatcgggg agatcttcct tcacgcctcg 25800
tcaggccgtc ctgactttgg agagttcgtc ctcgcagccc cgctcgggtg gcatcggcac 25860
tctccagttc gtggaggagt tcactccctc ggtctacttc aaccccttct ccggctcccc 25920
cggccactac ccggacgagt tcatcccgaa cttcgacgcc atcagcgagt cggtggacgg 25980
ctacgattga atgtcccatg gtggcgcagc tgacctagct cggcttcgac acctggacca 26040
ctgccgccgc ttccgctgct tcgctcggga tctcgccgag tttgcctact ttgagctgcc 26100
cgaggagcac cctcagggcc cggcccacgg agtgcggatc gtcgtcgaag ggggcctcga 26160
ctcccacctg cttcggatct tcagccagcg tccgatcctg gtcgagcgcg agcaaggaca 26220
gacccttctg actctgtact gcatctgcaa ccaccccggc ctgcatgaaa gtctttgttg 26280
tctgctgtgt actgagtata ataaaagctg agatcagcga ctactccgga cttccgtgtg 26340
ttcctgaatc catcaaccag tctttgttct tcaccgggaa cgagaccgag ctccagctcc 26400
agtgtaagcc ccacaagaag tacctcacct ggctgttcca gggctccccg atcgccgttg 26460
tcaaccactg cgacaacgac ggagtcctgc tgagcggccc tgccaacctt actttttcca 26520
cccgcagaag caagctccag ctcttccaac ccttcctccc cgggacctat cagtgcgtct 26580
cgggaccctg ccatcacacc ttccacctga tcccgaatac cacagcgtcg ctccccgcta 26640
ctaacaacca aactaacctc caccaacgcc accgtcgcga cggccacaat acatgcccat 26700
attagactat gaggccgagc cacagcgacc catgctcccc gctattagtt acttcaatct 26760
aaccggcgga gatgactgac ccactggcca acaacaacgt caacgacctt ctcctggaca 26820
tggacggccg cgcctcggag cagcgactcg cccaacttcg cattcgccag cagcaggaga 26880
gagccgtcaa ggagctgcag gatgcggtgg ccatccacca gtgcaagaga ggcatcttct 26940
gcctggtgaa acaggccaag atctcctacg aggtcactcc aaacgaccat cgcctctcct 27000
acgagctcct gcagcagcgc cagaagttca cctgcctggt cggagtcaac cccatcgtca 27060
tcacccagca gtctggcgat accaaggggt gcatccactg ctcctgcgac tcccccgact 27120
gcgtccacac tctgatcaag accctctgcg gcctccgcga cctcctcccc atgaactaat 27180
caccccctta tccagtgaaa taaagatcat attgatgatg attttacaga aataaaaaat 27240
aatcatttga tttgaaataa agatacaatc atattgatga tttgagttta acaaaaaaat 27300
aaagaatcac ttacttgaaa tctgatacca ggtctctgtc catgttttct gccaacacca 27360
cttcactccc ctcttcccag ctctggtact gcaggccccg gcgggctgca aacttcctcc 27420
acacgctgaa ggggatgtca aattcctcct gtccctcaat cttcatttta tcttctatca 27480
gatgtccaaa aagcgcgtcc gggtggatga tgacttcgac cccgtctacc cctacgatgc 27540
agacaacgca ccgaccgtgc ccttcatcaa cccccccttc gtctcttcag atggattcca 27600
agagaagccc ctgggggtgt tgtccctgcg actggccgac cccgtcacca ccaagaacgg 27660
ggaaatcacc ctcaagctgg gagagggggt ggacctcgat tcctcgggaa aactcatctc 27720
caacacggcc accaaggccg ccgcccctct cagtttttcc aacaacacca tttcccttaa 27780
catggatcac cccttttaca ctaaagatgg aaaattatcc ttacaagttt ctccaccatt 27840
aaatatactg agaacaagca ttctaaacac actagcttta ggttttggat caggtttagg 27900
actccgtggc tctgccttgg cagtacagtt agtctctcca cttacatttg atactgatgg 27960
aaacataaag cttaccttag acagaggttt gcatgttaca acaggagatg caattgaaag 28020
caacataagc tgggctaaag gtttaaaatt tgaagatgga gccatagcaa ccaacattgg 28080
aaatgggtta gagtttggaa gcagtagtac agaaacaggt gttgatgatg cttacccaat 28140
ccaagttaaa cttggatctg gccttagctt tgacagtaca ggagccataa tggctggtaa 28200
caaagaagac gataaactca ctttgtggac aacacctgat ccatcaccaa actgtcaaat 28260
actcgcagaa aatgatgcaa aactaacact ttgcttgact aaatgtggta gtcaaatact 28320
ggccactgtg tcagtcttag ttgtaggaag tggaaaccta aaccccatta ctggcaccgt 28380
aagcagtgct caggtgtttc tacgttttga tgcaaacggt gttcttttaa cagaacattc 28440
tacactaaaa aaatactggg ggtataggca gggagatagc atagatggca ctccatatac 28500
caatgctgta ggattcatgc ccaatttaaa agcttatcca aagtcacaaa gttctactac 28560
taaaaataat atagtagggc aagtatacat gaatggagat gtttcaaaac ctatgcttct 28620
cactataacc ctcaatggta ctgatgacag caacagtaca tattcaatgt cattttcata 28680
cacctggact aatggaagct atgttggagc aacatttggg gctaactctt ataccttctc 28740
atacatcgcc caagaatgaa cactgtatcc caccctgcat gccaaccctt cccaccccac 28800
tctgtggaac aaactctgaa acacaaaata aaataaagtt caagtgtttt attgattcaa 28860
cagttttaca ggattcgagc agttattttt cctccaccct cccaggacat ggaatacacc 28920
accctctccc cccgcacagc cttgaacatc tgaatgccat tggtgatgga catgcttttg 28980
gtctccacgt tccacacagt ttcagagcga gccagtctcg ggtcggtcag ggagatgaaa 29040
ccctccgggc actcccgcat ctgcacctca cagctcaaca gctgaggatt gtcctcggtg 29100
gtcgggatca cggttatctg gaagaagcag aagagcggcg gtgggaatca tagtccgcga 29160
acgggatcgg ccggtggtgt cgcatcaggc cccgcagcag tcgctgccgc cgccgctccg 29220
tcaagctgct gctcaggggg tccgggtcca gggactccct cagcatgatg cccacggccc 29280
tcagcatcag tcgtctggtg cggcgggcgc agcagcgcat gcggatctcg ctcaggtcgc 29340
tgcagtacgt gcaacacaga accaccaggt tgttcaacag tccatagttc aacacgctcc 29400
agccgaaact catcgcggga aggatgctac ccacgtggcc gtcgtaccag atcctcaggt 29460
aaatcaagtg gtgccccctc cagaacacgc tgcccacgta catgatctcc ttgggcatgt 29520
ggcggttcac cacctcccgg taccacatca ccctctggtt gaacatgcag ccccggatga 29580
tcctgcggaa ccacagggcc agcaccgccc cgcccgccat gcagcgaaga gaccccgggt 29640
cccggcaatg gcaatggagg acccaccgct cgtacccgtg gatcatctgg gagctgaaca 29700
agtctatgtt ggcacagcac aggcatatgc tcatgcatct cttcagcact ctcaactcct 29760
cgggggtcaa aaccatatcc cagggcacgg ggaactcttg caggacagcg aaccccgcag 29820
aacagggcaa tcctcgcaca gaacttacat tgtgcatgga cagggtatcg caatcaggca 29880
gcaccgggtg atcctccacc agagaagcgc gggtctcggt ctcctcacag cgtggtaagg 29940
gggccggccg atacgggtga tggcgggacg cggctgatcg tgttcgcgac cgtgtcatga 30000
tgcagttgct ttcggacatt ttcgtacttg ctgtagcaga acctggtccg ggcgctgcac 30060
accgatcgcc ggcggcggtc tcggcgcttg gaacgctcgg tgttgaaatt gtaaaacagc 30120
cactctctca gaccgtgcag cagatctagg gcctcaggag tgatgaagat cccatcatgc 30180
ctgatggctc tgatcacatc gaccaccgtg gaatgggcca gacccagcca gatgatgcaa 30240
ttttgttggg tttcggtgac ggcgggggag ggaagaacag gaagaaccat gattaacttt 30300
taatccaaac ggtctcggag tacttcaaaa tgaagatcgc ggagatggca cctctcgccc 30360
ccgctgtgtt ggtggaaaat aacagccagg tcaaaggtga tacggttctc gagatgttcc 30420
acggtggctt ccagcaaagc ctccacgcgc acatccagaa acaagacaat agcgaaagcg 30480
ggagggttct ctaattcctc aatcatcatg ttacactcct gcaccatccc cagataattt 30540
tcatttttcc agccttgaat gattcgaact agttcgtgag gtaaatccaa gccagccatg 30600
ataaagagct cgcgcagagc gccctccacc ggcattctta agcacaccct cataattcca 30660
agatattctg ctcctggttc acctgcagca gattgacaag cggaatatca aaatctctgc 30720
cgcgatccct gagctcctcc ctcagcaata actgtaagta ctctttcata tcctctccga 30780
aatttttagc cataggacca ccaggaataa gattagggca agccacagta cagataaacc 30840
gaagtcctcc ccagtgagca ttgccaaatg caagactgct ataagcatgc tggctagacc 30900
cggtgatatc ttccagataa ctggacagaa aatcgcccag gcaattttta agaaaatcaa 30960
caaaagaaaa atcctccagg tggacgttta gagcctcggg aacaacgatg aagtaaatgc 31020
aagcggtgcg ttccagcatg gttagttagc tgatctgtag aaaaaacaaa aatgaacatt 31080
aaaccatgct agcctggcga acaggtgggt aaatcgttct ctccagcacc aggcaggcca 31140
cggggtctcc ggcgcgaccc tcgtaaaaat tgtcgctatg attgaaaacc atcacagaga 31200
gacgttcccg gtggccggcg tgaatgattc gacaagatga atacaccccc ggaacattgg 31260
cgtccgcgag tgaaaaaaag cgcccgagga agcaataagg cactacaatg ctcagtctca 31320
agtccagcaa agcgatgcca tgcggatgaa gcacaaaatt ctcaggtgcg tacaaaatgt 31380
aattactccc ctcctgcaca ggcagcaaag cccccgatcc ctccaggtac acatacaaag 31440
cctcagcgtc catagcttac cgagcagcag cacacaacag gcgcaagagt cagagaaagg 31500
ctgagctcta acctgtccac ccgctctctg ctcaatatat agcccagatc tacactgacg 31560
taaaggccaa agtctaaaaa tacccgccaa ataatcacac acgcccagca cacgcccaga 31620
aaccggtgac acactcaaaa aaatacgcgc acttcctcaa acgcccaaaa ctgccgtcat 31680
ttccgggttc ccacgctacg tcatcaaaac acgactttca aattccgtcg accgttaaaa 31740
acgtcacccg ccccgcccct aacggtcgcc cgtctctcag ccaatcagcg ccccgcatcc 31800
ccaaattcaa acacctcatt tgcatattaa cgcgcacaaa aagtttgagg tatattattg 31860
atgatgg 31867

<210> 12
<211> 32788
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 12
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagtagg gataacaggg taatgacatt 600
gattattgac tagttgttaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 660
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 720
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 780
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 840
atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 900
atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 960
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg 1020
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 1080
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg 1140
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 1200
cctggaacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga cagcgatcgc gccaccatgg 1260
ccgggatgtt ccaggcactg tccgaaggct gcacacccta tgatattaac cagatgctga 1320
atgtcctggg agaccaccag gtctctggcc tggagcagct ggagagcatc atcaacttcg 1380
agaagctgac cgagtggaca agctccaatg tgatgcctat cctgtcccca ctgaccaagg 1440
gcatcctggg cttcgtgttt accctgacag tgccttctga gcggggcctg tcttgcatca 1500
gcgaggcaga cgcaaccaca ccagagtccg ccaatctggg cgaggagatc ctgtctcagc 1560
tgtacctgtg gccccgggtg acatatcact ccccttctta cgcctatcac cagttcgagc 1620
ggagagccaa gtacaagaga cacttcccag gctttggcca gtctctgctg ttcggctacc 1680
ccgtgtacgt gttcggcgat tgcgtgcagg gcgactggga tgccatccgg tttagatact 1740
gcgcaccacc tggatatgca ctgctgaggt gtaacgacac caattattcc gccctgctgg 1800
cagtgggcgc cctggagggc cctcgcaatc aggattggct gggcgtgcca aggcagctgg 1860
tgacacgcat gcaggccatc cagaacgcag gcctgtgcac cctggtggca atgctggagg 1920
agacaatctt ctggctgcag gcctttctga tggccctgac cgacagcggc cccaagacaa 1980
acatcatcgt ggattcccag tacgtgatgg gcatctccaa gccttctttc caggagtttg 2040
tggactggga gaacgtgagc ccagagctga attccaccga tcagccattc tggcaggcag 2100
gaatcctggc aaggaacctg gtgcctatgg tggccacagt gcagggccag aatctgaagt 2160
accagggcca gagcctggtc atcagcgcct ccatcatcgt gtttaacctg ctggagctgg 2220
agggcgacta tcgggacgat ggcaacgtgt gggtgcacac cccactgagc cccagaacac 2280
tgaacgcctg ggtgaaggcc gtggaggaga agaagggcat cccagtgcac ctggagctgg 2340
cctccatgac caatatggag ctgatgtcta gcatcgtgca ccagcaggtg aggacatacg 2400
gacccgtgtt catgtgcctg ggaggcctgc tgaccatggt ggcaggagcc gtgtggctga 2460
cagtgcgggt gctggagctg ttcagagccg cccagctggc caacgatgtg gtgctgcaga 2520
tcatggagct gtgcggagca gcctttcgcc aggtgtgcca caccacagtg ccatggccca 2580
atgcctccct gacccccaag tggaacaatg agacaacaca gcctcagatc gccaactgta 2640
gcgtgtacga cttcttcgtg tggctgcact actatagcgt gagggatacc ctgtggcccc 2700
gcgtgacata ccacatgaat aagtacgcct atcacatgct ggagaggcgc gccaagtata 2760
agagaggccc tggcccaggc gcaaagtttg tggcagcatg gaccctgaag gccgccgccg 2820
gccccggccc cggccagtat atcaaggcta acagtaagtt cattggaatc acagagctgg 2880
gacccggacc tggataatga gtttaaactc ccatttaaat gtgagggtta atgcttcgag 2940
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 3000
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 3060
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 3120
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaataact ataacggtcc 3180
taaggtagcg agtgagtagt gttctggggc gggggaggac ctgcatgagg gccagaataa 3240
ctgaaatctg tgcttttctg tgtgttgcag cagcatgagc ggaagcggct cctttgaggg 3300
aggggtattc agcccttatc tgacggggcg tctcccctcc tgggcgggag tgcgtcagaa 3360
tgtgatggga tccacggtgg acggccggcc cgtgcagccc gcgaactctt caaccctgac 3420
ctatgcaacc ctgagctctt cgtcgttgga cgcagctgcc gccgcagctg ctgcatctgc 3480
cgccagcgcc gtgcgcggaa tggccatggg cgccggctac tacggcactc tggtggccaa 3540
ctcgagttcc accaataatc ccgccagcct gaacgaggag aagctgttgc tgctgatggc 3600
ccagctcgag gccttgaccc agcgcctggg cgagctgacc cagcaggtgg ctcagctgca 3660
ggagcagacg cgggccgcgg ttgccacggt gaaatccaaa taaaaaatga atcaataaat 3720
aaacggagac ggttgttgat tttaacacag agtctgaatc tttatttgat ttttcgcgcg 3780
cggtaggccc tggaccaccg gtctcgatca ttgagcaccc ggtggatctt ttccaggacc 3840
cggtagaggt gggcttggat gttgaggtac atgggcatga gcccgtcccg ggggtggagg 3900
tagctccatt gcagggcctc gtgctcgggg gtggtgttgt aaatcaccca gtcatagcag 3960
gggcgcaggg catggtgttg cacaatatct ttgaggagga gactgatggc cacgggcagc 4020
cctttggtgt aggtgtttac aaatctgttg agctgggagg gatgcatgcg gggggagatg 4080
aggtgcatct tggcctggat cttgagattg gcgatgttac cgcccagatc ccgcctgggg 4140
ttcatgttgt gcaggaccac cagcacggtg tatccggtgc acttggggaa tttatcatgc 4200
aacttggaag ggaaggcgtg aaagaatttg gcgacgcctt tgtgcccgcc caggttttcc 4260
atgcactcat ccatgatgat ggcgatgggc ccgtgggcgg cggcctgggc aaagacgttt 4320
cgggggtcgg acacatcata gttgtggtcc tgggtgaggt catcataggc cattttaatg 4380
aatttggggc ggagggtgcc ggactggggg acaaaggtac cctcgatccc gggggcgtag 4440
ttcccctcac agatctgcat ctcccaggct ttgagctcgg agggggggat catgtccacc 4500
tgcggggcga taaagaacac ggtttccggg gcgggggaga tgagctgggc cgaaagcaag 4560
ttccggagca gctgggactt gccgcagccg gtggggccgt agatgacccc gatgaccggc 4620
tgcaggtggt agttgaggga gagacagctg ccgtcctccc ggaggagggg ggccacctcg 4680
ttcatcatct cgcgcacgtg catgttctcg cgcaccagtt ccgccaggag gcgctctccc 4740
cccagggata ggagctcctg gagcgaggcg aagtttttca gcggcttgag tccgtcggcc 4800
atgggcattt tggagagggt ttgttgcaag agttccaggc ggtcccagag ctcggtgatg 4860
tgctctacgg catctcgatc cagcagacct cctcgtttcg cgggttggga cggctgcggg 4920
agtagggcac cagacgatgg gcgtccagcg cagccagggt ccggtccttc cagggtcgca 4980
gcgtccgcgt cagggtggtc tccgtcacgg tgaaggggtg cgcgccgggc tgggcgcttg 5040
cgagggtgcg cttcaggctc atccggctgg tcgaaaaccg ctcccgatcg gcgccctgcg 5100
cgtcggccag gtagcaattg accatgagtt cgtagttgag cgcctcggcc gcgtggcctt 5160
tggcgcggag cttacctttg gaagtctgcc cgcaggcggg acagaggagg gacttgaggg 5220
cgtagagctt gggggcgagg aagacggact cgggggcgta ggcgtccgcg ccgcagtggg 5280
cgcagacggt ctcgcactcc acgagccagg tgaggtcggg ctggtcgggg tcaaaaacca 5340
gtttcccgcc gttctttttg atgcgtttct tacctttggt ctccatgagc tcgtgtcccc 5400
gctgggtgac aaagaggctg tccgtgtccc cgtagaccga ctttatgggc cggtcctcga 5460
gcggtgtgcc gcggtcctcc tcgtagagga accccgccca ctccgagacg aaagcccggg 5520
tccaggccag cacgaaggag gccacgtggg acgggtagcg gtcgttgtcc accagcgggt 5580
ccaccttttc cagggtatgc aaacacatgt ccccctcgtc cacatccagg aaggtgattg 5640
gcttgtaagt gtaggccacg tgaccggggg tcccggccgg gggggtataa aagggtgcgg 5700
gtccctgctc gtcctcactg tcttccggat cgctgtccag gagcgccagc tgttggggta 5760
ggtattccct ctcgaaggcg ggcatgacct cggcactcag gttgtcagtt tctagaaacg 5820
aggaggattt gatattgacg gtgccggcgg agatgccttt caagagcccc tcgtccatct 5880
ggtcagaaaa gacgatcttt ttgttgtcga gcttggtggc gaaggagccg tagagggcgt 5940
tggagaggag cttggcgatg gagcgcatgg tctggttttt ttccttgtcg gcgcgctcct 6000
tggcggcgat gttgagctgc acgtactcgc gcgccacgca cttccattcg gggaagacgg 6060
tggtcagctc gtcgggcacg attctgacct gccagccccg attatgcagg gtgatgaggt 6120
ccacactggt ggccacctcg ccgcgcaggg gctcattagt ccagcagagg cgtccgccct 6180
tgcgcgagca gaaggggggc agggggtcca gcatgacctc gtcggggggg tcggcatcga 6240
tggtgaagat gccgggcagg aggtcggggt caaagtagct gatggaagtg gccagatcgt 6300
ccagggcagc ttgccattcg cgcacggcca gcgcgctctc gtagggactg aggggcgtgc 6360
cccagggcat gggatgggta agcgcggagg cgtacatgcc gcagatgtcg tagacgtaga 6420
ggggctcctc gaggatgccg atgtaggtgg ggtagcagcg ccccccgcgg atgctggcgc 6480
gcacgtagtc atacagctcg tgcgaggggg cgaggagccc cgggcccagg ttggtgcgac 6540
tgggcttttc ggcgcggtag acgatctggc ggaaaatggc atgcgagttg gaggagatgg 6600
tgggcctttg gaagatgttg aagtgggcgt ggggcagtcc gaccgagtcg cggatgaagt 6660
gggcgtagga gtcttgcagc ttggcgacga gctcggcggt gactaggacg tccagagcgc 6720
agtagtcgag ggtctcctgg atgatgtcat acttgagctg tcccttttgt ttccacagct 6780
cgcggttgag aaggaactct tcgcggtcct tccagtactc ttcgaggggg aacccgtcct 6840
gatctgcacg gtaagagcct agcatgtaga actggttgac ggccttgtag gcgcagcagc 6900
ccttctccac ggggagggcg taggcctggg cggccttgcg cagggaggtg tgcgtgaggg 6960
cgaaagtgtc cctgaccatg accttgagga actggtgctt gaagtcgata tcgtcgcagc 7020
ccccctgctc ccagagctgg aagtccgtgc gcttcttgta ggcggggttg ggcaaagcga 7080
aagtaacatc gttgaagagg atcttgcccg cgcggggcat aaagttgcga gtgatgcgga 7140
aaggttgggg cacctcggcc cggttgttga tgacctgggc ggcgagcacg atctcgtcga 7200
agccgttgat gttgtggccc acgatgtaga gttccacgaa tcgcggacgg cccttgacgt 7260
ggggcagttt cttgagctcc tcgtaggtga gctcgtcggg gtcgctgagc ccgtgctgct 7320
cgagcgccca gtcggcgaga tgggggttgg cgcggaggaa ggaagtccag agatccacgg 7380
ccagggcggt ttgcagacgg tcccggtact gacggaactg ctgcccgacg gccatttttt 7440
cgggggtgac gcagtagaag gtgcgggggt ccccgtgcca gcgatcccat ttgagctgga 7500
gggcgagatc gagggcgagc tcgacgagcc ggtcgtcccc ggagagtttc atgaccagca 7560
tgaaggggac gagctgcttg ccgaaggacc ccatccaggt gtaggtttcc acatcgtagg 7620
tgaggaagag cctttcggtg cgaggatgcg agccgatggg gaagaactgg atctcctgcc 7680
accaattgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa atgccgacgg cgcgccgaac 7740
actcgtgctt gtgtttatac aagcggccac agtgctcgca acgctgcacg ggatgcacgt 7800
gctgcacgag ctgtacctga gttcctttga cgaggaattt cagtgggaag tggagtcgtg 7860
gcgcctgcat ctcgtgctgt actacgtcgt ggtggtcggc ctggccctct tctgcctcga 7920
tggtggtcat gctgacgagc ccgcgcggga ggcaggtcca gacctcggcg cgagcgggtc 7980
ggagagcgag gacgagggcg cgcaggccgg agctgtccag ggtcctgaga cgctgcggag 8040
tcaggtcagt gggcagcggc ggcgcgcggt tgacttgcag gagtttttcc agggcgcgcg 8100
ggaggtccag atggtacttg atctccaccg cgccattggt ggcgacgtcg atggcttgca 8160
gggtcccgtg cccctggggt gtgaccaccg tcccccgttt cttcttgggc ggctggggcg 8220
acgggggcgg tgcctcttcc atggttagaa gcggcggcga ggacgcgcgc cgggcggcag 8280
gggcggctcg gggcccggag gcaggggcgg caggggcacg tcggcgccgc gcgcgggtag 8340
gttctggtac tgcgcccgga gaagactggc gtgagcgacg acgcgacggt tgacgtcctg 8400
gatctgacgc ctctgggtga aggccacggg acccgtgagt ttgaacctga aagagagttc 8460
gacagaatca atctcggtat cgttgacggc ggcctgccgc aggatctctt gcacgtcgcc 8520
cgagttgtcc tggtaggcga tctcggtcat gaactgctcg atctcctcct cttgaaggtc 8580
tccgcggccg gcgcgctcca cggtggccgc gaggtcgttg gagatgcggc ccatgagctg 8640
cgagaaggcg ttcatgcccg cctcgttcca gacgcggctg tagaccacga cgccctcggg 8700
atcgcgggcg cgcatgacca cctgggcgag gttgagctcc acgtggcgcg tgaagaccgc 8760
gtagttgcag aggcgctggt agaggtagtt gagcgtggtg gcgatgtgct cggtgacgaa 8820
gaaatacatg atccagcggc ggagcggcat ctcgctgacg tcgcccagcg cctccaaacg 8880
ttccatggcc tcgtaaaagt ccacggcgaa gttgaaaaac tgggagttgc gcgccgagac 8940
ggtcaactcc tcctccagaa gacggatgag ctcggcgatg gtggcgcgca cctcgcgctc 9000
gaaggccccc gggagttcct ccacttcctc ttcttcctcc tccactaaca tctcttctac 9060
ttcctcctca ggcggcagtg gtggcggggg agggggcctg cgtcgccggc ggcgcacggg 9120
cagacggtcg atgaagcgct cgatggtctc gccgcgccgg cgtcgcatgg tctcggtgac 9180
ggcgcgcccg tcctcgcggg gccgcagcgt gaagacgccg ccgcgcatct ccaggtggcc 9240
gggggggtcc ccgttgggca gggagagggc gctgacgatg catcttatca attgccccgt 9300
agggactccg cgcaaggacc tgagcgtctc gagatccacg ggatctgaaa accgctgaac 9360
gaaggcttcg agccagtcgc agtcgcaagg taggctgagc acggtttctt ctggcgggtc 9420
atgttggttg ggagcggggc gggcgatgct gctggtgatg aagttgaaat aggcggttct 9480
gagacggcgg atggtggcga ggagcaccag gtctttgggc ccggcttgct ggatgcgcag 9540
acggtcggcc atgccccagg cgtggtcctg acacctggcc aggtccttgt agtagtcctg 9600
catgagccgc tccacgggca cctcctcctc gcccgcgcgg ccgtgcatgc gcgtgagccc 9660
gaagccgcgc tggggctgga cgagcgccag gtcggcgacg acgcgctcgg cgaggatggc 9720
ttgctggatc tgggtgaggg tggtctggaa gtcatcaaag tcgacgaagc ggtggtaggc 9780
tccggtgttg atggtgtagg agcagttggc catgacggac cagttgacgg tctggtggcc 9840
cggacgcacg agctcgtggt acttgaggcg cgagtaggcg cgcgtgtcga agatgtagtc 9900
gttgcaggtg cgcaccaggt actggtagcc gatgaggaag tgcggcggcg gctggcggta 9960
gagcggccat cgctcggtgg cgggggcgcc gggcgcgagg tcctcgagca tggtgcggtg 10020
gtagccgtag atgtacctgg acatccaggt gatgccggcg gcggtggtgg aggcgcgcgg 10080
gaactcgcgg acgcggttcc agatgttgcg cagcggcagg aagtagttca tggtgggcac 10140
ggtctggccc gtgaggcgcg cgcagtcgtg gatgctctat acgggcaaaa acgaaagcgg 10200
tcagcggctc gactccgtgg cctggaggct aagcgaacgg gttgggctgc gcgtgtaccc 10260
cggttcgaat ctcgaatcag gctggagccg cagctaacgt ggtattggca ctcccgtctc 10320
gacccaagcc tgcaccaacc ctccaggata cggaggcggg tcgttttgca actttttttt 10380
ggaggccgga tgagactagt aagcgcggaa agcggccgac cgcgatggct cgctgccgta 10440
gtctggagaa gaatcgccag ggttgcgttg cggtgtgccc cggttcgagg ccggccggat 10500
tccgcggcta acgagggcgt ggctgccccg tcgtttccaa gaccccatag ccagccgact 10560
tctccagtta cggagcgagc ccctcttttg ttttgtttgt ttttgccaga tgcatcccgt 10620
actgcggcag atgcgccccc accaccctcc accgcaacaa cagccccctc cacagccggc 10680
gcttctgccc ccgccccagc agcaacttcc agccacgacc gccgcggccg ccgtgagcgg 10740
ggctggacag agttatgatc accagctggc cttggaagag ggcgaggggc tggcgcgcct 10800
gggggcgtcg tcgccggagc ggcacccgcg cgtgcagatg aaaagggacg ctcgcgaggc 10860
ctacgtgccc aagcagaacc tgttcagaga caggagcggc gaggagcccg aggagatgcg 10920
cgcggcccgg ttccacgcgg ggcgggagct gcggcgcggc ctggaccgaa agagggtgct 10980
gagggacgag gatttcgagg cggacgagct gacggggatc agccccgcgc gcgcgcacgt 11040
ggccgcggcc aacctggtca cggcgtacga gcagaccgtg aaggaggaga gcaacttcca 11100
aaaatccttc aacaaccacg tgcgcaccct gatcgcgcgc gaggaggtga ccctgggcct 11160
gatgcacctg tgggacctgc tggaggccat cgtgcagaac cccaccagca agccgctgac 11220
ggcgcagctg ttcctggtgg tgcagcatag tcgggacaac gaagcgttca gggaggcgct 11280
gctgaatatc accgagcccg agggccgctg gctcctggac ctggtgaaca ttctgcagag 11340
catcgtggtg caggagcgcg ggctgccgct gtccgagaag ctggcggcca tcaacttctc 11400
ggtgctgagt ttgggcaagt actacgctag gaagatctac aagaccccgt acgtgcccat 11460
agacaaggag gtgaagatcg acgggtttta catgcgcatg accctgaaag tgctgaccct 11520
gagcgacgat ctgggggtgt accgcaacga caggatgcac cgtgcggtga gcgccagcag 11580
gcggcgcgag ctgagcgacc aggagctgat gcatagtctg cagcgggccc tgaccggggc 11640
cgggaccgag ggggagagct actttgacat gggcgcggac ctgcactggc agcccagccg 11700
ccgggccttg gaggcggcgg caggacccta cgtagaagag gtggacgatg aggtggacga 11760
ggagggcgag tacctggaag actgatggcg cgaccgtatt tttgctagat gcaacaacaa 11820
cagccacctc ctgatcccgc gatgcgggcg gcgctgcaga gccagccgtc cggcattaac 11880
tcctcggacg attggaccca ggccatgcaa cgcatcatgg cgctgacgac ccgcaacccc 11940
gaagccttta gacagcagcc ccaggccaac cggctctcgg ccatcctgga ggccgtggtg 12000
ccctcgcgct ccaaccccac gcacgagaag gtcctggcca tcgtgaacgc gctggtggag 12060
aacaaggcca tccgcggcga cgaggccggc ctggtgtaca acgcgctgct ggagcgcgtg 12120
gcccgctaca acagcaccaa cgtgcagacc aacctggacc gcatggtgac cgacgtgcgc 12180
gaggccgtgg cccagcgcga gcggttccac cgcgagtcca acctgggatc catggtggcg 12240
ctgaacgcct tcctcagcac ccagcccgcc aacgtgcccc ggggccagga ggactacacc 12300
aacttcatca gcgccctgcg cctgatggtg accgaggtgc cccagagcga ggtgtaccag 12360
tccgggccgg actacttctt ccagaccagt cgccagggct tgcagaccgt gaacctgagc 12420
caggctttca agaacttgca gggcctgtgg ggcgtgcagg ccccggtcgg ggaccgcgcg 12480
acggtgtcga gcctgctgac gccgaactcg cgcctgctgc tgctgctggt ggcccccttc 12540
acggacagcg gcagcatcaa ccgcaactcg tacctgggct acctgattaa cctgtaccgc 12600
gaggccatcg gccaggcgca cgtggacgag cagacctacc aggagatcac ccacgtgagc 12660
cgcgccctgg gccaggacga cccgggcaac ctggaagcca ccctgaactt tttgctgacc 12720
aaccggtcgc agaagatccc gccccagtac gcgctcagca ccgaggagga gcgcatcctg 12780
cgttacgtgc agcagagcgt gggcctgttc ctgatgcagg agggggccac ccccagcgcc 12840
gcgctcgaca tgaccgcgcg caacatggag cccagcatgt acgccagcaa ccgcccgttc 12900
atcaataaac tgatggacta cttgcatcgg gcggccgcca tgaactctga ctatttcacc 12960
aacgccatcc tgaatcccca ctggctcccg ccgccggggt tctacacggg cgagtacgac 13020
atgcccgacc ccaatgacgg gttcctgtgg gacgatgtgg acagcagcgt gttctccccc 13080
cgaccgggtg ctaacgagcg ccccttgtgg aagaaggaag gcagcgaccg acgcccgtcc 13140
tcggcgctgt ccggccgcga gggtgctgcc gcggcggtgc ccgaggccgc cagtcctttc 13200
ccgagcttgc ccttctcgct gaacagtatc cgcagcagcg agctgggcag gatcacgcgc 13260
ccgcgcttgc tgggcgaaga ggagtacttg aatgactcgc tgttgagacc cgagcgggag 13320
aagaacttcc ccaataacgg gatagaaagc ctggtggaca agatgagccg ctggaagacg 13380
tatgcgcagg agcacaggga cgatccccgg gcgtcgcagg gggccacgag ccggggcagc 13440
gccgcccgta aacgccggtg gcacgacagg cagcggggac agatgtggga cgatgaggac 13500
tccgccgacg acagcagcgt gttggacttg ggtgggagtg gtaacccgtt cgctcacctg 13560
cgcccccgta tcgggcgcat gatgtaagag aaaccgaaaa taaatgatac tcaccaaggc 13620
catggcgacc agcgtgcgtt cgtttcttct ctgttgttgt tgtatctagt atgatgaggc 13680
gtgcgtaccc ggagggtcct cctccctcgt acgagagcgt gatgcagcag gcgatggcgg 13740
cggcggcgat gcagcccccg ctggaggctc cttacgtgcc cccgcggtac ctggcgccta 13800
cggaggggcg gaacagcatt cgttactcgg agctggcacc cttgtacgat accacccggt 13860
tgtacctggt ggacaacaag tcggcggaca tcgcctcgct gaactaccag aacgaccaca 13920
gcaacttcct gaccaccgtg gtgcagaaca atgacttcac ccccacggag gccagcaccc 13980
agaccatcaa ctttgacgag cgctcgcggt ggggcggcca gctgaaaacc atcatgcaca 14040
ccaacatgcc caacgtgaac gagttcatgt acagcaacaa gttcaaggcg cgggtgatgg 14100
tctcccgcaa gacccccaat ggggtgacag tgacagagga ttatgatggt agtcaggatg 14160
agctgaagta tgaatgggtg gaatttgagc tgcccgaagg caacttctcg gtgaccatga 14220
ccatcgacct gatgaacaac gccatcatcg acaattactt ggcggtgggg cggcagaacg 14280
gggtgctgga gagcgacatc ggcgtgaagt tcgacactag gaacttcagg ctgggctggg 14340
accccgtgac cgagctggtc atgcccgggg tgtacaccaa cgaggctttc catcccgata 14400
ttgtcttgct gcccggctgc ggggtggact tcaccgagag ccgcctcagc aacctgctgg 14460
gcattcgcaa gaggcagccc ttccaggaag gcttccagat catgtacgag gatctggagg 14520
ggggcaacat ccccgcgctc ctggatgtcg acgcctatga gaaaagcaag gaggatgcag 14580
cagctgaagc aactgcagcc gtagctaccg cctctaccga ggtcaggggc gataattttg 14640
caagcgccgc agcagtggca gcggccgagg cggctgaaac cgaaagtaag atagtcattc 14700
agccggtgga gaaggatagc aagaacagga gctacaacgt actaccggac aagataaaca 14760
ccgcctaccg cagctggtac ctagcctaca actatggcga ccccgagaag ggcgtgcgct 14820
cctggacgct gctcaccacc tcggacgtca cctgcggcgt ggagcaagtc tactggtcgc 14880
tgcccgacat gatgcaagac ccggtcacct tccgctccac gcgtcaagtt agcaactacc 14940
cggtggtggg cgccgagctc ctgcccgtct actccaagag cttcttcaac gagcaggccg 15000
tctactcgca gcagctgcgc gccttcacct cgcttacgca cgtcttcaac cgcttccccg 15060
agaaccagat cctcgtccgc ccgcccgcgc ccaccattac caccgtcagt gaaaacgttc 15120
ctgctctcac agatcacggg accctgccgc tgcgcagcag tatccgggga gtccagcgcg 15180
tgaccgttac tgacgccaga cgccgcacct gcccctacgt ctacaaggcc ctgggcatag 15240
tcgcgccgcg cgtcctctcg agccgcacct tctaaatgtc cattctcatc tcgcccagta 15300
ataacaccgg ttggggcctg cgcgcgccca gcaagatgta cggaggcgct cgccaacgct 15360
ccacgcaaca ccccgtgcgc gtgcgcgggc acttccgcgc tccctggggc gccctcaagg 15420
gccgcgtgcg gtcgcgcacc accgtcgacg acgtgatcga ccaggtggtg gccgacgcgc 15480
gcaactacac ccccgccgcc gcgcccgtct ccaccgtgga cgccgtcatc gacagcgtgg 15540
tggccgacgc gcgccggtac gcccgcgcca agagccggcg gcggcgcatc gcccggcggc 15600
accggagcac ccccgccatg cgcgcggcgc gagccttgct gcgcagggcc aggcgcacgg 15660
gacgcagggc catgctcagg gcggccagac gcgcggcttc aggcgccagc gccggcagga 15720
cccggagacg cgcggccacg gcggcggcag cggccatcgc cagcatgtcc cgcccgcggc 15780
gagggaacgt gtactgggtg cgcgacgccg ccaccggtgt gcgcgtgccc gtgcgcaccc 15840
gcccccctcg cacttgaaga tgttcacttc gcgatgttga tgtgtcccag cggcgaggag 15900
gatgtccaag cgcaaattca aggaagagat gctccaggtc atcgcgcctg agatctacgg 15960
ccctgcggtg gtgaaggagg aaagaaagcc ccgcaaaatc aagcgggtca aaaaggacaa 16020
aaaggaagaa gaaagtgatg tggacggatt ggtggagttt gtgcgcgagt tcgccccccg 16080
gcggcgcgtg cagtggcgcg ggcggaaggt gcaaccggtg ctgagacccg gcaccaccgt 16140
ggtcttcacg cccggcgagc gctccggcac cgcttccaag cgctcctacg acgaggtgta 16200
cggggatgat gatattctgg agcaggcggc cgagcgcctg ggcgagtttg cttacggcaa 16260
gcgcagccgt tccgcaccga aggaagaggc ggtgtccatc ccgctggacc acggcaaccc 16320
cacgccgagc ctcaagcccg tgaccttgca gcaggtgctg ccgaccgcgg cgccgcgccg 16380
ggggttcaag cgcgagggcg aggatctgta ccccaccatg cagctgatgg tgcccaagcg 16440
ccagaagctg gaagacgtgc tggagaccat gaaggtggac ccggacgtgc agcccgaggt 16500
caaggtgcgg cccatcaagc aggtggcccc gggcctgggc gtgcagaccg tggacatcaa 16560
gattcccacg gagcccatgg aaacgcagac cgagcccatg atcaagccca gcaccagcac 16620
catggaggtg cagacggatc cctggatgcc atcggctcct agtcgaagac cccggcgcaa 16680
gtacggcgcg gccagcctgc tgatgcccaa ctacgcgctg catccttcca tcatccccac 16740
gccgggctac cgcggcacgc gcttctaccg cggtcatacc agcagccgcc gccgcaagac 16800
caccactcgc cgccgccgtc gccgcaccgc cgctgcaacc acccctgccg ccctggtgcg 16860
gagagtgtac cgccgcggcc gcgcacctct gaccctgccg cgcgcgcgct accacccgag 16920
catcgccatt taaactttcg cctgctttgc agatcaatgg ccctcacatg ccgccttcgc 16980
gttcccatta cgggctaccg aggaagaaaa ccgcgccgta gaaggctggc ggggaacggg 17040
atgcgtcgcc accaccaccg gcggcggcgc gccatcagca agcggttggg gggaggcttc 17100
ctgcccgcgc tgatccccat catcgccgcg gcgatcgggg cgatccccgg cattgcttcc 17160
gtggcggtgc aggcctctca gcgccactga gacacacttg gaaacatctt gtaataaacc 17220
aatggactct gacgctcctg gtcctgtgat gtgttttcgt agacagatgg aagacatcaa 17280
tttttcgtcc ctggctccgc gacacggcac gcggccgttc atgggcacct ggagcgacat 17340
cggcaccagc caactgaacg ggggcgcctt caattggagc agtctctgga gcgggcttaa 17400
gaatttcggg tccacgctta aaacctatgg cagcaaggcg tggaacagca ccacagggca 17460
ggcgctgagg gataagctga aagagcagaa cttccagcag aaggtggtcg atgggctcgc 17520
ctcgggcatc aacggggtgg tggacctggc caaccaggcc gtgcagcggc agatcaacag 17580
ccgcctggac ccggtgccgc ccgccggctc cgtggagatg ccgcaggtgg aggaggagct 17640
gcctcccctg gacaagcggg gcgagaagcg accccgcccc gatgcggagg agacgctgct 17700
gacgcacacg gacgagccgc ccccgtacga ggaggcggtg aaactgggtc tgcccaccac 17760
gcggcccatc gcgcccctgg ccaccggggt gctgaaaccc gaaaagcccg cgaccctgga 17820
cttgcctcct ccccagcctt cccgcccctc tacagtggct aagcccctgc cgccggtggc 17880
cgtggcccgc gcgcgacccg ggggcaccgc ccgccctcat gcgaactggc agagcactct 17940
gaacagcatc gtgggtctgg gagtgcagag tgtgaagcgc cgccgctgct attaaaccta 18000
ccgtagcgct taacttgctt gtctgtgtgt gtatgtatta tgtcgccgcc gccgctgtcc 18060
accagaagga ggagtgaaga ggcgcgtcgc cgagttgcaa gatggccacc ccatcgatgc 18120
tgccccagtg ggcgtacatg cacatcgccg gacaggacgc ttcggagtac ctgagtccgg 18180
gtctggtgca gtttgcccgc gccacagaca cctacttcag tctggggaac aagtttagga 18240
accccacggt ggcgcccacg cacgatgtga ccaccgaccg cagccagcgg ctgacgctgc 18300
gcttcgtgcc cgtggaccgc gaggacaaca cctactcgta caaagtgcgc tacacgctgg 18360
ccgtgggcga caaccgcgtg ctggacatgg ccagcaccta ctttgacatc cgcggcgtgc 18420
tggatcgggg ccctagcttc aaaccctact ccggcaccgc ctacaacagt ctggccccca 18480
agggagcacc caacacttgt cagtggacat ataaagccga tggtgaaact gccacagaaa 18540
aaacctatac atatggaaat gcacccgtgc agggcattaa catcacaaaa gatggtattc 18600
aacttggaac tgacaccgat gatcagccaa tctacgcaga taaaacctat cagcctgaac 18660
ctcaagtggg tgatgctgaa tggcatgaca tcactggtac tgatgaaaag tatggaggca 18720
gagctcttaa gcctgatacc aaaatgaagc cttgttatgg ttcttttgcc aagcctacta 18780
ataaagaagg aggtcaggca aatgtgaaaa caggaacagg cactactaaa gaatatgaca 18840
tagacatggc tttctttgac aacagaagtg cggctgctgc tggcctagct ccagaaattg 18900
ttttgtatac tgaaaatgtg gatttggaaa ctccagatac ccatattgta tacaaagcag 18960
gcacagatga cagcagctct tctattaatt tgggtcagca agccatgccc aacagaccta 19020
actacattgg tttcagagac aactttatcg ggctcatgta ctacaacagc actggcaata 19080
tgggggtgct ggccggtcag gcttctcagc tgaatgctgt ggttgacttg caagacagaa 19140
acaccgagct gtcctaccag ctcttgcttg actctctggg tgacagaacc cggtatttca 19200
gtatgtggaa tcaggcggtg gacagctatg atcctgatgt gcgcattatt gaaaatcatg 19260
gtgtggagga tgaacttccc aactattgtt tccctctgga tgctgttggc agaacagata 19320
cttatcaggg aattaaggct aatggaactg atcaaaccac atggaccaaa gatgacagtg 19380
tcaatgatgc taatgagata ggcaagggta atccattcgc catggaaatc aacatccaag 19440
ccaacctgtg gaggaacttc ctctacgcca acgtggccct gtacctgccc gactcttaca 19500
agtacacgcc ggccaatgtt accctgccca ccaacaccaa cacctacgat tacatgaacg 19560
gccgggtggt ggcgccctcg ctggtggact cctacatcaa catcggggcg cgctggtcgc 19620
tggatcccat ggacaacgtg aaccccttca accaccaccg caatgcgggg ctgcgctacc 19680
gctccatgct cctgggcaac gggcgctacg tgcccttcca catccaggtg ccccagaaat 19740
ttttcgccat caagagcctc ctgctcctgc ccgggtccta cacctacgag tggaacttcc 19800
gcaaggacgt caacatgatc ctgcagagct ccctcggcaa cgacctgcgc acggacgggg 19860
cctccatctc cttcaccagc atcaacctct acgccacctt cttccccatg gcgcacaaca 19920
cggcctccac gctcgaggcc atgctgcgca acgacaccaa cgaccagtcc ttcaacgact 19980
acctctcggc ggccaacatg ctctacccca tcccggccaa cgccaccaac gtgcccatct 20040
ccatcccctc gcgcaactgg gccgccttcc gcggctggtc cttcacgcgt ctcaagacca 20100
aggagacgcc ctcgctgggc tccgggttcg acccctactt cgtctactcg ggctccatcc 20160
cctacctcga cggcaccttc tacctcaacc acaccttcaa gaaggtctcc atcaccttcg 20220
actcctccgt cagctggccc ggcaacgacc ggctcctgac gcccaacgag ttcgaaatca 20280
agcgcaccgt cgacggcgag ggctacaacg tggcccagtg caacatgacc aaggactggt 20340
tcctggtcca gatgctggcc cactacaaca tcggctacca gggcttctac gtgcccgagg 20400
gctacaagga ccgcatgtac tccttcttcc gcaacttcca gcccatgagc cgccaggtgg 20460
tggacgaggt caactacaag gactaccagg ccgtcaccct ggcctaccag cacaacaact 20520
cgggcttcgt cggctacctc gcgcccacca tgcgccaggg ccagccctac cccgccaact 20580
acccctaccc gctcatcggc aagagcgccg tcaccagcgt cacccagaaa aagttcctct 20640
gcgacagggt catgtggcgc atccccttct ccagcaactt catgtccatg ggcgcgctca 20700
ccgacctcgg ccagaacatg ctctatgcca actccgccca cgcgctagac atgaatttcg 20760
aagtcgaccc catggatgag tccacccttc tctatgttgt cttcgaagtc ttcgacgtcg 20820
tccgagtgca ccagccccac cgcggcgtca tcgaggccgt ctacctgcgc acccccttct 20880
cggccggtaa cgccaccacc taagctcttg cttcttgcaa gccatggccg cgggctccgg 20940
cgagcaggag ctcagggcca tcatccgcga cctgggctgc gggccctact tcctgggcac 21000
cttcgataag cgcttcccgg gattcatggc cccgcacaag ctggcctgcg ccatcgtcaa 21060
cacggccggc cgcgagaccg ggggcgagca ctggctggcc ttcgcctgga acccgcgctc 21120
gaacacctgc tacctcttcg accccttcgg gttctcggac gagcgcctca agcagatcta 21180
ccagttcgag tacgagggcc tgctgcgccg cagcgccctg gccaccgagg accgctgcgt 21240
caccctggaa aagtccaccc agaccgtgca gggtccgcgc tcggccgcct gcgggctctt 21300
ctgctgcatg ttcctgcacg ccttcgtgca ctggcccgac cgccccatgg acaagaaccc 21360
caccatgaac ttgctgacgg gggtgcccaa cggcatgctc cagtcgcccc aggtggaacc 21420
caccctgcgc cgcaaccagg aggcgctcta ccgcttcctc aactcccact ccgcctactt 21480
tcgctcccac cgcgcgcgca tcgagaaggc caccgccttc gaccgcatga atcaagacat 21540
gtaaaccgtg tgtgtatgtt aaatgtcttt aataaacagc actttcatgt tacacatgca 21600
tctgagatga tttatttaga aatcgaaagg gttctgccgg gtctcggcat ggcccgcggg 21660
cagggacacg ttgcggaact ggtacttggc cagccacttg aactcgggga tcagcagttt 21720
gggcagcggg gtgtcgggga aggagtcggt ccacagcttc cgcgtcagtt gcagggcgcc 21780
cagcaggtcg ggcgcggaga tcttgaaatc gcagttggga cccgcgttct gcgcgcggga 21840
gttgcggtac acggggttgc agcactggaa caccatcagg gccgggtgct tcacgctcgc 21900
cagcaccgtc gcgtcggtga tgctctccac gtcgaggtcc tcggcgttgg ccatcccgaa 21960
gggggtcatc ttgcaggtct gccttcccat ggtgggcacg cacccgggct tgtggttgca 22020
atcgcagtgc agggggatca gcatcatctg ggcctggtcg gcgttcatcc ccgggtacat 22080
ggccttcatg aaagcctcca attgcctgaa cgcctgctgg gccttggctc cctcggtgaa 22140
gaagaccccg caggacttgc tagagaactg gttggtggcg cacccggcgt cgtgcacgca 22200
gcagcgcgcg tcgttgttgg ccagctgcac cacgctgcgc ccccagcggt tctgggtgat 22260
cttggcccgg tcggggttct ccttcagcgc gcgctgcccg ttctcgctcg ccacatccat 22320
ctcgatcatg tgctccttct ggatcatggt ggtcccgtgc aggcaccgca gcttgccctc 22380
ggcctcggtg cacccgtgca gccacagcgc gcacccggtg cactcccagt tcttgtgggc 22440
gatctgggaa tgcgcgtgca cgaagccctg caggaagcgg cccatcatgg tggtcagggt 22500
cttgttgcta gtgaaggtca gcggaatgcc gcggtgctcc tcgttgatgt acaggtggca 22560
gatgcggcgg tacacctcgc cctgctcggg catcagctgg aagttggctt tcaggtcggt 22620
ctccacgcgg tagcggtcca tcagcatagt catgatttcc atacccttct cccaggccga 22680
gacgatgggc aggctcatag ggttcttcac catcatctta gcgctagcag ccgcggccag 22740
ggggtcgctc tcgtccaggg tctcaaagct ccgcttgccg tccttctcgg tgatccgcac 22800
cggggggtag ctgaagccca cggccgccag ctcctcctcg gcctgtcttt cgtcctcgct 22860
gtcctggctg acgtcctgca ggaccacatg cttggtcttg cggggtttct tcttgggcgg 22920
cagcggcggc ggagatgttg gagatggcga gggggagcgc gagttctcgc tcaccactac 22980
tatctcttcc tcttcttggt ccgaggccac gcggcggtag gtatgtctct tcgggggcag 23040
aggcggaggc gacgggctct cgccgccgcg acttggcgga tggctggcag agccccttcc 23100
gcgttcgggg gtgcgctccc ggcggcgctc tgactgactt cctccgcggc cggccattgt 23160
gttctcctag ggaggaacaa caagcatgga gactcagcca tcgccaacct cgccatctgc 23220
ccccaccgcc gacgagaagc agcagcagca gaatgaaagc ttaaccgccc cgccgcccag 23280
ccccgccacc tccgacgcgg ccgtcccaga catgcaagag atggaggaat ccatcgagat 23340
tgacctgggc tatgtgacgc ccgcggagca cgaggaggag ctggcagtgc gcttttcaca 23400
agaagagata caccaagaac agccagagca ggaagcagag aatgagcaga gtcaggctgg 23460
gctcgagcat gacggcgact acctccacct gagcgggggg gaggacgcgc tcatcaagca 23520
tctggcccgg caggccacca tcgtcaagga tgcgctgctc gaccgcaccg aggtgcccct 23580
cagcgtggag gagctcagcc gcgcctacga gttgaacctc ttctcgccgc gcgtgccccc 23640
caagcgccag cccaatggca cctgcgagcc caacccgcgc ctcaacttct acccggtctt 23700
cgcggtgccc gaggccctgg ccacctacca catctttttc aagaaccaaa agatccccgt 23760
ctcctgccgc gccaaccgca cccgcgccga cgcccttttc aacctgggtc ccggcgcccg 23820
cctacctgat atcgcctcct tggaagaggt tcccaagatc ttcgagggtc tgggcagcga 23880
cgagactcgg gccgcgaacg ctctgcaagg agaaggagga gagcatgagc accacagcgc 23940
cctggtcgag ttggaaggcg acaacgcgcg gctggcggtg ctcaaacgca cggtcgagct 24000
gacccatttc gcctacccgg ctctgaacct gccccccaaa gtcatgagcg cggtcatgga 24060
ccaggtgctc atcaagcgcg cgtcgcccat ctccgaggac gagggcatgc aagactccga 24120
ggagggcaag cccgtggtca gcgacgagca gctggcccgg tggctgggtc ctaatgctag 24180
tccccagagt ttggaagagc ggcgcaaact catgatggcc gtggtcctgg tgaccgtgga 24240
gctggagtgc ctgcgccgct tcttcgccga cgcggagacc ctgcgcaagg tcgaggagaa 24300
cctgcactac ctcttcaggc acgggttcgt gcgccaggcc tgcaagatct ccaacgtgga 24360
gctgaccaac ctggtctcct acatgggcat cttgcacgag aaccgcctgg ggcagaacgt 24420
gctgcacacc accctgcgcg gggaggcccg gcgcgactac atccgcgact gcgtctacct 24480
ctacctctgc cacacctggc agacgggcat gggcgtgtgg cagcagtgtc tggaggagca 24540
gaacctgaaa gagctctgca agctcctgca gaagaacctc aagggtctgt ggaccgggtt 24600
cgacgagcgc accaccgcct cggacctggc cgacctcatt ttccccgagc gcctcaggct 24660
gacgctgcgc aacggcctgc ccgactttat gagccaaagc atgttgcaaa actttcgctc 24720
tttcatcctc gaacgctccg gaatcctgcc cgccacctgc tccgcgctgc cctcggactt 24780
cgtgccgctg accttccgcg agtgcccccc gccgctgtgg agccactgct acctgctgcg 24840
cctggccaac tacctggcct accactcgga cgtgatcgag gacgtcagcg gcgagggcct 24900
gctcgagtgc cactgccgct gcaacctctg cacgccgcac cgctccctgg cctgcaaccc 24960
ccagctgctg agcgagaccc agatcatcgg caccttcgag ttgcaagggc ccagcgaagg 25020
cgagggttca gccgccaagg ggggtctgaa actcaccccg gggctgtgga cctcggccta 25080
cttgcgcaag ttcgtgcccg aggactacca tcccttcgag atcaggttct acgaggacca 25140
atcccatccg cccaaggccg agctgtcggc ctgcgtcatc acccaggggg cgatcctggc 25200
ccaattgcaa gccatccaga aatcccgcca agaattcttg ctgaaaaagg gccgcggggt 25260
ctacctcgac ccccagaccg gtgaggagct caaccccggc ttcccccagg atgccccgag 25320
gaaacaagaa gctgaaagtg gagctgccgc ccgtggagga tttggaggaa gactgggaga 25380
acagcagtca ggcagaggag gaggagatgg aggaagactg ggacagcact caggcagagg 25440
aggacagcct gcaagacagt ctggaggaag acgaggagga ggcagaggag gaggtggaag 25500
aagcagccgc cgccagaccg tcgtcctcgg cgggggagaa agcaagcagc acggatacca 25560
tctccgctcc gggtcggggt cccgctcgac cacacagtag atgggacgag accggacgat 25620
tcccgaaccc caccacccag accggtaaga aggagcggca gggatacaag tcctggcggg 25680
ggcacaaaaa cgccatcgtc tcctgcttgc aggcctgcgg gggcaacatc tccttcaccc 25740
ggcgctacct gctcttccac cgcggggtga actttccccg caacatcttg cattactacc 25800
gtcacctcca cagcccctac tacttccaag aagaggcagc agcagcagaa aaagaccagc 25860
agaaaaccag cagctagaaa atccacagcg gcggcagcag gtggactgag gatcgcggcg 25920
aacgagccgg cgcaaacccg ggagctgagg aaccggatct ttcccaccct ctatgccatc 25980
ttccagcaga gtcgggggca ggagcaggaa ctgaaagtca agaaccgttc tctgcgctcg 26040
ctcacccgca gttgtctgta tcacaagagc gaagaccaac ttcagcgcac tctcgaggac 26100
gccgaggctc tcttcaacaa gtactgcgcg ctcactctta aagagtagcc cgcgcccgcc 26160
cagtcgcaga aaaaggcggg aattacgtca cctgtgccct tcgccctagc cgcctccacc 26220
catcatcatg agcaaagaga ttcccacgcc ttacatgtgg agctaccagc cccagatggg 26280
cctggccgcc ggtgccgccc aggactactc cacccgcatg aattggctca gcgccgggcc 26340
cgcgatgatc tcacgggtga atgacatccg cgcccaccga aaccagatac tcctagaaca 26400
gtcagcgctc accgccacgc cccgcaatca cctcaatccg cgtaattggc ccgccgccct 26460
ggtgtaccag gaaattcccc agcccacgac cgtactactt ccgcgagacg cccaggccga 26520
agtccagctg actaactcag gtgtccagct ggcgggcggc gccaccctgt gtcgtcaccg 26580
ccccgctcag ggtataaagc ggctggtgat ccggggcaga ggcacacagc tcaacgacga 26640
ggtggtgagc tcttcgctgg gtctgcgacc tgacggagtc ttccaactcg ccggatcggg 26700
gagatcttcc ttcacgcctc gtcaggccgt cctgactttg gagagttcgt cctcgcagcc 26760
ccgctcgggt ggcatcggca ctctccagtt cgtggaggag ttcactccct cggtctactt 26820
caaccccttc tccggctccc ccggccacta cccggacgag ttcatcccga acttcgacgc 26880
catcagcgag tcggtggacg gctacgattg aatgtcccat ggtggcgcag ctgacctagc 26940
tcggcttcga cacctggacc actgccgccg cttccgctgc ttcgctcggg atctcgccga 27000
gtttgcctac tttgagctgc ccgaggagca ccctcagggc ccggcccacg gagtgcggat 27060
cgtcgtcgaa gggggcctcg actcccacct gcttcggatc ttcagccagc gtccgatcct 27120
ggtcgagcgc gagcaaggac agacccttct gactctgtac tgcatctgca accaccccgg 27180
cctgcatgaa agtctttgtt gtctgctgtg tactgagtat aataaaagct gagatcagcg 27240
actactccgg acttccgtgt gttcctgaat ccatcaacca gtctttgttc ttcaccggga 27300
acgagaccga gctccagctc cagtgtaagc cccacaagaa gtacctcacc tggctgttcc 27360
agggctcccc gatcgccgtt gtcaaccact gcgacaacga cggagtcctg ctgagcggcc 27420
ctgccaacct tactttttcc acccgcagaa gcaagctcca gctcttccaa cccttcctcc 27480
ccgggaccta tcagtgcgtc tcgggaccct gccatcacac cttccacctg atcccgaata 27540
ccacagcgtc gctccccgct actaacaacc aaactaacct ccaccaacgc caccgtcgcg 27600
acggccacaa tacatgccca tattagacta tgaggccgag ccacagcgac ccatgctccc 27660
cgctattagt tacttcaatc taaccggcgg agatgactga cccactggcc aacaacaacg 27720
tcaacgacct tctcctggac atggacggcc gcgcctcgga gcagcgactc gcccaacttc 27780
gcattcgcca gcagcaggag agagccgtca aggagctgca ggatgcggtg gccatccacc 27840
agtgcaagag aggcatcttc tgcctggtga aacaggccaa gatctcctac gaggtcactc 27900
caaacgacca tcgcctctcc tacgagctcc tgcagcagcg ccagaagttc acctgcctgg 27960
tcggagtcaa ccccatcgtc atcacccagc agtctggcga taccaagggg tgcatccact 28020
gctcctgcga ctcccccgac tgcgtccaca ctctgatcaa gaccctctgc ggcctccgcg 28080
acctcctccc catgaactaa tcaccccctt atccagtgaa ataaagatca tattgatgat 28140
gattttacag aaataaaaaa taatcatttg atttgaaata aagatacaat catattgatg 28200
atttgagttt aacaaaaaaa taaagaatca cttacttgaa atctgatacc aggtctctgt 28260
ccatgttttc tgccaacacc acttcactcc cctcttccca gctctggtac tgcaggcccc 28320
ggcgggctgc aaacttcctc cacacgctga aggggatgtc aaattcctcc tgtccctcaa 28380
tcttcatttt atcttctatc agatgtccaa aaagcgcgtc cgggtggatg atgacttcga 28440
ccccgtctac ccctacgatg cagacaacgc accgaccgtg cccttcatca accccccctt 28500
cgtctcttca gatggattcc aagagaagcc cctgggggtg ttgtccctgc gactggccga 28560
ccccgtcacc accaagaacg gggaaatcac cctcaagctg ggagaggggg tggacctcga 28620
ttcctcggga aaactcatct ccaacacggc caccaaggcc gccgcccctc tcagtttttc 28680
caacaacacc atttccctta acatggatca ccccttttac actaaagatg gaaaattatc 28740
cttacaagtt tctccaccat taaatatact gagaacaagc attctaaaca cactagcttt 28800
aggttttgga tcaggtttag gactccgtgg ctctgccttg gcagtacagt tagtctctcc 28860
acttacattt gatactgatg gaaacataaa gcttacctta gacagaggtt tgcatgttac 28920
aacaggagat gcaattgaaa gcaacataag ctgggctaaa ggtttaaaat ttgaagatgg 28980
agccatagca accaacattg gaaatgggtt agagtttgga agcagtagta cagaaacagg 29040
tgttgatgat gcttacccaa tccaagttaa acttggatct ggccttagct ttgacagtac 29100
aggagccata atggctggta acaaagaaga cgataaactc actttgtgga caacacctga 29160
tccatcacca aactgtcaaa tactcgcaga aaatgatgca aaactaacac tttgcttgac 29220
taaatgtggt agtcaaatac tggccactgt gtcagtctta gttgtaggaa gtggaaacct 29280
aaaccccatt actggcaccg taagcagtgc tcaggtgttt ctacgttttg atgcaaacgg 29340
tgttctttta acagaacatt ctacactaaa aaaatactgg gggtataggc agggagatag 29400
catagatggc actccatata ccaatgctgt aggattcatg cccaatttaa aagcttatcc 29460
aaagtcacaa agttctacta ctaaaaataa tatagtaggg caagtataca tgaatggaga 29520
tgtttcaaaa cctatgcttc tcactataac cctcaatggt actgatgaca gcaacagtac 29580
atattcaatg tcattttcat acacctggac taatggaagc tatgttggag caacatttgg 29640
ggctaactct tataccttct catacatcgc ccaagaatga acactgtatc ccaccctgca 29700
tgccaaccct tcccacccca ctctgtggaa caaactctga aacacaaaat aaaataaagt 29760
tcaagtgttt tattgattca acagttttac aggattcgag cagttatttt tcctccaccc 29820
tcccaggaca tggaatacac caccctctcc ccccgcacag ccttgaacat ctgaatgcca 29880
ttggtgatgg acatgctttt ggtctccacg ttccacacag tttcagagcg agccagtctc 29940
gggtcggtca gggagatgaa accctccggg cactcccgca tctgcacctc acagctcaac 30000
agctgaggat tgtcctcggt ggtcgggatc acggttatct ggaagaagca gaagagcggc 30060
ggtgggaatc atagtccgcg aacgggatcg gccggtggtg tcgcatcagg ccccgcagca 30120
gtcgctgccg ccgccgctcc gtcaagctgc tgctcagggg gtccgggtcc agggactccc 30180
tcagcatgat gcccacggcc ctcagcatca gtcgtctggt gcggcgggcg cagcagcgca 30240
tgcggatctc gctcaggtcg ctgcagtacg tgcaacacag aaccaccagg ttgttcaaca 30300
gtccatagtt caacacgctc cagccgaaac tcatcgcggg aaggatgcta cccacgtggc 30360
cgtcgtacca gatcctcagg taaatcaagt ggtgccccct ccagaacacg ctgcccacgt 30420
acatgatctc cttgggcatg tggcggttca ccacctcccg gtaccacatc accctctggt 30480
tgaacatgca gccccggatg atcctgcgga accacagggc cagcaccgcc ccgcccgcca 30540
tgcagcgaag agaccccggg tcccggcaat ggcaatggag gacccaccgc tcgtacccgt 30600
ggatcatctg ggagctgaac aagtctatgt tggcacagca caggcatatg ctcatgcatc 30660
tcttcagcac tctcaactcc tcgggggtca aaaccatatc ccagggcacg gggaactctt 30720
gcaggacagc gaaccccgca gaacagggca atcctcgcac agaacttaca ttgtgcatgg 30780
acagggtatc gcaatcaggc agcaccgggt gatcctccac cagagaagcg cgggtctcgg 30840
tctcctcaca gcgtggtaag ggggccggcc gatacgggtg atggcgggac gcggctgatc 30900
gtgttcgcga ccgtgtcatg atgcagttgc tttcggacat tttcgtactt gctgtagcag 30960
aacctggtcc gggcgctgca caccgatcgc cggcggcggt ctcggcgctt ggaacgctcg 31020
gtgttgaaat tgtaaaacag ccactctctc agaccgtgca gcagatctag ggcctcagga 31080
gtgatgaaga tcccatcatg cctgatggct ctgatcacat cgaccaccgt ggaatgggcc 31140
agacccagcc agatgatgca attttgttgg gtttcggtga cggcggggga gggaagaaca 31200
ggaagaacca tgattaactt ttaatccaaa cggtctcgga gtacttcaaa atgaagatcg 31260
cggagatggc acctctcgcc cccgctgtgt tggtggaaaa taacagccag gtcaaaggtg 31320
atacggttct cgagatgttc cacggtggct tccagcaaag cctccacgcg cacatccaga 31380
aacaagacaa tagcgaaagc gggagggttc tctaattcct caatcatcat gttacactcc 31440
tgcaccatcc ccagataatt ttcatttttc cagccttgaa tgattcgaac tagttcgtga 31500
ggtaaatcca agccagccat gataaagagc tcgcgcagag cgccctccac cggcattctt 31560
aagcacaccc tcataattcc aagatattct gctcctggtt cacctgcagc agattgacaa 31620
gcggaatatc aaaatctctg ccgcgatccc tgagctcctc cctcagcaat aactgtaagt 31680
actctttcat atcctctccg aaatttttag ccataggacc accaggaata agattagggc 31740
aagccacagt acagataaac cgaagtcctc cccagtgagc attgccaaat gcaagactgc 31800
tataagcatg ctggctagac ccggtgatat cttccagata actggacaga aaatcgccca 31860
ggcaattttt aagaaaatca acaaaagaaa aatcctccag gtggacgttt agagcctcgg 31920
gaacaacgat gaagtaaatg caagcggtgc gttccagcat ggttagttag ctgatctgta 31980
gaaaaaacaa aaatgaacat taaaccatgc tagcctggcg aacaggtggg taaatcgttc 32040
tctccagcac caggcaggcc acggggtctc cggcgcgacc ctcgtaaaaa ttgtcgctat 32100
gattgaaaac catcacagag agacgttccc ggtggccggc gtgaatgatt cgacaagatg 32160
aatacacccc cggaacattg gcgtccgcga gtgaaaaaaa gcgcccgagg aagcaataag 32220
gcactacaat gctcagtctc aagtccagca aagcgatgcc atgcggatga agcacaaaat 32280
tctcaggtgc gtacaaaatg taattactcc cctcctgcac aggcagcaaa gcccccgatc 32340
cctccaggta cacatacaaa gcctcagcgt ccatagctta ccgagcagca gcacacaaca 32400
ggcgcaagag tcagagaaag gctgagctct aacctgtcca cccgctctct gctcaatata 32460
tagcccagat ctacactgac gtaaaggcca aagtctaaaa atacccgcca aataatcaca 32520
cacgcccagc acacgcccag aaaccggtga cacactcaaa aaaatacgcg cacttcctca 32580
aacgcccaaa actgccgtca tttccgggtt cccacgctac gtcatcaaaa cacgactttc 32640
aaattccgtc gaccgttaaa aacgtcaccc gccccgcccc taacggtcgc ccgtctctca 32700
gccaatcagc gccccgcatc cccaaattca aacacctcat ttgcatatta acgcgcacaa 32760
aaagtttgag gtatattatt gatgatgg 32788

<210> 13
<211> 30684
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 13
ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60
aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120
gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180
tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240
aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300
gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360
gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420
tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480
atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540
tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagtagg gataacaggg taatgacatt 600
gattattgac tagttgttaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 660
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 720
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 780
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 840
atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 900
atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 960
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg 1020
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 1080
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg 1140
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 1200
cctggaacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga cagcgatcgc gccaccatgg 1260
tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 1320
acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 1380
agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 1440
tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 1500
acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 1560
aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 1620
accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 1680
tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 1740
tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 1800
actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 1860
tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 1920
tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctttac aagtagtgag 1980
tttaaactcc catttaaatg tgagggttaa tgcttcgagc agacatgata agatacattg 2040
atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 2100
gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 2160
attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg ggaggttttt taaagcaagt 2220
aaaacctcta caaatgtggt aaaataacta taacggtcct aaggtagcga gtgagtagtg 2280
ttctggggcg ggggaggacc tgcatgaggg ccagaataac tgaaatctgt gcttttctgt 2340
gtgttgcagc agcatgagcg gaagcggctc ctttgaggga ggggtattca gcccttatct 2400
gacggggcgt ctcccctcct gggcgggagt gcgtcagaat gtgatgggat ccacggtgga 2460
cggccggccc gtgcagcccg cgaactcttc aaccctgacc tatgcaaccc tgagctcttc 2520
gtcgttggac gcagctgccg ccgcagctgc tgcatctgcc gccagcgccg tgcgcggaat 2580
ggccatgggc gccggctact acggcactct ggtggccaac tcgagttcca ccaataatcc 2640
cgccagcctg aacgaggaga agctgttgct gctgatggcc cagctcgagg ccttgaccca 2700
gcgcctgggc gagctgaccc agcaggtggc tcagctgcag gagcagacgc gggccgcggt 2760
tgccacggtg aaatccaaat aaaaaatgaa tcaataaata aacggagacg gttgttgatt 2820
ttaacacaga gtctgaatct ttatttgatt tttcgcgcgc ggtaggccct ggaccaccgg 2880
tctcgatcat tgagcacccg gtggatcttt tccaggaccc ggtagaggtg ggcttggatg 2940
ttgaggtaca tgggcatgag cccgtcccgg gggtggaggt agctccattg cagggcctcg 3000
tgctcggggg tggtgttgta aatcacccag tcatagcagg ggcgcagggc atggtgttgc 3060
acaatatctt tgaggaggag actgatggcc acgggcagcc ctttggtgta ggtgtttaca 3120
aatctgttga gctgggaggg atgcatgcgg ggggagatga ggtgcatctt ggcctggatc 3180
ttgagattgg cgatgttacc gcccagatcc cgcctggggt tcatgttgtg caggaccacc 3240
agcacggtgt atccggtgca cttggggaat ttatcatgca acttggaagg gaaggcgtga 3300
aagaatttgg cgacgccttt gtgcccgccc aggttttcca tgcactcatc catgatgatg 3360
gcgatgggcc cgtgggcggc ggcctgggca aagacgtttc gggggtcgga cacatcatag 3420
ttgtggtcct gggtgaggtc atcataggcc attttaatga atttggggcg gagggtgccg 3480
gactggggga caaaggtacc ctcgatcccg ggggcgtagt tcccctcaca gatctgcatc 3540
tcccaggctt tgagctcgga gggggggatc atgtccacct gcggggcgat aaagaacacg 3600
gtttccgggg cgggggagat gagctgggcc gaaagcaagt tccggagcag ctgggacttg 3660
ccgcagccgg tggggccgta gatgaccccg atgaccggct gcaggtggta gttgagggag 3720
agacagctgc cgtcctcccg gaggaggggg gccacctcgt tcatcatctc gcgcacgtgc 3780
atgttctcgc gcaccagttc cgccaggagg cgctctcccc ccagggatag gagctcctgg 3840
agcgaggcga agtttttcag cggcttgagt ccgtcggcca tgggcatttt ggagagggtt 3900
tgttgcaaga gttccaggcg gtcccagagc tcggtgatgt gctctacggc atctcgatcc 3960
agcagacctc ctcgtttcgc gggttgggac ggctgcggga gtagggcacc agacgatggg 4020
cgtccagcgc agccagggtc cggtccttcc agggtcgcag cgtccgcgtc agggtggtct 4080
ccgtcacggt gaaggggtgc gcgccgggct gggcgcttgc gagggtgcgc ttcaggctca 4140
tccggctggt cgaaaaccgc tcccgatcgg cgccctgcgc gtcggccagg tagcaattga 4200
ccatgagttc gtagttgagc gcctcggccg cgtggccttt ggcgcggagc ttacctttgg 4260
aagtctgccc gcaggcggga cagaggaggg acttgagggc gtagagcttg ggggcgagga 4320
agacggactc gggggcgtag gcgtccgcgc cgcagtgggc gcagacggtc tcgcactcca 4380
cgagccaggt gaggtcgggc tggtcggggt caaaaaccag tttcccgccg ttctttttga 4440
tgcgtttctt acctttggtc tccatgagct cgtgtccccg ctgggtgaca aagaggctgt 4500
ccgtgtcccc gtagaccgac tttatgggcc ggtcctcgag cggtgtgccg cggtcctcct 4560
cgtagaggaa ccccgcccac tccgagacga aagcccgggt ccaggccagc acgaaggagg 4620
ccacgtggga cgggtagcgg tcgttgtcca ccagcgggtc caccttttcc agggtatgca 4680
aacacatgtc cccctcgtcc acatccagga aggtgattgg cttgtaagtg taggccacgt 4740
gaccgggggt cccggccggg ggggtataaa agggtgcggg tccctgctcg tcctcactgt 4800
cttccggatc gctgtccagg agcgccagct gttggggtag gtattccctc tcgaaggcgg 4860
gcatgacctc ggcactcagg ttgtcagttt ctagaaacga ggaggatttg atattgacgg 4920
tgccggcgga gatgcctttc aagagcccct cgtccatctg gtcagaaaag acgatctttt 4980
tgttgtcgag cttggtggcg aaggagccgt agagggcgtt ggagaggagc ttggcgatgg 5040
agcgcatggt ctggtttttt tccttgtcgg cgcgctcctt ggcggcgatg ttgagctgca 5100
cgtactcgcg cgccacgcac ttccattcgg ggaagacggt ggtcagctcg tcgggcacga 5160
ttctgacctg ccagccccga ttatgcaggg tgatgaggtc cacactggtg gccacctcgc 5220
cgcgcagggg ctcattagtc cagcagaggc gtccgccctt gcgcgagcag aaggggggca 5280
gggggtccag catgacctcg tcgggggggt cggcatcgat ggtgaagatg ccgggcagga 5340
ggtcggggtc aaagtagctg atggaagtgg ccagatcgtc cagggcagct tgccattcgc 5400
gcacggccag cgcgcgctcg tagggactga ggggcgtgcc ccagggcatg ggatgggtaa 5460
gcgcggaggc gtacatgccg cagatgtcgt agacgtagag gggctcctcg aggatgccga 5520
tgtaggtggg gtagcagcgc cccccgcgga tgctggcgcg cacgtagtca tacagctcgt 5580
gcgagggggc gaggagcccc gggcccaggt tggtgcgact gggcttttcg gcgcggtaga 5640
cgatctggcg gaaaatggca tgcgagttgg aggagatggt gggcctttgg aagatgttga 5700
agtgggcgtg gggcagtccg accgagtcgc ggatgaagtg ggcgtaggag tcttgcagct 5760
tggcgacgag ctcggcggtg actaggacgt ccagagcgca gtagtcgagg gtctcctgga 5820
tgatgtcata cttgagctgt cccttttgtt tccacagctc gcggttgaga aggaactctt 5880
cgcggtcctt ccagtactct tcgaggggga acccgtcctg atctgcacgg taagagccta 5940
gcatgtagaa ctggttgacg gccttgtagg cgcagcagcc cttctccacg gggagggcgt 6000
aggcctgggc ggccttgcgc agggaggtgt gcgtgagggc gaaagtgtcc ctgaccatga 6060
ccttgaggaa ctggtgcttg aagtcgatat cgtcgcagcc cccctgctcc cagagctgga 6120
agtccgtgcg cttcttgtag gcggggttgg gcaaagcgaa agtaacatcg ttgaagagga 6180
tcttgcccgc gcggggcata aagttgcgag tgatgcggaa aggttggggc acctcggccc 6240
ggttgttgat gacctgggcg gcgagcacga tctcgtcgaa gccgttgatg ttgtggccca 6300
cgatgtagag ttccacgaat cgcggacggc ccttgacgtg gggcagtttc ttgagctcct 6360
cgtaggtgag ctcgtcgggg tcgctgagcc cgtgctgctc gagcgcccag tcggcgagat 6420
gggggttggc gcggaggaag gaagtccaga gatccacggc cagggcggtt tgcagacggt 6480
cccggtactg acggaactgc tgcccgacgg ccattttttc gggggtgacg cagtagaagg 6540
tgcgggggtc cccgtgccag cgatcccatt tgagctggag ggcgagatcg agggcgagct 6600
cgacgagccg gtcgtccccg gagagtttca tgaccagcat gaaggggacg agctgcttgc 6660
cgaaggaccc catccaggtg taggtttcca catcgtaggt gaggaagagc ctttcggtgc 6720
gaggatgcga gccgatgggg aagaactgga tctcctgcca ccaattggag gaatggctgt 6780
tgatgtgatg gaagtagaaa tgccgacggc gcgccgaaca ctcgtgcttg tgtttataca 6840
agcggccaca gtgctcgcaa cgctgcacgg gatgcacgtg ctgcacgagc tgtacctgag 6900
ttcctttgac gaggaatttc agtgggaagt ggagtcgtgg cgcctgcatc tcgtgctgta 6960
ctacgtcgtg gtggtcggcc tggccctctt ctgcctcgat ggtggtcatg ctgacgagcc 7020
cgcgcgggag gcaggtccag acctcggcgc gagcgggtcg gagagcgagg acgagggcgc 7080
gcaggccgga gctgtccagg gtcctgagac gctgcggagt caggtcagtg ggcagcggcg 7140
gcgcgcggtt gacttgcagg agtttttcca gggcgcgcgg gaggtccaga tggtacttga 7200
tctccaccgc gccattggtg gcgacgtcga tggcttgcag ggtcccgtgc ccctggggtg 7260
tgaccaccgt cccccgtttc ttcttgggcg gctggggcga cgggggcggt gcctcttcca 7320
tggttagaag cggcggcgag gacgcgcgcc gggcggcagg ggcggctcgg ggcccggagg 7380
caggggcggc aggggcacgt cggcgccgcg cgcgggtagg ttctggtact gcgcccggag 7440
aagactggcg tgagcgacga cgcgacggtt gacgtcctgg atctgacgcc tctgggtgaa 7500
ggccacggga cccgtgagtt tgaacctgaa agagagttcg acagaatcaa tctcggtatc 7560
gttgacggcg gcctgccgca ggatctcttg cacgtcgccc gagttgtcct ggtaggcgat 7620
ctcggtcatg aactgctcga tctcctcctc ttgaaggtct ccgcggccgg cgcgctccac 7680
ggtggccgcg aggtcgttgg agatgcggcc catgagctgc gagaaggcgt tcatgcccgc 7740
ctcgttccag acgcggctgt agaccacgac gccctcggga tcgcgggcgc gcatgaccac 7800
ctgggcgagg ttgagctcca cgtggcgcgt gaagaccgcg tagttgcaga ggcgctggta 7860
gaggtagttg agcgtggtgg cgatgtgctc ggtgacgaag aaatacatga tccagcggcg 7920
gagcggcatc tcgctgacgt cgcccagcgc ctccaaacgt tccatggcct cgtaaaagtc 7980
cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg cgccgagacg gtcaactcct cctccagaag 8040
acggatgagc tcggcgatgg tggcgcgcac ctcgcgctcg aaggcccccg ggagttcctc 8100
cacttcctct tcttcctcct ccactaacat ctcttctact tcctcctcag gcggcagtgg 8160
tggcggggga gggggcctgc gtcgccggcg gcgcacgggc agacggtcga tgaagcgctc 8220
gatggtctcg ccgcgccggc gtcgcatggt ctcggtgacg gcgcgcccgt cctcgcgggg 8280
ccgcagcgtg aagacgccgc cgcgcatctc caggtggccg ggggggtccc cgttgggcag 8340
ggagagggcg ctgacgatgc atcttatcaa ttgccccgta gggactccgc gcaaggacct 8400
gagcgtctcg agatccacgg gatctgaaaa ccgctgaacg aaggcttcga gccagtcgca 8460
gtcgcaaggt aggctgagca cggtttcttc tggcgggtca tgttggttgg gagcggggcg 8520
ggcgatgctg ctggtgatga agttgaaata ggcggttctg agacggcgga tggtggcgag 8580
gagcaccagg tctttgggcc cggcttgctg gatgcgcaga cggtcggcca tgccccaggc 8640
gtggtcctga cacctggcca ggtccttgta gtagtcctgc atgagccgct ccacgggcac 8700
ctcctcctcg cccgcgcggc cgtgcatgcg cgtgagcccg aagccgcgct ggggctggac 8760
gagcgccagg tcggcgacga cgcgctcggc gaggatggct tgctggatct gggtgagggt 8820
ggtctggaag tcatcaaagt cgacgaagcg gtggtaggct ccggtgttga tggtgtagga 8880
gcagttggcc atgacggacc agttgacggt ctggtggccc ggacgcacga gctcgtggta 8940
cttgaggcgc gagtaggcgc gcgtgtcgaa gatgtagtcg ttgcaggtgc gcaccaggta 9000
ctggtagccg atgaggaagt gcggcggcgg ctggcggtag agcggccatc gctcggtggc 9060
gggggcgccg ggcgcgaggt cctcgagcat ggtgcggtgg tagccgtaga tgtacctgga 9120
catccaggtg atgccggcgg cggtggtgga ggcgcgcggg aactcgcgga cgcggttcca 9180
gatgttgcgc agcggcagga agtagttcat ggtgggcacg gtctggcccg tgaggcgcgc 9240
gcagtcgtgg atgctctata cgggcaaaaa cgaaagcggt cagcggctcg actccgtggc 9300
ctggaggcta agcgaacggg ttgggctgcg cgtgtacccc ggttcgaatc tcgaatcagg 9360
ctggagccgc agctaacgtg gtattggcac tcccgtctcg acccaagcct gcaccaaccc 9420
tccaggatac ggaggcgggt cgttttgcaa cttttttttg gaggccggat gagactagta 9480
agcgcggaaa gcggccgacc gcgatggctc gctgccgtag tctggagaag aatcgccagg 9540
gttgcgttgc ggtgtgcccc ggttcgaggc cggccggatt ccgcggctaa cgagggcgtg 9600
gctgccccgt cgtttccaag accccatagc cagccgactt ctccagttac ggagcgagcc 9660
cctcttttgt tttgtttgtt tttgccagat gcatcccgta ctgcggcaga tgcgccccca 9720
ccaccctcca ccgcaacaac agccccctcc acagccggcg cttctgcccc cgccccagca 9780
gcaacttcca gccacgaccg ccgcggccgc cgtgagcggg gctggacaga gttatgatca 9840
ccagctggcc ttggaagagg gcgaggggct ggcgcgcctg ggggcgtcgt cgccggagcg 9900
gcacccgcgc gtgcagatga aaagggacgc tcgcgaggcc tacgtgccca agcagaacct 9960
gttcagagac aggagcggcg aggagcccga ggagatgcgc gcggcccggt tccacgcggg 10020
gcgggagctg cggcgcggcc tggaccgaaa gagggtgctg agggacgagg atttcgaggc 10080
ggacgagctg acggggatca gccccgcgcg cgcgcacgtg gccgcggcca acctggtcac 10140
ggcgtacgag cagaccgtga aggaggagag caacttccaa aaatccttca acaaccacgt 10200
gcgcaccctg atcgcgcgcg aggaggtgac cctgggcctg atgcacctgt gggacctgct 10260
ggaggccatc gtgcagaacc ccaccagcaa gccgctgacg gcgcagctgt tcctggtggt 10320
gcagcatagt cgggacaacg aagcgttcag ggaggcgctg ctgaatatca ccgagcccga 10380
gggccgctgg ctcctggacc tggtgaacat tctgcagagc atcgtggtgc aggagcgcgg 10440
gctgccgctg tccgagaagc tggcggccat caacttctcg gtgctgagtt tgggcaagta 10500
ctacgctagg aagatctaca agaccccgta cgtgcccata gacaaggagg tgaagatcga 10560
cgggttttac atgcgcatga ccctgaaagt gctgaccctg agcgacgatc tgggggtgta 10620
ccgcaacgac aggatgcacc gtgcggtgag cgccagcagg cggcgcgagc tgagcgacca 10680
ggagctgatg catagtctgc agcgggccct gaccggggcc gggaccgagg gggagagcta 10740
ctttgacatg ggcgcggacc tgcactggca gcccagccgc cgggccttgg aggcggcggc 10800
aggaccctac gtagaagagg tggacgatga ggtggacgag gagggcgagt acctggaaga 10860
ctgatggcgc gaccgtattt ttgctagatg caacaacaac agccacctcc tgatcccgcg 10920
atgcgggcgg cgctgcagag ccagccgtcc ggcattaact cctcggacga ttggacccag 10980
gccatgcaac gcatcatggc gctgacgacc cgcaaccccg aagcctttag acagcagccc 11040
caggccaacc ggctctcggc catcctggag gccgtggtgc cctcgcgctc caaccccacg 11100
cacgagaagg tcctggccat cgtgaacgcg ctggtggaga acaaggccat ccgcggcgac 11160
gaggccggcc tggtgtacaa cgcgctgctg gagcgcgtgg cccgctacaa cagcaccaac 11220
gtgcagacca acctggaccg catggtgacc gacgtgcgcg aggccgtggc ccagcgcgag 11280
cggttccacc gcgagtccaa cctgggatcc atggtggcgc tgaacgcctt cctcagcacc 11340
cagcccgcca acgtgccccg gggccaggag gactacacca acttcatcag cgccctgcgc 11400
ctgatggtga ccgaggtgcc ccagagcgag gtgtaccagt ccgggccgga ctacttcttc 11460
cagaccagtc gccagggctt gcagaccgtg aacctgagcc aggctttcaa gaacttgcag 11520
ggcctgtggg gcgtgcaggc cccggtcggg gaccgcgcga cggtgtcgag cctgctgacg 11580
ccgaactcgc gcctgctgct gctgctggtg gcccccttca cggacagcgg cagcatcaac 11640
cgcaactcgt acctgggcta cctgattaac ctgtaccgcg aggccatcgg ccaggcgcac 11700
gtggacgagc agacctacca ggagatcacc cacgtgagcc gcgccctggg ccaggacgac 11760
ccgggcaacc tggaagccac cctgaacttt ttgctgacca accggtcgca gaagatcccg 11820
ccccagtacg cgctcagcac cgaggaggag cgcatcctgc gttacgtgca gcagagcgtg 11880
ggcctgttcc tgatgcagga gggggccacc cccagcgccg cgctcgacat gaccgcgcgc 11940
aacatggagc ccagcatgta cgccagcaac cgcccgttca tcaataaact gatggactac 12000
ttgcatcggg cggccgccat gaactctgac tatttcacca acgccatcct gaatccccac 12060
tggctcccgc cgccggggtt ctacacgggc gagtacgaca tgcccgaccc caatgacggg 12120
ttcctgtggg acgatgtgga cagcagcgtg ttctcccccc gaccgggtgc taacgagcgc 12180
cccttgtgga agaaggaagg cagcgaccga cgcccgtcct cggcgctgtc cggccgcgag 12240
ggtgctgccg cggcggtgcc cgaggccgcc agtcctttcc cgagcttgcc cttctcgctg 12300
aacagtatcc gcagcagcga gctgggcagg atcacgcgcc cgcgcttgct gggcgaagag 12360
gagtacttga atgactcgct gttgagaccc gagcgggaga agaacttccc caataacggg 12420
atagaaagcc tggtggacaa gatgagccgc tggaagacgt atgcgcagga gcacagggac 12480
gatccccggg cgtcgcaggg ggccacgagc cggggcagcg ccgcccgtaa acgccggtgg 12540
cacgacaggc agcggggaca gatgtgggac gatgaggact ccgccgacga cagcagcgtg 12600
ttggacttgg gtgggagtgg taacccgttc gctcacctgc gcccccgtat cgggcgcatg 12660
atgtaagaga aaccgaaaat aaatgatact caccaaggcc atggcgacca gcgtgcgttc 12720
gtttcttctc tgttgttgtt gtatctagta tgatgaggcg tgcgtacccg gagggtcctc 12780
ctccctcgta cgagagcgtg atgcagcagg cgatggcggc ggcggcgatg cagcccccgc 12840
tggaggctcc ttacgtgccc ccgcggtacc tggcgcctac ggaggggcgg aacagcattc 12900
gttactcgga gctggcaccc ttgtacgata ccacccggtt gtacctggtg gacaacaagt 12960
cggcggacat cgcctcgctg aactaccaga acgaccacag caacttcctg accaccgtgg 13020
tgcagaacaa tgacttcacc cccacggagg ccagcaccca gaccatcaac tttgacgagc 13080
gctcgcggtg gggcggccag ctgaaaacca tcatgcacac caacatgccc aacgtgaacg 13140
agttcatgta cagcaacaag ttcaaggcgc gggtgatggt ctcccgcaag acccccaatg 13200
gggtgacagt gacagaggat tatgatggta gtcaggatga gctgaagtat gaatgggtgg 13260
aatttgagct gcccgaaggc aacttctcgg tgaccatgac catcgacctg atgaacaacg 13320
ccatcatcga caattacttg gcggtggggc ggcagaacgg ggtgctggag agcgacatcg 13380
gcgtgaagtt cgacactagg aacttcaggc tgggctggga ccccgtgacc gagctggtca 13440
tgcccggggt gtacaccaac gaggctttcc atcccgatat tgtcttgctg cccggctgcg 13500
gggtggactt caccgagagc cgcctcagca acctgctggg cattcgcaag aggcagccct 13560
tccaggaagg cttccagatc atgtacgagg atctggaggg gggcaacatc cccgcgctcc 13620
tggatgtcga cgcctatgag aaaagcaagg aggatgcagc agctgaagca actgcagccg 13680
tagctaccgc ctctaccgag gtcaggggcg ataattttgc aagcgccgca gcagtggcag 13740
cggccgaggc ggctgaaacc gaaagtaaga tagtcattca gccggtggag aaggatagca 13800
agaacaggag ctacaacgta ctaccggaca agataaacac cgcctaccgc agctggtacc 13860
tagcctacaa ctatggcgac cccgagaagg gcgtgcgctc ctggacgctg ctcaccacct 13920
cggacgtcac ctgcggcgtg gagcaagtct actggtcgct gcccgacatg atgcaagacc 13980
cggtcacctt ccgctccacg cgtcaagtta gcaactaccc ggtggtgggc gccgagctcc 14040
tgcccgtcta ctccaagagc ttcttcaacg agcaggccgt ctactcgcag cagctgcgcg 14100
ccttcacctc gcttacgcac gtcttcaacc gcttccccga gaaccagatc ctcgtccgcc 14160
cgcccgcgcc caccattacc accgtcagtg aaaacgttcc tgctctcaca gatcacggga 14220
ccctgccgct gcgcagcagt atccggggag tccagcgcgt gaccgttact gacgccagac 14280
gccgcacctg cccctacgtc tacaaggccc tgggcatagt cgcgccgcgc gtcctctcga 14340
gccgcacctt ctaaatgtcc attctcatct cgcccagtaa taacaccggt tggggcctgc 14400
gcgcgcccag caagatgtac ggaggcgctc gccaacgctc cacgcaacac cccgtgcgcg 14460
tgcgcgggca cttccgcgct ccctggggcg ccctcaaggg ccgcgtgcgg tcgcgcacca 14520
ccgtcgacga cgtgatcgac caggtggtgg ccgacgcgcg caactacacc cccgccgccg 14580
cgcccgtctc caccgtggac gccgtcatcg acagcgtggt ggccgacgcg cgccggtacg 14640
cccgcgccaa gagccggcgg cggcgcatcg cccggcggca ccggagcacc cccgccatgc 14700
gcgcggcgcg agccttgctg cgcagggcca ggcgcacggg acgcagggcc atgctcaggg 14760
cggccagacg cgcggcttca ggcgccagcg ccggcaggac ccggagacgc gcggccacgg 14820
cggcggcagc ggccatcgcc agcatgtccc gcccgcggcg agggaacgtg tactgggtgc 14880
gcgacgccgc caccggtgtg cgcgtgcccg tgcgcacccg cccccctcgc acttgaagat 14940
gttcacttcg cgatgttgat gtgtcccagc ggcgaggagg atgtccaagc gcaaattcaa 15000
ggaagagatg ctccaggtca tcgcgcctga gatctacggc cctgcggtgg tgaaggagga 15060
aagaaagccc cgcaaaatca agcgggtcaa aaaggacaaa aaggaagaag aaagtgatgt 15120
ggacggattg gtggagtttg tgcgcgagtt cgccccccgg cggcgcgtgc agtggcgcgg 15180
gcggaaggtg caaccggtgc tgagacccgg caccaccgtg gtcttcacgc ccggcgagcg 15240
ctccggcacc gcttccaagc gctcctacga cgaggtgtac ggggatgatg atattctgga 15300
gcaggcggcc gagcgcctgg gcgagtttgc ttacggcaag cgcagccgtt ccgcaccgaa 15360
ggaagaggcg gtgtccatcc cgctggacca cggcaacccc acgccgagcc tcaagcccgt 15420
gaccttgcag caggtgctgc cgaccgcggc gccgcgccgg gggttcaagc gcgagggcga 15480
ggatctgtac cccaccatgc agctgatggt gcccaagcgc cagaagctgg aagacgtgct 15540
ggagaccatg aaggtggacc cggacgtgca gcccgaggtc aaggtgcggc ccatcaagca 15600
ggtggccccg ggcctgggcg tgcagaccgt ggacatcaag attcccacgg agcccatgga 15660
aacgcagacc gagcccatga tcaagcccag caccagcacc atggaggtgc agacggatcc 15720
ctggatgcca tcggctccta gtcgaagacc ccggcgcaag tacggcgcgg ccagcctgct 15780
gatgcccaac tacgcgctgc atccttccat catccccacg ccgggctacc gcggcacgcg 15840
cttctaccgc ggtcatacca gcagccgccg ccgcaagacc accactcgcc gccgccgtcg 15900
ccgcaccgcc gctgcaacca cccctgccgc cctggtgcgg agagtgtacc gccgcggccg 15960
cgcacctctg accctgccgc gcgcgcgcta ccacccgagc atcgccattt aaactttcgc 16020
ctgctttgca gatcaatggc cctcacatgc cgccttcgcg ttcccattac gggctaccga 16080
ggaagaaaac cgcgccgtag aaggctggcg gggaacggga tgcgtcgcca ccaccaccgg 16140
cggcggcgcg ccatcagcaa gcggttgggg ggaggcttcc tgcccgcgct gatccccatc 16200
atcgccgcgg cgatcggggc gatccccggc attgcttccg tggcggtgca ggcctctcag 16260
cgccactgag acacacttgg aaacatcttg taataaacca atggactctg acgctcctgg 16320
tcctgtgatg tgttttcgta gacagatgga agacatcaat ttttcgtccc tggctccgcg 16380
acacggcacg cggccgttca tgggcacctg gagcgacatc ggcaccagcc aactgaacgg 16440
gggcgccttc aattggagca gtctctggag cgggcttaag aatttcgggt ccacgcttaa 16500
aacctatggc agcaaggcgt ggaacagcac cacagggcag gcgctgaggg ataagctgaa 16560
agagcagaac ttccagcaga aggtggtcga tgggctcgcc tcgggcatca acggggtggt 16620
ggacctggcc aaccaggccg tgcagcggca gatcaacagc cgcctggacc cggtgccgcc 16680
cgccggctcc gtggagatgc cgcaggtgga ggaggagctg cctcccctgg acaagcgggg 16740
cgagaagcga ccccgccccg atgcggagga gacgctgctg acgcacacgg acgagccgcc 16800
cccgtacgag gaggcggtga aactgggtct gcccaccacg cggcccatcg cgcccctggc 16860
caccggggtg ctgaaacccg aaaagcccgc gaccctggac ttgcctcctc cccagccttc 16920
ccgcccctct acagtggcta agcccctgcc gccggtggcc gtggcccgcg cgcgacccgg 16980
gggcaccgcc cgccctcatg cgaactggca gagcactctg aacagcatcg tgggtctggg 17040
agtgcagagt gtgaagcgcc gccgctgcta ttaaacctac cgtagcgctt aacttgcttg 17100
tctgtgtgtg tatgtattat gtcgccgccg ccgctgtcca ccagaaggag gagtgaagag 17160
gcgcgtcgcc gagttgcaag atggccaccc catcgatgct gccccagtgg gcgtacatgc 17220
acatcgccgg acaggacgct tcggagtacc tgagtccggg tctggtgcag tttgcccgcg 17280
ccacagacac ctacttcagt ctggggaaca agtttaggaa ccccacggtg gcgcccacgc 17340
acgatgtgac caccgaccgc agccagcggc tgacgctgcg cttcgtgccc gtggaccgcg 17400
aggacaacac ctactcgtac aaagtgcgct acacgctggc cgtgggcgac aaccgcgtgc 17460
tggacatggc cagcacctac tttgacatcc gcggcgtgct ggatcggggc cctagcttca 17520
aaccctactc cggcaccgcc tacaacagtc tggcccccaa gggagcaccc aacacttgtc 17580
agtggacata taaagccgat ggtgaaactg ccacagaaaa aacctataca tatggaaatg 17640
cacccgtgca gggcattaac atcacaaaag atggtattca acttggaact gacaccgatg 17700
atcagccaat ctacgcagat aaaacctatc agcctgaacc tcaagtgggt gatgctgaat 17760
ggcatgacat cactggtact gatgaaaagt atggaggcag agctcttaag cctgatacca 17820
aaatgaagcc ttgttatggt tcttttgcca agcctactaa taaagaagga ggtcaggcaa 17880
atgtgaaaac aggaacaggc actactaaag aatatgacat agacatggct ttctttgaca 17940
acagaagtgc ggctgctgct ggcctagctc cagaaattgt tttgtatact gaaaatgtgg 18000
atttggaaac tccagatacc catattgtat acaaagcagg cacagatgac agcagctctt 18060
ctattaattt gggtcagcaa gccatgccca acagacctaa ctacattggt ttcagagaca 18120
actttatcgg gctcatgtac tacaacagca ctggcaatat gggggtgctg gccggtcagg 18180
cttctcagct gaatgctgtg gttgacttgc aagacagaaa caccgagctg tcctaccagc 18240
tcttgcttga ctctctgggt gacagaaccc ggtatttcag tatgtggaat caggcggtgg 18300
acagctatga tcctgatgtg cgcattattg aaaatcatgg tgtggaggat gaacttccca 18360
actattgttt ccctctggat gctgttggca gaacagatac ttatcaggga attaaggcta 18420
atggaactga tcaaaccaca tggaccaaag atgacagtgt caatgatgct aatgagatag 18480
gcaagggtaa tccattcgcc atggaaatca acatccaagc caacctgtgg aggaacttcc 18540
tctacgccaa cgtggccctg tacctgcccg actcttacaa gtacacgccg gccaatgtta 18600
ccctgcccac caacaccaac acctacgatt acatgaacgg ccgggtggtg gcgccctcgc 18660
tggtggactc ctacatcaac atcggggcgc gctggtcgct ggatcccatg gacaacgtga 18720
accccttcaa ccaccaccgc aatgcggggc tgcgctaccg ctccatgctc ctgggcaacg 18780
ggcgctacgt gcccttccac atccaggtgc cccagaaatt tttcgccatc aagagcctcc 18840
tgctcctgcc cgggtcctac acctacgagt ggaacttccg caaggacgtc aacatgatcc 18900
tgcagagctc cctcggcaac gacctgcgca cggacggggc ctccatctcc ttcaccagca 18960
tcaacctcta cgccaccttc ttccccatgg cgcacaacac ggcctccacg ctcgaggcca 19020
tgctgcgcaa cgacaccaac gaccagtcct tcaacgacta cctctcggcg gccaacatgc 19080
tctaccccat cccggccaac gccaccaacg tgcccatctc catcccctcg cgcaactggg 19140
ccgccttccg cggctggtcc ttcacgcgtc tcaagaccaa ggagacgccc tcgctgggct 19200
ccgggttcga cccctacttc gtctactcgg gctccatccc ctacctcgac ggcaccttct 19260
acctcaacca caccttcaag aaggtctcca tcaccttcga ctcctccgtc agctggcccg 19320
gcaacgaccg gctcctgacg cccaacgagt tcgaaatcaa gcgcaccgtc gacggcgagg 19380
gctacaacgt ggcccagtgc aacatgacca aggactggtt cctggtccag atgctggccc 19440
actacaacat cggctaccag ggcttctacg tgcccgaggg ctacaaggac cgcatgtact 19500
ccttcttccg caacttccag cccatgagcc gccaggtggt ggacgaggtc aactacaagg 19560
actaccaggc cgtcaccctg gcctaccagc acaacaactc gggcttcgtc ggctacctcg 19620
cgcccaccat gcgccagggc cagccctacc ccgccaacta cccctacccg ctcatcggca 19680
agagcgccgt caccagcgtc acccagaaaa agttcctctg cgacagggtc atgtggcgca 19740
tccccttctc cagcaacttc atgtccatgg gcgcgctcac cgacctcggc cagaacatgc 19800
tctatgccaa ctccgcccac gcgctagaca tgaatttcga agtcgacccc atggatgagt 19860
ccacccttct ctatgttgtc ttcgaagtct tcgacgtcgt ccgagtgcac cagccccacc 19920
gcggcgtcat cgaggccgtc tacctgcgca cccccttctc ggccggtaac gccaccacct 19980
aagctcttgc ttcttgcaag ccatggccgc gggctccggc gagcaggagc tcagggccat 20040
catccgcgac ctgggctgcg ggccctactt cctgggcacc ttcgataagc gcttcccggg 20100
attcatggcc ccgcacaagc tggcctgcgc catcgtcaac acggccggcc gcgagaccgg 20160
gggcgagcac tggctggcct tcgcctggaa cccgcgctcg aacacctgct acctcttcga 20220
ccccttcggg ttctcggacg agcgcctcaa gcagatctac cagttcgagt acgagggcct 20280
gctgcgccgc agcgccctgg ccaccgagga ccgctgcgtc accctggaaa agtccaccca 20340
gaccgtgcag ggtccgcgct cggccgcctg cgggctcttc tgctgcatgt tcctgcacgc 20400
cttcgtgcac tggcccgacc gccccatgga caagaacccc accatgaact tgctgacggg 20460
ggtgcccaac ggcatgctcc agtcgcccca ggtggaaccc accctgcgcc gcaaccagga 20520
ggcgctctac cgcttcctca actcccactc cgcctacttt cgctcccacc gcgcgcgcat 20580
cgagaaggcc accgccttcg accgcatgaa tcaagacatg taaaccgtgt gtgtatgtta 20640
aatgtcttta ataaacagca ctttcatgtt acacatgcat ctgagatgat ttatttagaa 20700
atcgaaaggg ttctgccggg tctcggcatg gcccgcgggc agggacacgt tgcggaactg 20760
gtacttggcc agccacttga actcggggat cagcagtttg ggcagcgggg tgtcggggaa 20820
ggagtcggtc cacagcttcc gcgtcagttg cagggcgccc agcaggtcgg gcgcggagat 20880
cttgaaatcg cagttgggac ccgcgttctg cgcgcgggag ttgcggtaca cggggttgca 20940
gcactggaac accatcaggg ccgggtgctt cacgctcgcc agcaccgtcg cgtcggtgat 21000
gctctccacg tcgaggtcct cggcgttggc catcccgaag ggggtcatct tgcaggtctg 21060
ccttcccatg gtgggcacgc acccgggctt gtggttgcaa tcgcagtgca gggggatcag 21120
catcatctgg gcctggtcgg cgttcatccc cgggtacatg gccttcatga aagcctccaa 21180
ttgcctgaac gcctgctggg ccttggctcc ctcggtgaag aagaccccgc aggacttgct 21240
agagaactgg ttggtggcgc acccggcgtc gtgcacgcag cagcgcgcgt cgttgttggc 21300
cagctgcacc acgctgcgcc cccagcggtt ctgggtgatc ttggcccggt cggggttctc 21360
cttcagcgcg cgctgcccgt tctcgctcgc cacatccatc tcgatcatgt gctccttctg 21420
gatcatggtg gtcccgtgca ggcaccgcag cttgccctcg gcctcggtgc acccgtgcag 21480
ccacagcgcg cacccggtgc actcccagtt cttgtgggcg atctgggaat gcgcgtgcac 21540
gaagccctgc aggaagcggc ccatcatggt ggtcagggtc ttgttgctag tgaaggtcag 21600
cggaatgccg cggtgctcct cgttgatgta caggtggcag atgcggcggt acacctcgcc 21660
ctgctcgggc atcagctgga agttggcttt caggtcggtc tccacgcggt agcggtccat 21720
cagcatagtc atgatttcca tacccttctc ccaggccgag acgatgggca ggctcatagg 21780
gttcttcacc atcatcttag cgctagcagc cgcggccagg gggtcgctct cgtccagggt 21840
ctcaaagctc cgcttgccgt ccttctcggt gatccgcacc ggggggtagc tgaagcccac 21900
ggccgccagc tcctcctcgg cctgtctttc gtcctcgctg tcctggctga cgtcctgcag 21960
gaccacatgc ttggtcttgc ggggtttctt cttgggcggc agcggcggcg gagatgttgg 22020
agatggcgag ggggagcgcg agttctcgct caccactact atctcttcct cttcttggtc 22080
cgaggccacg cggcggtagg tatgtctctt cgggggcaga ggcggaggcg acgggctctc 22140
gccgccgcga cttggcggat ggctggcaga gccccttccg cgttcggggg tgcgctcccg 22200
gcggcgctct gactgacttc ctccgcggcc ggccattgtg ttctcctagg gaggaacaac 22260
aagcatggag actcagccat cgccaacctc gccatctgcc cccaccgccg acgagaagca 22320
gcagcagcag aatgaaagct taaccgcccc gccgcccagc cccgccacct ccgacgcggc 22380
cgtcccagac atgcaagaga tggaggaatc catcgagatt gacctgggct atgtgacgcc 22440
cgcggagcac gaggaggagc tggcagtgcg cttttcacaa gaagagatac accaagaaca 22500
gccagagcag gaagcagaga atgagcagag tcaggctggg ctcgagcatg acggcgacta 22560
cctccacctg agcggggggg aggacgcgct catcaagcat ctggcccggc aggccaccat 22620
cgtcaaggat gcgctgctcg accgcaccga ggtgcccctc agcgtggagg agctcagccg 22680
cgcctacgag ttgaacctct tctcgccgcg cgtgcccccc aagcgccagc ccaatggcac 22740
ctgcgagccc aacccgcgcc tcaacttcta cccggtcttc gcggtgcccg aggccctggc 22800
cacctaccac atctttttca agaaccaaaa gatccccgtc tcctgccgcg ccaaccgcac 22860
ccgcgccgac gcccttttca acctgggtcc cggcgcccgc ctacctgata tcgcctcctt 22920
ggaagaggtt cccaagatct tcgagggtct gggcagcgac gagactcggg ccgcgaacgc 22980
tctgcaagga gaaggaggag agcatgagca ccacagcgcc ctggtcgagt tggaaggcga 23040
caacgcgcgg ctggcggtgc tcaaacgcac ggtcgagctg acccatttcg cctacccggc 23100
tctgaacctg ccccccaaag tcatgagcgc ggtcatggac caggtgctca tcaagcgcgc 23160
gtcgcccatc tccgaggacg agggcatgca agactccgag gagggcaagc ccgtggtcag 23220
cgacgagcag ctggcccggt ggctgggtcc taatgctagt ccccagagtt tggaagagcg 23280
gcgcaaactc atgatggccg tggtcctggt gaccgtggag ctggagtgcc tgcgccgctt 23340
cttcgccgac gcggagaccc tgcgcaaggt cgaggagaac ctgcactacc tcttcaggca 23400
cgggttcgtg cgccaggcct gcaagatctc caacgtggag ctgaccaacc tggtctccta 23460
catgggcatc ttgcacgaga accgcctggg gcagaacgtg ctgcacacca ccctgcgcgg 23520
ggaggcccgg cgcgactaca tccgcgactg cgtctacctc tacctctgcc acacctggca 23580
gacgggcatg ggcgtgtggc agcagtgtct ggaggagcag aacctgaaag agctctgcaa 23640
gctcctgcag aagaacctca agggtctgtg gaccgggttc gacgagcgca ccaccgcctc 23700
ggacctggcc gacctcattt tccccgagcg cctcaggctg acgctgcgca acggcctgcc 23760
cgactttatg agccaaagca tgttgcaaaa ctttcgctct ttcatcctcg aacgctccgg 23820
aatcctgccc gccacctgct ccgcgctgcc ctcggacttc gtgccgctga ccttccgcga 23880
gtgccccccg ccgctgtgga gccactgcta cctgctgcgc ctggccaact acctggccta 23940
ccactcggac gtgatcgagg acgtcagcgg cgagggcctg ctcgagtgcc actgccgctg 24000
caacctctgc acgccgcacc gctccctggc ctgcaacccc cagctgctga gcgagaccca 24060
gatcatcggc accttcgagt tgcaagggcc cagcgaaggc gagggttcag ccgccaaggg 24120
gggtctgaaa ctcaccccgg ggctgtggac ctcggcctac ttgcgcaagt tcgtgcccga 24180
ggactaccat cccttcgaga tcaggttcta cgaggaccaa tcccatccgc ccaaggccga 24240
gctgtcggcc tgcgtcatca cccagggggc gatcctggcc caattgcaag ccatccagaa 24300
atcccgccaa gaattcttgc tgaaaaaggg ccgcggggtc tacctcgacc cccagaccgg 24360
tgaggagctc aaccccggct tcccccagga tgccccgagg aaacaagaag ctgaaagtgg 24420
agctgccgcc cgtggaggat ttggaggaag actgggagaa cagcagtcag gcagaggagg 24480
aggagatgga ggaagactgg gacagcactc aggcagagga ggacagcctg caagacagtc 24540
tggaggaaga cgaggaggag gcagaggagg aggtggaaga agcagccgcc gccagaccgt 24600
cgtcctcggc gggggagaaa gcaagcagca cggataccat ctccgctccg ggtcggggtc 24660
ccgctcgacc acacagtaga tgggacgaga ccggacgatt cccgaacccc accacccaga 24720
ccggtaagaa ggagcggcag ggatacaagt cctggcgggg gcacaaaaac gccatcgtct 24780
cctgcttgca ggcctgcggg ggcaacatct ccttcacccg gcgctacctg ctcttccacc 24840
gcggggtgaa ctttccccgc aacatcttgc attactaccg tcacctccac agcccctact 24900
acttccaaga agaggcagca gcagcagaaa aagaccagca gaaaaccagc agctagaaaa 24960
tccacagcgg cggcagcagg tggactgagg atcgcggcga acgagccggc gcaaacccgg 25020
gagctgagga accggatctt tcccaccctc tatgccatct tccagcagag tcgggggcag 25080
gagcaggaac tgaaagtcaa gaaccgttct ctgcgctcgc tcacccgcag ttgtctgtat 25140
cacaagagcg aagaccaact tcagcgcact ctcgaggacg ccgaggctct cttcaacaag 25200
tactgcgcgc tcactcttaa agagtagccc gcgcccgccc agtcgcagaa aaaggcggga 25260
attacgtcac ctgtgccctt cgccctagcc gcctccaccc atcatcatga gcaaagagat 25320
tcccacgcct tacatgtgga gctaccagcc ccagatgggc ctggccgccg gtgccgccca 25380
ggactactcc acccgcatga attggctcag cgccgggccc gcgatgatct cacgggtgaa 25440
tgacatccgc gcccaccgaa accagatact cctagaacag tcagcgctca ccgccacgcc 25500
ccgcaatcac ctcaatccgc gtaattggcc cgccgccctg gtgtaccagg aaattcccca 25560
gcccacgacc gtactacttc cgcgagacgc ccaggccgaa gtccagctga ctaactcagg 25620
tgtccagctg gcgggcggcg ccaccctgtg tcgtcaccgc cccgctcagg gtataaagcg 25680
gctggtgatc cggggcagag gcacacagct caacgacgag gtggtgagct cttcgctggg 25740
tctgcgacct gacggagtct tccaactcgc cggatcgggg agatcttcct tcacgcctcg 25800
tcaggccgtc ctgactttgg agagttcgtc ctcgcagccc cgctcgggtg gcatcggcac 25860
tctccagttc gtggaggagt tcactccctc ggtctacttc aaccccttct ccggctcccc 25920
cggccactac ccggacgagt tcatcccgaa cttcgacgcc atcagcgagt cggtggacgg 25980
ctacgattga aactaatcac ccccttatcc agtgaaataa agatcatatt gatgatgatt 26040
ttacagaaat aaaaaataat catttgattt gaaataaaga tacaatcata ttgatgattt 26100
gagtttaaca aaaaaataaa gaatcactta cttgaaatct gataccaggt ctctgtccat 26160
gttttctgcc aacaccactt cactcccctc ttcccagctc tggtactgca ggccccggcg 26220
ggctgcaaac ttcctccaca cgctgaaggg gatgtcaaat tcctcctgtc cctcaatctt 26280
cattttatct tctatcagat gtccaaaaag cgcgtccggg tggatgatga cttcgacccc 26340
gtctacccct acgatgcaga caacgcaccg accgtgccct tcatcaaccc ccccttcgtc 26400
tcttcagatg gattccaaga gaagcccctg ggggtgttgt ccctgcgact ggccgacccc 26460
gtcaccacca agaacgggga aatcaccctc aagctgggag agggggtgga cctcgattcc 26520
tcgggaaaac tcatctccaa cacggccacc aaggccgccg cccctctcag tttttccaac 26580
aacaccattt cccttaacat ggatcacccc ttttacacta aagatggaaa attatcctta 26640
caagtttctc caccattaaa tatactgaga acaagcattc taaacacact agctttaggt 26700
tttggatcag gtttaggact ccgtggctct gccttggcag tacagttagt ctctccactt 26760
acatttgata ctgatggaaa cataaagctt accttagaca gaggtttgca tgttacaaca 26820
ggagatgcaa ttgaaagcaa cataagctgg gctaaaggtt taaaatttga agatggagcc 26880
atagcaacca acattggaaa tgggttagag tttggaagca gtagtacaga aacaggtgtt 26940
gatgatgctt acccaatcca agttaaactt ggatctggcc ttagctttga cagtacagga 27000
gccataatgg ctggtaacaa agaagacgat aaactcactt tgtggacaac acctgatcca 27060
tcaccaaact gtcaaatact cgcagaaaat gatgcaaaac taacactttg cttgactaaa 27120
tgtggtagtc aaatactggc cactgtgtca gtcttagttg taggaagtgg aaacctaaac 27180
cccattactg gcaccgtaag cagtgctcag gtgtttctac gttttgatgc aaacggtgtt 27240
cttttaacag aacattctac actaaaaaaa tactgggggt ataggcaggg agatagcata 27300
gatggcactc catataccaa tgctgtagga ttcatgccca atttaaaagc ttatccaaag 27360
tcacaaagtt ctactactaa aaataatata gtagggcaag tatacatgaa tggagatgtt 27420
tcaaaaccta tgcttctcac tataaccctc aatggtactg atgacagcaa cagtacatat 27480
tcaatgtcat tttcatacac ctggactaat ggaagctatg ttggagcaac atttggggct 27540
aactcttata ccttctcata catcgcccaa gaatgaacac tgtatcccac cctgcatgcc 27600
aacccttccc accccactct gtggaacaaa ctctgaaaca caaaataaaa taaagttcaa 27660
gtgttttatt gattcaacag ttttacagga ttcgagcagt tatttttcct ccaccctccc 27720
aggacatgga atacaccacc ctctcccccc gcacagcctt gaacatctga atgccattgg 27780
tgatggacat gcttttggtc tccacgttcc acacagtttc agagcgagcc agtctcgggt 27840
cggtcaggga gatgaaaccc tccgggcact cccgcatctg cacctcacag ctcaacagct 27900
gaggattgtc ctcggtggtc gggatcacgg ttatctggaa gaagcagaag agcggcggtg 27960
ggaatcatag tccgcgaacg ggatcggccg gtggtgtcgc atcaggcccc gcagcagtcg 28020
ctgccgccgc cgctccgtca agctgctgct cagggggtcc gggtccaggg actccctcag 28080
catgatgccc acggccctca gcatcagtcg tctggtgcgg cgggcgcagc agcgcatgcg 28140
gatctcgctc aggtcgctgc agtacgtgca acacagaacc accaggttgt tcaacagtcc 28200
atagttcaac acgctccagc cgaaactcat cgcgggaagg atgctaccca cgtggccgtc 28260
gtaccagatc ctcaggtaaa tcaagtggtg ccccctccag aacacgctgc ccacgtacat 28320
gatctccttg ggcatgtggc ggttcaccac ctcccggtac cacatcaccc tctggttgaa 28380
catgcagccc cggatgatcc tgcggaacca cagggccagc accgccccgc ccgccatgca 28440
gcgaagagac cccgggtccc ggcaatggca atggaggacc caccgctcgt acccgtggat 28500
catctgggag ctgaacaagt ctatgttggc acagcacagg catatgctca tgcatctctt 28560
cagcactctc aactcctcgg gggtcaaaac catatcccag ggcacgggga actcttgcag 28620
gacagcgaac cccgcagaac agggcaatcc tcgcacagaa cttacattgt gcatggacag 28680
ggtatcgcaa tcaggcagca ccgggtgatc ctccaccaga gaagcgcggg tctcggtctc 28740
ctcacagcgt ggtaaggggg ccggccgata cgggtgatgg cgggacgcgg ctgatcgtgt 28800
tcgcgaccgt gtcatgatgc agttgctttc ggacattttc gtacttgctg tagcagaacc 28860
tggtccgggc gctgcacacc gatcgccggc ggcggtctcg gcgcttggaa cgctcggtgt 28920
tgaaattgta aaacagccac tctctcagac cgtgcagcag atctagggcc tcaggagtga 28980
tgaagatccc atcatgcctg atggctctga tcacatcgac caccgtggaa tgggccagac 29040
ccagccagat gatgcaattt tgttgggttt cggtgacggc gggggaggga agaacaggaa 29100
gaaccatgat taacttttaa tccaaacggt ctcggagtac ttcaaaatga agatcgcgga 29160
gatggcacct ctcgcccccg ctgtgttggt ggaaaataac agccaggtca aaggtgatac 29220
ggttctcgag atgttccacg gtggcttcca gcaaagcctc cacgcgcaca tccagaaaca 29280
agacaatagc gaaagcggga gggttctcta attcctcaat catcatgtta cactcctgca 29340
ccatccccag ataattttca tttttccagc cttgaatgat tcgaactagt tcctgaggta 29400
aatccaagcc agccatgata aagagctcgc gcagagcgcc ctccaccggc attcttaagc 29460
acaccctcat aattccaaga tattctgctc ctggttcacc tgcagcagat tgacaagcgg 29520
aatatcaaaa tctctgccgc gatccctgag ctcctccctc agcaataact gtaagtactc 29580
tttcatatcc tctccgaaat ttttagccat aggaccacca ggaataagat tagggcaagc 29640
cacagtacag ataaaccgaa gtcctcccca gtgagcattg ccaaatgcaa gactgctata 29700
agcatgctgg ctagacccgg tgatatcttc cagataactg gacagaaaat cgcccaggca 29760
atttttaaga aaatcaacaa aagaaaaatc ctccaggtgg acgtttagag cctcgggaac 29820
aacgatgaag taaatgcaag cggtgcgttc cagcatggtt agttagctga tctgtagaaa 29880
aaacaaaaat gaacattaaa ccatgctagc ctggcgaaca ggtgggtaaa tcgttctctc 29940
cagcaccagg caggccacgg ggtctccggc gcgaccctcg taaaaattgt cgctatgatt 30000
gaaaaccatc acagagagac gttcccggtg gccggcgtga atgattcgac aagatgaata 30060
cacccccgga acattggcgt ccgcgagtga aaaaaagcgc ccgaggaagc aataaggcac 30120
tacaatgctc agtctcaagt ccagcaaagc gatgccatgc ggatgaagca caaaattctc 30180
aggtgcgtac aaaatgtaat tactcccctc ctgcacaggc agcaaagccc ccgatccctc 30240
caggtacaca tacaaagcct cagcgtccat agcttaccga gcagcagcac acaacaggcg 30300
caagagtcag agaaaggctg agctctaacc tgtccacccg ctctctgctc aatatatagc 30360
ccagatctac actgacgtaa aggccaaagt ctaaaaatac ccgccaaata atcacacacg 30420
cccagcacac gcccagaaac cggtgacaca ctcaaaaaaa tacgcgcact tcctcaaacg 30480
cccaaaactg ccgtcatttc cgggttccca cgctacgtca tcaaaacacg actttcaaat 30540
tccgtcgacc gttaaaaacg tcacccgccc cgcccctaac ggtcgcccgt ctctcagcca 30600
atcagcgccc cgcatcccca aattcaaaca cctcatttgc atattaacgc gcacaaaaag 30660
tttgaggtat attattgatg atgg 30684

<210> 14
<211> 8602
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 14
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gactctagaa tagtctttaa 7560
ttaaagtccg ccatatgagg ccaccatgca gatcttcgtg aagaccctga ccggcaagac 7620
catcacccta gaggtggagc ccagtgacac catcgagaac gtgaaggcca agatccagga 7680
taaagagggc atcccccctg accagcagag gctgatcttt gccggcaagc agctggaaga 7740
tggccgcacc ctctctgatt acaacatcca gaaggagtca accctgcacc tggtccttcg 7800
cctgagaggt ggcgctgctt acagtataat caactttgaa aaactggctg cttacggcat 7860
cctgggcttt gtgtttacac tggctgccta cctgctgttt ggctatcctg tgtacgtggc 7920
cgcttatgga ctgtgtaccc tggtggccat gctggctgct tacaatctgg tgcctatggt 7980
ggccacagtg gccgcctatt gtcttggcgg actgctgaca atggtggcag cctacagccc 8040
gagctatgcg tatcatcagt ttgcagccta cggcccagga ccaggcgcta aatttgtggc 8100
tgcctggaca ctgaaagccg ccgctggacc aggtcctgga cagtacatca aggccaacag 8160
caagttcatc ggcatcaccg aactcggccc aggaccaggc tatccctacg atgtgcctga 8220
ttacgcctga tagtgatgat tcgaacggcc gtatcacgcc caaacattta cagccgcggt 8280
gtcaaaaacc gcgtggacgt ggttaacatc cctgctggga ggatcagccg taattattat 8340
aattggcttg gtgctggcta ctattgtggc catgtacgtg ctgaccaacc agaaacataa 8400
ttgaatacag cagcaattgg caagctgctt acatagaact cgcggcgatt ggcatgccgc 8460
cttaaaattt ttattttatt ttttcttttc ttttccgaat cggattttgt ttttaatatt 8520
tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 8602

<210> 15
<211> 9595
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 15
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300
gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360
aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420
ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480
aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540
ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600
agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660
cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720
ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780
ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840
tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900
tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960
cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020
tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080
tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140
tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200
tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260
ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320
acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380
atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440
caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500
acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560
tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620
tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680
aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740
ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800
taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860
tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920
ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980
gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040
aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100
ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160
cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220
gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280
aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340
ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400
ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460
ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520
tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580
gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640
cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700
aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760
aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820
ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880
tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940
taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000
cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060
agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120
tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180
cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240
gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300
cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360
cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420
gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480
tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540
gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600
tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660
tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720
agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780
tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840
gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900
cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960
acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020
aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080
gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140
tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200
tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260
cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320
acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380
acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440
cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500
ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560
atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620
caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680
atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740
tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800
aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860
gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920
tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980
caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040
acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100
cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160
aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220
aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280
ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340
gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400
gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460
gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520
caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580
ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640
ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700
catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760
cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820
tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880
acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940
ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000
tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060
cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120
ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180
ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240
ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300
ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360
cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420
ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480
aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540
taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600
aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660
cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720
acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780
tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840
acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900
tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960
aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020
tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080
cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140
acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200
aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260
gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320
aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380
gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440
tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500
gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gactctagaa tagtctttaa 7560
ttaaagtccg ccatatgaga tggaagatgc caaaaacatt aagaagggcc cagcgccatt 7620
ctacccactc gaagacggga ccgccggcga gcagctgcac aaagccatga agcgctacgc 7680
cctggtgccc ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc 7740
cgagtacttc gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac 7800
aaaccatcgg atcgtggtgt gcagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc ccgtgttggg 7860
tgccctgttc atcggtgtgg ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg agcgcgagct 7920
gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca 7980
aaagatcctc aacgtgcaaa agaagctacc gatcatacaa aagatcatca tcatggatag 8040
caagaccgac taccagggct tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc 8100
cggcttcaac gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct 8160
gatcatgaac agtagtggca gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac cgcaccgcac 8220
cgcttgtgtc cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga 8280
caccgctatc ctcagcgtgg tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca ccacgctggg 8340
ctacttgatc tgcggctttc gggtcgtgct catgtaccgc ttcgaggagg agctattctt 8400
gcgcagcttg caagactata agattcaatc tgccctgctg gtgcccacac tatttagctt 8460
cttcgctaag agcactctca tcgacaagta cgacctaagc aacttgcacg agatcgccag 8520
cggcggggcg ccgctcagca aggaggtagg tgaggccgtg gccaaacgct tccacctacc 8580
aggcatccgc cagggctacg gcctgacaga aacaaccagc gccattctga tcacccccga 8640
aggggacgac aagcctggcg cagtaggcaa ggtggtgccc ttcttcgagg ctaaggtggt 8700
ggacttggac accggtaaga cactgggtgt gaaccagcgc ggcgagctgt gcgtccgtgg 8760
ccccatgatc atgagcggct acgttaacaa ccccgaggct acaaacgctc tcatcgacaa 8820
ggacggctgg ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac gaggacgagc acttcttcat 8880
cgtggaccgg ctgaagagcc tgatcaaata caagggctac caggtagccc cagccgaact 8940
ggagagcatc ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc ggggtcgccg gcctgcccga 9000
cgacgatgcc ggcgagctgc ccgccgcagt cgtcgtgctg gaacacggta aaaccatgac 9060
cgagaaggag atcgtggact atgtggccag ccaggttaca accgccaaga agctgcgcgg 9120
tggtgttgtg ttcgtggacg aggtgcctaa aggactgacc ggcaagttgg acgcccgcaa 9180
gatccgcgag attctcatta aggccaagaa gggcggcaag atcgccgtgt aattcgaacg 9240
gccgtatcac gcccaaacat ttacagccgc ggtgtcaaaa accgcgtgga cgtggttaac 9300
atccctgctg ggaggatcag ccgtaattat tataattggc ttggtgctgg ctactattgt 9360
ggccatgtac gtgctgacca accagaaaca taattgaata cagcagcaat tggcaagctg 9420
cttacataga actcgcggcg attggcatgc cgccttaaaa tttttatttt attttttctt 9480
ttcttttccg aatcggattt tgtttttaat atttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 9595

<210> 16
<211> 139
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
1 5 10 15
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
85 90 95
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
100 105 110
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
115 120 125
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135

<210> 17
<211> 167
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn
35 40 45
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
50 55 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165

<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10

<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 19
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15

<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 20
Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15

<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp
1 5 10

<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 22
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5

<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 23
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5

<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 26
Arg Tyr Trp Met Ser
1 5

<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly

<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr
1 5 10

<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10

<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5

<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr
1 5

<210> 32
<211> 2019
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 32
gcccgggcat ttaaatgcga tcgcatcgat tacgactcta gaatagtcta gtccgcaggc 60
caccatgcag atcttcgtga agaccctgac cggcaagacc atcaccctag aggtggagcc 120
cagtgacacc atcgagaacg tgaaggccaa gatccaggat aaagagggca tcccccctga 180
ccagcagagg ctgatctttg ccggcaagca gctggaagat ggccgcaccc tctctgatta 240
caacatccag aaggagtcaa ccctgcacct ggtccttcgc ctgagaggtg ccatgtttca 300
ggcgctgagc gaaggctgca ccccgtatga tattaaccag atgctgaacg tgctgggcga 360
tcatcaggtc tcaggccttg agcagcttga gagtataatc aactttgaaa aactgactga 420
atggaccagt tctaatgtta tgcctatcct gtctcctctg acaaagggca tcctgggctt 480
cgtgtttacc ctgaccgtgc cttctgagag aggacttagc tgcattagcg aagcggatgc 540
gaccaccccg gaaagcgcga acctgggcga agaaattctg agccagctgt atctttggcc 600
aagggtgacc taccattccc ctagttatgc ttaccaccaa tttgaaagac gagccaaata 660
taaaagacac ttccccggct ttggccagag cctgctgttt ggctaccctg tgtacgtgtt 720
cggcgattgc gtgcagggcg attgggatgc gattcgcttt cgctattgcg cgccgccggg 780
ctatgcgctg ctgcgctgca acgataccaa ctatagcgct ctgctggctg tgggggccct 840
agaaggaccc aggaatcagg actggcttgg tgtcccaaga caacttgtaa ctcggatgca 900
ggctattcag aatgccggcc tgtgtaccct ggtggccatg ctggaagaga caatcttctg 960
gctgcaagcg tttctgatgg cgctgaccga tagcggcccg aaaaccaaca ttattgtgga 1020
tagccagtat gtgatgggca ttagcaaacc gagctttcag gaatttgtgg attgggaaaa 1080
cgtgagcccg gaactgaaca gcaccgatca gccgttttgg caagccggaa tcctggccag 1140
aaatctggtg cctatggtgg ccacagtgca gggccagaac ctgaagtacc agggtcagtc 1200
actagtcatc tctgcttcta tcattgtctt caacctgctg gaactggaag gtgattatcg 1260
agatgatggc aacgtgtggg tgcatacccc gctgagcccg cgcaccctga acgcgtgggt 1320
gaaagcggtg gaagaaaaaa aaggtattcc agttcaccta gagctggcca gtatgaccaa 1380
catggagctc atgagcagta ttgtgcatca gcaggtcaga acatacggcc ccgtgttcat 1440
gtgtctcggc ggactgctta caatggtggc tggtgctgtg tggctgacag tgcgagtgct 1500
cgagctgttc cgggccgcgc agctggccaa cgacgtggtc ctccagatca tggagctttg 1560
tggtgcagcg tttcgccagg tgtgccatac caccgtgccg tggccgaacg cgagcctgac 1620
cccgaaatgg aacaacgaaa ccacccagcc ccagatcgcc aactgcagcg tgtatgactt 1680
ttttgtgtgg ctccattatt attctgttcg agacacactt tggccaaggg tgacctacca 1740
tatgaacaaa tatgcgtatc atatgctgga aagacgagcc aaatataaaa gaggaccagg 1800
acctggcgct aaatttgtgg ccgcctggac actgaaagcc gctgctggtc ctggacctgg 1860
ccagtacatc aaggccaaca gcaagttcat cggcatcacc gaactcggac ccggaccagg 1920
ctgatgattt cgaaatttaa ataagcttgc ggccgctagg gataacaggg taattatcac 1980
gcccaaacat ttacagccgc ggtgtcaaaa accgcgtgg 2019

<210> 33
<211> 619
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 33
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Met Phe Gln Ala
65 70 75 80
Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Val
85 90 95
Leu Gly Asp His Gln Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile
100 105 110
Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Pro Ile
115 120 125
Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr
130 135 140
Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Ser Cys Ile Ser Glu Ala Asp Ala Thr
145 150 155 160
Thr Pro Glu Ser Ala Asn Leu Gly Glu Glu Ile Leu Ser Gln Leu Tyr
165 170 175
Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln
180 185 190
Phe Glu Arg Arg Ala Lys Tyr Lys Arg His Phe Pro Gly Phe Gly Gln
195 200 205
Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln
210 215 220
Gly Asp Trp Asp Ala Ile Arg Phe Arg Tyr Cys Ala Pro Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Ala Leu Leu Arg Cys Asn Asp Thr Asn Tyr Ser Ala Leu Leu Ala Val
245 250 255
Gly Ala Leu Glu Gly Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg
260 265 270
Gln Leu Val Thr Arg Met Gln Ala Ile Gln Asn Ala Gly Leu Cys Thr
275 280 285
Leu Val Ala Met Leu Glu Glu Thr Ile Phe Trp Leu Gln Ala Phe Leu
290 295 300
Met Ala Leu Thr Asp Ser Gly Pro Lys Thr Asn Ile Ile Val Asp Ser
305 310 315 320
Gln Tyr Val Met Gly Ile Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp
325 330 335
Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Trp
340 345 350
Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Gly Gln Ser Leu Val Ile Ser Ala
370 375 380
Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu Leu Glu Gly Asp Tyr Arg Asp
385 390 395 400
Asp Gly Asn Val Trp Val His Thr Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn
405 410 415
Ala Trp Val Lys Ala Val Glu Glu Lys Lys Gly Ile Pro Val His Leu
420 425 430
Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile Val His
435 440 445
Gln Gln Val Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu
450 455 460
Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Arg Val Leu Glu
465 470 475 480
Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met
485 490 495
Glu Leu Cys Gly Ala Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro
500 505 510
Trp Pro Asn Ala Ser Leu Thr Pro Lys Trp Asn Asn Glu Thr Thr Gln
515 520 525
Pro Gln Ile Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His
530 535 540
Tyr Tyr Ser Val Arg Asp Thr Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Met
545 550 555 560
Asn Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu Glu Arg Arg Ala Lys Tyr Lys Arg
565 570 575
Gly Pro Gly Pro Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala
580 585 590
Ala Ala Gly Pro Gly Pro Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
595 600 605
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Gly Pro Gly
610 615

<210> 34
<211> 1638
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 34
atggccggga tgttccaggc actgtccgaa ggctgcacac cctatgatat taaccagatg 60
ctgaatgtcc tgggagacca ccaggtctct ggcctggagc agctggagag catcatcaac 120
ttcgagaagc tgaccgagtg gacaagctcc aatgtgatgc ctatcctgtc cccactgacc 180
aagggcatcc tgggcttcgt gtttaccctg acagtgcctt ctgagcgggg cctgtcttgc 240
atcagcgagg cagacgcaac cacaccagag tccgccaatc tgggcgagga gatcctgtct 300
cagctgtacc tgtggccccg ggtgacatat cactcccctt cttacgccta tcaccagttc 360
gagcggagag ccaagtacaa gagacacttc ccaggctttg gccagtctct gctgttcggc 420
taccccgtgt acgtgttcgg cgattgcgtg cagggcgact gggatgccat ccggtttaga 480
tactgcgcac cacctggata tgcactgctg aggtgtaacg acaccaatta ttccgccctg 540
ctggcagtgg gcgccctgga gggccctcgc aatcaggatt ggctgggcgt gccaaggcag 600
ctggtgacac gcatgcaggc catccagaac gcaggcctgt gcaccctggt ggcaatgctg 660
gaggagacaa tcttctggct gcaggccttt ctgatggccc tgaccgacag cggccccaag 720
acaaacatca tcgtggattc ccagtacgtg atgggcatct ccaagccttc tttccaggag 780
tttgtggact gggagaacgt gagcccagag ctgaattcca ccgatcagcc attctggcag 840
gcaggaatcc tggcaaggaa cctggtgcct atggtggcca cagtgcaggg ccagaatctg 900
aagtaccagg gccagagcct ggtcatcagc gcctccatca tcgtgtttaa cctgctggag 960
ctggagggcg actatcggga cgatggcaac gtgtgggtgc acaccccact gagccccaga 1020
acactgaacg cctgggtgaa ggccgtggag gagaagaagg gcatcccagt gcacctggag 1080
ctggcctcca tgaccaatat ggagctgatg tctagcatcg tgcaccagca ggtgaggaca 1140
tacggacccg tgttcatgtg cctgggaggc ctgctgacca tggtggcagg agccgtgtgg 1200
ctgacagtgc gggtgctgga gctgttcaga gccgcccagc tggccaacga tgtggtgctg 1260
cagatcatgg agctgtgcgg agcagccttt cgccaggtgt gccacaccac agtgccatgg 1320
cccaatgcct ccctgacccc caagtggaac aatgagacaa cacagcctca gatcgccaac 1380
tgtagcgtgt acgacttctt cgtgtggctg cactactata gcgtgaggga taccctgtgg 1440
ccccgcgtga cataccacat gaataagtac gcctatcaca tgctggagag gcgcgccaag 1500
tataagagag gccctggccc aggcgcaaag tttgtggcag catggaccct gaaggccgcc 1560
gccggccccg gccccggcca gtatatcaag gctaacagta agttcattgg aatcacagag 1620
ctgggacccg gacctgga 1638

<210> 35
<211> 546
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 35
Met Ala Gly Met Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp
1 5 10 15
Ile Asn Gln Met Leu Asn Val Leu Gly Asp His Gln Val Ser Gly Leu
20 25 30
Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr
35 40 45
Ser Ser Asn Val Met Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu
50 55 60
Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Ser Cys
65 70 75 80
Ile Ser Glu Ala Asp Ala Thr Thr Pro Glu Ser Ala Asn Leu Gly Glu
85 90 95
Glu Ile Leu Ser Gln Leu Tyr Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Ser
100 105 110
Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe Glu Arg Arg Ala Lys Tyr Lys Arg
115 120 125
His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr
130 135 140
Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Asp Ala Ile Arg Phe Arg
145 150 155 160
Tyr Cys Ala Pro Pro Gly Tyr Ala Leu Leu Arg Cys Asn Asp Thr Asn
165 170 175
Tyr Ser Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Leu Glu Gly Pro Arg Asn Gln
180 185 190
Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Gln Leu Val Thr Arg Met Gln Ala Ile
195 200 205
Gln Asn Ala Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu Glu Glu Thr Ile
210 215 220
Phe Trp Leu Gln Ala Phe Leu Met Ala Leu Thr Asp Ser Gly Pro Lys
225 230 235 240
Thr Asn Ile Ile Val Asp Ser Gln Tyr Val Met Gly Ile Ser Lys Pro
245 250 255
Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn
260 265 270
Ser Thr Asp Gln Pro Phe Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu
275 280 285
Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Gly
290 295 300
Gln Ser Leu Val Ile Ser Ala Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Glu Gly Asp Tyr Arg Asp Asp Gly Asn Val Trp Val His Thr Pro
325 330 335
Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Ala Val Glu Glu Lys
340 345 350
Lys Gly Ile Pro Val His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu
355 360 365
Leu Met Ser Ser Ile Val His Gln Gln Val Arg Thr Tyr Gly Pro Val
370 375 380
Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp
385 390 395 400
Leu Thr Val Arg Val Leu Glu Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn
405 410 415
Asp Val Val Leu Gln Ile Met Glu Leu Cys Gly Ala Ala Phe Arg Gln
420 425 430
Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp Pro Asn Ala Ser Leu Thr Pro Lys
435 440 445
Trp Asn Asn Glu Thr Thr Gln Pro Gln Ile Ala Asn Cys Ser Val Tyr
450 455 460
Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr Ser Val Arg Asp Thr Leu Trp
465 470 475 480
Pro Arg Val Thr Tyr His Met Asn Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu Glu
485 490 495
Arg Arg Ala Lys Tyr Lys Arg Gly Pro Gly Pro Gly Ala Lys Phe Val
500 505 510
Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Gly Gln Tyr
515 520 525
Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Gly
530 535 540
Pro Gly
545

<210> 36
<211> 2019
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 36
gcccgggcat ttaaatgcga tcgcatcgat tacgactcta gaatagtcta gtccgcaggc 60
caccatgcag atcttcgtga agaccctgac cggcaagacc atcaccctag aggtggagcc 120
cagtgacacc atcgagaacg tgaaggccaa gatccaggat aaagagggca tcccccctga 180
ccagcagagg ctgatctttg ccggcaagca gctggaagat ggccgcaccc tctctgatta 240
caacatccag aaggagtcaa ccctgcacct ggtccttcgc ctgagaggtg ccatgtttca 300
ggcgctgagc gaaggctgca ccccgtatga tattaaccag atgctgaacg tgctgggcga 360
tcatcagttt aagcacatca aagcctttga ccggacattt gctaacaacc caggtcccat 420
ggttgtgttt gccacacctg ggcctatcct gtctcctctg acaaagggca tcctgggctt 480
cgtgtttacc ctgaccgtgc cttctgagag aggacttagc tgcattagcg aagcggatgc 540
gaccaccccg gaaagcgcga acctgggcga agaaattctg agccagctgt atctttggcc 600
aagggtgacc taccattccc ctagttatgc ttaccaccaa tttgaaagac gagccaaata 660
taaaagacac ttccccggct ttggccagag cctgctgttt ggctaccctg tgtacgtgtt 720
cggcgattgc gtgcagggcg attgggatgc gattcgcttt cgctattgcg cgccgccggg 780
ctatgcgctg ctgcgctgca acgataccaa ctatagcgct ctgctggctg tgggggccct 840
agaaggaccc aggaatcagg actggcttgg tgtcccaaga caacttgtaa ctcggatgca 900
ggctattcag aatgccggcc tgtgtaccct ggtggccatg ctggaagaga caatcttctg 960
gctgcaagcg tttctgatgg cgctgaccga tagcggcccg aaaaccaaca ttattgtgga 1020
tagccagtat gtgatgggca ttagcaaacc gagctttcag gaatttgtgg attgggaaaa 1080
cgtgagcccg gaactgaaca gcaccgatca gccgttttgg caagccggaa tcctggccag 1140
aaatctggtg cctatggtgg ccacagtgca gggccagaac ctgaagtacc agggtcagtc 1200
actagtcatc tctgcttcta tcattgtctt caacctgctg gaactggaag gtgattatcg 1260
agatgatggc aacgtgtggg tgcatacccc gctgagcccg cgcaccctga acgcgtgggt 1320
gaaagcggtg gaagaaaaaa aaggtattcc agttcaccta gagctggcca gtatgaccaa 1380
catggagctc atgagcagta ttgtgcatca gcaggtcaga acatacggcc ccgtgttcat 1440
gtgtctcggc ggactgctta caatggtggc tggtgctgtg tggctgacag tgcgagtgct 1500
cgagctgttc cgggccgcgc agctggccaa cgacgtggtc ctccagatca tggagctttg 1560
tggtgcagcg tttcgccagg tgtgccatac caccgtgccg tggccgaacg cgagcctgac 1620
cccgaaatgg aacaacgaaa ccacccagcc ccagatcgcc aactgcagcg tgtatgactt 1680
ttttgtgtgg ctccattatt attctgttcg agacacactt tggccaaggg tgacctacca 1740
tatgaacaaa tatgcgtatc atatgctgga aagacgagcc aaatataaaa gaggaccagg 1800
acctggcgct aaatttgtgg ccgcctggac actgaaagcc gctgctggtc ctggacctgg 1860
ccagtacatc aaggccaaca gcaagttcat cggcatcacc gaactcggac ccggaccagg 1920
ctgatgattt cgaaatttaa ataagcttgc ggccgctagg gataacaggg taattatcac 1980
gcccaaacat ttacagccgc ggtgtcaaaa accgcgtgg 2019

<210> 37
<211> 619
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 37
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Met Phe Gln Ala
65 70 75 80
Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Val
85 90 95
Leu Gly Asp His Gln Phe Lys His Ile Lys Ala Phe Asp Arg Thr Phe
100 105 110
Ala Asn Asn Pro Gly Pro Met Val Val Phe Ala Thr Pro Gly Pro Ile
115 120 125
Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr
130 135 140
Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Ser Cys Ile Ser Glu Ala Asp Ala Thr
145 150 155 160
Thr Pro Glu Ser Ala Asn Leu Gly Glu Glu Ile Leu Ser Gln Leu Tyr
165 170 175
Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln
180 185 190
Phe Glu Arg Arg Ala Lys Tyr Lys Arg His Phe Pro Gly Phe Gly Gln
195 200 205
Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln
210 215 220
Gly Asp Trp Asp Ala Ile Arg Phe Arg Tyr Cys Ala Pro Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Ala Leu Leu Arg Cys Asn Asp Thr Asn Tyr Ser Ala Leu Leu Ala Val
245 250 255
Gly Ala Leu Glu Gly Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg
260 265 270
Gln Leu Val Thr Arg Met Gln Ala Ile Gln Asn Ala Gly Leu Cys Thr
275 280 285
Leu Val Ala Met Leu Glu Glu Thr Ile Phe Trp Leu Gln Ala Phe Leu
290 295 300
Met Ala Leu Thr Asp Ser Gly Pro Lys Thr Asn Ile Ile Val Asp Ser
305 310 315 320
Gln Tyr Val Met Gly Ile Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp
325 330 335
Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Trp
340 345 350
Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Gly Gln Ser Leu Val Ile Ser Ala
370 375 380
Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu Leu Glu Gly Asp Tyr Arg Asp
385 390 395 400
Asp Gly Asn Val Trp Val His Thr Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn
405 410 415
Ala Trp Val Lys Ala Val Glu Glu Lys Lys Gly Ile Pro Val His Leu
420 425 430
Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile Val His
435 440 445
Gln Gln Val Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu
450 455 460
Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Arg Val Leu Glu
465 470 475 480
Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met
485 490 495
Glu Leu Cys Gly Ala Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro
500 505 510
Trp Pro Asn Ala Ser Leu Thr Pro Lys Trp Asn Asn Glu Thr Thr Gln
515 520 525
Pro Gln Ile Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His
530 535 540
Tyr Tyr Ser Val Arg Asp Thr Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Met
545 550 555 560
Asn Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu Glu Arg Arg Ala Lys Tyr Lys Arg
565 570 575
Gly Pro Gly Pro Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala
580 585 590
Ala Ala Gly Pro Gly Pro Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
595 600 605
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Gly Pro Gly
610 615

<210> 38
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 38
atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ccctagaggt ggagcccagt 60
gacaccatcg agaacgtgaa ggccaagatc caggataaag agggcatccc ccctgaccag 120
cagaggctga tctttgccgg caagcagctg gaagatggcc gcaccctctc tgattacaac 180
atccagaagg agtcaaccct gcacctggtc cttcgcctga gaggtggc 228

<210> 39
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 39
atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ccctagaggt ggagcccagt 60
gacaccatcg agaacgtgaa ggccaagatc caggataaag agggcatccc ccctgaccag 120
cagaggctga tctttgccgg caagcagctg gaagatggcc gcaccctctc tgattacaac 180
atccagaagg agtcaaccct gcacctggtc cttcgcctga gaggtgcc 228

<210> 40
<211> 78
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc 60
cagacctggg cgggctct 78

<210> 41
<211> 201
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
ccgtcttccc agcccaccat ccccatcgtg ggcatcattg ctggcctggt tctctttgga 60
gctgtgatca ctggagctgt ggtcgctgct gtgatgtgga ggaggaagag ctcagataga 120
aaaggaggga gctactctca ggctgcaagc agtgacagtg cccagggctc tgatgtgtct 180
ctcacagctt gtaaagtgtg a 201

<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 42
atggagaccg atacactgct gctgtgggtg ctgctcctgt gggtgccagg aagcacaggc 60

<210> 43
<211> 3178
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
ggcaccgatt cggggcctgc ccggacttcg ccgcacgctg cagaacctcg cccagcgccc 60
accatgcccc ggcagctcag cgcggcggcc gcgctcttcg cgtccctggc cgtaattttg 120
cacgatggca gtcaaatgag agcaaaagca tttccagaaa ccagagatta ttctcaacct 180
actgcagcag caacagtaca ggacataaaa aaacctgtcc agcaaccagc taagcaagca 240
cctcaccaaa ctttagcagc aagattcatg gatggtcata tcacctttca aacagcggcc 300
acagtaaaaa ttccaacaac taccccagca actacaaaaa acactgcaac caccagccca 360
attacctaca ccctggtcac aacccaggcc acacccaaca actcacacac agctcctcca 420
gttactgaag ttacagtcgg ccctagctta gccccttatt cactgccacc caccatcacc 480
ccaccagctc atacagctgg aaccagttca tcaaccgtca gccacacaac tgggaacacc 540
actcaaccca gtaaccagac cacccttcca gcaactttat cgatagcact gcacaaaagc 600
acaaccggtc agaagcctga tcaacccacc catgccccag gaacaacggc agctgcccac 660
aataccaccc gcacagctgc acctgcctcc acggttcctg ggcccaccct tgcacctcag 720
ccatcgtcag tcaagactgg aatttatcag gttctaaacg gaagcagact ctgtataaaa 780
gcagagatgg ggatacagct gattgttcaa gacaaggagt cggttttttc acctcggaga 840
tacttcaaca tcgaccccaa cgcaacgcaa gcctctggga actgtggcac ccgaaaatcc 900
aaccttctgt tgaattttca gggcggattt gtgaatctca catttaccaa ggatgaagaa 960
tcatattata tcagtgaagt gggagcctat ttgaccgtct cagatccaga gacagtttac 1020
caaggaatca aacatgcggt ggtgatgttc cagacagcag tcgggcattc cttcaagtgc 1080
gtgagtgaac agagcctcca gttgtcagcc cacctgcagg tgaaaacaac cgatgtccaa 1140
cttcaagcct ttgattttga agatgaccac tttggaaatg tggatgagtg ctcgtctgac 1200
tacacaattg tgcttcctgt gattggggcc atcgtggttg gtctctgcct tatgggtatg 1260
ggtgtctata aaatccgcct aaggtgtcaa tcatctggat accagagaat ctaattgttg 1320
cccgggggga atgaaaataa tggaatttag agaactcttt catcccttcc aggatggatg 1380
ttgggaaatt ccctcagagt gtgggtcctt caaacaatgt aaaccaccat cttctattca 1440
aatgaagtga gtcatgtgtg atttaagttc aggcagcaca tcaatttcta aatacttttt 1500
gtttatttta tgaaagatat agtgagctgt ttattttcta gtttccttta gaatatttta 1560
gccactcaaa gtcaacattt gagatatgtt gaattaacat aatatatgta aagtagaata 1620
agccttcaaa ttataaacca agggtcaatt gtaactaata ctactgtgtg tgcattgaag 1680
attttatttt acccttgatc ttaacaaagc ctttgctttg ttatcaaatg gactttcagt 1740
gcttttacta tctgtgtttt atggtttcat gtaacataca tattcctggt gtagcactta 1800
actccttttc cactttaaat ttgtttttgt tttttgagac ggagtttcac tcttgtcacc 1860
caggctggag tacagtggca cgatctcggc ttatggcaac ctccgcctcc cgggttcaag 1920
tgattctcct gcttcagctt cccgagtagc tgggattaca ggcacacact accacgcctg 1980
gctaattttt gtatttttat tatagacggg tttcaccatg ttggccagac tggtcttgaa 2040
ctcttgacct caggtgatcc acccacctca gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcatg 2100
agccattgcg cccggcctta aatgtttttt ttaatcatca aaaagaacaa catatctcag 2160
gttgtctaag tgtttttatg taaaaccaac aaaaagaaca aatcagctta tattttttat 2220
cttgatgact cctgctccag aattgctaga ctaagaatta ggtggctaca gatggtagaa 2280
ctaaacaata agcaagagac aataataatg gcccttaatt attaacaaag tgccagagtc 2340
taggctaagc actttatcta tatctcattt cattctcaca acttataagt gaatgagtaa 2400
actgagactt aagggaactg aatcacttaa atgtcacctg gctaactgat ggcagagcca 2460
gagcttgaat tcatgttggt ctgacatcaa ggtctttggt cttctcccta caccaagtta 2520
cctacaagaa caatgacacc acactctgcc tgaaggctca cacctcatac cagcatacgc 2580
tcaccttaca gggaaatggg tttatccagg atcatgagac attagggtag atgaaaggag 2640
agctttgcag ataacaaaat agcctatcct taataaatcc tccactctct ggaaggagac 2700
tgaggggctt tgtaaaacat tagtcagttg ctcattttta tgggattgct tagctgggct 2760
gtaaagatga aggcatcaaa taaactcaaa gtatttttaa atttttttga taatagagaa 2820
acttcgctaa ccaactgttc tttcttgagt gtatagcccc atcttgtggt aacttgctgc 2880
ttctgcactt catatccata tttcctattg ttcactttat tctgtagagc agcctgccaa 2940
gaattttatt tctgctgttt tttttgctgc taaagaaagg aactaagtca ggatgttaac 3000
agaaaagtcc acataaccct agaattctta gtcaaggaat aattcaagtc agcctagaga 3060
ccatgttgac tttcctcatg tgtttcctta tgactcagta agttggcaag gtcctgactt 3120
tagtcttaat aaaacattga attgtagtaa aggtttttgc aataaaaact tactttgg 3178

<210> 44
<211> 1858
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 44
attccggagg tgaaaaacaa tggcacaacg tgtataatgg ccagcttctc tgcctccttt 60
ctgaccacct acgagactgc gaatggttct cagatcgtga acatttccct gccagcctct 120
gcagaagtac tgaaaaatgg cagttcttgt ggtaaagaaa atgtttctga ccccagcctc 180
acaattactt ttggaagagg atatttactg acactcaact tcacaaaaaa tacaacacgt 240
tacagtgtcc agcatatgta ttttacatat aacttgtcag atacagaaca ttttcccaat 300
gccatcagca aagagatcta caccatggat tccacaactg acatcaaggc agacatcaac 360
aaagcatacc ggtgtgtcag tgatatccgg gtctacatga agaatgtgac cgttgtgctc 420
cgggatgcca ctatccaggc ctacctgtcg agtggcaact tcagcaagga agagacacac 480
tgcacacagg atggaccttc cccaaccact gggccaccca gcccctcacc accacttgtg 540
cccacaaacc ccactgtatc caagtacaat gttactggta acaacggaac ctgcctgctg 600
gcctctatgg cactgcaact gaatatcacc tacctgaaaa aggacaacaa gacggtgacc 660
agagcgttca acatcagccc aaatgacaca tctagtggga gttgcggtat caacttggtg 720
accctgaaag tggagaacaa gaacagagcc ctggaattgc agtttgggat gaatgccagc 780
tctagcctgt ttttcttgca aggagtgcgc ttgaatatga ctcttcctga tgccctagtg 840
cccacattca gcatctccaa ccattcactg aaagctcttc aggccactgt gggaaactca 900
tacaagtgca acactgagga acacatcttt gtcagcaaga tgctctccct caatgtcttc 960
agtgtgcagg tccaggcttt caaggtggac agtgacaggt ttgggtctgt ggaagagtgt 1020
gttcaggatg gtaacaacat gttgatcccc attgctgtgg gcggtgccct ggcagggctg 1080
atcctcatcg tcctcattgc ctacctcatt ggcaggaaga ggagtcacgc cggctatcag 1140
accatctagc ctggtgggca ggtgcaccag agatgcacag gggcctgttc tcacatcccc 1200
aagcttagat aggtgtggaa gggaggcaca ctttctggca aactgtttta aaatctgctt 1260
tatcaaatgt gaagttcatc ttgcaacatt tactatgcac aaaggaataa ctattgaaat 1320
gacggtgtta attttgctaa ctgggttaaa tattgatgag aaggctccac tgatttgact 1380
tttaagactt ggtgtttggt tcttcattct tttactcaga tttaagccta tcaaagggat 1440
actctggtcc agaccttggc ctggcaaggg tggctgatgg ttaggctgca cacacttaag 1500
aagcaacggg agcagggaag gcttgcacac aggcacgcac agggtcaacc tctggacact 1560
tggcttgggc tacctggcct tgggggggct gaactctggc atctggctgg gtacacaccc 1620
ccccaatttc tgtgctctgc cacccgtgag ctgccacttt cctaaataga aaatggcatt 1680
atttttattt acttttttgt aaagtgattt ccagtcttgt gttggcgttc agggtggccc 1740
tgtctctgca ctgtgtacaa taatagattc acactgctga cgtgtcttgc agcgtaggtg 1800
ggttgtacac tgggcatcag ctcacgtaat gcattgcctg taacgatgct aataaaaa 1858

<210> 45
<211> 2339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
ggcccaaccg ccgcccgcgc ccccgctctc cgcaccgtac ccggccgcct cgcgccatgg 60
cggcccccgg cagcgcccgg cgacccctgc tgctgctact gctgttgctg ctgctcggcc 120
tcatgcattg tgcgtcagca gcaatgttta tggtgaaaaa tggcaacggg accgcgtgca 180
taatggccaa cttctctgct gccttctcag tgaactacga caccaagagt ggccctaaga 240
acatgacctt tgacctgcca tcagatgcca cagtggtgct caaccgcagc tcctgtggaa 300
aagagaacac ttctgacccc agtctcgtga ttgcttttgg aagaggacat acactcactc 360
tcaatttcac gagaaatgca acacgttaca gcgtccagct catgagtttt gtttataact 420
tgtcagacac acaccttttc cccaatgcga gctccaaaga aatcaagact gtggaatcta 480
taactgacat cagggcagat atagataaaa aatacagatg tgttagtggc acccaggtcc 540
acatgaacaa cgtgaccgta acgctccatg atgccaccat ccaggcgtac ctttccaaca 600
gcagcttcag caggggagag acacgctgtg aacaagacag gccttcccca accacagcgc 660
cccctgcgcc acccagcccc tcgccctcac ccgtgcccaa gagcccctct gtggacaagt 720
acaacgtgag cggcaccaac gggacctgcc tgctggccag catggggctg cagctgaacc 780
tcacctatga gaggaaggac aacacgacgg tgacaaggct tctcaacatc aaccccaaca 840
agacctcggc cagcgggagc tgcggcgccc acctggtgac tctggagctg cacagcgagg 900
gcaccaccgt cctgctcttc cagttcggga tgaatgcaag ttctagccgg tttttcctac 960
aaggaatcca gttgaataca attcttcctg acgccagaga ccctgccttt aaagctgcca 1020
acggctccct gcgagcgctg caggccacag tcggcaattc ctacaagtgc aacgcggagg 1080
agcacgtccg tgtcacgaag gcgttttcag tcaatatatt caaagtgtgg gtccaggctt 1140
tcaaggtgga aggtggccag tttggctctg tggaggagtg tctgctggac gagaacagca 1200
tgctgatccc catcgctgtg ggtggtgccc tggcggggct ggtcctcatc gtcctcatcg 1260
cctacctcgt cggcaggaag aggagtcacg caggctacca gactatctag cctggtgcac 1320
gcaggcacag cagctgcagg ggcctctgtt cctttctctg ggcttagggt cctgtcgaag 1380
gggaggcaca ctttctggca aacgtttctc aaatctgctt catccaatgt gaagttcatc 1440
ttgcagcatt tactatgcac aacagagtaa ctatcgaaat gacggtgtta attttgctaa 1500
ctgggttaaa tattttgcta actggttaaa cattaatatt taccaaagta ggattttgag 1560
ggtgggggtg ctctctctga gggggtgggg gtgccgctgt ctctgagggg tgggggtgcc 1620
gctgtctctg aggggtgggg gtgccgctct ctctgagggg gtgggggtgc cgctttctct 1680
gagggggtgg gggtgccgct ctctctgagg gggtgggggt gctgctctct ccgaggggtg 1740
gaatgccgct gtctctgagg ggtgggggtg ccgctctaaa ttggctccat atcatttgag 1800
tttagggttc tggtgtttgg tttcttcatt ctttactgca ctcagattta agccttacaa 1860
agggaaagcc tctggccgtc acacgtagga cgcatgaagg tcactcgtgg tgaggctgac 1920
atgctcacac attacaacag tagagaggga aaatcctaag acagaggaac tccagagatg 1980
agtgtctgga gcgcttcagt tcagctttaa aggccaggac gggccacacg tggctggcgg 2040
cctcgttcca gtggcggcac gtccttgggc gtctctaatg tctgcagctc aagggctggc 2100
acttttttaa atataaaaat gggtgttatt tttatttttt tttgtaaagt gatttttggt 2160
cttctgttga cattcggggt gatcctgttc tgcgctgtgt acaatgtgag atcggtgcgt 2220
tctcctgatg ttttgccgtg gcttggggat tgtacacggg accagctcac gtaatgcatt 2280
gcctgtaaca atgtaataaa aagcctcttt cttttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2339

<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 46
cagtacatca aggccaacag caagttcatc ggcatcaccg aactc 45

<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 47
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15

<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 48
gctaaatttg tggctgcctg gacactgaaa gccgccgct 39

<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 49
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10

<210> 50
<211> 593
<212> DNA
<213> Woodchuck hepatitis virus
<400> 50
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tgt 593

<210> 51
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 51
tctccccccc ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 60
taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 120
gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 180
ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 240
tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 300
gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 360
ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 420
gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 480
gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc 540
ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatg 589

<210> 52
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 52
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtag 720

<210> 53
<211> 1563
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 53
atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg aggctacagc tctccctggg catcatccca 60
gttgaggagg agaacccgga cttctggaac cgcgaggcag ccgaggccct gggtgccgcc 120
aagaagctgc agcctgcaca gacagccgcc aagaacctca tcatcttcct gggcgatggg 180
atgggggtgt ctacggtgac agctgccagg atcctaaaag ggcagaagaa ggacaaactg 240
gggcctgaga tacccctggc catggaccgc ttcccatatg tggctctgtc caagacatac 300
aatgtagaca aacatgtgcc agacagtgga gccacagcca cggcctacct gtgcggggtc 360
aagggcaact tccagaccat tggcttgagt gcagccgccc gctttaacca gtgcaacacg 420
acacgcggca acgaggtcat ctccgtgatg aatcgggcca agaaagcagg gaagtcagtg 480
ggagtggtaa ccaccacacg agtgcagcac gcctcgccag ccggcaccta cgcccacacg 540
gtgaaccgca actggtactc ggacgccgac gtgcctgcct cggcccgcca ggaggggtgc 600
caggacatcg ctacgcagct catctccaac atggacattg acgtgatcct aggtggaggc 660
cgaaagtaca tgtttcgcat gggaacccca gaccctgagt acccagatga ctacagccaa 720
ggtgggacca ggctggacgg gaagaatctg gtgcaggaat ggctggcgaa gcgccagggt 780
gcccggtatg tgtggaaccg cactgagctc atgcaggctt ccctggaccc gtctgtgacc 840
catctcatgg gtctctttga gcctggagac atgaaatacg agatccaccg agactccaca 900
ctggacccct ccctgatgga gatgacagag gctgccctgc gcctgctgag caggaacccc 960
cgcggcttct tcctcttcgt ggagggtggt cgcatcgacc atggtcatca tgaaagcagg 1020
gcttaccggg cactgactga gacgatcatg ttcgacgacg ccattgagag ggcgggccag 1080
ctcaccagcg aggaggacac gctgagcctc gtcactgccg accactccca cgtcttctcc 1140
ttcggaggct accccctgcg agggagctcc atcttcgggc tggcccctgg caaggcccgg 1200
gacaggaagg cctacacggt cctcctatac ggaaacggtc caggctatgt gctcaaggac 1260
ggcgcccggc cggatgttac cgagagcgag agcgggagcc ccgagtatcg gcagcagtca 1320
gcagtgcccc tggacgaaga gacccacgca ggcgaggacg tggcggtgtt cgcgcgcggc 1380
ccgcaggcgc acctggttca cggcgtgcag gagcagacct tcatagcgca cgtcatggcc 1440
ttcgccgcct gcctggagcc ctacaccgcc tgcgacctgg cgccccccgc cggcaccacc 1500
gacgccgcgc acccgggtta ctctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga 1560
taa 1563

<210> 54
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 54
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg taa 1653

<210> 55
<211> 66
<212> DNA
<213> Foot-and-mouth disease virus
<400> 55
gtaaagcaaa cactgaactt tgaccttctc aagttggctg gagacgttga gtccaatcct 60
gggccc 66

<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Gly Pro Gly Pro Gly
1 5

<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 57
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5

<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe
1 5

<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Tyr Val Tyr Val Ala Asp Val Ala Ala Lys
1 5 10

<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Tyr Glu Met Phe Asn Asp Lys Ser
1 5

<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Tyr Glu Met Phe Asn Asp Lys Ser Gln Arg Ala Pro Asp Asp Lys Met
1 5 10 15
Phe

<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 62
Tyr Glu Met Phe Asn Asp Lys Ser Phe
1 5

<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile or Leu
<400> 63
His Arg Xaa Glu Ile Phe Ser His Asp Phe Xaa
1 5 10

<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Pyrrolysine
<400> 64
Phe Xaa Ile Glu Xaa Phe Xaa Glu Ser Ser
1 5 10

<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Pyrrolysine
<400> 65
Asn Glu Ile Xaa Arg Glu Ile Arg Glu Ile
1 5 10

<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Selenocysteine
<400> 66
Xaa Phe Lys Ser Ile Phe Glu Met Met Ser Xaa Asp Ser Ser Xaa
1 5 10 15

<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Pyrrolysine
<400> 67
Lys Asn Phe Leu Glu Asn Phe Ile Glu Ser Xaa Phe Ile
1 5 10

<210> 68
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Selenocysteine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Ile or Leu
<400> 68
Xaa Phe Lys Ser Ile Phe Glu Met Met Ser Xaa Asp Ser Ser Xaa Ile
1 5 10 15
Phe Leu Lys Ser Xaa Phe Ile Glu Ile Phe Xaa
20 25

<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Ile or Leu
<400> 69
Phe Xaa Glu Ile Phe Asn Asp Lys Ser Leu Asp Lys Phe Xaa Ile
1 5 10 15

<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Pyrrolysine
<400> 70
Gln Cys Glu Ile Xaa Trp Ala Arg Glu
1 5

<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Selenocysteine
<400> 71
Phe Ile Glu Xaa His Phe Trp Ile
1 5

<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Selenocysteine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile or Leu
<400> 72
Phe Glu Trp Arg His Arg Xaa Thr Arg Xaa Xaa Arg
1 5 10

<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ile or Leu
<400> 73
Gln Ile Glu Xaa Xaa Glu Ile Xaa Glu
1 5

<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile or Leu
<400> 74
Phe Xaa Glu Leu Phe Ile Ser Asx Xaa Ser Xaa Phe Ile Glu
1 5 10

<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Ile or Leu
<400> 75
Gln Cys Glu Ile Xaa Trp Ala Arg Glu Phe Leu Lys Glu Ile Gly Xaa
1 5 10 15

<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ile or Leu
<400> 76
Ile Glu Phe Arg Xaa Glu Ile Phe Xaa Glu Phe
1 5 10

<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ile or Leu
<400> 77
Ile Glu Phe Arg Xaa Glu Ile Phe Xaa
1 5

<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ile or Leu
<400> 78
Glu Phe Arg Xaa Glu Ile Phe Xaa Glu
1 5

<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ile or Leu
<400> 79
Phe Arg Xaa Glu Ile Phe Xaa Glu Phe
1 5

<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 80
Ser Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5

<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Val Val
1 5

<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Glu Lys Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Leu
1 5

<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Lys Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10

<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Phe Glu Lys Leu Ala Ala Tyr Leu
1 5

<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Ala Ala Tyr Leu Leu Leu Leu Leu
1 5

<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 86
Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Val
1 5

<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Val Val Val Val Ala Ala Tyr Ser Ile Asn
1 5 10

<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Val Val Val Val Ala Ala Tyr
1 5

<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 89
Ala Tyr Ser Ile Asn Phe Glu Lys
1 5

<210> 90
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 90
Tyr Asn Tyr Ser Tyr Trp Ile Ser Ile Phe Ala His Thr Met Trp Tyr
1 5 10 15
Asn Ile Trp His Val Gln Trp Asn Lys
20 25

<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Ile Glu Ala Leu Pro Tyr Val Phe Leu Gln Asp Gln Phe Glu Leu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gly Glu Gln Gly Asn Asn
20 25

<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
Asp Ser Glu Glu Thr Asn Thr Asn Tyr Leu His Tyr Cys His Phe His
1 5 10 15
Trp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Thr Val
20 25

<210> 93
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 93
Gly Met Leu Ser Gln Tyr Glu Leu Lys Asp Cys Ser Leu Gly Phe Ser
1 5 10 15
Trp Asn Asp Pro Ala Lys Tyr Leu Arg
20 25

<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Val Arg Ile Asp Lys Phe Leu Met Tyr Val Trp Tyr Ser Ala Pro Phe
1 5 10 15
Ser Ala Tyr Pro Leu Tyr Gln Asp Ala
20 25

<210> 95
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Cys Val His Ile Tyr Asn Asn Tyr Pro Arg Met Leu Gly Ile Pro Phe
1 5 10 15
Ser Val Met Val Ser Gly Phe Ala Met
20 25

<210> 96
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Phe Thr Phe Lys Gly Asn Ile Trp Ile Glu Met Ala Gly Gln Phe Glu
1 5 10 15
Arg Thr Trp Asn Tyr Pro Leu Ser Leu
20 25

<210> 97
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Ala Asn Asp Asp Thr Pro Asp Phe Arg Lys Cys Tyr Ile Glu Asp His
1 5 10 15
Ser Phe Arg Phe Ser Gln Thr Met Asn
20 25

<210> 98
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Ala Ala Gln Tyr Ile Ala Cys Met Val Asn Arg Gln Met Thr Ile Val
1 5 10 15
Tyr His Leu Thr Arg Trp Gly Met Lys
20 25

<210> 99
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Lys Tyr Leu Lys Glu Phe Thr Gln Leu Leu Thr Phe Val Asp Cys Tyr
1 5 10 15
Met Trp Ile Thr Phe Cys Gly Pro Asp
20 25

<210> 100
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 100
Ala Met His Tyr Arg Thr Asp Ile His Gly Tyr Trp Ile Glu Tyr Arg
1 5 10 15
Gln Val Asp Asn Gln Met Trp Asn Thr
20 25

<210> 101
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Thr His Val Asn Glu His Gln Leu Glu Ala Val Tyr Arg Phe His Gln
1 5 10 15
Val His Cys Arg Phe Pro Tyr Glu Asn
20 25

<210> 102
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 102
Gln Thr Phe Ser Glu Cys Leu Phe Phe His Cys Leu Lys Val Trp Asn
1 5 10 15
Asn Val Lys Tyr Ala Lys Ser Leu Lys
20 25

<210> 103
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 103
Ser Phe Ser Ser Trp His Tyr Lys Glu Ser His Ile Ala Leu Leu Met
1 5 10 15
Ser Pro Lys Lys Asn His Asn Asn Thr
20 25

<210> 104
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Ile Leu Asp Gly Ile Met Ser Arg Trp Glu Lys Val Cys Thr Arg Gln
1 5 10 15
Thr Arg Tyr Ser Tyr Cys Gln Cys Ala
20 25

<210> 105
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Tyr Arg Ala Ala Gln Met Ser Lys Trp Pro Asn Lys Tyr Phe Asp Phe
1 5 10 15
Pro Glu Phe Met Ala Tyr Met Pro Ile
20 25

<210> 106
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Pro Arg Pro Gly Met Pro Cys Gln His His Asn Thr His Gly Leu Asn
1 5 10 15
Asp Arg Gln Ala Phe Asp Asp Phe Val
20 25

<210> 107
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
His Asn Ile Ile Ser Asp Glu Thr Glu Val Trp Glu Gln Ala Pro His
1 5 10 15
Ile Thr Trp Val Tyr Met Trp Cys Arg
20 25

<210> 108
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Ala Tyr Ser Trp Pro Val Val Pro Met Lys Trp Ile Pro Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Asn His Pro Pro Gly Thr
20 25

<210> 109
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
His Val Met Pro His Val Ala Met Asn Ile Cys Asn Trp Tyr Glu Phe
1 5 10 15
Leu Tyr Arg Ile Ser His Ile Gly Arg
20 25

<210> 110
<211> 484
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 110
Thr His Val Asn Glu His Gln Leu Glu Ala Val Tyr Arg Phe His Gln
1 5 10 15
Val His Cys Arg Phe Pro Tyr Glu Asn Ala Met His Tyr Gln Met Trp
20 25 30
Asn Thr Tyr Arg Ala Ala Gln Met Ser Lys Trp Pro Asn Lys Tyr Phe
35 40 45
Asp Phe Pro Glu Phe Met Ala Tyr Met Pro Ile Cys Val His Ile Tyr
50 55 60
Asn Asn Tyr Pro Arg Met Leu Gly Ile Pro Phe Ser Val Met Val Ser
65 70 75 80
Gly Phe Ala Met Ala Tyr Ser Trp Pro Val Val Pro Met Lys Trp Ile
85 90 95
Pro Tyr Arg Ala Leu Cys Ala Asn His Pro Pro Gly Thr Ala Asn Asp
100 105 110
Asp Thr Pro Asp Phe Arg Lys Cys Tyr Ile Glu Asp His Ser Phe Arg
115 120 125
Phe Ser Gln Thr Met Asn Ile Glu Ala Leu Pro Tyr Val Phe Leu Gln
130 135 140
Asp Gln Phe Glu Leu Arg Leu Leu Lys Gly Glu Gln Gly Asn Asn Asp
145 150 155 160
Ser Glu Glu Thr Asn Thr Asn Tyr Leu His Tyr Cys His Phe His Trp
165 170 175
Thr Trp Ala Gln Gln Thr Thr Val Ile Leu Asp Gly Ile Met Ser Arg
180 185 190
Trp Glu Lys Val Cys Thr Arg Gln Thr Arg Tyr Ser Tyr Cys Gln Cys
195 200 205
Ala Phe Thr Phe Lys Gly Asn Ile Trp Ile Glu Met Ala Gly Gln Phe
210 215 220
Glu Arg Thr Trp Asn Tyr Pro Leu Ser Leu Ser Phe Ser Ser Trp His
225 230 235 240
Tyr Lys Glu Ser His Ile Ala Leu Leu Met Ser Pro Lys Lys Asn His
245 250 255
Asn Asn Thr Gln Thr Phe Ser Glu Cys Leu Phe Phe His Cys Leu Lys
260 265 270
Val Trp Asn Asn Val Lys Tyr Ala Lys Ser Leu Lys His Val Met Pro
275 280 285
His Val Ala Met Asn Ile Cys Asn Trp Tyr Glu Phe Leu Tyr Arg Ile
290 295 300
Ser His Ile Gly Arg His Asn Ile Ile Ser Asp Glu Thr Glu Val Trp
305 310 315 320
Glu Gln Ala Pro His Ile Thr Trp Val Tyr Met Trp Cys Arg Val Arg
325 330 335
Ile Asp Lys Phe Leu Met Tyr Val Trp Tyr Ser Ala Pro Phe Ser Ala
340 345 350
Tyr Pro Leu Tyr Gln Asp Ala Lys Tyr Leu Lys Glu Phe Thr Gln Leu
355 360 365
Leu Thr Phe Val Asp Cys Tyr Met Trp Ile Thr Phe Cys Gly Pro Asp
370 375 380
Ala Ala Gln Tyr Ile Ala Cys Met Val Asn Arg Gln Met Thr Ile Val
385 390 395 400
Tyr His Leu Thr Arg Trp Gly Met Lys Tyr Asn Tyr Ser Tyr Trp Ile
405 410 415
Ser Ile Phe Ala His Thr Met Trp Tyr Asn Ile Trp His Val Gln Trp
420 425 430
Asn Lys Gly Met Leu Ser Gln Tyr Glu Leu Lys Asp Cys Ser Leu Gly
435 440 445
Phe Ser Trp Asn Asp Pro Ala Lys Tyr Leu Arg Pro Arg Pro Gly Met
450 455 460
Pro Cys Gln His His Asn Thr His Gly Leu Asn Asp Arg Gln Ala Phe
465 470 475 480
Asp Asp Phe Val

<210> 111
<211> 484
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 111
Ile Glu Ala Leu Pro Tyr Val Phe Leu Gln Asp Gln Phe Glu Leu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gly Glu Gln Gly Asn Asn Ile Leu Asp Gly Ile Met Ser
20 25 30
Arg Trp Glu Lys Val Cys Thr Arg Gln Thr Arg Tyr Ser Tyr Cys Gln
35 40 45
Cys Ala His Val Met Pro His Val Ala Met Asn Ile Cys Asn Trp Tyr
50 55 60
Glu Phe Leu Tyr Arg Ile Ser His Ile Gly Arg Thr His Val Asn Glu
65 70 75 80
His Gln Leu Glu Ala Val Tyr Arg Phe His Gln Val His Cys Arg Phe
85 90 95
Pro Tyr Glu Asn Phe Thr Phe Lys Gly Asn Ile Trp Ile Glu Met Ala
100 105 110
Gly Gln Phe Glu Arg Thr Trp Asn Tyr Pro Leu Ser Leu Ala Met His
115 120 125
Tyr Gln Met Trp Asn Thr Ser Phe Ser Ser Trp His Tyr Lys Glu Ser
130 135 140
His Ile Ala Leu Leu Met Ser Pro Lys Lys Asn His Asn Asn Thr Val
145 150 155 160
Arg Ile Asp Lys Phe Leu Met Tyr Val Trp Tyr Ser Ala Pro Phe Ser
165 170 175
Ala Tyr Pro Leu Tyr Gln Asp Ala Gln Thr Phe Ser Glu Cys Leu Phe
180 185 190
Phe His Cys Leu Lys Val Trp Asn Asn Val Lys Tyr Ala Lys Ser Leu
195 200 205
Lys Tyr Arg Ala Ala Gln Met Ser Lys Trp Pro Asn Lys Tyr Phe Asp
210 215 220
Phe Pro Glu Phe Met Ala Tyr Met Pro Ile Ala Tyr Ser Trp Pro Val
225 230 235 240
Val Pro Met Lys Trp Ile Pro Tyr Arg Ala Leu Cys Ala Asn His Pro
245 250 255
Pro Gly Thr Cys Val His Ile Tyr Asn Asn Tyr Pro Arg Met Leu Gly
260 265 270
Ile Pro Phe Ser Val Met Val Ser Gly Phe Ala Met His Asn Ile Ile
275 280 285
Ser Asp Glu Thr Glu Val Trp Glu Gln Ala Pro His Ile Thr Trp Val
290 295 300
Tyr Met Trp Cys Arg Ala Ala Gln Tyr Ile Ala Cys Met Val Asn Arg
305 310 315 320
Gln Met Thr Ile Val Tyr His Leu Thr Arg Trp Gly Met Lys Tyr Asn
325 330 335
Tyr Ser Tyr Trp Ile Ser Ile Phe Ala His Thr Met Trp Tyr Asn Ile
340 345 350
Trp His Val Gln Trp Asn Lys Gly Met Leu Ser Gln Tyr Glu Leu Lys
355 360 365
Asp Cys Ser Leu Gly Phe Ser Trp Asn Asp Pro Ala Lys Tyr Leu Arg
370 375 380
Lys Tyr Leu Lys Glu Phe Thr Gln Leu Leu Thr Phe Val Asp Cys Tyr
385 390 395 400
Met Trp Ile Thr Phe Cys Gly Pro Asp Ala Asn Asp Asp Thr Pro Asp
405 410 415
Phe Arg Lys Cys Tyr Ile Glu Asp His Ser Phe Arg Phe Ser Gln Thr
420 425 430
Met Asn Asp Ser Glu Glu Thr Asn Thr Asn Tyr Leu His Tyr Cys His
435 440 445
Phe His Trp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Thr Val Pro Arg Pro Gly Met
450 455 460
Pro Cys Gln His His Asn Thr His Gly Leu Asn Asp Arg Gln Ala Phe
465 470 475 480
Asp Asp Phe Val

<210> 112
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 112
Ser Ser Thr Pro Tyr Leu Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Val Ser Tyr Gln
1 5 10 15
Phe Pro Met Val Pro Gly Gly Asp Arg
20 25

<210> 113
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Glu Met Ala Gly Lys Ile Asp Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Ile Phe Gln
1 5 10 15
Leu Phe Trp Arg Glu Ala Ala Glu Pro
20 25

<210> 114
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 114
Ala Leu Lys Gln Arg Thr Trp Gln Ala Leu Ala His Lys Tyr Asn Ser
1 5 10 15
Gln Pro Ser Val Ser Leu Arg Asp Phe
20 25

<210> 115
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 115
Val Ser Ser His Ser Ser Gln Ala Thr Lys Asp Ser Ala Val Gly Leu
1 5 10 15
Lys Tyr Ser Ala Ser Thr Pro Val Arg
20 25

<210> 116
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Lys Glu Ala Ile Asp Ala Trp Ala Pro Tyr Leu Pro Glu Tyr Ile Asp
1 5 10 15
His Val Ile Ser Pro Gly Val Thr Ser
20 25

<210> 117
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 117
Ser Pro Val Ile Thr Ala Pro Pro Ser Ser Pro Val Phe Asp Thr Ser
1 5 10 15
Asp Ile Arg Lys Glu Pro Met Asn Ile
20 25

<210> 118
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 118
Pro Ala Glu Val Ala Glu Gln Tyr Ser Glu Lys Leu Val Tyr Met Pro
1 5 10 15
His Thr Phe Phe Ile Gly Asp His Ala
20 25

<210> 119
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Met Ala Asp Leu Asp Lys Leu Asn Ile His Ser Ile Ile Gln Arg Leu
1 5 10 15
Leu Glu Val Arg Gly Ser
20

<210> 120
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Ala Ala Ala Tyr Asn Glu Lys Ser Gly Arg Ile Thr Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Phe Gln Lys Val Phe Ala Gln Ile
20 25

<210> 121
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Lys Ile Glu Glu Val Arg Asp Ala Met Glu Asn Glu Ile Arg Thr Gln
1 5 10 15
Leu Arg Arg Gln Ala Ala Ala His Thr
20 25

<210> 122
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 122
Asp Arg Gly His Tyr Val Leu Cys Asp Phe Gly Ser Thr Thr Asn Lys
1 5 10 15
Phe Gln Asn Pro Gln Thr Glu Gly Val
20 25

<210> 123
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 123
Gln Val Asp Asn Arg Lys Ala Glu Ala Glu Glu Ala Ile Lys Arg Leu
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Ser Gln Lys Val Ser Asp
20 25

<210> 124
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 124
Cys Leu Ser Asp Ala Gly Val Arg Lys Met Thr Ala Ala Val Arg Val
1 5 10 15
Met Lys Arg Gly Leu Glu Asn Leu Thr
20 25

<210> 125
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Leu Pro Pro Arg Ser Leu Pro Ser Asp Pro Phe Ser Gln Val Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Gln Ser Gln Ser Ser Ser Gln
20 25

<210> 126
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 126
Glu Leu Val Leu Glu Asp Leu Gln Asp Gly Asp Val Lys Met Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Gly Ala Phe Ser Asn Ser
20 25

<210> 127
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Val Thr Met Asp Gly Val Arg Glu Glu Asp Leu Ala Ser Phe Ser Leu
1 5 10 15
Arg Lys Arg Trp Glu Ser Glu Pro His
20 25

<210> 128
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Ile Val Gly Val Met Phe Phe Glu Arg Ala Phe Asp Glu Gly Ala Asp
1 5 10 15
Ala Ile Tyr Asp His Ile Asn Glu Gly
20 25

<210> 129
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 129
Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Thr Gln Ser Pro Thr Pro
1 5 10 15
Thr Pro Ile Thr Thr Thr Thr Thr Val
20 25

<210> 130
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 130
Gln Glu Glu Met Pro Pro Arg Pro Cys Gly Gly His Thr Ser Ser Ser
1 5 10 15
Leu Pro Lys Ser His Leu Glu Pro Ser
20 25

<210> 131
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Pro Asn Ile Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Asp Ser His His
1 5 10 15
Lys Ala Lys Gly Lys
20

<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 132
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5

<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 133
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5

<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5

<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 135
Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val
1 5

<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5

<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1 5

<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Cys Thr
1 5

<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg
1 5

<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln
1 5

<210> 141
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr
1 5 10 15
Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln
20 25

<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 142
gtggtgtgca gcgagaatag 20

<210> 143
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 143
cgctcgttgt agatgtcgtt ag 22

<210> 144
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 144
ttcatgcccg tgttg 15

<210> 145
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 145
gtttttgatc cagacccaga tg 22

<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 146
gcccattatt cagagcgagt a 21

<210> 147
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 147
tcaccaggat ccac 14

<210> 148
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 148
ccttgcacat gccggag 17

<210> 149
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 149
acagagcctc gcctttg 17

<210> 150
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 150
gtgagctggc gg 12

<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 151
ctgaaagctc ggtttgctaa tg 22

<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 152
ccatgctgga agagacaatc t 21

<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 153
tggcgctgac cgata 15

<210> 154
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 154
tatgcctatc ctgtctcctc tg 22

<210> 155
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 155
gctaatgcag ctaagtcctc tc 22

<210> 156
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 156
tgaccgtgcc ttctg 15

<210> 157
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 157
Tyr Glu Met Phe Asn Asp Lys Ser Phe Gln Arg Ala Pro Asp Asp Lys
1 5 10 15
Met Phe

<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Selenocysteine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> Pyrrolysine
<400> 158
Phe Glu Gly Arg Lys Xaa Xaa Xaa Ile
1 5

<210> 159
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Pyrrolysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Pyrrolysine
<400> 159
Pro Xaa Phe Ile Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Gly Glu Ile Xaa
1 5 10

<210> 160
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 160
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10

<210> 161
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 161
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10

<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Ala Val
1 5

<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 163
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10

<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 164
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1 5

<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 165
Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu
1 5

<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 166
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
1 5

<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 167
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10

<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 168
Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val
1 5

<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 169
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu
1 5 10

<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 170
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
1 5

<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 171
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5

<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 172
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1 5

<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 173
Lys Leu Gly Gly Ala Leu Gln Ala Lys
1 5

<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 174
Arg Leu Arg Ala Glu Ala Gln Val Lys
1 5

<210> 175
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 175
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe
1 5 10

<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Glu Glu Tyr Leu Gln Ala Phe Thr Tyr
1 5

<210> 177
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 177
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met
1 5

<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 178
Thr Thr Pro Glu Ser Ala Asn Leu
1 5

<210> 179
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 179
Cys Ala Pro Pro Gly Tyr Ala Leu Leu
1 5

<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 180
Ser Gly Pro Lys Thr Asn Ile Ile Val
1 5

<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 181
Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp
1 5

<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 182
Thr Val Pro Trp Pro Asn Ala Ser Leu
1 5

<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 183
Glu Gly Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5

<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 184
Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu
1 5

<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 185
Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu
1 5

<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 186
Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met
1 5

<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 187
Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val Val Leu
1 5

<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 188
Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5

<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 189
Met Asn Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu
1 5

<210> 190
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 190
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15

<210> 191
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 191
Ser Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Val Val Val

<210> 192
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 192
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Val Val Ala Ala Tyr Ser Ile Asn Phe
1 5 10 15
Glu Lys Leu

<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 193
Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe
1 5

Claims (173)

  1. 新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
    前記新生抗原発現系が、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物：
    （ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、
    （ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに
    （ｂ）新生抗原カセットであって、
    （ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）前記腫瘍に由来する、少なくとも１つの腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列であって、
    （Ａ）コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列と、
    （Ｂ）任意で５’リンカー配列と、
    （Ｃ）任意で３’リンカー配列と
    を含む、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列
    を含む、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
    （ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｖ）任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ（Ａ）配列または外来性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記新生抗原カセット。
  2. 新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
    前記新生抗原発現系が、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物：
    （ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の核酸配列を含み、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格の配列が２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、前記２６Ｓプロモーター配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ（Ａ）配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに
    （ｂ）前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
    （ｉ）対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）互いに直鎖状に連結された、少なくとも１０個の腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
    （Ａ）コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有し、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列と、
    （Ｂ）前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、５’リンカー配列と、
    （Ｃ）前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、３’リンカー配列と
    を含む、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列
    を含み、
    ここで、前記新生抗原カセットが前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３～２５個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列の各３’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列の５’末端に連結されている、
    前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列と、
    （ｉｉ）少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）と、
    （ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）と、
    （ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする、第１の核酸配列と、
    （ＩＶ）前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の５’末端と前記少なくとも２０個の腫瘍特異的かつ対象特異的なＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする、第２の核酸配列と、
    （Ｖ）任意で、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の３’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする、第３の核酸配列と
    を含む、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
    を含む、前記新生抗原カセット。
  3. 前記新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列が、５’から３’に向かって、
    Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
    を含む式で示され、
    式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、
    Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｃ＝１であり、
    Ｌ５は、前記５’リンカー配列を含み、ここで、ｂ＝０または１であり、
    Ｌ３は、前記３’リンカー配列を含み、ここで、ｄ＝０または１であり、
    Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｅ＝０または１であり、
    Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｇ＝０または１であり、
    Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｆ＝１であり、
    Ｘ＝１～４００であり、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
    Ｙ＝０、１、または２であり、ここで、各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である、
    請求項１に記載の組成物。
  4. 各Ｘについて、対応するＮｃが、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である、請求項３に記載の組成物。
  5. 各Ｙについて、対応するＵｆが、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である、請求項３または４に記載の組成物。
  6. ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、
    前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、
    前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、
    各Ｎが、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
    Ｌ５が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、
    Ｌ３が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、
    Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、
    前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の配列であり、
    前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３個～２５個の長さのポリペプチドをコードする、
    請求項３～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが新生抗原発現系を封入する、請求項７～１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰが、
    新生抗原発現系と、
    カチオン性脂質と、
    非カチオン性脂質と、
    ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と
    を含み、前記複数のＬＮＰのうち、少なくとも約９５％のＬＮＰが、
    （ａ）非ラメラ形態を有するか、または、
    （ｂ）高電子密度である、
    請求項８に記載の組成物。
  13. 前記非カチオン性脂質が、
    （１）リン脂質、及び
    （２）コレステロールまたはコレステロール誘導体
    の混合物である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体である、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 前記ＰＥＧ－脂質複合体が、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ－リン脂質複合体、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体が、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ＬＮＰの非ラメラ形態が、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記非カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記非カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記非カチオン性脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１．５ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％を構成する、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記ＬＮＰの９５％超が非ラメラ形態を有する、請求項１２～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記ＬＮＰの９５％超が高電子密度である、請求項１２～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰが、
    前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、
    前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、
    （ａ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、
    （ｂ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、または、
    （ｃ）前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４９．５ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記コレステロールまたはその誘導体が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％を構成するもの
    のいずれかを含む、非カチオン性脂質と
    を含む、請求項８～２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰが、
    前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、
    前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、
    前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の１３ｍｏｌ％～４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と
    を含む、請求項８～２８のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記複合脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体を含む、請求項２９または３０に記載の組成物。
  33. 前記ＰＥＧ－脂質複合体が、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体が、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記複合体のＰＥＧ部分が、約２０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 前記複合脂質が、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、請求項２９～３５のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 前記ＬＮＰが、式Ｉの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項８～３６のいずれか１項に記載の組成物：
    Figure 2023123766000200
    式中、
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接的結合であり、
    Ｇ１は、Ｃｉ～Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、または直接的結合であり、
    －Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、または直接的結合であり、
    Ｇは、Ｃｉ～Ｃ６アルキレンであり、
    Ｒａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、
    Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、
    Ｒ７は、Ｃ４～Ｃ２０アルキルであり、
    Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合する窒素原子と共に、５、６、または７員の複素環を形成し、
    ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、それぞれ独立して１～２４の整数であり、ｘは０、１、または２である。
  38. 前記ＬＮＰが、式ＩＩの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項８～３６のいずれか１項に記載の組成物：
    Figure 2023123766000201
    式中、
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または炭素－炭素二重結合であり、
    Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ３ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各出現時に、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨもしくはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、
    Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、
    Ｒ７は、各出現時に、独立してＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、
    Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換のＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合する窒素原子と共に、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成し、
    ａ及びｄは、それぞれ独立して０～２４の整数であり、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１～２４の整数であり、ｅは１または２であり、
    ただし、
    Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、もしくはＲ４ａのうちの少なくとも１つが、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１もしくはＬ２の少なくとも一方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、
    Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、ａが８である場合にはｎ－ブチルでない。
  39. 中性脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質を含む１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項３７または３９に記載の組成物。
  40. 前記中性脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記中性脂質がＤＳＰＣである、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記化合物と前記中性脂質とのモル比が、約２：１～約８：１の範囲である、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 前記ステロイドがコレステロールである、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の組成物。
  44. 前記化合物と前記コレステロールとのモル比が、約２：１～1：１の範囲である、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記ポリマーコンジュゲート脂質がＰＥＧ化脂質である、請求項３９～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記化合物と前記ＰＥＧ化脂質とのモル比が、約１００：１～約２５：１の範囲である、請求項４５に記載の組成物。
  47. 前記ＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－スクシノイル－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキオキシプロピルカルバメートである、請求項４５または４６に記載の組成物。
  48. 前記ＰＥＧ化脂質が、下記構造ＩＩＩを有する、請求項４５または４６に記載の組成物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体：
    Figure 2023123766000202
    式中、
    Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で１つ以上のエステル結合によって中断され、
    ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する。
  49. Ｒ１０及びＲ１１が、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記平均ｚが、約４５である、請求項４８または４９に記載の組成物。
  51. 前記ＬＮＰが、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する、請求項８～５０のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 前記非二重層構造が、６０ｎｍ～１２０ｎｍの直径を有する、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記非二重層構造が、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍの直径を有する、請求項５１に記載の組成物。
  54. 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、約１００ｎｍの直径を有する、請求項７～５３のいずれか１項に記載の組成物。
  55. 前記新生抗原カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれている、請求項１、３～５、または７～５４のいずれか１項に記載の組成物。
  56. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記新生抗原コード核酸配列と機能的に連結されている、請求項１、３～５、または７～５５のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 前記１つ以上のベクターが、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む、請求項１、３～５、または７～５６のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、５’７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む、請求項５７に記載の組成物。
  59. 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、インビトロ転写によって生成される、請求項５７または５８に記載の組成物。
  60. 前記１つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、請求項１、３～５、または７～５９のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１、３～５、または７～６０のいずれか１項に記載の組成物。
  62. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１、３～５、または７～６０のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む、請求項６１または６２に記載の組成物。
  64. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む、請求項６１または６２に記載の組成物。
  65. 前記非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス５’ ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３または６４に記載の組成物。
  66. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記新生抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載の配列を含む、請求項６１または６２に記載の組成物。
  69. 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対７５４４と１１１７５との間の欠失をさらに含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列を含む、請求項６１または６２に記載のの組成物。
  70. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載の配列を含む、請求項６９に記載の組成物。
  71. 前記新生抗原カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の前記欠失を置換するように７５４４位に挿入されている、請求項６９または７０に記載の組成物。
  72. 前記新生抗原カセットの挿入が、ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、前記ｎｓＰ１～４遺伝子及び前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内にある、請求項６７～７１のいずれか１項に記載の組成物。
  73. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１、３～５、または７～７２のいずれか１項に記載の組成物。
  74. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、外来性のＲＮＡプロモーターである、請求項１、３～５、または７～７２のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１、３～５、または７～７４のいずれか１項に記載の組成物。
  76. 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす、請求項１、３～５、または７～７４のいずれか１項に記載の組成物。
  77. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  78. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  79. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ２ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  80. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  81. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  82. 各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項１、３～５、または７～８１のいずれか１項に記載の組成物。
  83. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている、請求項１、３～５、または７～８２のいずれか１項に記載の組成物。
  84. 前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する、請求項８３に記載の組成物。
  85. 前記リンカーが、
    （１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基、
    （２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基、
    （３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、
    （４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、
    （５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び
    （６）元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２～２０個の長さの１つ以上の天然配列
    からなる群から選択される、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する、請求項８３に記載の組成物。
  87. 前記リンカーが、配列ＧＰＧＰＧを含む、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つの配列が、
    前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続的な配列
    に機能的または直接的に連結されている、請求項１、３～５、または７～８７のいずれか１項に記載の組成物。
  89. 前記分離したまたは連続的な配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である、請求項８８に記載の組成物。
  90. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  91. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  92. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示の尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  93. 前記少なくとも１つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライスされた抗原を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  94. 前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  95. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む、請求項１、３～５、または７～９４のいずれか１項に記載の組成物。
  96. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む、請求項１、３～５、または７～９４のいずれか１項に記載の組成物。
  97. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が少なくとも２～４００個の核酸配列を含み、前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個が、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項１、３～５、または７～９４のいずれか１項に記載の組成物。
  98. 前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項２または６に記載の組成物。
  99. 対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  100. 前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ新生抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  101. 各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、アミノ酸８～３５個の長さ、任意で、アミノ酸９～１７個、９～２５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個のポリペプチド配列をコードする、請求項１、３～５、または７～１００のいずれか１項に記載の組成物。
  102. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在する、請求項１、３～５、または７～１０１のいずれか１項に記載の組成物。
  103. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を含む、請求項１、３～５、または７～１０１のいずれか１項に記載の組成物。
  104. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が、アミノ酸１２～２０個、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０～４０個の長さである、請求項１、３～５、または７～１０３のいずれか１項に記載の組成物。
  105. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む、請求項１、３～５、または７～１０４のいずれか１項に記載の組成物。
  106. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、請求項１、３～５、または７～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
  107. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、請求項１、３～５、または７～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
  108. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスに天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む、請求項１、３～５、または７～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
  109. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスに対して外来性のポリ（Ａ）配列を含む、請求項１、３～５、または７～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
  110. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結されている、請求項１、３～５、または７～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
  111. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチドである、請求項１、３～５、または７～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
  112. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドである、請求項１、３～５、または７～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
  113. 前記新生抗原カセットが、
    イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている５’もしくは３’末端非コード領域内の配列
    のうちの少なくとも１つをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  114. 前記新生抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  115. 前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される、請求項１１４に記載の組成物。
  116. 前記１つ以上のベクターが、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  117. 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１１６に記載の組成物。
  118. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異的もしくは互いに連結された多重特異性の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、フレキシブルリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である、請求項１１７に記載の組成物。
  119. 前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、２Ａなどの自己切断配列もしくはＩＲＥＳによって分けられた連続的配列であるか、または前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、連続したグリシン残基などのフレキシブルリンカーによって連結されている、請求項１１７または１１８に記載の組成物。
  120. 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項１１６に記載の組成物。
  121. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、またはそれぞれのその変異体のうちの１つである、請求項１２０に記載の組成物。
  122. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、
    （ａ）腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
    （ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
    （ｃ）新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
    を行うことによって選択される、請求項１、３～５、または７～１２１のいずれか１項に記載の組成物。
  123. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
    （ａ）腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
    （ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
    （ｃ）前記少なくとも２０個のＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
    を行うことによって選択される、請求項２または６に記載の組成物。
  124. 前記選択された新生抗原のセットの数が、２～２０である、請求項１２２に記載の組成物。
  125. 前記提示モデルが、
    （ａ）前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
    （ｂ）前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と
    の間の依存性を表す、請求項１２２～１２４のいずれか１項に記載の組成物。
  126. 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項１２２～１２５のいずれか１項に記載の組成物。
  127. 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項１２２～１２６のいずれか１項に記載の組成物。
  128. 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、請求項１２２～１２７のいずれか１項に記載の組成物。
  129. 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項１２２～１２８のいずれか１項に記載の組成物。
  130. 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項１２２～１２９のいずれか１項に記載の組成物。
  131. エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得される、請求項１２２～１３０のいずれか１項に記載の組成物。
  132. 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである、請求項１３１に記載の組成物。
  133. 前記新生抗原カセットが、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  134. 少なくとも１つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する、請求項１３３に記載の組成物。
  135. 各ジャンクショナルエピトープ配列が非自己である、請求項１３３または１３４に記載の組成物。
  136. 前記新生抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  137. 前記非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列が、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、請求項１３６に記載の組成物。
  138. 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、請求項１３３～１３７のいずれか１項に記載の組成物。
  139. 前記新生抗原カセット内における少なくとも１つの抗原コード核酸配列の順序が、
    （ａ）前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程、
    （ｂ）前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程、及び
    （ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程
    を含む一連の工程によって決定される、請求項１３３～１３８のいずれか１項に記載の組成物。
  140. 先行請求項のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  141. アジュバントをさらに含む、請求項１４０に記載の組成物。
  142. 免疫調節物質をさらに含む、請求項１４０または１４１に記載の医薬組成物。
  143. 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１４２に記載の医薬組成物。
  144. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の新生抗原カセットと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列から得られる１つ以上の要素とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記１つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載の配列のｎｓＰ１～４遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
  145. 前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載の配列の７５４４位に挿入された先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の新生抗原カセットを含む、請求項１４４に記載の単離ヌクレオチド配列。
  146. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列から得られた前記１つ以上の要素の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
    任意で、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と
    をさらに含む、請求項１４４または１４５に記載の単離ヌクレオチド配列。
  147. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の新生抗原カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の７５６３位に挿入されている、請求項１４４に記載の単離ヌクレオチド配列。
  148. 請求項１４４～１４７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクターまたはベクターのセット。
  149. 請求項１４４～１４８のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはその変異体、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である、前記単離細胞。
  150. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
  151. がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  152. 腫瘍に由来する少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、請求項１５１に記載の方法。
  153. 少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来しない、請求項１５１に記載の方法。
  154. 対象に免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  155. 前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与される、請求項１５１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
  156. 前記組成物が筋肉内投与される、請求項１５１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
  157. １つ以上の免疫調節物質の投与をさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項１５１～１５６のいずれか１項に記載の方法。
  158. 前記１つ以上の免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記免疫調節物質が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）投与される、請求項１５７または１５８に記載の方法。
  160. 前記皮下投与が、前記組成物または医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、請求項１５９に記載の方法。
  161. 前記対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む、請求項１５１～１６０のいずれか１項に記載の方法。
  162. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１５１～１６０のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１５１～１６０のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、請求項１６１に記載の方法。
  164. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１５１～１６０のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物と同じである、請求項１６２または１６３に記載の方法。
  165. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１５１～１６０のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物と異なる、請求項１６２または１６３に記載の方法。
  166. 前記第２のワクチン組成物が、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原コード核酸配列と同じである、請求項１６６に記載の方法。
  168. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の１つ以上のベクターを製造する方法であって、
    （ａ）前記ＲＮＡアルファウイルス骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、
    （ｂ）前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての構成要素を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ７ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、
    （ｃ）前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離することと
    を含む、前記方法。
  169. 前記直線化ＤＮＡ配列が、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される、請求項１６８に記載の製造する方法。
  170. 前記ＤＮＡプラスミド配列が、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの１つを用いて生成される、請求項１６９に記載の製造方法。
  171. 前記１つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することが、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む、請求項１６８に記載の製造する方法。
  172. 前記新生抗原発現系を送達するための先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法であって、
    （ａ）ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、
    （ｂ）前記新生抗原発現系を提供することと、
    （ｃ）前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が前記新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと
    を含む、前記方法。
  173. 前記条件がマイクロ流体混合によって提供される、請求項１７２に記載の製造する方法。
JP2023108263A 2017-05-08 2023-06-30 アルファウイルス新生抗原ベクター Pending JP2023123766A (ja)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762503283P 2017-05-08 2017-05-08
US62/503,283 2017-05-08
US201762523201P 2017-06-21 2017-06-21
US62/523,201 2017-06-21
US201762590163P 2017-11-22 2017-11-22
US62/590,163 2017-11-22
JP2019561211A JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2018-05-08 アルファウイルス新生抗原ベクター
PCT/US2018/031696 WO2018208856A1 (en) 2017-05-08 2018-05-08 Alphavirus neoantigen vectors

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019561211A Division JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2018-05-08 アルファウイルス新生抗原ベクター

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023123766A true JP2023123766A (ja) 2023-09-05
JP2023123766A5 JP2023123766A5 (ja) 2023-12-05

Family

ID=64105513

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019561211A Pending JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2018-05-08 アルファウイルス新生抗原ベクター
JP2023108263A Pending JP2023123766A (ja) 2017-05-08 2023-06-30 アルファウイルス新生抗原ベクター

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019561211A Pending JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2018-05-08 アルファウイルス新生抗原ベクター

Country Status (17)

Country Link
US (4) US11504421B2 (ja)
EP (1) EP3634449A4 (ja)
JP (2) JP2020518648A (ja)
KR (1) KR102945203B1 (ja)
CN (1) CN110612116A (ja)
AU (3) AU2018266705B2 (ja)
BR (1) BR112019023477A2 (ja)
CA (1) CA3062591A1 (ja)
CO (1) CO2019013609A2 (ja)
IL (2) IL270396B2 (ja)
MX (2) MX2019013259A (ja)
PE (1) PE20191842A1 (ja)
PH (1) PH12019502518A1 (ja)
SG (1) SG11201910101SA (ja)
TW (2) TW202333779A (ja)
WO (1) WO2018208856A1 (ja)
ZA (1) ZA201907461B (ja)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020500552A (ja) * 2016-11-23 2020-01-16 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド 新生抗原のウイルスによる送達方法
US11965892B2 (en) 2017-02-12 2024-04-23 Biontech Us Inc. HLA-based methods and compositions and uses thereof
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
AU2019275072A1 (en) 2018-05-23 2021-01-21 Seattle Project Corp. Shared antigens
GB201812474D0 (en) 2018-07-31 2018-09-12 Autolus Ltd Nucleic acid construct
WO2020072371A1 (en) * 2018-10-01 2020-04-09 The Wistar Institute Melanoma canine vaccine compositions and methods of use thereof
CN109536464B (zh) * 2018-12-10 2022-06-10 中国科学院武汉病毒研究所 一种缺失衣壳蛋白基因的基孔肯雅病毒感染性克隆及构建方法和在制备减毒疫苗中的应用
BR112021010611A2 (pt) * 2018-12-14 2021-08-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composições e métodos de vacina de reforço (prime boost) heterólogo
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
WO2020252039A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Biontech Us Inc. Neoantigen compositions and uses thereof
KR20220041844A (ko) * 2019-07-02 2022-04-01 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 Hiv 항원 및 mhc 복합체
KR20240137107A (ko) 2019-07-16 2024-09-19 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hiv 백신, 및 이의 제조 및 사용 방법
CN110515301B (zh) * 2019-08-06 2021-06-08 大连理工大学 一种结合dmpc的改进的admm算法
MX2022001664A (es) 2019-08-09 2022-07-19 Nutcracker Therapeutics Inc Aparato microfluídico y metodos de uso del mismo.
WO2021092095A1 (en) * 2019-11-04 2021-05-14 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen vaccine therapy
CR20220220A (es) 2019-11-18 2022-09-20 Janssen Biotech Inc Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos
AU2021236068A1 (en) 2020-03-09 2022-10-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
IL296752A (en) * 2020-04-03 2022-11-01 Gritstone Bio Inc Infectious disease antigens and vaccines
CA3173803A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 Karin Jooss Capping compounds, compositions and methods of use thereof
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
CN115836350A (zh) * 2020-07-14 2023-03-21 米尼奥公司 用于确定新抗原的呈递可能性的方法、系统和计算机程序产品
CN111951887B (zh) * 2020-07-27 2024-06-28 深圳市新合生物医疗科技有限公司 基于深度学习的白细胞抗原与多肽结合亲和力预测方法
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
EP4196128A4 (en) 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
CN114438128A (zh) * 2020-10-30 2022-05-06 上海市公共卫生临床中心 一种增强型溶瘤腺病毒及其应用
WO2022115645A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
US12275766B2 (en) 2020-12-23 2025-04-15 Janssen Biotech, Inc. Neoantigen peptide mimics
CN112553232B (zh) * 2020-12-29 2022-10-21 中国科学院武汉病毒研究所 多功能自组装纳米颗粒的可控生物合成方法
US12053517B2 (en) 2021-01-14 2024-08-06 Gilead Sciences, Inc. HIV vaccines and methods of using
AU2022210420A1 (en) * 2021-01-19 2023-09-07 Seattle Project Corp. Modified alphavirus vectors
IL319926A (en) 2021-03-19 2025-05-01 Tiba Biotech Llc Alphavirus-derived artificial RNA replicon expression systems
WO2022229966A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. T cell receptors directed against ras-derived recurrent neoantigens and methods of identifying same
CN113517030B (zh) * 2021-07-19 2022-09-20 中国人民解放军国防科技大学 基于病毒传播网络的基因序列表示学习方法
WO2023003679A1 (en) * 2021-07-22 2023-01-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Single domain antibodies that bind and neutralize venezuelan equine encephalitis virus
CA3230564A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Jean-Pol DETIFFE Method to generate personalized neoantigens of a tumor of a patient
EP4490738A4 (en) * 2022-03-08 2026-03-04 Avalo Inc SYSTEM AND METHOD FOR GENOMIC ASSOCIATION
WO2023183827A2 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 Gritstone Bio, Inc. Low-dose neoantigen vaccine therapy
CA3256897A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for the administration of nucleic acids and their methods of use
US20260034208A1 (en) * 2022-07-26 2026-02-05 Yale University Virus-like vesicles (vlvs) based vaccines and methods of preventing, ameliorating, and/or treating covid-19 and/or hepatocellular carcinoma (hcc)
CN121586776A (zh) * 2023-07-19 2026-02-27 上海复诺健生物科技有限公司 自扩增核酸分子及其应用
WO2025106713A1 (en) * 2023-11-14 2025-05-22 Avalo, Inc. System and method for gene-environment analysis
WO2025201315A1 (zh) * 2024-03-25 2025-10-02 南京金斯瑞生物科技有限公司 利用自复制rna制备与多次跨膜蛋白特异结合的抗体的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083716A (en) * 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
JP2012516679A (ja) * 2009-02-02 2012-07-26 オカイロス アーゲー サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
US9402888B2 (en) * 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
JP2022534282A (ja) * 2019-05-30 2022-07-28 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 改変アデノウイルス

Family Cites Families (225)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1837028A (en) 1924-11-11 1931-12-15 Om Edwards Co Inc Window construction
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5223427A (en) 1987-03-31 1993-06-29 The Scripps Research Institute Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
EP0452457B1 (en) 1989-11-03 1997-08-20 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US6770283B1 (en) 1990-12-13 2004-08-03 Bioption Ab DNA expression systems based on alphaviruses
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US9340577B2 (en) 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
US5662907A (en) 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
US20050271676A1 (en) 1993-03-05 2005-12-08 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human immunodeficiency virus-1 using peptide and nucleic acid compositions
DE69435171D1 (de) 1993-09-14 2009-01-08 Pharmexa Inc Pan dr-bindeproteinen zur erhöhung der immunantwort
US6413935B1 (en) 1993-09-14 2002-07-02 Epimmune Inc. Induction of immune response against desired determinants
DK0814154T3 (da) 1993-09-15 2009-08-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante alfavirusvektorer
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
PT728214E (pt) 1993-11-09 2004-11-30 Ohio Med College Linhas celulares estaveis capazes de expressar o gene de replicacao do virus adeno-associado
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
FR2726285B1 (fr) 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
DE69534166T2 (de) 1994-10-28 2006-03-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung
US5552350A (en) 1994-12-12 1996-09-03 Ceramco Inc. Low-fusing temperature porcelain
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US5851796A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Yale University Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes
UY24367A1 (es) 1995-11-23 2000-10-31 Boehringer Ingelheim Int Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
EP0803573A1 (en) 1996-04-25 1997-10-29 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Polycistronic expression construct with cytokines for multivalent vaccines
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
CA2259179C (en) 1996-07-03 2008-09-23 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
US5849561A (en) 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
ES2180258T3 (es) 1998-07-07 2003-02-01 Transgene Sa Utilizacion de pautas de lectura abierta adenovirales de e4 para mejorar la expresion de genes.
EP1000628A1 (en) 1998-09-28 2000-05-17 Fondation Mondiale Recherche et Prevention SIDA Use of antigenic complexes of HIV envelope and HLA class I antigens as HIV vaccine
US20030072767A1 (en) 1998-09-30 2003-04-17 Alexander Gaiger Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20080050393A1 (en) 1998-12-03 2008-02-28 Tang Y Tom Novel nucleic acids and polypeptides
CA2354374A1 (en) 1998-12-07 2000-06-15 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Live attenuated venezuelan equine encephalitis vaccine
WO2000047229A2 (en) 1999-02-11 2000-08-17 Genzyme Corporation Polynucleotide encoding multimers of antigenic peptides in order to enhance presentation of the antigenic peptide by mhc molecules
US7262049B2 (en) 1999-03-16 2007-08-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof
DE60038011T2 (de) 1999-04-08 2009-02-12 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Verbesserung der immunantwort als anwendung in impfstoff und gentherapie
DE60044125D1 (de) 1999-04-14 2010-05-20 Novartis Vaccines & Diagnostic Zusammensetzungen und verfahren zur auslösung einer immunantwort auf basis alphavirus-vektoren-systeme
US8647864B2 (en) 1999-04-14 2014-02-11 Novartis Ag Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
WO2003104467A1 (en) 2002-04-25 2003-12-18 Crucell Holland B.V. Means and methods for the production of adenovirus vectors
WO2000073465A1 (en) 1999-05-28 2000-12-07 Ajinomoto Co.,Inc. Peptides capable of inducing hiv-specific ctl and preventives/remedies for aids containing the peptides
US6365394B1 (en) 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
JP2003521245A (ja) 1999-12-21 2003-07-15 エピミューン， インコーポレイテッド ペプチドおよび核酸組成物を使用する、前立腺癌抗原に対する細胞性免疫応答の誘導
EP1242108B1 (en) 1999-12-28 2007-07-11 Pharmexa Inc. Optimized minigenes and peptides encoded thereby
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
US20040248113A1 (en) 1999-12-28 2004-12-09 Alessandro Sette Method and system for optimizing multi-epitope nucleic acid constructs and peptides encoded thereby
WO2001055393A2 (en) 2000-01-28 2001-08-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mhc class ii restricted t cell epitopes from the cancer antigen ny-eso-1
WO2001055177A2 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Statens Serum Institut Methods to identify ctl epitopes of hiv
US20010055596A1 (en) 2000-03-24 2001-12-27 Meagher Madeleine Joy Compositions and methods for therapy and diagnosis of colon cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
US20040115625A1 (en) 2000-10-02 2004-06-17 Reinhard Ebner Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets
US6783939B2 (en) 2000-07-07 2004-08-31 Alphavax, Inc. Alphavirus vectors and virosomes with modified HIV genes for use in vaccines
EP2336339A3 (en) 2000-09-25 2011-09-14 The Regents of the University of Michigan Production of viral vectors
US20020137081A1 (en) 2001-01-08 2002-09-26 Olga Bandman Genes differentially expressed in vascular tissue activation
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
CN1147587C (zh) 2001-05-30 2004-04-28 方炳良 一种增强细胞特异性目的基因表达的方法
US20030232324A1 (en) 2001-05-31 2003-12-18 Chiron Corporation Chimeric alphavirus replicon particles
JP4608210B2 (ja) 2001-05-31 2011-01-12 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド キメラアルファウイルスレプリコン粒子
EP1409748B1 (en) 2001-06-22 2011-10-26 The Trustees of The University of Pennsylvania Recombinant Adenoviruses comprising simian adenovirus proteins and uses thereof.
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
EP1497440B1 (en) 2002-04-25 2008-08-20 Crucell Holland B.V. Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
WO2004023973A2 (en) 2002-09-12 2004-03-25 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
AU2003295328A1 (en) 2002-10-02 2004-04-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CA2500955A1 (en) 2002-10-03 2004-04-15 Genencor International, Inc. Optimized multi-epitope constructs and uses thereof
US20040208848A1 (en) 2002-12-13 2004-10-21 Smith Jonathan F. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
US7078218B2 (en) 2002-12-13 2006-07-18 Alphavax, Inc. Alphavirus particles and methods for preparation
GB2398300A (en) 2003-02-17 2004-08-18 Isis Innovation Method and compositions for boosting immune response
US7425328B2 (en) 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
WO2005033265A2 (en) 2003-04-25 2005-04-14 Epimmune Inc. Optimized multi-epitope constructs and uses thereof
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
KR20060017635A (ko) 2003-06-05 2006-02-24 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 벡터 및파라믹소바이러스 단백질 항원을 포함하는 면역원성 조성물
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
DE602005017743D1 (de) 2004-01-23 2009-12-31 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
CA2563500C (en) 2004-04-28 2016-06-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
ES2361000T3 (es) 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
EP2848692B1 (en) 2004-05-21 2017-08-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
JP5689576B2 (ja) 2004-05-25 2015-03-25 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド αウイルスレプリコンパッケージング構築物
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
CN101056977B (zh) 2004-10-04 2013-01-30 拜欧瓦克西姆有限公司 用于治疗hiv感染患者的亚型匹配的灭活全病毒疫苗
US20060198854A1 (en) * 2004-12-28 2006-09-07 Peter Pushko Vector platforms derived from the alphavirus vaccines
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
FR2882557A1 (fr) 2005-02-25 2006-09-01 Centre Nat Rech Scient Epitopes de vih et composition pharmaceutique les contenant
US7283337B2 (en) 2005-03-04 2007-10-16 Headway Technologies, Inc. Abutted exchange bias design for sensor stabilization
CA2609142C (en) 2005-05-27 2016-02-09 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Therapeutic gene vectors comprising mirna target sequences
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
CA2626253A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
KR101499750B1 (ko) 2006-02-27 2015-03-06 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 가감염성 플라비바이러스 및 이들의 용도
CA2663295C (en) 2006-09-12 2020-03-10 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon particles matched to protein antigens as immunological adjuvants
US9085638B2 (en) 2007-03-07 2015-07-21 The Johns Hopkins University DNA vaccine enhancement with MHC class II activators
GB0706914D0 (en) 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel adenovirus vectors
EP2162540A2 (en) 2007-05-22 2010-03-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
US8969542B2 (en) 2007-05-31 2015-03-03 Genimmune N.V. HPV polyepitope constructs and uses thereof
US8460913B2 (en) 2007-06-21 2013-06-11 Alpha Vax, Inc. Promoterless cassettes for expression of alpha virus structural proteins
US20100015179A1 (en) 2007-08-16 2010-01-21 Frolov Ilya V Attenuation of encephalitogenic alphavirus and uses thereof
WO2009034190A2 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Genimmune N.V. Affinity tag
GB0719526D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Isis Innovation Compositions and methods
US20100285050A1 (en) 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
AU2008338803B2 (en) 2007-11-26 2015-02-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods of generating alphavirus particles
WO2009092113A2 (en) 2008-01-19 2009-07-23 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the delivery of vaccines to disrupted epithelium
US20090253184A1 (en) 2008-01-23 2009-10-08 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to an adenoviral trans-complementing cell line
KR101668849B1 (ko) 2008-01-24 2016-10-24 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 모기에서 복제 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스 및 그의 용도
WO2009120947A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Virxsys Corporation Lentivirus-based immunogenic vectors
WO2009146902A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Okairòs Ag A vaccine for the prevention and therapy of hcv infections
US8093021B2 (en) 2008-06-13 2012-01-10 New York University Defective sindbis viral vectors
ES2544702T3 (es) 2008-07-17 2015-09-02 Medigen, Inc. Vacunas en forma de ADNi y métodos para utilizarlas
RS53782B1 (sr) 2008-10-01 2015-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Preparati tumor-asociranih peptida i odgovarajuća antikancerska vakcina za tretman glioblastoma (gbm) i drugih kancera
WO2010037402A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
US8807362B2 (en) 2008-10-17 2014-08-19 Jeong-min Lee Bottle cap
EP2370455B1 (en) 2008-11-26 2019-07-03 Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Virus like particle compositions and methods of use
US8680258B2 (en) 2008-12-01 2014-03-25 Alphavax, Inc. Use of microRNAs to control virus helper nucleic acids
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
CN101579528B (zh) 2009-06-24 2011-06-29 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 一种hiv复合多表位dna疫苗及其应用
CA2766907A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
GB0918154D0 (en) 2009-10-16 2009-12-02 Isis Innovation Mycobacterial vaccines
ES2647662T3 (es) 2009-12-31 2017-12-26 Medigen, Inc. Vacunas de ADN infeccioso frente al virus chikungunya
WO2013040142A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
EP2569633B1 (en) 2010-05-14 2016-02-10 The General Hospital Corporation Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
NZ606591A (en) 2010-07-06 2015-02-27 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
MX342608B (es) 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
BR112013003579A2 (pt) 2010-08-16 2016-06-07 Salk Inst For Biological Studi adenovírus, células, e, métodos para tratar câncer
MX2013002332A (es) 2010-08-31 2013-03-18 Novartis Ag Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina.
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
KR102759126B1 (ko) 2010-12-30 2025-01-24 파운데이션 메디신 인코포레이티드 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화
US9487563B2 (en) 2011-01-31 2016-11-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles and methods of use
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
CA2835644C (en) 2011-05-13 2021-06-15 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
PL3892295T3 (pl) 2011-05-24 2023-07-24 BioNTech SE Zindywidualizowane szczepionki przeciwnowotworowe
GB201108879D0 (en) 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
WO2012171541A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
EP4115875A1 (en) 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP2559441B1 (en) 2011-08-16 2021-07-21 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex for intracellular delivery and uses thereof
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
RU2014118727A (ru) 2011-10-11 2015-11-20 Новартис Аг Рекомбинантные самореплицирующиеся полицистронные молекулы рнк
KR102181258B1 (ko) 2012-02-16 2020-11-20 브이엘피 테라퓨틱스 엘엘씨 바이러스 유사 입자 조성물
US20160289674A1 (en) 2012-04-02 2016-10-06 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
SG11201407343XA (en) 2012-05-18 2014-12-30 Univ Pennsylvania Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof
WO2013190090A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Philip Morris Products S.A. Gene signatures for classifying and grading lung cancer
EP2870236B1 (en) 2012-07-04 2018-01-10 Sirion Biotech GmbH Means and methods to increase adenovirus production
US20150140068A1 (en) 2012-07-06 2015-05-21 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
US8961995B2 (en) 2012-09-20 2015-02-24 Uab Research Foundation Methods and compositions for alphavirus replicons
GB201220119D0 (en) 2012-11-08 2012-12-26 Univ Cork Vector
US10106781B2 (en) 2012-11-16 2018-10-23 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and use thereof
KR101429696B1 (ko) 2012-11-21 2014-08-13 국립암센터 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
EP2983702A2 (en) 2013-04-07 2016-02-17 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
SG10201709917VA (en) 2013-06-03 2017-12-28 Vlp Therapeutics Llc Malaria vaccine
TWI636065B (zh) 2013-08-05 2018-09-21 伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物
WO2015063647A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Pfizer Inc. Vectors for expression of prostate-associated antigens
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
US20160310584A1 (en) 2013-12-06 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Formulations for neoplasia vaccines
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
CA2960096A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing immune responses
CN107075730A (zh) 2014-09-12 2017-08-18 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 循环核酸的鉴定及用途
CN118994363A (zh) 2014-11-26 2024-11-22 美国卫生和人力服务部 抗突变的kras的t细胞受体
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
EP3234130B1 (en) 2014-12-19 2020-11-25 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell- receptor repertoire
EP3250233A4 (en) 2015-01-29 2018-07-25 Agency for Science, Technology and Research Nanocapsules carrying chikungunya-associated peptides
WO2016124670A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Scil Proteins Gmbh Novel binding proteins comprising a ubiquitin mutein and antibodies or antibody fragments
WO2016154047A2 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Monoclonal antigen-binding proteins to intracellular oncogene products
WO2016154246A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 The Johns Hopkins University Hla-restricted epitopes encoded by somatically mutated genes
IL294183B2 (en) 2015-05-20 2023-10-01 Dana Farber Cancer Inst Inc shared neoantigens
CN120842296A (zh) 2015-09-21 2025-10-28 垂林克生物技术有限公司 用于合成5’-加帽rna的组合物和方法
CN115418401A (zh) 2015-10-08 2022-12-02 会聚基因学有限公司 用于膀胱癌的尿监测的诊断测定
MX2018004544A (es) 2015-10-12 2018-11-09 Nantomics Llc Composiciones y métodos para los neoepítopos de cáncer viral.
EP4011451A1 (en) 2015-10-22 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Metapneumovirus mrna vaccines
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
CN114959918A (zh) 2016-02-29 2022-08-30 基础医疗股份有限公司 用于评估肿瘤突变负荷的方法和系统
CA3014466A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
JP2019513373A (ja) 2016-03-31 2019-05-30 ネオン セラピューティクス， インコーポレイテッド ネオ抗原およびその使用方法
AU2017254477A1 (en) 2016-04-18 2018-11-01 Jennifer G. ABELIN Improved HLA epitope prediction
EP3452082A1 (en) 2016-05-04 2019-03-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Cell-based neoantigen vaccines and uses thereof
BE1024796B9 (fr) 2016-06-02 2019-01-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Constructions antigeniques du virus zika
SG11201811442UA (en) 2016-06-20 2019-01-30 Isa Pharmaceuticals B V Formulation of a peptide vaccine
GB2549809C (en) 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector
CN107698593A (zh) 2016-08-09 2018-02-16 南京天印健华医药科技有限公司 作为fgfr抑制剂的杂环化合物
EP3500294A4 (en) 2016-08-22 2020-07-29 Arbutus Biopharma Corporation ANTI-PD-1 ANTIBODIES, OR THEIR FRAGMENTS, FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS B
JP2020500552A (ja) 2016-11-23 2020-01-16 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド 新生抗原のウイルスによる送達方法
WO2018102585A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Advaxis, Inc. Personalized immunotherapy in combination with immunotherapy targeting recurrent cancer mutations
ES2959811T3 (es) 2016-12-09 2024-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Construcciones de adenovirus de chimpancé con antígenos de Lyssavirus
GB201620968D0 (en) 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
GB201621732D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Agricultural Research Council A multi-epitope dna vaccine for heartwater
AU2017379901B2 (en) 2016-12-21 2024-02-15 Arbutus Biopharma Corporation Methods for ameliorating infusion reactions
CA3058807A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Biontech Us Inc. Protein antigens and uses thereof
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
AU2018279627B2 (en) 2017-06-09 2023-08-10 Seattle Project Corp. Neoantigen identification, manufacture, and use
AR112166A1 (es) 2017-06-16 2019-09-25 Arbutus Biopharma Corp Composiciones terapéuticas y métodos para el tratamiento de hepatitis b
JP7760242B2 (ja) 2017-07-21 2025-10-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの治療法及び診断法
CN111868260B (zh) 2017-08-07 2025-02-21 约翰斯霍普金斯大学 用于评估和治疗癌症的方法和材料
WO2019090156A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Guardant Health, Inc. Normalizing tumor mutation burden
TW201930340A (zh) 2017-12-18 2019-08-01 美商尼恩醫療公司 新抗原及其用途
WO2019170773A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Cancer Research Technology Limited Improvements in variant detection
US12024738B2 (en) 2018-04-14 2024-07-02 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring
JP2021524247A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 免疫チェックポイント阻害剤の共発現ベクター
AU2019275072A1 (en) 2018-05-23 2021-01-21 Seattle Project Corp. Shared antigens
AU2019374874A1 (en) 2018-11-07 2021-06-10 Gritstone Bio, Inc. Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors
KR20220041844A (ko) 2019-07-02 2022-04-01 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 Hiv 항원 및 mhc 복합체
WO2021092095A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen vaccine therapy
WO2021119545A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Gritstone Bio, Inc. Durable vaccination
WO2021142437A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Gritstone Bio, Inc. Cell-free dna monitoring
EP4138890A4 (en) 2020-04-21 2024-07-31 Gritstone bio, Inc. ANTIGEN CODING CASSETTES
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083716A (en) * 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
JP2012516679A (ja) * 2009-02-02 2012-07-26 オカイロス アーゲー サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
US9402888B2 (en) * 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
JP2022534282A (ja) * 2019-05-30 2022-07-28 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 改変アデノウイルス

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTHERAPY, 1998, VOL.12 NO.5, P.785-787, JPN6022022594, ISSN: 0005518139 *
CURR OPIN MOL THER., 2002, VOL.4 NO.1, P.28-34, JPN6022022593, ISSN: 0005741824 *
VIROLOGY, 1997, VOL.239, P.389-401, JPN6022022591, ISSN: 0005518137 *
VIROLOGY, 2008, VOL.370 NO.1, P.22-32, JPN6022022592, ISSN: 0005518138 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2023202423A1 (en) 2023-05-11
MX2019013259A (es) 2020-01-13
US12109257B2 (en) 2024-10-08
EP3634449A1 (en) 2020-04-15
TW202333779A (zh) 2023-09-01
CO2019013609A2 (es) 2020-04-01
CN110612116A (zh) 2019-12-24
AU2018266705B2 (en) 2023-05-04
RU2019138741A (ru) 2021-06-09
RU2019138741A3 (ja) 2021-09-23
MX2025009055A (es) 2025-09-02
KR102945203B1 (ko) 2026-03-31
BR112019023477A2 (pt) 2020-06-30
ZA201907461B (en) 2023-04-26
TW201907937A (zh) 2019-03-01
US11504421B2 (en) 2022-11-22
SG11201910101SA (en) 2019-11-28
CA3062591A1 (en) 2018-11-15
KR20200003390A (ko) 2020-01-09
IL270396B2 (en) 2025-02-01
IL270396B1 (en) 2024-10-01
JP2020518648A (ja) 2020-06-25
PH12019502518A1 (en) 2020-07-20
IL270396A (ja) 2019-12-31
AU2018266705A1 (en) 2020-01-02
US11510973B2 (en) 2022-11-29
AU2023202423B2 (en) 2025-11-27
US20200197500A1 (en) 2020-06-25
PE20191842A1 (es) 2019-12-31
US20240024445A1 (en) 2024-01-25
US20220226453A1 (en) 2022-07-21
EP3634449A4 (en) 2021-03-17
WO2018208856A1 (en) 2018-11-15
IL315224A (en) 2024-10-01
US20250249084A1 (en) 2025-08-07
AU2026201462A1 (en) 2026-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023123766A (ja) アルファウイルス新生抗原ベクター
KR102950716B1 (ko) 신생항원의 바이러스성 전달
KR20210013105A (ko) 공유 항원
KR20220016137A (ko) 변형된 아데노바이러스
KR20210090650A (ko) 알파바이러스 신생항원 벡터 및 인터페론 억제제
KR20230046313A (ko) 다중에피토프 백신 카세트
KR20210013589A (ko) 면역 체크포인트 억제제 공동-발현 벡터
KR20220098379A (ko) 공유 네오항원을 표적으로 하는 항원-결합 단백질
KR20220041844A (ko) Hiv 항원 및 mhc 복합체
KR20230015914A (ko) 캡핑 화합물, 조성물 및 이의 사용 방법
KR20230006825A (ko) 전염성 질병 항원 및 백신
KR20230014694A (ko) 항원-코딩 카세트
KR20170102002A (ko) 에볼라 바이러스 백신접종을 위한 방법 및 조성물
EP4125973A1 (en) Neoantigen vaccine therapy
RU2803566C2 (ru) Неоантигенные векторы на основе альфавируса
TWI918097B (zh) 經修飾之腺病毒
KR20260057158A (ko) 알파바이러스 신생항원 벡터
KR20230117163A (ko) 상동 아데노바이러스 백신접종
KR20260052208A (ko) 신생항원의 바이러스성 전달
TW202613314A (zh) 新抗原之病毒遞送

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230731

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230731

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231127

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240404

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240610

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241002

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20250203

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20250321

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250801

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20251201