JP2706397B2 - ボレリア属リポタンパク質のクローニングおよび発現 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、病原体の外表面タンパ
ク質の組換え変異体、およびこれら変異体を構成するた
めの組換え法に関する。特に、本発明は、野生型ボレリ
ア属リポタンパク質の組換え変異体を産生する方法に関
する。さらに、本発明は、ライム（Ｌｙｍｅ）病の原因
となるスピロヘータであるボレリア・ブルグドルフェリ
（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の外表
面プロテインＡ（ｏｕｔｅｒｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ａ）の組換え変異体、及びそれを産生する方法
を含む。

【０００２】

【従来の技術】ボレリア属スピロヘータは、ライム病な
どさまざまな疾病の原因となる。ライム病は、スピロヘ
ータであるボレリア・ブルグドルフェリ（マダニによっ
て運ばれる）によって引き起こされる感染症である。こ
のスピロヘータは、マダニに刺されることによってヒト
および動物に伝染し、感染宿主に重篤な皮膚科系疾患、
関節炎、神経科系疾患およびその他の疾病を引き起こす
場合がある。最近、ライム病は、ヨーロッパ、アジアお
よびソ連邦ばかりでなく、北アメリカでも重大な疫学的
関心事となってきた。

【０００３】ボレリア属病原体に感染したヒトおよび動
物において、一般に、ボレリア属菌の外膜（ｏｕｔｅｒ
ｍｅｍｂｒａｎｅ）にあるリポタンパク質のほか、ボ
レリア属菌に存在するさまざまな抗原に応答する抗体が
産生されることがよく知られている。例えば、外表面プ
ロテインＡ（ＯｓｐＡ）、すなわちボレリア・ブルグド
ルフェリスピロヘータのリポタンパク質に対する抗体が
産生される（Ｃｒａｆｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，
Ｄ．Ｋ．，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｇ．Ｔ．およびＳｔｅ
ｅｒｅ，Ａ．Ｃ．，「ライム病によって認識されるボレ
リア・ブルグドリフェリの抗原。疾病後期の免疫グロブ
リンＧの応答および発現における新たな免疫グロブリン
の発現」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７８：９３４
−９３９（１９８６）及びＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，
Ｈｅｉｌａｎｄ，Ｒ．Ａ．，およびＨｏｗｅ，Ｔ．Ｒ．
「ライム病ボレリア中の主要タンパク質の不均一性：北
アメリカおよびヨーロッパでの単離物の分子的解析」
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５２：４７４−４８４
（１９８５）等参照）。外表面プロテインＡ（Ｏｓｐ
Ａ）は、ボレリア・ブルグドルフェリスピロヘータのＤ
ＮＡ中に存在するｏｓｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列に
よってコードされているリポタンパク質である。完全な
長さの野生型ＯｓｐＡをコードするヌクレオチド配列
（配列番号：１参照）は、Ｂ３１株（ボレリア・ブルグ
ドルフェリの北アメリカ株）ですでに決定されていた
（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｓ．，Ｂｕｎｄｏｃ，Ｖ．
Ｇ．，およびＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，「ライム病ス
ピロヘータボレリア・ブルグドルフェリの線形プラスミ
ドにコードされた主要表面タンパク質ＯｓｐＡおよびＯ
ｓｐＢの分子的解析」，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３：４７９−４８６（１９８９）参照）。この分
析結果から、ＯｓｐＡのアミノ配列が想定された（配列
表の配列番号：２参照）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】臨床的観点から、可溶
性で高度に精製された大量のボレリア属リポタンパク質
を産生する方法の開発が望まれている。それは、ボレリ
ア属スピロヘータに感染した患者の血清中のこれらのタ
ンパク質に対する抗体の存在を検出する免疫検定法およ
び他の診断的スクリーニング試験で使用するためのもの
である。さらに、可溶性の高度に精製されたこれらタン
パク質は、ボレリア病原体に対してヒトおよび動物をワ
クチン処理するための臨床的免疫源として価値を持ち得
る。また、こういったタンパク質に対する抗体の分離お
よび精製に関連する実験操作のための有用な研究材料と
しても価値をもつこととなろう。

【０００５】組換えＤＮＡ技術の観点から、目的とする
特異的反応性を保持しながら大量の組換えタンパク質を
得るための宿主／ベクター組換え発現系で非常に高レベ
ルで発現可能な、すなわち高度発現可能なヌクレオチド
配列または遺伝子の提供が特に望まれている。

【０００６】従来より、ボレリア属菌の培養増殖と、そ
れに続く培養物の精製を通して、可溶性の各種の精製ボ
レリア属リポタンパク質を単離する試みが行われて来
た。しかし、この試みには幾つかの欠点がある。ボレリ
ア属細菌の培養と、それに続く粗細胞抽出物からのこれ
らのタンパク質の精製は、非常に時間及び費用がかかる
操作である。また、ボレリア属生菌の培養および得られ
た培養物の処理は、検査質職員に対して重大な危険をも
たらす。最も重要なことは、この方法によって産生され
た、完全な長さをもつ野生型のボレリア属リポタンパク
質の溶解度が低いことである。それは、おそらくこれら
タンパク質が、その発現におけるスピロヘータ細胞膜と
の結合過程での脂質化により疎水性を有するようになる
ことによるものであると考えられる。したがって、これ
らの脂質化タンパク質を可溶化するには界面活性剤が必
要となる。

【０００７】界面活性剤を用いたリポタンパク質の処理
によって、その溶解性は改善されるが、目的のタンパク
質のエピトープ部位および折り畳み立体配置構造が変化
または破壊されることによってその反応性が損なわれる
こともしばしばある。このことは当該分野でよく知られ
ている。したがって、完全な長さの野生型のリポタンパ
ク質に対する抗体との特異的反応性を保持しつつ、かつ
界面活性剤を利用しなくても溶解性が得られるＯｓｐＡ
等のボレリア属リポタンパク質の組換え変異体を開発す
ることが望まれている。上記の溶解性の問題に加えて、
ボレリア属スピロヘータの細胞外膜におけるリポタンパ
ク質と外膜との結合は、粗細胞抽出物からのこれらリポ
タンパク質の分離、精製においても問題となる。

【０００８】また、組換えＤＮＡ技術による当該分野で
知られた組換えクローニングベクターや大腸菌を用いる
宿主／ベクター発現系が、各種ボレリア属遺伝子を発現
するために利用されている。適切な組換え用のクローニ
ングベクターとしては、野生型ボレリア属ＤＮＡの挿入
を可能とする修飾を行えるヌクレオチド配列を有するプ
ラスミドを挙げることができる。これら組換え技術によ
って、ボレリア属生菌自体の培養物を取り扱う必要がな
くなる。しかしながら、その一方で、組換え技術を用い
た方法には幾つかの欠点がある。

【０００９】例えば、完全な長さの野生型ボレリア・ブ
ルグドルフェリ リポタンパク質の組換え体を大腸菌で
生産させた場合、得られた組換え体の界面活性剤の非存
在下での溶解性は極めて低く、その原因は、おそらく発
現したタンパク質が宿主の細胞外膜に結合する過程にあ
ると思われる。したがって、生産された組換えタンパク
質の分離および精製で行われる連続操作にも、ボレリア
・ブルグドルフェリの生菌体からＯｓｐＡを単離、精製
する際に生じるのと同様の問題が起きる。

【００１０】上記の組換え技術を用いる試みにおけるも
う一つの欠点は、完全な長さの野生型ｏｓｐＡ遺伝子の
組換え体の大腸菌宿主中での高度発現が得られないこと
である。この発現レベルの問題は、おそらく発現過程で
大腸菌細胞膜に局在するＯｓｐＡの蓄積毒性効果による
ものであろう。

【００１１】本発明の目的は、野生型ボレリア属リポタ
ンパク質に対する抗体への特異的反応性を保持しつつ、
界面活性剤を使用しなくても溶解させることができ、大
腸菌などの宿主で高度発現できる野生型ボレリア属リポ
タンパク質の組換え体を産生する方法を提供することで
ある。

【００１２】また、本発明の目的は、野生型ボレリア・
ブルグドルフェリのＯｓｐＡに対する抗体への特異的反
応性をもちながら、界面活性剤の非存在下でも溶解状態
が得られるＯｓｐＡの組換え体を得る方法を提供するこ
とにある。

【００１３】本発明の他の目的は、界面活性剤の非存在
下でも溶解状態が得られ、野生型ボレリア・ブルグドル
フェリのＯｓｐＡに対する抗体への特異的な反応性を保
持しており、発現過程においてもこの特異的反応性が維
持され、かつ宿主細胞膜と結合しないＯｓｐＡの組換え
変異体を提供することである。更に、本発明は、大腸菌
などの宿主中で高度に発現され、界面活性剤の非存在下
でも溶解状態が得られ、野生型ボレリア・ブルグドルフ
ェリのＯｓｐＡに対する抗体への特異的反応性を保持し
ている野生型ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＡの
組換え変異体をコードするヌクレオチド配列を提供する
ことにある。

【００１４】本発明のさらに別の目的は、界面活性剤の
非存在下でも溶解し、発現過程においても宿主の細胞膜
と結合せず、かつ完全な長さの野生型ボレリア・ブルグ
ドルフェリＯｓｐＡに対する抗体への特異的な反応性を
保持している野生型ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓ
ｐＡの組換え変異体をコードするヌクレオチド配列を含
むＤＮＡプラスミドを提供することである。

【００１５】本発明の他の目的は、界面活性剤の非存在
下でも溶解し、発現過程においても宿主の細胞膜と結合
せず、かつ完全な長さの野生型ボレリア・ブルグドルフ
ェリＯｓｐＡに対する抗体への特異的な反応性を保持し
ている野生型ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＡの
組換え変異体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮ
Ａプラスミドを有する大腸菌の形質転換株を提供するこ
とである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、可溶性
があって極めてよく発現する、ボレリア・ブルグドルフ
ェリの外表面プロテインＡ（ＯａｐＡ）の組換え変異
体、およびこれを産生する方法が提供される。後述する
ように、ＯｓｐＡの組換え変異体の有するアミノ酸配列
は配列番号：４に示されている。

【００１７】本発明のＯｓｐＡ変異体は、野生型ボレリ
ア・ブルグドルフェリのｏｓｐＡ遺伝子の頭の部分を欠
失させることで、宿主中で高度に発現して、そのままで
可溶性の遺伝子産物を与える端部欠失型ｏｓｐＡ遺伝子
を作成する過程を含む方法によって提供される。シクナ
ルペプチダーゼＩＩが作用するシグナル配列をコードす
る頭の１７コドンからなる領域を除いた端部欠失型ｏｓ
ｐＡ遺伝子を、ボレリア・ブルグドルフェリからのＤＮ
Ａを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）で
増幅するために、特定のオリゴヌクレオチドプライマー
を利用した。当該分野で既知の組換えＤＮＡ技術を使っ
て、得られた増幅産物をＴ７バクテリオファージ中で発
現させた。

【００１８】本発明により、このＯｓｐＡ変異体をコー
ドするヌクレオチド配列をもったＤＮＡプラスミド（ｐ
ＥＴ９−ＯｓｐＡ）とともに、それによって形質転換さ
れた大腸菌株も提供される。

【００１９】本発明の方法は、ＯｓｐＡ以外の、シグナ
ルペプチダーゼＩＩが作用するシグナル配列を含むボレ
リア属リポタンパク質の組換え変異体の産生にも同様に
適用される。

【００２０】本発明の変異体は、生菌培養物や他の組換
え技術から得られたＯｓｐＡよりも大きな改良された溶
解性を保持しつつ、野生型ボレリア・ブルグドルフェリ
ＯｓｐＡに対する抗体への特異的反応性をもつ点で極め
て有用である。この改良された溶解性は、検査室での操
作と同様に免疫診断法において極めて好都合である。す
なわち、この変異体の使用にあたっては、その反応性を
変化または破壊する恐れのある界面活性剤が不要で、こ
のような界面活性剤を用いなくても溶解させることがで
きるからである。

【００２１】本発明の変異体のもう一つの利点は、それ
が、組換えによって発現される野生型ＯｓｐＡとは異な
り、発現中において宿主の細胞膜と結合しないことであ
る。したがって、本発明の変異体は野生型ＯｓｐＡのよ
うな宿主への毒性を示さないので、組換え技術による高
度発現が可能である。その結果、ボレリア属生菌の培養
物を取り扱う際の危険性を回避し、かつボレリア属菌自
体を用いる場合の費用を抑え、高収率での目的タンパク
質の生産が可能となる。

【００２２】本発明の別の利点は、野生型ボレリア属リ
ポタンパク質に対する抗体への特異的な反応性を保持し
つつ、界面活性剤の非存在下でも改良された溶解性を有
する高発現性ボレリア属リポタンパク質の組換え変異体
を産生する方法が提供できることである。本発明より前
においては、免疫検定法および他の検査室操作で使用す
るためにこれらリポタンパク質を可溶化する目的で界面
活性剤が必要であった。しかしながら、界面活性剤の使
用によりリポタンパク質の反応性エピトープ部位が界面
活性剤の強力な破壊効果に曝される場合が生じた。

【００２３】したがって、本発明の一態様において、第
１の部分と第２の部分からなり、第２の部分はＮ末端と
Ｃ末端を持つ配列番号：１０の配列を有し、第１の部分
が第２の部分のＮ末端に結合していて、アラニンおよび
メチオニンより選択された少なくとも１つのアミノ酸残
基からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
が提供される。後述するように、このアミノ酸配列とし
ては、配列番号：４、６及び８のアミノ酸配列を挙げる
ことができ、このアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列としては、配列番号：３、５及び７の配列を挙げ
ることができる。

【００２４】本発明の他の態様において、後述するよう
に、配列番号：１０で示されたアミノ酸配列を有するタ
ンパク質、およびこのアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列（配列番号：９）が提供される。

【００２５】本発明の具体的な態様において、宿主を形
質転換するためのプラスミドｐＥＴ９−ＯｓｐＡ、該プ
ラスミドを有する大腸菌の形質転換株［ＢＬ２１（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴ９−ＯｓｐＡ］および配列番
号：１１の配列を有し、ボレリア属リポタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列の一部を増幅するために有用
なオリゴヌクレオチドプライマーが提供される。

【００２６】本発明の他の態様において、以下の過程
（ａ）および（ｂ）を含む、ボレリア属リポタンパク質
をコードするヌクレオチド配列から頭の領域を削除して
得られる端部欠失型配列が提供される。 （ａ）シグナルぺプチダーゼＩＩの潜在的シグナル配列
をコードする領域（５’末端および３’末端を有し、そ
の３’末端はシステイン残基をコードするコドン中で終
止している）を含むボレリア属リポタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を有する二本鎖ＤＮＡを鋳型ＤＮ
Ａとして用意する過程。 （ｂ） 第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーか
らなるプライマーのセットを合成する過程。 該第１のプ
ライマーは、５’末端から３’末端方向での鋳型ＤＮＡ
の第１の鎖の増幅のためのものであり、鋳型ＤＮＡの第
２の鎖の所定領域に相補的な配列を有し、該第２のプラ
イマーは、５’末端から３’末端方向での鋳型ＤＮＡの
第２の鎖の増幅のためのものであり、鋳型ＤＮＡの第１
の鎖の所定領域に相補的な配列を有し、第１のプライマ
ーは鋳型ＤＮＡの第１の鎖の上記のシステイン残基をコ
ードするコドンの下流の部位から３’方向へのＤＮＡ重
合反応を開始させるものである。

【００２７】更に、本発明の他の態様において、以下の
過程からなる方法により得られるボレリア属リポタンパ
ク質の組換え変異体が提供される。（ａ）シグナルぺプチダーゼＩＩのシグナル配列となり
得る領域（ ５’末端および３’末端を有しており、該
３’末端はシステイン残基をコードするコドンで終止し
ている）を含むボレリア属リポタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を有する二本鎖ＤＮＡを鋳型ＤＮＡと
して用意する過程。 （ｂ）５’末端から３’末端方向での鋳型ＤＮＡの第１
の鎖の増幅のためのもので、上記のシステイン残基をコ
ードするコドンの下流の部位から３’方向へのＤＮＡ重
合反応を開始させるために鋳型ＤＮＡの第２の鎖の所定
領域に相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチド
プライマーと、５’末端から３’末端方向での鋳型ＤＮ
Ａの第２の鎖の増幅のためのもので、鋳型ＤＮＡの第１
の鎖の所定領域に相補的な配列を有する第２のオリゴヌ
クレオチドプライマーとからなる一組のプライマーを合
成する過程。 （ｃ）該一組のプライマーと鋳型ＤＮＡを反応させて、
各プライマーで指定された領域をＰＣＲでそれぞれ増幅
させる過程。 （ｄ）増幅産物から、ボレリア属リポタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列の頭の領域を削除して得られる
所望の端部欠失型配列を単離する過程。 （ｅ）該端部欠失型配列を適当な発現ベクターにクロー
ニングする過程。 （ｆ）該発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換す
る過程。 （ｇ）該端部欠失型配列にコードされたリポタンパク質
の変異体を産生するために該形質転換体を培養する過
程。

【００２８】上記以外の本発明の目的及び本発明自体を
より明確に理解するために、添付図面及び以下の記載が
参考となり、また、本発明の範囲は添付の特許請求の範
囲に規定されているとおりである。

【００２９】本発明を理解するための各用語の定義は以
下のとおりである。

【００３０】「細菌」とは、細胞壁と称する堅固な保護
層を有し、細胞壁の内側で細胞膜が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
タンパク質および低分子物質等を含む細胞質を囲んでい
る原核生物を指す。その例として、スピロヘータ、大腸
菌などがある。

【００３１】「高度発現」とは、クローニングされた遺
伝子の高レベル発現をいう。バクテリオファージＴ７の
ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、プラスミドのマルチ
コピー上でＴ７プロモーターのコントロール下での高レ
ベル転写を行うことができ、Ｔ７プロモーターに連結し
たＤＮＡの転写によってその高レベル発現を得ることが
できる。

【００３２】「プラスミド」とは、染色体と独立した、
２本鎖で閉環状のＤＮＡ分子であり、プラスミドが宿主
細胞中で複製するように完全な形のレプリコンを含む。
このプラスミドの単細胞生物の細胞内への導入により、
この生物を形質転換することができる。プラスミドによ
って付与される表現型には、抗性物質耐性ならびに制限
酵素及び修飾酵素の生産能等もある。

【００３３】「プライマー」とは、その伸長産物（鋳型
としての核酸鎖に対して相補的）が誘導される条件下に
おかれた場合、その合成の開始点として作用し得るオリ
ゴヌクレオチド（短い核酸鎖）を指す。このプライマー
は制限酵素消化物からの精製物中に得られる天然のもの
でも良いし、人工的に合成したものでも良い。

【００３４】本発明によって以下のことが明らかとなっ
た。野生型ｏｓｐＡ遺伝子のアミノ酸をコードする領域
（配列番号：１参照）の最初（５’側頭部）の１７個の
コドンを除く再構成により、大腸菌などの宿主生物中で
の高度発現が可能な端部欠失型ヌクレオチド配列を得る
ことができ、このヌクレオチド配列を用いることで、界
面活性剤の非存在下でも可溶性が得られ、かつ野生型ボ
レリア・ブルグドフェリのＯｓｐＡに対する抗体への特
異的反応性を保持するボレリア・ブルグドフェリのＯｓ
ｐＡの組換え変異体を産生することができる。従来技術
における欠点の原因がＮ末端側の最初の１７個のコドン
からなる領域にあることがわかり、この知見が可溶性で
高度発現可能な組換え変異体の設計への基礎となった。

【００３５】さらに詳細には、得られるタンパク質への
脂質付加が行われる過程に必要なシグナルをコードする
配列（配列番号：１４）が、リーダー配列（野生型ボレ
リア・ブルグドルフェリｏｓｐＡ遺伝子の最初の１７個
のコドン）中に見られ、このシグナルの存在に基づいた
大腸菌などの宿主中でのタンパク質プロセッシングの過
程を通して溶解性および発現レベルの低下が起きる。

【００３６】本発明の実施には、複数の工程が必要であ
る。代わりとなる応用可能なものがあれば、工程の削
除、変更、他の工程の追加等を行ってもよい。本発明の
方法は、ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡの組換え
変異体の構成という面で詳述されるが、これに限らず、
シグナルペプチダーゼＩＩによるプロセッシングに必要
なシグナル配列を有する他のボレリア属リポタンパク質
にも等しく応用される。好ましい実施態様のＯｓｐＡの
組換え変異体（配列番号：４）をコードする端部欠失型
ヌクレオチド配列（配列番号：３）の産生は、一般に下
記ように行われる。

【００３７】野生型ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ３
１株）の完全な長さのＯｓｐＡをコードする遺伝子を含
むＤＮＡを単離精製した。ＰＣＲによる増幅産物の両端
に制限酵素切断部位を与えるとともに、野生型の最初の
１７個のコドンを除いた端部欠失型ｏｓｐＡ遺伝子を増
幅させるための１組のオリゴヌクレオチドプライマー
（配列番号：１１、１２、図１、２参照）を合成した。
また、対照として、ＰＣＲによる増幅産物の両端に制限
酵素切断部位を付与するとともに、野生型（野生型のア
ミノ酸をコードする領域が全部揃っている完全型）ｏｓ
ｐＡ遺伝子を増幅させるための１組のオリゴヌクレオチ
ドプライマー（配列番号：１２、１３、図２、３参照）
を合成した。

【００３８】ＰＣＲによって増幅されたヌクレオチド断
片を精製して、制限酵素切断部位の解析により所望の断
片を選択してから、制限酵素切断部位が適合する発現ベ
クタープラスミド中にサブクローニングした。次いで、
得られたプラスミドを、タンパク質産生のために発現用
宿主に導入した。

【００３９】

【実施例】実施例１本発明のタンパク質を得 るために、原料としてのＯｓｐ
Ａをコードするヌクレオチド配列（完全型）を有する野
生型ボレリア・ブルグドルフェリＤＮＡを入手する必要
がある。このＤＮＡは、ＰＣＲの際に野生型ｏｐｓＡ遺
伝子（完全型；配列番号：１）中の所望の領域を増幅さ
せるための鋳型ＤＮＡとなる。組換えＤＮＡ操作用の出
発物質として、野生型の菌体から単離されたＤＮＡや、
遺伝子工学的手法によるクローニングによってプラスミ
ド中に組み込まれた目的ＤＮＡのコピーが利用できるこ
とは当該分野でよく知られている。後者の遺伝子工学的
手法は、均一性を促進し、目的とするＤＮＡの突然変異
体の発生頻度を減少させるという点で有利である。

【００４０】本発明の組換え変異体を産生する好適な方
法では、完全な長さの野生型ｏｓｐＡ遺伝子を含む鋳型
ＤＮＡの入手源として、プラスミドｐＴＲＨ４４から得
られたｏｓｐＡ遺伝子の組換えクローンが用いられた。
このプラスミドｐＴＲＨ４４は、プラスミドｐＵＣ９中
に、野生型ボレリア・ブルグドルフェリｏｓｐＡ遺伝子
のクローンを含む１．６ｋｂの制限酵素切断断片を挿入
した構造を有している（Ｈｏｗｅ，Ｔ．Ｒ．，ＬａＱｕ
ｉｅｒ，Ｆ．Ｒ．，およびＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，
「単一の転写単位中でのライム病病原体ボレリア・ブル
グドルフェリの２つの外表面タンパク質をコードする遺
伝子の統合」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５４：２０
７−２１２（１９８６）参照）。

【００４１】また、定常期の培養菌体からフェノール抽
出またはリゾチーム−プロテナーゼＫ−ＳＤＳ抽出によ
って分離精製されたボレリア・ブルグドルフェリの全Ｄ
ＮＡも鋳型ＤＮＡ用として用いられた。

【００４２】鋳型ＤＮＡの単離精製方法は、当該分野で
一般によく知られたものである（Ｈｏｗｅ，Ｔ．Ｒ．，
Ｍａｙｅｒ，Ｌ．Ｗ．，およびＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．
Ｇ．，「ライム病スピロヘータの２つの主要外表面タン
パク質を発現する単一の組換えプラスミド」Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２２７：６４５−６４６（１９８５）参照）。ま
た、ボレリア・ブルグドルフェリの培養および単離につ
いては、Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，「ライム病スピロ
ヘータの単離および培養」Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｄ．，５７：５２１−５２５（１９８４）が参照で
きる。

【００４３】オリゴヌクレオチドプライマーを、ミクロ
シン（Ｍｉｃｒｏｓｙｎ）１４５０ＤＮＡ合成装置（シ
ステック社、ミネソタ州ミネアポリスから入手）で合成
した。次いで、合成生成物は製造元の説明書に従い、ポ
リパク（Ｐｏｌｙ−ｐａｋ：商標登録）精製カートリッ
ジ［グレン・リサーチ・コーポレーション社（バージニ
ア州、ハーンドン）から入手］を用いて精製した。ＤＮ
Ａ合成およびそれに続く合成物の精製法は、組換えＤＮ
Ａ技術の分野でよく知られている。これらの工程を達成
するいかなる適切な手法も利用可能である。

【００４４】プライマーとしは２組用意し、一組目は、
ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡの組換え変異体を
コードするヌクレオチド配列（端部欠失型）の増幅用に
設計され、二組目は、野生型ボレリア・ブルグドルフェ
リＯｓｐＡ（完全型）をコードするヌクレオチド配列の
増幅用に設計された。各プライマーは、５’末端から
３’末端方向に所定の配列を有するもので、野生型ボレ
リア・ブルグドルフェリゲノム中に存在するｏｓｐＡ遺
伝子の所定領域と相補性を有する領域を３’末側にも
つ。この相補領域がｏｓｐＡ遺伝子の所定部分にアニー
ルして、そこからＤＮＡ鎖の伸長反応が開始される。野
生型ｏｓｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１
の配列を含む）はすでに公知である（Ｂｅｒｇｓｔｒｏ
ｍ，Ｓ．，Ｂｕｎｄｏｃ，Ｖ．Ｇ．，およびＢａｒｂｏ
ｕｒ，Ａ．Ｇ．，「ライム病スピロヘータボレリア・ブ
ルグドルフェリの、線状プラスミドでコードされた主要
表面タンパク質、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢの分子論的解
析」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３：４７９−４８
６（１９８９）参照）。増幅された断片に制限酵素切断
部位が導入されるように、各プライマーの５’末端側に
は鋳型ＤＮＡに非相補的な配列の制限酵素切断部位が組
み込まれた。この制限酵素切断部位によって増幅された
断片の発現ベクターへのクローニングが容易となる。こ
のような制限酵素切断部位の使用は組換えＤＮＡ技術で
よく知られている。

【００４５】一組目のプライマーは、第１及び第２のプ
ライマーから構成された。第１のプライマーを、プライ
マー２０１→２１６と称し、これは図１に示されるヌク
レオチド配列（配列番号：１１）を有する合成オリゴヌ
クレオチドである。このプライマーに付された番号は、
野生型ｏｓｐＡ遺伝子内におけるプライマーの有する配
列と相補的な領域の最初と最後のヌクレオチドの位置を
示す。図１に示された第１のプライマーの配列の下線領
域は、ｏｓｐＡ遺伝子（野生型）の２０１番のヌクレオ
チドから２１６番のヌクレオチドまでの領域に相補的な
部分を示す。「ＣＡＴＡＧＴ」で示される領域は、制限
酵素ＮｄｅＩによって認識される部分である。スラッシ
ュのマークは、ＮｄｅＩでの切断部位であり、この切断
部位の利用で、増幅された断片の発現ベクターへのクロ
ーニングが容易となる。

【００４６】プライマー２０１→２１６は、ＮｄｅＩ制
限酵素切断部位を提供し、野生型ｏｓｐＡ遺伝子の１８
番目のコドンから重合反応を開始させることで、その
５’末端が再設計された端部欠失型を得るために用いら
れた。野生型ｏｓｐＡ遺伝子では、リポタンパク質のシ
グナルペプチダーゼＩＩが認識するシグナルとなりえる
部位（潜在的認識部位）をコードするところは、１６番
目と１７番目のコドンの間にある。

【００４７】ボレリア属スピロヘータ中での完全な長さ
の野生型ＯｓｐＡへの脂質付加機能については正確には
分かっていない。しかし、アミノ酸配列Ｌｅｕ−ｘ−ｙ
−Ｃｙｓ（ここで、ｘおよびｙは、一般に非極性側鎖を
有するさまざまなアミノ酸である）は、各種の細菌リポ
タンパク質のリーダー配列中にみられ、プロセッシング
シグナルをコードしている。このシグナルに細菌酵素と
してのシグナルペプチダーゼＩＩが作用してタンパク質
のプロセッシングが開始される。この酵素は、リーダー
配列を開裂させて、システイン残基からなるアミノ末端
（Ｎ末端）を生じさせる役目を担い、このＮ末端にある
システイン残基が、膜への結合に際して、タンパク質に
高い親油性を付与する脂肪酸と共有結合する。大腸菌な
どの多くの原核細胞は、前記のプロセッシング工程を利
用して、細胞性リポタンパク質の形成及び細胞膜への転
移を行う（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｓ．，Ｂｕｎｄｏｃ，
Ｖ．Ｇ．，およびＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，「ライム
病スピロヘータのボレリア・ブルグドルフェリの、線状
プラスミドでコードされた主要表面タンパク質ＯｓｐＡ
およびＯｓｐＢの分子的解析」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，３：４７９−４８６（１９８９）、Ｂｒａｎｄ
ｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｒａｄｏｌｆ，
Ｊ．Ｄ．，およびＮｏｒｇａｒｄ，Ｍ．Ｖ．「ボレリア
・ブルグドルフェリの免疫原的必須膜タンパク質はリポ
タンパク質である」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５
８：９８３−９９１（１９９０）参照）。

【００４８】野生型ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓ
ｐＡの全アミノ酸配列自体は、このタンパク質特有の問
題のために、アミノ酸分析によって確認はされていない
が、野生型ボレリア・ブルグドルフェリＢ３１株の完全
な長さのｏｓｐＡ遺伝子の既知ヌクレオチド配列に基づ
いて従来から予測されている（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，
Ｓ．，Ｂｕｎｄｏｃ，Ｖ．Ｇ．およびＢａｒｂｏｕｒ，
Ａ．Ｇ．，「ライム病スピロヘータの、線状プラスミド
でコードされた主要表面タンパク質ＯｓｐＡおよびＯｓ
ｐＢの分子的解析」Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
３：４７９−４８６（１９８９）参照）。配列番号：２
は、すでに推定された野生型ボレリア・ブルグドルフェ
リＯｓｐＡのアミノ酸配列を示す。配列番号：２から、
この予想されたアミノ酸配列に、アミノ酸残基Ｌｅｕ−
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（配列番号：１５参照）を有す
るリーダー配列をコードする部分が含まれていることが
わかる。上記のように、これらの残基は、大腸菌中のシ
グナルペプチダーゼＩＩによるプロセッシング用シグナ
ルの形式に適合している。したがって、野生型のｏｓｐ
Ａ遺伝子では、リポタンパク質に対するシグナルペプチ
ダーゼＩＩの潜在的認識部位は１６番目と１７番目のコ
ドンの間にコードされる。このことは、シグナルペプチ
ダーゼＩＩの既知のシグナル配列と、野生型ボレリア・
ブルグドルフェリの完全な長さのＯｓｐＡの予想アミノ
酸配列中に現れる潜在的シグナル配列との間の相同性か
らいえる。

【００４９】高度発現において、得られる組換えタンパ
ク質への脂質付加が起きない確率を高めるために、野生
型ｏｓｐＡ遺伝子の２０１→２１６の領域に相補的な部
分をプライマー２０１→２１６に組み込み、野生型の１
８番目のコドンで始まる部分を増幅させることで上述の
システイン残基を除いた。この潜在的認識部位の除去に
よって、野生型ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡに
対する抗体への特異的反応性を損なわずに、得られたタ
ンパク質の可溶性を増し、その発現を改善することが期
待された。

【００５０】本発明の前においては、野生型ボレリア・
ブルグドルフェリＯｓｐＡのアミノ酸配列中にみられる
シグナル配列の存在が、成熟タンパク質への脂質付加に
関与してしていることは知られていなかった。さらに、
この潜在的シグナル配列がＯｓｐＡと類似のタンパク質
における脂質付加にも関与すること、または野生型Ｏｓ
ｐＡの組換え体が組換え宿主中で生産できることも知ら
れていなかった。またさらに、その潜在的シグナル配列
をコードする部分を含む野生型ｏｓｐＡ遺伝子の一部を
組換え手法によって除去することによって端部欠失型ｏ
ｓｐＡ遺伝子が生じ、界面活性剤の非存在下での溶解性
の改善されたタンパク質（野生型に対する抗体への反応
性を保持している）が得られることも知られていなかっ
た。

【００５１】タンパク質をコードする天然のヌクレオチ
ド配列に加えられる修飾の程度が大きいほど、そのタン
パク質が少しで発現される場合、得られる組換えタンパ
ク質の反応性が変化する危険性が大きくなる。実際、こ
ういった組換えによる形質転換は、宿主生物に対して毒
性を有するか、致死的であることが示されており、それ
によって目的とする遺伝子産物の発現が低下するか皆無
となる。

【００５２】図１に示されるように、プライマー２０１
→２１６の好ましい構成体においては、アラニン残基を
コードし、かつ鋳型ＤＮＡに対して非相補的であるコド
ン（ＧＣＴ）を有し、このコドンは鋳型ＤＮＡと相補的
な部分（下線部）とＮｄｅＩ制限酵素切断部位との間に
配置されている。プライマー２０１→２１６中に位置す
るこのＮｄｅＩ制限酵素切断部位には、Ｎ末端となるメ
チオニンをコードする３塩基からなるコドン（ＡＴ
Ｇ）、すなわち、タンパク質産生の開始部位として機能
する開始コドンが含まれる。上述のようにアラニン残基
をコードする３塩基からなるコドンが付加されたが、こ
れは、アラニン残基の存在により最終的に得られるタン
パク質からのメチオニン残基の除去が容易になるからで
ある。アラニン残基の代わりに、メチオニン残基の除去
を容易にするのに適した他のアミノ酸も使用可能である
（Ｈｉｒｅｌ，Ｐ−Ｈ．，Ｓｃｈｍｉｔｔｅｒ，Ｊ−
Ｍ．，Ｄｅｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｆａｙａｔ，Ｇ．，および
Ｂｌａｎｑｕｅｔ，Ｓ．，「大腸菌タンパク質からＮ末
端メチオニンの切り出しの程度は、末端から２番目のア
ミノ酸側鎖の長さによって支配される」Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６：８２４７〜
８２５１（１９８９）参照）。末端にみられるメチオニ
ン、または翻訳開始のためのコドンにコードされたアミ
ノ酸は、得られるタンパク質の特徴に対して重要ではな
く、通常アミノ酸配列から除去されることが一般的に知
られている。

【００５３】本発明の好ましい態様では、端部欠失型ｏ
ｓｐＡ遺伝子から生じるアミノ酸配列のアミノ末端には
アラニン残基がなお存在していた。この端部欠失型で
は、野生型の最初の１７個のコドンが除かれているの
で、アラニン残基をコードするコドンは、野生型Ｏｓｐ
Ａにおける１８番目のリシン（Ｌｙｓ）残基をコードす
るコドンの前に位置する。発現タンパク質の成熟型から
メチオニン残基は除かれていた。得られたアミノ酸配列
は、メチオニンが除去された配列番号：６として示され
る。これに対応するヌクレオチド配列は配列番号：５で
示される。

【００５４】また、他のタイプでは、アラニン残基が欠
失しているものもあった。この場合、開始コドンにコー
ドされるメチオニン残基を含むアミノ酸配列が得られ、
これは配列番号：８として示される。これに対応するヌ
クレオチド配列は、配列番号：７として示される。この
メチオニンが除去された場合は、配列番号：１０のアミ
ノ酸配列が得られる。これに対応するヌクレオチド配列
は、配列番号：９として示される。

【００５５】第２のプライマーは、プライマー９５８←
９７２として表され、これは図２に示す配列（配列番
号：１２参照）を有する合成ＤＮＡである。図２に示さ
れているように、下線領域は野生型ｏｓｐＡ遺伝子の９
５８番目のヌクレオチドから９７２番目のヌクレオチド
までの領域に対して相補的な配列を有し、「ＡＧＡＴＣ
Ｔ」は制限酵素ＢｇｌＩＩによって認識される制限酵素
切断部位である。スラッシュの印は、増幅された断片の
制限酵素ＢｇｌＩＩによる切断によって発現ベクターへ
のクローニングを容易にする部位を示す。配列番号：１
２の配列は、プライマー２０１→２１６およびプライマ
ー１５１→１７１に対応する配列番号：１１、１３の記
載方式と異なり、対応するアミノ酸残基を表示しない非
コード形式で記載されている。これは、プライマー９５
８←９７２の配列は、ｏｓｐＡ遺伝子のセンス鎖ではな
く、ナンセンス鎖の増幅を行うよう設計されているので
その表現形式として非コード形式が用いられているため
である。

【００５６】プライマー９５８←９７２は、端部欠失型
用の１組目のプライマーと、完全型増幅用の２組目のプ
ライマーで共通に使用された。１組目のプライマーにお
いては、プライマー９５８←９７２は、ＢｇｌＩＩ制限
酵素切断部位を提供し、プライマー２０１→２１６によ
って規定される増幅方向とは逆の方向での増幅を開始さ
せ、端部欠失型の３’末端を規定するものである。

【００５７】図４に野生型ｏｓｐＡ遺伝子のヌクレオチ
ド配列をその一部を省略して示した。下線が引かれた２
つの領域は、それぞれプライマー２０１→２１６および
プライマー９５８←９７２が鋳型ＤＮＡにアニーリング
してそこから増幅が開始される位置を示している。矢印
の方向は、プライマーに指定された位置で開始される重
合反応の方向を示す。

【００５８】２組目のオリゴヌクレオチドプライマー
は、対照としての野生型ボレリア・ブルグドルフェリｏ
ｓｐＡ遺伝子（完全型）を増幅するためのもので、第１
のプライマーおよび第２のプライマーのセットからな
る。第１のプライマーはプライマー１５１→１７１と命
名されて合成され、図３に示されるヌクレオチド配列
（配列番号：１３）を有する。図３において、下線領域
は、野生型ｏｓｐＡ遺伝子の１５１番目のヌクレオチド
から１７１番目のヌクレオチドまでの領域と相補的であ
る部分を示す。「ＣＡＴＡＧＴ」で示される領域は、制
限酵素ＮｄｅＩによって認識される部分である。スラッ
シュの印は、制限酵素ＮｄｅＩの切断部位であり、この
切断部位の利用で、増幅された断片の発現ベクターへの
クローニングが容易となる。

【００５９】第２のプライマーである９５８←９７２
は、１組目のプライマーのセットと共通である。この第
２のプライマーは、増幅される断片にＢｇｌＩＩ制限酵
素切断部位を導入し、プライマー１５１→１７１によっ
て規定される増幅方向とは逆方向で野生型ｏｓｐＡ遺伝
子の増幅を開始させる。

【００６０】図５には野生型ｏｓｐＡ遺伝子のヌクレオ
チド配列を一部を省略して示してある。下線を引かれた
２つの領域はそれぞれ、プライマー１５１→１７１およ
びプライマー９５８←９７２が鋳型ＤＮＡにアニールし
て、増幅が開始される位置を示している。矢印の方向
は、プライマーによって指定された位置から開始される
重合反応の方向を示す。

【００６１】図６は、プライマー２０１→２１６及びプ
ライマー９５８←９７２によって増幅される端部欠失型
ｏｓｐＡ遺伝子を含む増幅産物を示す略図である。アミ
ノ酸をコードする領域（コード領域）の前後には、プラ
イマーにより制限酵素切断部位が導入されている。下線
領域は、鋳型ＤＮＡとアニールしたプライマーの部分を
示す。

【００６２】オリゴヌクレオチドプライマーを用いて目
的とする標的ヌクレオチド配列を増幅する基本的な方法
は、当該分野では一般に知られており、ミリスの米国特
許第４，６８３，２０２号およびミリスらの米国特許第
４，８００，１５９号に詳述されている。これら両特許
は、参考までにここに引用することとする。クローニン
グに関する一層の情報は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＳａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．，「分子クローニング；実験室マニュアル」コール
ドスプリングハーバー・ラボラトリ社、ニューヨーク州
コールドスプリングハーバー（１９８２）やＡｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａ
ｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．およびＳｔｒｕｈ
ｌ，Ｋ．「分子生物学における最近のプロトコール」ジ
ョーウイレイ＆サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク
市（１９８９）が参照できる。プライマー１５１→１７
１、２０１→２１６および９５８←９７２を使って、１
単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキ
ン−エルマー・セッツ社（コネチカット州ノルウォー
ク）より入手）を含む反応溶液５０μｌ中でＰＣＲを実
施した。各プライマー濃度は１μＭで、Ｏ．１μｇの鋳
型ＤＮＡを使用した。この反応混合物には、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ 、０．０５％ＴＷＥＥＮ ２
０、０．０５％ノネデット（Ｎｏｎｅｄｅｔ）Ｐ−４
０、０．２６ｍＭｄＡＴＰ、０．２６ｍＭ ｄＴＴＰ、
０．１４ｍＭ ｄＣＴＰおよび０．１４ｍＭ ｄＧＴＰ
も含まれていた。好ましい増幅法では、使用されたｄＮ
ＰＴ濃度は、可能な、または好ましくない突然変異体の
形成を除くために、ボレリア・ブルグドルフェリで既知
のＤＮＡ塩基含量から２９％Ｇ＋Ｃとした（Ｓｃｈｍｉ
ｄ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｔ，Ａ．Ｇ．，Ｊ
ｏｈｓｏｎ，Ｓ．，Ｂａｒｂｏｕｇ，Ａ．Ｇ．，Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．およびＢｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．
「ライム病スピロヘータのＤＮＡの特徴」Ｙａｌｅ
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５７：５３９−５４２（１９
８４）参照）。

【００６３】増幅前に、反応混合物に鉱油を重層し、増
幅はＤＮＡサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒ （パーキン−エルマー・セッツ社（コネチカ
ット州ノルウォーク）より入手）中で行い、２５サイク
ルの増幅条件を使用した。各サイクルは、９４℃１分
間、４７℃１分間および７２℃で３分間の反応からな
り、このサイクルを２５回繰り返した後、７２℃１０分
間の最終インキュベーションで完了させた。増幅産物を
フェノールで抽出し、エタノール沈澱を行い、適当な制
限酵素で切断して、１％低融点アガロースゲル（ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（メリーランド州ガー
タースハーグ））上での電気泳動によって精製した。ア
クリルアミドゲル上での電気泳動など、増幅されたＤＮ
Ａの精製に関して当該分野での既知の他の手法も使用で
きよう。増幅産物は、発現に用いる前に、適当な制限酵
素（この実施例ではＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ）で処理
され、精製される必要があることは当該分野でよく知ら
れている。

【００６４】増幅産物を１％アガロースゲル上で電気泳
動させ、臭化エチジウムで染色して、ＵＶ照射によって
写真撮影した。図７に得られた結果を示す。レーン１、
６および１１は、分子量マーカーとしてのＴ７ＤＮＡの
ＨａｅＩＩ消化物の結果である。サイズはキロ塩基対
（ｋｂ）で示す。レーン２、４、７および９は、ボレリ
ア・ブルグドルフェリの全ＤＮＡを用いた増幅産物の１
／５容量の試料の結果であり、レーン３、５、８および
１０は、鋳型としてプラスミドｐＴＲＨ４４を用いた増
幅から得られた反応混合物の１／５容量を試料とした結
果を示す。使用した試料は、野生型ＯｓｐＡをコードす
る配列（完全型）を増幅するプライマーで増幅された試
料（レーン２、３、７および８）、および野生型の１８
番目のＬｙｓで始まる部分をコードする配列を増幅する
プライマーで増幅された試料（レーン４、５、９および
１０）であった。レーン７〜１０に示されるように、増
幅されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断すると、ｏｓｐＡ遺
伝子に単一に存在するＥｃｏＲＩ切断部位から切断され
た期待された移動度を有する産物（それぞれ、６６２＋
１８２および６２３＋１８２ｂｐ）を得ることができ
る。

【００６５】実施例２ｏ ｓｐＡ遺伝子の端部欠失型および完全な長さの野生型
（完全型）のそれぞれを発現させるために、ＰＣＲで増
幅されたＤＮＡ断片をタンパク質産生用のプラスミドベ
クター中にクローニングした。本発明におけるタンパク
質産生用として好ましいプラスミドベクターは、ｏｓｐ
Ａ遺伝子がＴ７プロモーター及びバクテリオファージＴ
７に有効な翻訳開始シグナルの制御下に置かれるｐＥＴ
９であった。発現ベクターｐＥＴ９およびｐＬｙｓＳ、
クローニング用細菌宿主、増殖培地、およびＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼによるクローン化遺伝子の発現を行うため
の方法については、従来の記載がある（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．，Ｄｕｍ
ｍ，Ｊ．Ｊ．およびＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．，
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．「クローン化遺伝子の発現
を規定するＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用」１８５：６
０−８９（１９９０）参照）。バクテリオファージＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングおよび発現に
ついてもＳｔｕｄｉｅｒらの米国特許第４，９５２，４
９６号（参考までにここに引用する）中に示されてい
る。Ｔ７プロモーター系が本発明の好ましい発現系であ
る一方、特定の発現系が宿主生物と適合すれば、端部欠
失型ｏｓｐＡ遺伝子の発現方法は限定されない。

【００６６】得られたプラスミドはｐＥＴ９−ｐｒｅＯ
ｓｐＡおよびｐＥＴ９−ＯｓｐＡとそれぞれ命名され、
ｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡは対照として使用する完全な
長さの野生型ＯｓｐＡのアミノ酸配列をコードする領域
を有する増幅ＤＮＡ断片（完全型）が導入されたプラス
ミドであり、ｐＥＴ９−ＯｓｐＡは、野生型ＯｓｐＡの
組換え変異型（端部欠失型）をコードする増幅ＤＮＡ断
片が導入されたプラスミドである。

【００６７】本発明の好ましい形態ではｐＥＴ９ベクタ
ーが使用されるが、それは、ｐＥＴ９が、その選択マー
カーとしてｂｌａ遺伝子の代わりにｋａｎ遺伝子を有す
るからである。そのため培養にアンピシリンは不要であ
り、したがって、免疫原となるアンピシリン・ＯｓｐＡ
複合体が形成される可能性がなくなる。この型の結合体
は、アンピシリンアレルギーにおける主要な抗原決定基
であると考えられており、それが存在すれば、計画され
た免疫学的研究が複雑なものとなり得よう（Ｙｖｏｎ，
Ｍ．，Ａｎｇｌａｄｅ，Ｐ．およびＷａｌ，Ｊ−Ｍ．，
「血清アルブミン分子における、ベンゾイルペニシロイ
ル（ペニシリンのアレルゲン代謝物）結合部位の同定」
ＦＥＢＳ，２６３：２３７〜２４０（１９９０）参
照）。プラスミドｐＥＴ９およびｐＥＴ９−ＯｐｓＡの
略図を、それぞれ図８および図９に示す。

【００６８】最初にプラスミドｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐ
Ａ及びｐＥＴ９−ＯｓｐＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
を欠く宿主であるＤＨ５αにクローニングした。細菌Ｒ
ＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターでは始動しないの
で、この宿主におけるバックグランドの発現は最小であ
る。基本的には、目的とする遺伝子産物は大腸菌に対し
て毒性をもつが、この宿主を用いることで安定な組換え
プラスミドの樹立が可能である。得られたプラスミドが
所望の構成を持つものであるかどうかは、制限酵素切断
部位の解析およびＯｓｐＡコード配列（アミノ酸をコー
ドする配列）の全域の標準的なジデオキシ法による配列
分析を徹底的に行うことで確認された。

【００６９】ここで使用されたプライマーは、ボレリア
・ブルグドルフェリの全ＤＡＮからの野生型ｏｓｐＡ遺
伝子の所定部分の増幅用として設計されたものであった
が、実施面での理由および突然変異体の発生率の増幅サ
イクル数に伴う増大を防ぐという理由から、プラスミド
ｐＴＲＨ４４を鋳型ＤＮＡとして用いた増幅反応生成物
からのＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ断片を用いてプラスミドを
構築した。続いて、各反応から得られた８２４ｂｐのＮ
ｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ断片と、７７９ｂｐのＮｄｅＩ／Ｂ
ｇｌＩＩ断片を別個にＴ７発現ベクターｐＥＴ９中にサ
ブクローニングした。なお、ｐＥＴ９は、ＮｄｅＩおよ
びＢａｍＨＩでの消化後、消化物を脱リン酸化し、１％
の低融点ゲル上での電気泳動によって精製し、このサブ
クローニングに用いた。ｐＵＣ９中に野生型ｏｓｐＡ遺
伝子（完全型）を挿入したプラスミドｐＴＲＨ４４につ
いては、従来の記述がある（Ｈｏｗｓ，Ｔ．Ｒ．，Ｌａ
Ｑｕｉｅｒ，Ｆ．Ｒ．およびＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．
「単一の転写単位中でライム病病原体ボレリア・ブルグ
ドルフェリの２種類の外膜タンパク質をコードする遺伝
子の構成」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５４：２０７
−２１２（１９８６）参照）。

【００７０】増幅されたＤＮＡのＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ
による消化および得られたＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ断片
の、ｐＥＴ９のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理断片との連結
によって得られた５１２７ｂｐのｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓ
ｐＡおよびｐＥＴ９−ＯｓｐＡの構造を図８、９にそれ
ぞれ示す。φ１０−Ｓ１０は、バクテリオファージＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ用のφ１０プロモーター、Ｔ７遺伝
子１０のリボゾーム結合部位および翻訳開始部位を含む
領域を示す。Ｔφは、Ｔ７ポリメラーゼの転写終止シグ
ナルである。

【００７１】実施例３ タンパク質の生産を目的として、上記のプラスミドをそ
れぞれ発現用株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳに導入
した。この株は、誘導可能なｌａｃＵＶ５プロモーター
に制御されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロモゾ
ームコピー、および低レベルのＴ７リゾチーム（Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼの天然阻害剤）発現用のｐＡＣＹＣ１
８４を基礎として得られたｐＬｙｓＳを有するものであ
る。さらに詳しい情報は、Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｂ．Ａ．お
よびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．「Ｔ７リゾチームはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼによる転写を阻害する」Ｃｅｌｌ，
４９：２２１−２２７（１９８７）参照）。非誘導細胞
中で、リゾチームは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの基本的
活性を低下させ、発現宿主中で安定に保持され得る目的
遺伝子の範囲を増大させる。

【００７２】各プラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）
／ｐＬｙｓＳを対数増殖期の中期まで増殖させた後、一
部の培養においてＩＰＴＧによる発現誘導を行った。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析か
ら、ボレリア・ブルグドルフェリ菌体全抽出物に得られ
る野生型ＯｓｐＡとほぼ同一の移動度のタンパク質が、
誘導によってプラスミドｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡから
比較的少量生産されることが分かった。図１０にその結
果を示す。試料（１．５μｌ）を、下記の所定時間経過
時にＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥによる分析用として取
出した。タンパク質は、クマシブルー染色によって観察
した。図１０のレーン１、５および９は、ボレリア・ブ
ルグドルフェリ細胞（５×１０⁷細胞）のサンプルの結
果であり、レーン２、３および４は、ｐＥＴ９−ｐｒｅ
ＯｓｐＡでの１、３及び１８時間の誘導での結果をそれ
ぞれ示す。レーン６、７および８はｐＥＴ９−ＯｓｐＡ
での１、３及び１８時間の誘導での結果をそれぞれ示
す。縦軸の数字（９４、６７、４３、３０および２０）
はそれぞれ分子量マーカーの位置を示し、単位はキロダ
ルトンである。

【００７３】パルス−チェイス実験を行って、ｐＥＴ９
−ｐｒｅＯｓｐＡからのタンパク質の発現が、誘導後１
〜２時間において、結果的に大腸菌にとって有毒である
ことが示された。対照的に、ｐＥＴ９−ＯｓｐＡの発現
誘導においては、非常に高い持続的発現が認められた。

【００７４】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって追跡
された、ＯｓｐＡ組換え変異体の発現誘導の結果を示
す。レーン１は、ｐＥＴ９−ＯｓｐＡを有するＢＬ２１
（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株の非誘導状態の全細胞（ｗｈ
ｏｌｅ ｃｅｌｌ）の泳動結果である。レーン２〜７
は、誘導後１時間間隔でサンプリングした全細胞の泳動
結果である。レーン８は、分子量マーカーの泳動結果で
ある。図１２には、以下の異なった精製段階でのＯｓｐ
Ａ組換え変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レー
ン１＝分子量マーカー；レーン２＝遠心前の粗抽出物；
レーン３＝遠心後の粗抽出物；レーン４＝Ｑセファロー
スでの泳動試料；レーン５＝Ｓセファロースによる密度
勾配分画；レーン６＝ヒドロキシルアパタイト分画。レ
ーン２〜６は、それぞれ各分画に存在する総タンパク質
の０．０１％を含む。タンパク質を、１０〜２０％アク
リルアミド勾配ゲル上で分析した。２種類のモノクロー
ナル抗体、Ｈ５３３２およびＨ３ＴＳを用いたウエスタ
ン法は、野生型ＯｓｐＡのさまざまなエピトープを認識
するために知られており、この方法も、これらのバンド
が真正なＯｓｐＡ配列を含むことを証明するために実施
された（Ｂｒａｎｄｔ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｂ．
Ｓ．，Ｒａｄｏｌｆ，Ｊ．Ｄ．およびＮｏｒｇａｒｄ，
Ｍ．Ｖ．「ボレリア・ブルグドルフェリの免疫原的統合
膜タンパク質はリポタンパク質である」Ｉｎｆａｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．，５８：９８３−９９１（１９９０）およ
びＨｏｗｅ，Ｔ．Ｒ．，Ｍａｙｅｒ，Ｌ．Ｗ．およびＢ
ａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，「ライム病スピロヘータの２
種類の主要外表面タンパク質を発現する単一の組換えプ
ラスミド」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：６４５−６４６
（１９８５）参照）。

【００７５】ｐＥＴ９−ＯｓｐＡからのタンパク質は、
野生型ＯｓｐＡから１７個のアミノ酸残基を除いたもの
であり、これからさらにメチオニン残基が取れた場合で
も、ｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡからのタンパク質と非常
に近いアミノ酸残基数を有することが予測されたにも拘
らず、図１０に示された結果は、これらのタンパク質間
の分子量に大きな差があることを示した。この差は、ｐ
ＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡから生産されプロセッシングを
経た産物のＮ末端に共有結合した脂質がその移動度を低
下させたことによって生じた可能性がもっとも高い。あ
るゲル上（例えば、図１３参照）では、ｐＥＴ９−ｐｒ
ｅＯｓｐＡからの産物は、２つの近接したバンドを示す
場合もあり、これらはプロセッシグ過程における中間体
であるかもしれない。この結果は、プロセッシグ前の前
駆体やプロセッシング過程から得られるものは１次元Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上で類似の移動度を持つことを示唆する
ものであった。

【００７６】実施例４ 細胞内での位置を決定するために、ｐＥＴ９−ｐｒｅＯ
ｓｐＡを有するＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを培養
（２０ｍｌ）し、ＩＰＴＧでの誘導３時間経過後に８，
０００ｒｐｍでの遠心によって菌体を収穫した。菌体ペ
レットを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、２０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含
む１０ｍｌの混合物中に懸濁させた。次いで、菌体を凍
結、解凍して細胞融解させた。得られた融解物をＤＮア
ーゼおよびＭｇ⁺⁺で処理してから、３３，０００ｒｐｍ
で９０分間沈降させた。ペレット画分を０．２５Ｍショ
糖、３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
ｍＭＤＴＴおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５ｍｌの混合
物中に再懸濁させた。この再懸濁物を５０，０００ｒｐ
ｍで１時間の遠心によって再びペレット化した。このペ
レットを、１ｍｌの２５重量％ショ糖、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび１ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁させ、次いで不連続
ショ糖密度勾配層上にのせた。遠心は、４℃にて１６時
間３０，０００ｒｐｍで実施した。遠心後、０．５ｍｌ
の分画を回収し、２０μｌの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびウエスタン法によって解析した。密度勾配の外膜領
域を、ＯｍｐＡ（特徴がよく分かった大腸菌の外膜成
分）に対する抗体との反応性によって決定した（Ｚｉｍ
ｍｅｒｍａｎ，Ｒ．およびＷｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．「大腸
菌の外膜へのＯｍｐＡタンパク質の結合に関するエネル
ギー論及び中間体」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５
８：３９２０−３９２５（１９８３）参照）。

【００７７】ｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡから得られる野
生型ＯｓｐＡ（完全型）のほぼ全量を凍結−解凍による
細胞融解物の低速ペレット分画中に回収した。このペレ
ットを、不連続ショ糖密度勾配遠心法によって内膜およ
び外膜画分に分画した。このタンパク質のほとんどは、
内膜成分に富んだ分画中に見い出された。

【００７８】いっそうの研究によれば、この野生型Ｏｓ
ｐＡの組換え体（完全型）は、大腸菌の内膜を選択的に
可溶化する当該分野で既知の条件下で抽出されることが
わかった。こういった条件では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００またはＮ−ラウリルサルコシン酸ナトリウムなどの
界面活性剤によるタンパク質画分の処理が必要とされる
（Ｆｏｒｓｔ，Ｓ．，Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｊ．，Ｒａｍａ
ｋｒｉｓｈｎａｎ，，Ｇ．およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．
「ｅｎｖＺの非存在下での大腸菌におけるｏｍｐＣおよ
びｏｍｐＦの発現」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７
０：５０８０−５０８５（１９８８）参照）。しかし一
方、ｐＥＴ９−ＯｓｐＡからの産物は、いかなる界面活
性剤の非存在下であっても可溶（≧５０ｍｇ／ｍｌ）で
あって、このＯｓｐＡ組換え変異体の有意量（≧細胞の
総タンパク質の５０％）を、ＩＰＴＧでの発現誘導後数
時間で生産させることができた（図１１参照）。ｐＥＴ
９−ＯｓｐＡの発現誘導が６時間を超えて続けられた場
合、細胞は融解し始め、最終的にはすべての産物が培養
上清中に表われた。

【００７９】実施例５ ＯｓｐＡの組換え変異体を精製するために、３工程の操
作を行った。ｐＥＴ９−ＯｓｐＡを有する大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを含む培地（５００ｍｌ）を
２リッターのフラスコに入れ、これを３７℃で振とうし
ながら培養を行った。このフラスコには、Ｍ９塩、０．
４％グルコース、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコー
ル、および２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンを添加した
肉汁が入っており、ＯＤ₆₀₀が０．６に達するまで増殖
させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭに
なるまで加えた。ＩＰＴＧとともに１００μｇ／ｍｌの
カナマイシンをさらに加え、標的プラスミドを失った細
胞の増殖による培養菌体の過剰生産を防いだ。６時間
後、菌体を遠心によって回収し、２０ｍＭのリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．７）２５〜３０ｍｌ中に再浮遊
させ、−２０℃で保存した。４℃でこの凍結菌体を解凍
することによって粗抽出物を調製した。この操作は、ｐ
ＬｙｓＳによってコードされたリゾチームによる細胞の
効果的な融解を可能とする。次に、ＭｇＣｌ₂およびＤ
Ｎアーゼ（それぞれ最終濃度は、２．５ｍＭおよび５μ
ｇ／ｍｌ）を添加した。４℃で３０分後、細胞残渣を遠
心（１５分間、１５，０００ｇ）によって除去した。得
られたペレットを１０ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．７、緩衝液Ａ）１０ｍｌで抽出
した。遠心の後、各上清を一緒にして約４０ｍｌの粗抽
出物を得た。

【００８０】この粗抽出物を、緩衝液Ａで平衡化したＱ
セファロースファーストフローを予め充填した２５ｍｌ
のカラムに室温でかけた。このカラムに５０ｍｌの緩衝
液Ａを通して溶出を行い、標的タンパク質のすべてをこ
の緩衝液Ａで溶出させて、回収した。

【００８１】標的タンパク質を含む画分を、５ｍＭのＮ
ａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０、緩衝液Ｂ）２リッターに対して４℃で一晩透析
（２回交換）し、１０，０００ｇでの遠心によって清澄
化してから、緩衝液Ｂで平衡化したＳセファロースファ
ーストフローを充填したカラム（２０×１．５ｃｍ）に
室温でかけた。１００ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄し
て、未結合のタンパク質及び２６０ｎｍに強い光吸収を
有する共雑物を除去した後、緩衝液Ｂ中のＮａＣｌ濃度
勾配（０〜１００ｍＭ；全量３００ｍｌ）での溶出を行
った。約３５ｍＭＮａＣｌのところで標的タンパク質の
溶出が得られた。Ｑセファロースファーストフロー及び
Ｓセファロースファーストフローは、ファルマシア社
（ニュージャージー州ピスカタウエイ）から入手した。

【００８２】Ｓセファロースを用いた工程から得られた
標的タンパク質の画分を合わせて、これを予め緩衝液Ｂ
で平衡化したバイオゲルＨＴＰハイドロキシアパタイト
を充填したカラム（２０ｍｌ）にかけた。カラムの操作
は室温で行い、これを５０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。
タンパク質を、１００〜４００ｍＭのリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）の直線濃度勾配（総量３００ｍ
ｌ）で溶出させた。標的タンパク質を含む分画は１５０
〜３００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液の濃度勾配の間
で幅広いピークとして溶出し、その分画を合わせて限外
濾過により最終容量が５ｍｌとなるまで濃縮した。この
濃縮タンパク質溶液を５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、緩衝液Ｄ）
に対して透析し、４℃で保存した。バイオゲルＨＴＰハ
イドロキシアパタイトはバイオラッド・ラボラトリーズ
社（カリフォルニア州リッチモンド）から購入した。

【００８３】組換えタンパク質を精製する上記の方法
は、本発明のタンパク質を精製するための１つの適切な
例を単に例示したにすぎない。当該分野では既知の他の
適切な方法を、精製のために代用することもできる。例
えば、Ｓセファロース分画を、濃縮して、ファルマシア
社（ニュージャージー州ピスカタウエイ）から入手した
セファクリルＳ２００または他の適切なゲル濾過マトリ
ックスのカラムにかけることができる。

【００８４】５００ｍｌの出発培養物からの生産におい
て、ＯｓｐＡ組換え変異体の収量は６０〜７０ｍｇであ
った。図１１に示すように、この場合の全体に対する収
率は、個々の分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥから判断した場
合、約５０％であり、これは、大腸菌中で端部欠失型ｏ
ｓｐＡ遺伝子の高度発現がよく行われていることを示し
ている。

【００８５】実施例６ ＯｓｐＡの組換え変異体のタンパク質試料を、変性条件
下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し
た。この方法に関しては、Ｓｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，
「スラブゲル上でのバクテリオファージＴ７初期ＲＮＡ
およびタンパク質の分析」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７
９：２３７−２４８（１９７３）が参照できる。ゲルを
固定してクマシブルーで染色するか、分離されたタンパ
ク質を電気泳動的にニトロセルロース膜に移し、試料に
結合したプローブとしての免疫グロブリンを［ ¹²⁵ Ｉ］
ラベルプロテインＡを用いて検出した（Ｂａｒｂｏｕ
ｒ，Ａ．Ｇ．「ボレリア属細菌の生物学」Ｙａｌｓ
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５７：５８１−５８６（１９
８４）参照）。［¹²⁵Ｉ］ラベルプロテインＡ（５×１
０５ｃｐｍ／ｍｌ）はデュポン−ニューイングランドヌ
クレアー社から得た。場合によっては、このニトロセル
ロース膜に、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ）に３％ゲラチン
を溶かした溶液で最低１時間のブロッキングを行い、抗
体との反応の前に０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含むＴＢ
Ｓ（ＴＴＢＳ）で洗浄した。ＴＴＢＳ中での数回の洗浄
によって未結合抗体を除いた後、反応性タンパク質を、
アフィニティー精製したアルカリフォスファターゼを結
合させたヤギ抗マウス抗体およびアルカリフォスファタ
ーゼの発色試薬を用いて検出した。未処理のＯｓｐＡ組
換え変異体の分子量を、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩
衝液Ａの溶液に精製タンパク質を溶解させた溶液を４℃
のセファクリルＳ−２００カラム（２．５×１２０ｃ
ｍ、検量線内蔵、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ）に通すクロ
マトグラフィーによって決定した。Ｎ末端から２０個の
アミノ酸残基をエドマン分解法によるアプライド・バイ
オシステムズ社の４７０Ａマイクロシークエンサーにか
けて決定した。ＯｓｐＡ組換え変異体のＮ末端から最初
の２０残基のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列から予想され
たものから最初のメチオニン残基がプロセッシングにお
いて除かれたものであった。このタンパク質のモル吸光
係数を、Ｅ_M,nat＝（Ａｂｓ_nat）（Ｅ_M,Gdn.HCl）／
（Ａｂｓ_Gdn.HCl）の式によりアミノ酸の組成の知見か
ら計算した（Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｃ．およびｖｏｎ Ｈｉｐ
ｐｅｌ，Ｐ．Ｈ．「アミノ酸データからのタンパク質の
吸光係数の計算」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：
３１９−３２６（１９８９）参照）。得られたモル吸光
係数（Ｅ₂₈₀）は、１０．５９×１０³Ｍ^-1であった。こ
の値は、酸加水分解物のアミノ酸組成の分析から得られ
た値と非常によく一致（±５％）しているとともに、得
られたタンパク質の収率面での数値とも一致しているこ
とが分かった。

【００８６】実施例７ ＯｓｐＡの組換え変異体の反応性を、抗野生型ＯｓｐＡ
ヒト抗体に対して試験した。ライム病患者からの血清に
は、ＯｓｐＡを含む数種のボレリア・ブルグドルフェリ
外表面タンパク質に対する抗体が含まれている。ライム
病関連慢性関節炎の患者から得られた反応性の関節滑液
およびＯｓｐＡ特異抗体Ｈ３ＴＳについては、従来から
記載されている（Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，Ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒ，Ｗ．，Ｇｒｕｎｗａｌｄｔ，Ｅ．および
Ｓｔｅｅｒｅ，Ａ．Ｇ．「イキソデス・ダミニスピロヘ
ータの成分に対する、ライム病患者の抗体」Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７２：５０４−５１５（１９８
３）及びＢａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．，Ｈｅｉｌａｎｄ，
Ｒ．Ａ．およびＨｏｗｅ，Ｔ．Ｒ．「ライム病ボレリア
属細菌の主要タンパク質の不均一性：北アメリカおよび
ヨーロッパでの単離物の分子的解析」Ｊ．Ｉｎｆａｃ
ｔ．Ｄｉｓ．，１５２：４７８−４８４（１９８５）参
照）。

【００８７】図１３に示されるように、ライム病関連関
節炎患者からの関節滑液に存在する抗体は、ウエスタン
法でボレリア・ブルグドルフェリからの３１ｋＤａおよ
び３４ｋＤａの野生型ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢと強く反
応した。更に、大腸菌中で合成された両型のＯｓｐＡ
（ＯｓｐＡの組換え変異体（端部欠失型）、および対照
として合成された完全な長さの野生型ＯｓｐＡ（完全
型））も強く反応した。

【００８８】図１３のレーン１はボレリア・ブルグドル
フェリ（Ｂ３１）スピロヘータの全細胞融解物（２×１
０⁶細胞）の結果で、レーン２〜４は、誘導発現処理さ
れた大腸菌を用いた場合の結果である。レーン５は、Ｏ
ｓｐＡの組換え変異体の精製物（０．５μｇ）の結果で
ある。レーン２〜５にかけた試料は、誘導後３時間経過
した段階で、それぞれｐＥＴ９ベクタープラスミドを有
する細胞、ｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡを有する細胞およ
びｐＥＴ９−ＯｓｐＡを有する細胞（６μｌ）での結果
を示す。ＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥで分離したタンパ
ク質をニトロセルロース膜に転写し、２％ウシ血清アル
ブミン中で一晩のブロッキングを行ってから、ライム病
患者から得られた関節滑液と反応させた。各ブロットを
洗浄し、［¹²⁵Ｉ］ラベルプロテインＡとインキュベー
ションし、オートラジオグラフィー用のフィルムにさら
した。野生型ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡおよ
びＯｓｐＢの位置が示された。

【００８９】得られた結果は、両プラスミドが免疫反応
性のＯｓｐＡタンパク質を発現することを示す一方、ｐ
ＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡから発現されたタンパク質が、
これと同等量のｐＥＴ９−ＯｓｐＡから生産されたタン
パク質より強く反応する傾向があったことを示してい
た。イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、登録商標：疎水
性のポリビニリデンジフルオリドを基材とする膜）がタ
ンパク質ブロッティング用の固相として用いられた際に
も、類似の結果が得られた。反応性におけるこの見かけ
の差異は、転写が不完全であったこと、またはニトロセ
ルロース膜上へのＯｓｐＡの組換え変異体の保持によっ
て引き起されるものと推定された。続いて、上記の理論
は、誘導処理時の培養菌体を［³⁵Ｓ］メチオニン（デュ
ポン−ニューイングランドヌクレアー社より入手、比活
性＝１１６５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識することによって
調べられた。オートラジオグラフィーを行って、ウエス
タン法の各ステップにおける野生型ＯｓｐＡに対するＯ
ｓｐＡの組換え変異体の相対的な量を追跡した。

【００９０】ｐＥＴ９−ｐｒｅＯｓｐＡを有するＢＬ２
１（ＤＥ３）／ＬｙｓＳ株およびｐＥＴ９−ＯｓｐＡを
有するＢＬ２１（ＤＥ３）／ＬｙｓＳ株をそれぞれ３７
℃にてＭ９培地中で対数増殖期の中期まで増殖させ、Ｉ
ＰＴＧで発現誘導を行った。１時間の誘導後、各培養菌
体を２０μＣｉ／ｍｌの［³⁵Ｓ］メチオニンで５分間標
識し、その１０μｌを、１２．５％のゲル上で電気泳動
にかけた後に分析した。図１４〜１８にその結果を示
す。各図のレーン１は未標識のボレリア・ブルグドルフ
ェリの全菌（５×１０⁷細胞）での結果である。レーン
２および３は、誘導発現により標識された菌体での結果
である。タンパク質を、図１４に示すようにクマシブル
ーでの染色で、また図１５に示すようにゲルのオートラ
ジオグラフィーによって観察した。図１６および図１７
では、タンパク質を、ニトロセルロース紙へ電気泳動的
に転写した後に観察した。図１６は、ウエスタン分析に
かける前のニトロセルロース紙のオートラジオグラフィ
ーを示す。図１７は、プローブとしての抗体を反応させ
た後のオートラジオグラフィーを示す。図１８は、アル
カリフォスファターゼ発色試薬での処理後の完全なウエ
スタン法の写真を示す。実線の矢印は、それぞれレーン
１および２に表われたＯｓｐＡの組換え変異体および組
換えＯｓｐＡ（完全型）を示す。破線の矢印は、レーン
３にみられるＯｓｐＡ組換え変異体の位置を示す。

【００９１】ここで図１４〜図１８の結果を参照する
と、野生型ＯｓｐＡとＯｓｐＡの組換え変異体の量がブ
ロッティング工程の間に相対的に変化したことが明かで
ある。そのブロットを選択して洗浄したところ、残った
ＯｓｐＡの組換え変異体の量は、最初に転写された量に
比較して著しく減少した。対照的に、ＯｓｐＡの野生型
は、各工程でよく保持された。この結果によれば、２つ
の型のＯｓｐＡ（組換え変異体および野生型）の反応性
に見られる差異は、おもに、ウエスタン法分析の最中で
可溶性の高いＯｓｐＡの組換え変異体の損失が生じるた
めであることを示している。

【００９２】結論およびデータの要約 あるタンパク質の組換え体を生産するための上記の方法
は、ボレリア・ブルグドルフェリの外表面プロテインＡ
に対して使用されたが、遺伝子中にシグナルペプチダー
ゼＩＩのシグナル配列をコードする領域を有するもので
あれば、本発明の方法を他のボレリア属リポタンパク質
にも等しく応用可能である。

【００９３】端部欠失型のｏｓｐＡ遺伝子は、宿主生物
の細胞膜との結合性に欠けるため、高生産可能な物質と
なった。得られたＯｓｐＡの組換え変異体は、誘導の数
時間後に総細胞タンパク質の５０％を超える量で生産さ
れた（実施例４、５および６参照）。さらに、このＯｓ
ｐＡ組換え変異体は、脂質が付加されておらず、界面活
性剤の非存在下で高い可溶性（≧５０ｍｇ／ｍｌ）を示
す（実施例４参照）。また、高度発現によって単純な精
製法を用いて、０．５リッター程度の培養液から、６０
〜７０ｍｇの純粋なタンパク質を得ることができた（実
施例５、６参照）。ＯｓｐＡの組換え変異体をウエスタ
ン法にかけるとによって、それが免疫反応性のエピトー
プ部位を保持していることが分かった。本発明のタンパ
ク質の高純度および可溶性とその反応性が組み合わさっ
て、このタンパク質は、臨床分離物中のライム病病原体
の有無を検出するための診断薬およびボレリア・ブルグ
ドルフェリに対するワクチン用の免疫原として優れた候
補となり得る。

【００９４】本発明で例示された実施態様は、添付の図
面を参照としてここに記載されてきたが、本発明はこれ
らの実施態様に厳密に限定されるわけではなく、本発明
の範囲または精神から逸脱しなければ当該分野の技術者
によって、さまざまな他の変更および修飾が加えられて
もよい。

【００９５】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：８２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG AAA AAA TAT TTA TTG GGA ATA GGT CTA ATA TTA GCC TTA ATA GCA 48 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 TGT AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGC GTT TCA GTA 96 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 GAT TTG CCT GGT GAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC AAA 144 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 35 40 45 GAC GGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT AAA 192 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT GGA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA AAA 240 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 65 70 75 80 GCT GAC AAA AGT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT CAA 288 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 85 90 95 ACC ACA CTT GAA GTT TTC AAA GAA GAT GGC AAA ACA CTA GTA TCA AAA 336 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 AAA GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT GAA 384 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 AAA GGT GAA GTA TCT GAA AAA ATA ATA ACA AGA GCA GAC GGA ACC AGA 432 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 130 135 140 CTT GAA TAC ACA GGA ATT AAA AGC GAT GGA TCT GGA AAA GCT AAA GAG 480 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 GTT TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA ACA 528 Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr 165 170 175 ACA TTG GTG GTT AAA GAA GGA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT TCA 576 Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 180 185 190 AAA TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT GAC AGT AGT GCT 624 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 195 200 205 GCT ACT AAA AAA ACT GCA GCT TGG AAT TCA GGC ACT TCA ACT TTA ACA 672 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 ATT ACT GTA AAC AGT AAA AAA ACT AAA GAC CTT GTG TTT ACA AAA GAA 720 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 AAC ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT GGC ACC AAA TTA GAG 768 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 245 250 255 GGG TCA GCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA 816 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 260 265 270 AAA TAA 822 Lys

【００９６】配列番号：２ 配列の長さ：２７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 65 70 75 80 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 85 90 95 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr 165 170 175 Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 180 185 190 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 195 200 205 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 245 250 255 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 260 265 270 Lys

【００９７】配列番号：３ 配列の長さ：７７７ 配列の型：核酸酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG GCT AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGC GTT TCA 48 Met Ala Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser 1 5 10 15 GTA GAT TTG CCT GGT GAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC 96 Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn 20 25 30 AAA GAC GGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT 144 Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu 35 40 45 AAA GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT GGA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA 192 Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val 50 55 60 AAA GCT GAC AAA AGT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT 240 Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly 65 70 75 80 CAA ACC ACA CTT GAA GTT TTC AAA GAA GAT GGC AAA ACA CTA GTA TCA 288 Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser 85 90 95 AAA AAA GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT 336 Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn 100 105 110 GAA AAA GGT GAA GTA TCT GAA AAA ATA ATA ACA AGA GCA GAC GGA ACC 384 Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr 115 120 125 AGA CTT GAA TAC ACA GGA ATT AAA AGC GAT GGA TCT GGA AAA GCT AAA 432 Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys 130 135 140 GAG GTT TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA 480 Glu Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys 145 150 155 160 ACA ACA TTG GTG GTT AAA GAA GGA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT 528 Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 165 170 175 TCA AAA TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT GAC AGT AGT 576 Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser 180 185 190 GCT GCT ACT AAA AAA ACT GCA GCT TGG AAT TCA GGC ACT TCA ACT TTA 624 Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu 195 200 205 ACA ATT ACT GTA AAC AGT AAA AAA ACT AAA GAC CTT GTG TTT ACA AAA 672 Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys 210 215 220 GAA AAC ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT GGC ACC AAA TTA 720 Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 GAG GGG TCA GCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT 768 Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala 245 250 255 TTA AAA TAA 777 Leu Lys

【００９８】配列番号：４ 配列の長さ：２５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Met Ala Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser 1 5 10 15 Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn 20 25 30 Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly 65 70 75 80 Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser 85 90 95 Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn 100 105 110 Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr 115 120 125 Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys 130 135 140 Glu Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys 145 150 155 160 Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 165 170 175 Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser 180 185 190 Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys 210 215 220 Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala 245 250 255 Leu Lys

【００９９】配列番号：５ 配列の長さ：７７４ 配列の型：核酸酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCT AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGC GTT TCA GTA 48 Ala Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 1 5 10 15 GAT TTG CCT GGT GAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC AAA 96 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 20 25 30 GAC GGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT AAA 144 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 35 40 45 GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT GGA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA AAA 192 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 50 55 60 GCT GAC AAA AGT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT CAA 240 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 65 70 75 80 ACC ACA CTT GAA GTT TTC AAA GAA GAT GGC AAA ACA CTA GTA TCA AAA 288 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 85 90 95 AAA GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT GAA 336 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 100 105 110 AAA GGT GAA GTA TCT GAA AAA ATA ATA ACA AGA GCA GAC GGA ACC AGA 384 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 115 120 125 CTT GAA TAC ACA GGA ATT AAA AGC GAT GGA TCT GGA AAA GCT AAA GAG 432 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 130 135 140 GTT TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA ACA 480 Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr 145 150 155 160 ACA TTG GTG GTT AAA GAA GGA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT TCA 528 Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 165 170 175 AAA TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT GAC AGT AGT GCT 576 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 180 185 190 GCT ACT AAA AAA ACT GCA GCT TGG AAT TCA GGC ACT TCA ACT TTA ACA 624 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 195 200 205 ATT ACT GTA AAC AGT AAA AAA ACT AAA GAC CTT GTG TTT ACA AAA GAA 672 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 210 215 220 AAC ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT GGC ACC AAA TTA GAG 720 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 GGG TCA GCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA 768 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 245 250 255 AAA TAA 774 Lys

【０１００】配列番号：６ 配列の長さ：２５７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Ala Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 1 5 10 15 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 50 55 60 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 65 70 75 80 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 85 90 95 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 100 105 110 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 130 135 140 Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr 145 150 155 160 Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 165 170 175 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 180 185 190 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 195 200 205 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 210 215 220 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 245 250 255 Lys

【０１０１】配列番号：７ 配列の長さ：７７４ 配列の型：核酸酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGC GTT TCA GTA 48 Met Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 1 5 10 15 GAT TTG CCT GGT GAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC AAA 96 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 20 25 30 GAC GGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT AAA 144 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 35 40 45 GGA ACT TCT GAT AAA AAC AAT GGA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA AAA 192 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 50 55 60 GCT GAC AAA AGT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT CAA 240 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 65 70 75 80 ACC ACA CTT GAA GTT TTC AAA GAA GAT GGC AAA ACA CTA GTA TCA AAA 288 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 85 90 95 AAA GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT GAA 336 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 100 105 110 AAA GGT GAA GTA TCT GAA AAA ATA ATA ACA AGA GCA GAC GGA ACC AGA 384 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 115 120 125 CTT GAA TAC ACA GGA ATT AAA AGC GAT GGA TCT GGA AAA GCT AAA GAG 432 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 130 135 140 GTT TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA ACA 480 Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr 145 150 155 160 ACA TTG GTG GTT AAA GAA GGA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT TCA 528 Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 165 170 175 AAA TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT GAC AGT AGT GCT 576 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 180 185 190 GCT ACT AAA AAA ACT GCA GCT TGG AAT TCA GGC ACT TCA ACT TTA ACA 624 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 195 200 205 ATT ACT GTA AAC AGT AAA AAA ACT AAA GAC CTT GTG TTT ACA AAA GAA 672 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 210 215 220 AAC ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT GGC ACC AAA TTA GAG 720 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 GGG TCA GCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA 768 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 245 250 255 AAA TAA 774 Lys

【０１０２】配列番号：８ 配列の長さ：２５７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Met Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 1 5 10 15 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 50 55 60 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 65 70 75 80 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 85 90 95 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 100 105 110 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 130 135 140 Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr 145 150 155 160 Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 165 170 175 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 180 185 190 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 195 200 205 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 210 215 220 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 245 250 255 Lys

【０１０３】配列番号：９ 配列の長さ：７７１ 配列の型：核酸酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAG CAA AAT GTT AGC AGC CTT GAC GAG AAA AAC AGC GTT TCA GTA GAT 48 Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp 1 5 10 15 TTG CCT GGT GAA ATG AAA GTT CTT GTA AGC AAA GAA AAA AAC AAA GAC 96 Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp 20 25 30 GGC AAG TAC GAT CTA ATT GCA ACA GTA GAC AAG CTT GAG CTT AAA GGA 144 Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly 35 40 45 ACT TCT GAT AAA AAC AAT GGA TCT GGA GTA CTT GAA GGC GTA AAA GCT 192 Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala 50 55 60 GAC AAA AGT AAA GTA AAA TTA ACA ATT TCT GAC GAT CTA GGT CAA ACC 240 Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr 65 70 75 80 ACA CTT GAA GTT TTC AAA GAA GAT GGC AAA ACA CTA GTA TCA AAA AAA 288 Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys 85 90 95 GTA ACT TCC AAA GAC AAG TCA TCA ACA GAA GAA AAA TTC AAT GAA AAA 336 Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys 100 105 110 GGT GAA GTA TCT GAA AAA ATA ATA ACA AGA GCA GAC GGA ACC AGA CTT 384 Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu 115 120 125 GAA TAC ACA GGA ATT AAA AGC GAT GGA TCT GGA AAA GCT AAA GAG GTT 432 Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val 130 135 140 TTA AAA GGC TAT GTT CTT GAA GGA ACT CTA ACT GCT GAA AAA ACA ACA 480 Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr Thr 145 150 155 160 TTG GTG GTT AAA GAA GGA ACT GTT ACT TTA AGC AAA AAT ATT TCA AAA 528 Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys 165 170 175 TCT GGG GAA GTT TCA GTT GAA CTT AAT GAC ACT GAC AGT AGT GCT GCT 576 Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala 180 185 190 ACT AAA AAA ACT GCA GCT TGG AAT TCA GGC ACT TCA ACT TTA ACA ATT 624 Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile 195 200 205 ACT GTA AAC AGT AAA AAA ACT AAA GAC CTT GTG TTT ACA AAA GAA AAC 672 Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn 210 215 220 ACA ATT ACA GTA CAA CAA TAC GAC TCA AAT GGC ACC AAA TTA GAG GGG 720 Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly 225 230 235 240 TCA GCA GTT GAA ATT ACA AAA CTT GAT GAA ATT AAA AAC GCT TTA AAA 768 Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys 245 250 255 TAA 771

【０１０４】配列番号：１０ 配列の長さ：２５６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp 20 25 30 Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala 50 55 60 Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr 65 70 75 80 Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys 85 90 95 Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys 100 105 110 Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val 130 135 140 Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr Thr 145 150 155 160 Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys 165 170 175 Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala 180 185 190 Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn 210 215 220 Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly 225 230 235 240 Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys 245 250 255

【０１０５】配列番号：１１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCGGGATCCA T ATG GCT AAG CAA AAT GTT AGC 32 Met Ala Lys Gln Asn Val Ser 1 5

【０１０６】配列番号：１２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GATATCTAGA TCTTTATTTT AAAGCGTT 28

【０１０７】配列番号：１３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCGGATCCAT ATG AAA AAA TAT TTA TTG GGA 31 Met Lys Lys Thr Leu Leu Gly 1 5

【０１０８】配列番号：１４ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTA ATA GCA TGT Leu Ile Ala Cys 1

【０１０９】配列番号：１５ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Leu Ile Ala Cys 1

【図面の簡単な説明】

【図１】オリゴヌクレオチドプライマー２０１→２１６
のヌクレオチド配列を示す図である。

【図２】オリゴヌクレオチドプライマー９５８←９７２
のヌクレオチド配列を示す図である。

【図３】オリゴヌクレオチドプライマー１５１→１７１
のヌクレオチド配列を示す図である。

【図４】野生型ｏｓｐＡ遺伝子の一部を省略したヌクレ
オチド配列を示し、プライマー２０１→２１６および９
５８←９７２がアニールする部分を表わす図である。

【図５】野生型ｏｓｐＡ遺伝子の一部を省略したヌクレ
オチド配列を示し、プライマー１５１→１７１および９
５８←９７２がアニールする部分を表わす図である。

【図６】プライマー２０１→２１６およびプライマー９
５８←９７２によって鋳型としての野生型ｏｓｐＡ遺伝
子の増幅から生じる増幅産物を示す図である。

【図７】増幅産物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ
てゲルを臭化エチジウムで染色した結果を示す図であ
る。

【図８】プラスミドｐＥＴ９の構造を示す図である。

【図９】プラスミドｐＥＴ９−ＯｓｐＡの構造を示す図
である。

【図１０】発現誘導後の所定の時間間隔で採取した菌体
から得た各タンパク質試料をＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧ
Ｅにかけた後にゲルをクマシブルーで染色した結果を示
す図である。

【図１１】非誘導菌体と、誘導後１時間の間隔で採取し
た誘導菌体とを比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥでのゲルの状
態を示す図である。

【図１２】各精製段階でのＯｓｐＡ試料のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけた際のゲルの状態を示す図である。

【図１３】ボレリア・ブルグドルフェリ菌からのＯｓｐ
ＡおよびＯｓｐＢ、ならびに大腸菌で生産された組換え
ＯｓｐＡおよびＯｓｐＡ組換え変異体のウエスタンブロ
ットによる免疫学的分析におけるオートラジオグラムの
結果を示す図である。

【図１４】ｐＥＴ９−ＯｓｐＡを有する全菌体及びｐＥ
Ｔ９−ｐｒｅＯｓｐＡを有する全菌体と、ボレリア・ブ
ルドルフェリ全菌体とを比較したＳＤＳ−１２．５％Ｐ
ＡＧＥの結果（クマシブルーで染色）を示す図である。

【図１５】図１４に関する操作で染色されたゲルのオー
トラジオグラムの結果を示す図である。

【図１６】図１４に関する操作で得られたゲルからのウ
エスタン分析用ニトロセルロースブロットのオートラジ
オグラムの結果を示す図である。

【図１７】図１６に関する操作で得られたニトロセルロ
ースブロットに抗体による検索をかけた後のオートラジ
オグラムの結果を示す図である。

【図１８】図１７に関する操作の後にアルカリホスファ
ターゼの発色試薬で処理して得た完全なウエスタンブロ
ットを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アラン ジー． バーバー アメリカ合衆国 78209 テキサス州 サン アントニオ チャールズ ロード 404 (56)参考文献 ＲＰＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯ Ｎ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯ Ｎ，１〜２！（1990−11），Ｐ．159− 168 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＭＩＣＲＯＢＩ ＯＬＯＧＹ，３〜４！（1989），Ｐ. 479−486

Claims (26)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１の部分と第２の部分からなるアミノ
   酸配列を有するタンパク質であって、前記第２の部分が
   Ｎ末端及びＣ末端を有し、かつ配列表の配列番号：１０
   の配列を有し、前記第１の部分は第２の部分のＮ末端に
   結合し、アラニンおよびメチオニンのうち少なくとも１
   つから選ばれたアミノ酸残基からなることを特徴とする
   タンパク質。
2. 【請求項２】 前記アミノ酸配列が、配列表の配列番
   号：４、６または８の配列であることを特徴とする請求
   項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号：１０のアミノ酸配列
   で表わされるタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３のアミノ酸配列を
   コードするヌクレオチド配列を有することを特徴とする
   核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項１または２のアミノ酸配列をコー
   ドし、配列表の配列番号：３、５または７のヌクレオチ
   ド配列を有する請求項４に記載の核酸分子。
6. 【請求項６】 請求項３のアミノ酸配列をコードし、配
   列表の配列番号：９のヌクレオチド配列を有する請求項
   ４に記載の核酸分子。
7. 【請求項７】 請求項４に記載の核酸分子の有するヌク
   レオチド配列を供給する方法であって、 ５’末端及び３’末端を有し、該３’末端がシステイン
   残基をコードするコドンで終了している潜在性シグナル
   ペプチダーゼＩＩシグナル配列を含むボレリア属リポタ
   ンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する鋳型二
   本鎖ＤＮＡを供給する過程と、 第１のプライマーと第２のプライマーからなるオリゴヌ
   クレオチドプライマーのセットであって、該第１のプラ
   イマーは、前記鋳型ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖の５’から
   ３’方向への効果的な増幅を開始させるために十分な該
   鋳型ＤＮＡの第２のＤＮＡ鎖の所定領域と相補的な領域
   を有し、該第２のプライマーは、該鋳型ＤＮＡの第２の
   ＤＮＡ鎖の５’から３’方向への増幅を開始させるため
   に十分な該鋳型ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖の所定領域と相
   補的な領域を有し、該第１のプライマーは前記鋳型ＤＮ
   Ａの前記システイン残基をコードするコドンよりも３’
   方向における下流に位置するヌクレオチドからＤＮＡの
   重合反応を開始させるプライマーのセットを合成する過
   程と、 を含むことを特徴とする請求項４に記載の核酸分子の有
   するヌクレオチド配列を供給する方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のタンパク質を供給する
   方法であって、 ５’末端及び３’末端を有し、該３’末端がシステイン
   残基をコードするコドンで終了している潜在性シグナル
   ペプチダーゼＩＩシグナル配列を含むボレリア属リポタ
   ンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する鋳型二
   本鎖ＤＮＡを供給する過程と、 第１のプライマーと第２のプライマーからなるオリゴヌ
   クレオチドプライマーのセットであって、該第１のプラ
   イマーは、前記鋳型ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖の５’から
   ３’方向への効果的な増幅を開始させるために十分な該
   鋳型ＤＮＡの第２のＤＮＡ鎖の所定領域と相補的な領域
   を有し、該第２のプライマーは、該鋳型ＤＮＡの第２の
   ＤＮＡ鎖の５’から３’方向への増幅を開始させるため
   に十分な該鋳型ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖の所定領域と相
   補的な領域を有し、該第１のプライマーは前記鋳型ＤＮ
   Ａの前記システイン残基をコードするコドンよりも３’
   方向における下流に位置するヌクレオチドからＤＮＡの
   重合反応を開始させるプライマーのセットを合成する過
   程と、 前記プライマーと前記鋳型ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反
   応法で反応させ、増幅産物のセットを供給する過程と、 該増幅産物のセットから、前記ヌクレオチド配列の端部
   欠失型を単離する過程と、 適当な発現ベクターに該端部欠失型をクローニングする
   過程と、 適当な生体宿主を該発現ベクターで形質転換する過程
   と、 前記リポタンパク質の組換え変異体を生産するために前
   記生体宿主を培養する過程とを有することを特徴とする
   請求項１に記載のタンパク質を供給する方法。
9. 【請求項９】 重合反応が開始されるヌクレオチドが、
   ３’方向のシステイン残基をコードするコドンの直ぐ下
   流に位置することを特徴とする請求項７または８に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 ボレリア属リポタンパク質のヌクレオ
    チド配列が、５’末端及び３’末端を有するリーダー配
    列を含むことを特徴とする請求項７〜９のいずれか１つ
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】 リーダー配列が、シグナル配列の全体
    または一部を含むことを特徴とする請求項１０に記載の
    方法。
12. 【請求項１２】 リーダー配列がシグナル配列とともに
    ３’末端で終了しているか、シグナル配列がリーダー配
    列の３’末端の直ぐ下流に位置することを特徴とする請
    求項１０または１１の方法。
13. 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドプライマーが、ボ
    レリア属リポタンパク質をコードするヌクレオチド配列
    の部分断片に十分な相補性を有する領域を含み、該プラ
    イマーは該部分断片のポリメラーゼ連鎖反応における増
    幅の開始に効果的であることを特徴とする請求項７〜１
    ２のいずれか１つに記載の方法。
14. 【請求項１４】 発現ベクターがプラスミドであること
    を特徴とする請求項８に記載の方法。
15. 【請求項１５】 発現ベクターがプラスミドｐＥＴ９で
    あることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 プラスミドが、以下の制限酵素地図： 【化１】 で表され、上記制限酵素地図中におけるｏｓｐＡ断片が
    配列表の配列番号：３のヌクレオチド配列を有するｐＥ
    Ｔ９−ＯｓｐＡであることを特徴とする請求項１５に記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 生体宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株である
    ことを特徴とする請求項８、１４〜１６のいずれか１つ
    に記載の方法。
18. 【請求項１８】 Ｅ．ｃｏｌｉ菌株がＢＬ２１（ＤＥ
    ３）／ｐＬｙｓＳであることを特徴とする請求項１７に
    記載の方法。
19. 【請求項１９】 Ｔ７バクテリオファージ発現システム
    を用いることを特徴とする請求項８、１４〜１８のいず
    れか１つに記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｔ７バクテリオファージ発現システム
    がＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用するものであることを
    特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ボレリア属リポタンパク質がボレリア
    ・ブルグドルフェリのリポタンパク質であることを特徴
    とする請求項７〜２０のいずれか１つに記載の方法。
22. 【請求項２２】 ボレリア・ブルグドルフェリのリポタ
    ンパク質が、外表面膜プロテインＡ（ＯｓｐＡ）である
    ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 第１のプライマーが、配列表の配列番
    号：１１のヌクレオチド配列によって表わされることを
    特徴とする請求項７〜２２のいずれか１つに記載の方
    法。
24. 【請求項２４】 以下の制限酵素地図： 【化２】 で表され、上記制限酵素地図中におけるｏｓｐＡ断片が
    配列表の配列番号：３のヌクレオチド配列を有すること
    を特徴とする生体宿主を形質転換するためのプラスミド
    ｐＥＴ９−ＯｓｐＡ。
25. 【請求項２５】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／
    ｐＬｙｓＳ株を、以下の制限酵素地図： 【化３】 で表され、上記制限酵素地図中におけるｏｓｐＡ断片が
    配列表の配列番号：３のヌクレオチド配列を有するプラ
    スミドｐＥＴ９−ＯｓｐＡで形質転換して得られたもの
    であることを特徴とする形質転換体。
26. 【請求項２６】 配列表の配列番号：１１であることを
    特徴とする、請求項７または１２に記載の方法における
    ボレリア属リポタンパク質をコードするヌクレオチド配
    列の１部分の増幅に有用なオリゴヌクレオチドプライマ
    ー。