JP3376357B2 - Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 - Google Patents
Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬Info
- Publication number
- JP3376357B2 JP3376357B2 JP2001060779A JP2001060779A JP3376357B2 JP 3376357 B2 JP3376357 B2 JP 3376357B2 JP 2001060779 A JP2001060779 A JP 2001060779A JP 2001060779 A JP2001060779 A JP 2001060779A JP 3376357 B2 JP3376357 B2 JP 3376357B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- tumor
- human
- cref
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【発明の背景】この出願は、1990年10月25日出願の米国
出願 SN.603,804 の一部継続出願であり、前記出願の内
容は参照することによりこの開示に組み込まれる。
出願 SN.603,804 の一部継続出願であり、前記出願の内
容は参照することによりこの開示に組み込まれる。
【０００２】この出願を通して、種々の刊行物が括弧付
きのアラビア数字で参照される。これらの刊行物の完全
な引用は明細書の最後、請求の範囲の直前に見出される
であろう。これらの刊行物の開示は、ここに記述され、
かつ請求される発明のなされた時点で当業者に知られて
いた当分野の状態をより完全に記述するために、参照す
ることによりそのままこの出願に組み込まれる。
きのアラビア数字で参照される。これらの刊行物の完全
な引用は明細書の最後、請求の範囲の直前に見出される
であろう。これらの刊行物の開示は、ここに記述され、
かつ請求される発明のなされた時点で当業者に知られて
いた当分野の状態をより完全に記述するために、参照す
ることによりそのままこの出願に組み込まれる。
【０００３】過去数年間にわたる研究は幾つかの仮説に
基づいている。（１）ヒト癌は、細胞遺伝形質の遺伝的
変化の結果として現われる。これらの遺伝的変化は、形
質転換状態の発現を調節する特定遺伝子の構造および／
または発現の直接変化を含み得る。腫瘍細胞表現型の遺
伝形質マーカーおよび潜在的な誘発因子には、特定の癌
遺伝子要素の活性化および／または腫瘍抑制因子要素の
欠損または不活性化が含まれる (1,2)。 （２）腫瘍の
表現型は、しばしば、異なる組織学的な型の腫瘍に特異
的であり、かつ同じ腫瘍組織型の患者において異なった
発現をし得る新規腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サブセットの
表面発現によって特徴付けられる。特定のサイトカイン
類を用いることにより特定のＴＡＡの発現のレベルを増
加させ、結果として、癌の治療に基づく診断の改善、映
像化および最終的に強化されたモノクローナル抗体（Ｍ
ｏＡｂ）を得ることができる (3-5)。（３）特定の腫瘍
に発現する特定のＴＡＡサブセットは患者自身の免疫系
では認識されないことがあり、そのため、患者が有効な
免疫応答の増加および腫瘍病変の破壊に対して無能力に
なる結果となる。この問題は、ＭｏＡｂ（特にヒトＭｏ
Ａｂ；霊長類ＭｏＡｂまたはキメラネズミＭｏＡｂ）の
外部からの適用、サイトカイン類および発現ベクター系
免疫賦活剤を用いた患者の免疫潜在力の増加および／ま
たは患者自身の腫瘍細胞を変性させてワクチンとして作
用させることにより解決することができる。（４）多く
の場合、腫瘍遺伝子表現型を含む遺伝要素は特定の細胞
表面ＴＡＡをコ−ドし得る。したがって、腫瘍遺伝子表
現型およびその対応ＴＡＡサブセットの両者を、ＤＮＡ
移送技術により適当なレシピエントに共に移送すること
が可能である。
基づいている。（１）ヒト癌は、細胞遺伝形質の遺伝的
変化の結果として現われる。これらの遺伝的変化は、形
質転換状態の発現を調節する特定遺伝子の構造および／
または発現の直接変化を含み得る。腫瘍細胞表現型の遺
伝形質マーカーおよび潜在的な誘発因子には、特定の癌
遺伝子要素の活性化および／または腫瘍抑制因子要素の
欠損または不活性化が含まれる (1,2)。 （２）腫瘍の
表現型は、しばしば、異なる組織学的な型の腫瘍に特異
的であり、かつ同じ腫瘍組織型の患者において異なった
発現をし得る新規腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サブセットの
表面発現によって特徴付けられる。特定のサイトカイン
類を用いることにより特定のＴＡＡの発現のレベルを増
加させ、結果として、癌の治療に基づく診断の改善、映
像化および最終的に強化されたモノクローナル抗体（Ｍ
ｏＡｂ）を得ることができる (3-5)。（３）特定の腫瘍
に発現する特定のＴＡＡサブセットは患者自身の免疫系
では認識されないことがあり、そのため、患者が有効な
免疫応答の増加および腫瘍病変の破壊に対して無能力に
なる結果となる。この問題は、ＭｏＡｂ（特にヒトＭｏ
Ａｂ；霊長類ＭｏＡｂまたはキメラネズミＭｏＡｂ）の
外部からの適用、サイトカイン類および発現ベクター系
免疫賦活剤を用いた患者の免疫潜在力の増加および／ま
たは患者自身の腫瘍細胞を変性させてワクチンとして作
用させることにより解決することができる。（４）多く
の場合、腫瘍遺伝子表現型を含む遺伝要素は特定の細胞
表面ＴＡＡをコ−ドし得る。したがって、腫瘍遺伝子表
現型およびその対応ＴＡＡサブセットの両者を、ＤＮＡ
移送技術により適当なレシピエントに共に移送すること
が可能である。
【０００４】上記仮説の多くを直接試験する研究が過去
数年間行なわれ、いまや多くの仮定が正当であると認め
られている。初期の試験例の１つには、ヒト前立腺癌分
化の遺伝的および免疫学的基礎の研究が含まれている。
数年間行なわれ、いまや多くの仮定が正当であると認め
られている。初期の試験例の１つには、ヒト前立腺癌分
化の遺伝的および免疫学的基礎の研究が含まれている。
【０００５】前立腺癌は、現在成人男性における最も普
通の癌であり、かつ55才をこえる男性の癌死の主な原因
である (6)。ヒトの寿命が延びるに伴い、前立腺癌分化
の発生および前立腺癌細胞による（特に骨への）転移能
力の獲得が解決されずにいる(7)。前立腺癌の公知の癌
遺伝子の発現における一定の変化を示そうとする試み(8
-10) は不成功に終わっている。同様に、カルシウム介
在ＤＮＡ形質導入により、前立腺癌または前立腺癌細胞
系のいずれかにおける優性フォーカス形成もしくは腫瘍
誘発遺伝子を示そうとする従来の試みは、限られた成功
のみを示す結果に終わった (9)。前立腺癌から単離され
たＤＮＡの形質導入の後ＮＩＨ-3Ｔ3 細胞に出現した形
質転換フォーカスの分析は、活性化された Ki-ras 癌遺
伝子の存在を示した (9)。
通の癌であり、かつ55才をこえる男性の癌死の主な原因
である (6)。ヒトの寿命が延びるに伴い、前立腺癌分化
の発生および前立腺癌細胞による（特に骨への）転移能
力の獲得が解決されずにいる(7)。前立腺癌の公知の癌
遺伝子の発現における一定の変化を示そうとする試み(8
-10) は不成功に終わっている。同様に、カルシウム介
在ＤＮＡ形質導入により、前立腺癌または前立腺癌細胞
系のいずれかにおける優性フォーカス形成もしくは腫瘍
誘発遺伝子を示そうとする従来の試みは、限られた成功
のみを示す結果に終わった (9)。前立腺癌から単離され
たＤＮＡの形質導入の後ＮＩＨ-3Ｔ3 細胞に出現した形
質転換フォーカスの分析は、活性化された Ki-ras 癌遺
伝子の存在を示した (9)。
【０００６】これらの結果は、ヒト前立腺癌における癌
遺伝子の活性化、少なくともＮＩＨ-3Ｔ3 におけるＤＮ
Ａ形質導入アッセイによって検出された活性化は、前立
腺癌においては頻発する出来事ではないことを示唆して
いる。しかしながら、高分子量ヒト前立腺癌ＤＮＡ（Ｌ
ＮＣａＰ細胞系由来）および優性バクテリア抗生物質耐
性遺伝子（dominant acting bacterial antibiotic res
istance gene）を用いるヌードマウスへのＤＮＡ共形質
導入（cotransfection）手順、それに続く腫瘍誘発を利
用することにより、腫瘍遺伝子表現型が確立ラット胚線
維芽細胞系、ＣＲＥＦに成功裡に移植された (14) 。こ
れら推定の上での前立腺癌形質転換遺伝子は、イン・ビ
トロにおけるＣＲＥＦ細胞中でフォーカスを形成しない
だけではなく、ＮＩＨ-3Ｔ3 細胞において試みられた同
様の形質導入／腫瘍形成によっても検出することができ
ない。ヒト反復（Ａｌｕ）配列および共通分子量のＡｌ
ｕ断片を含有する腫瘍由来ＣＲＥＦ形質導入体（transf
ectant）が、一次および独立した二次腫瘍由来ＣＲＥＦ
形質導入体の両者で同定された。 加えて、ヌードマウ
ス腫瘍由来ＬＮＣａＰ ＤＮＡ形質導入ＣＲＥＦ細胞も
また、ＬＮＣａＰ細胞の表面と反応するポリクローナル
およびモノクローナル抗体の両者の生成に用いられるヒ
ト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現することが見出され
た。これらの観察は、以下の仮説を支持する：（Ａ）Ｌ
ＮＣａＰ細胞は、ＣＲＥＦには移入して発現させること
ができるがＮＩＨ-3Ｔ3 細胞にはそれができない優性腫
瘍誘発遺伝子を含む；（Ｂ）一次および二次形質導入体
における共通のＡｌｕ断片の存在は、ＬＮＣａＰ細胞か
らＣＲＥＦ細胞に移入された遺伝子がこの配列に物理的
に結合し、その存在をこの腫瘍誘発遺伝的要素の単離お
よびクローニングの手段として用いることができる；お
よび（Ｃ）ＬＮＣａＰ細胞と特異的に相互作用する（か
つメラノーマ、肺癌、正常ヒト皮膚線維芽細胞およびＣ
ＲＥＦ細胞を含む他のヒト腫瘍とは相互作用しない）モ
ノクローナル抗体の生成に用いることができる、一次お
よび二次腫瘍由来ＣＲＥＦ形質導入体の表面のＴＡＡの
存在は、この推定の上での腫瘍誘発前立腺癌遺伝子とＬ
ＮＣａＰ細胞の形質転換表現型の発現との間の潜在的な
関係をさらに示唆している。
遺伝子の活性化、少なくともＮＩＨ-3Ｔ3 におけるＤＮ
Ａ形質導入アッセイによって検出された活性化は、前立
腺癌においては頻発する出来事ではないことを示唆して
いる。しかしながら、高分子量ヒト前立腺癌ＤＮＡ（Ｌ
ＮＣａＰ細胞系由来）および優性バクテリア抗生物質耐
性遺伝子（dominant acting bacterial antibiotic res
istance gene）を用いるヌードマウスへのＤＮＡ共形質
導入（cotransfection）手順、それに続く腫瘍誘発を利
用することにより、腫瘍遺伝子表現型が確立ラット胚線
維芽細胞系、ＣＲＥＦに成功裡に移植された (14) 。こ
れら推定の上での前立腺癌形質転換遺伝子は、イン・ビ
トロにおけるＣＲＥＦ細胞中でフォーカスを形成しない
だけではなく、ＮＩＨ-3Ｔ3 細胞において試みられた同
様の形質導入／腫瘍形成によっても検出することができ
ない。ヒト反復（Ａｌｕ）配列および共通分子量のＡｌ
ｕ断片を含有する腫瘍由来ＣＲＥＦ形質導入体（transf
ectant）が、一次および独立した二次腫瘍由来ＣＲＥＦ
形質導入体の両者で同定された。 加えて、ヌードマウ
ス腫瘍由来ＬＮＣａＰ ＤＮＡ形質導入ＣＲＥＦ細胞も
また、ＬＮＣａＰ細胞の表面と反応するポリクローナル
およびモノクローナル抗体の両者の生成に用いられるヒ
ト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現することが見出され
た。これらの観察は、以下の仮説を支持する：（Ａ）Ｌ
ＮＣａＰ細胞は、ＣＲＥＦには移入して発現させること
ができるがＮＩＨ-3Ｔ3 細胞にはそれができない優性腫
瘍誘発遺伝子を含む；（Ｂ）一次および二次形質導入体
における共通のＡｌｕ断片の存在は、ＬＮＣａＰ細胞か
らＣＲＥＦ細胞に移入された遺伝子がこの配列に物理的
に結合し、その存在をこの腫瘍誘発遺伝的要素の単離お
よびクローニングの手段として用いることができる；お
よび（Ｃ）ＬＮＣａＰ細胞と特異的に相互作用する（か
つメラノーマ、肺癌、正常ヒト皮膚線維芽細胞およびＣ
ＲＥＦ細胞を含む他のヒト腫瘍とは相互作用しない）モ
ノクローナル抗体の生成に用いることができる、一次お
よび二次腫瘍由来ＣＲＥＦ形質導入体の表面のＴＡＡの
存在は、この推定の上での腫瘍誘発前立腺癌遺伝子とＬ
ＮＣａＰ細胞の形質転換表現型の発現との間の潜在的な
関係をさらに示唆している。
【０００７】要約すると、遺伝子を同定し、ヒト起源の
ＴＡＡをコ−ドする免疫学的試薬を製造する一般的な方
法が開発された。ＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナル
抗体技術を用いることにより、本発明者は、ヒト肺癌お
よびグリア芽細胞腫多形を介在もしくはこれに関連する
遺伝子の移入、およびヒト肺癌および他の癌で発現する
抗原を認識するポリクローナルおよびＭｏＡｂの両者の
開発を成し遂げた。ＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナ
ル抗体技術は、分子量 170,000のクローン化ヒト（P-糖
蛋白質）複合薬剤耐性遺伝子を含む、定義され、形質導
入され、かつ発現した表面分子の同定にも用いられる。
ＣＲＥＦおよびヒト腫瘍（肺癌およびグリア芽細胞腫）
細胞にクローン化ｍｄｒ-1を形質導入し、コルヒチン耐
性で選択して、ｍｄｒ-1遺伝子の存在および発現をそれ
ぞれサザーンおよびノーザン分析により示した。次い
で、これらの形質導入ＣＲＥＦ細胞を、ＭＤＲ表現型を
発現する形質導入ヒト肺およびグリア芽細胞腫細胞に発
現するP-糖蛋白質と反応するＭｏＡｂの生成に用いた。
ＴＡＡをコ−ドする免疫学的試薬を製造する一般的な方
法が開発された。ＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナル
抗体技術を用いることにより、本発明者は、ヒト肺癌お
よびグリア芽細胞腫多形を介在もしくはこれに関連する
遺伝子の移入、およびヒト肺癌および他の癌で発現する
抗原を認識するポリクローナルおよびＭｏＡｂの両者の
開発を成し遂げた。ＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナ
ル抗体技術は、分子量 170,000のクローン化ヒト（P-糖
蛋白質）複合薬剤耐性遺伝子を含む、定義され、形質導
入され、かつ発現した表面分子の同定にも用いられる。
ＣＲＥＦおよびヒト腫瘍（肺癌およびグリア芽細胞腫）
細胞にクローン化ｍｄｒ-1を形質導入し、コルヒチン耐
性で選択して、ｍｄｒ-1遺伝子の存在および発現をそれ
ぞれサザーンおよびノーザン分析により示した。次い
で、これらの形質導入ＣＲＥＦ細胞を、ＭＤＲ表現型を
発現する形質導入ヒト肺およびグリア芽細胞腫細胞に発
現するP-糖蛋白質と反応するＭｏＡｂの生成に用いた。
【０００８】
【発明の要約】この発明は、遺伝子を同定し、かつヒト
起源の細胞表面抗原をコ−ドする免疫学的試薬を製造す
るための一般的な方法を提供する。
起源の細胞表面抗原をコ−ドする免疫学的試薬を製造す
るための一般的な方法を提供する。
【０００９】具体的には、この発明は、ヒト腫瘍細胞に
関連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合する
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を調製する方法を
提供する。この方法は、（ａ）確立された非ヒト非腫瘍
形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞から単離されたＤＮＡおよ
び選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤＮ
Ａを共形質導入し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な
形質を発現する形質導入細胞を選択し、 （ｃ）そのよ
うにして選択した形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのよ
うにして回収した形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿
主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入
した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫
瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍
を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして
単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして
得られた腫瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成
細胞系に対して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血
清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得ら
れた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と
反応する血清を生成する宿主を同定し、（ｋ）そのよう
にして同定された第２の宿主から脾臓を摘出し、（ｌ）
そのようにして摘出した脾臓からハイブリドーマを調製
し、および（ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認
識し、かつ結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を回収する、ことを包含する。
関連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合する
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を調製する方法を
提供する。この方法は、（ａ）確立された非ヒト非腫瘍
形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞から単離されたＤＮＡおよ
び選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤＮ
Ａを共形質導入し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な
形質を発現する形質導入細胞を選択し、 （ｃ）そのよ
うにして選択した形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのよ
うにして回収した形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿
主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入
した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫
瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍
を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして
単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして
得られた腫瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成
細胞系に対して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血
清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得ら
れた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と
反応する血清を生成する宿主を同定し、（ｋ）そのよう
にして同定された第２の宿主から脾臓を摘出し、（ｌ）
そのようにして摘出した脾臓からハイブリドーマを調製
し、および（ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認
識し、かつ結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を回収する、ことを包含する。
【００１０】この発明はまた、ヒト腫瘍細胞に関連する
細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するモノクロ
ーナル抗体の製造方法をも提供する。この方法は、上記
方法に従ってハイブリドーマを製造し、そのように製造
されたハイブリドーマからモノクローナル抗体を回収す
ることを包含する。
細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するモノクロ
ーナル抗体の製造方法をも提供する。この方法は、上記
方法に従ってハイブリドーマを製造し、そのように製造
されたハイブリドーマからモノクローナル抗体を回収す
ることを包含する。
【００１１】この発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞に関連
する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するポリ
クローナル抗体の調製方法を提供する。この方法は、
（ａ）確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に、ヒト腫瘍
細胞から単離されたＤＮＡおよび選択可能なもしくは同
定可能な形質をコ−ドするＤＮＡを共形質導入し、
（ｂ）選択可能もしくは同定可能な形質を発現する形質
導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選択した形質
導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして回収した形質
導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注入し、（ｅ）得
られた第１のネズミ宿主を、注入した形質導入細胞が誘
発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成するに有効な
期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１のネズミ宿主か
ら単離し、（ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍
細胞を得、（ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞に、
前記確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に対して生成し
た抗血清を固相化し、（ｉ）抗血清固相化細胞を適当な
第２の宿主に注入し、（ｊ）得られた第２の宿主をスク
リーニングして、ヒト腫瘍細胞と反応する血清を生成す
る宿主を同定し、および（ｋ）そのようにして同定した
第２の宿主からポリクローナル抗体を回収する、ことを
包含する。
する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するポリ
クローナル抗体の調製方法を提供する。この方法は、
（ａ）確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に、ヒト腫瘍
細胞から単離されたＤＮＡおよび選択可能なもしくは同
定可能な形質をコ−ドするＤＮＡを共形質導入し、
（ｂ）選択可能もしくは同定可能な形質を発現する形質
導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選択した形質
導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして回収した形質
導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注入し、（ｅ）得
られた第１のネズミ宿主を、注入した形質導入細胞が誘
発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形成するに有効な
期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１のネズミ宿主か
ら単離し、（ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍
細胞を得、（ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞に、
前記確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に対して生成し
た抗血清を固相化し、（ｉ）抗血清固相化細胞を適当な
第２の宿主に注入し、（ｊ）得られた第２の宿主をスク
リーニングして、ヒト腫瘍細胞と反応する血清を生成す
る宿主を同定し、および（ｋ）そのようにして同定した
第２の宿主からポリクローナル抗体を回収する、ことを
包含する。
【００１２】加えて、この発明は、被検体における腫瘍
の状態を診断する方法であって、被検体からの試料を、
抗体が腫瘍の状態に関連する細胞表面抗原を特異的に認
識し、かつ結合することが可能な条件下で、検出可能な
マーカーで標識した上記いずれかの抗体と接触させ、抗
原に結合した抗体の存在を検出し、およびそれにより腫
瘍の状態を診断することを包含する方法を提供する。
の状態を診断する方法であって、被検体からの試料を、
抗体が腫瘍の状態に関連する細胞表面抗原を特異的に認
識し、かつ結合することが可能な条件下で、検出可能な
マーカーで標識した上記いずれかの抗体と接触させ、抗
原に結合した抗体の存在を検出し、およびそれにより腫
瘍の状態を診断することを包含する方法を提供する。
【００１３】この方法はまた、腫瘍状態を治療する方法
であって、腫瘍状態に関連するヒト腫瘍細胞を、治療剤
が選択的にヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するような条件下
で、治療剤で標識した上記いずれかの抗体と接触させる
ことを包含する方法を提供する。
であって、腫瘍状態に関連するヒト腫瘍細胞を、治療剤
が選択的にヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するような条件下
で、治療剤で標識した上記いずれかの抗体と接触させる
ことを包含する方法を提供する。
【００１４】この発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞の像を
形成する方法であって、像を形成させようとするヒト腫
瘍細胞を、抗体が腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原を特
異的に認識し、かつ結合することが可能な条件下で、像
形成剤で標識した上記いずれかの抗体と接触させ、それ
らに結合した像形成剤を検出して腫瘍細胞の像を形成す
る方法を提供する。
形成する方法であって、像を形成させようとするヒト腫
瘍細胞を、抗体が腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原を特
異的に認識し、かつ結合することが可能な条件下で、像
形成剤で標識した上記いずれかの抗体と接触させ、それ
らに結合した像形成剤を検出して腫瘍細胞の像を形成す
る方法を提供する。
【００１５】この発明はまた、ヒト腫瘍細胞に関連する
細胞表面抗原をコ−ドするＤＮＡを調製する方法を提供
する。この方法は、（ａ）ＣＲＥＦ- トランス6 （CREF
-trans 6）細胞系にヒト腫瘍細胞から単離したＤＮＡお
よび選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤ
ＮＡを共形質導入し、（ｂ）選択可能なもしくは同定可
能な形質を発現する形質導入細胞を選択し、（ｃ）その
ようにして選択された形質導入細胞を回収し、（ｄ）そ
のようにして回収された形質導入細胞を適当な第１のネ
ズミ宿主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主
を、注入した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿
主内に腫瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得ら
れた腫瘍を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのよ
うにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、および（ｈ）
そのようにして得られた腫瘍細胞から、ヒト腫瘍細胞に
関連する細胞表面抗原をコ−ドするＤＮＡを回収する、
ことを包含する。
細胞表面抗原をコ−ドするＤＮＡを調製する方法を提供
する。この方法は、（ａ）ＣＲＥＦ- トランス6 （CREF
-trans 6）細胞系にヒト腫瘍細胞から単離したＤＮＡお
よび選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤ
ＮＡを共形質導入し、（ｂ）選択可能なもしくは同定可
能な形質を発現する形質導入細胞を選択し、（ｃ）その
ようにして選択された形質導入細胞を回収し、（ｄ）そ
のようにして回収された形質導入細胞を適当な第１のネ
ズミ宿主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主
を、注入した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿
主内に腫瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得ら
れた腫瘍を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのよ
うにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、および（ｈ）
そのようにして得られた腫瘍細胞から、ヒト腫瘍細胞に
関連する細胞表面抗原をコ−ドするＤＮＡを回収する、
ことを包含する。
【００１６】最後に、この発明は、被検体における腫瘍
状態の診断法であって、被検体からの試料を、ＤＮＡプ
ローブが腫瘍状態に関連するＤＮＡとハイブリダイズ可
能な条件下で、検出可能なマーカーで標識したＤＮＡプ
ローブと接触させ、ハイブリダイズしたＤＮＡの存在を
検出して腫瘍状態を診断する方法を提供する。
状態の診断法であって、被検体からの試料を、ＤＮＡプ
ローブが腫瘍状態に関連するＤＮＡとハイブリダイズ可
能な条件下で、検出可能なマーカーで標識したＤＮＡプ
ローブと接触させ、ハイブリダイズしたＤＮＡの存在を
検出して腫瘍状態を診断する方法を提供する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】発明の詳細な説明この発
明は、遺伝子を同定し、ヒト起源の細胞表面抗原をコ−
ドする免疫学的試薬を製造する一般法を提供する。
明は、遺伝子を同定し、ヒト起源の細胞表面抗原をコ−
ドする免疫学的試薬を製造する一般法を提供する。
【００１８】とりわけ、この発明は、ヒト腫瘍細胞に関
連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合する抗
体を産生するハイブリドーマ細胞系を調製する方法を提
供する。この方法は、 （ａ）確立された非ヒト非腫瘍
形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞から単離されたＤＮＡおよ
び選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤＮ
Ａを共形質導入し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な
形質を発現する形質導入細胞を選択し、 （ｃ）そのよ
うにして選択した形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのよ
うにして回収した形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿
主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入
した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫
瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍
を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして
単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして
得られた腫瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成
細胞系に対して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血
清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得ら
れた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と
反応する血清を生成する宿主を同定し、（ｋ）そのよう
にして同定した第２の宿主から脾臓を摘出し、（ｌ）そ
のようにして摘出した脾臓からハイブリドーマを調製
し、および（ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認
識し、かつ結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を回収する、ことを包含する。
連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合する抗
体を産生するハイブリドーマ細胞系を調製する方法を提
供する。この方法は、 （ａ）確立された非ヒト非腫瘍
形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞から単離されたＤＮＡおよ
び選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤＮ
Ａを共形質導入し、（ｂ）選択可能もしくは同定可能な
形質を発現する形質導入細胞を選択し、 （ｃ）そのよ
うにして選択した形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのよ
うにして回収した形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿
主に注入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入
した形質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫
瘍を形成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍
を第１のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして
単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、（ｈ）そのようにして
得られた腫瘍細胞に、前記確立された非ヒト非腫瘍形成
細胞系に対して生成した抗血清を固相化し、（ｉ）抗血
清固相化細胞を適当な第２の宿主に注入し、（ｊ）得ら
れた第２の宿主をスクリーニングして、ヒト腫瘍細胞と
反応する血清を生成する宿主を同定し、（ｋ）そのよう
にして同定した第２の宿主から脾臓を摘出し、（ｌ）そ
のようにして摘出した脾臓からハイブリドーマを調製
し、および（ｍ）そこから、細胞表面抗原を特異的に認
識し、かつ結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を回収する、ことを包含する。
【００１９】ここでは、確立された非ヒト非腫瘍形成細
胞系は、非ヒトのいかなる確立細胞系であってもよく、
形質転換および腫瘍形成表現型を示さず、結合および非
結合鎖の両者からなる外来ＤＮＡを効率的に取り込み、
かつ組み込み得るものである。この発明の好ましい態様
においては、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系はＣＲ
ＥＦ- トランス6 細胞系であり、この細胞系は、ＡＴＣ
Ｃ受付番号ＣＲＬ 10584でアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション、Rockville 、Maryland、20852 、
U.S.A.に寄託されている。これは、特許手続上の微生物
の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の要求に従
い、これを満足して寄託された。
胞系は、非ヒトのいかなる確立細胞系であってもよく、
形質転換および腫瘍形成表現型を示さず、結合および非
結合鎖の両者からなる外来ＤＮＡを効率的に取り込み、
かつ組み込み得るものである。この発明の好ましい態様
においては、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系はＣＲ
ＥＦ- トランス6 細胞系であり、この細胞系は、ＡＴＣ
Ｃ受付番号ＣＲＬ 10584でアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション、Rockville 、Maryland、20852 、
U.S.A.に寄託されている。これは、特許手続上の微生物
の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の要求に従
い、これを満足して寄託された。
【００２０】ヒト腫瘍細胞は、良性もしくは転移性のど
のようなヒト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト
腫瘍細胞系またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一
次腫瘍であっても）由来であってもよい。この発明の一
態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系ＬＮＣａＰ由来
のヒト前立腺癌細胞である。この発明の他の態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｔ47Ｄ由来のヒト肺癌細胞
である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞
は細胞系ＳＷ 480由来のヒト結腸直腸癌細胞である。こ
の発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｇ
ＢＭ-18 由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星
状細胞腫）である。この発明のさらに別の態様において
は、ヒト腫瘍細胞は一次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫
多形（ステージIV星状細胞腫）である。
のようなヒト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト
腫瘍細胞系またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一
次腫瘍であっても）由来であってもよい。この発明の一
態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系ＬＮＣａＰ由来
のヒト前立腺癌細胞である。この発明の他の態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｔ47Ｄ由来のヒト肺癌細胞
である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞
は細胞系ＳＷ 480由来のヒト結腸直腸癌細胞である。こ
の発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｇ
ＢＭ-18 由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星
状細胞腫）である。この発明のさらに別の態様において
は、ヒト腫瘍細胞は一次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫
多形（ステージIV星状細胞腫）である。
【００２１】ここでは、選択可能なもしくは同定可能な
形質をコ−ドするＤＮＡは、選択可能なもしくは同定可
能な形質をコ−ドするいかなるＤＮＡでもよい。この発
明の一態様においては、選択可能なもしくは同定可能な
形質をコ−ドするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコ
−ドするプラスミドＤＮＡである。この発明の好ましい
態様においては、このプラスミドＤＮＡはｐＳＶ2-ネオ
を含み、抗生物質はＧ418 である。
形質をコ−ドするＤＮＡは、選択可能なもしくは同定可
能な形質をコ−ドするいかなるＤＮＡでもよい。この発
明の一態様においては、選択可能なもしくは同定可能な
形質をコ−ドするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコ
−ドするプラスミドＤＮＡである。この発明の好ましい
態様においては、このプラスミドＤＮＡはｐＳＶ2-ネオ
を含み、抗生物質はＧ418 である。
【００２２】ここでは、適当な第２の宿主は、ネズミ宿
主または非ヒトの霊長類宿主であり得る。
主または非ヒトの霊長類宿主であり得る。
【００２３】この発明の目的のためには、ヒト腫瘍細胞
に関連する細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であ
ってもよい。以下の例に限定されるものではないが、細
胞表面抗原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイル
スがコ−ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によって
コ−ドされる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異
常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表
現型を介在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍
形成表現型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗
原、Ｔ細胞のような特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原およびマクロファージ細胞もしく
はナチュラルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフ
ェクター細胞によって認識される抗原であり得る。この
発明の好ましい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関
連抗原である。
に関連する細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であ
ってもよい。以下の例に限定されるものではないが、細
胞表面抗原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイル
スがコ−ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によって
コ−ドされる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異
常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表
現型を介在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍
形成表現型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗
原、Ｔ細胞のような特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原およびマクロファージ細胞もしく
はナチュラルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフ
ェクター細胞によって認識される抗原であり得る。この
発明の好ましい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関
連抗原である。
【００２４】ハイブリドーマ細胞系を、当業者に公知の
方法を用いて回収することができる。この発明はまた、
上述の方法に従って製造されるハイブリドーマ細胞系を
提供する。
方法を用いて回収することができる。この発明はまた、
上述の方法に従って製造されるハイブリドーマ細胞系を
提供する。
【００２５】工程（ａ）ないし（ｇ）を繰り返してさら
なる腫瘍細胞、すなわち、二次形質導入体、三次形質導
入体等を得ることが可能であることもこの発明の範囲内
である。
なる腫瘍細胞、すなわち、二次形質導入体、三次形質導
入体等を得ることが可能であることもこの発明の範囲内
である。
【００２６】この発明は、さらに、ヒト腫瘍細胞に関連
する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するモノ
クローナル抗体の製造方法を提供する。この方法は、上
述の方法に従ってハイブリドーマを製造し、そのように
して製造されたハイブリドーマからモノクローナル抗体
を回収することを含む。
する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するモノ
クローナル抗体の製造方法を提供する。この方法は、上
述の方法に従ってハイブリドーマを製造し、そのように
して製造されたハイブリドーマからモノクローナル抗体
を回収することを含む。
【００２７】この発明の目的のために、当業者に公知の
方法によってモノクローナル抗体を回収することができ
る。
方法によってモノクローナル抗体を回収することができ
る。
【００２８】この発明の方法はまた、上述の方法に従っ
て製造されたモノクローナル抗体を提供する。
て製造されたモノクローナル抗体を提供する。
【００２９】この発明はまた、ヒト腫瘍細胞に関連する
細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するポリクロ
ーナル抗体の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）
確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞か
ら単離されたＤＮＡおよび選択可能なもしくは同定可能
な形質をコ−ドするＤＮＡを共形質導入し、（ｂ）選択
可能もしくは同定可能な形質を発現する形質導入細胞を
選択し、（ｃ）そのようにして選択した形質導入細胞を
回収し、（ｄ）そのようにして回収した形質導入細胞を
適当な第１のネズミ宿主に注入し、（ｅ）得られた第１
のネズミ宿主を、注入した形質導入細胞が誘発されて第
１のネズミ宿主内に腫瘍を形成するに有効な期間維持
し、 （ｆ）得られた腫瘍を第１のネズミ宿主から単離
し、（ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を
得、（ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞に、前記確
立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に対して生成した抗血
清を固相化し、（ｉ）抗血清固相化細胞を適当な第２の
宿主に注入し、（ｊ）得られた第２の宿主をスクリーニ
ングして、ヒト腫瘍細胞と反応する血清を生成する宿主
を同定し、および（ｋ）そのようにして同定した第２の
宿主からポリクローナル抗体を回収する、ことを包含す
る。
細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するポリクロ
ーナル抗体の調製方法を提供する。この方法は、（ａ）
確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に、ヒト腫瘍細胞か
ら単離されたＤＮＡおよび選択可能なもしくは同定可能
な形質をコ−ドするＤＮＡを共形質導入し、（ｂ）選択
可能もしくは同定可能な形質を発現する形質導入細胞を
選択し、（ｃ）そのようにして選択した形質導入細胞を
回収し、（ｄ）そのようにして回収した形質導入細胞を
適当な第１のネズミ宿主に注入し、（ｅ）得られた第１
のネズミ宿主を、注入した形質導入細胞が誘発されて第
１のネズミ宿主内に腫瘍を形成するに有効な期間維持
し、 （ｆ）得られた腫瘍を第１のネズミ宿主から単離
し、（ｇ）そのようにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を
得、（ｈ）そのようにして得られた腫瘍細胞に、前記確
立された非ヒト非腫瘍形成細胞系に対して生成した抗血
清を固相化し、（ｉ）抗血清固相化細胞を適当な第２の
宿主に注入し、（ｊ）得られた第２の宿主をスクリーニ
ングして、ヒト腫瘍細胞と反応する血清を生成する宿主
を同定し、および（ｋ）そのようにして同定した第２の
宿主からポリクローナル抗体を回収する、ことを包含す
る。
【００３０】この発明の目的のために、当業者に公知の
方法によってポリクローナル抗体を回収することができ
る。
方法によってポリクローナル抗体を回収することができ
る。
【００３１】ここで、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞
系は、非ヒトのいかなる確立細胞系であってもよく、形
質転換および腫瘍形成表現型を示さず、結合および非結
合鎖の両者からなる外来ＤＮＡを効率的に取り込み、か
つ組み込み得るものである。この発明の好ましい態様に
おいては、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系はＣＲＥ
Ｆ- トランス6 細胞系（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ 1058
4）である。
系は、非ヒトのいかなる確立細胞系であってもよく、形
質転換および腫瘍形成表現型を示さず、結合および非結
合鎖の両者からなる外来ＤＮＡを効率的に取り込み、か
つ組み込み得るものである。この発明の好ましい態様に
おいては、確立された非ヒト非腫瘍形成細胞系はＣＲＥ
Ｆ- トランス6 細胞系（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ 1058
4）である。
【００３２】ヒト腫瘍細胞は、良性もしくは転移性のど
のようなヒト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト
腫瘍細胞系またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一
次腫瘍であっても）由来であってもよい。この発明の一
態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系ＬＮＣａＰ由来
のヒト前立腺癌細胞である。この発明の他の態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｔ47Ｄ由来のヒト肺癌細胞
である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞
は細胞系ＳＷ 480由来のヒト結腸直腸癌細胞である。こ
の発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｇ
ＢＭ-18 由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星
状細胞腫）である。この発明のさらに別の態様において
は、ヒト腫瘍細胞は一次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫
多形（ステージIV星状細胞腫）である。
のようなヒト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト
腫瘍細胞系またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一
次腫瘍であっても）由来であってもよい。この発明の一
態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系ＬＮＣａＰ由来
のヒト前立腺癌細胞である。この発明の他の態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｔ47Ｄ由来のヒト肺癌細胞
である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞
は細胞系ＳＷ 480由来のヒト結腸直腸癌細胞である。こ
の発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｇ
ＢＭ-18 由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星
状細胞腫）である。この発明のさらに別の態様において
は、ヒト腫瘍細胞は一次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫
多形（ステージIV星状細胞腫）である。
【００３３】選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−
ドするＤＮＡは、選択可能なもしくは同定可能な形質を
コ−ドするいかなるＤＮＡでもよい。この発明の一態様
においては、選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−
ドするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコ−ドするプ
ラスミドＤＮＡである。この発明の好ましい態様におい
ては、このプラスミドＤＮＡはｐＳＶ2-ネオを含み、抗
生物質はＧ418 である。
ドするＤＮＡは、選択可能なもしくは同定可能な形質を
コ−ドするいかなるＤＮＡでもよい。この発明の一態様
においては、選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−
ドするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコ−ドするプ
ラスミドＤＮＡである。この発明の好ましい態様におい
ては、このプラスミドＤＮＡはｐＳＶ2-ネオを含み、抗
生物質はＧ418 である。
【００３４】ここでは、適当な第２の宿主は、ネズミ宿
主または非ヒトの霊長類宿主であり得る。
主または非ヒトの霊長類宿主であり得る。
【００３５】この発明の目的のためには、ヒト腫瘍細胞
に関連する細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であ
ってもよい。以下の例に限定されるものではないが、細
胞表面抗原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイル
スがコ−ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によって
コ−ドされる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異
常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表
現型を介在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍
形成表現型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗
原、Ｔ細胞のような特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原およびマクロファージ細胞もしく
はナチュラルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフ
ェクター細胞によって認識される抗原であり得る。この
発明の好ましい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関
連抗原である。
に関連する細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であ
ってもよい。以下の例に限定されるものではないが、細
胞表面抗原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイル
スがコ−ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によって
コ−ドされる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異
常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表
現型を介在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍
形成表現型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗
原、Ｔ細胞のような特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原およびマクロファージ細胞もしく
はナチュラルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフ
ェクター細胞によって認識される抗原であり得る。この
発明の好ましい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関
連抗原である。
【００３６】工程（ａ）ないし（ｇ）を繰り返してさら
なる腫瘍細胞、すなわち、二次形質導入体、三次形質導
入体等を得ることが可能であることもこの発明の範囲内
である。
なる腫瘍細胞、すなわち、二次形質導入体、三次形質導
入体等を得ることが可能であることもこの発明の範囲内
である。
【００３７】この発明はまた、上記方法に従って製造さ
れるポリクローナル抗体を提供する。
れるポリクローナル抗体を提供する。
【００３８】この発明はまた、検出可能なマーカーで標
識された上記モノクローナルまたはポリクローナル抗体
を提供する。ここで、検出可能なマーカーは当業者に公
知であり、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光体、発
色基、重金属または放射性同位体であり得るが、これら
に限定されるものではない。
識された上記モノクローナルまたはポリクローナル抗体
を提供する。ここで、検出可能なマーカーは当業者に公
知であり、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光体、発
色基、重金属または放射性同位体であり得るが、これら
に限定されるものではない。
【００３９】この発明はまた、被検体における腫瘍状態
の診断法であって、被検体からの試料を、抗体が腫瘍状
態に関連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合
することが可能な条件下で、検出可能なマーカーで標識
した上記いずれかの抗体と接触させ、抗原に結合した抗
体の存在を検出して腫瘍状態を診断する方法を提供す
る。
の診断法であって、被検体からの試料を、抗体が腫瘍状
態に関連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合
することが可能な条件下で、検出可能なマーカーで標識
した上記いずれかの抗体と接触させ、抗原に結合した抗
体の存在を検出して腫瘍状態を診断する方法を提供す
る。
【００４０】この発明はまた、治療剤で標識した上記モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供す
る。ここでは、この治療剤は当業者によく知られてお
り、抗生物質、インターフェロンのような抗ウイルス
剤、毒、放射性同位体、または化学療法剤であり得る
が、これらに限定されるものではない。
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供す
る。ここでは、この治療剤は当業者によく知られてお
り、抗生物質、インターフェロンのような抗ウイルス
剤、毒、放射性同位体、または化学療法剤であり得る
が、これらに限定されるものではない。
【００４１】この方法はまた、腫瘍状態を治療する方法
であって、腫瘍状態に関連するヒト腫瘍細胞を、治療剤
が選択的にヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するような条件下
で、治療剤で標識した上記いずれかの抗体と接触させる
ことを包含する方法を提供する。
であって、腫瘍状態に関連するヒト腫瘍細胞を、治療剤
が選択的にヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するような条件下
で、治療剤で標識した上記いずれかの抗体と接触させる
ことを包含する方法を提供する。
【００４２】この発明はまた、像形成剤で標識した上記
いずれかのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体を提供する。ここでは、像形成剤は当業者によく知ら
れたものであり、放射性同位体、ペルオキシダーゼもし
くはアルカリホスフェートのような色素もしくは酵素、
常磁性イオン、またはＸ線に不透明な元素であり得る
が、これらに限定されるものではない。 この発明はま
た、ヒト腫瘍細胞の像を形成する方法であって、像を形
成させようとするヒト腫瘍細胞を、抗体が腫瘍細胞に関
連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するこ
とが可能な条件下で、像形成剤で標識した上記いずれか
の抗体と接触させ、それらに結合した像形成剤を検出し
て腫瘍細胞の像を形成する方法を提供する。
いずれかのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体を提供する。ここでは、像形成剤は当業者によく知ら
れたものであり、放射性同位体、ペルオキシダーゼもし
くはアルカリホスフェートのような色素もしくは酵素、
常磁性イオン、またはＸ線に不透明な元素であり得る
が、これらに限定されるものではない。 この発明はま
た、ヒト腫瘍細胞の像を形成する方法であって、像を形
成させようとするヒト腫瘍細胞を、抗体が腫瘍細胞に関
連する細胞表面抗原を特異的に認識し、かつ結合するこ
とが可能な条件下で、像形成剤で標識した上記いずれか
の抗体と接触させ、それらに結合した像形成剤を検出し
て腫瘍細胞の像を形成する方法を提供する。
【００４３】ここでは、この像形成方法は、当業者に公
知の多くの像形成法のどのようなものでも、例えば、こ
れに限定されるものではないが、放射性同位体によって
放射される放射線を可視化する方法をも含むことができ
る。
知の多くの像形成法のどのようなものでも、例えば、こ
れに限定されるものではないが、放射性同位体によって
放射される放射線を可視化する方法をも含むことができ
る。
【００４４】加えて、この発明は、ヒト腫瘍細胞に関連
する細胞表面抗原をコ−ドするＤＮＡを調製する方法を
提供する。この方法は、（ａ）ＣＲＥＦ- トランス6 細
胞系にヒト腫瘍細胞から単離したＤＮＡおよび選択可能
なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤＮＡを共形質
導入し、（ｂ）選択可能なもしくは同定可能な形質を発
現する形質導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選
択された形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして
回収された形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注
入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形
質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形
成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１
のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして単離し
た腫瘍から腫瘍細胞を得、および（ｈ）そのようにして
得られた腫瘍細胞から、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表
面抗原をコ−ドするＤＮＡを回収する、ことを包含す
る。
する細胞表面抗原をコ−ドするＤＮＡを調製する方法を
提供する。この方法は、（ａ）ＣＲＥＦ- トランス6 細
胞系にヒト腫瘍細胞から単離したＤＮＡおよび選択可能
なもしくは同定可能な形質をコ−ドするＤＮＡを共形質
導入し、（ｂ）選択可能なもしくは同定可能な形質を発
現する形質導入細胞を選択し、（ｃ）そのようにして選
択された形質導入細胞を回収し、（ｄ）そのようにして
回収された形質導入細胞を適当な第１のネズミ宿主に注
入し、（ｅ）得られた第１のネズミ宿主を、注入した形
質導入細胞が誘発されて第１のネズミ宿主内に腫瘍を形
成するに有効な期間維持し、（ｆ）得られた腫瘍を第１
のネズミ宿主から単離し、（ｇ）そのようにして単離し
た腫瘍から腫瘍細胞を得、および（ｈ）そのようにして
得られた腫瘍細胞から、ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表
面抗原をコ−ドするＤＮＡを回収する、ことを包含す
る。
【００４５】さらなる腫瘍細胞、すなわち二次形質導入
体、三次形質導入体等を得るために、工程（ａ）ないし
（ｇ）を繰り返し得ることもこの発明の範囲である。
体、三次形質導入体等を得るために、工程（ａ）ないし
（ｇ）を繰り返し得ることもこの発明の範囲である。
【００４６】このＤＮＡの調製方法は、従来の方法に対
する改良である。なぜならば、この発明のこの側面は、
新規にクローン化したラット胚線維芽細胞系、特にＣＲ
ＥＦ- トランス6 細胞系を用いるためである。このＣＲ
ＥＦ- トランス6 細胞系は、腫瘍表現型を介在する遺伝
子の同定および少量の腫瘍組織を用いる細胞表面抗原発
現を可能にする。ＣＲＥＦ- トランス6 細胞系はまた、
腫瘍表現型および細胞表面発現の誘発に関連する遺伝子
の位置を記述する遺伝子マーカーとして機能するヒト反
復配列を容易に検出することを可能にする。加えて、Ｃ
ＲＥＦ細胞系由来の腫瘍細胞では、多くの公知癌遺伝子
の発現は観察されていない（21）。これは、この系が、
ヒト癌遺伝子の潜在的に新規のクラスの同定に用いられ
る可能性を肯定するものである。
する改良である。なぜならば、この発明のこの側面は、
新規にクローン化したラット胚線維芽細胞系、特にＣＲ
ＥＦ- トランス6 細胞系を用いるためである。このＣＲ
ＥＦ- トランス6 細胞系は、腫瘍表現型を介在する遺伝
子の同定および少量の腫瘍組織を用いる細胞表面抗原発
現を可能にする。ＣＲＥＦ- トランス6 細胞系はまた、
腫瘍表現型および細胞表面発現の誘発に関連する遺伝子
の位置を記述する遺伝子マーカーとして機能するヒト反
復配列を容易に検出することを可能にする。加えて、Ｃ
ＲＥＦ細胞系由来の腫瘍細胞では、多くの公知癌遺伝子
の発現は観察されていない（21）。これは、この系が、
ヒト癌遺伝子の潜在的に新規のクラスの同定に用いられ
る可能性を肯定するものである。
【００４７】そのようにして得られた腫瘍細胞からＤＮ
Ａを回収する方法には、当業者に公知の多くの単離、精
製およびＤＮＡクローニング法が含まれ得る。この方法
は、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションまたは伝統
的なファージ・クローニング技術でありうるが、これに
限定されるものではない。
Ａを回収する方法には、当業者に公知の多くの単離、精
製およびＤＮＡクローニング法が含まれ得る。この方法
は、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションまたは伝統
的なファージ・クローニング技術でありうるが、これに
限定されるものではない。
【００４８】ヒト腫瘍細胞は、良性もしくは転移性のど
のようなヒト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト
腫瘍細胞系またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一
次腫瘍であっても）由来であってもよい。この発明の一
態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系ＬＮＣａＰ由来
のヒト前立腺癌細胞である。この発明の他の態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｔ47Ｄ由来のヒト肺癌細胞
である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞
は細胞系ＳＷ 480由来のヒト結腸直腸癌細胞である。こ
の発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｇ
ＢＭ-18 由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星
状細胞腫）である。この発明のさらに別の態様において
は、ヒト腫瘍細胞は一次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫
多形（ステージIV星状細胞腫）である。
のようなヒト腫瘍細胞であってもよく、どのようなヒト
腫瘍細胞系またはどのような一次腫瘍（たとえ少量の一
次腫瘍であっても）由来であってもよい。この発明の一
態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系ＬＮＣａＰ由来
のヒト前立腺癌細胞である。この発明の他の態様におい
ては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｔ47Ｄ由来のヒト肺癌細胞
である。この発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞
は細胞系ＳＷ 480由来のヒト結腸直腸癌細胞である。こ
の発明の他の態様においては、ヒト腫瘍細胞は細胞系Ｇ
ＢＭ-18 由来のヒトグリア芽細胞腫多形（ステージIV星
状細胞腫）である。この発明のさらに別の態様において
は、ヒト腫瘍細胞は一次腫瘍由来のヒトグリア芽細胞腫
多形（ステージIV星状細胞腫）である。
【００４９】選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−
ドするＤＮＡは、選択可能なもしくは同定可能な形質を
コ−ドするいかなるＤＮＡでもよい。この発明の一態様
においては、選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−
ドするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコ−ドするプ
ラスミドＤＮＡである。この発明の好ましい態様におい
ては、このプラスミドＤＮＡはｐＳＶ2-ネオを含み、抗
生物質はＧ418 である。
ドするＤＮＡは、選択可能なもしくは同定可能な形質を
コ−ドするいかなるＤＮＡでもよい。この発明の一態様
においては、選択可能なもしくは同定可能な形質をコ−
ドするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコ−ドするプ
ラスミドＤＮＡである。この発明の好ましい態様におい
ては、このプラスミドＤＮＡはｐＳＶ2-ネオを含み、抗
生物質はＧ418 である。
【００５０】この発明の目的のためには、ヒト腫瘍細胞
に関連する細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であ
ってもよい。以下の例に限定されるものではないが、細
胞表面抗原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイル
スがコ−ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によって
コ−ドされる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異
常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表
現型を介在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍
形成表現型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗
原、Ｔ細胞のような特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原およびマクロファージ細胞もしく
はナチュラルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフ
ェクター細胞によって認識される抗原であり得る。この
発明の好ましい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関
連抗原である。
に関連する細胞表面抗原は、いかなる細胞表面抗原であ
ってもよい。以下の例に限定されるものではないが、細
胞表面抗原は、腫瘍関連抗原、成長因子受容体、ウイル
スがコ−ドする表面発現抗原、癌遺伝子生成物によって
コ−ドされる抗原、表面エピトープ、正統なもしくは異
常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパク質、腫瘍形成表
現型を介在する抗原、転移表現型を介在する抗原、腫瘍
形成表現型を抑制する抗原、転移表現型を抑制する抗
原、Ｔ細胞のような特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原およびマクロファージ細胞もしく
はナチュラルキラー細胞のような非特異的免疫学的エフ
ェクター細胞によって認識される抗原であり得る。この
発明の好ましい態様においては、細胞表面抗原は腫瘍関
連抗原である。
【００５１】この発明はまた、上記方法に従って調製さ
れるＤＮＡを提供する。
れるＤＮＡを提供する。
【００５２】この発明はまた、上記ＤＮＡとハイブリダ
イズし得るＤＮＡプローブを提供する。この発明はさら
に、検出可能なマーカーで標識された上記ＤＮＡプロー
ブを提供する。ここでは、検出可能なマーカーは当業者
によく知られたものであり、酵素、常磁性イオン、ビオ
チン、蛍光体、発色基、重金属または放射性同位体であ
り得るが、これらに限定されるものではない。
イズし得るＤＮＡプローブを提供する。この発明はさら
に、検出可能なマーカーで標識された上記ＤＮＡプロー
ブを提供する。ここでは、検出可能なマーカーは当業者
によく知られたものであり、酵素、常磁性イオン、ビオ
チン、蛍光体、発色基、重金属または放射性同位体であ
り得るが、これらに限定されるものではない。
【００５３】最後に、この発明は、被検体における腫瘍
状態の診断法であって、被検体からの試料を、ＤＮＡプ
ローブが腫瘍状態に関連するＤＮＡとハイブリダイズ可
能な条件下で、検出可能なマーカーで標識したＤＮＡプ
ローブと接触させ、ハイブリダイズしたＤＮＡの存在を
検出して腫瘍状態を診断する方法を提供する。プローブ
の存在は、腫瘍状態の検出を意味する。 この発明を、
以下の実験詳述項においてさらに説明する。この項は、
この発明の理解を目的に説明されるものであり、いかな
る点においても、後述の請求の範囲に記載される発明を
限定することを意図するものではなく、そのように解釈
されるべきものでもない。
状態の診断法であって、被検体からの試料を、ＤＮＡプ
ローブが腫瘍状態に関連するＤＮＡとハイブリダイズ可
能な条件下で、検出可能なマーカーで標識したＤＮＡプ
ローブと接触させ、ハイブリダイズしたＤＮＡの存在を
検出して腫瘍状態を診断する方法を提供する。プローブ
の存在は、腫瘍状態の検出を意味する。 この発明を、
以下の実験詳述項においてさらに説明する。この項は、
この発明の理解を目的に説明されるものであり、いかな
る点においても、後述の請求の範囲に記載される発明を
限定することを意図するものではなく、そのように解釈
されるべきものでもない。
【００５４】
【実施例】実験の詳細
材料および方法
CREF-trans 6細胞系 CREF-trans 6細胞系はフィシャ−
(Fisher)F2408 ラット胚細胞の特異的クロ−ンであるCR
EF細胞系のサブクロ−ンである(33)。低密度（50-100細
胞／6 cmプレ−ト）のCREF細胞をプレ−ト培養し、単細
胞からの連続したサブクローンを単離することによりCR
EF-trans 6細胞系を開発した。Ha-ras (T24)オンコジ−
ンによるトランスフェクションに引き続く形態的な形質
転換能力についてこれらのCREFのサブクロ−ン（CREF-T
rans 1から20 まで同定）をテストした。更に、クロ−
ンされたネオマイシン耐性遺伝子（pSV2neo)によってト
ランスフェクトし、G418含有培地での成育用に選択した
サブクロ−ンについては、抗生物質耐性菌コロニ−を形
成する能力についても分析した。CREF-Trans 6は親また
は他のCREF−Trans サブクロ−ンよりT24 による形質転
換に対するセンシテイビテイが高く、ネオマイシン耐性
を発現させるCREFの特異的なサブクロ−ンである。
EF細胞系のサブクロ−ンである(33)。低密度（50-100細
胞／6 cmプレ−ト）のCREF細胞をプレ−ト培養し、単細
胞からの連続したサブクローンを単離することによりCR
EF-trans 6細胞系を開発した。Ha-ras (T24)オンコジ−
ンによるトランスフェクションに引き続く形態的な形質
転換能力についてこれらのCREFのサブクロ−ン（CREF-T
rans 1から20 まで同定）をテストした。更に、クロ−
ンされたネオマイシン耐性遺伝子（pSV2neo)によってト
ランスフェクトし、G418含有培地での成育用に選択した
サブクロ−ンについては、抗生物質耐性菌コロニ−を形
成する能力についても分析した。CREF-Trans 6は親また
は他のCREF−Trans サブクロ−ンよりT24 による形質転
換に対するセンシテイビテイが高く、ネオマイシン耐性
を発現させるCREFの特異的なサブクロ−ンである。
【００５５】その他の細胞系 LN-CaP細胞系はヒト前立
腺がん腫より派生した。T47D細胞系はヒト胸部がん腫よ
り派生した。GBM -18 はヒト多形神経膠芽細胞（第４ス
テ−ジ星状細胞腫）より派生した。またヒト多神経膠芽
細胞（第４ステ−ジ多形）原始腫瘍から派生したもあっ
た。SW480 細胞系はヒト結腸直腸がん腫より派生した。
MCF-7 細胞系はヒト乳がんより派生した。Colo38細胞系
はヒトメラノ−マより派生した。HO-I細胞系はヒトメラ
ノ−マより派生した。これらの細胞系は当業者が公に入
手可能である。
腺がん腫より派生した。T47D細胞系はヒト胸部がん腫よ
り派生した。GBM -18 はヒト多形神経膠芽細胞（第４ス
テ−ジ星状細胞腫）より派生した。またヒト多神経膠芽
細胞（第４ステ−ジ多形）原始腫瘍から派生したもあっ
た。SW480 細胞系はヒト結腸直腸がん腫より派生した。
MCF-7 細胞系はヒト乳がんより派生した。Colo38細胞系
はヒトメラノ−マより派生した。HO-I細胞系はヒトメラ
ノ−マより派生した。これらの細胞系は当業者が公に入
手可能である。
【００５６】抗血清の調製 BALB/c雌マウス(8乃至 10
週齢) をCREF-Trans 6細胞で過剰免疫化した。マウスに
(1) ０日目に完全なフロイント(Freund)のアジュバント
(1:1)による擦過細胞の皮下注射（ＳＣ）を一回； (2)
７日目に不完全なフロイント(Freund)のアジュバント
(1:1) により擦過細胞の皮下注射 （ＳＣ）を一回;
(3)14 日目および21日目ハンクスのバランス塩溶液中の
擦過細胞の腹膜内注射（ｉｐ）を二回行なった。マウス
の後部眼かより出血させ収集された血清について抗CREF
活性をエリザ法でテストした。CREF細胞を(1) 96穴ミク
ロタイタ−プレ−トで集密に近い状態まで成育させ;
(2)3.7%のホルムアルデヒドPBS ( 溶液) で、室温にて
５分間の細胞固定を行い、10% の正常山羊血清で細胞を
封鎖し; (3) 抗血清の細胞に対するタイタ−を順次希釈
液を使用して２時間、37℃で計測し；(4) ホ−スラデイ
ッシュ パ−オキシダ−ゼを接合した山羊抗マウスIg第
二抗体(GX MIg-HRP) を使用し、60分、37℃で結合を検
出し；(5) 過酸化水素水存在下で色素源を添加し、ポジ
テイブ結合が呈する色変化をスペクトロフォトメ−タ−
で定量した。上記手段の採用より、高度力価の血清(1:3
200 - 1:6400) を21日目までに得、力価1:100 の血清を
初期実験においてCREF-Trans 6細胞を被覆するために使
用し、二番目に高い力価の血清を後続実験に使用した。
週齢) をCREF-Trans 6細胞で過剰免疫化した。マウスに
(1) ０日目に完全なフロイント(Freund)のアジュバント
(1:1)による擦過細胞の皮下注射（ＳＣ）を一回； (2)
７日目に不完全なフロイント(Freund)のアジュバント
(1:1) により擦過細胞の皮下注射 （ＳＣ）を一回;
(3)14 日目および21日目ハンクスのバランス塩溶液中の
擦過細胞の腹膜内注射（ｉｐ）を二回行なった。マウス
の後部眼かより出血させ収集された血清について抗CREF
活性をエリザ法でテストした。CREF細胞を(1) 96穴ミク
ロタイタ−プレ−トで集密に近い状態まで成育させ;
(2)3.7%のホルムアルデヒドPBS ( 溶液) で、室温にて
５分間の細胞固定を行い、10% の正常山羊血清で細胞を
封鎖し; (3) 抗血清の細胞に対するタイタ−を順次希釈
液を使用して２時間、37℃で計測し；(4) ホ−スラデイ
ッシュ パ−オキシダ−ゼを接合した山羊抗マウスIg第
二抗体(GX MIg-HRP) を使用し、60分、37℃で結合を検
出し；(5) 過酸化水素水存在下で色素源を添加し、ポジ
テイブ結合が呈する色変化をスペクトロフォトメ−タ−
で定量した。上記手段の採用より、高度力価の血清(1:3
200 - 1:6400) を21日目までに得、力価1:100 の血清を
初期実験においてCREF-Trans 6細胞を被覆するために使
用し、二番目に高い力価の血清を後続実験に使用した。
【００５７】CREF-Trans 6細胞系のコトランスフェクシ
ョン 受容体CREF細胞のDNA トランスフェクションはHMW-DNA
が切断され6 乃至 25キロベ−スペア−のDNA 断片を形
成した以外は上述の様に行われた(22, 45, 47)。この改
変法は結果としてリン酸カルシウム介在DNA トランスフ
ェクションによってある種の細胞遺伝子を有効にトラン
スファ−し、HMW-DNA のトランスフェクションの際にし
ばしば遭遇する毒性を減少させる傾向をうむ(11)。DNA
はフェノ−ル抽出法使用により細胞系から単離する(14,
37) 。HMW-DNA を16- 口径( ゲ−ジ) の針を持つ注射器
に繰り返し通すことで切断し、アガロ−スジェルの電気
泳動でサイズ分別した(36)。次ぎにHMW-DNA をpSV2-Neo
DNAと混合した(HMW-DNA:NeoプラスミドDNA が20乃至40
μg:1 μg)。リン酸カルシウム沈殿物として最終DNA の
20乃至40μg を1 乃至2X10６ のCREF-Trans細胞中に添
加した(22, 45, 47)。CREF-Trans細胞をリン酸カルシウ
ムDNA 沈殿物と４時間培養した後、過剰DNA 沈殿物を除
去した。培養物をグリセロ−ル（15容量% のグリセロ−
ルPBS 溶液）で短時処理し、トリプシン／バ−ゼン(ver
sene) で素早く懸濁し、10 cm のプレ−トあたり5 x 10
６，、10５，、および 2.5 x10５ で再プレ−トした。
ョン 受容体CREF細胞のDNA トランスフェクションはHMW-DNA
が切断され6 乃至 25キロベ−スペア−のDNA 断片を形
成した以外は上述の様に行われた(22, 45, 47)。この改
変法は結果としてリン酸カルシウム介在DNA トランスフ
ェクションによってある種の細胞遺伝子を有効にトラン
スファ−し、HMW-DNA のトランスフェクションの際にし
ばしば遭遇する毒性を減少させる傾向をうむ(11)。DNA
はフェノ−ル抽出法使用により細胞系から単離する(14,
37) 。HMW-DNA を16- 口径( ゲ−ジ) の針を持つ注射器
に繰り返し通すことで切断し、アガロ−スジェルの電気
泳動でサイズ分別した(36)。次ぎにHMW-DNA をpSV2-Neo
DNAと混合した(HMW-DNA:NeoプラスミドDNA が20乃至40
μg:1 μg)。リン酸カルシウム沈殿物として最終DNA の
20乃至40μg を1 乃至2X10６ のCREF-Trans細胞中に添
加した(22, 45, 47)。CREF-Trans細胞をリン酸カルシウ
ムDNA 沈殿物と４時間培養した後、過剰DNA 沈殿物を除
去した。培養物をグリセロ−ル（15容量% のグリセロ−
ルPBS 溶液）で短時処理し、トリプシン／バ−ゼン(ver
sene) で素早く懸濁し、10 cm のプレ−トあたり5 x 10
６，、10５，、および 2.5 x10５ で再プレ−トした。
【００５８】選別可能または認識指標特質を発現するト
ランスフェクトされた細胞の選別 プレ−ト後48時間で
培地をG418(500μg/ml）を含有する培地で置換した(36,
45)。選択培地を週二回取換え、Neo Ｒ のコロニ−が
7 日乃至14日以内に検出できる。
ランスフェクトされた細胞の選別 プレ−ト後48時間で
培地をG418(500μg/ml）を含有する培地で置換した(36,
45)。選択培地を週二回取換え、Neo Ｒ のコロニ−が
7 日乃至14日以内に検出できる。
【００５９】被トランスフェクト細胞の回収およびマウ
スへの注入 各々のプレ−トからの培養細胞培養が適宜
な数に増殖したら、各々の選別G418選択プレ−トから細
胞がプ−ルされ10６ をヌ−ドマウスに皮下注射した。
スへの注入 各々のプレ−トからの培養細胞培養が適宜
な数に増殖したら、各々の選別G418選択プレ−トから細
胞がプ−ルされ10６ をヌ−ドマウスに皮下注射した。
【００６０】腫瘍細胞の単離および提供 被トランスフ
ェクト細胞の注射で培養期間8 週間でマウスに腫瘍が発
生したら、腫瘍を除去し、細胞培養中に再投入する。細
胞は酵素によらない分離かあるいはプレ−トからのラバ
−ポリスマン(a rubber policeman)による剥離によって
除去された。再懸濁液をHanks BSS で洗浄し、最小量の
Hanks BSS で再懸濁した。
ェクト細胞の注射で培養期間8 週間でマウスに腫瘍が発
生したら、腫瘍を除去し、細胞培養中に再投入する。細
胞は酵素によらない分離かあるいはプレ−トからのラバ
−ポリスマン(a rubber policeman)による剥離によって
除去された。再懸濁液をHanks BSS で洗浄し、最小量の
Hanks BSS で再懸濁した。
【００６１】腫瘍細胞の抗血清による被覆 通常CREF-T
rans 6細胞で発現する抗原の免疫応答を阻止するため、
腫瘍からの腫瘍細胞をマウスに注入する前に、高力価の
抗マウス-CREF-Trans 6 抗血清で被覆した。再懸濁細胞
(1乃至2.5 X10 ６ ) をM X CREF抗血清と濃度1:100(抗
血清: 細胞) で混合し、室温、６時間で培養するかある
いは４℃で一晩振盪培養した。
rans 6細胞で発現する抗原の免疫応答を阻止するため、
腫瘍からの腫瘍細胞をマウスに注入する前に、高力価の
抗マウス-CREF-Trans 6 抗血清で被覆した。再懸濁細胞
(1乃至2.5 X10 ６ ) をM X CREF抗血清と濃度1:100(抗
血清: 細胞) で混合し、室温、６時間で培養するかある
いは４℃で一晩振盪培養した。
【００６２】抗血清被覆細胞のマウスへの注入 BALB/c
雌マウス(8乃至10 週齢) にアジュバント併用あるいは
無併用で一ケ 月以上、抗血清被覆細胞を繰返しip注入
した。
雌マウス(8乃至10 週齢) にアジュバント併用あるいは
無併用で一ケ 月以上、抗血清被覆細胞を繰返しip注入
した。
【００６３】悪性細胞による血清反応性宿主のスクリ−
ニング 上述のように免疫化されプ−ルされたマウスの
血液と多種細胞；例えば、CREF-Trans 6, CREF 4-NMT(L
NCaP DNAでトランスフェクトされたもの), LNCaP( ヒト
前立腺がん腫細胞系), SW480( ヒト結腸直腸がん腫細胞
系), MCF-7( ヒト乳がん腫細胞系）, HO-1( ヒトメラノ
−マ細胞系), Colo38 ヒトメラノ−マ細胞系),およびヒ
ト皮膚繊維芽細胞、との結合性についてエリザ法でテス
トした。適宜なヒト腫瘍細胞と反応性を持つ血清を有す
と確認された動物を使用し、標準法によりMoAbs を産生
させた。
ニング 上述のように免疫化されプ−ルされたマウスの
血液と多種細胞；例えば、CREF-Trans 6, CREF 4-NMT(L
NCaP DNAでトランスフェクトされたもの), LNCaP( ヒト
前立腺がん腫細胞系), SW480( ヒト結腸直腸がん腫細胞
系), MCF-7( ヒト乳がん腫細胞系）, HO-1( ヒトメラノ
−マ細胞系), Colo38 ヒトメラノ−マ細胞系),およびヒ
ト皮膚繊維芽細胞、との結合性についてエリザ法でテス
トした。適宜なヒト腫瘍細胞と反応性を持つ血清を有す
と確認された動物を使用し、標準法によりMoAbs を産生
させた。
【００６４】モノクロ−ナル抗体の産生 MoAbs の産生
に利用される方法はヒトTAAs(50),HLA抗原(51), タイプ
５アデノウイルスで形質転換したスプラグ−ダウリ−(S
prague-Dawley)ラットの胚細胞(52), Ｘ線形質転換C3H-
10T 1/2 細胞(53), 神経膠芽細胞(neu) オンコジ−ンを
有し、発現するNIH-3T3 のトランスフェクタントに対す
るMoAbs の産生させた前述の方法と同様である。免疫化
したマウスから調製されたひ臓細胞は、ポリエチレング
リコ−ル(PEG) の存在下、ケ−ラ−とマイルスタイン(K
ohler and Milstein) の方法に若干の改変を加えた方法
で、非分泌性の骨髄細胞NSI とハイブリダイズし、融合
後24時間して、ハイブリッド細胞を選別するためハイブ
リドクロ−ンを96穴プレ−トのHAT 培地の再プレ−トし
た。増殖したハイブリッドクロ−ンを含むマイクロタイ
タ−の穴中の上澄液を採集し、多種のタ−ゲット細胞;
例えば、第３次、第２次LN-CAP-CREF トランスフェクタ
ントおよび正常CREF細胞に対する抗体活性をテストし
た。初期スクリ−ニングでは、タ−ゲット細胞が少量で
済み、時間を消費しないという理由で、寺崎プレ−ト１
２５ I-タンパクＡバインデイングアッセイ(55)を使用
した。他のアッセイ、例えば酵素結合免疫アッセイも使
用できる。下記の初期スクリ−ニングはLN-CAP-CREF ト
ランスフェクタントと特異的に反応するハイブリド−マ
培養上澄液を多種のタ−ゲット細胞; たとえばヒト前立
腺がん腫細胞系DU-145, PC-3, ２種のヒトメラノ−マ細
胞系(Colo38 および HO-1), Ｂリンパ芽球細胞系(WIL-
2),ヒト皮膚繊維芽細胞, 他のウイルス( タイプ５アデ
ノウイルス、ウシ胎児パピロ−マウイルスタイプ１およ
びHa-ras）によってのCREF-Trans 6細胞, に対する特異
性について再テストした。ヒト前立腺がん腫細胞系に対
して特異的な抗体を分泌するハイブリド−マは即座に少
なくとも５回、限られた希釈度で、サブクロ−ンされ
る。目的の最終ハイブリド−マクロ−ン、即ち、ヒト前
立腺がん腫細胞TAAsと特異的に反応する抗体を生産する
ものをin-vitroの大量培養で増殖させるかまたはイン・
ビボでpristane primed 同系マウスの腹水として増殖さ
せる。目的の抗体は被トランスフェクトCREF細胞上ある
いはヒト前立腺がん腫瘍細胞で発現した前立腺がん誘起
抗原の生化学的特徴を明らかにするために使用される。
に利用される方法はヒトTAAs(50),HLA抗原(51), タイプ
５アデノウイルスで形質転換したスプラグ−ダウリ−(S
prague-Dawley)ラットの胚細胞(52), Ｘ線形質転換C3H-
10T 1/2 細胞(53), 神経膠芽細胞(neu) オンコジ−ンを
有し、発現するNIH-3T3 のトランスフェクタントに対す
るMoAbs の産生させた前述の方法と同様である。免疫化
したマウスから調製されたひ臓細胞は、ポリエチレング
リコ−ル(PEG) の存在下、ケ−ラ−とマイルスタイン(K
ohler and Milstein) の方法に若干の改変を加えた方法
で、非分泌性の骨髄細胞NSI とハイブリダイズし、融合
後24時間して、ハイブリッド細胞を選別するためハイブ
リドクロ−ンを96穴プレ−トのHAT 培地の再プレ−トし
た。増殖したハイブリッドクロ−ンを含むマイクロタイ
タ−の穴中の上澄液を採集し、多種のタ−ゲット細胞;
例えば、第３次、第２次LN-CAP-CREF トランスフェクタ
ントおよび正常CREF細胞に対する抗体活性をテストし
た。初期スクリ−ニングでは、タ−ゲット細胞が少量で
済み、時間を消費しないという理由で、寺崎プレ−ト１
２５ I-タンパクＡバインデイングアッセイ(55)を使用
した。他のアッセイ、例えば酵素結合免疫アッセイも使
用できる。下記の初期スクリ−ニングはLN-CAP-CREF ト
ランスフェクタントと特異的に反応するハイブリド−マ
培養上澄液を多種のタ−ゲット細胞; たとえばヒト前立
腺がん腫細胞系DU-145, PC-3, ２種のヒトメラノ−マ細
胞系(Colo38 および HO-1), Ｂリンパ芽球細胞系(WIL-
2),ヒト皮膚繊維芽細胞, 他のウイルス( タイプ５アデ
ノウイルス、ウシ胎児パピロ−マウイルスタイプ１およ
びHa-ras）によってのCREF-Trans 6細胞, に対する特異
性について再テストした。ヒト前立腺がん腫細胞系に対
して特異的な抗体を分泌するハイブリド−マは即座に少
なくとも５回、限られた希釈度で、サブクロ−ンされ
る。目的の最終ハイブリド−マクロ−ン、即ち、ヒト前
立腺がん腫細胞TAAsと特異的に反応する抗体を生産する
ものをin-vitroの大量培養で増殖させるかまたはイン・
ビボでpristane primed 同系マウスの腹水として増殖さ
せる。目的の抗体は被トランスフェクトCREF細胞上ある
いはヒト前立腺がん腫瘍細胞で発現した前立腺がん誘起
抗原の生化学的特徴を明らかにするために使用される。
【００６５】抗体使用による特異的抗原の確認 前述の
方法を使用する生化学的分析をするため、特異的抗原を
ヒト前立腺がん腫細胞から単離するために目的のMoAbs
が使用される。最初に、MoAbs によって認識されるエピ
ト−プを内含する分子の性質、即ち蛋白であるか、糖脂
質であるかを決定するために単純な実験が実施される。
蛋白あるいは糖脂質抗原を確認するために、ラジオイム
ノ沈殿アッセイを(56,57) 使用する。 １ ２５I で標識
した細胞からあるいは３５S-メチオニンまたは ３H ロ
イシンで合成によって標識された細胞からの細胞膜洗剤
抽出物を抗マウス−(IgG +IgM)セファロ−スに結合した
MoAbs と反応させ、MoAbs と抗原の相互作用をSDS-PAGE
(56,57) によって分析する。糖脂質抗原を確認するため
に、ヒト前立腺がん腫細胞から単離した脂質成分を薄層
クロマトグラフによって解析し、そのクロマトグラムを
相応するMoAbs と反応させる。 蛋白抗原の分子量およ
び電荷の不均一性について更に前述のオファレル(O’Fa
rrell)(58)法あるいはガレル( Garrels)の改変法(59)の
ように２次元(2-D) のゲル電気泳動で分析する。MoAbs
による免疫沈殿によって単離された抗原は次にアンフォ
ラインおよび尿素含有のポリアクリルアミドの１次元等
電点電気泳動に供される。ゲルはSDS-ゲル緩衝液によっ
て均衡化し、SDS-PAGEゲルに適用される。2-D 分析に先
立ち、シアル酸による電荷の不均一性をノイラミニダ−
ゼによってシアル酸残基を除去することで、シアル酸に
よる電荷の不均一性を評価する。この様に2-D 分析は等
電点電気泳動(pI)および蛋白質分子料を同時に分析でき
る。
方法を使用する生化学的分析をするため、特異的抗原を
ヒト前立腺がん腫細胞から単離するために目的のMoAbs
が使用される。最初に、MoAbs によって認識されるエピ
ト−プを内含する分子の性質、即ち蛋白であるか、糖脂
質であるかを決定するために単純な実験が実施される。
蛋白あるいは糖脂質抗原を確認するために、ラジオイム
ノ沈殿アッセイを(56,57) 使用する。 １ ２５I で標識
した細胞からあるいは３５S-メチオニンまたは ３H ロ
イシンで合成によって標識された細胞からの細胞膜洗剤
抽出物を抗マウス−(IgG +IgM)セファロ−スに結合した
MoAbs と反応させ、MoAbs と抗原の相互作用をSDS-PAGE
(56,57) によって分析する。糖脂質抗原を確認するため
に、ヒト前立腺がん腫細胞から単離した脂質成分を薄層
クロマトグラフによって解析し、そのクロマトグラムを
相応するMoAbs と反応させる。 蛋白抗原の分子量およ
び電荷の不均一性について更に前述のオファレル(O’Fa
rrell)(58)法あるいはガレル( Garrels)の改変法(59)の
ように２次元(2-D) のゲル電気泳動で分析する。MoAbs
による免疫沈殿によって単離された抗原は次にアンフォ
ラインおよび尿素含有のポリアクリルアミドの１次元等
電点電気泳動に供される。ゲルはSDS-ゲル緩衝液によっ
て均衡化し、SDS-PAGEゲルに適用される。2-D 分析に先
立ち、シアル酸による電荷の不均一性をノイラミニダ−
ゼによってシアル酸残基を除去することで、シアル酸に
よる電荷の不均一性を評価する。この様に2-D 分析は等
電点電気泳動(pI)および蛋白質分子料を同時に分析でき
る。
【００６６】MoAbs により同定される蛋白質抗原の安定
性を決定するために、ウエスタンブロテイングアッセイ
を行う。要するに、SDS 洗剤によって変性した細胞抽出
物をSDS-PAGEで還元状態あるいは不還元状態で解析し、
ニトロセルロ−ス膜上にブロットし、イムノペルオキシ
ダ−ゼ法（ブロットをMAb で処理した後、抗マウスIg抗
体結合ペルオキシダ−ゼで処理、続いて過酸化水素と
3,3´- ジアミノベンジデイン テトラハイドロクロラ
イドで処理する）で選別されたMoAbs で染色されるかあ
るいはブロットされた抗体を精製したMoAbs で結合し、
１２５Ｉで標識したブドウ球菌(S.aureus)蛋白Ａを結
合させオ−トラジオグラフィ−を行う。これらの方法
は、(a) エピト−プが処理プロトコ−ルに従った免疫反
応性を残しているかどうか、および(b) 蛋白抗原がサブ
ユニットから構成されているか否かを示す。更に、これ
らの研究はイムノブロットアッセイが患者の標本中で特
異抗原を検出することに応用できるかどうかを示すこと
になる。
性を決定するために、ウエスタンブロテイングアッセイ
を行う。要するに、SDS 洗剤によって変性した細胞抽出
物をSDS-PAGEで還元状態あるいは不還元状態で解析し、
ニトロセルロ−ス膜上にブロットし、イムノペルオキシ
ダ−ゼ法（ブロットをMAb で処理した後、抗マウスIg抗
体結合ペルオキシダ−ゼで処理、続いて過酸化水素と
3,3´- ジアミノベンジデイン テトラハイドロクロラ
イドで処理する）で選別されたMoAbs で染色されるかあ
るいはブロットされた抗体を精製したMoAbs で結合し、
１２５Ｉで標識したブドウ球菌(S.aureus)蛋白Ａを結
合させオ−トラジオグラフィ−を行う。これらの方法
は、(a) エピト−プが処理プロトコ−ルに従った免疫反
応性を残しているかどうか、および(b) 蛋白抗原がサブ
ユニットから構成されているか否かを示す。更に、これ
らの研究はイムノブロットアッセイが患者の標本中で特
異抗原を検出することに応用できるかどうかを示すこと
になる。
【００６７】腫瘍細胞からのDNA 回収 腫瘍由来の腫瘍
細胞を使用してDNA を回収、同定、単離し、公知の方法
を用いて分子レベルでクロ−ン化できる。CREF-trans 6
細胞の第一、第二、第三次のトランスフェクションの子
孫である腫瘍由来細胞から抽出したDNA 内にヒトDNA 配
列が存在すするかどうかはサザンブロット分析で決定さ
れる。第二、第三次のトランスフェクタントは通常、ヒ
トAlu DNA 断片でプロ−ブしたサザンブロット上にバン
ドがひとつあるかないかというよう回収が少ないのに対
し、第一次マウス、またはマウスの被トランスフェクト
細胞に由来する制限酵素で消化分解されたDNA 中に、ヒ
トDNA を含む断片(Alu) は通常多く存在する。サザンブ
ロット分析で、265 ベ−スペア−のAlu DNA配列即ち、S
P 6プロモ−タ− [ラカニ−ロ（V.RacaniellO 提供）]
を含むベクタ−にサブクロ−ンされたBlur-8（23) が
特異的活性の高い３２P 標識のプロ−ブRNA を産生する
ために使用された。Blur-8プロ−ブはサイズが小さいた
め、異種DNA に組み込まれているAlu リピ−トの単一コ
ピ−を検出することはできない。Alu DNA の単一コピ−
のみを含む被トランスフェクトラット細胞でAlu DNA 配
列が検出できるか否かを決定するために、Alu DNA の単
一コピ−を含むとことがわかっている V. Racaniello(コロンビア大学）により提供の細胞系か
らDNA をハイブリデイゼ−ションのコントロ−ルとし
た。もし、サザンブロット分析で制限酵素断片を含む受
け継がれたヒトAlu DNA の存在が多くの第二、第三のト
ランスフェクタントで明らかになれば、CREF細胞の腫瘍
化に関係するヒト前立腺がん遺伝子を単離することが可
能である。これは、遺伝子DNA ライブラリ−の産生、ク
ロ−ンされたDNA 含有Alu DNA 配列の単離、およびpSV2
-Neo DNAでコトランスフェクトしたCREF細胞によるこれ
らのクロ−ンされたヒトDNAsの生化学活性のテストと抗
G-418-トランスフェクタントがヌ−ドマウスで腫瘍性で
あるかどうかを決定することによって可能となる。MboI
による腫瘍由来の第二または第三のLN-CAP DNAのトラン
スフェクトしたCREF細胞から抽出したDNA のMboI部分分
解物がラムダEMPL3(BamHI 部位) ライブラリ−(26)の構
築に使用され、これらのライブラリ−はBlur-8 Alu DNA
プロ−ブによるプラ−クハイブリデイゼ−ション(27)
によってスクリ−ニングされる。DNA はAlu 配列を含む
組換ラムダファ−ジから抽出され、およびクロ−ンされ
たヒトDNA は、その腫瘍誘発性についてpSV2-Neo DNAと
CREF細胞をコトランスフェクトし、10６ 細胞の皮下注
射後のヌ−ドマウスにおける腫瘍化可能性のある抗G-41
8-の細胞数を記録することで評価する。もし組換ファ−
ジがLN-CAP前立腺がん細胞由来の腫瘍誘発遺伝子を含ん
でいるなら、(a) 新規に単離された遺伝子の核除去分析
において新規に単離された遺伝子の転写率; (b) ノ−ザ
レンブロット分析によるイントロン相同性ポリA+RNA の
量および多数性; (c) Ｓ１ 分析(28)によるイントロン
／エクソンの配置; および(d) サザンブロット分析によ
り、LN-CaP細胞における前立腺オンコジ−ンのDNA 配置
が正常なヒト前立腺細胞ゲノムにおけるDNA の配置と同
一かどうか; を決定するためにクロ−ン化されたDNA を
制限酵素を使ってマップでき、CREF細胞をオンコジ−ン
の表現型に形質転換する能力を残しているクロ−ン化さ
れたDNA の最小断片がLN-CaPおよび正常な前立腺組織に
おいて使用される。正常、LN-CaP、第一、第二、および
第三次LN-CaPのトランスフェクトしたCREF細胞のサザン
ブロット分析の比較により、これらの前立腺がん細胞の
オンコジ−ンの表現型に関与する遺伝子の増幅があるか
どうか調べることができる。
細胞を使用してDNA を回収、同定、単離し、公知の方法
を用いて分子レベルでクロ−ン化できる。CREF-trans 6
細胞の第一、第二、第三次のトランスフェクションの子
孫である腫瘍由来細胞から抽出したDNA 内にヒトDNA 配
列が存在すするかどうかはサザンブロット分析で決定さ
れる。第二、第三次のトランスフェクタントは通常、ヒ
トAlu DNA 断片でプロ−ブしたサザンブロット上にバン
ドがひとつあるかないかというよう回収が少ないのに対
し、第一次マウス、またはマウスの被トランスフェクト
細胞に由来する制限酵素で消化分解されたDNA 中に、ヒ
トDNA を含む断片(Alu) は通常多く存在する。サザンブ
ロット分析で、265 ベ−スペア−のAlu DNA配列即ち、S
P 6プロモ−タ− [ラカニ−ロ（V.RacaniellO 提供）]
を含むベクタ−にサブクロ−ンされたBlur-8（23) が
特異的活性の高い３２P 標識のプロ−ブRNA を産生する
ために使用された。Blur-8プロ−ブはサイズが小さいた
め、異種DNA に組み込まれているAlu リピ−トの単一コ
ピ−を検出することはできない。Alu DNA の単一コピ−
のみを含む被トランスフェクトラット細胞でAlu DNA 配
列が検出できるか否かを決定するために、Alu DNA の単
一コピ−を含むとことがわかっている V. Racaniello(コロンビア大学）により提供の細胞系か
らDNA をハイブリデイゼ−ションのコントロ−ルとし
た。もし、サザンブロット分析で制限酵素断片を含む受
け継がれたヒトAlu DNA の存在が多くの第二、第三のト
ランスフェクタントで明らかになれば、CREF細胞の腫瘍
化に関係するヒト前立腺がん遺伝子を単離することが可
能である。これは、遺伝子DNA ライブラリ−の産生、ク
ロ−ンされたDNA 含有Alu DNA 配列の単離、およびpSV2
-Neo DNAでコトランスフェクトしたCREF細胞によるこれ
らのクロ−ンされたヒトDNAsの生化学活性のテストと抗
G-418-トランスフェクタントがヌ−ドマウスで腫瘍性で
あるかどうかを決定することによって可能となる。MboI
による腫瘍由来の第二または第三のLN-CAP DNAのトラン
スフェクトしたCREF細胞から抽出したDNA のMboI部分分
解物がラムダEMPL3(BamHI 部位) ライブラリ−(26)の構
築に使用され、これらのライブラリ−はBlur-8 Alu DNA
プロ−ブによるプラ−クハイブリデイゼ−ション(27)
によってスクリ−ニングされる。DNA はAlu 配列を含む
組換ラムダファ−ジから抽出され、およびクロ−ンされ
たヒトDNA は、その腫瘍誘発性についてpSV2-Neo DNAと
CREF細胞をコトランスフェクトし、10６ 細胞の皮下注
射後のヌ−ドマウスにおける腫瘍化可能性のある抗G-41
8-の細胞数を記録することで評価する。もし組換ファ−
ジがLN-CAP前立腺がん細胞由来の腫瘍誘発遺伝子を含ん
でいるなら、(a) 新規に単離された遺伝子の核除去分析
において新規に単離された遺伝子の転写率; (b) ノ−ザ
レンブロット分析によるイントロン相同性ポリA+RNA の
量および多数性; (c) Ｓ１ 分析(28)によるイントロン
／エクソンの配置; および(d) サザンブロット分析によ
り、LN-CaP細胞における前立腺オンコジ−ンのDNA 配置
が正常なヒト前立腺細胞ゲノムにおけるDNA の配置と同
一かどうか; を決定するためにクロ−ン化されたDNA を
制限酵素を使ってマップでき、CREF細胞をオンコジ−ン
の表現型に形質転換する能力を残しているクロ−ン化さ
れたDNA の最小断片がLN-CaPおよび正常な前立腺組織に
おいて使用される。正常、LN-CaP、第一、第二、および
第三次LN-CaPのトランスフェクトしたCREF細胞のサザン
ブロット分析の比較により、これらの前立腺がん細胞の
オンコジ−ンの表現型に関与する遺伝子の増幅があるか
どうか調べることができる。
【００６８】もしAlu DNA を含む第二、および第三次ト
ランスフェクタントからの組換ファ−ジがあり、それが
ヌ−ドマウスをCREF-trans 6細胞を腫瘍状態に形質転換
しないならば、これらの組換ファ−ジはLN-CAP DNA を
MboI およびEcoRI で部分消化分解して構築されるコス
ミド(pJB8)(27)およびラムダEMBL3 ファ−ジライブラリ
−をスクリ−ンすることに使用される。オリジナルのト
ランスフェクタントDNA/ラムダライブラリ−から産生す
るプロ−ブとハイブリダイズするファ−ジおよびコスミ
ドに含まれるDNA は制限酵素を使用し広範にわたってマ
ップ化され、フランキングDNA に加え相同配列を含むと
思われるファ−ジまたはコスミド内のDNA はCREF-trans
6細胞をトランスフェクトするのに使用され、ヌ−ドマ
ウスにおいて腫瘍化可能性が分析される。ヌ−ドマウス
腫瘍化アッセイで陽性となったトランスフェクタントを
産生するファ−ジまたはコスミド内に細胞性DNA 配列は
腫瘍誘発活性に関与する最小のDNA 配列を決定するため
様々な制限酵素のよって消化分解される。
ランスフェクタントからの組換ファ−ジがあり、それが
ヌ−ドマウスをCREF-trans 6細胞を腫瘍状態に形質転換
しないならば、これらの組換ファ−ジはLN-CAP DNA を
MboI およびEcoRI で部分消化分解して構築されるコス
ミド(pJB8)(27)およびラムダEMBL3 ファ−ジライブラリ
−をスクリ−ンすることに使用される。オリジナルのト
ランスフェクタントDNA/ラムダライブラリ−から産生す
るプロ−ブとハイブリダイズするファ−ジおよびコスミ
ドに含まれるDNA は制限酵素を使用し広範にわたってマ
ップ化され、フランキングDNA に加え相同配列を含むと
思われるファ−ジまたはコスミド内のDNA はCREF-trans
6細胞をトランスフェクトするのに使用され、ヌ−ドマ
ウスにおいて腫瘍化可能性が分析される。ヌ−ドマウス
腫瘍化アッセイで陽性となったトランスフェクタントを
産生するファ−ジまたはコスミド内に細胞性DNA 配列は
腫瘍誘発活性に関与する最小のDNA 配列を決定するため
様々な制限酵素のよって消化分解される。
【００６９】もし、CREF細胞を癌の表現型に変換する第
二、および第三トランスフェクタントから構築された単
一のファ−ジまたはコスミド内にクロ−ンされた配列を
包含しているヒトAluDNA がなければ、正常ヒトあるい
はLN-CAP DNAがラムダEMBL3 あるいはMboIの代わりにSa
lIまたはEcoRI による部分消化分解によって構築したコ
スミドライブラリ−からの重合する断片を供給すること
でオンコジ−ンを補足し、イン・ビボでの組換により、
作用性のあるオンコジ−ンを再構築できる。近年この技
術はヒト神経成長因子受容体をコ−ドする部分遺伝子と
ハイブリダイズする正常ヒトラムダラリブラリ−から選
別されたDNA 配列でこの遺伝子の決められたDNA 部分に
トランスフェクトすることでヒト神経成長因子受容体に
生化学的活性を産生するために使用されている(24)。こ
の結果トランスフェクタントはNGF 結合活性を示す新成
長因子受容体を発現する(24)。もし上記アプロ−チがCR
EF細胞の癌化形質転換に関与する遺伝子の単離に陰性で
あるとすればこのアプロ−チは有用であろう。
二、および第三トランスフェクタントから構築された単
一のファ−ジまたはコスミド内にクロ−ンされた配列を
包含しているヒトAluDNA がなければ、正常ヒトあるい
はLN-CAP DNAがラムダEMBL3 あるいはMboIの代わりにSa
lIまたはEcoRI による部分消化分解によって構築したコ
スミドライブラリ−からの重合する断片を供給すること
でオンコジ−ンを補足し、イン・ビボでの組換により、
作用性のあるオンコジ−ンを再構築できる。近年この技
術はヒト神経成長因子受容体をコ−ドする部分遺伝子と
ハイブリダイズする正常ヒトラムダラリブラリ−から選
別されたDNA 配列でこの遺伝子の決められたDNA 部分に
トランスフェクトすることでヒト神経成長因子受容体に
生化学的活性を産生するために使用されている(24)。こ
の結果トランスフェクタントはNGF 結合活性を示す新成
長因子受容体を発現する(24)。もし上記アプロ−チがCR
EF細胞の癌化形質転換に関与する遺伝子の単離に陰性で
あるとすればこのアプロ−チは有用であろう。
【００７０】CREF-trans 6細胞の癌化に関与する遺伝子
は遺伝子クロ−ンを使用し、ヒトAlu 配列に付随してい
るこのヒト遺伝子を探すことでは単離できない。この初
期アプロ−チの代替として、非癌化CREF細胞およびオン
コジ−ンの表現型を示すこれらCREF細胞の三次トランス
フェクタントに緊密に関係している異種mRNAあるいはmR
NA量を反映するcDNAを単離することによる遺伝子単離方
法をとることができる。CREF細胞遺伝子発現と腫瘍性LN
-CAPトランスフェクタントとの違いはヒト前立腺がんDN
A からの遺伝子の発現によるだろう。この仮説に基づ
き、クロ−ンした三次トランスフェクタント由来のRNA
をcDNA/ ラムダgt-10 ライブラリ−を構築するために使
用し、これらのライブラリ−をCREF mRNA あるいはCREF
トランスフェクタント mRNA から産生する３２P で標識
された cDNA プロ−ブでスクリ−ンする。
は遺伝子クロ−ンを使用し、ヒトAlu 配列に付随してい
るこのヒト遺伝子を探すことでは単離できない。この初
期アプロ−チの代替として、非癌化CREF細胞およびオン
コジ−ンの表現型を示すこれらCREF細胞の三次トランス
フェクタントに緊密に関係している異種mRNAあるいはmR
NA量を反映するcDNAを単離することによる遺伝子単離方
法をとることができる。CREF細胞遺伝子発現と腫瘍性LN
-CAPトランスフェクタントとの違いはヒト前立腺がんDN
A からの遺伝子の発現によるだろう。この仮説に基づ
き、クロ−ンした三次トランスフェクタント由来のRNA
をcDNA/ ラムダgt-10 ライブラリ−を構築するために使
用し、これらのライブラリ−をCREF mRNA あるいはCREF
トランスフェクタント mRNA から産生する３２P で標識
された cDNA プロ−ブでスクリ−ンする。
【００７１】10mgのpoly A+ RNA は10６ の独立した組
換ファ−ジを含むライブラリ−を構築するに十分であ
る。このサイズのλgt10-cDNA ライブラリ−は全 mRNA
の0.001%以下の濃度の配列を含む。三次LN-CaP CREF 細
胞トランスフェクタントから構築されるλgt10-cDNA ラ
イブラリ−は様々な方法でスクリ−ンされる。たとえ
ば、 CREF 細胞と比べ、 CREF 細胞トランスフェクタン
トで特異的に、あるいは高濃度で発現するmRNAに対応す
るcDNAクロ−ンを単離する比較法、競合法、消去法スク
リ−ニング(11-13, 29, 64).がある。
換ファ−ジを含むライブラリ−を構築するに十分であ
る。このサイズのλgt10-cDNA ライブラリ−は全 mRNA
の0.001%以下の濃度の配列を含む。三次LN-CaP CREF 細
胞トランスフェクタントから構築されるλgt10-cDNA ラ
イブラリ−は様々な方法でスクリ−ンされる。たとえ
ば、 CREF 細胞と比べ、 CREF 細胞トランスフェクタン
トで特異的に、あるいは高濃度で発現するmRNAに対応す
るcDNAクロ−ンを単離する比較法、競合法、消去法スク
リ−ニング(11-13, 29, 64).がある。
【００７２】CREF-Trans 6細胞ではなくLN-CaP被トラン
スフクト CREF 細胞中で発現する遺伝子をライブラリ−
からスクリ−ニングするために、適宜な組換ファ−ジ三
次 CREF トランスフェクタントcDNAを含む複写ニトロセ
ルロ−スフィルタ−を未形質転換CREF-Trans 6細胞およ
び腫瘍誘発LN-CaP被トランスフクト CREF 細胞(64)から
作成された３２P で標識された cDNA プロ−ブでハイブ
リダイズする。第二のスクリ−ニングアプロ−チとし
て、組換ファ−ジDNA 分子( CREF-Trans 6からのクロ−
ンしたcDNAs あるいはLN-CaP DNAを使用し、トランスフ
ェクトしたCREF-Trans 6細胞) を含むニトロセルロ−ス
フィルタ−を数百倍の他のCREF mRNA (11)の過剰存在下
で三次トランスフェクタントCREF細胞から調製された
３２P で標識された cDNA プロ−ブでハイブリダイズす
る。第三のアプロ−チとして、未形質転換CREF細胞の配
列あるいは三次CREF細胞cDNA(12,13) でエンリッチドさ
れた３２P で標識された cDNA プロ−ブで組換ファ−ジ
−三次トランスフェクタントDNA 分子を含むニトロセル
ロ−スフィルタ−をハイブリダイズする消去スクリ−ニ
ング法がある。これらの方法を使用し、CREF細胞と比較
し、被トランスフェクトCREF細胞中で特異的に発現する
かあるいは過剰発現する遺伝子配列を含む特異的組換フ
ァ−ジを単離することが可能である。
スフクト CREF 細胞中で発現する遺伝子をライブラリ−
からスクリ−ニングするために、適宜な組換ファ−ジ三
次 CREF トランスフェクタントcDNAを含む複写ニトロセ
ルロ−スフィルタ−を未形質転換CREF-Trans 6細胞およ
び腫瘍誘発LN-CaP被トランスフクト CREF 細胞(64)から
作成された３２P で標識された cDNA プロ−ブでハイブ
リダイズする。第二のスクリ−ニングアプロ−チとし
て、組換ファ−ジDNA 分子( CREF-Trans 6からのクロ−
ンしたcDNAs あるいはLN-CaP DNAを使用し、トランスフ
ェクトしたCREF-Trans 6細胞) を含むニトロセルロ−ス
フィルタ−を数百倍の他のCREF mRNA (11)の過剰存在下
で三次トランスフェクタントCREF細胞から調製された
３２P で標識された cDNA プロ−ブでハイブリダイズす
る。第三のアプロ−チとして、未形質転換CREF細胞の配
列あるいは三次CREF細胞cDNA(12,13) でエンリッチドさ
れた３２P で標識された cDNA プロ−ブで組換ファ−ジ
−三次トランスフェクタントDNA 分子を含むニトロセル
ロ−スフィルタ−をハイブリダイズする消去スクリ−ニ
ング法がある。これらの方法を使用し、CREF細胞と比較
し、被トランスフェクトCREF細胞中で特異的に発現する
かあるいは過剰発現する遺伝子配列を含む特異的組換フ
ァ−ジを単離することが可能である。
【００７３】腫瘍細胞および被腫瘍細胞で特異的に発現
するmRNAに相当するcDNAクロ−ンはクロスハイブリデイ
ゼ−ション分析により相同グル−プとされ、制限酵素を
使用しマッピンッグする(29)。クロ−ンしたcDNAがヒト
に特異的なmRNAに相当することを確かめるため、および
CREF-Trans 6細胞の癌化に関与し、前立腺がんの制御に
関与するのは遺伝子であることを確かめるため、CREF-T
rans 6細胞、LN-CaP細胞、LN-CaP DNAを使用してトラン
スフェクトしたCREF-Trans 6細胞にmRNAが存在するとし
て、これらの細胞由来の相同なmRNAs のサイズおよび量
的な特徴が各々の相同グル−プから最大のcDNA挿入物を
使用し明らかされる。
するmRNAに相当するcDNAクロ−ンはクロスハイブリデイ
ゼ−ション分析により相同グル−プとされ、制限酵素を
使用しマッピンッグする(29)。クロ−ンしたcDNAがヒト
に特異的なmRNAに相当することを確かめるため、および
CREF-Trans 6細胞の癌化に関与し、前立腺がんの制御に
関与するのは遺伝子であることを確かめるため、CREF-T
rans 6細胞、LN-CaP細胞、LN-CaP DNAを使用してトラン
スフェクトしたCREF-Trans 6細胞にmRNAが存在するとし
て、これらの細胞由来の相同なmRNAs のサイズおよび量
的な特徴が各々の相同グル−プから最大のcDNA挿入物を
使用し明らかされる。
【００７４】ノ−ザレンブロット分析はこれらの遺伝子
が、(a) 正常前立腺組織においてたぶん低率で発現する
か、(b) ヒトにおける前立腺癌の進行の各段階を示した
前立腺癌からの臨床学的組織サンプルにおいて発現する
か、(c) ラットから派生する正常および癌化した組織か
らの前立腺細胞において発現するかどうかを示す。
が、(a) 正常前立腺組織においてたぶん低率で発現する
か、(b) ヒトにおける前立腺癌の進行の各段階を示した
前立腺癌からの臨床学的組織サンプルにおいて発現する
か、(c) ラットから派生する正常および癌化した組織か
らの前立腺細胞において発現するかどうかを示す。
【００７５】それぞれに異なって発現するmRNAに相当す
るcDNAを含む組換DNA はクロ−ンした三次トランスフェ
クタント由来のmRNAほかに、CREF-Trans 6細胞由来のmR
NAのノ−ザレンブロット分析のプロ−ブとして使用され
る。もしノ−ザレンブロット分析で、被トランスフェク
ト細胞にのみに遺伝子の発現を同定したならば、これら
のcDNAクロ−ンはこれらの遺伝子の発現を制御する遺伝
子配列を単離し、同定するために、三次トランスフェク
タントDNA の遺伝子ライブラリ−からコスミドファ−ジ
を同定するプロ−ブとして採用される。遺伝子対の片方
がいったん単離されたら、オンコジ−ンの構造が S１
ヌ−クリエ−スマッピング(29)のテクニック、制限酵素
マッピング(29)、およびDNA シ−クエンスによって解明
される(14)。 クロ−ンしたcDNAの生化学的作用を確認
するために、組換λgt10 DNAからcDNAが分離され、この
cDNAをpCD 発現ベクタ−(15, 16)に挿入される。pCD-cD
NA組換プラスミドはSV40初期遺伝子転写ユニットと融合
しているネオマイシン遺伝子を含むλ-NMTバクテリオフ
ァ−ジにクロ−ンされ、哺乳類細胞のトランスフェクタ
ントおよびcDNA発現に関する強力なプロモ−タ−にG418
の耐性を与える(15)。λ-NMT-pCD-cDNA 組換バクテリオ
ファ−ジ粒子はCREF細胞を有効にトランスフェクション
するために使用される。G418耐性菌は、ヌ−ドマウスに
おける腫瘍化性および細胞形態、成長、寒天配合培地で
の成育能力における変化などの形質転換に伴う特性につ
いてテストする。
るcDNAを含む組換DNA はクロ−ンした三次トランスフェ
クタント由来のmRNAほかに、CREF-Trans 6細胞由来のmR
NAのノ−ザレンブロット分析のプロ−ブとして使用され
る。もしノ−ザレンブロット分析で、被トランスフェク
ト細胞にのみに遺伝子の発現を同定したならば、これら
のcDNAクロ−ンはこれらの遺伝子の発現を制御する遺伝
子配列を単離し、同定するために、三次トランスフェク
タントDNA の遺伝子ライブラリ−からコスミドファ−ジ
を同定するプロ−ブとして採用される。遺伝子対の片方
がいったん単離されたら、オンコジ−ンの構造が S１
ヌ−クリエ−スマッピング(29)のテクニック、制限酵素
マッピング(29)、およびDNA シ−クエンスによって解明
される(14)。 クロ−ンしたcDNAの生化学的作用を確認
するために、組換λgt10 DNAからcDNAが分離され、この
cDNAをpCD 発現ベクタ−(15, 16)に挿入される。pCD-cD
NA組換プラスミドはSV40初期遺伝子転写ユニットと融合
しているネオマイシン遺伝子を含むλ-NMTバクテリオフ
ァ−ジにクロ−ンされ、哺乳類細胞のトランスフェクタ
ントおよびcDNA発現に関する強力なプロモ−タ−にG418
の耐性を与える(15)。λ-NMT-pCD-cDNA 組換バクテリオ
ファ−ジ粒子はCREF細胞を有効にトランスフェクション
するために使用される。G418耐性菌は、ヌ−ドマウスに
おける腫瘍化性および細胞形態、成長、寒天配合培地で
の成育能力における変化などの形質転換に伴う特性につ
いてテストする。
【００７６】ヒト前立腺細胞由来のCREF細胞において腫
瘍誘発発現型を制御する遺伝子の同定は、(a) 同様の遺
伝子が存在しているかどうかおよびDU-145およびPC-3な
どの他の前立腺がん細胞系で発現するかを決定する際
に；(b) 同様の遺伝子が存在し、およびまたは正常前立
腺において、同じ疾患の各段階に相当する良性前立腺肥
大および前立腺がん組織で発現するかを決定する際に；
(c) 相同遺伝子がラットの前立腺がん細胞で発現するか
を決定する際、およびこの遺伝子の発現が異なった転移
性を呈する細胞で変換されるようなことがあるかどうか
を決定する際に；(d) CREF細胞での腫瘍誘発表現型が発
現する際に関与する特殊蛋白の同定、定性する際に；お
よび(e) 前立腺がんの特定の段階を診断し、前立腺がん
の治療を受けている患者の治療経過を追調査する際に有
用な特徴的免疫学薬剤の産生をする際に有用である。
瘍誘発発現型を制御する遺伝子の同定は、(a) 同様の遺
伝子が存在しているかどうかおよびDU-145およびPC-3な
どの他の前立腺がん細胞系で発現するかを決定する際
に；(b) 同様の遺伝子が存在し、およびまたは正常前立
腺において、同じ疾患の各段階に相当する良性前立腺肥
大および前立腺がん組織で発現するかを決定する際に；
(c) 相同遺伝子がラットの前立腺がん細胞で発現するか
を決定する際、およびこの遺伝子の発現が異なった転移
性を呈する細胞で変換されるようなことがあるかどうか
を決定する際に；(d) CREF細胞での腫瘍誘発表現型が発
現する際に関与する特殊蛋白の同定、定性する際に；お
よび(e) 前立腺がんの特定の段階を診断し、前立腺がん
の治療を受けている患者の治療経過を追調査する際に有
用な特徴的免疫学薬剤の産生をする際に有用である。
【００７７】ヒト前立腺がん細胞系(LNCaP）からCREF細
胞へトランスファ−された腫瘍誘発遺伝子の同定および
クロ−ニング 一次および確立したヒト前立腺がん細胞におけるオンコ
ジ−ン発現における一貫した変化を実証する企てはまだ
成功していない(8-10)。しかしながらレチノブラストマ
（RB) 腫瘍抑制遺伝子( 染色体13q14 に位置する）の発
現における欠陥がDU145 ヒト前立腺がん細胞系(64)、お
よび10中2 の割合でヒト前立腺がん標本(65)で発見され
た。染色体16q および10qにおける特殊な対立遺伝子欠
損がヒト前立腺がんの病理に関与している(66- 68) 。
特殊前立腺がんの挙動を抑えあるいは患者の予後の経過
に関する見通しを立てる際の、RBおよび他の推測上の腫
瘍抑制遺伝子( 染色体16q および10q に位置する) にお
ける遺伝子学的変化の役割は知られていない(64 - 68)
。腫瘍抑制遺伝子自身の変化が前立腺がんを誘発し、
あるいはこれらの遺伝子学的変化がまだ同定されていな
いオンコジ−ンの活性に付随して起こるかどうかを突き
止めるにはさらに研究が必要となる。カルシウム仲介に
よる前立腺がん細胞からNIH3T3 細胞への高分子DNA のD
NA トランスフェクションではこのクラスの腫瘍におい
て共通した腫瘍誘発に集中して優先的に作用するオンコ
ジ−ンを同定するには至っていない(9) 。精巧な単一DN
A トランスフェクションテクニックは組織学的に異なる
ヒト腫瘍において弱い形質転換能をを持つ付加的なオン
コジ−ンの同定を可能にする(12, 13, 68-71) 。この方
法はヒト腫瘍DNA および選択可能な抗生物質耐性遺伝子
で成熟した細胞系へコトランスフェクションすること、
抗生物質耐性の選択および耐性コロニ−をヌ−ドマウス
に注入することからなる(12, 13,69-71) 。クロ−ンさ
れたネオマイシン耐性遺伝子(pSV2neo) のDNA とLNCaP
細胞由来の高分子DNA をCREFまたはNIH 3T3 細胞へコト
ランスフェクションし、G418に対する耐性で選択を行っ
た結果、形態学的に形質転換したフォ−カスにはならな
かった。しかし、コトランスフェクションされたNIH3T3
細胞ではなくコトランスフェクションされたCREFをヌ−
ドマウスに注射した結果、異種のトランスフェクション
からプ−ルした細胞を受容した4 セット動物のうち 3セ
ットに腫瘍の誘発が見られた。CREF細胞にpSV2neo と正
常皮膚繊維芽細胞由来DNA あるいはサケ精子由来DNA を
コトランスフェクションした結果、腫瘍の形成は見られ
なかった。一次LNCaP-CREF腫瘍(1°トランスフェクタン
ト）由来DNA は第二次CREF細胞へのコトランスフェクシ
ョンの後、腫瘍表現型を誘発した。第二次CREF細胞への
コトランスフェクションの後、選別された抗生物質耐性
コロニ−(2°トランスフェクタント）はin vitroで形態
学的な形質転換を示さなかった。しかし、これらの抗生
物質耐性形態学的に正常な培養物は、異種のトランスフ
ェクションからプ−ルした細胞を7 セット動物のうち 6
セットに腫瘍の誘発が見られた。LNCaP-CREFから得られ
た1 °、2 °トランスフェクタントの両者ともCREF細胞
で検出されないヒト(Alu) のリピ−ト配列を含むヌ−ド
マウスで腫瘍を誘発した（これらのトランスフェクタン
トの幾つかを図１に示す）。1 °(CREF 4 NMT)、2 °ト
ランスフェクタント (CREF 4-5 NMT; CREF 4-7 NMT) の
両者とも約7.5kb の共通なAlu 断片の他にあきらかにユ
ニ−クなAlu 断片含んでいた。この知見はヒト前立腺が
ん細胞由来の推定上の腫瘍誘発遺伝子がこのDNA 配列の
近傍に位置していることを示唆している。下記に述べる
ように、1 °および2 °トランスフェクタントはヒト前
立腺がん細胞系LNCaP から CREF にトランスファ−され
た腫瘍細胞の表現型に係わる遺伝子の単離に使用され
る。
胞へトランスファ−された腫瘍誘発遺伝子の同定および
クロ−ニング 一次および確立したヒト前立腺がん細胞におけるオンコ
ジ−ン発現における一貫した変化を実証する企てはまだ
成功していない(8-10)。しかしながらレチノブラストマ
（RB) 腫瘍抑制遺伝子( 染色体13q14 に位置する）の発
現における欠陥がDU145 ヒト前立腺がん細胞系(64)、お
よび10中2 の割合でヒト前立腺がん標本(65)で発見され
た。染色体16q および10qにおける特殊な対立遺伝子欠
損がヒト前立腺がんの病理に関与している(66- 68) 。
特殊前立腺がんの挙動を抑えあるいは患者の予後の経過
に関する見通しを立てる際の、RBおよび他の推測上の腫
瘍抑制遺伝子( 染色体16q および10q に位置する) にお
ける遺伝子学的変化の役割は知られていない(64 - 68)
。腫瘍抑制遺伝子自身の変化が前立腺がんを誘発し、
あるいはこれらの遺伝子学的変化がまだ同定されていな
いオンコジ−ンの活性に付随して起こるかどうかを突き
止めるにはさらに研究が必要となる。カルシウム仲介に
よる前立腺がん細胞からNIH3T3 細胞への高分子DNA のD
NA トランスフェクションではこのクラスの腫瘍におい
て共通した腫瘍誘発に集中して優先的に作用するオンコ
ジ−ンを同定するには至っていない(9) 。精巧な単一DN
A トランスフェクションテクニックは組織学的に異なる
ヒト腫瘍において弱い形質転換能をを持つ付加的なオン
コジ−ンの同定を可能にする(12, 13, 68-71) 。この方
法はヒト腫瘍DNA および選択可能な抗生物質耐性遺伝子
で成熟した細胞系へコトランスフェクションすること、
抗生物質耐性の選択および耐性コロニ−をヌ−ドマウス
に注入することからなる(12, 13,69-71) 。クロ−ンさ
れたネオマイシン耐性遺伝子(pSV2neo) のDNA とLNCaP
細胞由来の高分子DNA をCREFまたはNIH 3T3 細胞へコト
ランスフェクションし、G418に対する耐性で選択を行っ
た結果、形態学的に形質転換したフォ−カスにはならな
かった。しかし、コトランスフェクションされたNIH3T3
細胞ではなくコトランスフェクションされたCREFをヌ−
ドマウスに注射した結果、異種のトランスフェクション
からプ−ルした細胞を受容した4 セット動物のうち 3セ
ットに腫瘍の誘発が見られた。CREF細胞にpSV2neo と正
常皮膚繊維芽細胞由来DNA あるいはサケ精子由来DNA を
コトランスフェクションした結果、腫瘍の形成は見られ
なかった。一次LNCaP-CREF腫瘍(1°トランスフェクタン
ト）由来DNA は第二次CREF細胞へのコトランスフェクシ
ョンの後、腫瘍表現型を誘発した。第二次CREF細胞への
コトランスフェクションの後、選別された抗生物質耐性
コロニ−(2°トランスフェクタント）はin vitroで形態
学的な形質転換を示さなかった。しかし、これらの抗生
物質耐性形態学的に正常な培養物は、異種のトランスフ
ェクションからプ−ルした細胞を7 セット動物のうち 6
セットに腫瘍の誘発が見られた。LNCaP-CREFから得られ
た1 °、2 °トランスフェクタントの両者ともCREF細胞
で検出されないヒト(Alu) のリピ−ト配列を含むヌ−ド
マウスで腫瘍を誘発した（これらのトランスフェクタン
トの幾つかを図１に示す）。1 °(CREF 4 NMT)、2 °ト
ランスフェクタント (CREF 4-5 NMT; CREF 4-7 NMT) の
両者とも約7.5kb の共通なAlu 断片の他にあきらかにユ
ニ−クなAlu 断片含んでいた。この知見はヒト前立腺が
ん細胞由来の推定上の腫瘍誘発遺伝子がこのDNA 配列の
近傍に位置していることを示唆している。下記に述べる
ように、1 °および2 °トランスフェクタントはヒト前
立腺がん細胞系LNCaP から CREF にトランスファ−され
た腫瘍細胞の表現型に係わる遺伝子の単離に使用され
る。
【００７８】LNCaP 細胞からの形質導入腫瘍誘発遺伝子
の単離に用いられる遺伝子クローニング策 EMBL3 ファージにおけるクローニング 用いられる基本
的な手順は、ヒトＤＮＡが形質導入された齧歯類動物細
胞内に存在する Aluヒト繰り返し配列を同定し、これら
の配列をクローニングするために確立されている（23、
70-72 ）。加えて、最近このアプローチは、pSV2neo Ｄ
ＮＡ有する NIH 3T3細胞と細胞性ＤＮＡとを共形質導入
し、ヌードマウスにおいて腫瘍形成した後、家族性腺癌
様ポリポーシス患者からの潜在的に新規の癌遺伝子の同
定に用いられている（71）。図１に示すように、サザー
ンブロットでの研究は、 1°および 2°両腫瘍由来 LNC
aP DNA-CREF 形質導入体が、Blur 8（Alu ）プローブと
ハイブリダイズする、EcoRIでの開裂の後に生成する約
7.5 kb の DNA断片を含有することを示す（23）。この
推定 LNCaP腫瘍誘発遺伝子を含有するゲノムクローンを
単離するために、以下の策を用いることができる。Blur
8で探索した場合に陽性である、 7ないし 9 kb の Eco
RI消化 DNA断片を単離し、フェノール、フェノール：ク
ロロホルムおよびクロロホルムで処理することにより低
融点アガロースゲルから抽出する。このDNA断片を、Eco
RI （Stratagene、CA）で切断したバクテリオファージ
EMBL3アームにライゲートする（72）。ライゲーション
の後、この反応混合物を、ストラタジーン・パッキング
・エクストラクトを用いて、パックする。全ファージ・
ライブラリーを LE392宿主バクテリアに塗布し、Blur 8
をプローブとして用いる（74、75）ニトロセルロース・
ペーパー上でのプラーク・ハイブリダイゼーション（7
3）によって Alu陽性プラークを同定する。Alu プロー
ブは、ランダム・オリゴヌクレオチド標識法（76）を用
いて、［α- 32Ｐ］ dCTP （Amersham, Inc.,IL）で標
識する。陽性ゲノムクローンを制限酵素マッピングおよ
びサザーンブロット分析により特徴付ける（77、78）。
陽性クローンを配列決定のために pUC19または M13ファ
ージにサブクローニングし、また、ノーザンブロット研
究にプローブとして用いる。ノーザンブロットでの研究
のために、LNCaP から単離された細胞質 RNA、 1°およ
び 2°腫瘍由来 LNCaP DNA- CREF形質導入体およびさら
なるヒト前立腺癌細胞系（DU145 および PC-3 を含む）
が用いられる。これらのノーザンブロット分析において
陽性であり、かつ同サイズのエクソンを含むクローン
は、配列決定によりさらに特徴付ける。適当なエクソン
を含むクローンを、LNCaP および 1°および 2°腫瘍由
来 LNCaPDNA-CREF形質導入体から構成された cDNA ライ
ブラリーのスクリーニングに用い、推定腫瘍誘発遺伝子
に対応する完全長の cDNA クローンを得る。
の単離に用いられる遺伝子クローニング策 EMBL3 ファージにおけるクローニング 用いられる基本
的な手順は、ヒトＤＮＡが形質導入された齧歯類動物細
胞内に存在する Aluヒト繰り返し配列を同定し、これら
の配列をクローニングするために確立されている（23、
70-72 ）。加えて、最近このアプローチは、pSV2neo Ｄ
ＮＡ有する NIH 3T3細胞と細胞性ＤＮＡとを共形質導入
し、ヌードマウスにおいて腫瘍形成した後、家族性腺癌
様ポリポーシス患者からの潜在的に新規の癌遺伝子の同
定に用いられている（71）。図１に示すように、サザー
ンブロットでの研究は、 1°および 2°両腫瘍由来 LNC
aP DNA-CREF 形質導入体が、Blur 8（Alu ）プローブと
ハイブリダイズする、EcoRIでの開裂の後に生成する約
7.5 kb の DNA断片を含有することを示す（23）。この
推定 LNCaP腫瘍誘発遺伝子を含有するゲノムクローンを
単離するために、以下の策を用いることができる。Blur
8で探索した場合に陽性である、 7ないし 9 kb の Eco
RI消化 DNA断片を単離し、フェノール、フェノール：ク
ロロホルムおよびクロロホルムで処理することにより低
融点アガロースゲルから抽出する。このDNA断片を、Eco
RI （Stratagene、CA）で切断したバクテリオファージ
EMBL3アームにライゲートする（72）。ライゲーション
の後、この反応混合物を、ストラタジーン・パッキング
・エクストラクトを用いて、パックする。全ファージ・
ライブラリーを LE392宿主バクテリアに塗布し、Blur 8
をプローブとして用いる（74、75）ニトロセルロース・
ペーパー上でのプラーク・ハイブリダイゼーション（7
3）によって Alu陽性プラークを同定する。Alu プロー
ブは、ランダム・オリゴヌクレオチド標識法（76）を用
いて、［α- 32Ｐ］ dCTP （Amersham, Inc.,IL）で標
識する。陽性ゲノムクローンを制限酵素マッピングおよ
びサザーンブロット分析により特徴付ける（77、78）。
陽性クローンを配列決定のために pUC19または M13ファ
ージにサブクローニングし、また、ノーザンブロット研
究にプローブとして用いる。ノーザンブロットでの研究
のために、LNCaP から単離された細胞質 RNA、 1°およ
び 2°腫瘍由来 LNCaP DNA- CREF形質導入体およびさら
なるヒト前立腺癌細胞系（DU145 および PC-3 を含む）
が用いられる。これらのノーザンブロット分析において
陽性であり、かつ同サイズのエクソンを含むクローン
は、配列決定によりさらに特徴付ける。適当なエクソン
を含むクローンを、LNCaP および 1°および 2°腫瘍由
来 LNCaPDNA-CREF形質導入体から構成された cDNA ライ
ブラリーのスクリーニングに用い、推定腫瘍誘発遺伝子
に対応する完全長の cDNA クローンを得る。
【００７９】1°および 2°腫瘍由来 LNCaP DNA-CREF
形質導入体内に存在する推定腫瘍誘発遺伝子の獲得にEM
BL3 クローニングを用いる第２のアプローチとしては、
以下のアプローチを用いることができる（71、74、7
6）。二次腫瘍誘発 LNCaP DNA-CREF形質転換体 DNAは S
au3AI で部分的に消化し、次いでショ糖勾配遠心により
分画する。20ないし30 kb 断片を含有する精製画分を、
BamHI で切断した精製 EMBL3ファージ・アームでライゲ
ートする。この組換えファージ・ライブラリーをAluプ
ローブでスクリーニングし、陽性クローンを同定する。
その後、クローンＤＮＡを SalI で消化し、Alu プロー
ブおよび上で得られたプローブを用いるサザーンブロッ
トにより分析する。
形質導入体内に存在する推定腫瘍誘発遺伝子の獲得にEM
BL3 クローニングを用いる第２のアプローチとしては、
以下のアプローチを用いることができる（71、74、7
6）。二次腫瘍誘発 LNCaP DNA-CREF形質転換体 DNAは S
au3AI で部分的に消化し、次いでショ糖勾配遠心により
分画する。20ないし30 kb 断片を含有する精製画分を、
BamHI で切断した精製 EMBL3ファージ・アームでライゲ
ートする。この組換えファージ・ライブラリーをAluプ
ローブでスクリーニングし、陽性クローンを同定する。
その後、クローンＤＮＡを SalI で消化し、Alu プロー
ブおよび上で得られたプローブを用いるサザーンブロッ
トにより分析する。
【００８０】ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（PCR ）クローニング 組換えファージを用いる 1°お
よび 2°腫瘍由来 LNCaP DNA-CREF 形質導入体からのヒ
ト DNA配列の単離は、EMBL3 内の全ゲノムライブラリー
（ 2ないし 4×105 の独立した組換えファージを含む）
の製造およびプローブとして Aluを用いるこのライブラ
リーのスクリーニングを必要とする。最近の研究は、Al
u PCR アプローチが、齧歯類動物のゲノム・バックグラ
ンドにヒト染色体断片を保持する体細胞ハイブリッド、
ラムダファージ内にクローニングされたゲノムDNA およ
びイースト人工染色体（YAC ）ベクターのような複合源
からのヒト DNA配列の同定および精製に、単一法として
使用可能であることを示している（79、80）。このアプ
ローチは、ヒトゲノムに合理的に保全されている Alu繰
返しのコンセンサス配列を用いることにより、促進され
ている（79）。体細胞ハイブリッドおよび YACベクター
におけるヒト DNA配列の同定において特別な価値を有す
ることが立証されているPCR プライマー・コンセンサス
配列は、TC-65 および 517である（79）。プライマー T
C-65は、霊長類 Alu繰返しの第２モノマーで唯一の 31
bp配列内に位置する（81）。プライマー 517は、TC-65
と同じ 17 bpの Alu配列を認識するが、その方向は反対
である。Nelsonらの研究（79）に基づくと、TC-65 はヒ
トDNA の 500 kb 毎に生成する断片を同定し、プライマ
ー 517は 1000 bp毎に断片を生成すると見積もられる。
これらのコンセンサス Alu配列が 1°および 2°腫瘍由
来LNCaP DNA-CREF 形質導入体内に存在する場合には、A
luPCR アプローチにより、ゲノムライブラリーの調製お
よびこのライブラリーを Alu陽性クローンについてスク
リーニングする必要がなくなる。最初に、 1°および 2
°腫瘍由来LNCaP DNA-CREF 形質導入体 DNA 1μｇ、お
よび Nelson ら（79）にによって記述される、TC-65 お
よび 517を用いるPCRが用いられる。 2種のプライマー
を用いる単一 Alu繰返しからの 2方向増幅を可能にする
プライマーの使用または逆 PCRのいずれか（82）による
このアプローチの変形は、領域またはクローンからの大
部分の Alu配列の増幅を可能にする。このPCR Alu 方法
論が成功するならば、同定される配列は、 1°および 2
°腫瘍由来 LNCaP DNA-CREF 形質導入体由来の組換えラ
イブラリーのスクリーニングにおいて関心のあるcDNA
クローンの同定に使用されるプローブとして、直接用い
ることができる。 差別的スクリーニング（減法的スクリーニング） ２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランス
フェクタントから構築された減法ライブラリー(subtrac
tedlibraries)のスクリーニングは、合計１×１０6 個
の組換ファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
から得られるよりも大きな、ハイブリダイゼーション陽
性のファージクローンの富化をもたらす。まず、ＣＲＥ
Ｆおよび２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦ
トランスフェクタント細胞からの単方向性ｃＤＮＡ発現
ライブラリーが、５μｇのポリＡ＋ＲＮＡから調製さ
れ、次いでストラタジーン社のｃＤＮＡ合成キットで二
重鎖ｃＤＮＡが調製される（８３）。このｃＤＮＡｓは
ラムダザップ社のバクテリオファージベクター中にライ
ゲートされ、パッケージングエキストラクト(packaging
extracts)と共にパッケージされる。合計１×１０6 個
のクローンが計数される。減法ライブラリーは、Sargen
t 及びDawid の方法によって上記ｃＤＮＡライブラリー
から作製される（８４）。ラムダザップベクター中に存
在する２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦト
ランスフェクタントｃＤＮＡ 30 μｇがＸｈｏＩで開裂
され、Ｔ3ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写物が
生成される（８５）。このＲＮＡ転写物は、ＸｈｏＩリ
ンカープライマーを添加すると、モロニーネズミ白血病
ウイルス逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡに変換され
る。この一本鎖ｃＤＮＡは、60℃で48時間、過剰のＣＲ
ＥＦ細胞質ＲＮＡとハイブリダイズされる。ハイブリダ
イズされなかったｃＤＮＡは、水酸アパタイトカラムを
通すことによって回収される（８６）。略２ラウンドの
減法によって、２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- Ｃ
ＲＥＦトランスフェクタントｃＤＮＡから 90％の減法
がもたらされる。この減法ｃＤＮＡはプローブとして用
いることができ、或いは更にクレノウポリメラーゼで二
重鎖に加工され、ファージベクターにライゲートされて
パッケージされる。得られるコロニーの合計数は、５〜
１０×１０4 である。このアプローチは任意的であり、
何等かの理由で、ＥＭＢＬ３クローニングまたはＰＣＲ
・Ａｌｕ法を用いた推定ＬＮＣａＰ腫瘍誘導遺伝子の同
定が不成功であるときにのみ用いられる。
（PCR ）クローニング 組換えファージを用いる 1°お
よび 2°腫瘍由来 LNCaP DNA-CREF 形質導入体からのヒ
ト DNA配列の単離は、EMBL3 内の全ゲノムライブラリー
（ 2ないし 4×105 の独立した組換えファージを含む）
の製造およびプローブとして Aluを用いるこのライブラ
リーのスクリーニングを必要とする。最近の研究は、Al
u PCR アプローチが、齧歯類動物のゲノム・バックグラ
ンドにヒト染色体断片を保持する体細胞ハイブリッド、
ラムダファージ内にクローニングされたゲノムDNA およ
びイースト人工染色体（YAC ）ベクターのような複合源
からのヒト DNA配列の同定および精製に、単一法として
使用可能であることを示している（79、80）。このアプ
ローチは、ヒトゲノムに合理的に保全されている Alu繰
返しのコンセンサス配列を用いることにより、促進され
ている（79）。体細胞ハイブリッドおよび YACベクター
におけるヒト DNA配列の同定において特別な価値を有す
ることが立証されているPCR プライマー・コンセンサス
配列は、TC-65 および 517である（79）。プライマー T
C-65は、霊長類 Alu繰返しの第２モノマーで唯一の 31
bp配列内に位置する（81）。プライマー 517は、TC-65
と同じ 17 bpの Alu配列を認識するが、その方向は反対
である。Nelsonらの研究（79）に基づくと、TC-65 はヒ
トDNA の 500 kb 毎に生成する断片を同定し、プライマ
ー 517は 1000 bp毎に断片を生成すると見積もられる。
これらのコンセンサス Alu配列が 1°および 2°腫瘍由
来LNCaP DNA-CREF 形質導入体内に存在する場合には、A
luPCR アプローチにより、ゲノムライブラリーの調製お
よびこのライブラリーを Alu陽性クローンについてスク
リーニングする必要がなくなる。最初に、 1°および 2
°腫瘍由来LNCaP DNA-CREF 形質導入体 DNA 1μｇ、お
よび Nelson ら（79）にによって記述される、TC-65 お
よび 517を用いるPCRが用いられる。 2種のプライマー
を用いる単一 Alu繰返しからの 2方向増幅を可能にする
プライマーの使用または逆 PCRのいずれか（82）による
このアプローチの変形は、領域またはクローンからの大
部分の Alu配列の増幅を可能にする。このPCR Alu 方法
論が成功するならば、同定される配列は、 1°および 2
°腫瘍由来 LNCaP DNA-CREF 形質導入体由来の組換えラ
イブラリーのスクリーニングにおいて関心のあるcDNA
クローンの同定に使用されるプローブとして、直接用い
ることができる。 差別的スクリーニング（減法的スクリーニング） ２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランス
フェクタントから構築された減法ライブラリー(subtrac
tedlibraries)のスクリーニングは、合計１×１０6 個
の組換ファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
から得られるよりも大きな、ハイブリダイゼーション陽
性のファージクローンの富化をもたらす。まず、ＣＲＥ
Ｆおよび２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦ
トランスフェクタント細胞からの単方向性ｃＤＮＡ発現
ライブラリーが、５μｇのポリＡ＋ＲＮＡから調製さ
れ、次いでストラタジーン社のｃＤＮＡ合成キットで二
重鎖ｃＤＮＡが調製される（８３）。このｃＤＮＡｓは
ラムダザップ社のバクテリオファージベクター中にライ
ゲートされ、パッケージングエキストラクト(packaging
extracts)と共にパッケージされる。合計１×１０6 個
のクローンが計数される。減法ライブラリーは、Sargen
t 及びDawid の方法によって上記ｃＤＮＡライブラリー
から作製される（８４）。ラムダザップベクター中に存
在する２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦト
ランスフェクタントｃＤＮＡ 30 μｇがＸｈｏＩで開裂
され、Ｔ3ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写物が
生成される（８５）。このＲＮＡ転写物は、ＸｈｏＩリ
ンカープライマーを添加すると、モロニーネズミ白血病
ウイルス逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡに変換され
る。この一本鎖ｃＤＮＡは、60℃で48時間、過剰のＣＲ
ＥＦ細胞質ＲＮＡとハイブリダイズされる。ハイブリダ
イズされなかったｃＤＮＡは、水酸アパタイトカラムを
通すことによって回収される（８６）。略２ラウンドの
減法によって、２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- Ｃ
ＲＥＦトランスフェクタントｃＤＮＡから 90％の減法
がもたらされる。この減法ｃＤＮＡはプローブとして用
いることができ、或いは更にクレノウポリメラーゼで二
重鎖に加工され、ファージベクターにライゲートされて
パッケージされる。得られるコロニーの合計数は、５〜
１０×１０4 である。このアプローチは任意的であり、
何等かの理由で、ＥＭＢＬ３クローニングまたはＰＣＲ
・Ａｌｕ法を用いた推定ＬＮＣａＰ腫瘍誘導遺伝子の同
定が不成功であるときにのみ用いられる。
【００８１】ＣＲＥＦトランスフェクタントからＬＮＣ
ａＰ腫瘍誘導遺伝子をクローニングするために理論的に
用いられ得る別のアプローチは、減法ハイブリダイゼー
ション及びＰＣＲ技術の両者を兼ね備える（８７）。こ
の方法においては、大過剰のドライバーＤＮＡ（ＣＲＥ
Ｆ）がテスターＤＮＡ（ドライバーＤＮＡには存在しな
い問題の遺伝子を含んだ２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・Ｄ
ＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェクタント）と結合され、減
法手順により共通の配列が除去されて、（テスターＤＮ
Ａサンプル中の）標的ＤＮＡ配列の富化がもたらされ
る。アビジン／ビオチン・アフィニティークロマトグラ
フィーによって、ドライバーＤＮＡから減法されたテス
ターＤＮＡを分離した後、一本鎖標的ＤＮＡはＰＣＲに
よって増幅され、これを二本鎖としてクローン化可能に
される。この新しい方法を用いて、Wieland 等（８７）
は標的ＤＮＡ配列の100 倍〜700 倍の富化を達成してい
る。このアプローチを採用すれば、ＣＲＥＦおよび２°
腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェ
クタントの両者に存在する共通の配列を除去し、２°腫
瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェク
タントのみに存在するＡｌｕリンクされた配列の富化を
もたらすことが可能である。これらＡｌｕリンクされた
配列は次いでＰＣＲを用いて増幅され得、該遺伝子は、
更なる分析のために直接ｐＵＣ１８ベクター中にクロー
ン化され得る。
ａＰ腫瘍誘導遺伝子をクローニングするために理論的に
用いられ得る別のアプローチは、減法ハイブリダイゼー
ション及びＰＣＲ技術の両者を兼ね備える（８７）。こ
の方法においては、大過剰のドライバーＤＮＡ（ＣＲＥ
Ｆ）がテスターＤＮＡ（ドライバーＤＮＡには存在しな
い問題の遺伝子を含んだ２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・Ｄ
ＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェクタント）と結合され、減
法手順により共通の配列が除去されて、（テスターＤＮ
Ａサンプル中の）標的ＤＮＡ配列の富化がもたらされ
る。アビジン／ビオチン・アフィニティークロマトグラ
フィーによって、ドライバーＤＮＡから減法されたテス
ターＤＮＡを分離した後、一本鎖標的ＤＮＡはＰＣＲに
よって増幅され、これを二本鎖としてクローン化可能に
される。この新しい方法を用いて、Wieland 等（８７）
は標的ＤＮＡ配列の100 倍〜700 倍の富化を達成してい
る。このアプローチを採用すれば、ＣＲＥＦおよび２°
腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェ
クタントの両者に存在する共通の配列を除去し、２°腫
瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェク
タントのみに存在するＡｌｕリンクされた配列の富化を
もたらすことが可能である。これらＡｌｕリンクされた
配列は次いでＰＣＲを用いて増幅され得、該遺伝子は、
更なる分析のために直接ｐＵＣ１８ベクター中にクロー
ン化され得る。
【００８２】ラムダザップ発現ベクターおよびポリクロ
ーナル抗体でのプロービング ＬＮＣａＰ細胞と反応するポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体が、マウスの免疫感作に先立って、１
°腫瘍由来のＬＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランス
フェクタントをコートする高力価ＣＲＥＦ抗血清を用い
ることによって開発された。このアプローチ及びウサギ
の免疫感作を用いて、１°および２°腫瘍由来のＬＮＣ
ａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェクタントおよびＬ
ＮＣａＰ細胞の表面に発現した抗原とは反応するが、Ｃ
ＲＥＦ細胞とは反応しないポリクローナル抗体が生成さ
れている。１°および２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮ
Ａ- ＣＲＥＦトランスフェクタントおよびＬＮＣａＰ細
胞からのｃＤＮＡライブラリーは、ラムダザップ発現ベ
クター中に構築され、コロニーはポリクローナル抗体
（ヤング及びデービスにより記述されたように（８８）
してE.coli抽出物に対して中和された（７７）もの）で
スクリーニングされる。略１×１０6 個の組換ファージ
クローンを３〜４回連続してポリクローナル抗体でスク
リーニングし、陽性クローンを得る。次いで、このｃＤ
ＮＡをサブクローニングし、先に述べたようにしてシー
ケンシングされる（７７，７８）。このアプローチは、
ＣＲＥＦ細胞に導入されているＬＮＣａＰ腫瘍誘導遺伝
子を同定し、クローニングするための別の代替えアプロ
ーチとしてのみ提供される。
ーナル抗体でのプロービング ＬＮＣａＰ細胞と反応するポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体が、マウスの免疫感作に先立って、１
°腫瘍由来のＬＬＮＣａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランス
フェクタントをコートする高力価ＣＲＥＦ抗血清を用い
ることによって開発された。このアプローチ及びウサギ
の免疫感作を用いて、１°および２°腫瘍由来のＬＮＣ
ａＰ・ＤＮＡ- ＣＲＥＦトランスフェクタントおよびＬ
ＮＣａＰ細胞の表面に発現した抗原とは反応するが、Ｃ
ＲＥＦ細胞とは反応しないポリクローナル抗体が生成さ
れている。１°および２°腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮ
Ａ- ＣＲＥＦトランスフェクタントおよびＬＮＣａＰ細
胞からのｃＤＮＡライブラリーは、ラムダザップ発現ベ
クター中に構築され、コロニーはポリクローナル抗体
（ヤング及びデービスにより記述されたように（８８）
してE.coli抽出物に対して中和された（７７）もの）で
スクリーニングされる。略１×１０6 個の組換ファージ
クローンを３〜４回連続してポリクローナル抗体でスク
リーニングし、陽性クローンを得る。次いで、このｃＤ
ＮＡをサブクローニングし、先に述べたようにしてシー
ケンシングされる（７７，７８）。このアプローチは、
ＣＲＥＦ細胞に導入されているＬＮＣａＰ腫瘍誘導遺伝
子を同定し、クローニングするための別の代替えアプロ
ーチとしてのみ提供される。
【００８３】おそらく、上記に概説した方法はＬＮＣａ
Ｐ細胞中に存在し、且つカルシウムに媒介されたＤＮＡ
形質導入を介してＣＲＥＦ細胞中に導入された推定の前
立腺カルチノーマ腫瘍誘導遺伝子もしくは腫瘍関連遺伝
子の単離および同定をもたらすであろうと思われる。
Ｐ細胞中に存在し、且つカルシウムに媒介されたＤＮＡ
形質導入を介してＣＲＥＦ細胞中に導入された推定の前
立腺カルチノーマ腫瘍誘導遺伝子もしくは腫瘍関連遺伝
子の単離および同定をもたらすであろうと思われる。
【００８４】正常な前立腺、良性前立腺肥大（ＢＰ
Ｈ）、前立腺カルチノーマおよび骨への転移性腫瘍にお
けるＬＮＣａＰ細胞に由来する、形質導入された腫瘍誘
導遺伝子の組織化および発現 上記に説明した方法は、ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ細
胞へ導入されて、形質導入された細胞の腫瘍発現型を媒
介するｃＤＮＡまたは遺伝子クローン（前立腺カルチノ
ーマ腫瘍誘導／関連（ＰＣＴＩ）遺伝子という）の単離
をもたらす。一旦同定されると、このクローンは、その
ヒト前立腺カルチノーマの発生における潜在的役割を決
定するために用いられる。これらの研究には、(a) 正常
ヒト前立腺、ＢＰＨおよび（異なったグリーソン(Gleas
on) 段階の）前立腺カルチノーマ細胞ラインにおけるそ
の発現の分析；(b) 正常ヒト前立腺、ＢＰＨ、（異なっ
たグリーソン(Gleason) 段階の）前立腺カルチノーマお
よび骨への転移性腫瘍からの一次組織におけるその発現
の分析；および(c) 相同性遺伝子がラット前立腺カルチ
ノーマ細胞内で発現するか否か、およびこの遺伝子の発
現が異なった程度の腫瘍形成能／転移能を示す細胞内で
変化するか否かの決定が含まれる。
Ｈ）、前立腺カルチノーマおよび骨への転移性腫瘍にお
けるＬＮＣａＰ細胞に由来する、形質導入された腫瘍誘
導遺伝子の組織化および発現 上記に説明した方法は、ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ細
胞へ導入されて、形質導入された細胞の腫瘍発現型を媒
介するｃＤＮＡまたは遺伝子クローン（前立腺カルチノ
ーマ腫瘍誘導／関連（ＰＣＴＩ）遺伝子という）の単離
をもたらす。一旦同定されると、このクローンは、その
ヒト前立腺カルチノーマの発生における潜在的役割を決
定するために用いられる。これらの研究には、(a) 正常
ヒト前立腺、ＢＰＨおよび（異なったグリーソン(Gleas
on) 段階の）前立腺カルチノーマ細胞ラインにおけるそ
の発現の分析；(b) 正常ヒト前立腺、ＢＰＨ、（異なっ
たグリーソン(Gleason) 段階の）前立腺カルチノーマお
よび骨への転移性腫瘍からの一次組織におけるその発現
の分析；および(c) 相同性遺伝子がラット前立腺カルチ
ノーマ細胞内で発現するか否か、およびこの遺伝子の発
現が異なった程度の腫瘍形成能／転移能を示す細胞内で
変化するか否かの決定が含まれる。
【００８５】前立腺カルチノーマ発生の異なった段階を
示すヒト前立腺細胞ラインにおけるＰＣＴＩ遺伝子の発
現 ＬＮＣａＰ・ＤＮＡ形質導入腫瘍由来ＣＲＥＦ細胞に由
来するＰＣＴＩ遺伝子の、正常前立腺、ＢＰＨおよび前
立腺カルチノーマ細胞ライン（８）における組織化およ
び発現が、先に説明したようにして、サザン（６，７
１，７４，７５）およびノーザンブロッティング分析
（４７，７１）によって測定される。ＰＣＴＩ遺伝子の
組織化および発現は、追加の正常細胞ラインおよび腫瘍
由来細胞ラインにおいても測定される。これらには、正
常ヒト皮膚繊維芽細胞、表皮ケラチノサイト、メラノサ
イト、乳房上皮細胞および結腸上皮細胞；並びにサルコ
ーマ、血液悪性腫瘍、メラノーマ、中枢神経系腫瘍およ
び種々のカルチノーマ（乳癌、結腸直腸癌等）からの腫
瘍由来細胞ラインが含まれる。ダンニングラット背側前
立腺アデノカルチノーマ系（７，８９）を含むラット前
立腺モデル系は、ＰＣＴＩ遺伝子の機能的性質の決定に
有用であることが立証されるので、これらの系もまた評
価される。上記研究は、ＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入
された腫瘍由来のＣＲＥＦ細胞から単離されたＰＣＴＩ
遺伝子の発現の分布に関する情報を提供する。
示すヒト前立腺細胞ラインにおけるＰＣＴＩ遺伝子の発
現 ＬＮＣａＰ・ＤＮＡ形質導入腫瘍由来ＣＲＥＦ細胞に由
来するＰＣＴＩ遺伝子の、正常前立腺、ＢＰＨおよび前
立腺カルチノーマ細胞ライン（８）における組織化およ
び発現が、先に説明したようにして、サザン（６，７
１，７４，７５）およびノーザンブロッティング分析
（４７，７１）によって測定される。ＰＣＴＩ遺伝子の
組織化および発現は、追加の正常細胞ラインおよび腫瘍
由来細胞ラインにおいても測定される。これらには、正
常ヒト皮膚繊維芽細胞、表皮ケラチノサイト、メラノサ
イト、乳房上皮細胞および結腸上皮細胞；並びにサルコ
ーマ、血液悪性腫瘍、メラノーマ、中枢神経系腫瘍およ
び種々のカルチノーマ（乳癌、結腸直腸癌等）からの腫
瘍由来細胞ラインが含まれる。ダンニングラット背側前
立腺アデノカルチノーマ系（７，８９）を含むラット前
立腺モデル系は、ＰＣＴＩ遺伝子の機能的性質の決定に
有用であることが立証されるので、これらの系もまた評
価される。上記研究は、ＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入
された腫瘍由来のＣＲＥＦ細胞から単離されたＰＣＴＩ
遺伝子の発現の分布に関する情報を提供する。
【００８６】前立腺カルチノーマ発生の異なった段階を
表わす一次前立腺組織におけるＰＣＴＩ遺伝子の発現 ＰＣＴＩ遺伝子が、ヒト前立腺カルチノーマ細胞におい
てイン・ビボで発現するか否かを決定することが重要で
ある。ＲＮＡは、正常前立腺、ＢＰＨ、種々のグリーソ
ン段階の前立腺カルチノーマ、並びに先に記述された技
術（９０）を用いて骨に転移した前立腺カルチノーマか
ら抽出される。これらのＲＮＡは、ＰＣＴＩ遺伝子の発
現レベルを測定するために、スロット- ブロット（９
０）及びノーザンブロッティング（４７）によって分析
される。ＲＮＡの発現および負荷を正規化するために、
ブロットはグリセルアルデヒド燐酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰＤＨ）で再ブロットされる。
表わす一次前立腺組織におけるＰＣＴＩ遺伝子の発現 ＰＣＴＩ遺伝子が、ヒト前立腺カルチノーマ細胞におい
てイン・ビボで発現するか否かを決定することが重要で
ある。ＲＮＡは、正常前立腺、ＢＰＨ、種々のグリーソ
ン段階の前立腺カルチノーマ、並びに先に記述された技
術（９０）を用いて骨に転移した前立腺カルチノーマか
ら抽出される。これらのＲＮＡは、ＰＣＴＩ遺伝子の発
現レベルを測定するために、スロット- ブロット（９
０）及びノーザンブロッティング（４７）によって分析
される。ＲＮＡの発現および負荷を正規化するために、
ブロットはグリセルアルデヒド燐酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰＤＨ）で再ブロットされる。
【００８７】ＰＣＴＩ遺伝子が一次前立腺組織において
異なって発現したならば、この遺伝子はｐＧＥＭ-4また
はＳＫベクター中にサブクローニングされ、その場での
ハイブリダイゼーションにより（９１）、正常前立腺、
ＢＰＨおよび前立腺カルチノーマ組織からの凍結組織切
片におけるＰＣＴＩ遺伝子の発現が測定される。特異的
なヒトクロモソームを保持したゲッ歯類- ヒト・ハイブ
リッド及びサザンブロッティング分析を用いることによ
って、研究は、ヒト・ゲノムにおけるＰＣＴＩ遺伝子の
染色体上での位置を決定するためにも行なわれる （７
１）。
異なって発現したならば、この遺伝子はｐＧＥＭ-4また
はＳＫベクター中にサブクローニングされ、その場での
ハイブリダイゼーションにより（９１）、正常前立腺、
ＢＰＨおよび前立腺カルチノーマ組織からの凍結組織切
片におけるＰＣＴＩ遺伝子の発現が測定される。特異的
なヒトクロモソームを保持したゲッ歯類- ヒト・ハイブ
リッド及びサザンブロッティング分析を用いることによ
って、研究は、ヒト・ゲノムにおけるＰＣＴＩ遺伝子の
染色体上での位置を決定するためにも行なわれる （７
１）。
【００８８】ヒト前立腺カルチノーマ（ＬＮＣａＰ）細
胞から誘導されたＰＣＴＩ遺伝子の機能的研究 重要な問題は、ＣＲＥＦ細胞内で発現した単離されたＰ
ＣＴＩ遺伝子が腫瘍誘導遺伝子として機能し得るか否
か、および／または正常なヒト、ラット及びマウスの前
立腺細胞で発現されたときに該遺伝子が腫瘍誘導遺伝子
として機能し得るか否かである。研究はまた、ヒトＢＰ
Ｈ並びにヒト、ラット及びマウスの前立腺カルチノーマ
細胞の寒天中での増殖及びヌードマウスにおける腫瘍形
成によって示されるように、ＰＣＴＩ遺伝子が発現型を
変更し得るか否かを決定するためにも行なわれる。前立
腺カルチノーマの誘導において、ＰＣＴＩ遺伝子がｒａ
ｓ及びｍｙｃのような他の癌遺伝子と共働し得るか否か
を決定するための有用なモデル系は、トーマス等によっ
て記述されたマウスの再構築器官系である（９２）。こ
の系において、正常マウス前立腺細胞におけるｒａｓの
発現は血管形成と組合わされた形成異常をもたらし、ｍ
ｙｃはこれがなければ正常に発生する前立腺の過形成を
誘発し、またｒａｓとｍｙｃとの組合わせは一次カルチ
ノーマを誘発する（９２）。
胞から誘導されたＰＣＴＩ遺伝子の機能的研究 重要な問題は、ＣＲＥＦ細胞内で発現した単離されたＰ
ＣＴＩ遺伝子が腫瘍誘導遺伝子として機能し得るか否
か、および／または正常なヒト、ラット及びマウスの前
立腺細胞で発現されたときに該遺伝子が腫瘍誘導遺伝子
として機能し得るか否かである。研究はまた、ヒトＢＰ
Ｈ並びにヒト、ラット及びマウスの前立腺カルチノーマ
細胞の寒天中での増殖及びヌードマウスにおける腫瘍形
成によって示されるように、ＰＣＴＩ遺伝子が発現型を
変更し得るか否かを決定するためにも行なわれる。前立
腺カルチノーマの誘導において、ＰＣＴＩ遺伝子がｒａ
ｓ及びｍｙｃのような他の癌遺伝子と共働し得るか否か
を決定するための有用なモデル系は、トーマス等によっ
て記述されたマウスの再構築器官系である（９２）。こ
の系において、正常マウス前立腺細胞におけるｒａｓの
発現は血管形成と組合わされた形成異常をもたらし、ｍ
ｙｃはこれがなければ正常に発生する前立腺の過形成を
誘発し、またｒａｓとｍｙｃとの組合わせは一次カルチ
ノーマを誘発する（９２）。
【００８９】ＤＮＡ形質転換および発現研究
最初に、ＰＣＴＩ遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子（お
よびネオマイシン耐性遺伝子を含む複製欠損レトロウイ
ルスベクター）を含む適切な哺乳類発現ベクター系に挿
入され、ＣＲＥＦ細胞中に形質導入（またはレトロウイ
ルスの場合には感染）された。ＰＣＴＩ遺伝子を発現す
るこれらの形質導入細胞が腫瘍を誘発すれば、この腫瘍
は切除され、適切な遺伝子の存在を分析され（サザン分
析）（１４）、またその発現が分析される（ノーザン分
析）（４７）。また、ＰＣＴＩ遺伝子を発現する腫瘍由
来のＣＲＥＦ細胞が、その細胞表面に、上記で開発した
ＭｏＡｂｓによって認識されるＴＡＡｓを発現するか否
かを決定することもできる。陽性の結果は、クローニン
グされた遺伝子が、ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ細胞へ
公式に導入された腫瘍誘導遺伝子エレメントであるとの
仮定を支持する。
よびネオマイシン耐性遺伝子を含む複製欠損レトロウイ
ルスベクター）を含む適切な哺乳類発現ベクター系に挿
入され、ＣＲＥＦ細胞中に形質導入（またはレトロウイ
ルスの場合には感染）された。ＰＣＴＩ遺伝子を発現す
るこれらの形質導入細胞が腫瘍を誘発すれば、この腫瘍
は切除され、適切な遺伝子の存在を分析され（サザン分
析）（１４）、またその発現が分析される（ノーザン分
析）（４７）。また、ＰＣＴＩ遺伝子を発現する腫瘍由
来のＣＲＥＦ細胞が、その細胞表面に、上記で開発した
ＭｏＡｂｓによって認識されるＴＡＡｓを発現するか否
かを決定することもできる。陽性の結果は、クローニン
グされた遺伝子が、ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ細胞へ
公式に導入された腫瘍誘導遺伝子エレメントであるとの
仮定を支持する。
【００９０】次に、正常なマウス、ラット及びヒトの前
立腺細胞におけるＰＣＴＩ遺伝子の発現が、部分的（不
死）または完全（ヌードマウスにおける固定非依存性(a
nchorage independence)および腫瘍形成能）な形質転換
発現型を誘導するか否かが決定される。これらの研究
は、ＰＣＴＩ遺伝子を適切な標的細胞中に形質導入し、
Ｇ414 耐性について選択し、また個々のクローンを単離
することによって行なわれる（９３）。次いで、これら
クローンは生物学的（１）および分子的（１４，４７，
９３）に分析され、それらがＰＣＴＩ遺伝子を含み且つ
発現するか否か、並びにそれらが発現型の後天的変更を
有しているか否かが決定される。また、先に記述された
プロトコール（１，９５）を用いて、ヌードマウスにお
けるこれら形質転換された前立腺細胞の腫瘍形性能およ
び転移能が決定される。ＰＣＴＩ遺伝子がこれら細胞を
腫瘍形成状態および／または転移状態に進行させ得るか
否かを決定するために、同様の研究がヒトＢＰＨ細胞に
おいて行なわれる。ダニングラットの前立腺アデノカル
チノーマ細胞およびヒト前立腺のカルチノーマ細胞でＰ
ＣＴＩ遺伝子を発現させることによって、形質転換細胞
のヌードマウス内での腫瘍形成能および転移能の調節に
おけるＰＣＴＩ遺伝子の役割を、更に探求することが可
能である。ＰＴＣＩ遺伝子がそれ自身により、またはｒ
ａｓ若しくはｍｙｃとの組合わせにより、再構築された
マウス前立腺においてカルチノーマを誘導するか否かを
決定するために、実験はまた、トンプソン等（９２）に
よって記述されたようにして行なわれる。上記のこれら
研究は、ヒト前立腺カルチノーマの発生におけるＰＴＣ
Ｉ遺伝子の推定される機能的役割に関する価値ある情報
を提供する。
立腺細胞におけるＰＣＴＩ遺伝子の発現が、部分的（不
死）または完全（ヌードマウスにおける固定非依存性(a
nchorage independence)および腫瘍形成能）な形質転換
発現型を誘導するか否かが決定される。これらの研究
は、ＰＣＴＩ遺伝子を適切な標的細胞中に形質導入し、
Ｇ414 耐性について選択し、また個々のクローンを単離
することによって行なわれる（９３）。次いで、これら
クローンは生物学的（１）および分子的（１４，４７，
９３）に分析され、それらがＰＣＴＩ遺伝子を含み且つ
発現するか否か、並びにそれらが発現型の後天的変更を
有しているか否かが決定される。また、先に記述された
プロトコール（１，９５）を用いて、ヌードマウスにお
けるこれら形質転換された前立腺細胞の腫瘍形性能およ
び転移能が決定される。ＰＣＴＩ遺伝子がこれら細胞を
腫瘍形成状態および／または転移状態に進行させ得るか
否かを決定するために、同様の研究がヒトＢＰＨ細胞に
おいて行なわれる。ダニングラットの前立腺アデノカル
チノーマ細胞およびヒト前立腺のカルチノーマ細胞でＰ
ＣＴＩ遺伝子を発現させることによって、形質転換細胞
のヌードマウス内での腫瘍形成能および転移能の調節に
おけるＰＣＴＩ遺伝子の役割を、更に探求することが可
能である。ＰＴＣＩ遺伝子がそれ自身により、またはｒ
ａｓ若しくはｍｙｃとの組合わせにより、再構築された
マウス前立腺においてカルチノーマを誘導するか否かを
決定するために、実験はまた、トンプソン等（９２）に
よって記述されたようにして行なわれる。上記のこれら
研究は、ヒト前立腺カルチノーマの発生におけるＰＴＣ
Ｉ遺伝子の推定される機能的役割に関する価値ある情報
を提供する。
【００９１】ＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入された腫瘍
由来のＣＲＥＦ細胞に対して開発されたモノクローナル
抗体（ＭｏＡｂｓ）の特徴付け 腫瘍性の発現型は、組織学的タイプの異なる腫瘍に対し
て特異的な新規な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サブセットの
表面発現によって特徴付けられることが多い。ある場合
には、腫瘍形成性の発現型を誘導する遺伝子エレメント
が、これら表面ＴＡＡｓをもコードすることは可能であ
る。ＣＲＥＦ細胞中に形質導入されたＰＣＴＩ遺伝子と
前立腺カルチノーマ発現型の発現との間の直接的な関係
があることが、ＬＮＣａＰ細胞と反応するＭｏＡｂｓを
生成させるためにＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入された
腫瘍由来のＣＲＥＦ細胞を使用できることによって示唆
される。ＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入された腫瘍由来
のＣＲＥＦ細胞は、高度の特異的活性を有するＣＲＥＦ
ポリクローナル抗血清でコートされ、マウスに注射され
る。これら動物からの血清はＬＮＣａＰ細胞と反応する
ポリクローナル抗体を含んでおり、またこれら動物から
の脾臓は、ＬＮＣａＰおよびＰＣ3 を含むヒト前立腺カ
ルチノーマ細胞と特異的に反応するＭｏＡｂｓを生成さ
せるために用いられた。これら同じＭｏＡｂｓは、他の
組織学的に異なるヒト腫瘍からのＤＮＡで形質転換され
たＣＲＥＦまたはＣＲＥＦ細胞と交差反応せず、また正
常なヒト皮膚繊維芽細胞、メラノーマ、乳癌、グリア芽
細胞腫多形または結腸直腸カルチノーマとも反応しな
い。ＬＮＣａＰとは反応するが、上記に挙げたタイプの
細胞またはＰＣ3 細胞とは交差反応しないＭｏＡｂｓも
また、上記のアプローチを用いて単離されている。
由来のＣＲＥＦ細胞に対して開発されたモノクローナル
抗体（ＭｏＡｂｓ）の特徴付け 腫瘍性の発現型は、組織学的タイプの異なる腫瘍に対し
て特異的な新規な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サブセットの
表面発現によって特徴付けられることが多い。ある場合
には、腫瘍形成性の発現型を誘導する遺伝子エレメント
が、これら表面ＴＡＡｓをもコードすることは可能であ
る。ＣＲＥＦ細胞中に形質導入されたＰＣＴＩ遺伝子と
前立腺カルチノーマ発現型の発現との間の直接的な関係
があることが、ＬＮＣａＰ細胞と反応するＭｏＡｂｓを
生成させるためにＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入された
腫瘍由来のＣＲＥＦ細胞を使用できることによって示唆
される。ＬＮＣａＰ・ＤＮＡを形質導入された腫瘍由来
のＣＲＥＦ細胞は、高度の特異的活性を有するＣＲＥＦ
ポリクローナル抗血清でコートされ、マウスに注射され
る。これら動物からの血清はＬＮＣａＰ細胞と反応する
ポリクローナル抗体を含んでおり、またこれら動物から
の脾臓は、ＬＮＣａＰおよびＰＣ3 を含むヒト前立腺カ
ルチノーマ細胞と特異的に反応するＭｏＡｂｓを生成さ
せるために用いられた。これら同じＭｏＡｂｓは、他の
組織学的に異なるヒト腫瘍からのＤＮＡで形質転換され
たＣＲＥＦまたはＣＲＥＦ細胞と交差反応せず、また正
常なヒト皮膚繊維芽細胞、メラノーマ、乳癌、グリア芽
細胞腫多形または結腸直腸カルチノーマとも反応しな
い。ＬＮＣａＰとは反応するが、上記に挙げたタイプの
細胞またはＰＣ3 細胞とは交差反応しないＭｏＡｂｓも
また、上記のアプローチを用いて単離されている。
【００９２】以前の研究においては、急性リンパ性白血
病（ＡＬＬ） （９６）または膵臓アデノカルチノーマ
細胞ライン（ＨＰＡＦ）（９７）からのＤＮＡを形質導
入されたＮＩＨ 3T3細胞は、形態学的に形質転換された
フォーカスを形成した。これらの形態学的に形質転換さ
れたＮＩＨ3T3 細胞は、次いで、ＮＩＨ3T3 細胞とは反
応しないが、組織学的に同一であるヒト組織細胞膜上の
エピトープに結合するＭｏＡｂｓを開発するために用い
られた。ＡＬＬ- ＤＮＡで形質導入／形質転換されたＮ
ＩＨ3T3 由来のＭｏＡｂｓの場合、ＡＬＬ- ＤＮＡで形
質導入／形質転換されたＮＩＨ3T3 細胞、並びに新鮮な
ヒト白血病細胞ライン、培養された白血病細胞ライン、
Ｔ細胞ラインおよび正常ヒト造血細胞（９６）との反応
性が観察された。ＨＰＡＦ- ＤＮＡで形質導入／形質転
換されたＮＩＨ3T3 由来のＭｏＡｂｓの場合は、ＨＰＡ
Ｆ細胞ライン、並びに別の６個のヒト膵臓アデノカルチ
ノーマ細胞ラインとの反応性が見出だされた。これとは
対照的に、ＨＰＡＦ- ＤＮＡで形質導入／形質転換され
たＮＩＨ3T3 由来のＭｏＡｂｓは、リンパ芽球腫瘍細胞
ライン（ミエロイド(K562 及びHL- 60) 、Ｔ細胞ライン
(CEM,MOLT 及びRESKW3）、Ｂ細胞ライン(SB,Daudi,WIL-
2 及びCALLA)、メラノーマ細胞ライン、前立腺カルチノ
ーマ細胞ラインまたは正常細胞ライン（皮膚繊維芽細胞
および正常膵臓）との交差反応性を示さなかった。腫瘍
由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入されたＣＲＥＦ細
胞に対して生成されたＭｏＡｂｓを用いて行なわれた上
記に記載のこれら実験および研究によって、以下のこと
が示唆される：(a) ヒト腫瘍関連抗原は異種のマウス細
胞およびラット細胞内に導入されて発現され得る；(b)
形質導入された細胞は、異なった組織タイプのヒト組織
と特異的かつ限定的な反応性を示すＭｏＡｂｓを生成さ
せるために用いられ得る。腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮ
Ａで形質導入されたＣＲＥＦ細胞に対して生成されたＭ
ｏＡｂｓを、前立腺カルチノーマの診断および最終的に
はその治療のための可能な手段として更に特徴付けるた
めに、以下に記載する実験が計画される。
病（ＡＬＬ） （９６）または膵臓アデノカルチノーマ
細胞ライン（ＨＰＡＦ）（９７）からのＤＮＡを形質導
入されたＮＩＨ 3T3細胞は、形態学的に形質転換された
フォーカスを形成した。これらの形態学的に形質転換さ
れたＮＩＨ3T3 細胞は、次いで、ＮＩＨ3T3 細胞とは反
応しないが、組織学的に同一であるヒト組織細胞膜上の
エピトープに結合するＭｏＡｂｓを開発するために用い
られた。ＡＬＬ- ＤＮＡで形質導入／形質転換されたＮ
ＩＨ3T3 由来のＭｏＡｂｓの場合、ＡＬＬ- ＤＮＡで形
質導入／形質転換されたＮＩＨ3T3 細胞、並びに新鮮な
ヒト白血病細胞ライン、培養された白血病細胞ライン、
Ｔ細胞ラインおよび正常ヒト造血細胞（９６）との反応
性が観察された。ＨＰＡＦ- ＤＮＡで形質導入／形質転
換されたＮＩＨ3T3 由来のＭｏＡｂｓの場合は、ＨＰＡ
Ｆ細胞ライン、並びに別の６個のヒト膵臓アデノカルチ
ノーマ細胞ラインとの反応性が見出だされた。これとは
対照的に、ＨＰＡＦ- ＤＮＡで形質導入／形質転換され
たＮＩＨ3T3 由来のＭｏＡｂｓは、リンパ芽球腫瘍細胞
ライン（ミエロイド(K562 及びHL- 60) 、Ｔ細胞ライン
(CEM,MOLT 及びRESKW3）、Ｂ細胞ライン(SB,Daudi,WIL-
2 及びCALLA)、メラノーマ細胞ライン、前立腺カルチノ
ーマ細胞ラインまたは正常細胞ライン（皮膚繊維芽細胞
および正常膵臓）との交差反応性を示さなかった。腫瘍
由来のＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入されたＣＲＥＦ細
胞に対して生成されたＭｏＡｂｓを用いて行なわれた上
記に記載のこれら実験および研究によって、以下のこと
が示唆される：(a) ヒト腫瘍関連抗原は異種のマウス細
胞およびラット細胞内に導入されて発現され得る；(b)
形質導入された細胞は、異なった組織タイプのヒト組織
と特異的かつ限定的な反応性を示すＭｏＡｂｓを生成さ
せるために用いられ得る。腫瘍由来のＬＮＣａＰ・ＤＮ
Ａで形質導入されたＣＲＥＦ細胞に対して生成されたＭ
ｏＡｂｓを、前立腺カルチノーマの診断および最終的に
はその治療のための可能な手段として更に特徴付けるた
めに、以下に記載する実験が計画される。
【００９３】ＬＮＣａＰ細胞と反応するこの開発された
ＭｏＡｂｓは、先に既述されたようにして特徴付けられ
る（９８）。これらの研究は、ホルマリン固定された正
常ヒト細胞ライン（前立腺上皮、結腸上皮、乳房上皮
等）および腫瘍由来のヒト細胞ライン（ＢＰＨ、前立腺
カルチノーマ、骨からの転移性前立腺カルチノーマ、結
腸直腸カルチノーマ、乳癌等）とのＭｏＡｂｓの反応性
に関する、ＥＬＩＳＡによる広範な分析を含んでいる。
下記の(a) 〜(d) を決定するために、先に記述されたよ
うにして（９８−１００）追加の研究が行なわれる：即
ち、(a) 該ＭｏＡｂｓと反応する抗原性エピトープが培
養液中に脱落されるか否か；(b) 生きた透過性にされた
正常前立腺細胞、ＢＰＨ細胞および前立腺カルチノーマ
細胞における、ＦＡＣＳ分析によるＭｏＡｂｓの発現；
(c) ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を用いた、
ＭｏＡｂｓによって認識されるエピトープの分子量；
(d) 種々の酵素（フコシダーゼ、β- グルコシダーゼ、
β- ガラクトシダーゼ、混合グリコシダーゼ、過ヨウ素
酸、マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及びプロテアー
ゼ）を用いた、ＭｏＡｂｓにより認識される抗原の生化
学的性質。ＭｏＡｂｓはまた、前立腺細胞タイプ及び追
加の細胞タイプの同定に関して、前立腺特異的抗原（Ｐ
Ａ）およびプロスタティック酸ホスファターゼ（ＰＡ
Ｐ）ＭｏＡｂｓと比較される。ＰＡおよびＰＡＰは前立
腺癌の初期マーカとして有用ではないが、疾患の再発お
よび治療応答のモニターには有用である。従って、どの
ようにしてＭｏＡｂｓをこれら確立された免疫学的試薬
と比較するか、並びに該ＭｏＡｂｓにより認識されるエ
ピトープが正常な前立腺、ＢＰＨおよび／または前立腺
カルチノーマ細胞に存在するか否かを決定することは興
味深いものである。
ＭｏＡｂｓは、先に既述されたようにして特徴付けられ
る（９８）。これらの研究は、ホルマリン固定された正
常ヒト細胞ライン（前立腺上皮、結腸上皮、乳房上皮
等）および腫瘍由来のヒト細胞ライン（ＢＰＨ、前立腺
カルチノーマ、骨からの転移性前立腺カルチノーマ、結
腸直腸カルチノーマ、乳癌等）とのＭｏＡｂｓの反応性
に関する、ＥＬＩＳＡによる広範な分析を含んでいる。
下記の(a) 〜(d) を決定するために、先に記述されたよ
うにして（９８−１００）追加の研究が行なわれる：即
ち、(a) 該ＭｏＡｂｓと反応する抗原性エピトープが培
養液中に脱落されるか否か；(b) 生きた透過性にされた
正常前立腺細胞、ＢＰＨ細胞および前立腺カルチノーマ
細胞における、ＦＡＣＳ分析によるＭｏＡｂｓの発現；
(c) ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を用いた、
ＭｏＡｂｓによって認識されるエピトープの分子量；
(d) 種々の酵素（フコシダーゼ、β- グルコシダーゼ、
β- ガラクトシダーゼ、混合グリコシダーゼ、過ヨウ素
酸、マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及びプロテアー
ゼ）を用いた、ＭｏＡｂｓにより認識される抗原の生化
学的性質。ＭｏＡｂｓはまた、前立腺細胞タイプ及び追
加の細胞タイプの同定に関して、前立腺特異的抗原（Ｐ
Ａ）およびプロスタティック酸ホスファターゼ（ＰＡ
Ｐ）ＭｏＡｂｓと比較される。ＰＡおよびＰＡＰは前立
腺癌の初期マーカとして有用ではないが、疾患の再発お
よび治療応答のモニターには有用である。従って、どの
ようにしてＭｏＡｂｓをこれら確立された免疫学的試薬
と比較するか、並びに該ＭｏＡｂｓにより認識されるエ
ピトープが正常な前立腺、ＢＰＨおよび／または前立腺
カルチノーマ細胞に存在するか否かを決定することは興
味深いものである。
【００９４】ＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍
由来ＣＲＥＦ細胞に対して開発されたＭｏＡｂｓの、ヒ
ト組織に対する反応性スペクトル ＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由来ＣＲＥＦ
細胞に対して開発されたＭｏＡｂｓが、患者から得た前
立腺カルチノーマ組織上の抗原性エピトープを認識でき
るか否かを決定することは重要である。従って、ＭｏＡ
ｂｓが、正常な前立腺、ＢＰＨ、前立腺カルチノーマお
よび前立腺カルチノーマ転移を含む骨切片からの、凍結
され且つホルマリン固定／パラフィン埋設された組織に
おける前立腺細胞を同定できるか否かを確認するため
に、研究が行なわれる。ＭｏＡｂｓが脱落した抗原性エ
ピトープを検出できならば、（異なったグリーソン度
の）前立腺カルチノーマをもった患者および骨に転移し
た前立腺カルチノーマをもった患者からの尿、精液分泌
物および血液サンプルがこれら抗原を含んでいるかどう
かが決定される。同様に、ＭｏＡｂｓによって認識され
る抗原性エピトープの発現と前立腺カルチノーマとの間
に良好な相関が観察されるならば、該ＭｏＡｂｓが、広
範なスペクトルの追加の正常細胞および腫瘍細胞（異な
った組織起源のもの）と反応し得るか否かを決定するこ
とができる。これら全ての研究のために、適切な比較対
照試薬としてＰＡおよびＰＡＰが用いられる。こらら研
究は、開発されたＭｏＡｂｓが、ヒトにおける前立腺癌
の診断に有用であり得るか否か、並びにＰＡおよびＰＡ
Ｐ・ＭｏＡｂｓに優る何等かの選択的利点を提供するか
否かを決定するために必要である。
由来ＣＲＥＦ細胞に対して開発されたＭｏＡｂｓの、ヒ
ト組織に対する反応性スペクトル ＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由来ＣＲＥＦ
細胞に対して開発されたＭｏＡｂｓが、患者から得た前
立腺カルチノーマ組織上の抗原性エピトープを認識でき
るか否かを決定することは重要である。従って、ＭｏＡ
ｂｓが、正常な前立腺、ＢＰＨ、前立腺カルチノーマお
よび前立腺カルチノーマ転移を含む骨切片からの、凍結
され且つホルマリン固定／パラフィン埋設された組織に
おける前立腺細胞を同定できるか否かを確認するため
に、研究が行なわれる。ＭｏＡｂｓが脱落した抗原性エ
ピトープを検出できならば、（異なったグリーソン度
の）前立腺カルチノーマをもった患者および骨に転移し
た前立腺カルチノーマをもった患者からの尿、精液分泌
物および血液サンプルがこれら抗原を含んでいるかどう
かが決定される。同様に、ＭｏＡｂｓによって認識され
る抗原性エピトープの発現と前立腺カルチノーマとの間
に良好な相関が観察されるならば、該ＭｏＡｂｓが、広
範なスペクトルの追加の正常細胞および腫瘍細胞（異な
った組織起源のもの）と反応し得るか否かを決定するこ
とができる。これら全ての研究のために、適切な比較対
照試薬としてＰＡおよびＰＡＰが用いられる。こらら研
究は、開発されたＭｏＡｂｓが、ヒトにおける前立腺癌
の診断に有用であり得るか否か、並びにＰＡおよびＰＡ
Ｐ・ＭｏＡｂｓに優る何等かの選択的利点を提供するか
否かを決定するために必要である。
【００９５】ＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍
由来ＣＲＥＦ細胞に対して開発されたＭｏＡｂｓによっ
て認識される、ＴＡＡｓの潜在的機能をアドレスするた
めの生物学的研究 現在、ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ細胞中に導入された
ＴＣＴＩ遺伝子の役割は知られていない。この問題への
アドレスを開始するために、ＬＮＣａＰ細胞およびＬＮ
ＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由来ＣＲＥＦ細胞
がＭｏＡｂｓでコートされ、単層および／または寒天懸
濁液中での増殖が変更するか否かが決定される（９
４）。ＭｏＡｂでコートされた細胞はまた、ヌードマウ
スへ移植した後の腫瘍発生および増殖の変化について評
価される（９７）。上記実験のための適切な対照とし
て、(a) ＰＡおよびＰＡＰでコートされた、ＬＮＣａＰ
細胞およびＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由
来ＣＲＥＦ細胞、(b) ＬＮＣａＰ細胞およびＬＮＣａＰ
・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由来ＣＲＥＦ細胞であっ
て、これら細胞と結合しない高分子量メラノーマ関連抗
体のような非反応製抗体と共にインキュベートされた細
胞について同様の研究が行なわれる。何れかのＭｏＡｂ
ｓがヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ細胞の腫瘍形成を
抑制するならば、この研究は、該ＭｏＡｂｓと反応する
追加の前立腺カルチノーマに対するこれらＭｏＡｂｓの
効果の評価を含むように拡大される。陰性の結果は有益
ではないが、前立腺カルチノーマ細胞でのＭｏＡｂｓに
よる固定依存性増殖および／または腫瘍形成の抑制は、
ＰＣＴＩ遺伝子にコードされたＴＡＡａとヒト前立腺カ
ルチノーマ細胞における形質転換状態との間に関係があ
ることについての強力な証拠を与える。加えて、陽性の
結果が得られるならば、同定されたＭｏＡｂｓは、前立
腺癌の治療のための毒素または高エネルギー放射性核種
と結合された後に有用であることが立証され得る（１０
２）。
由来ＣＲＥＦ細胞に対して開発されたＭｏＡｂｓによっ
て認識される、ＴＡＡｓの潜在的機能をアドレスするた
めの生物学的研究 現在、ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ細胞中に導入された
ＴＣＴＩ遺伝子の役割は知られていない。この問題への
アドレスを開始するために、ＬＮＣａＰ細胞およびＬＮ
ＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由来ＣＲＥＦ細胞
がＭｏＡｂｓでコートされ、単層および／または寒天懸
濁液中での増殖が変更するか否かが決定される（９
４）。ＭｏＡｂでコートされた細胞はまた、ヌードマウ
スへ移植した後の腫瘍発生および増殖の変化について評
価される（９７）。上記実験のための適切な対照とし
て、(a) ＰＡおよびＰＡＰでコートされた、ＬＮＣａＰ
細胞およびＬＮＣａＰ・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由
来ＣＲＥＦ細胞、(b) ＬＮＣａＰ細胞およびＬＮＣａＰ
・ＤＮＡで形質導入された腫瘍由来ＣＲＥＦ細胞であっ
て、これら細胞と結合しない高分子量メラノーマ関連抗
体のような非反応製抗体と共にインキュベートされた細
胞について同様の研究が行なわれる。何れかのＭｏＡｂ
ｓがヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ細胞の腫瘍形成を
抑制するならば、この研究は、該ＭｏＡｂｓと反応する
追加の前立腺カルチノーマに対するこれらＭｏＡｂｓの
効果の評価を含むように拡大される。陰性の結果は有益
ではないが、前立腺カルチノーマ細胞でのＭｏＡｂｓに
よる固定依存性増殖および／または腫瘍形成の抑制は、
ＰＣＴＩ遺伝子にコードされたＴＡＡａとヒト前立腺カ
ルチノーマ細胞における形質転換状態との間に関係があ
ることについての強力な証拠を与える。加えて、陽性の
結果が得られるならば、同定されたＭｏＡｂｓは、前立
腺癌の治療のための毒素または高エネルギー放射性核種
と結合された後に有用であることが立証され得る（１０
２）。
【００９６】結果および考察
ヒト前立腺カルチノーマ細胞ライン、ＬＮＣａＰ及びｐ
ＳＶ２ｎｅｏからのＤＮＡを同時形質導入されたＣＲＥ
Ｆ細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍を誘導する。１°
（第一形質導入）および２°（第二形質導入）の腫瘍由
来ＣＲＥＦ細胞は、ヒトＡｌｕ配列を含む。全ての腫瘍
は、略7.5 kbの共通のＡｌｕフラグメントに加えて、一
見して独特のＡｌｕフラグメントを含む（図１）。この
所見は、これらヒト前立腺カルチノーマ細胞に由来する
推定の腫瘍誘導遺伝子が、このＤＮＡ配列に隣接して位
置することを示唆する。ヒト前立腺ＤＮＡを形質導入さ
れたＣＲＥＦ細胞を注射したヌードマウスから誘導され
た１°及び２°腫瘍を用いて、腫瘍細胞発現型を媒介す
る遺伝子を単離するために種々の戦略が使用され得る。
一つのアプローチは、１°および２°の腫瘍由来ＣＲＥ
Ｆトランスフェクタントに見られるＡｌｕ陽性シグナル
に対応したＤＮＡを用いて、ＥＭＢＬ３ファージ内のゲ
ノムＤＮＡライブラリーを調製することである。次い
で、Ａｌｕ陽性クローンが同定され、サブクローニング
され、ノーザンブロッティングによってエキソンの存在
が決定され得る。ノーザンブロット上の同じ大きさのＲ
ＮＡにハイブリダイズするサブクローンは、シーケンシ
ングによって更に特徴付けられる。これらは、ゲノムラ
イブラリー又はｃＤＮＡ・ＬＮＣａＰライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとして使用され得る。
第二のアプローチは、ポリメラーゼチェインリアクショ
ン（ＰＣＲ）によって、１°および２°腫瘍由来ＣＲＥ
Ｆトランス６トランスフェクタントにおけるこれら配列
に隣接したＤＮＡを同定および増幅するために、Ａｌｕ
特異性プローブを用いることである。次に、これらの増
幅されたＤＮＡ配列は発現ベクター系に直接クローニン
グされ、ヌードマウスにおける腫瘍誘導能について試験
される。第三のアプローチは、ＣＲＥＦ・ＮＭＴ４細胞
およびＣＲＥＦ- トランス６細胞から減法ライブラリー
を作製することである。更に別のアプローチは、ＣＲＥ
Ｆ細胞内での腫瘍形成を媒介し、ヒトの前立腺カルチノ
ーマ発生に含まれ得るＬＮＣａＰ細胞内の遺伝子を同定
し、クローニングするために用いられ得る。これらに
は、ＬＮＣａＰ・ＤＮＡをＳａｕＩＩＩＡＩで部分的に
消化しすること、30〜35kbのＤＮＡを選択すること、及
びゲノムｎｅｏ発現ベクター系内のゲノムライブラリー
を製造することが含まれる。次いで、これらＤＮＡｓは
ｎｅｏ耐性のＣＲＥＦ細胞内に形質導入され、腫瘍形成
のためにプールされた細胞集団をヌードマウスに注射す
る。上記戦略を用いて、ＬＮＣａＰ細胞由来の推定され
る腫瘍誘導遺伝子を成功裡に同定およびクローニングで
きる可能性は高い。加えて、上記に概説したアプローチ
は、ＣＲＥＥＦ- トランス６細胞中に形質導入され発現
されている他の特定のヒト悪性腫瘍からの他の腫瘍誘導
性遺伝子を同定し、クローニングするためにも用いられ
得る。一旦同定されれば、ＬＮＣａＰからのこの推定の
腫瘍誘導性遺伝子（およびＬＮＣａＰおよび他の腫瘍か
ら得た他の同定された推定の腫瘍誘導性遺伝子）は、次
いで、ヒトの正常な前立腺、良性前立腺肥大および異な
ったグリーソン段階の前立腺カルチノーマにおけるその
組織化および発現を測定するためのプローブとして用い
られ得る。
ＳＶ２ｎｅｏからのＤＮＡを同時形質導入されたＣＲＥ
Ｆ細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍を誘導する。１°
（第一形質導入）および２°（第二形質導入）の腫瘍由
来ＣＲＥＦ細胞は、ヒトＡｌｕ配列を含む。全ての腫瘍
は、略7.5 kbの共通のＡｌｕフラグメントに加えて、一
見して独特のＡｌｕフラグメントを含む（図１）。この
所見は、これらヒト前立腺カルチノーマ細胞に由来する
推定の腫瘍誘導遺伝子が、このＤＮＡ配列に隣接して位
置することを示唆する。ヒト前立腺ＤＮＡを形質導入さ
れたＣＲＥＦ細胞を注射したヌードマウスから誘導され
た１°及び２°腫瘍を用いて、腫瘍細胞発現型を媒介す
る遺伝子を単離するために種々の戦略が使用され得る。
一つのアプローチは、１°および２°の腫瘍由来ＣＲＥ
Ｆトランスフェクタントに見られるＡｌｕ陽性シグナル
に対応したＤＮＡを用いて、ＥＭＢＬ３ファージ内のゲ
ノムＤＮＡライブラリーを調製することである。次い
で、Ａｌｕ陽性クローンが同定され、サブクローニング
され、ノーザンブロッティングによってエキソンの存在
が決定され得る。ノーザンブロット上の同じ大きさのＲ
ＮＡにハイブリダイズするサブクローンは、シーケンシ
ングによって更に特徴付けられる。これらは、ゲノムラ
イブラリー又はｃＤＮＡ・ＬＮＣａＰライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとして使用され得る。
第二のアプローチは、ポリメラーゼチェインリアクショ
ン（ＰＣＲ）によって、１°および２°腫瘍由来ＣＲＥ
Ｆトランス６トランスフェクタントにおけるこれら配列
に隣接したＤＮＡを同定および増幅するために、Ａｌｕ
特異性プローブを用いることである。次に、これらの増
幅されたＤＮＡ配列は発現ベクター系に直接クローニン
グされ、ヌードマウスにおける腫瘍誘導能について試験
される。第三のアプローチは、ＣＲＥＦ・ＮＭＴ４細胞
およびＣＲＥＦ- トランス６細胞から減法ライブラリー
を作製することである。更に別のアプローチは、ＣＲＥ
Ｆ細胞内での腫瘍形成を媒介し、ヒトの前立腺カルチノ
ーマ発生に含まれ得るＬＮＣａＰ細胞内の遺伝子を同定
し、クローニングするために用いられ得る。これらに
は、ＬＮＣａＰ・ＤＮＡをＳａｕＩＩＩＡＩで部分的に
消化しすること、30〜35kbのＤＮＡを選択すること、及
びゲノムｎｅｏ発現ベクター系内のゲノムライブラリー
を製造することが含まれる。次いで、これらＤＮＡｓは
ｎｅｏ耐性のＣＲＥＦ細胞内に形質導入され、腫瘍形成
のためにプールされた細胞集団をヌードマウスに注射す
る。上記戦略を用いて、ＬＮＣａＰ細胞由来の推定され
る腫瘍誘導遺伝子を成功裡に同定およびクローニングで
きる可能性は高い。加えて、上記に概説したアプローチ
は、ＣＲＥＥＦ- トランス６細胞中に形質導入され発現
されている他の特定のヒト悪性腫瘍からの他の腫瘍誘導
性遺伝子を同定し、クローニングするためにも用いられ
得る。一旦同定されれば、ＬＮＣａＰからのこの推定の
腫瘍誘導性遺伝子（およびＬＮＣａＰおよび他の腫瘍か
ら得た他の同定された推定の腫瘍誘導性遺伝子）は、次
いで、ヒトの正常な前立腺、良性前立腺肥大および異な
ったグリーソン段階の前立腺カルチノーマにおけるその
組織化および発現を測定するためのプローブとして用い
られ得る。
【００９７】ＬＮＣａＰ細胞からのこの腫瘍誘導性遺伝
子の、前立腺カルチノーマ細胞の転移の媒介における潜
在的役割もまたアドレスされ得る。
子の、前立腺カルチノーマ細胞の転移の媒介における潜
在的役割もまたアドレスされ得る。
【００９８】上記に示したように、腫瘍性発現型は屡
々、腫瘍の異なった組織学的タイプに特異的な新規腫瘍
関連抗原（ＴＡＡ）サブセットの表面発現によって特徴
付けられる。或る場合には、腫瘍形成性発現型を誘導す
る遺伝子エレメントは、これら特異的な細胞表面ＴＡＡ
ｓをもコードすることが可能である。多くの場合、ＴＡ
Ａｓは直接的な腫瘍増殖の抑制をもたらすＭｏＡｂに基
づく治療のための適切な標的であることが立証されてい
る。腫瘍細胞発現型の誘導と特異的ＴＡＡａの発現との
間の可能な関係は、ＬＮＣａＰで形質導入された腫瘍由
来のＣＲＥＦ- トランス６細胞（ＣＲＥＦ・４・ＮＭ
Ｔ）を用いて直接に試験されている。ＣＲＥＦ- トラン
ス６細胞に対して生成された高い特異的活性のポリクロ
ーナル抗体でコートされたＣＲＥＦ・４・ＮＭＴ細胞を
マウスに注射することによって、ＣＲＥＦ・４・ＮＭＴ
細胞およびＬＮＣａＰ細胞に発現した抗原と反応するポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両者が成
功裡に生成された（表１および図２，３，４）。
々、腫瘍の異なった組織学的タイプに特異的な新規腫瘍
関連抗原（ＴＡＡ）サブセットの表面発現によって特徴
付けられる。或る場合には、腫瘍形成性発現型を誘導す
る遺伝子エレメントは、これら特異的な細胞表面ＴＡＡ
ｓをもコードすることが可能である。多くの場合、ＴＡ
Ａｓは直接的な腫瘍増殖の抑制をもたらすＭｏＡｂに基
づく治療のための適切な標的であることが立証されてい
る。腫瘍細胞発現型の誘導と特異的ＴＡＡａの発現との
間の可能な関係は、ＬＮＣａＰで形質導入された腫瘍由
来のＣＲＥＦ- トランス６細胞（ＣＲＥＦ・４・ＮＭ
Ｔ）を用いて直接に試験されている。ＣＲＥＦ- トラン
ス６細胞に対して生成された高い特異的活性のポリクロ
ーナル抗体でコートされたＣＲＥＦ・４・ＮＭＴ細胞を
マウスに注射することによって、ＣＲＥＦ・４・ＮＭＴ
細胞およびＬＮＣａＰ細胞に発現した抗原と反応するポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両者が成
功裡に生成された（表１および図２，３，４）。
【００９９】
表 １
マウス抗血清
細胞ライン 起源 CREF CREF-NMT
CREF-Trans 6 ラット胎児の
繊維芽細胞 ＋ −
CREF-NMT 4 LNCaP-形質導入された
腫瘍由来のCREF ＋ ＋
LNCaP ヒト前立腺
カルチノーマ − ＋
SW480 ヒト結腸直腸
カルチノーマ − ＋
MCF-7 ヒト乳癌 − ＋
Colo38 ヒトメラノーマ − −
ＣＲＥＦ- トランス６細胞は、ＣＲＥＦ- トランス６細
胞およびＣＲＥＦ 4 NMT細胞に対する免疫応答を行なっ
た、ヒト起源の細胞に対しては応答しなかった。対照的
に、ＣＲＥＦ- トランス６でコートされたＣＲＥＦ 4 N
MT細胞は、ＣＲＥＦ 4 NMT細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ヒト
結腸直腸カルチノーマ細胞（SW480 ）およびヒト乳癌細
胞（MCF-7 ）上の抗原を同定するが、ＣＲＥＦ- トラン
ス６細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞（WI-38 ）またはヒトメ
ラノーマ細胞（HO-1）上の抗原は同定しないポリクロー
ナル抗体応答を生起した（表１および図２）。マウスに
ＣＲＥＦ- トランス６でコートされたＣＲＥＦ 4NMT 細
胞を注射することにより製造されたポリクローナル抗体
の、滴定分析による更なる特徴付けが図３に示されてい
る。ここに見られるように、抗ＣＲＥＦ 4 NMTポリクロ
ーナル抗体はヒトの前立腺カルチノーマ細胞ライン、乳
癌細胞ラインおよび結腸直腸カルチノーマ細胞ラインに
結合することができる。次に、標準的な方法によって、
高力価ＣＲＥＦ高血清でコートされたＣＲＥＦ 4 NMTで
過免疫された動物からＭｏＡｂｓが生成された。図４に
示すように、これらのＭｏＡｂｓ（ＭｏＡｂ 1.5.6及び
ＭｏＡｂ5.3.1.3）は、ＬＮＣａＰ並びに他のヒトカル
チノーマとの良好な反応性を有している。対照的に、こ
れらのＭｏＡｂｓはＨＯ-1細胞、ＷＩ-38 細胞またはＣ
ＲＥＦ細胞には結合しない。これらの結果は、ＬＮＣａ
Ｐ・ＤＮＡからＣＲＥＦ-トランス６細胞へ導入された
遺伝子が形質導入された細胞内で発現されており、これ
らはヒト腫瘍ＤＮＡが単離された元の細胞と反応するＭ
ｏＡｂｓを生成させるために使用され得ることを明瞭に
示している。
胞およびＣＲＥＦ 4 NMT細胞に対する免疫応答を行なっ
た、ヒト起源の細胞に対しては応答しなかった。対照的
に、ＣＲＥＦ- トランス６でコートされたＣＲＥＦ 4 N
MT細胞は、ＣＲＥＦ 4 NMT細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ヒト
結腸直腸カルチノーマ細胞（SW480 ）およびヒト乳癌細
胞（MCF-7 ）上の抗原を同定するが、ＣＲＥＦ- トラン
ス６細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞（WI-38 ）またはヒトメ
ラノーマ細胞（HO-1）上の抗原は同定しないポリクロー
ナル抗体応答を生起した（表１および図２）。マウスに
ＣＲＥＦ- トランス６でコートされたＣＲＥＦ 4NMT 細
胞を注射することにより製造されたポリクローナル抗体
の、滴定分析による更なる特徴付けが図３に示されてい
る。ここに見られるように、抗ＣＲＥＦ 4 NMTポリクロ
ーナル抗体はヒトの前立腺カルチノーマ細胞ライン、乳
癌細胞ラインおよび結腸直腸カルチノーマ細胞ラインに
結合することができる。次に、標準的な方法によって、
高力価ＣＲＥＦ高血清でコートされたＣＲＥＦ 4 NMTで
過免疫された動物からＭｏＡｂｓが生成された。図４に
示すように、これらのＭｏＡｂｓ（ＭｏＡｂ 1.5.6及び
ＭｏＡｂ5.3.1.3）は、ＬＮＣａＰ並びに他のヒトカル
チノーマとの良好な反応性を有している。対照的に、こ
れらのＭｏＡｂｓはＨＯ-1細胞、ＷＩ-38 細胞またはＣ
ＲＥＦ細胞には結合しない。これらの結果は、ＬＮＣａ
Ｐ・ＤＮＡからＣＲＥＦ-トランス６細胞へ導入された
遺伝子が形質導入された細胞内で発現されており、これ
らはヒト腫瘍ＤＮＡが単離された元の細胞と反応するＭ
ｏＡｂｓを生成させるために使用され得ることを明瞭に
示している。
【０１００】ＣＲＥＦ- トランス６系は、他のヒト腫瘍
細胞ライン並びに一次ヒト腫瘍ＤＮＡサンプルからの腫
瘍誘導性遺伝子の発現について試験された。ヒト乳癌細
胞ライン（T47D）、ヒトグリア芽細胞腫多形（第IV段階
の星細胞腫）細胞ライン（GBM-18）、および一次腫瘍由
来の一次ヒトグリア芽細胞腫多形（第IV段階の星細胞
腫）ＤＮＡからのヒト腫瘍形成発現型は、成功裡に導入
された。ＣＲＥＦ-T47Dトランスフェクタントの場合、
予想されたように、ＣＲＥＦ 4 NMT細胞に見出されるも
のとは大きさの異なるＡｌｕ配列が検出された。加え
て、特異的活性の高いＣＲＥＦ抗血清を用いたこの抗体
コーティング技術を使用することによって、Ｔ４７Ｄ細
胞並びにＭＣＦ-7細胞には結合するが、ＳＷ480 細胞、
ＬＮＣａＰ細胞、ＨＯ-1細胞またはＣＲＥＦ細胞には結
合しないＭｏＡｂ（4.2.6 ）が生成された（図５）。動
物をＣＲＥＦ- トランス６抗血清でコートされたＣＲＥ
Ｆ-T47D 細胞に曝して生成された第二のＭｏＡｂ（5.1.
4 ）は、Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＣＦ-7細胞のみならず、
ＬＮＣａＰ細胞とも反応する。これらの結果は、ＭｏＡ
ｂ 5.1.4によって認識されるエピトープが乳癌細胞およ
び前立腺カルチノーマでは発現するが、ＳＷ480 細胞ま
たはＨＯ-1細胞では同程度には発現しないことを示唆す
る。多数の細胞タイプをもったこれらのＭｏＡｂｓ（並
びにＣＲＥＦ 4 NMT細胞に対して生成されたＭｏＡｂｓ
1.5.6及び5.3.1.3 ）の更なる分析、並びに切除された
腫瘍組織の分析によって、これらＭｏＡｂｓの特異性お
よび診断上の有用性が決定されるであろう。
細胞ライン並びに一次ヒト腫瘍ＤＮＡサンプルからの腫
瘍誘導性遺伝子の発現について試験された。ヒト乳癌細
胞ライン（T47D）、ヒトグリア芽細胞腫多形（第IV段階
の星細胞腫）細胞ライン（GBM-18）、および一次腫瘍由
来の一次ヒトグリア芽細胞腫多形（第IV段階の星細胞
腫）ＤＮＡからのヒト腫瘍形成発現型は、成功裡に導入
された。ＣＲＥＦ-T47Dトランスフェクタントの場合、
予想されたように、ＣＲＥＦ 4 NMT細胞に見出されるも
のとは大きさの異なるＡｌｕ配列が検出された。加え
て、特異的活性の高いＣＲＥＦ抗血清を用いたこの抗体
コーティング技術を使用することによって、Ｔ４７Ｄ細
胞並びにＭＣＦ-7細胞には結合するが、ＳＷ480 細胞、
ＬＮＣａＰ細胞、ＨＯ-1細胞またはＣＲＥＦ細胞には結
合しないＭｏＡｂ（4.2.6 ）が生成された（図５）。動
物をＣＲＥＦ- トランス６抗血清でコートされたＣＲＥ
Ｆ-T47D 細胞に曝して生成された第二のＭｏＡｂ（5.1.
4 ）は、Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＣＦ-7細胞のみならず、
ＬＮＣａＰ細胞とも反応する。これらの結果は、ＭｏＡ
ｂ 5.1.4によって認識されるエピトープが乳癌細胞およ
び前立腺カルチノーマでは発現するが、ＳＷ480 細胞ま
たはＨＯ-1細胞では同程度には発現しないことを示唆す
る。多数の細胞タイプをもったこれらのＭｏＡｂｓ（並
びにＣＲＥＦ 4 NMT細胞に対して生成されたＭｏＡｂｓ
1.5.6及び5.3.1.3 ）の更なる分析、並びに切除された
腫瘍組織の分析によって、これらＭｏＡｂｓの特異性お
よび診断上の有用性が決定されるであろう。
【０１０１】まとめとして言えば、ヒト起源のＴＡＡを
コードする遺伝子を同定し、免疫学的試薬を製造するた
めの一般的な方法が開発された。ヒト前立腺カルチノー
マ細胞に結合するポリクローナル及びＭｏＡｂｓの両者
を生成する能力によって、トランスフェクションによっ
てＣＲＥＦ細胞内に導入された腫瘍誘導遺伝子と、コー
ドされたヒト遺伝子生成物（ＴＡＡｓ）との関連が示唆
された。加えて、ＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナル
抗体技術を用いるによって、ＨＩＴＯの乳癌およびグリ
ア芽細胞腫多形を媒介し若しくはこれと関連する遺伝子
が導入され、またヒト乳癌および他のカルチノーマに発
現する抗原を認識するポリクローナル及びＭｏＡｂｓが
開発された。このＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナル
抗体技術はまた、クローン化されたヒト170,000 分子量
（P-糖蛋白）多薬剤耐性遺伝子を含めて、定義された形
質導入され発現された表面分子を同定するためにも用い
られた。ＣＲＥＦおよびヒト腫瘍（乳癌及びグリア芽細
胞腫）細胞が、クローン化されたｍｄｒ-1遺伝子で形質
導入され、コルヒチン耐性について選択され、またサザ
ン及びノーザン分析によってｍｄｒ-1遺伝子の存在およ
び発現が夫々示された。次いで、これらの形質導入され
たＣＲＥＦ細胞は、ＭＤＲ発現型を発現する形質導入さ
れたヒト乳癌細胞およびグリア芽細胞腫細胞において発
現されたP-糖蛋白と反応するＭｏＡｂｓを生成させるた
めに用いられた。
コードする遺伝子を同定し、免疫学的試薬を製造するた
めの一般的な方法が開発された。ヒト前立腺カルチノー
マ細胞に結合するポリクローナル及びＭｏＡｂｓの両者
を生成する能力によって、トランスフェクションによっ
てＣＲＥＦ細胞内に導入された腫瘍誘導遺伝子と、コー
ドされたヒト遺伝子生成物（ＴＡＡｓ）との関連が示唆
された。加えて、ＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナル
抗体技術を用いるによって、ＨＩＴＯの乳癌およびグリ
ア芽細胞腫多形を媒介し若しくはこれと関連する遺伝子
が導入され、またヒト乳癌および他のカルチノーマに発
現する抗原を認識するポリクローナル及びＭｏＡｂｓが
開発された。このＣＲＥＦ／形質導入／モノクローナル
抗体技術はまた、クローン化されたヒト170,000 分子量
（P-糖蛋白）多薬剤耐性遺伝子を含めて、定義された形
質導入され発現された表面分子を同定するためにも用い
られた。ＣＲＥＦおよびヒト腫瘍（乳癌及びグリア芽細
胞腫）細胞が、クローン化されたｍｄｒ-1遺伝子で形質
導入され、コルヒチン耐性について選択され、またサザ
ン及びノーザン分析によってｍｄｒ-1遺伝子の存在およ
び発現が夫々示された。次いで、これらの形質導入され
たＣＲＥＦ細胞は、ＭＤＲ発現型を発現する形質導入さ
れたヒト乳癌細胞およびグリア芽細胞腫細胞において発
現されたP-糖蛋白と反応するＭｏＡｂｓを生成させるた
めに用いられた。
【０１０２】
【参照文献】
【図１】サザーン・ブロット分析。ＣＲＥＦ- トランス
6 （図１においてＣＲＥＦで表わされる）からの高分子
量ＤＮＡ、ｐＳＶ2-ネオおよびＬＮＣａｐＤＮＡ（ＣＲ
ＥＦ-4 ＮＭＴ）を形質導入したＣＲＥＦ- トランス6
細胞の注入に続いてヌードマウスから得た第１の腫瘍お
よびＣＲＥＦ- トランス6 細胞をｐＳＶ2-ネオおよびＣ
ＲＥＦ 4 ＮＭＴ ＤＮＡと共にヌードマウスに注入し
た後得られた２種の独立した第２の腫瘍。サザーンブロ
ットは、 300ｂｐのニックトランスレートした32Ｐ標識
Ａｌｕプローブで調べた。
6 （図１においてＣＲＥＦで表わされる）からの高分子
量ＤＮＡ、ｐＳＶ2-ネオおよびＬＮＣａｐＤＮＡ（ＣＲ
ＥＦ-4 ＮＭＴ）を形質導入したＣＲＥＦ- トランス6
細胞の注入に続いてヌードマウスから得た第１の腫瘍お
よびＣＲＥＦ- トランス6 細胞をｐＳＶ2-ネオおよびＣ
ＲＥＦ 4 ＮＭＴ ＤＮＡと共にヌードマウスに注入し
た後得られた２種の独立した第２の腫瘍。サザーンブロ
ットは、 300ｂｐのニックトランスレートした32Ｐ標識
Ａｌｕプローブで調べた。
【図２】ＬＮＣａＰに対する、ＣＲＥＦ 4 ＮＭＴ- 固
相化およびＣＲＥＦ- トランス6 （図２においてＣＲＥ
Ｆで表わされる）固相化抗血清。ＬＮＣａＰ ＤＮＡ
（ＣＲＥＦ-4 ＮＭＴ）が形質導入されたヌードマウス
腫瘍由来ＣＲＥＦ- トランス6 細胞で免疫された動物
は、元のＬＮＣａＰ細胞に対する免疫応答を発現する。
ＬＮＣａＰ細胞からの推定ヒトＴＡＡを欠くＣＲＥＦ-
トランス6 細胞は、ＬＮＣａＰ細胞に対する免疫応答を
生じない。
相化およびＣＲＥＦ- トランス6 （図２においてＣＲＥ
Ｆで表わされる）固相化抗血清。ＬＮＣａＰ ＤＮＡ
（ＣＲＥＦ-4 ＮＭＴ）が形質導入されたヌードマウス
腫瘍由来ＣＲＥＦ- トランス6 細胞で免疫された動物
は、元のＬＮＣａＰ細胞に対する免疫応答を発現する。
ＬＮＣａＰ細胞からの推定ヒトＴＡＡを欠くＣＲＥＦ-
トランス6 細胞は、ＬＮＣａＰ細胞に対する免疫応答を
生じない。
【図３】ＣＲＥＦ-4 ＮＭＴポリクローナル抗血清のヒ
ト癌細胞への結合。ＬＮＣａＰＤＮＡ（ＣＲＥＦ-4 Ｎ
ＭＴ）が形質導入された高力価ＣＲＥＦ- トランス6細
胞（図３においてＣＲＥＦ細胞で表わされる）に対して
生成したポリクローナル抗体は、ヒトの前立腺、肺およ
び結腸直腸癌細胞系に結合する。反対に、ＣＲＥＦ-4
ＮＭＴと同様に高力価のＣＲＥＦ- トランス6 抗血清が
固相化したＣＲＥＦ- トランス6 細胞に対して生成した
ポリクローナル抗体は、ヒト癌由来細胞系には結合しな
い。
ト癌細胞への結合。ＬＮＣａＰＤＮＡ（ＣＲＥＦ-4 Ｎ
ＭＴ）が形質導入された高力価ＣＲＥＦ- トランス6細
胞（図３においてＣＲＥＦ細胞で表わされる）に対して
生成したポリクローナル抗体は、ヒトの前立腺、肺およ
び結腸直腸癌細胞系に結合する。反対に、ＣＲＥＦ-4
ＮＭＴと同様に高力価のＣＲＥＦ- トランス6 抗血清が
固相化したＣＲＥＦ- トランス6 細胞に対して生成した
ポリクローナル抗体は、ヒト癌由来細胞系には結合しな
い。
【図４】ヒト腫瘍細胞系およびＣＲＥＦ- トランス6 へ
のＣＲＥＦ-4 ＮＭＴ ＭｏＡｂの結合。高力価ＣＲＥ
Ｆ- トランス6 抗血清で免疫した動物から作製したＭｏ
Ａｂで処理したＣＲＥＦ-4 ＮＭＴ細胞は、ＬＮＣａＰ
および他のヒト癌に対する良好な特異性を示す。反対
に、同じＭｏＡｂは、ＨＯ- Ｉヒトメラノーマ、ＷＩ-3
8 ヒト皮膚線維芽細胞またはＣＲＥＦ- トランス6 細胞
（図４においてＣＲＥＦで表わされる）には結合しな
い。
のＣＲＥＦ-4 ＮＭＴ ＭｏＡｂの結合。高力価ＣＲＥ
Ｆ- トランス6 抗血清で免疫した動物から作製したＭｏ
Ａｂで処理したＣＲＥＦ-4 ＮＭＴ細胞は、ＬＮＣａＰ
および他のヒト癌に対する良好な特異性を示す。反対
に、同じＭｏＡｂは、ＨＯ- Ｉヒトメラノーマ、ＷＩ-3
8 ヒト皮膚線維芽細胞またはＣＲＥＦ- トランス6 細胞
（図４においてＣＲＥＦで表わされる）には結合しな
い。
【図５】ヒト細胞系およびＣＲＥＦ- トランス6 細胞へ
のＣＲＥＦ- Ｔ47Ｄ ＭｏＡｂの結合。ヌードマウス腫
瘍由来ＤＮＡを形質導入したＣＲＥＦ- トランス6 細胞
に対して生成したＭｏＡｂは、ヒト肺癌細胞に対する良
好な特異性を表わす。ＭｏＡｂ 5.1.4はまた、ヒト前立
腺癌細胞に対する幾らかの結合を示す。ＭｏＡｂはＨＯ
- Ｉヒトメラノーマ細胞または非形質導入ＣＲＥＦ- ト
ランス6 細胞（図５においてＣＲＥＦで表わされる）に
は結合しない。
のＣＲＥＦ- Ｔ47Ｄ ＭｏＡｂの結合。ヌードマウス腫
瘍由来ＤＮＡを形質導入したＣＲＥＦ- トランス6 細胞
に対して生成したＭｏＡｂは、ヒト肺癌細胞に対する良
好な特異性を表わす。ＭｏＡｂ 5.1.4はまた、ヒト前立
腺癌細胞に対する幾らかの結合を示す。ＭｏＡｂはＨＯ
- Ｉヒトメラノーマ細胞または非形質導入ＣＲＥＦ- ト
ランス6 細胞（図５においてＣＲＥＦで表わされる）に
は結合しない。
【図６】ヒトおよびＣＲＥＦ- トランス6 細胞系（図６
においてＣＲＥＦで表わされる）へのＭｏＡｂ 5.1.4
（ＣＲＥＦ- Ｔ47Ｄ）腹水の結合。Ｔ47Ｄ細胞からのヒ
ト肺癌ＤＮＡが形質導入されたヌードマウス腫瘍由来Ｃ
ＲＥＦ- トランス6 細胞（これは、動物に注入される前
に高力価ＣＲＥＦ- トランス6 抗血清が固相化されてい
る）で免疫された動物に対するＭｏＡｂ 5.1.4は、サブ
クローニングおよび腹水形成の後も、ヒト肺癌細胞に対
する良好な特異性を示し続ける。
においてＣＲＥＦで表わされる）へのＭｏＡｂ 5.1.4
（ＣＲＥＦ- Ｔ47Ｄ）腹水の結合。Ｔ47Ｄ細胞からのヒ
ト肺癌ＤＮＡが形質導入されたヌードマウス腫瘍由来Ｃ
ＲＥＦ- トランス6 細胞（これは、動物に注入される前
に高力価ＣＲＥＦ- トランス6 抗血清が固相化されてい
る）で免疫された動物に対するＭｏＡｂ 5.1.4は、サブ
クローニングおよび腹水形成の後も、ヒト肺癌細胞に対
する良好な特異性を示し続ける。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
33/574 5/00 Ｂ
(72)発明者 ポール・ビー・フィッシャー
アメリカ合衆国、ニューヨーク州
10583、スケアースデイル、ゴードン・
プレイス 15
(56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．77，ｐｐ．1398,
1980年
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面抗原を
コードするDNAを調製する方法であって、 (a) CREF−トランス6細胞株にヒト腫瘍細胞から単離し
たDNAおよび選択可能なもしくは同定可能な形質をコー
ドするDNAを共形質導入し、 (b) 選択可能なもしくは同定可能な形質を発現する形質
導入細胞を選択し、 (c) そのようにして選択された形質導入細胞を回収し、 (d) そのようにして回収された形質導入細胞を適当な第
1のネズミ宿主に注入し、 (e) 得られた第1のネズミ宿主を、注入した形質導入細
胞が誘発されて第1のネズミ宿主内に腫瘍を形成するに
有効な期間維持し、 (f) 得られた腫瘍を第1のネズミ宿主から単離し、 (g) そのようにして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得、お
よび (f) そのようにして得られた腫瘍細胞から、ヒト腫瘍細
胞に関連する細胞抗原をコードするDNAを回収する、 ことを包含する方法。 - 【請求項２】 ヒト腫瘍細胞が良性細胞、転移性細胞、
細胞株LNCaＰ由来のヒト前立腺癌細胞、細胞株T47D由来
のヒト肺癌細胞、細胞株SW480由来のヒト結腸直腸癌細
胞、細胞株GBM-18由来のヒトグリア芽細胞腫多型（ステ
ージIV星状細胞腫）または一次腫瘍由来のヒトグリア芽
細胞腫多型（ステージIV星状細胞腫）である請求項1に
記載の方法。 - 【請求項３】 選択可能もしくは同定可能な形質をコー
ドするDNAが抗生物質に対する耐性をコードするプラス
ミドDNAである請求項1に記載の方法。 - 【請求項４】 プラスミドDNAがpSV2−ネオを含む請求
項3に記載の方法。 - 【請求項５】 抗生物質がＧ418である請求項4に記載の
方法。 - 【請求項６】 細胞表面抗原が腫瘍関連抗原、成長因子
受容体、ウイルスがコードする表面発現抗原、癌遺伝子
生成物、表面エピトープ正統な複合薬剤耐性を介在する
膜タンパク質、異常な複合薬剤耐性を介在する膜タンパ
ク質、腫瘍形成表現型を介在する抗原、転移表現型を介
在する抗原、腫瘍形成表現型を抑制する抗原、転移表現
型を抑制する抗原、特異的免疫学的エフェクター細胞に
よって認識される抗原、T細胞により認識される抗原、
非特異的免疫学的エフェクター細胞によって認識される
抗原、またはマクロファージ細胞もしくはナチュラルキ
ラー細胞により認識される抗原である請求項1に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60380490A | 1990-10-25 | 1990-10-25 | |
| US603,804 | 1990-10-25 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51862191A Division JP3256227B2 (ja) | 1990-10-25 | 1991-10-25 | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001292767A JP2001292767A (ja) | 2001-10-23 |
| JP3376357B2 true JP3376357B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=24416995
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51862191A Expired - Fee Related JP3256227B2 (ja) | 1990-10-25 | 1991-10-25 | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 |
| JP2001060779A Expired - Fee Related JP3376357B2 (ja) | 1990-10-25 | 2001-03-05 | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 |
| JP2001273492A Expired - Fee Related JP3445586B2 (ja) | 1990-10-25 | 2001-09-10 | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51862191A Expired - Fee Related JP3256227B2 (ja) | 1990-10-25 | 1991-10-25 | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001273492A Expired - Fee Related JP3445586B2 (ja) | 1990-10-25 | 2001-09-10 | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6184032B1 (ja) |
| EP (1) | EP0641385B1 (ja) |
| JP (3) | JP3256227B2 (ja) |
| AT (1) | ATE230024T1 (ja) |
| AU (1) | AU660001B2 (ja) |
| CA (1) | CA2094378A1 (ja) |
| DE (1) | DE69133185D1 (ja) |
| WO (1) | WO1992008131A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5851764A (en) | 1990-10-25 | 1998-12-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Human prostate tumor inducing gene-1 and uses thereof |
| US6979728B2 (en) * | 1998-05-04 | 2005-12-27 | Baylor College Of Medicine | Articles of manufacture and methods for array based analysis of biological molecules |
| US6852291B1 (en) * | 2000-10-11 | 2005-02-08 | Innovadyne Technologies, Inc. | Hybrid valve apparatus and method for fluid handling |
| JPWO2003010542A1 (ja) * | 2001-07-25 | 2004-11-18 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 癌診断薬 |
| US20030050266A1 (en) * | 2001-09-07 | 2003-03-13 | Fisher Paul B. | Anti-tumor effects of prostate carcinoma tumor antigen-1 |
| JP4249028B2 (ja) * | 2001-12-04 | 2009-04-02 | 田辺三菱製薬株式会社 | 蛋白質の活性化方法 |
| US7049121B2 (en) * | 2001-12-20 | 2006-05-23 | Applied Molecular Evolution | Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use |
| JP2005516220A (ja) * | 2002-01-25 | 2005-06-02 | イノベイダイン・テクノロジーズ・インコーポレーテッド | 低容量かつ非接触な液体の分注方法 |
| JP4866006B2 (ja) | 2002-10-04 | 2012-02-01 | 田辺三菱製薬株式会社 | 抗体認識抗原 |
| JPWO2004056872A1 (ja) * | 2002-12-20 | 2006-04-20 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | タンパク質のチオール基を保護する方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4634665A (en) * | 1980-02-25 | 1987-01-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| US4935341A (en) * | 1986-06-04 | 1990-06-19 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Detection of point mutations in neu genes |
| US4535058A (en) * | 1982-10-01 | 1985-08-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Characterization of oncogenes and assays based thereon |
| US4699877A (en) * | 1982-11-04 | 1987-10-13 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting human tumors |
| US4631259A (en) * | 1983-05-04 | 1986-12-23 | Board Of Regents Of The University Of Michigan | Transposon in cloning DNA |
| US4681840A (en) * | 1984-01-18 | 1987-07-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce | Deoxyribonucleic acid molecules useful as probes for detecting oncogenes incorporated into chromosomal DNA |
| US4871838A (en) * | 1985-07-23 | 1989-10-03 | The Board Of Rijks Universiteit Leiden | Probes and methods for detecting activated ras oncogenes |
| JPS6319561A (ja) * | 1986-07-11 | 1988-01-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト肺癌単クロ−ン性抗体 |
| US4994558A (en) * | 1986-12-24 | 1991-02-19 | Eli Lilly And Company | Immunoglobulin conjugates |
| US4914021A (en) * | 1988-03-04 | 1990-04-03 | New England Deaconess Hospital Corporation | Carcinoma orosomucoid-related antigen, a monoclonal antibody thereto, and their uses |
| US4996298A (en) * | 1988-04-20 | 1991-02-26 | New England Deaconess Hospital Corporation | Marker for colorectal carcinoma and methods of detecting the same |
| JPH0797997B2 (ja) * | 1988-04-28 | 1995-10-25 | 帝人株式会社 | 新規生理活性ポリペプチド |
| EP0346702A3 (en) * | 1988-06-16 | 1991-08-28 | Miles Inc. | Transfectant cell lines which express isolated genes of the carcinoembryonic antigen family |
-
1991
- 1991-10-25 CA CA002094378A patent/CA2094378A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-25 DE DE69133185T patent/DE69133185D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-25 AT AT92909591T patent/ATE230024T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-25 JP JP51862191A patent/JP3256227B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-25 AU AU89314/91A patent/AU660001B2/en not_active Ceased
- 1991-10-25 EP EP92909591A patent/EP0641385B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-25 WO PCT/US1991/007912 patent/WO1992008131A1/en not_active Ceased
-
1994
- 1994-12-08 US US08/351,888 patent/US6184032B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-06 US US09/777,980 patent/US20010014474A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-05 JP JP2001060779A patent/JP3376357B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-09-10 JP JP2001273492A patent/JP3445586B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐｐ．１３９８，１９８０年 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6184032B1 (en) | 2001-02-06 |
| AU8931491A (en) | 1992-05-26 |
| WO1992008131A1 (en) | 1992-05-14 |
| US20010014474A1 (en) | 2001-08-16 |
| JP3256227B2 (ja) | 2002-02-12 |
| JPH06505147A (ja) | 1994-06-16 |
| CA2094378A1 (en) | 1992-04-26 |
| DE69133185D1 (de) | 2003-01-30 |
| JP3445586B2 (ja) | 2003-09-08 |
| ATE230024T1 (de) | 2003-01-15 |
| JP2001292767A (ja) | 2001-10-23 |
| EP0641385B1 (en) | 2002-12-18 |
| EP0641385A1 (en) | 1995-03-08 |
| JP2002159293A (ja) | 2002-06-04 |
| AU660001B2 (en) | 1995-06-08 |
| EP0641385A4 (en) | 1994-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5851764A (en) | Human prostate tumor inducing gene-1 and uses thereof | |
| JP4204642B2 (ja) | 前立腺に特異的な膜抗原 | |
| US8163883B2 (en) | Gene encoding labyrinthin, a marker for cancer | |
| WO2000053755A2 (en) | Compositions and methods for the treatment of tumor | |
| JP3376357B2 (ja) | Ｄｎａプローブの開発およびヒト腫瘍関連抗原の免疫学的試薬 | |
| US5759803A (en) | Recombinant retinoblastoma-associated protein 1 (E2F-1) polypeptides and cDNA | |
| US6221621B1 (en) | Methods of screening for colorectal cancers in which a complement Factor I or related protein is associated | |
| CA2353775A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of tumor | |
| JP2010057497A (ja) | 抗癌剤の開発および癌の診断のための、腫瘍の発生に関与することが同定されたマウスゲノム領域の使用 | |
| JPH11512294A (ja) | 癌の治療、予防および発見を目的とする腫瘍細胞での蛋白ホスファターゼ２Ｃ−ＰＰ２Ｃα−発現の操作と検出 | |
| US6159751A (en) | Development of DNA probes and immunological reagents of human tumor associated antigens | |
| WO1998039659A1 (en) | Screening and treatment using complement regulator or receptor proteins | |
| WO1998039659A9 (en) | Screening and treatment using complement regulator or receptor proteins | |
| WO2001083705A1 (en) | Myocardial cell proliferation-associated genes | |
| Alberti et al. | Molecular Characterization of Trop-2, a Cell Surface Molecule Highly Expressed by Human Carcinomas—Cloning of the Gene Encoding Trop-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20021022 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |