JP2901286B2 - 酵素含有バイオ触媒、その製法及びその使用による生化学反応法 - Google Patents
酵素含有バイオ触媒、その製法及びその使用による生化学反応法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はバイオ触媒、バイオ触媒の製法、及びバイオ
触媒を用いての生化学反応法に関する。
触媒を用いての生化学反応法に関する。
微生物学は、過去20年の間に急速に発展し、多数の商
業的生化学反応法がバイオ触媒として酵素を用いて開発
されてきている。そのような生化学反応法の例として
は、欧州特許明細書第76606号及び同第179603号に記載
されたものがある。そのような生化学反応法において、
採用されるバイオ触媒は重要な役割を果す。
業的生化学反応法がバイオ触媒として酵素を用いて開発
されてきている。そのような生化学反応法の例として
は、欧州特許明細書第76606号及び同第179603号に記載
されたものがある。そのような生化学反応法において、
採用されるバイオ触媒は重要な役割を果す。
今日まで、バイオ触媒として使用されている酵素は、
一般的には、（ａ）精製された酵素の形、（ｂ）酵素を
含む細胞の湿潤懸濁物の形、及び（ｃ）酵素を含む全細
胞を固定した形、で使用されてきている。しかし、これ
ら三つの形態は、商業的応用性を制限する欠点を有す
る。精製酵素は、非常に有用であるが製造するのに費用
が嵩み、従つてその用途は高価な目的製品を製造する方
法に限定される。湿潤細胞懸濁物中の酵素は活性を迅速
に失なう。そのような懸濁物を、たとえ短期間であつて
も貯蔵すべきときには、懸濁物に対して不凍の深冷防護
剤のような他の物質を添加して０℃以下の温度にまで冷
却して、懸濁物中に含まれる細胞の破裂を防止すること
が必要である。固定化された全細胞中の酵素では、長期
間にわたり酵素の完全な活性を維持するのが困難であ
る。
一般的には、（ａ）精製された酵素の形、（ｂ）酵素を
含む細胞の湿潤懸濁物の形、及び（ｃ）酵素を含む全細
胞を固定した形、で使用されてきている。しかし、これ
ら三つの形態は、商業的応用性を制限する欠点を有す
る。精製酵素は、非常に有用であるが製造するのに費用
が嵩み、従つてその用途は高価な目的製品を製造する方
法に限定される。湿潤細胞懸濁物中の酵素は活性を迅速
に失なう。そのような懸濁物を、たとえ短期間であつて
も貯蔵すべきときには、懸濁物に対して不凍の深冷防護
剤のような他の物質を添加して０℃以下の温度にまで冷
却して、懸濁物中に含まれる細胞の破裂を防止すること
が必要である。固定化された全細胞中の酵素では、長期
間にわたり酵素の完全な活性を維持するのが困難であ
る。
本発明によれば、酵素含有微生物の全細胞を、酵素の
バイオ触媒活性が保持されるような条件下で噴霧乾燥す
ることにより製造された酵素含有バイオ触媒を提供す
る。
バイオ触媒活性が保持されるような条件下で噴霧乾燥す
ることにより製造された酵素含有バイオ触媒を提供す
る。
さらに本発明によれば、酵素含有微生物の全細胞を、
酵素のバイオ触媒活性が保持されるような条件下で噴霧
乾燥する工程を含む、酵素含有バイオ触媒の製法も提供
する。
酵素のバイオ触媒活性が保持されるような条件下で噴霧
乾燥する工程を含む、酵素含有バイオ触媒の製法も提供
する。
さらに本発明によれば、酵素含有微生物の全細胞を、
酵素のバイオ触媒活性が保持されるような条件下で噴霧
乾燥することにより製造された酵素含有バイオ触媒を使
用する生化学反応の実施方法も提供される。
酵素のバイオ触媒活性が保持されるような条件下で噴霧
乾燥することにより製造された酵素含有バイオ触媒を使
用する生化学反応の実施方法も提供される。
可溶性タンパク質の一般的特徴は、より高温度におい
て、触媒活性の損失を伴なう不可逆的変更が生じること
である。いずれの酵素についても、それ以上では酵素活
性が急激に失なわれるある温度がある。従つて、例えば
多くのデハロゲナーゼ酵素は、それらを含む溶液の温度
が50℃以上に上昇すると不活性になる。従つて、噴霧乾
燥された微生物がバイオ触媒活性を保持しうること、及
び噴霧乾燥法が、バイオ触媒として使用されることが意
図された微生物細胞に従来使用されたことがないこと
は、驚くべきことである。我々は、噴霧乾燥に用いられ
る温度は通常では不活性化が生じる温度よりもはるかに
高いけれども、このような高い温度での細胞の滞留時間
が短く、従つて不活性化の程度が著しくないことによ
り、バイオ触媒活性の保持がなされるものと、信じる。
て、触媒活性の損失を伴なう不可逆的変更が生じること
である。いずれの酵素についても、それ以上では酵素活
性が急激に失なわれるある温度がある。従つて、例えば
多くのデハロゲナーゼ酵素は、それらを含む溶液の温度
が50℃以上に上昇すると不活性になる。従つて、噴霧乾
燥された微生物がバイオ触媒活性を保持しうること、及
び噴霧乾燥法が、バイオ触媒として使用されることが意
図された微生物細胞に従来使用されたことがないこと
は、驚くべきことである。我々は、噴霧乾燥に用いられ
る温度は通常では不活性化が生じる温度よりもはるかに
高いけれども、このような高い温度での細胞の滞留時間
が短く、従つて不活性化の程度が著しくないことによ
り、バイオ触媒活性の保持がなされるものと、信じる。
本発明の製法は、酵母または細菌、殊にグラム陰性細
菌（遺伝子変性により作られた酵母株及び細胞株も含
む）を用いてバイオ触媒を製造するのに使用できる。バ
イオ触媒としては、いずれの所要酵素を含むものも製造
できる。本発明のバイオ触媒中に非常に適切に含まれう
る酵素としては、シアナイドヒドラターゼ、アミダー
ゼ、アルコールデヒトロゲナーゼ及びＤ−２−ハロアル
カン酸ハリドヒドロラーゼ（Ｄ−２−HAA halidohydrol
ase）がある。殊に、本発明方法は、下記の菌株の細胞
を噴霧乾燥することにより、我々の欧州特許明細書第17
9603号に記載の方法に使用するためのバイオ触媒の製造
に使用できる。
菌（遺伝子変性により作られた酵母株及び細胞株も含
む）を用いてバイオ触媒を製造するのに使用できる。バ
イオ触媒としては、いずれの所要酵素を含むものも製造
できる。本発明のバイオ触媒中に非常に適切に含まれう
る酵素としては、シアナイドヒドラターゼ、アミダー
ゼ、アルコールデヒトロゲナーゼ及びＤ−２−ハロアル
カン酸ハリドヒドロラーゼ（Ｄ−２−HAA halidohydrol
ase）がある。殊に、本発明方法は、下記の菌株の細胞
を噴霧乾燥することにより、我々の欧州特許明細書第17
9603号に記載の方法に使用するためのバイオ触媒の製造
に使用できる。
1. シユウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）NC
IB 12018 2. シユウドモナス・フルオレセンズ（fluorescens）N
CIB 12159 3. NCIB 12160 4. NCIB 12161 5. シユウドモナス・プチダNCIB 12158 これらの株の培養物は、英国アバーデイーン、135ア
ビイ・ロード、PO Box 31のザ・ナシヨナル・コレクシ
ヨン・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バク
テリア（NCIB）に寄託されている。
IB 12018 2. シユウドモナス・フルオレセンズ（fluorescens）N
CIB 12159 3. NCIB 12160 4. NCIB 12161 5. シユウドモナス・プチダNCIB 12158 これらの株の培養物は、英国アバーデイーン、135ア
ビイ・ロード、PO Box 31のザ・ナシヨナル・コレクシ
ヨン・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バク
テリア（NCIB）に寄託されている。
本発明の製法により噴霧乾燥しうるその他の商業的に
有用な微生物としては下記のものがある。
有用な微生物としては下記のものがある。
フサリウム・ラテリチウム（Fusarium lateritium）ニ
ース（Nees）株CMI300533。このものは欧州特許第23371
9号に記載されており、英国サーリイ、リツチモンド、
キユウ、フエリーレーンのザ・コモンウエルス・マイコ
ロジカル・インスチチユート（CMI）に1986年２月３日
寄託された。
ース（Nees）株CMI300533。このものは欧州特許第23371
9号に記載されており、英国サーリイ、リツチモンド、
キユウ、フエリーレーンのザ・コモンウエルス・マイコ
ロジカル・インスチチユート（CMI）に1986年２月３日
寄託された。
メチロフイルス・メチロトロフス（Methylophilus meth
ylotrophus）株AS−１（NCIB10515）。このものは英国
特許第1370892号に記載されている。
ylotrophus）株AS−１（NCIB10515）。このものは英国
特許第1370892号に記載されている。
カンジダ・ユテイリス（Candida utilis）株ATCC8206。
米国、20852、メリーランド州ロツクビレ、12301パーク
ローンドライブのジ・アメリカン・タイプ・カルチヤー
・コレクシヨン（ATCC）に寄託されている。
米国、20852、メリーランド州ロツクビレ、12301パーク
ローンドライブのジ・アメリカン・タイプ・カルチヤー
・コレクシヨン（ATCC）に寄託されている。
ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus plantr
um）株NCIMB40027。
um）株NCIMB40027。
噴霧乾燥において、原料（通常は水性）は微細化され
て霧状となり、このものは乾燥媒（一般的には空気）と
接触されて水分を蒸発させる。霧状物の乾燥は、乾燥さ
れた粒子中に所望の水分が得られるまで継続され、その
段階で製品を乾燥媒から回収する。本発明の方法は、い
ずれの噴霧乾燥法でも（例えば加圧ノズルの使用、回転
式アトマイザーの使用または二流体ノズルの使用）実施
できる。好ましい噴霧乾燥器入口温度は140〜250℃、殊
に140〜180℃の範囲である。好ましい噴霧乾燥器出口温
度は60〜110℃、殊に60〜90℃の範囲である。噴霧乾燥
は、細胞が高温度に付される時間が可及的に短かくしか
も満足な乾燥が行なわれるように実施されるのが好まし
い。高温度へ露出される適当の平均時間は15秒ないし45
秒の範囲である。本発明の方法は、２〜18％、殊に６〜
12％の細胞乾燥重量の細胞含有懸濁液に応用されるのが
好ましい。
て霧状となり、このものは乾燥媒（一般的には空気）と
接触されて水分を蒸発させる。霧状物の乾燥は、乾燥さ
れた粒子中に所望の水分が得られるまで継続され、その
段階で製品を乾燥媒から回収する。本発明の方法は、い
ずれの噴霧乾燥法でも（例えば加圧ノズルの使用、回転
式アトマイザーの使用または二流体ノズルの使用）実施
できる。好ましい噴霧乾燥器入口温度は140〜250℃、殊
に140〜180℃の範囲である。好ましい噴霧乾燥器出口温
度は60〜110℃、殊に60〜90℃の範囲である。噴霧乾燥
は、細胞が高温度に付される時間が可及的に短かくしか
も満足な乾燥が行なわれるように実施されるのが好まし
い。高温度へ露出される適当の平均時間は15秒ないし45
秒の範囲である。本発明の方法は、２〜18％、殊に６〜
12％の細胞乾燥重量の細胞含有懸濁液に応用されるのが
好ましい。
本発明の方法は、バツチ式または連続式で実施しう
る。噴霧乾燥は、別の場所で作られた細胞に対して実施
される独立の工程であつても、あるいは微生物細胞が醗
酵槽中で生産され、次いで採取されるときに噴霧乾燥器
へ供給される総合プロセスの中の一工程であつてもよ
い。本発明の方法は、多様な生化学方法に応用すること
ができ、殊に本発明方法は欧州特許第179603号明細書に
記載の方法において応用できる。欧州特許第179603号明
細書の方法は、２−ハロアルカン酸のＤ−及びＬ−エナ
ンチオマーの混合物中のＬ−エナンチオマーの濃度を増
加させるものである。
る。噴霧乾燥は、別の場所で作られた細胞に対して実施
される独立の工程であつても、あるいは微生物細胞が醗
酵槽中で生産され、次いで採取されるときに噴霧乾燥器
へ供給される総合プロセスの中の一工程であつてもよ
い。本発明の方法は、多様な生化学方法に応用すること
ができ、殊に本発明方法は欧州特許第179603号明細書に
記載の方法において応用できる。欧州特許第179603号明
細書の方法は、２−ハロアルカン酸のＤ−及びＬ−エナ
ンチオマーの混合物中のＬ−エナンチオマーの濃度を増
加させるものである。
本発明の製法によつて作られる噴霧乾燥細胞は一般
に、従来の湿潤細胞懸濁物の場合と比較して、可成り長
期間にわたり酵素活性を保持する。殊に、噴霧乾燥細胞
は、１年間までの間貯蔵してもほとんど無視しうるほど
の活性損失を示すにすぎない。これとは対照的に、湿潤
細胞懸濁液中の酵素活性は時間と共に一定の割合で低減
し、わずか数週間（例えば４〜６週間）の後には活性が
ほとんどなくなつてしまう。
に、従来の湿潤細胞懸濁物の場合と比較して、可成り長
期間にわたり酵素活性を保持する。殊に、噴霧乾燥細胞
は、１年間までの間貯蔵してもほとんど無視しうるほど
の活性損失を示すにすぎない。これとは対照的に、湿潤
細胞懸濁液中の酵素活性は時間と共に一定の割合で低減
し、わずか数週間（例えば４〜６週間）の後には活性が
ほとんどなくなつてしまう。
本発明の製法を以下添付図により説明する。この添付
図は開放サイクル並流噴霧乾燥のための装置の概略フロ
ーシートである。
図は開放サイクル並流噴霧乾燥のための装置の概略フロ
ーシートである。
この装置において、製造されるべき酵素バイオ触媒を
含む微生物細胞の水性懸濁物からなる原料と、加熱空気
とを、導管１及び２に沿つてそれぞれアトマイザー３へ
供給して、このアトマイザーにおいて原料を無数の小滴
からなる霧にする。アトマイザー３は乾燥室４の頂部に
位置しており、形成された霧状物は乾燥室４中へ移り、
乾燥される。霧の乾燥の後に、乾燥製品の大部分は乾燥
室４の下方部５中へ降下する。製品のうち細かいものは
空気中に同伴されて排出乾燥空気ダクト６に沿つて粉末
回収サイクロン７へ移行し、分離される。その後その微
生物は、気流運搬装置に入る。乾燥室４の下方部５か
ら、製品の大部分が粉末取出口８を経て導管９中へ移行
し、その導管に沿つて、10から供給される輸送用気流に
よつて輸送サイクロン11へ送られる。乾燥製品活性酵素
バイオ触媒を含む乾燥微生物細胞は、輸送サイクロン11
の下端部で装置から最終的に取出される。サイクロン７
及び11からの排出空気は、スクラバー13を経て大気中へ
移る。
含む微生物細胞の水性懸濁物からなる原料と、加熱空気
とを、導管１及び２に沿つてそれぞれアトマイザー３へ
供給して、このアトマイザーにおいて原料を無数の小滴
からなる霧にする。アトマイザー３は乾燥室４の頂部に
位置しており、形成された霧状物は乾燥室４中へ移り、
乾燥される。霧の乾燥の後に、乾燥製品の大部分は乾燥
室４の下方部５中へ降下する。製品のうち細かいものは
空気中に同伴されて排出乾燥空気ダクト６に沿つて粉末
回収サイクロン７へ移行し、分離される。その後その微
生物は、気流運搬装置に入る。乾燥室４の下方部５か
ら、製品の大部分が粉末取出口８を経て導管９中へ移行
し、その導管に沿つて、10から供給される輸送用気流に
よつて輸送サイクロン11へ送られる。乾燥製品活性酵素
バイオ触媒を含む乾燥微生物細胞は、輸送サイクロン11
の下端部で装置から最終的に取出される。サイクロン７
及び11からの排出空気は、スクラバー13を経て大気中へ
移る。
本発明を下記実施例により説明する。
実施例 1. 図面に示した装置を用いて、Ｄ−２−ハロアルカン酸
ハリドヒドロラーゼ酵素を含むシユウドモナス・プチダ
NCIB 12018細菌の細胞を噴霧乾燥した。噴霧乾燥器入口
温度は180℃、出口温度は90℃であつた。この乾燥器で
の、酵素のＤ−クロロピロピオン酸をＬ−乳酸へ加水分
解する活性の保持率は100％であつた。
ハリドヒドロラーゼ酵素を含むシユウドモナス・プチダ
NCIB 12018細菌の細胞を噴霧乾燥した。噴霧乾燥器入口
温度は180℃、出口温度は90℃であつた。この乾燥器で
の、酵素のＤ−クロロピロピオン酸をＬ−乳酸へ加水分
解する活性の保持率は100％であつた。
貯蔵において、この噴霧乾燥細胞は室温での貯蔵時に
６ケ月後にその酵素活性の50％を保持するであろうこと
が判明した。酵素活性は、４℃及びマイナス20℃での12
ケ月以上にわたる貯蔵において完全に保持された。これ
は、同一微生物の湿潤細胞による活性の保持性と比較し
てはるかにすぐれているものである。湿潤細胞において
活性は４℃において３週間以内に失なわれた。
６ケ月後にその酵素活性の50％を保持するであろうこと
が判明した。酵素活性は、４℃及びマイナス20℃での12
ケ月以上にわたる貯蔵において完全に保持された。これ
は、同一微生物の湿潤細胞による活性の保持性と比較し
てはるかにすぐれているものである。湿潤細胞において
活性は４℃において３週間以内に失なわれた。
実施例 2. 添付図の装置を用いてシアナイドヒドラターゼ酵素を
含むフサリウム・ラナリチウム・ニースの細胞を噴霧乾
燥した。噴霧乾燥器入口温度は150℃、出口温度は70℃
であつた。この乾燥器での、酵素のシアナイドを分解し
てホルムアミドとする活性の保持率は100％であつた。
含むフサリウム・ラナリチウム・ニースの細胞を噴霧乾
燥した。噴霧乾燥器入口温度は150℃、出口温度は70℃
であつた。この乾燥器での、酵素のシアナイドを分解し
てホルムアミドとする活性の保持率は100％であつた。
貯蔵において、この噴霧乾燥細胞は数ケ月間酵素活性
を保持した。これは、同一微生物の湿潤細胞による活性
保持と比較してはるかにすぐれたものであつた。湿潤細
胞においては、活性は７日で失なわれた。
を保持した。これは、同一微生物の湿潤細胞による活性
保持と比較してはるかにすぐれたものであつた。湿潤細
胞においては、活性は７日で失なわれた。
実施例 3. アミダーゼ酵素を含むメチロフイルス・メチロトロフ
ス細菌株AS−１の細胞を、添付図の装置で噴霧乾燥し
た。噴霧乾燥器入口温度は160〜180℃であり、出口温度
は80〜90℃であつた。この乾燥器での、酵素のアクリル
アミド分解活性の保持率は90％であつた。この噴霧乾燥
細胞は数ケ月間酵素活性を維持した。同一微生物の湿潤
細胞は７日で酵素活性を失なつた。
ス細菌株AS−１の細胞を、添付図の装置で噴霧乾燥し
た。噴霧乾燥器入口温度は160〜180℃であり、出口温度
は80〜90℃であつた。この乾燥器での、酵素のアクリル
アミド分解活性の保持率は90％であつた。この噴霧乾燥
細胞は数ケ月間酵素活性を維持した。同一微生物の湿潤
細胞は７日で酵素活性を失なつた。
実施例 4. 添付図の装置を用いて、カンジダ・ユチリス酵母株AT
CC 8206（ピルベートデカルボキシラーゼ酵素含有）の
細胞を噴霧乾燥した。噴霧乾燥器入口温度は150℃、出
口温度は60℃であつた。
CC 8206（ピルベートデカルボキシラーゼ酵素含有）の
細胞を噴霧乾燥した。噴霧乾燥器入口温度は150℃、出
口温度は60℃であつた。
この乾燥器での、ピルベートデカルボキシラーゼ酵素
活性の保持は80％であつた。この酵素の活性が貯蔵中に
保持された時間は、同一の微生物の湿潤細胞で活性が保
持された時間と同様であつた。
活性の保持は80％であつた。この酵素の活性が貯蔵中に
保持された時間は、同一の微生物の湿潤細胞で活性が保
持された時間と同様であつた。
実施例 5. 添付図に示した装置を用いて細菌ラクトバシルス・プ
ランタルム株NCIB 40027の細胞を噴霧乾燥した。この乾
燥器での、細菌細胞による解糖作用回路及びアミノ酸生
合成回路における活性の保持は100％であつた。貯蔵に
おいて、この噴霧乾燥細胞は上記代謝回路における活性
を数ケ月保持した。同一の微生物の湿潤細胞における活
性は１〜２週間で失なわれた。
ランタルム株NCIB 40027の細胞を噴霧乾燥した。この乾
燥器での、細菌細胞による解糖作用回路及びアミノ酸生
合成回路における活性の保持は100％であつた。貯蔵に
おいて、この噴霧乾燥細胞は上記代謝回路における活性
を数ケ月保持した。同一の微生物の湿潤細胞における活
性は１〜２週間で失なわれた。
添付図は本発明方法を実施するための開放サイクル並流
式噴霧乾燥装置の概略フローシートである。 原料導管……１、加熱空気導管……２、 アトマイザー……３、乾燥室……４、 粉末回収サイクロン……７。
式噴霧乾燥装置の概略フローシートである。 原料導管……１、加熱空気導管……２、 アトマイザー……３、乾燥室……４、 粉末回収サイクロン……７。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 西独国特許出願公告2626626（ＤＥ, Ｂ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】酵素含有細菌の全細胞を、酵素のバイオ触
媒活性が保持されるような条件下で噴霧乾燥することに
より製造された、噴霧乾燥した細菌の全細胞を含む酵素
含有バイオ触媒。 - 【請求項２】酵素含有細菌の全細胞を、酵素のバイオ触
媒活性が保持されるような条件下で噴霧乾燥する工程を
含む、噴霧乾燥した細菌の全細胞を含む酵素含有バイオ
触媒の製法。 - 【請求項３】バイオ触媒中に含まれる酵素がシアナイド
ヒドラターゼ、アミダーゼまたはＤ−２−ハロアルカン
酸ハリドヒドロラーゼである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】細菌がNCIB 12018株、NCIB 12158株、NC
IB 12159株、NCIB 12160株またはNCIB 12161株であ
る請求項３記載の方法。 - 【請求項５】140〜180℃の範囲内の噴霧乾燥器入口温度
を用いて細胞を噴霧乾燥する請求項２〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】60〜90℃の範囲内の噴霧乾燥器出口温度を
用いて細胞を噴霧乾燥する請求項２〜５のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項７】15〜45秒の平均時間にわたり、細胞を一層
高い温度に付す請求項２〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】６％〜12％の範囲内の細胞乾燥重量を有す
る懸濁液の状態にある細胞を噴霧乾燥する請求項２〜７
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】酵素含有細菌の全細胞を、酵素のバイオ触
媒活性が保持されるような条件下で噴霧乾燥することに
より製造された、噴霧乾燥した細菌の全細胞を含む酵素
含有バイオ触媒を使用する生化学反応の実施方法。 - 【請求項１０】Ｄ−２−ハロアルカン酸ハリドヒドロラ
ーゼを用いて、２−ハロアルカン酸のＤ−及びＬ−エナ
ンチオマー混合物中のＬ−エナンチオマーの濃度を増大
させる請求項９記載の方法。
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