JPH0451890A

JPH0451890A - 大腸菌群の増殖及び検出用培地

Info

Publication number: JPH0451890A
Application number: JP15706490A
Authority: JP
Inventors: Hidemasa Odaka; 秀正小高; Shingo Mizuochi; 慎吾水落; Taku Nakatate; 中楯　卓
Original assignee: NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Current assignee: NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1992-02-20
Anticipated expiration: 2014-06-28
Also published as: JP2913419B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は大腸菌群の増殖用培地、更に詳しくは、ジェネ
レイションタイムが速く、増殖率がよく、ラッグフェイ
ズがなく、大腸菌群の検出用培地に適した培地に関する
。

〔従来の技術〕

近年、微生物の汚染を防止するという社会的要請の強ま
りによって、食品、医薬品、化粧品、飲料水、尿等中に
存在する大腸菌群を検査することが盛んになってきた。

従来から行われている大腸菌群の検査法としては、デシ
キシコレート培地を用いて２４時間培養した後、発育し
た菌のコロニー数を算出する方法、あるいはブリリアン
トグリーン乳糖ブイヨン（ＢＧＬＢ）　、乳糖ブイヨン
等を用いて２４〜４８時間培養した後、ガスの産生が認
められる試験管の本数を数えて菌数を算定する方法が知
られている。

しかし、これらの方法は長時間を要し、現在の流通体制
に適合するためには凪速な検査法が望まれ、微生物が増
殖する際に変化する電気的抵抗を利用した迅速検出法や
、微生物のもつＡＴＰを測定する方法等が開発された。

しかし、これらの方法は、選択性及び精度性の点で必ず
しも満足できるものではなかった。

また、近年、４−メチル−ウンベリフェリルβ−Ｄ−ガ
ラクトシド（４−ＭＵＧａｌ）を含む栄養培地を使用し
て、大腸菌群が産生ずるβ−ガラクトシダーゼによって
４−Ｍ［ＪＧａｌを４−メチル−ウンベリフェロン（４
−ＭＵ）に変化させ、この４−Ｍｌｌの蛍光を測定する
大腸菌群の玉速検出法が報告された（特開昭５６−６４
７９７号及び特開昭５７１４４９９５号）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかるところ、４−Ｍ［ｌＧａ１を用いる検出法では、
大腸菌群数が試料原液１ｍｌあたり１０−４〜１０−５
以上必要なため、食品等の比較的菌数の少ない大腸菌群
を検出するには培養操作が必要となり、大腸菌群をより
速く増殖させる培地が要求される。

そして、従来再もよいとされている大腸菌群増殖用培地
は、特開昭５６−６４７９７号公報に記載のプレインハ
ートインフュージョンブロス・ブイヨン培地（ＢＨＩ）
であるが、これも未だ充分に満足できるものでなく、よ
りジェネレイションタイムが速く、増殖率がよく、しか
もラッグフェイズがない大腸菌群増殖用培地が望まれて
いた。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、上記目的にあった培地を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、重量で、ペプトン１．０〜２．５
％、塩化ナトリウム０．２５〜０．５％、酵母エキス０
．４〜０．６％、グリセロール０．５〜１．５％、リン
酸−水素二カリウム０．２〜０，５％、ピルビン酸ナト
リウム０．０５〜５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１
．０％、牛胆汁末１．０〜２．０％及び寒天０．１〜０
．３％を含有する大腸菌群増殖用培地に係る第１の発明
と、この培地に更に、４−メチル−ウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトシド又は４−メチル−ウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−グルクロニドを含む大腸菌群検出用培地に
係る第２の発明を提供するものである。

本明細書において、［ジェネレイションタイム」とは、
初発菌数より１０倍以上増殖したときの時間をもって、
その時の菌数（対数値）から初発菌数（対数値）を差し
引いた値に係数３．３を乗じた値で、その時までの時間
を除して得られる値であり、「増殖率」とは、初発菌数
より１０倍以上増殖したときの時間をもって、その時の
菌数（対数値）から初発菌数（対数値）を差し引いた値
に係数３．３を乗じた値を、その時までの時間で除して
得られる値であり、また「ラッグフェイズ」とは、増殖
率測定時において、ある時点でサンプリングした菌が、
その前にサンプリングしたときの菌数より少なくなって
いる時をいうものである。そして、大腸菌群検出用培地
としては、ジエネレイションタイムが３分未満、増殖率
が０．３５以上で、ラッグフェイズがない培地が好まし
い。

本発明者は、従来公知の多くの培地について大腸菌群の
生育性を試験した結果、増殖率がよく、かつラッグフェ
イズがなかったのはＢＨＩのみであった。そこで、この
ＢＨＩ培地中のどの組成成分が増殖因子になっているか
を調べるた狛に次の実験を行った。

実験ＩＥ、　ｃｏｌｉ、　ＡＴ［：Ｃ１１７７５（普通ブイヨ
ンで３７℃、２４時間培養したものを小分けし、ドライ
アイス・アルコールで瞬間凍結した後−８０℃で保存し
たものを、用時融解して使用する）を第１表に示す各培
地に接種し、３７℃のウォーターバスで培養し、定期的
にサンプリングした後、菌数を測定し、ジェネレイショ
ンタイムと増殖率を算出した。

これと同時にラッグフェイズの有無を観察した。

尚、本明細書において、菌数測定は次のようにして行わ
れる。すなわち、細菌を接種した培地を原液とし、１０
倍段階希釈し、その１ｍｌを滅菌シャーレにとり、ここ
にあらかじめ加温溶解し４５℃ぐらいにだもっであるデ
シキシコレート培地を注ぎ、ただちにシャーレを静かに
肋かし、よく培地と菌液を混合し、平板に固まらせ３７
℃２４時間培養した後、菌数を測定する。

その結果を第２表に示す。

第表（注）＋：含む、（ｐＨ７，０±０．１）：含まない。

以下余白この実験の結果から、ポリペプトン、塩化ナトリウム及
びリン酸−水素二カリウムが大腸菌群の増殖に関与して
いることが明らかとなった。

また、特開昭５７−１４４９９５号公報には、肝汁酸を
添加して大腸菌群以外の微生物の生育を抑制することが
できることが記載されている。そこで、本発明者は、牛
胆汁末の添加効果について次の実験を行った。

実験２ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％及びリン酸
−水素二カリウム０．２５％を含む基礎培地に種々の濃
度で牛胆汁末を添加した培地にＥ。

ｃｏｌｉを接種し、実験１と同様にして培養して菌数を
測定した。その結果を第３表に示す。

以下余白ｌ）時間単位二分２）ラブグツエイズの出現回数／実験回数以下余白この実験から、牛胆汁末は大腸菌群以外の微生物の生育
を抑制するばかりでなく、大腸菌群の生育を促進させる
こと、並びにその培地中の最適濃度は１．０〜２．０％
であることが見出された。

更にまた、大腸菌群の生育に有用であることが予想され
る成分について次の実験を行った。

実験３実験２の基礎培地に牛胆汁末１．５％を添加した培地（
牛胆汁未添加基礎培地）に各物質を添加した第４表に示
す培地にＥ、ｃｏｌｉを接種し、実験１と同様にして培
養後菌数を測定した。その結果を第５表に示す。

第表第表以下余白この実験の結果、牛胆汁未添加基礎培地に硝酸カリウム
及びピルビン酸す）　ＩＪウムを添加した培地が、ジエ
ネレイションタイム及び増殖率において優れていた。

本発明の培地において、ピルビン酸ナトリウムは、菌体
内で各種の代謝経路を結ぶ重要な中間生成物で、ピルビ
ン酸を添加することにより、菌体内活性を促進する作用
をするものであり、その添加量は０．０５〜５．０％が
好ましい。また硝酸カリウムはエネルギー獲得手段とし
て大腸菌群にとって重要であり、その添加量は０．０５
〜１．０％が好ましい。

以上の組成の本発明培地は大腸菌群の増殖が速いので、
これに４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラク
トシド（４−ＭＵＧａｌ〕又は４−メチル−ウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−グルクロニド［４−ＭＬＩＧｕｌ〕を
含有せしめれば優れた大腸菌検出用培地が得られる。

本発明で大腸菌群とは、ラクトースを分解する能力を有
する一群の微生物で、エシェリキャ属、サイトロバクタ
ー属、クレブシェラ属、エンテロバクタ−属、セラチャ
属に属するものである。

本発明の培地の基質である４−Ｍ［ｌＧａ１及び４−Ｍ
ＵＧｕｌは培地中に１０−’Ｍ　〜１０−’Ｍ程度添加
するのが好ましい。

〔作　用〕

本発明の大腸菌群検出用培地を用いて、被検体中の大腸
菌群の存在を検出するには、当該培地に被検体を加えて
約３７℃で数時間〜十数時間培養する。基質の４−ＭＵ
Ｇａｌ及び４−ＭＬＩＧｕｌは無色であるが、被検体中
に大腸菌群が存在すると、これが産生ずるβ−ガラクト
シダーゼの作用によって４−メチル−ウンベリフェロン
（４−Ｍ［ｌ）が生成され、４−ＭＵは、蛍光性物質で
あり、３３０ｒ＋ｎ＋の波長で励起されて、４５０ｎｍ
の蛍光を発するので、これを測定することにより大腸菌
群の存在を確認することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１下記組成の本発明大腸菌群検出用培地を調製した。

トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）　　　　　　１０　
ｇフィトンベプトン（ＢＢＬ）　　　　　　　　　５　
ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　５ｇ酵母エ
キス（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　　　　　　　５　ｇグリ
セロール　　　　　　　　　　　１０ｇリン酸−水素二
カリウム　　　　　　　２．５３ピルビン酸ナトリウム
　　　　　　　　　１ｇ硝酸カリウム　　　　　　　　
　　　　　１ｇ牛胆汁末　　　　　　　　　　　　　　
１５ｇ寒天　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ４
−Ｍ［ｌＧａ１　　　　　　　　　　　　　Ｉ　Ｘ　１
０−３モルイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド　　　　　　ｌＸｌ０−３モル精製水
　　　　　１０００ｄｐ８７．０±０．１実施例２ハートインフュージョン培地に４−ＭＵＧａｌ　　ｌ　
ｘｌｏ−３モル及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドｌＸ１０−３モルを添加した培地及び実施例
１の大腸菌群検出用培地を用いて初発菌数と蛍光発現時
間との関係を比較した。その結果を表−１に示す。

なお、比較方法は両方の培地を９６穴透明Ｕプレートに
１００Ｉｉずつ分注しておき、各濃度の菌を１００１ｉ
接種し、ＭＴ　Ｐ　−３２ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＢＲＢＡ
ＤＩＥＲ（ＣＯＲＯＮＡ）で蛍光の発現する時間を一時
間ごとに測定した。

以下余白実施例３実施例２と同じ培地を用いて、食肉製品における初発菌
数と蛍光発現時間との関係を比較した。

比較方法は実施例２と同様にして行った。その結果を表
−２に示す。

以下余白実施例４実施例２と同じ培地を用いて、市販食肉及び食肉製品の
大腸菌群の検査を行った。その結果を表−３に示す。

検査方法は両方の培地を９６穴透明Ｕプレートに１００
μβずつ分注しておき、そこにストマツカーで処理した
検体原液１００μｌを接種し、３７℃で培養しながら一
時間ごとにＭＴＰ−３２ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＢ　ＲＥＡ
ＤＥＲ（Ｃ０ＲＯＮＡ　’）で測定し蛍光発現時間を計
った（プレート法）。それと同時に、検体原液を適当に
希釈しデシキシコレート培地で混釈しくＤｅｓｏ混釈法
）大腸菌群のコロニー発現数を測定した。

プレート法は従来のＤｅｓｏ混釈法とよく一致している
のがよくわかり、しかもＤｅｓｏ混釈法は最低１８時間
の培養時間が必要だが、プレート法は最高８時間で大腸
菌群の確認ができた。更に、ハートインフュージョンを
使用するよりも本発明の培地を使用した方が明かに蛍光
発現時間の短縮が認められる。

表＊：蛍光検出時間（時）１）　ニハードインフュージョン培地２）二大腸菌群検出用培地〔発明の効果〕本発明の培地は大腸菌群をジェネレイションタイムが速
く、増殖率がよく、ラッグフェイズがなく増殖させるこ
とができ、大腸菌群の検出用培地として有利に使−用で
きる。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、重量で、ペプトン１．０〜２．５％、塩化ナトリウ
ム０．２５〜０．５％、酵母エキス０．４〜０．６％、
グリセロール０．５〜１．５％、リン酸−水素二カリウ
ム０．２〜０．５％、ピルビン酸ナトリウム０．０５〜
５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１．０％、牛胆汁末
１．０〜２．０％及び寒天０．１〜０．３％を含有する
大腸菌群増殖用培地。２、重量で、ペプトン１．０〜２．５％、塩化ナトリウ
ム０．２５〜０．５％、酵母エキス０．４〜０．６％、
グリセロール０．５〜１．５％、リン酸−水素二カリウ
ム０．２〜０．５％、ピルビン酸ナトリウム０．０５〜
５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１．０％、牛胆汁末
１．０〜２．０％、寒天０．１〜０．３％及び４−メチ
ル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド又は４−
メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含
有する大腸菌群検出用培地。