JP3142962B2 - 大腸菌群の蛍光検出用培地 - Google Patents
大腸菌群の蛍光検出用培地Info
- Publication number
- JP3142962B2 JP3142962B2 JP19837392A JP19837392A JP3142962B2 JP 3142962 B2 JP3142962 B2 JP 3142962B2 JP 19837392 A JP19837392 A JP 19837392A JP 19837392 A JP19837392 A JP 19837392A JP 3142962 B2 JP3142962 B2 JP 3142962B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- fluorescence
- present
- fluorescence detection
- coliform bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品等の検体中に微生物
が存在するか否かを迅速、簡便かつ高感度で判定するた
めの大腸菌群蛍光検出用培地に関する。
が存在するか否かを迅速、簡便かつ高感度で判定するた
めの大腸菌群蛍光検出用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品、薬品等に代表されるヒトが摂取す
るものの安全性については厳しい管理がなされており、
特に微生物の有無の判定は重要である。このうち、食品
中の大腸菌群の有無の判定は日常検査として特に重要で
ある。
るものの安全性については厳しい管理がなされており、
特に微生物の有無の判定は重要である。このうち、食品
中の大腸菌群の有無の判定は日常検査として特に重要で
ある。
【０００３】食品中の大腸菌群の検出法としては、従
来、食品サンプルを滅菌生理食塩水等に懸濁してストマ
ッキングして得られた懸濁液を段階希釈し、デゾキシコ
レート培地を用いて２４時間培養した後、発育したコロ
ニー数を算出する方法、あるいはブリリアントグリーン
乳糖ブイヨン（ＢＧＬＢ）、乳糖ブイヨン等を用いて２
４〜４８時間培養した後、ガスの産生が認められる試験
管の本数を数えて菌数を算定する方法が知られている。
しかしながら、これらの方法では、培養時間が２４〜４
８時間程度必要であることから判定に１日以上を要する
こと、コロニーの計測は煩雑であり、その操作には熟練
を要すること、また検体を段階希釈したり、培地を用事
調製することから操作が煩雑である等の問題があった。
来、食品サンプルを滅菌生理食塩水等に懸濁してストマ
ッキングして得られた懸濁液を段階希釈し、デゾキシコ
レート培地を用いて２４時間培養した後、発育したコロ
ニー数を算出する方法、あるいはブリリアントグリーン
乳糖ブイヨン（ＢＧＬＢ）、乳糖ブイヨン等を用いて２
４〜４８時間培養した後、ガスの産生が認められる試験
管の本数を数えて菌数を算定する方法が知られている。
しかしながら、これらの方法では、培養時間が２４〜４
８時間程度必要であることから判定に１日以上を要する
こと、コロニーの計測は煩雑であり、その操作には熟練
を要すること、また検体を段階希釈したり、培地を用事
調製することから操作が煩雑である等の問題があった。
【０００４】一方、最近蛍光基質を利用し、より迅速な
微生物の検出が可能な蛍光法が報告された（特公昭５８
−１７５９８号公報及び特開昭５７−１４４９９５号公
報）。しかしながら、蛍光基質を用いる検出法では、大
腸菌群数が試料原液１ml当たり１０4 〜１０5 以上必要
なため、食品等の比較的菌数の少ない大腸菌群を検出す
るには培養操作が必要となり、大腸菌群をより速く増殖
させる培地が要求される。そこで、本発明者らは、大腸
菌群増殖用培地としてジェネレイションタイムが速く、
増殖率がよく、しかもラッグフェイズがない大腸菌群用
増殖培地を開発し、報告した（特開平４−５１８９０号
公報）。
微生物の検出が可能な蛍光法が報告された（特公昭５８
−１７５９８号公報及び特開昭５７−１４４９９５号公
報）。しかしながら、蛍光基質を用いる検出法では、大
腸菌群数が試料原液１ml当たり１０4 〜１０5 以上必要
なため、食品等の比較的菌数の少ない大腸菌群を検出す
るには培養操作が必要となり、大腸菌群をより速く増殖
させる培地が要求される。そこで、本発明者らは、大腸
菌群増殖用培地としてジェネレイションタイムが速く、
増殖率がよく、しかもラッグフェイズがない大腸菌群用
増殖培地を開発し、報告した（特開平４−５１８９０号
公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この培
地は大腸菌群の増殖には適した培地ではあるが、蛍光基
質をこの培地に組み込み、蛍光検出用の培地として用い
るには濁度が高く、蛍光の消光がみられることから蛍光
検出用の培地としては未だ充分に満足し得るものではな
かった。そこで、より透明度が高く、大腸菌群の蛍光検
出に適した培地の開発が望まれていた。
地は大腸菌群の増殖には適した培地ではあるが、蛍光基
質をこの培地に組み込み、蛍光検出用の培地として用い
るには濁度が高く、蛍光の消光がみられることから蛍光
検出用の培地としては未だ充分に満足し得るものではな
かった。そこで、より透明度が高く、大腸菌群の蛍光検
出に適した培地の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは前記特開平４−５１８９０号公報記載の培地
について種々の検討を行ったところ、この培地に含有さ
れている牛胆汁末は大腸菌群等のグラム陰性菌以外の微
生物の生育を抑制し、かつ大腸菌群の生育を促進させる
作用を有するが、その反面、培地の濁度を上昇させ、か
つ蛍光の消光原因となっていることを見出した。そこ
で、当該牛胆汁末に代わり得る成分を探索したところ、
意外にもドデシル硫酸ナトリウムを牛胆汁末に代えて添
加した培地は、濁度が上昇しないだけでなく、これを用
いれば蛍光発現時間が短縮され、より迅速な大腸菌群検
出ができることを見出し、本発明を完成した。
発明者らは前記特開平４−５１８９０号公報記載の培地
について種々の検討を行ったところ、この培地に含有さ
れている牛胆汁末は大腸菌群等のグラム陰性菌以外の微
生物の生育を抑制し、かつ大腸菌群の生育を促進させる
作用を有するが、その反面、培地の濁度を上昇させ、か
つ蛍光の消光原因となっていることを見出した。そこ
で、当該牛胆汁末に代わり得る成分を探索したところ、
意外にもドデシル硫酸ナトリウムを牛胆汁末に代えて添
加した培地は、濁度が上昇しないだけでなく、これを用
いれば蛍光発現時間が短縮され、より迅速な大腸菌群検
出ができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、重量で、ペプトン
１．０〜２．５％、塩化ナトリウム０．２５〜０．５
％、酵母エキス０．４〜０．６％、リン酸一水素二カリ
ウム０．２〜０．５％、ピルビン酸ナトリウム０．０５
〜５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１．０％、ドデシ
ル硫酸ナトリウム０．０１〜１．０％及び４−メチル−
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド又は４−メチ
ル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含有す
る大腸菌群検出用培地を提供するものである。
１．０〜２．５％、塩化ナトリウム０．２５〜０．５
％、酵母エキス０．４〜０．６％、リン酸一水素二カリ
ウム０．２〜０．５％、ピルビン酸ナトリウム０．０５
〜５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１．０％、ドデシ
ル硫酸ナトリウム０．０１〜１．０％及び４−メチル−
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド又は４−メチ
ル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含有す
る大腸菌群検出用培地を提供するものである。
【０００８】本発明の培地は、前記のようにドデシル硫
酸ナトリウムを含有することを特徴とするが、その配合
量は０．０１〜１重量％であり、０．０１重量％未満で
は大腸菌群等のグラム陰性菌以外の菌種の抑制が充分で
なく、１重量％を超えると蛍光強度の低下がみられ、好
ましくない。
酸ナトリウムを含有することを特徴とするが、その配合
量は０．０１〜１重量％であり、０．０１重量％未満で
は大腸菌群等のグラム陰性菌以外の菌種の抑制が充分で
なく、１重量％を超えると蛍光強度の低下がみられ、好
ましくない。
【０００９】また、本発明培地の成分である４−メチル
−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵ
Ｇａｌ）及び４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−
グルクロニド（４−ＭＵＧｕｌ）は、蛍光性基質であ
る。４−ＭＵＧａｌ及び４−ＭＵＧｕｌは通常無色であ
り、このうち４−ＭＵＧａｌは大腸菌群が存在すると、
これが産生するβ−ガラクトシダーゼの作用によって４
−メチル−ウンベリフェロン（４−ＭＵ）が生成し、４
−ＭＵＧｕｌは大腸菌の中のエシェリシア コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が存在すると、これが
産生するグルクロニダーゼの作用によって４−ＭＵが生
成する。かくして生成した４−ＭＵは、蛍光性物質であ
り、３６５nmの波長で励起されて、４５０nmの蛍光を発
するので、これを測定することにより大腸菌群の存在を
確認することができる。
−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵ
Ｇａｌ）及び４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−
グルクロニド（４−ＭＵＧｕｌ）は、蛍光性基質であ
る。４−ＭＵＧａｌ及び４−ＭＵＧｕｌは通常無色であ
り、このうち４−ＭＵＧａｌは大腸菌群が存在すると、
これが産生するβ−ガラクトシダーゼの作用によって４
−メチル−ウンベリフェロン（４−ＭＵ）が生成し、４
−ＭＵＧｕｌは大腸菌の中のエシェリシア コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が存在すると、これが
産生するグルクロニダーゼの作用によって４−ＭＵが生
成する。かくして生成した４−ＭＵは、蛍光性物質であ
り、３６５nmの波長で励起されて、４５０nmの蛍光を発
するので、これを測定することにより大腸菌群の存在を
確認することができる。
【００１０】４−ＭＵＧａｌ又は４−ＭＵＧｕｌは、本
発明の培地中に１０-4〜１０-2Ｍ程度添加するのが好ま
しい。本発明培地の検出対象である大腸菌群とは、ラク
トース分解酵素を産生する能力を有する一群の微生物
で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレブシエ
ラ属、エンテロバクター属等に属するものをいう。
発明の培地中に１０-4〜１０-2Ｍ程度添加するのが好ま
しい。本発明培地の検出対象である大腸菌群とは、ラク
トース分解酵素を産生する能力を有する一群の微生物
で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレブシエ
ラ属、エンテロバクター属等に属するものをいう。
【００１１】本発明の培地は、前記成分を混合して液体
培地として用いることもできるが、これに寒天０．１〜
１．５重量％配合して寒天培地として用いることもでき
る。
培地として用いることもできるが、これに寒天０．１〜
１．５重量％配合して寒天培地として用いることもでき
る。
【００１２】本発明の大腸菌群検出用培地を用いて、被
検体中の大腸菌群の存在を検出するには、当該培地に被
検体を加えて３０〜４４．５℃で数時間〜十数時間培養
した後、３６５nmの光を照射し、４５０nmの蛍光を測定
すればよい。
検体中の大腸菌群の存在を検出するには、当該培地に被
検体を加えて３０〜４４．５℃で数時間〜十数時間培養
した後、３６５nmの光を照射し、４５０nmの蛍光を測定
すればよい。
【００１３】
【実施例】以下、実施例を挙げて更に詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】実施例１ 特開平４−５１８９０号公報記載の大腸菌群検出用培地
を基礎培地として、改変培地１〜４を作製し、いずれの
培地が蛍光検出に適するかについて試験を行った。表１
に示す組成の培地を９６穴マイクロプレートに０．１ml
ずつ注加し、このプレートに表２記載の菌を接種後、３
５℃で培養を行い、経時的に各プレートに蛍光リーダー
（コロナ社製，ＭＴＰ−３２）を用いて３６５nmの光を
照射し、４５０nmの蛍光が発現するまでの時間を測定し
た。この結果を表２に示す。
を基礎培地として、改変培地１〜４を作製し、いずれの
培地が蛍光検出に適するかについて試験を行った。表１
に示す組成の培地を９６穴マイクロプレートに０．１ml
ずつ注加し、このプレートに表２記載の菌を接種後、３
５℃で培養を行い、経時的に各プレートに蛍光リーダー
（コロナ社製，ＭＴＰ−３２）を用いて３６５nmの光を
照射し、４５０nmの蛍光が発現するまでの時間を測定し
た。この結果を表２に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】この結果から、本発明の培地である改変４
の培地がいずれの菌株においても蛍光検出時間が他の培
地に比べて１〜２時間以上も短縮されることが分かる。
の培地がいずれの菌株においても蛍光検出時間が他の培
地に比べて１〜２時間以上も短縮されることが分かる。
【００１８】実施例２ 本発明培地を用いて市販食品の大腸菌群検査を行った。
本発明培地を２４穴透明プレートに１mlずつ分注してお
き、そこに表３記載の食品１０ｇに９０mlの滅菌生理食
塩水を加えて均一になるようにストマッキングした試料
の１mlを接種して３５℃で培養した。培養開始後６、
７、８及び２４時間目に蛍光リーダー（コロナ社製，Ｍ
ＴＰ−３２）を用いて３６５nmの光を照射し４５０nmの
蛍光を測定した（蛍光プレート法）。他方、ストマッキ
ングした試料を１０倍段階希釈し、その１mlを滅菌シャ
ーレにとり、ここにあらかじめ加温溶解し４５℃程度に
冷却してあるデゾキシコレート培地を注ぎ、培地と試料
をよく混合し、冷却重層後、３５℃、２０時間培養した
後、菌数を算出した（Ｄｅｓｏ混釈法）。この結果を表
３に示す。表３より、本発明培地を用いた蛍光プレート
法は従来法であるＤｅｓｏ混釈法とよく一致しているこ
とが分かり、更にＤｅｓｏ混釈法は最低１８時間の培養
時間が必要なのに対し蛍光プレート法は６〜８時間の培
養時間で大腸菌群の確認ができた。
本発明培地を２４穴透明プレートに１mlずつ分注してお
き、そこに表３記載の食品１０ｇに９０mlの滅菌生理食
塩水を加えて均一になるようにストマッキングした試料
の１mlを接種して３５℃で培養した。培養開始後６、
７、８及び２４時間目に蛍光リーダー（コロナ社製，Ｍ
ＴＰ−３２）を用いて３６５nmの光を照射し４５０nmの
蛍光を測定した（蛍光プレート法）。他方、ストマッキ
ングした試料を１０倍段階希釈し、その１mlを滅菌シャ
ーレにとり、ここにあらかじめ加温溶解し４５℃程度に
冷却してあるデゾキシコレート培地を注ぎ、培地と試料
をよく混合し、冷却重層後、３５℃、２０時間培養した
後、菌数を算出した（Ｄｅｓｏ混釈法）。この結果を表
３に示す。表３より、本発明培地を用いた蛍光プレート
法は従来法であるＤｅｓｏ混釈法とよく一致しているこ
とが分かり、更にＤｅｓｏ混釈法は最低１８時間の培養
時間が必要なのに対し蛍光プレート法は６〜８時間の培
養時間で大腸菌群の確認ができた。
【００１９】
【表３】
【００２０】
【発明の効果】本発明により食品等の検体中の大腸菌群
が存在するか否かを迅速かつ高感度に判定することがで
きる検査が可能となった。
が存在するか否かを迅速かつ高感度に判定することがで
きる検査が可能となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/10 C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 重量で、ペプトン１．０〜２．５％、塩
化ナトリウム０．２５〜０．５％、酵母エキス０．４〜
０．６％、リン酸一水素二カリウム０．２〜０．５％、
ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０％、硝酸カリウ
ム０．０５〜１．０％、ドデシル硫酸ナトリウム０．０
１〜１．０％及び４−メチル−ウンベリフェリル−β−
Ｄ−ガラクトシド又は４−メチル−ウンベリフェリル−
β−Ｄ−グルクロニドを含有する大腸菌群蛍光検出用培
地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19837392A JP3142962B2 (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | 大腸菌群の蛍光検出用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19837392A JP3142962B2 (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | 大腸菌群の蛍光検出用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646891A JPH0646891A (ja) | 1994-02-22 |
| JP3142962B2 true JP3142962B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=16390039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19837392A Expired - Lifetime JP3142962B2 (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | 大腸菌群の蛍光検出用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3142962B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970707302A (ko) * | 1994-11-07 | 1997-12-01 | 프랭크 파렌트 | 대장균군 또는 대장균을 검출하기 위한 효소적 방법(enzymatic method for detecting coliform bacteria or e. coli) |
| GB2386946A (en) * | 2002-03-27 | 2003-10-01 | Danisco | Detecting microorganisms |
-
1992
- 1992-07-24 JP JP19837392A patent/JP3142962B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0646891A (ja) | 1994-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wilson et al. | The effect of membrane lipid unsaturation on glycoside transport | |
| Alphen et al. | Influence of osmolarity of the growth medium on the outer membrane protein pattern of Escherichia coli | |
| JPS5817598B2 (ja) | 微生物の迅速検出方法 | |
| JPH11505405A (ja) | 大腸菌型細菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の酵素的検出方法 | |
| US6921635B1 (en) | Culture and identification media specific of different species of Candida and analysis methods | |
| Williamson et al. | Biotypes of oral Candida albicans and Candida tropicalis isolates | |
| Srienc et al. | Detection of bacterial β-galactosidase activity in individual Saccharomyces cerevisiae cells by flow cytometry | |
| EP1506309A2 (en) | Plating media | |
| Busbee et al. | Inactivation of Candida albicans by ultraviolet radiation | |
| JPH0646891A (ja) | 大腸菌群の蛍光検出用培地 | |
| EP2938741B1 (fr) | Milieu de détection de micro-organismes comprenant au moins un alkyl(thio)glycoside | |
| Smith et al. | Phosphatase activity among Candida species and other yeasts isolated from clinical material | |
| JPH0451890A (ja) | 大腸菌群の増殖及び検出用培地 | |
| JP3195432B2 (ja) | Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法 | |
| JP5823390B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
| JP5639791B2 (ja) | β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌検出用培地 | |
| Gill et al. | Effect of metabolic inhibitors on the production of Chlamydia psittaci by infected l cells | |
| Jones et al. | Simplified complete medium for the growth of Neisseria gonorrhoeae | |
| TWI881614B (zh) | 培養高密度菌量及誘導蛋白質大量表現之自誘導培養基 | |
| Fouad et al. | The use of glucose inorganic salts media in the classification of the coli‐aerogenes bacteria. I. The methyl red and Voges‐Proskauer reactions | |
| JP5730304B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
| CN112760358B (zh) | 一种耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的筛查显色平板 | |
| JPH08317787A (ja) | 大腸菌群発育用生培地 | |
| JP5730305B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
| Derstine et al. | Deoxyribonucleic acid synthesis in a temperature-sensitive Escherichia coli dnaH mutant, strain HF4704S |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20001212 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081222 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091222 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101222 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101222 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111222 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111222 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222 Year of fee payment: 12 |