JPH02131592A - 甘味料の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、新規な甘味料の製造方法に関し，更に詳し
くはステビ才一ル配糖体であるステビオサイドまたはル
プソサイドのβ−ガラクトース転移酵素による転移反応
において、１９位のＣＯＯＨにエステル結合するβ−グ
ルコシル基（以下、１９位のグルコシル基と記す）にガ
ラクトースを優先的に転移させ、更に第二段のα−グル
コシル転移反応により、■３位のＯＨにエーテル結合す
るβ−グルコシル基（以下、１３位のグルコシル基と記
す）に選択的にグルコースを転移させる新規な甘味料の
製造方法、更に第三段のβ−ガラクトシダーゼの加水分
解反応により、１９位の糖鎖の末端ガラクトシル基をは
ずした甘味料の新規な製造方法に関するものである． （従来の技術） 近年、人工甘味料であるサッカリン、ズルチン、チクロ
等が安全性のウ、から一般食品への使用が禁止、または
規制される傾向にある．一方では、近年砂糖の採りすぎ
による健康上の影響が問題にされはじめたことから、そ
れ等の問題がより少ない天然甘味料の開発が熱望されて
いる． これに対して、南米パラグアイ原産のキク科植物である
ステビアから得られるステビオサイド及び中国南部、広
西，広東地方に野生するバラ科、キイチゴ属の潅木、甘
葉懸鈎子の葉から得られるルプソサイドは、下記の構造
式（１）及び（ＩＩ）に示すように、ステビ才一ル配糖
体であるが、これらは砂糖と異なり、低カロリーの甘味
料であり、しかも甘味度は砂糖の約１１４〜１４５倍と
高（式中β−ｇｌｕｃ：　β−グルコシル基）ところが
、上記ステビオール配糖体であるステビオサイド、ルプ
ソサイドの甘味質には苦味、嫌味があり、更に残味が長
《尾を引くという欠点があるため、ａまたはβ−グルコ
シル転移酵素でグルコシル化することにより、これらの
欠点を改善した製品が生産されているが、未だ充分な成
果を収めるには至っていない． ステビ才サイドの甘味度、甘味質の改良法については、
数多くの研究報告並びに特開昭５４−５０７０号など数
多くの特許出願がなされている．またルプソサイドにつ
いては、サイクロデキストリンを添加することにより甘
味質を改善する方法が提案されている（特願昭５８−７
１８６７号）．更に、ルプソサイドにバシラス・メガテ
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕａ＋）
が生産するサイクロデキストリングルカノトランスフエ
ラーゼ（以下．　ＣＧＴａｓｅと記す）を用い、澱粉を
糖供与体として、酵素転移を行なうことにより甘味質を
改善する方法も捉案されている． （発明が解決しようとする問題点） しかし、上述のルプソサイドにＣＧＴａｓｅを用いて澱
粉を酵素転移させる方法については、味質の充分な改善
が行なわれず、またステビオサイドについても同様であ
る． これらの原因については、上述の反応においてはルプソ
サイドの１３位または１９位のグルコシル基にグルコー
スが１〜３分子それぞれ一方に転移するもの、また両方
に転移するもの等の混合物が生成するが、このうち１３
位のグルコシル基にグルコースが１〜３分子転移したも
のは、甘味度、味質共に改良されるが、１３位のグルコ
シル基より、１９位のグルコシル基により多くのグルコ
ースが転移した生成物は、甘味度、味質が低下すること
等が１９８４年にＡｇｒｉ．　．Ｂｉｏｌ．　．ｃｈｅ
ｍ．　４８　ｆｌＯ）　２４８３　〜２４８８に報告さ
れている。

即ち、上述の反応の結果得られた転移生成物は味質が改
善されたもの、逆に悪くなったものの混合物であるので
、その味質は充分な改善に至らないのである． この結果、１３位のグルコシル基が転移した生成物のみ
を単離すれば、良質の甘味料となることは明らかである
が、分離が容易でなく、仮に分離しても高価となり、実
用的ではなくなることから、現在、混合物として市販さ
れている． 一方，ステビオール配糖体の１９位のカルボキシル基に
エステル結合したグルコシル基を化学的方法によりガラ
クトシル基に置換させて得られた合成ステビオール配糖
体を受容体とし、これにＣＧＴａｓｅを作用させ、１３
位のグルコシル基にグルコースを選択的に転移させた場
合の甘味度、味質の改善についての研究報告がなされて
いる（日本薬学会大会講演要旨集、６Ｅ１５　２−４　
　昭和６３年３月１０日発行） しかし、この方法においてはステビオール配糖体の１９
位のカルボキシル是にエステル結合したグルコシル基を
化学的方法によりガラクトシル基に置換させてステビオ
ール配糖体を合成しているが、一般にステビ才一ル配糖
体の１９位のグルコシル基を外すと、甘味度乃至味質が
低下する傾向が見られる．またこの方法においては反応
中に触媒としてＡｇなとの金属を使用するため、甘味料
などの食品添加物として使用する場合、人体への影響等
が問題となる。

（問題点を解決するための手段） そこで、この発明ではステビ才一ル配糖体の１９位のグ
ルコシル基を外すことなく、酵素法による新たな甘味料
の製造方法を提案するものである．具体的には、本願第
１発明はステビオール配糖体であるステビオサイドまた
はルプソサイドとβーガラクトシル糖化合物とを含有す
る水溶液または懸濁液にβ−ガラクトシル転移酵素を作
用させることによって各々の１９位のグルコシル基に優
先的にガラクトースを転移させる第一段酵素反応、更に
その転移反応液を加熱し、β−ガラクトシル転移酵素を
失活させた後、ａ−グルコシル糖化合物を加え、ａ−グ
ルコシル転移酵素を作用させて１３位のグルコシル基に
選択的にグルコースを転移させる第二段酵素反応から成
り立っている．更に、本願第２発明においては味質を改
良する手段として、第二段酵素反応液を加熱し、α−グ
ルコシル転移酵素を失活させ、基質となるβ−ガラクト
シル・α−グルコシルスデビ才サイドまたはβ−ガラク
トシル・ａ−グルコシルルプソサイド溶液にβ−ガラク
トシダーゼを作用させ、１９位の糖鎖のβ−ガラクトシ
ル基を分解してはずし、α−グルコシルステビオサイド
またはα−グルコシルルプソサイドとする第三段酵素反
応を行なわせるものである． この発明の第一段酵素反応に用いるβ−ガラクトシル糖
化合物（以下、ＧＡ糖供与体と記す）は、ラクトース、
β−ガラクタン等が使用されるが、β−ガラクタンの分
解物であるオリゴマーでもよい． β−ガラクトシル転移酵素は、ＧＡ糖供与体とステビオ
サイドまたはルプソサイドを含有する水溶液または懸濁
液に作用させるとき、ＧＡ糖供与体を分解し，そのガラ
クトースをステビオサイドまたはルプソサイドの１９位
のグルコシル基に優先的に転移させ、β−ガラクトシル
ステビ才サイドまたはβ−ガラクトシルルプソサイドを
生成するものであれば何れも使用可能である。

このようなβ−ガラクトシル転移酵素は，植物の種子に
存在するほか、例えばバシラス・サーキュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓｌ、エシエリキア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ラクトバ
シラス・ビフィズス　ｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
　ｂｉｆｉｄｕｓ　）等の細菌およびロドツルラ・ミヌ
タ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍｉｎｕｔａ）．ロドツ
ルラ・ラクトサ　（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｌａｃｔ
ｏｓａ）等の酵母により生産されることが知られている
．反応に用いるステビオサイドまたはルプソサイドとβ
−ガラクトシル糖化合物とを含有する水溶液または懸濁
液は、ステビオサイドまたはルプソサイドの濃度が約１
〜４０％ｆＷ／Ｗ）　．　ＧＡ糖供与体の濃度が約０．
５〜５０％（Ｗ／１１とし、且つステビオサイドまたは
ルプソサイドに対するＧＡ糖供与体の比率は使用するＧ
ＡＩＩ供与体によって異なるが、０．１〜５０倍の範囲
とし、好まし《は０．５〜２倍の範囲とする． また、第１段酵素反応の使用酵素活性量は反応時間と密
接な関係があり、通常は５〜１２０時間、好ましくは５
〜４８時間で反応が終了する酵素活性量にすればよいが
、これに限定されるものでない． 更に、反応液のｐＨと温度は通常ｐＨ４〜８、温度２０
〜７０℃が適当であり、このような条件下で第段酵素反
応を行なわせ、ステビオサイドまたはルプソサイドの１
９位のグルコシル基に優先的にガラクトースを転移させ
る。

この発明の第二段酵素反応に用いる受容体であるガラク
トース転移生成物は第一段酵素反応液を加熱し、酵素を
失活させた反応液でもよいが、さらに精製分画したβ−
ガラクトシルステビオサイドまたはβ−ガラクトシルル
プソサイドであることが好ましい． α−グルコシル糖化合物（以下．ＧＬ糖供与体と記す）
は澱粉糊化物、澱粉部分分解物等のα−グルカンが使用
される． また、α−グルコシル転移酵素はＧＬ糖供与体と第一段
酵素反応にて得られる転移生成物、β−ガラクトシルス
テビオサイドまたはβ−ガラクトシルルプソサイドを含
有する水溶液または懸濁液に作用させるとき、ＧＬ糖供
与体を分解し、そのグルコースを受容体の１３位のグル
コシル基に選択的に転移させ、β−ガラクトシル・ａ−
グルコシルステビ才サイドまたはβ−ガラクトシル・α
−グルコシルルプソサイドを生成するものであれば使用
できる． このよりなａ−グルコシル転移酵素としては、グルコシ
ル基が受容体となり得るが、ガラクトシル基は受容体と
なり得ない酵素、例えばバシラス・マセランス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓｌ．バシラス・メガテリ
ウム　ｌＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　）
　　，パシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｃｉｒｕｃｕｌａｎｓ）．バシラス・ステアロサーモフ
ィルスｆＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉ　ｌｕｓ）等の生産するＣＧＴａｓｅまたはビー
ル酵母等の生産するａ−グルコシターゼ等を使用するこ
とができる。

第二段酵素反応系において、第一段酵素反応液に対する
ＧＬＷＭ供与体の比率は、第一段酵素反応液の精製度、
使用するＧＬ糖供与体によっても異なるが、一般には０
．１〜５０倍の範囲、好ましくは１〜５倍の範囲である
． 第二段酵素反応のｐＨと温度は、通常ｐＨ４〜８、温度
２０〜７０℃が適当であり、使用酵素活性量は反応時間
と密接な関係があり、通常は５〜１２０時間、好ましく
は５〜４８時間で反応が終了する酵素活性量にすれば良
いが、これらに限定されるものではない。

このような条件下に第二段酵素反応を行なわせてβ−ガ
ラクトシル・ａ−グルコシルステビ才サイドまたはβ−
ガラクトシル・ａ−グルコシルルプソサイドの１３位の
グルコシル基にグルコースを選択的に転移させる． この発明の第三段酵素反応に用いる基質は、第二段酵素
反応液を加熱し、酵素を失活させた反応液そのものか、
またはさらに精製分画したβ−ガラクトシル・α−グル
コシルステビオサイドまたはβ−ガラクトシル・ａ−グ
ルコシルルプソサイドでもよい． ここでβ−ガラクトシダーゼは、第一段酵素反応に用い
る萌記β−ガラクトシル転移酵素を使用することができ
る． また第三段酵素反応のｐＨ及び反応温度は、通常ｐＨ４
〜８、温度２０〜７０℃が適当であり、このような条件
下に反応を行なわせ、β−ガラクトシル・α−グルコシ
ルステビオサイドまたはβ−ガラクトシル・ａ−グルコ
シルルプソサイドの１９位のグルコシル基に転移させた
β−ガラクトシル基を外す．　なお、第一段、第二段、
第三段の酵素反応に使用する各酵素の調製方法としては
、該微生物の固体培養および液体培養の何れを使用して
もよいが、最近では殆ど液体培養で行なわれている． その培養液は通常、不溶物を除去した培養上澄液を酵素
として使用するか、菌体内酵素である場合は分離した菌
体をそのまま使用するか、抽出して利用すればよい．ま
た必要に応じて、上記抽出液をさらに精製して用いても
よい． 植物起源のβ−ガラクトシル転移酵素を使用する場合は
公知の方法により抽出精製すればよく、目的に応じて粗
製、精製品の何れかを選択すればよい。また、これら各
酵素は上記のごとく調製するのではなく、市叛されてい
る酵素剤を用いることもできる． （発明の効果） 以上のような方法により、得られた第二段酵素反応液を
、吸着樹脂（商品名：ダイヤイオン■Ｐ２〇三菱化成社
製）によるカラムクロマトおよびシリカゲルクロマトに
かけ分画、分取した後、その画分を１３Ｃ−ＮＭＲによ
る構造解析、ヨウ化リチウム、２．６−ルチジン、メタ
ノール試薬を用いて、！９位のエステル結合を選択的に
分解し、その分解した糖鎖の解析、およびグルコアミラ
ーゼによる分解試験の結果、下記構造式（■１）及び（
ＩＶ）に示すようなβ−ガラクトシル、ａ−グルコシル
ステビオサイドおよびβ−ガラクトシル，αーグルコシ
ルルプソサイドであることを確認した． ａ−グルコシル基、β−ｇａｌ　：β−ガラクトシル基
、ｎ：１〜４の任意の整数） 上記のようにして得られた転移反応生成物の内、ｎ＝２
のβ−ガラクトシル、α−グルコシルステビオサイドの
甘味度は、原体のステビオサイドの約２倍となり、ｎ＝
２のβ−ガラクトシル、ａ−グルコシルルプソサイドに
おいては約２．７倍となった。

また味質についても各々原体と比べて改善されることを
パネル試験により確認した． 更に第三段酵素反応にて、１９位の糖鎖の末端ガラクト
シル基を分解してはずしたα−グルコシルステビオサイ
ドおよびα−グルコシルルプソサイドは、より味質が改
善されることをパネル試験により確認した． またこの発明においては酵素法により製造し、前述の合
成法のように反応中に触媒として重金属を使用しないた
め、各転移生成物を甘味料などの食品ｉｎ加物として使
用しても人体への影響も皆無である． したがって、このようにして得られた各転移生成物の反
応液は、そのまま甘味料として使用できるが、必要に応
じて酵素を失活させて濾過後、その溶液をイオン交換樹
脂、例えばＨ型強酸性カチ才ン交換樹脂およびＯＨ型弱
酸性アニ才ン交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮してシラッ
プ状の甘味料とするか、またはこの濃縮液を乾燥して粉
末状の甘味料とすることもできる． （実施例） 以下、実施例を挙げて、この発明を具体的に説明する． 実施例ｌ 乾燥したステビアの葉から抽出精製した純度９７％のス
テビオサイド１０ｇ、ラクトースｌＯｇを５０＋ｎＭリ
ン酸緩衝液ｆｐＨ　６．０）５０ｍｌに加えて加熱溶解
後、同緩衝液にて１００ｍｌとした。その後、β−ガラ
クトシル転移酵素としてラクターゼ（大和化成社製）を
０．０２ｇ添加し、４０℃にて２４時間反応させた．反
応後に酵素を加熱、失活させた反応液を吸着樹脂に吸着
させた後、６０％メタノールで溶出し、未反応ステビオ
サイドと転移反応生成物を分取した．更に、この転移反
応生成物をシリカゲルクロマトおよび液体クロマト法に
より分画、分取した．得られた両分は３種（Ａ）、（Ｂ
）、（Ｃ）であり、生成比率は８６：８：６となった．
この両分（Ａ）〜（Ｃ）を”Ｃ　−　Ｎ　Ｍ　Ｒ解析お
よびヨウ化リチウム、２．６−ルチジン、メタノール試
薬にて、１９位のグルコシル基にガラクトースが転移し
たものであることを確認した． 次の第二段酵素反応は上記、β−ガラクトシルステビオ
サイド（Ａ）粉末５ｇ、可溶性澱粉５ｇを５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ　５．４１５Ｏｎ＋１に加えて加熱溶解後
、同緩衝液にて１０Ｏｎ＋１とした．その後粗ＣＧＴａ
ｓｅ　（Ｂａｃｉ１１ｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ　　起源
）１５０単位を添加し、４０℃にて２４時間反応させた
。この反応液を加熱し、酵素を失活させた後、この溶液
を吸着樹脂に吸着させた．その後、６０％メタノールで
溶出し、未反応β一ガラクトシルステビ才サイドと転移
生成物をシノ力ゲルクロマトおよび液体クロマトにより
分画、分取した．ここで、得られた画分Ａ１〜Ａ５につ
いては、”Ｃ−ＮＭＲ解析，ヨウ化リチウム、２．６−
ルチジン、メタノール試薬を用いて、１９位のエステル
結合を選択的に分解し、その分解した糖鎖の解析、グル
コアミラーゼによる分解試験の結果、Ａ１は未反応のＢ
−ガラクトシルステビオサイドであり、Ａ２〜Ａ５迄は
β−ガラクトシルステビオサイドの１３位の糖鎖に選択
的にグルコースｈｓａ−１．４結合で１〜４分子転移し
たものであることを確認した． なお、この転移生成物のｎ＝１または２のものの甘味度
は，かなり増強され、味質も苦味、嫌味がな《なり，ま
ろやかな甘味に改善された．実施例２ 実施例ｌにて、得られたβ−ガラクトシル・α一グルコ
シルステビオサイド軸を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　
６．０）５０ａ＋１に加えて溶解し、同緩衝液にて１０
１１１＋ｅｌとした後、β−ガラクトシダーゼとしてラ
クターゼ（大和化成社製）を０．０１ｇ添加し、４０℃
にて５時間反応させた．反応後に酵素を加熱、失活させ
た反応液をシリカゲルクロマトおよび液体クロマト法に
より基質と分解物を分画、分取した．得られた分解物、
α−グルコシルステビオサイド画分は７０％であった．
このａ−グルコシルステビオサイドの味質についてパネ
ル試験を行なった結果、基質のβ−ガラクトシル・α〜
グルコシルステビオサイドよりさらに味質が改善された
ことを確認した． 実施例３ 乾燥した甘葉懸鈎子から抽出精製した純度９８％のルプ
ソサイドを受容体として使用する以外は、実施例ｌと同
じく、二段反応を行なった．第一段酵素反応における転
移生成物のうち．　１９位のグルコシル基にガラクトー
スが転移したβ−ガラクトシルルプソサイドは実施例ｌ
とほぼ近い８７２であった。更に、第二段の酵素反応に
おいては．やはり１９位の糖鎖のガラクトシル基にはグ
ルコースの転移は認められず，１３位のグルコシル基の
みにα−グルコースが１〜４分子転移していることを確
認した． 実施例４ 実施例２にて得られたβ−ガラクトシルーα−グルコシ
ルルプソサイドを基質とする以外は実施例２に同じく第
三段反応を行なった． 得られた分解物α−グルコシルルプソサイド画分は７２
％であった．得られた分解物の味質も、やはり反応前の
β−ガラクトシル・α−グルコシルルプソサイドより味
質が改善されることを確認した． 実施例５ β−ガラクトシル転移酵素として、β−ガラクトシダー
ゼ（ベーリンガー社製）を用いる以外は，実施例３と同
じく、二段酵素反応を行なった． この第一段酵素反応における転移生成物のうち、１９位
のグルコシル基に優先的にガラクトースが転移したβ−
ガラクトシルルプソサイドは実施例３と同様にほぼ８５
％に近いものであった．更に第二段酵素反応においては
、やはり１９位の糖鎖のガラクトシル基にはグルコース
の転移は認められず．　１３位のグルコシル基に選択的
にグルコースが１〜４分子転移していることを確認した
．特許出願人　北海道糖業株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ステビオール配糖体であるステビオサイドまたは
   ルプソサイドとβ−ガラクシトシル糖化合物を含む水溶
   液または懸濁液にβ−ガラクトシル転移酵素を作用させ
   てステビオール配糖体の１９位のＣＯＯＨにエステル結
   合するβ−グルコシル基にガラクトースを優先的に転移
   させた後、β−ガラクトシル転移酵素を加熱失活させ、
   更にこの反応液にα−グルコシル糖化合物を加えた水溶
   液または懸濁液にα−グルコシル転移酵素を作用させて
   、１３位のＯＨにエーテル結合するβ−グルコシル基に
   グルコースを選択的に転移させることを特徴とする甘味
   料の製造方法。
2. （２）第１項記載の方法により、甘味料を製造した後、
   α−グルコシル転移酵素を加熱失活させ、更にこの反応
   液にβ−ガラクトシダーゼを作用させ、最初に１９位の
   ＣＯＯＨにエステル結合するβ−グルコシル基に転移さ
   せたβ−ガラクトシル基をはずすことを特徴とする甘味
   料の製造方法。