JPH03218398A - ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヘパリンバインディング・セクレトリー・ト
ランスフォーミング・ファクター（以下、本明細書にお
いてはｒｈｓｔ−１ｊと略称することもある。）の欠失
型ムテインおよびそれを製造するための技術に関する。

従来の技術 ｈｓｔ−１は、ＨＳＴＦ　１と記載されることもある（
Ｍ．　　Ｙｏｓｈｉｄａ　ら，　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａ
ｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ，ｖｏｌ
．　８５，　ｌ）Ｉ）．４８６１−４８６４（１９８８
））。

ｈｓｔ　　１遺伝子は、ヒト胃癌組織より単離されたト
ランスフォーミング遺伝子であり ［Ｈ．　　Ｓａｋａｍｏｔｏ　ら，　　Ｐｒｏｃ．　　
Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉｔｌ．ｓ．Ａ．　
８３：　３９９７（１９８６））　、その遺伝子産物は
細胞成長因子の１つである線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ
）と構造および生物活性か似ていることが判明した［Ｔ
．　　Ｙｏｓｈｉｄａ　ら，　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔ
ｌ．　　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　８４：　
７３０５（１９８７），　Ｋ．　ＭｉｙａｇａｗａらＯ
ｎｃｏｇｅｎｅ　３，　３８３（１９８ｇ）］　。また
、ｈｓｔ−１遺伝子は、胃癌のみならず大腸癌、肝癌、
エイズ患者のカポシ肉腫より分離されており〔Ｔ．　Ｋ
ｏｄａら，Ｊｐｎ．　　Ｊ，　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
．（Ｇａｎｎ）７８：　　３２５（１９８７），　　ｔ
ｌ．Ｎａｋａｇａｗａ　ら，　　Ｊｐｎ．　　Ｊ．　　
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ＞７８：６５１（１
９８７），　　Ｙ．　　Ｙｕａｓａ　ら，　　Ｊｐｎ．
　　Ｊ．　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ（Ｇａｎｎ）７８：
　１０３６（１９８７），　　Ｐ．Ｄｅｌｌｉ　Ｂｏｖ
ｉ　　ら，　　Ｃｅｌｌ５０゜７２９（１９８７））ｌ
　、この遺伝子は塩基性ＦＧＦ酸性Ｆ　Ｇ　Ｆ　，　ｉ
ｎｔ　−　２遺伝子産物なとと共にＦＧＦファミリーを
形成すると考えられている。上記カポン肉腫より分離さ
れた遺伝子はＫ−ＦＧＦとも呼ばれている。このように
ｈｓｔ−１遺伝子が細胞成長因子の働きをもつトランス
フォーミング遺伝子であることから、その遺伝子産物は
ＦＧＦと同様損傷の治療薬なとの予防治療薬となる可能
性を持っている。

ｈｓｔ　　１遺伝子の塩基配列は既に報告されており　
　［Ｍ．　　　Ｔａｉｒａ　　ら，　　　Ｐｒｏｃ．　
　　Ｎａｔｌ．　　　Ａｃａｄ．　　　Ｓｃｉ．　　　
Ｕ．ＳＡ．　　８４：　２９８０（１９８７）．　　Ｔ
．　　Ｙｏｓｈｉｄａ　ら．　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａ目
５Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４．　７３０５（
１９８７））　、同報告にはこれから推測されるｈｓｔ
−１の構成アミノ酸も示されている。

しかし天然に存在するｈｓｔ−１は極めて微量て３一 あると考えられ、未だに生体材料よりｈｓｔ−］を取得
した報告はない。

一方、ｈｓｔ−１の遺伝子組換え技術を用いた産生が報
告されている［Ｐ，　Ｄｅｌｌｉ　Ｂｏｖｉ　ら，　Ｃ
ｅｌｌ５０：　７２９（１．９８７）およびＫ．　Ｍｉ
ｙａｇａｗａら，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ３：３８３（１９
８８）〕。しかしこれらの場合においても大量生産は非
常に難しい。

発明が解決しようとする課題 上記のようにｈｓｔ−］の性質、生物活性については不
明の点が多い。しかしｈｓｔ−１は医薬品あるいは試薬
として用いられる可能性が考えられる。

しかしながら、上記したように、これまでｈｓｔ１を大
量に生産できた例はない。

そこで本発明者らは組換えＤＮＡ技術を用い、このｈｓ
ｔ−１をその活性に悪影響を及ぼさないが、微生物学的
に大量生産できるように改変することを考えた。このよ
うな改変により、」二記した細胞における産生能の」二
昇のみならずｈｓｔ　−　１の安定性，分子当りの細胞
増殖活性の上昇、さらに未知の生物活性の賦活化かなさ
れる可能性があること４ を考えた。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技術により、ｈｓｔ１遺伝
子の一部を欠失したムテイン遺伝子を作製し、微生物中
で発現されることにより、このｈｓｔ−１ムテインの細
胞内での産生能、活性の上昇および生物活性の変化につ
き鋭意研究し、これらの目的に叶うムテインを見い出し
た。さらにこれらの知見に基づいて研究した結果、本発
明を完成した。

本発明は、 （１）、ヘパリンバインディング・セクレトリー・トラ
ンスフォーミング・ファクター（ｈｓｔ−１）の欠失型
ムテイン （２）、上記（１）のムテインをコードする塩基配列を
有する組換えＤＮＡ （３）、上記（２）の組換えＤＮＡを含むベクター（４
）、上記（３）のベクターを保持する形質転換体，およ
び （５）、上記（４）の形質転換体を培地に培養する上記
（１）のムテインの製造法である。

本発明の欠失型ムテインの基となるｈｓｔ−１は、第１
図に示された１７５個のアミノ酸配列からなる蛋白質で
ある。

ｈｓｔ−１は、Ｔａｉｒａ　ら，　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎ
ａｔｌ．　　Δｃａｄ．　　Ｓｃｉ［ＪＳＡ，　ｓ４，
ｎｓｏ−２９ｓ４（Ｍｓ７’）においては、２０６個の
アミノ酸配列からなるものとして示されている。

該アミノ酸配列を第２図に示す。しかしながら、Ｄｅｌ
　Ｉ　ｉ−Ｂｏｖｉ　らは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎ
ｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，　８．　２９３
３−２９４１（１９８８）において、サルＣＯＳ−１細
胞で発現させる（目的物をＫ−ＦＧＦと称している。）
と、Ｎ末から３０個あるいは３１個のアミノ酸が脱離さ
れたものが得られることを示している。したがって、ｈ
ｓｔ　−　１の成熟タンパクとしては、」一記２０６個
のアミノ酸配列のＮ末から３１個のアミノ酸が脱離され
たアミノ酸配列（第１図に示す。）を有するものとする
のが最も妥当であると考えられる。

本発明の欠失型ムテインとしては、ｈｓｔ　−　１の構
成アミノ酸のうし少なくとも１個のアミノ酸が欠失して
おり、ｈｓｔ−１活性を有するものが挙げられる。

該欠失型ムテインとしては、ｈｓｔ　−　１の連続した
構成アミノ酸が１ないし４７個欠失しているものか好ま
しく、さらに、１ないし４３個欠失しているものが好ま
し《、１ないし２７個欠失しているものか好ましい。

本発明の欠失型ムティンのさらに好ましい例としては、
上記欠失がＮ末端より連続した構成アミノ酸が欠失して
いるものが挙げられる。

本発明の欠失型ｈｓｔ−１ムティンの化学構造は種々の
要因に負うことがある。たとえば、本ムテインは酸性塩
，塩基性塩または中性塩として得られることもある。さ
らに、本ムティンは、糖鎖脂質，アセチル基なとか付加
した誘導体となっていてもよい。本発明のムティンは、
ｈｓｔ−１の欠失型のものであって、上述の誘導体とな
っていてもよく、ｈｓｔ−１活性を有するものであれば
、本発明のムテインに含まれる。

本発明の欠失型ｈｓｔ−１ムティンの生物活性の７ 測定は、たとえば、佐々田らの方法（　Ｍｏｌ．　Ｃｅ
ｌｌＢｉｏｌ．　　８　：　５　８　８　　５　９　４
　（１９８ｇ））に従い、マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞のＤＮＡ合成誘起を［３Ｈ］チミジンの取り込みを指
標として測定することにより、多田らの方法（　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ＋　　９３＋　　ｌ　５７（１９８６））に
従い、血管内皮細胞の増殖促進を測定することにより、
またはＡｕｅｒｂａｃｈらの方Ｌ　（Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，　　４　１，　　３　９　
］　（１９７４））に従い、ニワトリ胚漿尿膜」二の血
管新生を測定することにより、行なうことができる。

本発明のｈｓｔ　−　１ムテインをコートする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現型ヘクターは、例えば、 （イ）ｈｓｔ　−　］タンパクをコードするＲＮＡを分
離し、 （口）該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、
次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、 （ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（二）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転８ 換し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばｌ）　Ｎ　Ａプローブを用いたコロニ
ーハイブリクイセーション法、により目的とするＤＮＡ
を含有するプラスミドを単離し、 くべ）そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、 （ト）該クローン化ＤＮＡ上に目的に叶う欠失を生じさ
せ、 （チ）場合によりＡＴＧコドンを含むオリゴヌクレオチ
ドを結合させ、 （り）該ＤＮＡをビークル中のプロモーターの下流に連
結する、ことにより製造することができる。

ｈｓｔ−１をコードするＲＮＡは、ヒトの種々の癌細胞
、例えば、胃癌，大腸癌，肝癌，カボシ肉腫，ヒト胚細
胞性腫瘍，ヒトｈｓｔ−１遺伝子によるＮＩＨ３Ｔ３ト
ランスフォーマントなどから得ることができる。

ヒトの癌からＲＮＡを調製する方法としては、グアニジ
ンチオシアネート法［Ｊ，　Ｍ．　Ｃｈｉｒｇｗｉｎら
，バイオケミストリ−（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌｌ
８　５２９４（１９７９）〕などが挙げられる。

このようにして得られたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを
合成し、例えばｌｌａｔｓｏｎとＪａｃｋｓｏｎの方法
（Ｗａｔｓｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏ
ｎ，　Ｊ．　Ｆ．，　ＤＮＡクローニング・ア・プラク
ティカル・アプローチ（ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　
Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）ＩＲ　Ｌ
　　Ｐｒｅｓｓ．　Ｏｘｆｏｒｄ，　ｐ７９．　　１９
８５）に従って例えばλファージベクター　λｇｔ　ｌ
　Ｏ　（Ｈｕｙｎｈ，　Ｔ．　Ｖら，ＤＮＡクローニン
グ・ア・プラクティカル・アプローチ，　　Ｉ　Ｒ　Ｌ
　　Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ，　ｐ４９．　　１９
８５）に組みこみ、これを大腸菌，例えばＣ６００　　
ＨｆｌＡ　（Ｈｕｙｎｈ．　Ｔ．　Ｖ．　　ら，同上）
に感染させ、ｃＤＮＡライブラリーを作成することがで
きる。

このようにして得られたｃＤＮＡライブラリーより、自
体公知の方法、例えばプラーク・ハイブリタイゼーショ
ン法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら　モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ］｛ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ＋　ｐ３２０．　　１９８２）およひＤＮＡ塩基配列
決定法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ
．　ＬＩＳＡ　７４，５６０（１９７７），　　ニュー
クレイック　アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）　　９，　　３０９
（１９８１）’］を用い、求めるファージクローンを選
出する。

次に、該ファージクローンを集め、例えばＤａｖｉｓ　
らの方法（Ｄａｖｉｓら，アドパンスト・バクテリアル
・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ）．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８０）によ
り、ファージＤＮＡを抽出して、そのｃＤＮＡ部分を制
限酵素を用いて切り出し、これをプラスミド例えばｐＵ
ｃ１３等に組みこみ直して、使用するのも好都合である
。

上記クローン化されたｈｓｔ−１をコードする塩基配列
を含有するＤＮＡを有するプラスミドはそのまま、また
は所望により制限酵素で切り出す。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

本発明のムテインを製造するためには、従来の１ｌ 組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術
（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール・エ
フ・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ．　Ｒ．　Ｆ．　）及ひジ
ェイ・ピー・レコソク（Ｌｅｃｏｑ，　Ｊ．　Ｐ．　）
，シェネティック・エンシニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ
　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミックプレス社
（１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。オリ
ゴヌクレオチトに指示された変異誘発はエム・スミス（
Ｓｍｉｔｈ，　　Ｍ．　）及びエス・キラム（Ｇｉｌｌ
ａｍ．　　Ｓ．　）、シ工不ティック・エンンニアリン
グ，原理と方法、プレナムプレス社（１．９８１年）３
巻　１−３２頁に示されている。

本発明のムテインをコードする構造遺伝子を製造するた
めには、たとえば、 （ａ）　ｈｓｔ　　１の構造遺伝子の１本鎖からなる１
本鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチトプライマーと
雑種形成させる、 （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ
、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させる、及び １２ （ｃ）この突然変異性ヘテロニ量体を複製する。

オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成
に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレ
オチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチ
ドで指示される突然変異誘発に使用するオワゴヌクレオ
チＦを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば全
体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさ）
は、エム・スミス及びエス・ギラム（　前掲）によって
記述されている。概して、オリコヌクレオチドの全長は
、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適
化するような長さであり、突然変異サイトから５′及び
３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）は、
ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーセ活性による突
然変異の編集をさけるのに十分な大きさとする。本発明
に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチド
は、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ましくは
約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは約１４
個ないし約１８個の塩基を含有する。これらは通常、変
更されるコドンの少なくとも約３個の３′側塩基を含有
する。

ｈｓｔ−１構成アミノ酸が欠失しているムテインを得る
目的の場合における変異ｈｓｔ−１遺伝子を作る方法と
しては、三つの場合か考えられる。ひとつはｈｓｔ　−
　１のアミン末端を欠失させる場合、二つめはｈｓｔ−
１の中央部分を欠失させる場合、三つにはｈｓｔ−１の
カルポキシル末端を欠失させる場合である。

アミン末端を欠失させる場合には欠失させようとするア
ミノ酸配列のカルホキシル末端をコートする遺伝子のコ
ドンをＭｅｔをコードするＡＴＧに特定部位指向性変異
法を用いて変更し、さらにそのフトンの５′末端側に適
当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーターと
の連結（］　ｉｇａｔ　ｉｏｎ）を容易にさせるか、あ
るいは制限酵素でアミノ末端を欠失させた遺伝子にＡＴ
Ｇをもつオリコヌクレオチドを読み取り枠を合わせて結
合させる。

アミノ酸配列をその中央部分て欠失させる場合には欠失
させたい配列をコードする遺伝子の５′および３′末端
側にユニークな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変
異法を用いて生成し、この部位を酵素によって消化して
抜きとり、再連結によって遺伝子をもとにつなげば目的
のアミノ酸を欠失したｈｓｔ−１をコードする遺伝子が
でき上る。

このとき制限酵素消化により読み取り枠がすれないよう
にすることは云うまでもない。

カルポキシル末端側のアミノ酸配列を欠失させる場合に
は、欠失させたい配列のアミノ末端側のアミノ酸をコー
ドする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異によってス
トップコドンに変更すればよい。

本発明の欠失型ムテインは、ｈｓｔ−１の構成アミノ酸
が欠失し、さらにその中の少なくとも１個のアミノ酸が
別のアミノ酸で置換されているものであってもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイン
，システイン以外のもの（Ｌ　アスパラギン酸，アルギ
ニン）が挙げられる。

１５ 置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン，パリン，アラニン，ロイシン，インロ
イシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチシン，ト
リプトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなとか
挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン，スレオニンバリンフェニルアラニン，アルギニ
ンなどが挙げられるか、特にアスパラキン，アルギニン
が好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルキニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン，１６ スレオニンロイシンフェニルアラニン，アスパラギン酸
が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

特定部位指向性変異により本発明のｈｓｔ　−　１の欠
失ムテインを産生させる時に、ＤＮＡ配列に複数個の変
異を行ってもよいこと、すなわち、アミノ酸に対応して
いるＤＮＡのコドンは縮退していることを認識しておか
なければならない。

たとえば、構成アミノ酸がシステイン以外のアミノ酸で
あってこれを他のアミノ酸に置換したムテインを得る目
的の場合における変異ｈｓｔ　−　１遺伝子を作る方法
としては、システインの場合と同様にして、オリゴヌク
レオチドプライマーによるコドンの変更を行う。

たたしオリコヌクレオチドプライマーのテザインはとの
アミノ酸を変更するかで異なることは五うまでもない。

ブライマーは、ｈＳｔ−１遺伝子の１本鎖がクローン化
されたＭ　ｌ　３　　［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ
，　　ＣＶｉｅｉｒａ，　　Ｊ．　　Ｍｅｓｓｉｎｇ＋
シーン（Ｇｅｎｅ）．　３　３　　１　０　３１　１　
９　（１　９　８　５），Ｍｅｓｓｉｎｇ　　Ｊ．メ７
７ズ・イン噛エンジーモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌ１０１　　　２０−７８（１
９８３）］ｆｄ　［Ｒ．　　Ｈ　ｅｒｒｍａｎ　　ｅｔ
　　ａｌ　　モレキュラー・アンド・シェネラル・ジェ
ネティノク（Ｍｏｌ．　　ＧｅｎＧｅｎｅｔ．），１．
７７　　２３１（１９８０）〕，又はφ×１　７４　　
ＣＭ．　Ｓｍｉｔｈ　　ａｎｄ　　Ｓ．　　Ｇｉｌｌａ
ｍ，シェネティノク●エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｖｏｌ．３＋ｐｌ）ｌ　３２（１９８１））のよ
うな１本鎖ファーンヘ雑種形成される。ファージが遺伝
子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも運搬できる
ことは認められる。ファージかアンチセンス鎖を運搬す
る時には、別のアミノ酸を暗号つけたトリプレットを決
定するこのコドンとの不一致以外にもプライマーは突然
変異させるフドンを含有するセンス鎖の領域とコドンの
縮退のために同一でない場合があってもよい。同様にフ
ァ−シかセンス鎖を運搬する時には、欠失させるコドン
と対合をつくるトリプレソト中の適当な不一致以外は、
突然変異さ且るコドンを劇有するセンス鎖の領域に対し
て相補的でない場合かあってもよい。雑種形成に使用さ
れる条件はエム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によ
って記述されている。

温度は通常、約Ｏ′Ｃないし７０゜Ｃ１　もつと一般的
には約１０’Ｃないし５０゜Ｃの範囲にある。雑種形成
後、ブライマーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なＤＮＡポ
リメラーセとの反応によってファージＤＮＡＪ二で伸長
される，生ずるｄｓＤＮＡは、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの
ようなＤＮＡリカーゼでの処理によって閉鎖環ｄｓＤＮ
Ａへ変換される。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ
ｌエンドヌクレアーゼ処理によって破壊できる。

生ずる突然変異形成へテロニ量体は、被感染能力をもつ
宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。宿主
によるヘテロニ量体の複製では、双方の鎖から子孫がで
きる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子孫から突然変
異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベ
クターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用する
。

】９ 次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドヘ組み込む。

ＤＮＡを組み込むプラスミトとしては、たとえば犬腸閑
由来のＩ）ＢＲ３２２［ジーン（ｇｅｎｅ）．　２　，
９５（１９７７）］，ｐＢＲ３２５［ジーン，　４．　
，　］．　２　１（１　９　７　８）］，ｐＵｃ　＋　
２［ジーン．１９．２５９（］　９　８　２）］．ｐＵ
Ｃ　ｌ　３　［シーン，１９，２５９（１９８２）コ、
枯草菌由来のｐＵＢ１１０［バイオケミカル・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　ｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）
．−１−１２，６７８（１９８３）］なとが挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で複製保持される
ものであれば、いずれをも用いることができる。

ブラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ．　
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　らモレキュラー●クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ　ｌｏｎｉｎｇ）　　コール
ト・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃ　ｏｌｄ
　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨ　ａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ），第２３９頁（１９８２）に記載の方法など
が挙げられる。

２０ クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型組換
えベクターを得ることができる。

絹換えベクターを作成するためのビークル（ベクター）
としては、たとえば大腸菌由来のプラスミ　ドｐＢＲ３
２２．［ジーン（ｇｅｎｅ），　　２．　　９５（１！
１７７）Ｅ，ｐＥ３　Ｒ　３　２　５　［シーン，　　
４，　　１２１．（１９７８）］．　　Ｉ）Ｕ　Ｃ　１
　２［ジーン，　　１９，　　２５９（１９８２）］．
　　ｐＵＣ　１　３［ジーン，１９，　２５９（１９８
２）］）、枯草菌由来のｐＵＢ１１０［バイオケミカル
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌＲｅｓｅａｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），
　　１１２．　　６６７８（１９８３）］ｐＴＰ５，１
）Ｃ１９４），酵母由来ブラスミド（例、ｐＳＨ１９，
ｐｓＨ１５），あるいはλファージなどのバクテリオフ
ァージおよびレトロウイルス　ワク／ニアウイルスなど
の動物ウイルスなどがあげられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡＸＴＧＡまたはＴＡＧを有していでもよい。さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する。本発明で用いられるプロモーターとしでは、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェワヒア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒ
ｅｃＡプロモーター，λｐＬ　　プロモーターσｐｐプ
ロモーター，Ｔ７プロモーターなどか、宿主がバチルス
属菌である場合は、ＳＰ○１プロモーター，ＳＰ○２プ
ロモーター，ｌ）ｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母
である場合は、Ｐ　Ｈ　０　５プロモーター，ＰＧＫプ
ロモーター　ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーター
なとが好ましい。とりわけ宿主かエンエリヒア属閑でプ
ロモーターがｔｒｐプロモーターまたはＴ７プロモータ
ーであることか好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけＳＶ４　Ｑ由来のプロモ−夕−か好ましい。

このようにして構築されたＤＮＡを含有するヘクターを
用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリヒア属閑，バチルス属
菌，酵母，動物細胞なとが挙げられる。

上記エシェリヒア属閑の例としては、エシェリヒア・コ
リ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　
２Ｄ　Ｈ　１［Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ
．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ，６０＋　１　６０（１９６
８月，ＭＩｏ３　［ヌクレイック・アシッズ一ノサーチ
，　　（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ｃｉｄｓ　　Ｒ　ｅ
ｓｅａｒｃｈ）９，３０９（］　９８　１）］，ＪＡ２
２　１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロシ
−（Ｊ　ｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｂ　ｉｏ１ｏｇｙ）上２０，５１７（１９７　８）］，
ＨＢ　１　０　１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー，土↓，４　５　９（１　９　６　９）］
，Ｃ６００「ジェネティックス（Ｇ　ｅｎｅｔｉｃｓ）
，　３　９　，　４　４０（１９５４）］などか挙げら
れる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　Ｉ
　１　１　４　［（ジーン，７４，２５５（１　９８３
）］，２０７−２　１［ジャ２３ −ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９　５．　８　
７　（１　９　８　４　）］などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツ力口マイセスセレビシ
アエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ−．ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−
５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、株化したもの（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ
）が好ましく、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７［セル（ｃ
ｅｌｌ），　　２３，　　１５７（１９８１）］，　Ｖ
　ｅｒｏチャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ
細胞，ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばＰ
ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　Ｕ
ＳＡ，６９２　１　１０（１　９７２），ジーン，１７
，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわ
れる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｇ　ｅｎｅｒａｌ　　Ｇ　ｅｎｅ
ｔｉｃｓ），２４ １６８，］　１　１．（１　９７９）なとに記載の方法
に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰ　ｒｏｃＮａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　７５：ｌ９２
９（１　９　７　８）に記載の方法に従って行なわれる
。

動物細胞を形質転換するには、たとえばウ゛イロロジ−
（Ｖｊｒｏ１ｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載
の方法に従って行なわれる。

このようにして、ｈｓｔ−１の欠失型ムテインｃＤＮＡ
を含有するベクターで形質転換された形質転換体か得ら
れる。

宿主がエシエリヒア属菌，バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源，窒素源，無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース，デキストリン，
可溶性澱粉，シヨ糖なと、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスチープ・リカー，
ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイシａ抽
出液などの無機または有機物質，無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム塩化マグネ
シウムなとがあげられる。また、酵母エキス，ビタミン
類，生長促進因子なとを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ
，ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジェネティノクス（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ），　４　３　１　−４　３
　３，　Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　１　
９　７　２）］が好ましい。ここに必要によりプロモー
ターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インド
リル　アクリル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシ．　＋７ヒア属閑の場合、培養は通常約１５
〜４３゜Ｃで約３〜２４時間行い、必要により、通気や
撹拌を加えることもできる。

宿主かバチルス属閑の場合、培養は通常約３０〜４０’
Ｃで約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加
えることもてきる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂ　ｏｓｔｉａｎ，　　Ｋ　．　　Ｌ　
．　　らＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　　Ｓｃ
ｉ．　　ＵＳＡ，７　７，４５０５（１．９８０）］か
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい。培養は通常約２０’Ｃ〜３５゜Ｃて約２４〜７２
時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主か動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、ＭＥＭ培地［サイエンス（３　ｃｉｅｎｃｅ）
上λｔ，５０　１（１　９５２）］．ＤＭＥＭ培地［ウ
゛イロロシー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１　
９５９）コ，ＲＰＭｌ　１６４０培地［ジャーナル・オ
ブ・ザ・アメリカン・メティカル・アソシエーション（
Ｔ　ｈｅＪｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　　ＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
）　　１９９，５１９（１９６７）］１９９培地［プロ
シーディング・オブ・ザ・ソサ２７ イエティ・フォー・サ・ハイオロシカル・メデイスン（
Ｐ　ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　　ｏｒｔｈｅ　　Ｓ　ｏｃｉ
ｅｔｙ　　Ｉ’ｏｒｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１（１９５０）］なとか挙
げられる。これにさらに約５〜２０％の胎児牛血清を添
加しても良い。ｐＨは約６〜８であるのか好ましい。培
養は通常約３０〜４０’Ｃ，培養時間は約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からｈｓｔ　−　１欠失型ムテインを分離精
製するには、例えば下記の方法により行うことができる
。

ｈｓｔ　−　１の欠失型ムテインを培養菌体あるいは細
胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で閑体
あるいは細胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白
質変性剤を含む緩衝液に懸濁して閑体外に目的の蛋白を
溶出さ且る方法、フレンチプレス、Ｍ３　音波、リゾチ
ーｌ・および（または）凍結融解によって菌体あるいは
細胞を破壊したのち、遠心分離によりｈＳｔ−１の欠失
型ムテインを得る方法なとか適宜用い得る。とりわけ、
リゾチーｌ・２８ と超音波処理を併用する方法が好ましい。

上記」二澄液からｈｓｔ　−　１の欠失型ムテインを精
製するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わ
せて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法
としては、塩析や溶媒沈澱法なとの溶解度を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドケル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフイー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティーク口マ
トグラフイーなとの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフイーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法なとの等電点の差を利用する
方法などが挙げられる。

さらに具体的には、」二記上澄液をＤＥＡＥセルロース
なとを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかけ
ることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くこと
ができる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥセルロース力ラムに」二澄液をかけ
、素通り画分を集めるごとは有効である。また、さらに
ＣＭセルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグ
ラフイーにかけることにより、ｈｓｔ　−　１の欠失型
ムテインを担体に吸着させ、塩溶液を用いてこれを溶出
させることにより精製することができる。

ＣＭセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマトグラ
フィーにより、菌体抽出液から直接、ｈｓｔ−１の欠失
型ムテインを精製することができる。たとえば、上清液
を、弱酸性緩衝液（例、リン酸緩衝液）で平衡化したＣ
Ｍ−セルロースカラムにかけることにより、効率良く行
なうことができる。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラ
ムを、塩（例、ＮａＣｌ）をさらに含有する緩衝液を用
いて溶出することにより、ｈｓｔ−１の欠失型ムテイン
を溶出させることができる。これらの溶出液は透析後、
凍結乾燥することができる。

マタ、ヘバリンーセファロースを担体としたアフィニテ
ィーク口マトグラフイー法を、ｈＳｔ＝１の欠失型ムテ
インの精製法として、大腸菌抽出液中のｈｓｔ−１の欠
失型ムテインにも適用すると好都合である。たとえば中
性附近のトリス，リン酸なとの緩衝液で平衡化したヘパ
リン・セファロースカラムに、上記溶出液をかけ、十分
洗った後、Ｎ　ａｃ１などの直線勾配溶出を行うことに
よりｈｓｔ１の欠失型ムテインを精製することかできる
。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
１）ンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−ｐ
ａｋＨ　Ｒ・８９４，昭和電工製など）は有効である。

上記ヘパリンセファロース力ラムと同様に、中性附近の
緩衝液てサンプルをかけ、十分洗ったのちＮ　ａｃＩな
との直線勾配溶出を行うと、ｈｓｔ−１の欠失型ムテイ
ンはほぼ均一な標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防《ことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適で３１ ある。還元剤としてはβ−メルカプトエタノール，ジチ
オスレイトール，グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして、実質的にパイロジェンもエンドトキシ
ンも含まない、実質的に純粋なｈｓｔ　−　１の欠失型
ムテインが得られる。本発明の実質的に純粋なｈｓｔ−
１の欠失型ムティンきしては、蛋白質含量としてｈｓｔ
　−　１の欠失型ムティンが９５％（Ｗ／ｗ）以上であ
るもの、さらに好ましくはｈｓｔ　−　１の欠失型ムテ
ィンが９８％（ｗ／ｗ）以上であるものが挙げられる。

該ポリペプチドはそのＮ末端にＭｅｔを有していてもよ
い。

かくして生成するｈｓｔ　−　１の欠失型ムテインの活
性は、公知のＢＡＬＢＡ／ｃ３Ｔ３細胞の増殖促進効果
などにより測定することができる。

本発明のＤＮＡで遺伝子感染または形質転換した細胞で
は、本来わずかのｈｓｔ−１の欠失型しか合成されない
、あるいは全く合成されない各種細胞においても大量の
ｈｓｔ−１の欠失型ムティンを産生せしめることができ
、ｈｓｔ−］の欠失型ムテ３２ インを有利に導《ことができる。

本発明のｈｓＬ−　１の欠失型ムテインをコートする遺
伝子を含有する発現型プラスミ１−は、これを各種細胞
に導入することにより該細胞にｈｓｔ−１の欠失型ムテ
インを産生させることができるため、ｈｓＬ　−　１の
欠失型ムテインを大量に取得することかできる。

ここに製造されるｈｓｔ−１の欠失型ムテインは、血管
内皮細胞などの細胞の増殖促進活性や血管新生促進作用
を有し、毒性は低いので、火傷，創傷，術後組織などの
治癒促進剤なとの治療薬として用いることができる。ま
た、細胞培養を促進させるための試薬として用いること
ができる。

本発明のｈｓｔ−１の欠失型ムテインを医薬として用い
るには、そのまま粉末として、または他の薬理学的に許
容されうる担体，賦形剤，希釈剤とともに医薬組成物（
例、注射剤，錠剤，カプセル剤，液剤，軟膏）として、
温血浦乳動物（例、ヒト，マウス，ラット，ハムスター
，ウサギ，犬，ネコ）に対して非経口的または経口的に
安全に投与することができる。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠剤，カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製しうる。さらに、医薬組成物としての注射剤，液
剤，錠剤８カプセル剤等を製造する際には、無菌条件下
で行なう。

本発明のｈｓｔ　−　１の欠失型ムティンを上記した医
薬として用いる場合には、たとえば上記した温血動物に
、投与ルー１・，症状なとを考慮して、１日量約１ｎｇ
ないし１００μｇ／ｋｇの中から適当量を選んで投与さ
れる。

また、本発明のｈｓｔ−１の欠失型ムティンを細胞培養
を促進させるための試薬として用いる場合、培地ｌＱあ
たり約０．０１〜１０μｇ１さらに好ましくは約０．１
〜１０μｇとなるように培地に加えることが好ましい。

本発明のムテインは、すぐれた細胞増殖促進活性などを
示し、また酸性条件下で安定であるので、潰瘍たとえば
消化管の潰瘍症の治療薬としても用いることができる。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ｌ　ＩＪＰＡＣ，−１ｔＪ　Ｂ
　　Ｃ　ｏｍｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌＮ　ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号ある
いは当該分野における慣用略号に基つくものであり、そ
の例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体かあ
りうる場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものと
する。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　　・相浦的デオ牛シリボ核酸Ａ　　　・ア
デニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　：グアニン Ｃ　　　：シトシン ＲＮＡ　　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ　　　デオキシアデ／シン三１ノン酸ｄＴＴＰ
　　　：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　：デ
オキシグアノシン三リン酸ｄｃＴＰ　　　：デオキシシ
チジン三リン酸３５ ＡＴＰ Ｔｄｒ ＥＤＴＡ ＳＤＳ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ｃｙＳ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Δｓｐ １−ｙＳ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ アテノシン三リン酸 ：チミジン ：エチレンシアミン四酢酸 コドデ／ル硫酸ナトリウム グリンン ゛アラニン パリン ロイシン イソロイシン セリン ：スレオニン ：システイン ：メチオニン ：グルタミン酸 アスパラキン酸 リジン ・アル牛ニン ：ヒスチジン ：フェニールアラニン チロシン ３６ Ｔｒｐ　　　　ニトリプトファン Ｐｒｏ　　　　・プロリン Ａｓｎ　　　　：アスノ寸ラギン Ｇｌｎ　　　　：グルタミン 後述の実施例で得られた形質転換体は、財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ）に寄託され、また、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に
基づく寄託として寄託されている。受託番号および受託
日を次の第１表に示す。

（以　下　余　白） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
か、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例で得られたＮ末端よりアミノ酸番号２７ま
てが欠失したムテインをｈｓｔ−１ムテインＮ２７と称
し、そのアミノ酸配列を第３図に示す。

実施例１ ａ）発現プラスミトの構築 ヒトｈｓＬ−１ｃＤＮＡを含むプラスミトｐＫＯｃ５（
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳ
Ａ　８４．　２９８０−２９８４（１９８７））をＨｉ
ｎｄｕで切断し、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーセ
ｌ　　Ｋｌｅｎｏｗ断片反応により平滑化した。ここに
ＢａｍＨＩリンカーをＴ４リガーゼ反応により連結した
のち、ＢａｍＨ　Ｉ　−Ｓ　ｔｙｌで切断して０．４９
ｋｂＤＮＡ断片を得た。合成オリゴヌクレオチ｝　　５
’ＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣ３′お
よび５’ＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧ
ＣＡ３’を上記０．４９ｋｂＤＮＡの５′末端側に連結
して得られた０．５　１ｋｂ　Ｎｄｅｌ３９ ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片（開始コドンＡＴＧ　　ヒ｝
ｈｓｔ−１　　ｃＤＮＡのヌクレオチドＮｏ．４．１３
〜９１６を含む）を、Ｔ７ファーシのφ１０プロモータ
ーを有する犬腸閑用発現ベクターｐＥＴ３ｃ（Ｇｅｎｅ
　５６，　　１２５−１３５（１９８７））のＮｄｅｌ
−ＢａｍＨ　Ｉ間に組み込んでｐＴＢ１０５１を得た（
第４図）。

ｂ）ｃＤＮＡの大腸閑での発現 大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７ファーシのＲＮＡポリメラー
セ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒ，　Ｆ．　！Ｉ．ら　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　
１８９：　１１３−１３０（１９８６））を溶原化させ
、さらにＴ７ファージのリゾチーム遺伝子をもつプラス
ミトｐＬｙｓＳ　（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．　Ｗ．　　ら
Ｊ．　　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏ１．　　１８９：　１１３−
１３０（１９８６））を導入し、大腸菌ＭＭ　２　９　
４　（Ｄ　Ｅ　３　）／　ｐＬｙｓＳ株を作製した。

上記（ａ）で得られたプラスミドｐＴＢ］０５１を、こ
の大腸菌ＭＭ　２　９　４　（Ｄ　Ｅ　３　）／　ｐＬ
ｙｓＳ株に導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐｌ
、ｙｓＳ，　ｐＴ　Ｂ　１０５１（ＩＦＯ　　１４９５
２　　ＦＥＲＭ　　ＢＰ２６２１）を作製した。この閑
を１０μｇ／威クロ４０ ラムフェニコール，３５μｇ／威アンピンリンを含むＩ
７培地で培養し、Ｋ　Ｉｅｔｔ値が約１２０の時点で、
イソプロピルβ一Ｄチオガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴ
Ｇ）を最終濃度が０．４ｍＭになるように加え更に４時
間培養を継続した。菌体を遠心により集め、水冷したフ
ォスフェートバッファードセライン（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）で
洗った後、再集菌し使用時まで２０°Ｃに保存した。

Ｃ）組換え型ｈｓｔ−１ムティンの精製ｌＱｌｉｔｅｒ
培養から集めた閑体を２５０滅の水冷１　０，ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｆ２（ｐＨ　７．４），　１　０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ，０．５Ｍ　ＮａＣＩ２．１　０％シヨ糖，ｌｍ
ＭＰＭＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを０　．　５　ｍ
ｇ／蔵となるように添加した。１時間水中に放置後３７
゜Ｃで５分間インキユベートし、水冷下で超音波処理（
２０秒間，２回）を行い、遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ，１　
８Ｋｒｐｍ，　　３　０ｍｉｎ，　　４°Ｃ）Ｌて土清
を得、これを菌体抽出液とした。

菌体抽出液２５０滅を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｐＨ
７．６，０．５Ｍ　ＮａＣ（溶液で平衡化したＱセファ
ロース（ファルマシア）カラム（径５　Ｘ　５　ｃｍ）
に通し、抽出液中の核酸成分を除去した。カラムからの
素通り液および２　０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−　Ｈ　Ｃ
　Ｑ．．　ｐＨ７．６，０．５Ｍ　ＮａＣＱ溶液でのカ
ラム洗液を合わせて集めた（Ｑセファロース素通り画分
４５０滅）。この画分をヘパリン力ラムＳｈｏｄｅｘ　
Ａ　Ｆｐａｋ　ＨＲ　　２０９４，（２ｃｍｌ　ＤＸ２
５ｃｍ，昭和電工製）を装備した高速液体クロマトグラ
フィー装置（ギルソン社）にかけた。カラムを、２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ　ｐｌ｛　７．６溶液，次いて２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣρ　ｐＨ７．６．０．５Ｍ　ＮａＣ
（！溶液で洗った後、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　ｐ
Ｈ７．６，　バッ７７一中、０．５Ｍから２Ｍ（７）Ｎ
ａＣ（２（７）直線勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ，　　］　８　０ｍｉｎ，流
速６．０蔵／ｍｉｎ）を行った。

溶出パターンを第５図に示す。第５図において、縦軸は
○Ｄ　２８０の吸収値、およびグラジェント中のＮａＣ
（ｌ濃度を示している。横軸はフラクション番号を示し
ており、ｔ　ｉｍｅＯでグラジエント溶出を開始した。

０．７５分毎の画分を分取した。これらの蛋白質の比活
性、及びｈｓｔ−１ムテイン回収量を第２表に示した。

また、ピークを与えた各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（１　２．５％ポリアクリルアミドケル）を第６図に
示した。

第２表 粗抽出液　　　　　　　　２５３０　　　　　　３．８
ＱＩ！万叶ス素通り画分　　　　２２４０　　　　　　
　５．２ヘパリン力ラム溶出画分（４７−６０）　　　
　　６．５ｄ）逆相Ｃ　４　Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ ヘバリンＨＰＬＣ力ラムからの溶出画分＃５６の約半量
（タンパク３００μｇ）を逆相Ｃ４カラム（ＶＹＤＡＣ
）　ニ−ｒプライし、０，１％ＴＦＡ存在下に０％から
９０％アセトニトリルの直線的濃度勾配をかけ溶出パタ
ーンを調べた。流速１顎／ｍｉｎ．、勾配時間６０分で
行った（第７図）。３６〜３７分に検出されたピーク画
分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１　２５％ポリアクリルアミド
ゲル）をヘパリン力ラム４３ からの溶出画分５６と共に第８図に示す。

なお、第８図において、１は分子量マーカー（５　０　
ｎｇ）の、２はへパリ７ＨＰＬＣカラムより溶出された
フラクション５６（５０ｎｇ）の、３はヘパｊンＨＰＬ
Ｃ力ラムより溶出されたフラクション５６（１００ｎｇ
）の、４は逆相Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ溶出画分（５　０　ｎｇ
）の、５は逆相ＨＰＬＣ溶出画分（１００ｎｇ）の１２
．５％ポリアクリルアミトケル電気泳動のパターンをそ
れぞれ示す。また、これらの蛋白の比活性は組換え型ヒ
トｂＦ　Ｇ　Ｆ　（ｒｈｂＦＧＰ）　（ヨーロッパ特許
公開第２３７，９６６号公報）を１．００とした場合０
．４３と測定された。これら精製過程の比活性の変化、
およびｈｓｔ−］ムテインＮ２７の回収量を第３表に示
した。なお、第３表において、比活性は、ウシ脳下垂体
由来ＦＧＦ（宝酒造製）の活性を１とした。

このようにして、第３図に示すアミノ酸配列を有するｈ
ｓｔ　−　１ムテインＮ２７を得た。

４４ ｅ）生物活性 ｈｓｔ　　１ムテインの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓ
ａｄａ　ら，　　Ｍｏｌ．　　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ１．　
　８：　５８８−５９４（１９８ｇ））に従い、マウス
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃ３　Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起を［
３Ｈ〕チミジンの取り込みを指標として測定した。結果
を上述の第２表に示した。

実施例２　（血管内皮細胞増殖の促進）実施例１で得ら
れたｈｓｔ　−　１ムテインＮ２７について、細胞の増
殖におよぼす作用について以下のように測定を行なった
。本検定に用いられた細胞は、ヒト謄帯より単離された
静脈血管内皮細胞（以下Ｈ　Ｕ　Ｖ　Ｅ細胞）である。

また、細胞増殖度の測定には以下に述べるＭＴＴア．，
セイ法を用いた。

ＭＴＴアッセイの手法は多田らの方法［ジャーナル　オ
ブ　イム７口シカル　メソッド（Ｊ．　ｌｍｍｕｎｏｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）、９３、１５７（’１９８６）］に若
干の変更を加えた。

即ち、継代維持されているＨＵＶＥ細胞を０００２％Ｅ
ＤＴＡ（同仁化学株式会社製，　３４５−０１８８２）
を含む０．１２５％トリブシン酵素溶液（ベーリンガー
マンハイム社製）を用いて単一細胞に解離し、得られた
細胞を、牛胎児血清（ウイタカーハイオプロダクト社製
）を２．５％含む、ＧＩＴ培地（日本製薬製，　３９８
−００５１５）からなるＨ　Ｕ　Ｖ　Ｅ細胞培地に懸濁
した。この細胞懸濁液に含まれる細胞数をコールター細
胞数計測機（コールター社，ＺＭ型）を用いて算出し、
以下の培養に供した。２Ｘ１０３個のＨＵＶＥ細胞を含
む１００μＣのＨ　Ｕ　Ｖ　Ｅ細胞懸濁液を９６穴培養
皿（ヌンク社，Ｆ９６）に加え、３７゜Ｃで培養したく
日立炭酸カス−窒素ガス制御培養機ＣＨ−１６型、ｃｏ
２：　５％、Ｏ，：７％）。

培養翌日に、各々のサンプルを、ＨＵＶＥ細胞培地を用
いて調製し、それぞれ１００μρずつを、９６穴培養皿
で培養されたＨＵＶＥ細胞に加えた。

検定に用いたサンプルは、■ｈｓｔ　−　１ムテインＮ
２７を終濃度、Ｏ．　Ｏ　Ｏ　４　ｎｇ／滅から２　．
　Ｏ　ｎｇ／　Ｊになるよう調製されたものを用いた。

■土記ｈｓｔ１ムテインＮ２７にたいして、さらにヘパ
リン（シグマ社製）を終濃度５．０μｇ／威になるよう
に添加したものである。各サンプルを加えたのち、さら
に培養を３日間行ない、培養皿より培地を除き、１．０
ｍｇ／蔵のＭＴＴ試薬（同仁化学株式会社製，　３４１
０１８２３）を含むＨＵＶＥ培地を１００μＱ加え、３
７゜Ｃで４時間保温した。その後、１０％ＳＤＳ水溶液
（和光純薬工業製，　１９１−０７１４５）を１００μ
ρ加え、４時間保温を続けた。反応終了の後、反応液を
含む９６穴培養皿を振盪し、反応液の波長５９０ｎｍに
おける吸収を、マイクロタイタープレート吸光度測定機
（タイターテック社製，ＭＣＣ３４１）を用いて測定し
た。得られた結果を第９図に示す。

第９図において、横軸は、血管内皮細胞の培養液に加え
たｈｓｌ−１ムテインＮ２７の濃度を示す。

縦軸は培養終了の後、ＭＴＴ試薬を加えて反応させ、Ｓ
ＤＳ溶液で反応産物を可溶化させた後に測４７ 定された溶液の波長５９０ｎｍにおける吸光度であり、
その量は細胞量に対応する。ｈｓｔ−１ムテインＮ２７
単独を添加した場合を■の実線で示し、各濃度のｈｓｔ
−１ムテインＮ２７にヘパリンを加えた場合を●の破線
で示した。このように、ｈｓｔ１ムテインＮ２７は、検
討した濃度の範囲で、それ単独ではＨＵＶＥ細胞にたい
する細胞増殖促進の活性を示さず、５．０μｇ／歳のヘ
パリンと共存させた場合には、Ｈ　Ｕ　Ｖ　Ｅ細胞の増
殖を促進した。

実施例３　　（ＣＡＭアッセイ） 実施例１で得られたｈｓｔ−１ムテインＮ２７について
Ｃ　Ａ　Ｍ（Ｃｈｏｒｉｏ　Ａｌｌａｎｔｏｉｃ　Ｍｅ
ｍｂｒａｎｅ）アッセイを行なった。ＣＡＭアッセイの
手法はオウルバノハ（Ａｕｅｒｂａｃｈ）の方法Ｕテベ
ロプメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），　４１，３９１（１９７４）
］に若干の変更を加えた。即ち、ニワトリ有精卵を３日
間３７゜Ｃのふ卵器中でインキユベートしたのち、卵殻
をはずし、さらに１週間３７°Ｃでインキユベートした
（ナプコ炭酸ガスインキュベー４８ 夕−６３００使用、Ｃｏ，：　Ｑ％，Ｈ，Ｏ飽和）。直
径６ｍｍのポリフロピレン製ディスクに、種々の濃度の
ｈｓｔ　−　］ムテインＮ２７溶ｔ夜（ｈｓＬ−１ムテ
インＮ２７を２０ｍＭ｝リス塩酸（ｐＨ７．／ｌ）、１
，ＯＭＮａＣＱの組成からなる緩衝液に溶解したもの）
を、２００ｎｇ、５０ｎｇになるようにスポソトし、ク
リーンベンチ内で風乾した後、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ
）上に静置してさらに３日間３７°Ｃでインキユベート
し、血管形成の状況を観察した。また、ｈｓｔ　−　１
ムテインＮ２７溶液に、ヘパリン（シグマ社製）水溶液
を、１０μｇになるようにスポットしたもの、さらに対
照としてｈｓｔ−１ムテインＮ２７を含まずにウシ血清
アルブミン（シグマ社製）を等量含む溶液をスポットし
、同様に風乾した後、漿尿膜上に静置したものを作製し
た。得られた結果を第４表に示す。ｈｓｔ　−　１ムテ
インＮ２７２　０　０　ｎｇでは単独で血管新生がみら
れた。ヘパリンを併用した場合には、ｈｓｔ　−　１ム
テインＮ２７２００ｎｇだけでなく、５０ｎｇでも血管
新生がみられた。しかし緩衝液のみ、およびヘパリン単
独ては血管新生は殆どみられなかった。

第４表　ＣＡＭアソセイの陽性率（分子：陽性数、分母
実施例４　（アミノ酸組成） 実施例１−ｄ）で得られたｈｓｔ−１ムテインＮ２７の
精製蛋白質（１４μｇ）をガラス製加水分解用試験管に
とり、２００倍量（ｖ／ｗ）の、４％チオグリコール酸
を含む定沸点塩酸を加えて減圧下に封管したのち、１１
０゜Ｃで２４時間加水分解した。

加水分解後、開管し、塩酸を減圧下で除去し、残渣を０
．０２Ｎ塩酸に溶解して日立製作所製８３５型高速アミ
ノ酸分析計によりアミノ酸分析を行った。なお、シスチ
ンおよびシステインは計測していない。各アミノ酸の残
基数を算出し、その結果を第５表に示した。

第５表に示したアミノ酸の残基数は、ｃＤＮＡの塩基配
列より推定されるｈｓｔ〜１ムテインＮ２７のアミノ酸
組成ときわめてよく一致した。

第５表 アミノ酸 ｈｓｔ−１ムテインＮ２７　　推定されるｈｓｔ−１ム
テについての実測値　インＮ２７のアミノ酸組Ｇｌｕ／
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇａｙ Ｈｉｓ Ａｔｇ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｈ−Ｃｙｓ Ｉ１ｅ １０，３ １０，８ １５．５ ３４ １０．１ ６．０ １２ ９５ ５．８ ９，２ ２．７ Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　１４−．４　　　　　　
　　　　１５Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　８．３　
　　　　　　　　　　　９Ｔｒｐ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０実施例５　（アミン末
端部のアミノ酸配列とカルボキシル末端のアミノ酸残基
） 実施例１−ｄ）で得られたｈｓｔ−１ムテインＮ２７の
精製蛋白質２８μｇについて気相プロテインシークエン
サー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ
．製，モデル４７０Ａ）を用いて、Ｎ末端部のアミノ酸
配列分′析を行った。生成したフェニルチオヒタントイ
ンーアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）はＭｉｃｒｏｐａｋ
ｓｐ−Ｃ−１８−３カラムを用い、バリアン製高速液体
クロマトグラフで同定、定量した。その結果を第６表に
示した。この結果より、ｈｓｔ−１ムテインＮ２７のア
ミノ末端部のアミノ酸配列は発現ブラスミドのＤＮＡの
塩基配列より期待される配列と一致した。なお翻訳開始
コドンに由来するメチオニンは除去されていることがわ
かった。

またカルボキシル末端のアミノ酸残基をヒドラジン分解
法により検討した結果、ｃＤＮＡ配列から予測されるロ
イシンが検出された。

第６表 ＰＴＨ−アミノ酸 Ｖａｌ　　　　　　　　　３４５ Ａｌａ　　　　　　　　　４０９ Ａｌａ　　　　　　　　　４１８ Ｇｌｎ　　　　　　　　　３２１ Ｐｒｏ　　　　　　　　　２３６ Ｌｙｓ　　　　　　　　　　２１１ Ｇｌｕ　　　　　　　　　１７２ Ａｌａ　　　　　　　　　２１６ Ａｌａ　　　　　　　　　３２０ Ｖａｌ　　　　　　　　　　１７７ Ｇｉｎ　　　　　　　　　１５３ Ｓｅｒ　　　　　　　　　　３８ Ｇｌｙ　　　　　　　　　１０８ Ａｌａ　　　　　　　　　１２４ Ｇｌｙ　　　　　　　　　１４０ Ａｓｐ　　　　　　　　　１１６ Ｔｙｒ　　　　　　　　　１０５ Ｌｅｕ　　　　　　　　　ＩＩ３ Ｌｅｕ　　　　　　　　　１８２ 実施例６　（精製ｈｓｔ　−　１ムテインＮ２７のＤＮ
Ａ合成誘起活性） 先の実施例１−ｃ）で得られた精製ｈｓｔ〜１ムテイン
Ｎ２７のマウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ
合成誘起活性を、実施例１−ｅ）に記載の方法により検
討し、結果を第１０図に示した。

第１０図において、一ローはウシ脳下垂体由来ＦＧＦの
結果を、一〇一はｈｓｔ　−　１ムテインＮ２７の結果
を、一△一はヘバリン（５０μｇ／Ｔｎ１）存在下にお
けるｈｓｔ　−　１ムテインＮ２７の結果を、それぞれ
示す。第１０図より、ｈｓｔ　−　１ムテインＮ２７は
ウシ脳下垂体由来ＦＣ；Ｆ（宝酒造製）と同様の活性を
有し、またヘバリン依存性を示さないことが判明した。

実施例７　（精製ｈｓｔ−１ムテインＮ２７の細胞増殖
促進活性） ５％ＦＣＳ（ＭＢＡ製）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｆｌｏ
ｗ社製）でＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞をリンブロディッシ
ュ（Ｆｌｏｗ社製）にまき、翌日、０．５％ＦＣＳを加
えたＤＭＥＭ培地で液交換し、同時にサンプルを添加し
た。３日後の細胞数を計測し、第１１図に示した。

第１１図において、一●−はｈｓｔ−１ムテインＮ２７
の結果を、一−−○−−−はヘパリン（５０μｇ／滅）
存在下におけるｈｓｔ−１ムテインＮ２７の結果を、そ
れぞれ示す。第１１図より、ｈｓｔ−１ムテインＮ２７
は細胞増殖促進活性を有すること、またこの活性は、ヘ
パリン添加により増強されることがわかった。

実施例８　（酸性条件下における安定性）実施例１−ｃ
）で得られたｈｓｔ−１ムテインＮ２７（Ｉμｇ／ｄ）
およびｒｈｂＦ　Ｇ　ＦをそれぞれｐＨ４．０，３７゜
Ｃにおき、経時的に残存活性を実施例１−ｅ）の方法に
より測定し、結果を第１２図にボした。

第１２図において、一〇一はｈｓｔ−１ムテインＮ２７
の結果を、−−−［］一−一はｂＦＧＦの結果を、それ
ぞれ示す。また、第１２図ではインキュベーション開始
時の活性を１００％として表わした。この結果からｈｓ
ｔ−１ムテインＮ２７は酸性一５５ 条件下でｂＦＧＦより安定であることがわかった。

実施例９　　（ｈｓｔ　−　１ムテインＮ２７のトラン
スフォーミング活性） ｈｓｔ−１ムテインＮ２７　　Ｌｏｎｇ／滅をマウスＢ
ＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　　Ａ３　１細胞に添加して培養する
とトランスフォーム細胞様の顕著な形態変化が認められ
た。また同時にヘパリン（２５μｇ／ｍ）を添加した場
合には、ｈｓｔ−］ムテインＮ２７１　ｎｇ／一で同様
の形態変化が認められた。

さらに、ｈｓｔ−１ムテインＮ２７は、軟寒天培地での
コロニー形成活性を有することが明らかになった。すな
わち、リンブロデイッシュを用い０．５％寒天（バタト
アガー，　Ｄｉｆｃｏ社）を含む１０％ＦＣＳ−ＤＭＥ
Ｍ培地０．５−の上に、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　　Ａ３１
細胞１０３個を懸濁した０．３％寒天培地を重層した。

このとき、ｈｓｔ−１ムテインＮ２７　　１００〜ｌ０
００ｎｇ／ＩＲｆｌを寒天培地に添加してＣＯ，インキ
ュベーターにて培養すると、約２週間後に０．５〜Ｉ．
Ｘ１０−’の頻度で、コロニー形成が観察された。

５６ 実施例１０　　（ｂＦＧＦと受容体の結合にたいする作
用） 本発明のｈｓｔ−１ムテインＮ２７は、ｂＦＧＦと相同
性が高い。ｂＦＧＦは、いくつかの細胞株にその受容体
が存在し、その細胞増殖活性が発現される。ｂＦＧＦが
、細胞のもつその受容体に結合するのを、本発明のｈｓ
ｔ−１ムテインＮ２７が阻害するか否か検討した。ｂＦ
　Ｇ　Ｆと受容体との結合実験は、ウェークフィールド
Ｑａｋｅｆ　ｉｅｌｄ）による別の細胞増殖因子（ＴＧ
Ｆ−Ｂ）の結合実験の方法を援用した［メソッド　イン
　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏ１ｏｇｙ）、１４６、１６７（１９８７）］。

標的細胞としては、ラットＣ６グリオーマ細胞（犬日本
製薬より購入）を用いた。放射標識ｂＦＧＦはアマシャ
ム社のヨード標識ウシｂＦ　Ｇ　Ｆを用いた。

対照には、ヨーロッパ特許公開第２３７，９６６号公報
に記載の方法で得られた組換え型ヒ｝ｂＦＧＦ（ｒｈｂ
ＦＧＦ）を用いた。２４穴培養プレートにＣ６グリオー
マ細胞を培養し、培養液を除いて、結合実験のための緩
衝液（イーグルＭＥＭ培地、２　５ｍＭ　　Ｈ　Ｅ　Ｐ
　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ　７．５）、０．１５％ｇｅｌａｔｉ
ｎ，　５　．　０　μｇ／７ｎＩｌｄｅｘｔｒａｎ　ｓ
ｕｌｆａｔｅ）を加えた。１．７ＫＢｑのヨード標識ｂ
Ｆ　Ｇ　Ｆと、種々の濃度のｈｓｔ−１ムテインＮ２７
または対照としてのｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆを添加して、反応
液量を３００μｇとして、４℃で３時間反応を行なった
。反応終了の後、反応液を除き、Ｈａｎｋ’　ｓ平衡塩
類溶液で洗浄し、０．５％Ｔ　ｒｉｔｏｎ　−　Ｘ　１
　０　０溶液により細胞膜を可溶化し、その中に含まれ
る放射活性を、アロカ社製ガンマー線量計測機により測
定した。反応溶液に大過剰のｒｈｂＦＧＦ４．０μｇ／
＋ｄを共存させた場合の放射活性を別に求め、その値を
非特異的結合量として、先に得られた放射活性量より差
し引いて特異的結合量を算出した。この特異的結合量を
、放射標識体の放射比活性で除してｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆの
濃度を算出し、また反応に用いた細胞数を別に細胞数計
測機（コールター社、コールターカウンターＺＭ型）に
より定量して、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆの細胞当たり結合量を
求めた。得られた結果を第１３図に示す。第１３図にお
いて、横軸は、結合実験の反応液中に加えたｈｓｔ−１
ムテインＮ２７、ならびに対照として加えたｒｈｂＦ　
Ｇ　Ｆの濃度を示す。縦軸は、反応の後、測定された放
射標識ｒｈｂＦＧＦ量より算出された。反応に用いられ
た細胞１０６個当たりのｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆ結合量（フェ
ムトモル（ｆｍｏｌ））を示す。その量は、ｒｈｂＦ　
Ｇ　Ｆの受容体にたいするｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆの結合量に
対応する。ｈｓｔ−１ムテインＮ２７を添加した場合を
●の実線で示し、ｒｈｂＦＧＦを添加した場合を■の破
線で示した。

第１３図から明らかな如く、本発明のｈｓｔ−１ムテイ
ンＮ２７は、検討した濃度の範囲で、ｒｈｂＦＧＦが受
容体に結合することを阻害する作用は示さなかった。

発明の効果 本発明のｈｓｔ−１ムテインは、高い生体組織の損傷の
治癒促進作用を有するので、火傷．創傷などの治癒促進
剤などの治療薬として有利に用いることができ、また、
消化管の潰瘍症の治療薬としても用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｈｓｔ　−　１の成熟タンパクのアミノ酸配
列を示す。 第２図は、ｈｓｔ−１ｃＤＮＡのオープンリーディング
フレームを構成するリーダー配列を含むｈｓｔ１のコー
ディング領域より予想されるアミノ酸配列を示す。 第３図は、実施例１で得られた、ｈｓｔ−１ムテインＮ
２７のアミノ酸配列を示す。 第４図は、実施例１で得られた、プラスミドｐＴＢ１０
５１の構築図を示す。 第５図は、実施例ｌで得られた、溶出パターンを示す。 第６図は、実施例ｌで得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳
動パターンを示す。 第７図は、実施例１で得られた、溶出パターンを示す。 第８図は、実施例ｌで得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳
動パターンを示す。 第９図は、実施例２で得られた、ｈｓｔ−１ムテインＮ
２７のヒト血管内皮細胞の細胞増殖におよぼす促進作用
の測定の結果を示す。 第１０図は、実施例６で得られた、マウスＢＡＬＢ／ｃ
３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性についての結果
を示す。 第１１図は、実施例７で得られた、細胞増殖促進活性の
結果を示す。 第１２図は、実施例１０で得られた、酸性条件下におけ
る残存活性を示す。 第１３図は、実施例１０で得られた、放射標識ｒｈｂＦ
　Ｇ　Ｆの結合実験に対するｈｓｔ−１ムティンＮ２７
の作用の測定の結果を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）、ヘパリンバインディング・セクレトリー・トラ
   ンスフォーミング・ファクター（ｈｓｔ−１）の欠失型
   ムテイン。
2. （２）、ｈｓｔ−１の連続した構成アミノ酸が１ないし
   ４３個欠失している請求項１記載のムテイン。
3. （３）、請求項１記載のムテインをコードする塩基配列
   を有する組換えＤＮＡ。
4. （４）、請求項３記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
5. （５）、請求項４記載のベクターを保持する形質転換体
   。
6. （６）、請求項５記載の形質転換体を培地に培養するこ
   とを特徴とする請求項１記載のムテインの製造法。