JPH01181790A - 生理活性物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、生理活性物質の固定化方法に関し、詳しくは
、生理活性物質の無機担体上への固定化方法に関する。

〈従来技術〉 生理活性物質を無機担体上に固定化する方法としては、
単に物理的吸着により固定化する場合と比較して、より
安定な固定化方法である、米国特許第３６５２７６１号
、特開昭５４−７３１８５号、特開昭６０−２３２０９
０号による方法゛が知られている。すなわち、３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランや、Ｎ　−（２−アミノ
エチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを用
いて、無機担体を表面処理し。

次いでアミノ基を手がかりにして、常法により、生理活
性物質を固定化する方法である。

〈発明が解決しようとする課題〉 生理活性物質が、その活性を発現するためには、活性中
心をとりまく特定の高次構造を保持することが必要であ
る。

生理活性物質を固定化して利用する場合には、固定化に
よって、その高次構造が変化し、活性の低下をおこすこ
とが多く、その点においては、上記米国特許第３６５２
７６１号などによる方法も例外ではなり１゜ そこで、本発明者は、従来技術の持つ欠点を解消すべく
鋭意研究した結果１本発明に到達した。

本発明の目的は、生理活性物質の活性を高度に維持し、
かつ高い固定化量を実現することのできる生理活性物質
の無機担体への固定化方法を提供することにある。

〈課題の解決手段およびその作用〉 前記した本発明の目的は、無機担体を、一般式％式％ （式中、Ｒは炭素原子数１〜４のアルキル基であり、ｎ
は５〜１２の整数である）で示されるアルミノアルキル
アルコキシシランにより処理し、次いで、該アミノ基を
用いて、生理活性物質を化学的に結合させることにより
達成される。

無機担体としては、これまでに酵素、抗体、抗原などの
生理活性物質の固定化に用いられてきた無機担体があげ
られる。それらは、多孔性ガラス、シリカゲル、コロイ
ダルシリカ、アルミナ、カオリナイト、ベントナイト、
ウオラストナイト、ヒドロキシアパタイト、各種金属水
酸化物、各種金属酸化物などである。

これら無機担体を処理するのに使用される一般式■で示
されるアミノプロピルアルコキシシラン中のＲとしては
、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基
が例示される。ｎは５から１２までの整数である。一般
式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランとして
、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノプロピルト
リメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−
アミノプロピルトリエトキトトラン、Ｎ−（８−アミノ
オクチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ　−（１２−アミノドデシル）−３−アミノプロピル
トリプロポキシシランが例示される。

一般式■に示されるアミノプロピルアルコキシシランは
、例えば３−クロロプロピルトリアルコキシシランと、
２倍モル以上の下記ジアミンＨ，Ｎ　−（ＣＨ，）ｎ−
ＮＨ２ （式中、ｎは５〜１２の整数である） とを反応させ、生成する塩酸塩を除去し、減圧蒸留によ
り精製することにより容易に製造することができる。こ
こで、ｎが１３以上のジアミンは高価であり入手し難く
、さらに対応する一般弐〇で示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの沸点が高くなりすぎて減圧蒸留しにく
くなるため、実用上好ましくない。また、ｎが小さいと
生理活性物質の活性が高度には維持されず、固定量も高
くない。従って、一般弐ので示されるアミノプロピルア
ルコキシシランのうちでさらに好適なものは、ｎが６以
上、特には６，８．１０のような偶数のものである。こ
れらは、原料であるアルキレンジアミンが安価であり、
入手しやすいからである。

一般式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランは
、同一分子内に異なる二種の官能基を有し、分子内のア
ルコキシシラン部分が無機物質に対する結合性をもち、
分子内の第一級アミノ基部分が、種々の生理活性物質と
結合性を有する。すなわち、アミノプロピルアルコキキ
ランは、無機担体と生理活性物質とを化学的に結合させ
る。−般弐〇で示されるアミノプロピルアルコキキラン
を用いた場合には、従来かかる目的に広く用いられてい
た、３−アミノプロピルトルエトキシシランあるいはＮ
−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトルメト
キシシランに比べて、ケイ素原子から第一級アミノ基ま
でのスペーサーアームが長いために、生理活性物質が固
定化された場合にも、生理活性物質がもつ固有の高次構
造への制約が小さく、従って、生理活性が高度に維持さ
れるという特徴を有する。また、ケイ素原子から第一級
アミノ基までのスペーサーアームが長いために、生理活
性物質の固定化量が増加するという特徴を有する。

生理活性物質としては、酵素、抗体、抗原などがある。

酵素としては、一般的命名で分類される広範囲な種類の
酵素が利用される。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵
素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、制限酵素などで
ある。酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ
、カタラーゼ、パーオキシダーゼが例示される。加水分
解酵素としては、蛋白質分解酵素のパパイン、トリプシ
ン、キモトリプシン、サーモリシン、エステル加水分解
酵素のリパーゼ、ヌクレアーゼのりボヌクレア−ゼなど
が例示される。抗体、抗原には、各種免疫グロブリン、
ホルモン、蛋白質等の抗原およびそれに対する抗体の全
てが含まれる。

かかる生理活性物質を無機担体に固定するには、まず、
無機担体を、従来知られている方法によって、一般式■
で示されるアミノプロピルアルコキシシランを用いて表
面処理する。通常、一般式■で示されるアミノプロピル
アルコキキランを、トルエン、キシレンなどの有機溶媒
に溶解し、この溶液で無機担体を表面処理する。好まし
くは、約０．１〜４０重量％の濃度の溶液を用いて、昇
温下、例えば５０〜１１０℃で数時間処理する。これに
より、無機担体表面に存在する水酸基と、一般式ω中の
ケイ素に結合したアルコキシ基とが脱アルコール縮合す
る。あるいは、上記溶液の代りに、水溶液を用いてもよ
い。

かくして得られた処理済み無機担体は、一般式■中の第
一級アミノ基をもとにして、生理活性物質と共有結合さ
せる。それには、一般によく知られた基本的反応を使用
すればよい。たとえば、グルタルアルデヒドのようなド
アルデヒドで処理して、反応性に富んだアルデヒド基を
導入し、ついで生理活性物質と結合させる。あるいは、
Ｐ−二り トロベンゾイル−ロリドで処理後、還元することによっ
て芳香族アミノ基を導入し、これをジアゾ化するか、ヒ
ドラジン誘導体としてから、生理活性物質を結合させる
。あるいは、無水コハク酸で処理してカルボキシル基を
導入し、カルボジイミドを用いて生理活性物質のアミノ
残基と脱水縮合させる。

かかる一般的方法で、無機担体に結合した一般式ω中に
示される第一級アミノ基と生理活性物質とを結合させる
場合、普通は、生理活性物質を不活性化する傾向のない
ｐＨおよび温度の水性媒体を用いる。また、上記一般的
方法で、生理活性物質を固定化するに当っては、生理活
性物質の活性に不可欠でない生理活性物質上の反能性残
基を利用するような結合手段を選択した方がよい。例え
ば、球状タンパク質である酵素分子の活性中心から離れ
た部位には、リシンのε−アミノ基、Ｎ末端のアミノ基
；システィンのスフルヒドリル基；アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のカルボキシル残基、Ｃ末端のカルボキシル
基フチロジンのフェノール性水酸基；セリンやトレオニ
ンの水酸基；アルギニンのグアジノ基；ヒスチジンのイ
ミダゾール基；トリプトファンのインドール基；メチオ
ニンのチオエーテル基といった反応性のある残基が含ま
れている。特に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基の
含量は高いとされているので、酵素の活性部位にも留意
して、これらの反応性基を用いるとよい。

しかして、本発明の固定化方法によって、生理活性物質
が、無機担体に化学的に結合された場合には、その結合
のなかだちをする一般弐〇に示されるアミノプロピルア
ルコキシシラン残基が、十分なスペーサーアーム長さを
有しているために、生理活性物質の高次構造が維持され
、高い活性を保ちながら、固定化がなされるという特徴
を示す。

本発明によって得られる、無機担体に固定化された生理
活性物質は、バイオリアクター、酵素センサー、免疫セ
ンサー、ラジオイムノアッセイ、化学分析、臨床検査、
治療などの多くの分野で有効に使用される。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ 粒度１０ｔＩＭ、比表面積１００ｍ／ｇのシリカゲルを
、Ｎ−（８−アミノオクチル）−３−アミノプロピルト
リメトキシシランの１０重量％トルエン溶液に入れ、１
００℃で３時間加熱してシラン処理した。

このものをメタノール、次いでイオン交換水で洗浄した
。次に、グルタルアルデヒド５重量％水溶液中に入れ、
４時間混合して、アルデヒド基を導入し、再びイオン交
換水で洗浄した。

このものをグルコースオキシダーゼ２ｇ／Ｑを含む０．
０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に入れ、１２時間反応させ
、次いで緩衝液で洗浄してグルコースオキシダーゼのシ
リカゲルへの固定化を行った。

０．２１ｍＭの０−ジアニシジンを含む上記緩衝液２．
４ｍｌ！、１０％Ｗ／ＵのＤ−グルコース水溶液０．５
　ｎｉｌ、６０Ｕ／−のペルオキシダーゼ水溶液０．１
ｍＱの混合液に、該固定化酵素を加え、波長５００ｎｍ
の吸光度変化を測定することによって、該固定化酵素の
活性を求めた。このシリカゲル固定化グルコースオキシ
ダーゼの活性は、担体１ｇ当り３．ＯＵであった。

比較例１ 実施例１に示したＮ−（８−アミノオクチル）−３−ア
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、３−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いた他は、同様の条件
でシリカゲルへのグルコースオキシダーゼの固定化を行
ったところ、シリカゲル固定化グルコースオキシダーゼ
の活性は、担体１ｇ当り１．８Ｕであった。

実施例２ 細孔６１０人、細孔容積０．５３ｃｃ／ｇの多孔質ガラ
ス破砕体を、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノ
プロピルトリメトキシシランの７重量％トルエン溶液に
入れ、１０２℃で３時間熱処理してシラン処理した。こ
のシラン処理した多孔質ガラス破砕体を、トルエン、次
いでメタノールで洗浄し、真空乾燥した。次に、これを
グルタルアルデヒドの１６．７重量％水溶液中に入れ、
２時間混合して、アルデヒド基を導入し、次いで、イオ
ン交換水で洗浄した。

このものを、サーモリシン１０ｇ／Ｊを含む、５Ｍ−Ｎ
ａＢｒ、１６．６ｍＭ　ＣａＣｌ２．０．０２５ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆｌから成る緩衝液（ＰＨ７，５）に加え、
室温で一晩混合してサーモリシンを多孔質ガラス破砕体
に固定化させた。　その後、１６．６＋ａＭ　ＣａＣｌ
２．．０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＱ緩衝液で洗浄
し、さらに１重量％Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４水溶液中に１５分
間入れて多孔質ガラス破砕体固定化サーモリシンを得た
。

この固定化酵素の活性は、礼装カゼインに３５℃で作用
するときに、反応初期の１分間に、１Ｍモルのチロシン
に相当する非たんばく性のＦｏｌｉｎ呈色物質の増加量
をもたらす酵素量をＩＵとして求めた。上記固定化酵素
の活性は、担体１ｇ当り１．８７Ｕであった。

比較例２ 実施例２に示したＮ−（６−アミノヘキシル）−３−ア
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、Ｎ−（２−
アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンを用いた他は、同様実施例２と条件で多孔質ガラス破
砕体へのサーモライシンの固定化を行ったところ、固定
化酵素の活性は、担体１ｇ当り０．６６Ｕであった。

実施例３ 塩化第一鉄０．２５モル／Ｑと塩化第二鉄０．５０モル
／Ｑとを含有する水溶液に、水酸化ナトリウム２０重量
％水溶液を加えてｐＨ１１，５とし、６０℃で２分間熟
成させることにより、微細なマグネタイトを生成させた
。次いで、イオン交換水を用いてデカンテーションをく
り返し、電解質とアルカリを除去した。

生成したマグネタイトの平均径は、ＴＥＭにより測定し
たところ１００人であった。

上記マグネタイトの懸濁液に、１０重量％の濃度で、Ｎ
−（６−７ミノヘキシル）−３−アミノプロピルトリメ
トキシシランを加え、９５℃で３時間加熱してシラン処
理した。シラン処理したマグネタイトをイオン交換水で
洗浄後、グルタルアルデヒドの１０重量％水溶液中に入
れ、４時間混合して、アルデヒド基を導入し、再び、イ
オン交換水で洗浄した。

このものを、サーモリシンＬｏｇ／Ωを含む５Ｍ−Ｎａ
Ｂｒ、１６．６ｍＭＣａ（１２２，０，０２５Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＱから成る緩衝液（ｐＨ７，５）に加え、室
温で一晩混合して、サーモリシンをマグネタイト上に固
定化させた。その後、１６．６ｍ　Ｍ　Ｃａ　ＣＱ　２
．０．０２５Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ緩衝液で洗浄
した。

Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエス
テルを、各８０ｍＭと１６０ｍＭの濃度で加え、４０℃
の温度で振どう下、ジペプチド（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル）の合
成を行った。

２時間後、分媒液から磁気によって酵素固定化マグネタ
イトを分離し、ジペプチドの生成量をＨＰＬＣにて調べ
た。ジペプチドの生成量は、マグネタイト担体１ｇ当り
０．３ｍ＋＋＋ｏｌｅであった。

実施例４ 実施例３のシラン処理したマグネタイトの懸濁液に、無
水グルタル酸を３重量％の濃度で添加し、混合すること
により、該シランのアミノ基末端を、カルボキシル基末
端に転化させた。次いで、イオン交換水で洗浄した。

カルボキシル基末端をもつマグネタイトの懸濁液２ｍＱ
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカ
ルポジイミドを６０■／Ｑ、サーモリシンを１０ｇ／Ｑ
の濃度で含む緩衝液２ＩＩＩＱを加え、３時間、振とう
して、サーモリシンをマグネタイト上に固定化させた。

次いで１６．６＋ｉＭ　ＣａＣＱ□、０　、０２５　Ｍ
　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣＱ緩衝液で洗浄した。

このものについて実施例３と同様の方法にて、分課液を
置換し、ジペプチドの合成反応を試みたところ、ジペプ
チドの生成量は、マグネタイト担体１ｇ当り０．２５ｍ
ｍｏｌｅであった。

も高いという特徴がある。

実施例５ 実施例３のアルデヒド基を導入したマグネタイトの懸濁
液に、抗ヒトＩｇＧを加えて５時間振とうさせることに
より、抗ヒトＩｇＧを固定化させた後、洗浄した。抗ヒ
トＩｇＧ固定化量は、洗浄液中に残存するＩｇＧの量を
Ｌ　ｏｗｒｙ法により求めた。マグネタイト１ｇ当り５
０■の抗ヒトＩｇＧが固定化されていた。

このものは、標識化されたＩｇＧおよびＩｇＧを含む試
料の混合液に加えて、競争的に抗体と結合させ、次いで
磁気的にＢ／Ｆ分離を行うことにより、試料中のＩｇＧ
量の定量に用いることができた。

〈発明の効果〉 本発明の方法によって、生理活性物質が無機担体に固定
化された場合には、生理活性物質と無機担体の結合のな
かだちをする一般式■により示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの残基が。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　無機担体を一般式 （ＲＯ）＿３ＳｉＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＨ＿２ＮＨ（ＣＨ
   ＿２）＿ｎＮＨ＿２（１）（式中、Ｒは炭素原子数１〜
   ４のアルキル基であり、ｎは５〜１２の整数である）で
   示されるアミノアルキルアルコキシシランにより処理し
   、次いで該アミノ基を用いて生理活性物質を化学的に結
   合させることを特徴とする、無機担体上への生理活性物
   質の固定化方法。 ２　生理活性物質が、酵素、抗体、または抗原である請
   求項１記載の固定化方法。