JP3963406B2 - 因子ＶＩＩおよび活性化因子ＶＩＩａの精製法 - Google Patents
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【０００１】
本発明は固定化可溶トロンボプラスチンへの結合により因子VIIおよび／または活性化因子VIIａ（ＦVII／ＦVIIａ）を精製する方法に関する。
凝固因子VII（ＦVII）はトロンボプラスチン（組織因子、ＴＦ）と一緒に外因性の凝固経路を開始させる複合体を構成する。組織損傷が起ると、ＴＦが露出され、ＦVIIおよび／またはＦVIIａはその細胞外タンパク質ドメインと結合できるようになる。疎水性タンパク質領域はＴＦを膜に固定する。
【０００２】
（好ましくは負電荷の）脂質およびカルシウムの存在下で、ＦVII／ＦVIIａ混合物の生理学的に活性な成分、すなわちＴＦ−ＦVIIａは効果的に因子Ｘ（ＦX）を活性化する。引き続いてＦXａが（ＦVａ、脂質およびカルシウムと一緒に）トロンビンの生成を触媒する。その後のフィブリンの生成はとりわけ創傷の縫合を確実にする。
膜に位置するＴＦに結合したＦVIIは引き続いて（ＴＦ−ＦVIIａが介在する）自己活性化により、またはＦIXａ、ＦXａおよびトロンビンにより活性化され、それにより凝固系のカスケード様活性化をさらに増強する。
【０００３】
相応じて、ＦVIIの欠乏は出血性傾向のような止血性合併症を伴うことがある。生理学的に機能的な分子を生成するその合成がビタミンＫの存在に依存する凝固子として、合併症は相応じて例えば手術前の（ビタミンＫアンタゴニストを用いた）経口抗凝固に関連して起こりうるものであり、そして消費性凝固障害および肝臓損傷はＦVII置換療法を適用するための追加的な徴候である。他方、ＦVIIａは急性出血に関して使用されうる活性化ＰＰＳＢ製剤の構成成分である。この他に、ＦVIIａは例えばＦVIII不耐性の血友病患者に置換療法を適用する場合に使用される、いわゆる因子VIII−バイパス活性（例えば抗体）を有する。
【０００４】
ＦVII／ＦVIIａは通常、幾つかの調製工程を使用して血漿または（組換え体調製の場合）培養上澄みから濃縮され、その手順は一般に収率の低下を伴なう。構造的に、またその特性においても他の凝固因子と関係のあるタンパク質として、相当する混合物からのその精製は困難かつ複雑である。この他に、ＦVIIの場合、精製工程がより複雑になるため、（望ましい調製法に従って）回避しなければならない（ＦVIIａへの）活性化が起こるという危険がある。適当な固定化モノクローナル抗体を使用する調製法は迅速な方法の例である。しかしながら、一般にタンパク質を非可逆的に傷つける溶離条件（pH３〜pH４）が必要である。部分変性は対応する収率の低下をもたらし、また抗原性にする配座が変った分子構造となる原因となりうる。
したがって、本発明の根元的な目的はＦVII／ＦVIIａの迅速で温和な精製法を提供することである。
【０００５】
本目的は次のようにして達成された；ＦVII／ＦVIIａを含有する溶液からそれらを固定化ｓＴＦ（“可溶性”トロンボプラスチン、可溶性組織因子）に結合し、非結合分子をマトリックスから洗浄により除去し、その後ＦVII／ＦVIIａを温和な条件下で溶離することによりＦVIIおよび／またはＦVIIａを取り出すものである。これに関して、ｓＴＦはトランスメンブラン部分および細胞質部分を欠乏しており、したがってＴＦの細胞外ドメインであるトロンボプラスチンである。
【０００６】
本発明者らはＦVII／ＦVIIａとｓＴＦの相互作用を利用してＦVIIおよび／またはＦVIIａを精製することができることを見い出した。すなわち、“生理学的に”完全な（脂質と結合する）ＴＦは自己活性化やＦIXａ、ＦXａおよびトロンビンによる結合ＦVIIのタンパク質分解またはフィードバック活性化を引き起こすが、ｓＴＦに結合したＦVIIは変わらないままである（MorrisseyのThromb. Haemostas. 74: 185〜188（1995年））。
【０００７】
ＦVIIおよび／またはＦVIIａとｓＴＦの結合は二価のイオン、特にカルシウムの存在下で最適にされるが、他のタンパク質を非結合形態で除去することができる。したがって、固定化ｓＴＦはマトリックスに吸着され、ＦVIIおよび／またはＦVIIａはカルシウムの存在下で溶液からｓＴＦに結合され、そして非結合分子は固相から洗浄により除去される。溶離はシトレート、オキサレート、タルトレート、ＥＤＴＡなどのようなキレート化剤を含有する緩衝液を使用して温和な方法で行なわれる。
【０００８】
ｓＴＦは非共有結合により固相に吸着させることができ、または共有結合により固定することができる。適当な結合相手は慣用的に調製されたｓＴＦ（完全ＴＦからタンパク質分解的に調製される）、遺伝子組換えにより調製されたｓＴＦまたはＦVII／ＦVIIａ−結合部分（ｓＴＦのペプチド領域）である。ｓＴＦまたは適当なＦVII−結合領域は固定化を簡単または最適にする物質に結合させることができる（例えばスペーサー官能基として、下記参照）。
【０００９】
好ましいアプローチでは、LaufferらのＥＰ ４６４ ５３３に記載のように、Ｆｃフラグメントに結合したｓＴＦ（Ｆｃ−ｓＴＦ）が使用される。ｓＴＦは最適に与えられ、精製法の有効性は例えばＦｃ−ｓＴＦを抗Ｆｃカラム、タンパク質Ａマトリックスまたはタンパク質Ｇマトリックスに結合することにより増大される。Ｆｃフラグメントまたは免疫グロブリンを含有する試料はマトリックスからのＦｃ−ｓＴＦの置換をもたらしうるため、知られている方法を使用してＦｃ−ｓＴＦをマトリックスに共有結合的に結合させることが適切である。
【００１０】
二価のイオン、好ましくはＣａＣｌ2の形態のカルシウムは０.０１〜５００mM、特に好ましくは０.５〜５０mMの濃度でＦVII／ＦVIIａ含有溶液に加えられる。溶液のpHは５.０〜１０.０、好ましくは７.０〜９.５である。この溶液をｓＴＦ−マトリックスと接触させ、そしてマトリックスを好ましくは７.０〜９.５のpHおよび０.５〜５０mMのカルシウム濃度を有する緩衝液で洗浄する。溶離はキレート化剤、好ましくはシトレート、オキサレート、タルトレート、ＮＴＡ、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを０.１〜１０００mM、好ましくは５〜２００mMの濃度で含有する溶液を使用して行なわれる。溶液のpHは５.０〜１０.０、好ましくは５.５〜８.５、特に好ましくは６.０〜７.５である。
【００１１】
活性化因子を含有する試料は（おそらく存在する過剰の因子VIIから）ＦVIIａの追加的な生成をもたらすことがあり、それにより人為的な結果をもたらす。このリスクを回避するため、固定化ｓＴＦと接触させる前に抗トロンビンIII／ヘパリンを試料に加えることができる。ＦVIIａは室温または高めの温度でＡＴIII／ヘパリンにより、他の潜在的に干渉する因子（ＦIIａ、ＦIXａ、ＦXａなど）と比べてゆっくりと阻害されるため、ＦVIIａを精製することが目的の場合、ＦVIIａの含量にあまり影響を及ぼすことなく後者の因子を遮断することができる。ある場合には、ＴＦ−結合ＦVIIａをＡＴIII／ヘパリンによって遊離分子よりも効果的に阻害することができる（しかし、ＡＴIIIは機能的なヘパリンがないと可溶性ＦVIIａと同様に非常にゆっくりと反応する）。したがって、ｓＴＦと接触させる前にプロタミンサルフェート／ポリブレン（登録商標）のような知られている試薬により加えたヘパリンを中和し、次に上記のような方法を行なうことができる。
方法のこの工程において可逆阻害剤、例えばベンズアミジン、およびそれら自体が中和可能な他の補因子依存阻害剤またはそれらの促進剤（例えばヘパリン−補因子II／ヘパリン）もまた適している。
次の実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
【実施例】
タンパク質Ａ−セファロースにＦｃ−ｓＴＦ（１０μｇ／５０μｌのゲルマトリックス）を負荷し、緩衝液Ａ（５０mMのトリス／ＨＣｌ、１５０mMのＮａＣｌ、１０mMのＣａＣｌ2、０.１％ヒトアルブミン、pH８.５）で平衡させた。ＦVII（１５IU／ml）を含有する０.５mlのタンパク質溶液にＦVIIａを（凝固試験で）ＦVII活性の５％に相当する濃度まで加えた。溶液はまた、因子II（３０IU／ml）、IX（２５IU／ml）およびＸ（３０IU／ml）のような他の凝固因子、並びに幾つかの追加的な血漿タンパク質を含有した。この溶液を同量の緩衝液Ａで稀釈し、小カラム中のｓＴＦ−マトリックスと接触させた。流動液をカラム中を通過させた後、マトリックスを０.５mlの緩衝液Ａで洗浄し、次に結合タンパク質を緩衝液Ｂ（５０mMのトリス／ＨＣｌ、１５０mMのＮａＣｌ、５０mMのクエン酸ナトリウム、pH６.５）で溶離し集めた。
【００１３】
溶出液を適当な凝固試験で試験し、そしてＦVII／VIIａの収率をその活性により、またＥＬＩＳＡにより（出発物質に関連して）定量した。溶出液の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかにした。
結果：ＦVII／ＦVIIａの収率は出発物質に基づいて、ＥＬＩＳＡでは９３％、そして活性では９０％であった。他の重要な発見は、溶出液中のＦVII活性の５％が（加えた）ＦVIIａから誘導されたものであるということである。これは２つの分子のどちらも優先的に結合していないことを示している。他方、この精製工程の間にＦVIIのＦVIIａへの活性化が起こるという可能性を除外することができる。
【００１４】
ＦII、ＦIXまたはＦXのいずれも溶出液中に存在しなかったが、それらはすべて（出発物質と対応して）カラムの流動液中に存在した。溶出液の純度、および溶出液中のＦVII／VIIａの濃縮における強力な効果はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により明らかにされる。それは精製効果を立証している。
本発明は固定化可溶トロンボプラスチンへの結合により因子VIIおよび／または活性化因子VIIａ（ＦVII／ＦVIIａ）を精製する方法に関する。
凝固因子VII（ＦVII）はトロンボプラスチン（組織因子、ＴＦ）と一緒に外因性の凝固経路を開始させる複合体を構成する。組織損傷が起ると、ＴＦが露出され、ＦVIIおよび／またはＦVIIａはその細胞外タンパク質ドメインと結合できるようになる。疎水性タンパク質領域はＴＦを膜に固定する。
【０００２】
（好ましくは負電荷の）脂質およびカルシウムの存在下で、ＦVII／ＦVIIａ混合物の生理学的に活性な成分、すなわちＴＦ−ＦVIIａは効果的に因子Ｘ（ＦX）を活性化する。引き続いてＦXａが（ＦVａ、脂質およびカルシウムと一緒に）トロンビンの生成を触媒する。その後のフィブリンの生成はとりわけ創傷の縫合を確実にする。
膜に位置するＴＦに結合したＦVIIは引き続いて（ＴＦ−ＦVIIａが介在する）自己活性化により、またはＦIXａ、ＦXａおよびトロンビンにより活性化され、それにより凝固系のカスケード様活性化をさらに増強する。
【０００３】
相応じて、ＦVIIの欠乏は出血性傾向のような止血性合併症を伴うことがある。生理学的に機能的な分子を生成するその合成がビタミンＫの存在に依存する凝固子として、合併症は相応じて例えば手術前の（ビタミンＫアンタゴニストを用いた）経口抗凝固に関連して起こりうるものであり、そして消費性凝固障害および肝臓損傷はＦVII置換療法を適用するための追加的な徴候である。他方、ＦVIIａは急性出血に関して使用されうる活性化ＰＰＳＢ製剤の構成成分である。この他に、ＦVIIａは例えばＦVIII不耐性の血友病患者に置換療法を適用する場合に使用される、いわゆる因子VIII−バイパス活性（例えば抗体）を有する。
【０００４】
ＦVII／ＦVIIａは通常、幾つかの調製工程を使用して血漿または（組換え体調製の場合）培養上澄みから濃縮され、その手順は一般に収率の低下を伴なう。構造的に、またその特性においても他の凝固因子と関係のあるタンパク質として、相当する混合物からのその精製は困難かつ複雑である。この他に、ＦVIIの場合、精製工程がより複雑になるため、（望ましい調製法に従って）回避しなければならない（ＦVIIａへの）活性化が起こるという危険がある。適当な固定化モノクローナル抗体を使用する調製法は迅速な方法の例である。しかしながら、一般にタンパク質を非可逆的に傷つける溶離条件（pH３〜pH４）が必要である。部分変性は対応する収率の低下をもたらし、また抗原性にする配座が変った分子構造となる原因となりうる。
したがって、本発明の根元的な目的はＦVII／ＦVIIａの迅速で温和な精製法を提供することである。
【０００５】
本目的は次のようにして達成された；ＦVII／ＦVIIａを含有する溶液からそれらを固定化ｓＴＦ（“可溶性”トロンボプラスチン、可溶性組織因子）に結合し、非結合分子をマトリックスから洗浄により除去し、その後ＦVII／ＦVIIａを温和な条件下で溶離することによりＦVIIおよび／またはＦVIIａを取り出すものである。これに関して、ｓＴＦはトランスメンブラン部分および細胞質部分を欠乏しており、したがってＴＦの細胞外ドメインであるトロンボプラスチンである。
【０００６】
本発明者らはＦVII／ＦVIIａとｓＴＦの相互作用を利用してＦVIIおよび／またはＦVIIａを精製することができることを見い出した。すなわち、“生理学的に”完全な（脂質と結合する）ＴＦは自己活性化やＦIXａ、ＦXａおよびトロンビンによる結合ＦVIIのタンパク質分解またはフィードバック活性化を引き起こすが、ｓＴＦに結合したＦVIIは変わらないままである（MorrisseyのThromb. Haemostas. 74: 185〜188（1995年））。
【０００７】
ＦVIIおよび／またはＦVIIａとｓＴＦの結合は二価のイオン、特にカルシウムの存在下で最適にされるが、他のタンパク質を非結合形態で除去することができる。したがって、固定化ｓＴＦはマトリックスに吸着され、ＦVIIおよび／またはＦVIIａはカルシウムの存在下で溶液からｓＴＦに結合され、そして非結合分子は固相から洗浄により除去される。溶離はシトレート、オキサレート、タルトレート、ＥＤＴＡなどのようなキレート化剤を含有する緩衝液を使用して温和な方法で行なわれる。
【０００８】
ｓＴＦは非共有結合により固相に吸着させることができ、または共有結合により固定することができる。適当な結合相手は慣用的に調製されたｓＴＦ（完全ＴＦからタンパク質分解的に調製される）、遺伝子組換えにより調製されたｓＴＦまたはＦVII／ＦVIIａ−結合部分（ｓＴＦのペプチド領域）である。ｓＴＦまたは適当なＦVII−結合領域は固定化を簡単または最適にする物質に結合させることができる（例えばスペーサー官能基として、下記参照）。
【０００９】
好ましいアプローチでは、LaufferらのＥＰ ４６４ ５３３に記載のように、Ｆｃフラグメントに結合したｓＴＦ（Ｆｃ−ｓＴＦ）が使用される。ｓＴＦは最適に与えられ、精製法の有効性は例えばＦｃ−ｓＴＦを抗Ｆｃカラム、タンパク質Ａマトリックスまたはタンパク質Ｇマトリックスに結合することにより増大される。Ｆｃフラグメントまたは免疫グロブリンを含有する試料はマトリックスからのＦｃ−ｓＴＦの置換をもたらしうるため、知られている方法を使用してＦｃ−ｓＴＦをマトリックスに共有結合的に結合させることが適切である。
【００１０】
二価のイオン、好ましくはＣａＣｌ2の形態のカルシウムは０.０１〜５００mM、特に好ましくは０.５〜５０mMの濃度でＦVII／ＦVIIａ含有溶液に加えられる。溶液のpHは５.０〜１０.０、好ましくは７.０〜９.５である。この溶液をｓＴＦ−マトリックスと接触させ、そしてマトリックスを好ましくは７.０〜９.５のpHおよび０.５〜５０mMのカルシウム濃度を有する緩衝液で洗浄する。溶離はキレート化剤、好ましくはシトレート、オキサレート、タルトレート、ＮＴＡ、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを０.１〜１０００mM、好ましくは５〜２００mMの濃度で含有する溶液を使用して行なわれる。溶液のpHは５.０〜１０.０、好ましくは５.５〜８.５、特に好ましくは６.０〜７.５である。
【００１１】
活性化因子を含有する試料は（おそらく存在する過剰の因子VIIから）ＦVIIａの追加的な生成をもたらすことがあり、それにより人為的な結果をもたらす。このリスクを回避するため、固定化ｓＴＦと接触させる前に抗トロンビンIII／ヘパリンを試料に加えることができる。ＦVIIａは室温または高めの温度でＡＴIII／ヘパリンにより、他の潜在的に干渉する因子（ＦIIａ、ＦIXａ、ＦXａなど）と比べてゆっくりと阻害されるため、ＦVIIａを精製することが目的の場合、ＦVIIａの含量にあまり影響を及ぼすことなく後者の因子を遮断することができる。ある場合には、ＴＦ−結合ＦVIIａをＡＴIII／ヘパリンによって遊離分子よりも効果的に阻害することができる（しかし、ＡＴIIIは機能的なヘパリンがないと可溶性ＦVIIａと同様に非常にゆっくりと反応する）。したがって、ｓＴＦと接触させる前にプロタミンサルフェート／ポリブレン（登録商標）のような知られている試薬により加えたヘパリンを中和し、次に上記のような方法を行なうことができる。
方法のこの工程において可逆阻害剤、例えばベンズアミジン、およびそれら自体が中和可能な他の補因子依存阻害剤またはそれらの促進剤（例えばヘパリン−補因子II／ヘパリン）もまた適している。
次の実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
【実施例】
タンパク質Ａ−セファロースにＦｃ−ｓＴＦ（１０μｇ／５０μｌのゲルマトリックス）を負荷し、緩衝液Ａ（５０mMのトリス／ＨＣｌ、１５０mMのＮａＣｌ、１０mMのＣａＣｌ2、０.１％ヒトアルブミン、pH８.５）で平衡させた。ＦVII（１５IU／ml）を含有する０.５mlのタンパク質溶液にＦVIIａを（凝固試験で）ＦVII活性の５％に相当する濃度まで加えた。溶液はまた、因子II（３０IU／ml）、IX（２５IU／ml）およびＸ（３０IU／ml）のような他の凝固因子、並びに幾つかの追加的な血漿タンパク質を含有した。この溶液を同量の緩衝液Ａで稀釈し、小カラム中のｓＴＦ−マトリックスと接触させた。流動液をカラム中を通過させた後、マトリックスを０.５mlの緩衝液Ａで洗浄し、次に結合タンパク質を緩衝液Ｂ（５０mMのトリス／ＨＣｌ、１５０mMのＮａＣｌ、５０mMのクエン酸ナトリウム、pH６.５）で溶離し集めた。
【００１３】
溶出液を適当な凝固試験で試験し、そしてＦVII／VIIａの収率をその活性により、またＥＬＩＳＡにより（出発物質に関連して）定量した。溶出液の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかにした。
結果：ＦVII／ＦVIIａの収率は出発物質に基づいて、ＥＬＩＳＡでは９３％、そして活性では９０％であった。他の重要な発見は、溶出液中のＦVII活性の５％が（加えた）ＦVIIａから誘導されたものであるということである。これは２つの分子のどちらも優先的に結合していないことを示している。他方、この精製工程の間にＦVIIのＦVIIａへの活性化が起こるという可能性を除外することができる。
【００１４】
ＦII、ＦIXまたはＦXのいずれも溶出液中に存在しなかったが、それらはすべて（出発物質と対応して）カラムの流動液中に存在した。溶出液の純度、および溶出液中のＦVII／VIIａの濃縮における強力な効果はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により明らかにされる。それは精製効果を立証している。
Claims (9)
- 溶液の pH が７ . ０〜９ . ５である因子VIIおよび／または因子VIIaを含有する溶液からそれらを固定化可溶トロンボプラスチンに結合させ、非結合分子を pH ７ . ０〜９ . ５の緩衝液で洗浄することにより除去し、そして因子VIIおよび／または因子VIIaを pH ５ . ５〜８ . ５の溶離液で溶離することにより因子VIIおよび／または因子VIIaを取出すことからなり、自己活性化、タンパク質分解またはフィードバック活性化を引き起こさずに、因子VIIおよび／または因子VIIaを精製する方法。
- 結合因子VIIおよび／または因子VIIａはキレート化剤を使用して溶離される請求項１記載の方法。
- 固定化可溶トロンボプラスチンへの結合に関してＣａ2+イオンが０.０１〜５００mMの濃度で加えられる、請求項１または２記載の方法。
- 因子VIIおよび／または因子VIIａを溶離するのに十分な０.１〜１０００mMの濃度のシトレート、オキサレート、タルトレート、ＮＴＡ、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡがキレート化剤として選択される請求項２または３記載の方法。
- 他の干渉する活性化因子は固定化可溶トロンボプラスチンと接触させる前に阻害される請求項１〜４の何れかの項記載の方法。
- 固定化可溶トロンボプラスチンと接触させる前に、他の潜在的に干渉する活性化因子は抗トロンビンIII／ヘパリンを加えることにより不活性化され、適当ならばプロタミンサルフェートが引き続いて加えられる請求項５記載の方法。
- 可溶性トロンボプラスチンは非共有結合により固相に吸着される請求項１〜６の何れかの項記載の方法。
- Ｆｃフラグメントに結合する可溶性トロンボプラスチンが使用される請求項７記載の方法。
- 可溶性トロンボプラスチンは固相に共有結合される請求項１〜６記載の方法。
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