JP3447733B2 - Ｔリンパ球表面のヒト糖蛋白質を認識するネズミモノクローナル抗体（５ｃ８） - Google Patents

Ｔリンパ球表面のヒト糖蛋白質を認識するネズミモノクローナル抗体（５ｃ８）

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Description

【発明の詳細な説明】 ここで開示される発明は、国立衛生研究所からの助成
金第PO1−AI−26886、RO−１−AI−14969、RO−１−CA
−55713、及び免疫学養成助成金（Immunology Training
Grant）AI−07132による研究でなされたものである。
従って、合衆国政府は、この発明に一定の権利を有す
る。
〔本発明の背景〕
この出願の全体を通じて、種々の報告が、括弧内の著
者の名字及びこれに続く報告年によって参照されてい
る。これらの報告に対する全参照文献は、明細書の最
後、即ち請求の範囲のすぐ前にある。本出願で開示さ
れ、クレームされた本発明の期日における当分野の状態
をより完全に説明するために、これらの報告の開示内容
は、参照文献によって本出願中に含まれる。
〔背景技術〕
「Ｔ細胞ヘルパー機能」といわれる接触依存性プロセ
スにおいて、CD4+Tリンパ球は、Ｂ細胞を活性化及び分
化させ、これによって抗体分子の特異性、分泌及びアイ
ソタイプエンコード機能を調節することにより体液性免
疫応答を認識している（Mitchellら,1968;Michison,1 9
71;Whiteら,1978;Reinherzら,1979;Janewayら,1988;O′
Brienら,1988;Rahemtullaら,1991;及びGrusbyら,199
1）。Ｔ細胞ヘルパー機能の接触依存性要素を媒介する
Ｔ細胞表面分子はまだ完全にはわかっていない（Noelle
ら,1991）。
Ｔ細胞がＢ細胞を補助し、分化させるプロセスは、２
つの異なったフェーズ、即ち誘導フェーズ及びエフェク
ターフェーズに分けられる（Vitettaら,1989;Noelleら,
1990）。誘導フェーズにおいて、増殖していないＴ細胞
は、抗原感作されたＢ細胞に接触し、この結合は、クロ
ーン型のＴ細胞レセプター（TCR）−CD4複合体をＢ細胞
上のI a/Ag複合体と相互作用させる（Janewayら,1988;K
atzら,1973;Zinkernagel,1976;Sprent,1978a;Sprent,19
78b;Jonesら,1981;Juliusら,1982;Chestnutら,1981;Rog
ozinskiら,1984）。I a/AgのTCR/CD4認識は、安定なＴ
−Ｂ連結相互作用対（cognate pairs）の形成並びに両
方向のＴ及びＢ細胞活性化で起こる（Sandersら,1986;S
nowら,1983;Krusemeierら,1988;Noelleら,1989;Bartlet
tら,1989;Kupferら,1987）。エフェクターフェーズにお
いて、活性化されたＴ細胞は、リンフォカインを分泌す
ることによって（Noelleら,1983;Thompsonら,1985）、
及び接触依存性の刺激によって（Noelleら,1989;Clemen
tら,1984;Crowら,1986;Brianら,1988;Hirohataら,1988;
Joverら,1989;Whalenら,1988;Pollokら,1991;Bartlett
ら,1990）Ｂ細胞を分化させる。これらは両方とも、Ｔ
細胞が小さな増殖していないＢ細胞を最終的にIg分泌細
胞に分化させるのに必要である（Clementら,1984;Marti
nezら,1981;Anderssonら,1980）。
Ｔ細胞が補助する誘導フェーズはAg−依存性及びMHC
−制限性であるが（Janewayら,1988;Katzら,1973;Zinke
rnagle,1978a;Sprent,1978a;Jonesら,1981;Juliusら,19
82;Chestnutら,1981;Anderssonら,1980）、Ｔ細胞ヘル
パー機能のエフェクターフェーズは、Ag−独立性及びMH
C−非制限性であり得る（Clementら,1984;Hirohataら,1
988;Whalenら,1988;Anderssonら,1980;DeFrancoら,198
4;Juliusら,1988a;Juliusら,1988b;Riedelら,1988;Owen
s,1988;Cambierら,1988;Tohmaら,1991;Lohoffら,197
7）。追加の対照的な性質は、Ｔ細胞が補助する誘導フ
ェーズが、しばしばCD4分子を必要とし、抗−CD4 mAb
によって阻害されることである（Rogozinskyら,198
4）。これに対して、ヘルパーエフェクター機能は、CD4
分子を必要とせず（Friedmanら,1986）、抗−CD4 mAb
によって阻害されない（Brian,1988;Hirohataら,1988;W
halenら,1988;Tohmaら,1991）。非特異的なヘルパーエ
フェクター機能は、抗原特異的な連結相互作用対を伴っ
たＴ−Ｂ細胞相互作用の局剤化する性質によって、特異
的なＢ細胞標的上に集められると信じられている（Bart
lettら,1989;Kupferら,1987;Pooら,1988）。
Ｂ細胞分化の終末は、接触及びリンフォカインの両方
で媒介されたＴ細胞からの刺激を必要とするが、Ｂ細胞
分化の中間段階は、分泌されるファクターを欠いた状態
で活性化されたＴ細胞表面によって誘導されうる（Crow
ら,1986;Brianら,1988;Sekitaら,1988;Hodgkinら,1990;
Noelleら,1991;Kubotaら,1991）。Ｂ細胞に関するこれ
らの中間体効果には、表面CD23発現の誘導（Crowら,Jov
erら,1989;Crowら,1989）、細胞分裂の進行に伴った酵
素の誘導（Pollokら,1991）及びリンフォカインに対す
る応答性の誘導（Noelleら,1989;Pollokら,1991;Tohma
ら,Hodgkinら,1990;Noelleら、1991;Kubotaら,1991）が
含まれる。Ｂ細胞を活性化させる活性化誘導Ｔ細胞表面
分子は同定されていないが、機能性の研究は、これらの
誘導及び生化学の幾つかの特徴を示している。第一に、
Ｔ細胞は、Ｂ細胞を４〜８時間刺激し、ついで活性化す
る能力を身につけている（Bartlettら,1990;Tohmaら,19
91）。第二に、活性化されたＴ細胞の表面に関連づけら
れるＢ細胞刺激活性は、パラホルムアルデヒド固定細胞
上（Noelleら,1989;Crowら,1986;Pollokら,1991;Tohma
ら,1991;Kubotaら,1991）、及び精製された膜フラグメ
ント上（Hodgkinら,1990;Martinezら,1981）で保持され
る。第三に、Ｂ細胞刺激活性は、プロテアーゼ処理に対
して敏感である（Noelleら,1989;Sekitaら,1988;Hodgki
nら,1990）。第４に、これらの表面活性構造を取得し、
次いでＴ細胞活性化を起こすプロセスは、シクロヘキサ
ミドによって阻害される（Tohmaら,1991;Hodgkinら,199
0）。これらの研究は、Ｂ細胞に接触依存性刺激を伝達
する活性化誘導Ｔ細胞表面蛋白質の存在を強く示唆して
いるが、このような構造の分子の同一性は、まだ不明の
ままである。
表面CD23分子を発現し、レクチンの存在下でＢ細胞の
終末分化を補助するようにＢ細胞を活性化するというユ
ニークで機能的な可能性を有するCD4-1Jurkatサブクロ
ーン（D1.1）の単離は、以前に報告されている（Yellin
ら,1991）。JurkatD1.1は、多数の関連のないドナーか
らのＢ細胞を活性化し、このD1.1の効果が、Ag独立性で
あり、MHC非制限性であることを示唆した。JurkatD1.1
で媒介されるＢ細胞の活性化のメカニズムは、細胞−細
胞接触か、又は細胞がかなり近接することに依存するこ
とが見い出されている。これは、パラホルムアルデヒド
固定D1.1細胞であるがファクターを分泌しないものが、
Ｂ細胞CD23を誘導する能力を有しているためである。加
えて、Ｂ細胞上のD1.1の効果は、抗−IL4抗体によって
阻害されない。更に、Ｂ細胞上のD1.1の効果は、IL−４
の効果から明瞭である。これは、D1.1ではなく、rIL−
４がＢ細胞表面IgM（sIgM）の上方調節を誘導するから
である（Yellinら,1991;Shieldsら,1989）。まとめて考
えると、これらのデータは、JurkatD1.1及び活性化され
たCD4＋Ｔ細胞が、Ｔ細胞によって補助される接触依存
性要素をＢ細胞に与える表面構造を分担していることを
示唆している。
本出願において、ネズミIgG2a mAb（5c8）が生成さ
れ、これは、D1.1で媒介されたＢ細胞活性化を阻害し、
及びD1.1の表面からの、新規な30キロダルトン（kD）の
非スルフィド結合性蛋白質をイムノプレシピテーション
させる。通常のＴ細胞では、5c8抗原は、活性化されたC
D4＋Ｔ細胞上で、mRNA及び蛋白質合成に要求されるより
も幾分過渡的に発現される。機能性の研究では、mAb 5
c8はＢ細胞の活性化及び終末分化を媒介するＴ細胞の能
力を阻害する。まとめて考えると、これらのデータは、
5c8 Agが、Ｂ細胞分化のための接触依存性刺激を媒介
する活性化誘導Ｔ細胞表面構造の重要な成分であること
を示している。
〔本発明の概要〕
本発明は、ハイブリドーマ（ATCCアクセス番号HB 10
916）から生産されるモノクローナル抗体5c8によって特
異的に認識される蛋白質に結合することができるモノク
ローナル抗体を提供する。本発明は、またハイブリドー
マ（ATCCアクセス番号HB 10916）によって生産される
モノクローナル抗体5c8も提供する。
本発明は、D1.1（ATCCアクセス番号HB CRL10915）と
称されるヒトCD4-T細胞白血病細胞株であって、接触依
存性ヘルパー機能を構造的にＢ細胞に与えるものを提供
する。本発明はまた、活性化されたＴ表面から単離され
た蛋白質も提供する。ここで、該蛋白質は、Ｔ細胞がＢ
細胞を活性化するために必要なものである。本発明は、
更に活性化されたＴ細胞表面から単離された安定な蛋白
質を提供する。ここで、該蛋白質は、Ｔ細胞がＢ細胞を
活性化するために必要なものである。
本発明は、更にハイブリドーマ（ATCCアクセス番号HB
10916）から生産されるモノクローナル抗体5c8によっ
て特異的に認識される蛋白質をエンコーディングする単
離された核酸分子を提供する。
図面の簡単な説明 図1. CD- Jurkat D1.1.の細胞表面の表現型。CD4- J
urkat D1.1.とCD4+B2.7の蛍光ヒストグラム（FACS）分
析の結果を示した。Ｙ軸は細胞数を、Ｘ軸は相対蛍光強
度を表す。使用したmAbは:OKT3（抗CD3）、OKT4（抗CD
4）、W6/32（抗MHC Ｉ）である。“コントロール”は
一次mAb非存在下でのバックグラウンド染色（強度）を
示す。
図2. Jurkat D1.1は休止Ｂリンパ球上でCE23の発現を
誘導する。単独で、あるいはCD4-Jurkat（D1.1）、もし
くはCD4+ Jurkat（B2.7）と共に24時間培養した後の、
粘性を失った高密度Ｂ細胞の２色FACS分析の結果を示
す。分析には抗IgM−FITCもしくは抗CD20（Leu−16）−
FITC（Ｘ軸上）と抗CD23−PE（Ｙ軸上）（Becton−Dick
inson）を用いた。各ヒストグラムの右上に示した数値
は、両分子を発現するゲートされた（gated）全細胞の
割合を表す。Jurkat D1.1で培養したＢ細胞ポピュレー
ションは、B2.7（16％のIgM+細胞と16％のCD20+細胞）
で培養したＢ細胞と比較してIgM+細胞の66％、CD20+細
胞の69％でCD23を発現した。本実験では、単色FACSは、
CD3（OKT3）＋ ２％、IgM+84％、CR2（HB−５）+84％
およびCD（Leu−16）+87％となる小さな高密度Ｂ細胞の
ポピュレーションを示した。
図3. D1.1に誘導されたC23発現の投与応答。種々の割
合のD1.1、B2.7細胞または細胞上清と共に24時間培養し
た後に、CD23を発現するIgM+細胞の割合を示す。実験の
条件と２色FACS分析は、図２に示す通りである。凡例で
は、２×105細胞に添加されるJurkatsの比率を図示する
ように変化させたことを除いた。上清は、１×105D1.1
もしくはB2.7細胞をIscove′ｓ改良Dulbecco培地/10％F
CS 1ml中で培養し、48時間後に採取した。またその後Ｂ
細胞へ添加する前に0.2mμのフィルターを通した。IgM+
細胞のCD23発現のバックグラウンドの値（Ｂ細胞のみ）
は、12％であった。Ｂ細胞ポピュレーションは、本実験
ではIgM+が65％であった。
図4. この図は、PHA存在下でJurkat D1.1がＢ細胞の増
殖を誘導することを示す。rIL−２（25U/ml）、rIL−４
（25U/ml）、PHA（5ug/ml）またはコントロール培地の
指示された組み合わせの存在下で、マイトマイシン−Ｃ
処理されたJurkat細胞と共に培養したＢ細胞の［H3］チ
ミジンの取り込みを示す。エラーバーは、３回の培養の
平均値の標準偏差を示す。
図5. Jurkat D1.1は、Ig分泌細胞へのＢ細胞の分化を
誘導する。A.PWM欠乏下で、Ｂ細胞に対して指示された
割合のJurkat D1.1もしくはB2.7により誘導されるＢ細
胞105個当りのプラーク形成コロニーの数。B. 1A）と
同様の実験から得られた上清中のIgG。E-細胞は、Ｅロ
セッタ（rosette）がなく、粘着性がない高密度のパー
コールポピュレーションであり、それは優勢なＢ細胞で
ある。E+細胞は、Ｅロセッタがポジティブで、マイトマ
イシンＣ処理した休止Ｔ細胞である。Igの測定は定量サ
ンドイッチELISA法により行った。エラーバーはは標準
曲線を基に計算された標準偏差を表す。
図6. D1.1ではなくrIL−４がＢ細胞のsigM発現を増加
させた。図３と同様の実験の結果得られた２色FACS分析
を示す。示された抗IL−４の濃度は1.25μg/mlであり、
rIL−４は50U/mlである。IgMのメジアンチャンネル蛍光
（median channel fluorescence）は右のカラムで示
す。
図7. mAb 5c8のJurkat D1.1細胞への結合。CD4- Jurk
at D1.1とCD4+ Jurkat B2.7細胞の蛍光ヒストグラム分
析（FACS）を示す。Ｙ軸は細胞数を示し、Ｘ軸は相対蛍
光強度を示す。用いたmAbは:OKT3（抗CD3）、OKT4（抗C
D4）、OKT8（抗CD8）、W6/32（抗MHC Ｉ）およびmAb 5
c8である。FITCはコントロールmAbとマッチしたアイソ
タイプのバックグラウンド染色（強度）を表す。
図8. mAb 5c8は、Ｂリンパ球によりCD23の発現を誘導
するJurkat D1.1を阻害する。培地のみ、B2.7もしくはD
1.1 Jurkatクローンを加えた培地を24時間培養し、粘性
を失った高密度Ｂ細胞の２色FACS分析を示す。そしてこ
こでは、抗IgM−FITC（Ｘ軸）または抗CD23−PE（Ｙ
軸）を用いた。FACSトレーシング（tracing）の右上の
数値は、CD23を発現するIgM+細胞の割合を表す。mAb W
6/32は１μg/ml存在し、mAb 5c8はハイブリドーマの上
清を200倍希釈したものである。ネズミのIgG2a mAb W
6/32は、クラスＩ MHC分子上の同一構造決定基（monom
orphic determinant）を認識する。
図9. mAb 5c8とコントロールmAbにより免疫沈降した表
面蛋白のSDS/PAGE分析。２−MEの存在下（還元基、Ｒ）
または非存在下（非還元基、NR）において12.5％のポリ
アクリルアミドにて分離された、表面をヨウ素処理した
Jurkat D1.1、Jurkat B2.7細胞の細胞溶解物由来のmAb
5c8またはコントロールのmAbとの免疫沈降物のオートラ
ジオグラムを示す。示されたmAbは、抗CD28（KOLT−
４）と抗MHCクラスＩ（W6/32）である。分子量マーカー
は、ラベル処理前のスタンダードの移動度を表す。NMS:
正常マウス血清 図10. Ｔ細胞の活性化と活性化されたＴ細胞の抗原5c8
の発現における代謝的阻害因子の影響。示されているよ
うにmAb 5c8もしくは抗CD69を用い、休止状態または活
性化状態のＴ細胞のFACSヒストグラムを表す。Ｔ細胞の
活性は、アクチノマイシンＤ（10μＭ）もしくはシクロ
ヘキサミド（100μＭ）存在下に５時間放置後、PMA（10
ng/ml）、PHA（10μg/ml）により測定した。
図11. 単離されたCD4+、CD8+T細胞サブセット上での5c
8の発現のカイネティクス。直前に精製調製したＴ細胞
サブセットをPHA（10μg/ml）、PMA（10ng/ml）で活性
化した後の、CD4+細胞（a,b,c）またはCD8+細胞（d,e,
f）の示された時間毎蛍光ヒストグラムを示す。実線:5c
8の結合；破線:IgG2aコントロール；点線：抗CD69。
図12. D1.1は、Ｂ細胞上での表面CD23の発現を誘導
し、RAMOS266でも幾分か発現を誘導する。それはmAb 5
c8（抗Ｔ−BAM）またはmAb G28−５（抗CD40）により
阻害される。図示されるようにJurkatクローンD1.1もし
くはB2.7との培養後の、Ｂ細胞（左のカラム）もしくは
RAMOS266（右のカラム）のＹ軸上の抗CD23PEとＸ軸上の
抗IgM FITCの２色のFACSヒストグラムを示す。右上の
数値は、Ｂ細胞を含む実験における表面CD23を発現する
IgM+B細胞の割合、またはRAMOS266実験におけるRAMOS26
6上でのCD23のメジアン蛍光強度（測定）を示す。
図13. 扁桃のＢ細胞に対するD1.1の影響。２色FACS分
析によるCD23を発現するIgM+B細胞の割合を表す。ここ
ではD1.1またはB2.7細胞は、mAb 5c8（IgG2a抗Ｔ−BA
M）、W6/32（IgG2a抗クラスＩ MHC）、抗LF Ala（IgG
1）およびＢ−B20（IgG1抗CD40）存在下で、18時間、扁
桃Ｂ細胞と培養した後に用いた。
図14. D1.1−Ｂ細胞活性化におけるＴ−BAMとCD40の役
割。JurkatクローンD1.1もしくはB2.7と共に、あるいは
図示されるリンホカインの存在下で18時間培養した後
の、表面CD23を発現するIgM+B細胞の割合（左側 Ｙ
軸、縞模様バー）とRAMOS266のCD23メジアン蛍光強度
（右側 Ｙ軸、網目模様バー）を示す２色FACSの棒グラ
フを示す。（a.）rIL4とrIK−２は10ユニット/ml、抗IL
−４と抗GM−CSF（“CSF"）は10μg/ml存在する。
（b.）示されたmAbは飽和濃度まで培養開始時に添加さ
れた。
図15. 末梢性Ｂ細胞のD1.1活性化に対する抗CD40mAbの
影響。図示されたmAbの存在下で18時間、D1.1細胞と培
養したIgM+B細胞の２色FACS分析の結果を示す。
図16. Ｂ細胞CD23発現に対する抗CD40のCD32＋Ｌ細胞
へ及ぼす影響。図示されたmAbもしくはコントロール培
地存在下で、Ｉ−A+L細胞（Ｌ細胞）もしくはFcRg II+L
細胞（CD32+L細胞）の単層と共に18時間培養を行なった
後の、（a.）末梢性Ｂ細胞またはRAMOS266、および
（b.）扁桃腺と脾臓のＢ細胞の２色FACS分析の結果を示
す。（a.）では左側のＹ軸はCD23を発現するIgM+B細胞
の割合を示し、右側のＹ軸はRAMOS上でのCD23のMFIを示
す（図１で凡例に示されている）。（b.）では“コント
ロール”とは扁桃を用いた実験の抗LF Alaおよび脾臓を
用いた実験の抗CR2（THB−５）を意味する。
図17. ヒト正常リンパ球組織でのＴ−BAM発現。Ｔ−BA
M発現は、（A.、B.）正常な扁桃（A.×25、B.×40）と
（c.）正常なリンパ節（×25）並びに正常な脾臓（D.×
25;E.×63）の凍結した組織断片で評価した。ここではm
Ab 5c8と改変ABC技術（材料と方法参照）を用いた。Ｔ
−BAM陽性は、膜の染色として現われる。
図18. Ｔ−Ｂ分子の相互作用モデル 図19. 慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるCD4
+Tリンパ球上でのＴ−BAMの発現。活性型、細胞性の慢
性関節リューマチの患者に由来する滑膜パンヌスでの１
つのリンパ小節における免疫化学的な染色区分を示す。
（a.b）抗CD3ジアミノベンジジン（DAB）染色（a.ロー
パワー、b.ハイパワー）。（ｃ）抗CD4（ブルーフシ
ン、APAP染色）と抗Ｔ−BAM（mAb 5c8、褐色、DAB）に
よる二重染色。（ｄ）抗CD8（ブルーフシン、APAP染
色）および抗Ｔ−BAM（mAb 5c8、褐色、DAB）。これら
の標本は全て、慢性関節リューマチの滑膜の炎症に関わ
るCD4+T細胞上でＴ−BAMが発現すること示す。
図20. 浸潤性乾癬損傷のＴリンパ球でのＴ−BAMの発
現。乾癬損傷由来皮膚生検標本の免疫化学的な染色（a.
ローパワー）、（b.ハイパワー）−皮膚でのＴ細胞の浸
潤を示す。Ｔ−BAM発現は、mAb 5c8とジアミノベンジジ
ン（DAB）（褐色）により検出された。
図21. 非ホジキンリンパ腫細胞でのＴ−BAMの発現。Ｔ
−BAM+T細胞（褐色、DAB）を示す非ホジキンリンパ腫を
保持する患者２人のリンパ節に由来する免疫化学的な標
本を示す（a.630×およびb.400×）。
発明の詳細な説明 この発明は、ATCC受付番号HB 10916のハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体5c8によって特
異的に認識されるタンパク質と結合可能なモノクローナ
ル抗体を提供する。
この発明は、活性化Ｔ細胞の表面に位置するタンパク
質を特異的に認識し、かつこのタンパク質と複合体を形
成し、それによりＢ細胞のＴ細胞活性化を阻害するモノ
クローナル抗体を提供する。活性化Ｔ細胞は、通常、動
物のリンパ節の胚中心にのみ見出される。しかしなが
ら、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞腫瘍、例えば、Ｔ細胞白血
病およびリンパ腫に罹患した動物の末梢血または慢性間
接リウマチおよび乾癬のような疾患の浸潤組織に見出さ
れる。
ここに記載され、請求されるモノクローナル抗体は、
リンパ節の胚中心においてＢ細胞と相互作用するＴ細胞
に結合し、健常個体の他のＴ細胞には結合しない。Ｔ細
胞表面上のタンパク質を特異的に認識し、かつこのタン
パク質と結合して、それによりＢ細胞の活性化を阻害す
ることが当業者に知られているモノクローナル抗体、例
えば、抗CD28モノクローナル抗体および抗LFA−１モノ
クローナル抗体は、活性化Ｔ細胞を区別しない。
この発明の目的のためには、“活性化Ｔ細胞”は、休
止Ｂ細胞にＴ細胞ヘルパー機能を付与し得るＴ細胞であ
る。この発明の目的のためには、“リンパ節の胚中心”
は、Ｔ細胞がＢ細胞にＴ細胞ヘルパー機能を付与するリ
ンパ節の領域である。
この発明に目的のためには、“モノクローナル抗体”
は、ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体であ
る。モノクローナル抗体合成ハイブリドーマ細胞の作製
方法は当業者に公知であり、例えば、抗体産生Ｂリンパ
球と不死化Ｂリンパ球細胞株との融合による。
この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞で
ある。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ
細胞である。この発明の目的のためには、“休止"B細胞
は、非活性化Ｂ細胞、すなわち抗体分子を合成しない未
文化Ｂ細胞である。この発明の目的のためには、“感
作"B細胞は、抗原と接触し、それにより部分的に活性化
してはいるが、いまだ抗体分子を合成しないＢ細胞であ
る。
この発明の一態様においては、モノクローナル抗体は
ネズミモノクローナル抗体である。この発明の他の態様
においては、モノクローナル抗体はキメラモノクローナ
ル抗体である。この発明のさらに別の態様においては、
モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体であ
る。しかしながら、この発明の好ましい態様において
は、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であ
る。
この発明の目的のためには、“キメラ”モノクローナ
ル抗体は、異なる動物からの定常領域フラグメント
（Fc）を有するネズミモノクローナル抗体である。この
発明の好ましい態様においては、キメラモノクローナル
抗体はヒトFcおよびネズミFabを有する。この発明の目
的のためには、“ヒト化”モノクローナル抗体は、軽鎖
および重鎖両者のネズミ相補性決定領域（CDR）を除い
て全てのネズミタンパク質配列がヒトタンパク質配列に
置き換えられているネズミモノクローナル抗体である。
この発明の一態様においては、モノクローナル抗体
は、ATCC受付番号HB 10916のハイブリドーマによって産
生されるモノクローナル抗体5c8により特異的に認識さ
れるエピトープに向けられている。この発明のさらに別
の態様においては、モノクローナル抗体はモノクローナ
ル抗体5c8である。
この発明は、さらに、ATCC受付番号HB 10916のハイブ
リドーマによって産生されるモノクローナル抗体5c8に
より特異的に認識されるタンパク質に結合することがで
きるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
を提供する。この発明の目的のためには、“ハイブリド
ーマ細胞”は、不死化細胞と抗体産生細胞とを融合し、
それによりモノクローナル抗体を産生する細胞を形成す
ることにより作製された細胞である。一態様において
は、ハイブリドーマ細胞は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、
1991年11月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC）、12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,Maryland 20852,U.S.S.に寄託されたATCC受付番号HB
10916に一致した。
この発明の１つにおいて、モノクローナル抗体は検出
可能なマーカー、例えば放射性同位体、酵素、染料また
はビオチンで標識されている。この発明の他の態様にお
いては、モノクローナル抗体は治療剤、例えば放射性同
位体、トキシン、トキソイドまたは化学療法剤に結合し
ている。この発明のさらに別の態様においては、モノク
ローナル抗体は画像形成剤（imaging agent）、例えば
放射性同位体に結合している。
この発明は、このモノクローナル抗体と薬剤学的に許
容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。この発
明の目的のためには、“薬剤学的に許容し得る担体”は
標準的な医薬担体のいかなるものをも意味する。適切な
担体の例はこの分野において公知であり、標準的な医薬
担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、ポリソルブ（Poly
sorb）80を含有するリン酸緩衝生理食塩水、水、油／水
エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタイ
プの浸潤剤を含み得るが、これに限定されるものではな
い。
典型的には、このような担体は賦形剤、例えばスター
チ、ミルク、砂糖、特定のタイプのクレイ、ゼラチン、
ステアリン酸もしくはそれらの塩、ステアリン酸マグネ
シウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしく
は油、ゴム、グリコールまたは他の公知の賦形剤を含有
する。このような担体はフレーバーおよび着色添加物ま
たは他の成分を含有してもよい。このような担体を含有
する組成物は、よく知られた通常の方法により処方され
る。
このような担体はこの分野において公知であり、標準
的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、油／
水エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタ
イプ湿潤剤のいかなるものをも含み得るが、これらに限
定されるものではない。他の担体には、無菌溶液、錠
剤、コート錠、およびカプセルが含まれ得る。
ここに記述され、請求されるモノクローナル抗体は、
このモノクローナル抗体が結合するタンパク質の単離に
有用である。このモノクローナル抗体はまた、新規かつ
有用な；動物における免疫応答の阻害方法；自己免疫疾
患のような免疫不全またはライム病、梅毒、結核および
HIV感染のような自己免疫発現を伴う感染症により特徴
付けられる疾患における免疫応答の緩和方法；動物にお
ける腫瘍もしくは新生物の像形成方法；動物における腫
瘍もしくは新生物の存在を検出する方法；動物が腫瘍細
胞を宿しているかどうかを決定する方法であって、Ｔ細
胞ガンに罹患した動物におけるＴ細胞腫瘍細胞の増殖を
阻害することを含む方法；および動物Ｔ細胞のウイルス
感染を阻害する方法においても有益である。
この発明は、このモノクローナル抗体の軽鎖タンパク
質をコードする単離核酸分子を提供する。この発明の一
態様においては、この核酸分子はDNA分子である。好ま
しくは、このDNA分子はcDNA分子である。
この出願を通して、特定のヌクレオチドに対する言及
は核酸のコード鎖上に存在するヌクレオチドに対するも
のである。この明細書を通して、特定のヌクレオチドを
示すために、以下の標準的な略語が用いられる： Ｃ＝シトシン Ａ＝アデニン Ｔ＝チミジン Ｇ＝グアノシン この発明のDNA分子は、１以上のアミノ酸残基の同一
性および位置が天然の形態とは異なり（タンパク質につ
いて特定される全ての残基よりも少ない残基を有する欠
損アナログ、特定される残基の１以上が他の残基によっ
て置換されている置換アナログおよび１以上のアミノ酸
残基がポリペプチドの末端もしくは中間部に追加されて
いる付加アナログ）、かつ天然型の性質の幾つかもしく
は全てを共有する、抗原性ポリペプチドのポリペプチド
・アナログ、断片または誘導体をも含む。これらには、
選択された非哺乳動物ホストによる発現に好ましいコド
ンの組み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂
のための部位の提供；および容易に発現するベクターの
構築を容易にする、さらなる先頭、末端もしくは中間DN
A配列を提供することが含まれる。
ここに記述され、請求される核酸は、以下に記載する
新規ウイルスもしくは環状プラスミドベクターの産生に
有用である。この核酸分子はまた、遺伝子治療の新規か
つ有用な方法、すなわち動物から単離した細胞を核酸分
子で安定に形質転換し、次いで安定に形質転換した細胞
を動物に再投与することによる方法に有益でもある。細
胞を単離する方法には、動物から細胞を抜き取るいかな
る標準法もが含まれる。適切な単離細胞には骨髄細胞が
含まれるが、これに限定されるものではない。細胞の再
投与方法には、動物に細胞を再投与するといかなる標準
法もが含まれる。
この発明は、RNA転写のプロモーターに作働可能に連
結する、モノクローナル抗体の軽鎖タンパク質をコード
する核酸分子を含む遺伝子運搬ベクター、例えばプラス
ミドもしくはウイルスベクターを提供する。この発明は
また、RNA転写のプロモーターに作働可能に連結する、
モノクローナル抗体の重鎖タンパク質をコードする核酸
分子を含む遺伝子運搬ベクター、例えばプラスミドもし
くはウイルスベクターをも提供する。
ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクターは、
安定に形質転換された真核ホスト細胞の産生に有用であ
り、それ故にそのようなホスト細胞をタンパク質産生に
適した条件下で増殖させる新規かつ有用な方法において
有益な生成物としての価値を有する。
この発明は、ここに記載され、請求される遺伝子運搬
ベクターを適切なホスト細胞中に有するホストベクター
系を提供する。この発明の一態様においては、適切なホ
スト細胞は、安定に形質転換された真核細胞、例えば安
定に形質転換された酵母もしくは哺乳動物細胞である。
この発明の好ましい態様においては、安定に形質転換さ
れた真核細胞は、安定に形質転換された哺乳動物細胞で
ある。
ここに記載され、請求されるホストベクター系は、こ
のホストベクター系をモノクローナル抗体の産生に適し
た条件下で増殖させることを包含する、モノクノーナル
抗体の新規かつ有用な合成方法に有益である。
この発明は、Ｂ細胞に接触依存性ヘルパー機能を本質
的に付与することが可能な、D1.1と呼ばれるATCC受付番
号CRL 10915のCD4-ヒトＴ細胞白血病細胞株を提供す
る。このD1.1細胞は、特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、1991年
11月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ATCC）、12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryl
and 20852,U.S.S.に寄託された。この発明の一態様にお
いては、このＢ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他
の態様においては、このＢ細胞は感作Ｂ細胞である。
ここに記載され、請求される細胞株は、ATCC受付番号
10916のハイブリドーマによって産生されるモノクロー
ナル抗体5c8により特異的に認識される単離タンパク質
の源として有益である。この単離タンパク質は、それ自
身をコードするヌクレオチド配列に関する事項を提供す
る情報にとって有益である。この核酸配列は、ここに記
載され、請求される可溶性活性化Ｔ細胞表面タンパク質
の新規かつ有用な産生方法に有益である。この細胞株は
また、タンパク質抗原に対して動物を免疫する新規かつ
有用な方法、および医薬化合物をＢ細胞のＴ細胞活性化
を阻害するそれらの能力についてスクリーニングする新
規かつ有用な方法に有益である。
この発明は、ATCC受付番号HB 10916のハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体5c8により特異
的に認識される単離タンパク質を提供する。
この発明はさらに、ATCC受付番号10916のハイブリド
ーマによって産生されるモノクローナル抗体5c8により
特異的に認識される単離タンパク質を提供する。ここ
で、この単離タンパク質は、活性化Ｔ細胞の表面からの
ものであり、Ｂ細胞最終分化のＴ細胞誘発に必要なもの
である。この出願において、“最終分化”はその細胞の
特定のIg分泌が明らかにされていることを意味し、この
用語は当業者には公知である。
この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞で
ある。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ
細胞である。
この発明はまた、ATCC受付番号HB 10916のハイブリド
ーマによって産生されるモノクローナル抗体5c8により
特異的に認識され、Ｎ末端に配列Xaa−Ile−Glu−Xaa−
Tyr−Asn−Gln−Xaa−Ser−Pro−（配列番号11）を有す
る単離タンパク質を提供する。この出願においては、
“Xaa"はいかなるアミノ酸残基でもよい。
この発明は、Ｔ細胞表面タンパク質をコードする単離
核酸分子を提供する。この発明の一態様においては、核
酸分子はDNA分子である。好ましくは、このDNA分子はcD
NA分子である。この核酸分子は、以下に記載の新規ウイ
ルスまたは環状プラスミドベクターを生成するための生
成物として有益である。この核酸分子はまた、遺伝子治
療の新規かつ有用な方法、すなわち、動物から単離した
細胞をこの核酸分子で安定に形質転換し、次いで安定に
形質転換した細胞を動物に再投与することによる方法に
有益である。細胞の単離方法には、動物から細胞を取り
出すいかなる標準法もが含まれる。適切な単離細胞には
骨髄細胞が含まれるが、これに限定されるものではな
い。細胞の再投与方法には、動物に細胞を再投与するい
かなる標準法もが含まれる。
この発明はまた、活性化Ｔ細胞表面タンパク質をコー
ドする単離核酸分子を含む遺伝子運搬ベクター、例えば
プラスミドまたはウイルスベクターを提供する。
ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクターは、
安定に形質転換された真核ホスト細胞を産生し、それ故
にそのホスト細胞をタンパク質の産生に適した条件下で
増殖させる新規かつ有用な方法に有益な生成物として価
値がある。
この発明は、さらに、適切なホスト細胞中に遺伝子運
搬ベクターを含むホストベクター系を提供する。この発
明の一態様においては、この適切なホスト細胞は、細菌
細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である。
このホストベクター系は、このホストベクター系をタ
ンパク質の産生に適した条件下で増殖させることによる
活性化Ｔ細胞表面タンパク質の大規模合成に有用な生成
物として有益である。したがって、活性化Ｔ細胞表面タ
ンパク質の産生方法もまた提供される。この発明は、さ
らに、この方法により産生されたタンパク質を提供す
る。
この発明は、Ｂ細胞のＴ細胞活性化に必要な、活性化
Ｔ細胞の表面から単離された可溶性タンパク質を提供す
る。この発明の一態様においては、このＢ細胞は休止Ｂ
細胞である。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は
感作Ｂ細胞である。
この発明の目的のためには、“可溶性タンパク質”
は、細胞膜および他の細胞成分を含有しないタンパク質
である。好ましくは、この可溶性タンパク質は、ATCC受
付番号HB 10916のハイブリドーマによって産生されるモ
ノクローナル抗体抗体5c8により特異的に認識されるタ
ンパク質である。この発明の一態様においては、この可
溶性タンパク質は検出可能なマーカー、例えば、放射性
同位体、酵素、染料またはビオチンで標識されている。
この可溶性タンパク質は、新規かつ有用な医薬組成物を
作製するための生成物として有益である。
したがって、この可溶性タンパク質および薬剤学的に
許容し得る担体を含有する医薬組成物もまた提供され
る。“薬剤学的に許容し得る担体”は標準的な薬剤学的
に許容し得る担体のいかなるものをも意味する。例とし
て、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水および油／
水エマルジョンのようなエマルジョンを挙げることがで
きるが、これらに限定されるものではない。
この発明は、この可溶性タンパク質をコードする単離
核酸分子を提供する。この発明の一態様においては、核
酸分枝はDNA分子である。好ましくは、このDNA分子はcD
NA分子である。
ここに記載され、請求される核酸配列は、以下に記載
される新規ウイルスおよび環状プラスミドベクターの産
生に有用である。この核酸分子はまた、遺伝子治療の新
規かつ有用な方法、すなわち、動物から単離した細胞を
この核酸分子で安定に形質転換し、次いで安定に形質転
換された細胞を動物に再投与することによる方法に有益
である。細胞を単離する方法には、動物から細胞を取り
出す標準法のいかなるものも含まれる。適切な単離細胞
には骨髄細胞が含まれるが、これに限定されるものでは
ない。細胞の再投与方法には、動物に細胞を再投与する
標準法のいかなるものも含まれる。
この発明はまた、RNA転写プロモーターに作働可能に
連結した単離核酸分子を有する遺伝子運搬ベクター、例
えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターをも提
供する。ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクタ
ーは、安定に形質転換された真核ホスト細胞を生成し、
それ故にそのようなホスト細胞をタンパク質産生に適し
た条件下で増殖させる新規かつ有用な方法に有益な生成
物として価値がある。
この発明は、さらに、適切なホスト細胞中にこの遺伝
子運搬ベクターを有するホストベクター系を提供する。
この発明の一態様においては、適切なホスト細胞は安定
に形質転化された真核細胞、例えば、安定に形質転換さ
れた真核酵母もしくは哺乳動物細胞である。好ましく
は、安定に形質転換された細胞は、哺乳動物細胞であ
る。
このホストベクター系は、このホストベクター系をタ
ンパク質の産生に適した条件下で増殖させ、産生された
タンパク質を回収することによる、可溶性活性Ｔ細胞表
面タンパク質の大規模合成に有用な生成物として有益で
ある。したがって、この可溶性タンパク質の産生方法も
また提供される。この発明は、さらに、この方法により
産生された可溶性タンパク質を提供する。
この発明は、活性Ｔ細胞表面タンパク質を特異的に認
識するモノクローナル抗体および薬剤学的に許容し得る
担体を含有する医薬組成物の有効阻害量を動物に投与す
ることを具備する、動物においてＢ細胞活性化を阻害す
る方法を提供する。この発明の目的のためには、医薬組
成物の“有効阻害量”は、活性Ｔ細胞表面上のタンパク
質に結合し、それによりＢ細胞のＴ細胞活性化を阻害す
るに有効な医薬組成物の量である。この有効阻害量は、
この分野において公知の実験を用いて、当業者が容易に
決定することができる。そのような実験的アプローチの
１つはタイトレーションによるものである。この発明の
一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞である。この発
明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ細胞である。
“有効阻害量”を決定する方法は当業者には公知であ
り、関連する動物のタイプおよび動物の体重（これらに
限られるものではないが）を含む因子に依存するであろ
う。この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例
えばマウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物は
ヒトである。
この発明の目的のためには、“投与”は当業者に公知
の医薬組成物の標準投与方法のいかなるものをも意味す
る。例として、静脈内、腹腔内または筋肉内投与を挙げ
ることができるが、これらに限定されるものではない。
Ｂ細胞活性化を阻害する方法は、動物の免疫応答を阻
害する新規かつ有用な方法に有益である。この発明の一
態様においては、動物は哺乳動物、例えば、マウスまた
はヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
この発明の一態様においては、動物の免疫応答の阻害
は、動物による移植臓器、例えば、心臓、腎臓または肝
臓の拒絶を阻害する方法として有益である。
この発明の他の態様においては、動物の免疫応答の阻
害は、突発性自己免疫疾患に罹患している動物における
自己免疫応答を阻害する方法として有益である。突発性
自己免疫疾患の例には、乾癬、慢性関節リューマチ、重
症筋無力症、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、
突発性血小板減少紫斑病、溶血性貧血、IgE増加症候群
（hyper IgE syndrome）、真性糖尿病および薬物誘発自
己免疫疾患、例えば薬物誘発ループスが含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。
他の態様においては、この発明は、感染症の自己免疫
発現に罹患しているヒトにおける自己免疫応答を阻害す
る方法を提供する。自己免疫発現は、ライター症候群、
脊椎関節炎（spondyloarthritis）、ライム病、HIV感
染、梅毒または結核に由来することがある。
この発明のさらに別の態様においては、動物における
免疫応答の阻害は、動物におけるアレルギー応答、例え
ば、枯草熱またはペニシリンに対するアレルギーを阻害
する方法として有益である。
この発明は、ATCC受付番号10916のハイブリドーマに
よって産生されるモノクローナル抗体5c8により特異的
に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生
物細胞の像を形成する方法であって、（ｉ）抗体が像形
成剤と結合している、モノクローナル抗体5c8の医薬組
成物の有効量を、モノクローナル抗体とタンパク質との
複合体の形成を許容する条件下で患者に投与し、かつ
（ii）形成されるモノクローナル抗体／タンパク質複合
体の像を形成し、それにより患者における腫瘍細胞また
は新生物細胞の像を形成することを具備する方法を提供
する。
このような腫瘍細胞または新生物細胞は、Ｔ細胞腫
瘍、例えば、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫由来であって
もよい。好ましくは、患者はヒト患者である。
“投与”は、当業者に公知の医薬組成物投与の標準法
のいかなるものをも意味する。例として、筋肉内または
腹腔内投与を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。モノクローナル抗体／タンパク質複合
体の形成を検出する方法、例えばＸ線フィルムの露光に
よる方法は、当業者には公知である。
医薬組成物の“有効像形成量”は、複合体の像を形成
し得るように、モノクローナル抗体と細胞表面タンパク
質との複合体を形成するに有効な量である。“有効像形
成量”を決定する方法は当業者に公知であり、関係する
動物のタイプ、動物の大きさおよび用いられる像形成剤
を含む（これらに限られるものではない）要素に依存す
る。そして、正確な有効像形成量は、当業者に公知の、
タイタレーションのような実際の実験により決定するこ
とができる。この発明の一態様においては、像形成剤は
放射性同位体である。
この発明は、動物において、ATCC受付番号10916のハ
イブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5c
8により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍
細胞または新生物細胞の存在を検出する方法であって、
検出し得るマーカーに結合したモノクローナル抗体を含
有する医薬組成物の、腫瘍細胞または新生物細胞の表面
上のタンパク質に結合するに有効な量を、モノクローナ
ル抗体とタンパク質との複合体の形成を許容する条件下
で動物に投与し；未結合の像形成剤を動物から除去し；
および形成されるモノクローナル抗体／タンパク質複合
体の存在を検出することを具備する方法を提供する。複
合体の存在は、動物における腫瘍細胞または新生物細胞
の存在を示す。この腫瘍細胞は、Ｔ細胞白血病またはリ
ンパ腫由来であってもよい。好ましい態様においては、
この腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。この発明の一態
様においては、動物は哺乳動物、例えば、マウスまたは
ヒトである。好ましくは、動物はヒトである。
“投与”は、当業者に公知の、医薬組成物のあらゆる
標準投与方法を意味する。例として、静脈内、筋肉内ま
たは腹腔内投与を挙げることができるが、これらに限定
されるものではない。例えばＸ線フィルムの露光または
顕微鏡下での試験により、モノクローナル抗体／タンパ
ク質複合体の形成を検出する方法は当業者に公知であ
る。
医薬組成物の“有効量”は、動物において腫瘍細胞ま
たは新生物細胞の存在を検出するに有効な医薬組成物の
量である。“有効量”を決定する方法は当業者に公知で
あり、関連する動物のタイプ、接触する血液試料のサイ
ズおよび用いる検出可能なマーカーを含む（これらに限
られるものではない）多くの要素に依存する。この発明
の一態様において、検出可能なマーカーは、放射性同位
体、酵素、染料またはビオチンである。
この発明は、ATCC受付番号10916のハイブリドーマに
よって産生されるモノクローナル抗体5c8により特異的
に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生
物細胞を動物が有しているかどうかを決定する方法であ
って、動物から血液試料を単離し；この試料を、可溶性
タンパク質に結合するに有効な量の、検出可能なマーカ
ーで標識されたモノクローナル抗体を含有する医薬組成
物と、モノクローナル抗体とタンパク質との複合体の形
成を許容する条件下で接触させ；および形成されるモノ
クローナル抗体／タンパク質複合体の存在を検出する
（このような複合体の存在は、患者における腫瘍細胞ま
たは新生物細胞の存在を示す）ことを具備する方法を提
供する。
一態様において、腫瘍細胞はＴ細胞腫瘍、例えば、Ｔ
細胞白血病またはリンパ腫に由来する。好ましい態様に
おいて、Ｔ細胞リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。
この発明によって提供される方法は、腫瘍細胞それ自
身の存在が検出され得る前に、動物の血液中のＴ細胞腫
瘍細胞の存在を検出する新規かつ有用な方法として有益
である。この発明によって提供される方法はまた、抗Ｔ
細胞腫瘍剤を用いる動物の治療の有効性を決定する新規
かつ有用な方法、すなわち、動物の血液中の可溶性タン
パク質のレベル（そのようなレベルは治療の有効性を示
す）を決定することによる方法として有益である。
Ｔ細胞腫瘍に罹患している患者の血液がＴ細胞腫瘍細
胞表面から脱落した可溶性タンパク質、例えばtac抗
原、を含むことは当業者には公知である。したがって、
動物の血液中における可溶性Ｔ細胞表面タンパク質の存
在は、動物におけるＴ細胞腫瘍の存在を示している。
この発明の目的のためには、“可溶性タンパク質”
は、細胞膜および他の細胞成分を含有しないタンパク質
である。この発明の好ましい態様においては、可溶性タ
ンパク質は、ATCC受付番号HB 10916のハイブリドーマに
よって産生されるモノクローナル抗体5c8により特異的
に認識されるタンパク質である。
動物からの血液の“単離”は、血液を抜き取り、この
血液を、抗凝集剤、例えばヘパリン、EDTAまたはクエン
酸塩を入れた容器に直ちに収容する、一般的に許容し得
るあらゆる方法を意味する。モノクローナル抗体／タン
パク質複合体の検出方法は当業者には公知である。例と
してＸ線フィルムの露光およびELISAを挙げることがで
きるが、これらに限定されるものではない。
医薬組成物の“有効量”は、動物の血液中において可
溶性タンパク質の存在を検出するに有効な医薬組成物の
量である。“有効量”を決定する方法は当業者には公知
であり、関連する動物のタイプ、接触する血液試料のサ
イズおよび用いられる検出可能なマーカーを含む（これ
らに限られるものではない）多くの要素に依存する。
この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例え
ばマウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒ
トである。
この発明は、腫瘍または新生物、例えば、Ｔ細胞白血
病またはリンパ腫に罹患している動物において、ATCC受
付番号HB 10916のハイブリドーマによって産生されるモ
ノクローナル抗体5c8により特異的に認識されるタンパ
ク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞の増殖を阻害
する方法であって、ATCC受付番号HB 10916のハイブリド
ーマによって産生されるモノクローナル抗体5c8により
特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞また
は新生物細胞の増殖を阻害するに有効な量の、治療剤と
結合した、もしくは結合していないモノクローナル抗体
を含有する医薬組成物を患者に投与することを具備する
方法を提供する。この発明の一態様においては、動物は
哺乳動物、例えばマウスまたはヒトである。好ましく
は、哺乳動物はヒトである。
“投与”は、医薬組成物を投与する、当業者に公知の
あらゆる標準法を意味する。例として、筋肉内または腹
腔内投与を挙げることができるが、これらに限定される
ものではない。
医薬組成物の“有効量”は、ATCC受付番号HB 10916の
ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体
5c8により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫
瘍細胞または新生物細胞の増殖を阻害するに有効な医薬
組成物の量である。“有効量”を決定する方法は当業者
には公知であり、関連する動物のタイプ、動物の大きさ
および用いられる治療剤を含む（これらに限られるもの
でない）要素に依存する。この発明の一態様において
は、治療剤は放射性同位体、毒素、トキソイドまたは化
学療法剤である。
この発明は、HTLV Ｉウイルスによる動物Ｔ細胞のウ
イルス感染を阻害する方法であって、HTLV Ｉウイルス
によるＴ細胞の感染を阻害するに有効な量の、活性Ｔ細
胞表面のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル
抗体を含有する医薬組成物を動物に投与することを具備
する方法を提供する。この発明の一態様においては、動
物は哺乳動物、例えば、マウスまたはヒトである。好ま
しくは哺乳動物はヒトである。
HTLV Ｉウイルスが結合する細胞性タンパク質がCD4
タンパクであることは当業者には公知である。このよう
に、HTLV Ｉウイルスは、CD8+ではなくCD4+T細胞に優
先的に感染する。この発明は、モノクローナル抗体5c8
が結合し、またCD4+T細胞に特異的なタンパク質を提供
する。
この発明は、医薬化合物、例えば、シクロスポリン、
シクロホスファミドまたはアゾチオプリンを、そのＴ細
胞ヘルパー機能を阻害する能力についてスクリーニング
する方法であって：動物から血液試料を単離し；この試
料を、そこに含まれるＢ細胞の活性化を許容する条件下
で培養し；試料を、Ｂ細胞を活性化するに有効な量のD
1.1細胞株またはATCC受付番号HB 10916のハイブリドー
マによって産生されるモノクローナル抗体5c8により特
異的に認識される単離タンパク質を発現する細胞と接触
させ；医薬化合物がＴ細胞活性化を阻害することが可能
であるならば、Ｂ細胞の最終分化のＴ細胞誘発を阻害す
るに有効な量の医薬化合物と試料を接触させ；および医
薬化合物の存在下において、Ｔ細胞株がＢ細胞を活性化
するかどうかを決定することを具備する方法を提供す
る。
この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞で
ある。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ
細胞である。
この発明の一態様においては、血液は哺乳動物、例え
ば、マウスまたはヒトから単離される。
動物からの血液の“単離”は、血液を抜き取り、この
血液を、抗凝集剤、例えば、ヘパリン、EDTAまたはクエ
ン酸塩を入れた容器に直ちに収容する、一般に許容可能
なあらゆる方法を意味する。“Ｂ細胞の活性化を許容す
る条件下”でのＢ細胞の培養には、リンホカイン類の存
在下でのＢ細胞の培養が含まれる。D1.1細胞株“の有効
活性化量”は、培養物中におけるこの細胞の、培養物中
のＢ細胞を活性化するに有効な濃度である。“有効活性
化量”を決定する方法は、当業者に公知である。
タンパク質抗原に対して動物を免疫する方法であっ
て：動物から休止Ｂリンパ球を含有する血液試料を単離
し；この試料から休止Ｂ細胞を回収し；この休止Ｂ細胞
を、Ｂ細胞を刺激して分化させる量の細胞株D1.1または
ATCC受付番号HB 10916のハィブリドーマによって産生さ
れるモノクローナル抗体5c8により特異的に認識される
単離タンパク質を発現する細胞と共に、Ｂ細胞の分化を
許容する条件下で共培養（coculturing）し；この分化
Ｂ細胞を、分化Ｂ細胞にタンパク質抗原を認識する抗体
を産生させるに有効な量のタンパク質抗原と接触させ；
およびこの抗体産生Ｂリンパ球を、血液試料を単離した
動物に投与することを具備する方法。
この発明の目的のためには、“休止Ｂ細胞”は、未分
化の非抗体合成Ｂ細胞または記憶Ｂ細胞のいずれかであ
る。
動物からの血液の“分離”は、血液を抜き取り、この
血液を、抗凝集剤、例えば、ヘパリン、EDTAまたはクエ
ン酸塩を入れた容器に直ちに収容する、一般に許容可能
なあらゆる方法を意味する。“Ｂ細胞の活性化を許容す
る条件下”でのＢ細胞の培養には、リンホカイン類の存
在下でのＢ細胞の培養が含まれる。Ｂリンパ球を動物に
投与する方法には、細胞を動物に投与する、一般に許容
可能なあらゆる方法が含まれる。
D1.1細胞株または可溶性活性Ｔ細胞表面タンパク質の
“有効量”は、細胞株または可溶性タンパク質の、Ｂ細
胞の分化を誘発するに有効な量である。“有効量”を決
定する方法は当業者には公知である。
タンパク質抗原の“有効分化量”は、抗原の、分化Ｂ
細胞に抗原を特異的に認識する抗体を産生させるに有効
な量である。
この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例え
ば、マウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物は
ヒトである。
この発明の一態様においては、抗原はウイルス性タン
パク質抗原、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質抗
原、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタンパク質抗原またはヒ
ト免疫不全症ウイルスタンパク質抗原である。この発明
の他の態様においては、抗原は自己抗原または腫瘍抗原
である。当業者に公知のRo、La、RNPおよびリューマチ
様因子（IgG）は、そのような自己抗原の例である。
この発明は、さらに、抗体産生細胞のイソタイプの切
替えを誘発する方法であって、（ｉ）抗体産生細胞を、
Ｂ細胞の分化を許容する条件下で、イソタイプの切替え
を誘発するに有効な量の細胞株D1.1またはATCC受付番号
HB 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクロ
ーナル抗体5c8により特異的に認識される単離タンパク
質を発現する細胞と接触させ；および（ii）抗体産生細
胞のイソタイプを検出することを具備する方法を提供す
る。一態様においては、抗体産生細胞はハイブリドーマ
細胞である。他の態様においては、抗体産生細胞はEBV
形質転換細胞株である。
この発明はまた、抗体産生細胞によって産生される抗
体の親和性を増大する方法であって、抗体産生細胞を、
細胞の接触を許容する条件下で、有効量の細胞株D1.1あ
るいはATCC受付番号HB 10916のハイブリドーマによって
産生されるモノクローナル抗体5c8により特異的に認識
される単離タンパク質を発現する細胞と接触させ；およ
び抗体産生細胞によって産生される抗体の結合親和性を
決定することを具備する方法を提供する。
この発明は、低ガンマグロブリン血症に罹患した患者
を治療する方法であって、低ガンマグロブリン血症につ
いて患者を治療するに有効な量の可溶性活性Ｔ細胞表面
タンパク質を患者に投与することを具備する方法を提供
する。“有効量”を決定する方法は当業者に公知であ
る。タイトレーションによる方法は、そのような方法の
一例である。
この発明は、以下の実験の詳細を参照することにより
さらに理解されるであろう。しかしながら、詳細に述べ
られる特定の実験は単に説明に過ぎず、ここに記載さ
れ、その後に続く請求の範囲によって定義されるこの発
明を限定することを意味するものではないことは、当業
者には容易に理解されるであろう。
実験の第一シリーズ 材料および方法 5C8モノクローナル抗体の産生および特徴 ５匹のBalb/
cマウスは、生理食塩水で2x106のD1.1細胞で静脈内免疫
感作し、次ぎに腹腔内で約２週間間隔での５回のブース
トがなされた。これらのマウスの血清は、B2.7細胞に対
してジャーカットD1.1に優先的に結合する抗体が存在す
るかどうかについてテストするために、FACSによって滴
定された。最も差異のある滴定を示した一匹のマウス
は、融合する三日前に、静脈下、2x106のD1.1細胞のブ
ーストを受けた。該マウス由来の脾臓細胞は、前記記載
（Kirchevsky et al.,1988）のように、7x107のマウスS
P2/0骨髄融合パートナー細胞と融合させた。融合産生物
を８−mmの360ウエルに播種する前に、細胞混合物は、1
5％ FCSを含むDulbecco′s Modified Eagle′ｓ培地
（DMEM）中で一晩培養された。220ウエルに出現したコ
ロニーおよびすべてについて、D1.1およびB2.7細胞を識
別して結合するかどうかを、FACSによってスクリーニン
グした。5c8と名付けられたmAbがD1.1細胞と結合し、B
2.7細胞には結合しないことがわかった。5c8クローン
は、モノクローナル性が達成されるまで何回もサブクロ
ーンされた。5c8 mAbは、エリサ法（Hyclone,Logan,U
T）でIgG2aであることがわかった。
モノクローナル抗体：下記のmAbs:OKT 11（抗−CD2）,O
KT 10（抗−38）,OKT 8（anti−CD8）,OKT 6（抗−CD1
a）,OKT 4（anti−CD4）,OKT 3（抗−CD3）,OKT 1（抗
−CD5）,3A1（抗−CD7）,tac（抗−CD25）,T−HB5（抗
−CD21,CR2）,W6/32（抗−MHC class I）,AB2.06（抗−
MHCclass II）,L243（抗−MHC class II）,93F10（抗−
MHC class II）,TS1/22.1.13（抗−LFA−1a）,TS1/18.
1.2.11.4（抗−LFA−１β）,TS2/9.1.4.3（抗−LFA−
３），および187.1（抗−human Ig（Fab））は、Americ
an Type Culture Collection（Rockville,MD）から入手
可能なハイブリドーマによって製造された。これらのmA
bは、飽和濃度のハイブリドーマ上澄液で使用される
か、またはタンパクＡカラム（Biorad,Rockville Cente
r,NY）で腹腔液から精製されるかのいづれかであった。
抗−ジャーカットTCR Clonotypic mAb（抗−ｖβ８）mA
b 16G8および抗−TCR mAbのような他のパネルは、Diver
si−T,T cell Science（Cambridge,MA）から購入した。
mAb OKT4Aは、Ortho Pharmaceutical（Raritan,NJ）か
ら購入し、TCRδ−１はDr.Michael Brenner,ハーバード
医学学校（Boston,MA）からの贈呈された。M241（anti
−CD1c）はDr.Cox Terhorst ofハーバード医科大学から
の贈呈であった。FITC標識抗−CD23−PE mAbおよび無標
識の抗−CD69は、Becton Dickinson（Mountainview,C
A）より購入した。FITC標識抗IgMはTago（Burlingame,C
A）より購入した。Kolt−４（抗−CD28）、および抗−C
D27はAccurate Scientific（Westbury,NY）から購入し
た。
組換蛋白rIL−４はGenzyme（Cambridge,MA）より購入し
た。rIL−２はHoffmann−LaRoche（Nutley,N.J.）の贈
呈であった。
細胞フルオログラフィー分析 約105細胞を、表示のmAb
sの飽和濃度により、45分間４℃で、80μg/mlの熱凝集
したヒトIgG（International Enzyme,Fallbrook,CA）の
存在下でインキュベートした。細胞は、洗浄されて未結
合のmAbを除去した後、蛍光体（Cappel,Cochranville,P
A）と結合されたヤギ抗−マウスIg二次抗体でインキュ
ベーションされた。
二色分析のため、細胞を表示のように直接連結された
FITCまたはmAbに接合し、45分４℃で、凝集ヒトIgG存在
下で、フィコエリスリン（PE）と反応させた。分析に先
立ち、細胞を洗浄し、PBS中に再懸濁した。蛍光強度
は、consort−30ソフトウエアー（Becton−Dickinson,M
ountainview,CA）付きFACSCAN細胞フルオグラフィーで
測定した。Ｂ細胞とジャーカットクローンとの共培養に
関する実験では、弱い前方および側方の光分散によって
異種細胞集団をゲーチングすることによって、ジャーカ
ット細胞をＢ細胞蛍光分析から除外した。PMAおよびPHA
活性化細胞による実験においては、死細胞は、ヨウ化プ
ロピリデイウムおよび電子FACSゲーテイングによる処理
によって分析から除外された。
細胞系 下記の細胞系:HPB−ALL,Jurkat,CEM,PEER,MOLT
−IV,K562,Ramos,Raji,およびU937は、American Type C
ulture Collection（Rockville,MD）から入手できる。B
Aは以前報告されている（Bank,et al.,1986）ようにEps
tein Barrウイルスで形質転換されたＢ細胞系である。H
9は、HIV Repository（Rockville,MD）から入手でき
る。HLAの分類は、コロンビア大学（One Lambda,Los An
geles,CA）の病理課Dr.Elaine Reedによって行われた。
ジャーカットD1.1およびB2.7は、Mycotectキット（GIBC
O,Grand Island,NY）およびDNAハイブリデイゼーション
法（Genprobe,La Jolla,CA）ではマイコプラズマに対し
て陰性であった。
細胞集団の単離 末梢血液リンパ球は、健康な志願者よ
り取り出された新鮮な血液を、Ficoll−Hypaque（Sigm
a,St.Louis,MO）またはLeukoprep（Becton−Dickson）
で遠心分離することで得られた。Ｔ細胞は、ノイラミニ
ダーゼ処理されたヒツジ赤血球によって実質的に選別さ
れた。CD4+CD8-およびCD4-CD8+細胞のサブセットが、そ
れぞれ抗CD8または抗CD4mAb処理によって単離された
後、以前（Rogozinksi,et al.,1984）に記載されている
ように、補体の仲介によって溶菌された。Ｂ細胞は、ノ
イラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球によるロゼット形成を
二回行った後、Ficoll−Hypaque遠心分離ではペレット
化されなかった細胞集団から得られた。
Ｂ細胞は、更に密度遠心分離あるいは抗Igカラムでの
ポシテイブ選別によって精製された。最初の方法では、
消耗したマクロファージを固定させるため、Ｅ−細胞を
ポリスチレンフラスコ（37℃、５％CO2）中で一晩培養
した。これらの非Ｔ細胞および非マクロファージ細胞が
不連続の30％/50％/100％のパーコール勾配中で、2300r
pm、12分の遠心分離で、高および低密度の分画に分画さ
れた。高密度細胞が50/100％の界面から、低密度細胞が
30/50％の界面から得られた（Crow,et al.,1985）。高
密度（静止）細胞は、主に60−80％CD20+,55−80％Ig
M+、および＜５％CD3+および＜５％CD23+（バックグラ
ウンド）であった。（表示されている）他の実験では、
Ｂ細胞が、記載（Rogozinksi et al.,1984;Friedman,et
al.,1976）されているように、Sephadex G−200抗Ｆ
（ab）2Ig親和性クロマトグラフィで精製された。FACS
で分析すると、sIg+細胞集団は、主に＜５％CD3+、＜10
CD2+、および＞90％CD20+であった。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 ジャーカットク
ローンは、ラクトペルオキシダーゼ法でヨウ素化し、１
％のNP40,ヨードアセトアミドを含む25mMトリスで緩衝
化されたPBSおよび10μmPMSF中に溶解された。細胞溶解
物を、mAb187.1（抗ヒトＦ（ab）Ig）と約10μｇの表示
mAbで被覆された蛋白Ａ−4Bセファロースビーズ（Pharm
acia,Uppsula,Sweden）と反応させた。ビーズを洗浄し
て非特異的に結合した蛋白を除去後、沈殿した蛋白をSD
S中で２−ME存在下または無存在下で、熱変性させた。
変性蛋白および予め染色してある分子量マーカー（Bior
ad,Rockville Center,NY）を、12cmのゲル中で12％ポリ
アクリルアミドを通して電気泳動にかけ、乾燥ゲルを使
用してＸ線フィルム（Kodak,Rochester,NY）を感光させ
た。
マイトマインシンＣおよびパラフォルムアルデヒド処理
ジャーカット細胞（107）を、50μg/mlのマイトマイ
シン−Ｃ（Sigma,St.Louis,MO）で、60分37℃で処理し
た。マイトマイシン処理されたジャーカット細胞を二回
洗浄し、無マイトマイシン培地に再懸濁してから、45−
60分37℃で培養した。該細胞を更に二回洗浄してからＢ
細胞培養中に添加した。固定化実験では、Ｔ細胞を新た
に作成した0.5％のパラフォルムアルデヒドで５−10分
処理し、0.2MのＬ−リジンで抑制し、５回洗浄しＢ細胞
培養中に添加した。
Ｔ細胞活性化 5c8 Agの発現を研究する実験では、静
止Ｔ細胞を、10μg/mlのホルボールミリステートアセテ
ート（PMA）（Sigma,St.Louis,MO）および10μg/mlのPH
A（Sigma）の存在下または無存在下で培養した。5c8 A
g発現の代謝要求を研究する実験では、Ｔ細胞が100μｍ
シクロヘキサアミド（Sigma）または10μg/mlのアクチ
ノマイシンＤ（Sigma）の存在下で活性化された。
活性化したＴ細胞によって高密度のＢ細胞でのCD23の
発現の誘発を研究する実験では、10μg/mlのmAbをPBS中
で１時間培養することで、mAbsOKT3またはOKT4を24ウエ
ル培養プレートの表面に固定化した。対照のウエルは、
mAbを含まないPBS中で培養した。未結合mAbを洗浄した
後、10ng/mlのホルボールジブチレート（PDB）（Sigm
a）の存在下、６時間で2x106細胞／ウエルでプレートが
被覆された。細胞を激しいピペット操作で除去し、洗浄
し、培養前に、細胞と2x105の高密度で、パーコールで
単離された静止Ｂ細胞との割合を1:1にして、0.5％のパ
ラフォルムアルデヒドで上記記載通りに固定化した。Ｂ
細胞CD23の発現が上記記載のように２色FACSで測定され
た。
Ｂ細胞活性化および分化 Ｂ細胞表面CD23の発現誘発を
測定する実験では、2x105高密度細胞を、200μｌのIsoc
ove′s Modified Dulbecco培地（IMDM）10％ FCS丸底
マイクロタイターウエル（Nunc）中の表示数のジャーカ
ット細胞またはＴ細胞に添加し、18−24時間たってCD23
の発現について分析した。ミリポア（Bedford,MA）から
の45μｍ培養プレート挿入物によって1x106細胞から分
離された1x106のＢ細胞の存在下または無存在下で、1x1
06ジャーカット細胞による二つのチェンバー実験が行な
われた。
Ｂ細胞増殖は、平底マイクロタイターウエル（NUNC）
中で、PHA（５μg/ml）の存在下または無存在下で、105
B細胞と、マイトマイシン−Ｃ−で処理した同数のE+細
胞またはジャーカットクローンと共に培養することによ
って測定された。培養物は、60時間後に、１μCI（H3）
チミン（New England Nuclear,Boston,MA）でパルス標
識され、16時間後にグラスファイバーフィルターペーパ
ー（Cambridge Technology Watertown,MA）上で採取さ
れた。ベータシンチレーションcpmをベータ計測器（LKB
Rackbeta counter、1209型）で測定した。
プラーク形成体（PFC）は、イエルネ溶血プラーク分
析の改変法で測定された（Rogozinski,et al.,1984）。
つまり、2.5x105B細胞をマイトシンＣ処理された様々な
数のジャーカット細胞と共に培養するか、または未処理
の新たに単離された自己に由来するＴ細胞と共に、６日
間1:400の希釈率のPWM（Gibco,Grand Island,NY）の存
在下あるいは無存在下で培養した。細胞を二回洗浄し、
ハンクス平衡塩類溶液中に再懸濁した。適宜希釈から、
培養された細胞懸濁液の50μｌを、塩化第二クロムによ
ってラビット抗ヒトIgで被覆されたSRBCの11％溶液10μ
ｌ、希釈されたラビット抗ヒトIg10μｌ、およびギアナ
ピッグ補体10μｌと混合した。これらの混合物を二つ対
になったガラス室に入れ、２時間37℃で培養した。プラ
ークを解剖用顕微鏡を使用して計測し、プラーク形成コ
ロニー（PFC）106B細胞として表示した。
Igアイソトープ定量のためのエリサ法が、炭酸緩衝液、
pH9.6中で、ポリスチレン96ウエル（immunion II,Dynat
ech Laboratories,Chantilly,VA9）を、ヤギ抗ヒトIgA,
IgG,またはIgM（Tago,Burligname,CA）の希釈物で、18
時間４℃で被覆することで行なわれた。そのプレートを
PBS中0.05％トウイーンで洗浄し、１％のBSA−PBSで２
時間のインキュベーションすることで非特異的部位を封
鎖した。洗浄後、50μｌの細胞培養上澄液またはIgアイ
ソトープ標準液（Rockland,Gilbertsville,PA）を該ウ
エルに添加し、２時間結合させた。次ぎに、結合したヒ
トIgを検出するために、アルカリフォスファターゼ（Ta
go）と結合したヤギ抗ヒトIgを添加した。２時間後、ウ
エルを洗浄し、ｐ−ニトロフェニル フォスフェートを
添加した。Molecular Devices VMAX器（Palo Alto,CA）
で405nmにおける吸光度を測定した。サンプルは３回分
析した。エラーバーは曲線当てはめ法および内挿法（De
lta−Soft,BioMetallics,Inc.Princeton,NJ）から計算
された標準偏差を示す。
Ｔ細胞の作用におけるCD4の役割 Ｔ細胞の作用におけるCD4の役割を研究するために、C
D4-ジャーカットクローン（D1.1）をCD4-のサブ細胞集
団自然発生させた培養液から単離し、FACS分析でのマイ
ナスピークで確認した。CD4の表面発現が見られなかっ
たことは、ジャーカットD1.1細胞表面の表現型が、多く
のmAb類の結合についてのCD4+クローン、すなわちジャ
ーカットB2.7（図１、および表１）と同様であった事
が、比較的特異的であった。CD4の異なる発現は、これ
らのサブクローン間での定量的差異に過ぎないけれど
も、研究された他の分子構造はのうち幾つかは、定量的
に異なるレベルで発現された。例えばジャーカットD1.1
は、ジャーカットB2.7よりもCD2およびMHCクラス（HL
A）の分子を多く発現した。しかしながら、ジャーカッ
トD1.1はジャーカットB2.7よりもCD28分子、およびTCR
−α／β（Ｖβ８）/CD3複合体の発現が少なかった（図
１、および表１）。これらのclonotypic抗−TCR mAbと
の反応性が共通しているのに加えて、ジャーカットD1.1
およびB2.7はHLAと同一（A3,34、２、16）であり、無関
連Ｔ細胞白血病系、HPB−ALL（A9）とははっきり相違し
ていた。これらのデータをまとめると、ジャーカットD
1.1はジャーカットのCD4-サブクローンであり、CD4分子
がないことは表面表現型における比較的特異的な変化で
あることが実証された。
作用性研究では、CD4+（B2.7）および（D1.1）ジャー
カット細胞が静止Ｂ細胞を誘発してCD23を発現させる能
力、Ｂ細胞活性化のマーカーを比較した（Crow,et al.,
1986;Jover,et al.,1989;Crow,et al.,1989）。驚いた
ことに、Ｂ細胞と、CD4+ジャーカット細胞（B2.7）では
なくCD4-ジャーカット（D1.1）と共培養すると、CD23の
発現が、60％を越えるＢ細胞で誘導された。（図２）。
ジャーカットD1.1によるＢ細胞表面のCD23発現の誘導
は、D1.1とＢ細胞との比率が1:1では、20−24時間で最
大となった（図３）。反対に、B2.7ジャーカットサブク
ローンは、高比率のＢ細胞、または長期間共培養（最高
48時間、表示せず）したＢ細胞を活性化しなかった（図
３）。更に、ジャーカットD1.1は他のＴ細胞（H9,HPB−
ALL,MOLT−IV,CEM）および非Ｔ細胞（U937）白血病系
（表示せず）と比較すると、該能力に特異性をもってい
た。ジャーカットD1.1は、IgM（図２）、CD20（図２）
またはクラスIMHC等の他のＢ細胞表面分子の量が影響を
受けないので、Ｂ細胞のCD23の発現を選択的に誘発し
た。Ｂ細胞活性化におけるジャーカットD1.1の効果は、
25以上の関連性のない提供者由来のＢ細胞に一定に観察
された。これは、該影響がAgにもMHCにも制限されない
事を示唆する。
Ｂ細胞CD23は、Igの分泌細胞に至る最終Ｂ細胞分化に
おいて、初期、および、もしかすると中間の段階で発現
される。活性化されたＴ細胞表面に与えられる刺激とは
別の刺激が、実質的なＢ細胞の増殖および分化を行うに
は必要である。Ｂ細胞増殖または分化を測定するには、
数日の培養が必要であるので、ジャーカットクローンの
増殖を、マイトシンＣによる前処理で阻害した。マイト
シンＣは、Ｂ細胞を活性化する能力を奪うことはしない
（表２）。
二色FACS分析によって、抗CD20（lel−16）−FITCお
よび抗−CD23 PEで測定されたCD23を発現するCD20（Le
u−16）+B細胞のパーセンテージを示す。高密度のパー
コールで分画されたＢ細胞（2x105）は単独で培養され
るか、または同数のジャーカットB2.7またはD1.1細胞と
共に、表示されたように20時間培養された。表示のよう
に、精製されたポリクローナルラビットの抗IL−４また
は抗IL−2Igは、実験開始時に最終濃度1.25μg/mlにな
るまで添加された。表示のように、rIL−２またはrIL−
４は、最終濃度25U/mlになるまで表示された培養液に添
加された。分析された細胞は、前方および側方の光分散
によって該分析からゲートされ、大きなD1.1またはB2.7
細胞（もしあれば）が除かれた。C:対照;D1.1/M:マイト
シンＣで処理されたD1.1細胞;B2.7/M:マイトシンＣで処
理されたB2.7;ND:測定せず。
マイトマイシンＣ処理されたCD4-ジャカットD1.1 およびCD4+ジヤーカットB2.7は、そのＢ細胞増殖また
はIg分泌細胞へ至る最終Ｂ細胞分化へ誘導する能力につ
いて調査された。Ｔ細胞依存Ｂ細胞マイトジェン（Doec
h,et al.,1980）の存在下、ジヤーカットB2.7ではな
く、ジャカットD1.1に誘導されたＢ細胞の増殖は、DNA
分析（図４）によって測定され、Ig分泌細胞の分化は、
逆溶血プラーク分析（図5A）によって測定された。更
に、分泌された抗体のアイソタイプは定量エリサ法で定
性された。ジヤーカットB2.7ではなく、ジャカットD1.1
は、培養上澄液中へIgGおよび少量ではあるがIgMの分泌
を誘発した（図5BおよびＣ）。これらのデータは、まと
めると、ジヤーカットB2.7ではなく、ジャカットD1.1が
Ｂ細胞の分化およびIgMおよびIgGの分泌を援助する機能
的能力を活性化Ｔ細胞と共有していることを示す。
Ｂ細胞活性化の汎用要素の役割 D1.1上澄液はＢ細胞CD23の発現を誘発しなかった（図
３）。静止Ｂ細胞を、Ｂ細胞存在下、無存在下で、D1.1
細胞の培養培地を含むリンフォカインまたは培養液と、
浸透膜によって分離されたチェンバーで培養する二室実
験が行われた。ある実験では、Ｂ細胞（66％IgM）が0.4
5mμ膜の付いたチェンバー中で培養された。二色FACS分
析によると、rIL−４（25U/ml）が、IgM+B細胞の28％で
CD23の発現を誘発した。反対に、もう一つのチェンバー
では、D1.1細胞がCD23（バックグランド4.0％に対してD
1.1は4.7％）を発現するためのＢ細胞を活性化しなかっ
た。更に、D1.1細胞とＢ細胞を一つのチェンバーで共培
養したものは、もう一方のチェンバー中のCd23（4.9
％）を発現するためのＢ細胞を活性化しなかった。しか
しながら、Ｂ細胞と直接接触を達成できれば、D1.1細胞
は、Ｂ細胞によるCD23の発現を誘発するできた（B2.7細
胞に対して76％体8.4％）。まとめると、これらのデー
タによって、Ｂ細胞におけるD1.1の効果を生じる汎用要
素としての役割を裏づける事はできなかった。
rIL−４は、CD23を発現するＢ細胞を活性化する事が
知られていた（Rabin,et al.,1985）ので、この効果を
果たす際のIL−４の潜在的役割を、Ｂ細胞でのCD23発現
誘発の役割とは別に、更に調査した。rILはBsIgM+の発
現のアップレキュレーションをすることが知られていた
（Shields,et al.,1989）。rIL−４は、CD23の発現およ
びsIgM+のアップレギュレーションを投与量に依存した
かたちで誘発したけれども、D1.1細胞はCD23の発現を誘
発したが、Ｂ細胞sIgMのアップレギュレーションはしな
かった（図６）。Ｂ細胞の増殖におけるD1.1細胞の効果
もまた、rIL−４（図４）効果とは異なっていた。rIL−
４ではなくD1.1細胞は、PHA存在下でＢ細胞増殖を誘発
した。おもしろいことに、rIL−４およびD1.1細胞は共
同して、PHA無存在下ではＢ細胞増殖を誘発し、PHA存在
下ではD1.1に誘発された増殖を増大させた。これらのデ
ータは、まとめると、Ｂ細胞におけるD1.1細胞の効果
が、IL−４によって誘発される効果とははっきりと異な
る事を示唆している。しかしながら、Ｂ細胞に対するD
1.1細胞の影響におけるIl−４の役割を直接調べるため
に、IL−４に対する中和抗体を使用した。rIL−４（図
６）によって行われる抗23の誘発およびsIgMのアップレ
ギュレーションの両方を阻害する抗IL−４抗体の濃度で
は、D1.1が介在するＢ細胞CD23発現は阻害されなかった
（表II）。これらのデータにより、IL−４単独ではD1.1
のＢ細胞における効果が説明できない事が実証された。
これらの結果を、まとめると、分泌要素ではなく、細胞
−細胞接触がＢ細胞活性化におけるD1.1の効果を説明す
ることが示唆された。
細胞−細胞接触がＢ細胞におけるD1.1効果を生じると
いうアイデアを実証するために、ジャーカットD1.1およ
び対照のB2.7細胞を１％のパラフォルムアルデヒドで固
定化した。パラフォルムアルデヒド固定化は、ジャーカ
ットD1.1のＢ細胞を活性化する能力を低下させたけれど
も、固定化されたD1.1細胞は、Ｂ細胞CD23の発現を誘発
する能力を残していた。しかしながら固定化されたB2.7
細胞は、CD23の発現をバックグランドレベルから変えは
しなかった。固定化されたD1.1細胞:B細胞の割合が5:1
の時、無固定化D1.1細胞では80％であったのに比べて、
63％のＢ細胞が誘発されてCD23を発現した。これらのデ
ータは、まとめると、ジャーカットD1.1上の表面構造
が、Ｂ細胞の活性化を誘発するには十分であることを示
唆している。
ヘルパーエフェクター作用を与える活性化されたCD4+T
細胞の細胞表面蛋白の特徴 ヘルパーエフェクター作用を与える活性化されたCD4+
T細胞の細胞表面蛋白の特徴付けを行うために、マウス
を接触依存性ヘルパーエフェクター作用を有するジャー
カットD1.1クローンで免疫感作した（Yellin et al.,19
91）。モノクローナル抗体（mAb）が産生され、D1.1ク
ローンおよび非ヘルパージャーカットクローンB2.7に識
別して結合するかどうかに対して、ハイブリドーマ上澄
液をスクリーニングする。
非ヘルパーB2.7細胞の表面ではなく、D1.1細胞表面に
特異的に結合した5c8と名付けられたマウスIgG2a mAb
が確認された（図７）。mAb 5c8は、他の様々な細胞
系:T細胞白血病系、CEM,H9,Molt−4,およびPeer;B細胞
由来細胞系、BA,Raji,またはRamos;骨髄単球細胞系、U9
37;または赤血球細胞系、K562とは結合しなかった（下
記表３参照）。
これらのデータは、表示細胞系または細胞集団に結合
しているmAb 5c8のFACS分析から得られた。mAb 5c8の
結合は、各々の細胞系または細胞集団に対する適切な陽
性および陰性対照mAbsのFACS染色と比較して決定され
た。ND:測定されなかった。
mAB 5c8がジャーカットクローンD1.1のヘルパー能力
と作用的に関連のある分子と反応するかどうかを評価す
るために、mAb 5c8の効果を、Ｂ細胞でのD1.1に誘発さ
れるCD23発現の分析で調査した。mAb 5c8はジャーカッ
トD1.1誘発細胞活性化（図８）を阻害した可能性があ
る。反対に、アイソタイプの対照mAb、W6/32は、D1.1が
介在するＢ細胞活性化を阻止しなかった。ここに提示し
たデータにより、5c8 AgがD1.1細胞のヘルパーエフェ
クター作用に重要な役割を果たしていることが示唆され
る。
mAb 5c8によって認識される抗原の生化学的特質 mAb 5c8によって認識される抗原を生化学的に特質化
するために、免疫沈殿を,mAb 5c8または対照mAbsによ
っておこなわれる。対照mAbsは、表面ヨウ素化されたジ
ャーカットD1.1細胞および対照、つまり表面mAb 5c8結
合を欠く非ヘルパージャーカットB2.7細胞の細胞溶融物
上のクラスＩ MHC（W6/32）またはCD28（kolt−４）抗
原を認識する。mAb 5c8は、対照のB2.7溶融物からでな
く、ヘルパークローンD1.1の溶融物から、SDS/PAGE上の
30kDaに移動する蛋白を免疫沈殿した（図９）。
mAb 5c8によって免疫沈殿された蛋白種は、２−メル
カプトエタノール（２−ME）による還元による影響は受
けなかった。これは、30kDaのバンドが、ホモダイマー
に連結した二硫化物でも、ヨウ素化が容易にできない他
の蛋白に連結した二硫化物でもないことを示唆してい
る。反対に、対照、抗−CD28mAb、KOLT−４は、２−ME
が存在しない場合は88kDaバンドを、２−MEが存在する
場合は44kDaバンドを免疫沈殿した（図９）。これは公
開のレポート（Martin,et al.,1986）およびこの構造が
二硫化物が結合したホモダイマーであるという解釈と一
致する。対照のmAb W6/32は、43と12kDa MWの蛋白の
非硫化物が結合したヘテロダイマーを沈殿させた（図
９）。これらのデータにより、mAb 5c8が、30kDa MW
の非硫化物に結合した蛋白種を、D1.1細胞の表面から認
識したことが示唆された。
通常リンパ細胞による5c8 Ag発現の特徴 mAb 5c8または様々な対照mAbsの結合について、新た
に単離されたＴおよびＢリンパ球、単球、および、PMA
およびPHAに刺激されたＴ細胞についてのFACSによって
調査される。静止ＴまたはＢリンパ球または単球は、5c
8 Agを発現しなかった（上記表３、および図10参照）
けれドンも、活性化されたＴ細胞のサブセットは、PMA
およびPHAで活性化された後５時間して、5c8 Agを発現
した事がわかった（図10）。
5c8 Agの発現のカイネチクスおよび細胞分布を特徴
づけるために、mAb 5c8のＴ細胞への結合が、Ｔ細胞活
性化後、様々な間隔をおいてFACSで調査された。Ｔ細胞
活性化後、実質的に全てのＴ細胞に上に急速に誘導され
る事が知られている（Bjorndahl,et al.,1988）ので、3
2/38KDaの二硫化物結合ヘテロダイマーであるCD69分子
を、対照として選択した。5c8が静止Ｔ細胞には無く、
活性化後Ｔ細胞のサブセット上で発現されるけれども、
対照的に、低レベルのCD69発現が静止Ｔ細胞上でみら
れ、高レベルのCD69の発現が全Ｔ細胞集団の活性化によ
って誘導された（図10）。mAb 5c8の結合が活性化後３
時間（Bjorndahl,et al.,1988）に著じるしく、24時間
（図11）を越えて持続したので、発現のカイネテクスに
より、さらにCD69と5c8 Agは区別された。ここに示さ
れたデータによって、CD69と5c8 Agが、それらの発現
の細胞分布によっても、それらの活性化後のアップレギ
ュレーションのカイネテクスによっても識別されること
が提示された。
mRNAまたは蛋白の合成が、5c8 Ag発現に必要とされ
るかどうかを決定するために、アクチノマイシンＤまた
はシクロヘキサアミドの存在または非存在下で、Ｔ細胞
をPMAおよびPHAで刺激し、5c8およびCD69の発現を比較
した。5c8の発現は、アクチノマイシンＤまたはシクロ
ヘキサミドのいづれかの処理によって阻害された（図1
0）。反対に、CD69は、アクチノマイシンＤまたはシク
ロヘキサミドのいづれかの存在下にもかかわらず、活性
化によって、以前に報告されている（Bjourndahl,et a
l.,1988）ようにアップレギュレーションされた（図1
1）。これらのデータにより、Ｔ細胞活性化後に5c8の抗
原の発現が、mRNAの転写および蛋白の新生（de novo）
合成に依存している事が示唆された。
活性化後に5c8 Agを発現するＴ細胞サブセットの特徴 活性化後5c8 Agを発現するＴ細胞サブセットの特徴
付けを行うために、CD4+CD8-またはCD4-CD8+T細胞集団
を抗CD8または抗CD4mAb処理によってそれぞれ単離し、
その後、補体depletionを行なった。CD4+CD8-またはCD4
-CD8+集団を、PHAおよびPMAで活性化し、FACSによる5c8
AgまたはCD69の発現について調査した。CD8+細胞が活
性化後、類似量のCD69を発現したという事実にもかかわ
らず（図11）、活性化後、5c8の発現は、CD8+ではなくC
D4+細胞上において排他的に誘発された。これらのデー
タをまとめると、5c8 Agの発現がCD4+細胞に限られる
事が実証された。
通常Ｔ細胞の介在するＴヘルパー機能における5c8 Ag
の役割の評価 通常Ｔ細胞の介在するＴヘルパー機能における5c8 A
gの役割の評価するために、表面CD23分子と発現するた
めの小量の静止Ｂ細胞を誘発する活性化Ｔ細胞の能力に
おけるmAb 5c8の効果を調査した。ホルボールジブチレ
ート（PBD）の存在下、抗−CD3（OKT3）または対照の抗
−CD4（OKT4）mAbsで被覆された表面で、Ｔ細胞を培養
しそしてパラフォルムアルデヒドで固定化した。これら
の固定化されたＴ細胞の、溶解性mAb 5c8またはOKT4の
存在下でのＢ細胞活性化能力について調査した。OTK4
は、Ｔ細胞表面CD4分子と反応するが、Ｔ−Ｂ細胞相互
作用と阻害しない（Rogozinksi,et al.,1984）から、mA
b OTK4は、これらの実験でアイソタイプと適合した対
照として選択された。OTK4ではなくmAb 5c8は、活性化
されたＴ細胞のＢ細胞CD23発現を誘導する能力を阻害し
た（下記表４参照）。
表示したように、Ｂ細胞を単独で培養した後、または
同数のジャーカットd1.1細胞存在下で培養した後、二色
FACS分析によってCD23を発現するIgM+B細胞のパーセン
テージ、あるいはPBD単独で刺激されたか、または固定
化された抗−CD3（OKT3）または抗−CD4（OKT4）mAbの
いづれかの存在下で刺激されたパラフォルムアルデヒド
で固定化されたＴ細胞のパーセンテージを示す。IgG2a
mAbs、5c8、およびOKT4は、並行の用量−反応実験に
おいて、90％のCD23誘導を阻害したmAb5c8の濃度の二倍
の500ng/mlであった。ND:測定せず。
次に、mAb 5c8およびOKT4の、通常のヒトＴ細胞によ
って起こされる最終Ｂ細胞分化を阻害する能力に対する
効果を比較した。これらの実験では、CD4+T細胞をPWMの
存在下、自己由来の、カラム単離Ｂ細胞と共に培養し、
Igを分泌するＢ細胞プラーク形成コロニー（PFCS）の数
を逆溶血プラーク分析によって測定した。OKT4ではな
く、mAb 5c8が、CD4+細胞起動PFC反応を阻害した（表
５参照）。これらのデータをまとめると、5c8 Agが活
性化されたCD4+T細胞のヘルパーエフェクター機能の接
触依存性面に関わっている事が実証される。
CD4+T細胞を、PWMの存在下または無存在下で、自己由
来の、抗Igカラム単離Ｂ細胞との比率0.6:1で培養し
た、無関連のドナーについての３つの別個の実験の結果
を示す。106B細胞につきプラーク形成コロニー（PFC）
の数を逆溶血プラーク分析によって測定した。OKT4が１
μg/mlである実験１以外では、mAbs 5c8およびOKT4
は、500ng/mlであった。ND:測定せず。
考察 ジャーカットD1.1クローンは、関連のない種々の患者
由来のＢ細胞に対して、表面CD23分子（Ｂ細胞活性化の
マーカー）の発現を誘導し、またＴ依存性Ｂ細胞マイト
ジェンの存在下で増殖およびISCへの最終分化を誘導す
る点において、CD4+ジャーカット細胞ライン及び他の種
々の白血病Ｔ細胞ラインとは機能的に異なっている。Ｂ
細胞活性化に対するこのD1.1の作用は、親密な細胞接触
を必要とし、分泌された因子（または特にIL−４）によ
っては説明できなかった。
ジャーカットD1.1が接触依存性Ｂ細胞の活性化および
分化を誘導できるという事実は、ジャーカットD1.1が、
補助（help）の接触依存性エフェクター相を媒介する活
性化Ｔ細胞と共通した、表面構造を有していることを示
唆している。
活性化されたＴ細胞と、Ｔヘルパー機能のエフェクタ
ー相を媒介するＢ細胞との間の分子的相互作用は複雑で
あり、殆ど理解されていない。Ｔヘルパー・エフェクタ
ー機能の機構を詳細に吟味するために、幾つかの研究に
よってＢ細胞分化の初期現象が測定された。第一に、細
胞サイクル過程に関連したRNA、DNAおよび酵素のＢ細胞
合成が、活性化された休止していないＴ細胞によって誘
導される（Ｏ′Brien,et al.,1988;Grusby,et al.,199
1;Noelle,et al.,1991;Noelle,et al.,1990;Zinkernagl
e,1977;Sprent,1978;Sprent,1978;Jones,et al.,1981;J
ulius,et al.,1982;Chestnut et al.,1981）。第二に、
Ｂ細胞表面CD23の誘導により測定されるＢ細胞の活性化
が、活性化された休止していないＴ細胞によって誘導さ
れる（Zinkernagle,1976）。第三に、Ｂ細胞の活性化お
よび増殖が、パラホルムアルデヒドで固定された活性化
Ｔ細胞によって誘導され得る（Zinkernagle,1977;Juliu
s,et al.,1982）。第四に、Ｂ細胞の増殖が、活性化さ
れた休止していないＴ細胞由来の膜プレパレーションに
よって誘導される（Noelle,et al.,1991;Katz,et al.,1
973;Brian,1988）。最後に、活性化Ｔ細胞または活性化
Ｔ細胞膜がＢ細胞の活性化または増殖を誘導する能力
は、プロテアーゼ処理によって喪失される（Katz,et a
l.,1973;Jones,et al.,1981）。総合すると、これら所
見は、Ｔ細胞の活性化が、Ｂ細胞と相互作用する表面構
造の誘導に付随し、Ｂ細胞の活性化および増殖のための
接触依存性信号を提供するするという思想に合致してい
る。活性化Ｔ細胞と同様であるが、他の白血病細胞ライ
ンとは異なり、ジャーカットD1.1は、細胞／細胞の接触
に依存するがリンホカイン、Ag特異性またはMHC制限に
は依存せずに、Ｂ細胞CD23の発現を誘導する能力を有し
ている。Ｂ細胞表面CD23の発現の誘導は、Ｔ指令された
Ｂ細胞のIg分泌細胞への分化（固定された活性化Ｔ細胞
の表面によって駆動され得る）の初期段階または中間段
階で生じると思われる（Zinkernagle,1976;Sprent,197
8）。Ｂ細胞CD23の発現の誘導に加えて、ジャーカットD
1.1は、PWMの存在下でのD1.1に誘導された最終Ｂ細胞分
化において、CD4+ジャーカットクローンとは機能的に異
なっている。これらの点において、ジャーカットD1.1は
活性化されたＴ細胞と共通した、Ｂ細胞を刺激する後天
的な表面特性を有していると思われる。
ヘルパー機能を説明するジャーカットD1.1の表面構造
の性質は、今回の研究においては同定されなかった。Ｔ
細胞上のCD28分子はＢ細胞リガンドを結合するから（Hi
rohata,et al.,）、特に興味深いのは、ヘルパーD1.1お
よびB2.7クローン上のCD28の発現を比較することであ
る。しかし、ジャーカットD1.1およびB2.7がCD28分子を
発現したという事実によって、CD28だけではジャーカッ
トD1.1の独特の機能的性質を説明できないことが示され
た。更に、CD2、CD3、CD5、CE38、LFA−1a、LFA−1bお
よびLFA−３に特異的なmAbを用いたmAb阻害研究におい
ては、何れのmAbも、D1.1に媒介されたＢ細胞の活性化
を阻害するものとして同定され得なかった。ヘルパーエ
フェクター機能を媒介するD1.1の異なった細胞表面特性
を同定するために、D1.1と反応し、D1.1のＢ細胞を補助
する能力を阻害するmAbを創製する試みが開始された。
ヘルパー機能を媒介する表面構造は同定されていない
が、D1.1系は、ヘルパーエフェクター機能におけるCD4
分子の役割を暗示している。CD4-であるものとして単離
されたジャーカットサブクローンが、ヘルパー機能（通
常はCD4分子を発現するＴ細胞のサブセットに付随す
る）を有していたことは奇妙なことである。幾つかの系
統の研究によって、CD4分子はヘルパーエフェクター機
能において直接の役割を果たさないことが示唆されてい
る（Mitchison,1971;Gusby,et al.,1991;Noelle,et a
l.,1991;Vitetta,et al.,1989;Katz,et al.,1973;Zinke
rnagle,1976）。TCRおよびCD4のりょうしゃがMHCクラス
IIの分子（I a）と相互作用するという事実（Whalen,et
al.,1988）は、I a分子のライゲーションがヘルパーエ
フェクター機能のモデルになり得ることを示唆してい
る。加えて、Ｂ細胞上のI a分子のライゲーションがＢ
細胞に信号を発するという所見は、このモデルによって
更に支持される（Pollok,et al.,1991;Bartlett,et a
l.,1990;Martinez,et al.,1981）。ジャーカットD1.1は
ヘルパー機能を有するがCD4-ではないという事実は、CD
4分子がヘルパー機能のエフェクター相には必要とされ
ないことを強力に示唆する。これとは対称的に、ジャー
カットのCD4-クローンが後天的なヘルパー機能を有する
ことは、CD4分子がCD4-ジャーカット細胞のヘルパーエ
フェクター機能を阻害し得ることを示唆する。ジャーカ
ットD1.1がDC4分子を欠失していることと、その独特の
ヘルパー機能との間の関係を直接測定するために、異種
プロモータによって駆動されるCD4・cDNA構築物の電気
穿孔法によって、D1.1の安定なCD4+形質導入体が創製さ
れた。
最近、ネズミ系において、活性化されているが休止し
ていないＴリンパ球から誘導された膜プレパレーション
が、Ｂ細胞の増殖を誘導するがIg分泌を誘導しないこと
が示された（Noelle,et al.,1991;Katz,et al.,1973;Br
ian,1988）。これら研究のD1.1系に対する関係は現在は
明らかでないが、D1.1細胞から単離された膜が、Ｂ細胞
に対してCD23の発現、増殖および最終分化を誘導するか
否かを決定することは興味深いことである。何れにして
も、ジャーカットD1.1は、接触依存性ヘルパー機能の媒
介において重要な表面分子の同定および特徴付けを行な
うために有用であるらしい。
接触依存性ヘルパー機能をもった機能的に独特なジャ
ーカット白血病ライン（D1.1）が、D1.1に誘導されたＢ
細胞の活性化を阻害するネズミ抗体（5c8と命名）を創
製するために用いられた。抗体5c8は、D1.1表面の独特
な蛋白種（ジスルフィド結合されておらず、SDS/PAGE上
では30kDaの分子量で移動する）を認識した。正常なリ
ンパ球においては、5c8・Agの発現は活性化後のＴ細胞
サブセットに限定されていた。Ｔ細胞上における5c8・A
gの該活性化に誘導された発現は、mRNAの転写およびノ
ボタンパク（novo protein）合成を必要とした。該5c8
・Agは活性化されたＴ細胞表面に一時的に発現される
が、この発現は６時間でピークに達し、24時間で消失す
る。正常Ｔ細胞表面での機能的研究において、mAb・5c8
は、固定化された活性化Ｔ細胞のＢ細胞CD23の発現を誘
導する能力を阻害した。加えて、mAb・5c8は、正常Ｔ細
胞のＢ細胞分化を指令する能力を阻害した。総合する
と、これらのデータは、5c8・Agが活性化CD4+T細胞（Ｔ
ヘルパー機能の接触依存性因子を媒介すること含まれ
る）に専ら発現される、活性化に誘導された新規な表面
タンパクであることを示している。
5c8・Agの組織分布、発現の速度論、誘導のための代
謝要求性および生化学によって、5c8・Agは、Ｔ細胞活
性化によって誘導される他の公知の表面タンパクから区
別される。第一に、他の公知のＴ細胞活性化マーカーは
全て、CD4+で且つCD8+のＴ細胞によって発現されるのに
対して、5c8・Agは専らCD4＋Ｔ細胞によって発現され
る。第二に、Ｔ細胞の活性化に続く5c8・Ag発現の速度
論は、他のＴ細胞活性化分子とは異なっていた。5c8・A
gは活性化後６時間で最大に発現され、24時間で消失す
るのに対し、CD25（Doech,et al.,1980）、I a（Rabin,
et al.,1985）およびCD28の32kD形は、活性化後18時間
以上誘導される。加えて、CD69は5c8・Agよりも迅速に
発現され、また（5c8・Agとは異なって）24時間以上持
続する。第三に、5c8・Ag発現の誘導はmRNA転写および
タンパク合成に依存したが、CD69は依存しなかったの
で、5c8・Agは、その誘導の代謝要求性によってCD69か
ら区別された。第四に、5c8・Agは30kDのジスルフィド
結合されていない種であった。これに対して、初期活性
化分子であるCD69は、28/32kDのジスルフィド結合され
たヘテロダイマーである（Bjorndahl,et al.,1988）。
総合すると、これらのデータは、5c8・Agが他の公知の
Ｔ細胞活性化分子とは異なっていることを示唆してい
る。
また、5c8・Agは、その組織分布および生化学の幾つ
かの側面によって、Ｔ−Ｂ相互作用において役割を果た
すことが知られている他のＴ細胞表面分子からも区別さ
れた。第一に、5c8・AgはＴ細胞活性化によって誘導さ
れたが、休止細胞出は発現されなかった。これに対し
て、Ｂ細胞表面リガンドと相互作用するCD4,CD2,CD5,CD
28,LFA−1,ICAM−1,CD45RO及び6C2（Doyle,et al.,198
7;Van de Velde,1991;Tohma,et al.,1991;Sanders,et a
l.,1991;Linsley,et al.,1990;Stamenkovic,et al.,199
1;Rothlein,et al.,1986;Tanimoto et al.,1991）は、
休止Ｔ細胞表面に発現する（Rothlein,et al.,1986;Tan
imoto et al.,1991;Sanchez Madrid,et al.,1982;Smit
h,et al.,1986;Yamada et al.,1985）。第二に、5c8・A
gは活性化Ｔリンパ球に特異的に発現され、Ｂ細胞、単
球または細胞ラインのパネル（表１）には発現されない
ことによって、5c8・Agは、Ｂ細胞または一定の細胞ラ
イン（例示せず）にも発現されるICAM−1,CD4,CD5,IFA
−1,CD2および6C2分子から区別される。第三に、CD2,CD
5,CD28,LFA−1,ICAM−1,CD45RO及び6C2は、CD4+T細胞と
同様にCD8+にも発現される（Rothlein,et al.,1986;Tan
imoto et al.,1991;Sanchez Madrid,et al.,1982;Smit
h,et al.,1986;Yamada et al.,1985）のに対して、5c8
・Agの発現はCD4+T細胞に限定されていた。第四に、mAb
・5c8で沈殿された30kDタンパクは、これら他のタンパ
ク（Rothlein,et al.,1986;Tanimoto et al.,1991;Sanc
hez Madrid,et al.,1982;Smith,et al.,1986;Yamada et
al.,1985）の何れとも似ていなかった）。最後に、mAb
・5c8はジャーカットD1.1に媒介されるヘルパーエフェ
クター機能を阻害する能力によって同定されたから、5c
8・Agはこれら他の分子とは異なっていた。
mAb・5c8はジャーカットD1.1および固定された活性化
Ｔリンパ球の接触依存性ヘルパー作用を阻害するから、
5c8・Agは、Ｂ細胞表面のリガンド（または「カウンタ
ーレセプター」）と相互作用することによって、Ｂ細胞
活性化機能を媒介すると思われる。この5c8・AgのＢ細
胞カウンターレセプターとの相互作用は、Ｔ−Ｂ対に追
加の付着力を提供すること、Ｂ細胞原形質への刺激信号
を変換することまたはこれら機構の組み合わせによっ
て、ヘルパー機能を媒介し得る。正確な機構には関係な
く、5c8・Agの一時的な発現は、非特異的なＢ細胞活性
化を制限するための分子的な解決を提供し得る。抗原特
異的な同起源のＴ−Ｂ対の局在化された環境における5c
8・Agの一時的発現は、5c8・Agの抗原/MHCに制限されな
い活性化機能を、適切なＢ細胞標的へチャンネルし得
る。5c8・Agの発現および下方調節の速度論は、内皮細
胞、活性化誘導されたリンパ球の細胞表面メディエータ
およびリンパ球結合性ELAM−１（Bevilacqua,et al,198
7）と共通している。この類似性は、局在化された細胞
間相互作用を生じさせるために一時的発現を利用する戦
略が、5c8・Ag、ELAM−１、並びに可能性としては、直
接接触によって他の細胞に強力な信号を伝達する未だ特
徴付けられていない他の表面分子によって共有され得る
ことを示し得るかも知れない。
CD4分子は、ヘルパー機能をもったＴ細胞前駆体を包
含するＴ細胞ポピュレーションを同定する（Reinherz,e
t al.,1979）。しかし、CD4+サブセットは機能的に付均
一であり、またヘルパー細胞に加えて、細胞毒性のサプ
レッサー細胞を含んでいる（Krensky,et al.,1982;Thom
as,et al.,1981）。5c8・Agがヘルパー機能に含まれる
という事実は、5c8・Agが、CD4発現よりも密接にヘルパ
ー発現型と関連し得ることを示唆している。活性化CD4+
細胞における5c8発現の不均一な分布は、CD4+T細胞の機
能的サブセット類が、その5c8発現レベルによって区別
される得るかもしれないことを示唆する。例えば、ヘル
パー活性または細胞毒性に関連して、5c8-CD4+細胞およ
び5c8+CD4+細胞の機能的可能性を測定することは興味深
いことであろう。
Ｔ細胞ヘルパーエフェクター機能は、Ｂ細胞応答性
（Krusemeier,et al.,1988;Hodgkin,et al.,1990;Noell
e,et al.,1991;Kubota,et al.,1991）、アイソタイプス
イッチングの調節（Tesch,et al.,1984）及び体細胞超
突然変異（Weigert,et al.,1970）をもたらす複雑なプ
ロセスである。多くの細胞／細胞相互作用によって、並
びに種々のリンホカインを分泌することによって、Ｔ細
胞がＢ細胞と相互作用するという事実は、個々の信号ま
たは信号の一定の組み合わせによって、Ｂ細胞分化の特
定の側面が調節されるであろうことを示唆する。mAb・5
c8がＴ細胞ヘルパー機能の接触依存性の側面を阻害する
という事実によって、CD4+T細胞が液性免疫反応を調節
するプロセスを更に詳細に検討する手段が提供される。
実験の第２シリーズ ヒトリンパ瀘胞内でＴ−Ｂリンパ球の共働を媒介する分
子的相互作用 Ｔヘルパー機能と称する過程では、CD4+のＴリンパ球
は、体液での（抗体が媒介する）免疫反応を媒介する抗
原特異的Ｂ細胞の分化を選択、誘発する（Mitchell,et
al.;1968;Mitchison,1971;White,et al,1978;Reinhert
z,et al.,1979;Janeway,et al.,1988;Rehemtulla,et a
l.,1991;Grusby.et al.1991）。リンパ瀘胞内では生理
学的なＴ−Ｂ反応が起こっているが、様々なインビトロ
系において、Ｔヘルパーの信号の機構的解明が可能にな
っている。ヘルプの誘導相は抗体とMHCに限定されてい
るが、エフェクター相は非特異的であり、リンホカイン
と接触依存性信号の両方に媒介されている（Martinez,e
t al.,1981;Anderson,et al.,1980;Clement,et al.,198
4;Crow,et al.,1986;Brian,1988;Hirohata,et al.,198
8;Noelle,et al.,1989;Whalen,et al.1988）。
接触依存性信号の解明は、不活性な末梢Ｂ細胞を本質
的に活性化する、機能的にユニークなジャーカットＴ細
胞白血病細胞系D1.1のサブクローンが最近同定されたこ
とにより進歩した（Yellin,1991）。D1.1クローンは、
以前から、不活性なＢ細胞を誘発して表面のCD23分子を
発現させ、Ｂ細胞を増殖させて、抗体産性細胞に分化さ
せることがわかっている（Yellin,1991）。D1.1のＢ細
胞活性化能力は細胞の表面に局在している。これはパラ
ホルムアルデヒドで固定されたD1.1が、Ｂ細胞を活性化
する能力を保持していたが、D1.1の上清は不活性だった
からである（Yellin,1991）。これらのデータを一緒に
考慮すると、D1.1は、接触依存性のヘルパー機能を媒介
する活性化されたＴ細胞と表面構造を共有していること
を示している。
実験の第１シリーズでは、D1.1と特異的に反応してD
1.1によるＢ細胞の機能的活性化を阻害するmAb（Lederm
an,et al.,1992）について、ハイブリドーマをスクリー
ニングすることにより、このような一つの構造（5c8・A
gと称する）が同定された。mAb・5c8によって、活性化
されたCD4＋Ｔ細胞上に発現するが、CD8＋Ｔ細胞、Ｂ細
胞、単球には発現しない30キロダルトンの新規な表面構
造が同定さた（Lederman,et al.,1992）。PHA、PMAで刺
激した後の、細胞表面での5c8抗原の発現の速度論は比
較的ユニークであり、最大の発現は６時間後に起こる
が、その後は下方調節されて24時間後にはまったく発現
しなくなる（Lederman,et al.,1992）。機能的アッセイ
において、mAb・5c8は、正常なCD4＋Ｔ細胞のＢ細胞を
抗体産生細胞に分化させる能力を阻害する（Lederman,e
t al.,1992）。以上のことを総合すると、これらのデー
タは、5c8抗原が、接触依存性ヘルパー機能を媒介するC
D4＋Ｔ細胞の表面構造の一つの構成部分であることを示
している。従って、この5c8・Agを「Ｔ細胞−Ｂ細胞活
性化分子（Ｔ−BAM）」と命名する。
Ｔ−BAMはインビトロで接触依存性ヘルパー機能を誘
起するＴ細胞分子の一つであるが、そのリガンド及びＢ
細胞上の「カウンターレセプター」、即ち、インビボの
リンパ系組織内で接触依存性ヘルパー機能を媒介するの
に他のＴ細胞分子とＢ細胞分子がどのような役割を果た
しているかは殆どわかっていない。幾つかの興味深いＢ
細胞の表面分子が、リンパ系組織内において接触依存性
信号を受容する役割をしているだろうといわれている。
CD40分子、CR2分子および接着分子がそれである。ヒト
Ｂ細胞表面上のCD40分子は、リンパ節Ｂ細胞分化に関係
する興味深い信号機能を持っている（Clark,et al.,198
6;Clark,et al.,1988;Ledbetter,et al.,1987;Ledbette
r,et al.,1986）。何故なら、抗CD40（mAb G28−５（Cl
ark,et al.,1986））はプログラムされた胚中心Ｂ細胞
の死（アポトーシス）（Lim,et al.,1989）を阻害し、
ヒトＢ細胞の増殖、分化および長期の成長を誘起するこ
とがわかっているからである（Banchereau,et al.,1991
a;Banchereau,et al.,1991b）。CR2はＢ細胞の補助レセ
プターで、抗体による誘発の後にＢ細胞に細胞分裂誘信
号を送ることができ、またはEBウィルスの細胞表面レセ
プターとしての役割を果たす（Nemerow,et al.,1985;Ca
rten,1988）。最後に、接着レセプターLFA1、LFA3およ
びICAM−１は、多くの細胞の相互作用の中の接着相互作
用において役割を果たしていることが知られていて、こ
れらの構造と反応するmAbは、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の過
程を阻害する（Tohma,et al.,1991a;Tohma,et al.,1991
b）。しかし、ヘルパー相互作用におけるこれら分子の
正確な役割はまだはっきりしていない。
この第２シリーズの実験では、これらの発見を３つの
方向に拡大した。第一に、Ｂ細胞リンパ腫クローンRAMO
S266（Seigel,et al.,1990）が、抗Ｔ−BAM（mAb・5c
8）に阻害される仕方で、D1.1細胞の接触に応答するも
のとして同定された。第二に、Ｔ−BAMと共に接触依存
性Ｔ−Ｂ活性化の媒介に関与するＢ細胞の表面構造（CD
40）が同定された。第三に、Ｔ−BAMは、インビボでは
主に、リンパ節の外套部と中心部（Ｔ細胞とCD40を発現
するＢ細胞との相互作用が起こる解剖学的部位）におい
て、Ｔ細胞によって発現されることがわかった。
材料と方法 細胞系：ジャーカット・クローンD1.1とB2.7について
は既述されている（Yellin,et al.,1991;Lederman,et a
l.,1992）。RAMOS266、4CN・3F10（RAMOS266）クローン
（Siegel,et al.1990）は、食品医薬品局（FDA）のセン
ター・フォー・バイオロジックス・エバリュエーション
・アンド・リサーチ（Bethesda,MD）のJay P.Siegel博
士の好意により寄贈された。ヒトFcRg II（CD32）を発
現しているＬ細胞は、Schering−Plough（Dardilly Ced
ex,France）のJacques Banchereau博士から贈られた（2
4）。また、マウスI aを発現しているＬ細胞は、コロン
ビア大学のNed Braunstein博士から贈られた。
モノクローナル抗体:mAb・5c8（IgG2a）については記
述されている（Lederman,et al.,1992）。次のmAbは、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Rocd
ville,MD）から入手可能なハイブリドーマから作製され
た;OKT4（抗CD4）、OKT8（抗CD8）、OKT3（抗CD3）、W6
/32（抗MHCクラスＩ）、THB−５（抗CR2（CD21））、TS
1/22.1.13（抗LFAla（CD11a））、TS1/18.1.2.11.4（抗
LFA1b（CD18））、TS2/9.1.4.3（抗LFA3（CD58））。こ
れらのmAbは、ハイブリドーマの上清の飽和濃度もしく
は腹水の希釈濃度で使用され、又はプロテインＡカラム
（Biorad,Rockville Center,NY）若しくはプロテインＧ
カラム（Pharmacia,Upsula,Sweden）で腹水液から精製
して使用された。抗LFA3（7A6）はバイオジーン社（Cam
bridge,MA）のVicki Sato博士から贈られた。抗CD23−P
E、leu16（CD20）、leuM5（IgG2b・抗CD11c）mAbは、ベ
クトン・ディクソン社（Mountainview,CA）から購入し
た。mAb・G28−５（19）は、ワシントン大学（シアト
ル,WA）のEdward A.Clark博士から贈られた。mAb・RR1/
1.1.1（抗ICAM−１（CD54））は、テキサス大学サウス
ウエスタン・メディカル・センター（ダラス,TX）のPet
er Lipsky博士から贈られた。抗CD40・mAbであるＢ−B2
0（IgG1）は、バイオソース・インターナショナル社（C
amarillo,CA）から購入した。mAb・32.2（抗FcRg II（C
D32））は、Medarex、West Lebanon、NHから購入した。
FITCでラベルした抗IgMは、Tago社（Burlingame,CA）か
ら購入した。イソタイプに適合した関連のないコントロ
ールmAb・UPC−10（IgG2a）とMOPC141（IgG2b）は、シ
グマ社（セントルイス,MO）から購入した。抗IL−４と
抗GM−CSFは、Genzyme社（ケンブリッジ,MA）から購入
した。
細胞蛍光グラフィック分析；略105の細胞を、飽和濃
度の指示されたmAbと共に、80mg/mlの熱凝集ヒトIgG
（インターナショナル・エンザイム社,Falbrook,CA）の
存在下において、４℃で45分間培養した。蛍光物質と結
合したＦ（ab）２ヤギ抗マウス免疫グロブリン二次抗体
（Cappel,Cochranville,PA）と共にインキュベートする
前に、結合しなかったmAbを除去するために細胞を洗浄
した。２色分析のために、指示した直接結合FITCまたは
フィコエリトリン（PE）結合mAbと細胞とを、４℃で45
分間、凝集したヒトIgG存在下で反応させた。分析に先
だって細胞を洗浄し、PBSに再懸濁した。蛍光強度は、F
ACSCAN細胞蛍光グラフ（ベクトン・ディッキンソン社、
Mountainview,CA）で測定した。Ｂ細胞とジャーカット
クローンとの共培養を伴う実験において、ジャーカット
細胞は、前方および側方の低い光散乱をもつ細胞の異な
ったポピュレーション上にゲートを設けることによっ
て、Ｂ細胞の蛍光分析から除去された。
リンホカイン:rIL−４はRobert Coffman博士から贈ら
れ、DNAXとrIL−２はホフマン・ラ・ロッシュ社から得
た。
細胞群の単離：抹消血液リンパ球は、健康なボランテ
ィアから採った新鮮な血液から、ficoll−hypaque（シ
グマ社、セントルイス,MO）上の遠心分離によって得
た。脾臓Ｂ細胞も同様に、臓器提供者の新鮮なバイオプ
シー標本（コロンビア大学外科のMark Barr博士から提
供された）から得た。扁桃腺Ｂ細胞は、扁桃削除術後の
新鮮な手術標本（コロンビア大学ENT課のJoseph Hadad
博士から提供された）から得た。リンパ系組織Ｂ細胞
は、細かく砕いた組織標本をメタルスクリーンを通し、
続いてficoll−hypaque遠心分離をすることによって得
た。
Ｔ細胞は、ノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球と
で陽性が選択された。Ｂ細胞は、ノイラミニダーゼ処理
したヒツジ赤血球で２回ローゼッティング（rosettin
g）した後に、ficoll−hypaqueで沈殿しなかった細胞群
から得た。
Ｂ細胞は密度遠心法によってさらに精製された。Ｅ−
細胞は一晩ポリスチレンフラスコのなかで培養され（37
℃、５％CO2）、接着によってマクロファージが除去さ
れた。これらの非Ｔ細胞、非マクロファージは、2300rp
mでの12分間の遠心分離により、30％/50％/100％パーコ
ール（percoll）非連続勾配中の、高密度フラクション
および低密度フラクションに分別された。高密度細胞は
50％と100％の界面から得られ、低密度細胞は30％と50
％の界面から得られた（Crow,et al.,1985）。抹消血液
からの高密度（休止）細胞は、典型的には60−90％がCD
20+であり、55−90％がIgM+、CD3+が５％未満、CD23+が
５％未満（バックグラウンド）であった。扁桃腺と脾臓
からの高密度Ｂ細胞は、95％以上がCD20+であった。
Ｌ細胞の培養実験：ヒトFcRg II（CD32）またはマウ
スI aを表示しているＬ細胞が、12ウェルプレート（Cos
tar,Cambridge,MA）内のDMEM・10％FCS中において、集
密になるまで増殖された。この単層を培地で一回洗浄
し、２×106のＢ細胞を含む1mlのIMDM・10％FCSをこの
単層に加え、対でコントロール培地、或いは2mgのG28−
５・mAb、Ｂ−B20・mAb若しくはコントロールmAbを加え
るた。18時間の培養後、温和に撹拌しながらピペットで
Ｂ細胞を回収し、一度洗浄して、上記のようにしてFACS
でCD23の発現を分析した。
Ｂ細胞の活性化と分化のアッセイ:B細胞表面のCD23発
現の誘起を測定する実験では、１−２×105の高密度Ｂ
細胞か又はRAMOS・266細胞が、200ml IMDM・10％FCS中
の同数のジャーカット細胞（丸底マイクロタイターウェ
ル（Nunc）内）に添加され、18−24時間後にCD23の発現
が分析された。
ヒト組織標本：バイオプシー標本を通常の診断過程か
検死で集め、すぐ研究室に運んだ。それぞれの組織標本
の代表的な一部を、最適切断温度（OCT compound,Mile
s,Elkhart,ID）でイソペンタンとドライアイス混合物の
中の丸いコルクのディスク上で急速冷凍し、−70℃で種
々の期間保存した。夫々の標本の代表部分をホルマリン
緩衝液、B5またはブーアン液中で常法により固定し、パ
ラフィンに埋め込み、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ
＆Ｅ）染色された切片を調製した。
多数の良性の組織検体の代表的な一部は、任意の患者
から日常の治療の間に集められ、免疫組織化学的にmAb
・5c8の結合が検査された。これら検体には以下のもの
が含まれる：食道２、胃２、小腸３、結腸６、膵臓２、
肝臓３、腎臓３、子宮３、卵巣２、精巣２、前立腺１、
肺４、心臓２、皮膚３、胸２、脳２、扁桃腺14、胸腺
７、リンパ節４、脾臓10、虫垂５。
免疫組織化学的染色：一連の４ミクロンの冷凍切片
が、低温保存した組織ブロックから切り出され、以前に
詳細に記述されたようにして（Inghirami,et al.,199
0）、固定、染色された。概略を説明すれば次の通りで
ある。切片を、適切に滴定されたmAbと共に、またＦ（a
b′）２ヤギ抗マウスIgG（Fcガンマ特異的、1:200,Orga
non Teknika,Malvern,PA）及びアルカリ性ホスファター
ゼ・抗アルカリホスファターゼ複合体（APAAP,Dako,San
ta Barbara,CA）と共に連続的に培養した。次いで、基
質としてNew Fuschin及びＢ−ナフトール−AS−ビホス
フェートで現像した。或いは、一次mAb又はイソタイプ
適合性の非関連mAbの何れかと共に切片をインキュベー
トし、３回洗浄し、ビオチニル化されたウマ・抗マウス
IgG（Vector,San Diego,CA）と共にインキュベートし
た。パーオキシダーゼを結合したアビジン−ビオチン複
合体を適用し、ジアミノベンチジン（DAB）で現像し、
場合によっては塩化ニッケルで増幅した。クライオスタ
ット組織切片に対し、先に既述されたようにして（Ingh
irami,et al.,1991）、二色免疫組織化学的染色もまた
実施された。簡単に説明すると、先ず、ABC技術（Vecto
r）を用いて、切片を一つのmAb（mAb・5c8、又はイソタ
イプ適合性の非関連mAb（UPC−10、IgG2a）で染色し、D
ABで現像した。次いで、切片をmAb（LeuM5,CD11c）か、
又はイソタイプ適合性の非関連mAbと共にインキュベー
トし、３回洗浄し、APAAP複合体と共にインキュベート
した後、前述したようにして現像した。
結果 D1.1による誘発に反応するＢリンパ腫細胞系の同定： 我々は以前、5c8・Ag（Ｔ−BAM）が、活性化したCD4
＋Ｔ細胞の表面上のタンパクであり、接触依存性ヘルパ
ー機能に関与していることを示した（Lederman,et al.,
1992）。この過程をより詳細に調べるために、Ｔ−BAM
や他の分子の役割の分子分析を可能とする、均質なクロ
ーン化されたリンパ腫細胞系の同定を研究した。この目
的のために、我々はＴ−BAM発現リンパ腫細胞系D1.1を
利用して、CD23の上方調節によりD1.1接触に反応するＢ
細胞リンパ腫を同定した。候補細胞系はRAMOS・266クロ
ーンであり、これはCD23をあまり発現しないが、IL−４
に誘起されると多く発現する（Siegel,et al.,1990）。
RAMOS・266が、D1.1細胞に媒介された接触に反応する
かどうかを知るために、RAMOS・266細胞をD1.1細胞と共
にインキュベートして、RAMOS・266の細胞表面に発現し
たCD23を２色FACS分析によって測定した（図12）。これ
らの実験において、陽性コントロールとして末梢Ｂ細胞
をD1.1と共にインキュベートしたが、これは、Ｂ細胞が
D1.1接触に反応して表面のCD23を増加することが知られ
ているからである（図12）。陰性コントロールとして、
RAMOS・266又は末梢Ｂ細胞を、Ｔ−BAMを発現せずＢ細
胞を活性化しないジャーカットのB2.7クローンと共にイ
ンキュベート（Lederman,et al.,1992）。予想どおり、
18時間のインキュベーション後に、ジャーカットD1.1は
末梢Ｂ細胞に表面CD23分子の発現を誘起したが、ジャー
カットB2.7は誘起しなかった（図12）。重要なことに、
末梢Ｂ細胞に対するこの効果と同じように、D1.1細胞は
RAMOS・266に対して、18時間の共培養の後にCD23の発現
を誘起したが、B2.7は誘起しなかった（図12）。RAMOS
・266と末梢Ｂ細胞との明白な反応の違いは、RAMOS・26
6は全てのポピュレーションがCD23を均質なピークに上
方調節したが、末梢Ｂ細胞は典型的に、明瞭に反応した
細胞ポピュレーション（80％がCD23を発現した）と、全
く反応しなかった細胞ポピュレーション（20％がCD23を
発現しなかった）とにわかれたことである。この相違の
ために、RAMOS・266の反応を、CD23発現の単一のピーク
をもった中間の蛍光強度（MFI）として定量し、また末
梢Ｂ細胞の反応を、反応細胞の比率として定量すること
が必要となった（図12）。異なる量のD1.1細胞を一定量
のRAMOS・266またはＢ細胞に加えた分量反応実験（dose
response experiments）によって、これらの方法が正
しいことがかる。何故なら、D1.1細胞の数が減少する
と、RAMOS・266のMFIも減少し（示していない）、CD23
＋Ｂ細胞の割合も減少するからである（Yellin,et al.,
1991）。これらのデータは、RAMOS・266が末梢Ｂ細胞の
反応と同じ様に、D1.1との共培養に反応することを示し
ている。
RAMOSに対するD1.1の効果がＴ−BAM依存性であるかを
調べるために、D1.1に媒介性された活性化に対する抗Ｔ
−BAM・mAb・5c8の効果を研究した。これらの実験で
は、mAb・5c8またはイソタイプのコントロールmAbを、D
1.1が入っているRAMOS・266または末梢Ｂ細胞の培養倍
に加えた（図12）。末梢Ｂ細胞のD1.1による活性化を阻
害するmAb・5c8の公知の効果と同様に、mAb・5c8は、RA
MOS・266のD1.1による活性化を阻害する（図12）。対照
的に、イソタイプのコントロールmAbは、D1.1の効果を
阻害しなかった。以上を総合すると、これらのデータ
は、Ｂリンパ腫細胞系（RAMOS・266）が、D1.1で活性化
された後にCD23を発現する細胞機構を有しており、また
D1.1とRAMOS・266との相互作用がmAb・5c8によって阻害
されることを示している。これらのデータは更に、D1.1
とRAMOS・266との相互作用が、同質のリンパ腫細胞系に
おける接触依存性Ｔ−Ｂ信号をさらに詳しく調べるため
の有力なモデル系になり得ることを示している。
この研究における我々の最終的な興味は、リンパ系Ｂ
細胞の分化におけるＴ−BAMの役割を定義することであ
ったので、次に、リンパ系器官から単離したＢ細胞に対
するD1.1の効果を研究した。従って、前述したのと同じ
ような実験において、mAb・5c8及びコントロール抗体の
存在下および非存在下で、リンパ系器官から単離したＢ
細胞をD1.1と共に培養した。末梢Ｂ細胞およびリンパ腫
クローン（RAMOS・266）に対するD1.1の効果と同様に、
扁桃腺由来のＢ細胞（図13）も脾臓由来のＢ細胞（示し
ていない）も、D1.1細胞によって活性化されてCD23分子
を発現することが分かった。さらに、D1.1細胞のリンパ
腫Ｂ細胞に対する効果は、mAb・5c8によって阻害される
が、コントロールmAbによっては阻害されない（図1
3）。これらのデータは、D1.1細胞とRAMOS・266の分子
的相互作用が、リンパ系器官内のＴ細胞とＢ細胞の相互
作用に類似していることを示している。
Ｂ細胞に対するD1.1の増強効果は、分泌因子とは関係
ないことが以前に示された。D1.1細胞がどのようにして
RAMOS・266を活性化するのかを調べるために、次の一連
の実験では、リンホカインの放出（特にIL−４の役割）
に関連した、RAMOSに対するD1.1の効果を研究した。こ
れらの実験において、RAMOS・266はD1.1の上清液、D1.1
細胞、rIL−２またはIL−４のいずれかと共に培養さ
れ、18時間後に表面CD23の発現のレベルをFACSで測定し
た。図14aに示したように、D1.1細胞またはIL−４は、R
AMOS・266と末梢Ｂ細胞上にCD23を誘起した。対照的
に、D1.1上清液またはrIL−２は効果がなかった（図14
a）。更に、rIL−４の効果は抗IL−４によって阻害され
たが、D1.1の効果は阻害されなかった（図14a）。最後
に、mAb・5c8は、rIL−４の効果を阻害しなかった（図1
4a）。以上を総合すると、これらのデータによって、D
1.1のRAMOS・266に対する効果はリンホカインの放出と
関係ないことが示唆され、D1.1は活性IL−４を分泌しな
いという以前の見解が確認された（図14a）。
Ｔ−BAMの誘発に関連するＢ細胞の表面分子の同定： 接触依存性Ｔ−Ｂ相互作用に役割を果しているＢ細胞
表面分子を同定するために、D1.1−RAMOS・266系を活用
した。我々は、特徴のあるＢ細胞表面分子のうちで、CD
40、CR2および接着受容対が接触依存性信号に役割を果
たしている候補物質であると考えた。その理由は、これ
らがＢ細胞活性化（特に接触依存性相互作用）において
役割を果していることが知られているからである（Banc
hereau,et al.,1991a;Nemerow,et al.,1985;Carter,et
al.,1988;Tohma,et al.,1991a;Tohma,et al.,1991b;Emi
lie,et al.,1988;Sen,et al.,1992）。それゆえ、我々
は、D1.1に媒介されたRAMOS・266および末梢Ｂ細胞の活
性化に対する、これらのＢ細胞分子に向けられたmAbの
効果について研究した。これらの実験において、D1.1細
胞は、Ｂ細胞表面分子と反応するmAbの存在下におい
て、RAMOS・266または末梢Ｂ細胞と共に培養され、18時
間後にRAMOS・266またはＢ細胞のCD23の発現を測定し
た。これらの実験における陽性コントロースとして、mA
b・5c8が用いられた（図12）。重要なことに、抗CD40・
mAbであるG28−５（Clark,et al.,1986）は、D1.1に媒
介されるRAMOS・266またはＢ細胞の活性化を阻害した
（図12、14b）が、CR2、LFA−１、LFA−３およびICAM−
１に対するmAbはほとんど効果がなかった（図12、14
b）。G28−５（IgG1）に加えて、抗CD40・mAbであるＢ
−B20（IgG1）もまた、D1.1効果を阻害した（図15）。
これらの実験では、Ｂ細胞およびRAMOS・266の両方の表
面と反応する抗LFA1a・mAbであるTS1/22（IgG1）を、イ
ソタイプ適合性の陰性コントロールとして使用した（図
14b,15）。同様の実験において、我々は、抗CD40がリン
パ系器官から単離したＢ細胞に対するD1.1の効果を阻害
することを発見した（図13）。以上を総合すると、これ
らのデータは、D1.1に媒介されるＢ細胞CD23の上方調節
を阻害するという点において、抗CD40・mAbが調査した
抗Ｂ細胞抗体のうちで特にユニークであることを示して
いる。
抗CD40・mAbは、rIL−４に誘起されたＢ細胞のCD23発
現を増大することが知られている（Clark,et al.1989）
ので、抗CD40・mAbがCD23の発現を阻害するというのは
幾分驚きである。従って、この結果を再び検討すること
によって、G28−５がD1.1に誘起されるCD23の発現を阻
害する効果をもつのとは対照的に、G28−５は、rIL−４
に誘起されるＢ細胞およびRAMOS・266の指示クローンの
両方に対して、CD23の上方調節を強化することが分かっ
た（図14a）。以上のデータを総合すると、抗CD40・mAb
はＢ細胞に対するD1.1の効果を阻害するが、これらのmA
bのＢ細胞に対する効果は、活性化の全般的な阻害では
ないことが示される。何故なら、抗CD40はrIL−４効果
を増大するからである。
抗CD40が如何にして接触介助相互作用を阻害し、他の
Ｂ細胞活性化信号を増大するかは、現在のところ分かっ
ていない。一つの可能性は、D1.1がCD40と相互作用する
表面分子を発現することである。我々は、D1.1の表面分
子がCD40と相互作用してＢ細胞を刺激するならば、多量
体の立体配置（multimeric configuration）の抗CD40抗
体はD1.1の効果に似ているだろうし、またＢ細胞のCD23
を上方調節するだろうと推測した。従って、FcgR IIを
発現しているＬ細胞の存在下において、RAMOS・266とＢ
細胞CD23に対するG28−５の効果を研究した。なお、Fcg
R II発現Ｌ細胞は、末梢Ｂ細胞の増殖を誘起する立体配
置になっている（Banchereau,et al.,1991a）。従って
我々は、Ｂ細胞を、G28−５、Ｂ−B20またはコントロー
ルmAbの存在下において、FcgR II発現Ｌ細胞またはコン
トロールＬ細胞と共に培養し、18時間後にＢ細胞のCD23
発現を調べた。多価の抗CD40は、扁桃腺および脾臓のＢ
細胞（図16b）と同様に、末梢Ｂ細胞およびRAMOS（図16
a）のCD23発現を誘起したが、単価のものは誘起しなか
った。以上を総合すると、これらのデータは、多量体の
抗CD40・mAbがＢ細胞を活性化してCD23を発現すること
を示している。また、D1.1系における抗CD40・mAbの阻
害効果は、単価の抗CD40・mAbが、D1.1の表面の架橋リ
ガンドとCD40分子との相互作用を阻害した結果であろう
ことを示唆する。
Ｔ−Ｂ相互作用に含まれるリンパ系組織の領域におけ
る、Ｔ−BAMの発現： CD4＋Ｔ細胞は、卵胞や胚中心と呼ばれるリンパ系組
織内において、一時的に抗原が誘起された構造でヘルパ
ー機能を媒介するので、リンパ瀘胞内でＴ細胞上にＴ−
BAMが発現しているかを調べるために、Ｔ−BAMの組織分
布が免疫組織化学によって研究された。正常なヒト組織
から調製された凍結組織切片をアセトンで固定し、mAb
・5c8および種々のコントロールmAbを用いて免疫組織化
学的に染色した。Ｔ−BAMの発現は、リンパ組織内の比
較的小さい単核細胞に限定されており（図16）、筋肉、
脳、腎臓、腸、卵巣、子宮、睾丸、皮膚、肺、または肝
臓を含む他の組織には見られなかった（材料と方法の項
を参照のこと）。
リンパ系組織におけるＴ−BAMをもった細胞の正確な
位置を知るために、扁桃腺、リンパ節、GI関連リンパ系
組織、脾臓および胸腺を分析した。Ｔ−BAM発現細胞
は、全ての末梢リンパ組織の二次瀘胞の外套ゾーンと胚
中心明領域に優先的に局在化しており、その局在パター
ンはこれらの部位におけるCD4＋Ｔリンパ球の分布と非
常に類似している（図17）。扁桃腺においては、mAb・5
c8及び抗CD4または抗CD8の何れかを用いた２色免疫組織
化学分析によって、Ｔ−BAM発現がCD3＋CD4＋Ｔリンパ
球に限られおり、CD8＋Ｔ細胞には見られないことが示
された（図示せず）。更に、二重染色によって、二次瀘
胞内のCD4＋Ｔリンパ球の大部分（50％以上）はＴ−BAM
を発現していることが示唆された。
インビトロのデータは、Ｔ−BAMおよびCD40の両方が
接触依存性相互作用に関係していることを示しているの
で、我々は、Ｔ−BAMとCD40発現細胞とのインビボでの
関係を研究することに興味を持った。単色および二色免
疫組織化学分析において抗CD40・mAbを用いることによ
り、Ｂ細胞と瀘胞樹状細胞がCD40を強く発現するとの公
知の所見が確認された（Clark.,et al.,1986;Hart,et a
l.,1988）（データは省略する）。Ｔ−BAM発現Ｔ細胞は
多くのCD40＋Ｂ細胞に囲まれているので、我々は、Ｔ−
BAM発現Ｔ細胞と瀘胞樹状細胞との関係を測定すること
ができなかった（Ｂ細胞濃度が高いからである）。瀘胞
胚中心内のＴ−BAM発現細胞と樹状細胞との関係を正確
に決定するために、mAb・5c8および瀘胞樹状細胞を認識
することが知られている抗CD11c・mAbを使って、二色免
疫組織化学分析をおこなった。この方法を使用すること
により、Ｔ−BAM細胞は屡々、瀘胞樹状細胞および／ま
たはその細胞質突起の近くに存在するか、またはこれら
に直接接していることが示された。これは多分、Ｔ−BA
M発現Ｔ細胞はCD40＋Ｂ細胞との相互作用に加えて、CD4
0を発現している瀘胞樹状細胞と相互作用しているであ
ろうことを示している（データは省略する）。
Ｔ−BAM発現細胞が瀘胞内において明瞭に局在してい
たことに加えて、比較的少ない（１％未満）Ｔ−BAM発
現細胞が、末梢リンパ組織の瀘胞間領域、脾臓のＴ細胞
部位および正常な胸腺皮質においても同定され得た。胸
腺においては、CD4発現細胞が多く存在するのに、Ｔ−B
AM発現Ｔ細胞がほとんど無いことは興味深い。以上を総
合すると、インビトロの機能的データ、並びにＴ−BAM
保有細胞がＴ−Ｂ相互作用に関連した生理学的に解剖学
的部位に局在することは、Ｔ−BAMがインビボでのＴ細
胞補助において重要であるという考えを強く支持してい
る。
考察 特異的な抗体反応をもたらすＴ細胞とＢ細胞との間の
相互作用は、Ｔヘルパー機能のエフェクター相における
重要な接触依存性相互作用を含んでいる。最近になっ
て、CD4＋Ｔ細胞に限定された表面活性化蛋白質、即ち
Ｔ−BAMはＢ細胞への接触依存性ヘルパー信号の構成物
であることが示された（Lederman,et al.,1992）。Ｔ−
Ｂ接触依存性信号を媒介する分子的相互作用は、Ｔ−BA
M発現細胞系（D1.1）およびＴ−BAMに媒介されるＢ細胞
活性化を阻害する抗Ｔ−BAM・mAb（5c8）を用いること
によって、更に研究された（Lederman,et al,1992）。
この第二系列の実験においては次のことが示された。即
ち、１）末梢血液からのＢ細胞に加えて、リンパ系のＢ
細胞およびＢリンパ腫クローン（RAMOS・266）が、抗Ｔ
−BAM（mAb・5c8）に阻害されるような態様で、D1.1細
胞接触に対して反応すること;2）CD40は、Ｔ−BAMと共
に、接触依存性Ｔ−Ｂ活性化の媒介に関係しているＢ細
胞の表面構造であること;3）Ｔ−BAMは、主に、インビ
ボのリンパ節の外套と細胞質の中心部分（これらはＴ細
胞がCD40発現Ｂ細胞と相互作用する解剖学的な部位であ
る）に多く存在するＴ細胞によって発現されることであ
る。これらデータによって、Ｔ−BAMは、リンパ節Ｂ細
胞の分化の過程でＴ細胞からＢ細胞に送られる関連信号
であり得るとの考えを強く支持している。
更に、Ｔ−BAMリガンドを発現していると思われるRAM
OS・266が入手可能であることは、接触依存性ヘルパー
信号に役割を果たしている他のＢ細胞表面構造の抗体、
並びにＴ依存性Ｂ細胞分化を媒介する分子メッセンジャ
ーを生化学的に特徴づける抗体を、作製およびスクリー
ニングする際に有用であろう。
この研究においては、D1.1−RAMOS・266系を使用する
ことにより、接触依存性の補助におけるＢ細胞表面分子
の役割が分析された。我々は、抗CD40・mAbであるG28−
５およびＢ−20が、何れも末梢血液とリンパ系器官から
得られたRAMOS・266およびＢ細胞に対するD1.1細胞の効
果を阻害するのことを観察した。対照的に、CR2、LFA
1、LFA3、ICAM−１に対するmAbは、Ｂ細胞に対するD1.1
の効果を阻害しなかった。これらのデータは、Ｔ−Ｂ細
胞接触と同時に起こり且つこれと強く関連しているＴ細
胞信号の受容における、CD40の正確な役割を示してい
る。しかしながら、我々の系は、Ｔ−Ｂ相互作用におけ
る、LFA1及びICAM−１の正しい役割を示していない。mA
b・抗ICAM−１（RR1/1.1.1.）は、D1.1が媒介するRAMOS
・266またはＢ細胞の活性化を阻害しないが、このmAb
は、活性Ｔ細胞を固定することによって部分的に接触依
存性Ｂ細胞増殖を阻害することが知られている（Tohma,
et al.,1991a）。我々が述べてきたＴ−BAM、並びにCD4
0依存性相互作用は、その後に引き続いて起こるLFA1−I
CAM相互作用に依存した相互作用を誘起し得ると推測し
たい。何故なら、抗CD40が引き金となって、LFA1−ICAM
−１の相互作用に依存したＴ−Ｂ接着が刺激されること
が知られているからである（Barett,et al.,1991）。
D1.1の引き金に対する抗CD40・mAbの阻害効果は、そ
れらがrIL−４に誘起されるCD23の発現を強める効果を
有することとは対照的である。これらのデータは、抗CD
40mAbによるD1.1効果の阻害が、Ｂ細胞の反応の一般的
な阻害の結果ではないことを示している。加えて、抗CD
40・mAbであるG28.5およびＢ−B20は、Fcrg II＋のＬ細
胞の表面上にクロスリンクした形で存在しているとき
に、RAMOS・266並びに末梢およびリンパ節Ｂ細胞上のCD
23発現を誘起した。以上を総合すると、これらの研究
は、多価の抗CD40がD1.1細胞の効果と同じ効果を有し得
ることを示しており、またCD40のリガンドはD1.1の表面
構造であり得るとの考えと一致している。
D1.1系におけるmAb・5c8と抗CD40・mAbの阻害効果
は、インビボのリンパ節の中で、Ｔ細胞が送るＢ細胞の
接触依存性信号に、Ｔ−BAMとCD40の両方が、役割を果
たしていることを示唆している。生理学的なＴ−Ｂ相互
作用におけるＴ−BAMの役割を調べるために、インビボ
でのＴ−BAMの発現を免疫組織化学的に研究した。リン
パ系組織の中で、Ｔ−BAM発現は、CD4＋Ｔリンパ球に限
られていた。これらのデータは、インビトロと同様にイ
ンビボでも、Ｔ−BAM発現がCD4＋Ｔ細胞に限定されてお
り、CD8＋Ｔ細胞には発現しないことを示している。以
上を総合すると、これらのデータは、CD4＋Ｔ細胞ポピ
ュレーション及びCD8＋Ｔ細胞ポピュレーションが、CD4
及びCD8の発現だけでなく、少なくとも一つの別の分子
（Ｔ−BAM）の発現に関しても異なっている別個のＴ細
胞系であることを示唆している。また、CD4＋細胞のＴ
−BAM発現がCD4＋細胞に限定されていることは、ヘルパ
ー機能がCD4＋細胞に限定されることの分子根拠である
ことを示唆している。
Ｔ−BAMは、CD4＋Ｔ細胞に限定されていることに加え
て、インビボのリンパ系器官において、その発現がＴ細
胞に限られている点で、今までにわかっているヒト表面
Ｔ細胞活性化分子の中でも独特であると思われる。ラッ
トにおいては、インビトロでの活性化の後に、OX−40と
いう分子量50キロダルトンの蛋白質だけがCD4＋Ｔ細胞
によって発現されるが、報告された脾臓内でのOX−40の
発現様式（Paterson,et al.,1987）は、我々が観察した
外套と細胞中心部分でのＴ−BAMの発現とは異なってい
るように思える。しかし、これらの分子の関係（もし存
在するとすれば）を理解するには、両者の種において、
これらの構造の関連した相同性を同定することが必要に
なるだろう。以上を総合すると、インビトロの機能的デ
ータおよび免疫組織化学的分析は、Ｔ−BAM発現CD4＋Ｔ
細胞が、リンパ節の胚中心で生じていることが分かって
いるヘルパー機能に関係していることを示唆している。
この研究によって提供された新しいデータは、Ｔ細胞
がリンパ瀘胞Ｂ細胞分化の過程で果たしている役割を解
明するための助けとなるだろう（Liu,et al.,1992;Noss
al,1992で再検討されている）。リンパ瀘胞において、
抗原に刺激されたＢリンパ球は、胚中心のセントロブラ
スティック（暗）ゾーン（centroblastic（dark）zon
e）内で急激な細胞増殖と体細胞分裂をおこす。その
後、セントロブラスティックＢ細胞は、セントロサイテ
ィック（明）ゾーンに入る。ここで、Ｂ細胞は、その抗
原レセプターの親和性に基づいて、生きるべきか死ぬべ
き（アポプトーシス）かをＴ細胞によって選択される。
次いで、肯定的に選択されたＢ細胞はＴ細胞に指令され
て、記憶Ｂ細胞か又は抗体産生プラズマ細胞に分化され
る。抗体産生プラズマ細胞は、ある場合には更に、機能
的に異なる免疫グロブリンのイソタイプを作るために遺
伝子を再配列される。従って、Ｂ細胞の分化を指示する
信号は完全には分からないが、リンパ節でのＢ細胞の分
化において、Ｔ細胞は少なくとも３つの異なる決定に関
与すると思われる。その３つとは、生きるか死ぬか；記
憶系かプラズマ細胞系；および抗体のイソタイプの選択
である。セントロサイティックゾーン内のＴ細胞がＴ−
BAMを発現するとの観察は、一定のこれら決定に関し
て、Ｂ細胞の運命の決定においてＴ−BAMが役割を果た
し得ることを示唆している。今後の研究は、リンパ節Ｂ
細胞分化におけるこれらＴ細胞依存性の過程において、
Ｔ−BAMが果たす具体的な役割に向けられるであろう。
抗CD40mAbが、D1.1細胞とのＴ細胞接触に媒介された
周到な相互作用を阻害するという結果によって、同様な
CD40依存性の相互作用が、既に報告されているもっと複
雑な生理学的反応に対する抗CD40の幾つかの効果の基礎
であり得ることが示唆される。抗CD40（G28−５）は、
培養された胚中心Ｂ細胞のプログラムされた細胞死（ア
ポップトーシス）を強力に阻害する（Liu,et al.,198
9）。更に、G28−５は、溶解性のrCD23及びIL−1aによ
ってインビトロで誘起される、形質芽球およびスイッチ
された胚中心Ｂ細胞の生成を阻害する（Liu,et al.,199
1）。これらCD40に依存した現象におけるＴ細胞接触の
役割は、現在のところわかっていないが、ここに提示し
たデータは、CD40がＴ−Ｂ接触相互作用において特殊な
役割を果たしており、またCD40リガンドを同定する手段
およびCD40の信号機能をより正確に定義する手段を提供
することを示している。
これらの研究によって、Ｔ−Ｂの相互反応におけるＴ
−BAMのＴ細胞に対する重要な役割、およびCD40のＢ細
胞に対する重要な役割が同定されたから、これら分子の
可能な関係について探求することが適切である。我々は
このデータを説明できる２つのモデルを提案する。Ｔ−
BAMが直接CD40と反応するという仮定は、全てのデータ
を説明する最も簡単なモデルである（図７、モデル＃
１）。しかしながら、Ｔ−BAMとCD40との相互作用を示
すはっきりした生化学的結合のデータがないので、Ｔ−
BAMおよびCD40が異なるリガンドと相互作用するとい
う、他の可能性に目を向けることが大切である（図７、
モデル＃２）。もし、Ｔ−BAMおよびCD40が異なるリガ
ンドと相互作用するとしたら、上記の機能的データは、
CD40−Ｘ相互作用およびＴ−BAM−Ｙ相互作用の両方が
Ｂ細胞CD23誘起のために必要であるが、これで十分では
ないことを示唆する。
Ｔ−BAMの“カウンターレセプター”（“X"）とCD40
のカウンターレセプター（“Y"）とは夫々、Ｂ細胞とＴ
細胞の表面分子であるらしいが（図７、モデル＃2.a）
が、我々のデータによれば、CD40はＢ細胞が分泌（自己
分泌）する因子のレセプターである可能性を除外できな
い（図７、モデル2b）。CD40は、以前はサイトカインレ
セプターであると考えられたが、NGFレセプター（Stame
nkovic,et al.,1989;Clark,1990）との構造的同質性に
基づけば、これがヘルパー機能に関与するＴ細胞表面タ
ンパクのカウンターレセプターであるとの可能性は、Fo
Rg II＋のＬ細胞にクロスリンクした抗CD40・mAbと、D
1.1細胞の表面を活性化する性質とがによく似ていると
いう事実と合致する。
Ｂ細胞に加えて、瀘胞樹状細胞がCD40を発現してお
り、我々は、瀘胞樹状細胞ときわめて接近し且つ恐らく
これと関係していると思われる、Ｔ−BAM発現Ｔ細胞を
発見した。Ｔ細胞とCD40との相互作用は、Ｔ細胞の瀘胞
樹状細胞との機能的な相互作用において重要かもしれな
い。なお、瀘胞樹状細胞はリンパ節での抗原のプロセッ
シングに役割を果たしていることが知られている（Gra
y,et al.,1988;Askonas,et al.,1972;Gray,et al.,199
1）。更に、CD4＋Ｔ細胞とCD40＋瀘胞樹状細胞との相互
作用は、AIDSにおける特別な病原性の重要性を有してい
るかもしれない。AIDSにおいて、瀘胞樹状細胞はHIVの
貯蔵場所となっている（Spiegel,et al.,1992）。
もし、モデル＃２が正しくて、Ｔ−BAMがCD40以外の
リガンドと相互作用するならば、Ｔ−BAMはCD40を発現
しない細胞に対して信号を与える役割を果たしているで
あろう。この点に関して、CD4＋のＴ細胞は他のＴ細胞
（CD4＋及びCD8＋）と相互作用し、細胞毒性の誘導（Be
nnick,et al.,1978;Ashman,et al.,1979;Kast,et al.,1
986;Zinkernagle,et al.,1978;Leist,et al.,1989）、
並びに抑制（Thomas,et al.,1980;Thomas,et al.,198
2）を媒介する。更に、CD4＋Ｔ細胞はマクロファージと
相互作用して、活性化信号を媒介する（Zimecki,et a
l.,1988;Zimecki et al.,1989;Weaer,et al.,1989;Wasi
k,et al.,1988;Fau,et al.,1990;Fau,et al.,1988）。
将来の研究の重要なゴールは、Ｔ−BAMが他の細胞の活
性化に関係しているか否か、或いは他の、おそらく関連
のある分子がそういった役割を果たすか否かを決定する
ことである。
実験の第３シリーズ モノクローナル抗体5c8の前臨床実験;T−BAMに対して向
けられたネズミモノクローナル抗体 実験の全体の目的は、炎症および腫瘍疾患の診断と治
療に於ける新規モノクローナル抗体（mAb）の有用性を
評価することである。これらの実験の中心は、最近産生
され特徴付けられた5c8の呼ばれるネズミmAbで、活性化
されたヒトCD4＋Ｔヘルパーリンパ球細胞上に存在する
新規表面タンパク（Ｔ−BAM）を認識する。
重要なことに、mAb 5c8はCD4＋Ｔ細胞のエフェクタ
ー機能を阻止し、それはＢ細胞が特異的抗体を産生する
先駆けとなる過程を含んでいる。健常人組織中では、Ｔ
−BAMはリンパ組織中の胚中心と呼ばれる、一次的に抗
原誘導される構造中に存在するCD4＋Ｔ細胞上で独占的
に発現される。しかしながら、種々の感染症疾患由来組
織での予備実験により、Ｔ−BAMは疾患組織に浸潤して
いるCD4＋Ｔリンパ球細胞によって発現されることが示
されている。現在まで、Ｔ−BAMを発現しているCD4＋Ｔ
細胞の浸潤は、リュアマチ様および変形性関節症に冒さ
れた関節組織中に、そして、乾せん、接触皮膚炎、およ
び高IgE症候群に冒された皮膚中で観察された。Ｔ−BAM
はインビトロでCD4＋Ｔ細胞エフェクター機能の重要な
役割を果たしていると思われるため、インビボでの感染
部位でのＴ−BAM発現CD4＋Ｔ細胞の存在は、Ｔ−BAMが
これらの疾患の免疫性の病理発生に参画しているかもし
れないということを示唆している。抗Ｔ−BAM mAb 5c
8を得たことにより、Ｔ−BAMを持っているCD4＋Ｔ細
胞、あるいはＴ−BAM分子それ自体がこれらの仮定で重
要な役割を果たしているか否かということを尋ねる機会
を与える。もしＴ−BAM＋CD4＋Ｔ細胞が特定の疾患で決
定的な役割をすることが発見されるとすると、Ｔ−BAM
＋CD4＋Ｔ細胞を溶解または中毒させるか、あるいは機
能を阻止するためにmAb 5c8を使用して、攻撃的で、病
原性のCD4＋Ｔ細胞を特異的に標的とすることが可能か
もしれない。さらに、Ｔ−BAM分子の変異発現は多くの
リンパ腫瘍で観察されており、mAb 5c8がリンパ腫瘍の
診断および治療に適用される可能性を示唆している。ま
とめると、これらの観察は炎症疾患およびリンパ腫瘍の
診断および治療におけるmAb 5c8の有用性を示唆してい
る。
次に示す範囲が探求あるいは評価される： 1.炎症、自己免疫、アレルギーおよび腫瘍疾患の患者か
らの冒された組織中でのＴ−BAM発現、およびＴ−BAM発
現は病気の範囲と関係しているか否かを決定すること。
2.炎症、自己免疫あるいはアレルギー疾患を持つ個体か
らの細胞を使用するインビトロ系でのリンパ機能に対す
るmAb 5c8の効果。
3.最終的にそのような動物で安全性試験と薬物動態実験
とを実施するために、ヒト以外の霊長類（ルサスマカク
ーrhesusmacaques）からのＴリンパ球機能に於けるmAb
5c8の効果。
4.炎症疾患および白血病／リンパ腫の臨床評価での診断
様式としての5c8 mAbの利用の可能性。
理論的根拠： CD4＋Ｔリンパ球細胞は炎症反応において中心的な役
割を果たしている、なぜならばCD4＋Ｔ細胞の活性化は
体液性（抗体が関与した）免疫反応と細胞毒性（キラ
ー）CD8＋Ｔ細胞反応の両方の生成に対して必要とされ
るからである。この重要な役割にふさわしく、CD4＋Ｔ
細胞は正常な免疫反応および幾つかの突発性炎症疾患に
於ける炎症反応の間、組織に最も早く浸潤している細胞
である。
組織中で炎症反応を支配することに加えて、CD4＋Ｔ
細胞は体液性の（抗体）関与した免疫反応の特異性およ
びエフェクター機能（アイソタイプISOTYPE）の両方を
支配する重要な役割（“ヘルパー機能”と呼ばれてい
る）を果たしている。ヘルパー機能はCD4＋Ｔ細胞によ
って媒介され、それはリンパ組織に移行し、胚中心と呼
ばれる一時的な構造の種を播き、抗原特異的（コグネイ
トCOGNATE）Ｂ細胞が集まってくる。リュウマチ様関節
炎および自己抗体産生によって特徴づけられた確定した
他の自己免疫疾患（全身性の狼そう）において、CD4＋
Ｔ細胞は自己抗体の産生に病原性の役割を果たしてい
る。アレルギーでは、CD4＋Ｔ細胞はIgE抗体の産生に重
要な役割を果たしており、従ってアレルギー状態の維持
に重要な役割を果たしている。
CD4＋Ｔ細胞は単一に分布した抗原レセプターを持っ
ており、Ｂ細胞およびマクロファージによって自己クラ
スII MHC分子上で提示される外来性の消化された抗原を
認識する。CD4＋Ｔ細胞クローンは“活性化”と呼ばれ
る変換をする事によって、その様な認識に対応する特異
的抗原/MHCクラスIIリガンドを認識し、それは幾つかの
表面分子の新たな発現およびリンフォカインの分泌を含
んでいる。
最近開発されたmAb 5c8と呼ばれるモノクローナル抗
体は、新規な30kDaの構造（5c8 AgあるいはＴ−BAMと
呼ばれる）が同定し、静止期ではなく活性化されたCD4
＋Ｔ細胞上で独占的に発現されるが、しかしCD8＋Ｔ細
胞によっては発現されない（イェリン、ら、1991;リー
ダーマン、ら1991）。重要なことに、Ｔ−BAMと相互作
用する性質によって、mAb 5c8は抗体を産生するＢ細胞
を誘導するCD4＋Ｔ細胞の能力を阻止することである
（リーダーマン、ら、1992）。それゆえに、インビボで
Ｔ−BAMはインビボでリンパ節のマントルおよびセント
ロシティックゾーンに優先的に存在するCD4＋Ｔ細胞に
よって主に発現されて、その部位は生理的にＴ細胞がＢ
細胞と相互作用する解剖学的部位である（リーダーマ
ン、ら、1992b）。5c8AgはCD4＋Ｔ細胞上の表面構造の
成分であり、Ｂリンパ球の接触依存性活性化を仲介する
という発見により、5c8Agを“Ｔ細胞−Ｂ細胞活性化分
子”（Ｔ−BAM）と改名することにした。Ｔ−BAMは活性
化されているCD4＋Ｔ細胞によってのみ発現されるとい
う事実により、mAb 5c8は炎症反応に関与するCD4＋Ｔ
細胞に対して特異的かもしれないということが示唆され
た。
従って、予備実験において、自己免疫および炎症疾患
患者からの炎症組織中における5c8Agの発現が調べられ
た。リュウマチ様関節炎ではＴ−BAM発現CD4＋Ｔ細胞は
リュウマチ滑液性関節パンヌスに局在し、周辺の炎症組
織中とこの状態を特徴付ける胚中心との両方に局在化さ
れていた。炎症性関節炎の症例では、Ｔ−BAM発現細胞
は浸潤している炎症細胞中で明確に一成分となっている
事が発見された。乾せん、アトピー性皮膚炎および高−
IgE症候群において、Ｔ−BAM発現Ｔ細胞は真皮中に浸潤
しているリンパ球中で顕著に存在した。炎症性疾患を持
つ個体からの標本とは対称的に、Ｔ−BAM発現細胞は正
常組織では初期のリンパ小節の外側には存在しなかっ
た。
Ｔ−BAM発現細胞は疾患組織に浸潤しており、そして
正常組織では一時的に再生している解剖学的構造に存在
するという発見により、mAb 5c8療法は治療に有用であ
るかもしれない、なぜならば1.）mAb 5c8は静止期の循
環しているＴ細胞に影響を与えずに病原性のあるＴリン
パ球を標的とするかもしれない、そして2.）5c8を持つ
Ｔ細胞の枯渇はＴ−BAM発現Ｔ細胞の持続的全身性の枯
渇には至らないであろう、なぜなら細胞の活性化された
プールは循環している静止期のプールによって補充され
るかもしれないからである。mAb 5c8療法が病原性のあ
るCD4＋Ｔ細胞を取り除くかあるいは免疫固定し、一時
的に免疫抑制状態の結果をもたらす（胚中心Ｔ細胞の枯
渇から）かもしれない可能性により、その様な治療は広
範囲に使用されている、あるいは開発中の既存の免疫抑
制剤を越えるほど重要な利益を持たらすかもしれない。
自己免疫疾患、突発性炎症疾患、およびアレルギー患
者治療に現在使用されている免疫抑制剤は、CD4＋Ｔ細
胞の機能を阻害する事によって一次的な治療効果を持
つ。しかし、サイクロスポリンＡ（サンヂムン）、アザ
トプリン（イムラン）およびサイクロフォスファミド
（サイトキサン）のような現存する療法は、CD4＋Ｔ細
胞機能を全体に渡って阻害し、その結果全身性の免疫抑
制となる。従って、その様な薬剤の限界のため、我々自
身を含む多くの研究室の目標は、特異的にCD4＋Ｔ細胞
に作用する薬剤を開発することである。例えば、臨床試
験はCD4＋Ｔ細胞の全身的な枯渇を媒介するCD4分子に対
して向けられたネズミモノクローナル抗体を使用してヨ
ーロッパおよびU.S.で実施されている。症例の大部分
は、CD4＋Ｔ細胞の欠乏は一時的なものであるが、しか
し、観察されている厄介な副作用は治療後に数か月、CD
4＋Ｔ細胞の枯渇が長く続く場合があることである。そ
の様なCD4＋細胞枯渇の臨床作用は観察されていないけ
れども、CD4＋Ｔ細胞の不在はAIDSに於ける主な病態生
理学的出来事である。まとめると、これらの考察によ
り、mAb 5c8、抗−Ｔ−BAMはすべてのリンパ球の活性
化を阻害する治療剤（例えば免疫抑制剤）あるいはすべ
てのCD4＋Ｔ細胞の活性を阻害するmAbs（例えば抗−CD4
mAbs）あるいは活性化されたＴ細胞を標的とする薬剤
（例えばIL−２のような活性化分子）をこえて、浸潤す
るCD4＋Ｔ細胞に媒介された疾患において、重要な治療
有利性を持つかもしれないということが示唆された。
その様な全身性の免疫抑制とは対称的に、多くの努力
が、特殊な民族の背景を持つ個体での特異的な病気に対
して開発された特殊な免疫学的治療法に向けられてい
る。特定のMHCクラスIIハプロタイプはリュウマチ様関
節炎およびインスリン依存型糖尿病に対する遺伝的感受
性が授けられることが知られている。これらの発見によ
り多くの研究者が、クラスII MHC分子および／あるいは
ペプチド抗原の関与を研究することによって、これらの
疾患に対する診断および治療の戦略を追求している。こ
の様に比較的均質の条件下においてさえも、結局は個々
の患者に対し独特な治療を工夫する必要があるかもしれ
ない。さらに、一般的なCD4＋Ｔ細胞−MHCクラスII/抗
原相互作用に起因すると推測される疾患とは対称的に、
乾せん、全身性狼そう、炎症性変形関節炎の様な幾つか
の重要な特発性炎症疾患は、まだMHCクラスIIハプロタ
イプとの関連があまり明確ではないが、初期のCD4＋Ｔ
細胞浸潤が重要な病原性の特徴であるという点で、RAや
糖尿病と共通している。抗−Ｔ−BAM療法のようなCD4＋
Ｔ細胞を標的とする治療戦略の追求に都合の良いこと
は、主として、炎症反応を調節するために適切なMHC分
子あるいは抗原を同定することは必要ではないという事
実のためである。さらに進んだ戦略は、mAb 5c8療法の
ように、疾患組織において活性化されたCD4＋Ｔ細胞を
主要に標的とする条件は、Ｔ細胞を除去あるいは機能調
節する目的で選択するために各々の個々の免疫系の認識
機能を利用しているかもしれない。これらの疑問を調べ
るために、次に示す実験を提案する： 方法：提案された研究目的は、広く種々にわたる免疫性
疾患を持つ患者から外科あるいは針生検を行ない臨床的
標本を得るという、研究者の能力に非常に依存してい
る。P.I.はその様な標本を得るための理想的な立場にあ
り、事実、我々の予備的研究はこの能力を示している。
P.I.は医学部のリュウマチ学部門のメンバーであり、そ
して研究者はプレスビテリアン病院にあるエドワードダ
ニール関節炎診療所で自己免疫疾患を持つ患者に対し精
力的に治療している。さらに、関節標本を我々に提供し
てくれる整形外科学部の何人かのメンバーと共同的な関
係が進行中である。従って、P.I.は、自己免疫疾患およ
び変型性関節炎を持つ個体からの末梢血液および関節組
織から得たリンパ球のインビトロ機能に対し、mAb 5c8
の評価を追求するのに適切な臨床標本を得るための良い
立場に置かれている。さらに、アレスサンドラペルニス
博士は、我々の研究チームの一員であり、かつアレルギ
ーと免疫部門の精力的な臨床医でもある。ペルニス博士
はアレルギー疾患を患う個体からの臨床標本を固定し、
提供することで我々を援助してくれることになってい
る。さらに、我々はレオナルド チェス博士の“人に於
ける免疫学研究”研究許可審議機構の研究者であり、そ
の様な個体からのリンパ球を得ることが許可されてい
る。さらに関節症疾患に於ける我々の研究は、皮膚学部
のジャネット リストスキー博士と関係しており、最
近、乾せんを研究する方法“乾せんおよび他の皮膚疾患
に於ける皮膚のＴリンパ球分析”の認可を得た。
1.疾患組織中のＴ−BAM発現の特徴付け 炎症、自己免疫およびアレルギー状態でのＴ−BAMの
役割をさらに分析するために、疾患組織の免疫組織学的
分析が、病気の状態および進行が種々の段階にあるリュ
ウマチおよび変型性関節炎および乾せんの追加症例患者
におけるスナップ凍結組織標本上のＴ−BAMの局在を研
究することが拡大されるだろう。さらに、これらの分析
は、全身性狼そう、アレルギー性喘息、糖尿病性膵
臓、、炎症性腸疾患および臓器移植の患者に拡大される
だろう。これらの分析は、Ｔ−BAM、CD4および様々な他
のリンパ球表面分子のような特殊な表面構造の発現パタ
ーンが、病気および病気の状態と互いに関係があるかど
うかを試みるだろう。
2.炎症、自己免疫およびアレルギー疾患を持つ個体から
の細胞を使用したリンパ球のインビトロ系に於けるmAb
5c8の作用の評価。
炎症疾患患者のＴ−BAM＋CD4＋Ｔ細胞浸潤組織が、こ
れらの疾患において重要な病態生理学的出来事を仲介す
る役割を果たしているか否かは現在のところ明らかでは
ない。特定の疾患はインビトロで研究できる病理学的免
疫学的活性を持っている。それゆえに、リュウマチ性関
節炎、全身性狼そう、アレルギー性喘息のようなアレル
ギー状態を持つ個体からの末梢血液および炎症組織のリ
ンパ球が単離されるだろう。インビトロ実験において
は、リュウマチ性関節炎のリュウマチ性因子（IgM抗−I
gG）、全身性狼そうの抗−DNA抗体産生、あるいはアレ
ルギーでのIgE産生をmAb 5c8が阻害するか否かを提案
するだろう。これらの実験において、末梢血液あるいは
損傷を受けた組織からのＴおよびＢ細胞が単離されて、
成長因子の存在下および5c8あるいはコントロールmAbs
の存在下で共培養されて、そしてび自己抗体あるいはIg
Eの産生が特殊なELISAによって測定されるだろう。
3.その様な動物での、最終的に安全性および薬物動態試
験を実施することを目的とする、ヒト以外の霊長類（rh
esus macaques）からのＴリンパ球の機能に於けるmAb
5c8の作用の評価 rhesusm macaquesリンパ球とmAb 5c8の相互作用は
研究されて（生殖生物学部のミッシェル フェリン博士
の方法にしたがって）そしてmAb 5c8はRhesus macaqu
esのＴ−BAM相同部分と相互作用することが発見され
た。将来的な実験は、rhesusはmAb 5c8の投薬のインビ
ボでの最終的な研究に対する適切な動物モデル可か否か
を決定するために、mAb 5c8はmacaquesからのCD4＋Ｔ
細胞の機能を阻害するかどうかを提示することだろう
（現在の計画には入っていない）rhesusリンパ球の機能
的研究とそれらの機能に於けるmAb 5c8の作用は、ヒト
リンパ球サブプピュレイションですでに実施した機能的
研究と密接に並立的に位置するだろう。
4.白血病／リンパ腫の臨床的評価に於ける診断様式とし
てのmAb 5c8の潜在的な使用を評価する。
病理学部のジオロジオ インギラム博士及びダニエル
ノウレス博士との共同研究において、白血病／リンパ腫
の100の以上の症例でのＴ−BAM発現が研究された。Ｔ細
胞リンパ腫の約30％がリンパ節の凍結切片中でＴ−BAM
を発現する。末梢血液中の白血病Ｔ細胞はその様な症例
においてＴ−BAMを発現するか否かは現在のところ知ら
れていない。従って、Ｔ−BAM発現が存在するか否か、
および末梢Ｔ−BAM発現はリンパ節Ｔ−BAM発現とどの様
な関係があるかを決定するために、白血病の症例の末梢
血液を実験する予定である。これらの実験は白血病を持
つ個体の評価において、mAb 5c8が有効な診断抗体であ
ることを示すだろう。さらに、これらの研究はその様な
腫瘍の治療においてmAb 5c8による治療試験を正当化す
るかもしれない。
将来の進展： 将来の研究は提案された予備的な前臨床探索の結果に
異存するだろう。免疫組織学的研究の結果により、病気
のあるセットに我々の注意を向けることになるだろう。
インビトロ実験はその様な病気のあるサブセットにおい
て臨床的な研究を正当化するだろう。結局、予備実験は
臨床試験の正当な理由となるので、ヒト以外の霊長類で
の動物実験を実施するだろう、なぜならば、mAb 5c8は
Rhesus macaqueの活性化されたＴ細胞上でＴ−BAM相同
部分と反応することが知られているからである（上記参
照）。動物実験はＴ−BAMを発現している細胞は一時的
に存在し、そしてＴ−BAMを発現している細胞は静止期
のＴ細胞の循環プールから再配置されるだろうという仮
説を試験すると共に、mAb 5c8の毒性および薬物動態様
式を決定するために考案されるだろう。この疑問はmAb
5c8処理の前後の正常動物のリンパ節針生検を免疫組
織学によって研究することにより明確に試験されるだろ
う。最終的には、インビボで阻害されている免疫反応で
の5c8の役割は、5c8処理を行った場合と行わない場合
で、および抗体の評価および実験動物の皮膚試験反応に
おいて、免疫された動物によって試験されるだろう。そ
の様な実験を実施するために、別のIRB認可を得る必要
があるだろう、なぜならば、我々の現在の方法中には提
示されていないからである。しかしながら、その様な認
可を得るためにはその様な研究に適した形態で5c8を得
ることが重要であろう、そしてその様な試薬を得るため
の費用は現在申し出ている予算の一部である。
これらの研究は、mAb 5c8の現在の形が（ネズミIgG2
a−ヒト補体結合）CD4＋Ｔ細胞機能の期待された特殊な
調節を得るためには最適ではないことを示しているかも
しれない。このことに関しては、補体結合機能および／
あるいは組織標的を決定する抗体のFc領域を変化させる
ためにmAb 5c8を遺伝的修飾することが必要となるかも
しれない。これにより、抗体のFc領域をヒトのFc領域に
入れ替えた形を得るか、あるいはヒト抗体に密接に類似
した結合部分を持つ抗体に変化させることができる。こ
の過程は基礎研究社がかなり経験を持っている“ヒュー
マニゼイション”と呼ばれる技術であり、ヒト抗体をCD
4分子のアミノ酸配列を含むものに劇的に変化させるこ
とも可能となっている（未発表）。抗体の機能的性質を
正常抗体の異なるエフェクター機能を持つものに変化さ
せることに加えて、mAb 5c8のFc領域に対して毒を遺伝
的に付着することが望ましいかもしれない、それは我々
が現在交渉している幾つかの会社によって利用されてい
る共通の方法である。
動物実験の成功的な終了に続いて、ヒトでのmAb 5c8
の安全生および薬物動態の性質を決定するためにヒトの
臨床第Ｉ相試験が行われるだろう。
第４シリーズの実験 Ｂ細胞に対する接触依存性ヘルパー機能を仲介するCD4
＋Ｔ細胞上の表面糖タンパクＴ−BAMをコードするcDNA
の単離:TNFアルファ遺伝子スーパーファミリーの新規メ
ンバー Ｔ−BAMは、Ｂ細胞分化および分泌に対する接触依存
性シグナルを仲介する、CD4＋Ｔ細胞上の活性化誘起表
面タンパクである。Ｔ−BAMは、表面Ｔ−BAMを構成的に
表現する機能的にユニークなジャーカット（Jurkat）サ
ブクローンD1.1上にＴ−BAMを結合するmAb 5c8によっ
て同定された。このシリーズの実験において、Ｔ−BAM
の構造が規定される。Ｔ−BAMタンパクをmAb 5c8を用
いたアフィニティークロマトグラフィーによりD1.1細胞
溶解産物から精製した。単離したＴ−BAMタンパクのNH2
末端アミノ酸配列を自動マイクロ配列決定法により決定
し、この配列を退化オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔ−
BAM.2）を設計するために用いた。アンチセンス配位に
おいて、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｔ−BAMを表
現するD1.1細胞から単離された2kB mRNAを認識した
が、Ｔ−BAMを表現しない対照の非ヘルパージャーカッ
ト細胞B2.7から単離されたmRNAを認識しなかった。NH2
末端配列は、関連機能のタイプIIネズミＴ細胞表面分子
CD40−Ｌのそれと関連していることが見い出された。D
1.1mRNAのRNA−PCRは、サイズおよび配列がネズミCD−4
0Lの対応する領域、すなわち分子の細胞質および膜の近
位部分をコードする領域と相同であるDNAの断片を増幅
した。約330bpであるこの断片をサブクローン化し、λg
t−11におけるD1.1cDNAライブラリーをプローブするた
めに用いた。1.8−2.2kB挿入物を含有する９種のクロー
ンを得た。
クローンの配列分析は、ネズミCD40−Ｌと相同性を有
するタイプII表面膜糖タンパク、すなわちIgE分泌を誘
発させる活性化ネズミＴ細胞上の分子を解明した。これ
らタンパクの両方は、広範種の免疫学的および他の機能
を有するサイトカインおよび細胞表面エフェクターを含
むTNFαスーパーファミリーのメンバーである。Ｔ−BAM
およびCD40−Ｌに加えて、少なくとも１つの他の関連分
子の存在がＴ−BAMプローブを用いたヒトDNAのサザン分
析により示唆される。これらは機能的に別のものである
が、Ｔ−BAMおよびCD40−Ｌは同族体である可能性がな
お存在し、その場合、Ｔ−BAMに関係する２つの新規分
子が存在することとなる。
導入 接触依存性シグナルの解明の進展は、休止末梢Ｂ細胞
を構成的に活性化するジャーカットＴ細胞白血病系D1.1
の機能的にユニークなサブクローンの最近の同定（イェ
リン（Yellin）ら、1991）により達成された。D1.1クロ
ーンは、休止Ｂ細胞を誘起して表面CD23分子を表現さ
せ、Ｂ細胞を増殖させ、Ｂ細胞のAb形成細胞への分化を
誘起するものであることが以前に示された（イェリン
ら、1991）。パラホルムアルデヒド固定化D1.1はＢ細胞
を活性化する能力を保持したが、D1.1上澄は不活性であ
ったので、D1.1のＢ細胞活性化能は細胞表面に局在化さ
れた（イェリンら、1991）。併せてこれらデータは、D
1.1が、接触依存性ヘルパー機能を仲介する活性化Ｔ細
胞と表面構造を共有することを示唆した。
前のシリーズの実験において、Ｔ−BAM（5c8 Ag）と
名付けたそのような１つの構造がD1.1と特異的に反応
し、D1.1によるＢ細胞の機能的活性化を阻害するmAbに
たいするハイブリドーマをスクリーニングすることによ
って同定された。mAbは、活性化CD4＋Ｔ細胞（CD8＋Ｔ
細胞、Ｂ細胞または単核細胞ではない）上に表現された
新規30kDa構造を同定した。PHAおよびPMA刺激後のＴ−B
AMの細胞表面表現の動態は、最大の表現が6h後に生じる
が24hによりベースライン（無）表現をもたらすダウン
レギュレーションが続いて生じるという点で比較的ユニ
ークである（レダーマン（Lederman）ら、1992）。機能
アッセイにおいて、抗Ｔ−BAM mAb 5c8は正常CD4＋Ｔ
細胞が抗体生成性細胞へのＢ細胞の分化を誘発する能力
を阻害する（レダーマンら、1992）。加えて、Ｔ−BaM
を表現するリンパ腫Ｔ細胞ジャーカットD1.1は、リンパ
器官からのＢ細胞、およびＢ細胞リンパ腫クローンRAMO
S266（シーゲル（Siegel）ら、1990）を、抗Ｔ−BAM（m
Ab 5c8）によって阻害され、われわれが末梢Ｂ細胞に
ついて以前に記述した効果と同様である様態で活性化す
る。インビボで、Ｔ−BAMは、Ｔ細胞のＢ細胞との相互
作用の解剖学的部位であるリンパ節の外套および中心細
胞領域において主に、Ｔ細胞によって表現される（レダ
ーマンら、1992）。併せてこれらデータは、Ｔ−BAMが
接触依存性ヘルパー機能を仲介するCD4＋Ｔ細胞上の表
面構造の一成分であることを立証している。
Ｂ細胞に対するＴ−BAM特異的効果は、CD40に対してm
Abによってブロックされることが見い出され、それほど
多くはない他のＢ細胞分子がリンパ組織における接触依
存性シグナルを受け取る上で役割をなしていると考えら
れている。ヒトＢ細胞表面上のCD40分子はリンパ節Ｂ細
胞分化に関連した興味のあるシグナル機能を有する（ク
ラーク（Clark）ら、1986;クラークら、1988;レッドベ
ター（Ledbetter）ら、1987;レッドベターら、1986）。
抗CD40（mAbG28−５（クラークら、1986））はプログラ
ムされた胚中心Ｂ細胞壊死（アポプトシス）を防止し
（リュー（Liu）ら、1989）、またヒトＢ細胞の増殖、
分化および長期成長を誘起することが示されている（バ
ンチャロー（Banchereau）ら、1991a;バンチャローら、
1991b）からである。CD23表現に対する抗CD40の効果がr
IL−４の最大下投与で相加的であることが見い出された
ので、Ｔ−BAM特異的ヘルプに対する抗CD40mAbの効果
は、Ｂ細胞の応答性の一般的な阻害からは生じなかっ
た。加えて、mAbないしCD40は、形質移入ネズミ線維芽
細胞の層上のFc受容体上に存在したとき、D1.1の効果を
模倣するようであった。併せてこれら知見は、Ｔ−BAM
およびCD40が、おそらく受容体−反受容体（counter−a
nti−counter）関係で、相互に作用しあっているかも知
れないという考えと一致した。
続いて、CD40分子に対するネズミリガンドは、キメラ
ヒトCD40−Ig鎖分子を用いたネズミcDNAライブラリーの
表現クローン化により同定されている。CD40−LcDNA
は、33kDaタイプ−II表面膜タンパクをコードする（ア
ーミテージ（Armitage）ら、1992）。初めは新規遺伝子
として報告されたが、われわれの研究室による後の分析
（発表せず）および著者らによる後の分析（ファラー
（Farrah）ら、1992）によりCD40−Ｌはtnfαと関係し
ていることが明らかにされた。CD40−Ｌがtnfαと相同
であるという考えは、それらの受容体tnfαR IおよびII
がCD40に関連していれば、興味のあるものである。CD40
−ＬのCD40との結合相互作用は、Ｔ−BAMをCD40特異的
シグナリングと結び付ける機能的証拠と考え併せると、
Ｔ−BAMとCD40−Ｌとは関連する分子でありえることを
示唆している。さらに、CD40−ＬとＴ−BAMとの関連性
は、Ｂ細胞トリガリングにおけるそれらの関連する機能
と、それらの類似する見かけの分子量の双方により示唆
される。しかしながら、CD40−ＬのＴ−BAMとの正確な
関係は、未知のままである。
それ故、このシリーズの実験では、Ｔ−BAMの構造を
調べ、PCR断片と部分cDNAを単離し、これらがCD40−Ｌ
との有意の相同をもってタイプII表面膜タンパクをコー
ドすることを見い出した（アーミテージら、1992）。機
能的証拠はＴ−BAMとCD40−Ｌとは異なるものであるこ
とを示唆しているが、Ｔ−BAMがCD40−Ｌのヒト同族体
であるという可能性がなお存在する。Ｔ−BAMおよびCD4
0−Ｌに加えて、このファミリーの少なくとも他の関連
メンバーの存在は、Ｔ−BAMを用いたヒトゲノミックDNA
のサザンブロット分析により示唆される。Ｔ−BAMとCD4
0−Ｌが相同であることが見い出された場合は、サザン
データは、そのような形態の他の２つのメンバーが存在
し得ることを示唆する。構造の情報は、Ｔ−ヘルパー機
能のいくつかの分子的姿に光を当てるものであり、Ｔ細
胞上の少なくとも２つの分子がCD40細胞を経由するシグ
ナリングを含む相互作用において異なるＢ細胞応答を指
向させると言うことを示唆している。
材料および方法 細胞系。ジャーカットクローンD1.1およびB2.7は、記述
されている（イェリンら、1991;レダーマンら、199
2）。
Ｔ−BAMペプチドの単離 精製Ｔ−BAMタンパクを得るために、ジャーカットD1.
1細胞を、「細胞工場」（NUNC）と10個のフラスコ（600
mlフラスコ）の双方において、10％ウシ胎児血清（ハイ
クローン（Hyclone））中のイスコブ（Iscove）の変性
ダルベッコ培地（ギブコ（Gibco））において成長させ
た。これら培養は、併せて14×109個の細胞を得た。細
胞ペレットを氷冷分解緩衝液（１％NP40、13mMトリス、
15mM NaCl、10μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオ
リド（PMSF）、5mM EDTA、10μg/mlヨードアセトアミ
ド（IAA））125ml中で分解した。溶解産物を渦動処理に
供し、回転シェーカーで１時間混合し、7000rpmで20分
間遠心して不溶物をペレット化した。溶解産物の上澄を
順次0.45および0.2mフィルター（ナルジーン（Nalgen
e）を通してろ過した。ろ過した溶解産物（80ml）を0.1
M重炭酸塩緩衝液（0.5M NaCl、pH8.3）で1:1で希釈し
た後、アフィニティークロマトグラフィーに供した。
アフィニティークロマトグラフィーによるＴ−BAMの精
製 mAb 5c8およびOKT4をタンパクＧカラム（ファルマシ
ア（Pharmacia））で精製した。各mAb当り0.142グラム
のCNBr活性化スファロース4Bビーズ（ファルマシア、ア
ップサラ、スウェーデン）とともに結合用緩衝液（0.25
M重炭酸塩緩衝液、0.5M NaCl、pH8.75）中でmAb（3.88
mg/2mlの5c8、および3.0mg/1.5mlのOKT4）をインキュベ
ートすることにより、精製されたmAbはビーズに共有結
合された。mAb溶液を室温で３時間ビーズと反応させ、
0.3Mトリス中pH8.0で３時間クエンチングした。mAbで被
覆されたビーズを用いて短いカラム（シュライチャーお
よびシュエル）中で0.5mlゲルを作り、結合用重炭酸塩
緩衝液および溶出緩衝液（アセテート緩衝液、0.5M Na
Cl、pH4.0）で交互に洗浄した。
Ｔ−BAMを精製するために、D1.1溶解産物を、5c8カラ
ムに通じる前に、OKT4カラムに通じて予備精製した。溶
解産物を両方のカラムに通じた後、mAbカラムを重炭酸
塩緩衝液200mlで洗浄してから、0.1Mアセテート、pH4.0
で溶出させ、15mlのポリプロピレン製のコニカルチュー
ブ（サースタット、プリンストン、NJ）中で0.5mlずつ
の分画を得た。各分画中のタンパクを−20゜のアセトン
5mlで一晩沈殿させた。ついで、沈殿物を3000Gでの遠心
により集め、空気乾燥した。
Ｔ−BAMペプチドのNH2末端配列決定 各カラム分画からのアセトンによる沈殿物を60mlのゲ
ル充填用緩衝液中に再懸濁させ（バイオラッドの指
示）、バイオラッド縦型電気泳動装置中の20cm12.5％SD
S−PAGEゲル上に充填し、約６時間100Vに供した後、バ
イオラッドトランスブロット装置においてCAPS緩衝液中
70ボルトで90分間プロブロット（Problott）PVDFペーパ
ー（アドバンスト・バイオシステムズ、シアトルWA）へ
移植した。移植は、予備染色したタンパク標準（低分子
量および高分子量標準（バイオラッド、ロックビルセン
ター、NY））を用いて最適化した。
移植後、タンパクバンドをコマジーブルー（comassie
blue）Ｒ−450で染色し、膜を空気乾燥した。Ｔ−BAM
の相対移動に対応する31KDバンド（p31K）を剃刀の刃で
切除し、コロンビア大学ハワード・ヒューズ・メディカ
ル・インスチチュート、プロテイン・コア・ファシリテ
ィのメアリー−アン・ガビノビッチ博士により、アプラ
イド・バイオシステムズ470A気相シーケンサー/120A P
THアナライザー上での20サイクルの配列決定に供した。
決定されたNH2末端配列は、（Ｍ）IE（Ｔ）YNQ（Ｑ）SP
（PXAAS）（SEQ IDNo.11）であった。
cDNAライブラリーの構成およびスクリーニング D1.1ポリA+RNAをFAST−TRACK（インビトロゲン（Invi
trogen）により単離し、ファルマシアのプロトコールに
よりストラテゲン（Strategene）（サンジエゴ、CA）か
らのλアームを用い、約４×106個の独立クローンを含
有するオリゴ−dT感作λ−gt11ライブラリーを生成し
た。
増幅されたライブラリーから、約１×106個のプラー
クをスクリーニングし、８個の独立クローンを同定し、
各プラークをYT1090（インビトロゲン、サンジエゴ、C
A）上での４回のクローン化により精製した。
オリゴ合成 コロンビア大学ハワード・ヒューズ・メディカル・イ
ンスチチュート、プロテイン・コア・ファシリティによ
りアプライド・バイオシステムズDNAシンセサイザーモ
デル380B上で以下のオリゴデオキシヌクレオチドが合成
された。
RNAポリメラーゼ連鎖反応 ５×108個のD1.1細胞からポリ−A+RNAを単離し、200
単位のモロニーネズミ白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵
素（ベセスダ・リサーチ・ラブズ（BRL（商品名））を
用い、50mMのトリス−HCl、pH8.3、75mMのKCl、3mMのMg
Cl2、10mMのDTTおよび20単位のRNAsin（ファルマシア
（商品名））を含有する緩衝液20ml中5pMのプライマーC
D40L（369−348）を含有する反応液において42℃で30分
間にわたる約1.0μｇの全RNAの転写によりcDNAを調製し
た。反応混合物を５分間95℃に熱して酵素を失活させ
た。第１の鎖を以下の条件下でPCRにより増幅した：初
めのテンプレート変性工程（94℃で８分）、ついで、55
℃での３分間（アニーリング）、2.5単位のDNATaq−ポ
リメラーゼ（パーキン−エルマーセタス、ニューウォー
ク、CT）、dATP、dCTP、TTPおよびdGTPそれぞれ200mM
（パーキン−エルマーセタス、およびPCR緩衝液（10mM
のトリス−HCl、pH8.3、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、0.0
01％のゼラチン）100ml最終容量中の50pMのプライマーC
D40L（11−31）およびCD40L（369−348））を用いた72
℃での２分間（変性）の30倍繰り返しサイクル。増幅
後、試料を、1.0％寒天ゲル上での電気泳動により分析
し、エチジウムブロミドで染色した。
サブクローニング EcoR5消化ブルースクリプト（プロメガ（Promega））
へのPCR生成物の鈍端結さつによりブルースクリプト/p
3.1を生成した。予め子ウシ腸ホスファターゼで処理し
たEcoR I消化ブルースクリプト11SK＋（プロメガ）への
λgt−11ファージDNAマキシプレプス（maxipreps）の一
晩のEcoR1消化の結さつによりブルースクリプト/p5−１
を生成した。ブルースクリプト中への結さつは、コンピ
テントE.Coli中へのT4DNAリガーゼを用いて行い、アン
ピシリン（25μg/ml）プレート上に成長させた。
λgt−11ライブラリーのスクリーニング PCR生成プローブをランダムヘキサマー法により放射
線標識し、λgt−11プラークをスクリーニングするため
に用いた。
DNA配列決定 DNA配列決定は、アプライド・バイオシステムズの自
動DNAシーケンサー上でコロンビア大学のコンプリヘン
シブ・キャンサー・センター・コア・ファシリティによ
り行われた。
293細胞の形質移入 形質移入の48時間前に、２×106個の293細胞を100mm
のペトリ皿上で平板培養する。形質移入の１時間前に、
細胞に新鮮な培地を供給する。１皿につき20mgのプラス
ミドDNAを用いてリン酸カルシウム沈殿物を調製する。
５％CO2中37℃で15時間後、細胞に新鮮な培地を供給す
る。形質移入の36時間後、細胞をトリプシン−EDTAでの
処理により収穫し、FACSにより調べる。
単一クローン性抗体。mAb5c8（IgG2a）似ついては、記
述されている（レダーマンら、1992）。mAb5cbは、記述
されている。mAbOKT4（抗CD4）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ロックビル、MD）から入
手できる。全てのmAbは、タンパクＡ（バイオラッド、
ロックビル・センター、NY）またはタンパクＧカラム上
で腹水から精製した。
結果 Ｔ−BAMは、Ｂ細胞分化およびIgG分泌のための接触依
存性シグナルを仲介する、CD4＋Ｔ細胞上の活性化誘起
表面タンパクである。Ｔ−BAMは、構成的にＴ−BAMを表
現する機能的にユニークなジャーカットサブクローンD
1.1上にＴ−BAMを結合するmAb5c8により同定された。
本報告では、Ｔ−BAMの構造は、タンパク化学によ
る、またＴ−BAMをコードするcDNAの単離による研究で
あった。
Ｔ−BAMタンパクは、D1.1細胞溶解産物からＴ−BAMを
親和精製するためにmAb5c8を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーにより精製された。単離されたＴ−BAM
タンパクのNH2末端アミノ酸配列は、自動マイクロ配列
決定法により決定され、この配列を退化オリゴヌクレオ
チドプローブ（Ｔ−BAM.2）を設計するために用いた。
アンチセンス配位において、末端標識退化オリゴヌクレ
オチドプローブは、Ｔ−BAM＋D1.1細胞からのノーザン
ブロットおよびコントロールＴ−BAM−ジャーカットB2.
7細胞系をプローブするために用いた。アンチセンスプ
ローブは、Ｔ−BAMを表現するD1.1細胞中で特異的にほ
ぼ2kB mRNA種と交雑したが、Ｔ−BAM−コントロール、
非ヘルパージョーカット細胞B2.7とはしなかった。
この時点で、ネズミCD40分子のためのリガンドの配列
が、アーミテージら（1992）により発表された。この分
子は、関連する機能を有し、また興味のあることに、非
常に相同のNH2末端配列を持っていたことに注目され
る。２つの配列を比較して以下に示す。
Ｔ−BAMのクローン化の初期の研究は、λgt−11中のD
1.1cDNAライブラリーをスクリーニングするために退化
オリゴヌクレオチド（Ｔ−BAM.2）を用いることを含ん
でいたが、Ｔ−BAMとCD40−Ｌの配列の関係は、それら
の配列関係がより長い２本鎖DNAプローブを精製するた
めに利用できることを示唆した。この考えを支持して、
CD40−ＬのNH2末端がタイプII細胞膜内タンパクの細胞
質尾部をコードするすること、および類推により、Ｔ−
BAMの高度相同性NH2末端が、関連するタンパクのアイソ
フォーム（isoform）間で高度に維持された細胞質尾部
であり得るということがある。
それ故、次のシリーズの実験は、ネズミ配列のCD40−
LcDNA（細胞質および膜近位領域から）由来の一対のオ
リゴヌクレオチドプローブが、Ｔ−BAMcDNAの相同配列
を増幅するかどうかに向けられた。したがって、D1.1か
らのmRNAのRNA−PCRは、まずCD40L（369−348）で感作
されたcDNAを合成することによって行い、ついでプライ
マーCD40L（11−31）およびCD40L（369−348）で増幅し
た。この反応は、D1.1DNAからの約330bpの断片を増幅し
た。PCR生成物は、ブルースクリプトへの鈍端結さつに
よりサブクローン化し、一方向に配列した４つの挿入物
のうち１つのクローンを同定した。これは、330kB挿入
物であり、ネズミCD40−Ｌと約85％相同であった。
プラスミドp3−1/ブルースクリプトII SK＋は、特許
出願手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペ
スト条約の規定の下に、米国メリーランド20852、ロッ
クビル、12301パークローン・ドライブ所在のアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託
した。プラスミドp3−1/ブルースクリプトII SK＋は、A
TCC受託番号（ ）を与えられた。
CD40−Ｌ配列と増幅されたPCR生成物p3−１を比較し
て以下に示す。
さらに、D1.1からのRNA、Ｔ−BAM−ジャーカットクロ
ーンB2.7およびRAMOS Ｂ細胞系からのコントロールRNA
を比較するノーザン分析により、p3.1プローブは、D1.1
細胞系中で排他的に2kB mRNA種に交雑した。アンチセ
ンスＴ−BAM.2プローブのノーザン分析、およびＴ−BAM
がD1.1中で排他的に表現されるが、B2.7ジャーカット細
胞にはされないというタンパクデータと考え併せると、
これらデータは、330bp挿入物がＴ−BAMcDNAから由来し
得ることを示唆した。
したがって、この約330bpの挿入物を、D1.1cDNAライ
ブラリーからλgt−11をスクリーニングするためのプロ
ーブとして用いた。ランダムヘキサマー標識プローブと
して330bp挿入物を用いたそのようなスクリーニング
は、サイズが1.8から2.4kBにわたる挿入物を含有する９
個の独立λgt−11クローンを同定した。
ファージDNAのPCRは、挿入物をフランク（flank）す
る。ファージDNAの領域に交雑するプローブを用いて行
い、クローンが、サイズが1.8〜2.1kBの範囲の挿入物を
含有していることを明らかにした。ノーザン分析による
NH2末端配列から由来するアンチセンスオリゴを用い
た、Ｔ−BAMのmRNAのサイズが約2kBであるという観察が
あれば、これらクローンの最も大きなものは、Ｔ−BAM
をコードするmRNAの全長cDNAまたはほぼ全長cDNAのいず
れかを表わすということが有望である。
９個のクローンの各々において、EcoR1挿入物の離脱
（EcoR1による消化による）は、すべての場合に２つの
断片が得られたので、すべての８つの挿入物が内部EcoR
1部位を含有していたことを明らかにした。λgt−11ク
ローン１−1b（これは、PCRによる最も大きな2.1kBの挿
入物を持つものであった）の場合には、生成した２つの
EcoR1断片は、1.3kBおよび0.8kBであった。これら２つ
の断片を消化したEcoR1中にクローン化した。子ウシ腸
ホスファターゼ処理ブルースクリプトII SK＋は、p1−1
b（1.3kB）／ブルースクリプトII SK＋およびp1−1b
（0.8kB）／ブルースクリプトII SK＋を生成した。
プラスミドP1−1B（1.3KB）／ブルースクリプトII SK
＋およびp1−1b（0.8kB）／ブルースクリプトII SK＋
は、特許出願手続上の微生物の委託の国際的承認に関す
るブタペスト条約の規定の下に、米国メリーランド2085
2、ロックビル、12301パークローン・ドライブ所在のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）
に寄託した。プラスミドP1−1B（1.3KB）／ブルースク
リプトII SK＋は、ATCC受託番号（ ）を与えられ、
およびプラスミドp1−1b（0.8kB）／ブルースクリプトI
I SK＋は、ATCC受託番号（ ）を与えられた。
0.8kB挿入物の部分DNA配列決定は、それが、クローン
化された生成物p3−１と約150bpだけ有意のオーバーラ
ップを持つことを明らかにした。比較を以下に示す。
加えて、p1−1b（0.8）kBの5'末端は、成熟タンパク
の、最初のコドンへ向けて、約200bp3'である。このこ
とは、全長cDNAに関して以下のクローンの配列を与え
る。
このマップは、p1−1b（1.3kB）が3'−UT（翻訳され
ない領域）中の配列に由来する、その理由は、メッセー
ジがそのように長い5'UT領域をもつくとはあまり普通で
はないからである、という仮定に基づいている。この仮
定をさらに支持するものとして、CD40−Ｌに対する関連
するcDNAが類似の大きさの3'UT（約1kB）を有するとい
う観察がある。
したがって、全長cDNAは、成熟タンパク（30kDa）の
サイズが与えられれば、そしてPCR生成物がNH2末端配列
から誘導されたので、おそらく共にＴ−BAMcDNAの全コ
ード化領域を含むところのクローン化PCR生成物（p3−
１）およびクローン化cDNA（p1−1b（0.8kB））の組み
合わせにより得ることができる。加えて、我々が提供し
たクローン化DNAは、当該分子の可溶性組み替え体に使
用される全てのアミノ酸をコードするようである。
Ｔ−BAMの表現のために、p1−1b（1.3kB）は、それが
dDNAの3'−UT領域をコードするので、おそらく必要では
ない。しかしながら、cDNAの3'−UT領域は、他の3'−UT
と同様に、Ｔ−BAM表現の調節に関与するようであり、
それ故、p1−1b（1.3）は、将来の研究において、調節
機能における3'UTの役割を確立するために重要であろ
う。
Ｔ−BAM表現を指示するクローンを生成するために、p
3−１に類似しているが、さらにプライマーmu12/T−BA
M.2および3'T−BAM配列を用いたPCRによりアニールされ
たmuCD40−Ｌのネズミリーダー配列を有するクローン化
PCR断片を生成する。ネズミCD40−Ｌへのリーダー配列
は、Ｔ−BAMクローンの表現を生じさせるに充分である
ことが予期される。そのような断片は、p1−1b（0.8）
から欠落した（5'−200bp）断片を含み、p1−1b（0.8）
およびPCR生成物のオーバーラップ領域においてBstY I
部位をフランクするNH2末端のほぼ60aaをコードするも
のである。このBstY I部位が両方の断片の制限マッピン
グ（および配列決定）後にユニークではないようであれ
ば、他の６つの部位が近くに存在する。
この断片は、ついで、BstY Iによるp1−1b（0.8kB）
の消化、および指向性（鈍端）クローン化のためのBstY
IおよびEcoR5によるPCR断片の消化によってp1−1b（0.
8kB）へ結さつされる。得られた挿入物（15bpネズミリ
ーダー−200bpPCR断片−および600bpBstY I/p1−1b（0.
8kB）断片を含む）は、中間体ベクターから表現ベクタ
ー中に指向的にクローン化されてＴ−BAMタンパク合成
を誘発する。
全長クローンがそのような表現ベクター中に結さつさ
れると、線維芽細胞系（293細胞のような）中に一時的
に形質移入され得、ついでFACSによりＴ−BAM表現につ
いてアッセイされる。さらに、Ｔ−BAMを表現する線維
芽細胞は、休止ヒトＢリンパ球で培養することができ、
またはRAMOS266クローンおよびついでＢ細胞を表面CD23
表現の誘起にかんして研究することができる。
Ｔ−BAMの全長cDNA配列を決定するために、最終的に
は、D1.1mRNAを用いて新規λgt11ライブラリーが構築さ
れるであろう。Ｔ−BAMライブラリーは、p1−1b（0.8k
B）断片由来のＴ−BAM配列に特異的なオリゴヌクレオチ
ドで感作される。このライブラリーは、p3−１からの挿
入物でスクリーニングして、Ｔ−BAMcDNAの5'領域をコ
ードするλgt11クローンを得る。この新しい挿入物のDN
A配列とp1−1b（0.8kB）およびp1−1b（1.3kB）からの
配列を決定する。新規配列5'cDNAの分析は、NH2末端ペ
プチド配列を明らかにするにちがいない。
p1−1b（1.3）kBを含む全長挿入物の構造は、また、
クローン１−1bのλgt−11DNAのPCRを行い、ついでこの
断片のブルースクリプトへの鈍端クローニングを行うこ
とによっても決定することができる。このクローン化さ
れたPCR断片の全長配列のDNA配列を決定する。この配列
とp1−1b（1.3kB）およびp1−1b（0.8kB）の1.3および
0.8kB挿入物のそれとの比較は、それらの正確なp1−1b
（1.3kB）の5'−3'配位の決定を容易にする。これらの
断片から全長cDNAクローンを生成させるために、1.3kB
挿入物をp1−1b（1.3kB）／ブルースクリプトII SK＋ク
ローンのEcoR1消化により遊離させ、ゲル精製する。つ
いで、p1−1b（0.8kB）／ブルースクリプトII SK＋プラ
スミドの部分EcoR1消化を行い、線形体をゲル精製す
る。次に、1.3kBEcoR1挿入物を部分的に消化された（線
形化）p1−1b（0.8kB）／ブルースクリプトSK＋プラス
ミド中に結さつし、コンピテントバクテリアを形質転換
する。この形質転換からのクローンの詳細な制限マップ
は、正しい配位に結さつされた1.3および0.8kB挿入物を
共に有する全長cDNA挿入物の同定を可能にする。つい
で、この全長挿入物（pT−BAM/ブルースクリプトII SK
＋）の配列決定を行い、それが正しい配位に２つの挿入
物を有していることを確認する。次に、ブルースクリプ
ト上のポリ−リンカーによりこれら断片をpCDNA−１の
ような真核性表現ベクター中に指向的にクローン化する
ことが可能になる。ついで、このpCDNA−1/pT−BAM293
細胞のような線維芽細胞中に形質移入し、これを表面Ｔ
−BAMタンパクの表現について研究することができる。
このクローンを表現するに当たり、予知されない問題
があるかもしれない。5'または3'非翻訳配列のいくつか
が除去されて表現を許容する場合がある。これは、得ら
れた配列情報を用いて容易に達成できる。加えて、pT−
BAM/pCDNA−１のようなcDNAクローンがライブラリーの
オリジナルな発生から派生する配列中でエラーを有する
という場合がまれにある（典型的に、逆転写酵素反
応）。この場合は、他の８つのλgt−11クローンを上に
述べたと同様に研究し、これらクローンを再構築してＴ
−BAMのための表現プラスミドを生成させる。
クローンの配列分析は、IgE分泌を誘発する、活性化
ネズミＴ細胞上の分子であるネズミCD40−Ｌと相同を有
するタイプII表面膜糖タンパクをすでに明らかにしてい
る。これらタンパクの両方は、広範な免疫学的および他
の機能を有するサイトカインおよび細胞表面エフェクタ
ー分子を含むTNFαスーパーファミリーのメンバーであ
る。
他の関連する遺伝子が存在するかどうかを決定するた
めに、クローンp3−1/ブルースクリプトII SK＋の330bp
挿入物を用いてヒトDNA（ヘラ・セルズ（Hela Cellsか
ら）のサザンブロットをプローブした。興味のあること
に、３つのバンドが観察された。Ｔ−BAMおよびCD40−
Ｌがこれらバンドの２つを説明するようであることを考
え併せると、これらデータは、「Ｔ−ヘルパー−エフェ
クター」分子のこのファミリーの少なくとも１つの他の
メンバーが存在することを示唆している。あるいは、Ｔ
−BAMおよびCD40−Ｌの機能的性質は別のものである
が、Ｔ−BAMがCD40−Ｌのヒト同族体であるという可能
性がなお存在する。Ｔ−BAMとCD40−Ｌが同族であるこ
とが見い出されたら、サザンデータは、そのような形態
のヘルパー分子の他の２つのメンバーが存在し得ること
を示唆する。
考察 本研究において、Ｂ細胞分化を指示する、CD4＋Ｔリ
ンパ球上の細胞表面タンパクＴ−BAMを共にコードするP
CR生成物およびcDNAクローン。
Ｔ−BAMは、tnfα遺伝子スーパーファミリーのメンバ
ーであることがわかった。非常に有意であることに、Ｔ
−BAMは、マウス中で（アーミテージら、1992）、特に
ヒトＴ−BAMとネズミCD40−Ｌとの間の配列同一性が約8
5％であった細胞質膜内外および茎領域において最近同
定されたCD40−Ｌと関連している。これらの新しいデー
タは、Ｔ−BAMおよびCD40−Ｌは、Ｂ細胞誘起Ｔ細胞表
面分子の構造的に異なるアイソフォームであることを示
唆している。もっとも、そのような概念の直接的な確認
には、両アイソフォームのネズミおよびヒト同族体の同
定と、特に、p1−１（0.8kB）クローンの残渣における
コード領域の配列決定を要するであろう。
従前のデータは、Ｔ−BAMとCD40−Ｌとは関連してい
るが、機能的には別のものであることを示唆している。
Ｔ−BAMはIgG合成を指示するが、CD40−ＬはIgEの合成
を指示する（アーミテージら、1992）。IgGに体するＴ
−BAMヘルパー機能の制限は、最近、D1.1がrIL4の存在
下にRAMOS Ｂ細胞のIgM＋クローンを誘発してIgEおよ
び他の異性タイプではなく排他的にIgG1へクラススイッ
チさせる（未公表）という観察により強化された。これ
らの実験において、Ramos細胞（１ウェル当たり30細
胞）を100のミトマイシン−Ｃ−処理D1.1細胞のフィー
ダそう上で２ないし３週間培養し、培養した上澄をアイ
ソタイプおよびサブクラス特異的ELISAにより、Ig分泌
について研究した。D1.1細胞およびrIL−４の存在下で
のみ、Ramos細胞はIgG1を分泌する細胞系（実験１にお
ける4/15クローンおよび実験２における19/59クロー
ン）に分化した。これに対し、B2.7細胞は分化およびア
イソタイプスイッチングを誘起しなかった。さらに組み
換え体IL−４はアイソタイプスイッチングに必要であっ
た。これらデータは、Ｔ−BAMおよびCD40が別のアイソ
タイプのIgの表現を指示するＢ細胞誘起Ｔ細胞表面分子
のアイソフォームであることを示唆している。
この点に関し、mAb抗CD40が増殖、分化および全ての
アイソタイプIgを含むポリクローン性Ig生産を誘起する
ことが示された（バンチェローら、1991a;バンチェロー
ら、1991b）ことは、興味のあることである。さらに、
両分子がＢ細胞上のCD40分子を含む重要な相互作用を有
するらしいことは、興味のあることである。CD40−Ｌの
場合には、CD40−ＬおよびCD40は、受容体−co−受容体
関係を含むようである（アーミテージら、1992）。Ｔ−
BAMの場合には、そのような関係は、２つの異なる構造
に対するmAbによるそれらの機能のレシプロカル遮断に
より示唆されるが、受容体リガンド関係の直接の証拠は
存在しない。それらの機能的差異と考え併せると、これ
らデータは、CD40−ＬとＴ−BAMは、両者がＢ細胞上のC
D40分子と相互作用するらしいという事実にもかかわら
ず、異なる機能的重要性を持つことを示唆する。
抗体アイソタイプに対する異なる効果に加えて、Ｔ−
BAMおよびCD40−Ｌは、異なるパターンの表現とＢ細胞
増殖についての要求を持つ。PHAおよびPMA刺激後の5c8A
gの細胞表面表現の動態は、最適表現が６時間後に生じ
るが、24時間までにベースライン（無）表現をもたらす
ダウンレグレーションが起こるという点（デダーマン
ら、1992）で比較的スニークである。これに対し、CD40
−Ｌは、同様の刺激により、＞72時間接続されるようで
ある。さらに、Ｔ−BAM＋D1.1細胞は、rIL4またはPHAの
文脈においてのみＢ細胞表現を誘起するが、CD40−Ｌ＋
トランスフェクトーマは、加えたサイトカインまたはレ
クチンの不存在下でＢ細胞増殖を誘起する（アーミテー
ジら、1992）。これらデータは、CD40−ＬとＴ−BAMに
よりＢ細胞に提供されたシグナルは異なるものであり、
それゆえ、これら分子が関連はするが別の機能を有する
異なるアイソフォームであるという構造的示唆と一致す
る。
Ｂ細胞表面上のCD40分子は、リンパ節Ｂ細胞分化に関
連した興味のあるシグナリング機能を有する（クラーク
ら、1986;クラークら、1988;レドベターら、1987;レド
ベターら1986）。何故なら、抗CD40（mAbG28−５（クラ
ークら、1986））は、プログラムされた胚中心Ｂ細胞壊
死（アポプトシス）を防止するからである（リューら、
1989）。この点で、CD40がアポプトシシに体するＴおよ
びＢ細胞表面受容体であるFAS（イトーら、1991）と同
族であることは興味のあることである。リンパ器官中の
Ｔ−Ｂ相互作用がアポプトシスを含むという程度まで、
これらデータは、CD40分子との相互作用に加えてＴ−BA
MはFAS（イトーら、1991）と相互作用し得ることを示唆
する。事実、我々は、最近、mAb抗FAS（Apo−１）（エ
ームら、1992;イトーら、1991）がCD23のRAMOS266およ
びＢ細胞誘起に対するD1.1効果を部分的に疎外すること
を観察した（未公表観察）。Ｔ−BAMがCD40とFAS双方と
相互作用し得るという考えは、CD40toFASが異なる受容
対構造であり得るか、またはヘテロ二量体受容体を形成
し得るという考えを示唆する。ある種のTNFαＲ様分子
は、多量体として、CD27の場合にはおそらくホモ二量体
として存在することが知られている（カメリニら、199
1）。tnfα様分子の多量体受容体との相互作用は、ま
た、このファミリーの唯一の結晶化メンバーであるtnf
（ハコシマら、1988;スミスら、1987）およびngf（マク
ドナルドら、1991）の分配された三量体構造によっても
示唆される。FASおよびTNFαがヘテロ二量体を形成し得
るという証拠がある。これら分子は、リンパ球表面上の
抗FAS抗体により共に調節されるからである（ヨネハラ
ら、1989）。単一tnfα様リガンドがTNFαＲ様分子の混
合ヘテロ二量体を含む多重リガンドと相互作用し得ると
いうことは、また、tnfα様分子の他の例によっても示
唆される。たとえば、tnfαおよびtnfβ（リンフォトキ
シン）は、両方ともTNFαＲの２つの別の鎖（ＩおよびI
I）と反応する（グッドウィンら、1991;ローズら、199
1;ノファーら、1990;エンゲルマンら、1990;ルイスら、
1992;ヒムラーら、1990;ウミエルら、1987;ヘラーら、1
990;グレーら、1990;スミスら、1990;レッチャーら、19
90;デムビックら、1990）。加えて、これら鎖のヘテロ
二量体組み合わせが、バイオ化学的分析により示唆され
ている（ノファーら、1990;エンゲルマンら、1990）。
共に、これら観察は、tnfαおよびTNFαＲファミリーの
メンバーは、一般に、ことなる様態でＢ細胞をシグナル
するために関連した受容体の組み合わせと相互作用し得
るということを示唆する。tnfαファミリーのメンバー
の共有特徴と思われる他の性質は、TFNαＲ、CD40およ
びFAS（ワタナベら、1992）が全てアポプトシスシグナ
ルのための受容体であるということである。
ＴおよびＢ細胞間で作用するtnfα様およびTFNα様相
互作用の多くの例が以下の表６に示されている。tnfα
様分子の性質および機能に関し、正確な機能CD38（ジャ
クソンら、1990）は未知であり、ngfはがＢ細胞分化に
効果を有することは報告されている（キマタら、1991;
オッテンら、1989）が、Ｂ細胞生理学におけるngf−NGF
R（セーガルら、1989;チャオら、1986;ジョンソンら、1
986）相互作用の役割は、現在、わかっていない。TNFα
Ｒ様分子の中で、CD27およびOx40の機能は現在未知であ
るが、CD27（マレットら、1991）が２つの形態として表
現され、Ox40（マレットら、1990）表現がCD8＋Ｔ細胞
ではなくCD4＋に制限されるということは、興味深い。
これら両方の分子は、Ｔ細胞活性化により誘起される。
「ホジキン（Hodgkin）の抗原」CD30（ダーコプら、199
2）の生理学的役割は未知である。
tnfα科のいくつかの部分の重要な特徴は、tnfαのプ
ロサイトカイン表面品種の蛋白分解の分裂がtnfαの溶
解サイトカイン品種を生じることである。将来の研究
は、Ｔ−BAMがプロテアーゼで分解されならば、かつ溶
液Ｔ−BAMの役割はもし同定されるならばＴ−Ｂセル相
互作用で働くならかもしないことが決定するはずであ
る。TNFαRs（ウミールら、1987;ヒーラーら、1990;グ
ラィら、1990）およびCD27（ローエンら、1992;ディヨ
ングら、1991）分子は溶液形態を有ことが重要であり、
CD40分子の溶液形態が存在し、かつＴ−Ｂ相互作用で役
割を果たすであろうことを示唆する。
その上に、CD40のＢセルとのＴセル表面分子の相互作
用の複雑さは、CD40−Ｌ（39kDa対33kDa）に比べてかな
り大きな分子量を有する他のねずみ科のCD40−Ｌの最近
リポートによって示唆されている（アーミテージら、19
92;ノエルら、1992）。しかしながら、その正確な構成
またはＴ−BAMまたはCD40−Ｌの関係は正確には知られ
ていない。
けれども、いくつかの他のＢセル表面分子はリンパ組
織中で従属信号を受けることで役割を果たすかもしれな
いことが述べられている。しかしながら、阻害するD1.1
−Ｂセル相互作用のmAb 5c8の効果は、ＢセルとのD1.1
相互作用で効果のない抗CR2、抗LFAI、抗LFA3または抗I
CAMで試験される抗体間で比較的独特のであることが明
らかである。したがって、Ｔ−Ｂ相互作用の前記Ｔ−BA
M従属段階は促進効果因子の分別する工程であることが
明らかである。
Ｔ−BAM発現の瞬間的性質は、そのＴ−Ｂ“同源対”
を安定にする役割をなすかもしれないことを示唆する。
“同源”天然のままのプロテイン特異Ｂセルとの活性ペ
プチド特異CD4＋Ｔセルの物理的関連は、“抗原ブリッ
ジ”として生理学的に規定の分子基本であることが明ら
かである。
Ｔ−BAMとCD40−Ｌ間の関係を明らかにすることに加
えて、Ｔ−BAMを暗号化するcDNAの有益さは、別の種、
特にＴ−BAM因子の生理学的様子が過発現（遷移因子
中）によるかまたは標的にされる因子分裂によって宛名
書きされることができるねずみ、の中の同種の遺伝子を
確認することを許容する。さらに、Ｔ−BAM特異cDNAプ
ローブの有益さは、組み換えレベルでＴ−BAM発現の規
則の分析を促進し、同様に遺伝子操作によってＴ−BAM
因子性状の構造決定を研究するための手段を供する。
免疫性生理機能のそれら役割に加えて、いくつかのTN
FαＲ科員はウイルス性病原体によって利用されている
ことが明らかである。粘液種ウィルスはウィルス病毒性
を伴うTNFαＲに対して同種の分泌蛋白質を発現する
（アプトンら、1991）。さらにシープフィブロマウィル
スからの読取り枠によって暗号化された蛋白質はTNFα
Ｒに対して同種である（スミスら、1990）。したがっ
て、これら分子を理解することの付加的な特徴は免疫性
病原体、例えば自己免疫疾患を誘発するＴ−BAMのよう
な分子の機能範囲を利用する新規なウィルスの識別化ま
たは特徴付けであるかもしれない。
配列表 （１）一般情報 （ｉ） 出願人:Lederman,Seth Chess,Leonard Yellin,Michael J. （ii） 発明の名称:Tリンパ球表面のヒト糖蛋白質を
認識するネズミモノクローナル抗体（5c8）、これを含
有する組成物および使用方法 （iii） 配列の数:16 （iv） 書信宛先： （Ａ）受信人:Cooper ＆ Dunham （Ｂ）ストリート:30 Rockefeller Plaza （Ｃ）シティ:New York （Ｄ）ステート:New York （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）ZIP:10112 （ｖ） コンピューター読取可能形式： （Ａ）メディアタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム： PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア： PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.25 （vi） 現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii） 代理人情報 （Ａ）名前:White,John P. （Ｂ）登録番号:28,678 （Ｃ）参照番号:0575/39757−Ａ−PCT （ix） 遠隔地通信情報 （Ａ）電話：（212）977−9550 （Ｂ）TELEFAX:（212）664−0525 （Ｃ）TELEX:422523 COOP UI （２）配列番号１の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:17塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号２の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:20塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号３の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:20塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号４の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号５の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号６の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号７の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号８の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号９の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:15アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号10の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:15アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号11の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:10アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号12の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:12塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号13の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:325塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号14の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:342塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号15の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:53塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列 （２）配列番号16の情報 （ｉ） 配列の特性 （Ａ）配列の長さ:53塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii） 配列の種類:cDNA （iii） ハイポセティカル配列:NO （iv） アンチセンス:NO （xi） 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 レダーマン、セス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027、ニューヨーク、アパートメント 44、ウエスト・ワンハンドレッドトウ エンティファースト・ストリート 523 (72)発明者 チェス、レオナード アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10538、スカースデール、グリーン・ア クレス・アベニュー 81 (72)発明者 イエリン、マイケル・ジェイ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10463、リバーデール、インデペンデン ス・アベニュー 2736 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/28 C12N 5/10 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ATCC受付番号HB10916を有するハイブリド
    ーマによって産生されたモノクローナル抗体5c8。
  2. 【請求項２】前記モノクローナル抗体が治療剤に結合し
    ている請求項１のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】前記治療剤が放射性同位体、毒素、トキソ
    イド又は化学療法剤である請求項２のモノクローナル抗
    体。
  4. 【請求項４】前記モノクローナル抗体が検出可能なマー
    カーで標識された請求項１のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】前記検出可能なマーカーが放射性同位体、
    酵素、色素又はビオチンである請求項４のモノクローナ
    ル抗体。
  6. 【請求項６】前記モノクローナル抗体が画像形成剤と結
    合している請求項１のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】前記画像形成剤が放射性同位体である請求
    項６のモノクローナル抗体。
  8. 【請求項８】請求項１のモノクローナル抗体を産生する
    ハイブリドーマ。
  9. 【請求項９】前記ハイブリドーマがATCC受付番号HB1091
    6を有する請求項８のハイブリドーマ。
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