JP3144905B2 - シナプトフィジンに対する新規なモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シナプトフィジンに特
異的に結合するモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】シナプトフィジンは、シナプス小胞膜に
存在する分子量約３８，０００の酸性糖蛋白であり、１
９８５年にウィーデマンらによってウシ脳から見出され
たものである（Ｃｅｌｌ，４１，１０１７−１０２
８）。一方、Ｐ−３８は、同年ジョーンらによってラッ
ト脳から見出された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４１３７−４１４１）。しか
し、両者の遺伝子配列を解析した結果、シナプトフィジ
ンとＰ−３８は同一の蛋白質であることが明らかになっ
ている。

【０００３】一般に、これらシナプトフィジン及びＰ−
３８はシナプス小胞に局在するため、シナプス小胞を保
持するニューロエンドクリン腫瘍の検出マーカーとして
用いられている。ニューロエンドクリン腫瘍は、例えば
脳下垂体や膵臓のような内分泌器官に発生するが、他の
組織にも転移する。もし、シナプス小胞を持たない器官
にシナプトフィジンが検出されれば、この事実は当該器
官にニューロエンドクリン腫瘍が存在することを示して
おり、また、その腫瘍の原発病巣が上記の内分泌器官で
あることを示している。

【０００４】従って、シナプトフィジンに対して特異的
なモノクローナル抗体は、ニューロエンドクリン腫瘍の
原発病巣をつきとめるための一手段としても有用であ
る。

【０００５】現在、これらシナプトフィジン及びＰ−３
８に対するモノクローナル抗体に関しては、免疫グロブ
リンクラスがＩｇＧに属するモノクローナル抗体が製造
されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、シナプ
トフィジンに対する従来公知のモノクローナル抗体は、
免疫グロブリンクラスＩｇＧに属するため、抗原又は補
体結合部位は１分子中に２個しか存在しない。このた
め、補体固定化アッセイによって組織中の微量シナプト
フィジンを定量する際、多量の抗体が必要であるという
問題があった。

【０００７】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、その課題は、組織中の微量シナプトフィジンを補体
固定化アッセイによって定量する際に、少量の抗体で定
量を可能とすることである。より具体的には、シナプト
フィジンに対して特異性を有し、且つ免疫グロブリンク
ラスＩｇＭに属するモノクローナル抗体を提供すること
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ラット
脳の抽出物を免疫原として作製されたモノクローナル抗
体であって、免疫グロブリンクラスＩｇＭに属し、ラッ
トのシナプトフィジンまたはＰ−３８に対して特異的な
反応性を有することを特徴とするモノクローナル抗体が
提供される。

【０００９】また、本発明によれば下記塩基配列を有す
る遺伝子が発現する蛋白質に対して特異的な反応性を有
するモノクローナル抗体が提供される。

【００１０】 10 20 30 40 50 60 AGCACCTGGC GATGCCTACG GCGATGCGGG CTACGGGCAG GGCCCCGGAG GCTATGGGCC 70 80 90 100 110 120 CCAGGACTCC TACGGGCCTC AGGGTGGTTA TCAACCCGAT TACGGGCAGC CAGCCAGCGG 130 140 150 160 170 180 TGGCGGTGGC TACGGGCCTC AGGGCGACTA TGGGCAGCAA GGCTATGGCC AACAGGGTGC 190 200 210 220 230 240 GCCCACCTCC TTCTCCAATC AGATGTAATC TGGTCAGTGA AGTCCATGAA GATCCCACGG 250 260 270 280 290 300 GTGGGCAAGA GCTCAAGAGA AGGCCTGCCC CCCTTTTCCC ATCCCCATAT CCTAGGTCTC 310 320 330 340 350 360 CACCCCTCAA CCCAGGAGAC CCTAACTGTC TTTGCTGTTT ATATATATAT ATATTATATA 370 380 390 400 410 420 TAAATATCTA TTTATCTGTC TGAGCCCTAC ATTCACCCAC TTCTCCATGC ACTAGAGGCC 430 440 450 460 470 480 CAGTCCTGAA TGGGCTCCTC CCCAACCCTG ACCTTGCATT CCTCAGCCCC TATCTGTTCC 490 500 510 520 530 540 CCAGCCCTGT CCCTTGAGGT AAGGGGCTCT AGAAAGGGGA GAGGAAGGGA ACCAGACCTT 550 560 570 580 590 600 GGCTGCATGG AGTGGGTTGG TGTGACTTTC TCTCCTTCCT CCTCTCCCTC TGCCCCTCCT 610 620 630 640 650 660 AACTCTGGCC TTGGTCCTCC AGCATCACCT GAACTTCAGA AGCTCTCGAA TGGAAATCTG 670 680 690 700 710 720 ACCCCAAGAG TAGAGCAGTA GACTGAGTGG AGGAGGCTTG GGTGAAACGG GCAGAGAGGA 730 740 750 GATAACCTCT GTAGAGAGAG GACTAGTCAG （ここで、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
およびＴはチミンを表わす。） 以下本発明を詳細に説明する。

【００１１】まず、本発明のモノクローナル抗体の作製
について説明する。

【００１２】これは、通常のモノクローナル抗体技術を
用いて作製することができる。即ち、まずラット脳の抽
出物で免疫された哺乳動物から取り出した抗体産生細胞
と、適当な動物の腫瘍細胞、例えばミエローマとを融合
させ、目的とする抗体を生産する融合細胞（ハイブリド
ーマ）を調製する。この融合細胞をクローン化した後、
培養することにより目的のモノクローナル抗体を作製す
ることができる。

【００１３】より詳細に説明すると、本発明のモノクロ
ーナル抗体は、下記の手順により作製することができ
る。

【００１４】ａ）抗体産生細胞の調製 まず、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを得るために、ラット脳の抽出物を用いて哺乳動
物を免疫感作する。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体を産生する抗
体産生細胞を得るための哺乳動物としては、マウス、ラ
ット、ウサギ、モルモットなどの一般に用いられる実験
動物を使用することができるが、特にマウスを用いるこ
とが好ましい。

【００１６】哺乳動物を免疫感作する方法としては、例
えばマウスの腹腔もしくは皮下に、免疫原としてラット
脳の抽出物を接種する方法を用いることができる。１回
当りの接種量は、免疫原０．２ml／マウス程度が好まし
く、これを等量のアジュバンドと混和して懸濁液とした
ものを用いる。この操作を１〜２週間ごとに数回繰り返
す。更に、０．２〜０．４ml／マウスの免疫原をそのま
ま静脈内もしくは腹腔に注射することにより最終免疫を
行う。最終免疫のための注射の３〜４日後に脾臓を摘出
し、抗体産生細胞を得る。

【００１７】ｂ）腫瘍細胞の調製 上記抗体産生細胞と細胞融合させるための腫瘍細胞を調
製する。

【００１８】本発明における腫瘍細胞としては、通常ミ
エローマ細胞が用いられる。腫瘍細胞の由来は特に限定
されるものではなく、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等
の哺乳動物の細胞株を使用することができる。しかし、
なかでもマウスの細胞株を用いることが好ましい。一般
には、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ⁻）、或いはチミジン
キナーゼ欠損（ＴＫ⁻）のような適当な選択マーカーを
有する腫瘍細胞株が用いられる。このような細胞株とし
ては、例えばP3-X63-Ag8,P3-X63-Ag8-U1,SP20-Ag8-6.5.
3 が挙げられる。これらの腫瘍細胞は、何れも８−アザ
グアニン抵抗性の細胞株であり、ＨＡＴ培地（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン含有）中では生育す
ることができない。

【００１９】ｃ）細胞融合 上記抗体産生細胞及び腫瘍細胞を融合させる。

【００２０】細胞融合の際に用いられる培地としては、
通常用いられるイーグル最小基本培地（ＭＥＭ）、ダル
ベッコ改良ＭＥＭ、ロズウェル・パーク・メモリアル・
インスティチュート（ＲＰＭＩ）１６４０等の基本培地
に、１０％ＣＳ（子ウシ血清）、５％ＦＣＳ（ウシ胎児
血清）＋５％ＣＳ、または１０％ＦＣＳを添加したもの
を用いることができる。通常、親細胞を維持する際には
上記の何れの培地を用いてもよいが、ハイブリドーマを
作成する際には１０％ＦＣＳを添加したものが好まし
い。

【００２１】細胞融合は、融合促進剤の存在下におい
て、親細胞であるミエローマなどの腫瘍細胞と免疫感作
された脾細胞（抗体産生細胞）とを１：５〜１：２０の
割合で混合することにより行う。融合促進剤としては、
例えばＨＶＪ（Ｈｅｎｎａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ
Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）などを使用することができるが、特に、
３０％〜５０％のＰＥＧ１５００を用いることが好まし
い。

【００２２】ｄ）ハイブリドーマのＨＡＴ選択 ＨＡＴ培地においてハイブリドーマを選別する。

【００２３】ｃ）の方法により融合した細胞を、２０％
ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希
釈し、マイクロカルチャープレート（通常９６ウェルま
たは２４ウェルのプレート）に、１０⁴ 〜１０⁶ ／１０
０μｌ／ウェル程度植え付ける。その後、各ウェルにＨ
ＡＴ選択培地を添加し、通常１〜２日ごとに培地の交換
を行いながら培養する。

【００２４】腫瘍細胞として８−アザグアニン抵抗性株
を用いた場合には、未融合のミエローマ細胞およびミエ
ローマ・ミエローマ融合細胞は、ＨＡＴ培地中では約７
日間で死滅する。また、脾細胞は正常細胞であるために
寿命があり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは２週間以上は生育で
きない。従って、培養７〜１０日目位から生育して来る
ものは、すべて脾・ミエローマ融合細胞と考えられる。

【００２５】ｅ）ハイブリドーマのスクリーニング 上記ｄ）の方法により選別されたハイブリドーマをスク
リーニングする。

【００２６】スクリーニングは、主にハイブリドーマが
増殖したウェルの培養上清を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚ
ｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ）法やイムノブロット法など公知の方法を用
いて目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクロー
ンを拾い上げることにより行うことができる。

【００２７】ｆ）クローニング スクリーニングにより得られた目的のハイブリドーマを
クローニングする。

【００２８】各ウェル中には、異なる抗体を産生してい
る２種類以上のハイブリドーマが生育している可能性が
ある。従って、限界希釈法等によりクローニングを行な
い、最終的に目的のモノクローナル抗体を産生している
単一のハイブリドーマクローンを得てもよい。

【００２９】ｇ）モノクローナル抗体の取得 上記ｆ）で獲られたハイブリドーマを、培養することに
より目的のモノクローナル抗体を得る。

【００３０】前記ハイブリドーマは、培養容器中（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）または動物体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のい
ずれにおいても培養することができる。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで培養する場合、培地は先に述べた通常培地にＣＳま
たはＦＣＳを添加したものでよい。この培地で３〜５日
間培養した後、培地上清から目的の抗体を得ることがで
きる。ｉｎ ｖｉｖｏによる培養では、ミエローマ細胞
と同系の動物に対してプリスタン（２，６，１０，１４
−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に
投与した後、少なくとも１週間以上経過してからハイブ
リドーマを腹腔内に接種する。次いで、７〜１４日後に
貯留している腹水を採取し、目的の抗体を得ることがで
きる。

【００３１】次に、本発明のモノクローナル抗体が認識
するシナプトフィジンを発現する遺伝子について説明す
る。

【００３２】本発明のモノクローナル抗体が認識するシ
ナプトフィジン遺伝子は、以下の手順により得ることが
できる。すなわち、λgt11ベクターを用いてラット脳か
ら調製したｃＤＮＡライブラリを、適切な宿主細胞に形
質転換して発現させる。こうして宿主細胞により産生さ
れた蛋白質を、上述のラットシナプトフィジンに特異的
に結合する抗体を用いてスクリーニングすることによ
り、目的の遺伝子断片が挿入されたベクターを選択す
る。この選択されたベクターを増幅させることにより、
シナプトフィジン遺伝子を得ることができる。

【００３３】より詳細には、本発明のモノクローナル抗
体が認識するシナプトフィジンを発現する遺伝子は、下
記の手順により調製することができる。

【００３４】ｈ）スクリーニング まず、宿主細胞（例えば、大腸菌）を適当な培地で培養
し、この宿主細胞にクローンテック社のラット脳ｃＤＮ
Ａライブラリ（これはλgt11ベクターに挿入されてい
る）を導入する。例えば、大腸菌をＬＢＭ培地などの適
当な培地で培養し、この培養液１μリットル当りに、５
×１０⁴ pfu の上記ｃＤＮＡが組み込まれたファージベ
クター液を混合することによって導入してもよい。次
に、この混合液を寒天培地に広げ、更に培養してプラー
クを形成させる。形成されたプラーク上にニトルセルロ
ース膜を重ね、更にインキュベートする。これにより、
ベクターに組み込まれたｃＤＮＡが発現し、産生された
蛋白質がニトロセルロース膜に写しとられる。

【００３５】このニトロセルロース膜に、上述の抗シナ
プトフィジンモノクローナル抗体を反応させ、次いでこ
の抗シナプトフィジン抗体と特異的に結合する、標識さ
れた抗体を反応させる。反応後、抗体の標識を検出する
のに必要な処理を施し、標識が存在するスポットを検出
する。そのスポットに対応するプラークを検索すること
により、目的とするラットシナプトフィジン遺伝子断片
を有するベクターを得ることができる。

【００３６】ｉ）ラットシナプトフィジン遺伝子を有す
るベクターの増幅 上記ｈ）の方法によりスクリーニングしたシナプトフィ
ジン遺伝子を増幅させる。

【００３７】ラットシナプトフィジン遺伝子断片を有す
ることが確認されたベクターは、プレートライセート
法、液体培養法などの方法で宿主細胞を培養することに
より、増幅させることができる。

【００３８】ｊ）ラットシナプトフィジン遺伝子の調製 増幅させたベクターから目的の遺伝子を調製する。

【００３９】まず、宿主細胞からラットシナプトフィジ
ン遺伝子断片を有するファージのみを回収する。回収し
たファージをクロロホルムなどを用いて破壊し、更にフ
ェノールなどを用いて蛋白を取り除く。蛋白を取り除い
た後、エタノールを用いて沈殿させることにより、ラッ
トシナプトフィジン遺伝子断片を含有するＤＮＡを得る
ことができる。

【００４０】本発明のモノクローナル抗体は、上述した
ようにシナプトフィジンに特異的に結合する。従って、
本発明のモノクローナル抗体、及び薬理学的に許容し得
る担体或いは希釈剤を含有する薬用組成物は、シナプト
フィジンの存在を指標とするニューロエンドクリン腫瘍
の診断に有用である。

【００４１】診断に用いる場合の本発明のモノクローナ
ル抗体は、診断を可能とするために標識されていること
が必要である。標識としては、体内に取り込まれた後に
検出され得るいずれのものを用いてもよい。しかし、現
在では後述するシンチグラフィー法等による画像診断が
最も一般的に行われているため、ラジオアイソトープを
標識として好ましく用いることができる。標識として用
いられるラジオアイソトープは、半減期や、放射線の種
類、診断の目的等に応じていずれのものをも選択し得る
が、目的とする臓器に貯留しやすいものを用いることが
好ましい。具体的には、^99m Ｔｃ、¹¹¹ Ｉｎ、¹²³ Ｉ、
¹³¹ Ｉ、²⁰¹ Ｔｌ、⁷⁵Ｓｅ、¹⁶⁹ Ｙｂ、⁶⁷Ｇａ等が用い
られる。

【００４２】本発明の薬用組成物に含有される担体或い
は希釈剤としては、薬理学的に許容し得るものとして慣
用的に用いられているいずれのものを用いてもよく、ま
た２種以上併用することも可能である。好ましくは、無
菌かつ水性の等張懸濁液または溶液であり、具体的には
生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水等を好ましく
用いることができる。

【００４３】本発明の薬用組成物の投与方法としては、
皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与等いず
れの非経口投与方法をとってもよい。

【００４４】本発明における薬用組成物の投与量は、投
与対象の年齢、体重、投与経路等に依存するが、哺乳類
の体重１Ｋｇ当たり１〜１００ｍｇの１日の投薬量、好
ましくは１〜１０ｍｇ／Ｋｇの投薬量で使用され得る。

【００４５】本発明の薬用組成物は、標準的な方法によ
り調製することができる。

【００４６】このようにして調製された薬用組成物を用
いた診断方法について以下に簡単に説明する。

【００４７】診断方法として、現在最も一般的に用いら
れているのはシンチグラフィー法である。これはγ線を
出すアイソトープを体内に投与し、一定時間後に目的と
する臓器或いは全身の放射能の分布をシンチスキャナー
（コンピューターを駆使することにより画像化でき
る）、或いはシンチカメラを用いて測定し、画像に表し
て診断する方法である。これにより臓器の病巣の有無
（アイソトープをよく取り込む部分或いは逆に取り込ま
ない部分）の診断が可能となる。

【００４８】すなわち、具体的には、本発明の薬用組成
物を有効量投与し、一定時間後に、病巣を有する臓器
（本来シナプス小胞を持たない臓器）の映像を描写し、
当該病巣がニューロエンドクリン腫瘍であるかどうかを
診断することができる。

【００４９】

【作用】本発明のモノクローナル抗体を用いると、ニト
ロセルロース等の膜に移し取られた蛋白質群、ＥＬＩＳ
Ａプレートに吸着された蛋白質群、或いは組織切片のよ
うな組織標本中に含まれるラットシナプトフィジンのみ
を容易に検出することができる。その検出方法として
は、酵素あるいは蛍光色素等でラベルした抗マウスＩｇ
Ｍ抗体と組み合わせて用いる、間接酵素抗体法や間接蛍
光抗体法を挙げることができる。

【００５０】また、本発明のモノクローナル抗体は免疫
グロブリンクラスＩｇＭに属し、１分子中に１０個の抗
原又は補体結合部位を有する。従って、本発明のモノク
ローナル抗体を用いて補体固定化アッセイを行うと、従
来のＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を用いた場合に
比べて、高感度であり、より少量の抗体で微量のラット
シナプトフィジンを定量することができる。

【００５１】また本発明のモノクローナル抗体を含有す
る薬用組成物を用いると、転移した場合のニューロエン
ドクリン腫瘍の診断が可能となる。また、当該薬用組成
物を用いたシンチスキャナー法及びコンピューターを用
いた総合的な映像診断により、Ｘ線を用いた場合よりも
容易に検出することができる。

【００５２】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。

【００５３】実施例１ ラット脳の蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製 （１）免疫原の調製 以下の調製操作は、特に断らないかぎり０〜４℃で行っ
た。また、水と溶液には、必要に応じて０．５ｍＭの蛋
白質分解酵素阻害剤ＰＭＳＦを加えた。

【００５４】まず、ラット脳に３倍量の緩衝液Ａ（０．
３２ｍＭシュークロース、２０ｍＭトリス−クエン酸緩
衝液）を加え、ホモジェナイズした。このホモジェネー
トをそのまま免疫原に用いてもよい。しかし、この実施
例では該ホモジェネートをナイロンメッシュ（メッシュ
サイズ１３３μｍ，７７μｍ）に通した後、等量の緩衝
液Ａに重層し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清
を採取した。更に、この上清を１，５０００ｒｐｍで３
０分間遠心し、得られた沈殿を採取した（この沈殿とし
て得られた抽出物をＰ２画分と呼ぶ）。次に、この遠心
により得られた上清を４０，０００ｒｐｍで１５０分間
遠心し、得られた沈殿を採取した（この沈殿として得ら
れた抽出物をＰ３画分と呼ぶ）。これら両画分を単独
に、または適当な割合で混合して免疫原とした。

【００５５】（２）動物の免疫 （１）で調製した免疫原と、フロイントのコンプリート
アジュバンドとを等量づつ夫々１mlのシリンジにとり、
これをジョイントでつないで乳化するまでよく攪拌し
た。これをマウスの腹腔内に注射して免疫感作を行っ
た。即ち、基本的には１回目の免疫の２週間後に２回目
の免疫を行い、その更に２週間後にブーストとして免疫
した。そして、ブーストの３日後に細胞融合操作を行う
というスケジュールで実験を行った。日数を調整する必
要があるときには、ブーストを遅らせることにより調整
した。また、抗体価は、免疫後２日から７日後にマウス
の尾静脈から採血し、その血清を用いて後述のイムノブ
ロット法を行うことにより検定した。

【００５６】（３）細胞融合 （２）の操作により免疫したマウスの頚椎を脱臼し、脾
臓を取り出した。これを予め５mlのＲＰＭＩが入った６
cmディッシュに移し、余分な脂肪などを除いた。さらに
２枚の５mlＲＰＭＩ入りの６cmディッシュで洗った。２
つに折った５cm角のステンレス製金網の間にピンセット
で脾臓を擦り付け、細胞をバラバラにした。このバラバ
ラにした細胞をピペットで遠心管に移し、遠心操作によ
り１０mlのＲＰＭＩで２回洗った。沈殿した細胞に０．
１７ＭのＮＨ₄ Ｃｌを加え、氷中に５分間つけて溶血さ
せた。この溶血操作の後に５mlのＲＰＭＩを加え、１６
００ｒｐｍで５分間遠心し、ＲＰＭＩで洗い、２０mlに
メスアップして脾臓細胞懸濁液とした。

【００５７】一方、対数増殖期にあるミエローマ２〜４
ｄｉｓｈ分を、１２００ｒｐｍで５分間の遠心で集め
た。これを血清を含まないＲＰＭＩで２回洗い、最後に
１０mlのＲＰＭＩに懸濁してミエローマ懸濁液を調製し
た。脾臓細胞懸濁液とミエローマ懸濁液の細胞数をカウ
ントし、ミエローマが脾臓細胞の１／５〜１／２０にな
るように、脾臓細胞懸濁液にミエローマ懸濁液を加え
た。５分間遠心し、上清を除いてサスペンドした。０．
３mlの５０％ポリエチレングリコール１５００（ｉｎ
７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）を一気に沈殿に加え、直ちによ
く攪拌した。攪拌を続けながら、ＲＰＭＩを加えた。こ
の懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿にＨＡ
Ｔ培地（最終濃度で、１×１０^-7Ｍのヒポキサンチン、
４×１０^-4Ｍのアミノプリテン、１６×１０^-4Ｍのチミ
ジンを含むＲＰＭＩ−ＦＣＳ）を５０ml加えた。これを
５００μｌ／ｗｅｌｌずつ２４ウェルプレート２枚に撒
き、また１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレート
約３枚に撒いた。４〜５日後に、２４ウェルプレートに
は約１ｍｌ／ｗｅｌｌ、９６ウェルプレートには約１０
０μｌ／ｗｅｌｌのＨＡＴ培地を加えた。その結果、約
１週間で殆どのウェルにハイブリドーマが増殖した。こ
のハイブリドーマを更に培養し、培養上清をイムノブロ
ット法によるスクリーニングに用いた。

【００５８】（４）ハイブリドーマの選定とクローニン
グ （１）で調製した免疫原を、総蛋白量が数１０ｍｇ／ｍ
ｌとなるように希釈してこれを抗原溶液とした。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行った後、Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９）の
方法により、電気泳動的にニトロセルロース膜に蛋白質
を写し取った。このニトロセルロース膜を、ブロックエ
ース（大日本製薬より入手可能）等の適当なブロック剤
を用いて室温で１時間から一晩ブロックした。これを、
一次抗体としてスクリーニングしようとする培養上清と
共にインキュベートした。その後、このニトロセルロー
ス膜をＴＢＳで１５分間３回洗った。次いで、二次抗体
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でラベ
ルしたヤギ抗マウス抗体とインキュベートして反応させ
た後、ＴＢＳで１５分間３回洗った。発色検索のため
に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の１
００μｇ／ｍｌジアミノベンジジン４塩酸塩に、１／１
００量の１％ＣｏＣｌ₂ ６Ｈ₂ Ｏと、１％（ＮＨ₄ ）₂
Ｎｉ（ＳＯ₄ ）₂ ６Ｈ₂ ０と、１／５００量の過酸化水
素水とを加えた発色液を用いた。十分に発色させた後、
蒸留水で洗って乾燥させた。この検索の結果、強い活性
が認められた培養上清を採取することができたウェルを
選別した。これらウェルのハイブリドーマをフィーダー
細胞としてマウスの胸腺細胞を用い、限界希釈法により
クローニングした。これにより１個のクローンを得た。
このようにして得られたハイブリドーマＲＢ２−４は、
微工研条寄３９４４号をもって、微生物工業技術研究所
に寄託されている。このハイブリドーマを培養すること
によりモノクローナル抗体を得た。このモノクローナル
抗体をＲＢ２−４と命名した。

【００５９】アマシャム社製のＳｕｂ Ｉｓｏｔｙｐｉ
ｎｇ Ｋｉｔを用いて検討した結果、この抗体のサブク
ラスはＩｇＭであることが判明した。

【００６０】実施例２ ＲＢ２−４反応特異性の検討 ＲＢ２−４の反応特異性を、実施例１と同様のイムノブ
ロット法によって検討した。その結果を第１図に示す。

【００６１】第１図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる脳ホモ
ジェネートの展開パターンおよびイムノブロット法によ
るＲＢ２−４の結合位置を示す写真である。図１におい
て、１は分子量マーカーのＣＢＢによる染色パターンで
あり、２はラット脳ホモジェネートのＣＢＢによる染色
パターンである。また、３はラット脳ホモジェネートに
対して、ＲＢ２−４を用いて行ったイムノブロット法の
結果を示している。図から明らかなように、ＲＢ２−４
は、分子量約４０ｋＤの単一の蛋白質のバンドに反応す
る。

【００６２】実施例３ ラットシナプトフィジン遺伝子の単離 （１）モノクローナル抗体ＲＢ２−４によるプラークの
スクリーニング 大腸菌（Ｙ１０９０（Δ1acU169proA+Δ1on araD139str
AsupF[trpC22::Tn10] (pMC9*),mcrA-,mcrB+)) を、ＬＢ
Ｍ培地（０．２％マルトース、５０ｍｇ／ｌアンピシリ
ンを含有）を用いて一晩培養した。一方、λｇｔ１１ベ
クターを用いてラット脳から調製されたクローンテック
社製のｃＤＮＡライブラリを４×１０⁵ pfu 程度に希釈
した。この希釈液と上記培養によって得られた培養液
０．６mlを混合し、室温で２０分間インキュベートし
た。一方、トップアガロース（ＬＢＭアガロースなど）
をオートクレーブ処理して溶融状態のまま５５℃でイン
キュベートし、上記の混合液に加えて素早く攪拌した。
これを予めプレート上に広げたボトムアガー（０．８％
ＬＢＭアガーなど）の上に広げた。トップアガロースが
固まった後、４２℃で３．５時間インキュベートし、プ
ラークを形成させた。形成されたプラーク上にニトロセ
ルロース膜を重ね、３７℃で３．５時間インキュベート
して大腸菌に導入されたｃＤＮＡを発現させた。このニ
トロセルロース膜は、予め１０ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプ
ロピルチオガラクトピラノシド）に浸し、乾燥させたも
のである。その後、ニトロセルロース膜をＴＢＳで洗浄
し、以後の抗原抗体反応によるスクリーニングに用い
た。

【００６３】ＲＢ２−４を用いたスクリーニングは、以
下の通りに行った。まず、上記のニトロセルロース膜を
３％ゼラチンを含むＴＢＳを用い、室温で１時間から一
晩ブロックした。ブロッキングが終了したニトロセルロ
ース膜を、スクリーニングに用いるモノクローナル抗体
（一次抗体）と反応させた後、ＴＢＳによる１５分間の
洗浄を３回行った。続いて、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）でラベルしたヤギ抗マウス抗体（二次抗
体）と反応させた後、ＴＢＳによる１５分間の洗浄を３
回行った。次いで、１００μｇ／ｍｌジアミノベンジジ
ン４塩酸塩 in ５０mM Tris-ＨＣｌ(pH7.5) に、１／１
００量の１％ＣｏＣｌ₂ ６Ｈ₂ Ｏと、１％（ＮＨ₄ ）₂
Ｎｉ（ＳＯ₄ ）₂ ６Ｈ₂ ０と、１／５００量の過酸化水
素水を加えた発色液で発色させた。十分に発色させた
後、染色されたスポットを検索した。染色されたスポッ
トに対応するプラークを探すことで、目的とする遺伝子
断片をもつファージを得た。

【００６４】（２）ラットシナプトフィジン遺伝子およ
びその相補鎖を有する ファージの増殖 上記（１）で得られたラットシナプトフィジン遺伝子お
よびその相補鎖を有するファージを、プレートライセー
ト法を用いて以下の手順で増殖させた。まず、大腸菌
（Ｙ１０８８（ΔlacU169supEsupFhsdR-hsdM+metBtrpRt
onA21[proc::Tn5](pMC9),mcra-mcrB+)）を、ＬＢＭ培地
（０．２％マルトース、５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンを
含有）で一晩培養した。その培養液に、１０⁵ 〜１０⁶
pfu のファージを含むＳＭ緩衝液０．１ｍｌを加え、１
０分間室温でインキュベートした。一方、トップアガロ
ース（ＬＢＭアガロースなど）をオートクレーブ処理
し、溶融状態のまま５５℃でインキュベートした。これ
を上記の混合液に加え、素早く攪拌して、予めプレート
上に用意してあったボトムアガー（ＬＢＭアガーなど）
上に広げた。トップアガロースが固まった後、プレート
をビニール袋にいれ、３７℃で６〜７時間培養した。大
腸菌が溶菌した後、５ｍｌのＳＭ緩衝液および数滴のク
ロロホルムを添加し、ＳＭ緩衝液が表面を完全に覆うよ
うに水平に保ちながら、４℃で一晩インキュベートし
た。これにより、ラットシナプトフィジン遺伝子および
その相補鎖を有するファージがＳＭ緩衝液中にを分散さ
れたファージ懸濁液がえられた。

【００６５】（３）ラットシナプトフィジン遺伝子およ
びその相補鎖の調製 上記（２）で得られたラットシナプトフィジン遺伝子お
よびその相補鎖を有するファージ液に、ＲＮａｓｅＡ、
ＤＮａｓｅＩを夫々５μｇ／ｍｌになるように加え、３
７℃で３０分間インキュベートした。次に、等量のポリ
エチレングリコールＰＥＧ６０００−２M ＮａＣｌ溶液
を加えて混合した後、０℃で１時間インキュベートし
た。この混合液を４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心
した後、上清を完全に除去した。得られた沈殿をＳＭ緩
衝液０．５ｍｌ中に懸濁し、エッペンドルフチューブに
移した。これを８０００ｒｐｍで２分間遠心し、得られ
た上清を別のエッペンドルフチューブに移した。これに
ＥＤＴＡ及びＳＤＳを夫々１０ｍＭ、０．１％になるよ
うに添加し、６５℃で１５分間インキュベートした。そ
の後、フェノール抽出１回、フェノール・クロロホルム
抽出２回、クロロホルム抽出１回を行った。この抽出の
際には、ＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液）で飽和された
フェノールを用いた。これらの抽出によって得られた水
層に、３Ｍ酢酸ナトリウムを５０μｌおよびエタノール
１ｍｌを加え、−８０℃で１５分間インキュベートした
後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心の後、上
清を捨て得られた残渣を冷７０％エタノールですすいで
乾燥させた。これを５０μｌのＴＥに溶解して、ラット
シナプトフィジン遺伝子およびその相補鎖を有するファ
ージＤＮＡを得た。

【００６６】こうして得られたＤＮＡからは、ＥｃｏＲ
Ｉなどの制限酵素を用いることにより、ラットシナプト
フィジン遺伝子およびその相補鎖を切り出すことができ
た。

【００６７】更に、以下の手順により、ＥｃｏＲＩなど
で切断したファージＤＮＡからラットシナプトフィジン
遺伝子およびその相補鎖のみを得た。まず、エチジウム
ブロマイドとＴＡＥ（ＥＤＴＡ−トリス酢酸緩衝液）を
含む緩衝液系において、ＥｃｏＲＩで切断したファージ
ＤＮＡを、１％低融点アガロースゲルを用いて電気泳動
を行った。泳動後、トランスイルミネータでＵＶ照射し
て、０．８ｋｂｐの目的のバンドを切り出し、これをエ
ッペンドルフチューブに移した。６５℃でゲルを溶か
し、蒸留水を加えた後にゆっくりと冷やした。フェノー
ル抽出を２回、フェノール・クロロホルム抽出を１回行
った後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。この
抽出の際には、ＴＥで飽和されたフェノールを用いた。

【００６８】このＤＮＡの塩基配列をダイデオキシ法で
解析したところ、配列表の配列番号１に示す塩基配列が
含まれていることが見出された。配列番号１は、本発明
で得られたラットシナプトフィジン遺伝子の塩基配列を
示しており、その配列は５´末端に向かう方向に表し
た。ここで、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ンおよびＴはチミンをあらわす。

【００６９】また、配列表の配列番号２は、既に知られ
ているラットシナプトフィジン遺伝子の塩基配列を示し
ている。この配列表では、５´末端から３´末端に向か
う方向に、７２１番から１５０１番までの塩基配列を示
してある。配列番号１に記載した本発明における塩基配
列は、この公知のシナプトフィジン遺伝子の塩基番号７
２６〜１４８６に対応している。

【００７０】本発明で得られたラットシナプトフィジン
遺伝子の塩基配列及び既知のラットシナプトフィジン遺
伝子の塩基配列の相同性を図２〜図３に示す。上段には
本発明で得られたラットシナプトフィジン遺伝子の塩基
配列、下段に既知のラットシナプトフィジン遺伝子の塩
基配列が示してある。＊は双方の塩基配列が相同である
ことを示している。またＡはアデニン、Ｃはシトシン、
Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表し、−は塩基が脱落して
いる部分を示す。両者を比較すると、以下の三つの塩基
が異なっているが、それ以外は完全に一致している。

【００７１】 配列番号１の塩基（番号） 配列番号２の対応する塩基（番号） Ｇ（６４） Ａ（７８９） Ｃ（２２４） Ｔ（９４９） Ｔ（２９７） Ｃ（１０２２） この関係から明らかなように、上記二つのＤＮＡ配列は
ほぼ完全に一致している。つまり、上記で調製されたＤ
ＮＡはラットシナプトフィジン遺伝子である。

【００７２】

【発明の効果】以上のように、本発明によると、ラット
シナプトフィジンに特異的に結合するモノクローナル抗
体が提供される。このモノクローナル抗体を用いること
により、間接酵素抗体法、間接蛍光抗体等によって、ニ
トロセルロース膜に写しとった蛋白質群などからラット
シナプトフィジンのみを容易に検出することが可能にな
る。

【００７３】また、シナプトフィジンはニューロエンド
クリン腫瘍の良い検出マーカーとなるため、ニューロエ
ンドクリン腫瘍を検出することが可能になる。従って、
臨床医学分野における診断にも用いることが期待され
る。

【００７４】［配列表］ 配列番号：１ 配列の長さ：７５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（生物名） 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 10 20 30 40 50 60 AGCACCTGGC GATGCCTACG GCGATGCGGG CTACGGGCAG GGCCCCGGAG GCTATGGGCC 70 80 90 100 110 120 CCAGGACTCC TACGGGCCTC AGGGTGGTTA TCAACCCGAT TACGGGCAGC CAGCCAGCGG 130 140 150 160 170 180 TGGCGGTGGC TACGGGCCTC AGGGCGACTA TGGGCAGCAA GGCTATGGCC AACAGGGTGC 190 200 210 220 230 240 GCCCACCTCC TTCTCCAATC AGATGTAATC TGGTCAGTGA AGTCCATGAA GATCCCACGG 250 260 270 280 290 300 GTGGGCAAGA GCTCAAGAGA AGGCCTGCCC CCCTTTTCCC ATCCCCATAT CCTAGGTCTC 310 320 330 340 350 360 CACCCCTCAA CCCAGGAGAC CCTAACTGTC TTTGCTGTTT ATATATATAT ATATTATATA 370 380 390 400 410 420 TAAATATCTA TTTATCTGTC TGAGCCCTAC ATTCACCCAC TTCTCCATGC ACTAGAGGCC 430 440 450 460 470 480 CAGTCCTGAA TGGGCTCCTC CCCAACCCTG ACCTTGCATT CCTCAGCCCC TATCTGTTCC 490 500 510 520 530 540 CCAGCCCTGT CCCTTGAGGT AAGGGGCTCT AGAAAGGGGA GAGGAAGGGA ACCAGACCTT 550 560 570 580 590 600 GGCTGCATGG AGTGGGTTGG TGTGACTTTC TCTCCTTCCT CCTCTCCCTC TGCCCCTCCT 610 620 630 640 650 660 AACTCTGGCC TTGGTCCTCC AGCATCACCT GAACTTCAGA AGCTCTCGAA TGGAAATCTG 670 680 690 700 710 720 ACCCCAAGAG TAGAGCAGTA GACTGAGTGG AGGAGGCTTG GGTGAAACGG GCAGAGAGGA 730 740 750 GATAACCTCT GTAGAGAGAG GACTAGTCAG 配列番号：２ 配列の長さ：７８１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 721 726 736 746 756 766 776 786 CAACCAGCACCTGGC GATGCCTACG GCGATGCGGG CTACGGGCAG GGCCCCGGAG GCTATGGGCC 796 806 816 826 836 846 CCAGGACTCC TACGGGCCTC AGGGTGGTTA TCAACCCGAT TACGGGCAGC CAGCCAGCGG 856 866 876 886 896 906 TGGCGGTGGC TACGGGCCTC AGGGCGACTA TGGGCAGCAA GGCTATGGCC AACAGGGTGC 916 926 936 946 956 966 GCCCACCTCC TTCTCCAATC AGATGTAATC TGGTCAGTGA AGTCCATGAA GATCCCACGG 976 986 996 1006 1016 1026 GTGGGCAAGA GCTCAAGAGA AGGCCTGCCC CCCTTTTCCC ATCCCCATAT CCTAGGTCTC 1036 1046 1056 1066 1076 1086 CACCCCTCAA CCCAGGAGAC CCTAACTGTC TTTGCTGTTT ATATATATAT ATATTATATA 1096 1106 1116 1126 1136 1146 TAAATATCTA TTTATCTGTC TGAGCCCTAC ATTCACCCAC TTCTCCATGC ACTAGAGGCC 1156 1166 1176 1186 1196 1206 CAGTCCTGAA TGGGCTCCTC CCCAACCCTG ACCTTGCATT CCTCAGCCCC TATCTGTTCC 1216 1226 1236 1246 1256 1266 CCAGCCCTGT CCCTTGAGGT AAGGGGCTCT AGAAAGGGGA GAGGAAGGGA ACCAGACCTT 1276 1286 1296 1306 1316 1326 GGCTGCATGG AGTGGGTTGG TGTGACTTTC TCTCCTTCCT CCTCTCCCTC TGCCCCTCCT 1336 1346 1356 1366 1376 1386 AACTCTGGCC TTGGTCCTCC AGCATCACCT GAACTTCAGA AGCTCTCGAA TGGAAATCTG 1396 1406 1416 1426 1436 1446 ACCCCAAGAG TAGAGCAGTA GACTGAGTGG AGGAGGCTTG GGTGAAACGG GCAGAGAGGA 1456 1466 1476 1486 1496 GATAACCTCT GTAGAGAGAG GACTAGTCAG CCAAGAGTTG AATTCCAGAC ATACT

【図面の簡単な説明】

【図１】ラット脳ホモジェネートのＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる展開パターンおよびモノクローナル抗体ＲＢ２−４
の特異性をイムノブロット法で表した電気泳動を示す図
である。

【図２】本発明で得られたラットシナプトフィジン遺伝
子の塩基配列及び既知のラットシナプトフィジン遺伝子
の塩基配列の相同性を示す図である。

【図３】本発明で得られたラットシナプトフィジン遺伝
子の塩基配列及び既知のラットシナプトフィジン遺伝子
の塩基配列の相同性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/06 - 15/08 A61B 10/00 A61K 49/00 C12N 5/12 - 5/28 C12P 21/08 G01N 33/574 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微工研条寄第３９４４号をもって微生物
   工業技術研究所に寄託されているハイブリドーマ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のハイブリドーマによっ
   て生産される抗シナプトフィジンモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 検出可能な標識で標識した請求項２に記
   載のモノクローナル抗体を被検査対象に投与した後、該
   被検査対象内における前記モノクローナル抗体の分布状
   態を示す情報を画像表示し、ニューロエンドクリン腫瘍
   の分布状態を検出することを特徴とするヒト以外の被検
   査対象のニューロエンドクリン腫瘍の検出方法。