JPH07126293A - ｈｓｔ−２ムテイン、その製造法および用途 - Google Patents
ｈｓｔ−２ムテイン、その製造法および用途Info
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- JPH07126293A JPH07126293A JP6016219A JP1621994A JPH07126293A JP H07126293 A JPH07126293 A JP H07126293A JP 6016219 A JP6016219 A JP 6016219A JP 1621994 A JP1621994 A JP 1621994A JP H07126293 A JPH07126293 A JP H07126293A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ヘパリン・バインディング・セレクトリー・ト
ランスフォーミング・ファクター２（hst−２）活性を
有するポリペプチド（hst−２ポリペプチド）の提供。 【構成】hst−２ポリペプチド、特にhst−２のＮ末端か
ら３８〜６３個のアミノ酸が欠失したポリペプチド、そ
れをコードする組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡを含
有するベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体
の作製、該形質転換体によるhst−２ポリペプチドの産
生およびhst−２ポリペプチドの血小板増加剤としての
利用。 【効果】本hst−２ポリペプチドは、大量生産が可能で
あり、かつhst−２の活性を保持しているので、火傷，
創傷などの治癒促進剤や消化管潰瘍症の治療薬として有
利に利用できる。また、血小板増加剤として利用でき
る。
ランスフォーミング・ファクター２（hst−２）活性を
有するポリペプチド（hst−２ポリペプチド）の提供。 【構成】hst−２ポリペプチド、特にhst−２のＮ末端か
ら３８〜６３個のアミノ酸が欠失したポリペプチド、そ
れをコードする組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡを含
有するベクターおよび該ベクターを保持する形質転換体
の作製、該形質転換体によるhst−２ポリペプチドの産
生およびhst−２ポリペプチドの血小板増加剤としての
利用。 【効果】本hst−２ポリペプチドは、大量生産が可能で
あり、かつhst−２の活性を保持しているので、火傷，
創傷などの治癒促進剤や消化管潰瘍症の治療薬として有
利に利用できる。また、血小板増加剤として利用でき
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞の増殖促進等
の活性を有するヘパリンバインディング・セクレトリー
・トランスフォーミング・ファクター２(以下、本明細
書においては「hst−２」と略称することもある。)ポリ
ペプチド、それをコードする組換えＤＮＡ，および該ポ
リペプチドを製造する方法およびその用途に関する。本
発明はまたhst−２を含有する血小板増加剤に関する。
の活性を有するヘパリンバインディング・セクレトリー
・トランスフォーミング・ファクター２(以下、本明細
書においては「hst−２」と略称することもある。)ポリ
ペプチド、それをコードする組換えＤＮＡ，および該ポ
リペプチドを製造する方法およびその用途に関する。本
発明はまたhst−２を含有する血小板増加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘパリン結合性成長因子（Heparin-bind
ing growth factor）（HBGF)ファミリーに属する細胞成
長因子群は、相互にアミノ酸配列上で相同性を示すとと
もに、強いヘパリン結合性を有することを共通の特徴と
する。このファミリーに属する細胞成長因子には酸性お
よび塩基性線維芽細胞成長因子(aFGFおよびbFGF)、hst
−１、ＩＮＴ２、ＦＧＦ５、およびケラチノサイト成長
因子（keratinocyte growth factor）(KGF)がある。こ
の中でＦＧＦはさまざまな細胞に対して活性を有してお
り、特に中胚葉系の細胞に対し増殖促進および分化促進
活性を有していることが報告され〔Gospodarowicz ら、
ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J. Cel
l. Physiol.）、補遺（supplt.），第５巻,第１５頁
（１９８７年)〕、創傷治癒や、虚血後の心筋や神経組
織の修復を促進するものとして応用研究が進められてい
る。
ing growth factor）（HBGF)ファミリーに属する細胞成
長因子群は、相互にアミノ酸配列上で相同性を示すとと
もに、強いヘパリン結合性を有することを共通の特徴と
する。このファミリーに属する細胞成長因子には酸性お
よび塩基性線維芽細胞成長因子(aFGFおよびbFGF)、hst
−１、ＩＮＴ２、ＦＧＦ５、およびケラチノサイト成長
因子（keratinocyte growth factor）(KGF)がある。こ
の中でＦＧＦはさまざまな細胞に対して活性を有してお
り、特に中胚葉系の細胞に対し増殖促進および分化促進
活性を有していることが報告され〔Gospodarowicz ら、
ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J. Cel
l. Physiol.）、補遺（supplt.），第５巻,第１５頁
（１９８７年)〕、創傷治癒や、虚血後の心筋や神経組
織の修復を促進するものとして応用研究が進められてい
る。
【０００３】hst−１遺伝子はフォーカス形成法によっ
て同定されたトランスフォーミング遺伝子であり、その
産物はＦＧＦと同様に細胞増殖促進活性、ならびにin v
ivoにおける血管新生の誘導活性を有する〔特開平３−
２１８３９８号公報、ヨーロッパ特許公開４２１４５５
号〕。hst−２遺伝子はＤＮＡブロットハイブリダイゼ
ーション法でhst−１遺伝子に高い相同性を有する遺伝
子として見出された〔Sakamotoら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ン（Biochem. Biophys. Res. Commun.），第１５１巻，
第９６５頁 (１９８８年)〕。この遺伝子はまたＦＧＦ
６遺伝子として報告されていた〔MaricusI. ら、オン
コジーン（Oncogene)，６（４），１４３３（１９９
１）〕。ＦＧＦ６遺伝子はＡＴＧコドン枠を３個持って
おり、これらは１７５，１９８及び２０８残基の３種の
ペプチドの翻訳を開始することができる。また本発明者
等は、hst−２遺伝子を導入した線維芽細胞がヌードマ
ウス上で腫瘤を形成するため、実際に生物学的活性を有
しており、hst−２はＨＳＴファミリーに属する新しい
増殖因子であると考えた〔Naitoら、ジャパン・ジャー
ナル・オブ・キャンサー・リサーチ・アブストラクト
（Jpn. J. Cancer Res. Abstr.），５００ (１９８９
年)〕。したがってhst−２遺伝子産物も創傷治癒や心虚
血後の心筋および脳虚血後の神経組織の修復を促進する
ものとして医薬に応用できるものと考えられ期待されて
いる。
て同定されたトランスフォーミング遺伝子であり、その
産物はＦＧＦと同様に細胞増殖促進活性、ならびにin v
ivoにおける血管新生の誘導活性を有する〔特開平３−
２１８３９８号公報、ヨーロッパ特許公開４２１４５５
号〕。hst−２遺伝子はＤＮＡブロットハイブリダイゼ
ーション法でhst−１遺伝子に高い相同性を有する遺伝
子として見出された〔Sakamotoら、バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ン（Biochem. Biophys. Res. Commun.），第１５１巻，
第９６５頁 (１９８８年)〕。この遺伝子はまたＦＧＦ
６遺伝子として報告されていた〔MaricusI. ら、オン
コジーン（Oncogene)，６（４），１４３３（１９９
１）〕。ＦＧＦ６遺伝子はＡＴＧコドン枠を３個持って
おり、これらは１７５，１９８及び２０８残基の３種の
ペプチドの翻訳を開始することができる。また本発明者
等は、hst−２遺伝子を導入した線維芽細胞がヌードマ
ウス上で腫瘤を形成するため、実際に生物学的活性を有
しており、hst−２はＨＳＴファミリーに属する新しい
増殖因子であると考えた〔Naitoら、ジャパン・ジャー
ナル・オブ・キャンサー・リサーチ・アブストラクト
（Jpn. J. Cancer Res. Abstr.），５００ (１９８９
年)〕。したがってhst−２遺伝子産物も創傷治癒や心虚
血後の心筋および脳虚血後の神経組織の修復を促進する
ものとして医薬に応用できるものと考えられ期待されて
いる。
【０００４】hst−２蛋白質の研究を進めるためには、
該蛋白質を大量にしかも高純度で得ることが必要である
が、これら動物細胞の増殖促進作用を有する上記蛋白質
が局在していると考えられる筋肉、精巣〔de Lapeyrier
e ら、オンコジーン（Oncogene）第５巻，第８２３頁
(１９９０年)〕あるいは該ペプチドを産生していると思
われる白血病細胞株ＨＥＬ〔Martin と Papayannoponlo
u、サイエンス（Science）第２１６巻，第１２２３頁
(１９８２年)〕ＣＭＫ〔Satoら、ブリティッシュジャー
ナル オブ ヘマトロジー（Britishi Journal of Hema
tology），第７２巻，第１８４頁(１９８９年)〕からの
該蛋白質の単離、精製といった方法は複雑で、また目的
とする蛋白質も少量しか得られないという問題がある。
このためhst−２蛋白質を大量にしかも高純度で得る方
法が渇望されていた。hst−２遺伝子については、その
塩基配列が最近報告されており〔S. Iida ら,オンコジ
ーン（Oncogene）第７巻、第３０３頁(１９９２)および
ヨーロッパ特許出願公開第４２１４５５号公報〕同報告
にはこれから推測されるhst−２の構成アミノ酸も示さ
れているが、hst−２の遺伝子組換え技術を用いた産生
法については報告されていなかった。
該蛋白質を大量にしかも高純度で得ることが必要である
が、これら動物細胞の増殖促進作用を有する上記蛋白質
が局在していると考えられる筋肉、精巣〔de Lapeyrier
e ら、オンコジーン（Oncogene）第５巻，第８２３頁
(１９９０年)〕あるいは該ペプチドを産生していると思
われる白血病細胞株ＨＥＬ〔Martin と Papayannoponlo
u、サイエンス（Science）第２１６巻，第１２２３頁
(１９８２年)〕ＣＭＫ〔Satoら、ブリティッシュジャー
ナル オブ ヘマトロジー（Britishi Journal of Hema
tology），第７２巻，第１８４頁(１９８９年)〕からの
該蛋白質の単離、精製といった方法は複雑で、また目的
とする蛋白質も少量しか得られないという問題がある。
このためhst−２蛋白質を大量にしかも高純度で得る方
法が渇望されていた。hst−２遺伝子については、その
塩基配列が最近報告されており〔S. Iida ら,オンコジ
ーン（Oncogene）第７巻、第３０３頁(１９９２)および
ヨーロッパ特許出願公開第４２１４５５号公報〕同報告
にはこれから推測されるhst−２の構成アミノ酸も示さ
れているが、hst−２の遺伝子組換え技術を用いた産生
法については報告されていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のようにhst−２
の性質、生物活性については研究すべき点も残されてい
るが、医薬品あるいは試薬としての応用が期待されてい
る。しかしながら、上記したように、これまで十分な量
のhst−２を得ることができず、研究開発に支障をきた
していた。そこで本発明者らは組換えＤＮＡ技術を用
い、このhst−２をその活性に悪影響を及ぼさず、しか
も微生物学的に大量生産できるように改変することを考
えた。このような改変により、上記した細胞における産
生能の上昇のみならずhst−２の安定性，分子当りの細
胞増殖活性の上昇、さらに未知の生物活性の賦活化がな
される可能性もあると考えられる。
の性質、生物活性については研究すべき点も残されてい
るが、医薬品あるいは試薬としての応用が期待されてい
る。しかしながら、上記したように、これまで十分な量
のhst−２を得ることができず、研究開発に支障をきた
していた。そこで本発明者らは組換えＤＮＡ技術を用
い、このhst−２をその活性に悪影響を及ぼさず、しか
も微生物学的に大量生産できるように改変することを考
えた。このような改変により、上記した細胞における産
生能の上昇のみならずhst−２の安定性，分子当りの細
胞増殖活性の上昇、さらに未知の生物活性の賦活化がな
される可能性もあると考えられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、組換えＤ
ＮＡ技術により、hst−２遺伝子の一部を欠失したムテ
イン遺伝子を作製し、微生物中で発現させることによ
り、この hst−２の細胞内での産生能、活性の上昇およ
び生物活性の変化につき鋭意研究し、これらの目的に叶
うポリペプチドを見出した。さらにこれらの知見に基づ
いて研究した結果、本発明を完成した。本発明は、
（１）次のアミノ酸配列で表されるポリペプチド： (Met)n X Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 X は Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：１、ｎ＝１：配列番号：２〕又はその断片を
表す。）（以下、ポリペプチド（Ｉ）と略称することが
ある）、（２） X が Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn As
n Thr Leu Leu Asp Ser Arg GlyTrp Gly Thr Leu Leu S
er Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly を表す（１）記
載のポリペプチド〔ｎ＝０：配列番号：１、ｎ＝１：配
列番号：２〕、（３） X Gly を表す請求項１記載のポ
リペプチド〔ｎ＝０：配列番号：３、ｎ＝１：配列番
号：４〕、（４）配列番号：１のアミノ酸配列を有する
（１）記載のポリペプチド、（５）配列番号：３のアミ
ノ酸配列を有する（１）記載のポリペプチド、（６）ポ
リペプチドがヘパリンバインディング・セクレトリー・
トランスフォーミング・ファクター２(hst−２）活性を
有するポリペプチドである（１）記載のポリペプチド、
（７）ポリペプチドが（１）、（２）、（３）、
（４）、（５）又は（６）記載のポリペプチドをコード
する組換えＤＮＡ、（８）（７）記載の組換えＤＮＡを
含むベクター、（９）（８）記載のベクターを保持する
形質転換体、（１０）（９）記載の形質転換体を培地に
培養し、培養物中に次のアミノ酸配列で表されるポリペ
プチド： (Met)n X Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 X は Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：１、ｎ＝１：配列番号：２〕又はその断片を
表す。）を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする上記ポリペプチドの製造法、（１１）ヘパリンバ
インディング・セクレトリー・トランスフォーミング・
ファクター２(hst−２）活性を有するポリペプチドを含
有することを特徴とする血小板増加促進用組成物、（１
２）ポリペプチドが次のアミノ酸配列： (Met)n Y Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 Y は Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe Ile Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly Ile Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：配列番号：５、ｎ＝１：配列番号：６〕又は
その断片を表すものである、（１１）記載の製造法、
（１３） Y が Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg
Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Th
r Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：配列番
号：７、ｎ＝１：配列番号：８〕又はその断片を表すも
のである、（１２）記載の組成物、（１４）ポリペプチ
ドが（１）、（２）、（３）、（４）、（５）又は
（６）記載のポリペプチドである、（１１）記載の組成
物、（１５）他の生理活性成分を更に含有する、（１
１）記載の組成物、（１６）他の生理活性成分が抗腫瘍
剤である、（１５）記載の組成物、および（１７）
（１）、（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）記
載のポリペプチドと抗腫瘍剤との薬剤調製物を組み合わ
せてなる血小板増加促進用キット、に関するものであ
る。
ＮＡ技術により、hst−２遺伝子の一部を欠失したムテ
イン遺伝子を作製し、微生物中で発現させることによ
り、この hst−２の細胞内での産生能、活性の上昇およ
び生物活性の変化につき鋭意研究し、これらの目的に叶
うポリペプチドを見出した。さらにこれらの知見に基づ
いて研究した結果、本発明を完成した。本発明は、
（１）次のアミノ酸配列で表されるポリペプチド： (Met)n X Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 X は Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：１、ｎ＝１：配列番号：２〕又はその断片を
表す。）（以下、ポリペプチド（Ｉ）と略称することが
ある）、（２） X が Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn As
n Thr Leu Leu Asp Ser Arg GlyTrp Gly Thr Leu Leu S
er Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly を表す（１）記
載のポリペプチド〔ｎ＝０：配列番号：１、ｎ＝１：配
列番号：２〕、（３） X Gly を表す請求項１記載のポ
リペプチド〔ｎ＝０：配列番号：３、ｎ＝１：配列番
号：４〕、（４）配列番号：１のアミノ酸配列を有する
（１）記載のポリペプチド、（５）配列番号：３のアミ
ノ酸配列を有する（１）記載のポリペプチド、（６）ポ
リペプチドがヘパリンバインディング・セクレトリー・
トランスフォーミング・ファクター２(hst−２）活性を
有するポリペプチドである（１）記載のポリペプチド、
（７）ポリペプチドが（１）、（２）、（３）、
（４）、（５）又は（６）記載のポリペプチドをコード
する組換えＤＮＡ、（８）（７）記載の組換えＤＮＡを
含むベクター、（９）（８）記載のベクターを保持する
形質転換体、（１０）（９）記載の形質転換体を培地に
培養し、培養物中に次のアミノ酸配列で表されるポリペ
プチド： (Met)n X Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 X は Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：１、ｎ＝１：配列番号：２〕又はその断片を
表す。）を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする上記ポリペプチドの製造法、（１１）ヘパリンバ
インディング・セクレトリー・トランスフォーミング・
ファクター２(hst−２）活性を有するポリペプチドを含
有することを特徴とする血小板増加促進用組成物、（１
２）ポリペプチドが次のアミノ酸配列： (Met)n Y Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 Y は Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe Ile Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly Ile Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：配列番号：５、ｎ＝１：配列番号：６〕又は
その断片を表すものである、（１１）記載の製造法、
（１３） Y が Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg
Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Th
r Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：配列番
号：７、ｎ＝１：配列番号：８〕又はその断片を表すも
のである、（１２）記載の組成物、（１４）ポリペプチ
ドが（１）、（２）、（３）、（４）、（５）又は
（６）記載のポリペプチドである、（１１）記載の組成
物、（１５）他の生理活性成分を更に含有する、（１
１）記載の組成物、（１６）他の生理活性成分が抗腫瘍
剤である、（１５）記載の組成物、および（１７）
（１）、（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）記
載のポリペプチドと抗腫瘍剤との薬剤調製物を組み合わ
せてなる血小板増加促進用キット、に関するものであ
る。
【０００７】hst−２は、〔図１〕に示されたＮ末端の
開始コドンに対応するＭetをアミノ酸残基番号１とする
２０８個のアミノ酸配列（配列番号：６）を全分子とす
る蛋白質であり、本明細書においてhst−２の構成アミ
ノ酸をアミノ酸残基番号で示す場合はこの配列のアミノ
酸残基番号に準ずる（ヨーロッパ特許出願第４８８１９
６号公報）〔配列番号：６〕。本明細書における「hst
−２ポリペプチド」はhst−２活性を有するポリペプチ
ドの総称である。このポリペプチドは配列番号：６のポ
リペプチドおよびその断片を包含するものである。本発
明のポリペプチド（Ｉ）としては、Ｘで表わされる部分
配列のアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも１個のアミ
ノ酸を有し、かつhst−２活性を有するものが挙げられ
る。ＸがＣ−末端アミノ酸残基Ｇｌｙのみの場合を包含
する。その中でもそのアミノ酸配列のＮ末端から１〜２
５の連続したアミノ酸が欠失しているものが好ましい。
一方、血小板増加促進法に用いられるhst−２活性を有
するポリペプチド（hst−２ポリペプチド）はhst−２活
性を有する限り、どのようなポリペプチドでもよい。中
でもＮ−末端欠失ムテイン類、特にＮ末３８〜６３アミ
ノ酸残基を欠失している本発明ポリペプチドが好まし
い。しかしながら、そのポリペプチドがhst−２活性を
有する限り、hst−２の中央部分あるいはカルボキシル
末端側が欠失したものであってもよい。
開始コドンに対応するＭetをアミノ酸残基番号１とする
２０８個のアミノ酸配列（配列番号：６）を全分子とす
る蛋白質であり、本明細書においてhst−２の構成アミ
ノ酸をアミノ酸残基番号で示す場合はこの配列のアミノ
酸残基番号に準ずる（ヨーロッパ特許出願第４８８１９
６号公報）〔配列番号：６〕。本明細書における「hst
−２ポリペプチド」はhst−２活性を有するポリペプチ
ドの総称である。このポリペプチドは配列番号：６のポ
リペプチドおよびその断片を包含するものである。本発
明のポリペプチド（Ｉ）としては、Ｘで表わされる部分
配列のアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも１個のアミ
ノ酸を有し、かつhst−２活性を有するものが挙げられ
る。ＸがＣ−末端アミノ酸残基Ｇｌｙのみの場合を包含
する。その中でもそのアミノ酸配列のＮ末端から１〜２
５の連続したアミノ酸が欠失しているものが好ましい。
一方、血小板増加促進法に用いられるhst−２活性を有
するポリペプチド（hst−２ポリペプチド）はhst−２活
性を有する限り、どのようなポリペプチドでもよい。中
でもＮ−末端欠失ムテイン類、特にＮ末３８〜６３アミ
ノ酸残基を欠失している本発明ポリペプチドが好まし
い。しかしながら、そのポリペプチドがhst−２活性を
有する限り、hst−２の中央部分あるいはカルボキシル
末端側が欠失したものであってもよい。
【０００８】本発明のポリペプチド（Ｉ）を包含するhs
t−２ポリペプチドの化学構造は例えば、製造，精製段
階での操作、試薬などの種々の要因に負うことがある。
たとえば、本発明のhst−２ポリペプチドは無機酸との
塩（例、塩酸塩，リン酸塩)、有機酸との塩(例、酢酸
塩、トリフルオロ酢酸塩)、塩基との塩(例、ナトリウム
塩，カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩，
マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウ
ム塩)などの塩として得られることもあるが、本発明は
これらの塩を包含する。さらに、本発明hst−２ポリペ
プチドは、糖鎖，脂質，アセチル基などが付加した誘導
体となっていてもよい。このように本発明のhst−２ポ
リペプチドは、上述のような塩または誘導体となってい
てもよく、hst−２活性を有するポリペプチドあるいは
生体内で容易に活性型に転じるものであれば、本発明の
ポリペプチドに含まれる。
t−２ポリペプチドの化学構造は例えば、製造，精製段
階での操作、試薬などの種々の要因に負うことがある。
たとえば、本発明のhst−２ポリペプチドは無機酸との
塩（例、塩酸塩，リン酸塩)、有機酸との塩(例、酢酸
塩、トリフルオロ酢酸塩)、塩基との塩(例、ナトリウム
塩，カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩，
マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウ
ム塩)などの塩として得られることもあるが、本発明は
これらの塩を包含する。さらに、本発明hst−２ポリペ
プチドは、糖鎖，脂質，アセチル基などが付加した誘導
体となっていてもよい。このように本発明のhst−２ポ
リペプチドは、上述のような塩または誘導体となってい
てもよく、hst−２活性を有するポリペプチドあるいは
生体内で容易に活性型に転じるものであれば、本発明の
ポリペプチドに含まれる。
【０００９】本発明のhst−２ポリペプチドの生物活性
の測定は、たとえば、佐々田らの方法〔モレキュラー
セル バイオロジー(Mol. Cell Biol.）第８巻、第５８
８−５９４頁(１９８８年)〕に従い、マウスＢＡＬＢ／
c３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起をトリチウムチミジン
（〔3Ｈ〕チミジン）の取り込みを指標として測定する
ことにより、多田らの方法〔ジャーナル オブ イムノ
ロジカル メソッズ（Journal of Immunological Metho
ds），第９３巻、第１５７頁(１９８６年)〕に従い、血
管内皮細胞の増殖促進を測定することにより、または A
uerbach らの方法〔デベロップメンタル バイオロジー
（Developmental Biology)，第４１巻、第３９１頁(１
９７４年)〕に従い、ニワトリ胚漿尿膜上の血管新生を
測定することにより、行なうことができる。
の測定は、たとえば、佐々田らの方法〔モレキュラー
セル バイオロジー(Mol. Cell Biol.）第８巻、第５８
８−５９４頁(１９８８年)〕に従い、マウスＢＡＬＢ／
c３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起をトリチウムチミジン
（〔3Ｈ〕チミジン）の取り込みを指標として測定する
ことにより、多田らの方法〔ジャーナル オブ イムノ
ロジカル メソッズ（Journal of Immunological Metho
ds），第９３巻、第１５７頁(１９８６年)〕に従い、血
管内皮細胞の増殖促進を測定することにより、または A
uerbach らの方法〔デベロップメンタル バイオロジー
（Developmental Biology)，第４１巻、第３９１頁(１
９７４年)〕に従い、ニワトリ胚漿尿膜上の血管新生を
測定することにより、行なうことができる。
【００１０】本発明のhst−２ポリペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベクター
は、例えば、(イ)hst−２蛋白質をコードするＲＮＡを
分離し、(ロ)該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ(cＤＮＡ)
を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、(ハ)該相補ＤＮＡを
プラスミドに組み込み、(ニ)得られた組み換えプラスミ
ドで宿主を形質転換し、(ホ)得られた形質転換体を培養
後、形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法、により目
的とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、(ヘ)そ
のプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出
し、(ト)該クローン化ＤＮＡ上に目的に叶う欠失を生じ
させ、(チ)場合によりＡＴＧコドンを含むオリゴヌクレ
オチドを結合させ、(リ)該ＤＮＡをビークル中のプロモ
ーターの下流に連結する、ことにより製造することがで
きる。
る塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベクター
は、例えば、(イ)hst−２蛋白質をコードするＲＮＡを
分離し、(ロ)該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ(cＤＮＡ)
を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、(ハ)該相補ＤＮＡを
プラスミドに組み込み、(ニ)得られた組み換えプラスミ
ドで宿主を形質転換し、(ホ)得られた形質転換体を培養
後、形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法、により目
的とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、(ヘ)そ
のプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出
し、(ト)該クローン化ＤＮＡ上に目的に叶う欠失を生じ
させ、(チ)場合によりＡＴＧコドンを含むオリゴヌクレ
オチドを結合させ、(リ)該ＤＮＡをビークル中のプロモ
ーターの下流に連結する、ことにより製造することがで
きる。
【００１１】上記のhst−２をコードするＲＮＡは、hst
−２蛋白質が局在していると考えられるような、前述の
筋肉、精巣〔de Lapeyriere ら、 前掲〕あるいは該ペプ
チドを産生していると思われる白血病細胞株ＨＥＬ〔Ma
rtin と Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｎｌｏｕ、前掲〕Ｃ
ＭＫ〔Ｓａｔｏ ら、 前掲〕, ヒトhst−２遺伝子によ
るＮ１Ｈ３Ｔ３トランスフォーマント（ヨーロッパ特許
出願公開第４８８１９６号公報）または、Iidaら、 〔オ
ンコジーン（Oncogene）第７巻、第３０３頁(１９９２
年)〕などから得ることができる。ヒトの臓器や細胞株
からＲＮＡを調製する方法としては、グアニジンチオシ
アネート法〔J. M. Chirgwin ら，バイオケミストリー
(Biochemistry)，第１８巻、第５２９４頁(１９７９
年)〕などが挙げられる。このようにして得られたＲＮ
Ａを鋳型として cＤＮＡを合成し、例えば Watson とJ
ackson の方法(Watson, C. J. and Jackson, J. F., Ｄ
ＮＡクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ
(ＤＮＡ Cloning, A Practical Approach)アイ アー
ル エル プレス(ＩＲＬ Press), オクスフォード 第
７９頁，１９８５年）に従って例えばλファージベクタ
ーλgt１０(Huynh, T. V. ら，ＤＮＡクローニング・ア
・プラクティカル・アプローチ，アイ アール エル
プレス(ＩＲＬ Press), オクスフォード 第４９頁、１
９８５年)に組みこみ、これを大腸菌，例えばＣ６０
０，ＨflＡ(Huynh, T. V. ら，同上)に感染させ、cＤＮ
Ａライブラリーを作成することができる。このようにし
て得られたcＤＮＡライブラリーより、自体公知の方
法、例えばプラーク・ハイブリダイゼーション法(Mania
tis ら，モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng) コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
（ColdSpring Harbor Laboratory）, 第３２０頁、１９
８２年）およびＤＮＡ塩基配列決定法〔プロシーディン
グス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第７
４巻、第５６０頁(１９７７年), ニュークレイック ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）第９巻、
第３０９頁(１９８１年)〕を用い、求めるファージクロ
ーンを選出する。
−２蛋白質が局在していると考えられるような、前述の
筋肉、精巣〔de Lapeyriere ら、 前掲〕あるいは該ペプ
チドを産生していると思われる白血病細胞株ＨＥＬ〔Ma
rtin と Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｎｌｏｕ、前掲〕Ｃ
ＭＫ〔Ｓａｔｏ ら、 前掲〕, ヒトhst−２遺伝子によ
るＮ１Ｈ３Ｔ３トランスフォーマント（ヨーロッパ特許
出願公開第４８８１９６号公報）または、Iidaら、 〔オ
ンコジーン（Oncogene）第７巻、第３０３頁(１９９２
年)〕などから得ることができる。ヒトの臓器や細胞株
からＲＮＡを調製する方法としては、グアニジンチオシ
アネート法〔J. M. Chirgwin ら，バイオケミストリー
(Biochemistry)，第１８巻、第５２９４頁(１９７９
年)〕などが挙げられる。このようにして得られたＲＮ
Ａを鋳型として cＤＮＡを合成し、例えば Watson とJ
ackson の方法(Watson, C. J. and Jackson, J. F., Ｄ
ＮＡクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ
(ＤＮＡ Cloning, A Practical Approach)アイ アー
ル エル プレス(ＩＲＬ Press), オクスフォード 第
７９頁，１９８５年）に従って例えばλファージベクタ
ーλgt１０(Huynh, T. V. ら，ＤＮＡクローニング・ア
・プラクティカル・アプローチ，アイ アール エル
プレス(ＩＲＬ Press), オクスフォード 第４９頁、１
９８５年)に組みこみ、これを大腸菌，例えばＣ６０
０，ＨflＡ(Huynh, T. V. ら，同上)に感染させ、cＤＮ
Ａライブラリーを作成することができる。このようにし
て得られたcＤＮＡライブラリーより、自体公知の方
法、例えばプラーク・ハイブリダイゼーション法(Mania
tis ら，モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng) コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
（ColdSpring Harbor Laboratory）, 第３２０頁、１９
８２年）およびＤＮＡ塩基配列決定法〔プロシーディン
グス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第７
４巻、第５６０頁(１９７７年), ニュークレイック ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）第９巻、
第３０９頁(１９８１年)〕を用い、求めるファージクロ
ーンを選出する。
【００１２】次に、該ファージクローンを集め、例えば
Davis らの方法〔Davis ら，アドバンスト・バクテリ
アル・ジェネティクス(Advanced Bacterial Genetics).
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Col
d Spring Harbor Laboratory）１９８０年〕により、フ
ァージＤＮＡを抽出して、そのcＤＮＡ部分を制限酵素
を用いて切り出し、これを例えばpＵＣ１３等のプラス
ミドに組み込み直して、使用するのも好都合である。上
記クローン化されたhst−２をコードする塩基配列を含
有するＤＮＡを有するプラスミドはそのまま、または所
望により該ＤＮＡ部分を制限酵素で切り出す。クローン
化された遺伝子を、発現に適したビークル(ベクター)中
のプロモーターの下流に連結することにより発現型ベク
ターを得ることができる。本発明のポリペプチド（Ｉ）
を含むhst−２ポリペプチドを製造するためには、従来
の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技
術(Site-directedmutagenesis)が採用される。該技術は
周知であり、アール・エフ・レイサー(Lather, R. F. )
及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq, J. P. ),ジェネテ
ィック・エンジニアリング(Genetic Engineering)、ア
カデミックプレス社（１９８３年）第３１−５０頁、に
示されている。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘
発はエム・スミス(Smith, M. )及びエス・ギラム（Gill
am, S.）、ジェネティック・エンジニアリング：原理と
方法、プレナムプレス社 (１９８１年)第３巻、第１−
３２頁に示されている。
Davis らの方法〔Davis ら，アドバンスト・バクテリ
アル・ジェネティクス(Advanced Bacterial Genetics).
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Col
d Spring Harbor Laboratory）１９８０年〕により、フ
ァージＤＮＡを抽出して、そのcＤＮＡ部分を制限酵素
を用いて切り出し、これを例えばpＵＣ１３等のプラス
ミドに組み込み直して、使用するのも好都合である。上
記クローン化されたhst−２をコードする塩基配列を含
有するＤＮＡを有するプラスミドはそのまま、または所
望により該ＤＮＡ部分を制限酵素で切り出す。クローン
化された遺伝子を、発現に適したビークル(ベクター)中
のプロモーターの下流に連結することにより発現型ベク
ターを得ることができる。本発明のポリペプチド（Ｉ）
を含むhst−２ポリペプチドを製造するためには、従来
の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技
術(Site-directedmutagenesis)が採用される。該技術は
周知であり、アール・エフ・レイサー(Lather, R. F. )
及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq, J. P. ),ジェネテ
ィック・エンジニアリング(Genetic Engineering)、ア
カデミックプレス社（１９８３年）第３１−５０頁、に
示されている。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘
発はエム・スミス(Smith, M. )及びエス・ギラム（Gill
am, S.）、ジェネティック・エンジニアリング：原理と
方法、プレナムプレス社 (１９８１年)第３巻、第１−
３２頁に示されている。
【００１３】本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードする
構造遺伝子を製造するためには、たとえば、(a) hst−
２の構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変
異オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形成させる、
(b) ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体(heteroduplex)を形成させる、
及び(c) この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。オリ
ゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を導入
すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成に必
要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレオチ
ド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチドで
指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチド
を設計するに当たって、考慮すべき因子(例えば全体の
大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさなど)
は、エム・スミス及びエス・ギラム(前掲)によって記述
されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、突
然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適化す
るような長さであり、突然変異サイトから５′及び３′
末端までの伸長部分（extensions）は、ＤＮＡポリメラ
ーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然変異の編集を
さけるのに十分な大きさとする。本発明に従って突然変
異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、約１
２ないし２４個の塩基、好ましくは約１４ないし２０個
の塩基、更に好ましくは約１４ないし１８個の塩基を含
有する。これらは通常、変更されるコドンの少なくとも
３個の３′側塩基を含有する。
構造遺伝子を製造するためには、たとえば、(a) hst−
２の構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変
異オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形成させる、
(b) ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体(heteroduplex)を形成させる、
及び(c) この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。オリ
ゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を導入
すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成に必
要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレオチ
ド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチドで
指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチド
を設計するに当たって、考慮すべき因子(例えば全体の
大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさなど)
は、エム・スミス及びエス・ギラム(前掲)によって記述
されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、突
然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適化す
るような長さであり、突然変異サイトから５′及び３′
末端までの伸長部分（extensions）は、ＤＮＡポリメラ
ーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然変異の編集を
さけるのに十分な大きさとする。本発明に従って突然変
異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、約１
２ないし２４個の塩基、好ましくは約１４ないし２０個
の塩基、更に好ましくは約１４ないし１８個の塩基を含
有する。これらは通常、変更されるコドンの少なくとも
３個の３′側塩基を含有する。
【００１４】本発明のhst−２構成アミノ酸が欠失して
いるhst−２ポリペプチドを得る目的の場合における変
異hst−２遺伝子を作製する方法としては、構成アミノ
酸を欠失させる部分によって三つの場合が考えられる。
ひとつはhst−２のアミノ末端を欠失させる場合、二つ
めはhst−２の中央部分を欠失させる場合、三つめにはh
st−２のカルボキシル末端を欠失させる場合である。ア
ミノ末端を欠失させる場合には欠失させたいアミノ酸配
列のカルボキシル末端をコードする遺伝子のコドンをＭ
etをコードする開始コドンＡＴＧに特定部位指向性変異
法を用いて変更し、さらにそのコドンの５′末端側に適
当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーターと
の連結(ligation)を容易にさせるか、あるいは制限酵素
でアミノ末端を欠失させた遺伝子にＡＴＧをもつオリゴ
ヌクレオチドを読み取り枠を合わせて結合させる。これ
らの方法によって、本発明のポリペプチド（Ｉ）の変異
遺伝子は、配列番号：６の３８番目のＳｅｒから６３番
目のＡｌａの残基をコードする遺伝子のコドンを適宜変
異させることによって製造される。アミノ酸配列をその
中央部分で欠失させる場合には欠失させたいアミノ酸配
列をコードする遺伝子の５′および３′末端側にユニー
クな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変異法を用い
て生成し、この部位を酵素によって消化して該配列をコ
ードする部分を抜きとり、 再連結によって遺伝子をもと
につなげば目的のアミノ酸を欠失したhst−２をコード
する遺伝子ができあがる。このとき制限酵素消化により
読み取り枠がずれないようにすることは云うまでもな
い。カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠失させる場
合には、欠失させたいアミノ酸配列のアミノ末端側のア
ミノ酸をコードする遺伝子のコドンを特定部位指向性変
異によってストップコドンに変更すればよい。
いるhst−２ポリペプチドを得る目的の場合における変
異hst−２遺伝子を作製する方法としては、構成アミノ
酸を欠失させる部分によって三つの場合が考えられる。
ひとつはhst−２のアミノ末端を欠失させる場合、二つ
めはhst−２の中央部分を欠失させる場合、三つめにはh
st−２のカルボキシル末端を欠失させる場合である。ア
ミノ末端を欠失させる場合には欠失させたいアミノ酸配
列のカルボキシル末端をコードする遺伝子のコドンをＭ
etをコードする開始コドンＡＴＧに特定部位指向性変異
法を用いて変更し、さらにそのコドンの５′末端側に適
当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーターと
の連結(ligation)を容易にさせるか、あるいは制限酵素
でアミノ末端を欠失させた遺伝子にＡＴＧをもつオリゴ
ヌクレオチドを読み取り枠を合わせて結合させる。これ
らの方法によって、本発明のポリペプチド（Ｉ）の変異
遺伝子は、配列番号：６の３８番目のＳｅｒから６３番
目のＡｌａの残基をコードする遺伝子のコドンを適宜変
異させることによって製造される。アミノ酸配列をその
中央部分で欠失させる場合には欠失させたいアミノ酸配
列をコードする遺伝子の５′および３′末端側にユニー
クな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変異法を用い
て生成し、この部位を酵素によって消化して該配列をコ
ードする部分を抜きとり、 再連結によって遺伝子をもと
につなげば目的のアミノ酸を欠失したhst−２をコード
する遺伝子ができあがる。このとき制限酵素消化により
読み取り枠がずれないようにすることは云うまでもな
い。カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠失させる場
合には、欠失させたいアミノ酸配列のアミノ末端側のア
ミノ酸をコードする遺伝子のコドンを特定部位指向性変
異によってストップコドンに変更すればよい。
【００１５】本発明のポリペプチド（Ｉ）を包含するhs
t−２ポリペプチドは、上記のように、hst−２の構成ア
ミノ酸が欠失するものであるが、hst−２活性を有する
かぎり、さらにその中の少なくとも１個のアミノ酸が別
のアミノ酸で置換されているものであってもよい。置換
される前の構成アミノ酸（被置換アミノ酸）の例として
は、システインもしくはシステイン以外のアミノ酸
（例、アスパラギン酸，アルギニン）のいずれのアミノ
酸であってもよい。被置換アミノ酸がシステインである
場合には、それに代わって置換されるアミノ酸（置換ア
ミノ酸）としては、たとえば中性アミノ酸が好ましい。
該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば、グリシ
ン,バリン,アラニン,ロイシン,イソロイシン,チロシン,
フェニルアラニン,ヒスチジン,トリプトファン,セリン,
スレオニン,メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン,スレオニンが好ましい。被置換アミノ酸がシステイ
ン以外のものである場合には、置換アミノ酸としては、
たとえば、アミノ酸の親水性,疎水性あるいは電荷の点
で、被置換アミノ酸とは異なる性質をもつものを選ぶ。
具体的には被置換アミノ酸がアスパラギン酸の場合に
は、置換アミノ酸としてアスパラギン,スレオニン,バリ
ン,フェニルアラニン,アルギニンなどが挙げられるが、
特にアスパラギン,アルギニンが好ましい。被置換アミ
ノ酸がアルギニンの場合には、置換アミノ酸としてグル
タミン,スレオニン,ロイシン,フェニルアラニン,アスパ
ラギン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。
t−２ポリペプチドは、上記のように、hst−２の構成ア
ミノ酸が欠失するものであるが、hst−２活性を有する
かぎり、さらにその中の少なくとも１個のアミノ酸が別
のアミノ酸で置換されているものであってもよい。置換
される前の構成アミノ酸（被置換アミノ酸）の例として
は、システインもしくはシステイン以外のアミノ酸
（例、アスパラギン酸，アルギニン）のいずれのアミノ
酸であってもよい。被置換アミノ酸がシステインである
場合には、それに代わって置換されるアミノ酸（置換ア
ミノ酸）としては、たとえば中性アミノ酸が好ましい。
該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば、グリシ
ン,バリン,アラニン,ロイシン,イソロイシン,チロシン,
フェニルアラニン,ヒスチジン,トリプトファン,セリン,
スレオニン,メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン,スレオニンが好ましい。被置換アミノ酸がシステイ
ン以外のものである場合には、置換アミノ酸としては、
たとえば、アミノ酸の親水性,疎水性あるいは電荷の点
で、被置換アミノ酸とは異なる性質をもつものを選ぶ。
具体的には被置換アミノ酸がアスパラギン酸の場合に
は、置換アミノ酸としてアスパラギン,スレオニン,バリ
ン,フェニルアラニン,アルギニンなどが挙げられるが、
特にアスパラギン,アルギニンが好ましい。被置換アミ
ノ酸がアルギニンの場合には、置換アミノ酸としてグル
タミン,スレオニン,ロイシン,フェニルアラニン,アスパ
ラギン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。
【００１６】特定部位指向性変異により本発明のポリペ
プチド（Ｉ）を包含するhst−２ポリペプチドを産生さ
せる時に、ＤＮＡ配列に複数個の変異を行ってもよい、
すなわち、アミノ酸に対応しているＤＮＡのコドンであ
ればいずれを選択してもかまわない。たとえば、構成ア
ミノ酸がシステイン以外のアミノ酸であってこれを他の
アミノ酸に置換したムテインを得る目的の場合における
変異hst−２遺伝子を作る方法としては、システインの
場合と同様にして、オリゴヌクレオチドプライマーによ
るコドンの変更を行う。ただしオリゴヌクレオチドプラ
イマーのデザインはどのアミノ酸を変更するかで異なる
ことは云うまでもない。プライマーは、hst−２遺伝子
の１本鎖がクローン化されたＭ１３〔Yanisch−Perror,
C., Vieira, J. Messing, ジーン(Gene)，第３３巻、
第１０３−１１９頁(１９８５年)，Messing J. メソッ
ズ・イン・エンジーモロジー（Methods inEnzymolog
y），第１０１巻、第２０−７８頁(１９８３年)〕，fd
〔R. Herrman et al. モレキュラー・アンド・ジェネラ
ル・ジェネティック（Mol. Gen. Genet.），第１７７
巻、第２３１頁(１９８０年)〕，又はφ×１７４〔M. S
mith and S. Gillam，ジェネティック・エンジニアリン
グ（Genetic Engineering）, プレナム プレス（Plenu
m Press）, 第３巻、第ｌ−３２頁(１９８１年)〕のよ
うな１本鎖ファージへ雑種形成される。ファージが遺伝
子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも運搬でき、
アンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗号
づけたトリプレットを決定するこのコドンとの不一致以
外にプライマーは突然変異させるコドンを含有するセン
ス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場合があ
ってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬する時に
は、欠失させるコドンと対合をつくるトリプレット中の
適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含有する
センス鎖の領域に対して相補的でない場合があってもよ
い。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及びエス
・ギラム(前掲)によって記述されている。温度は通常、
約０℃ないし７０℃、より一般的には約１０℃ないし５
０℃の範囲にある。雑種形成後、プライマーは大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼI、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写
酵素又は他の適当なＤＮＡポリメラーゼとの反応によっ
てファージＤＮＡ上で伸長される。生ずるdsＤＮＡは、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼでの処理に
よって閉鎖環dsＤＮＡへ変換される。１本鎖領域を含有
するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレアーゼ処理によって
破壊できる。
プチド（Ｉ）を包含するhst−２ポリペプチドを産生さ
せる時に、ＤＮＡ配列に複数個の変異を行ってもよい、
すなわち、アミノ酸に対応しているＤＮＡのコドンであ
ればいずれを選択してもかまわない。たとえば、構成ア
ミノ酸がシステイン以外のアミノ酸であってこれを他の
アミノ酸に置換したムテインを得る目的の場合における
変異hst−２遺伝子を作る方法としては、システインの
場合と同様にして、オリゴヌクレオチドプライマーによ
るコドンの変更を行う。ただしオリゴヌクレオチドプラ
イマーのデザインはどのアミノ酸を変更するかで異なる
ことは云うまでもない。プライマーは、hst−２遺伝子
の１本鎖がクローン化されたＭ１３〔Yanisch−Perror,
C., Vieira, J. Messing, ジーン(Gene)，第３３巻、
第１０３−１１９頁(１９８５年)，Messing J. メソッ
ズ・イン・エンジーモロジー（Methods inEnzymolog
y），第１０１巻、第２０−７８頁(１９８３年)〕，fd
〔R. Herrman et al. モレキュラー・アンド・ジェネラ
ル・ジェネティック（Mol. Gen. Genet.），第１７７
巻、第２３１頁(１９８０年)〕，又はφ×１７４〔M. S
mith and S. Gillam，ジェネティック・エンジニアリン
グ（Genetic Engineering）, プレナム プレス（Plenu
m Press）, 第３巻、第ｌ−３２頁(１９８１年)〕のよ
うな１本鎖ファージへ雑種形成される。ファージが遺伝
子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも運搬でき、
アンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗号
づけたトリプレットを決定するこのコドンとの不一致以
外にプライマーは突然変異させるコドンを含有するセン
ス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場合があ
ってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬する時に
は、欠失させるコドンと対合をつくるトリプレット中の
適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含有する
センス鎖の領域に対して相補的でない場合があってもよ
い。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及びエス
・ギラム(前掲)によって記述されている。温度は通常、
約０℃ないし７０℃、より一般的には約１０℃ないし５
０℃の範囲にある。雑種形成後、プライマーは大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼI、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写
酵素又は他の適当なＤＮＡポリメラーゼとの反応によっ
てファージＤＮＡ上で伸長される。生ずるdsＤＮＡは、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼでの処理に
よって閉鎖環dsＤＮＡへ変換される。１本鎖領域を含有
するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレアーゼ処理によって
破壊できる。
【００１７】生ずる突然変異形成ヘテロ二量体は、被感
染能力をもつ宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用
される。宿主によるヘテロ二量体の複製では、双方の鎖
から子孫ができる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子
孫から突然変異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。次に、突然変異化された遺伝子を運搬す
るファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由
来のpＢＲ３２２〔ジーン(gene)，第２巻、第９５頁(１
９７７年)〕，pＢＲ３２５〔ジーン，第４巻、第１２１
頁(１９７８年)〕，pＵＣ１２〔ジーン，第１９巻、第
２５９頁(１９８２年)〕，pＵＣ１３〔ジーン，第１９
巻、第２５９頁(１９８２年)〕、枯草菌由来のpＵＢ１
１０〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション(Biochemical and Biophys
ical Research Communication)，第１１２巻、第６７８
頁(１９８３年)〕などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で複製保持されるものであれば、いずれ
をも用いることができる。
染能力をもつ宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用
される。宿主によるヘテロ二量体の複製では、双方の鎖
から子孫ができる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子
孫から突然変異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。次に、突然変異化された遺伝子を運搬す
るファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由
来のpＢＲ３２２〔ジーン(gene)，第２巻、第９５頁(１
９７７年)〕，pＢＲ３２５〔ジーン，第４巻、第１２１
頁(１９７８年)〕，pＵＣ１２〔ジーン，第１９巻、第
２５９頁(１９８２年)〕，pＵＣ１３〔ジーン，第１９
巻、第２５９頁(１９８２年)〕、枯草菌由来のpＵＢ１
１０〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション(Biochemical and Biophys
ical Research Communication)，第１１２巻、第６７８
頁(１９８３年)〕などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で複製保持されるものであれば、いずれ
をも用いることができる。
【００１８】プラスミドに組み込む方法としては、たと
えば、T．Maniatis ら，モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory)，
第２３９頁(１９８２年)に記載の方法などが挙げられ
る。クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
(ベクター)中のプロモーターの下流に連結して発現型組
換えベクターを得ることができる。組換えベクターを作
成するためのビークル(ベクター)としては、たとえば大
腸菌由来のプラスミドpＢＲ３２２，〔前掲〕，pＢＲ３
２５〔前掲〕, pＵＣ１２〔前掲〕, pＵＣ１３〔前
掲〕、枯草菌由来のpＵＢ１１０〔前掲〕, pＴＰ５，p
Ｃ１９４)，酵母由来プラスミド（例、pＳＨ１９，pＳ
Ｈ１５)，あるいはλファージなどのバクテリオファー
ジおよびレトロウイルス,ワクシニアウイルスなどの動
物ウイルスなどがあげられる。該遺伝子はその５′末端
に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３′末端
には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡ
Ｇを有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるに
はその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いら
れるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主
に対応して適切なプロモーターであればいかなるもので
もよい。たとえば、形質転換する際の宿主がエシェリヒ
ア属菌である場合は、trpプロモーター,lacプロモータ
ー,rec Ａプロモーター,λpＬプロモーター,lppプロモ
ーター,Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌
である場合は、ＳＰＯ１プロモーター,ＳＰＯ２プロモ
ーター,penＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター,ＰＧＫプロモーター,ＧＡＰ
プロモーター,ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。と
りわけ宿主がエシェリヒア属菌でプロモーターがtrpプ
ロモーターまたはＴ７プロモーターであることが好まし
い。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げ
られ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好まし
い。
えば、T．Maniatis ら，モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory)，
第２３９頁(１９８２年)に記載の方法などが挙げられ
る。クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
(ベクター)中のプロモーターの下流に連結して発現型組
換えベクターを得ることができる。組換えベクターを作
成するためのビークル(ベクター)としては、たとえば大
腸菌由来のプラスミドpＢＲ３２２，〔前掲〕，pＢＲ３
２５〔前掲〕, pＵＣ１２〔前掲〕, pＵＣ１３〔前
掲〕、枯草菌由来のpＵＢ１１０〔前掲〕, pＴＰ５，p
Ｃ１９４)，酵母由来プラスミド（例、pＳＨ１９，pＳ
Ｈ１５)，あるいはλファージなどのバクテリオファー
ジおよびレトロウイルス,ワクシニアウイルスなどの動
物ウイルスなどがあげられる。該遺伝子はその５′末端
に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３′末端
には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡ
Ｇを有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるに
はその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いら
れるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主
に対応して適切なプロモーターであればいかなるもので
もよい。たとえば、形質転換する際の宿主がエシェリヒ
ア属菌である場合は、trpプロモーター,lacプロモータ
ー,rec Ａプロモーター,λpＬプロモーター,lppプロモ
ーター,Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌
である場合は、ＳＰＯ１プロモーター,ＳＰＯ２プロモ
ーター,penＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター,ＰＧＫプロモーター,ＧＡＰ
プロモーター,ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。と
りわけ宿主がエシェリヒア属菌でプロモーターがtrpプ
ロモーターまたはＴ７プロモーターであることが好まし
い。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げ
られ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好まし
い。
【００１９】このようにして構築されたＤＮＡを含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては、たとえばエシェリヒア属菌,バチルス属菌,酵母,
動物細胞などが挙げられる。上記エシェリヒア属菌の例
としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１
２ＤＨ１〔プロシージングス オブ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス ユーエスエー（Proc．Nat
l．Acad．Sci．ＵＳＡ），第６０巻、第１６０頁(１９
６８年)〕, Ｍ１０３ 〔ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ, (Nucleic Acids Research）第９巻、第３０９頁
(１９８１年)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biolog
y)第１２０巻、第５１７頁(１９７８年)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，第
４１巻、第４５９頁(１９６９年)〕，Ｃ６００〔ジェネ
ティックス(Genetics)，第３９巻、第４４０頁(１９５
４年)〕などが挙げられる。上記バチルス属菌として
は、たとえばバチルス・サブチルス(Bacillus subtili
s）ＭＩ１１４〔ジーン，第２４巻、第２５５頁(１９８
３年)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Journal of Biochemistry）第９５巻、第
８７頁(１９８４年)〕などが挙げられる。上記酵母とし
ては、たとえばサッカロマイセス セレビシアエ（Sacc
haromyces cerevisiae）ＡＨ２２Ｒ~，ＮＡ８７−１１
Ａ, ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。動物細胞として
は、株化したもの(cell line)が好ましく、たとえばサ
ル細胞ＣＯＳ−７〔セル (cell), 第２３巻、第１５７
頁(１９８１年)〕，Vero,チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ,マウスＬ細胞,ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては、たとえばエシェリヒア属菌,バチルス属菌,酵母,
動物細胞などが挙げられる。上記エシェリヒア属菌の例
としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１
２ＤＨ１〔プロシージングス オブ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス ユーエスエー（Proc．Nat
l．Acad．Sci．ＵＳＡ），第６０巻、第１６０頁(１９
６８年)〕, Ｍ１０３ 〔ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ, (Nucleic Acids Research）第９巻、第３０９頁
(１９８１年)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biolog
y)第１２０巻、第５１７頁(１９７８年)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，第
４１巻、第４５９頁(１９６９年)〕，Ｃ６００〔ジェネ
ティックス(Genetics)，第３９巻、第４４０頁(１９５
４年)〕などが挙げられる。上記バチルス属菌として
は、たとえばバチルス・サブチルス(Bacillus subtili
s）ＭＩ１１４〔ジーン，第２４巻、第２５５頁(１９８
３年)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Journal of Biochemistry）第９５巻、第
８７頁(１９８４年)〕などが挙げられる。上記酵母とし
ては、たとえばサッカロマイセス セレビシアエ（Sacc
haromyces cerevisiae）ＡＨ２２Ｒ~，ＮＡ８７−１１
Ａ, ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。動物細胞として
は、株化したもの(cell line)が好ましく、たとえばサ
ル細胞ＣＯＳ−７〔セル (cell), 第２３巻、第１５７
頁(１９８１年)〕，Vero,チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ,マウスＬ細胞,ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。
【００２０】上記エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー（Proc．
Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ），第６９巻、第２１１０頁
(１９７２年)，ジーン，第１７巻、第１０７頁(１９８
２年)などに記載の方法に従って行なわれる。バチルス
属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular ＆ Gene
ral Genetics)，第１６８巻、第１１１頁(１９７９年)
などに記載の方法に従って行なわれる。酵母を形質転換
するには、たとえばプロシーディングス オブ ナショ
ナルアカデミー オブ サイエンス ユーエスエー（Pr
oc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ），第７５巻，第１９２
９頁(１９７８年)に記載の方法に従って行なわれる。動
物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー(Vir
ology)，第５２巻、第４５６頁(１９７３年)に記載の方
法に従って行なわれる。このようにして、所望のhst−
２ポリペプチド、例えばポリペプチド（Ｉ）cＤＮＡを
含有するベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。
は、たとえばプロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー（Proc．
Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ），第６９巻、第２１１０頁
(１９７２年)，ジーン，第１７巻、第１０７頁(１９８
２年)などに記載の方法に従って行なわれる。バチルス
属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular ＆ Gene
ral Genetics)，第１６８巻、第１１１頁(１９７９年)
などに記載の方法に従って行なわれる。酵母を形質転換
するには、たとえばプロシーディングス オブ ナショ
ナルアカデミー オブ サイエンス ユーエスエー（Pr
oc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ），第７５巻，第１９２
９頁(１９７８年)に記載の方法に従って行なわれる。動
物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー(Vir
ology)，第５２巻、第４５６頁(１９７３年)に記載の方
法に従って行なわれる。このようにして、所望のhst−
２ポリペプチド、例えばポリペプチド（Ｉ）cＤＮＡを
含有するベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。
【００２１】宿主がエシェリヒア属菌,バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源,窒素源,無機物その他が含有せし
められる。炭素源としては、たとえばグルコース,デキ
ストリン,可溶性澱粉,ショ糖など、窒素源としては、た
とえばアンモニウム塩類,硝酸塩類,コーンスチープ・リ
カー,ペプトン,カゼイン, 肉エキス, 大豆粕, バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質, 無機物としてはた
とえば塩化カルシウム,リン酸二水素ナトリウム,塩化マ
グネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス,ビタ
ミン類,生長促進因子などを添加してもよい。培地のpＨ
は約６〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際
の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含む
Ｍ９培地〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメン
ツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal
of Experiments in Molecular Genetics)，第４３１−
４３３頁，コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）, ニューヨー
ク(１９７２年)〕が好ましい。さらに、必要によりプロ
モーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イ
ンドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができ
る。
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源,窒素源,無機物その他が含有せし
められる。炭素源としては、たとえばグルコース,デキ
ストリン,可溶性澱粉,ショ糖など、窒素源としては、た
とえばアンモニウム塩類,硝酸塩類,コーンスチープ・リ
カー,ペプトン,カゼイン, 肉エキス, 大豆粕, バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質, 無機物としてはた
とえば塩化カルシウム,リン酸二水素ナトリウム,塩化マ
グネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス,ビタ
ミン類,生長促進因子などを添加してもよい。培地のpＨ
は約６〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際
の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含む
Ｍ９培地〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメン
ツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal
of Experiments in Molecular Genetics)，第４３１−
４３３頁，コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）, ニューヨー
ク(１９７２年)〕が好ましい。さらに、必要によりプロ
モーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イ
ンドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができ
る。
【００２２】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿
主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地
〔Bostian, K．L．ら，プロシーディングス オブ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエ
ー（Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ），第７７巻、第
４５０５頁(１９８０年)〕が挙げられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃
〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、ＭＥＭ培地〔サイエンス(Scien
ce)第１２２巻、第５０１頁(１９５２年)〕，ＤＭＥＭ
培地〔ヴィロロジー(Virology)，第８巻、第３９６頁
(１９５９年)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ザ・ジャーナ
ル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーシ
ョン(The Journal of the American Medical Associati
on）第１９９巻、第５１９頁(１９６７年)〕１９９培地
〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディシン（Proceeding of th
e Society for theBiological Medicine）第７３巻、第
１頁(１９５０年)〕などが挙げられる。これにさらに約
５〜２０％の牛胎仔血清を添加しても良い。pＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃、
培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿
主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地
〔Bostian, K．L．ら，プロシーディングス オブ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエ
ー（Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ），第７７巻、第
４５０５頁(１９８０年)〕が挙げられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃
〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、ＭＥＭ培地〔サイエンス(Scien
ce)第１２２巻、第５０１頁(１９５２年)〕，ＤＭＥＭ
培地〔ヴィロロジー(Virology)，第８巻、第３９６頁
(１９５９年)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ザ・ジャーナ
ル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーシ
ョン(The Journal of the American Medical Associati
on）第１９９巻、第５１９頁(１９６７年)〕１９９培地
〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディシン（Proceeding of th
e Society for theBiological Medicine）第７３巻、第
１頁(１９５０年)〕などが挙げられる。これにさらに約
５〜２０％の牛胎仔血清を添加しても良い。pＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃、
培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。
【００２３】上記培養物中、すなわち菌体内または菌体
外に生成蓄積されたポリペプチド（Ｉ）を包含するhst
−２ポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方
法を用いることができる。ポリペプチド（Ｉ）を含むhs
t−２ポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞
を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含
む緩衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる通
常の方法、フレンチプレス、超音波、リゾチームなどの
酵素および(または)凍結融解によって菌体あるいは細胞
を破壊したのち、遠心分離によりポリペプチド（Ｉ）を
含むhst−２ポリペプチドを得る方法などが適宜用い得
る。とりわけ、リゾチームなどの酵素処理と超音波処理
を併用する方法が好ましい。上記上澄液から例えば本発
明のポリペプチド（Ｉ）を精製するには、自体公知の分
離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
外に生成蓄積されたポリペプチド（Ｉ）を包含するhst
−２ポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方
法を用いることができる。ポリペプチド（Ｉ）を含むhs
t−２ポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞
を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含
む緩衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる通
常の方法、フレンチプレス、超音波、リゾチームなどの
酵素および(または)凍結融解によって菌体あるいは細胞
を破壊したのち、遠心分離によりポリペプチド（Ｉ）を
含むhst−２ポリペプチドを得る方法などが適宜用い得
る。とりわけ、リゾチームなどの酵素処理と超音波処理
を併用する方法が好ましい。上記上澄液から例えば本発
明のポリペプチド（Ｉ）を精製するには、自体公知の分
離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００２４】さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥ
セルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等
を除くことができる。たとえば、中性附近のトリスなど
の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄
液をかけ、素通り画分を集めることは有効である。ま
た、さらにカルボキシメチル（ＣＭ）セルロースなどを
担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかけること
により、ポリペプチド（Ｉ）を担体に吸着させ、塩溶液
を用いてこれを溶出させることにより精製することがで
きる。ＣＭセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマ
トグラフィーにより、菌体抽出液から直接、ポリペプチ
ド（Ｉ）を精製することができる。たとえば、上清液
を、弱酸性緩衝液(例、リン酸緩衝液)で平衝化したＣＭ
−セルロースカラムにかけることにより、効率良く行な
うことができる。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラム
を、塩(例、ＮaＣl)をさらに含有する緩衝液を用いて溶
出することにより、ポリペプチド（Ｉ）を溶出させるこ
とができる。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥するこ
とができる。
セルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等
を除くことができる。たとえば、中性附近のトリスなど
の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄
液をかけ、素通り画分を集めることは有効である。ま
た、さらにカルボキシメチル（ＣＭ）セルロースなどを
担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかけること
により、ポリペプチド（Ｉ）を担体に吸着させ、塩溶液
を用いてこれを溶出させることにより精製することがで
きる。ＣＭセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマ
トグラフィーにより、菌体抽出液から直接、ポリペプチ
ド（Ｉ）を精製することができる。たとえば、上清液
を、弱酸性緩衝液(例、リン酸緩衝液)で平衝化したＣＭ
−セルロースカラムにかけることにより、効率良く行な
うことができる。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラム
を、塩(例、ＮaＣl)をさらに含有する緩衝液を用いて溶
出することにより、ポリペプチド（Ｉ）を溶出させるこ
とができる。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥するこ
とができる。
【００２５】また、ポリペプチド（Ｉ）の精製法とし
て、ヘパリンーセファロースを担体としたアフィニティ
ークロマトグラフィー法を、大腸菌抽出液中のポリペプ
チド（Ｉ）にも適用すると好都合である。たとえば中性
附近のトリス,リン酸などの緩衝液で平衡化したヘパリ
ン・セファロースカラムに、上記溶出液をかけ、十分洗
った後、ＮaClなどの直線濃度勾配溶出を行うことによ
りポリペプチド（Ｉ）を精製することができる。特に、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用に開発され
たヘパリンカラム(例えば、Shodex ＡＦ−pakＨＲ・８
９４,昭和電工製など)は有効である。
て、ヘパリンーセファロースを担体としたアフィニティ
ークロマトグラフィー法を、大腸菌抽出液中のポリペプ
チド（Ｉ）にも適用すると好都合である。たとえば中性
附近のトリス,リン酸などの緩衝液で平衡化したヘパリ
ン・セファロースカラムに、上記溶出液をかけ、十分洗
った後、ＮaClなどの直線濃度勾配溶出を行うことによ
りポリペプチド（Ｉ）を精製することができる。特に、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用に開発され
たヘパリンカラム(例えば、Shodex ＡＦ−pakＨＲ・８
９４,昭和電工製など)は有効である。
【００２６】上記ヘパリンセファロースカラムと同様
に、中性附近の緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったの
ちＮaClなどの直線濃度勾配溶出を行うと、本発明のポ
リペプチド（Ｉ）はほぼ均一な標品として回収すること
ができる。この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥
を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体と
して血清アルブミンなどを添加して保存することは、標
品の容器への吸着を防ぐことができ好適である。
に、中性附近の緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったの
ちＮaClなどの直線濃度勾配溶出を行うと、本発明のポ
リペプチド（Ｉ）はほぼ均一な標品として回収すること
ができる。この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥
を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体と
して血清アルブミンなどを添加して保存することは、標
品の容器への吸着を防ぐことができ好適である。
【００２７】また、精製過程、あるいは保存過程での微
量の還元剤の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適であ
る。還元剤としてはβ−メルカプトエタノール,ジチオ
スレイトール,グルタチオンなどが挙げられる。このよ
うにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含
まない、実質的に純粋な本発明のポリペプチド（Ｉ）が
得られる。本発明の実質的に純粋なポリペプチド（Ｉ）
としては、蛋白質含量としてポリペプチド（Ｉ）が９５
％(w／w)以上であるもの、さらに好ましくはポリペプチ
ド（Ｉ）が９８％(w／w)以上であるものが挙げられる。
この実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含まない
生成物は、リムルス溶解テストにおいて陰性であること
によって確認できる。かくして生成するポリペプチドの
hst−２活性は、公知のＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞の増殖促
進効果などにより測定することができる。本発明のＤＮ
Ａで遺伝子感染または形質転換した細胞では、本来わず
かのhst−２ポリペプチドしか合成されないか、あるい
は全く合成されない各種細胞においても大量のポリペプ
チド（Ｉ）を産生せしめることができ、本発明のポリペ
プチド（Ｉ）を効率的に高純度で得ることができる。
量の還元剤の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適であ
る。還元剤としてはβ−メルカプトエタノール,ジチオ
スレイトール,グルタチオンなどが挙げられる。このよ
うにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含
まない、実質的に純粋な本発明のポリペプチド（Ｉ）が
得られる。本発明の実質的に純粋なポリペプチド（Ｉ）
としては、蛋白質含量としてポリペプチド（Ｉ）が９５
％(w／w)以上であるもの、さらに好ましくはポリペプチ
ド（Ｉ）が９８％(w／w)以上であるものが挙げられる。
この実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含まない
生成物は、リムルス溶解テストにおいて陰性であること
によって確認できる。かくして生成するポリペプチドの
hst−２活性は、公知のＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞の増殖促
進効果などにより測定することができる。本発明のＤＮ
Ａで遺伝子感染または形質転換した細胞では、本来わず
かのhst−２ポリペプチドしか合成されないか、あるい
は全く合成されない各種細胞においても大量のポリペプ
チド（Ｉ）を産生せしめることができ、本発明のポリペ
プチド（Ｉ）を効率的に高純度で得ることができる。
【００２８】本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードする
遺伝子を含有する発現型プラスミドは、これを各種細胞
に導入することにより該細胞に該ポリペプチドを産生さ
せることができるため、ポリペプチド（Ｉ）を大量に取
得することができる。ここに製造されるポリペプチド
（Ｉ）は、血管内皮細胞などの細胞の増殖促進活性や血
管新生促進作用を有し、毒性は低いので、火傷，創傷，
術後組織などの治癒促進剤などの治療薬として安全に用
いることができる。また、細胞培養を促進させるための
試薬として用いることができる。本発明のポリペプチド
（Ｉ）を医薬として用いるには、そのまま粉末として、
または他の薬理学的に許容されうる担体,賦形剤,希釈剤
とともに医薬組成物(例、注射剤,錠剤,カプセル剤,液
剤,軟膏)として、温血哺乳動物(例、ヒト,マウス,ラッ
ト,ハムスター,ウサギ,犬,ネコ)に対して非経口的また
は経口的に安全に投与することができる。注射剤の製剤
化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖やその他の補助
薬を含む水溶液を用い、常法に従って行なわれる。錠
剤,カプセル剤等の医薬組成物も常法に従って調製しう
る。さらに、医薬組成物としての注射剤，液剤，錠剤，
カプセル剤等を製造する際には、無菌条件下で行なう。
遺伝子を含有する発現型プラスミドは、これを各種細胞
に導入することにより該細胞に該ポリペプチドを産生さ
せることができるため、ポリペプチド（Ｉ）を大量に取
得することができる。ここに製造されるポリペプチド
（Ｉ）は、血管内皮細胞などの細胞の増殖促進活性や血
管新生促進作用を有し、毒性は低いので、火傷，創傷，
術後組織などの治癒促進剤などの治療薬として安全に用
いることができる。また、細胞培養を促進させるための
試薬として用いることができる。本発明のポリペプチド
（Ｉ）を医薬として用いるには、そのまま粉末として、
または他の薬理学的に許容されうる担体,賦形剤,希釈剤
とともに医薬組成物(例、注射剤,錠剤,カプセル剤,液
剤,軟膏)として、温血哺乳動物(例、ヒト,マウス,ラッ
ト,ハムスター,ウサギ,犬,ネコ)に対して非経口的また
は経口的に安全に投与することができる。注射剤の製剤
化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖やその他の補助
薬を含む水溶液を用い、常法に従って行なわれる。錠
剤,カプセル剤等の医薬組成物も常法に従って調製しう
る。さらに、医薬組成物としての注射剤，液剤，錠剤，
カプセル剤等を製造する際には、無菌条件下で行なう。
【００２９】本発明のポリペプチド（Ｉ）を上記した医
薬として用いる場合には、たとえば上記した温血動物
に、投与ルート,症状などを考慮して、１日量約１ngな
いし１００μg／kgの中から適当量を選んで投与され
る。hst−２ポリペプチドは上記と同程度の範囲の量か
ら選択される適当な量で使用される。また、 本発明のポ
リペプチド（Ｉ）を細胞培養を促進させるための試薬と
して用いる場合、培地１リットルあたり約０.０１〜１
０μg、さらに好ましくは約０.１〜１０μgとなるよう
に培地に加えることが好ましい。さらに、巨核球系前駆
細胞の培養を促進させるための試薬として用いる場合、
培地１リットルあたり約０，１〜１０ｍｇ、好ましくは
約０.５〜１０ｍｇとなるように培地に加えることが好
ましい。本発明のポリペプチド（Ｉ）は、すぐれた細胞
増殖促進活性などを示し、また酸性条件下で安定である
ので、潰瘍たとえば消化管の潰瘍症の治療薬としても用
いることができる。また、巨核芽球増殖促進活性を示す
ので、先天的なまたは化学療法剤の副作用としての血小
板減少症状の改善に応用することができる。
薬として用いる場合には、たとえば上記した温血動物
に、投与ルート,症状などを考慮して、１日量約１ngな
いし１００μg／kgの中から適当量を選んで投与され
る。hst−２ポリペプチドは上記と同程度の範囲の量か
ら選択される適当な量で使用される。また、 本発明のポ
リペプチド（Ｉ）を細胞培養を促進させるための試薬と
して用いる場合、培地１リットルあたり約０.０１〜１
０μg、さらに好ましくは約０.１〜１０μgとなるよう
に培地に加えることが好ましい。さらに、巨核球系前駆
細胞の培養を促進させるための試薬として用いる場合、
培地１リットルあたり約０，１〜１０ｍｇ、好ましくは
約０.５〜１０ｍｇとなるように培地に加えることが好
ましい。本発明のポリペプチド（Ｉ）は、すぐれた細胞
増殖促進活性などを示し、また酸性条件下で安定である
ので、潰瘍たとえば消化管の潰瘍症の治療薬としても用
いることができる。また、巨核芽球増殖促進活性を示す
ので、先天的なまたは化学療法剤の副作用としての血小
板減少症状の改善に応用することができる。
【００３０】本発明のhst−２ポリペプチド、中でもポ
リペプチド（Ｉ）を含む薬剤組成物は血小板増加剤とし
て用いることができる。本発明の血小板増加剤の投与に
より抹梢血中の血小板数を増加させることができる。癌
の化学療法では、ほとんどの化学療法剤の投与によって
血小板減少が引きおこされ、充分量の化学療法剤の投与
をさまたげている。このことは放射線治療においても同
様である。血小板の減少は通常薬剤投与後３〜１５日に
観察される。本発明の血小板増加剤は投与後、直ちに血
小板の増加作用を現わすので、化学療法剤の投与後すぐ
に、また血小板の減少を観察してから投与し、血小板数
の回復をはかることができる。また、化学療法剤の投与
前より本発明の血小板増加剤を投与し、前もって血小板
数を増加させておくこともよい効果をもたらす。本発明
の血小板増加剤は血小板を増加させ、化学療法剤処理に
よって減少した血小板数を回復させ、治療の効果をあげ
るとともに患者の危険な状態を回復させることができ
る。すなわち本発明の血小板増加剤は制癌補助剤として
応用することができる。これら制癌剤としては、例えば
アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタードＮ・オ
キシド，シクロフォスファミド，メルファラン，カルボ
コン，ブスルファン，塩酸ニムスチン，ラニムスチン，
ダカルバジンなど）、代謝拮抗剤（例えばフルオロウラ
シル，テガフール，シタラビン，塩酸アンシタビン，ブ
ロクスウリジン，ドキシフルリジン，メルカプトプリ
ン，チオイノシン，メトトレキサートなど）、抗生物質
（例えばマイトマイシン，ブレオマイシン，塩酸ダウノ
ルビシン，塩酸ドキソルビシン，塩酸ピラルビシン，塩
酸アクラルビシン，ネオカルチノスタシン，アクチノマ
イシンＤなど）植物アルカロイド（例えば硫酸ビンクリ
スチン，硫酸ビンブラスチン，硫酸ビンデシン，エトポ
シドなど）ホルモン剤（例えばクエン酸タモキシフェン
など）その他（塩酸プロカルバジン，ミトブロニトー
ル，塩酸ミトキサントン，シスプラチンなど）が挙げら
れる。本発明のポリペプチド（Ｉ）は、その遺伝子を種
々の細胞に導入することにより、大量にそして高純度で
得ることができる。
リペプチド（Ｉ）を含む薬剤組成物は血小板増加剤とし
て用いることができる。本発明の血小板増加剤の投与に
より抹梢血中の血小板数を増加させることができる。癌
の化学療法では、ほとんどの化学療法剤の投与によって
血小板減少が引きおこされ、充分量の化学療法剤の投与
をさまたげている。このことは放射線治療においても同
様である。血小板の減少は通常薬剤投与後３〜１５日に
観察される。本発明の血小板増加剤は投与後、直ちに血
小板の増加作用を現わすので、化学療法剤の投与後すぐ
に、また血小板の減少を観察してから投与し、血小板数
の回復をはかることができる。また、化学療法剤の投与
前より本発明の血小板増加剤を投与し、前もって血小板
数を増加させておくこともよい効果をもたらす。本発明
の血小板増加剤は血小板を増加させ、化学療法剤処理に
よって減少した血小板数を回復させ、治療の効果をあげ
るとともに患者の危険な状態を回復させることができ
る。すなわち本発明の血小板増加剤は制癌補助剤として
応用することができる。これら制癌剤としては、例えば
アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタードＮ・オ
キシド，シクロフォスファミド，メルファラン，カルボ
コン，ブスルファン，塩酸ニムスチン，ラニムスチン，
ダカルバジンなど）、代謝拮抗剤（例えばフルオロウラ
シル，テガフール，シタラビン，塩酸アンシタビン，ブ
ロクスウリジン，ドキシフルリジン，メルカプトプリ
ン，チオイノシン，メトトレキサートなど）、抗生物質
（例えばマイトマイシン，ブレオマイシン，塩酸ダウノ
ルビシン，塩酸ドキソルビシン，塩酸ピラルビシン，塩
酸アクラルビシン，ネオカルチノスタシン，アクチノマ
イシンＤなど）植物アルカロイド（例えば硫酸ビンクリ
スチン，硫酸ビンブラスチン，硫酸ビンデシン，エトポ
シドなど）ホルモン剤（例えばクエン酸タモキシフェン
など）その他（塩酸プロカルバジン，ミトブロニトー
ル，塩酸ミトキサントン，シスプラチンなど）が挙げら
れる。本発明のポリペプチド（Ｉ）は、その遺伝子を種
々の細胞に導入することにより、大量にそして高純度で
得ることができる。
【００３１】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 cＤＮＡ :相補的デオキシリボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン ＲＮＡ :リボ核酸 dＡＴＰ :デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ :デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ :デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ :デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ :アデノシン三リン酸 Ｔdr :チミジン ＥＤＴＡ :エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ :ドデシル硫酸ナトリウム Ｇly :グリシン Ａla :アラニン Ｖal :バリン Ｌeu :ロイシン Ｉle :イソロイシン Ｓer :セリン Ｔhr :スレオニン Ｃys :システイン Ｍet :メチオニン Ｇlu :グルタミン酸 Ａsp :アスパラギン酸 Ｌys :リジン Ａrg :アルギニン Ｈis :ヒスチジン Ｐhe :フェニールアラニン Ｔyr :チロシン Ｔrp :トリプトファン Ｐro :プロリン Ａsn :アスパラギン Ｇln :グルタミン。
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 cＤＮＡ :相補的デオキシリボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン ＲＮＡ :リボ核酸 dＡＴＰ :デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ :デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ :デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ :デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ :アデノシン三リン酸 Ｔdr :チミジン ＥＤＴＡ :エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ :ドデシル硫酸ナトリウム Ｇly :グリシン Ａla :アラニン Ｖal :バリン Ｌeu :ロイシン Ｉle :イソロイシン Ｓer :セリン Ｔhr :スレオニン Ｃys :システイン Ｍet :メチオニン Ｇlu :グルタミン酸 Ａsp :アスパラギン酸 Ｌys :リジン Ａrg :アルギニン Ｈis :ヒスチジン Ｐhe :フェニールアラニン Ｔyr :チロシン Ｔrp :トリプトファン Ｐro :プロリン Ａsn :アスパラギン Ｇln :グルタミン。
【００３２】
【実施例】後述の実施例で得られた形質転換体は、財団
法人発酵研究所(ＩＦＯ)に寄託され、また、通商産業省
工業技術院生命工学研究所(ＮＩＢＨ)にブダペスト条約
に基づく寄託として寄託されている。受託番号および受
託日を次の〔表１〕に示す。
法人発酵研究所(ＩＦＯ)に寄託され、また、通商産業省
工業技術院生命工学研究所(ＮＩＢＨ)にブダペスト条約
に基づく寄託として寄託されている。受託番号および受
託日を次の〔表１〕に示す。
【００３３】
【表１】 ─────────────────────────────────── 形質転換体 ＩＦＯ ＦＲＩ ─────────────────────────────────── Ｅ. coli MM294(DE3)/ ＩＦＯ １５４３０ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７９ pLysS,pTB1545 (1993年 1月19日) (1993年 2月8日) ( 実施例１(b) ) Ｅ. coli MM294(DE3)/ ＩＦＯ １５４３１ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１８０ pLysS,pTB1547 (1993年 1月19日) (1993年 2月8日) ─────────────────────────────────── 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の
実施例で得られた配列番号：６のＮ末端よりアミノ酸残
基番号３８までが欠失したムテインをＮ３８と称し、そ
のアミノ酸配列を〔図２〕に示す〔配列番号：１〕。ま
た、Ｎ末端よりアミノ酸残基番号６３までが欠失したム
テインをＮ６３と称し、そのアミノ酸配列を〔図４〕に
示す〔配列番号：３〕。 実施例１ Ｎ３８の発現 a) 発現プラスミドの構築 ヒトhst−２cＤＮＡを含むプラスミドpＫＯh２〔オンコ
ジーン（Oncogene）第７巻、第３０３−３０９頁(１９
９２年)〕をＳmaＩ−ＤraＩで切断し、０.６２kb ＤＮ
Ａ断片を得た。 これをpＵＣ１８のＮdeＩ−ＰstＩ欠失
ベクターのＳmaＩ部位に挿入し、 ＤraＩ部位のうしろに
ＢamＨＩ部位がくるプラスミドpＴＢ１５４４を得た。
合成オリゴヌクレオチド 5′GGGCATATGCCTGCA3′〔配列
番号:9〕および 5′GGCATATGCCC3′〔配列番号:10〕を
上記プラスミドのＳmaＩ−ＰstＩ部位に挿入したものを
ＮdeＩ−ＢamＨＩで消化することによりＮdeＩ−ＢamＨ
Ｉ断片を得た。 (３９番目のＰroをコードするＣＣＴの
前に開始コドンＡＴＧをつけた遺伝子を含む）上記断片
を、Ｔ７ファージのφ１０プロモーターを有する大腸菌
用発現ベクターpＥＴ−３c〔ジーン（Gene）第５６巻、
第１２５−１３５頁(１９８７年)〕のＮdeI−ＢamＨＩ
間に組み込んでpＴＢ１５４５を得た〔図３〕。 b) cＤＮＡの大腸菌での発現 大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７ファージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３（Studier, F.
W. ら ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J. Mol. Biol.），第１８９巻、第１１３−１３０(１
９８６年)）を溶原化させ、さらにＴ７ファージのリゾ
チーム遺伝子をもつプラスミドpLysS（Studier, F. W.
ら 同上）を導入し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS
株を作製した。上記(a)で得られたプラスミドpＴＢ１５
４５を、この大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS株に導
入し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS,pＴＢ１５４
５(ＩＦＯ １５４３０ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７９)を
作製した。この菌を１０μg／mlクロラムフェニコー
ル，１００μg／mlアンピシリンを含むＬ培地で培養
し、Ｋlett値が約１８０の時点で、イソプロピルβ−Ｄ
チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を最終濃度が０.１m
Ｍになるように加え更に４時間培養を継続した。菌体を
遠心により集め、氷冷したフォスフェートバッファード
セライン(ＰＢＳ)で洗った後、再集菌し使用時まで−２
０℃に保存した。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の
実施例で得られた配列番号：６のＮ末端よりアミノ酸残
基番号３８までが欠失したムテインをＮ３８と称し、そ
のアミノ酸配列を〔図２〕に示す〔配列番号：１〕。ま
た、Ｎ末端よりアミノ酸残基番号６３までが欠失したム
テインをＮ６３と称し、そのアミノ酸配列を〔図４〕に
示す〔配列番号：３〕。 実施例１ Ｎ３８の発現 a) 発現プラスミドの構築 ヒトhst−２cＤＮＡを含むプラスミドpＫＯh２〔オンコ
ジーン（Oncogene）第７巻、第３０３−３０９頁(１９
９２年)〕をＳmaＩ−ＤraＩで切断し、０.６２kb ＤＮ
Ａ断片を得た。 これをpＵＣ１８のＮdeＩ−ＰstＩ欠失
ベクターのＳmaＩ部位に挿入し、 ＤraＩ部位のうしろに
ＢamＨＩ部位がくるプラスミドpＴＢ１５４４を得た。
合成オリゴヌクレオチド 5′GGGCATATGCCTGCA3′〔配列
番号:9〕および 5′GGCATATGCCC3′〔配列番号:10〕を
上記プラスミドのＳmaＩ−ＰstＩ部位に挿入したものを
ＮdeＩ−ＢamＨＩで消化することによりＮdeＩ−ＢamＨ
Ｉ断片を得た。 (３９番目のＰroをコードするＣＣＴの
前に開始コドンＡＴＧをつけた遺伝子を含む）上記断片
を、Ｔ７ファージのφ１０プロモーターを有する大腸菌
用発現ベクターpＥＴ−３c〔ジーン（Gene）第５６巻、
第１２５−１３５頁(１９８７年)〕のＮdeI−ＢamＨＩ
間に組み込んでpＴＢ１５４５を得た〔図３〕。 b) cＤＮＡの大腸菌での発現 大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７ファージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３（Studier, F.
W. ら ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J. Mol. Biol.），第１８９巻、第１１３−１３０(１
９８６年)）を溶原化させ、さらにＴ７ファージのリゾ
チーム遺伝子をもつプラスミドpLysS（Studier, F. W.
ら 同上）を導入し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS
株を作製した。上記(a)で得られたプラスミドpＴＢ１５
４５を、この大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS株に導
入し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS,pＴＢ１５４
５(ＩＦＯ １５４３０ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７９)を
作製した。この菌を１０μg／mlクロラムフェニコー
ル，１００μg／mlアンピシリンを含むＬ培地で培養
し、Ｋlett値が約１８０の時点で、イソプロピルβ−Ｄ
チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を最終濃度が０.１m
Ｍになるように加え更に４時間培養を継続した。菌体を
遠心により集め、氷冷したフォスフェートバッファード
セライン(ＰＢＳ)で洗った後、再集菌し使用時まで−２
０℃に保存した。
【００３４】実施例２ Ｎ６３の発現 a) 発現プラスミドの構築 実施例１−a)で得られたプラスミドpＴＢ１５４４をＮh
eＩ−ＢamＨＩで切断して得た０.４６Kb断片と合成オリ
ゴヌクレオチド 5′TATGGGG3′および 5′CTAGCCCCA3′
を上記０.４６Kb ＤＮＡの5′末端側に連結して得られ
た０.４７kb ＮdeＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片(６４番目の
ＧlyをコードするＣＣＴの前に開始コドンＡＴＧをつけ
た遺伝子を含む)を、Ｔ７ファージのφ１０プロモータ
ーを有する大腸菌用発現ベクターpＥＴ−３c〔前掲〕の
ＮdeI−ＢamＨＩ間に組み込んでpＴＢ１５４７を得た
〔図５〕。 b) cＤＮＡの大腸菌での発現 上記(a)で得られたプラスミドpＴＢ１５４７を、実施例
１−b)で作製した大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS株
に導入し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS,pＴＢ１
５４８(ＩＦＯ １５４３１ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１８
０)を作製した。この菌を１０μg／mlクロラムフェニコ
ール，１００μg／mlアンピシリンを含むＬ培地で培養
し、Ｋlett値が約１８０の時点で、ＩＰＴＧを最終濃度
が０.１mＭになるように加え更に４時間培養を継続し
た。菌体を遠心により集め、氷冷したＰＢＳで洗った
後、再集菌し使用時まで−２０℃に保存した。
eＩ−ＢamＨＩで切断して得た０.４６Kb断片と合成オリ
ゴヌクレオチド 5′TATGGGG3′および 5′CTAGCCCCA3′
を上記０.４６Kb ＤＮＡの5′末端側に連結して得られ
た０.４７kb ＮdeＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片(６４番目の
ＧlyをコードするＣＣＴの前に開始コドンＡＴＧをつけ
た遺伝子を含む)を、Ｔ７ファージのφ１０プロモータ
ーを有する大腸菌用発現ベクターpＥＴ−３c〔前掲〕の
ＮdeI−ＢamＨＩ間に組み込んでpＴＢ１５４７を得た
〔図５〕。 b) cＤＮＡの大腸菌での発現 上記(a)で得られたプラスミドpＴＢ１５４７を、実施例
１−b)で作製した大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS株
に導入し、大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pLysS,pＴＢ１
５４８(ＩＦＯ １５４３１ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１８
０)を作製した。この菌を１０μg／mlクロラムフェニコ
ール，１００μg／mlアンピシリンを含むＬ培地で培養
し、Ｋlett値が約１８０の時点で、ＩＰＴＧを最終濃度
が０.１mＭになるように加え更に４時間培養を継続し
た。菌体を遠心により集め、氷冷したＰＢＳで洗った
後、再集菌し使用時まで−２０℃に保存した。
【００３５】実施例３ 組換え型Ｎ３８の精製 a)抽出とヘパリンカラム １リットル培養から集めた上記実施例１記載の菌体を２
５mlの氷冷１０mＭトリス−塩酸(pＨ７.４)，１０mＭ
ＥＤＴＡ，０.５Ｍ ＮaＣl, １０％ショ糖，１mＭ ＰＭ
ＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを０.５mg／mlとなるよ
うに添加した。１時間氷中に放置後３７℃で５分間イン
キュベートし、氷冷下で超音波処理（２０秒間，２回）
を行い、遠心(SORVALL,１８Krpm, ３０分, ４℃)して上
清を得、これを菌体抽出液とした。菌体抽出液２５mlを
２０mＭ トリス−塩酸 pＨ７.６，０.５Ｍ ＮaＣl溶液
で平衡化したＱセファロース(ファルマシア)カラム(径
５×５cm)に通し、抽出液中の核酸成分を除去した。カ
ラムからの素通り液および２０mＭトリス−塩酸, pＨ
７.６，０.５Ｍ ＮaＣl溶液でのカラム洗液を合わせて
集めた(Ｑセファロース素通り画分４５ml)。この画分を
ヘパリンカラムShodex ＡＦ−pak ＡＨＲ−８９４，(８
mmＩＤ×５cm, 昭和電工製)を装備した高速液体クロマ
トグラフィー装置(ギルソン社)にかけた。カラムを、２
０mＭトリス−塩酸 pＨ７.６溶液，次いで２０mＭトリ
ス−塩酸 pＨ７.６，０.７Ｍ ＮaＣl溶液で洗った後、
２０mＭトリス−塩酸 pＨ７.６, バッファー中、０.７
Ｍから２ＭのＮaＣlの直線濃度勾配溶出(linear gradie
nt elution, ６０分，流速１.０ml／分)を行った。溶出
パターンを〔図６〕に示す。〔図６〕において、縦軸は
ＯＤ280の吸収値、およびグラジエント中のＮaＣｌ濃度
を示している。横軸はフラクション番号を示しており、
Ｏでグラジエント溶出を開始した。０.１分毎の画分を
分取した。これらの蛋白質の比活性、及びＮ３８回収量
を〔表２〕に示した。また、ピークを与えた各フラクシ
ョンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１２.５％ポリアクリルアミド
ゲル)を〔図７〕に示した。
５mlの氷冷１０mＭトリス−塩酸(pＨ７.４)，１０mＭ
ＥＤＴＡ，０.５Ｍ ＮaＣl, １０％ショ糖，１mＭ ＰＭ
ＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを０.５mg／mlとなるよ
うに添加した。１時間氷中に放置後３７℃で５分間イン
キュベートし、氷冷下で超音波処理（２０秒間，２回）
を行い、遠心(SORVALL,１８Krpm, ３０分, ４℃)して上
清を得、これを菌体抽出液とした。菌体抽出液２５mlを
２０mＭ トリス−塩酸 pＨ７.６，０.５Ｍ ＮaＣl溶液
で平衡化したＱセファロース(ファルマシア)カラム(径
５×５cm)に通し、抽出液中の核酸成分を除去した。カ
ラムからの素通り液および２０mＭトリス−塩酸, pＨ
７.６，０.５Ｍ ＮaＣl溶液でのカラム洗液を合わせて
集めた(Ｑセファロース素通り画分４５ml)。この画分を
ヘパリンカラムShodex ＡＦ−pak ＡＨＲ−８９４，(８
mmＩＤ×５cm, 昭和電工製)を装備した高速液体クロマ
トグラフィー装置(ギルソン社)にかけた。カラムを、２
０mＭトリス−塩酸 pＨ７.６溶液，次いで２０mＭトリ
ス−塩酸 pＨ７.６，０.７Ｍ ＮaＣl溶液で洗った後、
２０mＭトリス−塩酸 pＨ７.６, バッファー中、０.７
Ｍから２ＭのＮaＣlの直線濃度勾配溶出(linear gradie
nt elution, ６０分，流速１.０ml／分)を行った。溶出
パターンを〔図６〕に示す。〔図６〕において、縦軸は
ＯＤ280の吸収値、およびグラジエント中のＮaＣｌ濃度
を示している。横軸はフラクション番号を示しており、
Ｏでグラジエント溶出を開始した。０.１分毎の画分を
分取した。これらの蛋白質の比活性、及びＮ３８回収量
を〔表２〕に示した。また、ピークを与えた各フラクシ
ョンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１２.５％ポリアクリルアミド
ゲル)を〔図７〕に示した。
【００３６】
【表２】 ────────────────────────────────── 蛋白量mg hst−２活性(μgbFGF当量) ────────────────────────────────── 粗抽出液 ５７５ ６４４ Ｑセファロース素通り画分 ４８０ ４６１ ヘパリンカラム溶出画分(23-25) ０.２２ ４３ ────────────────────────────────── b) 逆相Ｃ４ＨＰＬＣ ヘパリンＨＰＬＣカラムからの溶出画分＃２２の約半量
(タンパク約５０μg)を逆相Ｃ４カラム (ＶＹＤＡＣ)に
アプライし、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在
下に０％から１００％アセトニトリルの直線的濃度勾配
をかけ溶出パターンを調べた。流速１ml／分、勾配時間
４５分で行った〔図８〕。
(タンパク約５０μg)を逆相Ｃ４カラム (ＶＹＤＡＣ)に
アプライし、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在
下に０％から１００％アセトニトリルの直線的濃度勾配
をかけ溶出パターンを調べた。流速１ml／分、勾配時間
４５分で行った〔図８〕。
【００３７】実施例４ Ｎ３８の生物活性 実施例３−a)で得られたＮ３８の活性は佐々田らの方法
〔Sasada ら，モレキュラー セル バイオロジー（Mo
l. Cell Biol.），第８巻、第５８８−５９４頁(１９８
８年)〕に従い、マウスＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞のＤＮＡ
合成誘起能を〔3Ｈ〕チミジンの取り込みを指標として
測定した。結果を上述の〔表２〕に示した。
〔Sasada ら，モレキュラー セル バイオロジー（Mo
l. Cell Biol.），第８巻、第５８８−５９４頁(１９８
８年)〕に従い、マウスＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞のＤＮＡ
合成誘起能を〔3Ｈ〕チミジンの取り込みを指標として
測定した。結果を上述の〔表２〕に示した。
【００３８】実施例５ アミノ末端部のアミノ酸配列 実施例３−b)で得られたＮ３８の精製蛋白質２.６μg
(約１３０pmol)について気相プロテインシークエンサー
(Applied Biosystems Inc. 製，モデル４７３Ａ)を用い
て、Ｎ末端部のアミノ酸配列分析を行った。その結果を
〔表３〕に示した。この結果より、Ｎ３８のアミノ末端
部のアミノ酸配列は発現プラスミドのＤＮＡの塩基配列
より期待される配列と一致した。なお翻訳開始コドンに
由来するメチオニンは除去されていることがわかった。
(約１３０pmol)について気相プロテインシークエンサー
(Applied Biosystems Inc. 製，モデル４７３Ａ)を用い
て、Ｎ末端部のアミノ酸配列分析を行った。その結果を
〔表３〕に示した。この結果より、Ｎ３８のアミノ末端
部のアミノ酸配列は発現プラスミドのＤＮＡの塩基配列
より期待される配列と一致した。なお翻訳開始コドンに
由来するメチオニンは除去されていることがわかった。
【００３９】
【表３】 実施例６ Ｎ３８のＤＮＡ合成誘起活性 実施例３−a)で得られた精製Ｎ３８のマウスＢＡＬＢ／
c３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性を、実施例４
に記載の方法により検討し、結果を〔図９〕に示した。
〔図９〕において、○はウシ脳下垂体由来ＦＧＦの結果
を、●はＮ３８の結果を、△を黒く塗った印はヘパリン
(５μg／ml)存在下におけるＮ３８の結果を、それぞれ
示す。〔図９〕より、Ｎ３８はウシ脳下垂体由来ＦＧＦ
(宝酒造製)と同様の活性を有し、ヘパリン添加により活
性が増強されることが判明した。 実施例７ Ｎ３８のトランスフォーミング活性 Ｎ３８ １μg／mlをマウスＢＡＬＢ／c３Ｔ３ Ａ３１
細胞に添加して培養するとトランスフォーム細胞様の顕
著な形態変化が認められた。また同時にヘパリン(５μg
／ml)を添加した場合には、Ｎ３８ １０ng／mlで同様
の形態変化が認められた。 実施例８ Ｎ６３の生物活性 １０ml培養から集めた実施例２記載の菌体を０.２５ml
の氷冷１０mＭトリス−塩酸（pＨ７.４），１０mＭ Ｅ
ＤＴＡ，０.５Ｍ ＮaＣl，１０％ショ糖，１mＭＰＭＳ
Ｆに懸濁し、卵白リゾチームを０.５mg／mlとなるよう
に添加した。１時間氷中に放置後氷冷下で超音波処理
（５秒間，２回）を行い、遠心（クボタマイクロ冷却遠
心機１５０００rpm，１５分／４℃）して上清を得、こ
れを菌体抽出液とした。菌体抽出液を用いて実施例４に
記載の方法に従い、Ｎ６３の活性を測定した。その結
果、ＦＧＦ当量として約６０μg／mlのＮ６３が生産さ
れていることが分った。
c３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性を、実施例４
に記載の方法により検討し、結果を〔図９〕に示した。
〔図９〕において、○はウシ脳下垂体由来ＦＧＦの結果
を、●はＮ３８の結果を、△を黒く塗った印はヘパリン
(５μg／ml)存在下におけるＮ３８の結果を、それぞれ
示す。〔図９〕より、Ｎ３８はウシ脳下垂体由来ＦＧＦ
(宝酒造製)と同様の活性を有し、ヘパリン添加により活
性が増強されることが判明した。 実施例７ Ｎ３８のトランスフォーミング活性 Ｎ３８ １μg／mlをマウスＢＡＬＢ／c３Ｔ３ Ａ３１
細胞に添加して培養するとトランスフォーム細胞様の顕
著な形態変化が認められた。また同時にヘパリン(５μg
／ml)を添加した場合には、Ｎ３８ １０ng／mlで同様
の形態変化が認められた。 実施例８ Ｎ６３の生物活性 １０ml培養から集めた実施例２記載の菌体を０.２５ml
の氷冷１０mＭトリス−塩酸（pＨ７.４），１０mＭ Ｅ
ＤＴＡ，０.５Ｍ ＮaＣl，１０％ショ糖，１mＭＰＭＳ
Ｆに懸濁し、卵白リゾチームを０.５mg／mlとなるよう
に添加した。１時間氷中に放置後氷冷下で超音波処理
（５秒間，２回）を行い、遠心（クボタマイクロ冷却遠
心機１５０００rpm，１５分／４℃）して上清を得、こ
れを菌体抽出液とした。菌体抽出液を用いて実施例４に
記載の方法に従い、Ｎ６３の活性を測定した。その結
果、ＦＧＦ当量として約６０μg／mlのＮ６３が生産さ
れていることが分った。
【００４０】実施例９ Ｎ３８のＭＫ−ＣＳＦ活性 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週令）の大腿骨より骨髄
細胞を採取し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む
ＩＭＤＭ培地(Iscove's Modification of Dulbecco's M
edium)（Flow社）にて２×１０5 個／mlに懸濁し、プラ
スチックシャーレ上で３７℃，４５分間インキュベート
した。非付着性細胞を集め、血清を除去するためにＩＭ
ＤＭ培地で洗浄した。これら非付着性骨髄細胞（１×１
０5）をNeutridoma−sp（Boehringer Mannheim 社）を
含むＩＭＤＭ培地に懸濁し、９６穴平底プレート（ヌン
ク社）に２００μl ずつ播種した。次いで、種々の濃度
のhst−２ムテインＮ３８を単独あるいはヘパリン（２
０μg／ml）と共に添加した。３７℃で７日間培養後、
５％グルタルアルデヒド（和光純薬）を５０μl 添加
し、２０００rpm で５分間遠心して細胞を固定した。
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で簡単に洗浄し、
アセチルコリンエステラーゼ染色を行った。すなわち、
ヨウ化アセチルチオコリン（シグマ社）３０mgを０．１
Ｍリン酸緩衝液４５mlに溶解後、３０mＭ硫酸銅６ml、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム３ml、５mＭフェリシアン
化カリウム６mlを加えたものを用時調製し、各ウエルに
２００μl ずつ添加し、室温で６時間染色した。０．１
Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、倒立顕微鏡で検鏡し、巨核球
系細胞の数を数えた。〔図１０〕に示すように、Ｎ３８
はヘパリン存在の有無にかかわらずマウス骨髄中の巨核
球系前駆細胞を用量依存的に増殖させた。
細胞を採取し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む
ＩＭＤＭ培地(Iscove's Modification of Dulbecco's M
edium)（Flow社）にて２×１０5 個／mlに懸濁し、プラ
スチックシャーレ上で３７℃，４５分間インキュベート
した。非付着性細胞を集め、血清を除去するためにＩＭ
ＤＭ培地で洗浄した。これら非付着性骨髄細胞（１×１
０5）をNeutridoma−sp（Boehringer Mannheim 社）を
含むＩＭＤＭ培地に懸濁し、９６穴平底プレート（ヌン
ク社）に２００μl ずつ播種した。次いで、種々の濃度
のhst−２ムテインＮ３８を単独あるいはヘパリン（２
０μg／ml）と共に添加した。３７℃で７日間培養後、
５％グルタルアルデヒド（和光純薬）を５０μl 添加
し、２０００rpm で５分間遠心して細胞を固定した。
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で簡単に洗浄し、
アセチルコリンエステラーゼ染色を行った。すなわち、
ヨウ化アセチルチオコリン（シグマ社）３０mgを０．１
Ｍリン酸緩衝液４５mlに溶解後、３０mＭ硫酸銅６ml、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム３ml、５mＭフェリシアン
化カリウム６mlを加えたものを用時調製し、各ウエルに
２００μl ずつ添加し、室温で６時間染色した。０．１
Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、倒立顕微鏡で検鏡し、巨核球
系細胞の数を数えた。〔図１０〕に示すように、Ｎ３８
はヘパリン存在の有無にかかわらずマウス骨髄中の巨核
球系前駆細胞を用量依存的に増殖させた。
【００４１】実施例１０ Ｎ３８の内皮細胞に対する増
殖促進活性 ２％ＦＣＳ（ＭＢＡ製）を加えた改変ＭＣＤＢ１３１
（クラボウ製）でヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ細
胞）をリンブロデイッシュ（Flow社製）に５×１０3 個
／ウエルとなるようにまき、翌日種々の濃度のＮ３８を
単独あるいはヘパリン（５μg／ml）と共に添加した。
５日後の細胞数を計測した。その結果を〔図１１〕に示
す。また、培地を上記培地にＥＧＦ（上皮細胞成長因
子）を１０ng／mlになるように添加したものに変え同様
の操作を行った結果を〔図１２〕に示す。〔図１１〕お
よび〔図１２〕において、●はＮ３８単独添加時の結果
を、○はヘパリン（５μg／ml）存在下におけるＮ３８
の結果をそれぞれ示す。〔図１１〕に示すとおり、Ｎ３
８はＨＵＶＥ細胞に対する細胞増殖促進活性を有し、か
つこの活性は、ヘパリン添加により増強されることがわ
かった。さらに、〔図１２〕に示すとおりＥＧＦを１０
ng／mlになるように添加した２％ＦＣＳを含む改変ＭＣ
ＤＢ１３１培地では、両者の細胞増殖促進活性の差がよ
り顕著になることが判明した。 製剤実施例１ 実施例３で調製されたＮ３８を５０ｍＭクエン酸緩衝液
ｐＨ５．０に１晩透析した後５００μｇ／ｍｌの濃度に
調製する。この溶液をフィルターロ過により除菌、滅菌
してバイアルに１ｍｌずつ分注して注射用製剤とする。
殖促進活性 ２％ＦＣＳ（ＭＢＡ製）を加えた改変ＭＣＤＢ１３１
（クラボウ製）でヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ細
胞）をリンブロデイッシュ（Flow社製）に５×１０3 個
／ウエルとなるようにまき、翌日種々の濃度のＮ３８を
単独あるいはヘパリン（５μg／ml）と共に添加した。
５日後の細胞数を計測した。その結果を〔図１１〕に示
す。また、培地を上記培地にＥＧＦ（上皮細胞成長因
子）を１０ng／mlになるように添加したものに変え同様
の操作を行った結果を〔図１２〕に示す。〔図１１〕お
よび〔図１２〕において、●はＮ３８単独添加時の結果
を、○はヘパリン（５μg／ml）存在下におけるＮ３８
の結果をそれぞれ示す。〔図１１〕に示すとおり、Ｎ３
８はＨＵＶＥ細胞に対する細胞増殖促進活性を有し、か
つこの活性は、ヘパリン添加により増強されることがわ
かった。さらに、〔図１２〕に示すとおりＥＧＦを１０
ng／mlになるように添加した２％ＦＣＳを含む改変ＭＣ
ＤＢ１３１培地では、両者の細胞増殖促進活性の差がよ
り顕著になることが判明した。 製剤実施例１ 実施例３で調製されたＮ３８を５０ｍＭクエン酸緩衝液
ｐＨ５．０に１晩透析した後５００μｇ／ｍｌの濃度に
調製する。この溶液をフィルターロ過により除菌、滅菌
してバイアルに１ｍｌずつ分注して注射用製剤とする。
【００４２】
【発明の効果】本発明のhst−２ポリペプチドは、高い
生体組織の損傷の治癒促進作用を有するので、火傷，創
傷などの治癒促進剤などの治療薬として有利に用いるこ
とができ、また、消化管の潰瘍症の治療薬としても用い
ることができる。また血小板増加剤としても有効であ
る。本発明のhst−２ポリペプチドは、各種細胞への遺
伝子導入により大量に取得することができる。
生体組織の損傷の治癒促進作用を有するので、火傷，創
傷などの治癒促進剤などの治療薬として有利に用いるこ
とができ、また、消化管の潰瘍症の治療薬としても用い
ることができる。また血小板増加剤としても有効であ
る。本発明のhst−２ポリペプチドは、各種細胞への遺
伝子導入により大量に取得することができる。
【００４３】
配列番号（SEQ ID NO）:1 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 170 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly Glu Ile Ala 20 25 30 Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg 35 40 45 Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro 50 55 60 Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu 65 70 75 80 Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg 85 90 95 Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr 100 105 110 Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn 115 120 125 Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala 130 135 140 Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile 145 150 155 160 Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 165 170。
【００４４】配列番号（SEQ ID NO）:2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 171 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Met Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly Glu Ile 20 25 30 Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln 35 40 45 Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu 50 55 60 Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val 85 90 95 Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala 100 105 110 Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro 115 120 125 Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile 130 135 140 Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro 145 150 155 160 Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 165 170。
【００４５】配列番号（SEQ ID NO）:3 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 145 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Gly Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu 1 5 10 15 Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly 20 25 30 Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu 35 40 45 Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val 50 55 60 Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser 65 70 75 80 Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe 85 90 95 Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu 100 105 110 Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg 115 120 125 Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg 130 135 140 Ile 145。
【００４６】配列番号（SEQ ID NO）:4 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 146 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Met Gly Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr 1 5 10 15 Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile 20 25 30 Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His 35 40 45 Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly 50 55 60 Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn 65 70 75 80 Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys 85 90 95 Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp 100 105 110 Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys 115 120 125 Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro 130 135 140 Arg Ile 145。
【００４７】配列番号（SEQ ID NO）:5 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 207 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe Ile Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg 1 5 10 15 Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly Ile Leu Val Gly 20 25 30 Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu 35 40 45 Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu 50 55 60 Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly 65 70 75 80 Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His 85 90 95 Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn 100 105 110 Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser 115 120 125 Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly 130 135 140 Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu 145 150 155 160 Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln 165 170 175 Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser 180 185 190 Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 195 200 205。
【００４８】配列番号（SEQ ID NO）:6 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 208 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Met Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe Ile Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly 1 5 10 15 Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly Ile Leu Val 20 25 30 Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 50 55 60 Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val 65 70 75 80 Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe 85 90 95 His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu 100 105 110 Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val 115 120 125 Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys 130 135 140 Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg 145 150 155 160 Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr 165 170 175 Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly 180 185 190 Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 195 200 205。
【００４９】配列番号（SEQ ID NO）:7 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 174 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile 35 40 45 Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu 50 55 60 Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu 85 90 95 Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg 100 105 110 Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr 115 120 125 Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly 130 135 140 Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys 145 150 155 160 Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 165 170。
【００５０】配列番号（SEQ ID NO）:8 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）: 175 配列の型（SEQUENCE TYPE）: アミノ酸（amino acid） トポロジー（TOPOLOGY）: 直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE）: タンパク質（protein） 配列: Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu 1 5 10 15 Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu 20 25 30 Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly 35 40 45 Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His 50 55 60 Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn 65 70 75 80 Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser 85 90 95 Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly 100 105 110 Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu 115 120 125 Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln 130 135 140 Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser 145 150 155 160 Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 165 170 175。
【００５１】配列番号(SEQ ID NO)：9 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：15 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸(nucleic acid) 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖(single) トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状(linear) 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸(Other nucleic
acid) 配列(SEQUENCE DESCRIPTION):アンチセンス (ANTI-SENCE):No GGGCATATGC CTGCA 15。
acid) 配列(SEQUENCE DESCRIPTION):アンチセンス (ANTI-SENCE):No GGGCATATGC CTGCA 15。
【００５２】配列番号(SEQ ID NO)：10 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：11 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸(nucleic acid) 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖(single) トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状(linear) 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸(Other nucleic
acid) アンチセンス(ANTI-SENCE) 配列(SEQUENCE DESCRIPTION):Yes GGCATATGCC C 11。
acid) アンチセンス(ANTI-SENCE) 配列(SEQUENCE DESCRIPTION):Yes GGCATATGCC C 11。
【図１】は、hst−２cＤＮＡのオープンリーディングフ
レームを構成するリーダー配列を含むhst−２のコーデ
ィング領域より予想されるアミノ酸配列〔配列番号：
６〕を示す。
レームを構成するリーダー配列を含むhst−２のコーデ
ィング領域より予想されるアミノ酸配列〔配列番号：
６〕を示す。
【図２】は、実施例１で得られた、Ｎ３８（配列番号：
１）をコードするｃＤＮＡに相当するアミノ酸配列〔配
列番号：２〕を示す。開始コドンＡＴＧに相当する最初
の残基Ｍｅｔはその製造の間におけるプロセッシングに
よって除去されている。
１）をコードするｃＤＮＡに相当するアミノ酸配列〔配
列番号：２〕を示す。開始コドンＡＴＧに相当する最初
の残基Ｍｅｔはその製造の間におけるプロセッシングに
よって除去されている。
【図３】は、実施例１で得られた、プラスミドpＴＢ１
５４５の構築図を示す。
５４５の構築図を示す。
【図４】は、実施例２で得られた、Ｎ６３のアミノ酸配
列〔配列番号：４〕を示す。
列〔配列番号：４〕を示す。
【図５】は、実施例２で得られた、プラスミドpＴＢ１
５４７の構築図を示す。
５４７の構築図を示す。
【図６】は、実施例３で得られた、溶出パターンを示
す。
す。
【図７】は、実施例３で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
泳動パターンを示す。
泳動パターンを示す。
【図８】は、実施例３で得られた、溶出パターンを示
す。
す。
【図９】は、実施例６で得られた、マウスＢＡＬＢ／c
３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性についての結果
を示す。
３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性についての結果
を示す。
【図１０】は、実施例９で得られた、巨核球系前駆細胞
増殖促進活性試験の結果を示す。
増殖促進活性試験の結果を示す。
【図１１】は、実施例１０で得られた、細胞増殖促進活
性試験の結果を示す。
性試験の結果を示す。
【図１２】は、実施例１０で得られた、細胞増殖促進活
性試験の結果を示す。
性試験の結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】実施例９ Ｎ３８のＭＫ−ＣＳＦ活性 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週令）の大腿骨より骨髄
細胞を採取し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む
ＩＭＤＭ培地(Iscove's Modification of Dulbecco's M
edium)（Flow社）にて２×１０5 個／mlに懸濁し、プラ
スチックシャーレ上で３７℃，４５分間インキュベート
した。非付着性細胞を集め、血清を除去するためにＩＭ
ＤＭ培地で洗浄した。これら非付着性骨髄細胞（１×１
０ 5 ）をNeutridoma−sp（Boehringer Mannheim 社）を
含むＩＭＤＭ培地に懸濁し、９６穴平底プレート（ヌン
ク社）に２００μl ずつ播種した。次いで、種々の濃度
のhst−２ムテインＮ３８を単独あるいはヘパリン（２
０μg／ml）と共に添加した。３７℃で７日間培養後、
５％グルタルアルデヒド（和光純薬）を５０μl 添加
し、２０００rpm で５分間遠心して細胞を固定した。
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で簡単に洗浄し、
アセチルコリンエステラーゼ染色を行った。すなわち、
ヨウ化アセチルチオコリン（シグマ社）３０mgを０．１
Ｍリン酸緩衝液４５mlに溶解後、３０mＭ硫酸銅６ml、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム３ml、５mＭフェリシアン
化カリウム６mlを加えたものを用時調製し、各ウエルに
２００μl ずつ添加し、室温で６時間染色した。０．１
Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、倒立顕微鏡で検鏡し、巨核球
系細胞の数を数えた。〔図１０〕において、●はＮ３８
単独添加時の結果を、○はヘパリン共存下におけるＮ３
８添加時の結果をそれぞれ示す。〔図１０〕に示すよう
に、Ｎ３８はヘパリン存在の有無にかかわらずマウス骨
髄中の巨核球系前駆細胞を用量依存的に増殖させた。
細胞を採取し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む
ＩＭＤＭ培地(Iscove's Modification of Dulbecco's M
edium)（Flow社）にて２×１０5 個／mlに懸濁し、プラ
スチックシャーレ上で３７℃，４５分間インキュベート
した。非付着性細胞を集め、血清を除去するためにＩＭ
ＤＭ培地で洗浄した。これら非付着性骨髄細胞（１×１
０ 5 ）をNeutridoma−sp（Boehringer Mannheim 社）を
含むＩＭＤＭ培地に懸濁し、９６穴平底プレート（ヌン
ク社）に２００μl ずつ播種した。次いで、種々の濃度
のhst−２ムテインＮ３８を単独あるいはヘパリン（２
０μg／ml）と共に添加した。３７℃で７日間培養後、
５％グルタルアルデヒド（和光純薬）を５０μl 添加
し、２０００rpm で５分間遠心して細胞を固定した。
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で簡単に洗浄し、
アセチルコリンエステラーゼ染色を行った。すなわち、
ヨウ化アセチルチオコリン（シグマ社）３０mgを０．１
Ｍリン酸緩衝液４５mlに溶解後、３０mＭ硫酸銅６ml、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム３ml、５mＭフェリシアン
化カリウム６mlを加えたものを用時調製し、各ウエルに
２００μl ずつ添加し、室温で６時間染色した。０．１
Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、倒立顕微鏡で検鏡し、巨核球
系細胞の数を数えた。〔図１０〕において、●はＮ３８
単独添加時の結果を、○はヘパリン共存下におけるＮ３
８添加時の結果をそれぞれ示す。〔図１０〕に示すよう
に、Ｎ３８はヘパリン存在の有無にかかわらずマウス骨
髄中の巨核球系前駆細胞を用量依存的に増殖させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＳ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ (72)発明者 五十嵐 貢一 京都府京都市左京区下鴨宮崎町66番地の３ (72)発明者 寺田 雅昭 東京都練馬区関町南２丁目17番14号
Claims (17)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列で表されるポリペプチ
ド： (Met)n X Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 X は Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：１、ｎ＝１：配列番号：２〕又はその断片を
表す。） - 【請求項２】 X が Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn
Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Se
r Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly を表す請求項１記
載のポリペプチド〔ｎ＝０：配列番号：１、ｎ＝１：配
列番号：２〕。 - 【請求項３】 X Gly を表す請求項１記載のポリペプチ
ド〔ｎ＝０：配列番号：３、ｎ＝１：配列番号：４〕。 - 【請求項４】配列番号：１のアミノ酸配列を有する請求
項１記載のポリペプチド。 - 【請求項５】配列番号：３のアミノ酸配列を有する請求
項１記載のポリペプチド。 - 【請求項６】ポリペプチドがヘパリンバインディング・
セクレトリー・トランスフォーミング・ファクター２(h
st−２）活性を有するポリペプチドである請求項１記載
のポリペプチド。 - 【請求項７】ポリペプチドが請求項１、２、３、４、５
又は６記載のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ。 - 【請求項８】請求項７記載の組換えＤＮＡを含むベクタ
ー。 - 【請求項９】請求項８記載のベクターを保持する形質転
換体。 - 【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物中に次のアミノ酸配列で表されるポリペプチ
ド： (Met)n X Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 X は Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：１、ｎ＝１：配列番号：２〕又はその断片を
表す。）を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする上記ポリペプチドの製造法。 - 【請求項１１】ヘパリンバインディング・セクレトリー
・トランスフォーミング・ファクター２(hst−２）活性
を有するポリペプチドを含有することを特徴とする血小
板増加促進用組成物。 - 【請求項１２】ポリペプチドが次のアミノ酸配列： (Met)n Y Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile （式中、n は 0 又は 1 であり、 Y は Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe Ile Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly Ile Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：配列番号：５、ｎ＝１：配列番号：６〕又は
その断片を表すものである、請求項１１記載の製造法。 - 【請求項１３】 Y が Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Th
r Arg Ala Asn Asn ThrLeu Leu Asp Ser Arg Gly Trp G
ly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 〔ｎ＝０：
配列番号：７、ｎ＝１：配列番号：８〕又はその断片を
表すものである、請求項１２記載の組成物。 - 【請求項１４】ポリペプチドが請求項１、２、３、４、
５又は６記載のポリペプチドである、請求項１１記載の
組成物。 - 【請求項１５】他の生理活性成分を更に含有する、請求
項１１記載の組成物。 - 【請求項１６】他の生理活性成分が抗腫瘍剤である、請
求項１５記載の組成物。 - 【請求項１７】請求項１、２、３、４、５又は６記載の
ポリペプチドと抗腫瘍剤との薬剤調製物を組み合わせて
なる血小板増加促進用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6016219A JPH07126293A (ja) | 1993-02-12 | 1994-02-10 | ｈｓｔ−２ムテイン、その製造法および用途 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2439993 | 1993-02-12 | ||
| JP5-186507 | 1993-07-28 | ||
| JP18650793 | 1993-07-28 | ||
| JP5-24399 | 1993-07-28 | ||
| JP6016219A JPH07126293A (ja) | 1993-02-12 | 1994-02-10 | ｈｓｔ−２ムテイン、その製造法および用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07126293A true JPH07126293A (ja) | 1995-05-16 |
Family
ID=27281298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6016219A Pending JPH07126293A (ja) | 1993-02-12 | 1994-02-10 | ｈｓｔ−２ムテイン、その製造法および用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07126293A (ja) |
-
1994
- 1994-02-10 JP JP6016219A patent/JPH07126293A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040324 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040517 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040517 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050125 |