JP2673659B2 - ペプチド - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生理活性を有する新規
ペプチド及び該ペプチドを含有する医薬組成物に関する
ものである。
ペプチド及び該ペプチドを含有する医薬組成物に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】食品蛋白質からは多様な生理活性を有す
るペプチドが派生することが知られている。食品起源で
あるこれらペプチドには生体に対する安全性が期待でき
る。一般に食品蛋白質由来の生理活性ペプチドは、内因
性生理活性ペプチドとは異なり予想もつかないようなア
ミノ酸配列を持つものが多く、またその機能についても
複数あることから、今なお確認されていないものも数多
くあるものと思われる。ペプチドの持つ生理活性作用の
１つに貪食（ファゴサイトーシス）促進作用がある。こ
の作用は生体内に細菌等の外的異物が進入してきた場
合、好中球やマクロファージによる生体防御の初発反応
として重要である。本発明者は先にファゴサイトーシス
を活性化するペプチドとして、大豆グリシニンＡ1aサブ
ユニットに含まれるGln-Arg-Pro-Arg やHis-Cys-Gln-Ar
g-Pro-Arg がマクロファージの貪食能を高めることにつ
いて証明し、新規なペプチドとして報告してきた。
るペプチドが派生することが知られている。食品起源で
あるこれらペプチドには生体に対する安全性が期待でき
る。一般に食品蛋白質由来の生理活性ペプチドは、内因
性生理活性ペプチドとは異なり予想もつかないようなア
ミノ酸配列を持つものが多く、またその機能についても
複数あることから、今なお確認されていないものも数多
くあるものと思われる。ペプチドの持つ生理活性作用の
１つに貪食（ファゴサイトーシス）促進作用がある。こ
の作用は生体内に細菌等の外的異物が進入してきた場
合、好中球やマクロファージによる生体防御の初発反応
として重要である。本発明者は先にファゴサイトーシス
を活性化するペプチドとして、大豆グリシニンＡ1aサブ
ユニットに含まれるGln-Arg-Pro-Arg やHis-Cys-Gln-Ar
g-Pro-Arg がマクロファージの貪食能を高めることにつ
いて証明し、新規なペプチドとして報告してきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】その後、大豆蛋白質か
ら由来するペプチドについて更なる研究を行ったとこ
ろ、新たに大豆蛋白酵素分解物中にファゴサイトーシス
促進活性を初めとして、他にも優れた生理活性効果を持
つペプチドを見いだした。またその類似化合物について
も検討し、上記ペプチドと同様な効果を有することを見
いだして本発明を完成した。従って、本発明は上記生理
活性を有する新規ペプチド及び該ペプチドの新規な食品
及び医薬用途を提供せんとするものである。
ら由来するペプチドについて更なる研究を行ったとこ
ろ、新たに大豆蛋白酵素分解物中にファゴサイトーシス
促進活性を初めとして、他にも優れた生理活性効果を持
つペプチドを見いだした。またその類似化合物について
も検討し、上記ペプチドと同様な効果を有することを見
いだして本発明を完成した。従って、本発明は上記生理
活性を有する新規ペプチド及び該ペプチドの新規な食品
及び医薬用途を提供せんとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、次式で示され
る配列番号１〜10のペプチドに関するものである。 配列番号１：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg 配列番号２：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly 配列番号３：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro 配列番号４：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys 配列番号５：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn 配列番号６：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val 配列番号７：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro 配列番号８：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile 配列番号９：Met-Ile-Thr-Leu-Ala 配列番号10：Met-Ile-Thr-Leu さらに本発明は、上記配列番号１〜10で示されるペプチ
ド及びその医薬上許容される塩を有効成分とする免疫系
賦活作用を有する医薬組成物に関するものである。上記
配列番号１〜10で示されるペプチドは、配列の長さ13〜
４で、いづれも 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド の性状を有する。
る配列番号１〜10のペプチドに関するものである。 配列番号１：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg 配列番号２：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly 配列番号３：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro 配列番号４：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys 配列番号５：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn 配列番号６：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val 配列番号７：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro 配列番号８：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile 配列番号９：Met-Ile-Thr-Leu-Ala 配列番号10：Met-Ile-Thr-Leu さらに本発明は、上記配列番号１〜10で示されるペプチ
ド及びその医薬上許容される塩を有効成分とする免疫系
賦活作用を有する医薬組成物に関するものである。上記
配列番号１〜10で示されるペプチドは、配列の長さ13〜
４で、いづれも 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド の性状を有する。
【０００５】本発明の有効成分である配列番号１のペプ
チドは、大豆蛋白質を酵素加水分解し、得られた消化物
を、ＤＥＡＥ−セルロースカラムによるクロマトグラフ
ィー、さらにオクタデシリル（ＯＤＳ）カラム及びフェ
ネチルカラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によって分画することによって得ることができ
る。
チドは、大豆蛋白質を酵素加水分解し、得られた消化物
を、ＤＥＡＥ−セルロースカラムによるクロマトグラフ
ィー、さらにオクタデシリル（ＯＤＳ）カラム及びフェ
ネチルカラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によって分画することによって得ることができ
る。
【０００６】本発明者らは、大豆蛋白質の酵素分解によ
って得られる配列番号１のペプチドがファゴサイトーシ
ス促進作用を有することを見いだし、該ペプチドに基づ
いて更に研究を進めた結果、配列番号１のペプチド及び
その類似体である配列番号２〜10のペプチドもファゴサ
イトーシス促進作用を示し、また配列番号１〜８のペプ
チドが活性酸素産出促進作用を持つことを見いだした。
従って配列番号１〜10のペプチドは免疫系賦活作用を有
する医薬組成物として使用することができる。
って得られる配列番号１のペプチドがファゴサイトーシ
ス促進作用を有することを見いだし、該ペプチドに基づ
いて更に研究を進めた結果、配列番号１のペプチド及び
その類似体である配列番号２〜10のペプチドもファゴサ
イトーシス促進作用を示し、また配列番号１〜８のペプ
チドが活性酸素産出促進作用を持つことを見いだした。
従って配列番号１〜10のペプチドは免疫系賦活作用を有
する医薬組成物として使用することができる。
【０００７】本発明のペプチドは上記の方法によって配
列番号１のペプチドを得、これを更に加水分解し、分画
して配列番号２〜10のペプチドを得ることができるほ
か、ペプチド合成機を用いて公知の方法によって配列番
号１〜10のペプチドを得ることもできる。
列番号１のペプチドを得、これを更に加水分解し、分画
して配列番号２〜10のペプチドを得ることができるほ
か、ペプチド合成機を用いて公知の方法によって配列番
号１〜10のペプチドを得ることもできる。
【０００８】
【製造例】以下に本発明の配列番号１〜10のペプチド製
造の一例を示すが、これらの例に限定されるものではな
い。
造の一例を示すが、これらの例に限定されるものではな
い。
【０００９】製造例１ 消化酵素による配列番号１のペ
プチドの調製 Ａ．消化酵素による調製法の概略を下記表−１に示す。 表−１ 大豆蛋白質からの調製法の概略 大豆蛋白質 ↓ トリプシン消化 ↓ カラムクロマト（ＤＥＡＥセルロースカラム） ↓ ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−カラム） ↓ ＨＰＬＣ（フェネチルカラム） ↓ ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−カラム） ↓ Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg
プチドの調製 Ａ．消化酵素による調製法の概略を下記表−１に示す。 表−１ 大豆蛋白質からの調製法の概略 大豆蛋白質 ↓ トリプシン消化 ↓ カラムクロマト（ＤＥＡＥセルロースカラム） ↓ ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−カラム） ↓ ＨＰＬＣ（フェネチルカラム） ↓ ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−カラム） ↓ Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg
【００１０】Ｂ．大豆蛋白質消化物からの配列番号１の
ペプチドの調製 分離大豆蛋白質50ｇを 800mlの水に溶解し、3000rpm ×
20分の遠心により可溶性画分を分離した。これを30分煮
沸し、 500mgのトリプシンを加え１Ｎ−ＮａＯＨでpH＝
7.6 に調整して、37℃で消化を行った。５時間後煮沸に
より消化を停止させ、 10000rpm ×15分の遠心分離によ
って得た上澄み液の凍結乾燥によってトリプシン消化物
（固形物量23.8ｇ）を得た。このうちの 100mgをＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラム（ＤＥ−５２、ワットマン製、担
体２ml）にロードし20mMのトリス−塩酸緩衝液（pH＝7.
8 ）によって展開し、非吸着画分を１mlずつ分取したと
ころ、活性ペプチドは２ml〜３mlの位置に溶出する画分
に含まれていた。次にこの画分を、ＯＤＳ−カラム（Co
smosil 5C18-AR, 20 × 250mm、ナカライテスク製）、
続いてフェネチルカラム（4.7 × 250mm、Develosil Ph
A-T-5,野村化学製）にロードし、 0.1％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（１％／min
）により展開した。これらカラムによる活性ペプチド
の溶出は、各々アセトニトリル33〜34％（図１参照）、
36〜37％の位置であった（図２参照）。さらにこの活性
画分をＯＤＳ−カラム（Cosmosil 5C18-AR, 4.6× 150
mm、ナカライテスク製）にロードし、10mMのリン酸緩衝
液（pH＝7.4 ）を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配
（１％／min ）により展開したところ、活性ペプチドは
アセトニトリル34〜35％の位置に単一のピークとして溶
出した（図３参照）。プロテインシーケンサーにて構造
決定したところ、活性ペプチドはMet-Ile-Thr-Leu-Ala-
Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg であることが判明し
た。
ペプチドの調製 分離大豆蛋白質50ｇを 800mlの水に溶解し、3000rpm ×
20分の遠心により可溶性画分を分離した。これを30分煮
沸し、 500mgのトリプシンを加え１Ｎ−ＮａＯＨでpH＝
7.6 に調整して、37℃で消化を行った。５時間後煮沸に
より消化を停止させ、 10000rpm ×15分の遠心分離によ
って得た上澄み液の凍結乾燥によってトリプシン消化物
（固形物量23.8ｇ）を得た。このうちの 100mgをＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラム（ＤＥ−５２、ワットマン製、担
体２ml）にロードし20mMのトリス−塩酸緩衝液（pH＝7.
8 ）によって展開し、非吸着画分を１mlずつ分取したと
ころ、活性ペプチドは２ml〜３mlの位置に溶出する画分
に含まれていた。次にこの画分を、ＯＤＳ−カラム（Co
smosil 5C18-AR, 20 × 250mm、ナカライテスク製）、
続いてフェネチルカラム（4.7 × 250mm、Develosil Ph
A-T-5,野村化学製）にロードし、 0.1％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（１％／min
）により展開した。これらカラムによる活性ペプチド
の溶出は、各々アセトニトリル33〜34％（図１参照）、
36〜37％の位置であった（図２参照）。さらにこの活性
画分をＯＤＳ−カラム（Cosmosil 5C18-AR, 4.6× 150
mm、ナカライテスク製）にロードし、10mMのリン酸緩衝
液（pH＝7.4 ）を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配
（１％／min ）により展開したところ、活性ペプチドは
アセトニトリル34〜35％の位置に単一のピークとして溶
出した（図３参照）。プロテインシーケンサーにて構造
決定したところ、活性ペプチドはMet-Ile-Thr-Leu-Ala-
Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg であることが判明し
た。
【００１１】製造例２ 化学合成法（Fmoc法）による配
列番号１のペプチドの調製 置換率 0.70meq／ｇの Fmoc-Arg(Pmc)- 樹脂 0.3ｇをＳ
ＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の反応容器
にセットし、デブロック液（ピペリジン：トルエン：ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）＝30：35：35）を加え攪
拌して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基
を除去した。この樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）：Ｄ
ＭＦ＝１：１で洗浄後、 Fmoc-Arg(Pmc)- 樹脂の４倍当
量のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）及びFm
oc-Glyを加えてカップリングを行った。反応終了後、Ｄ
ＣＭ：ＤＭＦ＝１：１で洗浄し、Fmoc-Gly-Arg(Pmc)-樹
脂を得た。以下同様にしてＮ末端の Metまで合成し、Ｄ
ＣＭ、メタノールで洗浄し、Met-Ile-Thr(Bzl)-Leu-Ala
-Ile-Pro-Val-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Pro-Gly-Arg(Pmc)-樹
脂のペプチドを得た。上記樹脂に脱保護剤（トリフロロ
酢酸：水：チオアニソール：エタンジオール：エチルメ
チルサルファイド：フェノール＝82：５：５：３：２：
３）を加えて、室温で４時間放置した。ついで分離した
樹脂を濾過後、エーテルで洗浄、凍結乾燥し、粗Met-Il
e-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg を得
た。これをＯＤＳ−カラム（Cosmosil 5C18-AR, 20 ×
250mm、ナカライテスク製）にロードし、 0.1％トリフ
ロロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による
ＨＰＬＣにて精製したところ約 200mgの純品が得られ
た。なお上記において、Pmc は２，２，５，７，８−ペ
ンタメチルクローマン−６−スルホニル基、Bzl はベン
ジル基、Trt はトリチル基、Boc はｔ−ブトキシカルボ
ニル基を示す。
列番号１のペプチドの調製 置換率 0.70meq／ｇの Fmoc-Arg(Pmc)- 樹脂 0.3ｇをＳ
ＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の反応容器
にセットし、デブロック液（ピペリジン：トルエン：ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）＝30：35：35）を加え攪
拌して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基
を除去した。この樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）：Ｄ
ＭＦ＝１：１で洗浄後、 Fmoc-Arg(Pmc)- 樹脂の４倍当
量のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）及びFm
oc-Glyを加えてカップリングを行った。反応終了後、Ｄ
ＣＭ：ＤＭＦ＝１：１で洗浄し、Fmoc-Gly-Arg(Pmc)-樹
脂を得た。以下同様にしてＮ末端の Metまで合成し、Ｄ
ＣＭ、メタノールで洗浄し、Met-Ile-Thr(Bzl)-Leu-Ala
-Ile-Pro-Val-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Pro-Gly-Arg(Pmc)-樹
脂のペプチドを得た。上記樹脂に脱保護剤（トリフロロ
酢酸：水：チオアニソール：エタンジオール：エチルメ
チルサルファイド：フェノール＝82：５：５：３：２：
３）を加えて、室温で４時間放置した。ついで分離した
樹脂を濾過後、エーテルで洗浄、凍結乾燥し、粗Met-Il
e-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg を得
た。これをＯＤＳ−カラム（Cosmosil 5C18-AR, 20 ×
250mm、ナカライテスク製）にロードし、 0.1％トリフ
ロロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による
ＨＰＬＣにて精製したところ約 200mgの純品が得られ
た。なお上記において、Pmc は２，２，５，７，８−ペ
ンタメチルクローマン−６−スルホニル基、Bzl はベン
ジル基、Trt はトリチル基、Boc はｔ−ブトキシカルボ
ニル基を示す。
【００１２】製造例３ 化学合成法（Fmoc法）による配
列番号２のペプチドの調製 置換率 0.55meq／ｇの Fmoc-Gly-樹脂 0.4ｇをＳＡＭ２
ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の反応容器にセッ
トし、２と同様な方法で合成し相当する12残基ペプチド
−樹脂を得た。上記樹脂に脱保護剤（トリフロロ酢酸：
エタンジオール：アニソール＝94：１：５）を加えて、
室温で１時間放置した。以下製造例２と同様にして、約
150mgの純品のMet-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-
Lys-Pro-Gly を得た。
列番号２のペプチドの調製 置換率 0.55meq／ｇの Fmoc-Gly-樹脂 0.4ｇをＳＡＭ２
ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の反応容器にセッ
トし、２と同様な方法で合成し相当する12残基ペプチド
−樹脂を得た。上記樹脂に脱保護剤（トリフロロ酢酸：
エタンジオール：アニソール＝94：１：５）を加えて、
室温で１時間放置した。以下製造例２と同様にして、約
150mgの純品のMet-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-
Lys-Pro-Gly を得た。
【００１３】製造例４ 化学合成法（Fmoc法）による配
列番号３のペプチドの調製 置換率 0.71meq／ｇの Fmoc-Pro-樹脂 0.3ｇをＳＡＭ２
ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の反応容器にセッ
トし、２と同様な方法で合成し相当する11残基ペプチド
−樹脂を得た。以下製造例３と同様にして、約 150mgの
純品のMet-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro
を得た。
列番号３のペプチドの調製 置換率 0.71meq／ｇの Fmoc-Pro-樹脂 0.3ｇをＳＡＭ２
ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の反応容器にセッ
トし、２と同様な方法で合成し相当する11残基ペプチド
−樹脂を得た。以下製造例３と同様にして、約 150mgの
純品のMet-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro
を得た。
【００１４】製造例５ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）によ
る配列番号４のペプチドの調製 置換率０．４６ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−樹脂
０．４ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する１０残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と
同様にして、約１５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｌｙｓを得た。
る配列番号４のペプチドの調製 置換率０．４６ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−樹脂
０．４ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する１０残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と
同様にして、約１５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｌｙｓを得た。
【００１５】製造例６ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）によ
る配列番号５のペプチドの調製 置換率０．７０ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する９残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約１５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
を得た。
る配列番号５のペプチドの調製 置換率０．７０ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する９残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約１５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
を得た。
【００１６】製造例７ 酵素による配列番号５のペプチ
ドの調製 配列番号５のペプチドは、配列番号１のペプチドの酵素
による加水分解によっても得ることができる。用いる酵
素は配列番号１のペプチドに含まれるAsn-Lysのペプチ
ド結合を特異的に切断するメタロエンドペプチダーゼ、
アスパラギニルエンドペプチダーゼ等を使用する。以下
にその調製法の一例を示すが、使用する酵素はこの例に
限定されるものではない。配列番号１のペプチド20mg
に、500Uのメタロエンドペプチダーゼ（生化学工業製）
を含む 100mMのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH＝10.0）
２mlを加えて、70℃で５時間インキュベートした。反応
停止後この溶液をＯＤＳ−カラム（Cosmosil5C18-AR,
4.6 × 150mm）を用い、０．１％トリフロロ酢酸を含む
アセトニトリルの直線的濃度勾配によるＨＰＬＣによっ
て精製した。アセトニトリル34％付近に溶出する画分を
凍結乾燥したところ約10mgの純品の配列番号５のペプチ
ドを得た。
ドの調製 配列番号５のペプチドは、配列番号１のペプチドの酵素
による加水分解によっても得ることができる。用いる酵
素は配列番号１のペプチドに含まれるAsn-Lysのペプチ
ド結合を特異的に切断するメタロエンドペプチダーゼ、
アスパラギニルエンドペプチダーゼ等を使用する。以下
にその調製法の一例を示すが、使用する酵素はこの例に
限定されるものではない。配列番号１のペプチド20mg
に、500Uのメタロエンドペプチダーゼ（生化学工業製）
を含む 100mMのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH＝10.0）
２mlを加えて、70℃で５時間インキュベートした。反応
停止後この溶液をＯＤＳ−カラム（Cosmosil5C18-AR,
4.6 × 150mm）を用い、０．１％トリフロロ酢酸を含む
アセトニトリルの直線的濃度勾配によるＨＰＬＣによっ
て精製した。アセトニトリル34％付近に溶出する画分を
凍結乾燥したところ約10mgの純品の配列番号５のペプチ
ドを得た。
【００１７】製造例８ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）によ
る配列番号６のペプチドの調製 置換率０．５２ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ樹脂０．
４ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の
反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相当する
８残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同様にし
て、約１００ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌを得た。
る配列番号６のペプチドの調製 置換率０．５２ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ樹脂０．
４ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ社）の
反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相当する
８残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同様にし
て、約１００ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌを得た。
【００１８】製造例９ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）によ
る配列番号７のペプチドの調製 置換率０．７１ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する７残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約１００ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを得た。
る配列番号７のペプチドの調製 置換率０．７１ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する７残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約１００ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを得た。
【００１９】製造例１０ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）に
よる配列番号８のペプチドの調製 置換率０．５５ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−樹脂
０．４ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する６残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約１００ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＩＩｅを得た。
よる配列番号８のペプチドの調製 置換率０．５５ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−樹脂
０．４ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する６残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約１００ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＩＩｅを得た。
【００２０】製造例１１ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）に
よる配列番号９のペプチドの調製 置換率０．７０ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する５残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ａｌａを得た。
よる配列番号９のペプチドの調製 置換率０．７０ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する５残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ａｌａを得た。
【００２１】製造例１２ 化学合成法（Ｆｍｏｃ法）に
よる配列番号１０のペプチドの調製 置換率０．５８ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する４残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕを得た。
よる配列番号１０のペプチドの調製 置換率０．５８ｍｅｑ／ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂
０．３ｇをＳＡＭ２ペプチド合成装置（バイオサーチ
社）の反応容器にセットし、２と同様な方法で合成し相
当する４残基ペプチド−樹脂を得た。以下製造例３と同
様にして、約５０ｍｇの純品のＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕを得た。
【００２２】配列番号１〜10までのペプチドのアミノ酸
組成、ＨＰＬＣの溶出位置、及び薄層クロマトグラフィ
ーのRf値を表−２にまとめて示した。尚、配列番号１の
天然品（製造例１）及び合成品（製造例２）は、それら
の結果から同一品であることが判明した。従って、以下
では合成品を用いて検討を行っている。
組成、ＨＰＬＣの溶出位置、及び薄層クロマトグラフィ
ーのRf値を表−２にまとめて示した。尚、配列番号１の
天然品（製造例１）及び合成品（製造例２）は、それら
の結果から同一品であることが判明した。従って、以下
では合成品を用いて検討を行っている。
【００２３】 上記表中、ＭはＭｅｔ、ＩはＩｌｅ、ＴはＴｈｒ、Ｌは
Ｌｅｕ、ＡはＡｌａ、ＰはＰｒｏ、ＶはＶａｌ、ＤはＡ
ｓｐ、ＫはＬｙｓ、ＧはＧｌｙ、ＲはＡｒｇを示す。 ＊１ ６Ｎ−ＨＣｌ １１０℃の加水分解後の値であ
る。従って、ペプチド組成のＡｓｎはＡｓｐとして検出
される。 ＊２ ＯＤＳ−カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−
ＡＲ，４．６×１５０ｍｍ）を用いて、アセトニトリル
の直線的濃度勾配により測定している。 ＊３ メルク製のキーゼルゲルプレートを用い、室温に
て展開した。展開溶媒の組成は、ブタノール：酢酸：ピ
リジン：水＝１５：３：１０：１２である。
Ｌｅｕ、ＡはＡｌａ、ＰはＰｒｏ、ＶはＶａｌ、ＤはＡ
ｓｐ、ＫはＬｙｓ、ＧはＧｌｙ、ＲはＡｒｇを示す。 ＊１ ６Ｎ−ＨＣｌ １１０℃の加水分解後の値であ
る。従って、ペプチド組成のＡｓｎはＡｓｐとして検出
される。 ＊２ ＯＤＳ−カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−
ＡＲ，４．６×１５０ｍｍ）を用いて、アセトニトリル
の直線的濃度勾配により測定している。 ＊３ メルク製のキーゼルゲルプレートを用い、室温に
て展開した。展開溶媒の組成は、ブタノール：酢酸：ピ
リジン：水＝１５：３：１０：１２である。
【００２４】
【試験例】以下、試験例により本発明ペプチドの薬理活
性を示す。 試験例１ ファゴサイトーシス活性の測定 試験方法： ヒト末梢血にリン酸緩衝液を含む生理食塩
水（ＰＢＳ）を加え、1000rpm−５分の遠心分離で血球
を洗浄したのち、ＰＢＳにて４×106 個／mlの血球の懸
濁液を調製した。この溶液 100μl を採り、ＰＢＳに溶
解させたペプチド溶液10μl を加え37℃で10分インキュ
ベートを行い、ついでヒト末梢血でオブソニル化した４
×108 個／mlの蛍光標識ラテックスビーズ液10μl を加
え、さらに５分インキュベートを行った。ＥＤＴＡを含
むＰＢＳで反応を停止させ、遠心により血球を分離し、
これに塩化アンモニウム溶血剤を加えて溶血させ白血球
を得た。これをＥＴＤＡを含むＰＢＳに懸濁後、フロー
サイトメトリーにて測定した。
性を示す。 試験例１ ファゴサイトーシス活性の測定 試験方法： ヒト末梢血にリン酸緩衝液を含む生理食塩
水（ＰＢＳ）を加え、1000rpm−５分の遠心分離で血球
を洗浄したのち、ＰＢＳにて４×106 個／mlの血球の懸
濁液を調製した。この溶液 100μl を採り、ＰＢＳに溶
解させたペプチド溶液10μl を加え37℃で10分インキュ
ベートを行い、ついでヒト末梢血でオブソニル化した４
×108 個／mlの蛍光標識ラテックスビーズ液10μl を加
え、さらに５分インキュベートを行った。ＥＤＴＡを含
むＰＢＳで反応を停止させ、遠心により血球を分離し、
これに塩化アンモニウム溶血剤を加えて溶血させ白血球
を得た。これをＥＴＤＡを含むＰＢＳに懸濁後、フロー
サイトメトリーにて測定した。
【００２５】結果： 数値はコントロール（ＰＢＳ）に対する倍率で示した。
【００２６】実験例２ 活性酸素産出量の測定 試験方法： 成人ヒト末梢血をＰＢＳにて洗浄した後、
赤血球を溶血させＨＥＰＥＳ−生理食塩緩衝液に溶かし
２×１０６ 個／ｍｌの好中球浮遊液を作製した。この液
１２５μｌにＨＥＰＥＳ−生理食塩緩衝液３５５μｌ、
５ｍＭチトクロム−Ｃ溶液１０μｌ、及び１０μｌのペ
プチド水溶液を加え、３７℃で１５分インキュベートし
た。１５分後氷中にて急冷することによりインキュベー
トを停止させた。この溶液を遠心分離し、上澄み液の５
５０ｎｍ及び４６８ｎｍの吸光度から活性酸素産出量を
計算した。活性酸素産出量は下記の計算式によって算出
した。 活性酸素産出量＝（Ａ１−Ａ２）×ｋ ただし式中、 Ａ１は波長５５０ｎｍによる吸光度 Ａ２は波長４６８ｎｍによる吸光度 ｋ は係数（測定に１ｃｍセルを用いた場合の係数は９
５である。）
赤血球を溶血させＨＥＰＥＳ−生理食塩緩衝液に溶かし
２×１０６ 個／ｍｌの好中球浮遊液を作製した。この液
１２５μｌにＨＥＰＥＳ−生理食塩緩衝液３５５μｌ、
５ｍＭチトクロム−Ｃ溶液１０μｌ、及び１０μｌのペ
プチド水溶液を加え、３７℃で１５分インキュベートし
た。１５分後氷中にて急冷することによりインキュベー
トを停止させた。この溶液を遠心分離し、上澄み液の５
５０ｎｍ及び４６８ｎｍの吸光度から活性酸素産出量を
計算した。活性酸素産出量は下記の計算式によって算出
した。 活性酸素産出量＝（Ａ１−Ａ２）×ｋ ただし式中、 Ａ１は波長５５０ｎｍによる吸光度 Ａ２は波長４６８ｎｍによる吸光度 ｋ は係数（測定に１ｃｍセルを用いた場合の係数は９
５である。）
【００２７】結果： ペプチド濃度は30μM で、数値はコントロール（水）に
対する倍率で示した。
対する倍率で示した。
【図１】酵素加水分解物をＤＥＡＥ−セルロースカラム
にロードして得られた活性画分を、ＯＤＳカラムによる
ＨＰＬＣにより溶離させた時の、該成分の吸光度を測定
したチャートである。
にロードして得られた活性画分を、ＯＤＳカラムによる
ＨＰＬＣにより溶離させた時の、該成分の吸光度を測定
したチャートである。
【図２】図１のＯＤＳカラムによるＨＰＬＣの活性画分
を、フェネチルカラムによるＨＰＬＣにより溶離させた
時の、該成分の吸光度を測定したチャートである。
を、フェネチルカラムによるＨＰＬＣにより溶離させた
時の、該成分の吸光度を測定したチャートである。
【図３】図２のフェネチルカラムによるＨＰＬＣの活性
画分を、中性ＯＤＳカラムにより溶離させた時の、該成
分の吸光度を測定したチャートである。
画分を、中性ＯＤＳカラムにより溶離させた時の、該成
分の吸光度を測定したチャートである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ６１Ｋ 37/18 ＡＢＡ // Ａ６１Ｋ 38/00 37/02
Claims (4)
- 【請求項１】 次式で示される配列番号１ないし10の生
理活性を有するペプチド。 配列番号１：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly-Arg 配列番号２：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro-Gly 配列番号３：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys-Pro 配列番号４：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn-Lys 配列番号５：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val-Asn 配列番号６：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro-Val 配列番号７：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile-Pro 配列番号８：Met-Ile-Thr-Leu-Ala-Ile 配列番号９：Met-Ile-Thr-Leu-Ala 配列番号10：Met-Ile-Thr-Leu - 【請求項２】 請求項１記載の配列番号１ないし10で示
されるペプチド及びその医薬上許容される塩よりなる群
から選択される１種又は２種以上を有効成分とする免疫
系賦活作用を有する医薬組成物。 - 【請求項３】 免疫系賦活作用がファゴサイトーシス促
進作用である請求項２記載の医薬組成物。 - 【請求項４】 免疫系賦活作用が活性酸素産出促進作用
である、請求項１記載の配列番号１ないし８のペプチド
及びその医薬上許容される塩の１種又は２種以上を有効
成分とする請求項２記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6037707A JP2673659B2 (ja) | 1994-02-11 | 1994-02-11 | ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6037707A JP2673659B2 (ja) | 1994-02-11 | 1994-02-11 | ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07224093A JPH07224093A (ja) | 1995-08-22 |
| JP2673659B2 true JP2673659B2 (ja) | 1997-11-05 |
Family
ID=12505004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6037707A Expired - Lifetime JP2673659B2 (ja) | 1994-02-11 | 1994-02-11 | ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2673659B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3932418A2 (en) * | 2015-07-16 | 2022-01-05 | Nuritas Limited | Peptides for use in promoting transport of glucose |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2719891B2 (ja) * | 1994-09-05 | 1998-02-25 | 株式会社ホーネンコーポレーション | Ｔｎｆ分泌促進用医薬組成物 |
| US6361938B1 (en) * | 1996-11-08 | 2002-03-26 | Elan Corporation, Plc | Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same |
| BR112018000660A2 (pt) | 2015-07-16 | 2019-05-14 | Nuritas Limited | peptídeos anti-inflamatórios e seu uso |
| EP3118216A1 (en) | 2015-07-16 | 2017-01-18 | Nuritas Limited | Cellular growth and proliferation promoting peptides, and uses thereof |
| CN110177575B (zh) * | 2016-12-01 | 2024-02-13 | 国立大学法人埼玉大学 | 药物递送系统用胞吞作用增强剂 |
| CN111848735B (zh) * | 2020-07-09 | 2022-03-04 | 中国科学院华南植物园 | 一种免疫调节活性肽及其制备方法和应用 |
-
1994
- 1994-02-11 JP JP6037707A patent/JP2673659B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3932418A2 (en) * | 2015-07-16 | 2022-01-05 | Nuritas Limited | Peptides for use in promoting transport of glucose |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07224093A (ja) | 1995-08-22 |
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