JP3119311B2 - 酸化酵素活性を有するモノクローナル抗体 - Google Patents
酸化酵素活性を有するモノクローナル抗体Info
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- JP3119311B2 JP3119311B2 JP03332513A JP33251391A JP3119311B2 JP 3119311 B2 JP3119311 B2 JP 3119311B2 JP 03332513 A JP03332513 A JP 03332513A JP 33251391 A JP33251391 A JP 33251391A JP 3119311 B2 JP3119311 B2 JP 3119311B2
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- antibody
- porphyrin
- cells
- oxidase activity
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はポルフィリンの金属錯体
と特異的に結合し、酸化酵素活性を発現するモノクロー
ナル抗体に関する。
と特異的に結合し、酸化酵素活性を発現するモノクロー
ナル抗体に関する。
【０００２】ポルフィリンの金属錯体は、ヘモグロビン
などの酸素を運搬する血中蛋白やカタラーゼやチトクロ
ムｂやＰ４５０などの酵素の構成成分として広く生体内
に存在する。もし、これらの機能をもつ物質を人工的に
作ることが出来れば、人工血液、人工光合成、酸化反応
を利用した物質など種々の用途への応用が期待できる。
近年抗体酵素(Catalytic Antibody)と呼ばれる触媒活性
を有する抗体が、ラーナーらあるいはシュルツらにより
報告され注目を集めている(Science,234,1566(1986)、i
bid.,234,1570 (1986))。その理由として通常のタンパ
ク質酵素に比べて抗体酵素の方が基質特異性の点で数段
優れていること、安定性の点で優れていることや適当な
ハプテンを用いることにより触媒する反応や基質特異性
を自由に設計できることなどが挙げられる。これらの多
くは、反応の遷移状態アナログをハプテンとして得られ
る抗体であるが、補酵素などのコファクターをハプテン
として得ることもできる。後者の方法の考え方によると
ポルフィリンの金属錯体と特異的に結合できる抗体が得
られれば、その抗体はヘモグロビンなどの酸素を運搬す
る血中蛋白やカタラーゼ、チトクロムｂあるいはＰ４５
０などの酵素機能をもつ可能性があることになる。ラー
ナーらはメソ−テトラキス（４−カルボキシフェニル）
ポルフィリン（ＴＣＰＰと略する）のＦｅ（ＩＩＩ）あ
るいはＣｏ（ＩＩＩ）錯体をハプテンとしてモノクロナ
ール抗体を得たと報告している(J. Am. Chem. Soc.,11
1,2344 (1989)) 。しかし得られた抗体が酸化酵素活性
を有するかについては報告されていない。またこのよう
なポルフィリンの金属錯体をハプテンとして抗体を得る
方法では、種々の金属についてのポルフィリン錯体と特
異的に結合する抗体を得るには、いくつものハプテンに
対して抗体を得る必要があり効率が悪い。このような欠
点を補う方法としてポルフィリンの金属錯体ではなく、
ポルフィリン自身をハプテンとして抗体を得、得られた
抗体の中から種々の金属のポルフィリン錯体に対する抗
体の結合能でスクリーニングする方法が考えられる。
などの酸素を運搬する血中蛋白やカタラーゼやチトクロ
ムｂやＰ４５０などの酵素の構成成分として広く生体内
に存在する。もし、これらの機能をもつ物質を人工的に
作ることが出来れば、人工血液、人工光合成、酸化反応
を利用した物質など種々の用途への応用が期待できる。
近年抗体酵素(Catalytic Antibody)と呼ばれる触媒活性
を有する抗体が、ラーナーらあるいはシュルツらにより
報告され注目を集めている(Science,234,1566(1986)、i
bid.,234,1570 (1986))。その理由として通常のタンパ
ク質酵素に比べて抗体酵素の方が基質特異性の点で数段
優れていること、安定性の点で優れていることや適当な
ハプテンを用いることにより触媒する反応や基質特異性
を自由に設計できることなどが挙げられる。これらの多
くは、反応の遷移状態アナログをハプテンとして得られ
る抗体であるが、補酵素などのコファクターをハプテン
として得ることもできる。後者の方法の考え方によると
ポルフィリンの金属錯体と特異的に結合できる抗体が得
られれば、その抗体はヘモグロビンなどの酸素を運搬す
る血中蛋白やカタラーゼ、チトクロムｂあるいはＰ４５
０などの酵素機能をもつ可能性があることになる。ラー
ナーらはメソ−テトラキス（４−カルボキシフェニル）
ポルフィリン（ＴＣＰＰと略する）のＦｅ（ＩＩＩ）あ
るいはＣｏ（ＩＩＩ）錯体をハプテンとしてモノクロナ
ール抗体を得たと報告している(J. Am. Chem. Soc.,11
1,2344 (1989)) 。しかし得られた抗体が酸化酵素活性
を有するかについては報告されていない。またこのよう
なポルフィリンの金属錯体をハプテンとして抗体を得る
方法では、種々の金属についてのポルフィリン錯体と特
異的に結合する抗体を得るには、いくつものハプテンに
対して抗体を得る必要があり効率が悪い。このような欠
点を補う方法としてポルフィリンの金属錯体ではなく、
ポルフィリン自身をハプテンとして抗体を得、得られた
抗体の中から種々の金属のポルフィリン錯体に対する抗
体の結合能でスクリーニングする方法が考えられる。
【０００３】本発明者らは既にＴＣＰＰに対するモノク
ローナル抗体を調製し、該抗体がＴＣＰＰのＺｎ（Ｉ
Ｉ）錯体と結合することができることを報告したが(Che
m. Lett.,917 (1990))、該抗体とＴＣＰＰのＺｎ（Ｉ
Ｉ）錯体との結合体についてペルオキシダーゼ活性があ
るか検討したところ、その活性は無かった。酵素活性が
確認された例としては、最近シュルツらがＮ−メチルメ
ソポルフィリンＩＸに対するモノクローナル抗体を調製
し、該抗体にメソポルフィリンＩＸのＦｅ（ＩＩＩ）錯
体を結合させたものにペルオキシダーゼ活性があること
を報告している(J.Am. Chem. Soc.,112,9414 (1990))
。しかし、ハプテンとして用いるＮ−メチルメソポル
フィリンおよびペルオキシダーゼ活性発現時に必要なメ
ソポルフィリンＩＸのＦｅ（ＩＩＩ）錯体は非常に高価
なものであり、あまり実用的なものとはいえない。
ローナル抗体を調製し、該抗体がＴＣＰＰのＺｎ（Ｉ
Ｉ）錯体と結合することができることを報告したが(Che
m. Lett.,917 (1990))、該抗体とＴＣＰＰのＺｎ（Ｉ
Ｉ）錯体との結合体についてペルオキシダーゼ活性があ
るか検討したところ、その活性は無かった。酵素活性が
確認された例としては、最近シュルツらがＮ−メチルメ
ソポルフィリンＩＸに対するモノクローナル抗体を調製
し、該抗体にメソポルフィリンＩＸのＦｅ（ＩＩＩ）錯
体を結合させたものにペルオキシダーゼ活性があること
を報告している(J.Am. Chem. Soc.,112,9414 (1990))
。しかし、ハプテンとして用いるＮ−メチルメソポル
フィリンおよびペルオキシダーゼ活性発現時に必要なメ
ソポルフィリンＩＸのＦｅ（ＩＩＩ）錯体は非常に高価
なものであり、あまり実用的なものとはいえない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は安価な
合成ポルフィリンをハプテンとし、さらに安価な合成ポ
ルフィリンの金属錯体と結合させることにより酸化酵素
活性を発現するモノクローナル抗体を提供することにあ
る。
合成ポルフィリンをハプテンとし、さらに安価な合成ポ
ルフィリンの金属錯体と結合させることにより酸化酵素
活性を発現するモノクローナル抗体を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するに際し、種々のポルフィリン化合物に対するモ
ノクローナル抗体を作製し、得られた抗体と各種ポルフ
ィリン金属錯体との結合体について鋭意検討した結果、
化１で示されるポルフィリンに対するモノクローナル抗
体に対応するポルフィリンの金属錯体（但しＺｎ錯体を
除く）を結合させたものに酸化酵素活性が有ることを発
見し本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、化
１で示されるポルフィリンを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体であり、かつ化１で示されるポルフィリンの
金属錯体（但しＺｎ錯体は除く）と特異的と結合し酸化
酵素活性を発現することを特徴とするモノクローナル抗
体。
達成するに際し、種々のポルフィリン化合物に対するモ
ノクローナル抗体を作製し、得られた抗体と各種ポルフ
ィリン金属錯体との結合体について鋭意検討した結果、
化１で示されるポルフィリンに対するモノクローナル抗
体に対応するポルフィリンの金属錯体（但しＺｎ錯体を
除く）を結合させたものに酸化酵素活性が有ることを発
見し本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、化
１で示されるポルフィリンを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体であり、かつ化１で示されるポルフィリンの
金属錯体（但しＺｎ錯体は除く）と特異的と結合し酸化
酵素活性を発現することを特徴とするモノクローナル抗
体。
【０００６】本発明の抗体は、化１で示されるポルフィ
リンを結合試薬により適当な担体に結合させたものを免
疫抗原として製造できる。より具体的には、例えば上記
免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と
哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞( hybridoma )
を作成し、これより化１で示されるポルフィリンを認識
する所望抗体を産生するクローンをスクリーニングし、
該クローンを培養することにより製造できる。上記方法
において担体としては、特に制限はなく、通常抗原の作
成にあたり慣用される高分子の天然もしくは合成のタン
パク質を広く使用できる。例えば、各種動物の血清アル
ブミン類、血清グロブリン類、チログロブリン類、ヘモ
グロビン類、ヘモシアニン類などの他ポリリジン、ポリ
グルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン
またはオルニチンを含む共重合体などを挙げることがで
き、好ましいものとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡと
略する）やキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
と略する）が挙げられる。また、結合試薬としては特に
制限なく、通常の抗原の作成にあたり慣用されるものを
広く使用することができ、具体的にはアミノ基とカルボ
キシル基とをアミド結合させることのできる試薬であれ
ばよく、例えば、Ｎ, Ｎ' −ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、１, １' −カルボニルジイミダゾ
ールなどが挙げられる。
リンを結合試薬により適当な担体に結合させたものを免
疫抗原として製造できる。より具体的には、例えば上記
免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と
哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞( hybridoma )
を作成し、これより化１で示されるポルフィリンを認識
する所望抗体を産生するクローンをスクリーニングし、
該クローンを培養することにより製造できる。上記方法
において担体としては、特に制限はなく、通常抗原の作
成にあたり慣用される高分子の天然もしくは合成のタン
パク質を広く使用できる。例えば、各種動物の血清アル
ブミン類、血清グロブリン類、チログロブリン類、ヘモ
グロビン類、ヘモシアニン類などの他ポリリジン、ポリ
グルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン
またはオルニチンを含む共重合体などを挙げることがで
き、好ましいものとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡと
略する）やキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
と略する）が挙げられる。また、結合試薬としては特に
制限なく、通常の抗原の作成にあたり慣用されるものを
広く使用することができ、具体的にはアミノ基とカルボ
キシル基とをアミド結合させることのできる試薬であれ
ばよく、例えば、Ｎ, Ｎ' −ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、１, １' −カルボニルジイミダゾ
ールなどが挙げられる。
【０００７】上記免疫抗原で免疫される哺乳動物として
は、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質細胞腫
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
にはマウス、ラットなどが有利に用いられる。免疫は一
般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動物に静脈
内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することに
より実施できる。例えば、マウスの場合、免疫抗原を所
望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に１
０〜５０日毎に数回投与し、総投与量が５０〜５００μ
ｇ／マウス程度になるようにして実施するのが望まし
い。免疫細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出
した脾臓細胞を使用するのが望ましい。さらに、上記免
疫細胞と融合される他方の母細胞としての哺乳動物の形
質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、例えば
ｐ３（ｐ３／ｘ６３Ａｇ８）(Nature,256,495 (1975))
、ｐ３−Ｕ１(Current Topics in Microbiology and I
mmunology,81,1 (1978)) 、ＮＳ−１(Eur. J. Immuno
l.,6,511 (1978)) 、ＭＰＣ−１１(Cell.,8,405 (197
8))、ＳＰ２／０(Nature,278,269 (1978)) 、Ｆ０(J. I
mmunol. Meth.,35,1 (1980)) 、ｘ６３．６．５．３(J.
Immunol.,123,1548 (1979)) 、Ｓ１９４(J. Exp. Me
d.,148,313 (1978)) などやラットにおけるＲ２１０(Na
ture,277,131(1979))などの骨髄腫細胞などを用いるこ
とができる。
は、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質細胞腫
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
にはマウス、ラットなどが有利に用いられる。免疫は一
般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動物に静脈
内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することに
より実施できる。例えば、マウスの場合、免疫抗原を所
望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に１
０〜５０日毎に数回投与し、総投与量が５０〜５００μ
ｇ／マウス程度になるようにして実施するのが望まし
い。免疫細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出
した脾臓細胞を使用するのが望ましい。さらに、上記免
疫細胞と融合される他方の母細胞としての哺乳動物の形
質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、例えば
ｐ３（ｐ３／ｘ６３Ａｇ８）(Nature,256,495 (1975))
、ｐ３−Ｕ１(Current Topics in Microbiology and I
mmunology,81,1 (1978)) 、ＮＳ−１(Eur. J. Immuno
l.,6,511 (1978)) 、ＭＰＣ−１１(Cell.,8,405 (197
8))、ＳＰ２／０(Nature,278,269 (1978)) 、Ｆ０(J. I
mmunol. Meth.,35,1 (1980)) 、ｘ６３．６．５．３(J.
Immunol.,123,1548 (1979)) 、Ｓ１９４(J. Exp. Me
d.,148,313 (1978)) などやラットにおけるＲ２１０(Na
ture,277,131(1979))などの骨髄腫細胞などを用いるこ
とができる。
【０００８】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反
応は公知の方法、例えばMilsteinらの方法(Method in E
nzymology,73,3 (1981))などに準じて行うことができ
る。具体的には、上記融合反応は通常の融合促進剤、例
えばポリエチレングリコール（ＰＥＧと略する）、セン
ダイウイルス（ＨＶＪと略する）などの存在下に、通常
の培地中で実施され、さらに培地中には融合効率を高め
るためにジメチルスルホキシドなどの補助剤を必要に応
じて添加することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞
との使用比は通常の方法と変わりはなく、例えば形質細
胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるの
が普通である。融合反応時の培地としては、形質細胞腫
細胞の培養に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭ
１−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培
養に一般に利用できるものを例示でき、通常これらの培
地は牛胎児血清（ＦＢＳ）などの血清補液を抜いておく
のがよい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所
定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加
温しておいたＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜
６０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０v/v ％
の濃度で加えて混ぜ合わせることにより行われる。以
後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する
ことを繰り返すことにより所望のハイブリドーマが形成
される。
応は公知の方法、例えばMilsteinらの方法(Method in E
nzymology,73,3 (1981))などに準じて行うことができ
る。具体的には、上記融合反応は通常の融合促進剤、例
えばポリエチレングリコール（ＰＥＧと略する）、セン
ダイウイルス（ＨＶＪと略する）などの存在下に、通常
の培地中で実施され、さらに培地中には融合効率を高め
るためにジメチルスルホキシドなどの補助剤を必要に応
じて添加することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞
との使用比は通常の方法と変わりはなく、例えば形質細
胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるの
が普通である。融合反応時の培地としては、形質細胞腫
細胞の培養に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭ
１−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培
養に一般に利用できるものを例示でき、通常これらの培
地は牛胎児血清（ＦＢＳ）などの血清補液を抜いておく
のがよい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所
定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加
温しておいたＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜
６０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０v/v ％
の濃度で加えて混ぜ合わせることにより行われる。以
後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する
ことを繰り返すことにより所望のハイブリドーマが形成
される。
【０００９】得られる所望のハイブリドーマの分離は、
通常の選別用培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチ
ン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培地）で培養
することにより行われる。該ＨＡＴ培地での培養は、目
的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞など）
が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間行えばよ
い。このようにして得られたハイブリドーマは、通常の
限界希釈法により目的とする抗体の検索および単一クロ
ーン化に供される。目的抗体産生株の検索は、例えばＥ
ＬＩＳＡ法(Method in Enzymology,70,419(1980))、プ
ラーク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー(Ouc
htoriony)法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法など
の一般的に抗体の検出に用いられている種々の方法に従
い、実施することができ、この検索には前記免疫抗原が
利用できる。
通常の選別用培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチ
ン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培地）で培養
することにより行われる。該ＨＡＴ培地での培養は、目
的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞など）
が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間行えばよ
い。このようにして得られたハイブリドーマは、通常の
限界希釈法により目的とする抗体の検索および単一クロ
ーン化に供される。目的抗体産生株の検索は、例えばＥ
ＬＩＳＡ法(Method in Enzymology,70,419(1980))、プ
ラーク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー(Ouc
htoriony)法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法など
の一般的に抗体の検出に用いられている種々の方法に従
い、実施することができ、この検索には前記免疫抗原が
利用できる。
【００１０】このようにして得られる化１で示されるポ
ルフィリンを認識する所望のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養すること
ができ、また液体窒素中で長期間保存することができ
る。上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハ
イブリドーマを常法に従い培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に供与して増殖させ、その腹水として得る方法などが
採用される。また上記のようにして得られる抗体は、さ
らに塩析、透析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの通常の
手段により精製することができる。
ルフィリンを認識する所望のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養すること
ができ、また液体窒素中で長期間保存することができ
る。上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハ
イブリドーマを常法に従い培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に供与して増殖させ、その腹水として得る方法などが
採用される。また上記のようにして得られる抗体は、さ
らに塩析、透析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの通常の
手段により精製することができる。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、化１で示
されるポルフィリンを特異的に認識する。本発明のモノ
クローナル抗体は、分子量１５万（Ｈ鎖５万、Ｌ鎖 2.5
万、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）であり、抗体型はＩｇＧ
２ｂ型であり、ＴＣＰＰに対する解離定数Ｋｄは1.0 ×
10-6Ｍである（ＥＬＩＳＡを用いた Klotzプロットによ
り決定）。また本発明のモノクローナル抗体は、化１で
示されるポルフィリンのＦｅ、Ｍｎ、Ｃｏなどの金属錯
体（但しＺｎ錯体は除く）、例えばＦｅ（ＩＩＩ）錯体
などと特異的に結合して酸化酵素活性を発現する。酸化
酵素活性としては、ペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ
活性、Ｐ４５０活性などが挙げられる。
されるポルフィリンを特異的に認識する。本発明のモノ
クローナル抗体は、分子量１５万（Ｈ鎖５万、Ｌ鎖 2.5
万、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）であり、抗体型はＩｇＧ
２ｂ型であり、ＴＣＰＰに対する解離定数Ｋｄは1.0 ×
10-6Ｍである（ＥＬＩＳＡを用いた Klotzプロットによ
り決定）。また本発明のモノクローナル抗体は、化１で
示されるポルフィリンのＦｅ、Ｍｎ、Ｃｏなどの金属錯
体（但しＺｎ錯体は除く）、例えばＦｅ（ＩＩＩ）錯体
などと特異的に結合して酸化酵素活性を発現する。酸化
酵素活性としては、ペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ
活性、Ｐ４５０活性などが挙げられる。
【００１２】
【発明の効果】本発明により、安価な合成ポルフィリン
をハプテンとし、安価な合成ポルフィリンの金属錯体
（但しＺｎを除く）を結合させることにより酸化酵素活
性を発現するモノクローナル抗体が提供され、本発明抗
体を従来、各種酸化酵素（タンパク質酵素）が行ってい
た反応に利用することができる。
をハプテンとし、安価な合成ポルフィリンの金属錯体
（但しＺｎを除く）を結合させることにより酸化酵素活
性を発現するモノクローナル抗体が提供され、本発明抗
体を従来、各種酸化酵素（タンパク質酵素）が行ってい
た反応に利用することができる。
【００１３】
【実施例】本発明を更に詳しく説明するために、以下に
実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。 実施例１ モノクローナル抗体の製造 ＴＣＰＰ６mg、１, １' −カルボニルジイミダゾール(C
DI)1.2mgをジメチルホルムアミド２mlに溶かし、氷冷下
２時間撹拌した後、ＫＬＨ（Sigma社製）５mgを0.1Mリ
ン酸−ホウ砂緩衝液(pH9.0，以下PBB)６mlに溶かしたも
のを滴下し、氷冷下一晩撹拌した。反応液をセファデッ
クスG-50(Pharmasia社製）カラムを用いて0.1M PBB (pH
9.0)で展開し、未反応のＴＣＰＰと分離し精製した。Ｔ
ＣＰＰ−ＫＬＨを0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0) に溶かした
溶液( 約1.5mg/ml)0.4ml、0.01M リン酸緩衝液（pH7.0,
0.9% NaCl を含む、以下PBS ）0.4ml と完全フロインド
アジュバント0.8ml を注射器内で混合しエマルジョン
にした。一晩放置しエマルジョンが分離していないこと
を確認した後、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射
した。免疫は１匹あたり１回につき0.2ml(ＴＣＰＰとし
て約1nmol)を使用し、１ケ月間隔で２回注射した。次
に、免疫したマウスがＴＣＰＰに対する抗体を産生して
いることを酵素抗体免疫法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて確
認した。２回目の免疫から約１ケ月後に抗体価を高める
ために最終免疫を行った。最終免疫には上記ＴＣＰＰ−
ＫＬＨ溶液とＰＢＳを１対１に混合したものを用いた。
ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体産生の確認はＴＣＰＰ−ＫＬ
Ｈ、ＴＣＰＰ−ＫＬＨと同様の方法で調製したＴＣＰＰ
−ＢＳＡおよびＢＳＡをコーティングしたＥＬＩＳＡプ
レート(Falcon Micro TestＩＩＩ Flexible Assay Plat
e)およびアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスグ
ロブリン抗体（Zymed 社製）を用いて行った。最終免疫
を実施した３日後に免疫したマウスの腹腔を切開して脾
臓を摘出し、摘出した脾臓細胞と骨髄腫細胞（マウス
ミエローマＳＰ２／０）を細胞数５：１になるように用
いて、ポリエチレングリコール１０００により細胞融合
した。調製したハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養し増
殖したものについて上記ＥＬＩＳＡ法により目的とする
ＴＣＰＰに対する抗体を産生している融合細胞を選抜し
た。選抜された融合細胞をさらに限界希釈法により単一
クローン化した。単一クローン化した抗体産生株を予め
約１〜２週間前にブリスタン 0.5mlを注射しておいたＢ
ａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。約７〜１０日後に
マウスの腹水を採取し、硫安塩析、各種クロマトグラフ
ィーにより精製した。上記抗体産生株の１つは工業技術
院微生物工業技術研究所に「（微工研菌寄１２６０９号
ＦＥＲＭ Ｐ−１２６０９）」の寄託番号で寄託され
ている。
実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。 実施例１ モノクローナル抗体の製造 ＴＣＰＰ６mg、１, １' −カルボニルジイミダゾール(C
DI)1.2mgをジメチルホルムアミド２mlに溶かし、氷冷下
２時間撹拌した後、ＫＬＨ（Sigma社製）５mgを0.1Mリ
ン酸−ホウ砂緩衝液(pH9.0，以下PBB)６mlに溶かしたも
のを滴下し、氷冷下一晩撹拌した。反応液をセファデッ
クスG-50(Pharmasia社製）カラムを用いて0.1M PBB (pH
9.0)で展開し、未反応のＴＣＰＰと分離し精製した。Ｔ
ＣＰＰ−ＫＬＨを0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0) に溶かした
溶液( 約1.5mg/ml)0.4ml、0.01M リン酸緩衝液（pH7.0,
0.9% NaCl を含む、以下PBS ）0.4ml と完全フロインド
アジュバント0.8ml を注射器内で混合しエマルジョン
にした。一晩放置しエマルジョンが分離していないこと
を確認した後、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射
した。免疫は１匹あたり１回につき0.2ml(ＴＣＰＰとし
て約1nmol)を使用し、１ケ月間隔で２回注射した。次
に、免疫したマウスがＴＣＰＰに対する抗体を産生して
いることを酵素抗体免疫法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて確
認した。２回目の免疫から約１ケ月後に抗体価を高める
ために最終免疫を行った。最終免疫には上記ＴＣＰＰ−
ＫＬＨ溶液とＰＢＳを１対１に混合したものを用いた。
ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体産生の確認はＴＣＰＰ−ＫＬ
Ｈ、ＴＣＰＰ−ＫＬＨと同様の方法で調製したＴＣＰＰ
−ＢＳＡおよびＢＳＡをコーティングしたＥＬＩＳＡプ
レート(Falcon Micro TestＩＩＩ Flexible Assay Plat
e)およびアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスグ
ロブリン抗体（Zymed 社製）を用いて行った。最終免疫
を実施した３日後に免疫したマウスの腹腔を切開して脾
臓を摘出し、摘出した脾臓細胞と骨髄腫細胞（マウス
ミエローマＳＰ２／０）を細胞数５：１になるように用
いて、ポリエチレングリコール１０００により細胞融合
した。調製したハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養し増
殖したものについて上記ＥＬＩＳＡ法により目的とする
ＴＣＰＰに対する抗体を産生している融合細胞を選抜し
た。選抜された融合細胞をさらに限界希釈法により単一
クローン化した。単一クローン化した抗体産生株を予め
約１〜２週間前にブリスタン 0.5mlを注射しておいたＢ
ａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。約７〜１０日後に
マウスの腹水を採取し、硫安塩析、各種クロマトグラフ
ィーにより精製した。上記抗体産生株の１つは工業技術
院微生物工業技術研究所に「（微工研菌寄１２６０９号
ＦＥＲＭ Ｐ−１２６０９）」の寄託番号で寄託され
ている。
【００１４】実施例２ 抗体のペルオキシダーゼ活性
について 実施例１で得られたモノクローナル抗体03Ａについて、
以下のような系でペルオキシダーゼ活性があるかどうか
検討した。 モノクローナル抗体 0.2mg/ml ＴＣＰＰ・ Ｆｅ（ＩＩＩ） 0.5 μM Ｈ2 Ｏ2 5mM ピロガロール 1mM ジメチルスルホキシド 8v/v％ 90mMトリス−酢酸緩衝液(pH8.0) 上記反応液を２０℃で反応させ、反応液の420nm におけ
る吸光度の時間変化を測定した。対照としてモノクロー
ナル抗体の代わりに蒸留水を用いた。結果は図１のよう
になり、モノクローナル抗体を加えた場合、対照に比べ
て吸光度の変化は明らかに大きくペルオキシダーゼ活性
を有していることがわかった。
について 実施例１で得られたモノクローナル抗体03Ａについて、
以下のような系でペルオキシダーゼ活性があるかどうか
検討した。 モノクローナル抗体 0.2mg/ml ＴＣＰＰ・ Ｆｅ（ＩＩＩ） 0.5 μM Ｈ2 Ｏ2 5mM ピロガロール 1mM ジメチルスルホキシド 8v/v％ 90mMトリス−酢酸緩衝液(pH8.0) 上記反応液を２０℃で反応させ、反応液の420nm におけ
る吸光度の時間変化を測定した。対照としてモノクロー
ナル抗体の代わりに蒸留水を用いた。結果は図１のよう
になり、モノクローナル抗体を加えた場合、対照に比べ
て吸光度の変化は明らかに大きくペルオキシダーゼ活性
を有していることがわかった。
【００１５】
図１は、得られたモノクローナル抗体についてペルオキ
シダーゼ活性の有無を検討したときの反応液の420nm に
おける吸光度の時間変化を示したものであり、曲線Ａは
モノクローナル抗体を加えた場合、曲線Ｂは加えなかっ
た場合である。
シダーゼ活性の有無を検討したときの反応液の420nm に
おける吸光度の時間変化を示したものであり、曲線Ａは
モノクローナル抗体を加えた場合、曲線Ｂは加えなかっ
た場合である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｑ 1/28 // Ｃ１２Ｑ 1/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 化１で示されるポルフィリンを特異的に
認識するモノクローナル抗体であり、かつ化１で示され
るポルフィリンの金属錯体（但しＺｎ錯体は除く）と特
異的と結合して酸化酵素活性を発現することを特徴とす
るモノクローナル抗体。 【化１】 （Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 はＨまたはＣＯＯＨであ
る。但しＲ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝Ｈの場合を除く。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03332513A JP3119311B2 (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 酸化酵素活性を有するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03332513A JP3119311B2 (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 酸化酵素活性を有するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05236989A JPH05236989A (ja) | 1993-09-17 |
| JP3119311B2 true JP3119311B2 (ja) | 2000-12-18 |
Family
ID=18255775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03332513A Expired - Fee Related JP3119311B2 (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 酸化酵素活性を有するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3119311B2 (ja) |
-
1991
- 1991-11-20 JP JP03332513A patent/JP3119311B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05236989A (ja) | 1993-09-17 |
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