JP3382256B2 - 過剰量の哺乳類セントロメアを有する細胞株及び過剰量の哺乳類セントロメアを有する細胞の産生方法 - Google Patents

過剰量の哺乳類セントロメアを有する細胞株及び過剰量の哺乳類セントロメアを有する細胞の産生方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトＤＮＡおよび支配マ
ーカーを含む哺乳類セントロメアおよび該セントロメア
を含む非−ヒトセルラインに関する。
【０００２】
【従来の技術】セントロメアは真核生物の染色体の特別
な領域である。セントロメアは細胞分裂の間に染色体の
厳密な分離を可能にする構造体である動原体の形成場所
である。このことに加えて、真核生物染色体の高次構造
に対する構造上の役割の可能性も示唆されている（ハド
ラズキー（Ｈａｄｌａｃｚｋｙ），（１９８５），Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｌ．Ｒｅｖ．，９４：５７−７６）。
【０００３】セントロメアの単離およびクローニング
は、その分子構造および機能の理解ばかりでなく、安定
な人工染色体の構築のためにも重要である。セントロメ
アに結合した遺伝子の存在を利用して、下等真核生物
（酵母）の機能性セントロメアの単離は成功している
（ブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）ら，（１９８
４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：１６３
−１９４；クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）ら，（１９８
５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：２９−５
６）。機能性セントロメアと染色体末端を安定化させる
テロメアとの組み合わせにより、酵母の人工的セントロ
メアの構築が可能であった（ミュレイ（Ｍｕｒｒａｙ）
ら，（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，３０５：１８９−１
９３；バーク（Ｂｕｒｋｅ）ら，（１９８７），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３６：８０６−８１２）。これは染色体の
機能の研究および遺伝子操作における新たな時代を示唆
している。
【０００４】高等生物（例えば哺乳類）では、酵母と異
なり、セントロメアの両端に境界を形成する繰り返しＤ
ＮＡ配列を含んでいる。この高度に繰り返しを有するＤ
ＮＡは、特に動物染色体内の特定の蛋白質と相互作用し
て、セントロメアの周囲に遺伝的に不活性なゾーン（ヘ
テロクロマチン）を造る。このペリセントリックヘテロ
クロマチンは、任意の選択マーカー遺伝子を可なりの距
離に維持し、そのため繰り返しＤＮＡはクロモゾーム
の”ウォーキング”によるセントロメア配列の分離を阻
止している。
【０００５】従って、高等真核生物のセントロメアＤＮ
Ａを単離する方法が、当該分野で必要とされている。そ
のようなＤＮＡの単離は、人工哺乳類染色体の構築のた
めに必要である。そのような染色体の使用は、遺伝子を
哺乳類細胞に導入する現在の技術に固有の問題（挿入ミ
ュータントの同時形成、導入されるＤＮＡの寸法の制
限、およびプラスミドベクターの不完全な離脱を含む）
を解消するであろう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、哺乳
類からセントロメアＤＮＡを単離する方法を提供するも
のである。本発明の他の目的は、減数分裂および有糸分
裂において、挿入されたＤＮＡの確実な分離を可能にす
るＤＮＡ要素を提供することである。本発明のさらに別
の目的は、哺乳類細胞に大量のＤＮＡを挿入するための
ベクターの形成のためのＤＮＡ要素を提供することであ
る。本発明のさらに別の目的は、哺乳類のセントロメア
蛋白質に結合するＤＮＡ要素を提供することである。本
発明のその他の目的は、下記の態様の一つもしくはそれ
以上により説明される。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の一態様によれ
ば、過剰量のセントロメアを含む非−ヒトセルラインが
提供される。
【０００８】他の態様によれば第１図の配列を有するＤ
ＮＡ分子にハイブリダイズする核酸プローブが提供され
る。
【０００９】さらに別の態様によれば、哺乳類からセン
トロメアＤＮＡを単離する方法が提供され、該方法は次
の工程からなる:哺乳類細胞株（セルライン）の有糸分
裂中期のセントロメアを単離し；染色体を断片に分けて
染色体フラグメントを含む懸濁物を得；この懸濁物を、
抗−セントロメア抗体を含むヒト血清とともにインキュ
ベートして、染色体フラグメントを該抗体と結合させ；
抗体−結合染色体フラグメントを懸濁物から分離し；そ
して該結合フラグメントの蛋白質を除去してセントロメ
アＤＮＡ調製物を得る。
【００１０】さらに別の態様によれば、過剰量の哺乳類
セントロメアを含む細胞を製造する方法が提供され、該
方法は次の工程よりなる：細胞を、（１）哺乳類のセン
トロメアＤＮＡを含むＤＮＡ、および（２）有力選択マ
ーカーを有するＤＮＡにより、コトランスフェクション
させ；有力選択マーカーを発現する細胞を選択し；そし
て過剰量の哺乳類セントロメアを持っている細胞を検出
する。
【００１１】上記態様およびその化合物の態様を以下に
より詳細に説明する。従って、本発明は、哺乳類細胞の
重要なセントロメアＤＮＡを入手および単離する方法を
提供する。特に、ヒトＤＮＡフラグメントＣＭ８が提供
され、これは遺伝子治療のための人工的染色体を造成す
るために使用できる。
【００１２】図面の簡単な説明 第１図は、λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの配列を示す。
【００１３】第２図は免疫沈降により得られたＤＮＡフ
ラグメントのアガロースゲル電気泳動の結果を示し、 レーンＡおよびＢ：染色体フラグメントから単離され抗
−セントロメアセファロースに未結合のＤＮＡ。 レーンＣおよびＤ：抗−セントロメアセファロースに結
合した染色体フラグメントから単離されたＤＮＡ。高分
子量ＤＮＡフラグメント群の存在に注意。レーンＢおよ
びＤのサンプルは電気泳動の前に１００μｇ／ｍｌのＲ
Ｎａｓｅ−Ａで処理した。 レーンＭ：λＨｉｎｄＩＩＩマーカー。
【００１４】第３図は、ＣＭ８λシャロン４Ａクローン
のヒトゲノムＤＮＡ挿入物の制限地図を示す。矢印は両
側の直接繰り返し配列を欠損した３００ｂｐのＡｌｕ繰
り返し構造の位置を示す。
【００１５】第４図は、３Ｈ−チミジン標識したＣＭ８
ＤＮＡのヒト有糸分裂中期染色体へのｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションの結果を示す。 パネルＡ：ヒト染色体のセントロメア（矢印の頭）にお
ける銀粒子の優先的局在。 パネルＢ：１３１メタセントリック染色体上の銀粒子
（＊）の分布を示す。数字は染色体の特定領域への銀粒
子の局在頻度を示す。
【００１６】第５図は、抗−セントロメア抗体での間接
免疫螢光法による（パネルＡおよびＢ）、そしてビオチ
ン標識したＣＭ８プローブでのｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーションによる（パネルＣ）およびＡＰＨ−ＩＩ
遺伝子のＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩの１ｋｂフラグメントに
よる（パネルＤ）、ＥＣ３／７細胞のダイセントリック
染色体およびミニ染色体の検出を示す。 パネルＥおよびＦ：ヘキスト３３２５８でのＤＮＡ染
色； パネルＧおよびＨ：プロピジウムヨージドでのＤＮＡ染
色。パネルＥ−ＨはそれぞれＡ−Ｄに相当する。矢頭は
ジセントリックおよびミニ染色体を示している
【００１７】第６図は、ＥＣ３／７セルラインでの余剰
セントロメアの複製を示す。 パネルＡ−Ｃ：ビオチン標識ＣＭ８プローブでのｉｎ
ｓｉｔｕハイプリダイゼーション。 パネルＤ−Ｆ：Ａ−ＣのＤＮＡ染色にそれぞれ相当す
る。
【００１８】第７図は、ＥＣ３／７細胞の同じ有糸分裂
中期において、組み込みＤＮＡ配列がセントロメア領域
と共に存在することを、抗−セントロメア血清での免疫
染色により（パネルＡおよびＤ）、およびビオチン標識
ＣＭ８での（パネルＢ）およびＡＰＨ−ＩＩプローブで
の（パネルＥ）引き続くｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションにより示している。 パネルＣおよびＦ：ＤＮＡ染色。
【００１９】詳細な説明 ヒトＤＮＡのセグメントを単離してマウス細胞に導入
し、機能的セントロメアを生産しうることが本発明によ
り見出された。本発明のＤＮＡを含む機能的セントロメ
アは、好ましくは有力選択マーカーと結合させる。この
マーカーは、例えばＧ４１８（Ｓｉｇｍａ）に対する耐
性を付与するアミノグリコシド−３’ホスホトランスフ
ェラーゼIIであってよい。当該分野で知られている他の
同様なマーカーを使用することもできる。
【００２０】本発明のセントロメアＤＮＡを単離する方
法は、任意の高等真核生物、特に哺乳類に適用可能であ
る。好ましくはヒトセルラインが使用される。有糸分裂
中期の染色体は、当該分野で知られている技術により単
離される。次に染色体をフラグメントに分ける。エンド
ヌクレアーゼ消化および機械的剪断を用いて染色体をフ
ラグメント化する。大部分のフラグメントが１μｍ以下
の寸法範囲でありそして染色体のいくつかは壊れずに残
っていることが好ましい。未分解の染色体は約１５００
ｇの遠心力で約１０分間処理して、容易に調製物から除
去できる。
【００２１】抗−セントロメア自己抗体を含むヒト血清
を本発明の方法に使用できる。この抗体はクレストシン
ドローム（ＣＲＥＳＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）患者から人
手可能である。抗体の代替供給源を用いることもでき、
例えばモノクローナル抗体または動物由来の抗−セント
ロメア抗体を含むポリクローナル血清である。抗体は染
色体フラグメントの調製物とともに、抗体−抗原複合体
が形成し且つ安定な条件でインキュベートする。抗体が
固相支持体に結合していると好都合である。好ましく
は、例えばプロテイン−Ａ セファロースＣＬ４Ｂ（フ
ァルマシア）のような支持体が、結合染色体フラグメン
トと未結合染色体フラグメントの分離を助けるために使
用される。しかしながら、固体支持体に結合した抗体を
使用することなく、当該分野で知られたこの目的を達成
する他の方法も用いることができる。
【００２２】セントロメアＤＮＡを含むＤＮＡフラグメ
ントは抗体から分離され、そしてセントロメアの蛋白質
は脱蛋白質処理により除去される。最終的には、蛋白質
は分解されそして染色体フラグメント調製物から抽出さ
れて、ＤＮＡから全蛋白質を除外する。当該分野で知ら
れている任意の処理を用いることができ、その非限定的
例はプロテイナーゼＫおよびフェノールのようなプロテ
アーゼと有機溶剤である。
【００２３】セントロメアＤＮＡフラグメントは、当該
分野で知られている任意の目的もしくは用途に使用でき
る。例えば、それを標識してプローブとして用いること
ができ、それをクローニングのベクターまたは配列の全
部分に連結することができ；およびそれを固体支持体に
結合してセントロメア蛋白質を精製するために用いるこ
とができる。
【００２４】本発明の一つの特定の態様において、セン
トロメアＤＮＡフラグメントを用いてこれとハイブリダ
イズするクローンを探すためにヒトもしくは他の哺乳類
のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることができ
る。ハイブリダイズするクローンを分析して、セントロ
メアＤＮＡが有する機能を奏する能力を持つことを調べ
ることができる。そのような機能の一つはセントロメア
蛋白質に結合することである。そのような機能の他の一
つは、特異的にセントロメアを染色する抗−セントロメ
ア抗体を用いた適当な免疫染色法を用いて細胞学的に検
出できる、細胞内構造を形成することである。
【００２５】本発明の他の方法によれば、過剰量の哺乳
類セントロメアを有する細胞が製造される。そのような
細胞はヒト細胞でも他の哺乳類細胞でもよい。セントロ
メアはその細胞と同一もしくは異なる哺乳類の種から単
離されたＤＮＡを含むことができる。本発明の方法は二
種類のＤＮＡ分子での細胞のコトランスフェクションを
含み、一方はセントロメアＤＮＡを有するＤＮＡであ
り、他方は有力選択マーカーを含むＤＮＡである。好ま
しくは、これら二種類のＤＮＡ分子は、コンカテマーを
形成することのできる配列、例えばλファージのような
ファージＤＮＡを含有している。第一のＤＮＡ分子は、
例えばプローブとして上記セントロメアフラグメントを
用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーから単離することが
できる。別法として第一ＤＮＡ分子は、上記セントロメ
アフラグメントを適当なサイズおよび末端を持つフラグ
メントを造成するための操作に続いて、例えばλファー
ジのようなファージにクローニングすることによって生
じたものでもよい。第二のＤＮＡ分子は、当業者が容易
に入手できるもので、例えば薬剤耐性マーカーを有する
λファージである。
【００２６】λファージＤＮＡはコンカテマーを形成す
るので、これを使用するのが望ましいと信じられるが、
しかしながら、それが絶対に必要であるとは決定されて
いない。さらに、たとえこの性質が必要であるとして
も、他のウイルスＤＮＡまたはＤＮＡ構造物もこの機能
を提供できるであろう。そのように、コンカテマーを形
成できる他の手段の使用も本発明の範囲である。
【００２７】コトランスフェクションの後、有力選択マ
ーカーを発現する細胞を、例えば該マーカーの不存在下
では細胞にたいして毒性量のＧ４１８中で増殖させるこ
とにより選択する。こうして選択された細胞群をさらに
過剰量の哺乳類セントロメアをもつ細胞の検出のために
スクリーニングする。このスクリーニングは標準的細胞
遺伝学的技術、並びに抗−セントロメア抗体での免疫染
色により行うことができる。好ましくはラムダ、マーカ
ーおよびセントロメアＤＮＡ（ラムダクローンからのも
の）は過剰セントロメアの部分に局在するであろう。こ
のことは、当該技術分野で知られているｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーション試験で確認できる。
【００２８】上記方法で製造された一つのセルライン
は、ＥＣ３／７であり、英国、ポートン ダウン（Ｐｏ
ｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）のヨーロピアン・コレクション・
オブ・アニマル・セル・カルチャーズに、１９９０年４
月１０日付けでブダペスト条約の条件下に寄託番号９０
０５１００１で寄託された。
【００２９】ＥＣ３／７セルラインを製造するために用
いられたラムダファージ中のＤＮＡ挿入物の配列（本明
細書中ではＣＭ８と呼ぶ）は、標準的技術で決定されそ
して第１図に示されている。この配列はいかなるＤＮＡ
配列バンクの配列とも異なっている。
【００３０】本発明はまた好ましくは約１０ヌクレオチ
ドの核酸プローブにも関し、このプローブは第１図に示
す配列を持つＤＮＡ分子にハイブリダイズする。そのよ
うな分子の一つはＣＭ８であり、この配列を誘導したλ
ファージクローンである。プローブは、例えば望みの用
途に応じて放射標識、ビオチン標識または未標識で使用
できる。
【００３１】
【実施例】以下の実施例は、本発明を記載された特定の
態様に限定するためではなく、本発明を実施するための
一定の道筋を説明するために特に記載するものである。
【００３２】実施例１ 本実施例はセントロメアからのヒトＤＮＡの単離を説明
する。ヒト結腸癌セルライン（Ｃｏｌｏ ３２０）を１
０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中
のサスペンジョンとして増殖させた。Ｃｏｌｏ ３２０
細胞の有糸分裂中期の染色体を標準的方法（Ｈａｄｌａ
ｃｚｋｙら，（１９８２），Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，
８６：６４３−６５９）により単離した。単離した有糸
分裂中期の染色体を１ｍｌのバッファー（１０５ｍＭ
ＮａＣｌ，５０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）
に、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡとなるように再懸濁して、５
００単位のＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで１時間
消化した。懸濁物を４ｍｌのＩＰＰバッファー（５００
ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸，０．５％ Ｎ
Ｐ−４０，ｐＨ８．０）で希釈し、ＭＳＥ ５−７０ソ
ニケーターで５ｘ５０ｓで音波処理した。この処理によ
り染色体のフラグメントおよび少量（１％以下）の未破
壊の小染色体を含む懸濁物が生じた。この懸濁物を１５
００ｇで１０分間遠心分離し未破壊の染色体フラグメン
トを除去した。光学顕微鏡観察によれば、上清にはほん
の小さい（１μｍ以下）の染色体フラグメントが含まれ
ていた。
【００３３】２５０ｍｇのプロテイン−Ａ セファロー
ス ＣＬ４Ｂ（ファルマシア）を、ＩＰＰバッファー中
で膨潤させ、ＩＰＰバッファーで２０倍に希釈した５０
０μｌのヒト抗−セントロメア血清ＬＵ８５１（Ｈａｄ
ｌａｃｚｋｙら（１９８９），Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，
９７：２８２−２８８）とともにインキュベートした。
音波処理した染色体フラグメント（５ｍｌ）を抗−セン
トロメアセファロース（１ｍｌ）と混合し、穏やかにゆ
すりながら室温で２時間インキュベートした。続いて、
２５ｍｌのＩＰＰバッファーで３回洗浄した後、セファ
ロースを２００ｇで１０分間遠心分離した。
【００３４】免疫沈降物からのＤＮＡの単離は、１％Ｓ
ＤＳを含む１０ｍＭ トリス塩酸，２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０中で５０℃一夜プロテイナーゼ−Ｋ処理
（Ｍｅｒｃｋ，１００μｇ／ｍｌ）を行い、その後フェ
ノール抽出を繰り返しそしてイソプロパノールで沈澱さ
せて行った。全ての一般的ＤＮＡ操作は「モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」〔コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８２〕に従っ
て行った。
【００３５】免疫沈降したＤＮＡおよび上清ＤＮＡの電
気泳動の結果は第２図に示す。抗−セントロメアセファ
ロースに結合しなかった染色体フラグメント（上清）か
らのＤＮＡの多くは、数百塩基対から５ｋｂの範囲であ
り（第２図，レーンＡおよびＢ）、一方、抗−セントロ
メアセファロースに結合した染色体フラグメントからの
ＤＮＡは、更に分子量の大きい（９−２０ｋｂ）のフラ
グメント群も含んでいた（第２図，レーンＣおよび
Ｄ）。このフラグメント寸法の分布は、セントロメアＤ
ＮＡが哺乳類染色体中で構造的に最も安定な領域である
という認識（Ｈａｄｌａｃｚｋｙら，（１９８１），Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍａ，８１：５５７−５６７）と一致
し、従ってこのＤＮＡを酵素消化および機械的剪断に対
して比較的抵抗性にする。
【００３６】実施例２ 本実施例は、高分子量の免疫沈降ＤＮＡを、ゲノムＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダ
イゼーションプローブとして用いる用途を例示する。高
分子量ＤＮＡを実施例１のアガロースゲルから、電気溶
出により単離し、ランダムオリゴヌクレオチドプライミ
ング法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら，（１９８３），Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２：６−１３）により３２
Ｐ−ｄＡＴＰで標識し、そしてλシャロン４Ａヒトゲノ
ムライブラリー（Ｍａｎｉａｔｉｓら，（１９７８），
Ｃｅｌｌ，，１５：６８７−７０１）のスクリーニング
用プローブとして用いた。ハイブリダイズしたクローン
（ＣＭ８）を得、これは１４ｋｂのヒトＤＮＡ挿入物を
含んでいた。この挿入物のいくつかの制限酵素に対する
制限地図は第３図に示されている。この１４ｋｂ挿入物
の一部分をヒトリンパ球ゲノムＤＮＡにサザンハイブリ
ダイゼーションさせた結果、この１４ｋｂ挿入物がゲノ
ム中のＤＮＡの連続的部分であって、複数のフラグメン
トの連結生成物ではないことが示された。
【００３７】実施例３ 本実施例はクローンＣＭ８の１４ｋｂ挿入物のコピー数
がヒトゲノム中の各染色体に存在するコピー数と一致す
ることを示す。サザンプロット実験を行うために、シン
グルコピーのＤＮＡプローブ（ＸＶ２Ｃ）（ＥＳｔｉｖ
ｉｌｌら，（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ，３２６：８４
０−８４５）およびＣＭ８挿入物の中心部ＸｈｏＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメント（第２図）を、ヒト末梢リンパ球
ＤＮＡの連続希釈列と、同時にハイブリダイズさせた。
プローブは、ランダムオリゴヌクレオチドプライミング
法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら，（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ・，１３２：６−１３）で標識して用い
た。ＣＭ８プローブのシグナルを既知のシングルコピー
プローブと比較することにより、ＣＭ８のコピー数は、
ハプロイドゲノム当たり１６−３２であると推定され
た。
【００３８】実施例４ 本実施例はヒト有糸分裂中期染色体に対するプローブと
しての、ＣＭ８ ＤＮＡの用途を示す例である。ヒト
（Ｃｏｌｏ ３２０）の有糸分裂中期染色体に対する、
３Ｈ−チミジン標識ＣＭ８ ＤＮＡの放射活性ｉｎ ｓ
ｉｔｕハイブリダイゼーションを、Ｐｉｎｋｅｌら（１
９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ・Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８３：２９３４−２９３８の方法で実施した。銀
粒子の優先的セントロメアへの局在か観察された（第４
図）。ビオチン標識した全ＣＭ８挿入物のサブフラグメ
ントを用いてグラハム（（Ｇｒａｈａｍ）ら，（１９７
３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７）の方
法で行った、非−放射活性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーションにおいては、本発明者らの標準的方法におい
ては陽性ハイブリダイゼーションシグナルを検出するこ
とがきなかった。さらに、ビオチン標識プローブを用い
たシングルコピー遺伝子の検出に適するハイブリダイゼ
ーション法（Ｌａｗｒｅｎｃｅら，（１９８８），Ｃｅ
ｌｌ，５２：５１−６１）では、典型的なＲ−バンド様
Ａｌｕハイブリダイゼーションパターン（Ｋｏｒｅｎｂ
ｅｒｇら，（１９８８），Ｃｅｌｌ，５３：３９１−４
００）を除いて、全１４ｋｂ ＣＭ８挿入物をもつ染色
体のどれについても、特異的ハイブリダイゼーションシ
グナルは全く検出されなかった。この陰性結果に関して
は、これらの配列はセントロメア構造の内部で小さくた
たまれているために、ハイブリダイゼーションプローブ
が実質的に接近できないこと、およびビオチン系が放射
活性系よりも低感度であるためとの説明が可能であろ
う。
【００３９】実施例５ 本実施例はヒトＣＭ８クローンの配列を開示する。λＣ
Ｍ８のヒトゲノム挿入物の配列は、ダイデオキシ法（Ｓ
ａｎｇｅｒら，（１９８０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１４３：１６１−１７８；Ｂｉｇｇｉｎら（１９
８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８０：３９６３−３９６５）で決定した。第１図参
照。１３８６３bpのヒトＣＭ８クローンの配列を完全な
核酸バンク（マイクロジェニー（ＭｉｃｒｏＧｅｎｉ
ｅ），ベックマン）と比較したところ、公知のどの配列
ともホモロジーを示さなかった。しかしがら、両側の直
接繰り返し配列中には欠損している３００bpのＡｌｕ繰
り返しが、２．５kbのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメン
ト中に見出され（第３図）、このことはＡｌｕ型のｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションパターンを説明でき
る。
【００４０】実施例６ 本実施例は哺乳類細胞中にセントロメアを形成させるた
めのＣＭ８ ＤＮＡの用途を例示する。ＣＭ８ ＤＮＡ
のｉｎ ｖｉｖｏセントロメア機能を十分検出するため
に、該ＤＮＡをＡＰＨ−ＩＩ選択遺伝子とともにマウス
ＬＭＴＫ−繊維芽細胞に導入した。マウス繊維芽細胞は
単層細胞として、１０％ＦＣＳを添加したＦ１２培地で
維持した。リン酸カルシウム法（Ｈａｒｐｅｒら，（１
９８１），Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，８３：４３１−４３
９）を用いて、細胞をペトリ皿（８０ｍｍ）当たり２０
μｇのλ ＣＭ８および２０μｇのλｇｔＷＥＳｎｅｏ
ＤＮＡでトランスフェクトした。２分間のグリセロー
ルショックを用いた。λｇｔＷＥＳｎｅｏは、ｐＡＧ６
０プラスミド（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，
（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ・Ｂｉｏｌ．，１５０：１−
１４）を、λｇｔＷＥＳ（Ｌｅｄｅｒら（１９７７），
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１７５−１７７）バクテリオ
ファージベクターにクローニングすることにより製造し
た。
【００４１】二つの理由から、完全λＣＭ８およびλｇ
ｔＷＥＳｎｅｏ構築物をトランスフェクションに使用し
た。第一に、セントロメア形成の間に起こりうるＡＰＨ
−ＩＩ遺伝子の不活性化を避けるために、ＣＭ８配列か
らマーカー遺伝子を分離するため、第二にλＤＮＡはコ
ンカテマー形成による長いタンデム配列のＤＮＡ分子を
形成することができるためである。コンカテマー形成は
セントロメアの形成に必要であると推測されている，と
いうのはＳ．ｐｏｍｂｅ中では４ないし１５コピーの保
存された配列部分がセントロメアを形成するためである
（Ｃｈｉｋａｓｈｉｇｅら，（１９８９），Ｃｅｌ
ｌ，，５７：７３９−７５１）。これら二つの要因を考
慮すると、コンカテマー形成による仮想セントロメアＤ
ＮＡの増殖は、セントロメアの形成の機会を増大させる
であろう。
【００４２】形質転換された細胞は、４００μｇ／ｍｌ
のＧ４１８（ゲンチシン，Ｓｉｇｍａ）を含む増殖培地
で選択した。各Ｇ４１８耐性クローンを分析した。形質
転換されたクローン中のヒト配列の存在は、ＣＭ８挿入
物のサブフラグメントをプローブとして用いるサザンブ
ロットによりモニターした。過剰量のセントロメアのス
クリーニングは、ヒト抗−セントロメア血清ＬＵ８５１
（Ｈａｄｌａｃｚｋｙら，（１９８９），Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍａ，９７：２８２−２８８）を用いて間接免疫螢
光法により行った。”外来”ＤＮＡ配列の染色体におけ
る局在は、ビオチン標識プローブを用いてｉｎ ｓｉｔ
ｕハイブリダイゼーションで決定した。
【００４３】８個の形質転換クローンを分析した。全て
のクローンはマウス染色体中に組み込まれたヒトＤＮＡ
配列を有していた。しかしながら、２つのクローン（Ｅ
Ｃ５／６およびＥＣ３／７）のみが、ジ−セントリック
な染色体の規則的存在を示した。ジ−，トリ−，および
多−セントメリックな染色体を有する、クローンＥＣ５
／６の各細胞は極端に不安定であった。このセルライン
の６０％以上の細胞において、組み込まれたＤＮＡ配列
の染色体での局在は、細胞間でばらついた。この不安定
性のためにクローンＥＣ５／６は不適当とみなされた。
しかしながら、ＥＣ３／７細胞は安定であり、ジセント
リック（８５％）またはミニ染色体（１０％）のいずれ
かを有していた。ジセントリック染色体のセントロメア
およびミニ染色体のセントロメアは、抗−セントロメア
抗体（第５図ＡおよびＢ）による免疫染色によって、正
常マウスセントロメアとの識別が可能であった。
【００４４】実施例７ 本実施例は、新たにＥＣ３／７セルライン中に導入され
たＤＮＡがセントロメアの形成に寄与することを示す。
ビオチン標識したＣＭ８、ＡＰＨ−ＩＩ遺伝子、および
λファージＤＮＡでの、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションを行った。染色体をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダ
イゼーション実験のためにプロピジウムヨージドで逆染
色し（カウンターステイン）（Ｐｉｎｋｅｌら，（１９
８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ・ＵＳ
Ａ，８３：２９３４−２９３８）、一方間接免疫螢光法
はＤＮＡ結合色素のへキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２
５８で行った。全ての観察および顕微鏡検査は、オリン
パスＡＨＢＳ Ｖａｎｏｘ顕微鏡を用いて行った。写真
撮影のフィルムには、フォルト４００プロフェッショナ
ルブラックアンドホワイト（Ｆｏｒｔｅ ４００ Ｐｒ
ｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｂｌａｃｋ ａｎｄ ｗｈｉｔ
ｅ）およびフジカラー４００スーパーＨＧカラーフィル
ムを用いた。
【００４５】これらの三つのプローブは、例外なく同じ
スポットにハイブリダイズした：そのスポットは、ジセ
ントリック染色体の遠位セントロメア上のもの（第５図
Ｃ）か、あるいはミニ染色体のセントロメア上のもの
（第５図Ｄ）である。ＥＣ３／７細胞の５％より少ない
細胞において、ハイブリダイゼーションシグナルの別の
局在が見られた。これらの細胞には一つ以上の組み込み
部位を持つ細胞、検出可能シグナルを持たない細胞、ま
たはジセントリック染色体であると同定された以外の染
色体上にハイブリダイゼーションが認められたものを含
んでいた。
【００４６】０．５％より少ない細胞に、ジセントリッ
ク染色体上にハイブリダイゼーションシグナルのタンデ
ム配列が観察され（第６図Ａ−Ｃ）、このことはこの追
加セントロメアが自己複製可能であることを示唆した。
これらの複製したセントロメアの少なくともあるものは
機能的であるように見えた。このことは二重セントロメ
アを持つミニ染色体の存在により示唆された。このミニ
染色体の両方のセントロメア共に抗−セントロメア抗体
による免疫染色が陽性であった（第７図Ａ）。二重セン
トロメアを有するミニ染色体は、多セントロメア染色体
の分解産物である可能性もある。
【００４７】マウスの有糸分裂中期細胞の間接免疫螢光
法は、Ｈａｄｌａｃｚｋｙら，（１９８９），Ｃｈｒｏ
ｍｏｓｏｍａ，９７：２８２−２８８に記載された方法
で行った。同じ有糸分裂中期に間接免疫螢光法およびｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行って、有糸分
裂細胞をグリシン−ヘキシレン グリコールバッファー
（Ｈａｄｌａｃｚｋｙら，（１９８９），Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍａ，９７：２８２−２８８）に再懸濁し、３７℃
で１０分間膨潤させ、続いて細胞遠心および冷（−２０
℃）のメタノールによる固定を行った。標準的免疫染色
（Ｈａｄｌａｃｚｋｙら，（１９８９），Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍａ，９７：２８２−２８８）ののち、中期細胞を
写真撮影し、次いでカバースリップをリン酸バッファー
サリンで洗浄し、そしてスライドを氷冷メタノール−酢
酸で固定し、風乾しそしてｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションに用いた。
【００４８】ヒトＣＭ８クローン配列およびＡＰＨ−II
遺伝子のセントロメア領域への組み込みを証明するた
め、抗−セントロメア抗体によるセントロメアの免疫染
色、続いてＣＭ８およびＡＰＨ−IIプローブによるｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、同じ有糸分裂中
期のＥＣ３／７細胞のプレートで実施した。ビオチン−
標識ＣＭ８およびＡＰＨ−IIプローブどちらのｉｎ ｓ
ｉｔｕハイブリダイゼーションの信号も、追加的セント
ロメアを有する染色体の免疫染色セントロメア領域との
同時局在を示した（第７図）。
【００４９】実施例８ 本実施例はＥＣ３／７セルラインの安定性を説明する。
単一の細胞に由来する４６の独立サブクローンを単離し
て分析した。各サブクローンはジセントリック染色体を
有していた。ミニ染色体を含む細胞のパーセントは、サ
ブクローンによって２％と３０％のあいだでばらつきを
示した。本発明者らは、追加的セントロメアをミニ染色
体のみに有するサブクローンを単離することはできなか
った。この結果はミニ染色体は不安定で、これがジセン
トリック染色体の規則的分解の生成物であるとみなしう
ることを示唆した。非−選択的培地で４６日間培養した
ＥＣ３／７細胞（１０３ 有糸分裂中期）の免疫染色に
よる、予備分析では、８０．６％の細胞がジセントリッ
ク染色体（６０．２％）またはミニ染色体（２０．４
％）を有していた。引き続きビオチン標識プローブによ
るｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、追加的セ
ントロメア中に”外来”ＤＮＡが存在することを確認し
た。これらの結果はこの培養期間において、非−選択条
件下で追加的セントロメアに重大な損失または不活性化
が生じないことを示唆する。
【００５０】実施例９ 本実施例はＣＭ８挿入物がコンカテマーになってセルラ
インＥＣ３／７の機能的セントロメアを形成することを
示す。ＥＣ３／７セルラインのＤＮＡおよびヒトリンパ
球のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして
サザンハイブリダイゼーション実験でＣＭ８挿入物のサ
ブフラグメントをプローブとして使用した。ＥＣ３／７
ＤＮＡによるハイブリダイゼーションシグナルの強さを
ヒトＤＮＡのものと比較して、付加的セントロメア中に
組み込まれたヒト配列の最低数は３０以上であると推定
された。ヒトリンパ球ＤＮＡ中のＣＭ８のコピー数は、
前記実施例３に記載したとおりと決定された。
【図面の簡単な説明】
【図１】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第１部分を示す図であ
る。
【図２】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第２部分を示す図であ
る。
【図３】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第３部分を示す図であ
る。
【図４】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第４部分を示す図であ
る。
【図５】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第５部分を示す図であ
る。
【図６】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第６部分を示す図であ
る。
【図７】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第７部分を示す図であ
る。
【図８】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第８部分を示す図であ
る。
【図９】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノムラ
イブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフラ
グメントの一連の配列における第９部分を示す図であ
る。
【図１０】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１０部分を示す図で
ある。
【図１１】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１１部分を示す図で
ある。
【図１２】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１２部分を示す図で
ある。
【図１３】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１３部分を示す図で
ある。
【図１４】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１４部分を示す図で
ある。
【図１５】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１５部分を示す図で
ある。
【図１６】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１６部分を示す図で
ある。
【図１７】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１７部分を示す図で
ある。
【図１８】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１８部分を示す図で
ある。
【図１９】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第１９部分を示す図で
ある。
【図２０】λシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａヒトゲノム
ライブラリー中に同定されたＤＮＡの１３８６３ｂｐフ
ラグメントの一連の配列における第２０部分を示す図で
ある。
【図２１】免疫沈降により得られたＤＮＡフラグメント
のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２２】ＣＭ８λシャロン４Ａクローンのヒトゲノム
ＤＮＡ挿入物の制限地図を示す図である。
【図２３】３Ｈ−チミジン標識したＣＭ８ＤＮＡのヒト
有糸分裂中期染色体へのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションの結果を示す図である。
【図２４】抗−セントロメア抗体での間接免疫螢光法に
よる（パネルＡおよびＢ）、そしてビオチン標識したＣ
Ｍ８プローブでのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ンによる（パネルＣ）およびＡＰＨ−ＩＩ遺伝子のＳｍ
ａＩ／Ｂｇｌ ＩＩの１ｋｂフラグメントによる（パネ
ルＤ）、ＥＣ３／７細胞のダイセントリック染色体およ
びミニ染色体の検出を示す図である。
【図２５】ＥＣ３／７セルラインでの余剰セントロメア
の複製を示す図である。
【図２６】ＥＣ３／７細胞の同じ有糸分裂中期におい
て、組み込みＤＮＡ配列がセントロメア領域と共に存在
することを、抗−セントロメア血清での免疫染色により
（パネルＡおよびＤ）、およびビオチン標識ＣＭ８での
（パネルＢ）およびＡＰＨ−ＩＩプローブでの（パネル
Ｅ）引き続くｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに
より示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 ジュラ・ハドラクスキー ハンガリー人民共和国ホー−6723，セゲ ド，サモス・ウー１／アー，イーイクス 36 (56)参考文献 特開 昭62−248491（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，Ｖｏｌ．97, Ｎｏ．４，（1989），ｐ．282−288

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 過剰量のセントロメアを含有する細胞を
    含むヒト以外の真核細胞株であって、前記セントロメア
    が染色体に含まれており、過剰のセントロメアを含む染
    色体がヒトＤＮＡを含んでおり、前記ヒトＤＮＡが下記
    ヌクレオチド配列を含んでいる、前記細胞株。 【化１】
  2. 【請求項２】 前記過剰のセントロメアを含む染色体
    が、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セ
    ル・カルチャー（ECACC）に受託番号90051001として寄
    託されている細胞株の同定特性をすべて有する細胞株に
    由来する、請求項１に記載の細胞株。
  3. 【請求項３】 ヨーロピアン・コレクション・オブ・ア
    ニマル・セル・カルチャー（ECACC）に受託番号9005100
    1として寄託されている細胞株の同定特性をすべて有す
    る細胞株。
  4. 【請求項４】 マウス細胞株である、請求項１〜３のい
    ずれかに記載の細胞株。
  5. 【請求項５】 二動原体染色体を含む、請求項１〜４の
    いずれかに記載の細胞株。
  6. 【請求項６】 下記ヌクレオチド配列を有する核酸プロ
    ーブ。 【化２】
  7. 【請求項７】 放射性標識されている、請求項６に記載
    の核酸プローブ。
  8. 【請求項８】 ビオチン標識されている、請求項６に記
    載の核酸プローブ。
  9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれかに記載の哺乳類
    細胞を産生する方法であって、 （ａ）下記ヌクレオチド配列を含むヒトＤＮＡを含むＤ
    ＮＡフラグメントと、有力選択マーカーをコードするＤ
    ＮＡフラグメントとで細胞を同時トランスフェクトし、 （ｂ）その細胞を増殖させ、有力選択マーカーを発現す
    る細胞を選択し、 （ｃ）有力選択マーカーを発現する細胞のうち、過剰量
    の哺乳類セントロメアを有する細胞を検出することを含
    んでなる、前記方法。 【化３】
  10. 【請求項１０】 同時トランスフェクトされるヒトＤＮ
    ＡフラグメントがλＣＭ８を含んでおり、λＣＭ８が下
    記ヌクレオチド配列およびλファージＤＮＡを含んでい
    る、請求項９に記載の方法。 【化４】
  11. 【請求項１１】 有力選択マーカーを発現し過剰量の哺
    乳類セントロメアを有する細胞が、ヨーロピアン・コレ
    クション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（ECAC
    C）に受託番号90051001として寄託されている細胞株の
    同定特性をすべて有する細胞である、請求項９に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 過剰のセントロメアを有する二動原体
    染色体を含有する哺乳類細胞を産生する方法であり、工
    程（ｃ）が、有力選択マーカーを発現する細胞のうち、
    ２つのセントロメアを有する染色体を含む過剰量のセン
    トロメアを有する細胞を検出することからなる、請求項
    ９〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 異種ＤＮＡを含有するミニクロモソー
    ムを含有する哺乳類細胞を産生する方法であり、工程
    （ｃ）が、有力選択マーカーを発現する細胞のうち、ミ
    ニクロモソームを含む過剰量のセントロメアを有する細
    胞を検出することからなる、請求項９〜１１のいずれか
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 選択マーカーがＧ４１８耐性である、
    請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 選択マーカーがアミノグリコシド−
    ３’ホスホトランスフェーゼ−IIをコードしている、請
    求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 選択マーカーをコードしているＤＮＡ
    フラグメントがさらに、コンカテマー化することができ
    るヌクレオチド配列を含んでいる、請求項９〜１５のい
    ずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 有力選択マーカーがλファージベクタ
    ーに担持されている、請求項９〜１６のいずれかに記載
    の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞を抗セントロメア抗体とin situ
    で反応させることにより、過剰のセントロメアを検出す
    る、請求項９〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 抗体がクレストシンドロームの患者の
    血清に由来する、請求項１８に記載の方法。
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