JPH01181790A - 生理活性物質の固定化方法 - Google Patents
生理活性物質の固定化方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、生理活性物質の固定化方法に関し、詳しくは
、生理活性物質の無機担体上への固定化方法に関する。
、生理活性物質の無機担体上への固定化方法に関する。
〈従来技術〉
生理活性物質を無機担体上に固定化する方法としては、
単に物理的吸着により固定化する場合と比較して、より
安定な固定化方法である、米国特許第３６５２７６１号
、特開昭５４−７３１８５号、特開昭６０−２３２０９
０号による方法゛が知られている。すなわち、３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランや、Ｎ −（２−アミノ
エチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを用
いて、無機担体を表面処理し。
単に物理的吸着により固定化する場合と比較して、より
安定な固定化方法である、米国特許第３６５２７６１号
、特開昭５４−７３１８５号、特開昭６０−２３２０９
０号による方法゛が知られている。すなわち、３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランや、Ｎ −（２−アミノ
エチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを用
いて、無機担体を表面処理し。
次いでアミノ基を手がかりにして、常法により、生理活
性物質を固定化する方法である。
性物質を固定化する方法である。
〈発明が解決しようとする課題〉
生理活性物質が、その活性を発現するためには、活性中
心をとりまく特定の高次構造を保持することが必要であ
る。
心をとりまく特定の高次構造を保持することが必要であ
る。
生理活性物質を固定化して利用する場合には、固定化に
よって、その高次構造が変化し、活性の低下をおこすこ
とが多く、その点においては、上記米国特許第３６５２
７６１号などによる方法も例外ではなり１゜ そこで、本発明者は、従来技術の持つ欠点を解消すべく
鋭意研究した結果１本発明に到達した。
よって、その高次構造が変化し、活性の低下をおこすこ
とが多く、その点においては、上記米国特許第３６５２
７６１号などによる方法も例外ではなり１゜ そこで、本発明者は、従来技術の持つ欠点を解消すべく
鋭意研究した結果１本発明に到達した。
本発明の目的は、生理活性物質の活性を高度に維持し、
かつ高い固定化量を実現することのできる生理活性物質
の無機担体への固定化方法を提供することにある。
かつ高い固定化量を実現することのできる生理活性物質
の無機担体への固定化方法を提供することにある。
〈課題の解決手段およびその作用〉
前記した本発明の目的は、無機担体を、一般式％式％
（式中、Ｒは炭素原子数１〜４のアルキル基であり、ｎ
は５〜１２の整数である）で示されるアルミノアルキル
アルコキシシランにより処理し、次いで、該アミノ基を
用いて、生理活性物質を化学的に結合させることにより
達成される。
は５〜１２の整数である）で示されるアルミノアルキル
アルコキシシランにより処理し、次いで、該アミノ基を
用いて、生理活性物質を化学的に結合させることにより
達成される。
無機担体としては、これまでに酵素、抗体、抗原などの
生理活性物質の固定化に用いられてきた無機担体があげ
られる。それらは、多孔性ガラス、シリカゲル、コロイ
ダルシリカ、アルミナ、カオリナイト、ベントナイト、
ウオラストナイト、ヒドロキシアパタイト、各種金属水
酸化物、各種金属酸化物などである。
生理活性物質の固定化に用いられてきた無機担体があげ
られる。それらは、多孔性ガラス、シリカゲル、コロイ
ダルシリカ、アルミナ、カオリナイト、ベントナイト、
ウオラストナイト、ヒドロキシアパタイト、各種金属水
酸化物、各種金属酸化物などである。
これら無機担体を処理するのに使用される一般式■で示
されるアミノプロピルアルコキシシラン中のＲとしては
、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基
が例示される。ｎは５から１２までの整数である。一般
式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランとして
、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノプロピルト
リメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−
アミノプロピルトリエトキトトラン、Ｎ−（８−アミノ
オクチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ −（１２−アミノドデシル）−３−アミノプロピル
トリプロポキシシランが例示される。
されるアミノプロピルアルコキシシラン中のＲとしては
、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基
が例示される。ｎは５から１２までの整数である。一般
式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランとして
、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノプロピルト
リメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−
アミノプロピルトリエトキトトラン、Ｎ−（８−アミノ
オクチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ −（１２−アミノドデシル）−３−アミノプロピル
トリプロポキシシランが例示される。
一般式■に示されるアミノプロピルアルコキシシランは
、例えば３−クロロプロピルトリアルコキシシランと、
２倍モル以上の下記ジアミンＨ，Ｎ −（ＣＨ，）ｎ−
ＮＨ２ （式中、ｎは５〜１２の整数である） とを反応させ、生成する塩酸塩を除去し、減圧蒸留によ
り精製することにより容易に製造することができる。こ
こで、ｎが１３以上のジアミンは高価であり入手し難く
、さらに対応する一般弐〇で示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの沸点が高くなりすぎて減圧蒸留しにく
くなるため、実用上好ましくない。また、ｎが小さいと
生理活性物質の活性が高度には維持されず、固定量も高
くない。従って、一般弐ので示されるアミノプロピルア
ルコキシシランのうちでさらに好適なものは、ｎが６以
上、特には６，８．１０のような偶数のものである。こ
れらは、原料であるアルキレンジアミンが安価であり、
入手しやすいからである。
、例えば３−クロロプロピルトリアルコキシシランと、
２倍モル以上の下記ジアミンＨ，Ｎ −（ＣＨ，）ｎ−
ＮＨ２ （式中、ｎは５〜１２の整数である） とを反応させ、生成する塩酸塩を除去し、減圧蒸留によ
り精製することにより容易に製造することができる。こ
こで、ｎが１３以上のジアミンは高価であり入手し難く
、さらに対応する一般弐〇で示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの沸点が高くなりすぎて減圧蒸留しにく
くなるため、実用上好ましくない。また、ｎが小さいと
生理活性物質の活性が高度には維持されず、固定量も高
くない。従って、一般弐ので示されるアミノプロピルア
ルコキシシランのうちでさらに好適なものは、ｎが６以
上、特には６，８．１０のような偶数のものである。こ
れらは、原料であるアルキレンジアミンが安価であり、
入手しやすいからである。
一般式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランは
、同一分子内に異なる二種の官能基を有し、分子内のア
ルコキシシラン部分が無機物質に対する結合性をもち、
分子内の第一級アミノ基部分が、種々の生理活性物質と
結合性を有する。すなわち、アミノプロピルアルコキキ
ランは、無機担体と生理活性物質とを化学的に結合させ
る。−般弐〇で示されるアミノプロピルアルコキキラン
を用いた場合には、従来かかる目的に広く用いられてい
た、３−アミノプロピルトルエトキシシランあるいはＮ
−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトルメト
キシシランに比べて、ケイ素原子から第一級アミノ基ま
でのスペーサーアームが長いために、生理活性物質が固
定化された場合にも、生理活性物質がもつ固有の高次構
造への制約が小さく、従って、生理活性が高度に維持さ
れるという特徴を有する。また、ケイ素原子から第一級
アミノ基までのスペーサーアームが長いために、生理活
性物質の固定化量が増加するという特徴を有する。
、同一分子内に異なる二種の官能基を有し、分子内のア
ルコキシシラン部分が無機物質に対する結合性をもち、
分子内の第一級アミノ基部分が、種々の生理活性物質と
結合性を有する。すなわち、アミノプロピルアルコキキ
ランは、無機担体と生理活性物質とを化学的に結合させ
る。−般弐〇で示されるアミノプロピルアルコキキラン
を用いた場合には、従来かかる目的に広く用いられてい
た、３−アミノプロピルトルエトキシシランあるいはＮ
−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトルメト
キシシランに比べて、ケイ素原子から第一級アミノ基ま
でのスペーサーアームが長いために、生理活性物質が固
定化された場合にも、生理活性物質がもつ固有の高次構
造への制約が小さく、従って、生理活性が高度に維持さ
れるという特徴を有する。また、ケイ素原子から第一級
アミノ基までのスペーサーアームが長いために、生理活
性物質の固定化量が増加するという特徴を有する。
生理活性物質としては、酵素、抗体、抗原などがある。
酵素としては、一般的命名で分類される広範囲な種類の
酵素が利用される。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵
素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、制限酵素などで
ある。酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ
、カタラーゼ、パーオキシダーゼが例示される。加水分
解酵素としては、蛋白質分解酵素のパパイン、トリプシ
ン、キモトリプシン、サーモリシン、エステル加水分解
酵素のリパーゼ、ヌクレアーゼのりボヌクレア−ゼなど
が例示される。抗体、抗原には、各種免疫グロブリン、
ホルモン、蛋白質等の抗原およびそれに対する抗体の全
てが含まれる。
酵素が利用される。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵
素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、制限酵素などで
ある。酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ
、カタラーゼ、パーオキシダーゼが例示される。加水分
解酵素としては、蛋白質分解酵素のパパイン、トリプシ
ン、キモトリプシン、サーモリシン、エステル加水分解
酵素のリパーゼ、ヌクレアーゼのりボヌクレア−ゼなど
が例示される。抗体、抗原には、各種免疫グロブリン、
ホルモン、蛋白質等の抗原およびそれに対する抗体の全
てが含まれる。
かかる生理活性物質を無機担体に固定するには、まず、
無機担体を、従来知られている方法によって、一般式■
で示されるアミノプロピルアルコキシシランを用いて表
面処理する。通常、一般式■で示されるアミノプロピル
アルコキキランを、トルエン、キシレンなどの有機溶媒
に溶解し、この溶液で無機担体を表面処理する。好まし
くは、約０．１〜４０重量％の濃度の溶液を用いて、昇
温下、例えば５０〜１１０℃で数時間処理する。これに
より、無機担体表面に存在する水酸基と、一般式ω中の
ケイ素に結合したアルコキシ基とが脱アルコール縮合す
る。あるいは、上記溶液の代りに、水溶液を用いてもよ
い。
無機担体を、従来知られている方法によって、一般式■
で示されるアミノプロピルアルコキシシランを用いて表
面処理する。通常、一般式■で示されるアミノプロピル
アルコキキランを、トルエン、キシレンなどの有機溶媒
に溶解し、この溶液で無機担体を表面処理する。好まし
くは、約０．１〜４０重量％の濃度の溶液を用いて、昇
温下、例えば５０〜１１０℃で数時間処理する。これに
より、無機担体表面に存在する水酸基と、一般式ω中の
ケイ素に結合したアルコキシ基とが脱アルコール縮合す
る。あるいは、上記溶液の代りに、水溶液を用いてもよ
い。
かくして得られた処理済み無機担体は、一般式■中の第
一級アミノ基をもとにして、生理活性物質と共有結合さ
せる。それには、一般によく知られた基本的反応を使用
すればよい。たとえば、グルタルアルデヒドのようなド
アルデヒドで処理して、反応性に富んだアルデヒド基を
導入し、ついで生理活性物質と結合させる。あるいは、
Ｐ−二り トロベンゾイル−ロリドで処理後、還元することによっ
て芳香族アミノ基を導入し、これをジアゾ化するか、ヒ
ドラジン誘導体としてから、生理活性物質を結合させる
。あるいは、無水コハク酸で処理してカルボキシル基を
導入し、カルボジイミドを用いて生理活性物質のアミノ
残基と脱水縮合させる。
一級アミノ基をもとにして、生理活性物質と共有結合さ
せる。それには、一般によく知られた基本的反応を使用
すればよい。たとえば、グルタルアルデヒドのようなド
アルデヒドで処理して、反応性に富んだアルデヒド基を
導入し、ついで生理活性物質と結合させる。あるいは、
Ｐ−二り トロベンゾイル−ロリドで処理後、還元することによっ
て芳香族アミノ基を導入し、これをジアゾ化するか、ヒ
ドラジン誘導体としてから、生理活性物質を結合させる
。あるいは、無水コハク酸で処理してカルボキシル基を
導入し、カルボジイミドを用いて生理活性物質のアミノ
残基と脱水縮合させる。
かかる一般的方法で、無機担体に結合した一般式ω中に
示される第一級アミノ基と生理活性物質とを結合させる
場合、普通は、生理活性物質を不活性化する傾向のない
ｐＨおよび温度の水性媒体を用いる。また、上記一般的
方法で、生理活性物質を固定化するに当っては、生理活
性物質の活性に不可欠でない生理活性物質上の反能性残
基を利用するような結合手段を選択した方がよい。例え
ば、球状タンパク質である酵素分子の活性中心から離れ
た部位には、リシンのε−アミノ基、Ｎ末端のアミノ基
；システィンのスフルヒドリル基；アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のカルボキシル残基、Ｃ末端のカルボキシル
基フチロジンのフェノール性水酸基；セリンやトレオニ
ンの水酸基；アルギニンのグアジノ基；ヒスチジンのイ
ミダゾール基；トリプトファンのインドール基；メチオ
ニンのチオエーテル基といった反応性のある残基が含ま
れている。特に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基の
含量は高いとされているので、酵素の活性部位にも留意
して、これらの反応性基を用いるとよい。
示される第一級アミノ基と生理活性物質とを結合させる
場合、普通は、生理活性物質を不活性化する傾向のない
ｐＨおよび温度の水性媒体を用いる。また、上記一般的
方法で、生理活性物質を固定化するに当っては、生理活
性物質の活性に不可欠でない生理活性物質上の反能性残
基を利用するような結合手段を選択した方がよい。例え
ば、球状タンパク質である酵素分子の活性中心から離れ
た部位には、リシンのε−アミノ基、Ｎ末端のアミノ基
；システィンのスフルヒドリル基；アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のカルボキシル残基、Ｃ末端のカルボキシル
基フチロジンのフェノール性水酸基；セリンやトレオニ
ンの水酸基；アルギニンのグアジノ基；ヒスチジンのイ
ミダゾール基；トリプトファンのインドール基；メチオ
ニンのチオエーテル基といった反応性のある残基が含ま
れている。特に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基の
含量は高いとされているので、酵素の活性部位にも留意
して、これらの反応性基を用いるとよい。
しかして、本発明の固定化方法によって、生理活性物質
が、無機担体に化学的に結合された場合には、その結合
のなかだちをする一般弐〇に示されるアミノプロピルア
ルコキシシラン残基が、十分なスペーサーアーム長さを
有しているために、生理活性物質の高次構造が維持され
、高い活性を保ちながら、固定化がなされるという特徴
を示す。
が、無機担体に化学的に結合された場合には、その結合
のなかだちをする一般弐〇に示されるアミノプロピルア
ルコキシシラン残基が、十分なスペーサーアーム長さを
有しているために、生理活性物質の高次構造が維持され
、高い活性を保ちながら、固定化がなされるという特徴
を示す。
本発明によって得られる、無機担体に固定化された生理
活性物質は、バイオリアクター、酵素センサー、免疫セ
ンサー、ラジオイムノアッセイ、化学分析、臨床検査、
治療などの多くの分野で有効に使用される。
活性物質は、バイオリアクター、酵素センサー、免疫セ
ンサー、ラジオイムノアッセイ、化学分析、臨床検査、
治療などの多くの分野で有効に使用される。
〈実施例〉
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１
粒度１０ｔＩＭ、比表面積１００ｍ／ｇのシリカゲルを
、Ｎ−（８−アミノオクチル）−３−アミノプロピルト
リメトキシシランの１０重量％トルエン溶液に入れ、１
００℃で３時間加熱してシラン処理した。
、Ｎ−（８−アミノオクチル）−３−アミノプロピルト
リメトキシシランの１０重量％トルエン溶液に入れ、１
００℃で３時間加熱してシラン処理した。
このものをメタノール、次いでイオン交換水で洗浄した
。次に、グルタルアルデヒド５重量％水溶液中に入れ、
４時間混合して、アルデヒド基を導入し、再びイオン交
換水で洗浄した。
。次に、グルタルアルデヒド５重量％水溶液中に入れ、
４時間混合して、アルデヒド基を導入し、再びイオン交
換水で洗浄した。
このものをグルコースオキシダーゼ２ｇ／Ｑを含む０．
０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に入れ、１２時間反応させ
、次いで緩衝液で洗浄してグルコースオキシダーゼのシ
リカゲルへの固定化を行った。
０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に入れ、１２時間反応させ
、次いで緩衝液で洗浄してグルコースオキシダーゼのシ
リカゲルへの固定化を行った。
０．２１ｍＭの０−ジアニシジンを含む上記緩衝液２．
４ｍｌ！、１０％Ｗ／ＵのＤ−グルコース水溶液０．５
ｎｉｌ、６０Ｕ／−のペルオキシダーゼ水溶液０．１
ｍＱの混合液に、該固定化酵素を加え、波長５００ｎｍ
の吸光度変化を測定することによって、該固定化酵素の
活性を求めた。このシリカゲル固定化グルコースオキシ
ダーゼの活性は、担体１ｇ当り３．ＯＵであった。
４ｍｌ！、１０％Ｗ／ＵのＤ−グルコース水溶液０．５
ｎｉｌ、６０Ｕ／−のペルオキシダーゼ水溶液０．１
ｍＱの混合液に、該固定化酵素を加え、波長５００ｎｍ
の吸光度変化を測定することによって、該固定化酵素の
活性を求めた。このシリカゲル固定化グルコースオキシ
ダーゼの活性は、担体１ｇ当り３．ＯＵであった。
比較例１
実施例１に示したＮ−（８−アミノオクチル）−３−ア
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、３−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いた他は、同様の条件
でシリカゲルへのグルコースオキシダーゼの固定化を行
ったところ、シリカゲル固定化グルコースオキシダーゼ
の活性は、担体１ｇ当り１．８Ｕであった。
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、３−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いた他は、同様の条件
でシリカゲルへのグルコースオキシダーゼの固定化を行
ったところ、シリカゲル固定化グルコースオキシダーゼ
の活性は、担体１ｇ当り１．８Ｕであった。
実施例２
細孔６１０人、細孔容積０．５３ｃｃ／ｇの多孔質ガラ
ス破砕体を、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノ
プロピルトリメトキシシランの７重量％トルエン溶液に
入れ、１０２℃で３時間熱処理してシラン処理した。こ
のシラン処理した多孔質ガラス破砕体を、トルエン、次
いでメタノールで洗浄し、真空乾燥した。次に、これを
グルタルアルデヒドの１６．７重量％水溶液中に入れ、
２時間混合して、アルデヒド基を導入し、次いで、イオ
ン交換水で洗浄した。
ス破砕体を、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノ
プロピルトリメトキシシランの７重量％トルエン溶液に
入れ、１０２℃で３時間熱処理してシラン処理した。こ
のシラン処理した多孔質ガラス破砕体を、トルエン、次
いでメタノールで洗浄し、真空乾燥した。次に、これを
グルタルアルデヒドの１６．７重量％水溶液中に入れ、
２時間混合して、アルデヒド基を導入し、次いで、イオ
ン交換水で洗浄した。
このものを、サーモリシン１０ｇ／Ｊを含む、５Ｍ−Ｎ
ａＢｒ、１６．６ｍＭ ＣａＣｌ２．０．０２５ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆｌから成る緩衝液（ＰＨ７，５）に加え、
室温で一晩混合してサーモリシンを多孔質ガラス破砕体
に固定化させた。 その後、１６．６＋ａＭ ＣａＣｌ
２．．０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＱ緩衝液で洗浄
し、さらに１重量％Ｎ ａ Ｂ Ｈ４水溶液中に１５分
間入れて多孔質ガラス破砕体固定化サーモリシンを得た
。
ａＢｒ、１６．６ｍＭ ＣａＣｌ２．０．０２５ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆｌから成る緩衝液（ＰＨ７，５）に加え、
室温で一晩混合してサーモリシンを多孔質ガラス破砕体
に固定化させた。 その後、１６．６＋ａＭ ＣａＣｌ
２．．０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＱ緩衝液で洗浄
し、さらに１重量％Ｎ ａ Ｂ Ｈ４水溶液中に１５分
間入れて多孔質ガラス破砕体固定化サーモリシンを得た
。
この固定化酵素の活性は、礼装カゼインに３５℃で作用
するときに、反応初期の１分間に、１Ｍモルのチロシン
に相当する非たんばく性のＦｏｌｉｎ呈色物質の増加量
をもたらす酵素量をＩＵとして求めた。上記固定化酵素
の活性は、担体１ｇ当り１．８７Ｕであった。
するときに、反応初期の１分間に、１Ｍモルのチロシン
に相当する非たんばく性のＦｏｌｉｎ呈色物質の増加量
をもたらす酵素量をＩＵとして求めた。上記固定化酵素
の活性は、担体１ｇ当り１．８７Ｕであった。
比較例２
実施例２に示したＮ−（６−アミノヘキシル）−３−ア
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、Ｎ−（２−
アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンを用いた他は、同様実施例２と条件で多孔質ガラス破
砕体へのサーモライシンの固定化を行ったところ、固定
化酵素の活性は、担体１ｇ当り０．６６Ｕであった。
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、Ｎ−（２−
アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンを用いた他は、同様実施例２と条件で多孔質ガラス破
砕体へのサーモライシンの固定化を行ったところ、固定
化酵素の活性は、担体１ｇ当り０．６６Ｕであった。
実施例３
塩化第一鉄０．２５モル／Ｑと塩化第二鉄０．５０モル
／Ｑとを含有する水溶液に、水酸化ナトリウム２０重量
％水溶液を加えてｐＨ１１，５とし、６０℃で２分間熟
成させることにより、微細なマグネタイトを生成させた
。次いで、イオン交換水を用いてデカンテーションをく
り返し、電解質とアルカリを除去した。
／Ｑとを含有する水溶液に、水酸化ナトリウム２０重量
％水溶液を加えてｐＨ１１，５とし、６０℃で２分間熟
成させることにより、微細なマグネタイトを生成させた
。次いで、イオン交換水を用いてデカンテーションをく
り返し、電解質とアルカリを除去した。
生成したマグネタイトの平均径は、ＴＥＭにより測定し
たところ１００人であった。
たところ１００人であった。
上記マグネタイトの懸濁液に、１０重量％の濃度で、Ｎ
−（６−７ミノヘキシル）−３−アミノプロピルトリメ
トキシシランを加え、９５℃で３時間加熱してシラン処
理した。シラン処理したマグネタイトをイオン交換水で
洗浄後、グルタルアルデヒドの１０重量％水溶液中に入
れ、４時間混合して、アルデヒド基を導入し、再び、イ
オン交換水で洗浄した。
−（６−７ミノヘキシル）−３−アミノプロピルトリメ
トキシシランを加え、９５℃で３時間加熱してシラン処
理した。シラン処理したマグネタイトをイオン交換水で
洗浄後、グルタルアルデヒドの１０重量％水溶液中に入
れ、４時間混合して、アルデヒド基を導入し、再び、イ
オン交換水で洗浄した。
このものを、サーモリシンＬｏｇ／Ωを含む５Ｍ−Ｎａ
Ｂｒ、１６．６ｍＭＣａ（１２２，０，０２５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＱから成る緩衝液（ｐＨ７，５）に加え、室
温で一晩混合して、サーモリシンをマグネタイト上に固
定化させた。その後、１６．６ｍ Ｍ Ｃａ ＣＱ ２
．０．０２５Ｍ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ緩衝液で洗浄
した。
Ｂｒ、１６．６ｍＭＣａ（１２２，０，０２５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＱから成る緩衝液（ｐＨ７，５）に加え、室
温で一晩混合して、サーモリシンをマグネタイト上に固
定化させた。その後、１６．６ｍ Ｍ Ｃａ ＣＱ ２
．０．０２５Ｍ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ緩衝液で洗浄
した。
Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエス
テルを、各８０ｍＭと１６０ｍＭの濃度で加え、４０℃
の温度で振どう下、ジペプチド（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル）の合
成を行った。
テルを、各８０ｍＭと１６０ｍＭの濃度で加え、４０℃
の温度で振どう下、ジペプチド（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル）の合
成を行った。
２時間後、分媒液から磁気によって酵素固定化マグネタ
イトを分離し、ジペプチドの生成量をＨＰＬＣにて調べ
た。ジペプチドの生成量は、マグネタイト担体１ｇ当り
０．３ｍ＋＋＋ｏｌｅであった。
イトを分離し、ジペプチドの生成量をＨＰＬＣにて調べ
た。ジペプチドの生成量は、マグネタイト担体１ｇ当り
０．３ｍ＋＋＋ｏｌｅであった。
実施例４
実施例３のシラン処理したマグネタイトの懸濁液に、無
水グルタル酸を３重量％の濃度で添加し、混合すること
により、該シランのアミノ基末端を、カルボキシル基末
端に転化させた。次いで、イオン交換水で洗浄した。
水グルタル酸を３重量％の濃度で添加し、混合すること
により、該シランのアミノ基末端を、カルボキシル基末
端に転化させた。次いで、イオン交換水で洗浄した。
カルボキシル基末端をもつマグネタイトの懸濁液２ｍＱ
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカ
ルポジイミドを６０■／Ｑ、サーモリシンを１０ｇ／Ｑ
の濃度で含む緩衝液２ＩＩＩＱを加え、３時間、振とう
して、サーモリシンをマグネタイト上に固定化させた。
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカ
ルポジイミドを６０■／Ｑ、サーモリシンを１０ｇ／Ｑ
の濃度で含む緩衝液２ＩＩＩＱを加え、３時間、振とう
して、サーモリシンをマグネタイト上に固定化させた。
次いで１６．６＋ｉＭ ＣａＣＱ□、０ 、０２５ Ｍ
Ｔ ｒｉｓ −ＨＣＱ緩衝液で洗浄した。
Ｔ ｒｉｓ −ＨＣＱ緩衝液で洗浄した。
このものについて実施例３と同様の方法にて、分課液を
置換し、ジペプチドの合成反応を試みたところ、ジペプ
チドの生成量は、マグネタイト担体１ｇ当り０．２５ｍ
ｍｏｌｅであった。
置換し、ジペプチドの合成反応を試みたところ、ジペプ
チドの生成量は、マグネタイト担体１ｇ当り０．２５ｍ
ｍｏｌｅであった。
も高いという特徴がある。
実施例５
実施例３のアルデヒド基を導入したマグネタイトの懸濁
液に、抗ヒトＩｇＧを加えて５時間振とうさせることに
より、抗ヒトＩｇＧを固定化させた後、洗浄した。抗ヒ
トＩｇＧ固定化量は、洗浄液中に残存するＩｇＧの量を
Ｌ ｏｗｒｙ法により求めた。マグネタイト１ｇ当り５
０■の抗ヒトＩｇＧが固定化されていた。
液に、抗ヒトＩｇＧを加えて５時間振とうさせることに
より、抗ヒトＩｇＧを固定化させた後、洗浄した。抗ヒ
トＩｇＧ固定化量は、洗浄液中に残存するＩｇＧの量を
Ｌ ｏｗｒｙ法により求めた。マグネタイト１ｇ当り５
０■の抗ヒトＩｇＧが固定化されていた。
このものは、標識化されたＩｇＧおよびＩｇＧを含む試
料の混合液に加えて、競争的に抗体と結合させ、次いで
磁気的にＢ／Ｆ分離を行うことにより、試料中のＩｇＧ
量の定量に用いることができた。
料の混合液に加えて、競争的に抗体と結合させ、次いで
磁気的にＢ／Ｆ分離を行うことにより、試料中のＩｇＧ
量の定量に用いることができた。
〈発明の効果〉
本発明の方法によって、生理活性物質が無機担体に固定
化された場合には、生理活性物質と無機担体の結合のな
かだちをする一般式■により示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの残基が。
化された場合には、生理活性物質と無機担体の結合のな
かだちをする一般式■により示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの残基が。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 無機担体を一般式 （ＲＯ）＿３ＳｉＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＨ＿２ＮＨ（ＣＨ
＿２）＿ｎＮＨ＿２（１）（式中、Ｒは炭素原子数１〜
４のアルキル基であり、ｎは５〜１２の整数である）で
示されるアミノアルキルアルコキシシランにより処理し
、次いで該アミノ基を用いて生理活性物質を化学的に結
合させることを特徴とする、無機担体上への生理活性物
質の固定化方法。 ２ 生理活性物質が、酵素、抗体、または抗原である請
求項１記載の固定化方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63007680A JPH01181790A (ja) | 1988-01-18 | 1988-01-18 | 生理活性物質の固定化方法 |
| CA000588318A CA1336508C (en) | 1988-01-18 | 1989-01-16 | Method of immobilizing physiologically active substances |
| US07/297,793 US5002884A (en) | 1988-01-18 | 1989-01-17 | Immobilization of physiologically active substances on an inorganic support |
| DE68917324T DE68917324T2 (de) | 1988-01-18 | 1989-01-17 | Methode zur Immobilisierung von physiologisch aktiven Substanzen. |
| EP89300394A EP0325404B1 (en) | 1988-01-18 | 1989-01-17 | Method of immobilizing physiologically active substances |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63007680A JPH01181790A (ja) | 1988-01-18 | 1988-01-18 | 生理活性物質の固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01181790A true JPH01181790A (ja) | 1989-07-19 |
Family
ID=11672504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63007680A Pending JPH01181790A (ja) | 1988-01-18 | 1988-01-18 | 生理活性物質の固定化方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5002884A (ja) |
| EP (1) | EP0325404B1 (ja) |
| JP (1) | JPH01181790A (ja) |
| CA (1) | CA1336508C (ja) |
| DE (1) | DE68917324T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03164174A (ja) * | 1989-08-25 | 1991-07-16 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
| JP2014133677A (ja) * | 2013-01-09 | 2014-07-24 | Shimane Univ | 水溶性超常磁性ナノ粒子 |
| JP2017061473A (ja) * | 2007-11-07 | 2017-03-30 | ロイコケア・アクチェンゲゼルシャフト | 生物学的物質の固定化のための生体適合性三次元マトリクス |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3740471A1 (de) * | 1987-11-28 | 1989-06-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Testtraeger zur analyse einer probenfluessigkeit und verfahren zu seiner herstellung |
| US5514601A (en) * | 1991-02-22 | 1996-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Detection of target species in a sample or liquid flow using diodes and an electrical signal |
| CH686518A5 (de) * | 1993-10-05 | 1996-04-15 | Asahi Optical Co Ltd | Granulares Polymerkomposit, Herstellungsverfahren fur dieses und diagnostische Mittel. |
| ES2179853T3 (es) * | 1994-01-19 | 2003-02-01 | Roche Diagnostics Gmbh | Compuestos de biotina-silanos y matriz de fijacion que contiene estos compuestos. |
| AU7484796A (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-19 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Organically modified inorganic oxides using silane-modified inorganic oxides |
| US6033719A (en) * | 1996-04-25 | 2000-03-07 | Medtronic, Inc. | Method for covalent attachment of biomolecules to surfaces of medical devices |
| US6995259B1 (en) * | 1998-10-23 | 2006-02-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | Method for the chemical synthesis of oligonucleotides |
| US6319674B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-11-20 | Agilent Technologies, Inc. | Methods for attaching substances to surfaces |
| US6987079B2 (en) * | 2001-08-14 | 2006-01-17 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Supported catalyst systems |
| US6802966B2 (en) | 2001-08-14 | 2004-10-12 | W. R. Grace & Co. Conn. | Solid compositions for selective adsorption from complex mixtures |
| WO2004085640A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-10-07 | Council Of Scientific And Industrial Research | A process for preparation of thermostable enzyme |
| DE10330204A1 (de) * | 2003-07-03 | 2005-02-03 | Universität Tübingen | Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf unporöse Kieselgel-Nanopartikel |
| NL1027360C2 (nl) * | 2004-10-28 | 2006-05-01 | Clea Technologies B V | Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten met verbeterde eigenschappen. |
| US8835143B2 (en) | 2004-10-28 | 2014-09-16 | Clea Technologies Bv | Method for preparing hybrid cross-linked enzyme-silica aggregates |
| CN101663581A (zh) * | 2007-04-19 | 2010-03-03 | 3M创新有限公司 | 水分散性二氧化硅纳米颗粒在连接生物分子方面的用途 |
| WO2008131063A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-30 | 3M Innovative Properties Company | Methods of use of solid support material for binding biomolecules |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3652761A (en) * | 1969-09-04 | 1972-03-28 | Corning Glass Works | Immunochemical composites and antigen or antibody purification therewith |
| US3669841A (en) * | 1970-02-11 | 1972-06-13 | Monsanto Co | Attachment of enzymes to siliceous materials |
| JPS609070B2 (ja) * | 1974-08-21 | 1985-03-07 | 日本原子力研究所 | 熱硬化性樹脂組成物の製法 |
| FR2407937A1 (fr) * | 1977-11-04 | 1979-06-01 | Dynamit Nobel Ag | Procede pour l'immobilisation d'enzymes sur une matiere de support minerale et application des produits d'enzymes immobilises a la saponification enzymatique selective de n-acylaminoacides |
| US4683203A (en) * | 1984-04-14 | 1987-07-28 | Redco N.V. | Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof |
-
1988
- 1988-01-18 JP JP63007680A patent/JPH01181790A/ja active Pending
-
1989
- 1989-01-16 CA CA000588318A patent/CA1336508C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-17 DE DE68917324T patent/DE68917324T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 EP EP89300394A patent/EP0325404B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 US US07/297,793 patent/US5002884A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03164174A (ja) * | 1989-08-25 | 1991-07-16 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
| JP2017061473A (ja) * | 2007-11-07 | 2017-03-30 | ロイコケア・アクチェンゲゼルシャフト | 生物学的物質の固定化のための生体適合性三次元マトリクス |
| JP2014133677A (ja) * | 2013-01-09 | 2014-07-24 | Shimane Univ | 水溶性超常磁性ナノ粒子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1336508C (en) | 1995-08-01 |
| EP0325404A2 (en) | 1989-07-26 |
| DE68917324D1 (de) | 1994-09-15 |
| US5002884A (en) | 1991-03-26 |
| DE68917324T2 (de) | 1995-03-16 |
| EP0325404B1 (en) | 1994-08-10 |
| EP0325404A3 (en) | 1990-03-28 |
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