JPS6319561A - 抗ヒト肺癌単クロ−ン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌の３つの組織型
のヒト肺癌細胞と高率に反応し、ヒト小細胞癌細胞およ
びヒト正常肺とは反応せず、その認識する抗原が糖蛋白
質であり、かつＩｇＭクラスに属することを特徴とする
単クローン性抗体に関する。本発明の単クローン性抗体
は小細胞癌以外の肺癌細胞を効率間約に検出できるので
、肺癌の病理診断ならびに血清診断に利用することがで
きる。

従来の技術 近年、ハイブリドーマ技術により、各種のヒトの癌に対
する単クローン性抗体が報告されている。

ヒト肺癌に対する単クローン性抗体も、数多く報告され
ている〔キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ
ａｒｃｈ）　４２．１５０（１９８２Ｌキヤンサー・リ
サーチ、４２、３１８７（１９８２）、ジャーナル・オ
ブ・サージカル・リサーチ（Ｊ、Ｓｕｒｇｉｃａｌ　’
Ｒｅｓ、）、３０．４０３（１９８１）、トランスプラ
ンテーション・プロシーディング（Ｔｒｉｎｓｐｌａｎ
ｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄ、）　、Ｘｎ［（４）　
、１９４２（１９８１）　、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、　１３１　（１
）　　４９７　（１９８３）、免疫学会要旨ｐ、２１２
（演題番号１０７番）（１９８３）　、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、　１
３１（１）、’　４９７　（１９’８３）　］が、肺癌
の３つの組織型、即ち扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌
とは同程度の反応性を有しかつ小細胞癌細胞とは反応し
ないものは知られていない。

古くから、腫瘍マーカーとして知られている癌胎児性抗
原（Ｃａｒｃｉｎｏ　ｅｍｂｒｉｏｎｒｃ　ａｎｔｌｇ
ｅｎ　；　ＣＥＡ）は、いずれの組織型の肺癌にも広（
その存在が知られているが、ＣＥＡは、正常肺及び血清
中にも存在し肺癌特異的とはいえず、肺癌での陽性率は
必ずしも高いものではない。

発明が解決すべき問題点および解決方法肺癌の４つの組
織型のうち小細胞癌だけは他の３つの組織型と治療法と
予後がまったく異る。従って扁平上皮癌、腺癌および大
細胞癌と小細胞癌とを区別できる単クローン性抗体が得
られれば、肺癌の診断上を用である。

本発明者らは、ヒト肺扁平上皮隔膜成分で免疫したマウ
スの肺細胞とマウス骨督腫細胞株とが融合したハイブリ
ドーマが、免疫原として用いた肺扁平上皮癌のみならず
、肺腺癌、肺大細胞癌に対して優れた反応性を有し、肺
癌の病理診断、血清、真水診断に応用できることを見い
出し本発明を完成した。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明は、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌のヒト肺癌
細胞と反応し、ヒト小細胞癌細胞およびヒト正常肺細胞
とは反応せず、糖蛋白質を抗原として認識し、かつＩｇ
Ｍクラスに属する抗ヒト肺癌単りローン性抗体を提供す
る。

本発明の単クローン性抗体は、ヒト肺扁平上皮癌膜成分
で免疫したヒト正常脈トレラントマウスの肺細胞とマウ
ス骨髄腫細胞株とを融合させてハイブリドーマを作製し
、ヒト肺癌に特異性を有する単クローン性抗体を産生ず
るハイブリドーマを選択し、酸ハイブリドーマを培地中
に培養するかマウスに投与して該マウスで腹水化し、該
培養物または腹水より採取することにより得られる。

本発明単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株ＳＬＣ−４５４が生産するＳＬＣ−４５４が
あげられる。

ハイブリドーマ細胞株ＳＬＣ−４５４は、１９８６年７
月　３　日付で英国、Ｅｕｒｏｐｅａ口Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　にＥＣＡＣＣＮ。

８６０７０３０６として寄託しである。

以下に本発明単クローン性抗体の製造法を詳細に説明す
る。

（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜１０週令、
望ましくは８週令のマウスに、ヒト肺扁平上皮癌の細胞
１組織あるいはそれらの膜成分を免疫して、その動物の
牌、リンパ節。

末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマウスは
ヒト正常肺細胞で前処理して免疫寛容にしたマウスを用
いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下あるいは
静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジ二バント〔例えば
、フロイントの完全アジ二バント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　
Ｆｒｅｕｎｃｌ’ｓ＾ｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化
アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともにヒ
ト肺扁平上皮癌細胞（１０６〜１０１細胞／匹）、ヒト
肺扁平上皮癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）　
（１０〜５００Ｍｇ／匹）を投与する。以後、１〜２週
問おきに、抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日
目に眼妻静脈叢より採血し、その血清がヒト肺癌と反応
することを以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）：医学書院列１９７６年〕などで調べる
。

酵素免疫測定法： ９６穴のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいは腫瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１０〜
１．０００Ｍｇ／ｍｌ含有する膜断片）を１００〜２０
０μｌ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して、上清
を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ　（！Ｊン
酸二す）ＩＪウム１．８３ｇ、　　リン酸−カリウムＱ
、　２１　ｇ　、食塩７．６５ｇ、蒸溜水ＩＣｐＨ７，
２）でよく洗浄後、第１抗体として、１％ＢＳＡ　（牛
血清アルブミン）−ＰＢＳをｊ　００〜２００μｍ／穴
分注し、４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った
蛋白質との結合残基をブロック（ブロッキング）した。

その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰＢ
Ｓでよく洗浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳ
で希釈した試料（マウス血清、ハイブリドーマ培養上清
、粗精製モノクローナル抗体）を１００μＩｌ／穴分注
し、４℃で１晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ　　Ｎ
ａＣｊ７溶液で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギ
の抗マウスイムノゾロ。プリンＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製、販売元協和メデック
ス〕の１００倍希釈液を１００ｗ／穴分注し、室温で２
時間放置する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐ）１４．２＞Ｉｆｔに溶かした溶液に、使用直前に
過酸化水素ＩＪＬｆｌ／ｍｌを加えた溶液〕を用い、発
色をＯＤ　ｓ　＋　Ｓｎｓの吸光度で測定する。このと
き、肺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対して強
く反応するマウスをヒト肺扁平上皮癌免疫マウスとして
ハイブリドーマ作製のための抗体産生細胞の供給源とし
て用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　
１００〜２００層を加え、２時間放置し、レジン水また
はＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて、一般の
抗［コートプレートを用いるのと同様の方法にて、抗体
価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト肺扁平上皮癌細胞９祖織あるいは
その膜成分を２〜５Ｘ１０’細胞／匹あるいは２０〜４
００μｇ／匹腹腔内に投与し、膵臓細胞を摘出し、肺細
胞を調製する。膵臓をＭＥＭ　（日永製薬社製）中で細
断し、ビンセットでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠
心分離にかけ、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム
緩衝液（ｐＨ７，６５）で１〜２分間処理し赤血球を除
去し、ＭＥＭで３回洗浄して融合用肺細胞として提供す
る。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ田来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−ｔＪ
１　（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・ミ
クロハイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（（ｕｒ
ｒａ＊ｔ’Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　％４ｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄ　ｉｍ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　−１）　’。

〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　６．　
５１１　−５１９（１９７６））　、ＳＰ２１０−Ａｇ
１４　（ＳＰ−２）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　
２７６、２６９−２７０　（１９７８））、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８６５３　（６５３）　Ｃジャーナル・オブ・
イムノロシイ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ！／）　１２
３．１５４８−１５５０　（１９７９）　）、Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８　（Ｘ６３）〔ネイチ−ｒ　−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２５６．　４９５−４９７（１９７５）　〕な
どが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン
培地（ＲＰＭＴ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍ
Ｍ）、２−メルカプトエタノール（５Ｘ　１０−５Ｍ）
　、ジェンタマインン（１０μｇ／ｎｌ）および牛胎児
血清（ＦＣ３）＜Ｃ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正常
培地に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ　／ｍｌ　
）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前
に正常培地に継代し、融合当日２ＸＩＯ’以上の細胞数
を確保する。

〔３）細胞融合 （１〕で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ　５分）した後
、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌
しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，
０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２＋ｍｌお
よびジメチルスルホキシドＱ、７ｍｌの混液０．２〜１
ｍｌ／１０３抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥ
Ｍ　１〜２ＩＩ＋１を数回加えた後、ＭＥＭを加えて全
量が５０ｍ１になるようにする。遠心分離（９００ｒｐ
ｍ５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後
、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０，ＦＣ３１０％）ｌＯ
Ｇｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆ
るやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を２４穴培養用プレートに１ｍｌ／穴ずつ分
注し、５％ＣＯ□インキュベーター中、３７℃で２４時
間培養する。培養プレートに１ａ＋ｌ／大の）（ＡＴ培
地〔正常培地にヒボキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジ
ン（１，５Ｘ　１０−’Ｍ）およびアミノプテリン（４
ＸＩＯ−”Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時間
培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１ｎ＋
１を揄で、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、Ｃ’　０２
インキユベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養する
。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間毎に）ＩＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ヒト肺癌に対する抗体価を
測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常綿胞１組
織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト肺
癌細胞、組織あるいはその膜成分に特異的に反応するも
のを選択する。ヒト肺癌細胞１粗織あるいはその膜成分
に強く反応し、ヒト正常綿胞１組織あるいはその膜成分
などに反応しない穴について、限界希釈法によりクロー
ニングを２回繰り返し、安定してヒト肺癌細胞１粗織あ
るいはその膜成分に強い抗体価の認められたものを抗ヒ
ト肺癌単りローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選
択する。

（４）単クローン性抗体の調製 ブリスタン処理（２，６，ｔｏ、　　１４−テトラメチ
ルベンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　Ｑ、　５ｍｌを
腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のＢ
ＡＬＢ／ｃヌード雌マウスに、（３）で得られた抗ヒト
肺癌単りローン性抗体産土ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ
ＩＯ’細胞／匹をＩ腔内注射する。

１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。

このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，００Ｏｒ
ｐｍ５分）して固形分を除去後、５０％硫酸アンモニウ
ムにて塩析し、ＰＢＳにＮａＣｊ！０．５Ｍを加えた液
で透析し、セファクリルＳ−３００（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカル社製）（ペットボリューム７５０ｍ１
　）のカラムに流速１５ｍ１／ｈｒで通塔し、ＩｇＭ画
分を集め、精製単クローン性抗体とする。

抗体のインタイブの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒ　Ｉｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）　（免疫学実験
入門、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、ｐ、
７４　１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度（１，０（ＯＤ２ａｏ　）　＝イムメグ０１９フ１ 得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検体
から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫瘍
組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常ある
いは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしくは
それるの膜成分との反応性、従来から知られている癌胎
児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性．正常。

患者ヒト血清との反応性などを、酵素免疫測定法，螢光
抗体法，免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより行
い、いずれの測定法においてもヒト肺癌以外とは、反応
しないものを選択する。

また、このようにして得られた、ヒト肺癌に特異的に反
応する単クローン性抗体は、血清検査９組織診断，イメ
ージングなどによる肺癌の診断、さらには、抗体そのも
のを、あるいは、抗体に制癌剤や毒素を結合させた、い
わゆるイムノトキシンを癌患者に投与することにより肺
癌の治療を行うことができるものと期待される。

さらに、この腫瘍特異抗原クローン性抗体を用いるアフ
ィニティーカラムにより、腫瘍特異抗原を精製し、その
抗原の解析ひいては、肺癌ワクチンの開発にも使用でき
るものと期待される。

（５）免疫組織化学的染色法（ＡＢ’Ｃ法）ペクタステ
ィンＡＢＣキット（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いた下記免
疫ペルオキシダーゼ法に従う。

ミクロトームで５μｍにスライスしたホルマリン固定パ
ラフィン包埋組織切片を、卵白アルブミンでコートした
スライドグラスに固定し、キシレンで脱パラフイン後、
アルコール／水で段階的に親水化する。レジン水で５分
間すすぎ、０、３％Ｈ　２　０　＊を含むメタノール中
で室温３０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダ
ーゼをブロックする。切片を２０分間リン酸バッファー
で洗浄後、希釈正常ウマ血清で室温２０分間インキュベ
ーションする。切片から過剰の血清を吸い取り、第１抗
体（ＳＬＣ−４５４は２０■／ｍｌ　）を３０分間反応
させ、さらに洗浄後、アビジン−ビオチン−ペルオキシ
ダーゼ複合体（ＡＢＣ試薬）を３０分間反応させる。洗
浄後、ペルオキシダーゼ基質（０．０２％Ｈ　２　０　
２を含む０．　１　Ｍ　）リスー塩酸バッファーｐ　Ｈ
　１．　２で調製した０．１％ジメチルベンジジン　テ
トラヒドロクロライド（　ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄ
ｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）　〕を
２分間反応させ、氷冷水中で反応を止める。ヘマトキシ
レン染色した後、アルコール／水およびキシレンで脱水
後、カナダバルナムで固定する〔臨床検査２８。

３５３　（１９８４）　）。

（６）肺癌血清診断法 血清診断は次の通り行う。

９６穴ＥＩＡ用プレートに、第１抗体１０〜１００■／
ｍｌを５０〜２００■／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩
あるいは、室温で２〜４％間放置する。ＰＢＳで洗浄後
、ＢＳＡ−ＰＢＳ　２　０　０ＪＬＩ！／穴を加え、さ
らに４℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。このプ
レートをＰＢＳでよく洗浄後、各穴に血清検体を１〜１
００倍希釈で、５０〜１００ｍを加える。４℃で１晩あ
るいは室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次
に、ビオチン化した第２抗体あるいは、ペルオキシダー
ゼ標識した第２抗体（１０〜１００■／４）を５０〜１
　０　０１Ｉｔ！／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは
室温で２〜４時間放置する。第２抗体として、ビオチン
化抗体を使用した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗
浄後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（１０■
／ｍ１）を５０〜１　０　０Ｊｔ１／穴加え、室温で３
０分間放置後ＰＢＳでよく洗浄する。次に基質液として
、ＡＢＴＳ基質液を５０〜１００ｄ／穴加え、室温で１
０〜３０分間放置し、５？６ＳＤＳ溶液５０〜１００μ
ｇ／穴を加え反応を停止する。各穴の０Ｄｓ１ｓ’ｔを
測定し、その発色度より、血清検体中の抗原量を算出す
る。このようにして得られた健常人血清内の抗原量と肺
癌患者血清中の抗原量を比較することにより、正常値を
決定し、その正常値を超えるものを肺癌陽性とする。

（７）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法あるいは
血清診断法の実施に際して、抗原（肺扁平上皮癌膜成分
、肺癌培養細胞株、肺癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎ
ｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）。

プロテアーゼ（ｐｒ＋）ｔｅａｓｅ）などの酵素や過ヨ
ウ素酸などの試薬で前処理した後、単クローン性抗体と
反応させ、それらの処理をしていない元の抗原と単クロ
ーン性抗体の反応性との差より、抗原の化学的性状（単
クローン性抗体の認識する抗原部位の化学的性状）を明
らかにする。すなわち、ノイラミニダーゼ処理により抗
原性が消失すれば、シアル酸が、プロテアーゼ処理によ
り消失すれば蛋白質が、また過ヨウ紫酸処理により消失
すれば糖鎖が、抗原決定基に関与していると推定される
。

（８）結合阻害試験による既知腫瘍マーカーとの異同の
判定 肺癌膜成分をＥＩＡ用プレートにコートし、１％ＢＳＡ
溶液でブロックした後、数段階に希釈したＳＬＣ−４５
４、ウサギ抗ＣＥＡ抗体、ウサギ抗ΔＦＰ抗体、ウサ５
抗β２−ミクログロブリン抗体を加え、４℃で１晩反応
させる。

ＰＢＳでよく洗浄後、ビオチン化ＳＬＣ−４５４を加え
、室温で３〜４時間反応させ、洗浄後、アビジン−ビオ
チン−ベルオキダーゼ複合体（Ｖ［：ＣＴＡＳＴ八ＩＮ
　へＡＢＣｌ！Ｊ＆（ＵＮＯＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ　　
５ＴＡＩＮＩＮＧキツト、ＶＥＣＴＯＲ社）を加え、室
温で１時間反応させる。反応後ＡＢＴＳ基質液を加え、
吸光度（４５０ｎｍ）を測定する。

このとき、第１抗体がＳＬＣ−４５４と同じ抗原（エピ
トープ）をＡｌＪｊｆ＆しているならば、その第１抗体
により、第２抗体であるビオチン化ＳＬＣ−４５４の結
合部位が占領されるため、第２抗体が抗原に結合できず
ＡＢＣ試薬も結合できないため、発色が阻害される。即
ち、末法において、第２抗体（ビオチン化Ｓ　Ｌ　Ｃ−
４５４）の結合が、第１抗体によって阻害されない場合
には、ＳＬＣ−４５４は、その第１抗体とは異なる抗原
を認識してい、ると判定される。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１）　　抗体産生細胞の調製 ヒト正常肺組織膜成分（１００■蛋白質／匹）を、生後
２４時間以内の新生仔（ＢＡＬＢ／ＣｘＣ５７ＢＬ／６
）Ｆ＋　マウスに静脈内投与した。８週間経過後のマウ
スにヒト肺扁平上皮隔膜断片１００■（蛋白質換算）７
匹を水酸化アルミニウムゲル２ｍｇ／匹、百日咳菌死菌
ワクチン１×ｌＯｓ／匹とともに腹腔内投与した。以後
１〜２週おきに、同一抗原１００μｇ（蛋白質換算）７
匹で３〜５回免疫した。これら免疫処理したマウスのう
ち、その抗血清が、ヒト肺癌細胞または組織あるいはそ
れらの膜断片と強く反応したマウスを免疫マウスとして
、そのマウスより、肺細胞を調製して、細胞融合に供し
た。

〔２〕マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（３）ハイブリドーマの作製 〔１）と（２）で得られた肺細胞と骨髄腫細胞とを５二
１の割合で用い、前述した方式で融合させ、ＨＡＴ培地
で３７℃、１４日間Ｃ０２５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗ヒト肺癌
に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さらに
正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、種々
の測定法により、ヒト正常細り包や組織あるいは他の癌
に全く反応せず、ヒトｇｌＹｉ癌に特異的に反応する単
クローン性抗体を産生ずるハイプリドーマ株ＳＬＣ−４
５４を選択した。

（４）単クローン性抗体の精製 プリスタン処理した８連合ＢＡＬ８／ｃヌード雌マウス
に（３）で得られたハイプリドーマ株ＳＬＣ−４５４を
４Ｘ１０’　′ＷＡ胞／匹腹腔内注射した。１０〜２１
日後に、ハイブリドーマは腹水癌化する。腹水のたまっ
たマウスかろ、腹水を採取（５〜ｌＱｍｌ／匹）し、遠
心分離（３，００Ｏｒｐｍ、　５分）して固形分を除去
した。

５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳにＮａＣ１
０，５Ｍを加えた液で透析し、セファクリル３００（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカル社製）（ペットボリュ
ーム７５０ｍ１）　ノ：ｂラムに流速１５ｍ１／ｈｒで
通塔しＩ　ｇ　Ｍ画分を集め精製抗体として用いた。

（５）　　ＳＬＣ−４５４の特異性 このようにして得られた抗肺癌特異的単クローン性抗体
ＳＬＣ−４５４のブ応特異性を第１表に示した。

第１表 続　膵癌細胞２株および胃癌細胞３株のうち各１株ずつ
が染まった。

実施例２゜ 実施例１でｉ８みれた単クローン性抗体ＳＬＣ−４５４
を用いて、各種癌組織の免疫組織化学的染色を行った。

７例の肺扁平上皮癌、７例の肺腺癌、５例の原人細胞癌
、３例の肺小細胞癌、４例の胃癌、３例の肝癌、１例の
膵癌、１例の直腸癌、１例の白血病細胞、１例の胆管癌
、１例の膀胱瘍、１例の神経芽細胞腫、１例の子宮癌、
１例の口蓋癌のパラフィン包埋ブロック切片について検
討した。

また、成人、胎児の各種正常組織についても、同嘩に免
疫組織化学的染色を行った。その結果を東向、正常成人
、胎児組織（肺、牌、胃、大腸、小腸、心、肝、胃、骨
髄、甲状腺、脳、膵）では陽性例は認めろれなかった。

実施例３゜ ９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌａｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＳＬＣ
−４５４（Ｉ　Ｌｃｇ／ｍｌ）を５０〃／穴加え、４℃
で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２
００μＱ／穴加え１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄したプ
レートに、健常人血清（６５検体）および肺癌患者血清
（２１Ｇ検体）を２０倍希釈して１００μＱ／穴加え、
４℃で１晩放置後、ＰＢＳでよ（洗浄した。次に、第２
抗体として、ビオチン化抗肺癌単りローン性抗ＫＳＬＣ
−４５４（５■／ｍ１）を１００μｇ／穴加え、４℃で
１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−ビオ
チン−ペルオキシダーゼ〔ベクトール（ＶＥＣＴＯＲ）
社製〕（１０μｇ／口り１００威／穴加え、室温で１時
間放置した後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢＴＳ基質液
を１００μｇ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％
ＳＤＳ溶液１００μＱ／穴を加え反応を停止した。各穴
の発色を吸光、実計（○Ｄ、、５）で測定した。その結
果、第１図に示した様に、健常人血清では、ＯＤＡ１５
が０．７０をこえる陽性例は６５例中１例もなかったが
、肺腺癌では、６９例中２１例、肺扁平上皮癌では、６
９例中１９例、原人細胞癌では、２７例中６例が陽性を
示した。

ただし本血清診断系では肺小細胞癌でも４５例中７例が
陽性を示した。一方、肺良性疾患では１６例中３例が陽
性を示したのみであった。胃癌２８例中には１例も陽性
例は認められなかった。以上の結果より、ＳＬＣ−４５
４を用いる血清診断は、肺癌の診断に有用であることが
わかる。

実施例４゜ 単クローン性抗体ＳＬＣ−４５４が認識する抗原を解析
するために、肺扁平上皮癌組織の膜成分を下記各種酵素
および試薬で処理した後ＳＬＣ−４５４との反応性を調
べた。

酵素および試薬 トリプシン（ＧＩＢＣＯ社！！ｉ！２．５％溶液）ＰＢ
Ｓ中　０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製） ０、１　Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４，５）　−３ｒ、！
、ＩＣａ　Ｃ１２中０．ＬＵ／ｍｌ α−Ｌ−フコシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製
） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ６，３）中Ｑ、ｌ　
Ｕ　／ｍｌ プロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ７，２）中１０　Ｕ
　／ｍｌ Ｎ　ａ　Ｉ○、（和光純薬社製） ＰＢＳ中５０ｍＭ 肺扁平上皮癌組織の膜成分（蛋白量１００■／ｍｌ）を
５０１ｔ１／穴ずつ、ＥＩＡ用プレート〔リンプロ（Ｌ
ｉｒ＋ｔ＋ｒｏ）社製〕に分注し、４℃で１晩放置後、
ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００ｎ／
大分注し、３０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳで３
回洗浄後、上記酵素液または試薬液を５０４／穴分注し
、３７℃で１時間反応させた。ついでＰＢＳで５回洗浄
し、単クローン性抗体Ｓ　ＬＣ−４５４（Ｉ　Ｌｃｇ／
ｍｌ）を５０４／穴分注し、４℃で１晩放置した。

Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ　（Ｔｗｅｅｎ　２０は和光
純薬工業社製）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＧ（４００倍希釈液）を５０４／穴加え、室
温で２時間反応後、Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳで５回洗
浄し、ＡＢＴＳ基質液１００Ｉ１１を加え、３０分間反
応後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。

抗原性は、第２図に示したとおり、過ヨウ素酸（Ｎ　ａ
　Ｉ　０４　）、トリプシン、プロテアーゼ処理により
消失した。この結果より、単クローン）生抗体ＳＬＣ−
４５４は糖蛋白質を認識しているものと推定された。

実施例５ 肺癌膜成分をＥＩＡ用プレートにコートし、１％ＢＳＡ
溶液でブロックした後、数段諧に希釈したＳＬＣ−４５
４、ウサギ抗ＣＥＡ抗体、ウサギ抗ＡＦＤ抗体、ウサギ
抗β２−ミクログロブリン抗体（いずれもＤ　Ａ　−Ｋ
　Ｏ社製）を加え、４℃で１晩反応させた。ＰＢＳでよ
く洗浄後、ビオチン化ＳＬＣ−４５４を加え、室温で３
〜４時間反応させ、洗浄後、アビジンービオチンーペル
オキンダーゼ複合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ　ＡＢＣＩ
ＭＭＩ！Ｎ０ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥＳＴＡ［ＮＩＮＧ　
　キット、ＶＥＣＴＯＲ社）を加え、室温で１時間反応
させた。反応後ＡＢＴ’Ｓ基質液を加え、吸光度（４１
５ｎｍ）を測定した。

その結果を第３図に示した。ＳＬＣ−４５４の結合活性
は、ＳＬＣ−４５４自身では、強く阻害されたが、抗Ｃ
ＥＡ抗体、抗ＡＦＰ体、抗−β２ミクログロブリン抗体
では全く阻害されなかだことより、ＳＬＣ−’４５４は
、これら抗体とは全く異なる抗原を認ｍしていることが
わかった。

発明の効果 本発明によれば、肺癌の検出に有効利用可鎌な抗ヒト肺
癌単りローン性抗体が供給される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単クローン性抗体ＳＬＣ−４５４による肺癌
の血清診断の結果を示す。 第２図は、単クローン性抗体ＳＬＣ−４５４の認識抗原
解析の結果を示す。 図中、○はノイラミニダーゼ０．　Ｉ　Ｕ　／ｉｌ、△
はα−Ｌ−フコシダーゼ０．　Ｉ　Ｕ　／ｍＬ■はトリ
プシン０．２５％、口はプロテアーゼＩＯＵ／ｍ＋、・
はＮａｌ○＜５０ｍＭの処理を示す。×は無処理を示す
。 第３図は、単クローン性抗体ＳＬＣ−４５４の結合阻害
試験による既知腫瘍マーカーとの異同の判定結果を示す
。図中 ムはＳＬＣ−４５４゜ Ｏはウサギ抗ＣＥＡ抗体。 ・はウサギ抗ＡＦＰ抗体。 △はウサギ抗β２−ＭＧ抗体を示す。 特許出願人　（１０２）協和醗酵工業は式会社第２図 紙業（酵ｆＦ）不秋牟

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌のヒト肺癌細胞
   と反応し、ヒト小細胞癌細胞およびヒト正常肺細胞とは
   反応せず、糖蛋白質を抗原として認識し、かつＩｇＭク
   ラスに属する抗ヒト肺癌単クローン性抗体。
2. （２）ＳＬＣ−４５４として同定した特許請求の範囲第
   １項の単クローン性抗体。
3. （３）ハイブリドーマ細胞株ＳＬＣ−４５４（ＥＣＡ　
   ＣＣ　８６０７０３０６）を培地に培養するか、マウス
   に投与して腹水化し、培養物または腹水より採取するこ
   とによって得られる特許請求の範囲第２項の単クローン
   性抗体。