JP3256227B2 - Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 - Google Patents

Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬

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Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1990年10月25日出願の米国出願SN.603,8
04の一部継続出願であり、前記出願の内容は参照するこ
とによりこの開示に組み込まれる。
発明の背景 この出願を通して、種々の刊行物が括弧付きのアラビ
ア数字で参照される。これらの刊行物の完全な引用は明
細書の最後、請求の範囲の直前に見出されるであろう。
これらの刊行物の開示は、ここに記述され、かつ請求さ
れる発明のなされた時点で当業者に知られていた当分野
の状態をより完全に記述するために、参照することによ
りそのままこの出願に組み込まれる。
過去数年間にわたる研究は幾つかの仮説に基づいてい
る。（１）ヒト癌は、細胞遺伝形質の遺伝的変化の結果
として現われる。これらの遺伝的変化は、形質転換状態
の発現を調節する特定遺伝子の構造および／または発現
の直接変化を含み得る。腫瘍細胞表現型の遺伝形質マー
カーおよび潜在的な誘発因子には、特定の癌遺伝子要素
の活性化および／または腫瘍抑制因子要素の欠損または
不活性化が含まれる（1,2）。（２）腫瘍の表現型は、
しばしば、異なる組織学的な型の腫瘍に特異的であり、
かつ同じ腫瘍組織型の患者において異なった発現をし得
る新規腫瘍関連抗原（TAA）サブセットの表面発現によ
って特徴付けられる。特定のサイトカイン類を用いるこ
とにより特定のTAAの発現のレベルを増加させ、結果と
して、癌の治療に基づく診断の改善、映像化および最終
的に強化されたモノクローナル抗体（MoAb）を得ること
ができる（３−５）。（３）特定の腫瘍に発現する特定
のTAAサブセットは患者自身の免疫系では認識されない
ことがあり、そのため、患者が有効な免疫応答の増加お
よび腫瘍病変の破壊に対して無能力になる結果となる。
この問題は、MoAb（特にヒトMoAb;霊長類MoAbまたはキ
メラネズミMoAb）の外部からの適用、サイトカイン類お
よび発現ベクター系免疫賦活剤を用いた患者の免疫潜在
力の増加および／または患者自身の腫瘍細胞を変性させ
てワクチンとして作用させることにより解決することが
できる。（４）多くの場合、腫瘍遺伝子表現型を含む遺
伝要素は特定の細胞表面TAAをコードし得る。したがっ
て、腫瘍遺伝子表現型およびその対応TAAサブセットの
両者を、DNA移送技術により適当なレシピエントに共に
移送することが可能である。
上記仮説の多くを直接試験する研究が過去数年間行な
われ、いまや多くの仮定が正当であると認められてい
る。初期の試験例の１つには、ヒト前立腺癌分化の遺伝
的および免疫学的基礎の研究が含まれている。
前立腺癌は、現在成人男性における最も普通の癌であ
り、かつ55才をこえる男性の癌死の主な原因である
（６）。ヒトの寿命が延びるに伴い、前立腺癌分化の発
生および前立腺癌細胞による（特に骨への）転移能力の
獲得が解決されずにいる（７）。前立腺癌の公知の癌遺
伝子の発現における一定の変化を示そうとする試み（８
−10）は不成功に終わっている。同様に、カルシウム介
在DA形質導入により、前立腺癌または前立腺癌細胞系の
いずれかにおける優性フォーカス形成もしくは腫瘍誘発
遺伝子を示そうとする従来の試みは、限られた成功のみ
を示す結果に終わった（９）。前立腺癌から単離された
DNAの形質導入の後NIH−3T3細胞に出現した形質転換フ
ォーカスの分析は、活性化されたKi−ras癌遺伝子の存
在を示した（９）。
これらの結果は、ヒト前立腺癌における癌遺伝子の活
性化、少なくともNIH−3T3におけるDNA形質導入アッセ
イによって検出された活性化は、前立腺癌においては頻
発する出来事ではないことを示唆している。しかしなが
ら、高分子量ヒト前立腺癌DNA（LNCaP細胞系由来）およ
び優性バクテリア抗生物質耐性遺伝子（dominant actin
g bacterial antibiotic resistance gene）を用いるヌ
ードマウスへのDNA共形質導入（cotransfection）手
順、それに続く腫瘍誘発を利用することにより、腫瘍遺
伝子表現型が確立ラット胚線維芽細胞系、CREFに成功裡
に移植された（14）。これら推定の上での前立腺癌形質
転換遺伝子は、イン・ビトロにおけるCREF細胞中でフォ
ーカスを形成しないだけではなく、NIH−3T3細胞におい
て試みられた同様の形質導入／腫瘍形成によっても検出
することができない。ヒト反復（Alu）配列および共通
分子量のAlu断片を含有する腫瘍由来CREF形質導入体（t
ransfectant）が、一次および独立した二次腫瘍由来CRE
F形質導入体の両者で同定された。
加えて、ヌードマウス腫瘍由来LNCaP DNA形質導入CR
EF細胞もまた、LNCaP細胞の表面と反応するポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体の両者の生成に用いられ
るヒト腫瘍関連抗原（TAA）を発現することが見出され
た。これらの観察は、以下の仮説を支持する：（Ａ）LN
CaP細胞は、CREFには移入して発現させることができる
がNIH−3T3細胞にはそれができない優性腫瘍誘発遺伝子
を含む；（Ｂ）一次および二次形質導入体における共通
のAlu断片の存在は、LNCaP細胞からCREF細胞に移入され
た遺伝子がこの配列に物理的に結合し、その存在をこの
腫瘍誘発遺伝的要素の単離およびクローニングの手段と
して用いることができる；および（Ｃ）LNCaP細胞と特
異的に相互作用する（かつメラノーマ、肺癌、正常ヒト
皮膚線維芽細胞およびCREF細胞を含む他のヒト腫瘍とは
相互作用しない）モノクローナル抗体の生成に用いるこ
とができる、一次および二次腫瘍由来CREF形質導入体の
表面のTAAの存在は、この推定の上での腫瘍誘発前立腺
癌遺伝子とLNCaP細胞の形質転換表現型の発現との間の
潜在的な関係をさらに示唆している。
要約すると、遺伝子を同定し、ヒト起源のTAAをコー
ドする免疫学的試薬を製造する一般的な方法が開発され
た。CREF/形質導入／モノクローナル抗体技術を用いる
ことにより、本発明者は、ヒト肺癌およびグリア芽細胞
腫多形を介在もしくはこれに関連する遺伝子の移入、お
よびヒト肺癌および他の癌で発現する抗原を認識するポ
リクローナルおよびMoAbの両者の開発を成し遂げた。CR
EF/形質導入／モノクローナル抗体技術は、分子量170,0
00のクローン化ヒト（Ｐ−糖蛋白質）複合薬剤耐性遺伝
子を含む、定義され、形質導入され、かつ発現した表面
分子の同定にも用いられる。CREFおよびヒト腫瘍（肺癌
およびグリア芽細胞腫）細胞にクローン化mdr−１を形
質導入し、コルヒチン耐性で選択して、mdr−１遺伝子
の存在および発現をそれぞれサザーンおよびノーザン分
析により示した。次いで、これらの形質導入CREF細胞
を、MDR表現型を発現する形質導入ヒト肺およびグリア
芽細胞腫細胞に発現するＰ−糖蛋白質と反応するMoAbの
生成に用いた。
発明の要約 この発明は、遺伝子を同定し、かつヒト起源の細胞表
面抗原をコードする免疫学的試薬を製造するための一般
的な方法を提供する。
具体的には、この発明は、ヒト腫瘍細胞に関連する細
胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合する抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系を調製する方法を提供する。
この方法は、（ａ）確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系
に、ヒト腫瘍細胞から単離されたDNAおよび選択可能な
もしくは同定可能な形質をコードするDNAを共形質導入
し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な形質を発現する
形質導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選択した
形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして回収した
形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注入し、
（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形質導入
細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成する
よに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１のネ
ズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして単離した腫
瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして得られた腫
瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に対
して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血清固相化細
胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得られた第２の
宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と反応する血
清を生成する宿主を同定し、（ｋ）そのようにして同定
された第２の宿主から脾臓を摘出し、（ｌ）そのように
して摘出した脾臓からハイブリドーマを調製し、および
（ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ
結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を回収す
る、ことを包含する。
この発明はまた、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面抗
原を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体
の製造方法をも提供する。この方法は、上記方法に従っ
てハイブリドーマを製造し、そのように製造されたハイ
ブリドーマからモノクローナル抗体を回収することを包
含する。
この発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表
面抗原を特異的に認識し、かつ結合するポリクローナル
抗体の調製方法を提供する。（ａ）確立された非ヒト非
腫瘍形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞から単離されたDNAお
よび選択可能なもしくは同定可能な形質をコードするDN
Aを共形質導入し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な
形質を発現する形質導入細胞を選択し、（ｃ）そのよう
にして選択した形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのよう
にして回収した形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿主
に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入し
た形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍
を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を
第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして単
離した腫瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして得
られた腫瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成細
胞系に対して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血清
固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得られ
た第２の宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と反
応する血清を生成する宿主を同定し、および（ｋ）その
ようにして同定した第２の宿主からポリクローナル抗体
を回収する、ことを包含する。
加えて、この発明は、被検体における腫瘍の状態を診
断する方法であって、被検体からの試料を、抗体が腫瘍
の状態に関連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ
結合することが可能な条件下で、検出可能なマーカーで
標識した上記いずれかの抗体と接触させ、抗原に結合し
た抗体の存在を検出し、およびそれにより腫瘍の状態を
診断することを包含する方法を提供する。
この方法はまた、腫瘍状態を治療する方法であって、
腫瘍状態に関連するヒト腫瘍細胞を、治療剤が選択的に
ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するような条件下で、治療剤
で標識した上記いずれかの抗体と接触させることを包含
する方法を提供する。
この発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞の像を形成する方
法であって、像を形成させようとするヒト腫瘍細胞を、
抗体が腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原を特異的に認識
し、かつ結合することが可能な条件下で、像形成剤で標
識した上記いずれかの抗体と接触させ、それらに結合し
た像形成剤を検出して腫瘍細胞の像を形成する方法を提
供する。
この発明はまた、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面抗
原をコードするDNAを調製する方法を提供する。この方
法は、（ａ）CREF−トランス６（CREF−trans 6）細胞
系にヒト腫瘍細胞から単離したDNAおよび選択可能なも
しくは同定可能な形質をコードするDNAを共形質導入
し、（ｂ）選択可能なもしくは同定可能な形質を発現す
る形質導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選択さ
れた形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして回収
された形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注入
し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形質
導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成
するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１の
ネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして単離した
腫瘍から腫瘍細胞を得、および（ｈ）そのようにして得
られた腫瘍細胞から、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面
抗原をコードするDNAを回収する、ことを包含する。
最後に、この発明は、被検体における腫瘍状態の診断
法であって、被検体からの試料を、DNAプローブが腫瘍
状態に関連するDNAとハイブリダイズ可能な条件下で、
検出可能なマーカーで標識したDNAプローブと接触さ
せ、ハイブリダイズしたDNAの存在を検出して腫瘍状態
を診断する方法を提供する。
図面の簡単な説明 図１ サザーン・ブロット分析。CREF−トランス６（図
１においてCREFで表わされる）からの高分子量DNA、pSV
2−ネオおよびLNCap DNA（CREF4 NMT）を形質導入した
CREF−トランス６細胞の注入に続いてヌードマウスから
得た第１の腫瘍およびCREF−トランス６細胞をpSV2−ネ
オおよびCREF 4 NMT DNAと共にヌードマウスに注入し
た後得られた２種の独立した第２の腫瘍。サザーンブロ
ットは、300bpのニックトランスレートした32P標識Alu
プローブで調べた。
図２ LNCaPに対する、CREF 4 NMT−固相化およびCREF
−トランス６（図２においてCREFで表わされる）固相化
抗血清。LNCaP DNA（CREF−４ NMT）が形質導入され
たヌードマウス腫瘍由来CREF−トランス６細胞で免疫さ
れた動物は、元のLNCaP細胞に対する免疫応答を発現す
る。LNCaP細胞からの推定ヒトTAAを欠くCREF−トランス
６細胞は、LNCaP細胞に対する免疫応答を生じない。
図３ CREF−４ NMTポリクローナル抗血清のヒト癌細
胞への結合。LNCaP DNA（CREF−４ NMT）が形質導入
された高力価CREF−トランス６細胞（図３においてCREF
細胞で表わされる）に対して生成したポリクローナル抗
体は、ヒトの前立腺、肺および結腸直腸癌細胞系に結合
する。反対に、CREF−４ NMTと同様に高力価のCREF−
トランス６抗血清が固相化したCREF−トランス６細胞に
対して生成したポリクローナル抗体は、ヒト癌由来細胞
系には結合しない。
図４ ヒト腫瘍細胞系およびCREF−トランス６へのCREF
−４ NMT MoAbの結合。高力価CREF−トランス６抗血
清で免疫した動物から作製したMoAbで処理したCREF−４
NMT細胞は、LNCaPおよび他のヒト癌に対する良好な特
異性を示す。反対に、同じMoAbは、HO−Ｉヒトメラノー
マ、WI−38ヒト皮膚線維芽細胞またはCREF−トランス６
細胞（図４においてCREFで表わされる）には結合しな
い。
図５ ヒト細胞系およびCREF−トランス６細胞へのCREF
−T47D MoAbの結合。ヌードマウス腫瘍由来DNAを形質
導入したCREF−トランス６細胞に対して生成したMoAb
は、ヒト肺癌細胞に対する良好な特異性を表わす。MoAb
5.1.4はまた、ヒト前立腺癌細胞に対する幾らかの結合
を示す。MoAbはHO−Ｉヒトメラノーマ細胞または非形質
導入CREF−トランス６細胞（図５においてCREFで表わさ
れる）には結合しない。
図６ ヒトおよびCREF−トランス６細胞系（図６におい
てCREFで表わされる）へのMoAb 5.1.4（CREF−T47D）腹
水の結合。T47D細胞からのヒト肺癌DNAが形質導入され
たヌードマウス腫瘍由来CREF−トランス６細胞（これ
は、動物に注入される前に高力価CREF−トランス６抗血
清が固相化されている）で免疫された動物に対するMoAb
5.1.4は、サブクローニングおよび腹水形成の後も、ヒ
ト肺癌細胞に対する良好な特異性を示し続ける。
発明の詳細な説明 この発明は、遺伝子を同定し、ヒト起源の細胞表面抗
原をコードする免疫学的試薬を製造する一般法を提供す
る。
とりわけ、この発明は、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞
表面抗原を特異的に認識し、かつ結合する抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞系を調製する方法を提供する。こ
の方法は、（ａ）確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系
に、ヒト腫瘍細胞から単離されたDNAおよび選択可能な
もしくは同定可能な形質をコードするDNAを共形質導入
し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な形質を発現する
形質導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選択した
形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして回収した
形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注入し、
（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形質導入
細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成する
のに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１のネ
ズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして単離した腫
瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして得られた腫
瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に対
して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血清固相化細
胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得られた第２の
宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と反応する血
清を生成する宿主を同定し、（ｋ）そのようにして同定
した第２の宿主から脾臓を摘出し、（ｌ）そのようにし
て摘出した脾臓からハイブリドーマを調製し、および
（ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ
結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を回収す
る、ことを包含する。
ここでは、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系は、非
ヒトのいかなる確立細胞系であってもよく、形質転換お
よび腫瘍形成表現型を示さず、結合および非結合鎖の両
者からなる外来DNAを効率的に取り込み、かつ組み込み
得るものである。この発明の好ましい態様においては、
確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系はCREF−トランス６
細胞系であり、この細胞系は、ATCC受付番号CRL 10584
でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ro
ckville、Maryland、20852、U.S.A.に寄託されている。
これは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブタペスト条約の要求に従い、これを満足して寄託さ
れた。
ヒト腫瘍細胞は、良性もしくは転移性のどのようなヒ
ト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト腫瘍細胞系
またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一次腫瘍であ
っても）由来であってもよい。この発明の一態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系LNCaP由来のヒト前立腺癌
細胞である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍
細胞は細胞系T47D由来のヒト肺癌細胞である。この発明
の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系SW480由
来のヒト結腸直腸癌細胞である。この発明の他の態様に
おいては、ヒト腫瘍細胞は細胞系GBM−18由来のヒトグ
リア芽細胞腫多形（ステージIV星状細胞腫）である。こ
の発明のさらに別の態様においては、ヒト腫瘍細胞は一
次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星状
細胞腫）である。
ここでは、選択可能なもしくは同定可能な形質をコー
ドするDNAは、選択可能なもしくは同定可能な形質をコ
ードするいかなるDNAでもよい。この発明の一態様にお
いては、選択可能なもしくは同定可能な形質をコードす
るDNAは、抗生物質に対する耐性をコードするプラスミ
ドDNAである。この発明の好ましい態様においては、こ
のプラスミドDNAはpSV2−ネオを含み、抗生物質はG418
である。
ここでは、適当な第２の宿主は、ネズミ宿主または非
ヒトの霊長類宿主であり得る。
この発明の目的のためには、ヒト腫瘍細胞に関連する
細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であってもよ
い。以下の例に限定されるものではないが、細胞表面抗
原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイルスがコー
ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によってコードさ
れる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異常な複合
薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表現型を介
在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍形成表現
型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗原、Ｔ細胞
のような特異的免疫学的エフェクター細胞によって認識
される抗原およびマクロファージ細胞もしくはナチュラ
ルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフェクター細
胞によって認識される抗原であり得る。この発明の好ま
しい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関連抗原であ
る。
ハイブリドーマ細胞系は、当業者に公知の方法を用い
て回収することができる。この発明はまた、上述の方法
に従って製造されるハイブリドーマ細胞系を提供する。
工程（ａ）ないし（ｇ）を繰り返してさらなる腫瘍細
胞、すなわち、二次形質導入体、三次形質導入体等を得
ることが可能であることもこの発明の範囲内である。
この発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表
面抗原を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル
抗体の製造方法を提供する。この方法は、上述の方法に
従ってハイブリドーマを製造し、そのようにして製造さ
れたハイブリドーマからモノクローナル抗体を回収する
ことを含む。
この発明の目的のために、当業者に公知の方法によっ
てモノクローナル抗体を回収することができる。
この発明の方法はまた、上述の方法に従って製造され
たモノクローナル抗体を提供する。
この発明はまた、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面抗
原を特異的に認識し、かつ結合するポリクローナル抗体
の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）確立された
非ヒト非腫瘍形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞から単離され
たDNAおよび選択可能なもしくは同定可能な形質をコー
ドするDNAを共形質導入し、（ｂ）選択可能もしくは同
定可能な形質を発現する形質導入細胞を選択し、（ｃ）
そのようにして選択した形質導入細胞を回収し、（ｄ）
そのようにして回収した形質導入細胞を適当な第１のネ
ズミ宿主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主
を、注入した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿
主内に腫瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得ら
れた腫瘍を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのよ
うにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのよ
うにして得られた腫瘍細胞に、前記確立された非ヒト非
腫瘍形成細胞系に対して生成した抗血清を固相化し、
（ｉ）抗血清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、
（ｊ）得られた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト
腫瘍細胞と反応する血清を生成する宿主を同定し、およ
び（ｋ）そのようにして同定した第２の宿主からポリク
ローナル抗体を回収する、ことを包含する。
この発明の目的のために、当業者に公知の方法によっ
てポリクローナル抗体を回収することができる。
ここで、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系は、非ヒ
トのいかなる確立細胞系であってもよく、形質転換およ
び腫瘍形成表現型を示さず、結合および非結合鎖の両者
からなる外来DNAを効率的に取り込み、かつ組み込み得
るものである。この発明の好ましい態様においては、確
立された非ヒト非腫瘍形成細胞系はCREF−トランス６細
胞系（ATCC受付番号CRL 10584）である。
ヒト腫瘍細胞は、良性もしくは転移性のどのようなヒ
ト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト腫瘍細胞系
またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一次腫瘍であ
っても）由来であってもよい。この発明の一態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系LNCaP由来のヒト前立腺癌
細胞である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍
細胞は細胞系T47D由来のヒト肺癌細胞である。この発明
の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系SW480由
来のヒト結腸直腸癌細胞である。この発明の他の態様に
おいては、ヒト腫瘍細胞は細胞系GBM−18由来のヒトグ
リア芽細胞腫多形（ステージIV星状細胞腫）である。こ
の発明のさらに別の態様においては、ヒト腫瘍細胞は一
次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星状
細胞腫）である。
選択可能なもしくは同定可能な形質をコードするDNA
は、選択可能なもしくは同定可能な形質をコードするい
かなるDNAでもよい。この発明の一態様においては、選
択可能なもしくは同定可能な形質をコードするDNAは、
抗生物質に対する耐性をコードするプラスミドDNAであ
る。この発明の好ましい態様においては、このプラスミ
ドDNAはpSV2−ネオを含み、抗生物質はG418である。
ここでは、適当な第２の宿主は、ネズミ宿主または非
ヒトの霊長類宿主であり得る。
この発明の目的のためには、ヒト腫瘍細胞に関連する
細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であってもよ
い。以下の例に限定されるものではないが、細胞表面抗
原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイルスがコー
ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によってコードさ
れる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異常な複合
薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表現型を介
在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍形成表現
型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗原、Ｔ細胞
のような特異的免疫学的エフェクター細胞によって認識
される抗原およびマクロファージ細胞もしくはナチュラ
ルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフェクター細
胞によって認識される抗原であり得る。この発明の好ま
しい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関連抗原であ
る。
工程（ａ）ないし（ｇ）を繰り返してさらなる腫瘍細
胞、すなわち、二次形質導入体、三次形質導入体等を得
ることが可能であることもこの発明の範囲内である。
この発明はまた、上記方法に従って製造されるポリク
ローナル抗体を提供する。
この発明はまた、検出可能なマーカーで標識された上
記モノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供す
る。ここで、検出可能なマーカーは当業者に公知であ
り、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光体、発色基、
重金属または放射性同位体であり得るが、これらに限定
されるものではない。
この発明はまた、被検体における腫瘍状態の診断法で
あって、被検体からの試料を、抗体が腫瘍状態に関連す
る細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合することが
可能な条件下で、検出可能なマーカーで標識した上記い
ずれかの抗体と接触させ、抗原に結合した抗体の存在を
検出して腫瘍状態を診断する方法を提供する。
この発明はまた、治療剤で標識した上記モノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体を提供する。ここで
は、この治療剤は当業者によく知られており、抗生物
質、インターフェロンのような抗ウイルス剤、毒、放射
性同位体、または化学療法剤であり得るが、これらに限
定されるものではない。
この方法はまた、腫瘍状態を治療する方法であって、
腫瘍状態に関連するヒト腫瘍細胞を、治療剤が選択的に
ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するような条件下で、治療剤
で標識した上記いずれかの抗体と接触させることを包含
する方法を提供する。
この発明はまた、像形成剤で標識した上記いずれかの
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供す
る。ここでは、像形成剤は当業者によく知られたもので
あり、放射性同位体、ペルオキシダーゼもしくはアルカ
リホスフェートのような色素もしくは酵素、常磁性イオ
ン、またはＸ線に不透明な元素であり得るが、これらに
限定されるものではない。
この発明はまた、ヒト腫瘍細胞の像を形成する方法で
あって、像を形成させようとするヒト腫瘍細胞を、抗体
が腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原を特異的に認識し、
かつ結合することが可能な条件下で、像形成剤で標識し
た上記いずれかの抗体と接触させ、それらに結合した像
形成剤を検出して腫瘍細胞の像を形成する方法を提供す
る。
ここでは、この像形成方法は、当業者に公知の多くの
像形成法のどのようなものでも、例えば、これに限定さ
れるものではないが、放射性同位体によって放射される
放射線を可視化する方法をも含むことができる。
加えて、この発明は、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表
面抗原をコードするDNAを調製する方法を提供する。こ
の方法は、（ａ）CREF−トランス６細胞系にヒト腫瘍細
胞から単離したDNAおよび選択可能なもしくは同定可能
な形質をコードするDNAを共形質導入し、（ｂ）選択可
能なもしくは同定可能な形質を発現する形質導入細胞を
選択し、（ｃ）そのようにして選択された形質導入細胞
を回収し、．（ｄ）そのようにして回収された形質導入
細胞を適当な第１のネズミ宿主に注入し、（ｅ）得られ
た第１のネズミ宿主を、注入した形質導入細胞が誘発さ
れて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成するに有効な期間
維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１のネズミ宿主から単
離し、（ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍細胞
を得、および（ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞か
ら、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原をコードする
DNAを回収する、ことを包含する。
さらなる腫瘍細胞、すなわち二次形質導入体、三次形
質導入体等を得るために、工程（ａ）ないし（ｇ）を繰
り返し得ることもこの発明の範囲である。
このDNAの調製方法は、従来の方法に対する改良であ
る。なぜならば、この発明のこの側面は、新規にクロー
ン化したラット胚線維芽細胞系、特にCREF−トランス６
細胞系を用いるためである。このCREF−トランス６細胞
系は、腫瘍表現型を介在する遺伝子の同定および少量の
腫瘍組織を用いる細胞表面抗原発現を可能にする。CREF
−トランス６細胞系はまた、腫瘍表現型および細胞表面
発現の誘発に関連する遺伝子の位置を記述する遺伝子マ
ーカーとして機能するヒト反復配列を容易に検出するこ
とを可能にする。加えて、CREF細胞系由来の腫瘍細胞で
は、多くの公知癌遺伝子の発現は観察されていない（2
1）。これは、この系が、ヒト癌遺伝子の潜在的に新規
のクラスの同定に用いられる可能性を肯定するものであ
る。
そのようにして得られた腫瘍細胞からDNAを回収する
方法には、当業者に公知の多くの単離、精製およびDNA
クローニング法が含まれ得る。この方法は、ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクションまたは伝統的なファージ・
クローニング技術でありうるが、これに限定されるもの
ではない。
ヒト腫瘍細胞は、良性もしくは転移性のどのようなヒ
ト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト腫瘍細胞系
またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一次腫瘍であ
っても）由来であってもよい。この発明の一態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系LNCaP由来のヒト前立腺癌
細胞である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍
細胞は細胞系T47D由来のヒト肺癌細胞である。この発明
の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系SW480由
来のヒト結腸直腸癌細胞である。この発明の他の態様に
おいては、ヒト腫瘍細胞は細胞系GBM−18由来のヒトグ
リア芽細胞腫多形（ステージIV星状細胞腫）である。こ
の発明のさらに別の態様においては、ヒト腫瘍細胞は一
次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星状
細胞腫）である。
選択可能なもしくは同定可能な形質をコードするDNA
は、選択可能なもしくは同定可能な形質をコードするい
かなるDNAでもよい。この発明の一態様においては、選
択可能なもしくは同定可能な形質をコードするDNAは、
抗生物質に対する耐性をコードするプラスミドDNAであ
る。この発明の好ましい態様においては、このプラスミ
ドDNAはpSV2−ネオを含み、抗生物質はG418である。
この発明の目的のためには、ヒト腫瘍細胞に関連する
細胞表現抗原は、いかなる細胞表面抗原であってもよ
い。以下の例に限定されるものではないが、細胞表面抗
原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイルスがコー
ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によってコードさ
れる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異常な複合
薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表現型を介
在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍形成表現
型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗原、Ｔ細胞
のような特異的免疫学的エフェクター細胞によって認識
される抗原およびマクロファージ細胞もしくはナチュラ
ルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフェクター細
胞によって認識される抗原であり得る。この発明の好ま
しい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関連抗原であ
る。
この発明はまた、上記方法に従って調製されるDNAを
提供する。
この発明はまた、上記DNAとハイブリダイズし得るDNA
プローブを提供する。この発明はさらに、検出可能なマ
ーカーで標識された上記DNAプローブを提供する。ここ
では、検出可能なマーカーは当業者によく知られたもの
であり、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光体、発色
基、重金属または放射性同位体であり得るが、これらに
限定されるものではない。
最後に、この発明は、被検体における腫瘍状態の診断
法であって、被検体からの試料を、DNAプローブが腫瘍
状態に関連するDNAとハイブリダイズ可能な条件下、検
出可能なマーカーで標識したDNAプローブと接触させ、
ハイブリダイズしたDNAの存在を検出して腫瘍状態を診
断する方法を提供する。プローブの存在は、腫瘍状態の
検出を意味する。
この発明を、以下の実験詳述項においてさらに説明す
る。この項は、この発明の理解を目的に説明されるもの
であり、いかなる点においても、後述の請求の範囲に記
載される発明を限定することを意図するものではなく、
そのように解釈されるべきものでもない。
実験の詳細 材料および方法 CREF−trans 6細胞系 CREF−trans 6細胞系はフィシャ
ー（Fisher）F2408ラット胚細胞の特異的クローンであ
るCREF細胞系のサブクローンである（33）。低密度（50
−100細胞/6cmプレート）のCREF細胞をプレート培養
し、単細胞からの連続したサブクローンを単離すること
によりCREF−trans 6細胞系を開発した。Ha−ras（T2
4）オンコジーンによるトランスフェクションに引き続
く形態的な形質転換能力についてこれらのCREFのサブク
ローン（CREF−trans 1から20まで同定）をテストし
た。更に、クローンされたネオマイシン耐性遺伝子（pS
V2neo）によってトランスフェクトし、G418含有培地で
の成育用に選択したサブクローンについては、抗生物質
耐性菌コロニーを形成する能力についても分析した。CR
EF−trans 6は親または他のCREF−transサブクローンよ
りT24による形質転換に対するセンシテイビテイが高
く、ネオマイシン耐性を発現させるCREFの特異的なサブ
クローンである。
その他の細胞系 LN−CaP細胞系はヒト前立腺がん腫よ
り派生した。T47D細胞系はヒト胸部がん腫より派生し
た。GBM−18はヒト多形神経膠芽細胞（第４ステージ星
状細胞腫）より派生した。またヒト多神経膠芽細胞（第
４ステージ多形）原始腫瘍から派生したもあった。SW48
0細胞系はヒト結腸直腸がん腫より派生した。MCF−７細
胞系はヒト乳がんより派生した。Colo38細胞系はヒトメ
ラノーマより派生した。HO−Ｉ細胞系はヒトメラノーマ
より派生した。これらの細胞系は当業者が公に入手可能
である。
抗血清の調製 BALB/c雌マウス（８乃至10週齢）をCREF
−trans 6細胞で過剰免疫化した。マウスに（１）０日
目に完全なフロイント（Freund）のアジュバント（1:
1）による擦過細胞の皮下注射（SC）を一回；（２）７
日目に不完全なフロイント（Freund）のアジュバント
（1:1）により擦過細胞の皮下注射（SC）を一回；
（３）14日目および21日目ハンクスのバランス塩溶液中
の擦過細胞の腹膜内注射（ip）を二回行なった。マウス
の後部眼かより出血させ収集された血清について抗CREF
活性をエリザ法でテストした。CREF細胞を（１）96穴ミ
クロタイタープレートで集密に近い状態まで成育させ；
（２）3.7％のホルムアルデヒドPBS（溶液）で、室温に
て５分間の細胞固定を行い、10％の正常山羊血清で細胞
を封鎖し；（３）抗血清の細胞に対するタイターを順次
希釈液を使用して２時間、37℃で計測し；（４）ホース
ラデイッシュ パーオキシダーゼを接合した山羊抗マウ
スIg第二抗体（G X MIg−HRP）を使用し、60分、37℃で
結合を検出し；（５）過酸化水素水存在下で色素源を添
加し、ポジテイブ結合が呈する色変化をスペクトロフォ
トメーターで定量した。上記手段の採用より、高度力価
の血清（1:3200−1:6400）を21日目までに得、力価1:10
0の血清を初期実験においてCREF−Trans 6細胞を被覆す
るために使用し、二番目に高い力価の血清を後続実験に
使用した。
CREF−Trans 6細胞系のコトランスフェクション 受容体CREF細胞のDNAトランスフェクションはHMW−DN
Aが切断され６乃至25キロベースペアーのDNA断片を形成
した以外は上述の様に行われた（22,45,47）。この改変
法は結果としてリン酸カルシウム介在DNAトランスフェ
クションによってある種の細胞遺伝子を有効にトランス
ファーし、HMW−DNAのトランスフェクションの際にしば
しば遭遇する毒性を減少させる傾向をうむ（11）。DNA
はフェノール抽出法使用により細胞系から単離する（1
4,37）。HMW−DNAを16−口径（ゲージ）の針を持つ注射
器に繰り返し通すことで切断し、アガロースジェルの電
気泳動でサイズ分別した（36）。次ぎにHMW−DNAをpSV2
−Neo DNAと混合した（HMW−DNA:NeoプラスミドDNAが20
乃至40μg:1μｇ）。リン酸カルシウム沈殿物として最
終DNAの20乃至40μｇを１乃至2X106のCREF−Trans細胞
中に添加した（22,45,47）。CREF−Trans細胞をリン酸
カルシウムDNA沈殿物と４時間培養した後、過剰DNA沈殿
物を除去した。培養物をグリセロール（15容量％のグリ
セロールPBS溶液）で短時処理し、トリプシン／バーゼ
ン（versene）で素早く懸濁し、10cmのプレートあたり5
x106,、105,、および2.5x105で再プレートした。
選別可能または認識指標特質を発現するトランスフェク
トされた細胞の選別 プレート後48時間で培地をG418
（500μg/ml）を含有する培地で置換した（36,45）。選
択培地を週二回取換え、NeoRのコロニーが７日乃至14日
以内に検出できる。
被トランスフェクト細胞の回収およびマウスへの注入
各々のプレートからの培養細胞培養が適宜な数に増殖し
たら、各々の選別G418選択プレートから細胞がプールさ
れ106をヌードマウスに皮下注射した。
腫瘍細胞の単離および提供 被トランスフェクト細胞の
注射で培養期間８週間でマウスに腫瘍が発生したら、腫
瘍を除去し、細胞培養中に再投入する。細胞は酵素によ
らない分離かあるいはプレートからのラバーポリスマン
（a rubber policeman）による剥離によって除去され
た。再懸濁液をHanks BSSで洗浄し、最小量のHanks BSS
で再懸濁した。
腫瘍細胞の抗血清による被覆 通常CREF−Trans 6細胞
で発現する抗原の免疫応答を阻止するため、腫瘍からの
腫瘍細胞をマウスに注入する前に、高力価の抗マウス−
CREF−Trans 6抗血清で被覆した。再懸濁細胞（１乃至
2.5X106）をM X CREF抗血清と濃度1:100（抗血清：細
胞）で混合し、室温、６時間で培養するかあるいは４℃
で一晩振盪培養した。
抗血清被覆細胞のマウスへの注入 BALB/c雌マウス（８
乃至10週齢）にアジュバント併用あるいは無併用で一ヶ
月以上、抗血清被覆細胞を繰返しip注入した。
悪性細胞による血清反応性宿主のスクリーニング 上述
のように免疫化されプールされたマウスの血液と多種細
胞；例えば、CREF−Trans 6,CREF 4−NMT（LNCaP DNAで
トランスフェクトされたの）,LNCaP（ヒト前立腺がん腫
細胞系）,SW480（ヒト結腸直腸がん腫細胞系）,MCF−７
（ヒト乳がん腫細胞系）,HO−１（ヒトメラノーマ細胞
系）,Colo38ヒトメラノーマ細胞系），およびヒト皮膚
繊維芽細胞、との結合性についてエリザ法でテストし
た。適宜なヒト腫瘍細胞と反応性を持つ血清を有すと確
認された動物を使用し、標準法によりMoAbsを産生させ
た。
モノクローナル抗体の産生 MoAbsの産生に利用される
方法はヒトTAAs（50）,HLA抗原（51），タイプ５アデノ
ウイルスで形質転換したスプラグーダウリー（Sprague
−Dawley）ラットの胚細胞（52）,X線形質転換C3H−10T
1/2細胞（53），神経膠芽細胞（neu）オンコジーンを
有し、発現するNIH−3T3のトランスフェクタントに対す
るMoAbsの産生させた前述の方法と同様である。免疫化
したマウスから調製されたひ臓細胞は、ポリエチレング
リコール（PEG）の存在下、ケーラーとマイルスタイン
（Kohler and Milstein）の方法に若干の改変を加えた
方法で、非分泌性の骨髄細胞NSIとハイブリダイズし、
融合後24時間して、ハイブリッド細胞を選別するためハ
イブリドクローンを96穴プレートのHAT培地の再プレー
トした。増殖したハイブリッドクローンを含むマイクロ
タイターの穴中の上澄液を採集し、多種のターゲット細
胞；例えば、第３次、第２次LN−CAP−CREFトランスフ
ェクタントおよび正常CREF細胞に対する抗体活性をテス
トした。初期スクリーニングでは、ターゲット細胞が少
量で済み、時間を消費しないという理由で、寺崎プレー
ト125I−タンパクＡバインデイングアッセイ（55）を使
用した。他のアッセイ、例えば酵素結合免疫アッセイも
使用できる。下記の初期スクリーニングはLN−CAP−CRE
Fトランスフェクタントと特異的に反応するハイブリド
ーマ培養上澄液を多種のターゲット細胞；たとえばヒト
前立腺がん腫細胞系DU−145,PC−3,2種のヒトメラノー
マ細胞系（Colo38およびHO−１）,Bリンパ芽球細胞系
（WIL−２），ヒト皮膚繊維芽細胞，他のウイルス（タ
イプ５アデノウイルス、ウシ胎児パピロ−マウイルスタ
イプ１およびHa−ras）によってのCREF−Trans 6細胞，
に対する特異性について再テストした。ヒト前立腺がん
腫細胞系に対して特異的な抗体を分泌するハイブリドー
マは即座に少なくとも５回、限られた希釈度で、サブク
ローンされる。目的の最終ハイブリドーマクローン、即
ち、ヒト前立腺がん腫細胞TAAsと特異的に反応する抗体
を生産するものをin−vitroの大量培養で増殖させるか
またはイン・ビボでpristane primed同系マウスの腹水
として増殖させる。目的の抗体は被トランスフェクトCR
EF細胞上あるいはヒト前立腺がん腫瘍細胞で発現した前
立腺がん誘起抗原の生化学的特徴を明らかにするために
使用される。
抗体使用による特異的抗原の確認 前述の方法を使用す
る生化学的分析をするため、特異的抗原をヒト前立腺が
ん腫細胞から単離するために目的のMoAbsが使用され
る。最初に、MoAbsによって認識されるエピトープを内
含する分子の性質、即ち蛋白であるか、糖脂質であるか
を決定するために単純な実験が実施される。蛋白あるい
は糖脂質抗原を確認するために、ラジオイムノ沈澱アッ
セイを（56,57）使用する。125Iで標識した細胞からあ
るいは35S−メチオニンまたは3Hロイシンで合成によっ
て標識された細胞からの細胞膜洗剤抽出物を抗マウス−
（IgG＋IgM）セファロースに結合したMoAbsと反応さ
せ、MoAbsと抗原の相互作用をSDS−PAGE（56,57）によ
って分析する。糖脂質抗原を確認するために、ヒト前立
腺がん腫細胞から単離した脂質成分を薄層クロマトグラ
フによって解析し、そのクロマトグラムを相応するMoAb
sと反応させる。
蛋白抗原の分子量および電荷の不均一性について更に
前述のオファレル（Ｏ′Farrell）（58）法あるいはガ
レル（Garrels）の改変法（59）のように２次元（２−
Ｄ）のゲル電気泳動で分析する。MoAbsによる免疫沈澱
によって単離された抗原は次にアンフォラインおよび尿
素含有のポリアクリルアミドの１次元等電点電気泳動に
供される。ゲルはSDS−ゲル緩衝液によって均衡化し、S
DS−PAGEゲルに適用される。２−Ｄ分析に先立ち、シア
ル酸による電荷の不均一性をノイラミニダーゼによって
シアル酸残基を除去することで、シアル酸による電荷の
不均一性を評価する。この様に２−Ｄ分析は等電点電気
泳動（pI）および蛋白質分子料を同時に分析できる。
MoAbsにより同定される蛋白質抗原の安定性を決定す
るために、ウエスタンブロテイングアッセイを行う。要
するに、SDS洗剤によって変性した細胞抽出物をSDS−PA
GEで還元状態あるいは不還元状態で解析し、ニトロセル
ロース膜上にブロットし、イムノペルオキシダーゼ法
（ブロットをMAbで処理した後、抗マウスIg抗体結合ペ
ルオキシダーゼで処理、続いて過酸化水素と3,3′−ジ
アミノベンジデイン テトラハイドロクロライドで処理
する）で選別されたMoAbsで染色されるかあるいはブロ
ットされた抗体を精製したMoAbsで結合し、125Iで標識
したブドウ球菌（S.aureus）蛋白Ａを結合させオートラ
ジオグラフィーを行う。これらの方法は、（ａ）エピト
ープが処理プロトコールに従った免疫反応性を残してい
るかどうか、および（ｂ）蛋白抗原がサブユニットから
構成されているか否かを示す。更に、これらの研究はイ
ムノブロットアッセイが患者の標本中で特異抗原を検出
することに応用できるかどうかを示すことになる。
腫瘍細胞からのDNA回収 腫瘍由来の腫瘍細胞を使用し
てDNAを回収、同定、単離し、公知の方法を用いて分子
レベルでクローン化できる。CREF−trans 6細胞の第
一、第二、第三次のトランスフェクションの子孫である
腫瘍由来細胞から抽出したDNA内にヒトDNA配列が存在す
するかどうかはサザンブロット分析で決定される。第
二、第三次のトランスフェクタントは通常、ヒトAlu DN
A断片でプローブしたサザンブロット上にバンドがひと
つあるかないかというよう回収が少ないのに対し、第一
次マウス、またはマウスの被トランスフェクト細胞に由
来する制限酵素で消化分解されたDNA中に、ヒトDNAを含
む断片（Alu）は通常多く存在する。サザンブロット分
析で、265ベースペアーのAlu DNA配列即ち、SP6プロモ
ーター［ラカニーロ（V.RacaniellO提供）］を含むベク
ターにサブクローンされたBlur−８（23）が特異的活性
の高い32P標識のプローブRNAを産生するために使用され
た。Blur−８プローブはサイズが小さいため、異種DNA
に組み込まれているAluリピートの単一コピーを検出す
ることはできない。Alu DNAの単一コピーのみを含む被
トランスフェクトラット細胞でAlu DNA配列が検出でき
るか否かを決定するために、Alu DNAの単一コピーを含
むとことがわかっているV.Racaniello（コロンビア大
学）により提供の細胞系からDNAをハイブリデイゼーシ
ョンのコントロールとした。もし、サザンブロット分析
で制限酵素断片を含む受け継がれたヒトAlu DNAの存在
が多くの第二、第三のトランスフェクタントで明らかに
なれば、CREF細胞の腫瘍化に関係するヒト前立腺がん遺
伝子を単離することが可能である。これは、遺伝子DNA
ライブラリーの産生、クローンされたDNA含有Alu DNA配
列の単離、およびpSV2−Neo DNAでコトランスフェクト
したCREF細胞によるこれらのクローンされたヒトDNAsの
生化学活性のテストと抗Ｇ−418−トランスフェクタン
トがヌードマウスで腫瘍性であるかどうかを決定するこ
とによって可能となる。Mbo Iによる腫瘍由来の第二ま
たは第三のLN−CAP DNAのトランスフェクトしたCREF細
胞から抽出したDNAのMbo I部分分解物がラムダEMPL3（B
amH I部位）ライブラリー（26）の構築に使用され、こ
れらのライブラリーはBlur−8 Alu DNAプローブによる
プラークハイブリデイゼーション（27）によってスクリ
ーニングされる。DNAはAlu配列を含む組換ラムダファー
ジから抽出され、およびクローンされたヒトDNAは、そ
の腫瘍誘発性についてpSV2−Neo DNAとCREF細胞をコト
ランスフェクトし、106細胞の皮下注射後のヌードマウ
スにおける腫瘍化可能性のある抗Ｇ−418−の細胞数を
記録することで評価する。もし組換ファージがLN−CAP
前立腺がん細胞由来の腫瘍誘発遺伝子を含んでいるな
ら、（ａ）新規に単離された遺伝子の核除去分析におい
て新規に単離された遺伝子の転写率；（ｂ）ノーザレン
ブロット分析によるイントロン相同性ポリＡ＋RNAの量
および多数性；（ｃ）S1分析（28）によるイントロン／
エクソンの配置；および（ｄ）サザンブロット分析によ
り、LN−CaP細胞における前立腺オンコジーンのDNA配置
が正常なヒト前立腺細胞ゲノムにおけるDNAの配置と同
一かどうか；を決定するためにクローン化されたDNAを
制限酵素を使ってマップでき、CREF細胞をオンコジーン
の表現型に形質転換する能力を残しているクローン化さ
れたDNAの最小断片がLN−CaPおよび正常な前立腺組織に
おいて使用される。正常、LN−CaP、第一、第二、およ
び第三次LN−CaPのトランスフェクトしたCREF細胞のサ
ザンブロット分析の比較により、これらの前立腺がん細
胞のオンコジーンの表現型に関与する遺伝子の増幅があ
るかどうか調べることができる。
もしAlu DNAを含む第二、および第三次トランスフェ
クタントからの組換ファージがあり、それがヌードマウ
スをCREF−trans 6細胞を腫瘍状態に形質転換しないな
らば、これらの組換ファージはLN−CaP DNAをMbo Iおよ
びEcoR Iで部分消化分解して構築されるコスミド（pJB
8）（27）およびラムダEMBL3ファージライブラリーをス
クリーンすることに使用される。オリジナルのトランス
フェクタントDNA/ラムダライブラリーから産生するプロ
ーブとハイブリダイズするファージおよびコスミドに含
まれるDNAは制限酵素を使用し広範にわたってマップ化
され、フランキングDNAに加え相同配列を含むと思われ
るファージまたはコスミド内のDNAはCREF−trans 6細胞
をトランスフェクトするのに使用され、ヌードマウスに
おいて腫瘍化可能性が分析される。ヌードマウス腫瘍化
アッセイで陽性となったトランスフェクタントを産生す
るファージまたはコスミド内に細胞性DNA配列は腫瘍誘
発活性に関与する最小のDNA配列を決定するため様々な
制限酵素のよって消化分解される。
もし、CREF細胞を癌の表現型に変換する第二、および
第三トランスフェクタントから構築された単一のファー
ジまたはコスミド内にクローンされた配列を包含してい
るヒトAlu DNAがなければ、正常ヒトあるいはLN−CaP D
NAがラムダEMBL3あるいはMbo Iの代わりにSal IまたはE
coR Iによる部分消化分解によって構築したコスミドラ
イブラリーからの重合する断片を供給することでオンコ
ジーンを補足し、イン・ビボでの組換により、作用性の
あるオンコジーンを再構築できる。近年この技術はヒト
神経成長因子受容体をコードする部分遺伝子とハイブリ
ダイズする正常ヒトラムダラリブラリーから選別された
DNA配列でこの遺伝子の決められたDNA部分にトランスフ
ェクトすることでヒト神経成長因子受容体に生化学的活
性を産生するために使用されている（24）。この結果ト
ランスフェクタントはNGF結合活性を示す新成長因子受
容体を発現する（24）。もし上記アプローチがCREF細胞
の癌化形質転換に関与する遺伝子の単離に陰性であると
すればこのアプローチは有用であろう。
CREF−trans 6細胞の癌化に関与する遺伝子は遺伝子
クローンを使用し、ヒトAlu配列に付随しているこのヒ
ト遺伝子を探すことでは単離できない。この初期アプロ
ーチの代替として、非癌化CREF細胞およびオンコジーン
の表現型を示すこれらCREF細胞の三次トランスフェクタ
ントに緊密に関係している異種mRNAあるいはmRNA量を反
映するcDNAを単離することによる遺伝子単離方法をとる
ことができる。CREF細胞遺伝子発現と腫瘍性LN−CAPト
ランスフェクタントとの違いはヒト前立腺がんDNAから
の遺伝子の発現によるだろう。この仮説に基づき、クロ
ーンした三次トランスフェクタント由来のDNAをcDNA/ラ
ムダgt−10ライブラリーを構築するために使用し、これ
らのライブラリーをCREF mRNAあるいはCREFトランスフ
ェクタントmRNAから産生する32Pで標識されたcDNAプロ
ーブでスクリーンする。
10mgのpoly A＋RNAは106の独立した組換ファージを含
むライブラリーを構築するに十分である。このサイズの
λgt10−cDNAライブラリーは全mRNAの0.001％以下の濃
度の配列を含む。三次LN−CaP CREF細胞トランスフェク
タントから構築されるλgt10−cDNAライブラリーは様々
な方法でスクリーンされる。たとえば、CREF細胞と比
べ、CREF細胞トランスフェクタントで特異的に、あるい
は高濃度で発現するmRNAに対応するcDNAクローンを単離
する比較法、競合法、消去法スクリーニング（11−13,2
9,64）．がある。
CREF−Trans 6細胞ではなくLN−CaP被トランスフクト
CREF細胞中で発現する遺伝子をライブラリーからスクリ
ーニングするために、適宜な組換ファージ三次CREFトラ
ンスフェクタントcDNAを含む複写ニトロセルロースフィ
ルターを未形質転換CREF−Trans 6細胞および腫瘍誘発L
N−CaP被トランスフクトCREF細胞（64）から作成された
32Pで標識されたcDNAプローブでハイブリダイズする。
第二のスクリーニングアプローチとして、組換ファージ
DNA分子（CREF−Trans 6からのクローンしたcDNAsある
いはLN−CaP DNAを使用し、トランスフェクトしたCREF
−Trans 6細胞）を含むニトロセルロースフィルターを
数百倍の他のCREF mRNA（11）の過剰存在下で三次トラ
ンスフェクタントCREF細胞から調製された32Pで標識さ
れたcDNAプローブでハイブリダイズする。第三のアプロ
ーチとして、未形質転換CREF細胞の配列あるいは三次CR
EF細胞cDNA（12,13）でエンリッチドされた32Pで標識さ
れたcDNAプローブで組換ファージ−三次トランスフェク
タントDNA分子を含むニトロセルロースフィルターをハ
イブリダイズする消去スクリーニング法がある。これら
の方法を使用し、CREF細胞と比較し、被トランスフェク
トCREF細胞中で特異的に発現するかあるいは過剰発現す
る遺伝子配列を含む特異的組換ファージを単離すること
が可能である。
腫瘍細胞および被腫瘍細胞で特異的に発現するmRNAに
相当するcDNAクローンはクロスハイブリデイゼーション
分析により相同グループとされ、制限酵素を使用しマッ
ピングする（29）。クローンしたcDNAがヒトに特異的な
mRNAに相当することを確かめるため、およびCREF−Tran
s 6細胞の癌化に関与し、前立腺がんの制御に関与する
のは遺伝子であることを確かめるため、CREF−Trans 6
細胞、LN−CaP細胞、LN−CaP DNAを使用してトランスフ
ェクトしたCREF−Trans 6細胞にmRNAが存在するとし
て、これらの細胞由来の相同なmRNAsのサイズおよび量
的な特徴が各々の相同グループから最大のcDNA挿入物を
使用し明らかされる。
ノーザレンブロット分析はこれらの遺伝子が、（ａ）
正常前立腺組織においてたぶん低率で発現するか、
（ｂ）ヒトにおける前立腺癌の進行の各段階を示した前
立腺癌からの臨床学的組織サンプルにおいて発現する
か、（ｃ）ラットから派生する正常および癌化した組織
からの前立腺細胞において発現するかどうかを示す。
それぞれに異なって発現するmRNAに相当するcDNAを含
む組換DNAはクローンした三次トランスフェクタント由
来のmRNAほかに、CREF−Trans 6細胞由来のmRNAのノー
ザレンブロット分析のプローブとして使用される。もし
ノーザレンブロット分析で、被トランスフェクト細胞に
のみに遺伝子の発現を同定したならば、これらのcDNAク
ローンはこれらの遺伝子の発現を制御する遺伝子配列を
単離し、同定するために、三次トランスフェクタントDN
Aの遺伝子ライブラリーからコスミドファージを同定す
るプローブとして採用される。遺伝子対の片方がいった
ん単離されたら、オンコジーンの構造がS1ヌークリエー
スマッピング（29）のテクニック、制限酵素マッピング
（29）、およびDNAシークエンスによって解明される（1
4）。
クローンしたcDNAの生化学的作用を確認するために、
組換λgt10 DNAからcDNAが分離され、このcDNAをpCD発
現ベクター（15,16）に挿入される。pCD−cDNA組換プラ
スミドはSV40初期遺伝子転写ユニットと融合しているネ
オマイシン遺伝子を含むλ−NMTバクテリオファージに
クローンされ、哺乳類細胞のトランスフェクタントおよ
びcDNA発現に関する強力なプロモーターにG418の耐性を
与える（15）。λ−NMT−pCD−cDNA組換バクテリオファ
ージ粒子はCREF細胞を有効にトランスフェクションする
ために使用される。G418耐性菌は、ヌ−ドマウスにおけ
る腫瘍化性および細胞形態、成長、寒天配合培地での成
育能力における変化などの形質転換に伴う特性について
テストする。
ヒト前立腺細胞由来のCREF細胞において腫瘍誘発発現
型を制御する遺伝子の同定は、（ａ）同様の遺伝子が存
在しているかどうかおよびDU−145およびPC−３などの
他の前立腺がん細胞系で発現するかを決定する際に；
（ｂ）同様の遺伝子が存在し、およびまたは正常前立腺
において、同じ疾患の各段階に相当する良性前立腺肥大
および前立腺がん組織で発現するかを決定する際に；
（ｃ）相同遺伝子がラットの前立腺がん細胞で発現する
かを決定する際、およびこの遺伝子の発現が異なった転
移性を呈する細胞で変換されるようなことがあるかどう
かを決定する際に；（ｄ）CREF細胞での腫瘍誘発表現型
が発現する際に関与する特殊蛋白の同定、定性する際
に；および（ｅ）前立腺がんの特定の段階を診断し、前
立腺がんの治療を受けている患者の治療経過を追調査す
る際に有用な特徴的免疫学薬剤の産生をする際に有用で
ある。
ヒト前立腺がん細胞系（LNCaP）からCREF細胞へトラン
スファーされた腫瘍誘発遺伝子の同定およびクローニン
グ 一次および確立したヒト前立腺がん細胞におけるオン
コジーン発現における一貫した変化を実証する企てはま
だ成功していない（８−10）。しかしながらレチノブラ
ストマ（RB）腫瘍抑制遺伝子（染色体13q14に位置す
る）の発現における欠陥がDU145ヒト前立腺がん細胞系
（64）、および10中２の割合でヒト前立腺がん標本（6
5）で発見された。染色体16qおよび10qにおける特殊な
対立遺伝子欠損がヒト前立腺がんの病理に関与している
（66−68）。特殊前立腺がんの挙動を抑えあるいは患者
の予後に経過に関する見通しを立てる際の、RBおよび他
の推測上の腫瘍抑制遺伝子（染色体16qおよび10qに位置
する）における遺伝子学的変化の役割は知られていない
（64−68）。腫瘍抑制遺伝子自身の変化が前立腺がんを
誘発し、あるいはこれらの遺伝子学的変化がまだ同定さ
れていないオンコジーンの活性に付随して起こるかどう
かを突き止めるにはさらに研究が必要となる。カルシウ
ム仲介による前立腺がん細胞からNIH 3T3細胞への高分
子DNAのDNAトランスフェクションではこのクラスの腫瘍
において共通した腫瘍誘発に集中して優先的に作用する
オンコジーンを同定するには至っていない（９）。精巧
な単一DNAトランスフェクションテクニックは組織学的
に異なるヒト腫瘍において弱い形質転換能をを持つ付加
的なオンコジーンの同定を可能にする（12,13,68−7
1）。この方法はヒト腫瘍DNAおよび選択可能な抗生物質
耐性遺伝子で成熟した細胞系へコトランスフェクション
すること、抗生物質耐性の選択および耐性コロニーをヌ
ードマウスに注入することからなる（12,13,69−71）。
クローンされたネオマイシン耐性遺伝子（pSV2neo）のD
NAとLNCaP細胞由来の高分子DNAをCREFまたはNIH 3T3細
胞へコトランスフェクションし、G418に対する耐性で選
択を行った結果、形態学的に形質転換したフォーカスに
はならなかった。しかし、コトランスフェクションされ
たNIH 3T3細胞ではなくコトランスフェクションされたC
REFをヌードマウスに注射した結果、異種のトランスフ
ェクションからプールした細胞を受容した４セット動物
のうち３セットに腫瘍の誘発が見られた。CREF細胞にpS
V2neoと正常皮膚繊維芽細胞由来DNAあるいはサケ精子由
来DNAをコトランスフェクションした結果、腫瘍の形成
は見られなかった。一次LNCaP−CREF腫瘍（１゜トラン
スフェクタント）由来DNAは第二次CREF細胞へのコトラ
ンスフェクションの後、腫瘍表現型を誘発した。第二次
CREF細胞へのコトランスフェクションの後、選別された
抗生物質耐性コロニー（２゜トランスフェクタント）は
in vitroで形態学的な形質転換を示さなかった。しか
し、これらの抗生物質耐性形態学的に正常な培養物は、
異種のトランスフェクションからプールした細胞を７セ
ット動物のうち６セットに腫瘍の誘発が見られた。LNCa
P−CREFから得られた１゜、２゜トランスフェクタント
の両者ともCREF細胞で検出されないヒト（Alu）のリピ
ート配列を含むヌードマウスで腫瘍を誘発した（これら
のトランスフェクタントの幾つかを図１に示す）。１゜
（CREF 4 NMT）、２゜トランスフェクタント（CREF 4−
5 NMR;CREF 4−7 NMT）の両者とも約7.5kbの共通なAlu
断片の他にあきらかにユニークなAlu断片含んでいた。
この知見はヒト前立腺がん細胞由来の推定上の腫瘍誘発
遺伝子がこのDNA配列の近傍に位置していることを示唆
している。下記に述べるように、１゜および２゜トラン
スフェクタントはヒト前立腺がん細胞系LNCaPからCREF
にトランスファーされた腫瘍細胞の表現型に係わる遺伝
子の単離に使用される。
LNCaP細胞からの形質導入腫瘍誘発遺伝子の単離に用い
られる遺伝子クローニング策 EMBL3ファージにおけるクローニング 用いられる基
本的な手順は、ヒトDNAが形質導入された齧歯類動物細
胞内に存在するAluヒト繰り返し配列を同定し、これら
の配列をクローニングするために確立されている（23、
70−72）。加えて、最近このアプローチは、pSV2neo DN
A有するNIH 3T3細胞と細胞性DNAとを共形質導入し、ヌ
ードマウスにおいて腫瘍形成した後、家族性線癌様ポリ
ポーシス患者からの潜在的に新規の癌遺伝子の同定に用
いられている（71）。図１に示すように、サザーンブロ
ットでの研究は、１゜および２゜両腫瘍由来LNCaP DNA
−CREF形質導入体が、Blur 8（Alu）プローブとハイブ
リダイズする、EcoR Iでの開裂の後に生成する約7.5kb
のDNA断片を含有することを示す（23）。この推定LNCaP
腫瘍誘発遺伝子を含有するゲノムクローンを単離するた
めに、以下の策を用いることができる。Blur 8で探索し
た場合に陽性である、７ないし9kbのEcoR I消化DNA断片
を単離し、フェノール、フェノール：クロロホルムおよ
びクロロホルムで処理することにより低融点アガロース
ゲルから抽出する。このDNA断片を、EcoR I（Stratagen
e、CA）で切断したバクテリオファージEMBL3アームにラ
イゲートする（72）。ライゲーションの後、この反応混
合物を、ストラタジーン・パッキング・エクストラクト
を用いて、パックする。全ファージ・ライブラリーをLE
392宿主バクテリアに塗布し、Blur 8をプローブとして
用いる（74、75）ニトロセルロース・ペーパー上でのプ
ラーク・ハイブリダイゼーション（73）によってAlu陽
性プラークを同定する。Aluプローブは、ランダム・オ
リゴヌクレオチド標識法（76）を用いて、［α−32P］d
CTP（Amersham,Inc.,IL）で標識する。陽性ゲノムクロ
ーンを制限酵素マッピングおよびサザーンブロット分析
により特徴付ける（77、78）。陽性クローンを配列決定
のためにpUC19またはM13ファージにサブクローニング
し、また、ノーザンブロット研究にプローブとして用い
る。ノーザンブロットでの研究のために、LNCaPから単
離された細胞質RNA、１゜および２゜腫瘍由来LNCaP DNA
−CREF形質導入体およびさらなるヒト前立腺癌細胞系
（DU145およびPC−３を含む）が用いられる。これらの
ノーザンブロット分析において陽性であり、かつ同サイ
ズのエクソンを含むクローンは、配列決定によりさらに
特徴付ける。適当なエクソンを含むクローンを、LNCaP
および１゜および２゜腫瘍由来LNCaP DNA−CREF形質導
入体から構成されたcDNAライブラリーのスクリーニング
に用い、推定腫瘍誘発遺伝子に対応する完全長のcDNAク
ローンを得る。
１゜および２゜腫瘍由来LNCaP DNA−CREF形質導入体
内に存在する推定腫瘍誘発遺伝子の獲得にEMBL3クロー
ニングを用いる第２のアプローチとしては、以下のアプ
ローチを用いることができる（71、74、76）。二次腫瘍
誘発LNCaP DNA−CREF形質転換体DNAはSau3AIで部分的に
消化し、次いでショ糖勾配遠心により分画する。20ない
し30kb断片を含有する精製画分を、BamH Iで切断した精
製EMBL3ファージ・アームでライゲートする。この組換
えファージ・ライブラリーをAluプローブでスクリーニ
ングし、陽性クローンを同定する。その後、クローンDN
AをSal Iで消化し、Aluプローブおよび上で得られたプ
ローブを用いるサザーンブロットにより分析する。
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）クロー
ニング 組換えファージを用いる１゜および２゜腫瘍由
来LNCaP DNA−CREF形質導入体からのヒトDNA配列の単離
は、EMBL3内の全ゲノムライブラリー（２ないし４×105
の独立した組換えファージを含む）の製造およびプロー
ブとしてAluを用いるこのライブラリーのスクリーニン
グを必要とする。最近の研究は、Alu PCRアプローチ
が、齧歯類動物のゲノム・バックグランドにヒト染色体
断片を保持する体細胞ハイブリッド、ラムダファージ内
にクローニングされたゲノムDNAおよびイースト人工染
色体（YAC）ベクターのような複合源からのヒトDNA配列
の同定および精製に、単一法として使用可能であること
を示している（79、80）。このアプローチは、ヒトゲノ
ムに合理的に保全されているAlu繰返しのコンセンサス
配列を用いることにより、促進されている（79）。体細
胞ハイブリッドおよびYACベクターにおけるヒトDNA配列
の同定において特別な価値を有することが立証されてい
るPCRプライマー・コンセンサス配列は、TC−65および5
17である（79）。プライマーTC−65は、霊長類Alu繰返
しの第２モノマーで唯一の31bp配列内に位置する（8
1）。プライマー517は、TC−65と同じ17bpのAlu配列を
認識するが、その方向は反対である。Nelsonらの研究
（79）に基づくと、TC−65はヒトDNAの500kb毎に生成す
る断片を同定し、プライマー517は1000bp毎に断片を生
成すると見積もられる。これらのコンセンサスAlu配列
が１゜および２゜腫瘍由来LNCaP DNA−CREF形質導入体
内に存在する場合には、Alu PCRアプローチにより、ゲ
ノムライブラリーの調製およびこのライブラリーをAlu
陽性クローンについてスクリーニングする必要がなくな
る。最初に、１゜および２゜腫瘍由来LNCaP DNA−CREF
形質導入体DNA1μｇ、およびNelsonら（79）にによって
記述される、TC−65および517を用いるPCRが用いられ
る。２種のプライマーを用いる単一Alu繰返しからの２
方向増幅を可能にするプライマーの使用または逆PCRの
いずれか（82）によるこのアプローチの変形は、領域ま
たはクローンからの大部分のAlu配列の増幅を可能にす
る。このPCR Alu方法論が成功するならば、同定される
配列は、１゜および２゜腫瘍由来LNCaP DNA−CREF形質
導入体由来の組換えライブラリーのスクリーニングにお
いて関心のあるcDNAクローンの同定に使用されるプロー
ブとして、直接用いることができる。
差別的スクリーニング（減法的スクリーニング） ２゜腫瘍由来のLNCaP・DNA−CREFトランスフェクタン
トから構築された減法ライブラリー（subtracted libra
ries）のスクリーニングは、合計１×106個の組換ファ
ージcDNAライブラリーのスクリーニングから得られるよ
りも大きな、ハイブリダイゼーション陽性のファージク
ローンの富化をもたらす。まず、CREFおよび２゜腫瘍由
来のLNCaP・DNA−CREFトランスフェクタント細胞からの
単方向性cDNA発現ライブラリーが、５μｇのポリＡ＋RN
Aから調製され、次いでストラタジーン社のcDNA合成キ
ットで二重鎖cDNAが調製される（83）。このcDNAsはラ
ムダザップ社のバクテリオファージベクター中にライゲ
ートされ、パッケージングエキストラクト（packaging
extracts）と共にパッケージされる。合計１×106個の
クローンが計数される。減法ライブラリーは、Sargent
及びDawidの方法によって上記cDNAライブラリーから作
製される（84）。ラムダザップベクター中に存在する２
゜腫瘍由来のLNCaP・DNA−CREFトランスフェクタントcD
NA30μｇがXho Iで開裂され、T3RNAポリメラーゼによっ
てRNA転写物が生成される（85）。このRNA転写物は、Xh
o Iリンカープライマーを添加すると、モロニーネズミ
白血病ウイルス逆転写酵素によって一本鎖cDNAに変換さ
れる。この一本鎖cDNAは、60℃で48時間、過剰のCREF細
胞質RNAとハイブリダイズされる。ハイブリダイズされ
なかったcDNAは、水酸アパタイトカラムを通すことによ
って回収される（86）。略２ラウンドの減法によって、
２゜腫瘍由来のLNCaP・DNA−CREFトランスフェクタント
cDNAから90％の減法がもたらされる。この減法cDNAはプ
ローブとして用いることができ、或いは更にクレノウポ
リメラーゼで二重鎖に加工され、ファージベクターにラ
イゲートされてパッケージされる。得られるコロニーの
合計数は、５〜10×104である。このアプローチは任意
的であり、何等かの理由で、EMBL3クローニングまたはP
CR・Alu法を用いた推定LNCaP腫瘍誘導遺伝子の同定が不
成功であるときにのみ用いられる。
CREFトランスフェクタントからLNCaP腫瘍誘導遺伝子
をクローニングするために理論的に用いられ得る別のア
プローチは、減法ハイブリダイゼーション及びPCR技術
の両者を兼ね備える（87）。この方法においては、大過
剰のドライバーDNA（CREF）がテスターDNA（ドライバー
DNAには存在しない問題の遺伝子を含んだ２゜腫瘍由来
のLNCaP・DNA−CREFトランスフェクタント）と結合さ
れ、減法手順により共通の配列が除去されて、（テスタ
ーDNAサンプル中の）標的DNA配列の富化がもたらされ
る。アビジン／ビオチン・アフィニティークロマトグラ
フィーによって、ドライバーDNAから減法されたテスタ
ーDNAを分離した後、一本鎖標的DNAはPCRによって増幅
され、これを二本鎖としてクローン化可能にされる。こ
の新しい方法を用いて、Wieland等（87）は標的DNA配列
の100倍〜700倍の富化を達成している。このアプローチ
を採用すれば、CREFおよび２゜腫瘍由来のLNCaP・DNA−
CREFトランスフェクタントの両者に存在する共通の配列
を除去し、２゜腫瘍由来のLNCaP・DNA−CREFトランスフ
ェクタントのみに存在するAluリンクされた配列の富化
をもたらすことが可能である。これらAluリンクされた
配列は次いでPCRを用いて増幅され得、該遺伝子は、更
なる分析のために直接pUC18ベクター中にクローン化さ
れ得る。
ラムダザップ発現ベクターおよびポリクローナル抗体で
のプロービング LNCaP細胞と反応するポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体が、マウスの免疫感作に先立って、１゜
腫瘍由来のLLNCaP・DNA−CREFトランスフェクタントを
コートする高力価CREF抗血清を用いることによって開発
された。このアプローチ及びウサギの免疫感作を用い
て、１゜および２゜腫瘍由来のLNCaP・DNA−CREFトラン
スフェクタントおよびLNCaP細胞の表面に発現した抗原
とは反応するが、CREF細胞とは反応しないポリクローナ
ル抗体が生成されている。１゜および２゜腫瘍由来のLN
CaP・DNA−CREFトランスフェクタントおよびLNCaP細胞
からのcDNAライブラリーは、ラムダザップ発現ベクター
中に構築され、コロニーはポリクローナル抗体（ヤング
及びデービスにより記述されたように（88）してE.coli
抽出物に対して中和された（77）もの）でスクリーニン
グされる。略１×106個の組換ファージクローンを３〜
４回連続してポリクローナル抗体でスクリーニングし、
陽性クローンを得る。次いで、このcDNAをサブクローニ
ングし、先に述べたようにしてシーケンシングされる
（77,78）。このアプローチは、CREF細胞に導入されて
いるLNCaP腫瘍誘導遺伝子を同定し、クローニングする
ための別の代替えアプローチとしてのみ提供される。
おそらく、上記に概説した方法はLNCaP細胞中に存在
し、且つカルシウムに媒介されたDNA形質導入を介してC
REF細胞中に導入された指定の前立腺カルチノーマ腫瘍
誘導遺伝子もしくは腫瘍関連遺伝子の単離および同定を
もたらすであろうと思われる。
正常な前立腺、良性前立腺肥大（BPH）、前立腺カルチ
ノーマおよび骨への転移性腫瘍におけるLNCaP細胞に由
来する、形質導入された腫瘍誘導遺伝子の組織化および
発現 上記に説明した方法は、LNCaP細胞からCREF細胞へ導
入されて、形質導入された細胞の腫瘍発現型を媒介する
cDNAまたは遺伝子クローン（前立腺カルチノーマ腫瘍誘
導／関連（PCTI）遺伝子という）の単離をもたらす。一
旦同定されると、このクローンは、そのヒト前立腺カル
チノーマの発生における潜在的役割を決定するために用
いられる。これらの研究には、（ａ）正常ヒト前立腺、
BPHおよび（異なったグリーソン（Gleason）段階の）前
立腺カルチノーマ細胞ラインにおけるその発現の分析；
（ｂ）正常ヒト前立腺、BPH、（異なったグリーソン（G
leason）段階の）前立腺カルチノーマおよび骨への転移
性腫瘍からの一次組織におけるその発現の分析；および
（ｃ）相同性遺伝子がラット前立腺カルチノーマ細胞内
で発現するか否か、およびこの遺伝子の発現が異なった
程度の腫瘍形成能／転移能を示す細胞内で変化するか否
かの決定が含まれる。
前立腺カルチノーマ発生の異なった段階を示すヒト前立
腺細胞ラインにおけるPCTI遺伝子の発現 LNCaP・DNA形質導入腫瘍由来CREF細胞に由来するPCTI
遺伝子の、正常前立腺、BPHおよび前立腺カルチノーマ
細胞ライン（８）における組織化および発現が、先に説
明したようにして、サザン（6,71,74,75）およびノーザ
ンブロッティング分析（47,71）によって測定される。P
CTI遺伝子の組織化および発現は、追加の正常細胞ライ
ンおよび腫瘍由来細胞ラインにおいても測定される。こ
れらには、正常ヒト皮膚繊維芽細胞、表皮ケラチノサイ
ト、メラノサイト、乳房上皮細胞および結腸上皮細胞；
並びにサルコーマ、血液悪性腫瘍、メラノーマ、中枢神
経系腫瘍および種々のカルチノーマ（乳癌、結腸直腸癌
等）からの腫瘍由来細胞ラインが含まれる。ダンニング
ラット背側前立腺アデノカルチノーマ系（7,89）を含む
ラット前立腺モデル系は、PCTI遺伝子の機能的性質の決
定に有用であることが立証されるので、これらの系もま
た評価される。上記研究は、LNCaP・DNAを形質導入され
た腫瘍由来のCREF細胞から単離されたPCTI遺伝子の発現
の分布に関する情報を提供する。
前立腺カルチノーマ発生の異なった段階を表わす一次前
立腺組織におけるPCTI遺伝子の発現 PCTI遺伝子が、ヒト前立腺カルチノーマ細胞において
イン・ビボで発現するか否かを決定することが重要であ
る。RNAは、正常前立腺、BPH、種々のグリーソン段階の
前立腺カルチノーマ、並びに先に記述された技術（90）
を用いて骨に転移した前立腺カルチノーマから抽出され
る。これらのRNAは、PCTI遺伝子の発現レベルを測定す
るために、スロット−ブロット（90）及びノーザンブロ
ッティング（47）によって分析される。RNAの発現およ
び負荷を正規化するために、ブロットはグリセルアルデ
ヒド燐酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）で再ブロットされ
る。
PCTI遺伝子が一次前立腺組織において異なって発現し
たならば、この遺伝子はpGEM−４またはSKベクター中に
サブクローニングされ、その場でのハイブリダイゼーシ
ョンにより（91）、正常前立腺、BPHおよび前立腺カル
チノーマ組織からの凍結組織切片におけるPCTI遺伝子の
発現が測定される。特異的なヒトクロモソームを保持し
たゲッ歯類−ヒト・ハイブリッド及びサザンブロッティ
ング分析を用いることによって、研究は、ヒト・ゲノム
におけるPCTI遺伝子の染色体上での位置を決定するため
にも行なわれる（71）。
ヒト前立腺カルチノーマ（LNCaP）細胞から誘導されたP
CTI遺伝子の機能的研究 重要な問題は、CREF細胞内で発現した単離されたPCTI
遺伝子が腫瘍誘導遺伝子として機能し得るか否か、およ
び／または正常なヒト、ラット及びマウスの前立腺細胞
で発現されたときに該遺伝子が腫瘍誘導遺伝子として機
能し得るか否かである。研究はまた、ヒトBPH並びにヒ
ト、ラット及びマウスの前立腺カルチノーマ細胞の寒天
中での増殖及びヌードマウスにおける腫瘍形成によって
示されるように、PCTI遺伝子が発現型を変更し得るか否
かを決定するためにも行なわれる。前立腺カルチノーマ
の誘導において、PCTI遺伝子がras及びmycのような他の
癌遺伝子と共働し得るか否かを決定するための有用なモ
デル系は、トーマス等によって記述されたマウスの再構
築器官系である（92）。この系において、正常マウス前
立腺細胞におけるrasの発現は血管形成と組合わされた
形成異常をもたらし、mycはこれがなければ正常に発生
する前立腺の過形成を誘発し、またrasとmycとの組合わ
せは一次カルチノーマを誘発する（92）。
DNA形質転換および発現研究 最初に、PCTI遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子（およ
びネオマイシン耐性遺伝子を含む複製欠損レトロウイル
スベクター）を含む適切な哺乳類発現ベクター系に挿入
され、CREF細胞中に形質導入（またはレトロウイルスの
場合には感染）された。PCTI遺伝子を発現するこれらの
形質導入細胞が腫瘍を誘発すれば、この腫瘍は切除さ
れ、適切な遺伝子の存在を分析され（サザン分析）（1
4）、またその発現が分析される（ノーザン分析）（4
7）。また、PCTI遺伝子を発現する腫瘍由来のCREF細胞
が、その細胞表面に、上記で開発したMoAbsによって認
識されるTAAsを発現するか否かを決定することもでき
る。陽性の結果は、クローニングされた遺伝子が、LNCa
P細胞からCREF細胞へ公式に導入された腫瘍誘導遺伝子
エレメントであるとの仮定を支持する。
次に、正常なマウス、ラット及びヒトの前立腺細胞に
おけるPCTI遺伝子の発現が、部分的（不死）または完全
（ヌードマウスにおける固定非依存性（anchorage inde
pendence）および腫瘍形成能）な形質転換発現型を誘導
するか否かが決定される。これらの研究は、PCTI遺伝子
を適切な標的細胞中に形質導入し、G414耐性について選
択し、また個々のクローンを単離することによって行な
われる（93）。次いで、これらクローンは生物学的
（１）および分子的（14,47,93）に分析され、それらが
PCTI遺伝子を含み且つ発現するか否か、並びにそれらが
発現型の後天的変更を有しているか否かが決定される。
また、先に記述されたプロトコール（1,95）を用いて、
ヌードマウスにおけるこれら形質転換された前立腺細胞
の腫瘍形性能および転移能が決定される。PCTI遺伝子が
これら細胞を腫瘍形成状態および／または転移状態に進
行させ得るか否かを決定するために、同様の研究がヒト
BPH細胞において行なわれる。ダニングラットの前立腺
アデノカルチノーマ細胞およびヒト前立腺のカルチノー
マ細胞でPCTI遺伝子を発現させることによって、形質転
換細胞のヌードマウス内での腫瘍形成能および転移能の
調節におけるPCTI遺伝子の役割を、更に探求することが
可能である。PCTI遺伝子がそれ自身により、またはras
若しくはmycとの組合わせにより、再構築されたマウス
前立腺においてカルチノーマを誘導するか否かを決定す
るために、実験はまた、トンプソン等（92）によって記
述されたようにして行なわれる。上記のこれら研究は、
ヒト前立腺カルチノーマの発生におけるPCTI遺伝子の推
定される機能的役割に関する価値ある情報を提供する。
LNCaP・DNAを形質導入された腫瘍由来のCREF細胞に対し
て開発されたモノクローナル抗体（MoAbs）の特徴付け 腫瘍性の発現型は、組織学的タイプの異なる腫瘍に対
して特異的な新規な腫瘍関連抗原（TAA）サブセットの
表面発現によって特徴付けられることが多い。ある場合
には、腫瘍形成性の発現型を誘導する遺伝子エレメント
が、これら表面TAAsをもコードすることは可能である。
CREF細胞中に形質導入されたPCTI遺伝子と前立腺カルチ
ノーマ発現型の発現との間の直接的な関係があること
が、LNCaP細胞と反応するMoAbsを生成させるためにLNCa
P・DNAを形質導入された腫瘍由来のCREF細胞を使用でき
ることによって示唆される。LNCaP・DNAを形質導入され
た腫瘍由来のCREF細胞は、高度の特異的活性を有するCR
EFポリクローナル抗血清でコートされ、マウスに注射さ
れる。これら動物からの血清はLNCaP細胞と反応するポ
リクローナル抗体を含んでおり、またこれら動物からの
脾臓は、LNCaPおよびPC3を含むヒト前立腺カルチノーマ
細胞と特異的に反応するMoAbsを生成させるために用い
られた。これら同じMoAbsは、他の組織学的に異なるヒ
ト腫瘍からのDNAで形質転換されたCREFまたはCREF細胞
と交差反応せず、また正常なヒト皮膚繊維芽細胞、メラ
ノーマ、乳癌、グリア芽細胞腫多形または結腸直腸カル
チノーマとも反応しない。LNCaPとは反応するが、上記
に挙げたタイプの細胞またはPC3細胞とは交差反応しな
いMoAbsもまた、上記のアプローチを用いて単離されて
いる。
以前の研究においては、急性リンパ性白血病（ALL）
（96）または脾臓アデノカルチノーマ細胞ライン（HPA
F）（97）からのDNAを形質導入されたNIH 3T3細胞は、
形態学的に形質転換されたフォーカスを形成した。これ
らの形態学的に形質転換されたNIH 3T3細胞は、次い
で、NIH 3T3細胞とは反応しないが、組織学的に同一で
あるヒト組織細胞膜上のエピトープに結合するMoAbsを
開発するために用いられた。ALL−DNAで形質導入／形質
転換されたNIH 3T3由来のMoAbsの場合、ALL−DNAで形質
導入／形質転換されたNIH 3T3細胞、並びに新鮮なヒト
白血病細胞ライン、培養された白血病細胞ライン、Ｔ細
胞ラインおよび正常ヒト造血細胞（96）との反応性が観
察された。HPAF−DNAで形質導入／形質転換されたNIH 3
T3由来のMoAbsの場合は、HPAF細胞ライン、並びに別の
６個のヒト膵臓アデノカルチノーマ細胞ラインとの反応
性が見出だされた。これとは対照的に、HPAF−DNAで形
質導入／形質転換されたNIH 3T3由来のMoAbsは、リンパ
芽球腫瘍細胞ライン（ミエロイド（K562及びHL−60）、
Ｔ細胞ライン（CEM,MOLT及びRESKW3）、Ｂ細胞ライン
（SB,Daudi,WIL−２及びCALLA）、メラノーマ細胞ライ
ン、前立腺カルチノーマ細胞ラインまたは正常細胞ライ
ン（皮膚繊維芽細胞および正常膵臓）との交差反応性を
示さなかった。腫瘍由来のLNCaP・DNAで形質導入された
CREF細胞に対して生成されたMoAbsを用いて行なわれた
上記に記載のこれら実験および研究によって、以下のこ
とが示唆される：（ａ）ヒト腫瘍関連抗原は異種のマウ
ス細胞およびラット細胞内に導入されて発現され得る；
（ｂ）形質導入された細胞は、異なった組織タイプのヒ
ト組織と特異的かつ限定的な反応性を示すMoAbsを生成
させるために用いられ得る。腫瘍由来のLNCaP・DNAで形
質導入されたCREF細胞に対して生成されたMoAbsを、前
立腺カルチノーマの診断および最終的にはその治療のた
めの可能な手段とし更に特徴付けるために、以下に記載
する実験が計画される。
LNCaP細胞と反応するこの開発されたMoAbsは、先に既
述されたようにして特徴付けられる（98）。これらの研
究は、ホルマリン固定された正常ヒト細胞ライン（前立
腺上皮、結腸上皮、乳房上皮等）および腫瘍由来のヒト
細胞ライン（BPH、前立腺カルチノーマ、骨からの転移
性前立腺カルチノーマ、結腸直腸カルチノーマ、乳癌
等）とのMoAbsの反応性に関する、ELISAによる広範な分
析を含んでいる。下記の（ａ）〜（ｄ）を決定するため
に、先に記述されたようにして（98−100）追加の研究
が行なわれる：即ち、（ａ）該MoAbsと反応する抗原性
エピトープが培養液中に脱落されるか否か；（ｂ）生き
た透過性にされた正常前立腺細胞、BPH細胞および前立
腺カルチノーマ細胞における、FACS分析によるMoAbsの
発現；（ｃ）PAGEおよびウエスタンブロット分析を用い
た、MoAbsによって認識されるエピトープの分子量；
（ｄ）種々の酵素（フコシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、混合グリコシダーゼ、過ヨ
ウ素酸、マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及びプロテ
アーゼ）を用いた、MoAbsにより認識される抗原の生化
学的性質。MoAbsはまた、前立腺細胞タイプ及び追加の
細胞タイプの同定に関して、前立腺特異的抗原（PA）お
よびプロスタティック酸ホスファターゼ（PAP）MoAbsと
比較される。PAおよびPAPは前立腺癌の初期マーカとし
て有用ではないが、疾患の再発および治療応答のモニタ
ーには有用である。従って、どのようにしてMoAbsをこ
れら確立された免疫学的試薬と比較するか、並びに該Mo
Absにより認識されるエピトープが正常な前立腺、BPHお
よび／または前立腺カルチノーマ細胞に存在するか否か
を決定することは興味深いものである。
LNCaP・DNAで形質導入された腫瘍由来CREF細胞に対して
開発されたMoAbsの、ヒト組織に対する反応性スペクト
ル LNCaP・DNAで形質導入された腫瘍由来CREF細胞に対し
て開発されたMoAbsが、患者から得た前立腺カルチノー
マ組織上の抗原性エピトープを認識できるか否かを決定
することは重要である。従って、MoAbsが、正常な前立
腺、BPH、前立腺カルチノーマおよび前立腺カルチノー
マ転移を含む骨切片からの、凍結され且つホルマリン固
定／パラフィン埋設された組織における前立腺細胞を同
定できるか否かを確認するために、研究が行なわれる。
MoAbsが脱落した抗原性エピトープを検出できならば、
（異なったグリーソン度の）前立腺カルチノーマをもっ
た患者および骨に転移した前立腺カルチノーマをもった
患者からの尿、精液分泌物および血液サンプルがこれら
抗原を含んでいるかどうかが決定される。同様に、MoAb
sによって認識される抗原性エピトープの発現と前立腺
カルチノーマとの間に良好な相関が観察されるならば、
該MoAbsが、広範なスペクトルの追加の正常細胞および
腫瘍細胞（異なった組織起源のもの）と反応し得るか否
かを決定することができる。これら全ての研究のため
に、適切な比較対照試薬としてPAおよびPAPが用いられ
る。こらら研究は、開発されたMoAbsが、ヒトにおける
前立腺癌の診断に有用であり得るか否か、並びにPAおよ
びPAP・MoAbsに優る何等かの選択的利点を提供するか否
かを決定するために必要である。
LNCaP・DNAで形質導入された腫瘍由来CREF細胞に対して
開発されたMoAbsによって認識される、TAAsの潜在的機
能をアドレスするための生物学的研究 現在、LNCaP細胞からのCREF細胞中に導入されたTCTI
遺伝子の役割は知られていない。この問題へのアドレス
を開始するために、LNCaP細胞およびLNCaP・DNAで形質
導入された腫瘍由来CREF細胞がMoAbsでコートされ、単
層および／または寒天懸濁液中での増殖が変更するか否
かが決定される（94）。MoAbでコートされた細胞はま
た、ヌードマウスへ移植した後の腫瘍発生および増殖の
変化について評価される（97）。上記実験のための適切
な対照として、（ａ）PAおよびPAPでコートされた、LNC
aP細胞およびLNCaP・DNAで形質導入された腫瘍由来CREF
細胞、（ｂ）LNCaP細胞およびLNCaP・DNAで形質導入さ
れた腫瘍由来CREF細胞であって、これら細胞と結合しな
い高分子量メラノーマ関連抗体のような非反応製抗体と
共にインキュベートされた細胞について同様の研究が行
なわれる。何れかのMoAbsがヌードマウスにおけるLNCaP
細胞の腫瘍形成を抑制するならば、この研究は、該MoAb
sと反応する追加の前立腺カルチノーマに対するこれらM
oAbsの効果の評価を含むように拡大される。陰性の結果
は有益ではないが、前立腺カルチノーマ細胞でのMoAbs
による固定依存性増殖および／または腫瘍形成の抑制
は、PCTI遺伝子にコードされたTAAaとヒト前立腺カルチ
ノーマ細胞における形質転換状態との間に関係があるこ
とについての強力な証拠を与える。加えて、陽性の結果
が得られるならば、同定されたMoAbsは、前立腺癌の治
療のための毒素または高エネルギー放射性核種と結合さ
れた後に有用であることが立証され得る（102）。
結果および考察 ヒト前立腺カルチノーマ細胞ライン、LNCaP及びpSV2n
eoからのDNAを同時形質導入されたCREF細胞は、ヌード
マウスにおいて腫瘍を誘導する。１゜（第一形質導入）
および２゜（第二形質導入）の腫瘍由来CREF細胞は、ヒ
トAlu配列を含む。全ての腫瘍は、略7.5kbの共通のAlu
フラグメントに加えて、一見して独特のAluフラグメン
トを含む（図１）。この所見は、これらヒト前立腺カル
チノーマ細胞に由来する推定の腫瘍誘導遺伝子が、この
DNA配列に隣接して位置することを示唆する。ヒト前立
腺DNAを形質導入されたCREF細胞を注射したヌードマウ
スから誘導された１゜及び２゜腫瘍を用いて、腫瘍細胞
発現型を媒介する遺伝子を単離するために種々の戦略が
使用され得る。一つのアプローチは、１゜および２゜の
腫瘍由来CREFトランスフェクタントに見られるAlu陽性
シグナルに対応したDNAを用いて、EMBL3ファージ内のゲ
ノムDNAライブラリーを調製することである。次いで、A
lu陽性クローンが同定され、サブクローニングされ、ノ
ーザンブロッティングによってエキソンの存在が決定さ
れ得る。ノーザンブロット上の同じ大きさのRNAにハイ
ブリダイズするサブクローンは、シーケンシングによっ
て更に特徴付けられる。これらは、ゲノムライブラリー
又はcDNA・LNCaPライブラリーをスクリーニングするた
めのプローブとして使用され得る。第二のアプローチ
は、ポリメラーゼチェインリアクション（PRC）によっ
て、１゜および２゜腫瘍由来CREFトランス６トランスフ
ェクタントにおけるこれら配列に隣接したDNAを同定お
よび増幅するために、Alu特異性プローブを用いること
である。次に、これらの増幅されたDNA配列は発現ベク
ター系に直接クローニングされ、ヌードマウスにおける
腫瘍誘導能について試験される。第三のアプローチは、
CREF・NMT4細胞およびCREF−トランス６細胞から減法ラ
イブラリーを作製することである。更に別のアプローチ
は、CREF細胞内での腫瘍形成を媒介し、ヒトの前立腺カ
ルチノーマ発生に含まれ得るLNCaP細胞内の遺伝子を同
定し、クローニングするために用いられ得る。これらに
は、LNCaP・DNAをSau III AIで部分的に消化しするこ
と、30〜35kbのDNAを選択すること、及びゲノムneo発現
ベクター系内のゲノムライブラリーを製造することが含
まれる。次いで、これらDNAsはneo耐性のCREF細胞内に
形質導入され、腫瘍形成のためにプールされた細胞集団
をヌードマウスに注射する。上記戦略を用いて、LNCaP
細胞由来の推定される腫瘍誘導遺伝子を成功裡に同定お
よびクローニングできる可能性は高い。加えて、上記に
概説したアプローチは、CREEF−トランス６細胞中に形
質導入され発現されている他の特定のヒト悪性腫瘍から
の他の腫瘍誘導性遺伝子を同定し、クローニングするた
めにも用いられ得る。一旦同定されれば、LNCaPからの
この推定の腫瘍誘導性遺伝子（およびLNCaPおよび他の
腫瘍から得た他の同定された推定の腫瘍誘導性遺伝子）
は、次いで、ヒトの正常な前立腺、良性前立腺肥大およ
び異なったグリーソン段階の前立腺カルチノーマにおけ
るその組織化および発現を測定するためのプローブとし
て用いられ得る。LNCaP細胞からのこの腫瘍誘導性遺伝
子の、前立腺カルチノーマ細胞の転移の媒介における潜
在的役割もまたアドレスされ得る。
上記に示したように、腫瘍性発現型は屡々、腫瘍の異
なった組織学的タイプに特異的な新規腫瘍関連抗原（TA
A）サブセットの表面発現によって特徴付けられる。或
る場合には、腫瘍形成性発現型を誘導する遺伝子エレメ
ントは、これら特異的な細胞表面TAAsをもコードするこ
とが可能である。多くの場合、TAAsは直接的な腫瘍増殖
の抑制をもたらすMoAbに基づく治療のための適切な標的
であることが立証されている。腫瘍細胞発現型の誘導と
特異的TAAaの発現との間の可能な関係は、LNCaPで形質
導入された腫瘍由来のCREF−トランス６細胞（CREF・４
・NMT）を用いて直接に試験されている。CREF−トラン
ス６細胞に対して生成された高い特異的活性のポリクロ
ーナル抗体でコートされたCREF・４・NMT細胞をマウス
に注射することによって、CREF・４・NMT細胞およびLNC
aP細胞に発現した抗原と反応するポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体の両者が成功裡に生成された
（表１および図2,3,4）。
CREF−トランス６細胞は、CREF−トランス６細胞およ
びCREF 4 NMT細胞に対する免疫応答を行なった、ヒト起
源の細胞に対しては応答しなかった。対照的に、CREF−
トランス６でコートされたCREF 4 NMT細胞は、CREF 4 N
MT細胞、LNCaP細胞、ヒト結腸直腸カルチノーマ細胞（S
W480）およびヒト乳癌細胞（MCF−７）上の抗原を同定
するが、CREF−トランス６細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞
（WI−38）またはヒトメラノーマ細胞（HO−１）上の抗
原は同定しないポリクローナル抗体応答を生起した（表
１および図２）。マウスにCREF−トランス６でコートさ
れたCREF 4 NMT細胞を注射することにより製造されたポ
リクローナル抗体の、滴定分析による更なる特徴付けが
図３に示されている。ここに見られるように、抗CREF 4
NMTポリクローナル抗体はヒトの前立腺カルチノーマ細
胞ライン、乳癌細胞ラインおよび結腸直腸カルチノーマ
細胞ラインに結合することができる。次に、標準的な方
法によって、高力価CREF高血清でコートされたCREF 4 N
MTで過免疫された動物からMoAbsが生成された。図４に
示すように、これらのMoAbs（MoAb1.5.6及びMoAb5.3.1.
3）は、LNCaP並びに他のヒトカルチノーマとの良好な反
応性を有している。対照的に、これらのMoAbsはHO−１
細胞、WI−38細胞またはCREF細胞には結合しない。これ
らの結果は、LNCaP・DNAからCREF−トランス６細胞へ導
入された遺伝子が形質導入された細胞内で発現されてお
り、これらはヒト腫瘍DNAが単離された元の細胞と反応
するMoAbsを生成させるために使用され得ることを明瞭
に示している。
CREF−トランス６系は、他のヒト腫瘍細胞ライン並び
に一次ヒト腫瘍DNAサンプルからの腫瘍誘導性遺伝子の
発現について試験された。ヒト乳癌細胞ライン（T47
D）、ヒトグリア芽細胞腫多形（第IV段階の星細胞腫）
細胞ライン（GBM−18）、および一次腫瘍由来の一次ヒ
トグリア芽細胞腫多形（第IV段階の星細胞腫）DNAから
のヒト腫瘍形成発現型は、成功裡に導入された。CREF−
T47Dトランスフェクタントの場合、予想されたように、
CREF 4 NMT細胞に見出されるものとは大きさの異なるAl
u配列が検出された。加えて、特異的活性の高いCREF抗
血清を用いたこの抗体コーティング技術を使用すること
によって、T47D細胞並びにMCF−７細胞には結合する
が、SW480細胞、LNCaP細胞、HO−１細胞またはCREF細胞
には結合しないMoAb（4.2.6）が生成された（図５）。
動物をCREF−トランス６抗血清でコートされたCREF−T4
7D細胞に曝して生成された第二のMoAb（5.1.4）は、T47
D細胞およびMCF−７細胞のみならず、LNCaP細胞とも反
応する。これらの結果は、MoAb5.1.4によって認識され
るエピトープが乳癌細胞および前立腺カルチノーマでは
発現するが、SW480細胞またはHO−１細胞では同程度に
は発現しないことを示唆する。多数の細胞タイプをもっ
たこれらのMoAbs（並びにCREF 4 NMT細胞に対して生成
されたMoAbs1.5.6及び5.3.1.3）の更なる分析、並びに
切除された腫瘍組織の分析によって、これらMoAbsの特
異性および診断上の有用性が決定されるであろう。
まとめとして言えば、ヒト起源のTAAをコードする遺
伝子を同定し、免疫学的試薬を製造するための一般的な
方法が開発された。ヒト前立腺カルチノーマ細胞に結合
するポリクローナル及びMoAbsの両者を生成する能力に
よって、トランスフェクションによってCREF細胞内に導
入された腫瘍誘導遺伝子と、コードされたヒト遺伝子生
成物（TAAs）との関連が示唆された。加えて、CREF/形
質導入／モノクローナル抗体技術を用いるによって、HI
TOの乳癌およびグリア芽細胞腫多形を媒介し若しくはこ
れと関連する遺伝子が導入され、またヒト乳癌および他
のカルチノーマに発現する抗原を認識するポリクローナ
ル及びMoAbsが開発された。このCREF/形質導入／モノク
ローナル抗体技術はまた、クローン化されたヒト170,00
0分子量（Ｐ−糖蛋白）多薬剤耐性遺伝子を含めて、定
義された形質導入され発現された表面分子を同定するた
めにも用いられた。CREFおよびヒト腫瘍（乳癌及びグリ
ア芽細胞腫）細胞が、クローン化されたmdr−１遺伝子
で形質導入され、コルヒチン耐性について選択され、ま
たサザン及びノーザン分析によってmdr−１遺伝子の存
在および発現が夫々示された。次いで、これらの形質導
入されたCREF細胞は、MDR発現型を発現する形質導入さ
れたヒト乳癌細胞およびグリア芽細胞腫細胞において発
現されたＰ−糖蛋白と反応するMoAbsを生成させるため
に用いられた。
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upp:774s.
フロントページの続き (72)発明者 フィッシャー、ポール・ビー アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10583、スケアースデイル、ゴードン・ プレイス 15 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原を特
    異的に認識し、かつ結合する抗体を産生するハイブリド
    ーマ細胞株を調製する方法であって、 （ａ）CREF−トランス６細胞株（ATCC受付番号CRL1058
    4）、またはその子孫由来細胞のいずれかに、ヒト腫瘍
    細胞から単離された、該細胞の表面抗原をコードするDN
    A、および選択可能なもしくは同定可能な形質をコード
    するDNAを含むDNAを共形質導入し、 （ｂ）選択可能もしくは同定可能な形質を発現する形質
    挿入細胞を選択し、 （ｃ）そのようにして選択した形質導入細胞を回収し、 （ｄ）そのようにして回収した形質導入細胞を適当な第
    １のネズミ宿主に注入し、 （ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形質導入
    細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成する
    に有効な期間維持し、 （ｆ）得られた腫瘍をネズミ宿主から単離し、 （ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、 （ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞に、前記確立さ
    れた非ヒト非腫瘍形成細胞株に対して生成した抗血清を
    固相化し、 （ｉ）抗血清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、 （ｊ）得られた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト
    収容細胞と反応する血清を生成する宿主を同定し、 （ｋ）そのようにして同定された第２の宿主から脾臓を
    摘出し、 （ｌ）そのようにして摘出した脾臓からハイブリドーマ
    を調整し、および （ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ
    結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を回収す
    る、 ことを包含する方法。
  2. 【請求項２】確立された非ヒト非腫瘍形成細胞株が、CR
    EF−トランス６細胞株（ATCC受付番号CRL10584）である
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】ヒト腫瘍細胞が良性細胞、転移性細胞、細
    胞株LNCaP由来のヒト前立腺癌細胞、細胞株T47D由来の
    ヒト肺癌細胞、細胞株SW480由来のヒト結腸直腸癌細
    胞、細胞株GBM−18由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ス
    テージIV星状細胞腫）または一次腫瘍由来のヒトグリア
    芽細胞腫多形（ステージIV星状細胞腫）である請求項１
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】選択可能もしくは同定可能な形質をコード
    するDNAが抗生物質に対する耐性をコードするプラスミ
    ドDNAである請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】プラスミドDNAがpSV2−ネオを含む請求項
    ４に記載の方法。
  6. 【請求項６】抗生物質がG418である請求項５に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】適当な第２の宿主がネズミ宿主または非ヒ
    ト霊長類宿主である請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞表面抗原が腫瘍関連抗原、成長因子受
    容体、ウイルスがコードする表面発現抗原、癌遺伝子生
    成物によってコードされる抗原、表面エピトープ、正統
    な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、異常な複合薬
    剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表現型を介在
    する抗原、移転表現型を介在する抗原、腫瘍形成表現型
    を抑制する抗原、移転表現型を抑制する抗原である、特
    異的免疫学的エフェクター細胞によって認識される抗
    原、Ｔ細胞により認識される抗原、非特異的免疫学的エ
    フェクター細胞によって認識される抗原、または、マク
    ロファージ細胞もしくはナチュラルキラー細胞により認
    識される抗原である請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】ヒト腫瘍細胞に関する細胞表面抗原を特異
    的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体の製造方
    法であって、 （ａ）請求項１に記載の方法に従って、ハイブリドーマ
    を製造し、および （ｂ）そのようにして製造されたハイブリドーマからモ
    ノクローナル抗体を回収する、ことを包含する方法。
  10. 【請求項１０】ヒト腫瘍細胞に関する細胞表面抗原を特
    異的に認識し、かつ結合するポリクローナル抗体の調整
    方法であって、 （ａ）確立された非ヒト腫瘍細胞株であるCREF−トラン
    ス６細胞系（ATCC受付番号CRL10584）に、非腫瘍細胞か
    ら単離されたDNA、および選択可能なもしくは同定可能
    な形質をコードするDNAを含むDNAを共形質導入し、 （ｂ）選択可能もしくは同定可能な形質を発現する形質
    挿入細胞を選択し、 （ｃ）そのようにして選択した形質導入細胞を回収し、 （ｄ）そのようにして回収した形質導入細胞を適当な第
    １のネズミ宿主に注入し、 （ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形質導入
    細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成する
    に有効な期間維持し、 （ｆ）得られた腫瘍をネズミ宿主から単離し、 （ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、 （ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞に、前記確立さ
    れた非ヒト非腫瘍形成細胞系に対して生成した抗血清を
    固相化し、 （ｉ）抗血清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、 （ｊ）得られた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト
    収容細胞と反応する血清を生成する宿主を同定し、 （ｋ）そのようにして同定された第２の宿主からポリク
    ローナル抗体を回収する、 ことを包含する方法。
  11. 【請求項１１】ヒト腫瘍細胞が良性細胞、転移性細胞、
    細胞株LNCaP由来のヒト前立腺癌細胞、細胞株T47D由来
    のヒト肺癌細胞、細胞系SW480由来のヒト結腸直腸癌細
    胞、細胞株GBM−18由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ス
    テージIV星状細胞腫）または一次腫瘍由来のヒトグリア
    芽細胞腫多形（ステージIV星状細胞腫）である請求項10
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】選択可能もしくは同定可能な形質をコー
    ドするDNAが抗生物質に対する耐性をコードするプラス
    ミドDNAである請求項10に記載の方法。
  13. 【請求項１３】プラスミドDNAがpSV2−ネオを含む請求
    項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】抗生物質がG418である請求項13に記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】細胞表面抗原が腫瘍関連抗原、成長因子
    受容体、ウイルスがコードする表面発現抗原、癌遺伝子
    生成物によってコードされる抗原、表面エピトープ、正
    統な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、異常な複合
    薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表現型を介
    在する抗原、移転表現型を介在する抗原、腫瘍形成表現
    型を抑制する抗原、移転表現型を抑制する抗原である、
    特異的免疫学的エフェクター細胞によって認識される抗
    原、Ｔ細胞により認識される抗原、非特異的免疫学的エ
    フェクター細胞によって認識される抗原、またはマクロ
    ファージ細胞もしくはナチュラルキラー細胞により認識
    される抗原である請求項10に記載の方法。
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