JPH05219982A - 脳に分布する蛋白質に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、組織中、および蛋白質群中に含ま
れるＲＢ３５抗原の検出を可能とするモノクローナル抗
体を提供することを目的とする。 【構成】 ラット脳の抽出物を免疫原として作製された
モノクローナル抗体であって、免疫グロブリンクラスが
ＩｇＧ₁ に属し、ＲＢ３５抗原に対して特異的な反応性
を有することを特徴とするモノクローナル抗体である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラット脳の抽出物を免
疫原として作製された、脳に分布する特定の蛋白質に対
するモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】脳は、感覚、運動、記憶等の人間の精神
活動の中心を司る部位であり、最も重要な器官の１つで
ある。しかし、従来、脳内の化学物質は、神経情報伝達
等の重要な機能を担っているにも拘らず、まだほとんど
解明されていない。また、脳は、人間の思考、運動能力
を司る重要な機能を有する器官であるため、病原体の感
染などによる脳炎等の後遺症が与える影響はかなり大き
い。従って、脳疾患等の診断、治療上の必要性からも、
脳内の化学物質の精製・単離は、近年、最も注目されて
いる課題の１つである。

【０００３】脳疾患の１つである脳炎は、脳実質の炎症
をいい、その多くは全身的疾患の一部を占めるものであ
るが、脳を中心する神経系が病像を支配している。脳炎
の病原因子は、寄生虫、菌、黴、リケッチア、ウイルス
など様々である。また、脳炎は髄膜炎と密接な関係があ
り、通常併発することが多い。脳炎の後遺症としては、
性格変化、知能低下、運動障害等の障害がある。

【０００４】一方、脳疾患に対する治療方法を開発する
ためのいくつかの実験動物モデルが存在し、また脳疾患
に関連する幾つかの蛋白質等が精製・単離されている。
例えば、脳脊髄炎に関するモデルとしては、脳組織のホ
モジネートを抗原としてフロイントの完全アジュバンド
法で動物を免疫することによって誘発される実験的アレ
ルギー性脳脊髄炎（EAE,experimental allergic cephal
omyelitis ）が知られている。これは、特に、多発性硬
化症（MS,multiple sclerosis ）などの自己免疫性脱髄
疾患に関するモデルとして重要な位置を占めている。EA
E の起発性蛋白質は、分子量１８３００のミエリン塩基
性蛋白質（MBP,myelin basic protein）である。これ
は、中枢及び末梢神経系の軸索突起を覆い、絶縁体の役
目をしているミエリンの主要構成蛋白質であり、E.H.Ey
lar, P.R.Carnegie らにより全一次構造が決定されてい
る。EAE 等は、このミエリン塩基性蛋白質に対する自己
免疫、すなわち、何らかの原因（例えばアジュバンドに
よる免疫性の上昇、或いはウイルス感染など）によって
引き起こされた免疫防御機構が、自己に対して働いてし
まうことが原因であると考えられている。

【０００５】このように、脳は、人間の精神活動等に重
要な部位を占めており、病変を引き起こすと致命的な打
撃を被ることが多い。また、重要な器官であるが故に、
脳疾患の生じた部位によっては外科的治療もかなり困難
な面がある。従って、前記ミエリン塩基性蛋白質のよう
な脳に分布する物質を精製・単離することは、脳疾患の
診断、治療方法を開発する上で重要である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、脳に分布する新規な蛋白質を精製・単離するために
有用な、ラット脳に存在する特定の抗原に対して特異的
に反応するモノクローナル抗体を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ラット
脳の抽出物を免疫原として作製されたモノクローナル抗
体であって、免疫グロブリンクラスがＩｇＧ₁ に属し、
ラット脳抽出物を抗原とするウェスタンブロッティング
法による検出において、分子量が約３０ｋＤａのバンド
に結合することを特徴とするモノクローナル抗体が提供
される。

【０００８】また、本発明によれば下記塩基配列を有す
る遺伝子が発現する蛋白質に対して反応性を有するモノ
クローナル抗体が提供される。

【０００９】以下、本発明のモノクローナル抗体をＲＢ
３５と呼び、ＲＢ３５と抗原抗体反応を有する蛋白質を
ＲＢ３５抗原と呼ぶ。

【００１０】 10 20 30 40 50 60 ATCCCTGGAG GGTCGCCCAG GCCAGCCCTG CATCCAGGGC AGCGACTTGA TTCAGCGACA 70 80 90 100 110 120 GGAACCCTCC TAAAACTAAG AATGAGTTCT TTCTAAGAGG CAGGGAATGG TTACTTTTCC 130 140 150 160 170 180 ACTGAGGTTA GTGTGCACCA ATGGGCACTG CCATGGCGAG CTGCCGCTGA CCACCCTAAA 190 200 210 220 230 240 GTGAGAAGTG GCCAGAGGGA CAGCACGAGG CCACCAGAGA ACTCCTGCAG TCCCACTTCC 250 260 270 280 290 300 TGATGCGCCA TGTCCTTGGA CTCTCCCTGG GCTCTGAGAG GAAACAGGGT TCTTAAAAGC 310 320 330 340 350 360 ACCTGCTCTG GGGAGCCACT GAGGAGAGAT GGTGACCTTC GGCAGCCACA CATGGCATCT 370 380 390 400 410 420 CCAGCGTGTT CCCCTAAGTC CCCGTTTCCT GTCGGGTCCA TTGCCCAGCC CGCTCGCCCC 430 440 450 460 470 480 TTTCCTTCCC TCTGCCACGC TCGAAATCAG CTGGTGGGGT GCAGGGAACC GCTGGCCTGG 490 500 510 520 530 540 AAGCGTCCCC AGGGCCACCC CACTCTGGAC TCTCACAGCT GCCCAGCCTG TGCTCACATA 550 560 570 580 590 600 CCACAAGCCC CCGTTGTGTA AGCCACTCCA AGACTGTCTG ATCCTGTTAG GAAAAACAAA 610 620 630 640 650 660 GCTCTTTAGG GGAAAGAAAA CAAAGGAAGC CTGGACCACA CAGTCCCCTG CGCCATGCTC 670 680 690 700 710 720 TCTGGCTCCT TGGCGGTGTG CCTGTCTATC CGCAGTGCCC ACGGAAGCTG GAGGGGTGCG 730 740 750 760 770 780 CCTCGCCGTG AAAAGAAAGT CTGAGGATGG AGTAGGGGTG AACTTGAAAG GGTGTCCGTG 790 800 810 820 830 840 CACCTGAACC TCCGGAGTCG ACCAAGGTAC ACGGGGAGCA AGTCGGGGCA GAGAAGACCC 850 860 870 880 890 900 CGAGGAAACT CAATCTTCAA ATAAAAAGGG ACAAACAGTT TTAGCCAGTC AGGGTGCCGT 910 920 930 940 950 960 GGGCCTGGCC CCGCCGCGTT CACAGCCCCA CGGGATTAAG AGAGGGTCTG CTCTAACTAG 970 980 990 1000 1010 1020 CTATTTGGTG CAAGTAGAAT TAAACGTTTA AGGCAGTTAT ATTAAGAAGC CGAGGGCAGG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ATTCGGGAAG GCTGAGCAGG GAGGCTCTCA GCGTCTTGCC ATGGGAGATC CAGAGCGGCT 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTCTCTTCCT CCCCAGCTAA ATCTGCTGAG GGACAGGCCT CTCCCCTTTC CTTGGGATGG 1150 AGGGGCC （ここで、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
およびＴはチミンをあらわす。）以下本発明を詳細に説
明する。

【００１１】まず、本発明のモノクローナル抗体を作製
する。

【００１２】これは、通常のモノクローナル抗体技術を
用いて作成することができる。すなわち、ラット脳の抽
出物で免疫された哺乳動物から取り出した抗体産生細胞
と、適当な動物の腫瘍細胞、例えばミエローマとを融合
させて、目的とする抗体を産生する融合細胞（ハイブリ
ドーマ）を調製し、この融合細胞をクローン化した後、
培養することにより作製することができる。

【００１３】より詳細には、本発明のモノクローナル抗
体は、下記の手順により作製することができる。 ａ）抗体産生細胞の調製 まず、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを得るために、ラット脳の抽出物を用いて哺乳動
物を免疫感作する。

【００１４】本発明のモノクローナル抗体を生産する抗
体産生細胞を得るための哺乳動物としては、マウス、ラ
ット、ウサギ、モルモットなど一般に用いられる実験動
物を使用することができるが、マウスを用いることが好
ましい。

【００１５】哺乳動物を免疫感作する方法としては、例
えばマウスの腹腔もしくは皮下などに、免疫原としての
ラット脳の抽出物を接種する方法を用いることができ
る。１回当りの接種量は、免疫原０．２ml／マウス程度
が好ましく、これを等量のアジュバンドと混和して懸濁
液としたものを用いる。この操作を、１〜２週間ごとに
数回繰り返す。更に、０．２〜０．４ml／マウスの免疫
原をそのまま静脈内もしくは腹腔に注射することにより
最終免疫を行う。最終免疫のための注射の３〜４日後に
脾臓を摘出し、抗体産生細胞を得る。 ｂ）腫瘍細胞の調製 上記抗体産生細胞と細胞融合するための腫瘍細胞を調製
する。

【００１６】本発明における腫瘍細胞としては、通常ミ
エローマ細胞が用いられる。腫瘍細胞の由来はとくに限
定されるものではなく、マウス、ラット、ウサギ、ヒト
等の哺乳動物の細胞株を使用することができるが、マウ
スの細胞株を用いることが好ましい。一般には、ヒポキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ欠損（ＨＧＰＲＴ^- ）またはチミジンキナーゼ欠損
（ＴＫ^- ）等の適当な選択マーカーを有する腫瘍細胞株
が用いられる。このような細胞株としては、例えばＰ３
−Ｘ６３−Ａｇ８，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１，ＳＰ
２０−Ａｇ８−６．５．３が挙げられる。これらの腫瘍
細胞は、８−アザグアニン抵抗性の細胞株であり、ＨＡ
Ｔ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを
含有）中では生育することができない。 ｃ）細胞融合 上記抗体産生細胞及び腫瘍細胞を融合させる。

【００１７】細胞融合の際に用いられる培地としては、
通常用いられるイーグル最少基本培地（ＭＥＭ）、ダル
ベッコ改良ＭＥＭ、ロズウェル・パーク・メモリアル・
インスティチュート（ＲＰＭＩ）１６４０などに１０％
ＣＳ（子ウシ血清）、５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）＋５
％ＣＳまたは１０％ＦＣＳを添加したものを用いること
ができる。通常、親細胞を維持する際には、上記のいず
れの培地を用いても良いが、ハイブリドーマを作製する
際には１０％ＦＣＳを添加することが好ましい。

【００１８】細胞融合は、融合促進剤の存在下で、親細
胞であるミエローマなどの腫瘍細胞と免疫感作された脾
細胞（抗体産生細胞）とを１：５〜１：２０の割合で混
合することにより行う。融合促進剤としては、ＨＶＪ
（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ ｏ
ｆ Ｊａｐａｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
などを使用することができるが、特に、３０％〜５０％
のＰＥＧ１５００を用いることが好ましい。 ｄ）ハイブリドーマのＨＡＴ選択 ＨＡＴ培地においてハイブリドーマを選別する。

【００１９】ｃ）の方法により融合させた細胞を、２０
％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地などで適当
に希釈し、マイクロカルチャープレート（通常９６ウェ
ルまたは２４ウェルのプレート）に、１０⁴ 〜１０⁶ ／
１００μｌ／ウェル程度植え付ける。その後、各ウェル
にＨＡＴ選択培地を添加し、通常１〜２日ごとに培地の
交換を行いながら培養する。

【００２０】腫瘍細胞として８−アザグアニン抵抗性株
を用いた場合には、未融合のミエローマ細胞およびミエ
ローマ・ミエローマ融合細胞はＨＡＴ培地中では約７日
間で死滅し、また脾細胞は正常細胞であるために寿命が
あり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは２週間以上は生育できな
い。従って培養７〜１０日目位から生育して来るものは
すべて脾・ミエローマ融合細胞と考えられる。 ｅ）ハイブリドーマのスクリーニング 上記ｄ）の方法により選別されたハイブリドーマをスク
リーニングする。

【００２１】スクリーニングは、主にハイブリドーマの
増殖したウェルの培養上清を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚ
ｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ）法やイムノブロット法など公知の方法を用
いて目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクロー
ンを拾い上げることにより行うことができる。 ｆ）クローニング スクリーニングにより得られた目的のハイブリドーマを
クローニングする。

【００２２】各ウェル中には異なる抗体を産生している
２種類以上のハイブリドーマが生育している可能性があ
るため、限界希釈法等によりクローニングを行う必要が
ある。 このクローニング操作によって、最終的に目的
のモノクローナル抗体を産生している単一性のハイブリ
ドーマを得ることができる。 ｇ）モノクローナル抗体の取得 上記ｆ）で獲られたハイブリドーマを培養することによ
り目的のモノクローナル抗体を得る。

【００２３】前記ハイブリドーマは、培養容器中（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）或いは動物体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のい
ずれにおいても培養することができる。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで培養する場合、培地は前述の通常培地にＣＳまたは
ＦＣＳを添加したものでよく、この培地で３〜５日間培
養の後、培地上清より目的の抗体を得ることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏによる培養では、ミエローマ細胞と同系
の動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチ
ルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、
少なくとも１週間以上経過してから、ハイブリドーマを
腹腔内に接種し、７〜１４日後に貯留している腹水を採
取することにより目的の抗体を得ることができる。

【００２４】次に、本発明のモノクローナル抗体が認識
するＲＢ３５抗原蛋白質を発現する遺伝子について説明
する。

【００２５】本発明のモノクローナル抗体が認識する蛋
白質を発現する遺伝子は、以下の手順により得ることが
できる。すなわち、λｇｔ１１ベクターを用いてラット
脳から調製したｃＤＮＡライブラリを、適切な宿主細胞
に形質転換して発現させ、この宿主細胞から産生された
蛋白質を、上述の抗体を用いてスクリーニングすること
により目的の遺伝子断片が挿入されたベクターを選択
し、このベクターを増幅させることによりＲＢ３５抗原
の遺伝子を得ることができる。

【００２６】より詳細には、本発明のモノクローナル抗
体が認識する蛋白質を発現する遺伝子は、下記の手順に
より調製することができる。 ｈ）スクリーニング 本発明のモノクローナル抗体が認識する蛋白質を発現す
る遺伝子をスクリーニングする。

【００２７】まず、宿主細胞（大腸菌）を適当な培地で
培養し、クローンテック社製の、λｇｔ１１ベクターに
挿入されているラット脳ｃＤＮＡライブラリを宿主細胞
に導入する。例えば、大腸菌をＬＢＭ培地（Ｌｅｎｏｘ
−ｂｒｏｔｈ、０．２％マルトース、５０mg／mlアンピ
シリン含有）などの適当な培地で培養し、この培養液１
μｌあたり５×１０⁴ ｐｆｕの上記ｃＤＮＡが組み込ま
れたファージ液を混合した後、寒天培地に広げて更に培
養し、プラークを形成させる。ついで、形成されたプラ
ーク上にニトロセルロース膜を重ね、更にインキュベー
トしてベクターに組み込んだｃＤＮＡを発現させる。こ
れにより、ベクターに組み込まれたｃＤＮＡによって宿
主細胞が産生した蛋白質がニトロセルロース膜に写しと
られる。

【００２８】次に、このニトロセルロース膜に上述のＲ
Ｂ３５抗体、ついでこの抗体と特異的に結合し、かつ標
識された抗体を反応させる。反応後、抗体の標識を検出
するのに必要な処理を施して標識が存在するスポットを
検出し、そのスポットに対応するプラークを検索するこ
とにより、目的とするＲＢ３５抗原の遺伝子断片を有す
るベクターを得ることができる。 ｉ）ＲＢ３５抗原遺伝子を有するベクターの増幅 上記ｈ）の方法によりスクリーニングしたＲＢ３５抗原
遺伝子を増幅させる。

【００２９】ＲＢ３５抗原遺伝子断片を有することが確
認されたベクターは、プレートライセート法、液体培養
法などの方法で宿主細胞を培養することにより増幅させ
ることができる。 ｊ）ＲＢ３５抗原遺伝子の調製 増幅させたベクターから目的の遺伝子を調製する。

【００３０】宿主細胞からＲＢ３５抗原遺伝子断片を有
するファージのみを取り出して集める。回収したファー
ジをＳＤＳなどを用いて破壊し、フェノールなどで処理
して除蛋白を行う。除蛋白処理の後、エタノール沈殿を
行うことにより、ＲＢ３５抗原遺伝子断片を含有するＤ
ＮＡを得ることができる。

【００３１】ここで得られた遺伝子断片は、ミエリン塩
基性蛋白質のｍＲＮＡの特定の部位に対して相補的に結
合し得るものである。より詳細には、このＲＢ３５抗原
遺伝子断片は、ミエリン塩基性蛋白質のｍＲＮＡの下記
塩基配列の３１４〜１４５１番に相補的に結合する。

【００３２】 301" ACACCTCGTACACCCCCTCCATCCCAAGGAAAGGGGAGAGGCCTGTCCCTCAGCAGATTT 361" AGCTGGGGAGGAAGAGACAGCCGCTCTGGATCTCCCATAGCAAGACGCTGAGAGCCTCCC 421" TGCTCAGCCTTCCCGAATCCTGCCCTCGGCTTCTTAATATAACTGCCTTAAACGTTTAAT 481" TCTACTTGCACCAAATAGCTAGTTAGAGCAGACCCTCTCTTAATCCCGTGGGGCTGTGAA 541" CGCGGC-GGGCCA-GCCCACGGCACCCTGACTGGCTAAAACTGTTTGTCCCTTTTTATTT 599" GAAGATTGAGTTTCCTCGGGGTCTTCTCTGCCCCGACTTGCTCCCCGTGTACCTTGGTCG 659" ACTCCGGAGGTTCAGGTGCACGGACACCCTTTCAAGTTCACCCCTACTCCATCCTCAGAC 719" TTTCTTTTCACGGCGAGGCGCACCCCTCCAGCTTCCGTGGGCACTGCGGATAGACAGGCA 779" CACCGCCAAGGAGCCAGAGAGCATGGCGCAGGGGACTATGTGGTCCAGGCTTCCTTTGTT 839" TTCTTTCCCCTAAAGAGCTTTGTTTTTCCTGACAGGATCAGACAGTCTTGGAGTGGCTTA 899" CACAACGGGGGCTTGTGGTATGTGAGCACAGGTCGGGCAGCTGTGAGAGTCCAGAGTGGG 959" GTGGCCCTGGGGACGCTTCCAGGCCAGCGGTTCCCTGCACCCCACCAGCTGATTTCGAGC 1019" GTGGCAGAGGGAAGGAAAGGGGCGAGCGGGCTGGGCAATGGACCCGACAGGAAACGGGGA 1079" CTTAGGGGAACACGCTGGAGATGCCATGTGTGGCTGCCGAAGGTCACCATCTCTCCTCAG 1139" T-GCTCCCCAGAGCAGGTGCTTTTAAGAACCCTGTTTCCTCTCAGAGCCTAGGGAGAGTC 1198" CAAGGACATGGCGCATCAGGAAGTGGGACTGCAGGAGTTCTCTGGTGGCCTCGTGCTGTC 1258" CCTCTGGCCACTTCTCACTTTAGGGTGGTCA-CGGCAGCTCGCCATGGCAGTG-CCATTG 1316" GTGCACACTAACCTCA-TGGAAAAGTAACCATTCCCTGCCTCTTAGAAAGAACTCATTCT 1375" TAGTTTTAGGAGGGTTCCTGTCGCTGAATCAAGTCGCTGCCCT-GATGCAGGGCTGGCCT 1434" TGGCGACCCTCCAGGGATGAGGAGCTCAGAA （ここで、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
およびＴはチミンをあらわし、−は塩基が脱落している
部分を示す。）

【００３３】

【作用】本発明のモノクローナル抗体によれば、酵素あ
るいは蛍光色素などでラベルした抗マウスＩｇＧ抗体な
どと組み合わせることによってなされる、間接酵素抗体
法、間接蛍光抗体法などによって、ニトロセルロースな
どの膜に写し取った蛋白質群や、ＥＬＩＳＡプレートに
吸着した蛋白質群、切片をはじめとする組織標本におい
て、ＲＢ３５抗原のみを容易に検出することができる。
また、ＲＢ３５抗原は、脳以外の臓器からは検出されて
いない。従って、臨床的には、脳内の特定の病変部位に
薬物を選択的に運搬する担体として使用し得ることが期
待される。

【００３４】一方、ＲＢ３５抗原遺伝子断片は、ミエリ
ン塩基性蛋白質に対するプローブとして用いることがで
きる。また、臨床的には、このＲＢ３５抗原遺伝子断片
を何等かの方法で脳に注入することによって、ミエリン
塩基性蛋白質の発現を抑制することができ、従って脱髄
を軽減するために使用し得ることが期待される。

【００３５】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。 ＜実施例１＞ ラット脳の蛋白質に対するモノクローナル抗体の作成 （１）免疫原の調製 以下の調製操作は特に断わらない限り０〜４℃で行い、
水と溶液には必要に応じて０．５ｍＭの蛋白質分解酵素
阻害剤ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド）を加えた。

【００３６】まず、ラット脳に３倍量の緩衝液Ａ（０．
３２ｍＭシュークロース、２０ｍＭトリス−クエン酸緩
衝液）を加え、ホモジェナイズした。このホモジェネー
トをナイロンメッシュ（メッシュサイズ１３３μｍ、７
７μｍ）に通したのち、等量の緩衝液Ａに重層して５，
０００rpm で１０分間遠心して上清を採取した。この上
清を１５，０００rpm で３０分間遠心して得られた上清
をさらに、４０，０００rpm で１５０分間遠心し、得ら
れた沈殿を採取した。この沈殿として得られた抽出物を
免疫原として用いた。

【００３７】なお、前記ホモジェネートをそのまま免疫
原として用いても同様の結果が得られる。 （２）動物の免疫 （１）で調製した免疫原とフロイントのコンプリートア
ジュバンドを等量それぞれ１mlのシリンジにとり、ジョ
イントでつないで乳化するまでよく撹拌した。これをマ
ウスの腹腔内に注射して免疫を行った。基本的には、１
回目の免疫の２週間後に２回目の免疫を行い、その更に
２週間後にブーストとして免疫し、ブースト３日後に細
胞融合操作を行うというスケジュールで実験を行った。
日数を調整する必要があるときには、ブーストを適宜遅
らせた。また抗体価は、免疫後２〜７日後にマウスの尾
静脈から採血し、その血清を用いて後述のイムノブロッ
ト法を行うことにより検定した。 （３）細胞融合 （２）の操作により免疫したマウスの頸椎を脱臼して脾
臓を取り出し、予めＲＰＭＩを５ml入れた６cmディッシ
ュに移した。この脾臓から余分な脂肪などを除き、さら
に新たに２枚の５mlＲＰＭＩ入りの６cmディッシュを用
いて洗った。洗浄した脾臓を、２つに折った５cm角のス
テンレス製金網の間にピンセットで擦り付け、細胞をバ
ラバラにした。このバラバラにした細胞を、ピペットで
遠心管に移し、遠心操作により１０mlのＲＰＭＩで２回
洗浄した。沈殿した細胞に０．１７ＭのＮＨ₄ Ｃｌを加
え、氷中に５分間つけて溶血させた。この溶血操作の
後、５mlのＲＰＭＩを加えて１，６００rpm で５分間遠
心して洗浄し、更に２０mlにメスアップして脾臓細胞懸
濁液とした。

【００３８】一方、対数増殖期にあるミエローマ２〜４
ｄｉｓｈ分を、１２００rpm 、５分間の遠心で集め、血
清を含まないＲＰＭＩで２回洗い、最後に１０mlのＲＰ
ＭＩに懸濁してミエローマ懸濁液とした。脾臓細胞懸濁
液とミエローマ懸濁液の細胞数をカウントし、ミエロー
マが脾臓細胞の１／５〜１／２０になるように脾臓細胞
懸濁液にミエローマ懸濁液を加えた。このミエローマ懸
濁液を５分間遠心して上清を除き、得られた沈殿に０．
３mlの５０％ポリエチレングリコール１５００（ｉｎ
７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）を一気に加え、直ちによく撹拌
した。撹拌を続けながら、４０ｍｌのＲＰＭＩを加え
た。この懸濁液を１，０００rpm で５分間遠心し、得ら
れた沈殿にＨＡＴ培地（最終濃度で、１×１０^-7Ｍのヒ
ポキサンチン、４×１０^-4Ｍのアミノプテリン、１６×
１０^-4Ｍのチミジンを含むＲＰＭＩ−ＦＣＳ）を５０ml
加えて、５００μｌ／ｗｅｌｌずつ２４ウェルプレート
２枚及び、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレー
ト約３枚にまいた。４〜５日後、２４ウェルプレートに
は約１ml／ｗｅｌｌ、９６ウェルプレートには約１００
μｌ／ｗｅｌｌのＨＡＴ培地を加えた。その結果、約１
週間でほとんどのウェルにハイブリドーマが増殖した。
ハイブリドーマは、更に培養して培養上清をイムノブロ
ット法によるスクリーニングに用いた。 （４）ハイブリドーマの選定とクローニング （１）で調製した免疫原を総蛋白量が数１０mg／mlとな
るように希釈して抗原溶液とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
った後、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６ ４３５０ １９７９）の方
法により電気泳動的にニトロセルロース膜に蛋白質を写
し取った。このニトロセルロース膜をブロックエースな
どの適当なブロック剤により、室温で１時間から一晩ブ
ロックした。ブロック剤で処理したニトロセルロース膜
の３０ｋＤａのバンドを切りだし、これを、一次抗体で
あるスクリーニングしようとする培養上清と共にインキ
ュベートした。インキュベート後、培養上清を除去し、
ＴＢＳで１５分間、３回洗った。その後、二次抗体とし
て西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でラベルした
ヤギ抗マウス抗体とインキュベートし、反応後、二次抗
体を除去し、ＴＢＳで１５分、３回洗った。これを、１
００μｇ／mlジアミノベンジジン４塩酸塩ｉｎ ５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．５）に、１／１００量
の１％ＣｏＣｌ₂ ６Ｈ₂ Ｏ、１％（ＮＨ₄ ）₂ Ｎｉ（Ｓ
Ｏ₄ ）₂ ６Ｈ₂ Ｏ、及び１／５００量の過酸化水素水を
加えた発色液で十分に発色させた後、蒸留水で洗い、乾
燥させた。検索の結果、強い活性が認められた培養上清
を採取することができたウェルを選別し、これらウェル
のハイブリドーマを、フィーダー細胞としてマウスの胸
腺細胞を用いて、限界希釈法によりクローニングした。
これにより１個のハイブリドーマのクローンを得、これ
を培養することによりモノクローナル抗体を得た。得ら
れたモノクローナル抗体をＲＢ３５と命名した。

【００３９】アマシャム社製のＳｕｂ Ｉｓｏｔｙｐｉ
ｎｇ Ｋｉｔを用いた検討の結果、得られたＲＢ３５抗
体のサブクラスは、ＩｇＧ₁ であることが判明した。 ＜実施例２＞ ＲＢ３５の反応特異性の検討 ＲＢ３５の反応特異性を、実施例１と同様のイムノブロ
ット法によって検討した。

【００４０】これらの結果を図１に示す。図１は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによるラット脳ホモジェネートの展開パタ
ーンおよびイムノブロット法によるＲＢ３５の結合位置
を示す写真である。

【００４１】図１において、１は分子量マーカーのＣＢ
Ｂ（クマシー・ブリリアント・ブルー）による染色のパ
ターン、２はラット脳ホモジェネートのＣＢＢによる染
色のパターン、３はラット脳ホモジェネートに対する、
ＲＢ３５を用いたイムノブロット法の結果をそれぞれ示
す。図１より明らかなように、ＲＢ３５は、分子量約３
０ｋＤの単一の蛋白質のバンドに反応する。 ＜実施例３＞ ＲＢ３５抗原遺伝子の調製 （１）モノクローナル抗体ＲＢ３５によるプラークのス
クリーニング 大腸菌（Ｙ１０９０（△ｌａｃＵ１６９ｐｒｏＡ＋△ｌ
ｏｎ ａｒａＤ１３９ｓｔｒＡｓｕｐＦ〔ｔｒｐＣ２
２：：Ｔｎ１０〕（ｐＭＣ９＊），ｍｃｒＡ−，ｍｃｒ
Ｂ＋））をＬＢＭ培地（０．２％マルトース、５０mg／
mlアンピシリンを含有）で一晩培養した。一方、λｇｔ
ｌｌベクターを用いてラット脳から調製されたクローン
テック社製のｃＤＮＡライブラリを４×１０⁵ ｐｆｕ程
度に希釈した。この希釈液と上記培養によって得られた
培養液０．６mlを混合し、室温で２０分間インキュベー
トした。一方、トップアガロース（ＬＢＭアガロースな
ど）をオートクレーブ処理して溶融状態のまま５５℃で
インキュベートし、上記の混合液に加えてすばやく撹拌
した。これを、予めプレート上に広げたボトムアガー
（ＬＢＭアガーなど）の上に広げた。トップアガロース
が固まった後、これを４２℃で３．５時間インキュベー
トし、プラークを形成させた。形成されたプラーク上
に、予め１０ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラク
トピラノシド）に浸し、乾燥させたニトロセルロース膜
を重ね、３７℃で３．５時間インキュベートして大腸菌
に導入されたｃＤＮＡを発現させた。その後、このニト
ロセルロース膜をＴＢＳで洗浄し、以後の抗原抗体反応
に用いた。

【００４２】ＲＢ３５を用いたスクリーニングは、以下
の通りに行った。まず、ニトロセルロース膜を３％ゼラ
チンを含むＴＢＳにより、室温で１時間から一晩ブロッ
クした。ブロッキングが終了したニトロセルロース膜
を、一次抗体としてスクリニーングに用いるモノクロー
ナル抗体、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）でラベルしたヤギ抗マウス抗体を用いて処理
し、各抗体で処理した後、それぞれＴＢＳで１５分、３
回洗浄した。処理したニトロセルロース膜を、１００μ
ｇ／mlジアミノベンジジン４塩酸塩 ｉｎ ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に、１／１００量の１
％ＣｏＣｌ₂ ６Ｈ₂ Ｏ、１％（ＮＨ₄ ）２Ｎｉ（Ｓ
Ｏ₄ ）₂ ６Ｈ₂ Ｏ、及び１／５００量の過酸化水素水を
加えた発色液で十分に発色させ、染色されたスポットを
検索した。染色されたスポットに対応するプラークを探
すことで、目的とする遺伝子断片をもつファージを得
た。 （２）ＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖を有するフ
ァージの増殖 （１）で得られたＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖
を有するファージを、プレートライセート法を用いて以
下の手順で増殖させた。まず、大腸菌（Ｙ１０８８（△
ｌａｃＵ１６９ ｓｕｐＥｓｕｐＦｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ
＋ｍｅｔＢｔｒｐＲｔｏｎＡ２１〔ｐｒｏｃ：：Ｔｎ
５〕（ｐＭＣ９），ｍｃｒａ−ｍｃｒＢ＋））をＬＢＭ
培地（０．２％マルトース、５０mg／mlアンピリシンを
含有）で一晩培養し、その培養液に、１０⁵ 〜１０⁶ ｐ
ｆｕのファージを含むＳＭ緩衝液０．１mlを加え、この
混合液を、３７℃、１０分間室温でインキュベートし
た。一方、トップアガロース（ＬＢＭアガロースなど）
をオートクレーブ処理し、溶融状態のまま５５℃でイン
キュベートした。これを、上記の混合液に加え、すばや
く撹拌して、予めプレート上に用意してあったボトムア
ガー（ＬＢＭアガーなど）上に広げた。トップアガロー
スが固まった後、プレートをビニール袋にいれ、３７℃
で６〜７時間培養した。大腸菌が溶菌した後、５mlのＳ
Ｍ緩衝液および数滴のクロロホルムを添加し、ＳＭ緩衝
液が表面を完全に覆うように水平に保ちながら、４℃で
１晩インキュベートした。これによりＲＢ３５抗原遺伝
子およびその相補鎖を有するファージがＳＭ緩衝液中に
分散されたファージ懸濁液が得られた。 （３）ＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖の調製 （２）で得られたＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖
を有するファージ液に、ＲＮａｓｅＡ、ＤＮａｓｅＩを
それぞれ５μｇ／mlになるように加え、３７℃で３０分
間インキュベートした。次に等量のポリエチレングリコ
ールＰＥＧ６０００−２Ｍ ＮａＣｌ溶液を加え、混合
後、０℃で１時間インキュベートした。この混合液を４
℃、３０００rpm で、２０分間遠心した後、上清を完全
に除去し、沈殿をＳＭ緩衝液０．５mlに懸濁して、エッ
ペンドルフチューブに移した。これを８０００rpm で２
分間遠心し、得られた上清を別のエッペンドルフチュー
ブに移し、ＥＤＴＡ、ＳＤＳをそれぞれ１０ｍＭ、０．
１％になるように加えて６５℃で１５分間インキュベー
トした。インキュベート後、これにフェノール（ＴＥ
（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液）で飽和されている）を用い
て１回、フェノール・クロロホルムを用いて２回、クロ
ロホルムを用いて１回抽出処理を施した。これらの抽出
によって得られた水層に３Ｍ酢酸ナトリウムを５０μ
ｌ、エタノールを１ml加えて、−８０℃で１５分間イン
キュベートした後、１５０００rpm で５分間遠心した。
遠心後、上清を捨て、得られた残渣を冷７０％エタノー
ルですすいで乾燥させた。これを５０μｌのＴＥに溶解
して、ＲＢ３５遺伝子およびその相補鎖を有するファー
ジＤＮＡを得た。

【００４３】さらに、以下の手順で、ＫｐｎＩ、Ｓａｃ
Ｉなどで切断したファージＤＮＡから、ＲＢ３５遺伝子
およびその相補鎖を含むＤＮＡ断片のみを得た。まず、
エチジウムブロマイド及びＴＡＥ（ＥＤＴＡ−トリス酢
酸緩衝液）を含む緩衝液系で、ＫｐｎＩ，ＳａｃＩで切
断したファージＤＮＡを、１％低融点アガロースゲルを
用いて電気泳動を行った。電気泳動後、トランスイルミ
ネータでＵＶ照射して、２．４Ｋｂｐの目的のバンドを
切り出し、エッペンドルフチューブに移した。６５℃で
ゲルを溶かし、蒸留水を加えた後ゆっくりと冷やした。
ＴＥで飽和されたフェノールを用いて、フェノール抽出
を２回、フェノール・クロロホルム抽出を１回行った
後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。 （４）ＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖のサブクロ
ーニング 上記（３）で得られたＲＢ３５抗原遺伝子およびその相
補鎖を含むＤＮＡ断片を、予めＫｐｎＩ，ＳａｃＩで切
断し、バクテリアルアルカリフォスファターゼによって
脱リン酸化しておいたベクターｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔ
プラスミド（クローンテック社製）と混合し、Ｔ４リガ
ーゼを用いてライゲーションした。これにより、ＲＢ３
５抗原遺伝子およびその相補鎖を含むＤＮＡ断片が挿入
されたｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔプラスミドを含むライゲ
ーション混合液が得られた。このライゲーション混合液
を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ１，ｌａｃ
^-，ｅｎｄＡ１，ｇｒｙＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１
７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，｛Ｆ′ｐｒｏＡＢ，ｌ
ａｃｌｑ，ｌａｃＺ△Ｍ１５，Ｔｎ１０｝）を形質変換
した。ホワイトコロニー（形質変換体）からプラスミド
を抽出し、ＫｐｎＩ，ＳａｃＩで切断して挿入断片の長
さを確認し、目的とする断片が挿入されたプラスミドを
持つ大腸菌のコロニーを選択した。 （５）ＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖を含む一本
鎖ＤＮＡの調製 目的とする断片が挿入されたプラスミドを持つ大腸菌の
コロニーを、３mlのＳｕｐｅｒ培地（５０mg／mlアンピ
シリン、１２．５mg／mlテトラサイクリンを含有）を用
いて、４時間振盪培養した。その培養液に１×１０⁹ ｐ
ｆｕのヘルパーファージＲ４０６を加え、３７℃で一晩
振盪培養した。さらに、その培養液を６５℃で１５分イ
ンキュベートした後、１５０００rpm で５分遠心し、上
清を１mlずつエッペンドルフチューブに移した。この上
清に２００μｌの２０％ポリエチレングリコール−２．
５Ｍ ＮａＣｌを混合して０℃に３０分間置いた後、１
５０００rpm で５分遠心した。遠心後、上清を捨て、残
渣を１００μｌのＴＥに懸濁した。これをフェノール抽
出処理し、得られた水層に３Ｍ酢酸ナトリウムを１０μ
ｌ、エタノールを３００μｌ加えて−８０℃で１５分間
インキュベートした。これを１５０００rpm で５分間遠
心した後、上清を捨て、得られた残渣を冷７０％エタノ
ールですすいで乾燥させた。これを２０μｌのＴＥに溶
解して、ＲＢ３５抗原遺伝子およびその相補鎖を含む一
本鎖ＤＮＡを得た。

【００４４】このＤＮＡの塩基配列をダイデオキシ法に
よって解析したところ、配列表の配列番号１に示す塩基
配列が含まれていることが見い出された。配列番号１は
本発明で得られたＲＢ３５抗原遺伝子の塩基配列を示し
ており、その配列は、５^- 末端から３^- 末端に向かう方
向に表した。ここで、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニンおよびＴはチミンをあらわす。

【００４５】また、配列表の配列番号２は、すでに知ら
れているミエリン塩基性蛋白質のｍＲＮＡの塩基配列を
示している。この配列表では５´末端から３´に向かう
方向に３０１番から１４６４番までの塩基配列を示して
ある。配列番号１に記載した本発明の塩基配列に相補的
な配列は、この公知のミエリン塩基性蛋白質の塩基番号
３１４から１４５１に対応している。

【００４６】ＲＢ３５抗原遺伝子の相補的な配列とミエ
リン塩基性蛋白質のｍＲＮＡの塩基配列の相同性を図２
〜５に示す。上段に、ＲＢ３５抗原遺伝子の相補的な配
列を、下段にラットミエリン塩基性蛋白質のｍＲＮＡの
塩基配列が示してある。＊は双方の塩基が同一であるこ
とを示している。また、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、
Ｇはグアニン及びＴはチミンを表し、−は塩基が脱落し
ている部分を示す。両者を比較すると、以下の１４の塩
基が異なっているがそれ以外は完全に一致している。

【００４７】 配列番号１に相補的な塩基（番号） 配列番号２の対応する塩基（番号） Ｇ（８８） Ａ（３９９） Ｇ（２３６） −（５４７） Ｇ（２４３） −（５５４） Ｇ（５０７） Ａ（８１６） Ａ（５６０） Ｇ（８６９） Ｃ（６２２） Ｔ（９３１） Ｔ（６２３） Ｃ（９３２） Ｇ（８３１） −（１１４０） Ｃ（８７９） Ｔ（１１８７） Ｇ（９８１） −（１２８９） Ｃ（１００３） −（１３０９） Ｇ（１０２６） −（１３３２） Ｇ（１１１３） −（１４１７） Ｇ（１１３０） Ｔ（１４３４） この関係から明らかなように、上記２つ塩基配列は実質
的に一致している。従って、配列番号１の塩基配列は、
ミエリン塩基性蛋白質の特定の部位に対して相補的に結
合するものであり、前記ミエリン塩基性蛋白質に対する
プローブとして用いることができる。

【００４８】

【発明の効果】以上のように、本発明によると、ＲＢ３
５抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供さ
れる。このモノクローナル抗体を用いることにより、間
接酵素抗体法、間接蛍光抗体法等によって、ニトロセル
ロース膜に写しとった蛋白質群などからＲＢ３５抗原の
みを容易に検出することが可能になる。

【００４９】また、ＲＢ３５抗原は脳以外の臓器からは
検出されていない。従って、臨床的には、脳内の特定の
病変部位に薬物を選択的に運搬する担体として使用し得
ることが期待される。

【００５０】一方、ＲＢ３５抗原遺伝子断片は、ミエリ
ン塩基性蛋白質に対するプローブとして用いることがで
きる。また、臨床的には、このＲＢ３５抗原遺伝子断片
を何等かの方法で脳に注入することによって、ミエリン
塩基性蛋白質の発現を抑えることができ、従って脱髄を
軽減するために使用し得ることが期待される。

【００５１】［配列表］ 配列番号：１ 配列の長さ：１１４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源：生物名 Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ 起源 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ） 直接の起源：ライブラリー名 Ｒａｔ ｌｉｂｒａｒｉ
ｅｓ−Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡ（Ｅｎｔｉｒｅ ａｄｕｌ
ｔ ｆｅｍａｌｅ，Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙ ｂ
ｒａｉｎ） 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 10 20 30 40 50 60 ATCCCTGGAG GGTCGCCCAG GCCAGCCCTG CATCCAGGGC AGCGACTTGA TTCAGCGACA 70 80 90 100 110 120 GGAACCCTCC TAAAACTAAG AATGAGTTCT TTCTAAGAGG CAGGGAATGG TTACTTTTCC 130 140 150 160 170 180 ACTGAGGTTA GTGTGCACCA ATGGGCACTG CCATGGCGAG CTGCCGCTGA CCACCCTAAA 190 200 210 220 230 240 GTGAGAAGTG GCCAGAGGGA CAGCACGAGG CCACCAGAGA ACTCCTGCAG TCCCACTTCC 250 260 270 280 290 300 TGATGCGCCA TGTCCTTGGA CTCTCCCTGG GCTCTGAGAG GAAACAGGGT TCTTAAAAGC 310 320 330 340 350 360 ACCTGCTCTG GGGAGCCACT GAGGAGAGAT GGTGACCTTC GGCAGCCACA CATGGCATCT 370 380 390 400 410 420 CCAGCGTGTT CCCCTAAGTC CCCGTTTCCT GTCGGGTCCA TTGCCCAGCC CGCTCGCCCC 430 440 450 460 470 480 TTTCCTTCCC TCTGCCACGC TCGAAATCAG CTGGTGGGGT GCAGGGAACC GCTGGCCTGG 490 500 510 520 530 540 AAGCGTCCCC AGGGCCACCC CACTCTGGAC TCTCACAGCT GCCCAGCCTG TGCTCACATA 550 560 570 580 590 600 CCACAAGCCC CCGTTGTGTA AGCCACTCCA AGACTGTCTG ATCCTGTTAG GAAAAACAAA 610 620 630 640 650 660 GCTCTTTAGG GGAAAGAAAA CAAAGGAAGC CTGGACCACA CAGTCCCCTG CGCCATGCTC 670 680 690 700 710 720 TCTGGCTCCT TGGCGGTGTG CCTGTCTATC CGCAGTGCCC ACGGAAGCTG GAGGGGTGCG 730 740 750 760 770 780 CCTCGCCGTG AAAAGAAAGT CTGAGGATGG AGTAGGGGTG AACTTGAAAG GGTGTCCGTG 790 800 810 820 830 840 CACCTGAACC TCCGGAGTCG ACCAAGGTAC ACGGGGAGCA AGTCGGGGCA GAGAAGACCC 850 860 870 880 890 900 CGAGGAAACT CAATCTTCAA ATAAAAAGGG ACAAACAGTT TTAGCCAGTC AGGGTGCCGT 910 920 930 940 950 960 GGGCCTGGCC CCGCCGCGTT CACAGCCCCA CGGGATTAAG AGAGGGTCTG CTCTAACTAG 970 980 990 1000 1010 1020 CTATTTGGTG CAAGTAGAAT TAAACGTTTA AGGCAGTTAT ATTAAGAAGC CGAGGGCAGG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ATTCGGGAAG GCTGAGCAGG GAGGCTCTCA GCGTCTTGCC ATGGGAGATC CAGAGCGGCT 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTCTCTTCCT CCCCAGCTAA ATCTGCTGAG GGACAGGCCT CTCCCCTTTC CTTGGGATGG 1150 AGGGGCC 配列番号：２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源：生物名 Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 301" ACACCTCGTACACCCCCTCCATCCCAAGGAAAGGGGAGAGGCCTGTCCCTCAGCAGATTT 361" AGCTGGGGAGGAAGAGACAGCCGCTCTGGATCTCCCATAGCAAGACGCTGAGAGCCTCCC 421" TGCTCAGCCTTCCCGAATCCTGCCCTCGGCTTCTTAATATAACTGCCTTAAACGTTTAAT 481" TCTACTTGCACCAAATAGCTAGTTAGAGCAGACCCTCTCTTAATCCCGTGGGGCTGTGAA 541" CGCGGC-GGGCCA-GCCCACGGCACCCTGACTGGCTAAAACTGTTTGTCCCTTTTTATTT 599" GAAGATTGAGTTTCCTCGGGGTCTTCTCTGCCCCGACTTGCTCCCCGTGTACCTTGGTCG 659" ACTCCGGAGGTTCAGGTGCACGGACACCCTTTCAAGTTCACCCCTACTCCATCCTCAGAC 719" TTTCTTTTCACGGCGAGGCGCACCCCTCCAGCTTCCGTGGGCACTGCGGATAGACAGGCA 779" CACCGCCAAGGAGCCAGAGAGCATGGCGCAGGGGACTATGTGGTCCAGGCTTCCTTTGTT 839" TTCTTTCCCCTAAAGAGCTTTGTTTTTCCTGACAGGATCAGACAGTCTTGGAGTGGCTTA 899" CACAACGGGGGCTTGTGGTATGTGAGCACAGGTCGGGCAGCTGTGAGAGTCCAGAGTGGG 959" GTGGCCCTGGGGACGCTTCCAGGCCAGCGGTTCCCTGCACCCCACCAGCTGATTTCGAGC 1019" GTGGCAGAGGGAAGGAAAGGGGCGAGCGGGCTGGGCAATGGACCCGACAGGAAACGGGGA 1079" CTTAGGGGAACACGCTGGAGATGCCATGTGTGGCTGCCGAAGGTCACCATCTCTCCTCAG 1139" T-GCTCCCCAGAGCAGGTGCTTTTAAGAACCCTGTTTCCTCTCAGAGCCTAGGGAGAGTC 1198" CAAGGACATGGCGCATCAGGAAGTGGGACTGCAGGAGTTCTCTGGTGGCCTCGTGCTGTC 1258" CCTCTGGCCACTTCTCACTTTAGGGTGGTCA-CGGCAGCTCGCCATGGCAGTG-CCATTG 1316" GTGCACACTAACCTCA-TGGAAAAGTAACCATTCCCTGCCTCTTAGAAAGAACTCATTCT 1375" TAGTTTTAGGAGGGTTCCTGTCGCTGAATCAAGTCGCTGCCCT-GATGCAGGGCTGGCCT 1434" TGGCGACCCTCCAGGGATGAGGAGCTCAGAA

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるラット脳ホモジェネー
トの展開パターンおよびイムノブロット法によるモノク
ローナル抗体ＲＢ３５の結合位置を示す写真。

【図２】ＲＢ３５抗原遺伝子の相補的な配列とミエリン
塩基性蛋白質のｍＲＮＡの塩基配列の相同性を示す図。

【図３】ＲＢ３５抗原遺伝子の相補的な配列とミエリン
塩基性蛋白質のｍＲＮＡの塩基配列の相同性を示す図。

【図４】ＲＢ３５抗原遺伝子の相補的な配列とミエリン
塩基性蛋白質のｍＲＮＡの塩基配列の相同性を示す図。

【図５】ＲＢ３５抗原遺伝子の相補的な配列とミエリン
塩基性蛋白質のｍＲＮＡの塩基配列の相同性を示す図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラット脳の抽出物を免疫原として作製さ
   れたモノクローナル抗体であって、免疫グロブリンクラ
   スがＩｇＧ₁ に属し、ラット脳抽出物を抗原とするウェ
   スタンブロッティング法による検出において、分子量が
   約３０ｋＤａのバンドに結合することを特徴とするモノ
   クローナル抗体。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列を
   有する遺伝子が発現する蛋白質に対して反応性を有する
   請求項１記載のモノクローナル抗体。