JPH0463590A - ラツトプロラクチンに対するモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞、及びモノクローナル抗体の産生方法 - Google Patents
ラツトプロラクチンに対するモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞、及びモノクローナル抗体の産生方法Info
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- JPH0463590A JPH0463590A JP2174664A JP17466490A JPH0463590A JP H0463590 A JPH0463590 A JP H0463590A JP 2174664 A JP2174664 A JP 2174664A JP 17466490 A JP17466490 A JP 17466490A JP H0463590 A JPH0463590 A JP H0463590A
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- prolactin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は、ラットプロラクチンに対して極めて特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドー
マ細胞に関するものである。また、この発明は、上記の
ハイプリドーマ細胞を培養することによって、ラットプ
ロラクチンに対して極めて特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を産生ずる方法に関するものである。
に反応するモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドー
マ細胞に関するものである。また、この発明は、上記の
ハイプリドーマ細胞を培養することによって、ラットプ
ロラクチンに対して極めて特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を産生ずる方法に関するものである。
（従来の技術）
一般に、哺乳動物のプロラクチンは互いに性質が類似し
ている。例えば、ヒトプロラクチンとラットプロラクチ
ンとは、構造的に似ている。このため、これらに特異的
に反応する抗体を得ることが困難であった。すなわち、
ヒトから得られた天然型のヒトプロラクチンやラットか
ら得られた天然型のラットプロラクチンを動物に免疫し
ても、得られる抗体はポリクローナル性のものであって
、モノクローナル性の抗体を得ることはできなかった。
ている。例えば、ヒトプロラクチンとラットプロラクチ
ンとは、構造的に似ている。このため、これらに特異的
に反応する抗体を得ることが困難であった。すなわち、
ヒトから得られた天然型のヒトプロラクチンやラットか
ら得られた天然型のラットプロラクチンを動物に免疫し
ても、得られる抗体はポリクローナル性のものであって
、モノクローナル性の抗体を得ることはできなかった。
従って、ラットプロラクチンに対して特異的に反応する
モノクローナル抗体は、これまで得られていなかった。
モノクローナル抗体は、これまで得られていなかった。
他方、ヒトのプロラクチンに対するモノクローナル抗体
は、知られている。それはＩｖａｎｙｉ Ｊ。
は、知られている。それはＩｖａｎｙｉ Ｊ。
ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ Ｐ、、 Ｐｒｏｔｉｄｅｓ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ、Ｆｌｕｉｄｓ、２９ ８５
５−８６０ （１９８１）に記載されている。しかし、
ラットのプロラクチンに対するモノクローナル抗体は知
られていない。なお、公知のヒトのプロラクチンに対す
るモノクローナル抗体も、天然型のヒトプロラクチンを
原料としたものに限られていた。
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ、Ｆｌｕｉｄｓ、２９ ８５
５−８６０ （１９８１）に記載されている。しかし、
ラットのプロラクチンに対するモノクローナル抗体は知
られていない。なお、公知のヒトのプロラクチンに対す
るモノクローナル抗体も、天然型のヒトプロラクチンを
原料としたものに限られていた。
（発明が解決しようとする課Ｍ）
この発明は、ラットプロラクチンの構造を解明し、ラッ
トプロラクチンに対して極めて特異的に反応するモノク
ローナル抗体を得ようとしてなされたものである。
トプロラクチンに対して極めて特異的に反応するモノク
ローナル抗体を得ようとしてなされたものである。
（課題解決のための手段）
この発明者は、遺伝子の組み換えによってラットプロラ
クチン産生用の遺伝子を作り、これを大腸菌に導入して
形質転換した大腸菌を作り、これ全培養して大腸菌にラ
ットプロラクチンを産生させた。
クチン産生用の遺伝子を作り、これを大腸菌に導入して
形質転換した大腸菌を作り、これ全培養して大腸菌にラ
ットプロラクチンを産生させた。
さらに、この組み換え型のラットプロラクチンを用いて
マウスを免疫し、これから常法に従って脾細胞を摘出す
るとともに、これをマウスの骨髄腫細胞と融合してハイ
プリドーマ細胞を得た。このハイプリドーマ細胞を培養
してその産生物を調べたところ、ハイプリドーマ細腕は
ラットプロラクチンに対するモノクローナル抗体を産生
ずるが、そのモノクローナル抗体は意外にもラットプロ
ラクチンに対して極めて特異的に反応するものであるこ
とが見出された。従って、このモノクローナル抗体は、
ラットプロラクチンを検出する際などに好適であること
が見出された。この発明はこのような知見に基づいてな
されたものである。
マウスを免疫し、これから常法に従って脾細胞を摘出す
るとともに、これをマウスの骨髄腫細胞と融合してハイ
プリドーマ細胞を得た。このハイプリドーマ細胞を培養
してその産生物を調べたところ、ハイプリドーマ細腕は
ラットプロラクチンに対するモノクローナル抗体を産生
ずるが、そのモノクローナル抗体は意外にもラットプロ
ラクチンに対して極めて特異的に反応するものであるこ
とが見出された。従って、このモノクローナル抗体は、
ラットプロラクチンを検出する際などに好適であること
が見出された。この発明はこのような知見に基づいてな
されたものである。
天然型のヒトプロラクチンは、第２表に示したアミノ酸
配列を持っている。これに対し組み換え型のラットプロ
ラクチンは、第１表に示したアミノ酸配列を持っている
。第１表と第２表とにおけるアミノ酸配列の違いは、頭
にＭｅｔすなわちメチオニンが有るか無いかという点で
ある。
配列を持っている。これに対し組み換え型のラットプロ
ラクチンは、第１表に示したアミノ酸配列を持っている
。第１表と第２表とにおけるアミノ酸配列の違いは、頭
にＭｅｔすなわちメチオニンが有るか無いかという点で
ある。
この発明は、ラットプロラクチンとして天然型のものの
代わりに、組み換え型のものを用いることとした点、及
びこれをクローナル抗体の産生用に利用することとした
点を除いては、既に知られている方法を踏襲することと
している。すなわち、ラットプロラクチンを用いてマウ
スを免疫し、こうして得られたマウス脾細胞と骨髄腫細
胞とを融合してハイプリドーマ細胞を作る点、及びこの
ハイプリドーマ細胞を培養してクローナル抗体を産生さ
せる点では、従来方法と何等変わるところがないのであ
る。
代わりに、組み換え型のものを用いることとした点、及
びこれをクローナル抗体の産生用に利用することとした
点を除いては、既に知られている方法を踏襲することと
している。すなわち、ラットプロラクチンを用いてマウ
スを免疫し、こうして得られたマウス脾細胞と骨髄腫細
胞とを融合してハイプリドーマ細胞を作る点、及びこの
ハイプリドーマ細胞を培養してクローナル抗体を産生さ
せる点では、従来方法と何等変わるところがないのであ
る。
（発明要旨）
この発明は、第１表に示したアミノ酸配列から成るラッ
トプロラクチンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞
とを融合して作られたラットプロラクチンに対するモノ
クローナル抗体産生用のハイプリドーマ細胞を要旨とす
るものである。
トプロラクチンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞
とを融合して作られたラットプロラクチンに対するモノ
クローナル抗体産生用のハイプリドーマ細胞を要旨とす
るものである。
また、この発明は、上記のハイプリドーマ細胞を培養し
てラットプロラクチンに対するモノクローナル抗体を製
造する方法に関するものである。
てラットプロラクチンに対するモノクローナル抗体を製
造する方法に関するものである。
（各要件の説明）
この発明では、第１表に示したアミノ酸配列から成るラ
ットプロラクチン（以下、これを単に第１ＲＰという）
を用いる。第１ＲＰは、遺伝子の組み換えによって人工
的に作られたＤＮＡを例えば大腸菌内に導入し、その大
腸菌を培養することによって初めて得られるものである
。第１ＲＰは前述のようにラットの体内から得られるラ
ットプロラクチンとは構造を異にしている。ラットの体
内から得られるラットプロラクチンは、第２表に示した
ようなアミノ酸配列を有するものであって、第１ＲＰに
比べると、最初に位置するＭｅｔｓすなわちメチオニン
を欠いている。
ットプロラクチン（以下、これを単に第１ＲＰという）
を用いる。第１ＲＰは、遺伝子の組み換えによって人工
的に作られたＤＮＡを例えば大腸菌内に導入し、その大
腸菌を培養することによって初めて得られるものである
。第１ＲＰは前述のようにラットの体内から得られるラ
ットプロラクチンとは構造を異にしている。ラットの体
内から得られるラットプロラクチンは、第２表に示した
ようなアミノ酸配列を有するものであって、第１ＲＰに
比べると、最初に位置するＭｅｔｓすなわちメチオニン
を欠いている。
第１ＲＰを得る方法は、さきにこの出願人が出願した特
願平２−４４８０４号（以下、これを先願という）の明
細書に開示されている。先願に添付された第２表を見る
と、上から３段目の下段には、 Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
ＧＩｙ−・−−−のアミノ酸配列が見られるが、その配
列は本願の第２表に示したと全く同じであるから、これ
によって先願が第１ＲＰを得るものであることが明らか
である。
願平２−４４８０４号（以下、これを先願という）の明
細書に開示されている。先願に添付された第２表を見る
と、上から３段目の下段には、 Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
ＧＩｙ−・−−−のアミノ酸配列が見られるが、その配
列は本願の第２表に示したと全く同じであるから、これ
によって先願が第１ＲＰを得るものであることが明らか
である。
第１ＲＰで免疫する方法は、公知の方法を踏襲する。す
なわち、例えば８−ＩＱ週令のＢＡＬＥ／ｃマウスの皮
下又は腹腔内に、適当なアジュバント（例えばフロイン
トの完全アジュバント（ｃ ｏｍｐ １ｅｔｅ Ｆｒｅ
ｕｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ））とともに、 第１Ｒ
Ｐ ２０−１００／ｌＦ／匹を投与する。 ２週間後
に、さらに追加免疫を行う。その後２日おいて、血清中
の抗プロラクチン抗体価を、以下に述べるように、固相
法による酵素免疫測定法で調べる。
なわち、例えば８−ＩＱ週令のＢＡＬＥ／ｃマウスの皮
下又は腹腔内に、適当なアジュバント（例えばフロイン
トの完全アジュバント（ｃ ｏｍｐ １ｅｔｅ Ｆｒｅ
ｕｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ））とともに、 第１Ｒ
Ｐ ２０−１００／ｌＦ／匹を投与する。 ２週間後
に、さらに追加免疫を行う。その後２日おいて、血清中
の抗プロラクチン抗体価を、以下に述べるように、固相
法による酵素免疫測定法で調べる。
酵素免疫測定法は次のとおりである。まず、９６穴ＥＩ
Ａ用プレートに５／１２／ｒｎｅになるようにＰＢＳ（
７，２ｍＭリン酸２ナトリウム、２．８ ｍＭリン酸ｌ
ナトリウム、ｐＨ７，２）に溶解したプロラクチンを１
００＃／穴ずつ分注し、室温で１時間放置して抗原を吸
着させた後、ＰＢＳで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ、０
．０５％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ溶液を２００ ｐｔ
ｌ穴ずつ分注し、室温に１時間放置してプレートをコー
トする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＥＳで３回洗浄
後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで適当に希釈
した抗体を１００声ｌ／穴ずつ分注し、室温に１時間放
置する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ Ｐ Ｂ Ｓで
３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ Ｐ Ｂ
Ｓで適当に希釈したペルオキシダーゼ標識２欣抗体をｌ
ｏｏ、ｇｌ／穴ずつ分注し、室温に１時間放置する。０
．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄後、ＯＰ
Ｄ基質液（Ｏ−フェニレンジアミン１０）Ｌｙを２５ｍ
Ｍクエン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム２５ｍ１に溶解
し、過酸化水素１０ｐｌを加えたもの）をＬｏｏｋ／穴
ずつ分注し、室温に３０分放置し、２Ｍ硫酸を５０ｐｌ
／穴ずつ分注して反応を止め、４９２ ｎｍの吸光度を
測定する。
Ａ用プレートに５／１２／ｒｎｅになるようにＰＢＳ（
７，２ｍＭリン酸２ナトリウム、２．８ ｍＭリン酸ｌ
ナトリウム、ｐＨ７，２）に溶解したプロラクチンを１
００＃／穴ずつ分注し、室温で１時間放置して抗原を吸
着させた後、ＰＢＳで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ、０
．０５％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ溶液を２００ ｐｔ
ｌ穴ずつ分注し、室温に１時間放置してプレートをコー
トする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＥＳで３回洗浄
後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで適当に希釈
した抗体を１００声ｌ／穴ずつ分注し、室温に１時間放
置する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ Ｐ Ｂ Ｓで
３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ Ｐ Ｂ
Ｓで適当に希釈したペルオキシダーゼ標識２欣抗体をｌ
ｏｏ、ｇｌ／穴ずつ分注し、室温に１時間放置する。０
．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄後、ＯＰ
Ｄ基質液（Ｏ−フェニレンジアミン１０）Ｌｙを２５ｍ
Ｍクエン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム２５ｍ１に溶解
し、過酸化水素１０ｐｌを加えたもの）をＬｏｏｋ／穴
ずつ分注し、室温に３０分放置し、２Ｍ硫酸を５０ｐｌ
／穴ずつ分注して反応を止め、４９２ ｎｍの吸光度を
測定する。
骨髄腫細胞としては公知のものを用いる。それは例えば
マウスから得られたＰ ３−Ｘ ６３−Ａｇ８−ｕｌ（
Ｐ３−Ｕｌ）（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、 ８１．１．１９７８）や、Ｐ
３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１ 〔ＮＳ−１）（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６，５１１．１９７
６） などの細胞株を用いる。
マウスから得られたＰ ３−Ｘ ６３−Ａｇ８−ｕｌ（
Ｐ３−Ｕｌ）（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、 ８１．１．１９７８）や、Ｐ
３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１ 〔ＮＳ−１）（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６，５１１．１９７
６） などの細胞株を用いる。
これらの細胞株を８−アザグアニンを含む培地で培養し
、細胞融合の２〜３日前に正常培地に戻す。
、細胞融合の２〜３日前に正常培地に戻す。
細胞融合も、公知の方法に従って行う。まず、上述の免
疫したマウスから牌臓を摘出し、脾細胞を調整する。こ
の脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１ニするように混合し、
ポリエチレングリコール等で融合する。細胞融合後、ヒ
ボキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むＨ
ＡＴ培地で培養して、融合細胞を選択する。２〜３日ご
とに培地を交換し、１０−１４日後に細胞の増殖が認め
られた時点で、培地をヒボキサンチン及びアミノプテリ
ンが含まれたＨＴ培地に変える。
疫したマウスから牌臓を摘出し、脾細胞を調整する。こ
の脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１ニするように混合し、
ポリエチレングリコール等で融合する。細胞融合後、ヒ
ボキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むＨ
ＡＴ培地で培養して、融合細胞を選択する。２〜３日ご
とに培地を交換し、１０−１４日後に細胞の増殖が認め
られた時点で、培地をヒボキサンチン及びアミノプテリ
ンが含まれたＨＴ培地に変える。
その後、ハイプリドーマがコロニー状に生育して来たウ
ェルから培養上清を取り、ラットプロラクチンに対する
抗体価を前述の酵素免疫測定法で調べる。抗体価の高い
ウェルの細胞について、限界希釈法によりクローニング
を行い、こうして抗ラットプロラクチンモノクローナル
抗体産生用のハイプリドーマ細胞株を得る。
ェルから培養上清を取り、ラットプロラクチンに対する
抗体価を前述の酵素免疫測定法で調べる。抗体価の高い
ウェルの細胞について、限界希釈法によりクローニング
を行い、こうして抗ラットプロラクチンモノクローナル
抗体産生用のハイプリドーマ細胞株を得る。
この発明に従って、ラットプロラクチンに対するモノク
ローナル抗体を得るには、上で得られたハイプリドーマ
細胞を公知の方法に従って培養し、増殖させることによ
り細胞からの分泌物を集めればよい。培養方法には、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏによる方法と、ｉｎ ｖｉｖｏによ
る方法とがある。
ローナル抗体を得るには、上で得られたハイプリドーマ
細胞を公知の方法に従って培養し、増殖させることによ
り細胞からの分泌物を集めればよい。培養方法には、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏによる方法と、ｉｎ ｖｉｖｏによ
る方法とがある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏによる方法は、牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ １６４０やＤＭＥＭなどの培地に、抗ラット
プロラクチンモノクローナル抗体産生用ハイプリドーマ
を細胞濃度ｌＸｌ０ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ’ 前後にな
るようにして、３７°Ｃ，ＣＯ２インキユベータで培養
する。２．３日培養し細胞数が５−１０倍に増殖したら
、培養液を遠心してモノクローナル抗体を得る。
ＰＭＩ １６４０やＤＭＥＭなどの培地に、抗ラット
プロラクチンモノクローナル抗体産生用ハイプリドーマ
を細胞濃度ｌＸｌ０ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ’ 前後にな
るようにして、３７°Ｃ，ＣＯ２インキユベータで培養
する。２．３日培養し細胞数が５−１０倍に増殖したら
、培養液を遠心してモノクローナル抗体を得る。
ｉｎ ｖｉｖｏによる方法は、プリスタンを投与した
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、上の方法で得られた抗ラットプ
ロラクチンモノクローナル抗体産生用ハイプリドーマ細
胞を２−５Ｘ１０ ｃａｌｌｓ／匹腹腔内に注射し、
１２週間後にモノクローナル抗体を含む腹水を採取する
。この腹水を遠心して固形分を除き、モノクローナル抗
体を得る。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、上の方法で得られた抗ラットプ
ロラクチンモノクローナル抗体産生用ハイプリドーマ細
胞を２−５Ｘ１０ ｃａｌｌｓ／匹腹腔内に注射し、
１２週間後にモノクローナル抗体を含む腹水を採取する
。この腹水を遠心して固形分を除き、モノクローナル抗
体を得る。
純度の高いモノクローナル抗体が必要な場合は、例えば
免疫グロブリンＩｇＧクラスの場合、硫安塩析して沈澱
を集め、これを透析することにより、粗製モノクローナ
ル抗体が得られる。さらに精製するには、ＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム、５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カ
ラムなどにかける。
免疫グロブリンＩｇＧクラスの場合、硫安塩析して沈澱
を集め、これを透析することにより、粗製モノクローナ
ル抗体が得られる。さらに精製するには、ＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム、５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カ
ラムなどにかける。
（発明の効果）
この発明によれば、第１表に示したアミノ酸配列から成
るラットプロラクチンで免疫したマウス脾細胞を用いる
ので、これを骨髄腫細胞に融合させて得られたハイプリ
ドーマ細胞は、ラットプロラクチンに対して特異性の強
いモノクローナル抗体を産生ずる能力を持っている。従
って、このハイプリドーマ細胞は、特異性の強いモノク
ローナル抗体を産生ずる上で有用なものである。
るラットプロラクチンで免疫したマウス脾細胞を用いる
ので、これを骨髄腫細胞に融合させて得られたハイプリ
ドーマ細胞は、ラットプロラクチンに対して特異性の強
いモノクローナル抗体を産生ずる能力を持っている。従
って、このハイプリドーマ細胞は、特異性の強いモノク
ローナル抗体を産生ずる上で有用なものである。
また、この発明によれば、上述のハイプリドーマ細胞を
培養してモノクローナル抗体を得る方法が提供されるの
で、これによってラットプロラクチンラクチンに対する
特異性の強いモノクローナル抗体を得ることができる。
培養してモノクローナル抗体を得る方法が提供されるの
で、これによってラットプロラクチンラクチンに対する
特異性の強いモノクローナル抗体を得ることができる。
従って、ラフトプロラクチンを検出する上において有用
である。
である。
以下に実施例を述べて、この発明のすぐれている所以を
説明する。
説明する。
実施例１
この実施例では、以下に述べるようにして、抗ラフトプ
ロラクチンモノクローナル抗体産生用のハイプリドーマ
細胞株を得た。
ロラクチンモノクローナル抗体産生用のハイプリドーマ
細胞株を得た。
１） 免疫マウス脾細胞の調整
第１表に示したラフトプロラクチンは、先願（特願平２
−４４８０４号）の教示に従って調整した。こうして得
たラフトプロラクチンをフロイントの完全アジュバント
とともに、８週令（７）［ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下投
与した。その２週間後に、さらにフロイントの不完全ア
ジュバントとともに、また第１表に示したラフトプロラ
クチン１００尾を皮下投与した。その３週間後に、さら
に第１表に示したラットプロラクチン１００＋ｇを静脈
内に投与した。
−４４８０４号）の教示に従って調整した。こうして得
たラフトプロラクチンをフロイントの完全アジュバント
とともに、８週令（７）［ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下投
与した。その２週間後に、さらにフロイントの不完全ア
ジュバントとともに、また第１表に示したラフトプロラ
クチン１００尾を皮下投与した。その３週間後に、さら
に第１表に示したラットプロラクチン１００＋ｇを静脈
内に投与した。
その後、２日おいてマウス血清中のラットプロラクチン
に対する抗体価を前述の酵素免疫測定法で調べ、抗体価
が充分高くなっていることを確認した。
に対する抗体価を前述の酵素免疫測定法で調べ、抗体価
が充分高くなっていることを確認した。
その後１日おいて、マウスから脾細胞を摘出した。摘出
した脾細胞をスライドガラスですり潰し、ステンレスメ
ツシュを通して単細胞にし、Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ７，２）で赤血球を熔解し、その後ＨＡＮＫＳ熔
液（日永製薬社製）で洗浄した。
した脾細胞をスライドガラスですり潰し、ステンレスメ
ツシュを通して単細胞にし、Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ７，２）で赤血球を熔解し、その後ＨＡＮＫＳ熔
液（日永製薬社製）で洗浄した。
２） マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｕｌ）の調整８−アザ
グアニン耐性マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｕｌ）を増殖培
地（ＲＰＭ［１６４０（日永製薬社製）にＮａＨＣＯ３
２ｇ／ ｉ！、、ピルビン酸ナトリウム０．１１ｇ／Ｃ
ペニシリン３１．２５５ｇ／ｊ！、ストレプトマイシン
５０．０■ｇ／ｌ、ゲンタマイシン１５４． Ｏｍｇ／
ｆ、２−メルカプトエタノール２．５Ｘ１０−’Ｍ及
び牛胎児血清１０．０％を加えた培地］で培養しく３７
°Ｃ，ＣＯ□インキュベーター）、ＨＡＮＫＳ溶液で洗
浄して、マウス骨髄腫細胞を得た。
グアニン耐性マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｕｌ）を増殖培
地（ＲＰＭ［１６４０（日永製薬社製）にＮａＨＣＯ３
２ｇ／ ｉ！、、ピルビン酸ナトリウム０．１１ｇ／Ｃ
ペニシリン３１．２５５ｇ／ｊ！、ストレプトマイシン
５０．０■ｇ／ｌ、ゲンタマイシン１５４． Ｏｍｇ／
ｆ、２−メルカプトエタノール２．５Ｘ１０−’Ｍ及
び牛胎児血清１０．０％を加えた培地］で培養しく３７
°Ｃ，ＣＯ□インキュベーター）、ＨＡＮＫＳ溶液で洗
浄して、マウス骨髄腫細胞を得た。
３） ハイプリドーマの作製
上で得た免疫マウス脾細胞ｌＸｌ０”個とマウス骨髄腫
細胞ｌＸｌ０’個とを混合し、１５００ｒｐｍで５分間
遠心分離を行い、上清を除いた。
細胞ｌＸｌ０’個とを混合し、１５００ｒｐｍで５分間
遠心分離を行い、上清を除いた。
沈澱として得られた免疫マウス脾細胞とマウス骨髄腫細
胞との混合物の塊をよく解きほぐした後、４５％ポリエ
チレングリコール１ｉを１分間にわたって徐々に加え、
よく混合した。その後ＨＡＮＫＳ溶液２０ｄを５分間に
わたって徐々に添加し、１５００ｒｐ＋ｓで５分間遠心
分離して上清を除き、細胞濃度が５Ｘ１０’個／ｄにな
るように増殖培地を加え細胞を懸濁した。
胞との混合物の塊をよく解きほぐした後、４５％ポリエ
チレングリコール１ｉを１分間にわたって徐々に加え、
よく混合した。その後ＨＡＮＫＳ溶液２０ｄを５分間に
わたって徐々に添加し、１５００ｒｐ＋ｓで５分間遠心
分離して上清を除き、細胞濃度が５Ｘ１０’個／ｄにな
るように増殖培地を加え細胞を懸濁した。
９６穴培養用プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に２００μ
ｉ／穴ずつ分注し、培養（３７°Ｃ，ＣＯｚインキュベ
ーター）した、１日後及び３日後に、何れも培養液１０
０μｌを各ウェルから捨て、ＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’
Ｍのヒポキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍのアミノプテリン
、１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含む増殖培地）を１
００ｐ１加えた。２日後に、培養液１００ ｐｉを各ウ
ェルから捨て、ＨＴ培地（ＩＸｌｏ−’Ｍのヒポキサン
チン、１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含む増殖培地）
を１００μ！加えた。２日後に、培養液１００ ｐｆを
各ウェルから捨て、増殖培地を１００ａｆｆｉ加えた。
ｉ／穴ずつ分注し、培養（３７°Ｃ，ＣＯｚインキュベ
ーター）した、１日後及び３日後に、何れも培養液１０
０μｌを各ウェルから捨て、ＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’
Ｍのヒポキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍのアミノプテリン
、１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含む増殖培地）を１
００ｐ１加えた。２日後に、培養液１００ ｐｉを各ウ
ェルから捨て、ＨＴ培地（ＩＸｌｏ−’Ｍのヒポキサン
チン、１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含む増殖培地）
を１００μ！加えた。２日後に、培養液１００ ｐｆを
各ウェルから捨て、増殖培地を１００ａｆｆｉ加えた。
こうして、ハイプリドーマ細胞を得た。
３日後に、培地上清のラフトプロラクチンに対する抗体
価を、前述の酵素免疫測定法により調べた。抗体を産生
ずるハイプリドーマ細胞を含むウェルの細胞を限界希釈
法により２回クローニングし、抗ラットプロラクチンモ
ノクローナル抗体産生ハイプリドーマ細胞として、二種
の細胞株１８３Ｂ及び５４１Ｂを得た。
価を、前述の酵素免疫測定法により調べた。抗体を産生
ずるハイプリドーマ細胞を含むウェルの細胞を限界希釈
法により２回クローニングし、抗ラットプロラクチンモ
ノクローナル抗体産生ハイプリドーマ細胞として、二種
の細胞株１８３Ｂ及び５４１Ｂを得た。
実施例２
この実施例では、実施例１で得たモノクローナル抗体の
性質を次のようにして確認した。
性質を次のようにして確認した。
マウスイムノグロブリンの各タイプ（ＩｇＡ、１ｇＭ、
Ｉ ｇＧ＋ 、 ｒ ｇＧ！ａ、 ｒ ｇＧｚｂ、
Ｉ ｇＧｉ）に特有なペルオキシダーゼ標識第２抗
体（Ｚｙｍｅｔ社製）を用いる酵素免疫法によりアイソ
タイプを調べた。その結果、１８３Ｂ及び５４１Ｂは何
れもＩｇＧ、であることがわかった。
Ｉ ｇＧ＋ 、 ｒ ｇＧ！ａ、 ｒ ｇＧｚｂ、
Ｉ ｇＧｉ）に特有なペルオキシダーゼ標識第２抗
体（Ｚｙｍｅｔ社製）を用いる酵素免疫法によりアイソ
タイプを調べた。その結果、１８３Ｂ及び５４１Ｂは何
れもＩｇＧ、であることがわかった。
実施例３
この実施例では、得られたモノクローナル抗体の抗原特
異性を調べた。
異性を調べた。
測定は、前述の固相法による酵素免疫測定法により行っ
た。抗原としては、特開平２−４４５号公報記載の方法
によって大腸菌によって作られたヒトプロラクチン（ｒ
ｈＰＲＬ）、ラフトプラクチン（ｒｒＰＲＬ）、マウス
プロラクチン（ｒｍＰＲＬ） （以上、敷島紡績社製）
天然型ヒトプロラクチン（ｈＰＩＩＬ）（ＣＡＬＢＩＯ
Ｃｈｅｍ社製）及び天然型ヒツジプロラクチン（ｏＰＲ
Ｌ） （Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ社製）を用いた。
た。抗原としては、特開平２−４４５号公報記載の方法
によって大腸菌によって作られたヒトプロラクチン（ｒ
ｈＰＲＬ）、ラフトプラクチン（ｒｒＰＲＬ）、マウス
プロラクチン（ｒｍＰＲＬ） （以上、敷島紡績社製）
天然型ヒトプロラクチン（ｈＰＩＩＬ）（ＣＡＬＢＩＯ
Ｃｈｅｍ社製）及び天然型ヒツジプロラクチン（ｏＰＲ
Ｌ） （Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ社製）を用いた。
抗体としては、この発明によって作られたモノクローナ
ル抗体、ヒトプロラクチン抗血清（オリエンタル酵母社
製）及びラフトプロラクチン抗血清（ＵＣＢ Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた。なお、ヒトプロラク
チン抗血清と、ラットプロラクチン抗血清とはポリクロ
ーナル抗体である。
ル抗体、ヒトプロラクチン抗血清（オリエンタル酵母社
製）及びラフトプロラクチン抗血清（ＵＣＢ Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた。なお、ヒトプロラク
チン抗血清と、ラットプロラクチン抗血清とはポリクロ
ーナル抗体である。
その結果は、下記第３表に示すとおりであワた。
ここで、＋は陽性、すなわち反応することを示し、は陰
性、すなわち反応しないことを示している。
性、すなわち反応しないことを示している。
第１表により、この発明によって得られた１８３゜Ｂ及
び５４１Ｂの何れも、他の抗血清に比べて、抗原特異性
にすぐれていることが判明する。
び５４１Ｂの何れも、他の抗血清に比べて、抗原特異性
にすぐれていることが判明する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、第１表に示したアミノ酸配列から成るラットプロラ
クチンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞とを融合
して作られたラットプロラクチンに対するモノクローナ
ル抗体産生用のハイプリドーマ細胞。 ２、第１表に示すアミノ酸配列から成るラットプロラク
チンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞とを融合し
て作られたハイプリドーマ細胞を培養することを特徴と
する、ラットプロラクチンに対するモノクローナル抗体
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2174664A JPH0463590A (ja) | 1990-07-02 | 1990-07-02 | ラツトプロラクチンに対するモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞、及びモノクローナル抗体の産生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2174664A JPH0463590A (ja) | 1990-07-02 | 1990-07-02 | ラツトプロラクチンに対するモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞、及びモノクローナル抗体の産生方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0463590A true JPH0463590A (ja) | 1992-02-28 |
Family
ID=15982540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2174664A Pending JPH0463590A (ja) | 1990-07-02 | 1990-07-02 | ラツトプロラクチンに対するモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞、及びモノクローナル抗体の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0463590A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116338212A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-06-27 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 一种抗大熊猫prl单克隆抗体、杂交瘤细胞株及prl酶联免疫检测方法 |
-
1990
- 1990-07-02 JP JP2174664A patent/JPH0463590A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116338212A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-06-27 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 一种抗大熊猫prl单克隆抗体、杂交瘤细胞株及prl酶联免疫检测方法 |
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