JPH03164174A - 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 - Google Patents
固定化酵素およびそれを用いる測定装置Info
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- JPH03164174A JPH03164174A JP2061703A JP6170390A JPH03164174A JP H03164174 A JPH03164174 A JP H03164174A JP 2061703 A JP2061703 A JP 2061703A JP 6170390 A JP6170390 A JP 6170390A JP H03164174 A JPH03164174 A JP H03164174A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/002—Electrode membranes
- C12Q1/003—Functionalisation
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、安定な固定化アルコールオキシダーゼとそれ
を用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関する
ものである。さらに本発明は、同時にグルコース濃度を
測定できる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関す
るものである。
を用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関する
ものである。さらに本発明は、同時にグルコース濃度を
測定できる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関す
るものである。
（従来の技術）
固定化酵素を用いる測定装置は、簡便性・迅速性・基質
特異性等の特徴を有し、臨床分析・食品分析・環境計測
等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつある
． このように固定化酵素を用いる測定装置の開発が進展す
るなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食品
・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の提
案がなされている。しかし、アルコール測定に用いられ
る酵素についてはいまだ充分な安定性のあるものが得ら
れていない。
特異性等の特徴を有し、臨床分析・食品分析・環境計測
等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつある
． このように固定化酵素を用いる測定装置の開発が進展す
るなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食品
・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の提
案がなされている。しかし、アルコール測定に用いられ
る酵素についてはいまだ充分な安定性のあるものが得ら
れていない。
アルコールの測定に利用できる酵素としては、アルコー
ル脱水素酵素（ＥＣＩ．１．１．１）やアルコールオキ
シダーゼ（ＥＣＩ．１．３．１３）等が知られている。
ル脱水素酵素（ＥＣＩ．１．１．１）やアルコールオキ
シダーゼ（ＥＣＩ．１．３．１３）等が知られている。
しかしアルコール脱水素酵素は、ＮＡＤ （ニコチンア
デニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に
用いる試薬が高価になること、また酵素自体の安定性が
低いことから、溶液系での測定用に留まっている。
デニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に
用いる試薬が高価になること、また酵素自体の安定性が
低いことから、溶液系での測定用に留まっている。
一方アルコールオキシダーゼは固定化して測定に用いた
例が知られている。固定化酵素を用いる測定装置として
は、アンペロメトリックな計測を行う装置があり、この
計測装置は酵素反応により起きる電極活性物質の増減を
、定電圧を印加した固定化酵素電極からの電流出力値の
変化として捉える形式の装置であり、高感度化が容易で
安定性も優れるため各種の電極、装置、方法が開発され
ている。アンペロメトリックな分析方法の代表例として
は、酸素電極によるものと過酸化水素電極によるものが
あるが、応答速度、Ｓ／Ｎ比の点で過酸化水素電極を用
いる方法が優れており、過酸化水素電極を用いる測定装
置が注目される。
例が知られている。固定化酵素を用いる測定装置として
は、アンペロメトリックな計測を行う装置があり、この
計測装置は酵素反応により起きる電極活性物質の増減を
、定電圧を印加した固定化酵素電極からの電流出力値の
変化として捉える形式の装置であり、高感度化が容易で
安定性も優れるため各種の電極、装置、方法が開発され
ている。アンペロメトリックな分析方法の代表例として
は、酸素電極によるものと過酸化水素電極によるものが
あるが、応答速度、Ｓ／Ｎ比の点で過酸化水素電極を用
いる方法が優れており、過酸化水素電極を用いる測定装
置が注目される。
しかし、従来の固定化アルコールオキシダーゼは、活性
が比較的低いものしか得られず、またその安定性も実用
上不満足なものである。そのため、より安定な酵素の探
索、固定化方法および測定方法に各種の工夫がなされ報
告されている。
が比較的低いものしか得られず、またその安定性も実用
上不満足なものである。そのため、より安定な酵素の探
索、固定化方法および測定方法に各種の工夫がなされ報
告されている。
例えば、カンディダ属の酵母から得られた酵素によって
約２０日の寿命を持つ固定化酵素電極（以下単に酵素電
極という）が作威された例がある（末信一朗；電気化学
および工業物理化学、５６、１１２２ （１９８８））
。この例でも、非使用時の酵素電極の保存に注意を払っ
ている上に、測定試料数は多くはなく必ずしも充分な安
定性は得られていない。
約２０日の寿命を持つ固定化酵素電極（以下単に酵素電
極という）が作威された例がある（末信一朗；電気化学
および工業物理化学、５６、１１２２ （１９８８））
。この例でも、非使用時の酵素電極の保存に注意を払っ
ている上に、測定試料数は多くはなく必ずしも充分な安
定性は得られていない。
また本願発明者もアルコールオキシダーゼの固定化方法
と測定方法に関する改善を行ってきた（特願昭６３−２
１７６４１号、特願昭６３−２１８８４４号）。しかし
安定性に関してはまだ充分ではなかった。
と測定方法に関する改善を行ってきた（特願昭６３−２
１７６４１号、特願昭６３−２１８８４４号）。しかし
安定性に関してはまだ充分ではなかった。
さらにこれらの固定化酵素を用いる測定装置では、測定
可能範囲を越える高濃度のアルコールを測定した後で、
低濃度のアルコールに対する応答が小さくなるという欠
点があった。
可能範囲を越える高濃度のアルコールを測定した後で、
低濃度のアルコールに対する応答が小さくなるという欠
点があった。
また、発酵・食品分野において、甘味戒分あるいは原材
料であるグルコースと、生戒物あるいは主要戒分である
アルコールを同時に測定する必要性は高いが、従来の不
安定な固定化アルコールオキシダーゼを用いた場合、充
分に満足できる同時測定装置を開発することはできなか
った。
料であるグルコースと、生戒物あるいは主要戒分である
アルコールを同時に測定する必要性は高いが、従来の不
安定な固定化アルコールオキシダーゼを用いた場合、充
分に満足できる同時測定装置を開発することはできなか
った。
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、安定な固定化アルコールオキシダーゼとそれ
を用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置を提供す
ることを目的とする。特に、室温以上での耐湿性に優れ
、高濃度のアルコール注入後においても、感度変動が少
ない測定装置を提供することを目的とする。
を用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置を提供す
ることを目的とする。特に、室温以上での耐湿性に優れ
、高濃度のアルコール注入後においても、感度変動が少
ない測定装置を提供することを目的とする。
さらに本発明は、高精度かつ安定なグルコースおよびア
ルコール測定装置を提供することを目的とする。
ルコール測定装置を提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段）
アルコールオキシダーゼの特性を調査検討し、各種固定
化方法および測定方法を試みた結果、本発明を完或する
に至った。
化方法および測定方法を試みた結果、本発明を完或する
に至った。
本発明者等は固定化アルコールオキシダーゼ電極を用い
た測定において、高濃度のアルコール溶液を測定した後
、低濃度のアルコール溶液を測定すると応答が小さくな
る現象に関して実験を行った。
た測定において、高濃度のアルコール溶液を測定した後
、低濃度のアルコール溶液を測定すると応答が小さくな
る現象に関して実験を行った。
アルコールオキシダーゼを、生血清アルブミンと混合し
、さらにグルタルアルデヒドを混合して白金電極上に展
開し固定化した酵素電極を得た。
、さらにグルタルアルデヒドを混合して白金電極上に展
開し固定化した酵素電極を得た。
この酵素電極を作用電極とし、白金線を対極として、銀
・塩化銀電極を参照電極とする３電極系を用いて測定し
た。ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中で作用電極
に対銀・塩化銀参照電極＋０．６ｖの電圧を印加した。
・塩化銀電極を参照電極とする３電極系を用いて測定し
た。ｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液中で作用電極
に対銀・塩化銀参照電極＋０．６ｖの電圧を印加した。
測定温度は室温（２５゜Ｃ）である。まず、０．１〜１
ｍＭ相当のエタノールを緩衝液に加え、感度を記録した
。この濃度領域では、出力電流値は加えたエタノール濃
度に比例する。次にＩＭ相当のエタノールを加え１分間
放置し、その後新しい緩衝液と入れ換えて、再度低濃度
のエタノールで感度を確認した。
ｍＭ相当のエタノールを緩衝液に加え、感度を記録した
。この濃度領域では、出力電流値は加えたエタノール濃
度に比例する。次にＩＭ相当のエタノールを加え１分間
放置し、その後新しい緩衝液と入れ換えて、再度低濃度
のエタノールで感度を確認した。
その結果、感度は約５０％に低下することがわかった。
ところが、このように高濃度のエタノールに曝された酵
素電極を、緩衝液中で約１時間放置すると、感度は初期
値の約９０％まで回復する。
素電極を、緩衝液中で約１時間放置すると、感度は初期
値の約９０％まで回復する。
そこで次に、１０ｍＭ相当の過酸化水素を加えて１分間
放置した後、感度を測定すると高濃度のアルコールに曝
した場合と同様の感度低下が認められ、また経時的に感
度が回復する現象が観察された。このことは、アルコー
ルオキシダーゼが反応生戒物である過酸化水素により生
或物阻害を受けることを示している。またアルコールオ
キシダーゼによって触媒される反応により、過酸化水素
以外にアルデヒドが生威し、アルデヒドもアルコールオ
キシダーゼの失活原因となる可能性がある。
放置した後、感度を測定すると高濃度のアルコールに曝
した場合と同様の感度低下が認められ、また経時的に感
度が回復する現象が観察された。このことは、アルコー
ルオキシダーゼが反応生戒物である過酸化水素により生
或物阻害を受けることを示している。またアルコールオ
キシダーゼによって触媒される反応により、過酸化水素
以外にアルデヒドが生威し、アルデヒドもアルコールオ
キシダーゼの失活原因となる可能性がある。
このような生戒物による失活を防止するには、過酸化水
素等を極力素早く固定化アルコールオキシダーゼ近傍か
ら排除すればよい。そして担体表面に単一層を形成する
ようにアルコールオキシダーゼを固定化することにより
このような目的が達成できることがわかった。
素等を極力素早く固定化アルコールオキシダーゼ近傍か
ら排除すればよい。そして担体表面に単一層を形成する
ようにアルコールオキシダーゼを固定化することにより
このような目的が達成できることがわかった。
本発明は、担体表面に、単一層を形成するようにアルコ
ールオキシダーゼを固定化したことを特徴とする固定化
酵素である。
ールオキシダーゼを固定化したことを特徴とする固定化
酵素である。
特に、用いる担体がケイソウ土系ケイ酸担体であり、担
体表面にアミノシラン化処理を施し、担体表面に形戒さ
れたアミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、アルコー
ルオキシダーゼを接触せしめて、前記多官能性アルデヒ
ドにアルコールオキシダーゼを結合させてなる固定化酵
素が好ましい。
体表面にアミノシラン化処理を施し、担体表面に形戒さ
れたアミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、アルコー
ルオキシダーゼを接触せしめて、前記多官能性アルデヒ
ドにアルコールオキシダーゼを結合させてなる固定化酵
素が好ましい。
さらに本発明は固定化酵素を充填したカラムを上流側に
備え、前記力ラム下流側に過酸化水素電極を配置したフ
ロー型アルコール測定装置である。
備え、前記力ラム下流側に過酸化水素電極を配置したフ
ロー型アルコール測定装置である。
また本発明は前記の固定化酵素を充填したカラムとその
下流側に配置した過酸化水素電極を有し、さらに直列に
グルコース測定用電極を接続したフロー型アルコール測
定装置である。
下流側に配置した過酸化水素電極を有し、さらに直列に
グルコース測定用電極を接続したフロー型アルコール測
定装置である。
（作用）
本発明では、アルコールオキシダーゼを単一層に配置す
るため、酵素層内部での過酸化水素等の残留がなく、生
底物によるアルコールオキシダーゼの失活を防止するこ
とができる。
るため、酵素層内部での過酸化水素等の残留がなく、生
底物によるアルコールオキシダーゼの失活を防止するこ
とができる。
本発明で用いるアルコールオキシダーゼは担子菌、酵母
等が生産する酵素であり、特にメタノール資化酵母のべ
ルオキシソーム中に大量に含まれている。
等が生産する酵素であり、特にメタノール資化酵母のべ
ルオキシソーム中に大量に含まれている。
担体としては、ケイソウ土、耐火煉瓦等のケイソウ土系
ケイ酸やシリカゲル、ガラスビーズ、砂、アルミナ、ジ
ルコニア、セラミック、カーボン、活性炭、モレキュラ
ーシープ、チタニア、タンニン、シリコンゴム、酸性白
土、セルロース、アガロース、デキストラン、キチン、
コラーゲン、アミノ酸系ボリマー、ボリスチレン樹脂、
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン
、イオン交換樹脂等が用いられる。
ケイ酸やシリカゲル、ガラスビーズ、砂、アルミナ、ジ
ルコニア、セラミック、カーボン、活性炭、モレキュラ
ーシープ、チタニア、タンニン、シリコンゴム、酸性白
土、セルロース、アガロース、デキストラン、キチン、
コラーゲン、アミノ酸系ボリマー、ボリスチレン樹脂、
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン
、イオン交換樹脂等が用いられる。
固定化法には物理吸着法、化学結合法等がある。
これらの担体および固定化方法を検討した結果、最も耐
熱安定性が改善され、かつ長寿命な固定化酵素が得られ
る方法は、用いる担体がケイソウ土系ケイ酸担体であり
、担体表面にアミノシラン化処理を施し、担体表面に形
戒されたアミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、好ま
しくは過剰の多官能性アルデヒドを除去した後、アルコ
ールオキシダーゼを接触せしめて、阻体にアルコールオ
キシダーゼを結合させる方法であった。アミノシラン化
処理はＴ−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−ア
ミノプチルジメチルメトキシシラン、４−ア旦ノプチル
トリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用い、
通常シランカップリング剤の無水ベンゼン溶液に担体を
浸漬して行う。尚アミノシランカノプリング剤の代わり
にアミノチタンカップリング剤を用いることもできる。
熱安定性が改善され、かつ長寿命な固定化酵素が得られ
る方法は、用いる担体がケイソウ土系ケイ酸担体であり
、担体表面にアミノシラン化処理を施し、担体表面に形
戒されたアミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、好ま
しくは過剰の多官能性アルデヒドを除去した後、アルコ
ールオキシダーゼを接触せしめて、阻体にアルコールオ
キシダーゼを結合させる方法であった。アミノシラン化
処理はＴ−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−ア
ミノプチルジメチルメトキシシラン、４−ア旦ノプチル
トリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用い、
通常シランカップリング剤の無水ベンゼン溶液に担体を
浸漬して行う。尚アミノシランカノプリング剤の代わり
にアミノチタンカップリング剤を用いることもできる。
多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒド、グリ
オキザール等がある。
オキザール等がある。
この方法では、第１にケイソウ土系ケイ酸担体を用いる
ことにより、表面にかなり粗い細孔を有する担体上に酵
素を固定化できる。従って基質であるアルコールと生或
された過酸化水素がともに細孔内に残留することなく排
除され、アルコールオキシダーゼに対する阻害が極めて
起こりにくい。
ことにより、表面にかなり粗い細孔を有する担体上に酵
素を固定化できる。従って基質であるアルコールと生或
された過酸化水素がともに細孔内に残留することなく排
除され、アルコールオキシダーゼに対する阻害が極めて
起こりにくい。
ケイソウ土系ケイ酸担体としては、天然のケイソウ土や
、その造粒体、ケイソウ上を高温処理した耐火煉瓦等が
例示される。これらはいずれもｌμｍ程度の１次粒子が
集合したもので、比較的粗い細孔径を有する。比較的類
似の担体としては、シリカゲルがあるが、シリカゲルは
より細孔径が細かいため、ケイソウ土系ケイ酸担体の方
がより効果に優れる。各種担体に固定化したアルコール
オキシダーゼの寿命を検討したところ、ケイソウ土系ケ
イ酸担体に固定化したものが最も長寿命であった。この
理由としては前記の細孔の差に基づく生戒物の迅速な除
去効果が第一の原因と考えられ、さらにケイソウ土系ケ
イ酸担体に含まれる微量のカルシウム・鉄等による安定
化効果があるのか、あるいは比較的強固にシランカツプ
リング剤が結合し酵素の脱落が少ないことも安定性に寄
与している可能性が考えられる。
、その造粒体、ケイソウ上を高温処理した耐火煉瓦等が
例示される。これらはいずれもｌμｍ程度の１次粒子が
集合したもので、比較的粗い細孔径を有する。比較的類
似の担体としては、シリカゲルがあるが、シリカゲルは
より細孔径が細かいため、ケイソウ土系ケイ酸担体の方
がより効果に優れる。各種担体に固定化したアルコール
オキシダーゼの寿命を検討したところ、ケイソウ土系ケ
イ酸担体に固定化したものが最も長寿命であった。この
理由としては前記の細孔の差に基づく生戒物の迅速な除
去効果が第一の原因と考えられ、さらにケイソウ土系ケ
イ酸担体に含まれる微量のカルシウム・鉄等による安定
化効果があるのか、あるいは比較的強固にシランカツプ
リング剤が結合し酵素の脱落が少ないことも安定性に寄
与している可能性が考えられる。
アルコールオキシダーゼは、比較的温和な架橋剤である
グルタルアルデヒドでも失活が起きる危険性があるが、
本発明の好ましい態様では、シランカップリング剤と多
官能性アルデヒドをあらかじめ担体に結合してから、ア
ルコールオキシダーゼを接触、固定させるため、過剰の
アルデヒドによって酵素が不必要な修飾を受けて失活す
ることがない利点もある。
グルタルアルデヒドでも失活が起きる危険性があるが、
本発明の好ましい態様では、シランカップリング剤と多
官能性アルデヒドをあらかじめ担体に結合してから、ア
ルコールオキシダーゼを接触、固定させるため、過剰の
アルデヒドによって酵素が不必要な修飾を受けて失活す
ることがない利点もある。
本発明の固定化酵素は、アルデヒドの生産、アルコール
除去用等のりアクターとしても用いられるが、特にアル
コール測定装置に好ましく利用される。
除去用等のりアクターとしても用いられるが、特にアル
コール測定装置に好ましく利用される。
測定装置は、生或物阻害を防ぎ長寿命の測定装置を作戒
するために、カラムリアクタ一方式の装置が望ましい。
するために、カラムリアクタ一方式の装置が望ましい。
第２図は、カラムリアクタ一方式フロー型測定装置を示
したものであり、本発明の固定化酵素を充填したカラム
を上流側に備え、カラムの下流側に過酸化水素電極を配
置したフロー型測定装置を例示した。この測定装置では
、固定化酵素の活性が直接測定される電流値として現れ
る。
したものであり、本発明の固定化酵素を充填したカラム
を上流側に備え、カラムの下流側に過酸化水素電極を配
置したフロー型測定装置を例示した。この測定装置では
、固定化酵素の活性が直接測定される電流値として現れ
る。
また、このアルコールオキシダーゼ固定化カラムと過酸
化水素電極を用いた測定系にグルコース測定用電極を組
み合せると、極めて迅速・高精度のアルコールおよびグ
ルコース同時測定装置を構或できる。
化水素電極を用いた測定系にグルコース測定用電極を組
み合せると、極めて迅速・高精度のアルコールおよびグ
ルコース同時測定装置を構或できる。
グルコース測定用電極は、過酸化水素電極または酸素電
極上に、グルコースオキシダーゼあるいはビラノースオ
キシダーゼを固定化することにより作成できる。
極上に、グルコースオキシダーゼあるいはビラノースオ
キシダーゼを固定化することにより作成できる。
グルコース測定用電極は、固定化カラムの上流側または
、過酸化水素電極の下流側のどちらにも配置できるが、
高濃度アルコールがグルコースと共存する系では固定化
力ラムの内部で、著しい溶存酸素の消費と過酸化水素の
生或が起きる。従って望ましくは固定化力ラムの上流側
にグルコース測定用電極を配置する。もちろん複流路型
のフロー型測定装置を作或することも可能であるが、注
入された試料を分流する際の分流比が、配管の汚染等に
より変動する可能性が大きく、より高精度の測定を行う
ために直列配置型の装置を構戊することが望ましい。
、過酸化水素電極の下流側のどちらにも配置できるが、
高濃度アルコールがグルコースと共存する系では固定化
力ラムの内部で、著しい溶存酸素の消費と過酸化水素の
生或が起きる。従って望ましくは固定化力ラムの上流側
にグルコース測定用電極を配置する。もちろん複流路型
のフロー型測定装置を作或することも可能であるが、注
入された試料を分流する際の分流比が、配管の汚染等に
より変動する可能性が大きく、より高精度の測定を行う
ために直列配置型の装置を構戊することが望ましい。
もちろん、グルコース測定用電極以外の、固定化酵素電
極を併用することにより各種同時測定装置を構戒できる
。例えば、シヨ糖、果糖、マルトース等の糖類、さらに
乳酸等の有機酸、グルタミン酸等のアミノ酸の同時測定
装置を作戒できる。
極を併用することにより各種同時測定装置を構戒できる
。例えば、シヨ糖、果糖、マルトース等の糖類、さらに
乳酸等の有機酸、グルタミン酸等のアミノ酸の同時測定
装置を作戒できる。
さらにｐＨ電極、ナトリウム・アンモニア等のイオン選
択性電極も用いることができる。
択性電極も用いることができる。
（実施例）
以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明するが、
もちろん本発明はこれらのみに限定されるものではない
。なお、％は重量％を表す。
もちろん本発明はこれらのみに限定されるものではない
。なお、％は重量％を表す。
実施例１
（１）電極の作戒方法
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、ｌｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０． １Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分
間の電解処理を行った。白金線をよく水洗した後、４０
゛Ｃで１０分間乾燥し、１０％Ｔ−ア旦ノプロビルトリ
エトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗
浄した。
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、ｌｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０． １Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分
間の電解処理を行った。白金線をよく水洗した後、４０
゛Ｃで１０分間乾燥し、１０％Ｔ−ア旦ノプロビルトリ
エトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗
浄した。
牛血清アルブξン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ
ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタ
ルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合
液を手早く先に用意した白金線上に５μ１のせ、４０゛
Ｃで１５分間乾燥硬化して過酸化水素選択透過膜を形成
した。これを過酸化水素電極とした。
ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタ
ルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合
液を手早く先に用意した白金線上に５μ１のせ、４０゛
Ｃで１５分間乾燥硬化して過酸化水素選択透過膜を形成
した。これを過酸化水素電極とした。
（２）固定化酵素カラムの作成方法
第１図はアルコールオキシダーゼの固定化を示したもの
である。担体として耐火煉瓦を使用した。
である。担体として耐火煉瓦を使用した。
耐火煉瓦（６０メッシュ〜８０メッシュ分級品）１５０
ｍｇをよく乾燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシ
ランの１０％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置
する。このシランカップリング剤をトルエンとメタノー
ルでよく洗浄後、１２０゜Ｃで２時間乾燥する（第１ｂ
図）。放冷後、５％グルタルアルデヒド水溶液を０．５
ｍｌ加え、室温でｌ時間放置する。この担体をよく水洗
した．最後にｐＨ７，Ｏのリン酸ナトリウム緩衝液で洗
浄し、可能な限り緩衝液を除いた（第１ｃ図）。
ｍｇをよく乾燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシ
ランの１０％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置
する。このシランカップリング剤をトルエンとメタノー
ルでよく洗浄後、１２０゜Ｃで２時間乾燥する（第１ｂ
図）。放冷後、５％グルタルアルデヒド水溶液を０．５
ｍｌ加え、室温でｌ時間放置する。この担体をよく水洗
した．最後にｐＨ７，Ｏのリン酸ナトリウム緩衝液で洗
浄し、可能な限り緩衝液を除いた（第１ｃ図）。
このアミノシラン化した担体に、アルコールオキシダー
ゼ（シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ ＬＬＬｔｏｌｉｓ由来
の液状酵素標品）５０μ１をｐＨ７．０のリン酸ナトリ
ウム緩衝液でＩＯ倍に希釈した酵素溶液を加え、水冷下
で１時間放置する。
ゼ（シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ ＬＬＬｔｏｌｉｓ由来
の液状酵素標品）５０μ１をｐＨ７．０のリン酸ナトリ
ウム緩衝液でＩＯ倍に希釈した酵素溶液を加え、水冷下
で１時間放置する。
放置後緩衝液でよく洗浄した（第１ｄ図）。このように
してアルコールオキシダーゼ（第１ｄ図中にＡＯＤと示
した）がほぼ１分子づつ固定化された単一層が形威され
る。この酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長
さ１０ｃｍのポリテトラフルオロ樹脂管中に充填した。
してアルコールオキシダーゼ（第１ｄ図中にＡＯＤと示
した）がほぼ１分子づつ固定化された単一層が形威され
る。この酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長
さ１０ｃｍのポリテトラフルオロ樹脂管中に充填した。
（３）測定装置
第２図に示すフロー型測定装置を使用した。このフロー
型測定装置は高速液体クロマトグラフィ用のインジエク
タ（レオダイン社製７１２５型インジェクタ）（３）と
前記した過酸化水素電極（６）及び参照電極としてのＡ
ｇ／ＡｇＣＩ電極（７）が取り付けられ対極（８）とし
てステンレス鋼から或る配管が備えられた測定用セル（
５）とを含んで構威される。内径０．５ｍｍ、長さ０．
５ｍのテフロン製配管でインジエクタ（３）と固定化酵
素力ラム（４）、および固定化酵素力ラム（４）と測定
用セル（５）とを接続した。測定用セル（５）の内容積
は４０ｔＩｌであり、過酸化水素電極（６）とＡｇ／Ａ
ｇＣ１電極（７）とが緩衝液の管路を介して対向して配
置される。過酸化水素電極（６）にはポテンシオスタッ
ト（９）によってＡｇ／ＡｇＣｔ電極に対して＋０．６
Ｖの電圧が印加される。これらは、恒温槽（１２）の内
部に設置される。恒温槽（１２）内の温度は３７゜Ｃ±
０．２゜Ｃに保持される。緩衝液（１）の送液には高
速液体クロマトグラフィ用のポンプ（２）を用い１．０
ｍｌ／分の流量で送液される。
型測定装置は高速液体クロマトグラフィ用のインジエク
タ（レオダイン社製７１２５型インジェクタ）（３）と
前記した過酸化水素電極（６）及び参照電極としてのＡ
ｇ／ＡｇＣＩ電極（７）が取り付けられ対極（８）とし
てステンレス鋼から或る配管が備えられた測定用セル（
５）とを含んで構威される。内径０．５ｍｍ、長さ０．
５ｍのテフロン製配管でインジエクタ（３）と固定化酵
素力ラム（４）、および固定化酵素力ラム（４）と測定
用セル（５）とを接続した。測定用セル（５）の内容積
は４０ｔＩｌであり、過酸化水素電極（６）とＡｇ／Ａ
ｇＣ１電極（７）とが緩衝液の管路を介して対向して配
置される。過酸化水素電極（６）にはポテンシオスタッ
ト（９）によってＡｇ／ＡｇＣｔ電極に対して＋０．６
Ｖの電圧が印加される。これらは、恒温槽（１２）の内
部に設置される。恒温槽（１２）内の温度は３７゜Ｃ±
０．２゜Ｃに保持される。緩衝液（１）の送液には高
速液体クロマトグラフィ用のポンプ（２）を用い１．０
ｍｌ／分の流量で送液される。
緩衝液は、１ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）’？’ある。
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）’？’ある。
測定を終えた緩衝液は、廃液瓶（１０）で捕捉される。
測定値は記録計（１１）によって記録される。
（４）測定方法
固定化直後の担体を有するカラムを測定装置に装着し、
恒温槽温度が平衡に達した後、１００ｍＭのエタノール
溶液１０μｌを注入した。このときの感度を記録した。
恒温槽温度が平衡に達した後、１００ｍＭのエタノール
溶液１０μｌを注入した。このときの感度を記録した。
そのまま８時間の間３７゜Ｃで恒温槽温度を保持し、１
時間に３０検体のエタノール溶液を測定した。夜間は送
液を止め、カラム周囲環境温度を３０゜Ｃに保持した。
時間に３０検体のエタノール溶液を測定した。夜間は送
液を止め、カラム周囲環境温度を３０゜Ｃに保持した。
このように昼間は３７゜Ｃで連続測定を８時間続け、夜
間は３０゜Ｃの環境にカラムを放置し、毎日１００ｍＭ
エタノール溶液に対する感度を記録した。最初に記録し
た固定化直後の感度を１００％としてその後の感度変化
を第３図（○印）に示す。
間は３０゜Ｃの環境にカラムを放置し、毎日１００ｍＭ
エタノール溶液に対する感度を記録した。最初に記録し
た固定化直後の感度を１００％としてその後の感度変化
を第３図（○印）に示す。
記録開始後、数日間は感度の上昇が見られ以後安定する
。この感度上昇は、アルコールオキシダーゼ標品に不純
物として含まれるカタラーゼが失活することに゛よるも
のである。つまり、最終検出化合物である過酸化水素が
カタラーゼにより分解されるが、やがてカタラーゼ活性
が失われ、アルコ一ルの酸化と同時に生戒した過酸化水
素が、定量的にカラムから溶出するようになるためであ
る。
。この感度上昇は、アルコールオキシダーゼ標品に不純
物として含まれるカタラーゼが失活することに゛よるも
のである。つまり、最終検出化合物である過酸化水素が
カタラーゼにより分解されるが、やがてカタラーゼ活性
が失われ、アルコ一ルの酸化と同時に生戒した過酸化水
素が、定量的にカラムから溶出するようになるためであ
る。
この第３図からわかるように、本実施例の方法で作威し
た固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１カ
月後でも活性低下は認められなかった。
た固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１カ
月後でも活性低下は認められなかった。
さらにこの固定化酵素カラムを備える装置に、１００ｍ
ＭとＩＭのエタノール溶液を交互に注入した。ＩＭ？＠
液の場合は出力値は飽和し、定量することはできなかっ
たが、直後に注入された１００ｍＭエタノール溶液の測
定値には影響を与えなかった。
ＭとＩＭのエタノール溶液を交互に注入した。ＩＭ？＠
液の場合は出力値は飽和し、定量することはできなかっ
たが、直後に注入された１００ｍＭエタノール溶液の測
定値には影響を与えなかった。
比較例１
（１）電極の作戒方法
実施例１と同じ過酸化水素電極を作威し使用した。
（２）固定化酵素カラムの作成方法
耐火煉瓦（６０メッシュ〜８０メッシュ分級品）１５０
ｍｇに、アルコールオキシダーゼ（シグマ社製、Ｐｉｃ
ｈｉａ ＪＬＬ主上土上土１由来の液状酵素標品）５
０μｌと５０ｍｇの牛血清アルブミンにｐＨ７．０のリ
ン酸ナトリウム緩衝液０．９５ｍｌを加え、さらに０．
２％になるようにグルタルアルデヒドを加えた液を
加え、冷蔵庫中で５時間放置し乾燥する。放置後緩衝液
でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内
径２ｍｍ，長さ１０ｃｍのポリテトラフルオロ樹脂管中
に充填する。この方法で固定化すると、担体表面に、固
定化酵素の比較的厚い膜が形成される。
ｍｇに、アルコールオキシダーゼ（シグマ社製、Ｐｉｃ
ｈｉａ ＪＬＬ主上土上土１由来の液状酵素標品）５
０μｌと５０ｍｇの牛血清アルブミンにｐＨ７．０のリ
ン酸ナトリウム緩衝液０．９５ｍｌを加え、さらに０．
２％になるようにグルタルアルデヒドを加えた液を
加え、冷蔵庫中で５時間放置し乾燥する。放置後緩衝液
でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内
径２ｍｍ，長さ１０ｃｍのポリテトラフルオロ樹脂管中
に充填する。この方法で固定化すると、担体表面に、固
定化酵素の比較的厚い膜が形成される。
（３）測定装置
実施例１と同じ装置を用いた。
（４）測定方法
実施例１と同じ測定方法で固定化酵素の寿命を評価した
。その結果を第３図（●印）に示す。
。その結果を第３図（●印）に示す。
この第３図からわかるように、実施例１の方法で作威し
た固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定であるが
、比較例１で得られた固定化酵素カラムを用いた場合、
１週間後から感度低下をきたし、１９日後には初期感度
の約２０％まで低下してしまう。
た固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定であるが
、比較例１で得られた固定化酵素カラムを用いた場合、
１週間後から感度低下をきたし、１９日後には初期感度
の約２０％まで低下してしまう。
なお比較例ｉの固定化酵素カラムを用いた場合、実施例
１に比べて過酸化水素の検出ピークが溶出し終るまでの
時間が１．５倍程度になり、過酸化水素が固定化酵素層
内に保持される時間が長くなっている。
１に比べて過酸化水素の検出ピークが溶出し終るまでの
時間が１．５倍程度になり、過酸化水素が固定化酵素層
内に保持される時間が長くなっている。
また実施例ｌと同様に、この固定化酵素カラムを備える
装置に、１００ｍＭと１Ｍのエタノール溶液を交互に注
入した。ＩＭ溶液の直後に注入された１００ｍＭエタノ
ール溶液の測定値は約６０％に減少し、ＬＭ溶液測定に
よる大きな影響が認められた。
装置に、１００ｍＭと１Ｍのエタノール溶液を交互に注
入した。ＩＭ溶液の直後に注入された１００ｍＭエタノ
ール溶液の測定値は約６０％に減少し、ＬＭ溶液測定に
よる大きな影響が認められた。
比較例２
（１）電極の作戒方法
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げた。この白金線を作用極、ｌｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分間の
電解処理を行った。その後白金線をよく水洗した後、４
０゜ＣでｌＯ分間乾燥し、１０％Ｔ−ア５ノプロピルト
リエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、
洗浄した。
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げた。この白金線を作用極、ｌｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分間の
電解処理を行った。その後白金線をよく水洗した後、４
０゜ＣでｌＯ分間乾燥し、１０％Ｔ−ア５ノプロピルト
リエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、
洗浄した。
牛血清アルプ藁ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔ ｉｏｎ
ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグル
タルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混
合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０
″Ｃで１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極と
した。
ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグル
タルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混
合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０
″Ｃで１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極と
した。
さらに、その上に、アルコールオキシダーゼ（実施例１
と同じ酵素標品）５０μｌと牛血清アルブミン５ ０ｍ
ｇにｌｏＯｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
０．９５ｍｌを加え、さらに０．２％になるようにグル
タルアルデヒドを加えた混合溶液を、上記過酸化水素電
極の上に５μｌのせ、４０゜Ｃで１５分間乾燥した。こ
の酵素電極を以下の実験に用いた。
と同じ酵素標品）５０μｌと牛血清アルブミン５ ０ｍ
ｇにｌｏＯｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
０．９５ｍｌを加え、さらに０．２％になるようにグル
タルアルデヒドを加えた混合溶液を、上記過酸化水素電
極の上に５μｌのせ、４０゜Ｃで１５分間乾燥した。こ
の酵素電極を以下の実験に用いた。
（２）測定装置
過酸化水素電極の代わりに、酵素電極を用い、固定化酵
素カラムを除いた以外は、実施例１と同じ装置を用いた
。
素カラムを除いた以外は、実施例１と同じ装置を用いた
。
（３）測定方法
実施例１と同様に寿命を評価した。その結果を第３図（
×印）に示す。
×印）に示す。
酵素電極形式の場合、使用開始３日目から顕著な感度低
下が認められ５日目には約３５％まで感度が低下し、実
施例１に比べて性能が劣ることが明白である。
下が認められ５日目には約３５％まで感度が低下し、実
施例１に比べて性能が劣ることが明白である。
実施例２
（１）電極の作成方法
実施例工と同じ方法で、過酸化水素電極を作威した。
（２）固定化酵素力ラムの作成方法
シリカゲル（８０メッシュ〜１００メッシュ分級品）２
００ｍｇをよく乾燥し、Ｔ−アミノプロビルトリエトキ
シシランの１０％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間
放置する。シランヵップリング剤をトルエンとメタノー
ルでよく洗浄後、１２０゛Ｃで４時間乾燥する。放冷後
、５％グルタルアルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室
温で１時間放置する。この担体をよく水洗する。最後に
ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、可能な
限り緩衝液を除く。
００ｍｇをよく乾燥し、Ｔ−アミノプロビルトリエトキ
シシランの１０％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間
放置する。シランヵップリング剤をトルエンとメタノー
ルでよく洗浄後、１２０゛Ｃで４時間乾燥する。放冷後
、５％グルタルアルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室
温で１時間放置する。この担体をよく水洗する。最後に
ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、可能な
限り緩衝液を除く。
このアミノシラ・ン化担体に、アルコールオキシダーゼ
（シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ ｇ土主１土１ｉｓ由来
の液状酵素標品）５０μ１をｐＨ１．０のリン酸ナトリ
ウム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、水冷下
で１時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。この
酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長さ１０ｃ
ｍのポリテトラフルオロ樹脂管中に充填する。
（シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ ｇ土主１土１ｉｓ由来
の液状酵素標品）５０μ１をｐＨ１．０のリン酸ナトリ
ウム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、水冷下
で１時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。この
酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長さ１０ｃ
ｍのポリテトラフルオロ樹脂管中に充填する。
（３）測定装置
実施例１と同じ、測定装置を用いた。
（４）測定方法
実施例１と同じ方法で固定化酵素の寿命を検討した。
昼間は３７゜Ｃで連続測定を８時間続け、夜間は３０゜
Ｃの環・境にカラムを放置し、毎日１００ｍＭエタノー
ル溶液に対する感度を記録し、最初に記録した固定化直
後の感度を１００％としてその後の感度変化を第４図に
示す。記録開始後、実施例１と同しく、数日間は感度の
上昇が見られ以後安定した。
Ｃの環・境にカラムを放置し、毎日１００ｍＭエタノー
ル溶液に対する感度を記録し、最初に記録した固定化直
後の感度を１００％としてその後の感度変化を第４図に
示す。記録開始後、実施例１と同しく、数日間は感度の
上昇が見られ以後安定した。
第４図からわかるように、本実施例の方法で作戒した固
定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、約３週間
活性低下は認められなかった。これは、比較例１および
比較例２と比べて極めて耐久性が改善されていることを
示している。ただし、シリカゲルの細孔は耐火煉瓦に比
べてより細かく、過酸化水素の溶出が遅れる傾向があり
、このため耐火煉瓦に比べて酵素近傍に過酸化水素が滞
留しやすい。それが若干寿命が短くなる理由であると考
えられる。
定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、約３週間
活性低下は認められなかった。これは、比較例１および
比較例２と比べて極めて耐久性が改善されていることを
示している。ただし、シリカゲルの細孔は耐火煉瓦に比
べてより細かく、過酸化水素の溶出が遅れる傾向があり
、このため耐火煉瓦に比べて酵素近傍に過酸化水素が滞
留しやすい。それが若干寿命が短くなる理由であると考
えられる。
さらにこの固定化酵素力ラムを備える装置に、１００ｍ
ＭとＩＭのエタノール溶液を交互に注入した。ＩＭ溶液
の場合は出力値は飽和し、定量することはできなかった
が、直後に注入された１００ｍＭエタノール溶液の測定
値には影響を与えなかった。
ＭとＩＭのエタノール溶液を交互に注入した。ＩＭ溶液
の場合は出力値は飽和し、定量することはできなかった
が、直後に注入された１００ｍＭエタノール溶液の測定
値には影響を与えなかった。
実施例３
（１）電極の作戊方法
実施例１と同じ方法で、過酸化水素電極を作威した。
（２）固定化酵素カラムの作戒方法
ケイソウ上（セライト５４５、キシダ化学（株）製、４
０メッシュ〜６０メッシュ分級品）１５０ｍｇをよく乾
燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの１０％
無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置する。シラン
ヵップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄後、
１２０″Ｃで４時間乾燥する。放冷後、５％グルタルア
ルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室温で１時間放置す
る。
０メッシュ〜６０メッシュ分級品）１５０ｍｇをよく乾
燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの１０％
無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置する。シラン
ヵップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄後、
１２０″Ｃで４時間乾燥する。放冷後、５％グルタルア
ルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室温で１時間放置す
る。
この担体をよく水洗する。最後にｐＨ７．０のリン酸ナ
トリウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除く。
トリウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除く。
このアミノシラン化担体に、アルコールオキシダーゼ（
シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ Ｌ１主工土１ｉｓ由来の
液状酵素標品）５０μ１をｐＨ７．０のリン酸ナトリウ
ム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、水冷下で
１時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。この酵
素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ，長さ１０ｃｍ
のポリテトラフルオロ樹脂管中に充填する。
シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ Ｌ１主工土１ｉｓ由来の
液状酵素標品）５０μ１をｐＨ７．０のリン酸ナトリウ
ム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、水冷下で
１時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。この酵
素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ，長さ１０ｃｍ
のポリテトラフルオロ樹脂管中に充填する。
（３）測定装置
実施例１と同じ、測定装置を用いた。
（４）測定方法
実施例１と同じ方法で固定化酵素の寿命を検討した。
昼間は３７゜Ｃで連続測定を８時間続け、夜間は３０゜
Ｃの環境にカラムを放置し、毎日１００ｍＭエタノール
溶液に対する感度を記録し、最初に記録した固定化直後
の感度を１００％としてその後の感度変化を第５図に示
す。記録開始後、実施例１と同じく、数日間は感度の上
昇が見られ以後安定した。
Ｃの環境にカラムを放置し、毎日１００ｍＭエタノール
溶液に対する感度を記録し、最初に記録した固定化直後
の感度を１００％としてその後の感度変化を第５図に示
す。記録開始後、実施例１と同じく、数日間は感度の上
昇が見られ以後安定した。
この第５図からわかるように、本実施例の方法で作戒し
た固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１カ
月後でも活性低下は認められなかった。これは、実施例
１と同様に極めて安定性が優れていることを示している
。
た固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１カ
月後でも活性低下は認められなかった。これは、実施例
１と同様に極めて安定性が優れていることを示している
。
さらにこの固定化酵素カラムを備える装置に、１００ｍ
ＭとＩＭのエタノール溶液を交互に注入した。ＩＭ溶液
の場合は出力値は飽和し、定量することはできなかった
が、直後に注入された１００ｍＭエタノール溶液の測定
値には影響を与えなかった。
ＭとＩＭのエタノール溶液を交互に注入した。ＩＭ溶液
の場合は出力値は飽和し、定量することはできなかった
が、直後に注入された１００ｍＭエタノール溶液の測定
値には影響を与えなかった。
実施例４
（１）電極等の作或方法
過酸化水素電極、カラムについては実施例１と同様に作
威した。
威した。
グルコース測定用電極は、実施例１で用いたものと同様
の過酸化水素電極の過酸化水素選択透過膜上にグルコー
スオキシダーゼを固定化した。グルコースオキシダーゼ
（シグマ社製、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
由来、Ｔｙｐｅ ＩＩ）５ ｍ ｇ ／ ｍ １と牛
血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔ ｉｏｎ
Ｖ）５ｍｇ／ｍｌをｌ：１に混合し、その混合液に０．
２％になるようにグルタルアルデヒドを加え、その５μ
ｌを過酸化水素選択透過膜上に滴下後、４０″Ｃで１５
分間乾燥した。
の過酸化水素電極の過酸化水素選択透過膜上にグルコー
スオキシダーゼを固定化した。グルコースオキシダーゼ
（シグマ社製、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
由来、Ｔｙｐｅ ＩＩ）５ ｍ ｇ ／ ｍ １と牛
血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔ ｉｏｎ
Ｖ）５ｍｇ／ｍｌをｌ：１に混合し、その混合液に０．
２％になるようにグルタルアルデヒドを加え、その５μ
ｌを過酸化水素選択透過膜上に滴下後、４０″Ｃで１５
分間乾燥した。
（２）測定装置
第２図に示すフロー型測定装置に測定用セル（１３）に
装着したグルコース測定用電極（１４）を取り付けて用
いた。その配置を第６図に示す。
装着したグルコース測定用電極（１４）を取り付けて用
いた。その配置を第６図に示す。
その他の測定条件は実施例１と同様である。
（３）測定方法
インジェクタ（３）より各種濃度のエタノール溶液およ
びグルコース溶液を５μｌ注入した場合の検量線を第７
図に示す。第７図の検量線（１）はグルコースの検量線
を示し、０．７５ （Ｗ／Ｖ）％までの直線範囲が得ら
れた。検量線（２）はエタノールに対する検量線を示し
、２．０ （Ｖ／Ｖ）％までの直線範囲が得られた。ま
たグルコースとアルコールの混合溶液を注入した場合で
も相互に妨害はみとめられなかった。
びグルコース溶液を５μｌ注入した場合の検量線を第７
図に示す。第７図の検量線（１）はグルコースの検量線
を示し、０．７５ （Ｗ／Ｖ）％までの直線範囲が得ら
れた。検量線（２）はエタノールに対する検量線を示し
、２．０ （Ｖ／Ｖ）％までの直線範囲が得られた。ま
たグルコースとアルコールの混合溶液を注入した場合で
も相互に妨害はみとめられなかった。
さらにグルコース測定用電極は６カ月間感度の低下が見
られず、本発明の装置を用いることにより、高精度かつ
安定なグルコースとアルコールの同時測定装置が構戒で
きることが判った。
られず、本発明の装置を用いることにより、高精度かつ
安定なグルコースとアルコールの同時測定装置が構戒で
きることが判った。
（効果）
本発明により、安定にアルコールオキシダーゼを固定化
することが可能となり、容易に優れたアルコール測定装
置を構或で゛きる。
することが可能となり、容易に優れたアルコール測定装
置を構或で゛きる。
また、高精度かつ安定なアルコールおよびグルコースの
同時測定装置を構戒できる。
同時測定装置を構戒できる。
第１図は実施例１において形威した固定化アルコールオ
キシダーゼをしめす。 第２図は実施例１〜３及び比較例で用いたフロー型測定
装置を示す。 第３図は、実施例１、比較例１、および比較例２の結果
を示している。 実施例１の結果一一〇印 比較例１の結果一一●印 比較例２の結果−一×印 第４図は実施例２の測定結果を示し、第５図は実施例３
の測定結果を示す。第６図は実施例４で用いた測定装置
を示す。第７図は実施例における検量線を示す。検量線
（１）はグルコースの検量線、検量線（２）はエタノー
ルの検量線を示す。 （１）・・・緩衝液 （２）・・・ポンプ （３）・・・インジエクタ （４）・・・固定化酵素力ラム （５）・・・測定セル （６）・・・過酸化水素電極 （７）・・・Ａｇ／ＡｇＣＩ参照電極 （８）・・・対極 （９）・・・ポテンシオスタット （１０）・・・廃液ボトル （１１）・・・レコーダー （１２）・・・恒温槽 （１３）測定セル （ｌ４）グルコース測定用電極
キシダーゼをしめす。 第２図は実施例１〜３及び比較例で用いたフロー型測定
装置を示す。 第３図は、実施例１、比較例１、および比較例２の結果
を示している。 実施例１の結果一一〇印 比較例１の結果一一●印 比較例２の結果−一×印 第４図は実施例２の測定結果を示し、第５図は実施例３
の測定結果を示す。第６図は実施例４で用いた測定装置
を示す。第７図は実施例における検量線を示す。検量線
（１）はグルコースの検量線、検量線（２）はエタノー
ルの検量線を示す。 （１）・・・緩衝液 （２）・・・ポンプ （３）・・・インジエクタ （４）・・・固定化酵素力ラム （５）・・・測定セル （６）・・・過酸化水素電極 （７）・・・Ａｇ／ＡｇＣＩ参照電極 （８）・・・対極 （９）・・・ポテンシオスタット （１０）・・・廃液ボトル （１１）・・・レコーダー （１２）・・・恒温槽 （１３）測定セル （ｌ４）グルコース測定用電極
Claims (4)
- （１）担体表面に、単一層を形成するようにアルコール
オキシダーゼを固定化したことを特徴とする固定化酵素
。 - （２）担体がケイソウ土系ケイ酸担体であり、担体表面
にアミノシラン化処理を施し、担体表面に形成されたア
ミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、アルコールオキ
シダーゼを接触せしめて、前記多官能性アルデヒドにア
ルコールオキシダーゼを結合させてなる固定化酵素。 - （３）請求項（１）または（２）記載の固定化酵素を充
填したカラムを上流側に備え、前記カラム下流側に過酸
化水素電極を配置したフロー型アルコール測定装置。 - （４）請求項（１）または（２）記載の固定化酵素を充
填したカラムとその下流側に配置した過酸化水素電極を
有し、さらに直列にグルコース測定用電極を接続したフ
ロー型アルコール測定装置。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2061703A JP2862940B2 (ja) | 1989-08-25 | 1990-03-12 | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
| US07/573,066 US5190872A (en) | 1989-08-25 | 1990-08-27 | Immobilized alcohol utidase for use in an alcohol measuring apparatus |
| DE69023440T DE69023440T2 (de) | 1989-08-25 | 1990-08-27 | Immobilisierte Alkoholoxydase, Methode zu deren Herstellung und Messgerät. |
| EP90116383A EP0416419B1 (en) | 1989-08-25 | 1990-08-27 | Immobilized alcohol oxidase, method for its preparation and measuring apparatus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21910489 | 1989-08-25 | ||
| JP1-219104 | 1989-08-25 | ||
| JP2061703A JP2862940B2 (ja) | 1989-08-25 | 1990-03-12 | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03164174A true JPH03164174A (ja) | 1991-07-16 |
| JP2862940B2 JP2862940B2 (ja) | 1999-03-03 |
Family
ID=26402765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2061703A Expired - Fee Related JP2862940B2 (ja) | 1989-08-25 | 1990-03-12 | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0416419B1 (ja) |
| JP (1) | JP2862940B2 (ja) |
| DE (1) | DE69023440T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE69217461T2 (de) * | 1991-11-08 | 1997-10-23 | Nippon Electric Co | Immobilisierte Enzym-Membran, immobilisierte Protein-Membran und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE4214822C2 (de) * | 1992-05-05 | 1998-12-03 | Inst Bioanalytik Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen |
| GB9227134D0 (en) * | 1992-12-31 | 1993-02-24 | Fuller Jess P | Cell support structure |
| US5653862A (en) * | 1996-04-15 | 1997-08-05 | Dade Chemistry Systems Inc. | Biochemical sensor device and method |
| DE19833406A1 (de) * | 1998-07-24 | 2000-02-03 | Stadler Johann | Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen oder Enzymen |
| US7700305B2 (en) | 1999-09-17 | 2010-04-20 | N2Itive1 Innovations | Analyte detection |
| ATE418605T1 (de) * | 2003-03-28 | 2009-01-15 | Council Scient Ind Res | Verfahren zur herstellung von hitzebeständige enzyme |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| JPS61145448A (ja) * | 1984-12-19 | 1986-07-03 | Fuji Electric Co Ltd | 固定化酵素膜 |
| JPH01181790A (ja) * | 1988-01-18 | 1989-07-19 | Toray Silicone Co Ltd | 生理活性物質の固定化方法 |
Family Cites Families (8)
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|---|---|---|---|---|
| US3669841A (en) * | 1970-02-11 | 1972-06-13 | Monsanto Co | Attachment of enzymes to siliceous materials |
| US4540668A (en) * | 1979-06-05 | 1985-09-10 | Phillips Petroleum Company | Alcohol oxidase from Pichia-type yeasts |
| US4619898A (en) * | 1979-06-05 | 1986-10-28 | Phillips Petroleum Company | Alcohol oxidase from Pichia-type yeasts |
| US4900666A (en) * | 1983-07-12 | 1990-02-13 | Lifescan, Inc. | Colorimetric ethanol analysis method and test device |
| US4556635A (en) * | 1983-08-29 | 1985-12-03 | Phillips Petroleum Company | Determination of alcohol content in water imiscible organic systems |
| JPS63182559A (ja) * | 1987-01-24 | 1988-07-27 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | 酵素電極の製造方法 |
| JP2685145B2 (ja) * | 1988-01-25 | 1997-12-03 | 王子製紙株式会社 | 酵素電極 |
| US5037737A (en) * | 1988-06-29 | 1991-08-06 | Apec, Inc. | Analysis by sensor placement in recprocating flow |
-
1990
- 1990-03-12 JP JP2061703A patent/JP2862940B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-27 DE DE69023440T patent/DE69023440T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-27 EP EP90116383A patent/EP0416419B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-27 US US07/573,066 patent/US5190872A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6187700A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-06 | Shimadzu Corp | ペプチド含有物質固定化物 |
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| JPH01181790A (ja) * | 1988-01-18 | 1989-07-19 | Toray Silicone Co Ltd | 生理活性物質の固定化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69023440D1 (de) | 1995-12-14 |
| US5190872A (en) | 1993-03-02 |
| JP2862940B2 (ja) | 1999-03-03 |
| EP0416419B1 (en) | 1995-11-08 |
| DE69023440T2 (de) | 1996-07-04 |
| EP0416419A3 (en) | 1993-04-21 |
| EP0416419A2 (en) | 1991-03-13 |
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